CN104203981A - 双特异性抗体分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双特异性抗体分子以及其制备方法、其用途和编码双特异性抗体分子的核酸分子。本发明尤其是提供一种能够介导免疫细胞靶细胞限制性激活的抗体分子。

Description

双特异性抗体分子

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2011年12月19日向美国专利商标局提交的美国临时申请61/577,327的优先权权益，所述申请的全部内容并入本文用于全部目的。

发明领域

本发明涉及一种双特异性抗体分子以及其制备方法、其用途和编码双特异性抗体分子的核酸分子。本发明尤其是提供一种能够介导免疫细胞靶细胞限制性激活的抗体分子。

发明背景

针对抗原特异性T细胞受体(TCR)/CD3复合物的单克隆抗体能够有效激活T细胞。然而，这种激活需要抗体-经由其Fc部分-在Fc受体表达细胞表面上多聚化，通常也提供T细胞激活辅助信号(Davis,L.,Vida,R.和Lipsky,P.E.,Regulation of human T lymphocyte mitogenesis by antibodies to CD3,J.Immunol.[1986]137:3758-3767)。

识别靶细胞上的抗原(例如，白血病细胞上的FLT3或CD19，黑色素瘤细胞上的CSPG4-抗原或胶质瘤细胞上的EGFR)和抗原特异性T细胞受体(TCR)/CD3复合物的双特异性抗体，同样能够激活T细胞(Jung,G.,Ledbetter,J.A.,和Muller-Eberhard,H.J.,Induction of cytotoxicity in restinghuman T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A[1987]84:4611-4615；Jung,G.,&Eberhard,H.J.,Anin-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates,Immunol.Today[1988]9:257-260；Jung,G.,Brandl,M.,Eisner,W.,Fraunberger,P.,Reifenberger,G.,Schlegel,U.,Wiestler,O.D.,Reulen,H.J.,Wilmanns,W.Localimmunotherapy of glioma patients with a combination of 2 bispecific antibodyfragments and resting autologous lymphocytes:evidence for in situ T-cellactivation and therapeutic efficacy,Int J Cancer.[2001]91:225-30)，此外还能在靶细胞上集中活化细胞(Staerz,U.D.,Kanagawa,O.,和Bevan,M.J.,Hybridantibodies can target sites for attack by T cells,Nature[1985]314:628-631；Perez,P.,Hoffman,R.W.,Shaw,S.,Bluestone,J.A.,和Segal,D.M.Specifictargeting of cytotoxic T cells by anti-T3 linked to anti-target cell antibody,Nature[1985]316:354-356；Jung,G.,Honsik,C.J.,Reisfeld,R.A.和Muller-Eberhard,H.J.Activation of human peripheral blood mononuclear cells by anti-T3:killing oftumor target cells coated with anti-target-anti-T3 conjugates,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,83:4479-4483,1986)。因此，T细胞介导的肿瘤细胞溶解发生。T细胞共刺激分子比如CD28的激动性抗体提高了抗-CD3介导的T细胞激活。如果这些共刺激抗体也能以双特异性形式提供，它们会特别有效(Grosse-Hovest,L.,Hartlapp,I.,Marwan,W.,Brem,G.,Rammensee,H.G.,和Jung,G.,A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted,supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing,Eur.J.Immunol.[2003]33:1334-1340)。总之，对于含有CD3特异性的双特异性抗体的治疗应用，我们认为与Fc受体结合能够被排除是绝对必要的(Jung,G.,和Eberhard,H.J.,An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates,Immunol.Today[1988]9:257-260；Jung,G.,Freimann,U.,Von Marshall,Z.,Reisfeld,R.A.,和Wilmanns,W.,Target cell-induced T cell activation with bi-andtrispecific antibody fragments,Eur.J.Immunol.[1991]21:2431-2435)。这种与Fc受体结合可能导致T细胞体内激活，无论是否与靶抗原结合，所述T细胞体内激活会在其中可发现Fc受体表达细胞的任何位置处出现，例如在全部造血、淋巴和网状内皮系统内。根据经验，这种T细胞激活导致T细胞全身性激活，伴随细胞因子释放综合征，这是一种在T细胞激活细胞因子或抗体的治疗应用过程中的严重不良反应(Rosenberg,S.A.,Lotze,M.T.,Yang,J.C.,Aebersold,P.M.,Linehan,W.M.,Seipp,C.A.,和White,D.E.,Experience with theuse of high-dose interleukin-2 in the treatment of 652 cancer patients,Ann.Surg.[1989]210:474-484；Tibben,J.G.,Boerman,O.C.,Massuger,L.F.,Schijf,C.P.,Claessens,R.A.,和Corstens,F.H.,Pharmacokinetics,biodistribution andbiological effects of intravenously administered bispecific monoclonal antibodyOC/TR F(ab')2 in ovarian carcinoma patients,Int.J.Cancer[1996]66:477-483；Kroesen,B.J.,Buter,J.,Sleijfer,D.T.,Janssen,R.A.,van der Graaf,W.T.,The,T.H.,de,L.L.和Mulder,N.H.,Phase I study of intravenously applied bispecificantibody in renal cell cancer patients receiving subcutaneous interleukin 2,Br.J.Cancer[1994]70:652-661)。因此，以形式化双特异性CD3抗体为目标需要避免Fc介导的T细胞全身性激活，从而允许靶细胞限制性激活，这专一依赖双特异性抗体的靶部分与相应的靶抗原结合(Jung,G.,&Eberhard,H.J.,An in-vitro model for tumor immunotherapy with antibody heteroconjugates,Immunol.Today[1988]9:257-260；Jung,G.,Freimann,U.,Von Marshall,Z.,Reisfeld,R.A.,and Wilmanns,W.Target cell-induced T cell activation with bi-and trispecific antibody fragments,Eur.J.Immunol.[1991]21:2431-2435)。由上述可知，当选择靶抗原时，必须注意表达尽可能限制于恶性细胞。这样，非恶性细胞的激活和细胞因子的伴随释放能够被维持得尽可能低。

下述情况适用相似的考量：构建双特异性抗体，这种抗体包含竞争性效应抗体，后者与在除T细胞以外的免疫细胞上的触发受体结合，所述触发受体比如在NK细胞表达的CD16。无论如何，根据以上关于T细胞的概述缘由，Fc介导的抗体与Fc受体结合应该得到避免。

目前已经最大程度上进入临床开发的双特异性抗体是Blinatumomab(Micromet,Inc.,Rockville,MD)，这是一个双特异性单链抗体，具有CD19×CD3特异性和抗淋巴瘤和白血病细胞的显著治疗活性(Bargou,R.,等人,Tumor regression in cancer patients by very low doses of a T cell-engagingantibody,Science[2008]321:974-977；Topp,M.S.,等人,Targeted therapy withthe T-cell-engaging antibody blinatumomab of chemotherapy-refractory minimalresidual disease in B-lineage acute lymphoblastic leukemia patients results inhigh response rate and prolonged leukemia-free survival,J.Clin.Oncol.[2011]29:2493-2498)。

由于单链形式不包含Fc部分的任何结构域，该抗体有上述解释意思内的靶细胞限制性，也就是存在CD19表达靶细胞时其仅激活T细胞(Brischwein,K.,等人,Strictly target cell-dependent activation of T cells bybispecific single-chain antibody constructs of the BiTE class,J.Immunother.[2007]30:798-807)。

然而，CD19也在正常B细胞上表达，以致尽管有靶细胞限制性，在治疗应用后，细胞因子的全身性释放也会发生，以日剂量约100μg即已产生显著的细胞毒性(Bargou,R.,等人,Tumor regression in cancer patients by very lowdoses of a T cell-engaging antibody,Science[2008]321:974-977；Topp,M.S.,等人,Targeted therapy with the T-cell-engaging antibody blinatumomab ofchemotherapy-refractory minimal residual disease in B-lineage acutelymphoblastic leukemia patients results in high response rate and prolongedleukemia-free survival,J.Clin.Oncol.[2011]29:2493-2498)。

此外，单链形式有以下缺点：(i)约50 kDa的分子量相对较低，并且与短血清半衰期有关，(ii)这种形式的抗体极易聚合，和(iii)在常规发酵过程中很难产生(Grosse-Hovest,L.,Hartlapp,I.,Marwan,W.,Brem,G.,Rammensee,H.G.,和Jung,G.,A recombinant bispecific single-chain antibodyinduces targeted,supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing,Eur.J.Immunol.[2003]33:1334-1340；Grosse-Hovest,L.,等人,Cloned transgenicfarm animals produce a bispecific antibody for T cell-mediated tumor cell killing,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A[2004]101:6858-6863)。

因此，本发明的目的是提供一种双特异性抗体分子，该分子至少克服一些上述困难，并且能够广泛用于如上所述关于免疫细胞的严格限制靶细胞激活的治疗等等。

发明概述

本发明第一方面提供一种重组双特异性抗体分子。该重组双特异性抗体分子由Fab片段、单链Fv片段和免疫球蛋白CH2结构域组成。Fab片段包含用于第一抗原的第一结合位点。单链Fv片段包含用于第二抗原的第二结合位点。Fab片段和单链Fv片段经由CH2结构域彼此结合。在典型实施方案中，形成重键间二硫键的半胱氨酸残基(人IgG-免疫球蛋白中的C226和C229)发生更换。

本发明第二方面提供一种四聚体抗体分子。该四聚体抗体分子包含根据第一方面所述抗体分子的二聚体。该二聚体通常由第一方面所述两个抗体分子的半胱氨酸残基之间的键限定，也就是在铰链区中的半胱氨酸之间。这些半胱氨酸残基通常是保护氨基酸(人IgG-免疫球蛋白C226和C229)。

本发明第三方面提供一种重组双特异性抗体分子。该重组双特异性抗体分子包含含有用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段，含有用于第二抗原的第二结合位点的单链Fv片段，免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域。Fab片段和单链Fv片段经由CH2结构域/CH3结构域连接。CH2结构域的能够介导与Fc受体结合的至少一个氨基酸残基缺失或突变。在这一方面的典型实施方案中，形成链间二硫键的半胱氨酸残基(人IgG-抗体中的C226和C229)中的至少一个发生更换。在一些实施方案中，这些分子可包含在CH3区的另外的修饰以阻止同型CH3结构域二聚化。

本发明第四方面提供一种四聚体抗体分子。该四聚体抗体分子由根据第三方面所述的重组双特异性抗体分子的二聚体组成。该二聚体通常由铰链区中的保护半胱氨酸(人IgG-抗体中的C226和C229)之间的键限定。

本发明第五方面进一步提供一种重组双特异性抗体分子。该抗体分子包含含有用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段、含有用于第二抗原的第二结合位点的单链Fv片段、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域。Fab片段和单链Fv片段经由CH2结构域和CH3结构域彼此连接。该抗体分子的能够形成用于二聚化的二硫键的至少一个半胱氨酸残基缺失或突变。

本发明第六方面提供一种核酸分子。该核酸分子编码根据第一、第二、第三、第四或第五方面中任一所述抗体分子。

本发明第七方面提供一种药物组合物。该药物组合物包含根据第一、第二、第三、第四和第五方面中任一所述抗体分子。

本发明第八方面提供一种治疗疾病的方法。该方法包括使用根据第一、第二、第三、第四和第五方面中任一所述抗体分子。通常抗体分子施用于由此需要的病人。

本发明第九方面提供一种包含第六方面所述核酸分子的宿主细胞。

本发明第十方面提供一种制备根据第一、第二、第三、第四和第五方面之一所述抗体分子的方法。该方法包括在允许核酸分子表达的条件下，表达编码该抗体分子的核酸。

本发明的这些方面在下面的说明书、附图和非限定实施例中将会得到更加全面的理解。

附图简述

图1示意性地描述根据本发明的双特异性抗体分子的实施方案。

图1A描述二价分子，其具有Fab片段、CH2结构域和单链Fv片段。抗体分子有主链，其中CH2结构域经由其N-端偶联到Fab片段的重链CH1和VH结构域，经由其C-端偶联到单链Fv片段(bsFc-1/2-形式)。

图1B描述二价抗体分子，其具有主链，其中CH2结构域连接到Fab片段的轻链，即其中主链包含VL和CL结构域、铰链区、CH2结构域和单链Fv片段。

图1C显示二价抗体分子，其中主链包含VL和CH1结构域、铰链区、CH2结构域和单链Fv片段。较低分子量的第二条链包含VH和CL结构域。因此，在图1C的抗体分子中，Fab片段因此不是其中轻链和重链的可变结构域融合到其各自的恒定区(分别是CL或CH1)的“经典(自然存在)的”Fab片段，而是“杂交的”Fab片段，其中可变结构域融合到“反义链”的恒定结构域，即VH结构域融合到CL结构域，VL结构域融合到CH1结构域。

图1D描述二价抗体分子，其具有主链，其中CH2结构域连接至CL和VH结构域。较低分子量的第二条链包含VL和CH1结构域。因此，图1D的抗体分子包含“杂交的Fab片段”(包含第一结合位点)，如同样出现在图1C的分子中。

图1E描述具有图1A所示结构的二价抗体分子，其中CH2结构域和/或铰链区中的氨基酸已经被修饰(图1O中用“X”表示，bsFc^ko-1/2-形式)。同样，这种修饰可以插入到图1B-1D中所述分子中。在图1A-1E所描述的分子中，形成链间二硫键的半胱氨酸残基(人IgG-抗体中的C226和C229)被更换以阻止二聚体(●)的形成。

图1F描述作为图1A中所述单元的二聚体的四价分子的示例性实施方案。这种分子也可以图1B-1D中描述的Fab-结构构建，这个结构有或没有图1E中所述的Fc修饰。这些修饰在图1P中列出。

图1G描述四价分子的示例性实施方案，其作为包含Fab片段、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段的单元的二聚体。CH2结构域和铰链区中的氨基酸被修饰(X)；图1P中概述。抗体的两条主链包含VH和CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段(bsFc^ko-1-形式)。类似分子也可以图1A-1E中所述Fab-结构构建。在所有这些分子中，二聚体由铰链区中的保护氨基酸(人IgG-抗体中的C226和C229)限定。

图1H描述四价分子，作为包含Fab片段、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段的单元的二聚体。在Fab片段内，抗体的两条主链包含VH和CL结构域。

图1I显示具有图1G中所述一般结构的四价抗体。与图1G的实施方案相比，该抗体的两条主链中只有一条包含CH2结构域和铰链区中的被修饰的氨基酸(由“X”表示)。

图1J描述四价分子，其中两条主链包含VL和CL结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段。

图1K描述具有两个结构不同的Fab片段的四价分子。抗体的第一条主链包含VL和CL结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段。抗体的第二条主链包含VH和CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段。

图1L描述四价分子，作为包含Fab片段、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段的单元的二聚体。在Fab片段内，抗体的两条主链包含VL和CH1结构域。

图1M描述又一个具有两个结构不同的Fab片段的四价分子。抗体的第一条主链包含VL和CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段。抗体的第二条主链包含VH和CL结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域和单链Fv片段。

