CN103403025B - 单价抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有CH1‑CL结构域交换的单价抗原结合蛋白，其生产方法，包含所述抗体的药物组合物，及其用途。

Description

单价抗原结合蛋白
本发明涉及具有CH1-CL结构域交换的单价抗原结合蛋白，其生产方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。
发明背景
在近20年中已开发和评估了多种单特异性或多特异性，单价或多价的工程抗体衍生物(见例如Holliger，P.，等人，Nature Biotech23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，Pathobiology74(2007)3-14)。
对某些抗原例如c-Met，单价抗体相比其对应的二价形式具有不同的性能，例如在抗体结合后缺乏对抗功能或受体内化降低，因此代表了用于治疗用途的有利形式。例如WO2005／063816涉及作为治疗剂的单价抗体片段。
US2004／0033561描述了基于共表达VH-CH1-CH2-CH3抗体链与VL-CL-CH2-CH3抗体链生成单价抗体的方法；但是，此方法的缺点是形成VL-CL-CH2-CH3链的结合无活性的同源二聚体，如在图2中描述。由于相似的分子量，难以分离这样的同源二聚体副产物。
WO2007／048037也涉及基于共表达VH-CH1-CH2-CH3抗体链与VL-CL-CH2-CH3抗体链的单价抗体，但其具有附着于重链的加标签部分，用于易于从难以分离的同源二聚体副产物中纯化异源二聚体。
WO2009／089004描述了使用静电转向效应生成异源二聚体单价抗体的另一种可能性。
WO2010／145792涉及四价双特异性抗体，其中相似重量的错配副产物的减少导致较高产量的期望的双特异性抗体。
发明概述
本发明包含单价抗原结合蛋白，其包含
a)特异性结合抗原的抗体的经修饰的重链，其中VH结构域被所述抗体的VL结构域替换；和
b)所述抗体的经修饰的重链，其中CH1结构域被所述抗体的CL结构域替换。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于
a)的抗体的经修饰的重链的CH3结构域与b)的抗体的经修饰的重链的CH3结构域各自在界面接触，所述界面包含抗体CH3结构域之间的原始界面；
其中改变所述界面以促进单价抗原结合蛋白的形成，其中所述改变的特征在于
i)改变一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的另一条重链的CH3结构域的原始界面接触的一条重链的CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，所述凸起可置于另一条重链的CH3结构域的界面内的腔中
和
ii)改变另一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的第一CH3结构域的原始界面接触的第二CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二CH3结构域的界面内产生腔，在所述腔中可放置第一CH3结构域的界面内的凸起。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的此单价抗原结合蛋白的特征在于
所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)，且所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的此单价抗原结合蛋白的特征还在于
通过引入半胱氨酸(C)作为在每个CH3结构域的对应位置处的氨基酸进一步改变两个CH3结构域，使得在两个CH3结构域之间能够形成二硫桥。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于其为人IgG同种型。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
或
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；
或
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；
或
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列；
或
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列；
或
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
在本发明的一个方面，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，a)和b)的经修饰的重链是IgG1同种型，且抗原结合蛋白是afucosylated，具有在Asn297处的寡糖(糖)总量的80％或更低(优选65％至5％)的岩藻糖量。
本发明还包含制备根据本发明的单价抗原结合蛋白的方法，
其包含以下步骤
a)用载体转化宿主细胞，所述载体包含编码根据本发明的单价抗原结合蛋白的核酸分子
b)在允许合成所述单价抗原结合蛋白分子的条件下培养宿主细胞；和
c)从所述培养物中回收所述单价抗原结合蛋白分子。
本发明还包含核酸，其编码根据本发明的单价抗原结合蛋白。
本发明还包含载体，其包含编码根据本发明的单价抗原结合蛋白的核酸。
本发明还包含宿主细胞，其包含所述载体。
本发明还包含根据本发明的单价抗原结合蛋白的组合物，优选药物或诊断组合物。
本发明还包含药物组合物，其包含根据本发明的单价抗原结合蛋白和至少一种可药用的赋形剂。
本发明还包含治疗需要疗法的患者的方法，所述方法特征在于对患者施用治疗有效量的根据本发明的单价抗原结合蛋白。
根据本发明的抗原结合蛋白是基于以下原理，即VL-CH1-CH2-CH3和VH-CL-CH2-CH3链仅形成异源二聚体，而不能形成具有相似结构和分子量的难以分离的同源二聚体副产物。此修饰的效果不仅主要在于减少副产物，而且在于形成的仅有的副产物从具有相似大小的同源二聚体副产物变为高分子量四聚体(图1D)。然后通过SEC或其他分子量分离技术可容易地去除此高分子量四聚体。
由于分子量(分子量约加倍)和结构不同，可容易地分离形成的二聚体副产物(图1D)。因此可以纯化而无需引入其他修饰(例如遗传引入标签)。
