CN108884168A - 抗体及其相关分子和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的抗体，其选择性结合CLEC14A，其中所述抗体(a)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区,其中所述重链可变区包含：(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.105，优选SEQ ID NO:2或42；(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.106，优选SEQ ID NO:3或43；和/或(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.107，优选SEQ ID NO:4或44；和/或其中所述轻链可变区包含：(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.108，优选SEQ ID NO:6或46；(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.109，优选SEQ ID NO:7或47；和/或(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.110，优选SEQ ID NO:8或48；或(b)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22；(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和/或(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24；和/或其中所述轻链可变区包含：(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27；和/或(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28；或(c)是能与抗体(a)或(b)竞争结合CLEC14A的抗体。本发明还提供了嵌合抗原受体、编码本发明的抗体或嵌合抗原受体的核酸分子、载体、细胞和方法/抗体和嵌合抗原受体的用途。

Description

抗体及其相关分子和用途
本发明一般涉及抗体，CLEC14A生物学和相关疗法，例如嵌合抗原受体(CAR)领域。更具体地，它提供与CLEC14A结合的抗体和针对抗原CLEC14A的CAR及其在免疫效应细胞中表达以靶向表达CLEC14A的靶细胞。此类抗CLEC14A抗体和免疫效应细胞在与CLEC14A相关的疾病和状况中具有治疗用途。例如，本发明提供了用于抑制血管生成和对抗与不需要的血管生成相关的疾病(例如癌症)的产品。本发明的抗体还可以在监测或预测肿瘤生长和进展中得到诊断效用，例如通过对血管系统成像。本发明的基于抗体的组合物和方法还延伸到免疫缀合物和其他治疗组合、试剂盒和方法的用途。本发明还提供编码此类抗体和CAR的核酸分子和含有它们的载体，其可用于修饰宿主细胞，例如免疫效应细胞，以表达抗体或CAR。特别地，本发明的CAR包含源自本发明抗体的抗原结合域。
CLEC14A(也称为表皮生长因子受体5(EGFR5))是单通跨膜糖蛋白，其属于血管限制性C型凝集素家族14，它的其他成员包括CD248/TEM1/内皮唾液酸蛋白、血栓调节蛋白和CD93。它是长度为490个氨基酸(aa)的单通I型跨膜蛋白，其含有信号肽(aa 1-21)，胞外区(aa 22-398)，跨膜域(aa 399-421)和胞质域(aa 422-490)。胞外区具有一个C型凝集素样域(aa 22-173)和表皮生长因子样区域(aa 245-287)。人和小鼠CLEC14A蛋白显示67％的氨基酸序列同一性，在C型凝集素和表皮生长因子样域中具有甚至更大的序列保守性。关于CLEC14A的可用数据提示操纵CLEC14A水平或功能(例如使用阻断抗体)可以调节内皮迁移(WO2011/027132)。
内皮细胞形成单个细胞层，其作为所有血管的衬里并调节血流和周围组织之间的交换。在称为血管生成的过程中，新血管通过内皮细胞的长出从现有小血管的壁发展。当在培养物中分离时，内皮细胞甚至具有形成中空毛细管的能力。一旦血管系统完全发育，血管的内皮细胞通常保持静止，没有新的血管形成，除了在自然伤口愈合中形成新血管。然而，一些肿瘤通过分泌刺激附近内皮细胞构建新毛细血管芽的因子来吸引新的血液供应。血管生成在实体瘤的进展中起主要作用，并且被广泛认为是实体瘤生长中的限速过程。未能吸引血液供应的肿瘤的生长受到严重限制。因此，抑制不适当的，不希望的或不需要的血管生成的能力可用于治疗实体瘤。
新血管的发展对于局部肿瘤进展和远处转移的发展都是必不可少的。实际上，肿瘤的生长和存活取决于它们获得血液供应的能力，并且已经显示肿瘤内皮上施加的损伤有效地根除肿瘤。肿瘤血管生成涉及通过活化组织或循环内皮前体降解基底膜，内皮细胞的增殖和迁移，与细胞外基质的相互作用，形态分化，细胞粘附和血管形成。因此，抑制肿瘤血管生成是抗肿瘤治疗的目标，单独使用血管生成抑制剂或与标准癌症治疗组合使用。然而，将抗肿瘤剂靶向到血管生成部位取决于肿瘤血管生成的特异性标志物的鉴定。内皮在许多生理和病理过程中起重要作用，并且已知其是特别活跃的转录位点。在内皮细胞中表达大约1,000种不同的基因，尽管它们中的许多不是内皮细胞特异性的。
CLEC14A已被鉴定为肿瘤内皮标志物(WO2011/027132)。CLEC14A在作为许多常见人癌症(包括乳腺癌，肝癌，前列腺癌，胰腺癌，膀胱癌和卵巢癌)的血管系统衬里的细胞表面高表达，但在健康组织的血管系统中表达低或不可检测。它在低剪切应力的条件下诱导，例如在肿瘤组织的不良形成血管中发生，并与细胞外基质内的MMRN2相互作用。它介导filipodia形成和内皮迁移，在发芽血管生成和促进小鼠肿瘤生长中起作用。因此，预期阻断或抑制CLEC14A功能或活性导致血管生成，特别是肿瘤血管生成的抑制。因此，需要抑制或阻断CLEC14A功能或活性的试剂和靶向表达CLEC14A的细胞，特别是肿瘤细胞(例如肿瘤血管系统)的试剂。
近年来，使用抗体，特别是单克隆抗体的免疫疗法作为治疗各种疾病(包括癌症)的安全和选择性方法而出现。还发现抗体在体外和体内以及离体的各种诊断和预后分析中都是有效的。然而，并非所有能够结合特定抗原的抗体在治疗中都是有效的。因此，需要和期望能够特异性结合CLEC14A的抗体，特别是与先前表征的CLEC14A抗体结合不同表位，并且还可以是治疗有效的和/或能够阻断或抑制CLEC14A功能或活性的抗体，例如，用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
涉及在T细胞或其他免疫效应细胞，例如NK细胞中表达嵌合抗原受体(CAR)的疗法也在近年发展起来。现在广泛已知并在本领域中描述的CAR是融合蛋白，其包含与T细胞受体(TcR)复合物的信号传导域(或等同物)连接的抗原结合域，通常但不总是源自抗体，并且若选择合适的抗原结合域或抗体，则可以用于引导针对肿瘤的T细胞或其他免疫效应细胞。
CAR构建体通常包含抗原结合域，任选地为铰链域(其发挥间隔物功能以将抗原结合域延伸远离其表达的免疫效应细胞的质膜)，跨膜域，胞内信号传导域(例如，来自TcR复合物的CD3分子的zeta链(CD3ζ)的信号传导域，或等同物)和任选地一种或多种共刺激域，其可以帮助表达CAR的细胞的信号传导或功能性。不同的域可以直接连接或通过接头连接。这些不同的域和接头可用多种选择。因此，需要能够靶向表达CLEC14A的细胞，特别是肿瘤细胞的CAR，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
本发明人已经产生了特异性和有效地结合CLEC14A的抗体(本文称为CRT-2和CRT-3)。此外，如实施例中更详细讨论的，本发明人已经确定所述抗体可以单独和与细胞毒性药物组合(例如作为抗体药物缀合物(也称为免疫缀合物))具有有用的治疗性质。值得注意的是，发明人已经表征了所述抗体的抗原结合域，并且确定所述域，更具体地，所述域的可变区(VL和VH链)可以提供用于针对表达CLEC14A的细胞的过继细胞转移疗法的有效CAR。如下文将更详细描述的，在更具体的实施方案中，CAR可以包含与“信号传导尾”组合的基于或包含本发明抗体的VL和VH链，特别是基于其高变区或CDR(互补决定区)的抗原结合域，所述信号传导尾包括铰链，跨膜，共刺激和胞内信号传导域的组合。
因此，在一个方面，本发明提供抗体，特别是分离的抗体，其选择性结合CLEC14A，其中所述抗体：
(a)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.105，优选SEQ ID NO:2或42，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.106，优选SEQ ID NO:3或43，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.107，优选SEQ ID NO:4或44，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.108，优选SEQ ID NO:6或46，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.109，优选SEQ ID NO:7或47，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.110，优选SEQ ID NO:8或48,或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的任何前述SEQ ID NO基本上同源的序列；或
(b)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；或
(c)是能与抗体(a)或(b)竞争结合CLEC14A的抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了抗体，特别是分离的抗体，其选择性结合CLEC14A，其中所述抗体：
(a)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.105，特别是SEQ ID NO:2或42；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.106，特别是SEQ ID NO:3或43；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.107，特别是SEQ ID NO:4或44；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.108，特别是SEQ ID NO:6或46；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.109，特别是SEQ ID NO:7或47；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.110，特别是SEQ ID NO:8或48；或
(b)是能够与抗体(a)竞争结合CLEC14A的抗体。
因此，在一些实施方案中，抗体(a)具有SEQ ID NO:1或41的VH域和/或SEQ ID NO:5或45的VL域；或(b)是能与抗体(a)竞争结合CLEC14A的抗体。例如，抗体可以包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.105，特别是SEQ ID NO:2或42或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.106，特别是SEQ ID NO:3或43或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.107，特别是SEQ ID NO:4或44或与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.108，特别是SEQ ID NO:6或46或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.109，特别是SEQ ID NO:7或47或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.110，特别是SEQ ID NO:8或48或与其基本上同源的序列。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自下组的一个或多个CDR：SEQ IDNO:2,3,4,6,7,8,42,43,44,46,47和48或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列。
因此，在一些优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:2,3和4或与任一个前述SEQID NO基本上同源的序列中的两个或更多个重链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:2,3和4或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR。
因此，在一些优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:42,43和44或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的两个或更多个重链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:42,43和44或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR。
在另外或备选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:6,7和8或与任一个前述SEQ IDNO基本上同源的序列中的两个或更多个轻链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQID NO:6,7和8或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在另外或备选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:46,47和48或与任一个前述SEQID NO基本上同源的序列中的两个或更多个轻链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:46,47和48或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
因此，在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:2,3和4或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR和SEQ ID NO:6,7和8或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:42,43和44或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR和SEQ ID NO:6,7和8或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:2,3和4或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR和SEQ ID NO:46,47和48或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:42,43和44或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR和SEQ ID NO:46,47和48或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ IDNO:1或41或与其基本上同源的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或45或与其基本上同源的序列。
在一些实施方案中，抗体是单链片段变体(scFv)。因此，在一些方面，抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:9,49,50或51或与其基本上同源的序列。
虽然不希望受理论束缚，但假设上述部分(a)中定义的抗体能够结合CLEC14A的C型凝集素域中的表位(CLEC14A的残基22-173)。(应当理解，不同的比对程序可以预测CLEC14A内域的备选定位。因此，C型凝集素域可以更特别地位于CLEC14A的残基22-175、CLEC14A的23-173或23-175、或32-173或32-175处，取决于使用的比对方式)。特别地，认为抗体在CLEC14A的残基22-96，例如32-96和/或残基109-175内结合表位。因此，在一些实施方案中，抗体不与CLEC14A的残基97-108结合。抗体是否结合这些表位或区域中的任一个可以使用本领域的标准技术评估，包括本文所述的结合测定，例如ELISA。
在优选的实施方案中，可以与上述部分(a)中定义的抗体竞争的抗体可以与上述部分(a)中定义的抗体结合基本上相同的表位。因此，在一些实施方案中，可以与上文部分(a)中定义的抗体竞争的抗体可以在CLEC14A的残基22-96，例如32-96和/或残基109-175，例如109-173内结合表位。值得注意的是，除非规定，本文讨论的氨基酸编号涉及人CLEC14A的氨基酸序列，如SEQ ID NO.52中所示。
在备选的实施方案中，本发明提供抗体，特别是分离的抗体，其选择性结合CLEC14A，其中所述抗体：
(a’)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28；或
(b’)是能够与抗体(a’)竞争结合CLEC14A的抗体。
因此，在一些实施方案中，抗体(a')具有SEQ ID NO:21的VH域和/或SEQ ID NO:25的VL域；或(b')是可以与抗体(a')竞争结合CLEC14A的抗体。例如，抗体可以包含至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或与其基本上同源的序列。
在一些实施方案中，本发明的抗体包含选自SEQ ID NO:22,23,24,26,27和28或与前述SEQ ID NO中任一个基本同源的序列的一个或多个CDR。
在一些优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:22,23和24或与任一个前述SEQID NO基本上同源的序列中的两个或更多个重链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:22,23和24或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个重链CDR。
在另外或备选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26,27和28或与任一个前述SEQID NO基本上同源的序列中的两个或更多个轻链CDR。在特别优选的实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:26,27和28或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
因此，在一些实施方案中，抗体包含SEQ ID NO:22,23和24或与任一个前述SEQ IDNO基本上同源的序列中的三个重链CDR和SEQ ID NO:26,27和28或与任一个前述SEQ ID NO基本上同源的序列中的三个轻链CDR。
在一些实施方案中，抗体包含重链和/或轻链，所述重链包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其基本同源的序列，所述轻链包含SEQ ID NO:25或与其基本同源的序列。
在一些实施方案中，抗体是单链片段变体(scFv)。因此，在一些方面，抗体包含氨基酸序列SEQ ID NO:29或与其基本同源的序列。
虽然不希望受理论束缚，但假设上文部分(a')中定义的抗体不结合CLEC14A的C型凝集素域中的表位(例如CLEC14A的残基22-173)。特别地，认为抗体可以结合CLEC14A的sushi样区域(残基174-244)内的表位，该表位接近C型凝集素，例如，在残基174-210、174-200、174-190内。
在优选的实施方案中，可以与上述部分(a')中定义的抗体竞争的抗体可以与上文部分(a')中定义的抗体结合基本上相同的表位。因此，在一些实施方案中，可以与上文部分(a')中定义的抗体竞争的抗体可以结合CLEC14A的C-型凝集素域和sushi样域之间的区域内的表位。可以使用本领域的标准技术，包括本文所述的结合测定如ELISA评估抗体是否结合这些表位或区域中的任一个。
如本文所用，术语“竞争性抗体”是指与“参考抗体”结合大致相同、基本上或实质上相同或甚至相同的表位的抗体。“竞争型抗体”包括具有重叠表位特异性的抗体。因此，竞争性抗体能够有效地与参考抗体竞争结合CLEC14A。优选地，竞争性抗体可以与参考抗体结合相同的表位。或者，竞争性抗体优选具有与参照抗体相同的表位特异性。
如本文所用，“参考抗体”是可以结合CLEC14A的表位(例如CLEC14A的胞外域，优选人CLEC14A)，并且具有如本文所定义的一个或多个CDR序列，优选如本文所定义的VH和VL域的抗体。
鉴于提供本发明的抗体，即参考抗体(CRT-2和CRT-3)，鉴定一种或多种竞争性抗体是直接的技术问题。由于与参考抗体比较确定竞争性抗体的鉴定，应当理解，不以任何方式需要实际上确定抗体中任一种或两者结合的表位以鉴定竞争性抗体。然而，若期望的化，可以使用标准技术进行表位定位。
举例来说，本文提及用于鉴定和定义表位的以下方法。CLEC14A的氨基酸序列是已知的，因此合成肽可以用于表位定位，例如，使用Pepscan测定。定点诱变也是表位定位中的有力工具，并且可以用于评估单个氨基酸在免疫复合物形成中的作用。蛋白质足迹法依赖于当作为抗体-抗原复合物结合时表位被保护免于切割的事实。酶联免疫吸附测定(ELISA)和血凝集和狭缝印迹法也可用于表位定位。抗原与抗体的结晶可用于定位非线性表位。用于实施此类方法的方案是广泛可用的，并且技术人员将了解表位定位的合适备选方法。
竞争抗体的鉴定可以使用多种免疫学筛选测定中的任一种容易地确定，其中可以评估抗体竞争。所有此类测定都是本领域常规的，并且美国专利No.6,342,219,6,524,583,7,056,509,6,887,468,6,342,221,6,676,941,6,703,020和6,416,758的每个都通过引用明确地并入本文，用于补充关于如何鉴定竞争性抗体的本教导的目的。
例如，在待检测的测试抗体从不同来源动物获得或甚至是不同同种型的情况下，可以使用简单的竞争测定法，其中将参照和测试抗体混合(或预吸附)并应用于含CLEC14A的组合物，优选表达CLEC14A的细胞，展示CLEC14A的噬菌体，或含有固定化CLEC14A的生物芯片。基于ELISA的方案特别适用于此类简单的竞争研究。
在某些实施方案中，可以将参考抗体(例如如本文定义的CRT2或CRT3)与不同量的测试抗体(例如，1:10、1:100或1:1000)预混合一段时间，之后应用于抗原组合物。在其他实施方案中，可以在暴露于抗原组合物期间简单地混合参考和不同量的测试抗体。在任何情况下，通过使用物种或同种型二抗，将仅能够检测结合的参照抗体，其结合将通过“竞争”结合的测试抗体的存在而降低。
在进行参考抗体和任何测试抗体(不论种类或同种型)之间的抗体竞争研究中，可以首先用可检测标记物(诸如例如生物素或酶或放射性标记物)标记参照(例如CRT-2或CRT-3)，以实现随后鉴定。在这些情况下，可以以不同比率(例如，1:10、1:100或1:1000)将标记的参考抗体与待检测的测试抗体预混合或温育，并且(任选地在合适的一段时间后)，然后测定标记的参考抗体的反应性，并且将这与温育中不包括潜在竞争性测试抗体的对照值进行比较。
该测定可以是基于抗体结合的一系列免疫测定中的任何一种，并且参考抗体可以通过检测其标记物来检测，例如，在生物素化抗体的情况下使用链霉抗生物素蛋白或通过使用与酶标记物结合的生色底物(如3,3'5,5'四甲基联苯胺(TMB)底物与过氧化物酶)或简单地检测放射性标记物。与参考抗体竞争结合CLEC14A的抗体将能够有效或显著地降低参考抗体与CLEC14A的结合，如结合标记物的减少所证明的。
在完全无关抗体存在下(标记的)参照抗体的反应性将是对照高数值。当发生竞争时，通过将标记的参考(例如，CRT-2或CRT-3)抗体与完全相同类型的未标记抗体一起温育，并降低标记抗体的结合来获得对照低数值。在测试测定中，在测试抗体存在下标记的抗体反应性的显著降低指示测试抗体与标记的抗体“竞争”结合CLEC14A。
显著降低是“可再现的”，即一致观察到的结合减少。就本申请而言，“显著降低”定义为在约1:10和约1:100之间的任何比率至少约20％，更优选至少约25,30,35,40,45,50,55,60或65％，甚至更优选至少约70％，约75％或约80％的(ELISA中参考抗体与CLEC14A的结合)可再现的降低。具有甚至更严格的竞争活性的抗体将表现出约1:10至约1:100之间的任何比率的至少约82％，约85％，约88％，约90％，约92％或约95％等的(ELISA或其他合适的测定中参照抗体与CLEC14A的结合)可再现的降低。当然不排除完全或接近完全的竞争，例如表现出参考抗体与CLEC14A结合的可再现降低约99％，约98％，约97％或约96％等，尽管实施本发明绝不需要。
上述方法仅是合适的竞争测定的一个实例。技术人员将了解其他合适的方法和变化。下文描述了另一种竞争测定。
在使用流式细胞术进行备选竞争测定之前，应当标记一些量的测试抗体，例如，通过生物素化。测定生物素化产物的功能性(保留细胞结合特性)和本发明的生物素化抗体(Ab1)的最小浓度，其给出针对固定数目的CLEC14A+细胞的亚最大结合。从指数生长的培养物中收获总共106个细胞，并在合适的温度下与各种抗体浓度一起温育合适的时间，例如，在4℃下1小时。将细胞清洗并与合适的检测抗体一起在合适的温度下培养合适的时间段，例如在4℃下再1小时。清洗后，通过流式细胞术分析细胞。对于每种测试抗体，通过针对抗体浓度绘制中值荧光强度(MFI)从数据产生饱和曲线。
对于备选竞争测定，可以如上制备CLEC14A+细胞，并用固定浓度的标记(生物素化)抗体(bio-Ab1)和递增浓度的未标记竞争性抗体的混合物一式两份处理。固定浓度是抗体的最小浓度，其产生针对如上确定的固定数目的肿瘤细胞的合理荧光信号。理想地，以nM计的该固定浓度应低于处理的抗体在平衡时的亲和力(Kd)。在此种情况下，所描述的方法可以用于估计竞争性抗体的亲和力。将抗体混合物与靶细胞一起在合适的温度下温育合适的时间段，例如，在4℃下1小时。清洗细胞，并且通过与FITC标记的链霉抗生物素蛋白温育揭示生物素化抗体的细胞结合。从每个测试样品(bio-Ab1+Ab2)的中值荧光读数中减去背景荧光(PBS-5％FCS)后，根据下式计算每个Ab2浓度“c”的抑制百分比：
％抑制＝(1-MFI bio-Ab1+Ab2”c”/MFI bio-Ab1)x 100
如上所述，竞争抗体可以包含一个或多个与本文公开的CDR氨基酸序列基本同源的CDR。关于CDR序列，术语“基本上同源的”意指相对于本文公开的CDR序列具有1,2,3或4个取代，缺失或添加的序列，优选1,2,3或4个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述取代可以是保守或非保守氨基酸取代，或其混合物。
因此，在一些实施方案中，基本上同源的序列可以是在本文公开的一个或多个CDR区中含有多达1,2或3个，优选多达1个或2个改变的氨基酸的序列。在一些优选的实施方案中，所述氨基酸取代是保守氨基酸取代。
在所有实施方案中，含有基本上同源序列的抗体保留结合CLEC14A的能力。
本发明的优选抗体包含至少一个包含三个CDR的重链可变区和至少一个包含三个CDR的轻链可变区。本文描述了这些CDR的示例性和优选序列。
如本文所用，除非另有具体说明或从科学术语清楚明确，否则简洁术语“CLEC14A”是指C型凝集素域家族成员14A(也称为表皮生长因子受体5(EGFR5))。
CLEC14A可以是游离的CLEC14A，例如重组或纯化的CLEC14A，但优选它以天然形式存在，例如在细胞表面上。
本发明的抗体还可以结合CLEC14A的片段，特别是包含胞外域或由胞外域组成的片段，或者可以结合包含CLEC14A或CLEC14A片段的实体。实际上，如上所述，认为本发明抗体的表位位于CLEC14A的胞外区中。
“CLEC14A”也可以指任何形式的CLEC14A，特别是因为CLEC14A在哺乳动物物种中是保守的。因此，本发明的抗体或抗体片段可以与人，猴(例如食蟹猴)，母牛(牛)，小鼠，大鼠，仓鼠，雪貂，豚鼠和/或兔CLEC14A结合。优选地，本发明的抗体或抗体片段至少与人CLEC14A结合。因此，除非另有说明，否则本文对“CLEC14A”的任何提及可以解读指“人CLEC14A”。在某些优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段将至少与人和猴(例如食蟹猴)CLEC14A结合。在其他优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段将至少与人和小鼠CLEC14A结合。在其他优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段将至少与人，猴和小鼠CLEC14A结合。在其他优选的实施方案中，本发明的抗体或抗体片段至少与人，猴，豚鼠和小鼠CLEC14A结合。
如本文所用，在本发明的抗体或抗体片段的上下文中，术语“与CLEC14A结合/结合CLEC14A”或“抗CLEC14A”是指能够具有下列一种或多种的抗体或抗体片段；优选地，下列超过一种；最优选地，满足所有下列各项：
(a)与细胞表面上表达的CLEC14A结合，例如，通过流式细胞术或免疫组织化学评估；
(b)与构象依赖性(例如非线性)CLEC14A表位结合，例如，通过在非还原条件下在Western印迹中与CLEC14A结合来评估；
(c)结合固体支持物上的游离CLEC14A；例如重组表达的CLEC14A，例如，通过ELISA测定或BIAcore测定评估；和/或
(d)至少结合人CLEC14A，更优选人和猴CLEC14A或人和小鼠CLEC14A，最优选人，猴和小鼠CLEC14A结合。
本发明的优选抗体或抗体片段在对患有肿瘤的动物施用后也可以能够定位于肿瘤。
在与CLEC14A+细胞结合的背景下，应当理解本发明的抗体与CLEC14A+细胞结合并且不与CLEC14A-细胞显著结合。
应当理解术语“不与CLEC14A-细胞显著结合”，使得抗体与CLEC14A-细胞的任何结合不禁止将所述抗体用于治疗或诊断目的。因此，通过与CLEC14A-细胞的“不显著”结合意指抗体与CLEC14A-细胞的结合弱于其与一种或多种CLEC14A+细胞的结合。因此，可以发生与正常细胞的一些交叉反应，但是此种结合水平可以认为是“背景”结合。出于治疗或诊断目的，主要考虑因素是抗体必须与一种或多种类型的CLEC14A+细胞结合比与在治疗或诊断应用期间可以与抗体接触的任何CLEC14A-细胞结合更强。
本发明的抗体可以称为“CLEC14A特异性的”。术语“CLEC14A特异性的”应当解释为使得抗体与表达CLEC14A的细胞的结合足够特异以允许将所述抗体用于治疗或诊断目的。通过比较与靶CLEC14A+细胞的结合强度与对一种或多种类型的CLEC14A-细胞，例如野生型(即未用CLEC14A转化)HUVEC细胞或HEK293T细胞的结合强度，技术人员可以容易地确定任何给定的抗体是否是CLEC14A特异性的。
技术人员将了解与CLEC14A-细胞相比与CLEC14A+细胞的结合可以通过本领域已知的任何合适的手段评估，例如使用流式细胞术。类似地，可以使用已知方法测定物种交叉反应性。
其它优选的性质包括当施用本发明的抗体时体内显著毒性的缺乏和体内显著的其他副作用的缺乏。
“CLEC14A+细胞”是指在其表面上表达CLEC14A，优选至少基本上以其野生型构象表达的细胞。CLEC14A+细胞对CLEC14A可以是天然阳性的，或者它们可以是表达重组CLEC14A的转化体。
如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”广泛地指任何包含抗原结合域的免疫结合剂或分子，包括多克隆和单克隆抗体。取决于重链中恒定域的类型，将完整抗体分配至五种主要类别之一：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且本发明的抗体可以是这些类别中的任何一种。这些中的几种进一步分为亚类或同种型，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4等。对应于免疫球蛋白的不同类别的重链恒定域分别称为α，δ，ε，γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的。
通常，在本发明中使用完整抗体而不是抗原结合区(即抗体片段)的情况下，优选IgG和/或IgM，因为它们是生理情况中最常见的抗体，并且因为它们最容易在实验室环境中制备。IgG1抗体是特别优选的。
哺乳动物抗体的“轻链”基于它们的恒定域的氨基酸序列和它们可变域的框架区中的一些氨基酸被分配为两种明显不同的类型之一：kappa(κ)和lambda(λ)。在本发明的抗体中基本上对使用κ或λ轻链恒定区没有优先。
如本领域技术人员所理解的，术语“抗体”所涵盖的免疫结合试剂延伸至所有抗体及其抗原结合片段，包括完整抗体，二聚体，三聚体和多聚体抗体；双特异性抗体；嵌合抗体；重组和工程化抗体及其片段。
因此，术语“抗体”用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，该术语包括包含抗原结合域的抗体片段，例如Fab'，Fab，F(ab')2，单域抗体(DABs)，TandAbs二聚体，Fv，scFv(单链Fv)，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，微型抗体，双抗体，双特异性抗体片段，二体(bibody)，三体(tribody)(scFv-Fab融合物，分别为双特异性或三特异性)；sc-双抗体；kappa(lambda)体(scFv-CL融合物)；双特异性T细胞结合剂(BiTE)(scFv-scFv串联以吸引T细胞)；双重可变域(DVD)-Ig(双特异性形式)；小免疫蛋白(SIP)(微型抗体种类)；SMIP(“小模块免疫药物”scFv-Fc二聚体；DART(ds-稳定的双抗体“Dual Affinity ReTargeting”)；包含一个或多个CDR等的小抗体模拟物。
用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的(参见Kabat et al.,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,647-669,1991，特别通过引用并入本文)。特别地，双抗体进一步描述于WO93/11161；而线性抗体进一步描述于Zapata et al.(Protein Eng.,8(10):1057-1062,1995)。
可以使用常规技术将抗体片段化。例如，通过用胃蛋白酶处理抗体可以产生F(ab')2片段。可以处理所得的F(ab')2片段以还原二硫键以产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可导致Fab片段的形成。也可以通过重组技术合成或可以化学合成Fab，Fab'和F(ab')2，scFv，Fv，dsFv，Fd，dAb，TandAb，ds-scFv，二聚体，微型抗体，双抗体，双特异性抗体片段和其他片段。产生抗体片段的技术是本领域公知的并且已有描述。
可以天然产生或可以全部或部分合成产生抗体或抗体片段。因此，抗体可以来自任何合适的来源，例如重组来源和/或在转基因动物或转基因植物中产生，或使用IgY技术在蛋中产生。因此，可以在体外或体内产生抗体分子。
优选地，抗体或抗体片段包含含有三个CDR域的抗体轻链可变区(VL)和包含三个CDR域的抗体重链可变区(VH)。所述VL和VH通常形成抗原结合位点。
“Fv”片段是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该区域具有紧密的非共价结合的一条重链和一条轻链的二聚体。在该构造中，每个可变域的三个高变区(CDR)相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定抗原结合位点。六个高变区(CDR)共同赋予抗体以抗原结合特异性。
然而，本领域充分记载，来自轻链可变区的三个CDR和来自抗体的重链可变区的三个CDR的存在对于抗原结合不是必需的。因此，已知小于上述经典抗体片段的构建体是有效的。
例如，骆驼科(camelid)抗体具有广泛的抗原结合全集，但没有轻链。此外，用包含单独的VH域或单独的VL域的单域抗体的结果显示这些域可以以可接受的高亲和力结合抗原。因此，三个CDR可以有效结合抗原。此外，还已知单个CDR或两个CDR可以有效地结合抗原。
值得注意的是，已知两个CDR可以有效地结合抗原，甚至赋予比亲本抗体拥有的特性优越的特性。例如，已显示来自亲本抗体的两个CDR(VH CDR1和VL CDR3区)可以保留亲本分子的抗原识别特性，但具有优异的穿透肿瘤的能力。将这些CDR域与合适的接头序列(例如，来自VH FR2)连接，以类似于天然亲本抗体的方式定向CDR，产生甚至更好的抗原识别。因此，本领域已知可以构建抗原结合抗体模拟物，其包含两个CDR域(优选来自VH域的一个和来自VL域的一个，更优选地，两个CDR域中的一个是CDR3域)，它们依靠适当的框架区定向以维持在亲本抗体中发现的构象。
因此，尽管本发明的优选抗体可以包含六个CDR区(来自轻链的三个和来自重链的三个)，但本发明包括具有少于六个CDR区和少至一个或两个CDR区的抗体。此外，还涵盖具有仅来自重链或轻链的CDR的抗体。在这方面，本发明进一步提供了选择性结合CLEC14A的抗体，其包含下列至少一种：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44或与其基本上同源的序列；和/或
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或46或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或47或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或48或与其基本上同源的序列。
进一步提供了抗体，其选择性结合CLEC14A并且包含下列至少一种：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其基本上同源的序列；和/或
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或与其基本上同源的序列。
结合CLEC14A的本发明的优选抗体包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，其中所述重链可变区包含：
(a)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42或与其基本上同源的序列,
(b)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43或与其基本上同源的序列，和
(c)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44或与其基本上同源的序列；或
(d)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其基本上同源的序列，
(e)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其基本上同源的序列，和
(f)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其基本上同源的序列。
与规定的重链CDR区结合使用的优选轻链CDR区在本文别处描述。然而，也涵盖包含三个CDR的其他轻链可变区以与本发明的重链可变区结合使用。本领域技术人员可以容易地鉴定可以与本发明的重链可变区组合使用并产生结合CLEC14A的抗体的合适的轻链可变区。
例如，本发明的重链可变区可以与单个轻链可变区或轻链可变区全集组合，并测试所得抗体与CLEC14A的结合。可以预期本发明的重链可变区与不同轻链可变区的合理数目的这种组合将保留结合CLEC14A的能力。
类似的方法可用于鉴定备选的重链可变区，以与本发明的优选轻链可变区组合使用。
在某些实施方案中，抗体或抗体片段包含重链恒定区的全部或部分，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE，IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或其部分。此外，抗体或抗体片段可以包含整个或部分的kappa轻链恒定区或lambda轻链恒定区或其部分。整个或部分的此类恒定区可以天然产生，或者可以是全部或部分合成的。用于此类恒定区的适当序列是本领域公知的并且在本领域中有记载。当来自重链和轻链的恒定区的完全互补物包括在本发明的抗体中时，此类抗体在本文中通常称为“全长”抗体或“完整”抗体。
含有Fc区的抗体对于某些用途是优选的，特别是体内治疗用途。