图1N描述具有Fab片段、CH2和CH3结构域和单链Fv片段的二价分子的示例性实施方案。抗体分子具有主链，其中CH2结构域经由其N-端偶联到Fab片段的重链CH1和VH结构域，并且经由其C-端偶联到CH3结构域，CH3结构域经由其C-端偶联到单链Fv片段。此分子也可以图1A-1D中所描述的Fab-结构构建，并且可以包含如图1E和1O中所描述的铰链区和CH2区中的Fc修饰(“X”)。此外，它们可以包含CH3结构域中的修饰以防止这个结构域的二聚化，且可影响与新生Fc受体(FcRn)结合。涉及于二聚化中并且因此可被缺失或突变修饰的残基的实例包括T366、L368、F405、Y407和K409(参见Dall’Aqua等人.“Contribution of domain interface residuesto the stability of antibody CH3 domain homodimers”Biochemistry(1998)Volume:37,Issue:26,9266-9273页)。CH3结构域界面中的可被修饰的其他接触残基包括Q347、Y349、T350、L351、L368、K370、K392、T394、P395、V397、L398、D399、F405、Y407和K409。参见S.Miller Protein-ProteinRecognition and the Association of Immunoglobulin Constant Domains.J.Mol.Biol.(1990)Volume 216 pp 965-973,和J Deisenhofer Crystallographicrefinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex withfragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9-and 2.8-A resolution.Biochemistry(1981)Volume 20 pp 2361-2370，并且就新生Fc受体的结合而言，例如CH2结构域的下述氨基酸残基：T250、M252、S254、T256、T307H310和CH3结构域的下述氨基酸残基：E380 M428、H433、N434、H435(参见Roopenian&Akilesh的综述；FcRn:the neonatal Fc receptor comes ofage.Nature Reviews Immunology(2007)Volume 7 pp:715-725)。在本发明所有这些分子中，形成的链间二硫键的半胱氨酸残基(人IgG-抗体中的C226和C229)发生更换以阻止二聚体(●)的形成。

相对于已描述的实施方案，图1A-1N中未描述的其它示例性实施方案包括这样的分子：在该分子中，C-端单链Fv-部分可以处于VL-VH-取向，而不是描述的VH-VL-取向，意味着VL结构域融合至各自的恒定结构域。

图1O列出示例性修饰，所述修饰可以引入到图1A-D和图1N中所述的二价抗体变体以获得图1E中所举例的Fc缺陷衍生物。排除保护半胱氨酸(人IgG-抗体的C226和C229)，修饰与图1P所示那些相同。氨基酸的编号与Kabat编号[EU-索引]一致。wt＝IgG1人野生型序列；△1＝基因敲除；Glycan＝△1-基因敲除缺失糖部分≌297；△2-5延续△1进一步敲除变体；-＝已缺失氨基酸。

图1P列出可以用于获得图1F-M中所述四价分子的示例性修饰。氨基酸的编号与Kabat编号[EU-索引]一致。wt＝IgG1人野生型序列；△1＝基因敲除；Glycan＝△1-基因敲除缺失糖部分≌297；△2-5延续△1进一步敲除变体；-＝被缺失氨基酸。

图2A-2C描述用于产生图1所述抗体的优化重链(主链)的克隆程序的示意图，作为具有ADCC-衰减修饰的Fc-部分的二价或四价双特异性抗体。

i)描述基于pcDNA3(Invitrogen；缺失CMV启动子和牛生长激素终止信号)的质粒骨架的原始载体。这个质粒包含具有免疫球蛋白重链基因座的调节元件的人γ1同型Ig重链。

ii)表明VDJ(重链可变结构域)或VJ(轻链可变结构域)元件经由限制性内切核酸酶位点AatII和ClaI发生更换。

iii)表明全人γ1同型Ig重链针对scFv片段、CH3-缺失以及铰链和CH2修饰的DNA元件编码序列的简单更换(经由限制性位点MluI和SpeI)，得到二价双特异性抗体重链。对于某些抗体变体，例如图1D中所述那些，CH1结构域可被CL-结构域替换。

iv)修饰的CH1-H-CH2片段(经由限制性位点MluI和BspEI)针对铰链和CH2修饰的CH1-H-CH2-CH3元件更换得到四价双特异性抗体重链，或如v)中所示。此外，如果仅有位点C226和C229处的半胱氨酸发生更换，则得到的分子是如图1N中所述的二价双特异性抗体分子。

v)scFv片段(经由限制性位点BspEI和SpeI)针对其他抗原特异性或不同VH和VL取向的scFv-片段发生更换。能够结合置换iv)和v)。

图2B和2C)中详细显示分别邻近已插入VDJ-CH1和scFv-元件的区域。

图2D-F描述用于生成人单特异性抗体的轻链的克隆程序的示意图。

i)基于pCR-Script(Stratagene；缺失lacZ启动子和终止信号)质粒骨架，亲本载体包含人κ-基因的VJ区和C区以及免疫球蛋白轻链基因座的调节元件。

ii)VJ(轻链可变结构域)元件或VDJ(重链可变结构域)元件经由限制内切酶XhoI和SpeI发生更换。

iii)CL(恒定轻链)元件经由限制内切酶PmlI和BsmBI发生更换。

图2E和2F中详细显示邻近已插入VJ和CL元件的区域。

框表示外显子，环表示增强子元件，细线表示UT区和内含子序列。前导序列L₁和L₂由两个不同的外显子编码(也示于图2B和2E)；V，可变区；D，多变区；J，连接区；CH1、CH2、CH3，分别为恒定重链和轻链的CL外显子；H，铰链区，scFv单链Fv-片段；X＝氨基酸修饰。NotI、AatII、ClaI、MluI、BspEI、SpeI、XhoI、KpnI、XhoI、SpeI、PmlI、BsmBI，SaII为用于克隆的限制性内切酶；Amp^R和Neo^R分别表示氨苄青霉素和新霉素抗性的编码区。

|表示分泌信号肽的切割位点；[,]表示外显子-内含子边界。

图3A通过根据本发明的两个不同形式的特异性抗体(有FLT3×CD3特异性)说明靶细胞限制性T细胞激活(³H-胸腺嘧啶核苷结合)。抗体用于不包括(空心符号)与包括(实心符号)FLT3/CD19-阳性REH细胞的细胞。○、●：图1A中所述二价抗体分子，其包含图1E和1O中所述“Glycan”序列(bsFc^ko-1/2-形式)、具有FLT3结合位点的Fab片段、具有CD3结合位点的scFv片段。□、■：图1G中所述四价抗体分子，其包含图1P中所述△1序列(bsFc^ko-1-形式)、具有FLT3结合位点的Fab₂片段、具有CD3结合位点的scFv片段。*：完整单特异性的没有靶细胞的抗-CD3抗体。缺失靶细胞时，完整单特异性CD3抗体以Fc/FcR依赖性方式有效激活T细胞，然而双特异性抗体是无效的。这表明本发明缺乏Fc/FcR的双特异性形式与完整形式结合一样好。

图3B说明通过根据本发明的不同二价双特异性抗体的靶细胞限制性T细胞激活(TNF释放)，用于不包括(空心符号)与包括(实心符号)FLT3/CD19-阳性REH细胞的细胞。○、●：图1A中所述二价抗体分子，其包含图1E和1O中所述“Glycan”序列、具有FLT3结合位点的Fab片段、具有CD3结合位点的scFv片段。◇、◆：图1E中所述二价抗体分子，其包含图1O中所述“Glycan”序列、具有CD19结合位点的Fab片段、具有TCR结合位点的scFv片段；▽、▼：图1E中所述二价抗体分子，其包含图1O中所述“Glycan”序列、具有CSPG4结合位点的Fab片段、具有CD3结合位点的scFv片段。硫酸软骨素蛋白聚糖CSPG4是黑色素瘤细胞的靶抗原且在REH细胞上不表达。

图4分别描述在4小时⁵¹铬释放试验中，通过根据本发明的双特异性抗体和通过激活的CD8阳性T杀伤细胞，(A)FLT3/CD19表达REH细胞和(B)CSPG表达SKMel63细胞的特异性溶解。●：图1E中所示FLT3×CD3，bsFc^ko-1/2形式；■：图1G中所示FLT3×CD3，bsFc^ko-1形式；▼：图1E中所示CSPG4×CD3，bsFc^ko-1/2形式；◆：图1E所示中CD19×TCR，bsFc^ko-1/2形式。

图5显示三种不同形式的具有相同特异性的FLT3×CD3抗体比较：图1E中所示双特异性单链形式(bs-scFv)，bsFc^ko-1/2形式，和图1G中所示bsFc^ko-1形式。A：通过凝胶过滤的聚集测定(值以百分比计)。聚集体移动接近空隙体积，对于bs-scFv、bsFc^ko-1/2、bsFc^ko-1分别为43％、0％、2％。推断如果抗体表达为bs-scFv而不是bsFc^ko-1/2或bsFc^ko-1，聚集体的形成显著更明显。B：经由亲和色谱法，抗体基因转染进入生产细胞并纯化后的产率。可以看到，对于根据本发明的两个Fc^ko形式，聚集体的形成显著降低，并且产率大幅高于双特异性单链形式(bs-scFv)。

图6A显示可包含在本发明的抗体中的示意性轻链序列。各自肽链对应于没有相应的前导肽序列的成熟蛋白质。序列包含粗体表示的N-端可变结构域和斜体表示的C-端恒定结构域。可变结构域的互补决定区(CDR)有下划线。

图6B描述示意性主链序列，其在本发明中也可以称为可包含在本发明的抗体中的重链。bsFc-1/2形式(图1E)的这个特殊的主链包含VH结构域、CH1结构域、铰链区、修饰的CH2结构域、scFv片段的VL结构域和VH结构域。在序列实例21)(SEQ ID NO:26)中，主链包含如实例图1G-M(bsFc^ko-1-形式)中所示CH3结构域。

粗体表示VH结构域，下划线文字为常规CH1结构域和常规铰链、CH2和CH3结构域。主链进一步包含scFv片段的粗体斜体表示的VL结构域和VH结构域(粗体)。VH和VL结构域经由连接序列彼此偶联，用斜体下划线表示。VL和VH区各自的互补性决定残基(CDR)用下划线表示。CH2结构域和scFv片段经由小的连接序列(GQPSG)彼此偶联，用斜体表示。

发明详述

本发明涉及一种重组双特异性抗体分子。这个抗体分子由同样天然存在的元件组成，即天然存在的免疫球蛋白，也就是免疫球蛋白重链和轻链的结构域。

术语“抗体”通常指具有免疫球蛋白-类功能的蛋白质性结合分子。抗体的典型实例是免疫球蛋白，以及其衍生物或功能片段，因此仍然保留结合特异性。用于制备抗体的技术是本领域熟知的。术语“抗体”还包括不同类的免疫球蛋白(Ig’s)(例如IgA、IgG、IgM、IgD和IgE)和亚类(如IgG1、lgG2等)。抗体的示例性实例是Fab片段、F(ab’)₂、Fv片段、单链Fv片段(scFv)、双体或结构域抗体(Holt LJ等人,Trends Biotechnol.21(11),2003,484-490)。结构域抗体可以是单结构域抗体、单可变结构域抗体或免疫球蛋白单可变结构域，这些抗体只有一个可变结构域，可能是VH或VL，特异性结合抗原或独立于其他V区或结构域的表位。这种免疫球蛋白单可变结构域可以不仅包含独立的抗体单可变结构域多肽，还包含更大的多肽，这个多肽包含抗体单可变结构域多肽序列的一个或多个单体，或由所述一个或多个单体组成。因此，术语“抗体”的定义还包含例如嵌合体、单链和人源化抗体的实施方案。

根据本发明的抗体分子可以携带一个或多个结构域，此结构域的序列与免疫球蛋白M、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白D或免疫球蛋白E的相应天然存在的结构域具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。就这一点而言，本文使用的术语“约”或“大约”是在20％偏差内，例如在给定值或范围的10％或5％偏差内。

因此，本发明抗体分子的主链(较长多肽链)可包含与免疫球蛋白μ重链、免疫球蛋白γ重链、免疫球蛋白α重链、免疫球蛋白δ重链或免疫球蛋白ε重链的相应结构域具有上述序列同一性的结构域，包括由所述结构域组成。此外，本发明的抗体分子可包含与免疫球蛋白λ轻链或免疫球蛋白κ轻链的相应结构域具有上述序列同一性的结构域，包括由所述结构域组成。在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子的所有重链结构域与免疫球蛋白μ重链、免疫球蛋白γ重链(如γ1、γ2、γ3或γ4重链)、免疫球蛋白α重链(如α1和α2重链)、免疫球蛋白δ重链或免疫球蛋白ε重链的相应区域具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子中存在的所有轻链结构域与免疫球蛋白λ轻链(如λ1、λ2、λ3或λ4轻链)或免疫球蛋白κ轻链的相应区域具有至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。

本文公开的关于氨基酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为，在比对序列和引入缺口(如果有必要)以实现最大百分比的序列同一性之后，并且不考虑作为序列同一性一部分的任何保守置换，在候选序列中与参考序列(即本发明的抗体分子)中氨基酸残基成对一样的氨基酸残基的百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以通过本领域技术内的多种方式实现，例如，使用公开可用计算机软件如BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括实现被比较序列全长的最大比对所需的任何算法。本文公开的同样适用于核苷酸序列。

术语“可变的”指的是免疫球蛋白结构域的部分，这些部分表现出序列可变性并且参与确定特定抗体的特异性和结合亲和力(即“可变结构域”)。可变性不是均匀分布在抗体的整个可变结构域，它是集中在每个重链和轻链可变区的亚结构域。这些亚结构域称为“高变区”、“HVR”或“HV”或“互补决定区”(CDR)。可变结构域的较保守(即非高变的)部分被称为“框架”区(FR)。天然存在的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区，主要采用β-折叠结构，由三个高变区连接，形成连接环，并在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区聚在一起靠近FR，与另一条链的高变区一起促进抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，见下文)。一般来说，天然存在的免疫球蛋白包含六个CDR(见下文)，三个在VH中(H1、H2、H3)和三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然存在的免疫球蛋白中，H3和L3表现出六个CDR的最高可变性，特别是H3被认为在赋予免疫球蛋白好的特异性中发挥独特作用。恒定区并不直接参与抗原结合，但表现出多种效应功能，比如，抗体-依赖性、细胞介导的细胞毒性和补体激活。

相应的免疫球蛋白μ重链、γ重链、α重链、δ重链、ε重链、λ轻链或κ轻链可为任何物种的，如哺乳动物物质，例如啮齿类物种、两栖动物，例如包括如青蛙、蟾蜍、火蜥蜴或蝾螈的滑体亚纲，或无脊椎物种。哺乳动物的实例包括但不限于大鼠、小鼠、兔、天竺鼠、松鼠、仓鼠、刺猬、鸭嘴兽、美洲鼠兔、犰狳、狗、狐猴、山羊、猪、牛、负鼠、马、蝙蝠、土拨鼠、猩猩、猕猴(orang-utan)、绒毛猴(woolly monkey)、猕猴(macaque)、黑猩猩、绢毛猴(绒顶柽柳猴)、绒猴或人。