还发现，根据本发明的单价抗原结合蛋白具有有价值的特征，例如生物学或药理学活性(例如ADCC，或拮抗生物活性以及缺乏对抗活性)。其可用于例如治疗疾病，例如癌症。单价抗原结合蛋白还具有高度有价值的药物代谢动力学性能(例如半衰期(术语t1／2)或AUC)。
附图描述
图1A)基于VL-CH1-CH2-CH3和VH-CL-CH2-CH3链的具有CH1-CL结构域交换的根据本发明的单价抗原结合蛋白(缩写为MoAb)的示意图。B)在CH3结构域中包含结入孔(knob-into-hole)的根据本发明的MoAb的示意图。C)二聚单价抗原结合蛋白的示意图(作为副产物形成的MoAb二聚体，其由于结构和分子量不同，可容易地分离)。
图2A)VL-CL-CH2-CH3和VH-CH1-CH2-CH3链的单价抗体(例如在US2004／0033561中描述)和B)VL-CL-CH2-CH3链的结合无活性的难以分离的二聚体副产物(例如在WO2007／048037中描述)的示意图。
图3 MoAb c-Met(c-Met5D5MoAb(“wt”))的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗原结合蛋白。单个峰对应MoAb(3)，MoAb二聚体(2)和聚集物级分(1)。(B)合并峰级分(1，2,3)并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。
图4单价MoAb IGF1R(IGF1R AK18MoAb(“wt“))的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗原结合蛋白。单个峰对应MoAb(2)和MoAb二聚体(1)。(B)合并峰级分(1，2)并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。C)通过SEC-MALLS研究峰级分1和2的分子量。将峰2鉴定为单价抗原结合蛋白MoAbIGF1R。
图5 MoAb Her3(Her3205MoAb(“wt“))的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗体。单个峰对应MoAb(3)，MoAb二聚体(2)和聚集物级分(1)。(B)合并峰级分(1，2，3)并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。
图6具有KiH突变的MoAb Her3(Her3205MoAb KiH)的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗原结合蛋白。(B)合并峰级分并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。
图7具有KiH突变的MoAb IGF1R(IGF1R AK18MoAb KiH)的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗体。单个峰对应MoAb(2)和MoAb二聚体(1)。(B)合并峰级分(1，2)并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。
图8具有KiH突变的MoAb c-Met(c-Met5D5MoAb KiH)的生化表征。(A)在Superdex20026／60柱上分离蛋白质A纯化的抗体。(B)合并峰级分并在非还原和还原条件下进行SDS-PAGE。用考马斯蓝染料染色聚丙烯酰胺凝胶。
图9在A549细胞中的c-Met受体磷酸化测定。在缺乏或存在c-Met结合抗体或c-Met5D5MoAb(“wt”))时用HGF刺激A549细胞。对总细胞裂解物进行免疫印记分析。星号标记在2条非特异性带之间的磷酸-c-Met带。
图10 MoAb c-Met(c-Met5D5MoAb(“wt”)))与A549细胞的细胞结合，使用流式细胞术分析。A549细胞与指示的抗体的稀释系列孵育。使用结合Fc的偶联荧光体的二抗显现结合的抗体。
图11用于分析单价抗原结合蛋白IGF1R AK18MoAb(“wt”)的结合亲和力的表面等离子共振测定的示意图。
图12 MoAb IGF-1R(IGF1R AK18MoAb(“wt”))与A549细胞的细胞结合，使用流式细胞术分析。A549细胞与指示的抗体的稀释系列孵育。使用结合Fc的偶联荧光体的二抗显现结合的抗体。
图13 ADCC测定，使用亲本非糖改造的(non-glycoengineered)(非ge)IGF1R Mab和亲本糖改造的(ge)IGF1R Mab和非糖改造的单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))。在存在亲本非ge IGF1R Mab(=1)，亲本ge IGF1R Mab(=2)和非ge单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(=3)时孵育将供体来源的外周血单核细胞(PBMC)与前列腺癌细胞(DU145)孵育。
图14在与亲本IGF-1R IgG1抗体和单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))孵育后评估IGF-1R的内化，数据显示当单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))被结合时，IGF-1R的内化在效价和绝对内化方面减少。
图15在与IGF-1R IgG1抗体和单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))孵育后评估IGF-1诱导的IGF-1R的自磷酸化，数据显示当单价抗原结合蛋白IGF1RMoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))被结合时，IGF-1诱导的IGF-1R的自磷酸化在效价方面减少。
图16通过DLS时间进程实验评估单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))的聚集倾向。在5天期间，检测不到分离的单体级分(见图4)的流体力学半径(Rh)的可测量的增加。
图17在去糖基化后和在非还原条件下，单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))的ESI-MS谱。
图18在去糖基化和还原后，IGF-1R单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))的ESI-MS谱。
发明详述