在优选的实施方案中，本发明的抗体是单克隆抗体，其可以是人源化的或人单克隆抗体。在这方面，人或人源化抗体通常具有至少三种用于人治疗的潜在优势。第一，人体免疫系统不应当将抗体识别为外来的。第二，人循环中的半衰期与天然存在的人抗体相似，允许给予更小且更少频率的剂量。第三，由于效应器部分是人的，它将与人免疫系统的其他部分更好地相互作用。
因此，实施例中公开的特异性抗体可以以已知方式“人源化”，例如通过将所述小鼠抗体的CDR区插入人抗体的框架中。可以使用Verhoeyenet al(1988)Science,239,1534-1536和Kettleboroughet al,(1991)Protein Engineering,l4(7),773-783中描述的技术和方法制备人源化抗体。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基被相应的非人残基取代。通常，人源化抗体将含有可变区，其中所有或大部分CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，和框架区基本上或完全是人免疫球蛋白共有序列的那些。
可以使用重组技术产生完全人抗体。通常使用包含数十亿种不同抗体的大型文库。与采用例如鼠抗体的嵌合化或人源化的先前技术相反，这种技术不依赖于动物的免疫来产生特异性抗体。相反，重组文库包含大量预制备抗体变体，其中文库可能具有至少一种对任何抗原特异的抗体。因此，在本发明的上下文中，可以使用此类文库鉴定具有期望结合特征的竞争性抗体。为了以有效的方式在文库中找到良好的结合剂，已经设计了各种系统，其中表型即抗体或抗体片段与其基因型，即编码基因连锁。最常用的此类系统是所谓的噬菌体展示系统，其中将抗体片段表达，在丝状噬菌体颗粒表面上以具有噬菌体壳体蛋白的融合物展示，同时携带编码所展示分子的遗传信息(McCafferty et al,1990,Nature 348:552-554)。可以通过与所讨论的抗原的结合来选择展示对特定抗原特异的抗体片段的噬菌体。然后可以扩增分离的噬菌体，并且可以任选地将编码所选抗体变体的基因转移至其他抗体形式，例如，全长免疫球蛋白，并使用本领域公知的合适载体和宿主细胞大量表达。或者，“人”抗体可以通过免疫基本上含有人免疫球蛋白基因的转基因小鼠来制备(Vaughanet al(1998)Nature Biotechnol.16,535-539)。
本发明的“人”和“人源化”抗体可以包括不由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或定点突变引入的突变，例如通过体外克隆或PCR引入的突变。此类突变的具体实例是在抗体的少量残基中涉及保守取代或其他突变(非保守取代，添加和/或缺失)的突变，例如，在抗体的高达5,4,3,2或1个残基中，优选例如在构成抗体的一个或多个CDR的多达5，4，3，2或1个残基中。此类“人”和“人源化”抗体的某些实例包括已经经历标准修饰技术以减少潜在免疫原性位点的量的抗体和可变区。
因此，本发明的“人”和“人源化”抗体包括源自人中发现的序列并与其相关，但在体内可以不天然存在于人抗体种系全集中的序列。此外，本发明的人和人源化抗体包括含有从人序列鉴定的人共有序列，或与人序列基本同源的序列的蛋白质。
另外，本发明的人和人源化抗体不限于本身在人抗体分子中组合发现的VH，VL，CDR或FR区的组合。因此，本发明的人和人源化抗体可以包括或对应于不一定在人中天然存在的此类区域的组合。
在一些实施方案中，人抗体可以是完全人抗体。如本文所用，“完全人”抗体是包含如上定义的“人”可变区和/或CDR，没有实质性非人抗体序列或没有任何非人抗体序列的抗体。例如，包含人可变区域和/或CDR，“没有实质性非人抗体序列”的抗体是下述抗体、域和/或CDR，其中仅多达5,4,3,2或1个氨基酸是不由人抗体序列编码的氨基酸。因此，“完全人”抗体与“人源化”抗体可区分，所述人源化抗体基于基本上非人的可变区域，例如小鼠可变区域，其中某些氨基酸已被改变以更好地对应于通常存在于人抗体中的氨基酸。
本发明的“完全人”抗体可以是人可变区域和/或CDR，没有任何其他实质性抗体序列，例如是单链抗体。或者，本发明的“完全人”抗体可以是与一个或多个人抗体恒定区整合或可操作地连接的人可变区域和/或CDR。某些优选的完全人抗体是具有IgG恒定区的完整互补物的IgG抗体。
在其他实施方案中，本发明的“人”抗体是部分人嵌合抗体。如本文所用，“部分人嵌合”抗体是包含可操作地连接或移植到非人物种(例如大鼠或小鼠)的恒定区上的“人”可变区域和/或CDR的抗体。此类部分人嵌合抗体可用于例如临床前研究，其中恒定区优选为临床前测试中使用的相同动物种类的。这些部分人嵌合抗体也可用于例如离体诊断，其中非人物种的恒定区可为抗体检测提供额外的选择。
如本文所用，术语“片段”是指生物学相关的片段，例如，有助于抗原结合，例如形成抗原结合位点的一部分，和/或有助于抑制或降低CLEC14A抗原的功能或活性的片段。某些优选的片段包含本发明抗体的重链可变区(VH域)和/或轻链可变区(VL域)。其他优选的片段包含本发明抗体(或本发明的VH域)的一个或多个重链CDR，或本发明抗体(或本发明的VL域)的一个或多个轻链CDR。某些优选的片段长度为至少5个氨基酸并且包含至少一个CDR区，优选CDR3区，更优选重链CDR3区。
在本发明的抗体包含任何确定序列的片段(例如包含SEQ ID NO:1,5,21,25,41或45的片段)，例如是包含本发明的VH和/或VL域的抗体，或者是包含本发明的一个或多个CDR的抗体的实施方案中，则这些区域/域通常在抗体内分离，使得每个区域/域可以发挥其生物学功能，并且因此对抗原结合的贡献得到保留。因此，VH和VL域优选通过合适的支架序列/接头序列分开，并且CDR优选通过合适的框架区，例如在天然存在的抗体和/或有效的工程化抗体中发现的框架区分开。因此，本发明的VH，VL和单独的CDR序列优选在合适的框架或支架内提供或掺入其中以实现抗原结合。此类框架序列或区域可以对应于天然存在的框架区FR1，FR2，FR3和/或FR4，适当地形成合适的支架，或者可以对应于共有框架区，例如通过比较各种天然存在的框架区来鉴定。或者，可以使用非抗体支架或框架，例如T细胞受体框架。
可以用于框架区的适当序列是本领域公知和记载的，并且可以使用任何这些序列。框架区的优选序列是构成本发明的VH和/或VL域的一个或多个(即一个，两个，三个或四个)构架区，即SEQ ID NO:1,5,21,25,41或45内找到的一个或多个框架区或与其基本上同源的框架区，特别是允许维持抗原特异性的框架区，例如产生抗体的基本上相同或相同的3D结构的框架区。
在本发明抗体的框架区的背景下，术语“基本上同源的”包括与本文公开的氨基酸序列具有至少60％，65％，70％或75％，优选至少80％，甚至更优选至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性的序列。因此，本发明的基本同源序列包括对本发明的序列的单个或多个碱基或氨基酸改变(添加，取代，插入或缺失)。在氨基酸水平上，优选的基本上同源的序列在构成本发明序列的一个或多个框架区和/或一个或多个CDR中仅含有多达1,2,3,4或5个，优选多达1,2或3个，更优选多达1个或2个改变的氨基酸。所述改变可以用保守的或非保守的氨基酸，或其混合物。优选地，所述改变是保守氨基酸取代。
因此，例如，本发明的抗体可以包含抗原结合域，该抗原结合域包含具有SEQ IDNO.1所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和具有SEQID NO.5所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VL序列，优选条件是SEQ ID NO.2,3,4,6,7和8的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以包含抗原结合域，该抗原结合域包含具有SEQ ID NO.41所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO.45所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VL序列，优选条件是SEQ ID NO.42,43,44,46,47和48的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在其它实施方案中，本发明的抗体可以包含抗原结合域，该抗原结合域包含具有SEQ ID NO.21所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和具有SEQ ID NO.25所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VL序列，优选条件是SEQ ID NO.22,23,24,26,27和28的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在又一些实施方案中，本发明的抗体可以是scFv，该scFv包含具有SEQ ID NO.9所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选条件是SEQ ID NO.2,3,4,6,7和8的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是scFv，该scFv包含具有SEQ ID NO.49所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选条件是SEQ ID NO.42,43,44,6,7和8的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。在一些实施方案中，本发明的抗体可以是scFv，该scFv包含具有SEQ ID NO.50所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选条件是SEQ ID NO.2,3,4,46,47和48的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是scFv，该scFv包含具有SEQ ID NO.51所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选条件是SEQ ID NO.42,43,44,46,47和48的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
在其它实施方案中，本发明的抗体可以是scFv，该scFv包含具有SEQ ID NO.29所示氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列，优选条件是SEQ ID NO.22,23,24,26,27和28的CDR序列得到保留(即不修改或改变)。
因此，应当理解，在此类实施方案中，抗体的CDR序列得到保留或基本保留(即它们可以任选地在上文阐述的限制内修饰，例如1至4个氨基酸的取代，添加或缺失，使得抗体的结合特异性得到保留(例如未改变))。
术语“基本上同源的”还包括本发明的氨基酸的修饰或化学等同物，其以基本相同的方式与本发明的蛋白质或核酸分子进行基本相同的功能。例如，任何基本上同源的抗体(或编码它的基本上同源的核酸)应当保留如上所讨论的结合CLEC14A的能力。优选地，任何基本上同源的抗体应当保留抗体，例如如本文别处所定义的抗体的功能。优选地，任何基本上同源的抗体应当保留特异性结合如所讨论的抗体所识别的CLEC14A的相同表位，例如如本文中所述的本发明的CDR域或本发明的VH和VL域识别的相同表位的能力。通过本领域公知和描述的方法，例如使用结合测定，例如竞争测定，可以容易地测试与相同表位/抗原的结合。通过本领域公知和描述的方法也可以容易地测试其他功能特性的保留。
因此，本领域技术人员将理解，结合测定可以用于测试“基本上同源的”抗体是否具有与本发明的抗体和抗体片段相同的结合特异性，例如结合测定，例如ELISA测定或BIAcore可以容易用于建立此类“基本上同源的”抗体是否可以与CLEC14A结合。如上所概述，竞争结合测定法可以用于测试“基本上同源的”抗体是否保留特异性结合如本发明的抗体所识别的CLEC14A的基本上相同的表位的能力。
本发明蛋白质的基本上同源的序列包括但不限于保守氨基酸取代，或例如不影响抗体的VH，VL或CDR域的改变，例如包括使用不同接头序列的scFv抗体或添加不促成对抗原的结合的标签序列或其他组分的抗体，或者将一种类型或形式的抗体分子或片段转换为另一种类型或形式的抗体分子或片段的改变(例如，从Fab转换为scFv或反之亦然)，或抗体分子向抗体分子的特定类别或亚类的转化(例如，抗体分子向IgG或其亚类的转化，例如IgG1或IgG3)。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的氨基酸取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(如甘氨酸，半胱氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链(如，苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。
可以通过任何方便的方法评估同源性。然而，为了确定序列之间的同源性程度，进行序列多重比对的计算机程序是有用的，例如Clustal W。若期望的话，Clustal W算法可以与BLOSUM 62评分矩阵和缺口开放罚分10以及缺口延伸罚分0.1一起使用，从而在两个序列之间获得最高阶匹配，其中序列之一的总长度的至少50％参与比对。计算两个氨基酸序列之间的百分比同一性的其他方法通常是本领域公认的，包括例如ComputationalMolecular Biology,Lesk,e.d.Oxford University Press,New York,1988,Biocomputing:Informatics and Genomics Projects中描述的。
通常，可采用计算机程序进行此类计算。比较和比对序列对的程序，如ALIGN，FASTA，gapped BLAST，BLASTP，BLASTN或GCG也可用于此目的。此外，欧洲生物信息学研究所的Dali服务器提供基于结构的蛋白质序列比对。
通过提供参考点，具有70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％的同源性，序列同一性等的根据本发明的序列可以使用具有默认参数的ALIGN程序(例如，在因特网上在GENESTREAM网络服务器，IGH,Montpellier,France可获得)来确定。
此外，尽管本发明的优选抗体由本发明的VH，VL或CDR组成，但是应当注意本发明的抗体还涵盖本发明的一种或多种VH，VL或CDR与不为本发明的其他VH、VL、或CDR的组合，条件是仍然存在如本文概述的本发明抗体的CLEC14A结合特性或抗CLEC14A特性。
如本文所用，术语“重链互补决定区”(“重链CDR”)是指抗体分子的重链可变区(VH域)内的高变区。重链可变区具有三个CDR，从氨基末端到羧基末端称为重链CDR1，重链CDR2和重链CDR3。重链可变区还具有四个框架区(从氨基末端到羧基末端的FR1，FR2，FR3和FR4)。这些框架区域将CDR分开。
如本文所用，术语“重链可变区”(VH域)是指抗体分子的重链的可变区。
如本文所用，术语“轻链互补决定区”(“轻链CDR”)是指抗体分子的轻链可变区(VL域)内的高变区。轻链可变区具有三个CDR，称为氨基末端至羧基末端的轻链CDR1，轻链CDR2和轻链CDR3。轻链可变区还具有四个框架区(FR1，FR2，FR3和FR4，从氨基末端到羧基末端)。这些框架区域将CDR分开。
如本文所用，术语“轻链可变区”(VL域)是指抗体分子的轻链的可变区。
应当注意在必要时本文遵循Kabat命名法，以便定义CDR的定位(Kabat等，1991(同上)，特别地通过引用并入本文)。
在一些实施方案中，本发明的抗体(例如在IgG形式中)可以对CLEC14A具有高结合亲和力，即Kd在1x10-8M或1x10-9M或更低的范围内。重要的是，具有此类亲和力的抗体处于已经显示可用于疗法的建立范围内。优选地，本发明的抗体(例如在IgG形式中)对CLEC14A具有结合亲和力，其对应于小于30nM，20nM，15nM或10nM，更优选小于10,9.5,9,8.5,8,7.5,7,6.5,6,5.5,5,4.5,4,3.5,3,2.5,2,1.5或1nM，最优选小于0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2或0.1nMd。
可以使用任何适当的确定Kd的方法。然而，优选地，通过在体外针对各种浓度的抗原(CLEC14A)测试各种浓度的测试抗体来确定Kd，以建立饱和曲线，例如使用Lineweaver-Burk方法，或通过使用市售的结合模型软件，例如作为BIAcore 1000评估软件中的1:1结合模型。
关于Kd值的确定，技术人员将理解使用表达靶物(例如CLEC14A)的细胞的结合实验得到的表观Kd值不能被认为是亲和力的绝对指示，因为实验条件将影响表观结合亲和力。例如，CLEC14A的表达水平可以根据培养细胞的条件，以及不同细胞类型之间的差异而变化。因此，最好比较在一组实验中获得的表观Kd值，并且将一组实验中获得的Kd值与在不同实验组中获得的Kd值进行比较可能并不总是合适的，特别是若实验条件变化显著的话。
或者，可以通过进行细胞表面保留测定来确定CLEC14A阳性细胞表面上的解离速率和抗体半衰期(Adams et al.,1998,Br J Cancer 77:1405-12；Le Gall et al.,1999,FEBS Lett 453:164-8)。Le Gall方法允许更适当地模拟治疗条件下人患者的真实情况。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以结合人CLEC14A和猴CLEC14A两者。物种之间，特别是人和通常用作临床前动物模型的物种之间的此类交叉反应性可以是有利的，因为它允许从临床前研究到临床使用的更有效的转化。例如，使用与所用特定动物模型中存在的天然CLEC14A交叉反应的抗体意味着该模型中的结果更可能反映人患者的情况，从而允许更准确评估例如要进行的给药以及鉴定任何潜在相关或有问题的副作用的增加的可能性。
例如，本发明的抗体结合人CLEC14A和猴CLEC14A两者的能力意味着可以在临床前毒性研究中测试此类抗体以评估治疗的不良副作用并找到适当的耐受剂量。
此外，结合人CLEC14A和小鼠CLEC14A两者的能力意味着本发明的此类抗体在小鼠模型中显示的结果，例如，使用免疫感受态小鼠的小鼠同基因模型更可能代表人受试者中抗体的活性。其原因是可以结合人CLEC14A但不结合小鼠CLEC14A的抗体将结合小鼠模型中人肿瘤细胞表达的CLEC14A，但不能结合内源性鼠CLEC14A。这当然不同于人患者的情况，其中将存在由肿瘤表达的CLEC14A和内源性CLEC14A。
在优选的实施方案中，本发明的抗体以相似的亲和力，例如10nM或更低或5nM或更低，更优选3nM或更低或2nM或更低，最优选1nM或更低的Kd结合人和猴CLEC14A和/或结合人和小鼠CLEC14A。
“相似亲和力”还意指抗体对人CLEC14A和一种或多种其他感兴趣物种(例如猴或小鼠)的结合亲和力是相当的，例如，不超过20倍不同。更优选地，结合亲和力之间的差异小于15倍，更优选小于10倍，最优选小于5倍，4倍，3倍或2倍。
然而，在其他实施方案中，本发明的抗体可以不结合猴CLEC14A和/或它们可以不结合小鼠CLEC14A。
因此，根据本发明，可以制备一系列抗CLEC14A抗体并用于多种实施方案中，包括治疗本文别处讨论的任何疾病，特别是涉及不希望的或不需要的血管生成的疾病或状况，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
本领域技术人员将理解，本发明的蛋白质和多肽，例如轻和重CDR，轻链和重链可变区，抗体，抗体片段和免疫缀合物(下面更详细地描述)，可以是以本领域公知和描述的几种方法中的任何一种制备，但最优选使用重组方法制备。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的本发明的抗体或其部分或片段的核酸分子，或与其基本上同源的核酸分子。因此，在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子，包含一种或多种选自SEQ ID NO.12,13,14,16,17和18的序列，一种或多种选自SEQ ID NO.32,33,34,36,37和38的序列或一种或多种选自SEQ ID NO.55,56,57,59,60和61的序列(即编码上文描述的CDR)。在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子，其包含选自SEQ ID NO.11和15的序列或选自SEQ ID NO:31和35的序列或选自SEQ ID NO:54和58的序列(即编码上文描述的可变链)。在一些实施方案中，本发明提供了核酸分子，其包含选自SEQ ID NO:19,39,62,63和64的序列(即编码上文描述的scFv多肽)。
在一些实施方案中，编码本发明抗体的核酸分子可以与本文示例的核酸分子基本同源。因此，在一些实施方案中，核酸分子可以编码包含抗原结合域的多肽，所述抗原结合域包含如本文所述的VH序列，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO.11,31或54中所示的核苷酸序列或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列，优选条件是编码SEQ ID NO.2,3和4或22,23和24或42,43和44的CDR序列的核苷酸序列得到保留，例如，核苷酸序列包含SEQ IDNO:12,13和14或32,33和34或55,56和57。
因此，在一些实施方案中，核酸分子可以编码包含抗原结合域的多肽，所述抗原结合域包含如本文所述的VL序列，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO.15,35或58中所示的核苷酸序列或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列，优选条件是编码SEQ ID NO.6,7和8或26,27和28或46,47和48的CDR序列的核苷酸序列得到保留，例如，核苷酸序列包含SEQID NO:16,17和18或36,37和38或59,60和61。
在更进一步的实施方案中，核酸分子可以编码包含如本文所述的scFv的多肽，其中所述核酸分子包含SEQ ID NO.SEQ ID NO.19,39,49,50或51中所示的核苷酸序列或与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列，优选条件是编码SEQ ID NO.2,3,4,6,7和8或22,23,24,26,27和28,或42,43,44,6,7和8或2,3,4,46,47和48或42,43,44,46,47和48的CDR序列的核苷酸序列得到保留，例如，核苷酸序列包含SEQ ID NO:12,13,14,16,17和18或32,33,34,36,37和38或55,56,57,16,17和18或12,13,14,59,60和61或55,56,57,59,60和61。
因此，如本文所定义的本发明抗体的片段，或与其基本上同源的序列，或包含编码此类片段的序列的核酸分子形成本发明的又一方面。
编码本发明抗体的轻链和重链可变区的核酸片段可以通过任何合适的方法衍生或产生，例如通过克隆或合成。例如，可以通过从例如人种系基因克隆合适的序列，然后使用本领域公知和描述的方法对种系序列进行任何必要的修饰以获得本发明的序列来制备此类序列。备选且更有效的方法是合成适当的轻链或重链可变区序列作为重叠引物，并使用引物延伸来获得完整序列。然后可以用含有适当限制性位点的引物通过PCR扩增该完整序列，用于进一步克隆和操作，例如克隆到合适的表达载体中。每个可变区五至七个重叠引物通常是足够的，从而使该技术非常有效和精确。
一旦获得了编码本发明抗体的轻链和重链可变区的核酸片段，就可以通过标准重组DNA技术进一步操作这些片段，例如将可变区片段转化为具有适当恒定区域的全长抗体分子，或者本文中别处讨论的抗体片段的特定形式，例如Fab片段，scFv片段等。通常，或者作为此进一步操作程序的一部分，通常将编码本发明的抗体分子的核酸片段掺入合适的表达载体中以促进本发明的抗体的产生。
如本文所用，术语“核酸序列”或“核酸分子”是指由天然存在的碱基，糖和糖间(主链)连接构成的核苷或核苷酸单体的序列。该术语还包括含有非天然存在的单体或其部分的修饰或取代的序列。本发明的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶。序列还可含有修饰的碱基。此类修饰碱基的实例包括氮杂和去氮腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶；和黄嘌呤和次黄嘌呤。核酸分子可以是双链或单链的。核酸分子可以是完全或部分合成的或重组的。
如本文中与核酸序列结合使用，术语“基本上同源的”包括与所公开的核酸序列具有至少60％，65％，70％或75％，优选至少80％，甚至更优选至少85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列同一性的序列。因此，本发明的基本上同源的序列包括对本发明序列的单碱基或多碱基改变(添加，取代，插入或缺失)。
基本上同源的核酸序列还包括在至少中等严格的杂交条件下与公开的核酸序列(或其互补序列)杂交，例如，与编码本发明的一个或多个轻链或重链CDR、本发明的轻链或重链可变区、或本发明的抗体的核苷酸序列杂交(或与其互补序列杂交)的核苷酸序列。
“至少中等严格的杂交条件”是指选择促进溶液中两个互补核酸分子之间选择性杂交的条件。可以对核酸序列分子的全部或部分进行杂交。杂交部分的长度通常为至少15(例如，20,25,30,40或50)个核苷酸。本领域技术人员将认识到核酸双链体或杂合体的稳定性由Tm确定，其在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃–16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)–600/l)或类似的方程式)。因此，确定杂合体稳定性的清洗条件中的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似但不相同的分子，可以假设1％的错配导致Tm降低约1℃。例如，若寻求具有>95％同一性的核酸分子，则最终清洗温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择合适的杂交条件。在优选的实施方案中，选择严格的杂交条件。举例来说，可以采用以下条件来实现严格杂交：基于上式，在Tm-5℃在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt溶液/1.0％SDS下杂交，然后清洗在60℃0.2x SSC/0.1％SDS清洗。中等严格的杂交条件包括在42℃下在3x SSC中的清洗步骤。作为另一个实例，“杂交”的序列是在非严格条件下(例如，在室温下6x SSC，50％甲酰胺)结合(杂交)并在低严格性条件(例如，2x SSC，室温，更优选2xSSC，42℃)或更高严格性条件(例如，2x SSC,65℃)(其中SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH7.2)下清洗的那些序列。
然而，应当理解，可以使用备选的缓冲剂，盐和温度实现等效的严格性。关于杂交条件的其他指导可以参见：Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,1989,6.3.1–6.3.6和Sambrook et al.,Molecular Cloning,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第3卷。
一般而言，优选在高严格性条件下杂交的序列，但出于编码简并性而将在高严格性条件下杂交的序列亦然。
本发明还涵盖作为本文定义的核苷酸序列的简并变体的核苷酸序列。应当理解，由于遗传密码的简并性，多个核苷酸序列可以编码单个氨基酸序列。在这方面，此类简并序列构成本发明的一部分。与此相关，可以期望密码子优化本发明的核苷酸序列以在特定宿主生物或细胞中表达(例如用于在人或小鼠中表达)。这可以涉及修饰本发明的核苷酸序列，以便选择密码子(来自编码特定氨基酸的密码子)，其优先在特定的宿主细胞/生物体中表达。此类程序是本领域公知的，并且通常不改变编码的氨基酸序列。因此，本发明进一步涵盖了本发明核苷酸序列的密码子优化形式。特别地，本发明涵盖包含SEQ ID NO 101-104的密码子优化序列的多核苷酸序列。进一步涵盖SEQ ID NO:101-104的变体，其中所述变体与SEQ ID NO 101-104的序列具有至少60％的同一性，并编码能够结合CLEC14A的抗体或其部分。在这方面，SEQ ID NO 101和103是用于在人宿主或细胞中表达的密码子优化序列，并且SEQ ID NO 102和104是用于在鼠宿主或细胞中表达的密码子优化序列，其中SEQ ID NO101-104编码本发明的scFv。特别地，SEQ ID NO:101和102分别代表SEQ ID NO.19的人和鼠表达的密码子优化序列，并且SEQ ID NO 103和104分别代表SEQ ID NO.39的人和鼠表达的密码子优化序列。
本发明的抗体和核酸分子通常是“分离的”或“纯化的”分子，只要它们与可以原位存在于人或动物身体或源自人或动物身体的组织样品内的任何此类组分区分。然而，序列可以与如人或动物身体内发现的序列对应或基本上同源。因此，如本文中就核酸分子或序列和蛋白质或多肽(例如抗体)而言使用，术语“分离的”或“纯化的”是指当从其天然环境中分离、纯化或基本上脱离，例如，从人或动物身体分离或纯化(若它们确实是天然存在的)时的此类分子，或者指当通过技术方法产生时的此类分子，即包括重组和合成产生的分子。
因此，当与核酸分子结合使用时，此类术语可以指基本上不含与其天然相关的物质，例如其他核酸/基因或多肽的核酸。这些术语还可以指通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学品的核酸。分离的或纯化的核酸也可以基本上不含衍生出核酸的在核酸天然侧翼的序列(即，位于核酸的5'和3'端的序列)，或者已经例如通过例如遗传工程制备为在核酸侧翼的序列(例如，标签序列或其他没有治疗价值的序列)。
因此，当与蛋白质或多肽分子，诸如轻链CDR1,2和3，重链CDR1,2和3，轻链可变区，重链可变区和本发明的抗体(包括全长抗体)结合使用时，术语“分离的”或“纯化的”通常是指基本上不含来自其衍生来源的细胞材料或其他蛋白质的蛋白质。在一些实施方案中，特别是在将蛋白质施用于人或动物的情况下，此类分离或纯化的蛋白质基本上不含当通过重组技术产生时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品。此类分离或纯化的蛋白质也可以不含侧翼序列，如上文对分离的核酸分子所述的那些。
如上所提及，本发明人已经确定本发明抗体的抗原结合域，更特别是所述域的可变区(VL和VH链)，可以提供用于针对表达CLEC14A的细胞，特别是肿瘤细胞(例如肿瘤血管系统)的过继细胞转移疗法的有效CAR。
因此，本发明进一步提供了编码针对抗原CLEC14A的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的抗原CLEC14A，并且包含抗原结合域，所述抗原结合域包含：
(1)(a)VH CDR序列，其包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42；和/或
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44；和/或
(b)VL CDR序列，其包含：
(i)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或46；和/或
(ii)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或47；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或48；和/或
一种或多种与(a)或(b)中所示的SEQ ID NO基本同源的序列；或
(2)(a)VH CDR序列，其包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22；和/或
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24；和/或
(b)VL CDR序列，其包含：
(i)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和/或
(ii)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27；和/或
(iii)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28；和/或
一种或多种与(a)或(b)中所示的SEQ ID NO基本同源的序列。
在一些实施方案中，CAR包含多于一个CDR，例如，2,3,4,5或6个CDR。因此，在一些实施方案中，CAR可以包含含有一个，两个或三个CDR的VH序列和/或含有一个，两个或三个CDR的VL序列。因此，在一些实施方案中，本发明提供了编码针对抗原CLEC14A的CAR的核酸分子，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的抗原CLEC14A并且包含抗原结合域，所述抗原结合域包含各包含三个CDR序列的VH序列和VL序列，其中：
(1)所述VH序列包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44；和/或
其中所述VL序列包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或46；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或47；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或48；或
一种或多种与(1)(i)-(1)(vi)中所示的SEQ ID NO基本同源的序列；或
(2)所述VH序列包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24；和/或
其中所述VL序列包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28；或
一种或多种与(2)(i)-(2)(vi)中所示的SEQ ID NO基本同源的序列。
在优选的实施方案中，基本上同源的序列在所述CDR中具有1,2或3个氨基酸取代，添加或缺失。或者，可以任选地通过1至3个氨基酸的取代，添加或缺失来修饰一个或多个所述CDR序列。在特别优选的实施方案中，所述氨基酸取代是保守取代。
(1)中的CDR序列是或对应于SEQ ID NO.1和41的VH序列和SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.45的VL序列中含有的CDR序列。(2)中的CDR序列是或对应于SEQ ID NO.21的VH序列和SEQ ID NO.25的VL序列中含有的CDR序列。SEQ ID NO.1,41,5和45和SEQ ID NO.21和25分别代表上文描述的抗体的VH和VL区的氨基酸序列(SEQ ID NO.11,54,15和58以及SEQ IDNO:31和35代表编码所述氨基酸序列的核苷酸序列)。
在一个优选的实施方案中，CAR至少包含相应VH和VL序列，例如SEQ ID NO:4和8，SEQ ID NO:44和48或SEQ ID NO:24和28(优选未修饰的序列)的CDR3。在一个特别优选的实施方案中，CAR包含相应VH和VL序列的至少两个CDR，例如，SEQ ID NO:2,3和4中的至少两个(即至少2和3,2和4，或3和4)或SEQ ID NO:42,43和44中的至少两个(即至少42和第43,42和44或43和44)和SEQ ID NO:6,7和8中的至少两个(即至少6和7,6和8，或7和8)或SEQ ID NO:46,47和48中的至少两个(即至少46和47,46和48，或47和48)，或其组合，或SEQ ID NO:22,23和24中的至少两个(即至少22和23，22和24，或23和24)和SEQ ID NO:26,27和28中的至少两个(即至少26和27,26和28，或27和28)。优选地，所述至少两个CDR是未修饰的。在特别优选的实施方案中，CAR包含相应VH和VL序列的所有CDR，即SEQ ID NO:2-4和6-8，或42-44和46-48，或SEQ ID NO:22-24和26-28，优选地，其中所述CDR是未修饰的。
更具体地，当在免疫效应细胞表面上表达时，CAR能够指导免疫效应细胞针对表达CLEC14A的靶细胞。换言之，免疫细胞能够指导其作用或功能，例如，其针对所述靶细胞，特别是靶癌细胞，例如，血管中的内皮细胞，特别是肿瘤血管中的内皮细胞的细胞毒性活性。
如本领域已知的并且在本文别处描述，抗体的VL和VH链各自包含由框架区分开的3个CDR，所述框架区作用为CDR的支架。因此，本发明的CAR的VL和VH序列包含由框架区分开的本发明抗体的VL和VH序列的CDR序列。框架区可以是本发明抗体的VL和VH链的框架区，但不需要如此。因此，可以修饰抗体的VL和VH链的框架区，其包括它们可以被取代(因此框架区的氨基酸序列可以被修饰和/或取代)，例如，它们可以是人源化的，如本文别处所述。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了编码针对抗原CLEC14A的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的抗原CLEC14A并且包含抗原结合域，其包含SEQ ID NO.1或41或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH序列，和/或SEQ ID NO.5或45或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了编码针对抗原CLEC14A的嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的抗原CLEC14A并且包含抗原结合域，其包含SEQ ID NO.21或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和SEQ ID NO.25或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL序列。
在其他实施方案中，修饰VL和VH序列的框架区，并且CAR可以包含抗原结合域，所述抗原结合域包含具有如SEQ ID NO.1或41中所示的氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和/或具有如SEQ ID NO.5或45中所示的氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VL序列，优选条件是SEQ ID NOs.2,3,4,6,7和8和/或SEQ ID NOs.42,43,44,46,47和48的CDR序列得到保留(即不修饰或改变)。
在其他实施方案中，修饰VL和VH序列的框架区，并且CAR可以包含抗原结合域，所述抗原结合域包含具有如SEQ ID NO.21中所示的氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VH序列和/或具有如SEQ ID NO.25所示的氨基酸序列或与其具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的VL序列，优选条件是SEQ ID NOs.22,23,24,26,27和28的CDR序列得到保留(即不修饰或改变)。
因此，应当理解，在此类实施方案中，抗体的CDR序列得到保留或基本保留(即它们可以任选地在上文阐述的限制内修饰，例如1至3个氨基酸的取代，添加或缺失，使得保留(例如未改变)抗体的结合特异性)。
抗原结合域是胞外的(即当CAR在免疫效应细胞上表达时)。因此，CAR包含含有抗原结合域的胞外域，所述抗原结合域包含如上定义的基于抗体的VL和VH序列。如下文将更详细描述的，胞外域还可以包含信号序列，更特别是质膜靶向序列，尤其是基于VL链的质膜靶向序列。
可以使用本发明的核酸分子来制备针对表达CLEC14A的细胞的免疫效应细胞(更特别是经修饰的免疫效应细胞)。此类(经修饰的)免疫效应细胞在其细胞表面上表达CAR，并且能够识别或结合表达CLEC14A的靶细胞，例如血管中的内皮细胞，特别是肿瘤血管中的内皮细胞。因此，核酸分子使得表达所述CAR(即由核酸分子编码的CAR)的免疫效应细胞能够具有针对(例如杀死)表达CLEC14A的靶细胞的效应器活性(例如细胞毒性活性)。因此，经修饰的免疫效应细胞是遗传修饰的或工程化的免疫效应细胞，或者表达已经用本发明的核酸分子转导的免疫效应细胞。
在产生CLEC14A特异性免疫效应细胞的方法中，通过引入本发明的核酸分子修饰的免疫效应细胞可以从待治疗的受试者(例如患有肿瘤的受试者)获得。在修饰免疫效应细胞和任选地体外扩增后，可以对受试者再导入(即施用)表达CAR的经修饰的免疫效应细胞。因此，自体免疫效应细胞可以用于下面进一步讨论的本发明的治疗组合物、方法和用途。或者，可以使用异源(即供体或同种异体，或同基因或异种)免疫效应细胞。
免疫效应细胞可以是能够针对表达CLEC14A的靶细胞的免疫应答的任何免疫细胞。更具体地，免疫效应细胞能够消除、破坏或删除靶细胞，即减少或抑制靶细胞的存活力，优选杀死靶细胞(换言之，使靶细胞变得更少或不存活)。因此，免疫效应细胞优选是细胞毒性免疫效应细胞。