术语“免疫球蛋白”指一种糖蛋白或其抗原结合部分，所述糖蛋白包括由二硫键连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链具有重链可变区(本文缩写为V_H)和重链恒定区。在一些实施方案中，重链恒定区包括三个结构域C_H1、C_H2和C_H3。每条轻链有轻链可变区(本文缩写为V_L)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域C_L。V_H和V_L区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，穿插着更保守的区域，称为框架区(FR)。CDR包含负责抗体与抗原特异性相互作用的大多数残基。每个V_H和V_L具有三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原表位相互作用的结合结构域。

免疫球蛋白的每条轻链包含N-端可变(V)结构域(VL)和恒定(C)结构域(CL)。每条重链包含N-端V结构域(VH)、三个或四个C结构域(CH)和铰链区。根据本发明的抗体分子同样包含这些结构域和区域(尽管双特异性抗体分子的一个结合位点只由单链Fv片段形成)。

本文使用的免疫球蛋白通常是四聚体糖基化的蛋白质，其由各约25 kDa的两条轻(L)链和各约50 kDa的两条重(H)链组成。轻链的两种类型，称为λ和κ，可发现于免疫球蛋白中。根据重链恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为五大类：A、D、E、G和M，其中的几个可进一步划分为亚类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。IgM免疫球蛋白由5个基本异四聚体单元连同称为J链的另外的多肽组成，并且包含10个抗原结合位点；而IgA免疫球蛋白含有2-5个基本4-链单元，其可与J链结合聚合形成多价集合物。对于IgG，4-链单元通常约150,000道尔顿。

术语“氨基酸”或“氨基酸残基”指α-或β-氨基羧酸。

当与蛋白质或肽相关使用时，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有本领域认可定义的α-氨基羧酸，如选自下述的氨基酸：L-丙氨酸(Ala或A)；L-精氨酸(Arg或R)；L-天门冬酰胺(Asn或N)；L-天门冬氨酸(Asp或D)；L-半胱氨酸(Cys或C)；L-谷氨酰胺(GIn或Q)；L-谷氨酸(GIu或E)；甘氨酸(GIy或G)；L-组氨酸(His或H)；L-异亮氨酸(ILE或I)；L-亮氨酸(Leu或L)；L-赖氨酸(Lys或K)；L-甲硫氨酸(Met或M)；L-苯丙氨酸(Phe或F)；L-脯氨酸(Pro或P)；L-丝氨酸(Ser或S)；L-苏氨酸(Thr或T)；L-色氨酸(Trp或W)；L-酪氨酸(Tyr或Y)和L-缬氨酸(VaI或V)，然而经修饰、合成或稀有的氨基酸如牛磺酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、同型半胱氨酸、羟脯氨酸、硫代脯氨酸、碘代-酪氨酸、3-硝基-酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、5-羟基-色氨酸、肌肽、环亮氨酸、3,4-二羟苯丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、脯氨醇、烯丙基甘氨酸或乙酸乙酯-2-羧酸可以根据需要使用。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(如Ala、Cys、ILE、Leu、Met、Phe、Pro、VaI)；带负电荷侧链(如Asp、GIu)；带正电荷侧链(如Arg、His、Lys)；或不带电的极性侧链(如Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp和Tyr)。

术语“表位”，也被称为“抗原决定簇”，指抗体或T-细胞受体特异性结合从而形成复合物的抗原的部分。因此，术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任一分子或蛋白决定簇。本文所述抗体分子的结合位点(抗体结合部位)可以与构象表位或连续表位特异性结合/相互作用，所述构象表位或连续表位对于靶结构是独特的。表位决定簇通常由分子的化学活性表面组分如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特点，以及特定电荷特征。在一些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面组分，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特点，和/或特定电荷特征。关于多肽抗原，构象表位或不连续表位的特点是存在两个或更多个的分立氨基酸残基，其在一级序列中分离，但当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，在分子表面组装成连续结构(SeIa,M.,Science(1969)166,1365-1374；Laver,W.G.,et al.Cell(1990)61,553-556)。促成表位的两个或更多个分离氨基酸残基可存在于一个或多个多肽链的分开的部分。当多肽链折叠成三维结构时，这些残基聚集在分子表面上以构成表位。相比之下，连续或线性表位由两个或更多个分立氨基酸残基组成，它们存在于多肽链的单一的线性区段中。作为一个示例性实例，“上下依赖的”CD3表位指的是所述表位的构象。这种定位于CD3ε链上的上下依赖的表位，仅在它嵌入到ε链的其余部分内并且通过ε链与CD3λ或δ链的异源二聚化来保持于正确位置，才能形成其正确构象。相比之下，上下独立的CD3表位可以是CD3ε的N-端1-27个氨基酸残基的多肽或其功能片段。通常，表位可以是自然线性的或可以是不连续表位。因此，本文所使用的术语“构象表位”是指由抗原氨基酸之间的空间关系形成的不连续表位，而不是一系列完整的氨基酸。术语“表位”还包括半抗原的表位，其称为小分子，可以经结合到更大物质如较大分子如蛋白质，通过显示一个或多个免疫识别表位用作抗原。

当抗体或抗体分子/片段识别蛋白质和/或大分子的复合混合物中的靶抗原时，抗体或抗体分子/片段被称为特异性结合至抗原。如果抗体交叉-竞争，抗体被称为“结合至相同表位”，使得在给定时间点只有一个抗体可以结合至表位，即一个抗体阻止别的抗体的结合或调控效应。

本文中的术语“特异性”或“特异性识别)”，也用作“指向”，意思是根据本发明，所述抗体分子能够与表位的至少两个、如至少三个或四个氨基酸特异性相互作用和/或结合，而基本上不结合至另一表位或抗原。这种结合可以以“锁-和-钥-原则”的特异性为例。特异性结合被认为是受抗体结合区的氨基酸序列上的特异性基序影响，抗体与表位或抗原由于它们的一级、二级或三级结构以及所述结构的二次修饰而彼此结合。表位/抗原-相互作用-位点与其特异性表位/抗原的特异性相互作用可以也形成所述位点与抗原的简单结合。此外，抗原-相互作用-位点与其特异性表位/抗原的特异性相互作用或可能导致信号启动，例如由于抗原构象改变或抗原的寡聚化的诱导。

通常，当结合亲和力高于10^-6M时，结合被认为是特异性的。特别是，结合亲和力为约10^-8M到10^-11M(K_D)，或为约10^-9M到10^-11M甚至更高时，结合被认为是特异性的。因此，本发明也包含具有第一结合位点和/或第二结合位点的亲和力在皮摩尔范围(K_D是10^-12M)的抗体分子。如果有必要，通过改变结合条件，可以减少结合位点的非特异性结合，且不显著影响特异性结合。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体结合的抗原是包含在细胞外基质中的抗原或是细胞表面抗原。在一些实施方案中，根据本发明的抗体结合的抗原是肿瘤相关抗原。可以理解，这种肿瘤相关抗原可以包含在细胞外基质中或是细胞表面抗原。

术语“细胞外基质”指的是多细胞动物(包括人)的组织区，发现于细胞间隙，即各组织细胞之间。细胞外基质主要是蛋白质如纤维状和非-纤维状胶原蛋白或弹性蛋白、糖蛋白比如层粘连蛋白或纤连蛋白、蛋白聚糖比如硫酸软骨素或硫酸角质素和多糖比如透明质酸的网络。细胞外基质尤其作用于彼此分离不同组织或调节细胞间通讯。在一些实施方案中，肿瘤相关抗原可以在肿瘤的细胞外基质处部分或完全表达。

本文使用的术语“细胞表面抗原”指的是显示在细胞表面上的分子。通常这种分子位于细胞的质膜中或上，使得这个分子的至少一部分保持可从四周接近，即从细胞外。各分子通常由氨基酸和/或糖部分组成，或包括氨基酸和/或糖部分。位于质膜中的细胞表面分子的示例性实例是一种跨膜蛋白，在它的三维构象中具有亲水性和疏水性区。一个或多个疏水区允许细胞表面分子嵌入或插入细胞的疏水质膜，而蛋白质亲水区在质膜两侧分别延伸到细胞质和细胞外空隙。定位于质膜上的细胞表面分子的实例包括但不限于具有携带棕榈酰基的翻译后修饰的半胱氨酸残基的蛋白质，在C-端半胱氨酸残基处修饰携带法尼基的蛋白质或在C-端修饰携带糖基磷脂酰肌醇(“GPI”)锚的蛋白质。这些基团允许蛋白质共价连接到质膜外表面，在这里它们保持可被细胞外分子如抗体识别。细胞表面抗原的实例包括细胞表面受体分子如G蛋白偶联受体(如β肾上腺素能受体)、酪氨酸激酶受体(如EGFR、EGFRvIII、Her2/neu、Her2/c-neu、PDGFRα、ILR-1、TNFR、CD30、CD33或GMCSFR)，具有相关酪氨酸激酶活性的膜受体(如IL6R或LIFR)或具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的膜受体(如TGFβR)，只列出几个实例。

包含在细胞外基质中的肿瘤相关抗原的实例包括但不限于蛋白多糖，如黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG4)或CD44v6，包括粘蛋白如Muc-1或膜结合酶如碳酸酐酶IX(CAIX)。这些抗原的实例是腱生蛋白和成纤维细胞激活蛋白(FAP)。

本文使用的术语“分离的抗体分子”指的是已经从其自然环境的组分中识别和分离和/或回收的抗体分子。其自然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并可能包括酶、激素和其他蛋白质性的或非蛋白质性的溶质。在一些实施方案中，根据Lowry方法测定抗体分子纯化至抗体的大于95重量％，如大于99重量％。在一些实施方案中，使用纺杯测序仪，抗体分子被纯化至足以获得至少15个N-端残基或内部氨基酸序列的程度。在一些实施方案中，使用考马斯蓝或更优选的银染色方法通过SDS-PAGE在还原或非还原条件下判断，抗体被纯化至同质性。在一些实施方案中，分离的抗体分子可以存在于具有一个或多个抗体自然环境中不存在的组分的重组细胞内。通常通过至少一个纯化步骤准备分离的抗体。

本文使用的术语“V_H”和“V_L”分别指免疫球蛋白的重链可变结构域和轻链可变结构域。免疫球蛋白轻或重链可变区由三个高变区间断的“框架”区组成。因此，术语“高变区”指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。在免疫球蛋白的可变区中存在三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。因此，适当地，本文使用的“CDR”指的是所有三个重链CDR(CDRH1、DRH2和CDRH3)，或所有三个轻链CDR(CDRL1、CDRL2和CDRL3)或所有重链和轻链CDR。三个CDR形成轻链可变区的结合特点，三个CDR形成重链可变区的结合特点。CDR决定免疫球蛋白分子的抗原特异性并且被包括支架或框架区的氨基酸序列分离。确切定义上CDR边界和长度从属于不同的分类和编号系统。抗体的结构和蛋白质折叠可意味着其他残基被认为是抗原结合区的一部分并且也被技术人员这么理解。CDR提供大部分用于免疫球蛋白结合至抗原或表位的接触残基。

CDR3通常是抗原-结合位点内的分子多样性的最大来源。例如，H3可以短至两个氨基酸残基或大于26个氨基酸。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是本领域熟知的。对于抗体结构的的综述，参见Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,eds.Harlow等人,1988。本领域技术人员将认识到每个亚基结构，例如CH、VH、CL、VL、CDR、FR结构，包括活性片段，例如结合到抗原的VH、VL或CDR亚基的一部分，即抗原-结合片段，或如结合和/或激活如Fc受体和/或补体的CH亚基的一部分。CDR通常指Kabat CDR，如Sequences of Proteins of immunologicalInterest,US Department of Health and Human Services(1991),eds.Kabat等人所述。抗原结合位点的另一个表征标准是如Chothia描述的高变环。参见如，Chothia等人(1992；J.MoI.Biol.227:799-817；和Tomlinson等人(1995)EMBOJ.14:4628-4638)。还有另一个标准是由Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的AbM定义。通常参见例如Protein Sequence and Structure Analysis ofAntibody Variable Domains.In:Antibody Engineering Lab Manual(Ed.:Duebel,S.and Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg)。关于Kabat CDR描述实施方案或可以使用关于Chothia超变环或AbM-定义环类似的描述关系实现。

“框架区”或“FR”残基是那些可变结构域残基而不是高变区。不同的轻链或重链框架区的序列在物种内相对保守。因此，“人框架区”是与天然存在的人免疫球蛋白的框架区大体相同的(约85％或更多，通常90-95％或更多)的框架区。抗体的框架区，作为轻链和重链构成的组合框架区，用于定位和比对CDR's。CDR's主要是负责结合至抗原表位。

术语“Fab”、“Fab结构域”、“Fab部分”或“Fab片段”被理解为定义包含V_H、C_H1、V_L和C_L免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指游离区，或者根据本发明的抗体分子中的这个区，以及全长免疫球蛋白或免疫球蛋白片段中的这个区。Fab区通常包含抗体的整条轻链。Fab区可以用来限定免疫球蛋白分子的“臂”。它包含该Ig的表位-结合部分。天然存在的免疫球蛋白Fab区可以通过木瓜水解酶消化作为蛋白水解片段获得。“F(ab')₂部分”是胃蛋白酶消化的免疫球蛋白的蛋白水解片段。“Fab部分”是由于F(ab')₂部分二硫键还原的产物。本文使用的术语“Fab”、“Fab区”、“Fab部分”或“Fab片段”可进一步包含限定抗体臂C-端的铰链区(参见上述)。这个铰链区对应于在全长免疫球蛋白内的C_H1结构域C-端发现的铰链区，在该处抗体分子的臂可以用来限定Y。本领域使用铰链区这个术语，因为免疫球蛋白在这个区有某种柔性。

“Fv”或“Fv片段”仅由免疫球蛋白“单臂”的V_L和V_H结构域组成。因此，“Fv”是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。“双链”Fv片段由一个重链和一个轻链可变区紧密非共价结合的二聚体组成。单链Fv类别(scFv)包含免疫球蛋白的V_H和V_L结构域，这些结构域存在于单个多肽链中，该其中，它们通过柔性肽段彼此共价连接。通常，scFv片段中，轻链和重链可变结构域以二聚体结构结合，类似于双链Fv类别。单链Fv片段中，可以使得轻链可变结构域排列在单多肽链的N-端，接着为连接序列和排列在多肽链的C-端的重链可变结构域，反之亦然，即重链可变结构域排列在N-端，轻链可变结构域排列在C-端，连接肽排列在之间。连接肽可以是本领域已知的任何柔性连接序列，例如由甘氨酸和丝氨酸残基形成。还可以通过向保守框架区中引入二硫键来另外稳定V_H和V_L结构域之间的结构域关联(参见Reiter等人.Stabilization of the Fv fragments in recombinant immunotoxins bydisulfide bonds engineered into conserved framework regions,Biochemistry1994,33,6551-5459)。这种scFv片段也被称为二硫化物-稳定的scFv片段(ds-scFv)。