本发明包含单价抗原结合蛋白，其包含
a)特异性结合抗原的抗体的经修饰的重链，其中VH结构域被所述抗体的VL结构域替换；和
b)所述抗体的经修饰的重链，其中CH1结构域被所述抗体的CL结构域替换。
在本发明的一个优选实施方案中，可通过“结入孔”(“knobs-into-holes”)(KiH)技术改变根据本发明的所述单价抗原结合蛋白的CH3结构域，所述技术在例如WO96／027011，Ridgway，J.B.，等人，Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等人，NatBiotechnol16(1998)677-681中以若干例子详细描述。在此方法中，改变2个CH3结构域的相互作用表面以增加含有这两个CH3结构域的2条重链的异源二聚化。(2条重链的)2个CH3结构域的每个可为“结”，而另一个为“孔”。此修饰的效果是显著减少了高分子量四聚体副产物。
引入二硫桥进一步稳定异源二聚体(Merchant，A.M.，等人，Nature Biotech16(1998)677-681；Atwell，S.，等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35)和提高产量。
因此，在本发明的一个方面，所述单价抗原结合蛋白的特征还在于
a)的全长抗体的重链的CH3的结构域与b)的全长抗体的经修饰的重链的CH3结构域各自在界面接触，所述界面包含抗体CH3结构域之间的原始界面；
其中改变所述界面以促进单价抗原结合蛋白的形成，其中所述改变的特征在于
i)改变一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的另一条重链的CH3结构域的原始界面接触的一条重链的CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，所述凸起可置于另一条重链的CH3结构域的界面内的腔中
和
ii)改变另一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的第一CH3结构域的原始界面接触的第二CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二CH3结构域的界面内产生腔，在所述腔中可放置第一CH3结构域的界面内的凸起。
优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)。
在本发明的一个方面，通过引入半胱氨酸(C)作为在每个CH3结构域的对应位置处的氨基酸进一步改变两个CH3结构域，使得在两个CH3结构域之间能够形成二硫桥。
在一个优选的实施方案中，所述单价抗原结合蛋白在“结链”的CH3结构域中包含T366W突变，和在“孔链”的CH3结构域中包含T366S，L368A，Y407V突变。也可使用在CH3结构域之间的额外的链间二硫桥(Merchant，A.M.，等人，Nature Biotech16(1998)677-681)，例如通过在“结链”的CH3结构域中引入Y349C突变和在“孔链”的CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。因此在另一个优选的实施方案中，所述单价抗原结合蛋白在2个CH3结构域之一中包含Y349C，T366W突变，和在2个CH3结构域的另一个中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述单价抗原结合蛋白在2个CH3结构域之一中包含Y349C，T366W突变，和在2个CH3结构域的另一个中包含S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的额外的Y349C突变和在另一个CH3结构域中的额外的E356C或S354C突变形成链间二硫桥)(始终根据Kabat的EU索引编号)。但可选或另外地，也可使用在EP1870459A1中描述的其他结入孔技术。所述单价抗原结合蛋白的优选例子是在“结链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变(始终根据Kabat的EU索引编号)。
在另一个优选的实施方案中，所述单价抗原结合蛋白包含在“结链”的CH3结构域中的T366W突变和在“孔链”的CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变，和额外地包含在“结链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变。
在另一个优选的实施方案中，所述单价抗原结合蛋白包含在2个CH3结构域之一中的Y349C，T366W突变，和在2个CH3结构域的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述单价抗原结合蛋白包含在2个CH3结构域之一中的Y349C，T366W突变，和在2个CH3结构域的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，和额外地包含在“结链”的CH3结构域中的R409D；K370E突变，和在“孔链”的CH3结构域中的D399K；E357K突变。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于包含
a)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列；和
b)经修饰的重链，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