术语“细胞毒性”与“细胞溶解”同义，并且在本文中用于指能够通过靶细胞中的裂解或凋亡诱导细胞死亡的细胞。
如本文所用，术语“免疫效应细胞”不仅包括成熟或完全分化的免疫效应细胞，而且还包括其前体细胞(或祖细胞)，包括干细胞(更特别是造血干细胞，HSC)或源自HSC的细胞。因此，免疫效应细胞可以是T细胞，NK细胞，NKT细胞，嗜中性粒细胞，巨噬细胞，或源自造血组织，例如源自骨髓，脐带血或血液，例如动员的外周血的CD34+细胞群体内含有的源自HSC的细胞，其在对受试者施用后分化成成熟的免疫效应细胞。如下面将更详细描述的，在优选的实施方案中，免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。可以使用原代细胞，例如从待治疗的受试者或从供体受试者分离的细胞，任选地在具有居间的细胞培养步骤(例如以扩增细胞)或其他培养的细胞或细胞系(例如NK细胞系，例如NK92细胞系)的情况下。
术语“针对抗原CLEC14A”与“对CLEC14A特异性”或“抗CLEC14A”同义，即它仅仅意指CAR能够特异性结合CLEC14A。特别地，CAR的抗原结合域能够特异性结合CLEC14A(更特别地，当CAR在免疫效应细胞的表面上表达时)。特异性结合可以区别于非特异性结合非靶抗原(在此情况下是CLEC14A以外的抗原)。因此，表达根据本发明的CAR的免疫效应细胞被重定向以特异性结合表达CLEC14A的靶细胞并表现出对表达CLEC14A的靶细胞的细胞毒性(例如杀死)。或者，修饰免疫效应细胞以将细胞毒性重定向至表达CLEC14A的靶细胞。
在一个实施方案中，对CLEC14A的特异性结合可以意指抗原结合域(或包含抗原结合域的CAR)以大于或等于约105M-1，例如至少106M-1,107M-1,或108M-1的亲和力或Ka(即平衡结合常数)与CLEC14A(或更特别是在其细胞表面上表达CLEC14A的靶细胞)结合或缔合。
CAR的抗原结合域与靶细胞表面上的其靶抗原的结合对含有CAR的细胞递送激活刺激物，导致效应细胞信号传导途径的诱导。因此，与靶抗原的结合可以触发增殖，细胞因子产生，吞噬作用，裂解活性和/或产生可以以MHC非依赖性方式介导靶细胞的细胞死亡的分子。尽管包含含有仅来自CD3ζ或FcRγ的信号传导域的胞内域的CAR可以传递用于免疫细胞活化和效应器功能的有力信号，但是它们可能不足以在缺乏伴随的共刺激信号的情况下引发促进免疫效应细胞存活和扩增的信号。因此，可以优选CAR含有一种或多种共刺激信号传导域。
因此，本发明的CAR通常包含如下的3、4或优选5个域：
(1)能够特异性结合CLEC14A的抗原结合域，其包含基于或源自如上所定义的SEQID NO.1和5或41和45或21和25的VH和VL序列；
(2)任选地铰链域，其使抗原结合域远离免疫效应细胞的表面延伸；
(3)跨膜域，其将CAR锚定至效应细胞并将包含抗原结合域的胞外域与胞内信号传导域连接；
(4)包含信号传导域的胞内域；并且任选或优选地；
(5)一种或多种共刺激信号传导域。
CAR还可以包含(6)信号序列(即靶向域)，和特别地将CAR靶向免疫效应细胞的质膜的序列。这通常位于CAR分子/构建体末端的抗原结合域的旁边或附近，通常位于抗原结合域的上游。
因此可以看出，CAR可以包含通过任选的铰链域和跨膜域连接到包含一个或多个信号传导域的胞内域的包含抗原结合域和信号序列(若存在的话)的胞外域。在一个方面，胞内域或任选的铰链，跨膜和胞内域可以视为CAR构建体中的“信号传导尾”。因此，CAR构建体中域的顺序为N-末端至C-末端：胞外域-任选的铰链域-跨膜域-胞内域。在胞外和胞内域内，可以以任何顺序排列分开的域。然而，优选地，顺序是胞外域中的信号序列-抗原结合域。在一个实施方案中，在胞内域中，顺序可以是共刺激域-胞内信号传导域。在另一个实施方案中，该顺序可以是胞内信号传导域-共刺激域。
在本发明的CAR中，可以以各种形式提供源自本发明抗体的可变区序列的“抗原结合域”，只要其包含如上定义的VL和VH序列即可。因此，它可以是或可以对应于天然或合成的抗体序列。因此，本发明的核酸分子中的编码抗原结合域的核苷酸序列可以源自或可以对应于天然序列或可以编码遗传工程化产物。因此，抗原结合域可以是(或更确切地说可以对应于)包含可变区(抗体轻链和重链可变区；VL和VH区)的本发明抗体的片段，例如Fv或Fab或Fab2或轻链和重链可变区可以在单链中且以任一方向(例如VL-VH或VH-VL)连接在一起。如上所讨论，可以修饰VL和/或VH序列。特别地，可以修饰框架区(例如取代，例如使抗原结合域人源化)。
在一个优选的实施方案中，结合域是源自本发明抗体的单链抗体(scFv)，例如基于或源自SEQ ID NO.9,29,49,50或51。
在一个优选的实施方案中，VL和VH通过接头序列连接在一起。更确切地说，这可以称为“可变区接头序列”，其是下述氨基酸序列，所述氨基酸序列将重链可变区与轻链可变区连接，并提供与两个亚结合域的相互作用相容的间隔物功能，使得得到的多肽与包含相同轻链和重链可变区的抗体保持对同一靶分子的特异性结合亲和力。接头序列可以用于提供分子的适当间隔和构象。
因此，在一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO.5或45的VL序列或与其具有至少95％序列同一性的序列连接的SEQ ID NO.1或41的VH序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，优选以VL-VH的顺序连接。
在进一步的实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO.25的VL序列或与其具有至少95％序列同一性的序列连接的SEQ ID NO.21的VH序列或与其具有至少95％序列同一性的序列，优选以VL-VH的顺序连接。
在另一个实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO.5或45的VL序列或与其具有至少60％序列同一性的序列连接的SEQ ID NO.1或41的VH序列或与其具有至少60％序列同一性的序列，优选以VL-VH的顺序连接。如上所述，这服从下述条件：即保留如上所定义的CDR序列，并且优选条件是CDR序列未改变。
在进一步的实施方案中，scFv包含与SEQ ID NO.25的VL序列或与其具有至少60％序列同一性的序列连接的SEQ ID NO.21的VH序列或与其具有至少60％序列同一性的序列，优选以VL-VH的顺序连接。如上所述，这服从下述条件：即保留如上所定义的CDR序列，并且优选条件是CDR序列未改变。
更优选地，VL序列通过接头序列与VH连接。接头序列可以长1-30，更优选1-25,1-22或1-20个氨基酸。接头可以是柔性接头。合适的接头可以容易地选择，并且可以是任何合适的长度，例如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸，2个氨基酸至15个氨基酸，3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸，5个氨基酸至9个氨基酸，6个氨基酸至8个氨基酸，或7个氨基酸至8个氨基酸，并且可以是1,2,3,4,5,6或7个氨基酸或更长。
示例性的柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物，其中n是至少1的整数，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其他柔性接头。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可以能够充当融合蛋白如本文所述的CAR的域之间的中性系链。在代表性的实施方案中，接头序列可以是(G4S)3(SEQ ID NO.65)。
因此，在代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.9的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列按顺序包括SEQ ID NO.1的VH，SEQ ID NO.65的接头和SEQ ID NO.5的VL。
在另一个代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.49的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列按顺序包含SEQ ID NO.41的VH，SEQ ID NO.65的接头和SEQ ID NO.5的VL。
在另一个代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.50的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列按顺序包含SEQ ID NO:1的VH，SEQ ID NO.65的接头和SEQ ID NO.45的VL。
在另一个代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.51的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列按顺序包含SEQ ID NO.41的VH，SEQ ID NO.65的接头和SEQ ID NO.45的VL。
在代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.10的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列包含SEQ IDNO.1的VH和SEQ ID NO.5的VL。因此，本发明的核酸分子可以包含含有SEQ ID NO.20或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在另一个代表性实施方案中，本发明的核酸分子可以包含编码SEQ ID NO.30的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列。所述氨基酸序列包含SEQID NO.21的VH和SEQ ID NO.25的VL。因此，本发明的核酸分子可以包含含有SEQ ID NO.40或与其具有至少95％序列同一性的序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，VH和VL区可以由分别包含SEQ ID NO.11和15的核苷酸序列或与其具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，VH和VL区可以由分别包含SEQ ID NO.54和58的核苷酸序列或与其具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在一些实施方案中，VH和VL区可以由分别包含SEQ ID NO.31和35的核苷酸序列或与其具有至少95％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。
在另一个实施方案中，VH和VL区可以由分别包含SEQ ID NO.11和15或SEQ IDNO.54和58的核苷酸序列或与其具有至少60％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。如上文，这服从下述条件：保留如上文定义的由核苷酸序列编码的CDR序列，并且优选条件是CDR序列未改变。
在另一个实施方案中，VH和VL区可以由分别包含SEQ ID NO.31和35的核苷酸序列或与其具有至少60％核苷酸序列同一性的核苷酸序列的核苷酸序列编码。如上文，这服从下述条件：保留如上文定义的由核苷酸序列编码的CDR序列，并且优选条件是CDR序列未改变。
若期望的话，VL和VH序列可以通过修饰一个或多个框架区以对应于至少一个人框架区来人源化。“人框架区”是指人免疫球蛋白可变区的野生型(即，天然存在的)框架区，区域中氨基酸的小于约50％(例如，优选小于约45％，40％，30％，25％，20％，15％，10％，5％或1％)被缺失或取代(例如取代为相应位置处非人免疫球蛋白框架区的一个或多个氨基酸残基)的人免疫球蛋白可变区的改变的框架区，或区域中氨基酸的小于约50％(例如，小于约45％，40％，30％，25％，20％，15％，10％，或5％)被缺失或取代(例如在暴露残基的位置处和/或取代为相应位置处人免疫球蛋白框架区的一个或多个氨基酸残基)，从而在一方面降低免疫原性的非人免疫球蛋白可变区的改变的框架区。
因此，在一个具体实施方案中，可以修饰SEQ ID NO.1,21和41的VH序列和SEQ IDNO.5,25和45的VL序列的框架区(更具体地，可以修饰框架区的氨基酸序列)，同时保留或基本上保留CDR的氨基酸序列。
因此，在另一个实施方案中，CAR中VH序列的框架区与SEQ ID NO.1,21和41的框架区具有至少60％的氨基酸序列同一性和/或CAR中VL序列的框架区与SEQ ID NO.5,25和45的框架区具有至少60％的氨基酸序列同一性。
如上所述，CAR，更特别是其胞外区，也可以包含信号序列(或靶向域)。此类序列通常在分子(构建体)的N端提供，并且可以起到以共翻译或翻译后方式指导分子转移的功能。特别地，信号序列可以是将CAR靶向免疫效应细胞的质膜的序列。这可以直接或间接(例如通过接头序列)与抗原结合域连接，通常在抗原结合域的上游，在CAR分子/构建体的N端。接头序列可以是如上文与可变区接头结合所述的接头。在一个实施方案中，信号序列直接与抗原结合域的N端连接，例如，与VL序列的N端连接。
CAR的抗原结合域任选地随后是铰链域。CAR中的铰链区通常位于跨膜域和抗原结合域之间。在某些实施方案中，铰链区是免疫球蛋白铰链区，并且可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区，例如截短的铰链区。可以使用的其他示例性铰链区包括源自1型膜蛋白如CD8α，CD4，CD28和CD7的胞外区的铰链区，其可以是来自这些分子的野生型铰链区或可以被改变。优选地，铰链区是或源自人CD8α，CD4，CD28或CD7的铰链区。或者(并且可互换地)，铰链区域称为间隔物或间隔物区。
“改变的野生型铰链区”或“改变的铰链区”或“改变的间隔物”是指(a)具有高达30％氨基酸变化的野生型铰链区(例如高达25％，20％，15％，10％或5％氨基酸变化，例如取代或缺失)，(b)野生型铰链区的一部分，其长度为至少10个氨基酸(例如，至少12,13,14或15个氨基酸)，具有高达30％的氨基酸变化(例如，高达25％，20％，15％，10％或5％的氨基酸变化，例如取代或缺失)，或(c)野生型铰链区的一部分，其包含核心铰链区域(其长度可以是4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,或15,或至少4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,或15个氨基酸)。当改变的野生型铰链区插入本文所述的嵌合抗原受体中的CLEC14A特异性结合域和另一个区域(例如跨膜域)之间并连接它们时，它允许嵌合融合蛋白维持对CLEC14A的特异性结合。
在某些实施方案中，野生型免疫球蛋白铰链区中的一个或多个半胱氨酸残基可以被一个或多个其他氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)取代。或者/另外，改变的免疫球蛋白铰链区可以具有被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代的野生型免疫球蛋白铰链区的脯氨酸残基。
本领域中描述了包含CH2和CH3恒定区的铰链区，用于在CAR中使用(例如CH2CH3铰链，称为“Fc铰链”或“IgG铰链”，如以SEQ ID NO.72所示)。然而，优选的是，当铰链域基于或源自免疫球蛋白时，它不包含CH3域，例如它可以包含CH2域或其片段或部分或由CH2域或其片段或部分组成，不包括CH3。
在一个优选的实施方案中，铰链域具有或包含SEQ ID NO.66的氨基酸序列(其代表CD8α的铰链域)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方案中，铰链域具有或包含SEQ ID NO.67的氨基酸序列(其代表缩短的IgG铰链)或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。
铰链域可以通过接头序列附着到跨膜域，所述接头序列可以是如上定义的接头序列。示例性接头序列是KDPK(SEQ ID NO.68)。在SEQ ID NO.69中显示具有接头序列的缩短的IgG铰链。此类序列或与其具有至少95％序列同一性的序列可以包含在本发明的CAR中。更特别地，此类序列可以包括在胞外域(例如scFv部分)和跨膜域之间。
跨膜域可以基于或源自任何跨膜蛋白的跨膜域。通常，它可以是或可以源自来自CD8α,CD28,CD4,CD3ζ CD45,CD9,CD16,CD22,CD33,CD64,CD80,CD86,CD134,CD137,和CD154，优选人的所述蛋白质的跨膜域。在一个实施方案中，跨膜域可以是或可以源自来自CD8α，CD28，CD4或CD3ζ，优选来自人CD28，CD4或CD3ζ的跨膜域。在另一个实施方案中，跨膜域可以是合成的，在此情况下，它将包含主要疏水残基，例如亮氨酸和缬氨酸。
在一个优选的实施方案中，跨膜域是具有SEQ ID NO.70的氨基酸序列或者与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的CD8α跨膜域。此跨膜序列可以进一步附着于如SEQID NO.66所示或者与其具有至少95％序列同一性的序列的来自CD8α的铰链域。
在另一个实施方案中，跨膜域可以是具有SEQ ID NO.71的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的人CD28的跨膜域。
“胞内信号传导域”是指CAR蛋白的一部分，其参与将CAR与靶抗原的有效结合的信息转导到免疫效应细胞内部以引发效应细胞功能，例如活化，细胞因子产生，增殖和细胞毒性活性，包括向CAR结合的靶细胞释放细胞毒性因子，或用抗原与胞外CAR域的结合引起的其他细胞应答。术语“效应器功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应器功能可以是细胞溶解活性或包括细胞因子分泌的帮助或活性。因此，术语“胞内信号传导域”是指蛋白质的一部分，其转导效应器功能信号并指导细胞进行特化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导域，但在许多情况下，不必使用整个域。就使用胞内信号传导域的截短部分而言，可以使用此类截短的部分替换整个域，只要它转导效应器功能信号即可。术语胞内信号传导域意图包括足以转导效应功能信号的胞内信号传导域的任何截短部分。胞内信号传导域也称为“信号转导域”，并且通常源自人CD3ζ或FcRy链的部分。
另外，为了允许或增强免疫效应细胞的完全活化，可以向CAR提供二级或共刺激域。因此，胞内信号传导域可以启动抗原依赖性初级激活(即可以是初级胞质信号传导序列)，并且共刺激域可以以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号(次级胞质信号传导序列(S))。初级胞质信号传导序列可以调节初级激活，包括以抑制方式。以共刺激方式起作用的初次胞质信号传导序列可以含有信号传导基序，其称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
可以用于本发明的含有初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括源自TCRζ,FcRy,FcRβ,CD3γ,CD3δ,CD3ε,CD5,CD22,CD79a,CD79b和CD66d的那些。在某些特定实施方案中，胞内信号传导域源自CD3ζ或FcRγ，优选人CD3ζ或FcRγ。
在优选的代表性实施方案中，胞内信号传导域优选为人CD3ζ域，更优选为具有SEQID NO.73的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的人CD3ζ域。
术语“共刺激信号传导域”或“共刺激域”是指包含共刺激分子的胞内域的CAR部分。共刺激分子是除抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其提供第二信号，所述第二信号通常是结合抗原时免疫效应细胞(例如T细胞)的有效激活和功能需要的。此类共刺激分子的实例包括CD27,CD28,4-IBB(CD137),OX40(CD134),CD30,CD40,ICOS(CD278),LFA-1,CD2,CD7,LIGHT,NKD2C,B7-H2和特异性结合CD83的配体，更特别是此类分子的胞内域。然而，在一些实施方案中，共刺激分子提供第二信号，其在结合配体时阻止免疫效应细胞(例如T细胞)的刺激。例如，并且如下面更详细讨论的，提供包含超过一个CAR的免疫效应细胞可以是有用的，其中第二CAR能够结合非靶细胞，例如非肿瘤细胞上呈现的配体，使得若第二(或另外)CAR结合其配体，则其提供阻止免疫效应细胞刺激的负信号。此类共刺激分子的实例包括PD-1和CTLA4。优选地，分子是人的。因此，尽管示例性或优选的共刺激域源自4-1BB，CD28或OX40(CD134)，但涵盖与本文所述的CAR一起使用的其他共刺激域。共刺激域可以单独使用或组合使用(即可以包括一种或多种共刺激域)。包含一种或多种共刺激信号可以增强表达CAR的免疫效应细胞的功效和扩增。
胞内信号传导和共刺激信号传导域可以以任何顺序与跨膜域的羧基末端串联连接。
在一个优选的实施方案中，共刺激域是具有SEQ ID NO.74的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的4-1BB的胞内域。
在另一个实施方案中，共刺激域可以是或可以包含具有SEQ ID NO.75的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的人CD28的胞内域和/或具有SEQ IDNO.76的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的OX40(CD134)共刺激域。
在本发明的一个优选实施方案中，CAR(或更具体地，其“信号传导尾”)包含来自CD8α的任选铰链域或不包含CH3域的截短的IgG铰链域，CD8α跨膜域，4-1BB共刺激域和CD3ζ胞内信号传导域。
在其他实施方案中，CAR(或其“信号传导尾”)包含来自CD8α的任选铰链域或不包含CH3域的截短的IgG铰链域，CD28跨膜域，CD28胞内域和/或OX40共刺激域和CD3ζ胞内信号传导域。
此外，本发明的多核苷酸可以编码CAR，其包含1)来自CD28的跨膜和共刺激域以及来自CD3ζ的胞内信号传导域；2)来自CD8α的跨膜域，来自4-1BB的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；3)来自CD8α的跨膜域，来自OX40的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；4)来自CD28的跨膜域，来自CD28和4-1BB的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；5)来自CD28的跨膜域，来自CD28和OX40的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；6)来自CD8α的跨膜域，来自4-1BB和OX40的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；7)来自CD8α的跨膜域，来自CD28的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域；8)来自CD8α的跨膜域，来自CD28和4-1BB的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域或9)或来自CD8α的跨膜域，来自CD28和OX40的共刺激域和来自CD3ζ的胞内信号传导域。特别地，包含来自CD8α的跨膜域的任何一种构建体可以进一步包含铰链或间隔区，其也源自CD8α。
根据本发明的此类CAR可以包括如上定义的scFv抗原结合域，并且还可以包含位于scFv上游的质膜靶向序列。
因此，在某些代表性实施方案中，本发明的CAR除了如上定义的信号传导尾外还包含具有SEQ ID NO.9,19,49,50或51的序列或与其具有至少95％序列同一性的序列的胞外域。
因此，根据本发明的代表性CAR可以具有或包含SEQ ID NO.10或30的氨基酸序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸。
本发明的核酸分子可以包含SEQ ID NO.20或SEQ ID NO:40的核苷酸序列或与其具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。
本公开内容提供了CAR多肽及其片段。特别地，本发明提供了由如先前所定义的本发明核酸分子编码的CAR。术语“多肽”、“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸的聚合物，不限于任何特定长度。该术语不排除诸如十四烷基化，硫酸化，糖基化，磷酸化和信号序列的添加或缺失的修饰。术语“多肽”或“蛋白质”或“肽”是指一条或多条氨基酸链，其中每条链包含通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包含非共价和/或通过肽键共价连接在一起，具有天然蛋白质的序列(即由天然存在的和特别是非重组的细胞，或遗传工程或重组细胞产生的蛋白质)的多条链，并且包含具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖本公开内容的CAR，或具有如本文公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失，添加和/或取代的序列。
如从上文清楚的是，CAR的各种域可以包含相对于它们来源的分子的天然序列的一个或多个氨基酸序列修饰。例如，可以期望改善CAR的结合亲和力和/或其他生物学特性。例如，可以通过将合适的核苷酸变化引入编码CAR或其域的多核苷酸来制备CAR、或结合域、或其刺激信号传导域的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如CAR的氨基酸序列内的残基的缺失，和/或插入和/或取代。例如，可以进行缺失，插入和取代的任何组合以获得最终CAR，只要最终构建体拥有期望的特征，诸如结合域对CLEC14A特异性结合，或通过胞内信号传导域和/或共刺激域实现的增加的信号传导。氨基酸变化也可以改变CAR的翻译后过程，例如改变糖基化位点的数目或位置。上述任何变化和修改都可以包括在本发明的CAR中。
在具体的实施方案中，CAR的各种域(除VL和VH序列外)可以与它们来源的蛋白质的域的天然序列具有至少80％相同，至少85％，至少90％，至少95％相同，或至少98％或99％相同的氨基酸序列。因此，在特定实施方案中，域可以具有与SEQ ID NO.66-76中的任一个具有至少80,85,90,95,98或99％序列同一性的氨基酸序列。
本领域普通技术人员将理解，由于遗传密码的简并性，存在许多可以编码如本文所述的CAR的核苷酸序列。
可以将核酸分子作为mRNA或DNA导入宿主细胞，特别是免疫效应细胞中以在细胞中表达。可以使用载体来将核酸分子转移到细胞中或产生用于转移的核酸(例如以产生用于转移的mRNA，或以产生用于制备表达载体以转移到细胞中的核酸分子)。
因此，本发明的另一方面提供了包含如本文定义的本发明的核酸分子的载体。
载体可以是例如mRNA表达载体，克隆载体或用于转移到免疫细胞中的表达载体，例如病毒载体。
因此，本发明的另一方面提供了包含如本文定义的本发明的核酸分子或载体的病毒。
本发明的另一方面提供宿主细胞，特别是免疫效应细胞，其包含如本文定义的本发明的核酸分子或载体(或CAR)。
在优选的实施方案中，免疫效应细胞可以是T细胞或NK细胞。
还提供了产生宿主细胞，特别是CLEC14A特异性免疫效应细胞的方法，所述方法包括将如本文所定义的本发明的核酸分子或载体导入宿主细胞，特别是免疫效应细胞中。
此类方法可以包括在导入核酸分子或载体之前和/或之后刺激细胞并诱导其增殖。
可以将本发明的核酸分子和载体导入宿主细胞以产生本发明的抗体或CAR。因此，本发明的又一方面是产生本发明的抗体或CAR的方法，包括在表达所述抗体的条件下培养包含本发明的核酸分子或载体的宿主细胞，并回收如此产生的所述分子。
可以通过多种手段将载体或构建体(核酸分子)导入本发明的细胞中，包括化学转染剂(如磷酸钙，支化有机化合物，脂质体或阳离子聚合物)，电穿孔，细胞挤压，声孔效应，光学转染，流体动力学递送或病毒转导。在优选的实施方案中，通过病毒转导导入载体或构建体。这可以允许CAR的更持久的表达。但是，在某些情况下，例如在临床试验中，或在某些临床情况下，可以期望具有更短暂的CAR蛋白表达期。在此类情况下，可以期望将核酸分子作为mRNA递送至免疫效应细胞。用于产生mRNA的mRNA表达载体可以根据本领域已知的方法(例如使用Gateway Technology)制备并且是本领域已知的(例如pClpA102,-Larssenet al,2002,J.Immunol.Methods 259,p191-203和pCIpA120-G, et al,2011,PLoS ONE 6(11)e27930)。
可以体外产生mRNA，通过例如体外转录。然后，可以将mRNA导入免疫效应细胞，例如作为裸mRNA，例如通过电穿孔(例如如记载于Almasbak et al.,Cytotherapy 2011,13,629-640,Rabinovich et al.,Hum.Gene Ther.,2009,20,51-60和Beatty et al.,CancerImmunol.Res.2014,2,112-120)。或者，可以通过其他手段，例如通过脂质体或阳离子分子等导入mRNA。导入细胞中的异源核酸分子可以以附加体形式表达，或者可以在合适的基因座处整合到细胞的基因组中。
包括使本发明的免疫效应细胞(例如T细胞)在体内对阴性选择易感的基因区段在本发明的范围内。“阴性选择”是指可以由于个体的体内状况的改变而消除输注细胞。阴性选择表型可以由基因(例如所谓的自杀基因)插入引起，该基因赋予对所施用的试剂(例如化合物)的敏感性。阴性选择基因是本领域已知的，尤其包括以下：赋予更昔洛韦敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler et al.,Cell 11(1):223-232,1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因，细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(APRT)基因，细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33-37(1992))。
在一些实施方案中，在遗传修饰的免疫效应细胞(例如T细胞)中包括能够在体外选择阴性可选择表型细胞的阳性标志物可以是有用的。阳性选择标志物可以是下述基因，其在导入宿主细胞中时表达显性表型，其允许阳性选择携带该基因的细胞。此类型的基因是本领域已知的，并且尤其包括赋予对潮霉素B的抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)，编码对抗生素G418的抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药物抗性(MDR)基因。其他阳性选择标志物可以包括编码允许转导细胞分选的细胞膜中或细胞膜上表达的蛋白质的基因，例如，编码荧光蛋白(例如GFP)的基因，所述荧光蛋白使得能够使用荧光激活细胞分选(FACS)选择转导的细胞。任何合适的阳性选择标志物可以用于本发明。
优选地，将阳性选择标志物和阴性可选择元件连接，使得阴性可选择元件的丧失也必然伴随着阳性选择标志物的丧失。甚至更优选地，将阳性和阴性选择标志物融合，使得一个的丧失必然导致另一个的丧失。产生赋予期望的阳性和阴性选择特征两者的多肽作为表达产物的融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)。该基因的表达产生赋予潮霉素B抗性用于体外阳性选择和更昔洛韦敏感性用于体内阴性选择的多肽。参见LuptonS.D.,et al,Mol.and Cell.Biology 11:3374-3378,1991。
在一些实施方案中，可以期望从本发明的CAR表达载体表达多肽，以允许检测免疫效应细胞中CAR的表达。因此，可以有可能通过检测在与编码CAR的核苷酸序列相同(或不同的启动子)控制下指导另一多肽的表达来鉴定用载体对免疫效应细胞的成功转导和CAR分子的成功表达。特别地，本发明的CAR分子可以另外包含CD34分子或经修饰的CD34分子，例如截短的CD34分子，其中此类分子包含胞外部分，所述胞外部分允许通过公知的技术检测，例如，使用合适的抗体和标记物的免疫荧光检测它。在一个具体实施方案中，本发明的载体可以另外包含SEQ ID NO.77的核苷酸序列或与其具有至少80％序列同一性的核苷酸序列。或者，载体可以另外编码SEQ ID NO.78的氨基酸序列或与其具有至少80％序列同一性的序列。
“免疫效应细胞”是免疫系统的任何细胞，其具有一种或多种效应器功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性，细胞因子分泌，ADCC和/或CDC的诱导)。因此，代表性的免疫效应细胞包括T淋巴细胞，特别是细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)和辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)。其他T细胞群体也可用于本文，例如幼稚T细胞和记忆T细胞。其他免疫效应细胞包括NK细胞，NKT细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞。如上所述，免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中可以诱导此类祖细胞以在体内或体外分化成免疫效应细胞。
T细胞，特别是CD8+T细胞和NK细胞代表根据本发明的优选免疫效应细胞。
术语“NK细胞”是指大颗粒淋巴细胞，是源自常见淋巴样祖细胞的细胞毒性淋巴细胞，其不天然地包含抗原特异性受体(例如T细胞受体或B细胞受体)。NK细胞可以通过其CD3-，CD56+表型区分。因此，如本文使用，该术语包括任何已知的NK细胞或任何NK样细胞或具有NK细胞特征的任何细胞。因此可以使用原代NK细胞，或者在备选实施方案中，可以使用本领域已知的先前已经分离和培养的NK细胞。因此，可以使用NK细胞系。文献中已知并报道了许多不同的NK细胞，并且可以使用任何这些细胞，或者可以从原代NK细胞制备细胞系，例如通过病毒转化(Vogel et al.2014,Leukaemia 28:192-195)。除NK-92外，合适的NK细胞包括(但绝不限于)NK-YS,NK-YT,MOTN-1,NKL,KHYG-1,HANK-1,或NKG细胞系。在优选的实施方案中，细胞是NK-92细胞(Gong et al.1994,Leukaemia 8:652-658)或其变体。原始NK-92细胞的许多不同变体已经得到制备并且描述或可获得，包括非免疫原性的NK-92变体。可以使用任何此类变体并且包括在术语“NK-92”中。也可以使用其他细胞系的变体。
当免疫效应细胞是用于治疗用途的非自体细胞(即是供体细胞)时，优选它是非免疫原性的，使得当对受试者施用时，它不产生影响，干扰或阻止在治疗中使用细胞的免疫应答。
NK细胞可以是天然的非免疫原性的，但可以将NK细胞或其他免疫效应细胞修饰为非免疫原性的。天然非免疫原性NK细胞不表达MHC分子或仅弱表达MHC分子，或者可以表达不刺激免疫应答的非功能性MHC分子。可以修饰具有免疫原性的免疫效应细胞以消除MHC分子的表达，或仅在其表面弱表达MHC分子。或者，可以修饰此类细胞以表达非功能性MHC分子。
涵盖破坏功能性MHC分子表达的任何手段。因此，这可以包括敲除或敲低MHC复合物的分子，和/或它可以包括阻止对细胞表面的合适转运和/或在细胞表面处MHC分子或整个复合物的正确表达的修饰。
特别地，可以破坏本发明细胞表面上的一种或多种功能性MHC I类蛋白的表达。在一个实施方案中，细胞可以是HLA阴性的人细胞以及因此一种或多种HLA分子，例如HLA MHCI类复合物的分子的表达被破坏(例如敲除)的细胞。
在一个优选的实施方案中，可以通过敲除编码β2-微球蛋白(β2m)(成熟MHC I类复合物的组分)的基因来进行MHC I类的破坏。可以通过靶向破坏β2m基因来消除β2m的表达，例如通过β2m启动子的定点诱变(以使启动子失活)，或在编码β2m蛋白的基因内引入阻止β2m蛋白表达的失活突变，例如引入基因内的移码突变或过早的“终止”密码子进行。或者，可以使用定点诱变产生不能在细胞表面处形成活性MHC蛋白的非功能性β2m蛋白。以此种方式，β2m蛋白或MHC可以在胞内保留，或者可以在细胞表面处存在但无功能。
或者，可以在施用于受试者之前照射免疫效应细胞。不希望受理论束缚，认为细胞的照射导致仅瞬时存在于受试者中的细胞，因此减少受试者免疫系统引发针对细胞的免疫应答的可用时间。虽然此类细胞可以在其细胞表面处表达功能性MHC分子，但它们也可以被认为是非免疫原性的。辐射可以来自α，β或γ辐射的任何来源，或者可以是X射线辐射或紫外光。5-10Gy的辐射剂量可以足以消除增殖，但其他合适的辐射剂量可以是1-10,2-10,3-10,4-10,6-10,7-10,8-10或9-10Gy，或更高的剂量，诸如11,12,13,14,15或20Gy。或者，可以修饰细胞以表达“自杀基因”，其允许将细胞诱导性杀死或防止响应于外部刺激物而复制。
因此，可以将根据本发明的免疫效应细胞修饰为非免疫原性的，这通过降低其增殖能力或容量，即通过降低其增殖能力进行。
本发明的经修饰的免疫效应细胞还可以以其他方式进行修饰，例如改变或修饰细胞功能或行为的其他方面，和/或表达其他蛋白质。例如，可以修饰细胞以表达归巢受体或定位受体，其作用为靶向或改善细胞定位于身体内的特定组织或位置。
例如，可以期望对用本发明的载体或核酸转导或用其转导的免疫效应细胞进行进一步修饰。特别地，可以期望对延长或增强其对CLEC14A的应答的免疫细胞进行修饰。例如，已知TGFβ由肿瘤分泌，并且这可以抑制T细胞的诱导。在这方面，可以期望本发明的修饰的免疫效应细胞，例如T细胞(即用本发明的核酸或载体转导的那些细胞)能够中和TGFβ的效应，例如，通过表达显性失活的TGFβ受体II。另外/或者，本发明的免疫效应细胞可以用编码细胞因子，例如IL-15或IL-2,IL-7,IL-12等的核酸转导，所述细胞因子可以增强细胞的效应器功能。任何另外的核酸序列可以从与CAR分子相同或不同的载体表达。
还应当理解，本发明的免疫效应细胞可以包含超过一种本发明的核酸或载体。特别地，本发明的免疫效应细胞可以包含2,3,4或5种或更多种本发明的核酸或载体，其各自表达不同的CAR分子。因此，本发明的免疫效应细胞可以包含不同的CAR分子，其能够结合CLEC14A，例如在CLEC14A上的相同或不同的位置。
因此，在一些实施方案中，本发明的免疫效应细胞包含超过一种下文所述的核酸分子，例如，2,3或4种下文所述的核酸分子，例如编码包含(1)的抗原结合域的核酸分子和编码包含(2)的抗原结合域的核酸分子，其中每个所述核酸分子编码针对抗原CLEC14A的CAR，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的抗原CLEC14A，并且包含抗原结合域，其包含：
(1)(a)VH CDR序列，其包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42；和/或
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44；和/或
(b)VL CDR序列，其包含：
(i)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或46；和/或
(ii)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或47；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或48；和/或
一种或多种与(a)或(b)中所示的SEQ ID NO基本上同源的序列；或
(2)(a)VH CDR序列，其包含：
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22；和/或
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24；和/或
(b)VL CDR序列，其包含：
(i)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和/或
(ii)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27；和/或
(iii)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28；和/或
一种或多种与(a)或(b)中所示的SEQ ID NO基本同源的序列。在一些实施方案中，除了表达的本发明的CAR之外，本发明的免疫效应细胞可以包含至少一种其他受体，特别是外源受体(例如多种受体)，其可以在组合方法中与CAR一起用于结合靶细胞(例如表达CLEC14A的肿瘤细胞，例如肿瘤血管系统)。因此，在此类方法中，可以需要CAR和至少一种其他受体与靶细胞的结合来刺激针对靶细胞的免疫应答(例如，每种CAR/受体可以仅提供免疫细胞刺激的部分信号，它们单独可能不足以实现免疫细胞刺激，但一起允许免疫效应细胞刺激)。在本发明的免疫效应细胞是T细胞的情况下，为了刺激T细胞，在CLEC14A表达细胞上CAR与CLEC14A的结合和至少一种其他受体与其配体的结合是必要的。至少一种其他受体可以是另外的CAR分子。