本文使用术语“Fc区”或“Fc片段”定义免疫球蛋白重链的C-端区域，包含天然-序列Fc区和变体Fc区。Fc部分介导抗体的效应子功能，例如补体系统和承受免疫效应细胞如NK细胞的Fc-受体的激活。在人IgG分子中，Fc区由木瓜蛋白酶切割Cys226的N-端生成。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，人IgG重链Fc区通常被定义为从位点Cys226或从Pro230的氨基酸残基伸展至其羧基端。Fc区的C端赖氨酸(残基447，根据EU编号系统)可能被去除，例如，在制备或纯化抗体分子期间，或通过编码抗体分子重链的核酸的重组工程化。因此，完整的抗体的组合物可包含所有K447残基去除的抗体群，没有K447残基去除的抗体群，和有或没有K447残基的抗体混合物的抗体群。用于本发明所述抗体的适合的天然-序列Fc区包括哺乳动物，例如人和小鼠IgG1、IgG2(IgG2A，IgG2B)、IgG3和IgG4。根据抗体分类，Fc区包含两个或三个恒定结构域。在免疫球蛋白是IgG的实施方案中，Fc区具有C_H2和C_H3结构域。

根据本发明的抗体分子具有两条链，一条是较短的链，在一些实施方案中可以是轻链，一条主链，在一些实施方案例中可以称为重链。抗体分子通常是这两条链的二聚体。基于本发明所述抗体分子所包含的结构域，抗体分子可以具有Fab片段，其通常包含铰链区、C_H2结构域和单链Fv片段。在一些实施方案中，抗体分子也具有C_H3结构域，通常排列在C_H2结构域的C-端。在一些实施方案中，本发明所述抗体的结构域的排列对应于免疫球蛋白中结构域的排列。作为两个实例，本发明所述抗体分子的较短链可以具有在较短链N-端的VL结构域和在较短链C-端的CL结构域，且主链可以具有在其N-端的VH结构域和在其C-端的CH1结构域。在一些实施方案中，较短链可以具有在较短链N-端的VL结构域和在较短链C-端的CH1结构域。在一些实施方案中，较短链可以具有在较短链N-端的VH结构域和在较短链C-端的CH1结构域。在一些实施方案中，较短链可以具有在较短链N-端的VH结构域和在较短链C-端的CL结构域。在一些实施方案中，主链可以具有在其N-端的VL结构域和在其C-端的CH1结构域。在一些实施方案中，主链可以具有在其N-端的VH结构域和在其C-端的CL结构域。在一些实施方案中，主链可以具有在其N-端的VL结构域和在其C-端的CL结构域。

抗体的较短链可以与抗体的主链通过一个或多个、包含两个或三个二硫键连接。各自的二硫键可限定较小链的C-端半胱氨酸残基和抗体主链的铰链区内的半胱氨酸残基之间的桥连。

在根据本发明的抗体分子中，主链的C-端区域可由单链Fv片段限定。在一些实施方案中，主链的C-端可由scFv片段的VH结构域限定。在一些实施方案中，主链的C-端可由scFv片段的VL结构域限定。因此，在一些实施方案中，scFv片段可以经由VH结构域、例如VH结构域的N-端偶联到主链的CH2结构域或CH3结构域(如果存在)。在一些实施方案中，scFv片段可以经由VL结构域、例如VL结构域的N-端偶联到主链的CH2结构域或CH3结构域(如果存在)。在一些实施方案中，抗体分子的CH2结构域或CH3结构域(如果存在)经由scFv片段的轻链可变结构域(VL结构域)连接至scFv片段。在一些实施方案中，CH2结构域经由scFv片段的重链可变结构域(VH结构域)连接至scFv片段。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子的Fab片段经由Fab片段的重链结构域连接至CH2结构域。因此，抗体的主链可以具有重链结构域例如CH1结构域(同上)，它与CH2结构域偶联。如上所述，相应的CH1结构域可以经由铰链区偶联到CH2结构域。在一些实施方案中，Fab片段相应的重链结构域可排列在抗体主链多肽链的N-端。在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子的Fab片段经由Fab片段的轻链结构域连接至CH2结构域。因此，抗体分子的主链可以具有轻链结构域如CL结构域，它与CH2结构域偶联。此外，相应的CL结构域可经由铰链区偶联到CH2结构域。在一些实施方案中，Fab片段相应的轻链结构域可排列在抗体分子主链多肽链的N-端。为防止二价实施方案中分子的二聚化(图1A-E和1N)，可以更换铰链区中提供链间二硫键的半胱氨酸残基。在四价实施方案中(图1F-M)，这些半胱氨酸残基是保护的。在这些实施方案中，抗体分子可以相应地用来定义个二价二聚体，如上所述的二聚体抗体分子，每条主链和每条较短链可以单独选择。例如，第一条较短链可以具有在N-端的VH结构域和在C-端的CL结构域。第一条主链可以具有在N-端的VL结构域和在其C-端的CH1结构域。此外，第一条主链可以具有CH2结构域和CH3结构域，以及C端scFv片段。scFv片段可经由VL结构域偶联到CH3结构域。第二条较短链可以具有在N-端的VH结构域和在C-端的CH1结构域。第二条主链可以具有在N-端的VL结构域和在其C-端的CL结构域。第二条主链也可以具有CH2和CH3结构域，以及C-端scFv片段。scFv片段可经由VL结构域偶联到CH3结构域。

相应四聚体抗体分子可以由两个二聚体抗体分子组成，它们经由一个或多个、如两个二硫键彼此连接。这种二硫键可限定义第一个二聚体抗体分子主链的半胱氨酸残基和第二个二聚体抗体分子主链的半胱氨酸残基之间桥连。通常，相应的半胱氨酸残基定位在每个二聚体抗体分子对应主链的铰链区内。在一些实施方案中，一条或两条主链，即四聚体抗体分子的第一个二聚体分子的主链和第二个二聚体分子的主链，在各自铰链区之一的序列位点226和/或序列位点229处具有半胱氨酸残基，根据Kabat编号[EU-索引]。在一个实施方案中，第一条主链铰链区和第二条主链铰链区之间的二硫键是由铰链结构域之一的序列位点226的半胱氨酸残基和序列位点229中的至少一个限定的，根据Kabat编号[EU-索引]。在一些实施方案中，一个四聚体抗体分子可以具有一个或多个连接二聚体抗体分子两条主链的铰链区的二硫键和连接二聚体抗体分子两条主链的铰链区的二硫键。在一些实施方案中，根据本发明的四聚体抗体分子的两个二聚体抗体分子可通过二硫键连接，这个二硫键由包含在第一个二聚体抗体分子主链的CH2结构域中的半胱氨酸残基和包含在第二个二聚体抗体分子主链的CH2结构域中的半胱氨酸残基限定。

作为另一实例，第一条较短链可以具有在N-端的VL结构域和在C-端的CH1结构域。第一条主链可以具有在N-端的VH结构域和在其C-端连接的CL结构域。此外，第一条主链可以具有CH2和CH3结构域，以及C-端scFv片段。scFv片段可经由VH结构域偶联到CH3结构域。第二条较短链可以具有在N-端的VL结构域和在C-端的CL结构域。第二条主链可以具有在N-端的VH结构域和在其C-端的CH1结构域。第二条主链可以还具有CH2和CH3结构域，以及C-端scFv片段。scFv片段可经由VH结构域偶联到CH3结构域。

“双特异性”或“双功能”抗体分子是具有两个不同的表位/抗原结合位点的抗体分子，因此具有对于两个不同靶表位的结合特异性。这两种表位可以是相同抗原或不同抗原的表位。与其相比，“二价抗体”可以具有相同抗原特异性的结合位点。

“双特异性抗体”可以是这样的抗体分子，它在两个或更多个结合臂之一(由第一对重链和轻链或主链和较短/较小链限定义(同上))上结合一个抗原或表位，并在第二臂(由第二对重链和轻链或主链和较小链限定)上结合不同的抗原或表位。这种双特异性抗体的实施方案具有两个特有的抗原结合臂，都有特异性和CDR序列。通常，双特异性抗体对每一个其结合的抗原是单价的。双特异性抗体是杂交抗体分子，其可以具有由第一个轻链可变区和第一个重链可变区限定的第一结合区和由第二个轻链可变区和第二个重链可变区限定的第二结合区。在一些实施方案中，这些结合区之一可由重/轻链对限定。如上所述，本发明上下文中，双特异性抗体分子具有第一结合位点，其由主链和较小链的可变区限定义，和第二不同的结合位点，其由包含于抗体分子主链中的scFv片段的可变区限定。

制备双特异性抗体分子的方法是本领域已知的，例如两种不同单克隆抗体的化学结合，或例如两个抗体片段如两个Fab片段的化学结合。另外，双特异性抗体分子重组地制备。通常，双特异性抗体的重组制备基于两个免疫球蛋白H链-L链对的共表达，其中两条H链具有不同的结合特异性。由于H链和L链的随机分配，产生十个不同抗体结构的可能混合物，其中只有一个具有所需结合特异性。替代性方法涉及将具有所需结合特异性的可变结构域融合到重链恒定区，其包含至少一部分铰链区、CH2和CH3结构域。在一个实施方案中，包含轻链结合必要位点的CH1区存在于至少一个融合蛋白中。编码这些融合蛋白的DNA和L链(如果需要)被插入单独表达载体中，然后共转染进入合适的宿主生物体。但可能是插入两条或全部三条链的编码序列进入一个表达载体中。

本发明所述双特异性抗体分子可以作为关于每个靶的单克隆抗体(MAb)。在一些实施方案中，抗体是嵌合的、人源化或全人的。

例如，“双特异性抗体”可以是全长免疫球蛋白或具有免疫球蛋白类似结合特性的构建体，通常理解为具有两个结合臂，尤其是由一对HC/LC限定的臂，所述臂可以结合两个不同的抗原或其各自的表位(参见PCT公开WO02/02773)。因此，双特异性结合蛋白具有两个有相同特异性的相同的抗原结合臂，和相同的CDR序列，且对于其结合的每个抗原是二价的。

T细胞受体(TCR)是存在于T细胞即T淋巴细胞表面上的特殊受体。体内T细胞受体以几个蛋白质的复合物存在。T细胞受体通常具有两个单独的肽链，通常是T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)链，在一些T细胞上是T细胞受体γ和δ(TCRγ和TCRδ)。复合物中其他蛋白质是CD3蛋白质：CD3εγ和CD3εδ异源二聚体，最重要的是，有六个ITAM基序的CD3ζ同源二聚体。CD3ζ上的ITAM基序可以被Lck磷酸化，反过来募集ZAP-70。Lck和/或ZAP-70也可以在许多其他分子上磷酸化酪氨酸，尤其是CD28、LAT和SLP-76，这允许围绕这些蛋白质的信号传导复合物聚集。

根据本发明的抗体分子包含含有VL结构域和CL结构域的轻链。抗体分子还包含含有VH结构域、CH1结构域和铰链区的主链。VH结构域排列在主链分子的N-端，且VH结构域连接至CH1结构域，或直接连接，或经由通常为20个或更少、包括10个或更少的氨基酸残基的连接肽偶联。铰链区与CH1结构域的C-端连接。因此，由VL、CL、VH和CH1结构域以及铰链区的相邻排列限定的抗体分子的一部分可以用来限定Fab片段，因此也如本文提到的。由于在天然存在的免疫球蛋白中VH和VL结构域的配对一起限定了单一抗原结合位点。因此，本发明抗体分子的Fab片段包括用于第一抗原的结合位点。在各自的抗体分子中，轻链通过二硫键连接至主链。在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子是二聚体，其包含如上所述的两条主链和两条轻链(也参见下文)。

在一些实施方案中，根据本发明的重组双特异性抗体分子的序列可以与IgG1的序列进行比较，原因是根据本发明的抗体分子的序列与IgG1的序列具有一定程度的相似性，如下进一步说明。与根据Kabat等人(1991,Sequencesof Proteins of Immunological Interest,5th Ed.,United States Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda)的IgG1氨基酸序列比较，在一些实施方案中根据本发明的抗体分子的主链包含在氨基酸位点1至117的V_H结构域，在位点118至215的C_H1结构域，在位点216至230的铰链区和在位点231至340的C_H2结构域。

根据本发明的抗体主链的氨基酸序列，由V_H结构域、C_H1结构域和铰链区组成的Fab片段在这些实施方案中通常跨越氨基酸1至230。在这个Fab片段内，V_H结构域通常由氨基酸1至118限定，C_H1结构域由氨基酸119至216限定，且铰链区由氨基酸217至231限定，根据Kabat编号。具有序列SEQ ID NO:6的抗体链可以用作相应实施方案的实例。在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子在主链位点342 et sqq处具有由V_H结构域和V_L结构域组成的嵌合序列。在一些实施方案中，排列V_L结构域以限定这种嵌合序列的C-端结构域。在一些实施方案中，与根据Kabat等人的IgG1氨基酸序列相比，根据本发明的抗体分子具有在位点342至447的C_H3结构域，随后是由V_H结构域和C-端V_L结构域组成的嵌合序列。在其中C_H3结构域包含在根据本发明的抗体中的实施方案中，这个C_H3结构域由根据抗体分子主链的氨基酸序列的氨基酸342至448限定。由V_H结构域和V_L结构域组成的嵌合序列，其在一些实施方案中可以在C-端(同上)，在这些实施方案中位于抗体分子主链的氨基酸序列位点449 et sqq。

根据本发明的双特异性抗体分子可以具有任何所需特异性的两个结合位点。在一些实施方案中，一个结合位点能够结合肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，包含在Fab片段中的结合位点是对于肿瘤相关表面抗原特异性的结合位点。在一些实施方案中，包含在单链Fv片段中的结合位点是对于肿瘤相关抗原如肿瘤相关表面抗原特异性的结合位点。

本文使用的术语“肿瘤相关表面抗原”指这样的抗原，它在或可以呈现在位于肿瘤细胞上或内部的表面上。这些抗原可以呈现在具有细胞外部分的细胞表面上，所述部分通常与分子的跨膜和胞质部分结合。在一些实施方案中，这些抗原可以只由肿瘤细胞呈现，而不由正常的即非-肿瘤细胞呈现。肿瘤抗原可以仅仅在肿瘤细胞上表达或可代表与非-肿瘤细胞相比的肿瘤特异性突变。在这样一个实施方案中，相应的抗原可以被称为肿瘤-特异性抗原。一些抗原由肿瘤细胞和非-肿瘤细胞两者呈现，这可以被称为肿瘤-相关抗原。当与非-肿瘤细胞相比时，这些肿瘤-相关抗原可以在肿瘤细胞上过表达，或者由于与非-肿瘤组织相比，肿瘤组织的结构较不紧密，所述抗原在肿瘤细胞中易于抗体结合。在一些实施方案中，肿瘤相关表面抗原位于肿瘤的维管系统上。