本文中使用的术语“抗体”表示由两条抗体重链和两条抗体轻链组成的全长抗体(见图1)。全长抗体的重链是多肽，其从N-端至C-端方向包含抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CHI)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定结构域2(CH2)、抗体重链恒定结构域3(CH3)，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；和任选地包含抗体重链恒定结构域4(CH4)，在抗体为IgE亚型的情况下。优选地，全长抗体的重链是多肽，其从N-端至C-端方向包含VH，CHI，HR，CH2和CH3。全长抗体的轻链是多肽，其从N-端至C-端方向包含抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)，缩写为VL-CL。抗体轻链恒定结构域(CL)可为κ(kappa)或λ(lambda)。抗体链通过CL结构域和CH1结构域之间(即轻和重链之间)和全长抗体重链铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的例子是例如IgG(例如IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD和IgE的天然抗体。根据本发明的抗体可来自单一物种，例如人，或其可为嵌合的或人源化的抗体。根据本发明的全长抗体包含2个抗原结合位点，每个由VH和VL对形成，它们都特异性结合相同的(第一)抗原。通过下述修饰从这些全长抗体得到本发明的单价抗原结合蛋白：a)通过将VH结构域替换为所述抗体的VL结构域，修饰所述抗体的第一重链；和b)通过将CHI结构域替换为所述抗体的CL结构域，修饰所述抗体的第二重链。因此得到的单价抗原结合蛋白包含2条经修饰的重链且没有轻链。
所述全长抗体的重或轻链的C-端表示所述重或轻链的C-端最后一个氨基酸。
本文中使用的术语“结合位点”或“抗原结合位点”表示根据本发明的抗原结合蛋白实际结合配体(例如抗原或其抗原片段)的区域，并且其源自抗体分子或其片段(例如Fab片段)。根据本发明的抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)。
特异性结合期望抗原的抗原结合位点(即VH／VL对)可源自a)抗原的已知抗体或b)通过从头合成免疫方法得到的新抗体或抗体片段，特别是使用抗原蛋白或核酸或其片段，或通过噬菌体展示。
本发明的单价抗原结合蛋白的抗原结合位点包含6个互补决定区(CDR)，其以不同程度参与抗原结合位点的亲和力。有3个重链可变结构域CDR(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和3个轻链可变结构域CDR(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。通过与氨基酸序列编译数据库的比较确定CDR和框架区(FR)的范围，在所述数据库中已根据序列间的变异性定义了这些区域。
抗体特异性指抗体对特定抗原表位的选择性识别。例如天然抗体是单特异性的。双特异性抗体是具有2种不同的抗原结合特异性的抗体。根据本发明的单价抗原结合蛋白是“单特异性的”且特异性结合各个抗原的表位。
在本申请中使用的术语“价”表示在抗体分子中存在的特定数目的结合位点。例如天然抗体具有2个结合位点，是二价的。术语“单价抗原结合蛋白”表示仅包含一个抗原结合位点的多肽。
本发明的全长抗体包含一种或多种免疫球蛋白类别的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白类别包括IgG，IgM，IgA，IgD和IgE类别(或同种型)，且在IgG和IgA的情况下包括其亚类别(或亚型)。在优选的实施方案中，本发明的全长抗体和因此本发明的单价抗原结合蛋白具有IgG类别抗体的恒定结构域结构。
本文中使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单种氨基酸组成的抗体分子制品。
术语“嵌合抗体”指包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和源自不同来源或物种的至少部分恒定区的抗体，通常通过重组DNA技术制备。优选包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其他优选形式是下述形式，其中恒定区相对原始抗体的恒定区已被修饰或改变以产生根据本发明的性能，特别是有关C1q结合和／或Fc受体(FcR)结合的性能。这样的嵌合抗体又称“类别转换的抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。产生嵌合抗体的方法包括常规的重组DNA和基因转染技术，这是本领域熟知的。见例如Morrison，S.L.，等人，Proc.NatI.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244。
术语“人源化的抗体”指下述抗体，其中框架或“互补决定区”(CDR)相比亲本免疫球蛋白的框架或互补决定区已被修饰，以包含不同特异性的免疫球蛋白的CDR。在优选的实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。见例如Riechmann，L.，等人，Nature332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等人，Nature314(1985)268-270。特别优选的CDR对应于那些识别嵌合抗体的上述抗原的描述的序列。本发明包含的“人源化抗体”的其他形式是下述形式，其中恒定区相对原始的恒定区抗体已被额外修饰或改变以产生根据本发明的性能，特别是有关C1q结合和／或Fc受体(FcR)结合的性能。
本文中使用的术语“人抗体”旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术熟知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。也可在转基因动物(例如小鼠)中产生人抗体，所述动物在免疫后能够在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下产生人抗体的完整库或选择的人抗体。在这些种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后产生人抗体(见例如Jakobovits，A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等人，Nature362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等人，Year Immunol.7(1993)33-40)。也可在噬菌体展示文库中产生人抗体(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks，J.D.，等人，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。也可使用Cole等人和Boerner等人的技术制备人单克隆抗体(Cole，等人，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，第77页(1985)；和Boerner，P.，等人，J.Immunol.147(1991)86-95)。正如已经在根据本发明的嵌合和人源化的抗体中提及的，本文中使用的术语“人抗体”也包含这样的抗体，其在恒定区中被修饰以产生根据本发明的性能，特别是有关C1q结合和／或FcR结合的性能，例如通过“类别转换”，即改变或突变Fc部分(例如从IgG1至IgG4和／或IgG1／IgG4突变)。