在该实施方案的变型中，可以诱导表达本发明的免疫效应细胞内的CAR。特别地，在该实施方案中，在免疫效应细胞上表达的至少一种其他受体与其靶物的结合可以允许或控制CAR分子的表达。因此，在此种情况下，在CAR表达发生之前需要至少一种其他受体与其配体的结合，因此免疫效应细胞刺激需要至少一种其他受体与其配体的结合以及随后CAR与靶细胞的结合。此类特定的系统可以包括SynNotch受体的额外表达，所述SynNotch受体工程化改造为具有针对感兴趣的抗原，例如CD19的胞外配体结合域和正交转录因子(例如TetR或Gal4)。在与感兴趣抗原结合后，正交转录因子从SynNotch受体的尾部切割并激活CAR的表达。因此，本发明的免疫效应细胞可以进一步包含编码受体的核酸或载体，所述受体结合除CLEC14A之外的抗原，特别是除CLEC14A之外的肿瘤相关抗原。
或者，也可以使用组合方法，其中除了本发明的CAR之外的另外的受体在本发明的免疫效应细胞上表达，其中所述另外的受体能够结合脱靶细胞或组织(例如非肿瘤细胞)。在此种情况下，若另外的受体结合其配体，则产生负信号，阻止免疫细胞刺激(例如T细胞刺激)。
进一步的组合方法可以使用另外的受体与本发明的CAR组合，其中这两种受体结合不同的靶物并诱导不同的效果来治疗肿瘤。因此，这两种抗肿瘤效果可以完全彼此独立，但是一起可以呈现针对肿瘤的有效疗法。在这方面，本发明的CAR可以与TCR疗法组合使用，其中免疫细胞可以用编码本发明的CAR和TCR的一种或多种核酸分子转导，所述TCR能够结合可以在肿瘤细胞上(例如在特定类型的肿瘤细胞上或在任何肿瘤细胞上)发现的特定MHC/肽组合。或者，可以单独，序贯或同时提供用编码CAR的核酸转导的免疫细胞和用编码TCR的核酸转导的分开的免疫细胞群体。还涵盖使用编码本发明的CAR和识别肿瘤MHC/肽组合的TCR的一种或多种核酸的基因疗法治疗。
本发明提供了制备表达如本文所述的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，该方法包括转染或转导自受试者分离的免疫效应细胞，使得免疫效应细胞表达如本文所述的一种或多种CAR。在某些实施方案中，免疫效应细胞从受试者中分离并通过引入核酸分子进行修饰而无需在体外进一步操作。然后可以将此类细胞直接对受试者再施用。在进一步的实施方案中，首先激活免疫效应细胞并刺激以在体外增殖，之后修饰以表达CAR。在这方面，可以在遗传修饰(即，转导或转染以表达如本文所述的CAR)之前或之后培养免疫效应细胞。
可以从许多来源获得T细胞，包括外周血单个核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺问题，来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。在某些实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术例如FICOLLTM分离从自受试者收集的血液单位获得T细胞。在一个实施方案中，通过单采血液成分术(apheresis)获得来自受试者的循环血液的细胞。单采血液成分产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞，单核细胞，粒细胞，B细胞，其他有核白细胞，红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以清洗通过单采血液成分术收集的细胞以除去血浆级份并将细胞置于合适的缓冲液或培养基中用于后续处理。在本发明的一个实施方案中，用PBS清洗细胞。在一个备选实施方案中，清洗的溶液缺乏钙和/或镁，或者可以缺乏许多(若不是全部)二价阳离子。如本领域普通技术人员应当理解，清洗步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，例如通过使用半自动流通式离心机。例如，Cobe2991细胞处理器，Baxter CytoMate等。清洗后，可以将细胞重悬浮于各种生物相容性缓冲液或具有或没有缓冲液的其他盐水溶液中。在某些实施方案中，可以在细胞直接重悬的培养基中除去单采血液成分样品的不希望的组分。
在某些实施方案中，通过裂解红细胞和消减单核细胞(例如通过离心通过PERCOLLTM梯度)从外周血单个核细胞(PBMC)分离T细胞。可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD28+，CD4+，CD8+，CD45RA+和CD45RO+T细胞。例如，可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体组合来实现通过阴性选择富集T细胞群体。本文使用的一种方法是通过负磁免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，所述负磁免疫粘附或流式细胞术使用针对负面选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包含针对CD 14,CD20,CDl lb,CD16,HLA-DR和CD8的抗体。也可以使用流式细胞术和细胞分选分离感兴趣的细胞群体以用于本发明。
可以使用如本文所述的方法直接使用PBMC进行遗传修饰。在某些实施方案中，在分离PBMC后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施方案中，可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助T淋巴细胞两者分选为幼稚，记忆和效应T细胞亚群。CD8+细胞可以通过使用标准方法获得。在一些实施方案中，通过鉴定与那些类型的CD8+细胞中的每一种相关的细胞表面抗原将CD8+细胞进一步分选为幼稚，中枢记忆和效应细胞。在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L亚组两者中。在用抗CD8和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选成CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方案中，中枢记忆TCM的表型标志物的表达包括CD45RO，CD62L，CCR7，CD28，CD3和CD127，并且对于颗粒酶B是阴性的。在一些实施方案中，中枢记忆T细胞是CD45RO+，CD62L+，CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞对CD62L，CCR7，CD28和CD127是阴性的，对于颗粒酶B和穿孔蛋白是阳性的。在一些实施方案中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于幼稚T细胞的表型标志物的表达，包括CD62L,CCR7,CD28,CD3,CD 127和CD45RA。
免疫效应细胞，例如T细胞，可以在分离后进行修饰，或者免疫效应细胞可以在修饰前在体外被激活和扩增(或在祖细胞的情况下分化)。在另一个实施方案中，通过引入核酸分子修饰免疫效应细胞，例如T细胞，然后在体外活化和扩增。用于激活和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如US6905874；US6867041；US6797514；WO2012079000。通常，此类方法包括在具有适当细胞因子如IL-2的培养基中使PBMC或分离的T细胞与通常附着于珠或其他表面的刺激剂和共刺激剂，例如抗CD3和抗CD28抗体接触。附着于相同珠的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代”抗原呈递细胞(APC)。在其他实施方案中，可以使用方法，诸如US6040177；US5827642；和WO2012129514中描述的那些方法激活和刺激T细胞以在饲养细胞和适当的抗体和细胞因子的情况下增殖。
在一个实施方案中，CD34+细胞用根据本发明的CAR编码核酸分子转导或转染。在某些实施方案中，修饰的(例如转染的或转导的)CD34+细胞在施用于受试者(通常是最初从中分离细胞的受试者)后体内分化成成熟的免疫效应细胞。在另一个实施方案中，可以根据本领域已知的方法用一种或多种以下细胞因子在引入核酸分子之前或之后在体外刺激CD34+细胞：Flt-3配体(FL)，干细胞因子(SF)，巨核细胞生长和分化因子(TPO)，IL-3和IL-6。
本发明提供了用于如下文更详细描述的疗法的经修饰的免疫效应细胞，表达如本文公开的CAR的修饰的免疫效应细胞。例如，经修饰的免疫效应细胞可以从获自诊断患有癌症，特别是实体瘤的患者获得的外周血单个核细胞(PBMC)制备。
标准程序可以用于存储(例如冷冻保存)经修饰的免疫效应细胞和/或用于人或其他受试者的制剂。
表达CAR的免疫效应细胞可以根据已知技术用于过继免疫疗法的方法和组合物中。在一些实施方案中，通过首先从其培养基中收获细胞，然后将细胞清洗并以治疗有效量浓缩在适于施用的培养基和容器系统(“药学上可接受的”载体)中配制细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质制剂，通常是生理盐水，Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)，但也可以使用水中的5％右旋糖或林格氏乳酸盐。输注介质可以补充有人血清白蛋白。组合物中治疗有效量的细胞是至少2个细胞(例如，至少1个CD8+中枢记忆T细胞和至少1个CD4+辅助T细胞亚组)或更通常大于102个细胞，并且多达106，多达并且包括108或109个细胞，并且可以超过1010个细胞。细胞的数目将取决于组合物意图的最终用途以及其中包含的细胞类型。对于本文提供的用途，细胞通常体积为1升或更小，500ml或更少，甚至250ml或100ml或更少。因此，期望的细胞的密度通常大于106个细胞/ml，通常大于107个细胞/ml，通常为10个细胞/ml或更大。临床相关数目的免疫细胞可以分配到累积等于或超过105,106,107,108,109,1010,1011,或1012个细胞的多次输注。例如，可以以24或48小时，或每3,4,5,6或7天的间隔向患者施用2,3,4,5,6或更多个分开的输注。输注也可以每周，每两周或每月间隔，或间隔6周或2,3,4,5或6个月间隔分开。也可以施用每年输注。在本发明的一些方面中，由于将所有输注的细胞再导向特定的靶抗原(即CLEC14A)，可以使用较低数目的细胞，范围为106/千克(106-109每名患者)。可以以这些范围内的剂量将细胞组合物施用多次。若期望的话，治疗还可包括施用有丝分裂原(例如，PHA)或淋巴因子，细胞因子和/或趋化因子(例如IFN-γ,IL-2,IL-12,TNF-alpha,IL-18,and TNF-beta,GM-CSF,IL-4,IL-13,Flt3-L,RANTES等)以增强免疫应答的诱导。
本发明的表达CAR的免疫效应细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分如IL-2或其他细胞因子或细胞群体组合施用。简而言之，本发明的药物组合物可以包含表达CAR的免疫效应细胞群体，如本文所述的T细胞，与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂组合。此类组合物可以包含缓冲液，例如中性缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。优选配制本发明的组合物用于静脉内施用，并在下面进一步描述。
如别处关于用于编码CAR的载体的体内选择标志物所指出，可以在用本发明的核酸分子修饰细胞之前、之后或同时用通过自杀基因(例如诱导型胱天蛋白酶9或胸苷激酶)转导含有CAR的免疫效应细胞来最小化不良事件。
通过施用本文所述的表达CAR的免疫效应细胞在受试者中诱导的免疫应答可以包括由能够杀死感染细胞的细胞毒性T细胞，调节性T细胞介导的细胞免疫应答和辅助性T细胞应答。还可以诱导主要由能够激活B细胞从而导致抗体产生的辅助T细胞介导的体液免疫应答。
当指示“有效量”时，可以由医生在考虑年龄，体重，恶性程度和患者(受试者)的一般状况的个体差异的情况下确定待施用的组合物的精确量。通过监测受试者的疾病迹象并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
术语“靶细胞”是指被本发明的经修饰的免疫效应细胞杀死或消除的任何细胞。如上所述，它通常是表达CLEC14A的内皮细胞(例如肿瘤，优选实体瘤内的内皮细胞，例如癌细胞)。
可能的表达载体包括但不限于粘粒，质粒或修饰的病毒(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)，只要该载体与所用的宿主细胞相容即可。表达载体“适合转化宿主细胞”，这意味着表达载体含有本发明的核酸分子和基于待用于表达的宿主细胞选择的调节序列，其可操作地连接到核酸分子。可操作地连接意指核酸以允许核酸表达的方式与调节序列连接。
因此，本发明涵盖重组表达载体，其含有本发明核酸分子或其片段，以及由本发明核酸分子编码的蛋白质序列的转录和翻译所必需的调节序列。
合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。合适的调节序列的选择取决于如下文讨论选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地完成。此类调节序列的实例包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，包括翻译起始信号。另外，取决于所选择的宿主细胞和所用的载体，可以将其他序列，例如复制起点，额外的DNA限制性位点，增强子和赋予转录诱导能力的序列掺入表达载体中。
本发明的重组表达载体还可以含有选择标志物基因，其有助于选择用本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞。选择标志物基因的实例是编码以下各项的基因：赋予对某些药物例如新霉素和潮霉素的抗性的蛋白质，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，萤火虫萤光素酶，或免疫球蛋白或其部分，例如免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。通过选择标志物蛋白质如β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶或萤火虫萤光素酶的浓度变化来监测选择标志物基因的转录。若选择标志物基因编码赋予抗生素抗性的蛋白质，例如新霉素抗性，可以用G418选择转化细胞。掺入了选择标志物基因的细胞将存活，而其他细胞死亡。这使得可以可视化和测定本发明的重组表达载体的表达，特别是确定突变对表达和表型的影响。应当理解，可以在与感兴趣的核酸分开的载体上引入选择标志物。
重组表达载体还可以含有编码融合部分的基因，该融合部分提供重组蛋白的增加的表达；增加重组蛋白的溶解度；并且通过在亲和纯化中充当配体来帮助纯化靶重组蛋白(例如，可以存在适当的“标签”以实现纯化和/或鉴定，例如His标签或myc标签)。例如，可以将蛋白水解切割位点添加到靶重组蛋白中，以允许在纯化融合蛋白后从重组蛋白中分离重组蛋白。典型的融合表达载体包括pGEX(Amrad Corp.,Melbourne,Australia),pMal(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway,NJ)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白，或蛋白A与重组蛋白融合。
可以将重组表达载体导入宿主细胞中以产生转导的宿主细胞。术语“用...转导”，“用......转化”，“用......转染”，“转化”和“转染”旨在涵盖通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)导入细胞中。如本文所用，术语“转化的宿主细胞”还意图包括已用本发明的重组表达载体转化的能够糖基化的细胞。可以通过例如电穿孔或氯化钙介导的转化用核酸转化原核细胞。例如，可以通过常规技术将核酸引入哺乳动物细胞中，所述常规技术如磷酸钙或氯化钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质转染，电穿孔或显微注射。用于转化和转染宿主细胞的合适方法可以参见Sambrook等，1989(同上)和其他实验室教科书。
合适的宿主细胞包括极其多种真核宿主细胞和原核细胞。例如，可以在酵母细胞或哺乳动物细胞中表达本发明的蛋白质(例如抗体)。此外，可以在原核细胞，例如大肠杆菌中表达本发明的蛋白质。
适用于实施本发明的酵母和真菌宿主细胞包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，毕赤酵母属(Pichia)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)以及曲霉属(Aspergillus)的各种物种。用于在酵母酿酒酵母中表达的载体的实例包括pYepSec1,pMFa,pJRY88,和pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,CA)。用于转化酵母和真菌的方案是本领域普通技术人员所公知的。
适用于实施本发明的哺乳动物细胞特别包括：COS(e.g.,ATCC No.CRL 1650或1651),BHK(e.g.,ATCC No.CRL 6281),CHO(ATCC No.CCL 61),HeLa(e.g.,ATCC No.CCL2),293(ATCC No.1573),NS-1细胞,NS0(ATCC CRL-11177),和(Crucell,Leiden,Netherlands)。用于在哺乳动物细胞中指导表达的合适表达载体通常包括启动子(例如，源自病毒材料，例如多瘤，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40)，以及其他转录和翻译控制序列。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8和pMT2PC。
鉴于本文提供的教导，也可以容易地实现用于将合适类型的表达载体引入植物，禽类和昆虫细胞中的启动子，终止子和方法。例如，在一个实施方案中，可以从植物细胞中表达本发明的蛋白质。
适用于实施本发明的昆虫细胞包括来自蚕娥(Bombyx)，Trichoplusia或Spodotera物种的细胞和细胞系。可用于在培养的昆虫细胞(SF 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列和pVL系列。
或者，本发明的蛋白质也可以在非人转基因动物如大鼠，兔，绵羊和猪中表达(美国专利号4,736,866)。
本发明的蛋白质还可以通过化学合成使用蛋白质化学中公知的技术制备，例如固相合成或在同质溶液中合成。
包含与其他分子(例如免疫缀合物)(例如蛋白质)缀合的本发明的抗体和蛋白质的N端或C端融合蛋白可以经由重组技术通过融合来制备。所得融合蛋白含有与选定的蛋白质或标志物蛋白，或如本文所述的标签蛋白融合的本发明的抗体或蛋白质。本发明的抗体和蛋白质也可以通过已知技术与其他蛋白质缀合。例如，可以使用如WO 90/10457所述的异双功能性含有硫醇的接头，N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代-丙酸酯)或N-琥珀酰亚胺基-5硫代乙酸酯偶联蛋白质。可用于制备融合蛋白或缀合物的蛋白质的实例包括细胞结合蛋白，例如免疫球蛋白，激素，生长因子，凝集素，胰岛素，低密度脂蛋白，胰高血糖素，内啡肽，转铁蛋白，铃蟾肽，无唾液酸糖蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，血凝素(HA)和截短的myc。
如上文和以下实施例中更详细讨论的，本发明人已确定本发明的抗体对血管生成具有影响。因此，本发明的抗体(包括其融合蛋白及其缀合物，例如免疫缀合物等)，CAR，核酸分子(包括载体，特别是包含所述核酸分子的表达载体)和免疫效应细胞在治疗中具有效用。因此，本发明的其他方面包括：
组合物，特别是治疗或药物组合物，其包含如本文所定义的本发明的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)或免疫效应细胞和至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂；
如本文所定义的本发明的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)或免疫效应细胞或组合物，用于疗法，特别是过继性细胞转移疗法；
如本文所定义的本发明的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)或免疫效应细胞或组合物，用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如治疗癌症；
对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况的方法，例如，用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成的方法，例如治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所定义的本发明的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)，免疫效应细胞或组合物，特别是有效量的所述抗体，CAR，核酸分子，细胞或组合物；和
如本文中定义的本发明的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)或免疫效应细胞用于制备药物(或组合物)的用途，所述药物(或组合物)用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
为避免疑义，还应当理解本发明还包括抑制血管生成(例如肿瘤血管生成)的体外或离体方法，包括体外或离体对组织或细胞施用如本文定义的抗体，CAR(即CAR多肽)，核酸分子(例如编码CAR，例如表达载体)，免疫效应细胞或组合物。细胞可以是已建立的细胞系，或已从个体中取出的细胞。组织或细胞优选是哺乳动物组织或细胞(例如内皮组织或细胞)，最优选是人组织或细胞。当该方法是离体方法时，可以将试剂离体施用于血管生成模型。合适的血管生成测定包括内皮细胞增殖，迁移和侵入的测定，海绵测定和主动脉环测定。进一步的血管生成测定在下文和实施例中描述。
通过“对抗”，我们包括该方法可以用于缓解病症症状(即姑息性使用方法)，或治疗病症或预防并增(即预防性使用该方法)的含义。
通过与CLEC14A表达相关的疾病或状况，我们包括与表达CLEC14A的细胞相关的任何疾病或状况。例如，细胞可以是不需要的细胞。不需要的细胞可以是不希望存在于宿主中的任何细胞。因此，与CLEC14A表达相关的疾病或状况可以是以表达CLEC14A并且不需要的细胞的存在为特征的任何状况，例如，其中至少部分病理学由表达CLEC14A的此类不需要的细胞的存在介导的任何生物学或医学状况或病症。该状况可以是由不需要的细胞的存在引起的，或者不需要的细胞的存在可以是该状况的效果。
通过CLEC14A的表达，我们包括CLEC14A蛋白能够在细胞上或细胞中或从细胞制备的提取物中检测到的含义，或者可以通过检测CLEC14A mRNA来推断多肽的表达。为了确认CLEC14A在细胞中的表达，可以进行多种测定。此类测定包括例如本领域技术人员公知的生物化学测定，例如通过免疫学手段(ELISA和Western印迹)，或者本领域技术人员公知的分子生物学测定法，例如Northern印迹法，RT-PCR和用于检测CLEC14A mRNA存在的PCR检测特定蛋白质(即CLEC14A)的存在。
如上文所提及，发明人发现CLEC14A是内皮细胞标志物，因此可以理解本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞和组合物在对抗涉及不希望的，不希望的或不适当的血管生成的任何疾病或状况中都是特别有用的。此类状况包括肿瘤/癌症，银屑病，月经过多，子宫内膜异位症，关节炎(包括炎症和类风湿性关节炎两者)，黄斑变性，佩吉特氏病，视网膜病变和其血管并发症(包括增殖和早产性和糖尿病性视网膜病变)，良性血管增殖，纤维化，肥胖和炎症。
术语“抑制血管生成”旨在表示降低血管生成的速率或水平。降低可以是血管生成速率或水平的约10％，或约20％，或约30％，或约40％的低水平降低。优选地，所述降低是血管生成速率或水平降低约50％，或约60％，或约70％，或约80％的中等水平降低。更优选地，该降低是血管生成速率或水平的约90％，或约95％，或约99％，或约99.9％的高水平降低。最优选地，抑制还可以包括消除血管生成或将其降低至不可检测的水平。用于确定血管生成的速率或水平，因此用于确定抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞或组合物是否以及在何种程度上抑制血管生成的方法和测定法是本领域已知的并且在本文，包括在实施例中更加详细描述。
通常，受到抑制的血管生成是肿瘤血管生成。因此，个体可具有实体瘤，其可通过抑制肿瘤血管生成来治疗，即实体瘤与新血管生成相关。术语“肿瘤”应被理解为是指所有形式的新生物细胞生长，包括但不限于，乳腺，卵巢，肝，膀胱，前列腺，肾，胰腺，胃，食道，肺和甲状腺肿瘤。
通常，肿瘤与不期望的新血管形成有关。不希望的新血管形成的减少可以阻止肿瘤的进展并且可以导致临床上有用的肿瘤尺寸和生长的减少。因此，抑制肿瘤血管生成可用于治疗肿瘤，例如，以防止(进一步)肿瘤生长，防止肿瘤扩散(转移)，或减小肿瘤的大小。
优选地，本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞，方法和组合物用于治疗人，在这种情况下，抗体，CAR或免疫效应细胞能够结合人CLEC14A或编码能够结合人CLEC14A的抗体或CAR的核酸分子或表达载体。然而，应当理解，当本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞，方法和组合物用于治疗非人哺乳动物时，优选抗体，CAR或免疫效应细胞能够结合来自其他物种的CLEC14A或核酸分子或表达载体编码能够结合来自其他物种的CLEC14A的抗体或CAR。
如上所讨论，CLEC14A在某些肿瘤细胞(例如内皮细胞)上表达，并且本发明的抗体定位于CLEC14A+细胞。因此，本发明的抗体可以靶向存在CLEC14A+细胞的身体部位(例如肿瘤)，于是抗体可以作用于靶位点。特别地，抗体定位于肿瘤血管中的CLEC14A+内皮细胞的能力意味着本发明的抗体可以靶向存在CLEC14A+肿瘤细胞的身体部位，因此抗体可以作用于靶位点。
如实施例中所示，本发明的抗体本身可以具有抗CLEC14A+细胞作用(例如对血管生成的抑制作用或抗癌作用)，即作为裸抗体，例如通过抑制，减少或阻断CLEC14A的功能或活性。这种充当裸抗体的能力是有利的，因此在一些实施方案中，本发明的组合物，用途和方法使用本发明的抗体，其不与任何其他活性剂如治疗活性剂缀合。
已知当与标准化学疗法组合施用时，血管生成抑制剂抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗改善许多实体瘤的临床结果。已经使用的组合包括贝伐单抗联合伊立替康，氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸；贝伐单抗联合FOLFOX4(奥沙利铂，5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸的方案)；贝伐单抗联合紫杉醇；和贝伐单抗联合紫杉醇和卡铂。
因此，技术人员将理解，尽管本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，组合物和免疫效应细胞在没有任何其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)的情况下可以是临床有效的，将本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，组合物和免疫效应细胞与其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成)联合使用可以是有利的。
因此，在本发明的另一个实施方案中，该方法还可以包括向个体施用至少一种另外的或别的治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。该方法可以包括向个体施用含有抗体，CAR，核酸分子，表达载体或免疫效应细胞和另外的治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)的药物组合物。然而，应当理解，本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，组合物或免疫效应细胞和其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以分开施用，例如，通过单独的施用途径。另外，本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，组合物或免疫效应细胞和至少一种其他治疗剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)可以顺序施用或者(基本上)同时施用。它们可以在相同的药物制剂或药物中施用，或者它们可以分别配制和施用。
在一个具体实施方案中，本发明提供了对抗与CLEC14A表达有关的疾病或状况的方法，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成的方法，例如治疗癌症的方法，所述方法包括施用如本文所定义的本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞或组合物，特别是有效量的所述抗体，细胞或组合物，并单独地，同时或顺序地将一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)施用于有需要的受试者。
或者，提供了如本文所定义的本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，免疫效应细胞或组合物，其与一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)组合使用以用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
因此，提供了如本文所定义的本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体或免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物与一种或多种另外的活性剂(例如治疗剂)(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)组合使用以对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况，例如用于抑制血管生成，特别是肿瘤血管生成，例如用于治疗癌症。
因此，在一个实施方案中，药物可以进一步包含一种或多种另外的活性(例如治疗)剂(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)。
药物可以为单一组合物的形式，其包含如本文定义的本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体或免疫效应细胞以及一种或多种另外的活性剂(例如治疗剂)(例如抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂)两者，或者它可以是含有它们的试剂盒或产品的形式，用于分开(例如同时或顺序)施用。
在一些实施方案中，另外的治疗剂是抗癌剂。另外的抗癌剂可以选自烷基化剂，包括氮芥类，例如氮芥(HN2)，环磷酰胺，异环磷酰胺，美法仑(L-沙可来新)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类如六甲基三聚氰胺，塞替派；磺酸烷基酯诸如白消安；亚硝基脲类，如卡莫司汀(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，司莫司汀(甲基-CCNU)和链脲佐菌素(链脲佐菌素)；和三嗪类如氨烯咪胺(DTIC；二甲基三氮烯咪唑-咪唑羧酰胺)；抗代谢物，包括叶酸类似物，如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤)；嘧啶类似物如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶；5-FU)，氟尿苷(氟脱氧尿苷；FUdR)和阿糖胞苷(胞嘧啶阿拉伯糖苷)；和嘌呤类似物和相关的抑制剂，如巯嘌呤(6-巯基嘌呤；6-MP)，硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤；TG)和喷司他丁(2'-脱氧助间型霉素)；天然产物，包括长春花生物碱类诸如长春碱(VLB)和长春新碱；表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷；抗生素如更生霉素(放线菌素D)，柔红霉素(道诺霉素；红比霉素)，多柔比星，博来霉素，普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素(丝裂霉素C)；酶诸如L-天冬酰胺酶；和生物反应调节剂，如干扰素alphenomes；混杂的试剂，包括铂配位络合物，如顺铂(cis-DDP)和卡铂；蒽二酮诸如米托蒽醌和蒽环类药物；取代的尿素如羟基脲；甲基肼衍生物如丙卡巴肼(N-甲基肼，MIH)；和肾上腺皮质抑制剂，如米托坦(ο，p'-DDD)和氨鲁米特；紫杉醇和类似物/衍生物；细胞周期抑制剂；蛋白酶体抑制剂如硼替佐米信号转导酶(例如酪氨酸激酶)抑制剂如伊马替尼COX-2抑制剂和激素激动剂/拮抗剂如氟他胺和他莫昔芬。
临床使用的抗癌剂通常按作用机制分组：烷化剂，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，RNA/DNA抗代谢物，DNA抗代谢物和抗有丝分裂剂。美国国立卫生研究院/国家癌症研究所网站列出了122种化合物(http://dtp.nci.nih.gov/docs/cancer/searches/standard_mechanism.html)，所有这些化合物都可以与本发明的抗体，组合物或免疫效应细胞一起使用。它们包括烷基化剂，包括Asaley，AZQ，BCNU，白消安，羧基邻苯二甲酸铂(carboxyphthalatoplatinum)，CBDCA，CCNU，CHIP，苯丁酸氮芥，氯噻嗪，顺铂，氯乙矾(clomesone)，氰基吗啉代-多柔比星，环二酮(cyclodisone)，二脱水半乳糖醇(dianhydrogalactitol)，氟多潘(fluorodopan)，hepsulfam，海恩酮，美法仑，甲基CCNU，丝裂霉素C，mitozolamide，氮芥，PCNU，哌嗪，哌嗪二酮，哌泊溴烷，泊非霉素，spirohydantoinmustard，替罗昔隆，四铂，picoplatin(SP-4-3)(顺式-氨基二氯(2-甲基吡啶))(Pt-II))，塞替派，曲他胺，尿嘧啶氮芥，Yoshi-864；抗有丝分裂剂，包括allocolchicine，Halichondrin B，秋水仙素，秋水仙素衍生物，多拉司他汀10，美坦辛，根霉素，紫杉醇，紫杉醇衍生物，硫代秋水仙碱，三苯甲基半胱氨酸，硫酸长春碱，硫酸长春新碱；拓扑异构酶I抑制剂，包括喜树碱，喜树碱，钠盐，氨基喜树碱，20种喜树碱衍生物，吗啉代多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂，包括多柔比星，氨萘非特，m-AMSA，蒽吡唑衍生物，吡唑啉吖啶，比生群HCL，柔红霉素，脱氧多柔比星，米托蒽醌，美诺立尔，N,N-二苄基道诺霉素，oxanthrazole，柔红霉素苯腙(rubidazone)，VM-26，VP-16；RNA/DNA抗代谢物，包括L-阿拉诺新，5-氮杂胞苷，5-氟尿嘧啶，阿西维辛，3氨基蝶呤衍生物，抗叶酸剂，Baker可溶性抗叶酸剂，二氯烯丙基指甲花醌(dichlorallyl lawsone)，布喹那，替加氟(前药)，5,6-二氢-5-氮杂胞苷，甲氨蝶呤，甲氨蝶呤衍生物，N-(膦酰基乙酰基)-L-天冬氨酸(PALA)，吡唑霉素，三甲曲沙；DNA抗代谢物，包括3-HP，2'-脱氧-5-氟尿苷，5-HP，α-TGDR，阿非科林甘氨酸盐(aphidicolinglycinate)，ara-C，5-氮杂-2'-脱氧胞苷，β-TGDR，环胞苷，胍那唑，羟基脲，肌苷糖二醛(inosine glycodialdehyde)，macbecin II，吡唑并咪唑(pyrazoloimidazole)，硫鸟嘌呤和硫嘌呤。
在一些优选的实施方案中，至少一种其他抗癌剂选自顺铂；卡铂；picoplatin；5-氟尿嘧啶；紫杉醇；丝裂霉素C；多柔比星；吉西他滨；拓优得；培美曲塞；甲氨蝶呤；伊立替康，氟尿嘧啶和亚叶酸钙(leucovorin)；奥沙利铂，5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸；和紫杉醇和卡铂。
当已经显示另外的抗癌剂对特定肿瘤类型特别有效时，可以优选本发明的抗体，CAR，核酸分子，表达载体，组合物或免疫效应细胞与该另外的抗癌剂组合使用以治疗该特异性肿瘤类型。
在一些实施方案中，抗血管生成化合物可以选自以下任何一种：贝伐单抗伊曲康唑；羧胺三唑(carboxyamidotriazole)；TNP-470(夫马洁林类似物)；CM101；IFN-α；IL-12；血小板因子-4；舒拉明；SU5416；凝血酶敏感蛋白；VEGFR拮抗剂；血管抑制类固醇+肝素；软骨衍生的血管生成抑制因子；基质金属蛋白酶抑制剂；血管他丁；内皮他丁；2-甲氧基雌二醇；tecogalan；四硫钼酸盐；沙利度胺；催乳素；αVβ3抑制剂；利诺胺；他喹莫德(Tasquinimod)；兰尼单抗(ranibizumab)；索拉非尼(sorafenib)；舒尼替尼帕唑帕尼(pazopanib)和依维莫司
在一些实施方案中，另外的治疗剂可以是免疫检查点抑制剂，特别与本发明的免疫效应细胞组合使用。此类抑制剂通常通过阻断免疫细胞和靶细胞(例如肿瘤细胞)之间的相互作用来起作用，所述相互作用阻止或下调免疫细胞的刺激。特别地，检查点抑制剂预防或减少T细胞上表达的蛋白质与肿瘤细胞上表达的蛋白质之间的相互作用，该相互作用将阻止或减少T细胞的刺激。检查点抑制剂可以例如阻止PD1和PDL1之间的相互作用，特别是可以构成结合PD1的试剂。或者，检查点抑制剂可以与CTLA-4结合。此类检查点抑制剂是本领域公知的，包括单克隆抗体，例如派姆单抗(Pembrolizumab)，纳武单抗(Nivolumab)或伊匹单抗(Ipilimumab)。
另外的活性剂也可以是鞘氨醇-1-磷酸酶激动剂，例如FTY720，其能够通过阻断来自鞘氨醇-1磷酸受体的信号来隔离淋巴样器官中的淋巴细胞。以此类方式，此类化合物可以限制对细胞因子如IL-7和IL-15的竞争，并因此可以使施用的免疫效应细胞的增殖增加。特别地，此类化合物可以在本发明的核酸，表达载体，CAR或免疫效应细胞之前施用，例如，之前至少12小时，24小时，36小时或48小时。
或者或另外，本发明的抗体可以通过与如本文中所述的另外的治疗分子，例如毒素或其它抗癌分子或抗血管生成剂缀合而具有抗CLEC14A+细胞效应(例如对血管生成的抑制作用或抗癌作用)。
在这方面，如实施例中所示，本发明的一些抗体能够内化到它们结合的细胞中。因此，在本发明的一些实施方案中，抗体能够被内化。该特性对于在免疫缀合物中的使用可能是特别有利的，因为与抗体分子附着的任何其他试剂应当与抗体分子一起被内在化。在其他实施方案中，没有看到显著的内化。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一系列缀合的抗体及其片段(如本文所定义)，其中抗体或片段可操作地附着到至少一种其他治疗剂或诊断剂。术语“免疫缀合物”广泛用于定义抗体(包括其片段)与另一种有效试剂的操作关联，并不意图限于任何特定类型的操作关联，并且特别不限于化学“缀合”。特别涵盖重组融合蛋白。只要递送或靶向剂能够结合靶物并且治疗或诊断剂在递送时具有足够的功能，则附着模式将是合适的。
因此，在一些实施方案中，本发明的抗体可以是免疫缀合物和/或用于本文定义的方法，组合物和用途的本发明的抗体是免疫缀合物，即与另外的治疗分子，例如毒素或其他抗癌分子或抗血管生成剂或诊断分子缀合(即偶联，附着或连接)的抗体。
Carter&Senter(2008),Cancer J.14(3):154-69和Chari et al(2014)Angewandte Chemie International第53版:3751(其通过引用并入本文)综述了抗体-药物偶联物(ADC)，例如用于癌症疗法，并且应当理解本发明的免疫缀合物可以认为包括此类抗体-药物缀合物(还参见US 5,773,001；US 5,767,285；US 5,739,116；US 5,693,762；US 5,585,089；US 2006/0088522；US 2011/0008840；US 7,659,241；Hughes(2010)Nat DrugDiscov 9:665,Lash(2010)；In vivo:The Business&Medicine Report 32-38；Mahato etal(2011)Adv Drug Deliv Rev 63:659；Jeffrey et al(2006)BMCL16:358；Drugs R D 11(1):85-95)。ADC通常包含针对肿瘤细胞上存在的靶物的单克隆抗体，细胞毒性药物和将抗体附着于药物的接头。