肿瘤相关表面抗原的示例性实例为CD10、CD19、CD20、CD22、CD33、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、表皮生长因子受体(EGFR)、Her2neu、Her3、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白(Tenascin)、卷曲蛋白1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4、CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8和Tie2。进一步的实例可包括A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐水解酶IX(MN/CA IX)、CD21、CD25、CD30、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、de2-7 EGFR、EGFRvIII、EpCAM、Ep-CAM、叶酸-结合蛋白、G250、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)和TAG-72。表达在肿瘤细胞外基质上的抗原的实例是腱生蛋白和成纤维细胞活化蛋白(FAP)。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子的结合位点之一能够结合T-细胞特异性受体分子和/或自然杀伤细胞(NK细胞)特异性受体分子。T-细胞特异性受体是所谓的“T-细胞受体”(TCR)，它允许T细胞结合至由另一个称为抗原呈递细胞或APC的细胞呈递的表位/抗原，如果存在另外的信号，它允许T细胞被所述表位/抗原激活和响应所述表位/抗原。T细胞受体已知类似天然存在的免疫球蛋白的Fab片段。它通常是单价，包含α-和β-链，在一些实施方案中，它包含γ-链和δ-链(同上)。因此。在一些实施方案中，TCR是TCR(α/β)，而在一些实施方案中它是TCR(γ/δ)。T细胞受体形成具有CD3 T-细胞共受体的复合物。CD3是蛋白质复合物，由四条不同链组成。在哺乳动物中，该复合物包含CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链。这些链与被称为T细胞受体(TCR)的分子和ζ-链结合以生成T淋巴细胞中的激活信号。因此，在一些实施方案中，T-细胞特异性受体是CD3 T-细胞共受体。在一些实施方案中，T细胞特异性受体是CD28，这是也在T细胞上表达的蛋白质。CD28可提供共刺激信号，其对T细胞激活是必需的。CD28在T-细胞增殖和存活、细胞因子产生和2型辅助型T细胞的发育中起重要作用。T-细胞特异性受体又一个实例是CD134，也称为Ox40。激活后24至72小时之后，CD134/OX40表达，且可以用于定义第二共刺激分子。T细胞受体的另一个实例是4-1BB，其能够在抗原呈递细胞(APC)上结合至4-1BB-配体，由此产生T细胞的共刺激信号。主要见于T-细胞上的受体的另一个实例是CD5，其还被发现以低水平存在于B细胞上。修饰T细胞功能的受体的进一步实例是CD95，也称为Fas受体，其通过在其他细胞表面上表达的Fas-配体介导细胞凋亡信号传导。CD95已被报道在静止T淋巴细胞上，调节TCR/CD3-驱动的信号传导通路。

NK细胞特异性受体分子的实例是CD16，一个低亲和力的Fc受体和NKG2D。存在于T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面上的受体分子的实例是CD2和CD2-亚家族的更多成员。CD2能够作为T细胞和NK细胞上的共刺激分子起作用。

在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，第二结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合以下之一：A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐水化酶IX(MN/CA IX)、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、CDCP1、Her3、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、CLEC14、Derlin1、表皮生长因子受体(EGFR)、de2-7 EGFR、EGFRvIII、EpCAM、内皮糖蛋白、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、叶酸-结合蛋白质、G250、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、卷曲蛋白1-10、Her2/neu、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、腱生蛋白、Tem1-8、Tie2和VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4 CD309)、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)，第二个结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子。在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，第二结合位点结合CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中之一。

在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，第二个结合位点结合肿瘤相关表面抗原。在一些实施方案中，抗体的第一结合位点结合T细胞特异性受体分子和/或自然杀伤(NK)细胞特异性受体分子，第二个结合位点结合以下之一：A33、CAMPATH-1(CDw52)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐水化酶IX(MN/CAIX)、CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CD133、CDCP1、Her3、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、CLEC14、Derlin1、表皮生长因子受体(EGFR)、de2-7 EGFR、EGFRvIII、EpCAM、内皮糖蛋白、Ep-CAM、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、叶酸-结合蛋白质、G250、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、卷曲蛋白1-10、Her2/neu、HLA-DR、IGFR、IL-2受体、IL3R、MCSP(黑素瘤相关细胞表面硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺特异性抗原(PSA)、TAG-72、腱生蛋白、Tem1-8、Tie2和VEGFR。在一些实施方案中，抗体分子的第一结合位点结合CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中之一，第二个结合位点结合肿瘤相关表面抗原。

术语“糖基化”意思是低聚糖(含有连接在一起的两个或更多个单糖、例如连接在一起的2个到约12个单糖的碳水化合物)附着形成糖蛋白。低聚糖侧链通常通过N-或O-连接连接到糖蛋白的骨架上。本文公开的抗体的低聚糖通常是连接到Fc区的CH2结构域，作为N-连接的低聚糖。“N-连接的糖基化”是指碳水化合物类部分连接到糖蛋白链的天冬酰胺残基上。例如，技术人员可以识别鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3以及人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgD的CH2结构域中的每一个在残基297处有用于N-连接的糖基化的单一位点。

根据本发明的抗体分子中包括的结构域或区的序列可以是任意所需物种的序列。然而在一些实施例中，根据抗体分子的后续用途可以可取地引入改变以阻止抗体引起的不需要的副作用。完整非-人抗体用于治疗人的疾病或障碍具有目前已被认识到的免疫原性的潜在问题，这意味着患者的免疫系统可识别非人完整抗体作为异己分子并且形成中和反应。当非人抗体对人患者多次施用时，这特别明显。多年以来已开发了各种技术以克服这些问题，并且通常涉及在完整抗体中减少非人氨基酸序列的成分，同时保留从接种动物如小鼠、大鼠或兔中获得非人抗体的相对容易性。大致有两种方法已经用于实现这个。第一种是嵌合抗体，其通常具有融合至人恒定区的非人(例如啮齿类动物如小鼠)可变结构域。因为抗体的抗原-结合位点由可变结构域内的残基限定，嵌合抗体保持其抗原的结合亲和力，但获得人恒定区的效应子功能，因此能够执行例如上述的效应子功能。嵌合抗体通常用重组DNA的方法制备。分离编码抗体的DNA(例如cDNA)，用常规程序测序(例如通过利用能够特异性结合编码本发明抗体的H链和L链基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞用作这种DNA的典型来源。一旦分离，DNA被置于表达载体中，然后转染进入宿主细胞如大肠杆菌、COS细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中以获得抗体的合成，所述细胞本来不产生免疫球蛋白。DNA可通过将人L和H链的编码序列置换相应的非人例如鼠H和L恒定区(参见如Morrison；PNAS[1984]81,6851)而被修饰。

第二种方法包含人源化抗体的制备，所述人源化抗体中抗体的非人成分通过人源化可变结构域而被减少。两种人源化技术已经得到普及。第一种是通过CDR移植人源化。CDR限定环(同上)，抗体的抗原-结合特异性主要由拓扑和其CDR表面的化学特性限定。这些特性反过来又由个别CDR的构象、CDR相对配置、和包含CDR的残基侧链的性质和配置确定。免疫原性的大的降低可以通过仅移植非人CDR例如鼠、抗体(“供体”抗体)到人框架(“受体框架”)和恒定区(参见Jones等人(1986)Nature 321,522-525和Verhoeyen M等人(1988)Science 239,1534-1536)获得。然而，CDR移植本身可能不会导致抗原-结合特性的完整保留且经常发现如果要恢复显著的抗原-结合亲和力，供体抗体的一些框架残基(有时称为“回复突变”)需要保留在人源化分子中(参见Queen C等人(1989)PNAS 86,10,029-10,033,Co,M等人(1991)Nature 351,501-502)。在这种情况下，从数据库中选择表现出最大的与非人供体抗体序列同源性的人可变结构域以提供人框架(FR)。人FR的选择可以从人共有或人个体抗体中进行。当来自供体抗体的必要重要残基被置换成人受体框架以保留CDR构象时，抗体的计算机建模可用于帮助识别这些结构上重要的残基。参见如WO99/48523。

另外，人源化可能通过“镶面”的方法获得。独特的人和小鼠免疫球蛋白重链和轻链可变结构域的统计分析显示，裸露残基的精确模式在人和鼠的抗体中是不同的，且大多数个别表面位点具有对于少数不同残基的强烈趋向(参见Padlan E.A.等人；(1991)Mol.Immunol.28,489-498和Pedersen J.T.等人(1994)J.Mol.Biol.235；959-973)。因此可以通过取代在其框架区上不同于那些通常发现在人抗体中的裸露残基，减少非人Fv的免疫原性。因为蛋白质抗原性可能与表面可接近性有关，表面残基的取代可能足以使小鼠可变结构域对于人免疫系统是“看不见的”(同样参见Mark G.E.等人(1994)，Handbook of Experimental Pharmacology vol.113:The pharmacology ofmonoclonal antibody,Springer-Verlag,pp 105-134)。人源化的这个过程被称为“镶面”，因为只有抗体的表面发生改变，支持残基保持原状。

本发明所述抗体分子可使用任何已知的和已建立的表达系统和重组细胞培养技术产生，例如，通过在细菌宿主(原核系统)或真核系统如酵母、真菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达。本发明所述抗体分子可以产生于转基因生物体如山羊、植物或XENOMOUSE转基因小鼠中，所述小鼠是有人免疫球蛋白基因座的大片段且缺乏小鼠抗体产生的基因工程小鼠品系。抗体也可通过化学合成产生。

关于本发明所述抗体分子的重组生产，通常分离编码抗体的多核苷酸，将其插入到可复制的载体如用于进一步克隆(扩增)或表达的质粒中。一个合适的表达系统的示例性实例是谷氨酸合成酶系统(如Lonza Biologics所售)，与宿主细胞如CHO或NS0。容易使用常规程序分离编码抗体的多核苷酸和将其测序。可以使用的载体包括质粒、病毒、噬菌体、转座子、微型染色体，其中质粒是典型实施例。通常这些载体还包括与轻链和/或重链多核苷酸可操作地连接以促进表达的信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。编码轻链和重链的多核苷酸可以插入到单独的载体中，然后转染进入同一宿主细胞，或如果需要，重链和轻链可以插入相同的载体以转染进入宿主细胞。例如，在双顺反子操纵子的控制下，两条链都可以排列和表达以产生功能性和正确折叠的抗体分子，如Skerra,A.(1994)Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of amurine antibody fragment in Escherichia coli,Gene 151,131-135或Skerra,A.(1994)A general vector,pASK84,for cloning,bacterial production,andsingle-step purification of antibody Fab fragments,Gene 141,79-8中所述。因此，根据本发明的一方面，提供了构建编码本发明抗体的轻链和/或重链或其抗原结合片段的载体的方法，这种方法包括将编码本发明所述抗体分子轻链和/或重链的多核苷酸插入载体中。

当使用重组技术时，抗体分子可以产生于细胞内、细胞周质间隙或直接分泌到介质中(同样参见Skerra 1994，同上)。如果抗体产生于细胞内，作为第一步，微粒碎片、宿主细胞或溶解片段都会被去除，例如通过离心或超滤。Carter等人Bio/Technology 10:163-167(1992)描述一个用于分离抗体的过程，该抗体分泌到大肠杆菌的细胞周质空间。抗体还可以产生于任何氧化环境。这种氧化环境中可由革兰氏阴性细菌如大肠杆菌的周质、革兰氏阳性细菌细胞外环境或真核细胞内质网内腔(包括动物细胞如昆虫或哺乳动物细胞)中提供，并且通常倾向于形成结构二硫键。然而，本发明所述抗体分子也可以产生于宿主细胞如大肠杆菌的胞质。在这种情况下，多肽可以以可溶和折叠状态直接获得或以包涵体形式回收，然后体外复性。另一选择是使用具有氧化细胞内环境的特异宿主菌株，这因此可允许在细胞溶质中形成二硫键(Venturi M,Seifert C,Hunte C.(2002)“High level production of functionalantibody Fab fragments in an oxidizing bacterial cytoplasm.”J.Mol.Biol.315,1-8)。

细胞产生的抗体分子可以使用任何常规纯化技术纯化，例如羟基磷灰石层析法、凝胶电泳、透析和亲和色谱法，亲和色谱法是一种优选纯化技术。抗体分子可以经由蛋白质/配体的亲和纯化而被纯化，这个蛋白质/配体特异性且可逆地结合恒定结构域如CH1或CL结构域。这种蛋白质的实例是免疫球蛋白-结合细菌蛋白质如蛋白质A、蛋白质G、蛋白质A/G或蛋白质L，其中L蛋白的结合限于包含κ轻链的抗体分子。另一种纯化具有κ-轻链的抗体的方法是使用珠偶联的抗κ抗体(KappaSelect)。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于物种和存在于抗体中的任何免疫球蛋白Fc结构域的的同型。蛋白质A可用于纯化抗体(Lindmark等人,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。推荐蛋白质G用于所有鼠同型和人γ3(Guss等人,EMBO J.5:15671575(1986))。用于本发明所述特定抗体分子的纯化方法的选择在本领域普通技术人员的知识范围内。

配备一条具有亲和标签的本发明抗体分子的链是可以的。亲和标签如或(Schmidt,T.G.M.等人(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标签、FLAG^TM-标签、His6-标签或HA-标签允许重组抗体分子容易检测和简单纯化。

关于核酸和多肽的术语“突变的”、“突变体”和“突变”分别指与天然核酸或多肽相比(即可以用来定义野生型的参照序列)，更换、缺失或插入一个或多个核苷酸或氨基酸。

据了解在这里术语“位点”当根据本发明使用时，意思是本文描述的氨基酸序列内的氨基酸位点。这个位点可以相对于类似天然序列例如天然存在的IgG结构域或链的序列指示。本文使用的术语“相应的”还包括不一定或不仅取决于前面的核苷酸或氨基酸的数量的位点。因此，可能被置换的根据本发明的给定氨基酸的位点可由于在抗体链中别处缺失或添加氨基酸而变。

因此，根据本发明在“相应位点”，可以被理解为氨基酸可以在指示的数字上有所不同，但仍可具有相似的相邻氨基酸。可被更换、缺失或添加的所述氨基酸也包含在术语“相应位点”中。为了确定给定氨基酸序列中的氨基酸残基是否符合对应天然存在的免疫球蛋白结构域或链的氨基酸序列的某个位点，技术人员可以使用本领域熟知的手段和方法，例如比对，人工地或通过使用计算机程序如BLAST2.0，其可以代表Basic Local Alignment SearchTool或ClustalW或任何其他适用于生成序列比对的合适程序。

在一些实施方案中，置换(或替换)是保守置换。保守置换通常是以下替换，其根据待突变的氨基酸列出，每个后面是一个或多个可以看做保守的替换：Ala→Gly、Ser、Val；Arg→Lys；Asn→Gln、His；Asp→Glu；Cys→Ser；Gln→Asn；Glu→Asp；Gly→Ala；His→Arg、Asn、Gln；Ile→Leu、Val；Leu→Ile、Val；Lys→Arg、Gln、Glu；Met→Leu、Tyr、Ile；Phe→Met、Leu、Tyr；Ser→Thr；Thr→Ser；Trp→Tyr；Tyr→Trp、Phe；Val→Ile、Leu。其他置换也是允许的，可以凭借经验确定或根据其他已知的保守或非保守置换。作为进一步定位，以下八组每个组含有通常可以被用来定义彼此保守置换的氨基酸：

1)丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)；

2)天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)；

3)天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)；

4)精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)；

5)异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、缬氨酸(Val)；

6)苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)；

7)丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)；和

8)半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)

如果这些置换导致生物活性的改变，继而可引入更多如下实质改变，或如下关于氨基酸类别进一步描述的，并就所需特性筛选产物。这些更实质改变的实例是：Ala→Leu、Ile；Arg→Gln；Asn→Asp、Lys、Arg、His；Asp→Asn；Cys→Ala；Gln→Glu；Glu→Gln；His→Lys；Ile→Met、Ala、Phe；Leu→Ala、Met、正亮氨酸；Lys→Asn；Met→Phe；Phe→Val、Ile、Ala；Trp→Phe；Tyr→Thr、Ser；Val→Met、Phe、Ala。