如本文中使用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如从宿主细胞，例如NS0或CHO细胞或从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体，或使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体。这样的重组人抗体具有处于重排形式的可变和恒定区。已对根据本发明的重组人抗体进行体内体细胞超变异。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，其尽管源自并与人种系VH和VL序列相关，但可能不天然存在于体内的人抗体种系库中。
本文中使用的“可变结构域”(轻链可变结构域(VL)，重链可变区(VH))表示直接参与抗体与抗原的结合的每个轻和重链对。可变人轻和重链的结构域具有相同的一般结构，并且每个结构域包含4个序列广泛保守的框架(FR)区，所述框架区通过3个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接。框架区采用β-折叠构象，并且CDR可形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过框架区维持其三维结构，并与来自其他链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性／亲和力中起特别重要的作用，因此提供了本发明的另一个目的。
当在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区为非本文定义的高变区残基的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻和重链从N-至C-端包含结构域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。每条链上的CDR被这些框架氨基酸分隔开。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区域。根据Kabat，等人，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD(1991)的标准定义确定CDR和FR区。
本文中使用的术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定中，优选在使用纯化的野生型抗原的等离子体共振测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，单价抗原结合蛋白与抗原表位的结合。通过术语ka(抗体从抗体／抗原复合物中缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD／ka)定义结合的亲和力。结合或特异性结合表示10-8mol／l或更低，优选10- 9M至10-13mol／l的结合亲和力(KD)。因此，根据本发明的单价抗原结合蛋白与下述每个抗原特异性结合，即具有10-8mol／l或更低，优选10-9M至10-13mol／l的结合亲和力(KD)的特异性抗原。
可通过BIAcore测定(GE-Healthcare Uppsala，瑞典)研究单价抗原结合蛋白与FcγRIII的结合。通过术语ka(抗体从抗体／抗原复合物中缔合的速率常数)，kD(解离常数)和KD(kD／ka)定义结合的亲和力。
术语“表位”包括能够与单价抗原结合蛋白特异性结合的任意多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基，例如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方案中，表位决定簇可具有特定的三维结构特征，和／或特异性的电荷特征。表位是被单价抗原结合蛋白结合的抗原区域。
在某些实施方案中，当抗体在蛋白质和／或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，称抗体与抗原特异性结合。
在其他实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，所述全长抗体是人IgG1亚类，或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。
在其他实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，所述全长抗体是人IgG2亚类。
在其他实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，所述全长抗体是人IgG3亚类。
在其他实施方案中，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，所述全长抗体是人IgG4亚类，或具有额外突变S228P和L235E的人IgG4亚类(又称IgG4SPLE)。
在本申请中使用术语“恒定区”表示非可变区的抗体的结构域总和。恒定区不直接参与抗原结合，但展示了多种效应子功能。取决于其重链恒定区的氨基酸序列，将抗体分类(又称同种型)：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，这些类型中的一些可被进一步分为亚类(又称同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，IgA1和IgA2。对应不同抗体类型的重链恒定区分别被称为α，δ：ε，γ和μ。可在所有5种抗体类型中找到的轻链恒定区(CL)被称为κ(kappa)和λ(lambda)。
在本申请中使用术语“源自人来源的恒定区”表示IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4亚类的人抗体的恒定重链区和／或恒定轻链κ或λ区。这样的恒定区是现有技术熟知的，例如在Kabat，E.A.，中描述(见例如Johnson，G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72(1975)2785-2788)。