因此，在另一方面，本发明提供了免疫缀合物(例如抗体-药物缀合物)，其包含本发明的抗体和细胞毒性部分。
细胞毒性部分可以对新血管系统中的细胞或与新血管系统非常接近并与之相关的细胞直接或间接毒性的。通过“直接细胞毒性”，我们包括该部分是本身具有细胞毒性的部分的含义。通过“间接细胞毒性”，我们包括该部分虽然本身不具有细胞毒性，但可以诱导细胞毒性，例如通过其对另一分子的作用或通过对其的进一步作用的部分的含义。例如，间接细胞毒性部分可以起到募集免疫细胞(例如细胞毒性免疫细胞，例如细胞毒性T细胞)的作用，从而间接诱导细胞毒性作用。
通常，细胞毒性部分选自直接细胞毒性化学治疗剂，直接细胞毒性多肽，能够将前药转化为细胞毒性药物的部分，放射增敏剂，直接细胞毒性核酸，编码直接或间接细胞毒性多肽的核酸分子或放射性原子。此类细胞毒性部分的实例以及制备包含抗体和细胞毒性部分的缀合物的方法在WO 02/36771,WO 2004/046191和WO 2011/027132(其通过引用并入本文)中提供。
在一些实施方案中，细胞毒性部分是细胞毒性化学治疗剂。细胞毒性化学治疗剂例如抗癌剂是本领域公知的，包括上文描述的那些。
上文提及的各种细胞毒性部分如细胞毒性化学治疗剂先前已经附着于抗体和其他靶向剂，因此本领域技术人员可以容易地制备包含这些试剂的本发明的免疫缀合物。例如，碳二亚胺缀合(Bauminger&Wilchek(1980)Methods Enzymol.70,151-159)可以用于将多种试剂(包括多柔比星)与抗体偶联。也可以使用其他将细胞毒性部分与抗体缀合的方法。例如，可以使用高碘酸钠氧化，然后是适当反应物的还原烷基化，戊二醛交联也可以使用。交联多肽的方法是本领域已知的并描述于WO 2004/046191中。然而，应当认识到，无论选择哪种产生本发明化合物的方法，都必须确定抗体保持其靶向能力并且所附着的部分保持其相关功能。
在本发明的一些实施方案中，细胞毒性部分可以是细胞毒性肽或多肽部分，通过所述细胞毒性肽或多肽部分，我们包括导致细胞死亡的任何部分。细胞毒性肽和多肽部分是本领域公知的，包括例如蓖麻毒素，相思豆毒蛋白，假单胞菌外毒素，组织因子等。将它们与靶向部分如抗体连接的方法也是本领域已知的，并且包括例如交联多肽的常规方法和使用重组DNA技术以融合多肽产生化合物。蓖麻毒素作为细胞毒剂的用途描述于Burrows&Thorpe(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90,8996-9000，组织因子的使用(其导致局部血液凝固和肿瘤梗塞)已经由Ran et al(1998)Cancer Res.58,4646-4653and Huang et al(1997)Science 275,547-550描述。Tsai et al(1995)Dis.Colon Rectum 38,1067-1074描述了与单克隆抗体缀合的相思豆毒蛋白A链。其他核糖体失活蛋白在WO 96/06641中被描述为细胞毒剂。假单胞菌外毒素也可用作细胞毒性多肽部分(Aiello et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92,10457-10461)。
某些细胞因子，例如TNFα，INFγ和IL-2也可用作细胞毒剂。
若以足够的剂量递送，某些放射性原子也可以具有细胞毒性。因此，在一些实施方案中，细胞毒性部分可以包含放射性原子，其在使用中向靶位点递送足够量的放射性以具有细胞毒性。合适的放射性原子包括磷-32，碘-125，碘-131，铟-111，铼-186，铼-188或钇-90，或发射足够能量以破坏相邻细胞，细胞器或核酸的任何其他同位素。优选地，本发明化合物中的放射性原子的同位素和密度使得将超过4000cGy(优选至少6000,8000或10000cGy)的剂量递送至靶位点，并且优选递送至靶部位及其细胞器，特别是细胞核处的细胞。
放射性原子可以以已知方式附着于抗体。例如，EDTA或另一种螯合剂可以与抗体附着并用于附着111In或90Y。酪氨酸残基可以用125I或131I标记。
在一些实施方案中，细胞毒性部分可以是放射增敏剂。放射增敏剂包括氟嘧啶，胸苷类似物，羟基脲，吉西他滨，氟达拉滨，烟酰胺，卤代嘧啶，3-氨基苯甲酰胺，3-氨基苯基二酰胺(3-aminobenzodiamide)，etanixadole，哌莫硝唑和米索硝唑(参见例如McGinn et al(1996)J.Natl.Cancer Inst.88,1193-11203；Shewach&Lawrence(1996)Invest.New Drugs14,257-263；Horsman(1995)Acta Oncol.34,571-587；Shenoy&Singh(1992)Clin.Invest.10,533-551；Mitchell et al(1989)Int.J.Radiat.Biol.56,827-836；Iliakis&Kurtzman(1989)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.16，1235-1241；Brown(1989)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.16,987-993；Brown(1985)Cancer 55,2222-2228)。
在一些实施方案中，细胞毒性部分可以是促凝血因子，例如组织因子的胞外域(Rippmann et al(2000)“Fusion of the tissue factor extracellular domain to atumour stroma specific single-chain fragment variable antibody results in anantigen-specific coagulation-promoting molecule.”Biochem J.349:805-12；Huanget al(1997)“Tumor infarction in mice by antibody-directed targeting of tissuefactor to tumor vasculature.”Science.275(5299):547–550。
在一些实施方案中，细胞毒性部分可以是间接细胞毒性多肽。在特别优选的实施方案中，间接细胞毒性多肽是具有酶活性并且可以将相对无毒的前药转化为细胞毒性药物的多肽。当靶向部分是抗体时，这种类型的系统通常称为ADEPT(抗体定向酶前体药物疗法)。该系统要求靶向部分将酶促部分定位于患者身体内的期望部位(例如与肿瘤相关的新血管组织的部位)，并且在允许酶在该部位处定位的时间之后，施用作为酶的底物的前药，催化的终产物是细胞毒性化合物。该方法的目的是使药物在期望部位的浓度最大化并使药物在正常组织中的浓度最小化((Senter et al(1988)“Anti-tumor effects ofantibody-alkaline phosphatase conjugates in combination with etoposidephosphate”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4842-4846；Bagshawe(1987)Br.J.Cancer 56,531-2；和Bagshawe,et al(1988)“A cytotoxic agent can be generated selectivelyat cancer sites”Br.J.Cancer.58,700-703)；Bagshawe(1995)Drug Dev.Res.34,220-230和WO 2004/046191描述了各种酶/前药组合，其可以适用于本发明的上下文。
通常，与细胞毒性药物相比，前药相对无毒。通常，它具有小于10％的毒性，优选小于1％的毒性，如在合适的体外细胞毒性测试中测量。
如本申请中使用，术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其与亲本药物相比活性较低并且能够被酶促活化或转化为更具活性的亲本形式(参见例如D.E.V.Wilman"Prodrugs in Cancer Chemotherapy"Biochemical Society Transactions14,375-382(615th Meeting,Belfast 1986)和V.J.Stella et al."Prodrugs:A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery"Directed Drug Delivery R.Borchardt et al(编)第247-267页(Humana Press 1985))。
可能的是能够将前药转化为细胞毒性药物的部分会与化合物的剩余部分分离是有活性的，但是仅当(a)它与化合物的剩余部分组合和(b)将化合物附着于靶细胞，与靶细胞相邻或在靶细胞中内化时使它变为有活性是有必要的。
细胞毒性部分可以是在照射时变成细胞毒性或释放细胞毒性部分的部分。例如，当适当照射时，硼-10同位素释放出具有细胞毒性的α粒子(US4,348,376；Primus et al(1996)Bioconjug.Chem.7:532-535)。
类似地，细胞毒性部分可以是可用于光动力疗法的细胞毒性部分，例如光敏素(参见例如Dougherty et al(1998)J.Natl.Cancer Inst.90,889-905)。
在一些实施方案中，细胞毒性部分是抗体，例如特异性结合免疫细胞，例如细胞毒性免疫细胞(例如T细胞)的抗体。因此，在此类情况下，本发明的化合物可以是不对称的IgG样抗体(例如triomab/quadroma，Trion Pharma/Fresenius Biotech；结入孔(knobs-into-holes)，Genentech；Cross MAbs，Roche；静电匹配的抗体，AMGEN；LUZ-Y，Genentech；链交换工程化域(SEED)体，EMD Serono；biolonic，erus；和Fab交换抗体，Genmab)，对称IgG样抗体(例如双重靶向(DT)-Ig，GSK/Domantis；二合一抗体(two-in-one antibody)，Genentech；交联的MAb，karmanos cancer center；mAb<2>，F-star；和Cov X-body，Cov X/Pfizer)，IgG融合物(例如双变体域(DVD)-lg，Abbott；IgG样双特异性抗体，Eli Lilly；Ts2Ab，Medimmune/AZ；BsAb，ZymoGenetics；HERCULES，Biogen Idee；TvAb，Roche)Fc融合物(例如ScFv/Fc融合物，Academic Institution；SCORPION，Emergent BioSolutions/Trubion，ZymoGenetics/BMS；双亲和重靶向技术(Fc-DART)，MacroGenics；双重(ScFv)2-Fab，National Research Center for Antibody Medicine)Fab融合物(例如F(ab)2，Medarex/AMGEN；双效或双Fab，Genentech；对接锁定(Dock-and-Lock，DNL)，ImmunoMedics；二价双特异性，Biotechnol；和Fab-Fv，UCB-Celltech)，基于ScFv和双抗体的抗体(例如双特异性T细胞结合剂(BiTE)，Micromet；串联双抗体(Tandab)，Affimed；DART，MacroGenics；单链双抗体，Academic；TCR样抗体，AIT，Receptor Logics；人血清白蛋白ScFv融合物，Merrimack；和COMBODIES，Epigen Biotech)，IgG/非IgG融合物(例如免疫细胞因子，EMDSerono，Philogen，ImmunGene，ImmunoMedics；超抗原融合蛋白，Active Biotech；和针对癌症的免疫动员性mTCR，ImmTAC)和寡克隆抗体(如Symphogen和Merus)。
在一些实施方案中，细胞毒性部分是吡咯并苯二氮杂卓(pyrrolobenzodiazepine)二聚体(PBD)。PBD是有力的抗癌剂，已显示其在体内具有广谱抗肿瘤活性。这些药物通过结合DNA的小沟并以细胞难以识别和修复的方式将两条DNA链连接在一起发挥其活性。因此，在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物可以是包含PBD的本发明的抗体。关于PBD的进一步信息可以参见Hartley et al,2012(Invest New Drugs 30:950-958)。
如上所讨论，在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物可以是包含本发明的抗体和细胞毒性多肽的融合蛋白/多肽。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明免疫缀合物的核酸分子，例如融合蛋白/多肽，其包含本发明的抗体和细胞毒性多肽。
因此，或者，本发明也可以视为提供将细胞毒剂靶向受试者身体内的新血管系统的方法，该方法包括给受试者施用本发明的免疫缀合物(例如与细胞毒剂缀合的本发明的抗体)。优选地，新血管系统是肿瘤新血管系统。
因此，本发明的另一方面包括本发明的免疫缀合物(例如与细胞毒剂偶联的本发明的抗体)，用于将细胞毒剂靶向受试者身体内的新血管系统(例如肿瘤新血管系统)。
因此，本发明的另一方面包括本发明的免疫缀合物(例如与细胞毒剂偶联的本发明的抗体)在制备或制造药物中的用途，所述药物用于将细胞毒剂靶向受试者身体中的新血管系统(例如肿瘤新血管系统)。
技术人员将理解，将细胞毒剂靶向新血管系统将起到抑制血管生成的作用。因此，显然本发明的免疫缀合物可以用于上文描述的治疗方法和用途。还将理解，尽管本发明的免疫缀合物可以是在不存在任何其他的治疗剂(例如，抗癌症和/或抗血管生成化合物/试剂)的情况下在临床上有效的，但是可以仍然有利的是与如上所述的另外的抗癌和/或抗血管生成化合物/试剂联合(分开，序贯或随后)施用免疫缀合物。
本发明的抗体与CLEC14A结合。因此，本发明的抗体可用于体内或体外检测CLEC14A，特别是检测CLEC14A+细胞。例如，当CLEC14A在某些肿瘤细胞上表达时，本发明的抗体可以用于体内或体外检测肿瘤细胞，特别是当与可检测部分缀合(偶联，附着或连接)时。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了免疫缀合物，其包含本发明的抗体和可检测的部分。此类化合物可以与适当的检测方法结合使用，以检测受试者中CLEC14A，特别是CLEC14A+细胞的位置，从而鉴定受试者中血管生成(例如肿瘤血管生成)的部位和程度，如以及在受试者中血管生成(例如肿瘤血管生成)抑制。
或者，本发明提供了诊断或成像剂，其包含与直接或间接产生可检测信号的标记物(可检测部分)连接的本发明抗体。
在一些实施方案中，本发明的免疫缀合物可以是融合蛋白/多肽，其包含本发明的抗体和包含多肽(例如直接信号给予或可用于产生或生成可检测信号的多肽)的可检测部分。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了编码本发明免疫缀合物，例如融合蛋白/多肽的核酸分子，所述融合蛋白/多肽包含本发明的抗体和包含多肽多肽的可检测部分。
通过“可检测的部分”，我们包括下述含义：该部分是当在将本发明的化合物施用于患者后可以通常从身体外非侵入性，以及在定位的靶物的部位处检测的部分。因此，本发明的免疫缀合物也可用于成像和诊断，尤其是在实体瘤的新血管系统的成像和诊断中，如下文进一步描述的。
在一些实施方案中，可检测部分是或包含磁性纳米颗粒，放射性核素或荧光团。
因此，在一些实施方案中，可检测部分可以是可用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括锝99m或碘123用于闪烁扫描研究。其他可以选自：碘124；碘125；碘126；碘-131；碘133；铟-111；铟-113m，氟18；氟19；碳11；碳-13；铜64；铜67；氮13；氮15；氧15；氧17；砷72；钆；锰；铁；氘；氚；钇86；锆89；溴77，镓67；镓68，钌95，钌97，钌103，钌105，汞107，铼99m，铼101，铼105，钪47。如本领域已知的，可以使用合适的方法将这种放射性同位素与抗体偶联-直接或通过螯合剂如EDTA或DTPA。
在一些实施方案中，可检测部分包括X射线可检测化合物，例如铋(III)，金(III)，镧(III)或铅(II)；放射性离子，如镓67，镓68，汞177，汞203，铼186，铼188，铷97，铷103或钇90；核磁自旋共振同位素，如钴(II)，铜(II)，铬(III)，镝(III)，铒(III)，钆(III)，钬(III)，铁(II)，铁(III)，锰(II)，钕(III)，镍(II)，钐(III)，铽(III)，钒(II)或镱(III)；或罗丹明或荧光素。
可以使用的其他易于检测的部分包括例如用于磁共振成像(MRI)的自旋标记物，例如碘123，碘131，铟111，氟19，碳13，氮15，氧17，钆，锰或铁。
放射性标记物或其他标记物可以以已知方式掺入化合物中。例如，若抗体可以生物合成或通过化学氨基酸合成使用合适的氨基酸前体合成，所述氨基酸前体包括例如氟19代替氢。标记物，如99mTc，123I，186Rh，188Rh和111In可以通过抗体中的半胱氨酸残基连接。钇90可以通过赖氨酸残基附着。可以使用IODOGEN方法(Fraker et al(1978)Biochem.Biophys.Res.Comm.80,49-57)掺入碘123。参考文献(“Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy”,J.F.Chatal,CRC Press,1989)详细描述了其他方法。
许多合适的荧光团和检测方法是本领域公知的，并且例如由Stefan Andersson-Engels et al(1997)“In vivo fluorescence imaging for tissuediagnostics.Phys.Med.Biol.42:815-824； et al(2008)“Near-InfraredEmitting Fluorophore-Doped CalciumPhosphate Nanoparticles for In Vivo Imagingof Human Breast Cancer”ACS Nano 2(10):2075-84；和Chin et al(2009)“In-vivooptical detection of cancer using chlorin e6–polyvinylpyrrolidone inducedfluorescence imaging and spectroscopy”BMC Medical Imaging 9:1(doi:10.1186/1471-2342-9-1)描述。实例包括荧光素及其衍生物，荧光染料，罗丹明及其衍生物，绿色荧光蛋白(GFP)，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)等。在此类缀合物中，本发明的抗体或其功能性片段可以通过本领域技术人员已知的的方法来制备。
可检测部分可以包括可检测的酶，例如过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖淀粉酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，溶菌酶，苹果酸脱氢酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶。
可检测部分可包含分子，如生物素，洋地黄毒苷(digoxygenin)或5-溴脱氧尿苷。
可检测部分可以包含化学发光标记物，例如鲁米诺(luminol)和二氧杂环丁烷(dioxetanes)，或生物发光标记物，如萤光素酶和萤光素。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了在受试者体内成像新血管系统的方法，该方法包括：
向受试者施用本发明的成像剂(例如包含本发明的抗体和可检测部分的免疫缀合物)，和
对体内可检测部分进行成像。优选地，新血管系统是肿瘤新血管系统。
在一些实施方案中，受试者可以具有实体瘤，优选例如如上所述的那些实体瘤，并且将肿瘤的新血管系统成像。因此，成像剂(例如免疫缀合物)在身体中特定器官处的定位指示个体可以在该器官处具有实体瘤或可以正在形成实体瘤。该方法可用于例如确定先前诊断的实体瘤的大小，确定针对实体瘤的疗法的有效性，或确定肿瘤的转移程度。用于对身体内可检测部分成像的方法是本领域公知的，并且包括PET(正电子发射断层摄影术)。
因此，还可以看出本发明提供了检测，诊断和预后受试者中的实体瘤的方法，该方法包括：向受试者施用本发明的成像剂(例如免疫缀合物)，并检测身体内可检测部分的存在和/或位置。
从上面的讨论中可以明显看出，本发明提供了各种组合物，例如药物，治疗，诊断，成像，包含本发明的抗体(包括上文描述的免疫缀合物)和/或本发明的免疫效应细胞，和药学上可接受的稀释剂，载体或赋形剂。在这方面，应当理解，通常可以将本发明的试剂(即抗体，免疫效应细胞，载体，病毒等)配制成药物组合物以对个体(即受试者)施用，即与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起。
“药学上可接受的”包括制剂是无菌和无热原的。合适的药物载体，稀释剂和赋形剂在药学领域是公知的。在与药物相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。通常，载体将是水或盐水，其将是无菌和无热原的；但是，可以使用其他可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物或制剂用于胃肠外施用，更特别用于静脉内施用。在优选的实施方案中，药物组合物适合于例如通过注射给患者静脉内施用。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和溶质，其使制剂与意图接受者的血液等张；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。
液体药物组合物(无论它们是溶液，悬浮液或其他类似形式)可以包括下列中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水，盐水溶液，优选生理盐水，林格氏溶液，等张氯化钠，不挥发油，如合成甘油单酯或甘油二酯，其可以充当溶剂或悬浮介质，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它溶剂；抗细菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和调节渗透压的试剂如氯化钠或右旋糖。胃肠外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿，一次性注射器或多剂量小瓶中。可注射药物组合物优选是无菌的。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数目和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定，尽管适当的剂量可以通过临床试验确定。
优选地，制剂是含有活性成分的日剂量或单位，每日亚剂量或其适当级份的单位剂量。
可以以药学上可接受的剂型以药物制剂的形式口服或通过任何胃肠外途径施用本发明的试剂或组合物，所述药物制剂包含活性成分，任选地以无毒有机或无机酸或碱，加成盐的形式。取决于病症和待治疗的患者，以及施用途径，组合物可以以不同剂量施用。
在人疗法中，本发明的试剂或组合物通常与根据预期施用途径和标准药学实践选择的合适的药物赋形剂，稀释剂或载体混合施用。
例如，本发明的试剂或组合物可以以片剂，胶囊，珠(ovules)，酏剂，溶液或悬浮液的形式口服，含服或舌下施用，其可以含有调味剂或着色剂，用于立即、延迟或控制释放应用。本发明的试剂或组合物还可以通过海绵体内(intracavernosal)注射施用。
合适的片剂可以含有赋形剂，例如微晶纤维素，乳糖，柠檬酸钠，碳酸钙，磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂如淀粉(优选玉米，马铃薯或木薯淀粉)，羟基乙酸淀粉钠，交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，和造粒粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，羟丙基纤维素(HPC)，蔗糖，明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸，山嵛酸甘油酯和滑石。
类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言，优选的赋形剂包括乳糖，淀粉，纤维素，乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂，本发明化合物可以与各种甜味剂或调味剂，着色剂或染料，乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂如水，乙醇，丙二醇和甘油混合和其组合进行组合。
本发明的试剂或组合物还可以以胃肠外施用，例如静脉内，动脉内，腹膜内，鞘内，心室内，胸骨内，颅内，肌内或皮下，或者它们可以通过输注技术施用。它们最好以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等张。若必要的话，水溶液应当适当缓冲(优选pH为3至9)。在无菌条件下制备合适的胃肠外制剂可通过本领域技术人员公知的标准制药技术容易地完成。
制剂可以单位剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以以冻干(冻干)状态储存，仅需要在使用之前立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由前述类型的无菌粉末，颗粒和片剂制备。
对于对人患者的口服和胃肠外施用，本发明的试剂或组合物的日剂量水平通常为每个成人1至1,000mg(即约0.015至15mg/kg)，以单剂量或分剂量施用。
因此，例如，本发明的试剂或组合物的片剂或胶囊剂可以含有1mg至1,000mg活性剂，用于一次的单一或两或更多施用，视情况而定。在任何情况下，内科医生将确定最适合于任何个体患者的实际剂量，并且它将随着特定患者的年龄，体重和响应而变化。上述剂量是一般情况示例性的。当然，可以有个别情况，其中更高或更低的剂量范围是有优点的，并且这些都在本发明的范围内。
本发明的试剂或组合物还可以鼻内或通过吸入施用，并且使用合适的推进剂从加压容器，泵，喷雾器或雾化器以干粉吸入器或气溶胶喷雾形式方便地递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，氢氟烷烃如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA 134A3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA3))，二氧化碳或其他合适的气体。在加压气雾剂的情况下，剂量单位可以通过提供阀门以递送计量量来确定剂量单位。加压容器，泵，喷雾器或雾化器可含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如三油酸山梨坦。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶制成)可配制成含有抗体和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。此类制剂可特别用于治疗肺实体瘤，诸如例如小细胞肺癌，非小细胞肺癌，胸膜肺母细胞瘤或类癌瘤。
气溶胶或干粉制剂优选地布置成使得每个计量剂量或“喷雾”含有至少1mg抑制剂以递送给患者。应当理解，具有气溶胶的总日剂量将因患者而异，并且可以以单剂量施用，或者更通常地，在一天中以分剂量施用。
在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物可以以栓剂或子宫托的形式施用，特别是用于治疗或靶向结肠，直肠或前列腺肿瘤。
在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物可以通过眼途径施用。对于眼使用，本发明的试剂或组合物可以配制成例如等渗pH调节的无菌盐水中的微粉化悬浮液，或者优选地，作为等渗pH调节的无菌盐水中的溶液，任选地与防腐剂例如苄基氯化铵组合。或者，可以将本发明的试剂或组合物配制成软膏，例如凡士林。此类制剂可特别用于治疗眼实体瘤，例如视网膜母细胞瘤，髓上皮瘤，葡萄膜黑素瘤，横纹肌肉瘤，眼内淋巴瘤或眶淋巴瘤。
在一些实施方案中，本发明的试剂或组合物可适合于对患者局部施用。本发明的试剂或组合物可以以洗剂，溶液，乳膏，软膏或撒粉的形式局部施用，或者可以透皮施用，例如，通过使用皮肤贴剂。对于局部施用于皮肤，本发明的试剂或组合物可以配制成合适的软膏，其含有悬浮或溶解在例如与下列中的一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油，液体凡士林，白色凡士林，丙二醇，聚氧乙烯聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。或者，它们可以配制成合适的乳液或乳膏，悬浮或溶解在例如以下一种或多种的混合物中：矿物油，硬脂山梨坦，聚乙二醇，液体石蜡，polysorbate 60，十六烷基酯蜡，棕榈醇，2-辛基十二醇，苯甲醇和水。此类制剂可特别用于治疗皮肤实体瘤，例如基底细胞癌，鳞状细胞癌或黑素瘤。
对于皮肤癌，本发明的试剂或组合物也可通过电子掺入(electroincorporation，EI)递送。当皮肤表面上直径达30微米的小颗粒经历与电穿孔中使用的电脉冲相同或相似的电脉冲时发生EI。在EI中，这些颗粒被驱动通过角质层并进入皮肤的更深层。颗粒可以用抑制剂加载或涂覆，或者可以简单地充当“子弹”，其在皮肤中产生孔，本发明的试剂或组合物可以通过该孔进入。
适于在口腔中局部施用的制剂包括锭剂，其包含调味基础，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的活性成分的；软锭剂，包含惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性成分；和漱口剂，其包含在合适的液体载体中的活性成分。此类制剂可特别用于治疗口腔和咽的实体瘤。
在一些实施方案中，可以使用可注射的持续释放药物递送系统递送本发明的试剂或组合物。这些专门设计用于降低注射频率。此类系统的一个例子是Nutropin Depot，其将重组人生长激素(rhGH)包囊在可生物降解的微球中，一旦注射，所述微球在持续的时间段内缓慢释放rhGH。
本发明的试剂或组合物可以通过手术植入装置施用，该装置将药物直接释放到所需部位，例如，进入眼以治疗眼肿瘤。此类对疾病部位的直接应用实现有效的治疗而没有显著的全身副作用。
用于递送本发明的试剂或组合物的替代方法是热敏感的ReGel可注射系统。低于体温，ReGel是一种可注射液体，在体温下它立即形成凝胶储库，所述凝胶储库缓慢侵蚀并溶解成已知的，安全的，可生物降解的聚合物。随着生物聚合物溶解，活性药物随时间递送。
本发明的试剂或组合物也可以口服递送。该过程采用自然过程在体内口服摄取维生素B12以共同递送蛋白质和肽。通过利用维生素B12摄取系统，蛋白质或肽可以穿过肠壁。在维生素B12类似物和药物之间合成复合物，其保留对复合物的维生素B12部分中内在因子(IF)的显著亲和力和复合物的药物部分的显著生物活性两者。
本发明的核酸分子试剂(例如核酸分子，载体等)可以作为如下所述的合适的遗传构建体施用，并在表达它的情况下递送给患者。通常，遗传构建体中的核酸与可在细胞中表达化合物的启动子可操作地连接。本发明的遗传构建体可以使用本领域公知的方法，例如Sambrook等(2001)中的方法制备。
尽管用于递送多核苷酸的遗传构建体可以是DNA或RNA，但优选它们是DNA。
优选地，遗传构建体适于递送至人细胞，例如可以使用转座子系统(例如sleepingbeauty,piggyBac)来将靶DNA整合到宿主细胞基因组中。将遗传构建体导入细胞中的手段和方法是本领域已知的，包括使用免疫脂质体，脂质体，病毒载体(包括痘苗，改良痘苗，慢病毒，细小病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体)，并通过直接递送DNA，例如使用基因枪和电穿孔。此外，将多核苷酸递送至患者的靶组织以进行治疗的方法也是本领域公知的。在另一种方法中，使用利用受体介导的胞吞作用将DNA大分子携带到细胞中的高效核酸递送系统。这通过将铁转运蛋白转铁蛋白与结合核酸的聚阳离子结合来实现。使用高效率受体介导的本发明的DNA构建体或其他遗传构建体的递送，其使用由Cotten等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:6094-6098的方法产生的缺陷或化学灭活的腺病毒颗粒的内体破坏活性进行。应当理解，“裸DNA”和与阳离子和中性脂质复合的DNA也可用于将本发明的DNA导入待治疗个体的细胞中。Ledley(1995，Human Gene Therapy 6,1129-1144)中描述了基因治疗的非病毒方法。
虽然对于特定组织的癌症/肿瘤，在编码多核苷酸抑制剂的载体中使用组织特异性启动子可能是有用的，但这不是必需的，因为预期除了癌症/肿瘤外的位置处的身体中的核酸分子试剂的表达风险与对患有癌症/肿瘤的患者的治疗性益处相比是可耐受的。可以期望能够暂时调节细胞中多核苷酸抑制剂的表达，尽管这也不是必需的。
可以冻干本发明的试剂和组合物用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。可以使用任何合适的冻干方法(例如喷雾干燥，滤饼干燥)和/或重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重建可导致不同程度的抗体活性丧失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体倾向于具有比IgG抗体更大的活性丧失)并且可能必须向上调整使用水平以补偿。在一个实施方案中，当再水合时，冻干(冷冻干燥)的抗体损失不超过约20％，或不超过约25％，或不超过约30％，或不超过约35％，或不超过约40％，或不超过约45％，或不超过约50％的其活性(在冻干前)。
可以适当地修改用于施用的本发明的试剂(例如抗体，免疫效应细胞，核酸分子，载体等)以用于药物组合物。例如，可以例如通过使用适当的添加剂，例如盐或非电解质，乙酸盐，EDTA，柠檬酸盐，Tris，磷酸盐或乙酸盐缓冲液，甘露醇，甘氨酸，HSA(人血清白蛋白)或Polysorbate在本发明的组合物中将试剂稳定化以防止降解。许多稳定剂在本领域中是已知的。
如本文所定义，本发明的抗体还可以用作体外或体内应用和测定的分子工具。由于抗体具有抗原结合位点，这些可以作为特异性结合对的成员起作用，并且这些分子可以用于需要特定结合对成员的任何测定中。
因此，本发明的其他方面提供了包含如本文所定义的本发明的抗体的试剂和此类抗体作为分子工具的用途，例如在体外或体内测定中的用途。
本发明进一步包括试剂盒，其包含以下一种或多种：本发明的抗体，CAR，免疫缀合物或组合物或一种或多种编码本发明的抗体或CAR的核酸分子，或一种或多种包含本发明的核酸序列的重组表达载体，或一种或多种包含本发明的重组表达载体或核酸序列的宿主细胞(包括免疫效应细胞)或病毒。优选地，所述试剂盒用于如本文所述的方法和用途，例如本文所述的治疗，诊断或成像方法，或用于如本文所述的体外测定或方法。此类试剂盒中的抗体可以优选为如本文别处所述的抗体缀合物(免疫缀合物)，例如可以与可检测部分或治疗或细胞毒剂缀合。优选地，所述试剂盒包括使用试剂盒组分的说明书，例如用于诊断。优选地，所述试剂盒用于诊断或治疗如本文别处所述的疾病，并且任选地包括使用试剂盒组分来诊断或治疗此类疾病的说明书。
癌症治疗也可以通过以下方式进行：
(a)通过向具有肿瘤的动物或患者(即受试者)施用诊断量至少第一可检测标记的本发明的抗CLEC14A抗体(例如本发明的成像剂)，从而形成肿瘤的可检测图像来形成肿瘤图像；和
(b)随后给同一动物或患者施用治疗优化量的至少第一本发明治疗剂(例如抗体，免疫效应细胞或组合物)，从而引起抗肿瘤效果。
本文对“肿瘤”的任何提及也指“癌症”或“癌瘤”。也可以治疗转移性癌症，其可以减少原发性肿瘤的转移。留在术后患者中的所谓的微小残留病(MRD)可以适合用本发明的抗CLEC14A抗体和其它试剂，例如免疫效应细胞或组合物进行的免疫疗法。
要使用本发明的方法和细胞治疗的受试者可以是任何哺乳动物物种。例如，受试者可以是任何种类的家养宠物，例如小鼠，大鼠，沙鼠，兔，豚鼠，仓鼠，猫或狗，或家畜，例如山羊，绵羊，猪，牛或马。在本发明的另一个优选实施方案中，受试者可以是灵长类动物，例如猴，长臂猿，大猩猩，orang-utang，黑猩猩或倭黑猩猩。然而，在本发明的一个优选实施方案中，受试者是人。
如在整个申请中所使用的，术语“一个”和“一种”在它们意味着所引用的组件或步骤的“至少一个/种”、“至少第一”、“一个/种或多个/种”或“多个/种”的意义上使用，除了在其后具体说明上限的情况之外。因此，如本文所用，“抗体”意指“至少第一抗体”。根据本公开内容，本领域普通技术人员将知道组合的可操作限制和参数，与任何单一试剂的量一样。
现在将参考附图在以下非限制性实施例中更详细地描述本发明，其中：
图1显示了CLEC14A在HUVEC和其他原代细胞中的相对表达的图。CLEC14A在内皮细胞(HUVEC)中特异性表达，而不在人主动脉平滑肌细胞(HASMC)，人肺成纤维细胞(MRC5)，人支气管上皮细胞(HBE)，肝细胞或外周血单个核细胞(PBMC)中表达。
图2显示[A]靶向CLEC14A的siRNA双链体可以有效地敲低HUVEC中的CLEC14A mRNA表达，如通过qPCR测定的。通过相对于flotilin2标准化表达来确定相对表达。[B]通过Western印迹分析测定蛋白质水平的CLEC14A的敲低。微管蛋白用作上样对照。[C]对照或clec14a靶向siRNA处理的HUVEC在16小时后芽长出的代表性图像。[D]用于对照和CLEC14A敲低HUVEC的27个球状体(来自3个脐带的9个球状体)的芽的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。[E]用于混合对照(绿色)和clec14a靶向siRNA处理的HUVEC(红色)的24小时后芽长处的代表性图像。[F]来自对照(CON)和CLEC14A敲低(KD)HUVEC的尖端和茎细胞的百分比的定量；使用Bonferroni后检验的双因素ANOVA统计检验***＝p<0.001，ns＝不显著。
图3显示[A]C57BL/6(clec14a+/+)或C57BL/6(Clec14atm1(KOMP)Vlcg)(clec14a-/-)小鼠中clec14a基因的示意图。[B]对从三个clec14a+/+小鼠(白色条)和三个clec14a-/-小鼠(黑色条)产生的cDNA定量PCR分析clec14a的5'非翻译区(UTR)，编码序列(CDS)和3'UTR。通过相对于flotilin2标准化表达来确定相对表达。[C]使用针对鼠CLEC14A的多克隆抗血清，来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的肺裂解物中CLEC14A蛋白表达的Western印迹分析。微管蛋白用作上样对照。[D]来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的主动脉环发芽测定的代表性图像。每个环形成的管的定量[E]，以及内皮管从主动脉环迁移的最大距离的定量[F]，每个基因型48个环的数据，每个基因型6个小鼠；Mann-Whitney统计检验p<0.001。[G]来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的海绵植入物的苏木精和曙红染色切片的代表性图像，分析在海绵中心的切片。[H]对G中所示的海绵植入物的细胞侵入的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.05。[I]血管密度的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。[J]用苏木精和曙红复染来自clec14a-/-小鼠的用x-gal染色的肝脏和海绵组织切片。
图4显示[A]在clec14a+/+(带点的黑线)和clec14a-/-(带有正方形的黑线)小鼠中的Lewis肺癌(LLC)肿瘤生长；双因素ANOVA统计分析，*＝p<0.05，**＝p<0.01，***＝p<0.001。[B]LLC肿瘤的代表性图像。[C]7个clec14a+/+(点)和7个clec14a-/-(正方形)小鼠的终点肿瘤重量；Mann-Whitney统计检验p<0.001。[D]针对鼠CD31染色的LLC肿瘤切片的免疫荧光染色的代表性图像。来自clec14a+/+和clec14a-/-小鼠的血管密度[E]和百分比内皮覆盖率[F]的定量；Mann-Whitney统计检验p<0.0001。[G]用苏木精和曙红复染的用x-gal染色的来自clec14a-/-小鼠的肝脏和LLC肿瘤组织切片。
图5显示(A)HUVEC划痕伤口愈合测定结果的光学显微镜图像，其中抗CLEC14A单克隆抗体CRT-3显示出伤口愈合的延迟。(B)(A)结果的图形表示。
图6显示了用CLEC14A抗体处理的HUVECS的小管形成测定的分析。用20μg/mlCRT2,3或4或小鼠IgG同种型对照处理HUVECS。在16小时时拍摄小管图像并分析总小管长度，接合数目，分支数目，分支长度，网孔数目和总网孔面积。显示的数据代表三个实验，每个实验分析五个数据点。误差棒显示SEM。*P，0.05。**P<0.01..