在一些实施方案中，根据本发明的抗体分子包含一个或多个氨基酸残基，包括二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七或十八个氨基酸残基，其被突变以防止经由半胱氨酸残基的二聚化或调节Fc-功能。在一些实施方案中，突变能够介导与Fc受体结合的CH2结构域和/或铰链区的一个或多个氨基酸残基。如果存在，能够介导与Fc受体结合的一个或多个氨基酸残基可以是能够激活抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体-介导的细胞毒性(CDC)的氨基酸残基。在一些实施方案中，通常将序列与免疫球蛋白如IgG中相应天然存在的结构域的序列比较时，能够介导与Fc受体结合的相应的氨基酸残基被另一个氨基酸置换。在一些实施方案中，通常相对于免疫球蛋白域如IgG中相应天然存在的结构域的序列，能够介导与Fc受体结合的这个氨基酸残基是缺失的。然而，在本发明的其他实施方案中，关于由Fab片段、单链Fv片段和免疫球蛋白CH2结构域组成的双特异性抗体分子，在人γ1的CH2结构域中引入例如优化抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的突变，是在本发明的范围内。这种突变在如国际专利申请WO2011/076922和WO2011/089211中有描述。

在一些实施方案中，一个或多个突变的如置换或缺失的氨基酸残基是位于以下位点之一处的氨基酸：226、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330。并且，使用的氨基酸序列编码也符合根据Kabat编号[EU-索引]的序列位点。相应氨基酸的缺失可以是例如氨基酸228(通常在IgG中是脯氨酸)的缺失，氨基酸229(通常在IgG中是半胱氨酸)的缺失，氨基酸230(通常在IgG中是脯氨酸)的缺失，氨基酸231(通常在IgG中是丙氨酸)的缺失，氨基酸232(通常在IgG中是脯氨酸)的缺失，氨基酸233(通常在IgG中是谷氨酸)的缺失，氨基酸234(通常在IgG中是亮氨酸)的缺失，氨基酸235(通常在IgG中是亮氨酸)的缺失，氨基酸236(通常在IgG中是甘氨酸)的缺失，氨基酸237(通常在IgG中是甘氨酸)的缺失，氨基酸238(通常在IgG中是脯氨酸)的缺失，和氨基酸265(通常在IgG中是天冬氨酸)的缺失。相应的氨基酸置换可以是例如氨基酸226(通常在IgG中是半胱氨酸)的置换，氨基酸228(通常在IgG中是脯氨酸)的置换，氨基酸229(通常在IgG中是半胱氨酸)的置换，氨基酸230(通常在IgG中是脯氨酸)的置换，氨基酸231(通常在IgG中是丙氨酸)的置换，氨基酸232(通常在IgG中是脯氨酸)的置换，氨基酸233(通常在IgG中是谷氨酸)的置换，氨基酸234(通常在IgG中是亮氨酸)的置换，氨基酸235(通常在IgG中是亮氨酸)的置换，氨基酸265(通常在IgG中是天冬氨酸)的置换，氨基酸297(通常在IgG中是天冬酰胺)的置换，氨基酸327(通常在IgG中是丙氨酸)的置换，和氨基酸330(通常在IgG中是丙氨酸)的置换。相应的置换可以是下述之一：置换Cys226→Ser，置换Cys229→Ser，置换Glu233→Pro，置换Leu234→Val，置换Leu235→Ala，置换Asp265→Gly，置换Asn297→Gln，置换Ala327→Gln，置换Ala327→Gly和置换Ala330→Ser。如上所述可知，在一些实施方案中，铰链区中位点226和229处半胱氨酸残基中的一个或两个被置换成另一种氨基酸，例如置换成丝氨酸残基。从而可以防止与另一主链的二硫键的形成。此外且如下文解释的，能够介导与Fc-受体结合的CH2结构域中选择的缺失和/或置换(突变)氨基酸残基可引起本发明抗体分子在抗体-依赖性的细胞-介导的细胞毒性和补体的固定方面活性减少或无活性。

抗体的另一种氨基酸变体改变了抗体分子的原始糖基化模式(如果有的话)。改变意味着缺失抗体中存在的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加抗体中不存在的一个或多个糖基化位点。抗体的糖基化通常是N-连接的或O-连接的。N-连接的指的是碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外任何氨基酸)是用于将碳水化合物部分酶促连接到天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列中任一个的存在产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化指的是将糖N-乙酰基半乳糖胺(N-aceylgalactosamine)、半乳糖、或木糖之一连接到羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸也可以使用。通过改变氨基酸序列使得它包含一个或多个上述三肽序列(对于N-连接的糖基化位点)，方便地完成糖基化位点添加到抗体。也可通过添加或置换一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基到原始抗体序列中进行改变(对于O-连接的糖基化位点)。

本发明文中所述一些实施方案中，本发明抗体分子的主链代表免疫球蛋白的Fc区的部分对于与Fc受体结合，通常是惰性的，或者至少基本上具有低影响。如所述，这通过缺失和/或置换(变异)CH2结构域中能够介导与Fc-受体结合的选定的氨基酸残基中至少一个而实现。这些分子在本文也称为“Fc-衰减的”抗体分子或“Fc^ko”抗体分子。根据本发明的抗体链的可以用来代表Fc片段的部分的部分，即CH2结构域，和CH3结构域(当存在时)因此可限定不提供特定生物功能例如效应子功能的“支架”。然而，本发明发现，与已知的抗体分子相比，这个支架可以在本发明所述抗体分子的纯化、生产效率和/或稳定性方面提供显著优势(参见实施例)。

在一些实施方案中，这个Fc-相应部分与给定Fc受体的识别和相应的结合是天然存在的免疫球蛋白的Fc区的约2倍、约5倍、约8倍、约10倍、约12倍、约15倍、约20倍低。在一些实施方案中，这个Fc-相应部分完全没有结合Fc受体的能力。本领域技术人员使用标准技术，如表面等离子体共振，例如使用Biacore^TM测量，可以很容易测定抗体与Fc受体的结合，包括测定离解常数。可同样使用任何其他测量生物分子结合的方法，例如可以依靠分光、光化学、光度或放射的方法。相应检测方法的实例分别是荧光相关光谱法、光化学交联和感光性或放射性标记的使用。这些方法中的一些可包含另外的分离技术如电泳或HPLC。

当需要时，可进行如上所述的氨基酸残基的置换或缺失以达到这种效果。例如，合适的突变可以从Armour等人(Eur.J.Immunol.[1999]29,2613-2624)获取。抗体链序列更合适的突变位点可以从就FcgRIII和人IgG1Fc片段之间的复合物公布的晶体结构数据(Sondermann等人,Nature[2000]406,267-273)中获取。除了测量如上所述结合亲和力以便评价“Fc衰减”水平或结合亲和力丧失，也可以功能性评价估介导与Fc-受体结合的能力(能力的缺乏)。在结合CD3作为一个靶的抗体分子的情况下，例如可以通过细胞上此CD3结合抗体分子的促有丝分裂来评估结合。有丝分裂通过CD3抗体在辅助细胞如单核细胞上与Fc-受体结合介导。如果本发明有一个CD3结合位点的抗体分子没有显示任何促有丝分裂的效应，而具有功能性Fc部分的亲代单克隆抗-CD3抗体诱导强大的T细胞有丝分裂，则很明显，由于缺乏有丝分裂，本发明抗体分子缺乏Fc结合的能力，因此可以视为“Fc敲除的”分子。评价抗-CD3介导的有丝分裂的方法的示例性实例已经由Davis,Vida&Lipsky(J.Immunol(1986)137,3758)和Ceuppens,JL,&van Vaeck,F,(参见J.Immunol.(1987)139,4067,or Cell.Immunol.(1989)118,136)描述。评价抗体促有丝分裂的分析的更合适示例性实例已经由Rosenthal-Allieri等人(Rosenthal-Allieri MA,Ticcioni M,Deckert M,Breittmeyer JP,Rochet N,Rouleaux M,和Senik A,Bernerd A,Cell Immunol.1995163(1):88-95)和Grosse-Hovest等人(Grosse-Hovest L,Hartlapp I,Marwan W,Brem G,Rammensee H-G,和Jung G,Eur J Immunol.[2003]May；33(5):1334-1340)描述。此外，可以通过本发明抗体分子介导Fc部分的一个或多个已知效应子功能的能力评价Fc结合的缺乏。

如上所述，可进行半胱氨酸残基的置换或缺失，以便引入或移除一个或多个二硫键，包括引入或移除潜在或之前已存在的二硫键。因此，可以控制主链与根据本发明的抗体分子较低重量/较短长度的链之间的连接，包括建立、加强或废除。通过引入或移除一个或多个半胱氨酸残基，二硫键可被引入或移除。作为一个示例性实例，根据本发明的四聚体抗体分子通常具有一个或多个二硫键，所述二硫键连接两个二聚体抗体分子。这样一个二硫键通常由在第一个二聚体抗体分子主链中的半胱氨酸和第二个二聚体抗体分子铰链区中的半胱氨酸限定。就这一点而言，在一些实施方案中，根据本发明的抗体可包含在位点226和/或229(相对于人IgG免疫球蛋白序列，根据Kabat编号(EU-索引))处的天然半胱氨酸残基的氨基酸置换。

还可以进行氨基酸残基如精氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基的置换或缺失，以修饰抗体的糖基化模式。作为示例性实例，IgG分子在CH2结构域的Asn297处具有单一N-连接的二天线的碳水化合物。对于血清中或离体产生于杂交瘤或基因工程细胞中的IgG，IgG相对于Asn297连接的碳水化合物是异质的。对于人IgG，核心寡糖通常由GlcNAc₂Man₃GlcNAc与不同数量的外部残基组成。

如所示，除了抗原/表位的结合，免疫球蛋白已知具有进一步的“效应子功能”，归因于免疫球蛋白的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)生物活性，并随免疫球蛋白同型而变化。抗体效应子功能的实例包括：Clq结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体-依赖性的细胞-介导细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体)；和B细胞活化。发挥抗体的效应子功能通常涉及募集效应细胞。几种免疫球蛋白效应子功能由Fc受体(FcR)介导，其结合抗体的Fc区。FcR由它们对免疫球蛋白同型的特异性限定；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等。可以采用这些效应子功能中任一(或这些效应子功能的丧失)，例如CDC或ADCC，以评估本发明的抗体分子是否缺乏Fc结合能力。

本文中指出，术语“Fc受体”或“FcR”定义了受体，通常是能够结合至抗体的Fc区的蛋白质。Fc受体被发现在某些生物体免疫系统细胞的表面上，例如自然杀伤细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞。体内Fc受体结合至固定化在感染细胞或出现在入侵的病原体上的免疫球蛋白。它们的活性刺激吞噬作用或细胞毒性细胞，通过抗体介导吞噬作用或抗体依赖性的细胞介导细胞毒性以破坏微生物或被感染细胞。一些病毒如黄病毒使用Fc受体来帮助它们感染细胞，通过被称为抗体-依赖性的增强感染机制。FcR已经在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下靶细胞的溶解作用。经典补体途径的激活由补体系统的第一个组件(Clq)结合到(合适亚类的)抗体开始，所述抗体结合到它们的同源抗原。为了评价补体激活，可以进行CDC分析，例如，如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202:163(1997)中所描述。

本领域所用术语“补体系统”指在血液中发现的大量的小蛋白质——称为补体因子，其通常以不活跃的前体(前-蛋白)循环。这一术语指的是这不变和不适应性系统的下述能力：“补充”抗体和吞噬细胞从生物体中清除病原体如细菌以及抗原-抗体复合物的能力。补体因子的一个实例是复合物C1,其包含C1q和两个丝氨酸蛋白酶C1r和C1s。复合物C1是CDC途径的组分。C1q是分子量约为460,000的六价分子，且其结构类似郁金香的花束，其中六个胶原“茎”连接至六个球状的头部区域。为了激活补体级联，C1q必须结合至IgG1、IgG2或IgG3的至少两个分子。

“抗体-依赖性的细胞介导细胞毒性”或ADCC指的是一种细胞毒性形式，其中结合至出现在某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体(FcR)的分泌的Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至携带抗原的靶细胞，且随后用细胞毒素杀死该靶细胞。抗体“武装”该细胞毒性细胞，并且对于用这个机制杀死靶细胞是必须的。用于介导ADCC、NK细胞的原始细胞仅表达FcgRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRlI和FcγRIII。在造血细胞上表达的FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)中总结在第464页表3中。为了评价目标分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC分析，如描述在美国专利No.5,500,362或No.5,821,337中。用于此分析的有用的效应细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，目标分子的ADCC活性可以在体内评估，例如，在如公开在Clynes等人,PNAS USA 95:652-656(1998)的动物模型中。

几个抗体效应子功能由Fc受体(FcR)介导，其结合抗体的Fc区。FcR是其对免疫球蛋白同型的特异性限定；IgG抗体的Fc受体被称为FcγR，IgE的为FcεR，IgA的为FcαR等。已经鉴定FcγR的三个亚类：FcγR(CD64)，FcγR(CD32)和FcγR(CD16)。

现转向本发明的核酸，其是编码根据本发明的抗体的一条或多条链的核酸分子，可以是任一可能构型的任一核酸，如单链、双链或其组合。核酸包括例如DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA分子类似物、锁核酸分子(LNA)、和蛋白质核酸分子(PNA)。DNA或RNA可以是基因组或合成来源的，可以是单链或双链的。这样的核酸可以是例如mRNA、cRNA、合成RNA、基因组DNA、cDNA合成DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸等。此外，相应的核酸可以包含非天然核苷酸类似物和/或被连接至亲和标签或标记。

在一些实施方案中，编码链，如根据本发明的抗体的主链和/或较小链的核酸序列包含在载体中，如质粒。在抗体链中包含置换或缺失的情况下，当与抗体的天然存在的结构域或区域相比较时，例如包括于免疫球蛋白序列中的相应天然结构域/区的编码序列可以用作突变形成的起点。关于选定氨基酸位点的突变，本领域技术人员具有他自己的处置使用关于定点突变的各种已建立标准方法。通常使用的技术是通过用合成寡核苷酸混合物进行PCR(聚合酶链式反应)引入突变，所述寡核苷酸携带在所需序列位点处的简并碱基组合物。例如，使用密码子NNK或NNS(其中N＝腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；S＝腺嘌呤或胞嘧啶)允许在突变过程中掺入所有20个氨基酸加上琥珀终止密码子，而密码子VVS把可能掺入的氨基酸的数量限制为12，因为它将氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val排除出被掺入到多肽序列的选择位点；例如，使用密码子NMS(其中M＝腺嘌呤或胞嘧啶)，将在选择序列位点处的可能氨基酸数目限制为11，因为它将氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val排除出被掺入在选定的序列位点出。在这方面，注意其他氨基酸(非常规20种天然存在的氨基酸)如硒半胱氨酸或吡咯赖氨酸的密码子也可以掺入抗体分子的核酸中。也可能如Wang,L.,等人(2001)Science 292,498-500或Wang,L.,和Schultz,P.G.(2002)Chem.Comm.1,1-11所述，用“人工的”密码子如UAG，其通常被认为是终止密码子，以插入其他不常见氨基酸，例如邻甲基-L-酪氨酸或对氨基苯丙氨酸。

碱基对特异性减少的核苷酸构建块的使用，例如肌苷、8-氧-2'脱氧鸟苷或6(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3,4-二氢-8H-嘧啶-do-1,2-噁嗪-7-酮(Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255,589-603)，是将突变引入到选定序列区段的另一个选项。进一步可能是所谓的三联体-突变。这种方法使用不同的核苷酸三联体的混合物，其中每个三联体编码一个氨基酸，以掺入编码序列(B,等人,1994 Nucleic Acids Res 22,5600-5607)。

编码链如根据本发明的抗体的主链和/或较小链的核酸分子可以使用任何合适的表达系统表达，例如在合适的宿主细胞或无细胞系统中。获得的抗体分子通过选择和/或隔离的方式富集。

如上所述，根据本发明的抗体分子可以针对任何预期的靶表位/抗原。根据选定的表位/抗原，抗体可以适合疾病治疗或预防。因此，在一些实施方案中，根据本发明的抗体可以用于治疗和/或预防医学状况如障碍或疾病的方法中。在掺入双特异性分子中的抗体之一能够以FcR-依赖性的方式激活免疫细胞的实施方案中，它也可特别用于选择具有示出对Fc-受体结合减少的Fc-相应部分的抗体分子。这意味着防止了非预期的FcR结合介导的免疫激活。在一些实施方案中，待治疗或预防的疾病可以是增生性疾病。增生性疾病的实例包括但不限于造血恶性肿瘤，如急性和慢性的髓性和淋巴白血病，以及淋巴瘤或实体肿瘤。实体肿瘤的实例包括但不限于胃肠道、骨、肺、肾、前列腺癌、乳腺、脑、卵巢、子宫、睾丸的肿瘤、间质肿瘤和皮肤如黑色素瘤。

本发明还提供了一种药物组合物，该组合物包含本发明的抗体分子和可选的药学上可接受的辅料。

根据本发明的抗体分子可以经由任何胃肠外或非-胃肠外(肠内)方式施用，其对蛋白质性药物在治疗上有效。肠胃外的施用方法包括，例如皮内、皮下、肌肉、气管内、鼻内、玻璃体内或静脉内注射和输注技术，例如以注射液、输注液或酊剂的形式，以及气雾剂装置和吸入剂，例如气雾剂混合物、喷剂或粉剂的形式。关于肺部给药的概述，即经由吸入气雾剂(也可以使用鼻内给药)或鞘内滴剂，例如由J.S.Patton等人The lungs as a portal of entry forsystemic drug delivery.Proc.Amer.Thoracic Soc.2004 Vol.1 pages 338-344提供。非胃肠外-给药模式，例如口服如以丸剂、片剂、胶囊、溶液或悬浮物形式，或直肠给药如栓剂形式。本发明抗体分子可以在包含常规无毒的药学上可接受的辅料或载体、添加剂和溶媒(根据需要)的制剂中全身性或局部施用。

在本发明所述一些实施方案中，药物被肠道外施用于哺乳动物，特别是人。相应的施用方法包括但不限于，例如，皮内、皮下、肌肉、气管内或静脉内注射和输注技术，例如注射液、输注液或酊剂的形式，以及气雾剂装置和吸入剂，例如气雾剂混合物、喷剂或粉剂的形式。如果化合物的血清半衰期相对较短，静脉和皮下输注和/或注射的结合可能是最方便的。药物组合物可以是水性溶液，水包油乳液或油包水乳液。

在这方面注意，经皮给药技术，例如电离子透入、超声促渗或显微操作针-加强给药，如Meidan VM和Michniak BB 2004 Am.J.Ther.11(4):312-316中所述，也可以用于本文所述抗体分子的经皮给药。非-胃肠外给药模式，例如口服如丸剂、片剂、胶囊、溶液或悬浮物的形式，或直肠给药例如栓剂的形式。本发明的抗体分子可以在含有多种常规无毒的药学上可接受的赋形剂或载体、添加剂和溶媒的制剂中全身性或局部施用。

抗体分子的施用剂量可以在广泛范围内变化以实现预期的预防效果或治疗反应。例如，它将取决于抗体分子对于选定靶的亲和力以及抗体分子和体内配体之间的复合物的半衰期。进一步地，优化剂量取决于抗体分子或其缀合物的生物分布、施用模式、被治疗的疾病/障碍的严重性以及患者的身体状况。例如，当用于局部施用的药膏时，可以使用高浓度的抗体分子。然而，如果需要，抗体分子也可以持续释放制剂给予，所述制剂例如脂质体分散物或基于水凝胶的聚合物微球，像PolyActiveTM或OctoDEXTM(参见Bos等人,Business Briefing:Pharmatech 2003:1-6)。其他可得到的持续释放制剂例如基于PLGA的聚合物(PR药物)，基于PLA-PEG的水凝胶(Medincell)和基于PEA的聚合物(Medivas)。

因此，本发明所述抗体分子可以使用药学上可接受的成分以及已建立制备方法(Gennaro,A.L.和Gennaro,A.R.(2000)Remington:The Science andPractice of Pharmacy,20th Ed.,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA)被制成组合物。为制备药物组合物，可以使用药学上惰性的无机或有机赋形剂。为了制备例如片剂、粉剂、明胶胶囊或栓剂，可以使用例如乳糖、滑石、硬脂酸及其盐、脂肪、蜡、固体或液体多元醇、天然和硬化油。用于生产溶液、悬浮物、乳剂、气雾剂混合物或在使用前重构成溶液或气溶胶混合物的粉剂的合适赋形剂包括水、醇、丙三醇、多元醇和其合适的混合物以及植物油。

药物组合物也可含有添加剂，例如，填料、粘结剂、润湿剂、助流剂、稳定剂、防腐剂、乳化剂，此外还有用于实现储存效果的溶剂或增溶剂或药剂。后者是融合蛋白可被掺入缓释或持续释放或靶向给药系统，如脂质体、微胶囊。

制剂可以通过多种方式，包括通过细菌-保留过滤器过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，所述无菌固体组合物在使用前可溶解或分散在无菌水或其他无菌介质中。

医学中存在本发明抗体分子的许多可能的应用。除了用于体外诊断或药物输送，可以生成结合如组织-或肿瘤-特异性细胞表面分子的本发明抗体分子。

通过如下非限定实施例进一步说明本发明。

具体实施方式

实施例1

产生一个双特异性Fc-衰减二价分子，也被指定为bsFc^ko-1/2-形式，具有肿瘤×CD3特异性，如图1E中示意性所示。铰链区和C_H2结构域的氨基酸的修饰如图1O中所示引入。产生双特异性Fc-衰减四价分子，也被指定为bsFc^ko-1-形式，具有肿瘤×CD3特异性，如图1G中示意性所示。铰链区和C_H2结构域的氨基酸的修饰如图1P中所示引入。

质粒的克隆和扩增使用大肠杆菌的DH5α(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)实现。相应载体的构建描述在图2中。

编码具有指定特异性的主链和较小链(也可以称为重链和轻链)的表达载体的共转染在Sp2/0浆细胞瘤细胞中进行，所述细胞从美国典型培养物保藏中心(ATCC,Manassas,VA)获得。对于相应载体的构建，参考如图2所示(也参见下文实施例2)。细胞培养在IMDM培养基中，该培养基补充10％胎牛血清(PAN-Biotech,Aidenbach,Germany)、1％的青霉素和链霉素(Lonza,Basel,Switzerland)。通过添加1 mg/ml G418选择稳定转染子(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)。

从稳定转染的细胞的培养物上清液中，经由亲和色谱法对于Fc^ko-1形式使用蛋白质A和对于bsFc^ko-1/2形式使用KappaSelect(两个色谱介质都来自GE Healthcare,Munich,Germany)，纯化双特异性抗体。

实施例2

免疫球蛋白V区与所需恒定C区在表达载体中结合。这里指的克隆程序允许引入完整的Ig V区，并且它们在淋巴细胞中表达，且氨基酸序列没有任何改变。为此，单特异性抗体VDJ和VJ片段的核苷酸序列被用来设计引物对((C C’；D D’；表1)。用适当限制性核酸酶(总结于表1)消化V区段的再扩增DNA片段(VJ直接地，VDJ在用表1引物对E E’扩增之后)，然后结合到表达载体中。或者，在GeneArt,Regensburg,Germany，V结构域被合成为DNA片段。该方法用于编码指向EGFR的抗体V区的基因(克隆C225)。载体(图2)包含人重链和人轻链恒定区基因。因此，在载体中插入重组和消化的V区段重建了Ig基因的原始基因组组织，不改变任何V区氨基酸。

用于重链的原始载体包含人γ1同型Ig重链(图2A)。在内含子中的所需位置处引入限制性位点，以便用单克隆抗体4G8(抗-Flt3)、BV10(抗-FLT3)、4G7(抗-CD19)、C225(抗-EGFR)和9.2.27(抗-CSPG4)或任何其他单克隆抗体的重链的VDJ片段更换AatII-ClaI片段。用于克隆VDJ片段的相关区放大显示于图2B中。被更换片段包含具有AatII限制性位点的第一个内含子、前导序列的第二个外显子、VDJ区的部分和具有限制性位点ClaI的重链内含子的部分。为了置换人γ1重链恒定区的所有外显子，在重链内含子(MluI)和5’-UTR重链polyA-区(pA-区；SpeI)的所需位置处引入限制性位点，如图2A和2C中所示。

此外，使用构建的表达载体，可以针对所有其他抗体同型的恒定区或针对具有优化或减少的效应子功能的Fc部分，更换人Igγ1同型的整个恒定区(MluI-SpeI片段；参见图2A)。在抗体优化触发ADCC的情况下，在人γ1恒定区的CH2结构域中引入氨基酸置换，如国际专利申请WO2011/076922和WO2011/089211中所示。为了生成图1A-N中所述的双特异性抗体，可以插入包含编码野生型的外显子或编码Ig重链的修饰恒定结构域的外显子的MluI和SpeI侧翼的DNA片段。待更换的MluI-SpeI片段被放大示于图2C中。添加双特异性抗体的第二个抗原特异性，可以经由限制性酶位点BspEI和SpeI包括以VH-VL或VL-VH取向的scFv-片段，如图2A中所示。关于克隆VL-VH取向的scFv片段的区域放大示于图2C中。通过用表2中列出的寡核苷酸F和F’PCR产生对于CD3(人源化克隆UCHT1；VL-VH取向)、CD28(克隆9.3；VL-VH取向)、TCRα/β(克隆BMA031；VH-VL取向)具有特异性的ScFv片段。或者，在GeneArt,Regensburg,Germany，它们被合成为DNA-片段。该方法用于编码针对CD16的抗体的基因(克隆3G8；VL-VH取向)。分别用适当的限制性核酸酶(总结于表2中)消化VH-VL和VL-VH取向的scFv片段的DNA片段，然后连接到表达载体中。

用于轻链的原始载体包含轻链的VJ区和人κ基因的C区(图2D)。在所需位置处引入限制性位点(XhoI和SpeI)，以便用单克隆抗体4G8(抗-Flt3)、BV10(抗-FLT3)、4G7(抗-CD19)、C225(抗-EGFR)和9.2.27(抗-CSPG4)或任何其他单克隆抗体的轻链的适当VJ片段置换轻链XhoI-SpeI片段。邻近待更换片段的区域如图2E中所示。这个区域包含前导序列的第二个外显子、用于框架融合的合适的限制性位点(XhoI)、VJ区的部分和具有限制性位点SpeI的κ链内含子的部分。为了替换轻链(CL)的恒定结构域，在所需位置处引入限制性位点(PmlI和BsmBI)。邻近待更换片段的区域放大示出于图2F中。这个区域包含κ链内含子、合适的限制性位点(PmlI)、CL区的部分和具有限制性位点(BsmBI)的3’-UTR区κ链polyA-区(pA-区)的部分。

表1：插入到表达载体中的用于扩增VDJ和VJ区段的寡核苷酸

限制性位点以粗体显示并用括号里的字母表示。

表2：插入到表达载体中的用于扩增scFv区段的寡核苷酸

限制性位点以粗体显示并用括号里的字母表示。

因此，获得具有FLT3×CD3(4G8×UCHT1,BV10×UCHT1)、FLT3×TCRα/β(4G8×BMA031,BV10×BMA031)、FLT3×CD28(4G8×9.3,BV10×9.3)、FLT3×CD16(4G8×3G8,BV10×3G8)、CD19×CD3(4G7×UCHT1)、CD19×TCRa/β(4G7×BMA031)、CD19×CD28(4G7×9.3)、CD19×CD16(4G7×3G8)、CSPG4×CD3(9.2.27×UCHT1)、CSPG4×TCRa/β(9.2.27×BMA031)、CSPG4×CD28(9.2.27×9.3)、CSPG4×CD16(9.2.27×3G8)、EGFR×CD3(C225×UCHT1)、EGFR×TCRa/β(C225×BMA031)、EGFR×CD28(C225×9.3)、EGFR×CD16(C225×3G8)的作为四价bsFc^-KO-1和二价bsFc^-KO-1/2的双特异性抗体分子。相应链的序列被描述为SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:26且如图6中所述。

编码嵌合重链和轻链(IgG1/κ)或修饰的重链的表达载体共转染进入非-Ig-产生骨髓瘤细胞系Sp2/0中，产生稳定转染瘤，该瘤分泌双特异性单克隆抗体，所述抗体能够特异性结合所需抗原。这些抗体分子的功能特点在下为使用FLT3×CD3、CD19×TCRa/β和CSPG×CD3双特异性抗体分子的实验中被说明。

实施例3

使用或不使用FLT3/CD19阳性REH细胞，测定实施例1中的两种抗体形式bsFc^ko-1/2-形式和bsFc^ko-1-形式的T细胞激活。数据如图3中所示。使用的双特异性抗体分子具有克隆4G8的FLT3结合位点(第一结合位点)和克隆UCHT1的CD3结合位点(第二结合位点)。“bsFc^ko-1/2-形式”分子由链SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6组成，“bsFc^ko-1-形式”分子由链SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26组成。结合CSPG4和CD3的双特异性抗体分子是“bsFc^ko-1/2形式”，并且由链SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:18组成。另外，使用“bsFc^ko-1/2形式”的双特异性抗体分子，其结合CD19和由链SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:15组成。

A)人单核细胞(PBMC)从健康捐赠者的外周血中获得并且用密度梯度离心法分离。PBMC被转移到96孔板(100,000/孔)。随后，添加辐射的FLT3/CD19阳性REH细胞(50,000/孔)或培养基，最后，以(图3A)描述的浓度添加抗体。24小时之后，添加³H胸苷(0.5μCi/孔)孵育细胞。又一个24小时后，使用细胞收割机，细胞被置于玻璃纤维过滤器上。随后，通过闪烁计数器检测放射性。

B)肝素化全血(50μl/孔)在添加和不添加FLT3/CD19阳性REH细胞(50,000/孔)的96孔板上孵育，以(图3B)描述的浓度添加抗体。24小时后，通过ELISA测定上清液中TNF的浓度。