图7显示CRT-2和CRT-3与用CLEC14A转染的HEK293T和(B)用血栓调节蛋白转染的HEK293T结合的流式细胞术分析图。
图8显示CRT-2和CRT-3与下列各项的结合的流式细胞术分析图：(A)用含有血栓调节蛋白的CTLD和CLEC14A的剩余部分的嵌合体转染的HEK293T，(B)用含有血栓调节蛋白的sushi样域和CLEC14A的剩余部分的嵌合体转染的HEK293T和(C)含有血栓调节蛋白的环残基97-108和CLEC14A的剩余部分的嵌合体转染的HEK293T。
图9显示了CD141的CLEC14A区1-42；CD141的CLEC14A区97-108；和CD141的CLEC14A区122-142的比对。
图10显示了共表达截短的CD34标志物基因和scFv片段/CD3ζ链嵌合受体的逆转录病毒CAR载体(基于pMP71)。表达由LTR启动子驱动，并且2A肽接头确保CD34和CAR两者的等摩尔表达。第二代CAR构建体包括CD28共刺激域。B显示通过流式细胞术分析的CD34染色，证明使用共表达CLEC14A特异性CAR的逆转录病毒构建体成功转导T细胞。基于抗体CRT3的第一代CAR分别称为CRT3.z。基于抗体CRT3的第二代CAR分别称为CRT3.28z。(C)显示了通过流式细胞术分析的细胞，使用CLEC14A-Fc针对CAR表达直接染色(％值显示CLEC14A-Fc的特异性结合，其已经扣除仅用Fc的背景染色)。
图11显示了经CAR转导的T细胞在体外响应CLEC14A。对经转导以表达基于抗体CRT3的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞测试其响应CLEC14A的能力，所述CLEC14A表达为(A)平板结合的重组Fc融合蛋白，(B)在工程化CHO细胞上表达，或(C)在静态培养中培养时天然表达CLEC14A的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达。使用用于干扰素γ产生的ELISA测量的T细胞应答。显示的数据代表从3-7次重复实验获得的数据。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+SD。
图12显示了CLEC14A特异性CAR转导的T细胞的进一步体外功能测试。在以下功能性测定法中对经转导以表达基于抗体CRT3的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞测试其响应CLEC14A的能力：(A)细胞毒性，使用工程化改造为表达人CLEC14A的CHO细胞(扣除单独CHO(对照细胞)裂解的背景水平)。显示的数据代表5次重复实验。(B)增殖，使用CFSE标记的CAR转导的T细胞，当与HUVEC共培养4天时，我们测量了CAR+(CD34+)和CAR-(CD34-)细胞亚组的增殖。显示的数据代表2次重复实验。(C)使用干扰素γ释放评估(CLEC14A特异性CAR转导的T细胞对人和小鼠CLEC14A两者的响应。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所示数据代表6次重复实验。所有直方图显示均值响应+SD。
图13显示了使用注射CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的健康C57/BL6小鼠体内毒性测试后组织样品的组织学图片。
图14显示了来自小鼠的Lewis肺癌肿瘤体积的图，所述小鼠用经转导以表达基于抗体CRT-3的第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞处理。小鼠接受总共2000万个T细胞(CD8:CD4＝5:2)，其中CRT3.28z在220万个这些细胞中表达。然后使用(A)生物发光或(B)卡尺监测肿瘤生长。
图15显示了描绘在Lewis肺癌肿瘤中肿瘤重量(A)，血管覆盖的肿瘤组织面积百分比(B)和纤维蛋白原染色的肿瘤组织百分比(C)的柱形图，该肿瘤来自用经转导以表达基于抗体CRT-3的第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞注射的小鼠。
图16显示(A)在(i)0分钟和(ii)90分钟用CRT-3处理的HUVEC的图像，并证明抗体被内化；(B)显示用CRT-3-抗体药物缀合物(免疫缀合物)处理的HUVEC的细胞活力的图。
图17显示(A)用对照ADC(B12-ADC)处理后24小时和(B)用CRT-3-ADC处理后24小时的小鼠肺组织的照片。
图18显示了对滴定浓度的人和小鼠重组CLEC14A的CRT1,3和5CAR(具有CD28共刺激域)T细胞应答。
图19显示了具有不同共刺激域的CAR的构建体的设计；1)tCD34-F2A-scFv-CD28TM-CD28信号-CD3zeta,2)tCD34-F2A-scFv-CD8TM-4-1BB信号-CD3zeta,3)tCD34-F2A-scFv-CD8TM-OX40信号-CD3zeta,4)tCD34-F2A-scFv-CD28TM-CD28信号-4-1BB信号–CD3zeta,5)tCD34-F2A-scFv-CD28TM-CD28信号-OX40信号-CD3zeta,6)tCD34-F2A-scFv-CD8TM-4-1BB信号–OX40信号-CD3zeta。包括tCD34以鉴定成功转导的细胞，因此构建体可以排除此物和F2A。可以另外包括铰链或间隔物区域，例如，来自CD8a的一个。
图20显示了用CRT1,3和5CAR相对于表达CLEC14A的小鼠内皮细胞的细胞毒性测定结果(图20A)。CRT 1,3和5CAR的增殖测定的结果在图48B中显示。
图21显示了包含不同的共刺激域的CRT3 CAR T细胞的功能测试并且显示响应于滴定数目的表达人CLEC14A的CHO细胞的IFNγ产生。
图22显示在与工程化改造为表达CLEC14A嵌合体(A1-具有小鼠胞内域的人CLEC14A，B1-具有小鼠跨膜和胞内域的人CLEC14A，huCLEC-人CLEC14A)的293或SEND细胞温育后CRT1,3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞的IFNγ释放。与SEND细胞一起温育后，CAR T细胞的细胞毒性数据显示在图22B中。
图23显示了通过体外转录产生用于电穿孔的RNA的合适载体的示意图。
图24显示可以用于转导鼠T细胞的编码CAR的构建体。构建体包含来自鼠蛋白的跨膜，共刺激和胞内信号传导序列(参见SEQ ID NO 116-121)。构建体可以进一步包含来自鼠CD8α的铰链或间隔物域。
*指变体序列
X指不存在氨基酸
实施例
实施例1-CLEC14A表达的分析
在捐赠者知情同意后，从英国国家卫生服务局(UK National Health Service)捐赠的脐带中分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。从胎盘解剖脐带，并在无菌PBS中洗涤静脉以除去血液。将在M199培养基(Sigma)中稀释的1mg/ml胶原酶注射到静脉中，然后在37℃下温育20分钟以分离内皮细胞。通过在含有10％FCS，10％大血管内皮细胞生长补充物(TCSCell Works)和4mM L-谷氨酰胺的M199完全培养基中洗涤来收集HUVEC，并在来自猪皮(Sigma)包被的皿的0.1％1型明胶上铺板。
原代细胞来源
人主动脉平滑肌细胞(HASMC)和人支气管上皮细胞(HBE)购自TCS Cell Works。人肺成纤维细胞(MRC5)获自癌症研究英国中心服务局(Cancer Research UK CentralServices)。人外周血单核细胞(PBMC)获自伯明翰大学癌症研究所。肝细胞是伯明翰大学免疫和感染学院David Adams教授的赠品。
RNA提取和实时PCR
使用TRI试剂(Sigma)从培养的原代细胞中分离总RNA，然后使用提供的随机引物使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)进行cDNA合成。在CLEC14A表达的原代细胞筛选中使用ProbeLibrary实时PCR测定系统(Exiqon)。选择Flotillin 2作为管家基因，相对于其标准化CLEC14A的表达。CLEC14A和Flotillin 2的Primerand探针组由ProbeFinder软件(Roche)设计。对于CLEC14A，引物和探针组是：
5'-CTGGGACCGAGGTGAGTG-3'(SEQ ID NO:79),和
5'-CGCGATGCAAGTAACTGAGA-3'(SEQ ID NO:80)，探针号24。
对于Flotillin 2，引物和探针组是：
5'-TGTTGTGGTTCCGACTATAAACAG-3'(SEQ ID NO:81)和
5'-GGGCTGCAACGTCATAATCT-3'(SEQ ID NO:82)，探针号28。在Rotor-Gene RG3000热循环仪(Corbett Research)上进行定量PCR反应。对于每种原代细胞类型，一式三份制备反应混合物，并在每个反应中施加5ng cDNA。使用ΔΔCt方法计算倍数变化。
HUVEC免疫荧光
在固定在冰冷甲醇中的玻璃微孔室(Nunc)中培养HUVEC，用PBST清洗，在PBST中的10％FCS 3％BSA中封闭。然后遵循用于石蜡包埋切片的相同方案用CLEC14A抗体染色或用针对人VE-钙粘蛋白的5μg/ml小鼠单克隆IgG抗体(Maria Grazia Lampugnani教授,FireInstitute for Molecular Oncology,Milan友情赠送)共染色细胞。用510激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss)分析切片染色。
结果
图1是显示CLEC14A在HUVEC和其他原代细胞中的相对表达的图。CLEC14A在内皮细胞中特异性表达。这确认了之前的发现，即CLEC14A是内皮特异性的。
使用CLEC14A特异性探针在实体瘤和正常组织的切片中表达CLEC14A。通过人卵巢，膀胱，肝，乳腺，结肠，直肠，食道，肾，肺，前列腺，胃，胰腺和甲状腺肿瘤组织中的免疫荧光测量CLEC14A表达。CLEC14A表达的内皮特异性通过与结合内皮细胞上的特定岩藻糖残基的乌乐树(Ulex europeaus)凝集素I(UEAI)共定位来证实。在分析的所有肿瘤组织的血管中看到CLEC14A表达。卵巢，膀胱，肝，乳腺，肾和前列腺肿瘤对CLEC14A表达呈强阳性，而胃，食道，肺，结肠，直肠，胰腺和甲状腺肿瘤组织显示较低水平的特异性CLEC14A表达。在任何相应的正常对照(非肿瘤)组织中未检测到CLEC14A表达。
总之，这些结果证明跨膜蛋白CLEC14A在肿瘤血管系统中特异性表达，因此可用作肿瘤内皮标志物。
实施例2：体外和体内CLEC14A功能的分析
材料和方法
用于Western印迹和免疫沉淀；一抗：绵羊多克隆抗人CLEC14A(R&D systems)，小鼠单克隆抗人Tubulin(Sigma)；二抗：与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG(Dako)，与HRP缀合的驴多克隆抗绵羊IgG(R&D系统)。用于免疫荧光；一抗：兔多克隆抗鼠PECAM(Santa Cruz)；二抗：与Alexa Fluor488缀合的驴多克隆抗兔(Invitrogen)。用于流式细胞术；一抗：小鼠单克隆抗HA标签(CRUK)，小鼠单克隆抗-CLEC14A(如下所述的C2，C4)；二抗：与Alexa Fluor488缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG(Invitrogen)。
用于蛋白质生产；使用慢病毒质粒psPAX2(慢病毒包装；Addgene)，pMD2G(包膜质粒；Addgene)和pWPI hCLEC14A-ECD-Fc(含有IRES-EGFP的慢病毒哺乳动物表达质粒；Addgene)。通过从clec14a IMAGE克隆(Origene)初始PCR亚克隆到pcDNA3-Fc质粒中产生pWPI hCLEC14A-Fc和mCLEC14A-Fc。使用的引物如下：
人CLEC14A fwd
5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCGGCGTTCGCCCTG3’(SEQ ID NO:83)；
人CLEC14A rev
5’AGAACCGCGGCCGCTGGAGGAGTCGAAAGCCTGAGGAGT3’(SEQ ID NO:84)；
鼠CLEC14A fwd
5’TAGTAGGAATTCGAGAGAATGAGGCCAGCGCTTGCCCTG3’(SEQ ID NO:85)；
鼠CLEC14A rev
5’CTACTAGCGGCCGCTCGTGGAAGAGGTGTCGAAAGT3’(SEQ ID NO:86)。
使用EcoR1和Not1限制性位点插入CLEC14A，进行进一步轮次的PCR亚克隆以将CLEC14A-Fc融合物转移到pWPI中。使用的引物如下：
人CLEC14A fwd
5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCGGCGTTC3’(SEQ ID NO:87)；
鼠CLEC14A fwd
5’TAGTAGTTAATTAAGAGAGAATGAGGCCAGCGCTT3’(SEQ ID NO:88)；
人Fc rev
5’CTACTAGTTTAAACTCATTTACCCGGAGACAGGGA3’(SEQ ID NO:89)。
对于该步骤，使用Pac1和Pme1限制性位点。
如前所述分离人脐静脉内皮细胞。在获得知情同意的情况下从BirminghamWomen's Health Care NHS Trust获得脐带。在第1-6代之间使用HUVEC，并在含有10％胎牛血清(PAA)，1％牛脑提取物，90μg/ml肝素和4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的M199完全培养基(cM199)中培养并且接种在涂有来自猪皮的0.1％1型明胶的平板上。将HEK293T细胞在含有10％胎牛血清(PAA)，4mM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen)的DMEM(Sigma)完全培养基(cDMEM)中培养。
如前所述进行HUVEC中的SiRNA转染。通过用上述慢病毒包装，包膜和表达质粒瞬时转染，在HEK293T细胞中产生慢病毒。将质粒在OptiMEM(Invitrogen)中与聚乙烯亚胺(36μg/ml)以1：4比率在室温下温育10分钟，然后加入到cDMEM中的HEK293T细胞中。培养基上清液用于转导新鲜的HEK293T细胞。分选GFP阳性HEK293T细胞并用于蛋白质生产。使用pHL-Avitag3hMMRN2通过如上所述的聚乙烯亚胺瞬时转染实现MMRN2在HEK293T细胞中的表达。
定量PCR
使用High-Capacity cDNA Archive试剂盒(Applied Biosystems)从1μg提取的总RNA制备cDNA。用Express QPCR supermix(Invitrogen)在RG-3000(Corbett/Qiagen，Manchester，UK)热循环仪上进行qPCR反应。人clec14a和flotillin-2的引物如前所述。小鼠clec14a 5'UTR，CDS和3'UTR以及鼠β-肌动蛋白的引物如下：
5’UTR fwd–TTCCTTTTCCAGGGTTTGTG(SEQ ID NO:90)；
5’UTR rev–GCCTACAAGGTGGCTTGAAT(SEQ ID NO:91)；
CDS fwd–AAGCTGTGCTCCTGCTCTTG(SEQ ID NO:92)；
CDS rev–TCCTGAGTGCACTGTGAGATG(SEQ ID NO:93)；
3’UTR fwd–CTGTAGAGGGCGGTGACTTT(SEQ ID NO:94)；
3’UTR rev–AGCTGCTCCCAAGTCCTCT(SEQ ID NO:95)；
mACTB fwd–CTAAGGCCAACCGTGAAAAG(SEQ ID NO:96)；
mACTB rev–ACCAGAGGCATACAGGGACA(SEQ ID NO:97)。
根据效率调整的数学模型计算相对表达比率。
Western印迹法和免疫沉淀
制备全细胞蛋白质裂解物并进行共免疫沉淀实验，其中从2x107个HUVEC中提取蛋白质。对于CLEC14A相互作用蛋白的初始分离，使用5μgCLEC14A-Fc或等摩尔量的hFc。对于内源性免疫沉淀实验，使用0.4μg抗CLEC14A抗体或绵羊IgG。对于封闭实验，将5μgCLEC14A-Fc或hFc与蛋白G珠在PBS中结合过夜。将珠在含有20％FCS(PAA)的PBS中封闭5-6小时。用增加浓度的mIgG oranti-CLEC14A抗体(CRT-2，如下所述)在结合缓冲液中封闭结合的CLEC14A-Fc或hFc蛋白过夜。标准方案用于Western印迹法和SDS-PAGE。如文中所示使用一抗与相应的HRP缀合的二抗。
流式细胞术
用细胞解离缓冲液(Invitrogen)分离细胞，在PBS中漂洗，然后在封闭缓冲液(PBS，3％BSA，1％NaN3)中温育15分钟。随后使用10μg/ml抗HA标签(CRUK)，10μg/ml抗CLEC14A(CRT-2，如下所述)作为一抗，在封闭缓冲液中染色30分钟。将细胞在PBS中漂洗并用在封闭缓冲液中与Alexa Fluor488(Invitrogen)缀合的山羊多克隆抗小鼠IgG染色。使用FACSCalibur装置(Becton Dickinson，Oxford，UK)收集数据(15,000个事件/样品)，并用Becton Dickinson Cell Quest软件分析结果。
HUVEC球状体发芽测定和体外基质胶管形成测定
每个球状体使用1000个HUVEC进行HUVEC球状体的产生和胶原凝胶中内皮发芽的诱导。在包埋后16小时进行定量。为了量化芽生长，计算芽数目，评估累积芽长度和最大芽长度。对于两个颜色发芽实验，用橙色和绿色CellTracker染料(Invitrogen)预标记HUVEC。24小时后，将球状体固定在4％甲醛中，并用Vectorshield(Vector labs)封固。用Axioskop2显微镜和AxioVision SE64Rel4.8软件(Zeiss，Cambridge，UK)对载玻片成像。
对于基质胶管形成测定，将1.4x105个HUVEC接种到12孔板中的70μl基底膜提取物(Matrigel，BD Bioscience，Oxford，UK)上。16小时后，使用Leica DM IL显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)和USB 2.0 2M Xli数码照相机(XL Imaging LLC，Carrollton，TX，USA)以10x放大率拍摄每孔5个视野的图像。使用Image J(CarpentierG.等,AngiogenesisAnalyzerforImageJ.4thImageJUserandDeveloperConferenceproceedings)并且在NIH网址(http://imagej.nih.gov/ij/macros/toolsets/Angiogenesis％20Analyzer.txt)可获得的血管生成分析仪插件分析图像。
蛋白质生产
收集来自表达CLEC14A-Fc的HEK293T细胞的培养基(CM)。使CM流过HiTrap蛋白AHP柱(GE healthcare，Amersham，UK)，并使用0-100％梯度的100mM柠檬酸钠(pH 3)洗脱蛋白质，然后用1M Tris碱中和。在SDS-PAG上运行级分，并通过考马斯染色和Western印迹法评估蛋白质纯度和特异性。将含有相似浓度蛋白质的级分组合，并在功能测定之前在PBS中透析。
单克隆抗体产生
小鼠单克隆抗体由Serotec Ltd(Oxford，UK)商业制备，使用我们提供的破坏耐受性的以下方案进行。以50μg在完全弗氏佐剂中皮下给予纯化的小鼠CLEC14A-Fc融合蛋白。两周后，对小鼠皮下给予另50μg，但这次是在弗氏佐剂中。将小鼠扑杀并在两周后收获脾脏用于融合。
产生clec14a-/-小鼠
将小鼠圈养在Birmingham Biomedical Services Unit(Birmingham,UK)。含有CLEC14A缺失盒(Clec14atm1(KOMP)Vlcg；项目ID VG10554)的C57BL/6N VGB6饲养细胞依赖性胚胎干细胞从Knockout Mouse Project(University of California，Davis，USA)获得。伯明翰大学的转基因小鼠房通过将胚胎干细胞注射到白化C57BL/6小鼠中而产生嵌合小鼠，并与C57BL/6雌性育种以产生对于盒杂合的小鼠。
主动脉环和鼠皮下海绵血管生成测定
分离主动脉并加工用于胶原中的主动脉环测定。定量管/芽长出，最大内皮迁移和总内皮长出。在第0天，在每个体侧的背部皮肤下向雄性C57黑色小鼠植入皮下无菌聚醚海绵盘(10x5x5mm)。每隔一天通过皮肤直接注射100μlbFGF(40ng/ml；R&D systems)到海绵中达14天。在第14天切除海绵，在10％福尔马林中固定，并石蜡包埋。切片用苏木精和曙红染色，使用Leica MZ 16显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)和USB 2.0 2M Xli数码照相机(XLImaging LLC，Carrollton，TX，USA)在1倍放大率下拍摄海绵横截面用于细胞侵入分析。分析通过Leica DM E显微镜(Leica，Milton Keynes，UK)在40x放大率下捕获的图像的血管密度。在每个海绵的每个切片的五个场中评估血管计数。所有动物实验均按照RB持有的内政部许可证号PPL 40/3339进行。
肿瘤植入测定
在8-10周龄时，将106个Lewis肺癌细胞皮下注射到雄性小鼠的体侧中。通过每日卡尺测量监测肿瘤生长，并且在生长2-4周后，通过重量确定肿瘤质量，在4％PFA中固定，石蜡包埋并且以6μm切割连续切片。
CLEC14A在体外调节发芽血管生成
为了研究CLEC14A在体外发芽血管生成中的作用，从靶向clec14a的siRNA或非互补siRNA双链体处理的HUVEC产生HUVEC球状体。通过qPCR在三个实验间以74％的平均降低(图2A)在mRNA水平上以及通过用抗CLEC14A多克隆抗血清探测的蛋白质提取物的Western印迹分析在蛋白质水平上(图2B)确认clec14a表达的敲低。来自CLEC14A敲低球状体的VEGF诱导的发芽受到损伤，与对照细胞的13.2个相比，敲低球状体平均产生每个球状体的6.9个芽(图2C和2D)。为了确定CLEC14A在尖端/茎细胞形成中的作用，在球体形成和诱导发芽之前，将对照HUVEC和敲低的HUVEC染成红色或绿色并混合(图2E)。与对照细胞(67％)相比，CLEC14A的敲低降低尖端位置处细胞的百分比(33％)，然而，对源自CLEC14A敲低的HUVEC的茎细胞的百分比没有影响(图2F)。这些数据提示CLEC14A在芽起始和迁移中起作用。
CLEC14A调节体内发芽血管生成
为了研究CLEC14A的体内和离体作用，产生小鼠以用lacZ报告物替换clec14a编码序列(图3A)。杂合子(clec14a-/+)的育种产生相等比例的雄性和雌性小鼠(分别为49.5％/50.5％)和野生型:杂合子:纯合子小鼠的孟德尔比率(分别为26.4％:47.2％:26.4％)。由于clec14a是内皮细胞限制性基因，因此从clec14a+/+和clec14a-/-小鼠中分离出主动脉。通过qPCR分析提取的cDNA并确认clec14a编码区的丧失，但保留5'和3'非翻译区的表达(图2B)。通过肺组织裂解物的Western印迹分析也确认蛋白质水平的CLEC14A丧失(图3C)。
为了确认CLEC14A在多细胞三维共培养中发芽血管生成中的作用，分离主动脉，切成环并包埋在胶原中。VEGF刺激细胞长出，并在内皮发芽的终点定量前7天内监测。同样，CLEC14A的丧失损害内皮芽长出和迁移(图3D)。与对CLEC14A敲除小鼠的观察相比，来自野生型小鼠的主动脉环产生管数目的超过倍增(与13.4个管相比30.6个管)(图3E)。此外，最大迁移(其由远离每个主动脉环的最远距离定义)在敲除培养物中也减少(图3F)。为了评估CLEC14A是否在体内具有相似的功能，将海绵桶皮下植入CLEC14A敲除小鼠中。每两天使用bFGF注射到海绵中刺激细胞浸润和新血管生成，持续两周。用苏木精和曙红染色的海绵切片的宏观分析揭示在clec14a-/-动物中细胞对海绵的浸润受损(图3G和3H)。此外，clec14a-/-动物的血管供应显著降低(p<0.01)(图3I)。为了确认在该模型中作为新血管生成血管衬里的内皮细胞表达clec14a，用x-gal染色来自CLEC14A KO小鼠的海绵和肝脏。与匹配的肝切片相比，在海绵内的血管上观察到强x-gal染色(图3J)。从这些数据，我们可以得出结论，小鼠CLEC14A表达在体内和体外调节内皮迁移和血管生成发芽，并且CLEC14A在发芽内皮上上调。
CLEC14A促进肿瘤生长
发现与来自健康组织的血管相比，CLEC14A表达在人肿瘤血管上高度上调，提示癌症疗法可以靶向CLEC14A。因此，为了研究CLEC14A的丧失是否实现肿瘤生长，我们使用同源Lewis肺癌(LLC)模型。对于这点，将1x106个LLC细胞皮下注射到clec14a+/+或clec14a-/-小鼠的右体侧中。与clec14a+/+同窝小鼠相比，clec14a-/-小鼠中的肿瘤生长受损(图4A)。这通过三次独立实验得到确认。自clec14a-/-小鼠采集的切除的肿瘤比clec14a+/+同窝小鼠尺寸更小(图4B)并且重量更小(图4C)。为了确定这些肿瘤内的血管密度是否也受影响，用抗CD31抗体染色组织切片。分析显示离散血管的密度降低(图4D和4E)和内皮覆盖百分比降低(图4F)。此外，自clec14a-/-小鼠采集的肿瘤和肝脏切片的x-gal染色揭示具有充满红细胞的管腔的成熟血管(图4G，黑色箭头)和肿瘤内未成熟的微血管(图4G)两者上clec14a的高表达，确认clec14a在肿瘤血管上上调。
实施例3：抗CLEC14A单克隆抗体的制备及其对血管生成的影响
单克隆抗体的制备
用于制备单克隆抗体的抗原是鼠CLEC14A-FC(CM)和人CLEC14A-Fc(CH)，任选地与佐剂蛋白(AP)缀合。使用以下方案将这四种抗原(CM，CH，CM-AP，CH-AP)用于小鼠免疫：
日 操作
0 采集免疫前样品
完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)
14 不完全弗氏佐剂中100ug抗原的免疫(足垫)
17 测试出血
18 腘淋巴结收获物，用于融合
针对三种抗原：CM，CH和Fc通过ELISA测试血清。采集非免疫血清作为阴性对照。
融合方案如下：
(1)从免疫小鼠收获腘淋巴结并均质化。
(2)用温热的DMEM洗涤细胞。
(3)将细胞与sp2/0骨髓瘤细胞混合。
(4)将混合物离心(1000g)
(5)将沉淀物悬浮在50％PEG 1500中并温育1分钟。
(6)用温热的DMEM缓慢稀释悬浮液。
(7)将悬浮液离心(1000g)。
(8)将细胞接种到具有腹膜巨噬细胞的平板中。
(9)将细胞在37℃和5％CO2下培养
获得来自每只小鼠的超过500个HAT抗性杂交瘤克隆。通过ELISA针对三种吸收的抗原(CM，CH和Fc)以4天间隔测试所有克隆上清液两次。测试产生5个克隆，进一步研究其中2个，即CRT-2和CRT-3(均为亚类lgG1)，并且显示与CM和CH两者起反应并且不与Fc起反应。通过有限稀释法将所有阳性物克隆2-4倍，在培养瓶中繁殖并注射到小鼠中以得到腹水。一个克隆(CRT-3)是用CLEC14a人-AP(CHAP)免疫的结果，而另一个克隆(CRT-2)是用CLEC14a小鼠-AP(CM-AP)免疫的结果。
用CLEC14A单克隆抗体进行划痕伤口愈合测定
在汇合的HUVEC中用10μl移液管尖端产生划痕。应用新培养基，其含有1g/m或10g/l在小鼠中针对CLEC14A的胞外域产生的单克隆CLEC14A抗体。通过使用Leica DM 1000光学显微镜和USB 2.0 2M Xli照相机在0、4、6、12小时获取伤口闭合的图像来评估HUVEC的化学动力学迁移。使用Image J软件定量伤口的开放区域。
检测CLEC14A单克隆抗体抑制血管生成的能力。使用下文所述的单克隆抗体的划痕伤口愈合测定显示了抗CLEC14A单克隆抗体抑制HUVEC划痕伤口愈合测定中的内皮细胞迁移。如图5A和5B中所示，与对照中的13％相比，当用10g/ml单克隆抗体CRT-3处理HUVEC时，25％的伤口区域在12小时时保持开放。
这些结果显示抗CLEC14A单克隆抗体CRT-3对内皮细胞迁移具有抑制作用。内皮细胞迁移是血管生成的必需特征。因此，该测定提供了本发明的单克隆抗体直接抑制血管生成的证据。
为了进一步表征CLEC14A抗体处理对内皮细胞的功能影响，用以20μg/ml CRT2，CRT3或CRT4处理的HUVEC进行管形成测定。用CRT2和CRT3处理给出小管长度和接合数目的显著减少。CRT2处理也显著减少每个场的网格面积。结果显示了CRT2,3和4对管形成都有不同的负面影响。
实施例4：抗CLEC14A单克隆抗体的表征
产生各种多肽构建体并在细胞中表达以定位本发明的单克隆抗体的结合位点。所有构建体都具有C端GFP标签，因此将绿色细胞门控，并染成红色。使用流式细胞术分析CRT抗体的结合。
图7A显示CRT-2和CRT-3均结合表达CLEC14A的细胞，而图7B证明了抗体不结合表达血栓调节蛋白的细胞。
产生包含血栓调节蛋白(CD141)的C型凝集素域(CTLD)和CLEC14A分子的剩余部分的嵌合体。尽管用CRT-2观察到荧光的轻微变化，但表达该抗原的细胞不被任一种CRT抗体识别(图8A)。还产生嵌合体，并且导致CRT-3，而非CRT-2的结合(图8B)，所述嵌合体包含Sushi样域已经替换为血栓调节蛋白(CD141)的Sushi样域(以确保CLEC14A的CTLD正确折叠)的CLEC14A。这两种CRT抗体均结合WT CLEC14A，并且如所预期，都不结合WT CD141(图7)。
这些数据提示抗体CRT-3的结合位点在C型凝集素域内，并且CRT-2在CTLD和sushi样域之间的区域上结合。
为了进一步确定抗体的结合区域，制备了嵌合环构建体。这是基于CLEC14A CTLD的结构预测。
具有CD141的区域1-42的CLEC14A
CD141序列-
MLGVLVLGALALAGLGFPAPAEPQPGGSQCVEHDCFALYPGP(SEQ ID NO:98)
具有CD141的区域97-108的CLEC14A
CD141序列–QLPPGCGDPKRL(SEQ ID NO:99)
具有CD141的区域122-142的CLEC14A
CD141序列–TSYSRWARLDLNGAPLCGPL(SEQ ID NO:100)
图9中显示了比对。不幸的是，1-42和122-142嵌合体不正确折叠。这被认为是由于它们存在于细胞表面的事实(CLEC14A多克隆抗体染色阳性，但它们在任一种抗体方面不染色)。
97-108嵌合体确实结合CRT-2和CRT-3，显示该突变体正确折叠。将残基97-108与来自血栓调节蛋白的相应区域交换。这导致正确的折叠，因为CRT-2和CRT-3仍然可以结合(图8C)。这些数据提示CRT-2和CRT-3不结合CLEC14A的残基97-108。
该实验重复三次，结果相同。
使用标准技术将CRT-2和CRT-3编码序列从它们各自的杂交瘤克隆并测序。已经使用标准软件预测了CDR。下表中列出多肽和核苷酸序列。鉴于不同的预测软件，还显示了序列变体，包括CDR变体(以“*”标记)。
实施例5：基于抗CLEC14A单克隆抗体的抗原结合域的嵌合抗原受体的设计和分析
生成CAR构建体
如上文所述，获得表达与蛋白质的人和小鼠形式交叉反应的CLEC14A特异性单克隆抗体的杂交瘤。然后通过使用简并引物组的RT-PCR从每个小鼠杂交瘤中分离编码scFv的基因构建体，所述简并引物组设计为扩增所有小鼠V基因家族。
然后，将scFv基因以ClaI，NotI片段亚克隆到两个先前描述的CAR载体pMP71.tCD34.2A.CD19ζ和pMP71.tCD34.2A.CD19.IEVζ(Cheadle等,J.Immunol.,2014,192(8),3654-65)，替换CD19特异性scFv区域。最初使用MP71逆转录病毒表达质粒(来自C.Baum，Hannover的友情赠品)构建这些载体，并共表达截短的CD34标志物基因。
人和小鼠T细胞的转导
为了产生用于转导人T细胞的重组逆转录病毒，根据制造商的说明书，使用FuGENEHD(Roche)，用MP71逆转录病毒载体和pCL ampho(Imgenex)转染Phoenix兼向性包装细胞。以相同的方式，但使用Phoenix同向性(ecotropic)包装细胞和pCLeco产生用于转导小鼠T细胞的重组逆转录病毒。通过在lymphoprep(Axis Shield，Oslo，Norway)上的密度梯度离心从肝素化血液中分离人外周血单个核细胞(PBMC)。使用抗CD3抗体(OKT3，eBioscience；30ng/ml)，抗CD28抗体(R&D Systems；30ng/ml)和白细胞介素-2(IL2；300U/ml；Chiron，Emeryville，CA)使用标准培养基(含有10％胎牛血清(FBS；PAA，Pasching Austria)，2mML-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100pg/ml链霉素)的RPMI 1640(Sigma))加1％人AB血清(TCS Biosciences，Buckingham，UK)预活化PBMC达48小时。使用小鼠脾细胞转导小鼠T细胞，所述小鼠脾细胞用标准培养基中的伴刀豆球蛋白A(2ug/ml；Sigma)和小鼠白细胞介素7(1ng/ml；eBioscience)预活化48小时。随后根据制造商的说明书，在retronectin(Takara)包被的板中通过旋转转染(spinfection)转导(或用来自未转染的phoenix细胞的条件化上清液模拟转导)预活化的人和小鼠T细胞。然后将人T细胞在含有IL2(100U/ml)的标准培养基加1％人AB血清中培养。在旋转感染后，将小鼠T细胞在含有IL2(100U/ml)的标准培养基中培养24小时，然后使用lymphoprep(Axis Shield)纯化。在指出的情况下，根据制造商的说明书，使用抗CD34微珠(Miltenyi Biotec，Germany)通过免疫磁性选择富集转导的细胞。National Research Ethics Service Committee West Midlands(Solihull)批准了对人捐赠者的研究，并且所有捐赠者给出书面知情同意书。
细胞系和重组蛋白
将Phoenix A或E，CHO和Lewis肺癌细胞维持在含有10％胎牛血清(FBS；PAA，Pasching Austria)，2mM L-谷氨酰胺，100IU/ml青霉素和100pg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DM EM)中。用表达全长人CLEC14A的pWPI载体(Addgene)(或单独的载体)转导CHO细胞。如上文所述，使用从Birmingham Women’s HealthCare NHS Trust获得的脐带在知情同意和south Birmingham research ethics committee的伦理批准下分离人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。将HUVEC维持在含有10％FBS，4mM L-谷氨酰胺，10％大血管内皮细胞生长补充物(TCS Cellworks)的M199完全培养基中，并在用来自猪皮的0.1％1型明胶(Sigma)包被的平板中培养。将具有人Fc标签的人和鼠CLEC14A蛋白在HEK293T细胞中表达，并在蛋白A柱上纯化。
流式细胞术
将HUVEC用胰蛋白酶处理并在冰上用5％正常山羊血清/PBS中的上述CLEC14A特异性小鼠单克隆抗体(10ug/ml)或1gG1同种型对照(Dako)染色1小时。洗涤细胞并通过与缀合有R-PE的山羊抗小鼠抗体(Serotec)一起温育来检测结合的抗体。通过用碘化丙啶染色鉴定死细胞。用PBS洗涤人T细胞，并在黑暗中用活/死可固定的紫罗兰死细胞染色试剂盒(Life Technologies)染色20分钟。然后用流动缓冲液(PBS中的0.5％w/v BSA+2mM EDTA；pH7.2)洗涤细胞，并用抗人CD4(缀合有PE)，抗人CD8(缀合有FITC)(均来自BD Pharmingen)和抗人CD34(Pe-Cy5)(BioLegend)在黑暗中在冰上染色30分钟。或者，不同于针对CD34染色，通过首先用人Fc片段(10ug/ml)封闭细胞，然后将其与10ug/ml重组人CLEC14A-Fc融合蛋白(或Fc对照)一起温育，然后与绵羊抗CLEC14A多克隆抗体(R&D systems，10ug/ml)温育，直接检测CAR表达。最后，用缀合有FITC的兔抗棉羊抗体(Invitrogen，1:10稀释)染色细胞。所有温育均在冰上进行1小时。
当染色来自肝素化尾部出血的小鼠T细胞时，它们首先进行使用BD Pharm lyse(Becton Dickinson)的红细胞裂解，然后如上所述，但使用抗小鼠CD4-FITC，CD8-PE和CD45.1(缀合有PE-Cy7)(均为BD Biosciences)染色。使用BD LSR II流式细胞仪和FlowJo软件(TreeStar Inc，Ashland，OR)分析细胞。
CFSE标记
用PBS洗涤T细胞两次，并且与2.5μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)在37℃下温育10分钟。通过加入含有10％FBS的RPMI-1640淬灭标记反应。洗涤细胞，以1.5x106个细胞/ml重悬于标准培养基加1％人AB血清和IL2(10IU/ml)中，并加入到含有HUVEC的孔中以给出T细胞:HUVEC比率10:1。在37℃/5％CO2下温育5天后，使用抗人CD34(Pe-Cy5)通过如上所述的流式细胞术分析细胞。
IFNγ释放测定
以指定的响应者:刺激物比率将刺激物细胞(2.5x104/孔)与CD34+CAR-T细胞一式三份共培养。或者，将2x 104个CD34+CAR-T细胞在用重组蛋白(1μg/ml)预包被的孔中温育。将细胞在37℃/5％CO2下在100μl/孔的补充有IL2(25U/ml)的标准培养基中温育。18小时后，根据制造商的说明书，使用ELISA(Pierce Endogen，Rockford，IL)测试培养上清液的分泌IFNγ。
细胞毒性测定
铬释放测定以已知的效应器:靶物比率(1250个靶物/孔)建立并在7.5小时后收获。
毒性测试
6至8周龄的C57BL6小鼠(Charles River Laboratories)接受4Gy全身照射(TBI)。18小时后，对每只小鼠的尾静脉注射2x 107个CAR或模拟转导的来自CD45.1+同源BoyJ小鼠的T细胞制备物。监测小鼠的毒性体征，并通过每周尾部出血进行免疫监测。最后在45天后扑杀小鼠并取出主要器官进行组织学分析。
RipTag2转基因小鼠肿瘤模型
RIP-Tag2小鼠是胰岛细胞癌发生的模型。将RIP-Tag2小鼠维持在C57BL/6J背景(The Jackson Laboratory)上。将冷冻保存的CAR转导的和模拟转导的T细胞解冻，洗涤，并且在单一时段中对12周龄的小鼠将1500万T细胞/小鼠静脉内注射到尾静脉中，所述小鼠在前一天已经用4Gy TBI调理。从12周龄开始，所有RIP-Tag2小鼠接受50％糖食物(HarlanTeklad)以缓解胰岛素分泌肿瘤诱导的低血糖症。使用卡尺测量在16周龄时量化扑杀的CAR-T细胞处理的小鼠中的总肿瘤负荷，以使用以下公式测量单独切除的宏观肿瘤(>1mm3)：体积＝a x b2x 0.52，其中a和b代表肿瘤的较长的和较短的直径。加入来自每只小鼠的所有肿瘤的体积，以给出每只动物的总肿瘤负荷。对于16周CAR处理的小鼠，没有年龄匹配的对照比较，因为未处理的RIP-Tag2小鼠不能存活至16周，因此与14周龄模拟处理的小鼠进行比较。
Lewis肺癌(LLC)小鼠模型
在体侧中对6-8周龄雌性C57BL6小鼠皮下接种106个LLC细胞。三天后，小鼠接受4Gy TBI，并且18小时后，对每只小鼠的尾静脉中注射来自CD45.1+同类BoyJ小鼠的2x 107个CAR或模拟T细胞制备物。用卡尺(使用公式：体积＝长度x宽度2x0.5)和生物发光成像(MSSpectrum，Caliper Life Sciences)测量肿瘤生长。通过每周尾部出血进行免疫监测。
组织制备和免疫荧光分析
将来自小鼠实验的组织在OCT(Bio Optica)中包埋，在干冰中冷冻并储存在-80℃。用以下一抗进行组织制备和组织学分析：纯化的大鼠单克隆抗-泛内皮细胞抗原(550563，克隆Meca32，BD Pharmingen，USA)，以1:100稀释；兔单克隆抗切割胱天蛋白酶3(asp175，克隆5A1，Cell Signaling，USA)，1:100稀释；兔多克隆抗纤维蛋白原(A0080，Dako)，以1:100稀释；和以1:50稀释的兔单克隆抗CD34(ab174720，Abcam)；以1:50稀释的绵羊多克隆抗CLEC14A(AF4968，R&D)。温育和洗涤后，将样品与二抗抗兔抗Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-555一起温育；抗大鼠Alexa Fluor-488和Alexa Fluor-555；和抗绵羊Alexa Fluor-488(Molecular Probes)并用DAPI核酸染剂(Invitrogen)复染。为了检测CAR转导的T细胞，用在PBS中1:50稀释的兔单克隆抗CD34(ab174720，Abcam)染色组织。温育和洗涤后，用抗兔Alexa Fluor-555(Molecular Probes)染色样品并用DAPI复染。
使用1:20稀释的绵羊多克隆抗CLEC14A(AF4968，R&D系统)和与罗丹明(Vectorlabs，UK)缀合的乌乐树凝集素I染色人肿瘤组织阵列(SuperBiochips Inc.，Seoul，Korea)1小时，然后使用抗羊FITC抗体(10μg/ml，Invitrogen，UK)染色。
对于RipTag2肿瘤组织的分析，通过ImageJ软件将血管占据的表面积定量为Meca32阳性结构占据的面积，与通过DAPI可视化的总组织面积进行比较。对于每只动物，量化至少四个视野/图像的总血管面积。为了确定每个图像中的纤维蛋白原外渗量(红色通道)，我们在每个血管附近绘制感兴趣区域(ROI)(Meca32，绿色通道)，然后使用Leica共聚焦软件直方图量化工具量化红色和绿色通道的平均荧光强度(MFI)。为了使得到的血管数值标准化，我们计算红色和绿色通道MFI之间的比率；值表示为红绿共染色的百分比。为了确定每个分析图像中胱天蛋白酶3(绿色通道)的表达水平，我们考虑了5个相同大小的随机ROI。然后我们测量了绿色通道的MFI，我们通过比较胱天蛋白酶3染色区域与组织区域中存在的总细胞来标准化数值。对每个样品分析每个处理组5只小鼠的至少10张图像。使用Leica TCS SP2AOBS共聚焦激光扫描显微镜(Leica Microsystems)分析来自RipTag2小鼠的组织。使用Axiovert 100M激光扫描共聚焦显微镜(Carl Zeiss，Welwyn Garden City，UK)分析所有其他组织。
统计分析
使用指示的检验和GraphPad Prism软件进行数据的统计分析。p值<0.05被认为是显著的。
结果
产生共表达截短的CD34标志物基因和scFv片段/CD3ζ链嵌合受体的逆转录病毒CAR载体(基于pMP71)。表达由LTR启动子驱动，并且2A肽接头确保CD34和CAR两者的等摩尔表达。第二代CAR构建体包括CD28共刺激域(参见图10)。
图10B显示通过流式细胞术分析的CD34染色，证明使用共表达CLEC14A特异性CAR的逆转录病毒构建体成功转导T细胞。基于抗体CRT3的第一代CAR分别称为CRT3.z。基于抗体CRT3的第二代CAR分别称为CRT3.28z。注意在CD4和CD8T细胞亚组中观察到等同表达(数据未显示)。
图10C显示了使用CLEC14A-Fc针对CAR表达直接染色的细胞(％值显示CLEC14A-Fc的特异性结合，其已经扣除仅用Fc的背景染色)。
图11显示了经CAR转导的T细胞在体外响应CLEC14A。对经转导以表达基于抗体CRT3的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞测试其响应CLEC14A的能力，所述CLEC14A表达为(A)平板结合的重组Fc融合蛋白，(B)在工程化CHO细胞上表达，或(C)在静态培养中培养时天然表达CLEC14A的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)上表达。使用用于干扰素γ产生的ELISA测量的T细胞应答。图11中显示的数据代表从3-7次重复实验获得的数据。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所有直方图显示均值响应+SD。
图12显示了CLEC14A特异性CAR转导的T细胞的进一步体外功能测试。在以下功能性测定法中对经转导以表达基于抗体CRT3的第一代或第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T细胞测试其响应CLEC14A的能力：(A)细胞毒性，使用工程化改造为表达人CLEC14A的CHO细胞(扣除单独CHO(对照细胞)裂解的背景水平)。显示的数据代表5次重复实验。(B)增殖，使用CFSE标记的CAR转导的T细胞，当与HUVEC共培养4天时，我们测量了CAR+(CD34+)和CAR-(CD34-)细胞亚组的增殖。显示的数据代表2次重复实验。(C)使用干扰素γ释放评估(CLEC14A特异性CAR转导的T细胞对人和小鼠CLEC14A两者的响应。调节T细胞以使转基因表达细胞的频率相等。所示数据代表6次重复实验。所有直方图显示均值响应+SD。
图13显示了使用注射CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的健康C57/BL6小鼠的体内毒性测试。在实验结束时，将小鼠扑杀并且收获主要器官。组织学检查揭示无病理学证据。
图14显示了当注射到携带Lewis肺癌肿瘤的小鼠中时CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的抗肿瘤响应。给C57BL6小鼠皮下注射Lewis肺癌细胞(100万个细胞/小鼠)，并且4天后，小鼠接受4Gy全身照射以帮助T细胞植入。将经转导以表达基于抗体CRT-3的第二代CAR的T细胞或模拟转导的(对照)T注射到尾静脉中。小鼠接受总共2000万个T细胞(CD8:CD4＝5:2)，其中CRT3.28z在220万个这些细胞上表达。然后使用(A)生物发光或(B)卡尺监测肿瘤生长。
图15显示当注射到携带Lewis肺癌肿瘤的小鼠中时CLEC14A特异性CAR转导的小鼠T细胞的抗肿瘤响应。在实验结束时，切除肿瘤并称重(A)。组织学分析证明用CAR处理的小鼠的肿瘤显示血管密度显著降低(B，MECA-32染色)和更高水平的血管渗漏(C，纤维蛋白原染色)。
下表中列出源自CRT-3的CAR的多肽和核苷酸序列：
实施例6：抗CLEC14A单克隆抗体-药物缀合物(免疫缀合物)的设计和分析
CRT-3抗体-药物缀合物(免疫缀合物)的内化
产生单克隆抗CLEC14A抗体(CRT-3)药物缀合物(CRT-3-ADC)，其中抗体附着于替拉扎明。
图16A显示用CRT-3处理的HUVEC细胞，并显示0分钟后(图16A(i))和90分钟(图16A(ii))后抗体的定位，并证明抗体在HUVEC细胞中内化。图16B显示了在HUVEC处理的CRT-3-ADC中通过Cell Titre Glo发光细胞活力测定测量的细胞毒性图，并证明CRT-3抗体显示出作为免疫缀合物的细胞毒性。
LLC ADC 24小时试验性实验
将1百万个Lewis肺癌细胞皮下注射到2只小鼠的右体侧中，并使其生长至可见大小。接下来，通过尾静脉注射施用1mg/kg的CRT-3-ADC或B12-ADC(对照)。观察小鼠1小时并在24小时后扑杀。
结果
用CRT-3-ADC处理24小时对小鼠的整体健康没有影响。仅在CRT-3-ADC处理的小鼠而不是对照中观察到肿瘤部位的大量出血，证明血管生成的肿瘤特异性破坏(图17)。
实施例7：CRT1、3和5针对CLEC14A的滴度
将CLEC14A以Fc融合蛋白表达以与CRT1、3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞温育。用模拟T细胞稀释所有CAR-T细胞系以在转导效率方面均衡。可以在图18中看到结果，其中显示所有测试的CAR T细胞良好响应CLEC14A(显示的数据是一式三份培养物平均值+SD)。
实施例8：CRT1、3和5CAR T细胞的细胞毒性和增殖测定
使用CRT1、3和5CAR(具有CD28共刺激域)T细胞进行细胞毒性研究。用模拟T细胞稀释T细胞以在转导效率方面均衡，并与表达人CLEC14A的小鼠内皮细胞一起温育。在图20中显示结果，其证明所有三种测试的CAR均可介导细胞毒性。显示的数据是一式三份培养物的均值+SD。
此外，用板结合的重组CLEC14A-Fc融合蛋白刺激的CRT1、3和5CAR(CD28共刺激域)T细胞进行增殖测定(CFSE标记)。用模拟T细胞稀释所有CAR T细胞系以在转导效率方面均衡，其中所有三种测试的CAR在刺激后都能够增殖。
实施例9：具有不同共刺激和跨膜区的CAR
使用逆转录病毒载体已经将以下CAR克隆并转染到来自单一供体的T细胞中：
1)CRT3-CD28TM-CD28costim信号-CD3(CRT3.28z)
2)CRT3-CD8TM-4-1BB costim信号-CD3(CRT3.BBz)
3)CRT3-CD28TM-CD28和4-1BB costim信号-CD3(CRT3.28BBz)
4)CRT3-CD28TM-CD28和OX40costim信号-CD3(CRT3.28Oxz)
5)CRT3-CD8TM-4-1BB和OX40costim信号-CD3(CRT3.BBOxz)
产生的所有构建体均良好地转导到T细胞中。在体外评估不同构建体的功能，分析细胞因子产生，细胞毒性和增殖响应(参见图21)。细胞因子释放指示强抗原特异性应答，特别是由表达CRT3.28z和CRT3.280xz的T细胞产生。通过测量响应滴定数目的表达人CLEC14A(或仅载体对照)的CHO细胞的IFNγ产生来分析细胞因子的产生。用模拟T细胞稀释所有CART细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的均值+SD。针对工程化改造为表达CLEC14A的小鼠内皮细胞(SEND)测量细胞毒活性，并在用平板结合的重组CLEC14A-Fc融合蛋白刺激后测量增殖响应(数据未显示)。
实施例10：用嵌合CLEC14A刺激后测定从CAR T细胞释放的细胞因子
在293和SEND细胞中表达含有人序列但具有小鼠来源的跨膜和/或胞内域的CLEC14A的嵌合形式。使用从慢病毒载体共表达的GFP分选这些细胞以在CLEC表达方面均衡，然后使用CAR T细胞(具有CD28共刺激域的CRT1、3和5)进行测试。在将CAR T细胞与293和SEND细胞两者一起温育后测量IFNγ的释放。可以在图22中看到结果。另外，测定了与表达CLEC14A嵌合体的SEND细胞一起温育时T细胞的细胞毒性。用模拟T细胞稀释所有CAR T细胞系以在转导效率方面均衡。显示的数据是一式三份培养物的平均值。
从图22中可以看出，所有测试的CRT1、3和5CAR T细胞导致从表达人CLEC14A(huCLEC)、具有小鼠胞内域的人CLEC14A(A1)和具有小鼠跨膜和胞内域的人CLEC14A(B1)的293和SEND细胞释放IFNγ。
序列表
<110> 癌症研究技术有限公司和伯明翰大学
<120> 抗体及其相关分子和用途
<130> 16/0003/JA
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的可变重链 (SEQ ID NO.1)
<400> 1
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
115
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR1(SEQ ID NO. 2)
<400> 2
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR2 (SEQ ID NO.3)
<400> 3
Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR3 (SEQ ID NO. 4)
<400> 4
Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的可变轻链 (SEQ ID NO. 5)
<400> 5
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
100 105 110
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VL的CDR1 (SEQ ID NO. 6)
<400> 6
Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3 的VL的CRT3 (SEQ ID NO. 8)
<400> 7
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr
1 5
<210> 8
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的scFv (SEQ ID NO. 9)
<400> 8
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
195 200 205
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
245
<210> 9
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的CAR3 (SEQ ID NO. 10)
<400> 9
Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala
1 5 10 15
Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln
20 25 30
Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys
35 40 45
Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys
50 55 60
Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly
65 70 75 80
Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu
85 90 95
Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
100 105 110
Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser
115 120 125
Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
165 170 175
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
180 185 190
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
195 200 205
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
225 230 235 240
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
245 250 255
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
260 265 270
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
275 280 285
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
290 295 300
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
305 310 315 320
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
325 330 335
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
340 345 350
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
355 360 365
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 10
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的可变重链的核苷酸序列 (SEQ ID NO.
11)
<400> 10
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtc 357
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR1的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 12)
<400> 11
ggctacacct ttaccagcta ctgg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR2的核苷酸序列(SEQ ID NO. 13)
<400> 12
atttatcctg gaaatagtga tact 24
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VH的CDR3的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 14)
<400> 13
acacattact acggtagtga ctatgctatg gactac 36
<210> 14
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3可变轻链的核苷酸序列 (SEQ ID NO.
15)
<400> 14
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60
atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 300
ggaggcacca agctggaaat caaacgt 327
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VL的CDR1的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 16)
<400> 15
tcaagtgtaa gttccagtta c 21
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的VL的CDR3的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 18)
<400> 16
caccagtatc atcgttcccc acggacg 27
<210> 17
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的scFv的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 19)
<400> 17
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc 420
acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct ctaggggaac gggtcaccat gacctgcact 480
gccagctcaa gtgtaagttc cagttacttg cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc 540
cccaaactct ggatttatag cacatccaac ctggcttctg gagtcccagc tcgcttcagt 600
ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct 660
gccacttatt actgccacca gtatcatcgt tccccacgga cgttcggtgg aggcaccaag 720
ctggaaatca aacgtgcggc cgca 744
<210> 18
<211> 1499
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3的CAR3的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 20)
<400> 18
atgggcgtgc tgctgaccca gaggaccctg ctgagcctgg tgctggccct gctgtttcca 60
tctatggcat cgatggccga ggtccagctg cagcagtctg ggactgtgct ggcaaggcct 120
ggggcttcag tgaagatgtc ctgcaaggct tctggctaca cctttaccag ctactggatg 180
cactgggtaa aacagaggcc tggacagggt ctggaatgga ttggcgctat ttatcctgga 240
aatagtgata ctagctacaa ccagaagttc aagggcaagg ccaaactgac tgcagtcaca 300
tccaccagca ctgcctacat ggagctcagc agcctgacaa atgaggactc tgcggtcttt 360
tactgtacac attactacgg tagtgactat gctatggact actggggtca aggaacctca 420
gtcactgtct cctcaggtgg aggcggttca ggcggaggtg gctctggcgg tggcggatcg 480
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 540
atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 600
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 660
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 720
gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 780
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 840
tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 900
ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga 960
gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020
aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 1080
acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgcagaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat aaaagcttaa cacgagcca 1499
<210> 19
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的可变轻链 (SEQ ID NO. 25)
<400> 19
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Pro Gly Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala
100 105
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR1 (SEQ ID NO. 26)
<400> 20
Ser Tyr Met His Trp Phe
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR2 (SEQ ID NO. 27)
<400> 21
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 22
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR3 (SEQ ID NO. 28)
<400> 22
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
1 5
<210> 23
<211> 329
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的可变轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO.
35)
<400> 23
gaaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
ataacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120
acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agtagttacc ccctcacgtt cggtgctggg 300