REH细胞(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen,DSMZ,Braunschweig,Germany)和PBMC在RPMI 1640培养基中培养，该培养基补充10％胎牛血清(PAN-Biotech,Aidenbach,Germany)、1％青霉素和链霉素(Lonza,Basel,Switzerland)。

实施例4

测定双特异性抗体和激活CD8+T杀伤细胞对FLT3/CD19表达REH细胞(图4A)和CSPG表达SKMel63细胞(图4B)的溶解作用。

使用单特异性CD3抗体UCHT1(10 ng/ml)刺激人单核细胞(PBMC)三天。随后使用磁性细胞分选通过阳性选择分离激活的CD8+T细胞。细胞被添加到⁵¹Cr标记的FLT3/CD19阳性REH细胞(图4A)或CSPG4-阳性SKMel63细胞(图4B)中，然后与所指示浓度的抗体一起孵育。4小时后获得细胞上清液到闪烁板上，通过闪烁计数器测定放射性。

在如下限定的实验条件下分析特异性溶解的百分比：cpm(exp)-cpm(bg)/cpm(100)-cpm(bg)，其中cpm(bg)对应于没有抗体和效应细胞的铬释放，cpm(100)对应于在用去污剂孵育靶细胞之后的铬释放。

SKMel63细胞获得于B.Gückel博士,Klinik fürUniversityof Tübingen,Germany。

实施例5

在三个不同的形式之间比较具有相同的特异性的FLT3×CD3抗体(FLT结合位点：克隆4G8，CD3结合位点：克隆UCHT1)的聚集和产：双特异性单链形式(bs-scFv)、bsFc^ko-1/2-形式、bsFc^ko-1-形式。“bsFc^ko-1/2-形式”的抗体分子由链SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6组成，“bsFc^ko-1-形式”的抗体分子由链SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:26组成。

双特异性单链分子通过用蛋白质L的亲和色谱法纯化。

用superdex 200 PC3.2/30柱和SMARTSystem(GE-Healthcare,Munich,Germany)进行凝胶过滤。使用的标准蛋白质是过氧化氢酶(232 kDa；来自牛肝)、醛缩酶(158 kDa；来自兔肌肉)、白蛋白(67 kDa；来自牛血清)和核糖核酸酶(13.7 kDa；来自牛胰腺)。结果如图5A中所示。从图5A明显看出，如果抗体表达为bs-scFv(43％聚集率)，而不是bsFc^ko-1/2(未检测到聚集)或bsFc^ko-1(2％聚集率)，聚集体的形成显著更加明显，即本发明的双特异性抗体分子仍然是单体分子，基本没有聚集倾向。

为了比较产率，编码所描述形式的包含4G8(抗-FLT3)和UCHT1(抗-CD3)-特异性的双特异性分子的基因被导入到Sp2/0细胞中，且用亲和色谱法纯化抗体。从挑选的最大产量的克隆的上清液中所纯化抗体的量如图5B中所述。通过光学光谱测定抗体浓度，设定1mg/ml抗体浓度在280nm下的光密度为1.4。本发明所述bsFc^ko-1/2和bsFc^ko-1抗体分子的产率显著高于其各自bs-scFv分子。

本领域技术人员很容易理解，本发明很好地适应实施提到的目标并获得结果和优势，以及其中固有的那些。此外，对本领域技术人员显而易见的是，在不偏离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明做出不同的替换和修改。这里描述的目前作为某些典型实施方案的代表的组合物、方法、程序、处理、分子和特异化合物是示例性的，且不意在限制本发明的范围。本领域技术人员将想到的包含在本发明精神内的其中的改变和其他用途由权利要求的范围限定。本说明书中之前发表文件的列表或讨论不一定看做是承认该文件是现有技术的一部分或公知常识。

在缺乏未在本文具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下，可以适当地实施本文示例性描述的本发明。因此，例如，术语“包括”、“包括”、“含有”等应该在广义上理解且没有限制。此外，本文使用的术语和表述被用作描述性术语且没有限制，在使用这些术语和表述时，没有排除显示和描述的特征或其部分的等同物的意思，而是应认识到各种修改均可在发明要求保护的范围内。因此，应理解的是，尽管本发明已经通过示例性实施方案和可选特征进行了具体公开，但是本领域技术人员可以寻求对其中体现的发明做出修改和变化，这样的修改和变化被认为在本发明的范围内。.

本文已经全面且一般地描述了本发明。落入一般公开内容内的每个较窄种类和亚属分组也形成本发明的部分。这包括本发明的一般描述，其具有从属中移除任何主题的条件或否定限制，无论离体材料是否在本文专门叙述。

其他实施方案在以下权利要求范围内。此外，在本发明的功能或方面以马库什组的方式描述时，本领域技术人员将认识到本发明也由此以马库什组的任何个体成员或成员亚组的形式描述。

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31  国际专利申请WO2011/089211

Claims (57)

1.一种重组双特异性抗体分子，其由含有用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段、含有用于第二抗原的第二结合位点的单链Fv片段和免疫球蛋白CH2结构域组成，其中所述Fab片段和所述单链Fv片段经由所述CH2结构域连接。

2.根据权利要求1所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点结合肿瘤相关抗原。

3.根据权利要求2所述的抗体分子，其中所述肿瘤相关抗原位于肿瘤的脉管系统上。

4.根据权利要求2或3所述的抗体分子，其中所述肿瘤相关抗原是表面抗原或细胞外基质抗原。

5.根据权利要求2至4中任一项所述的抗体分子，其中所述肿瘤相关抗原选自CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CDw52、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、CD133、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、EGFR、de2-7-EGFR、EGFRvIII、叶酸结合蛋白、Her2neu、Her3、PSMA、PSCA、PSA、TAG-72、HLA-DR、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、碳酸酐水解酶IX(MN/CA IX)、癌胚抗原(CEA)、EpCAM、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白(Tenascin)、卷曲蛋白1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)、内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8和Tie2。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点结合T-细胞-或NK(自然杀伤)细胞特异性受体分子。

7.根据权利要求6所述的抗体分子，其中所述T-细胞-或NK细胞特异性受体分子是CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一个。

8.根据权利要求7所述的抗体分子，其中所述TCR是TCR(α/β)或TCR(γ/δ)。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段经由Fab片段的重链CH1和VH结构域或经由Fab片段的轻链CL和VL结构域与所述CH2结构域连接。

10.根据权利要求9所述的抗体分子，其中所述Fab片段的重链结构域或所述Fab片段的轻链结构域排列在多肽链的N端。

11.根据权利要求10所述的抗体分子，其中所述CH2结构域经由包含第二结合位点的scFv片段的轻链可变结构域(VL结构域)连接至所述scFv片段。

12.根据权利要求10所述的抗体分子，其中所述CH2结构域经由包含第二结合位点的scFv片段的重链可变结构域(VH结构域)连接至所述scFv片段。

13.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体分子，其中所述包含用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段由融合至CH1结构域的VL结构域和融合至CL结构域的VH结构域组成。

14.根据权利要求13所述的抗体分子，其中所述Fab片段的CH1结构域融合至所述CH2结构域。

15.根据权利要求13或14所述的抗体分子，其中所述Fab片段的VL-CH1链排列在多肽链的N端。

16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段包含铰链区。

17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，所述第二结合位点结合CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一个。

18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述CH2结构域的能够介导与Fc受体结合的至少一个氨基酸残基缺失或突变。

19.根据权利要求18所述的抗体分子，其中所述氨基酸残基选自序列位点230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据EU-索引的序列位点编号)。

20.根据权利要求19所述的抗体分子，其中进一步地，序列位点226、228和229中的一个或多个氨基酸残基缺失或突变。

21.根据权利要求20所述的抗体分子，其中位点226和229中的一个或两个处的半胱氨酸被不同的氨基酸替换。

22.根据权利要求19至21中任一项所述的抗体分子，其包含选自下述的至少一个突变：氨基酸228的缺失、氨基酸229的缺失、氨基酸230的缺失、氨基酸231的缺失、氨基酸232的缺失、氨基酸233的缺失、置换Glu233→Pro、置换Leu234→Val、氨基酸234的缺失、置换Leu235→Ala、氨基酸235的缺失、氨基酸236的缺失、氨基酸237的缺失、氨基酸238的缺失、置换Asp265→Gly、置换Asn297→Gln、置换Ala327→Gln和置换Ala330→Ser。

23.一个四聚体抗体分子，其包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗体分子的二聚体，其中所述四聚体抗体分子在所述双特异性抗体分子的铰链区之间包含二硫键。

24.根据权利要求23所述的四聚体抗体分子，其中所述二硫键由序列位点226或229(根据EU-索引的序列位点编号)处的半胱氨酸残基中的至少一个形成。

25.一个重组双特异性抗体分子，其包含含有用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段、含有用于第二抗原的第二结合位点的单链Fv片段、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，其中所述Fab片段和所述单链Fv片段经由所述CH2结构域和CH3结构域彼此连接，且其中能够形成用于二聚化的二硫键的至少一个半胱氨酸残基缺失或突变。

26.根据权利要求25所述的抗体分子，其中位点226和229(根据EU-索引的序列位点编号)中的一个或两个处的半胱氨酸缺失或被不同的氨基酸替换。

27.根据权利要求25或26所述的抗体分子，其包含至少一个在CH3结构域中的修饰以阻止这个结构域的二聚化。

28.根据权利要求25至27中任一项所述的抗体分子，其中所述CH2结构域的能够介导与Fc-受体结合的氨基酸残基缺失或突变。

29.一种重组双特异性抗体分子，其包含含有用于第一抗原的第一结合位点的Fab片段、含有用于第二抗原的第二结合位点的单链Fv片段、免疫球蛋白CH2结构域和免疫球蛋白CH3结构域，其中所述Fab片段和所述单链Fv片段经由所述CH2结构域和CH3结构域彼此连接，且其中所述CH2结构域的能够介导与Fc-受体结合的至少一个氨基酸残基缺失或突变。

30.根据权利要求28或29所述的抗体分子，其中所述CH2结构域的能够介导与Fc-受体结合的至少一个氨基酸残基缺失或突变，所述至少一个氨基酸残基选自序列位点228、230、231、232、233、234、235、236、237、238、265、297、327和330(根据EU-索引的序列位点编号)。

31.根据权利要求30所述的抗体分子，其包含选自下述的至少一个突变：氨基酸228的缺失、氨基酸230的缺失、氨基酸231的缺失、氨基酸232的缺失、氨基酸233的缺失、置换Glu233→Pro、氨基酸234的缺失、氨基酸Leu234→Val的置换、氨基酸235的缺失、置换Leu235→Ala、氨基酸236的缺失、氨基酸237的缺失、氨基酸238的缺失、置换Asp265→Gly、置换Asn297→Gln、置换Ala327→Gln和置换Ala330→Ser。

32.根据权利要求25至31中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点结合肿瘤相关表面抗原。

33.根据权利要求32所述的抗体分子，其中所述肿瘤相关表面抗原选自CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD30、CD33、CD34、CD37、CD44v6、CD45、CDw52、Fms-类酪氨酸激酶3(FLT-3，CD135)、c-Kit(CD117)、CSF1R(CD115)、CD133、PDGFR-α(CD140a)、PDGFR-β(CD140b)、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4，黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖)、Muc-1、EGFR、de2-7-EGFR、EGFRvIII、叶酸结合蛋白、Her2neu、Her3、PSMA、PSCA、PSA、TAG-72、HLA-DR、IGFR、CD133、IL3R、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、碳酸酐水解酶IX(MN/CA IX)、癌胚抗原(CEA)、EpCAM、CDCP1、Derlin1、腱生蛋白、卷曲蛋白1-10、血管抗原VEGFR2(KDR/FLK1)、VEGFR3(FLT4，CD309)、内皮糖蛋白、CLEC14、Tem1-8和Tie2。

34.根据权利要求25至33中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点结合T-细胞-或NK细胞相关受体分子。

35.根据权利要求34所述的抗体分子，其中所述T-细胞-或NK细胞相关受体分子是CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一个。

36.根据权利要求35所述的抗体分子，其中所述TCR是TCR(α/β)或TCR(γ/δ)。

37.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段经由Fab片段的重链结构域或经由Fab片段的轻链结构域连接至所述CH2结构域。

38.根据权利要求37所述的抗体分子，其中所述Fab片段的重链结构域排列在多肽链的N-端。

39.根据权利要求38所述的抗体分子，其中所述CH2/CH3结构域经由包含第二结合位点的scFv片段的轻链可变结构域(VL结构域)连接至所述scFv片段。

40.根据权利要求39所述的抗体分子，其中所述CH2/CH3结构域经由包含第二结合位点的scFv片段的重链可变结构域(VH结构域)连接至所述scFv片段。

41.根据前述权利要求中任一项所述的抗体分子，其中所述Fab片段经由Fab片段的重链结构域或经由Fab片段的轻链结构域连接至所述CH2结构域。

42.根据权利要求25至41中任一项所述的抗体分子，其中所述第一结合位点结合肿瘤相关表面抗原，第二结合位点结合CD3、T细胞受体(TCR)、CD28、CD16、NKG2D、Ox40、4-1BB、CD2、CD5和CD95中的一个。

43.根据权利要求29至42中任一项所述的抗体分子，其包含序列位点226和/或229(根据EU-索引的序列位点编号)处的半胱氨酸残基。

44.根据权利要求29至42中任一项所述的抗体分子，其中能够形成用于二聚化的二硫键的至少一个半胱氨酸残基缺失或突变。

45.根据权利要求29至43中任一项所述的抗体分子，其包含至少一个在CH3结构域中的修饰以阻止这个结构域的二聚化。

46.一种四聚体抗体分子，其包含根据权利要求29至43中任一项所述的双特异性抗体分子的二聚体。

47.根据权利要求46所述的四聚体抗体分子，其中所述四聚体抗体分子在所述双特异性抗体分子的铰链区之间包含二硫键。

48.根据权利要求47所述的四聚体抗体分子，其中所述二硫键由序列位点226或229(根据EU-索引的序列位点编号)处的半胱氨酸残基中的至少一个形成。

49.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所定义的抗体分子。

50.如权利要求中1至48中任一项所定义的抗体分子，其用于疾病治疗。

51.根据权利要求50所述的抗体分子，其中所述疾病是增生性疾病。

52.根据权利要求51所述的抗体分子，其中所述增生性疾病选自造血恶性肿瘤如急性和慢性的髓性和淋巴白血病，以及淋巴瘤，实体肿瘤如胃肠道、肺、肾、前列腺、乳腺、脑、卵巢、子宫的肿瘤，间质肿瘤和黑色素瘤。

53.一种核酸分子，其编码如权利要求1至48中任一项所定义的抗体分子。

54.根据权利要求53所述的核酸分子，其包含在载体中。

55.一种宿主细胞，其包含如权利要求53所述的核酸分子或权利要求54所述的载体。

56.一种制备如权利要求1至48中任一项所述的抗体分子的方法，所述方法包括在允许所述核酸表达的条件下，表达编码所述抗体分子的核酸。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述抗体分子在宿主细胞或无细胞体系中表达。