accaagctgg agctgaaacg tgcggccgc 329
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR1的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 36)
<400> 24
agttacatgc actggttc 18
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR2的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 37)
<400> 25
ctctggattt atagcacatc caacctggct 30
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VL的CDR3的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 38)
<400> 26
cagcaaagga gtagttaccc cctc 24
<210> 27
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的可变重链(SEQ ID NO. 41)
<400> 27
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Ile Ser Ser Gly
115 120
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR1 (SEQ ID NO. 42)
<400> 28
Thr Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR2 (SEQ ID NO. 43)
<400> 29
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR3 (SEQ ID NO. 44)
<400> 30
Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp
1 5 10
<210> 31
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的可变轻链(SEQ ID NO. 45)
<400> 31
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro
85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala
100 105 110
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的CDR1 (SEQ ID NO. 46)
<400> 32
Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的CDR2 (SEQ ID NO. 47)
<400> 33
Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的CDR3 (SEQ ID NO. 48)
<400> 34
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg
1 5
<210> 35
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含变体CRT3的VH和非变体CRT3的VL的 scFv
(SEQ ID NO. 49)
<400> 35
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala
245 250
<210> 36
<211> 247
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CRT3的VH和CRT3变体的VL的scFv (SEQ ID NO. 50)
<400> 36
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr
145 150 155 160
Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
180 185 190
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
195 200 205
Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
210 215 220
Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala
245
<210> 37
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CRT3变体的VH和VL的scFv (SEQ ID NO. 51)
<400> 37
Met Ala Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20 25 30
Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln
50 55 60
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr
65 70 75 80
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Phe
85 90 95
Tyr Cys Thr His Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Thr Met Thr
145 150 155 160
Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn
180 185 190
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
195 200 205
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
210 215 220
Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala
245
<210> 38
<211> 490
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Arg Pro Ala Phe Ala Leu Cys Leu Leu Trp Gln Ala Leu Trp Pro
1 5 10 15
Gly Pro Gly Gly Gly Glu His Pro Thr Ala Asp Arg Ala Gly Cys Ser
20 25 30
Ala Ser Gly Ala Cys Tyr Ser Leu His His Ala Thr Met Lys Arg Gln
35 40 45
Ala Ala Glu Glu Ala Cys Ile Leu Arg Gly Gly Ala Leu Ser Thr Val
50 55 60
Arg Ala Gly Ala Glu Leu Arg Ala Val Leu Ala Leu Leu Arg Ala Gly
65 70 75 80
Pro Gly Pro Gly Gly Gly Ser Lys Asp Leu Leu Phe Trp Val Ala Leu
85 90 95
Glu Arg Arg Arg Ser His Cys Thr Leu Glu Asn Glu Pro Leu Arg Gly
100 105 110
Phe Ser Trp Leu Ser Ser Asp Pro Gly Gly Leu Glu Ser Asp Thr Leu
115 120 125
Gln Trp Val Glu Glu Pro Gln Arg Ser Cys Thr Ala Arg Arg Cys Ala
130 135 140
Val Leu Gln Ala Thr Gly Gly Val Glu Pro Ala Gly Trp Lys Glu Met
145 150 155 160
Arg Cys His Leu Arg Ala Asn Gly Tyr Leu Cys Lys Tyr Gln Phe Glu
165 170 175
Val Leu Cys Pro Ala Pro Arg Pro Gly Ala Ala Ser Asn Leu Ser Tyr
180 185 190
Arg Ala Pro Phe Gln Leu His Ser Ala Ala Leu Asp Phe Ser Pro Pro
195 200 205
Gly Thr Glu Val Ser Ala Leu Cys Arg Gly Gln Leu Pro Ile Ser Val
210 215 220
Thr Cys Ile Ala Asp Glu Ile Gly Ala Arg Trp Asp Lys Leu Ser Gly
225 230 235 240
Asp Val Leu Cys Pro Cys Pro Gly Arg Tyr Leu Arg Ala Gly Lys Cys
245 250 255
Ala Glu Leu Pro Asn Cys Leu Asp Asp Leu Gly Gly Phe Ala Cys Glu
260 265 270
Cys Ala Thr Gly Phe Glu Leu Gly Lys Asp Gly Arg Ser Cys Val Thr
275 280 285
Ser Gly Glu Gly Gln Pro Thr Leu Gly Gly Thr Gly Val Pro Thr Arg
290 295 300
Arg Pro Pro Ala Thr Ala Thr Ser Pro Val Pro Gln Arg Thr Trp Pro
305 310 315 320
Ile Arg Val Asp Glu Lys Leu Gly Glu Thr Pro Leu Val Pro Glu Gln
325 330 335
Asp Asn Ser Val Thr Ser Ile Pro Glu Ile Pro Arg Trp Gly Ser Gln
340 345 350
Ser Thr Met Ser Thr Leu Gln Met Ser Leu Gln Ala Glu Ser Lys Ala
355 360 365
Thr Ile Thr Pro Ser Gly Ser Val Ile Ser Lys Phe Asn Ser Thr Thr
370 375 380
Ser Ser Ala Thr Pro Gln Ala Phe Asp Ser Ser Ser Ala Val Val Phe
385 390 395 400
Ile Phe Val Ser Thr Ala Val Val Val Leu Val Ile Leu Thr Met Thr
405 410 415
Val Leu Gly Leu Val Lys Leu Cys Phe His Glu Ser Pro Ser Ser Gln
420 425 430
Pro Arg Lys Glu Ser Met Gly Pro Pro Gly Leu Glu Ser Asp Pro Glu
435 440 445
Pro Ala Ala Leu Gly Ser Ser Ser Ala His Cys Thr Asn Asn Gly Val
450 455 460
Lys Val Gly Asp Cys Asp Leu Arg Asp Arg Ala Glu Gly Ala Leu Leu
465 470 475 480
Ala Glu Ser Pro Leu Gly Ser Ser Asp Ala
485 490
<210> 39
<211> 1380
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
ctcctcttgc tctaagcagg gtgtttgacc ttctagtcga ctgcgtcccc tgtacccggc 60
gccagctgtg ttcctgaccc cagaataact cagggctgca ccgggcctgg cagcgctccg 120
cacacatttc ctgtcgcggc ctaagggaaa ctgttggccg ctgggcccgc ggggggattc 180
ttggcagttg gggggtccgt cgggagcgag ggcggagggg aagggagggg gaaccgggtt 240
ggggaagcca gctgtagagg gcggtgaccg cgctccagac acagctctgc gtcctcgagc 300
gggacagatc caagttggga gcagctctgc gtgcggggcc tcagagaatg aggccggcgt 360
tcgccctgtg cctcctctgg caggcgctct ggcccgggcc gggcggcggc gaacacccca 420
ctgccgaccg tgctggctgc tcggcctcgg gggcctgcta cagcctgcac cacgctacca 480
tgaagcggca ggcggccgag gaggcctgca tcctgcgagg tggggcgctc agcaccgtgc 540
gtgcgggcgc cgagctgcgc gctgtgctcg cgctcctgcg ggcaggccca gggcccggag 600
ggggctccaa agacctgctg ttctgggtcg cactggagcg caggcgttcc cactgcaccc 660
tggagaacga gcctttgcgg ggtttctcct ggctgtcctc cgaccccggc ggtctcgaaa 720
gcgacacgct gcagtgggtg gaggagcccc aacgctcctg caccgcgcgg agatgcgcgg 780
tactccaggc caccggtggg gtcgagcccg caggctggaa ggagatgcga tgccacctgc 840
gcgccaacgg ctacctgtgc aagtaccagt ttgaggtctt gtgtcctgcg ccgcgccccg 900
gggccgcctc taacttgagc tatcgcgcgc ccttccagct gcacagcgcc gctctggact 960
tcagtccacc tgggaccgag gtgagtgcgc tctgccgggg acagctcccg atctcagtta 1020
cttgcatcgc ggacgaaatc ggcgctcgct gggacaaact ctcgggcgat gtgttgtgtc 1080
cctgccccgg gaggtacctc cgtgctggca aatgcgcaga gctccctaac tgcctagacg 1140
acttgggagg ctttgcctgc gaatgtgcta cgggcttcga gctggggaag gacggccgct 1200
cttgtgtgac cagtggggaa ggacagccga cccttggggg gaccggggtg cccaccaggc 1260
gcccgccggc cactgcaacc agccccgtgc cgcagagaac atggccaatc agggtcgacg 1320
agaagctggg agagacacca cttgtccctg aacaagacaa ttcagtaaca tctattcctg 1380
<210> 40
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的可变重链的核苷酸序列(SEQ
ID NO. 54)
<400> 40
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tca 363
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR1的核苷酸序列(SEQ ID NO. 55)
<400> 41
accagctact ggatgcac 18
<210> 42
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR2的核苷酸序列(SEQ ID NO. 56)
<400> 42
tggattggcg ctatttatcc tggaaatagt gatactagc 39
<210> 43
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VH的CDR3的核苷酸序列(SEQ ID NO. 57)
<400> 43
acacattact acggtagtga ctatgctatg gac 33
<210> 44
<211> 335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的核苷酸序列(SEQ ID NO. 58)
<400> 44
caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60
atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120
ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180
gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccacg gacgttcggt 300
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgc 335
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的CDR1的核苷酸序列(SEQ ID NO. 59)
<400> 45
agttccagtt acttgcactg gtac 24
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体的VL的CDR2的核苷酸序列(SEQ ID NO. 60)
<400> 46
ctctggattt atagcacatc caacctggct 30
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRt3变体的VL的CDR3的核苷酸序列(SEQ ID NO. 61)
<400> 47
ccaccagtat catcgttccc cacgg 25
<210> 48
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CRT3变体VH和CRT3的VL的scFv的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 62)
<400> 48
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tcatcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaaatt 420
gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct gcatctctag gggaacgggt caccatgacc 480
tgcactgcca gctcaagtgt aagttccagt tacttgcact ggtaccagca gaagccagga 540
tcctccccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccagctcgc 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 660
gatgctgcca cttattactg ccaccagtat catcgttccc cacggacgtt cggtggaggc 720
accaagctgg aaatcaaacg t 741
<210> 49
<211> 743
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CRT3的VH和CRT3变体的VL的scFv的核苷酸序列(SEQ ID NO. 63)
<400> 49
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc tctggcggtg gcggatcgca aattgttctc 420
acccagtctc cagcaatcat gtctgcatct ctaggggaac gggtcaccat gacctgcact 480
gccagctcaa gtgtaagttc cagttacttg cactggtacc agcagaagcc aggatcctcc 540
cccaaactct ggatttatag cacatccaac ctggcttctg gagtcccagc tcgcttcagt 600
ggcagtgggt ctgggacctc ttactctctc acaatcagca gcatggaggc tgaagatgct 660
gccacttatt actgccacca gtatcatcgt tccccacgga cgttcggtgg aggcaccaag 720
ctggaaatca aacgtgcggc cgc 743
<210> 50
<211> 749
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含CRT3变体的VH和CRT3变体的VL的scFv的核苷酸序列(SEQ ID NO. 64)
<400> 50
atggccgagg tccagctgca gcagtctggg actgtgctgg caaggcctgg ggcttcagtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc tttaccagct actggatgca ctgggtaaaa 120
cagaggcctg gacagggtct ggaatggatt ggcgctattt atcctggaaa tagtgatact 180
agctacaacc agaagttcaa gggcaaggcc aaactgactg cagtcacatc caccagcact 240
gcctacatgg agctcagcag cctgacaaat gaggactctg cggtctttta ctgtacacat 300
tactacggta gtgactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt cactgtctcc 360
tcatcctcag gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcgcaaatt 420
gttctcaccc agtctccagc aatcatgtct gcatctctag gggaacgggt caccatgacc 480
tgcactgcca gctcaagtgt aagttccagt tacttgcact ggtaccagca gaagccagga 540
tcctccccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccagctcgc 600
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 660
gatgctgcca cttattactg ccaccagtat catcgttccc cacggacgtt cggtggaggc 720
accaagctgg aaatcaaacg tgcggccgc 749
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S)2接头(SEQ ID NO. 65)
<400> 51
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 52
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8alpha的铰链域(SEQ ID NO. 66)
<400> 52
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缩短的IgG铰链 (SEQ ID NO. 67)
<400> 53
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
1 5 10
<210> 54
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列(SEQ ID NO. 68)
<400> 54
Lys Asp Pro Lys
1
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缩短的IgG铰链和接头(SEQ ID NO. 69)
<400> 55
Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Lys Asp Pro
1 5 10 15
Lys
<210> 56
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8alpha跨膜域 (SEQ ID NO. 70)
<400> 56
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 57
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜域 (SEQ ID NO. 71)
<400> 57
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 58
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CH2CH3铰链(SEQ ID NO. 72)
<400> 58
Asp Pro Ala Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Lys Asp Pro Lys
225 230 235
<210> 59
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3zeta域(SEQ ID NO. 73)
<400> 59
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 60
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 41BB的胞内域 (SEQ ID NO. 74)
<400> 60
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 61
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD28的胞内域 (SEQ ID NO. 75)
<400> 61
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 62
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40共刺激域 (SEQ ID NO. 76)
<400> 62
Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr
20 25 30
Leu Ala Lys Ile
35
<210> 63
<211> 1101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的CD34的核苷酸序列(SEQ ID NO. 77)
<400> 63
atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60
ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120
tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180
caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240
tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300
cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360
accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420
ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480
gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540
cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600
gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660
ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720
attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780
ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840
gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900
aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960
aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020
ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080
ctgtttccat ctatggcatc g 1101
<210> 64
<211> 367
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的CD34 (SEQ ID NO. 78)
<400> 64
Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro
20 25 30
Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu
35 40 45
Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser
50 55 60
Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys
65 70 75 80
Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro
100 105 110
Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro
115 120 125
Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser
130 135 140
Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys
145 150 155 160
Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly
165 170 175
Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys
180 185 190
Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala
195 200 205
Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser
210 215 220
Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu
225 230 235 240
Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys
245 250 255
Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln
260 265 270
Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser
290 295 300
Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val
305 310 315 320
Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu
325 330 335
Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr
340 345 350
Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser
355 360 365
<210> 65
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLEC14A引物(SEQ ID NO. 79)
<400> 65
ctgggaccga ggtgagtg 18
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLEC14A探针(SEQ ID NO. 80)
<400> 66
cgcgatgcaa gtaactgaga 20
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Flotillin 2引物 (SEQ ID NO. 81)
<400> 67
tgttgtggtt ccgactataa acag 24
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Flotillin 2探针(SEQ ID NO. 82)
<400> 68
gggctgcaac gtcataatct 20
<210> 69
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLEC14A fwd引物 (SEQ ID NO. 83)
<400> 69
tagtaggaat tcgagagaat gaggccggcg ttcgccctg 39
<210> 70
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CLEC14A rev引物 (SEQ ID NO. 84)
<400> 70
agaaccgcgg ccgctggagg agtcgaaagc ctgaggagt 39
<210> 71
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CLEC14A引物 (SEQ ID NO. 85)
<400> 71
tagtaggaat tcgagagaat gaggccagcg cttgccctg 39
<210> 72
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CLEC14A引物 (SEQ ID NO. 86)
<400> 72
ctactagcgg ccgctcgtgg aagaggtgtc gaaagt 36
<210> 73
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CLEC14A fwd引物 (SEQ ID NO. 87)
<400> 73
tagtagttaa ttaagagaga atgaggccgg cgttc 35
<210> 74
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CLEC14A fwd引物 (SEQ ID NO. 88)
<400> 74
tagtagttaa ttaagagaga atgaggccag cgctt 35
<210> 75
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人Fc rev引物 (SEQ ID NO. 89)
<400> 75
ctactagttt aaactcattt acccggagac aggga 35
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR fwd (SEQ ID NO. 90)
<400> 76
ttccttttcc agggtttgtg 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'UTR rev (SEQ ID NO. 91)
<400> 77
gcctacaagg tggcttgaat 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDS fwd (SEQ ID NO. 92)
<400> 78
aagctgtgct cctgctcttg 20
<210> 79
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDS rev (SEQ ID NO. 93)
<400> 79
tcctgagtgc actgtgagat g 21
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'UTR fwd (SEQ ID NO. 94)
<400> 80
ctgtagaggg cggtgacttt 20
<210> 81
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'UTR rev (SEQ ID NO. 95)
<400> 81
agctgctccc aagtcctct 19
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mACTB fwd (SEQ ID NO. 96)
<400> 82
ctaaggccaa ccgtgaaaag 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mACTB rev (SEQ ID NO. 97)
<400> 83
accagaggca tacagggaca 20
<210> 84
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD141 1-42 aa (SEQ ID NO. 98)
<400> 84
Met Leu Gly Val Leu Val Leu Gly Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Gly
1 5 10 15
Phe Pro Ala Pro Ala Glu Pro Gln Pro Gly Gly Ser Gln Cys Val Glu
20 25 30
His Asp Cys Phe Ala Leu Tyr Pro Gly Pro
35 40
<210> 85
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD141 97-108 aa (SEQ ID NO. 99)
<400> 85
Gln Leu Pro Pro Gly Cys Gly Asp Pro Lys Arg Leu
1 5 10
<210> 86
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD141 122-142 aa (SEQ ID NO. 100)
<400> 86
Thr Ser Tyr Ser Arg Trp Ala Arg Leu Asp Leu Asn Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Cys Gly Pro Leu
20
<210> 87
<211> 130
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的重链可变区 (SEQ ID NO. 21)
<400> 87
Met Ala Glu Val Gln Gly Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn
20 25 30
Thr Tyr Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
65 70 75 80
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly
100 105 110
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly
130
<210> 88
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VH的CDR1 (SEQ ID NO. 22)
<400> 88
Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala
1 5
<210> 89
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VH的CDR2 (SEQ ID NO. 23)
<400> 89
Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr
1 5 10
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的VH的CDR3 (SEQ ID NO. 24)
<400> 90
Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 91
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2的scFv (SEQ ID NO. 29)
<400> 91
Met Ala Glu Val Gln Gly Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn
20 25 30
Thr Tyr Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
50 55 60
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln
65 70 75 80
Ser Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Met Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly
100 105 110
Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro
145 150 155 160
Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr
165 170 175
Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile
180 185 190
Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala
210 215 220
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu
225 230 235 240
Thr Phe Gly Ala Pro Gly Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala
245 250
<210> 92
<211> 841
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CAR CRT2 (SEQ ID NO. 30)
<400> 92
Met Pro Arg Gly Trp Thr Ala Leu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Pro Ser
1 5 10 15
Gly Phe Met Ser Leu Asp Asn Asn Gly Thr Ala Thr Pro Glu Leu Pro
20 25 30
Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Tyr Gln Glu
35 40 45
Thr Thr Thr Pro Ser Thr Leu Gly Ser Thr Ser Leu His Pro Val Ser
50 55 60
Gln His Gly Asn Glu Ala Thr Thr Asn Ile Thr Glu Thr Thr Val Lys
65 70 75 80
Phe Thr Ser Thr Ser Val Ile Thr Ser Val Tyr Gly Asn Thr Asn Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ser Gln Thr Ser Val Ile Ser Thr Val Phe Thr Thr Pro
100 105 110
Ala Asn Val Ser Thr Pro Glu Thr Thr Leu Lys Pro Ser Leu Ser Pro
115 120 125
Gly Asn Val Ser Asp Leu Ser Thr Thr Ser Thr Ser Leu Ala Thr Ser
130 135 140
Pro Thr Lys Pro Tyr Thr Ser Ser Ser Pro Ile Leu Ser Asp Ile Lys
145 150 155 160
Ala Glu Ile Lys Cys Ser Gly Ile Arg Glu Val Lys Leu Thr Gln Gly
165 170 175
Ile Cys Leu Glu Gln Asn Lys Thr Ser Ser Cys Ala Glu Phe Lys Lys
180 185 190
Asp Arg Gly Glu Gly Leu Ala Arg Val Leu Cys Gly Glu Glu Gln Ala
195 200 205
Asp Ala Asp Ala Gly Ala Gln Val Cys Ser Leu Leu Leu Ala Gln Ser
210 215 220
Glu Val Arg Pro Gln Cys Leu Leu Leu Val Leu Ala Asn Arg Thr Glu
225 230 235 240
Ile Ser Ser Lys Leu Gln Leu Met Lys Lys His Gln Ser Asp Leu Lys
245 250 255
Lys Leu Gly Ile Leu Asp Phe Thr Glu Gln Asp Val Ala Ser His Gln
260 265 270
Ser Tyr Ser Gln Lys Thr Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu
275 280 285
Leu Ala Val Leu Gly Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser
290 295 300
Trp Ser Pro Thr Gly Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro Val Asp Arg Val
305 310 315 320
Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu
325 330 335
Ser Asn Pro Gly Pro Gly Asn Met Gly Val Leu Leu Thr Gln Arg Thr
340 345 350
Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu Leu Phe Pro Ser Met Ala Ser Met
355 360 365
Ala Glu Val Gln Gly Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys
370 375 380
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr
385 390 395 400
Tyr Ala Met His Trp Val Cys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
405 410 415
Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala
420 425 430
Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser
435 440 445
Met Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met
450 455 460
Tyr Tyr Cys Val Arg Glu Gly Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Tyr
465 470 475 480
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
485 490 495
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
515 520 525
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
530 535 540
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
545 550 555 560
Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
565 570 575
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
580 585 590
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
595 600 605
Phe Gly Ala Pro Gly Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ile Glu Val
610 615 620
Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile
625 630 635 640
Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly
645 650 655
Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala
660 665 670
Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg
675 680 685
Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro
690 695 700
Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro
705 710 715 720
Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
725 730 735
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
740 745 750
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
755 760 765
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln
770 775 780
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
785 790 795 800
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
805 810 815
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
820 825 830
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
835 840
<210> 93
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CRT2的VH的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 31)
<400> 93
gacgcttatc gatggccgag gtgcaggggg tggagtctgg tggaggattg gtgcagccta 60
aaggatcatt gaaactctca tgtgccgcct ctggtttcac cttcaatacc tatgccatgc 120
actgggtctg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa 180
gtaataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaaga cagattcacc atctccagag 240
atgattcaca aagcatgctc tatctgcaaa tgaacaacct gaaaactgag gacacagcca 300
tgtattactg tgtgagagaa ggggtttatt actacggtag tagtgggtac tatgctatgg 360
actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagg t 401
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CRT2的VH的CDR1的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 32)
<400> 94
ggtttcacct tcaataccta tgcc 24
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CRT2的VH的CDR2的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 33)
<400> 95
ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 30
<210> 96
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CRT2的VH的CDR3的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 34)
<400> 96
gtgagagaag gggtttatta ctacggtagt agtgggtact atgctatgga ctac 54
<210> 97
<211> 781
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CRT2的scFv的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 39)
<400> 97
gacgcttatc gatggccgag gtgcaggggg tggagtctgg tggaggattg gtgcagccta 60
aaggatcatt gaaactctca tgtgccgcct ctggtttcac cttcaatacc tatgccatgc 120
actgggtctg ccaggctcca ggaaagggtt tggaatgggt tgctcgcata agaagtaaaa 180
gtaataatta tgcaacatat tatgccgatt cagtgaaaga cagattcacc atctccagag 240
atgattcaca aagcatgctc tatctgcaaa tgaacaacct gaaaactgag gacacagcca 300
tgtattactg tgtgagagaa ggggtttatt actacggtag tagtgggtac tatgctatgg 360
actactgggg tcaaggaacc tcagtcaccg tctcctcagg ttcctcaggt ggaggcggtt 420
caggcggagg tggctctggc ggtggcggat cggaaattgt tctcacccag tctccagcaa 480
tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccataacctg cagtgccagc tcaagtgtaa 540
gttacatgca ctggttccag cagaagccag gcacttctcc caaactctgg atttatagca 600
catccaacct ggcttctgga gtccctgctc gcttcagtgg cagtggatct gggacctctt 660
actctctcac aatcagccga atggaggctg aagatgctgc cacttattac tgccagcaaa 720
ggagtagtta ccccctcacg ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgtgcggccg 780
c 781
<210> 98
<211> 2549
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码CAR CRT2的核苷酸序列 (SEQ ID NO. 40)
<400> 98
atgcctcgcg gctggacagc cctgtgcctg ctgtctctgc tgccatccgg cttcatgagc 60
ctggataata acggcacagc caccccagag ctgcctacac agggcacctt cagcaatgtg 120
tccacaaacg tgagctatca ggagaccaca accccttcta ccctgggatc cacaagcctg 180
caccccgtgt ctcagcacgg caacgaagcc accaccaaca tcaccgagac cacagtgaag 240
tttacctcca cctctgtgat tacctctgtg tacggaaata caaactccag cgtgcagtct 300
cagacatctg tgatctccac agtgtttaca acacctgcca atgtgtccac cccagagaca 360
accctgaagc ccagcctgtc tcctggaaat gtgtccgatc tgtctaccac ctccaccagc 420
ctggccacct ctcccaccaa gccctatacc tcctcttctc ccatcctgag cgatatcaaa 480
gccgagatca aatgcagcgg gattcgggaa gtgaaactga cacagggcat ctgcctggaa 540
cagaataaga catccagctg cgccgagttt aagaaagata gaggagaggg actggccagg 600
gtgctgtgtg gcgaagagca ggccgacgcc gatgccggcg cccaggtgtg ttccctgctg 660
ctggcccagt ctgaggtgcg cccccagtgc ctgctgctgg tgctggccaa tcggacagaa 720
attagcagca agctgcagct gatgaaaaaa caccagagcg atctgaaaaa gctgggcatc 780
ctggacttta ccgagcagga cgtggcctct caccagagct acagccagaa aacactgatc 840
gccctggtga ccagcggagc cctgctggcc gtgctgggca tcaccggata tttcctgatg 900
aataggcgca gctggagccc caccggcgag cggctggagc tggagcctgt cgaccgagtg 960
aagcagaccc tgaactttga tctgctgaag ctggccggcg acgtggagtc caaccccggg 1020
ccagggaata tgggcgtgct gctgacccag aggaccctgc tgagcctggt gctggccctg 1080
ctgtttccat ctatggcatc ggacgcttat cgatggccga ggtgcagggg gtggagtctg 1140
gtggaggatt ggtgcagcct aaaggatcat tgaaactctc atgtgccgcc tctggtttca 1200
ccttcaatac ctatgccatg cactgggtct gccaggctcc aggaaagggt ttggaatggg 1260
ttgctcgcat aagaagtaaa agtaataatt atgcaacata ttatgccgat tcagtgaaag 1320
acagattcac catctccaga gatgattcac aaagcatgct ctatctgcaa atgaacaacc 1380
tgaaaactga ggacacagcc atgtattact gtgtgagaga aggggtttat tactacggta 1440
gtagtgggta ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc gtctcctcag 1500
gttcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga tcggaaattg 1560
ttctcaccca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc accataacct 1620
gcagtgccag ctcaagtgta agttacatgc actggttcca gcagaagcca ggcacttctc 1680
ccaaactctg gatttatagc acatccaacc tggcttctgg agtccctgct cgcttcagtg 1740
gcagtggatc tgggacctct tactctctca caatcagccg aatggaggct gaagatgctg 1800
ccacttatta ctgccagcaa aggagtagtt accccctcac gttcggtgct gggaccaagc 1860
tggagctgaa acgtgcggcc gcaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg 1920
agaagagcaa tggaaccatt atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat 1980
ttcccggacc ttctaagccc ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct 2040
atagcttgct agtaacagtg gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc 2100
tcctgcacag tgactacatg aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt 2160
accagcccta tgccccacca cgcgacttcg cagcctatcg ctccagagtg aagttcagca 2220
ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc 2280
taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg 2340
ggggaaagcc gcagagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag 2400
ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg 2460
ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc 2520
acatgcaggc cctgccccct cgctaataa 2549
<210> 99
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3 scFv密码子优化的人核苷酸序列(SEQ ID NO.
101)
<400> 99
atggccgagg tgcagctgca gcagtctggc accgtgctgg ccaggcccgg agcaagcgtg 60
aagatgtcct gcaaggcctc tggctacacc ttcacaagct attggatgca ctgggtgaag 120
cagcgcccag gacagggcct ggagtggatc ggagcaatct accccggcaa ctccgacacc 180
tcttataatc agaagttcaa gggcaaggcc aagctgacag ccgtgacctc tacaagcacc 240
gcctacatgg agctgagcag cctgaccaac gaggatagcg ccgtgtttta ttgcacacac 300
tactatggct ccgactacgc tatggactat tggggccagg gcacctccgt gacagtgtct 360
agcggaggag gaggcagcgg aggaggaggc tccggcggcg gcggctctca gatcgtgctg 420
acccagagcc ctgccatcat gtccgcctct ctgggcgagc gggtgacaat gacctgtaca 480
gcctcctcta gcgtgtcctc tagctacctg cactggtatc agcagaagcc cggctcctct 540
cctaagctgt ggatctacag cacctccaat ctggcatccg gcgtgcctgc aaggttctct 600
ggcagcggct ccggcacctc ttacagcctg acaatcagca gcatggaggc agaggacgca 660
gcaacatact attgtcacca gtatcaccgg agcccaagaa cctttggcgg cggcacaaag 720
ctggagatca agcgggcggc cgca 744
<210> 100
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3 scFv鼠密码子优化的核苷酸序列 (SEQ ID NO.
102)
<400> 100
atggccgagg tgcagctgca gcagtctggc accgtgctgg ctcggcccgg agctagcgtg 60
aagatgtcct gcaaggcttc tggctacacc ttcacaagct actggatgca ctgggtgaag 120
cagcgcccag gacagggcct ggagtggatc ggcgccatct accccggaaa ctccgacacc 180
tcttacaacc agaagttcaa gggcaaggct aagctgacag ccgtgacctc tacaagcacc 240
gcttacatgg agctgagcag cctgaccaac gaggatagcg ccgtgtttta ctgcacacac 300
tactacggct ccgactacgc tatggattac tggggacagg gcacctccgt gacagtgtct 360
agcggaggag gaggaagcgg cggaggcggc agcggaggag gaggatctca gatcgtgctg 420
acccagtctc ctgctatcat gtccgcctct ctgggcgaga gggtgacaat gacctgtaca 480
gcctcctcta gcgtgtcctc tagctacctg cactggtatc agcagaagcc cggctcctct 540
cctaagctgt ggatctacag cacctccaac ctggcttccg gagtgcctgc tcggttctct 600
ggaagcggct ccggaacctc ttacagcctg acaatcagca gcatggaggc tgaggacgcc 660
gctacatact actgtcacca gtaccacagg agcccaagaa cctttggcgg aggcacaaag 720
ctggagatca agagggcggc cgca 744
<210> 101
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2 scFv人密码子优化的核苷酸序列 (SEQ ID NO.
103)
<400> 101
atggcagagg tgcagggagt ggagagcgga ggcggcctgg tgcagcctaa gggctccctg 60
aagctgtctt gcgccgccag cggcttcacc tttaacacat atgcaatgca ctgggtgtgc 120
caggcaccag gcaagggcct ggagtgggtg gcacggatca gaagcaagtc caacaattat 180
gccacctact atgccgacag cgtgaaggat aggttcacaa tctcccgcga cgattctcag 240
agcatgctgt acctgcagat gaacaatctg aagaccgagg acacagccat gtactattgc 300
gtgcgggagg gcgtgtacta ttacggcagc tccggctatt acgctatgga ctactggggc 360
cagggcacca gcgtgacagt gtctagcgga ggaggaggct ccggaggagg aggctctggc 420
ggcggcggca gcgagatcgt gctgacccag tccccagcaa tcatgtccgc ctctccagga 480
gagaaggtga ccatcacatg ctccgcctcc tctagcgtgt cttatatgca ctggttccag 540
cagaagcccg gcacctctcc taagctgtgg atctacagca catccaatct ggcatccggc 600
gtgcccgcaa ggttttctgg cagcggctcc ggcacctctt atagcctgac aatcagccgg 660
atggaggcag aggacgcagc aacctattac tgtcagcaga gatcctctta ccctctgacc 720
tttggcgccg gcacaaagct ggagctgaag cgcgcggccg ca 762
<210> 102
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT2 scFv鼠密码子优化的核苷酸序列(SEQ ID NO.
104)
<400> 102
atggctgagg tgcagggagt ggagagcgga ggaggcctgg tgcagcctaa gggctccctg 60
aagctgtctt gcgccgctag cggattcacc tttaacacat acgctatgca ctgggtgtgc 120
caggctccag gaaagggcct ggagtgggtg gccaggatca gaagcaagtc caacaactac 180
gctacctact acgccgacag cgtgaaggat cggttcacaa tctcccgcga cgattctcag 240
agcatgctgt acctgcagat gaacaacctg aagaccgagg acacagctat gtactactgc 300
gtgcgggagg gcgtgtacta ctacggcagc tccggatact acgctatgga ctactgggga 360
cagggcacct ccgtgacagt gtctagcgga ggaggaggct ccggaggagg aggctctgga 420
ggcggaggca gcgagatcgt gctgacccag tctccagcta tcatgtccgc ctctcccggc 480
gagaaggtga ccatcacatg ctccgcctcc tctagcgtgt cttacatgca ctggttccag 540
cagaagcccg gcacctctcc taagctgtgg atctacagca catccaacct ggctagcgga 600
gtgcccgctc ggttttctgg aagcggctcc ggaacctctt acagcctgac aatctccagg 660
atggaggctg aggacgccgc tacatactac tgtcagcaga gatcctctta ccctctgacc 720
tttggcgccg gaacaaagct ggagctgaag cgcgcggccg ca 762
<210> 103
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2重链CDR1的共有序列 (SEQ ID NO.
105)
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是GYTF或无氨基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是MH或无氨基酸
<400> 103
Xaa Thr Ser Tyr Trp Xaa
1 5
<210> 104
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2重链CDR2的共有序列 (SEQ ID NO.
106)
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是WIGA或无氨基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (10)..(10)
<223> Xaa是S或无氨基酸
<400> 104
Xaa Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Xaa
1 5 10
<210> 105
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2重链CDR3的共有序列 (SEQ ID NO.
107)
<220>
<221> Xaa
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是Y或无氨基酸
<400> 105
Thr His Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Ala Met Asp Xaa
1 5 10
<210> 106
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2轻链 CDR1的共有序列 (SEQ ID NO.
108)
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是SSV或无氨基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是LHWY或无氨基酸
<400> 106
Xaa Ser Ser Ser Tyr Xaa
1 5
<210> 107
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2轻链CDR2的共有序列 (SEQ ID NO.
109)
<220>
<221> Xaa
<222> (1)..(1)
<223> Xaa是LWIY或无氨基酸
<220>
<221> Xaa
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是NLA或无氨基酸
<400> 107
Xaa Ser Thr Ser Xaa
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CRT3变体1和2轻链CDR3的共有序列(SEQ ID NO.
110)
<220>
<221> Xaa
<222> (9)..(9)
<223> Xaa是T或无氨基酸
<400> 108
His Gln Tyr His Arg Ser Pro Arg Xaa
1 5
<210> 109
<211> 216
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 109
actactacca agccagtgct gcgaactccc tcacctgtgc accctaccgg gacatctcag 60
ccccagagac cagaagattg tcggccccgt ggctcagtga aggggaccgg attggacttc 120
gcctgtgata tttacatctg ggcacccttg gccggaatct gcgtggccct tctgctgtcc 180
ttgatcatca ctctcatctg ctaccacagg agccga 216
<210> 110
<211> 123
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 110
aatagtagaa ggaacagact ccttcaaagt gactacatga acatgactcc ccggaggcct 60
gggctcactc gaaagcctta ccagccctac gcccctgcca gagactttgc agcgtaccgc 120
ccc 123
<210> 111
<211> 135
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 111
aaatggatca ggaaaaaatt cccccacata ttcaagcaac catttaagaa gaccactgga 60
gcagctcaag aggaagatgc ttgtagctgc cgatgtccac aggaagaaga aggaggagga 120
ggaggctatg agctg 135
<210> 112
<211> 334
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 112
agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 60
tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 120
cgggatccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 180
aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 240
aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 300
acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gccc 334
<210> 113
<211> 108
<212> DNA
<213> 小家鼠
<400> 113
cggaaggctt ggagattgcc taacactccc aaaccttgtt ggggaaacag cttcaggacc 60
ccgatccagg aggaacacac agacgcacac tttactctgg ccaagatc 108
<210> 114
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-CD28
共刺激信号-CD3 zeta胞内信号传导域
(SEQ ID NO. 116)
<400> 114
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300
ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360
gcagcgtacc gccccagagc aaaattcagc aggagtgcag agactgctgc caacctgcag 420
gaccccaacc agctctacaa tgagctcaat ctagggcgaa gagaggaata tgacgtcttg 480
gagaagaagc gggctcggga tccagagatg ggaggcaaac agcagaggag gaggaacccc 540
caggaaggcg tatacaatgc actgcagaaa gacaagatgg cagaagccta cagtgagatc 600
ggcacaaaag gcgagaggcg gagaggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagc 660
actgccacca aggacaccta tgatgccctg catatgcaga ccctggcccc tcgctaataa 720
aagcttaaca cgagccatag atagaataaa ag 752
<210> 115
<211> 764
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-41BB
共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域
(SEQ ID NO. 117)
<400> 115
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gaaaatggat caggaaaaaa ttcccccaca tattcaagca accatttaag 300
aagaccactg gagcagctca agaggaagat gcttgtagct gccgatgtcc acaggaagaa 360
gaaggaggag gaggaggcta tgagctgaga gcaaaattca gcaggagtgc agagactgct 420
gccaacctgc aggaccccaa ccagctctac aatgagctca atctagggcg aagagaggaa 480
tatgacgtct tggagaagaa gcgggctcgg gatccagaga tgggaggcaa acagcagagg 540
aggaggaacc cccaggaagg cgtatacaat gcactgcaga aagacaagat ggcagaagcc 600
tacagtgaga tcggcacaaa aggcgagagg cggagaggca aggggcacga tggcctttac 660
cagggtctca gcactgccac caaggacacc tatgatgccc tgcatatgca gaccctggcc 720
cctcgctaat aaaagcttaa cacgagccat agatagaata aaag 764
<210> 116
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-OX40
共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域
(SEQ ID NO. 118)
<400> 116
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gacggaaggc ttggagattg cctaacactc ccaaaccttg ttggggaaac 300
agcttcagga ccccgatcca ggaggaacac acagacgcac actttactct ggccaagatc 360
agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 420
tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 480
cgggatccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 540
aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 600
aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 660
acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gcccctcgct aataaaagct taacacgagc 720
catagataga ataaaag 737
<210> 117
<211> 887
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-CD28和41BB
共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域
(SEQ ID NO. 119)
<400> 117
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300
ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360
gcagcgtacc gccccaaatg gatcaggaaa aaattccccc acatattcaa gcaaccattt 420
aagaagacca ctggagcagc tcaagaggaa gatgcttgta gctgccgatg tccacaggaa 480
gaagaaggag gaggaggagg ctatgagctg agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact 540
gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag 600
gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct cgggatccag agatgggagg caaacagcag 660
aggaggagga acccccagga aggcgtatac aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa 720
gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt 780
taccagggtc tcagcactgc caccaaggac acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg 840
gcccctcgct aataaaagct taacacgagc catagataga ataaaag 887
<210> 118
<211> 860
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域-CD28和OX40
共刺激域-CD3 zeta胞内信号传导域
(SEQ ID NO. 120)
<400> 118
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gaaatagtag aaggaacaga ctccttcaaa gtgactacat gaacatgact 300
ccccggaggc ctgggctcac tcgaaagcct taccagccct acgcccctgc cagagacttt 360
gcagcgtacc gcccccggaa ggcttggaga ttgcctaaca ctcccaaacc ttgttgggga 420
aacagcttca ggaccccgat ccaggaggaa cacacagacg cacactttac tctggccaag 480
atcagagcaa aattcagcag gagtgcagag actgctgcca acctgcagga ccccaaccag 540
ctctacaatg agctcaatct agggcgaaga gaggaatatg acgtcttgga gaagaagcgg 600
gctcgggatc cagagatggg aggcaaacag cagaggagga ggaaccccca ggaaggcgta 660
tacaatgcac tgcagaaaga caagatggca gaagcctaca gtgagatcgg cacaaaaggc 720
gagaggcgga gaggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagcac tgccaccaag 780
gacacctatg atgccctgca tatgcagacc ctggcccctc gctaataaaa gcttaacacg 840
agccatagat agaataaaag 860
<210> 119
<211> 872
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 鼠CD8alpha铰链-CD8alpha跨膜域- 41BB和
Ox40 共刺激域和CD3 zeta胞内信号传导
域 (SEQ ID NO. 121)
<400> 119
ggaggcacca agctggaaat caaacgtgcg gccgcaacta ctaccaagcc agtgctgcga 60
actccctcac ctgtgcaccc taccgggaca tctcagcccc agagaccaga agattgtcgg 120
ccccgtggct cagtgaaggg gaccggattg gacttcgcct gtgatattta catctgggca 180
cccttggccg gaatctgcgt ggcccttctg ctgtccttga tcatcactct catctgctac 240
cacaggagcc gaaaatggat caggaaaaaa ttcccccaca tattcaagca accatttaag 300
aagaccactg gagcagctca agaggaagat gcttgtagct gccgatgtcc acaggaagaa 360
gaaggaggag gaggaggcta tgagctgcgg aaggcttgga gattgcctaa cactcccaaa 420
ccttgttggg gaaacagctt caggaccccg atccaggagg aacacacaga cgcacacttt 480
actctggcca agatcagagc aaaattcagc aggagtgcag agactgctgc caacctgcag 540
gaccccaacc agctctacaa tgagctcaat ctagggcgaa gagaggaata tgacgtcttg 600
gagaagaagc gggctcggga tccagagatg ggaggcaaac agcagaggag gaggaacccc 660
caggaaggcg tatacaatgc actgcagaaa gacaagatgg cagaagccta cagtgagatc 720
ggcacaaaag gcgagaggcg gagaggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagc 780
actgccacca aggacaccta tgatgccctg catatgcaga ccctggcccc tcgctaataa 840
aagcttaaca cgagccatag atagaataaa ag 872

Claims (42)

1.分离的抗体，其选择性结合CLEC14A，其中所述抗体：
(a)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.105，优选SEQ ID NO:2或42，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.106，优选SEQ ID NO:3或43，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.107，优选SEQ ID NO:4或44，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.108，优选SEQ ID NO:6或46，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.109，优选SEQ ID NO:7或47，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO.110，优选SEQ ID NO:8或48，或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
或
(b)包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含：
(i)可变重(VH)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)可变轻(VL)CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或具有1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失的与其基本上同源的序列；或
(c)是能与抗体(a)或(b)竞争结合CLEC14A的抗体。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体：
(a)具有SEQ ID NO:1或41的VH域和/或SEQ ID NO:5或45的VL域；或
(b)是能与抗体(a)竞争CLEC14A的的抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体：
(a)具有SEQ ID NO:21的VH域和/或SEQ ID NO:25的VL域；或
(b)是能与抗体(a)竞争结合CLEC14A的抗体。
4.权利要求1(c)或2(b)的抗体，其中所述抗体包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区。
其中所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或42或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或43或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或44或与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:6或46或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:7或47或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:8或48或与其基本上同源的序列。
5.权利要求1(c)或3(b)的抗体，其中所述抗体包含至少一个包含3个CDR的重链可变区和至少一个包含3个CDR的轻链可变区，
其中所述重链可变区包含
(i)VH CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:22或与其基本上同源的序列；
(ii)VH CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:23或与其基本上同源的序列；和/或
(iii)VH CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:24或与其基本上同源的序列；和/或
其中所述轻链可变区包含：
(iv)VL CDR1，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:26或与其基本上同源的序列；
(v)VL CDR2，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:27或与其基本上同源的序列；和/或
(vi)VL CDR3，其具有氨基酸序列SEQ ID NO:28或与其基本上同源的序列。
6.权利要求1(c)、2(b)或4的抗体，其中所述抗体能与权利要求1(a)和/或2(a)中限定的抗体结合基本上相同的表位。
7.权利要求1(c)、3(b)或5的抗体，其中所述抗体能与权利要求1(b)和/或3(a)中限定的抗体结合基本上相同的表位。
8.权利要求1或4至7中任一项的抗体，其中所述基本上同源的序列具有一个或多个所述CDR中的1、2、3或4个氨基酸取代、添加和/或缺失，优选1、2、3或4个取代。
9.权利要求8的抗体，其中所述氨基酸取代是保守取代。
10.权利要求1至9中任一项的抗体，其中所述抗体是小鼠、人或人源化抗体。
11.权利要求1至10中任一项的抗体，其中所述抗体包含整个或部分的抗体重链恒定区和/或整个或部分的抗体轻链恒定区。
12.权利要求1至11中任一项的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
13.权利要求1至12中任一项的抗体，其中所述抗体包含：
(a)重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或41或与其基本上同源的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:5或45或与其基本上同源的序列；或
(b)重链和轻链，所述重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:21或与其基本上同源的序列，所述轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:25或与其基本上同源的序列。
14.权利要求1-13中任一项的抗体，其中所述抗体是抗体的抗原结合片段。
15.权利要求14的抗体，其中所述抗体的所述抗原结合片段是Fab'、Fab、F(ab')2、单域抗体、TandAbs二聚体、Fv、scFv、dsFv、ds-scFv、Fd、线性抗体、微型抗体，双抗体(diabody)、双特异性抗体片段、二体(bibody)、三体、sc-双抗体、kappa(lamda)体、BiTE、DVD-Ig、SIP、SMIP、DART或包含一个或多个CDR的小抗体模拟物。
16.免疫缀合物，其包含与治疗剂、诊断剂或显像剂缀合的权利要求1-15中任一项的抗体。
17.核酸分子，其包含编码权利要求1-16中任一项的抗体或免疫缀合物或编码针对抗原CLEC14A的嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述CAR在免疫效应细胞表面上表达时能够结合靶细胞表面上表达的所述抗原CLEC14A，并且包含抗原结合域，其包含至少一个如权利要求1中定义的CDR氨基酸序列或与其基本同源的序列。
18.权利要求17的核酸分子，其中所述核苷酸序列如SEQ ID NO:11-19、31-39、54-64、101-104中任一项所示或是与其具有至少60％序列同一性的核苷酸序列。
19.表达载体，其包含权利要求17或18的核酸分子。
20.宿主细胞，其包含权利要求17或18的核酸分子或权利要求19的表达载体。
21.病毒，其包含权利要求17或18的核酸分子或权利要求19的表达载体。
22.组合物，其包含权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16的免疫缀合物、权利要求17或18的核酸、权利要求19的表达载体、权利要求20的宿主细胞或权利要求21的病毒和至少一种生理学上可接受的载体或赋形剂，优选其中所述组合物是治疗或药物组合物。
23.权利要求22的组合物，其中所述组合物包含至少一种另外的治疗剂。
24.试剂盒或产品，其包括：
(a)权利要求1-15中任一项的抗体；
(b)权利要求16的免疫缀合物；
(c)权利要求17或18的核酸分子；
(d)权利要求19的表达载体；
(e)权利要求20的宿主细胞；
(f)权利要求21的病毒；和/或
(g)权利要求22或23的组合物。
25.权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16的免疫缀合物、权利要求17或18的核酸、权利要求19的表达载体、权利要求20的宿主细胞、权利要求21的病毒、权利要求22或23的组合物或权利要求24的试剂盒或产品，用于治疗、成像或诊断。
26.权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16的免疫缀合物、权利要求17或18的核酸、权利要求19的表达载体、权利要求20的宿主细胞、权利要求21的病毒、权利要求22或23的组合物或权利要求24的试剂盒或产品，用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况。
27.对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16的免疫缀合物、权利要求17或18的核酸、权利要求19的表达载体、权利要求20的宿主细胞、权利要求21的病毒、权利要求22或23的组合物或权利要求24的试剂盒或产品，特别是有效量的所述抗体、免疫缀合物、核酸、表达载体、宿主细胞、病毒、组合物、试剂盒或产品。
28.权利要求1-15中任一项的抗体、权利要求16的免疫缀合物、权利要求17或18的核酸、权利要求19的表达载体、权利要求20的宿主细胞、权利要求21的病毒、权利要求22或23的组合物或权利要求24的试剂盒或产品在制备用于对抗与CLEC14A表达相关的疾病或状况的药物中的用途。
29.权利要求1至28中任一项的抗体、免疫缀合物、核酸、表达载体、宿主细胞、病毒、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述抗体、免疫缀合物、核酸、表达载体、宿主细胞、病毒、组合物、试剂盒或产品作为与一种或多种另外的治疗剂的组合制剂提供，用于分开、同时或序贯使用或施用。
30.权利要求1至29中任一项的抗体、免疫缀合物、核酸、表达载体、宿主细胞、病毒、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述与CLEC14A表达相关的疾病或状况是血管生成，优选肿瘤血管生成。
31.权利要求1至29中任一项的抗体、免疫缀合物、核酸、表达载体、宿主细胞、病毒、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述与CLEC14A表达相关的疾病或状况是癌症。
32.权利要求16或22-31中任一项的免疫缀合物、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述治疗剂是抗癌和/或抗血管生成剂。
33.权利要求32的免疫缀合物、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述抗癌剂是烷化剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、RNA/DNA抗代谢物、DNA抗代谢物或抗有丝分裂剂。
34.权利要求32的免疫缀合物、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述抗癌剂是细胞毒性部分。
35.权利要求34的免疫缀合物、组合物、试剂盒、产品、方法或用途，其中所述细胞毒性部分是直接细胞毒性化学治疗剂、直接细胞毒性多肽、能够将前药转化为细胞毒性药物的部分、放射增敏剂、直接细胞毒性核酸、编码直接或间接细胞毒性多肽的核酸分子，或放射性原子。
36.将细胞毒剂靶向至受试者身体中的新血管系统的方法，该方法包括给受试者施用权利要求16或32-35中任一项的免疫缀合物。
37.权利要求16或32-35中任一项的免疫缀合物，其用于将细胞毒剂靶向至受试者身体中的新血管系统。
38.权利要求16或32至35中任一项的免疫缀合物在制备或制造用于将细胞毒剂靶向至受试者身体中的新血管系统的药物中的用途。
39.权利要求36-38中任一项的方法、免疫缀合物和用途，其中所述新血管系统是肿瘤新血管系统。
40.权利要求16的免疫偶联物，其中所述诊断或成像剂是可检测的部分或包含磁性纳米颗粒、放射性核素或荧光团。
41.对受试者身体中的新血管系统，优选肿瘤新血管系统成像的方法，该方法包括：
向所述受试者施用权利要求40的免疫缀合物，和
对身体中的所述可检测部分成像。
42.权利要求41的方法，所述方法是检测、诊断和/或预后受试者中的实体瘤的方法，所述方法包括：
对所述受试者施用权利要求40的免疫缀合物，和
检测身体中的所述可检测部分的存在和/或位置。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113024672A (zh) * 2019-12-24 2021-06-25 深圳华大生命科学研究院 一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用
CN114573694A (zh) * 2020-12-01 2022-06-03 深圳华柏生物科技有限公司 一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
WO2019118921A1 (en) 2017-12-14 2019-06-20 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer drive and controller
KR20210143097A (ko) * 2020-05-19 2021-11-26 (주)이노베이션바이오 Cd22에 특이적인 항체 및 이의 용도
EP4216987A1 (en) * 2020-09-22 2023-08-02 Serpentide Inc. A long-lasting glp1 analogue drug for type-2 diabetes
CA3221833A1 (en) * 2021-06-25 2022-12-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody
CN114149506B (zh) * 2021-12-16 2023-01-10 华道(上海)生物医药有限公司 一种抗cd22抗体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027132A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Cancer Research Technology Limited Clec14a inhibitors
WO2013187556A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Scripps Korea Antibody Institute Novel antibody specific for clec14a and uses thereof
CN104203981A (zh) * 2011-12-19 2014-12-10 合成免疫股份有限公司 双特异性抗体分子

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027132A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Cancer Research Technology Limited Clec14a inhibitors
CN104203981A (zh) * 2011-12-19 2014-12-10 合成免疫股份有限公司 双特异性抗体分子
WO2013187556A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Scripps Korea Antibody Institute Novel antibody specific for clec14a and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MURA M 等: "Identification and angiogenic role of the novel tumor endothelial marker CLEC14A", 《ONCOGENE》 *
ZHUANG X等: "Abstract LB-256: Immunotherapy using genetically modified T lymphocytes to target CLEC14A on the tumor vasculature", 《PROCEEDING OF THE AACR ANNUAL MEETING 2014》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113024672A (zh) * 2019-12-24 2021-06-25 深圳华大生命科学研究院 一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用
CN113024672B (zh) * 2019-12-24 2022-05-31 深圳华大生命科学研究院 一种抗Dig的抗体及其在测序中的应用
CN114573694A (zh) * 2020-12-01 2022-06-03 深圳华柏生物科技有限公司 一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途
CN114573694B (zh) * 2020-12-01 2023-09-01 深圳华柏生物科技有限公司 一种抗IL13Rα2抗体及其制备方法和用途

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