尽管IgG4亚类的抗体显示降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合，其他IgG亚类的抗体显示强结合。然而，如果改变残基Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(损失Fc碳水化合物)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434和His435，也提供降低的Fc受体结合(Shields，R.L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund，J.，等人，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等人，Immunology86(1995)319-324；EP0307434)。
在一个实施方案中，根据本发明的抗体相比IgG1抗体具有降低的FcR结合，并且全长亲本抗体与IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类的FcR结合有关，具有S228，L234，L235和／或D265突变，和／或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在全长亲本抗体中的突变是S228P，L234A，L235A，L235E和／或PVA236。在另一个实施方案中，在全长亲本抗体中的突变在IgG4中是S228P和L235E，在IgG1中是L234A和L235A。
抗体的恒定区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和CDC(补体依赖性细胞毒性)。补体激活(CDC)是通过补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区的结合起始的。C1q与抗体的结合是通过在所谓的结合位点上的确定的蛋白质-蛋白质相互作用导致的。这样的恒定区结合位点是现有技术已知的，并在例如Lukas，T.J.，等人，J.Immunol.127(1981)2555-2560；Bunkhouse，R.和Cobra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton，D.R.，等人，Nature288(1980)338-344；Thomason，J.E.，等人，Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idiocies，E.E.，等人，J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hearer，M.，等人，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等人，Immunology86(1995)319-324；和EP0307434中描述。这些恒定区结合位点例如通过氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)表征。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”指在存在效应细胞时通过根据本发明的抗体的人靶细胞的裂解。优选地通过在存在效应细胞时使用根据本发明的抗体处理抗原表达细胞制剂测量ADCC，所述效应细胞为例如新鲜分离的PBMC或来自血沉棕黄层的纯化的效应细胞，如单核细胞或自然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。
出乎意料地已经发现，根据本发明的抗原结合蛋白相比其亲本全长抗体显示了改进的ADCC性能。没有进一步修饰Fc部分，例如糖改造就实现了这些改进的ADCC效果。术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”表示通过补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分的结合起始的过程。C1q与抗体的结合是通过在所谓的结合位点上的确定的蛋白质-蛋白质相互作用导致的。这样的Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。例如通过氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)表征这些Fc部分结合位点。IgG1，IgG2和IgG3亚类的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统也不结合C1q和/或C3。
如在Umana，P.，等人，Nature Biotechnol.17(1999)176-180和US6,602,684中描述的，单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可通过改造其寡糖组分而增强。最常使用的治疗抗体，IgG1型抗体是糖蛋白，其在每个CH2结构域中的Asn297处具有保守的N-连接的糖基化位点。附着于Asn297的2种复杂的二分支寡糖埋藏在CH2结构域之间，与多肽骨架形成大量接触，并且其存在对抗体介导效应子功能，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely，M.R.，等人，Glycobiology5(1995)813-822；Jefferis，R.，等人，Immunol.Rev.163(1998)59-76；Wright，A.，和Morrison，S.，L.，Trends Bioteehnol.15(1997)26-32)。Umana，P.，等人Nature Biotechnol.17(1999)176-180和WO99/54342显示，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中过表达β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)，一种催化二分支寡糖形成的糖基转移酶，显著提高了抗体的体外ADCC活性。Asn297碳水化合物组成的改变或其消除也影响与FcγR和C1q的结合(Umana，P.，等人，Nature Biotechno1.17(1999)176-180；Davies，J.，等人，Biotechnol.Bioeng.74(2001)288-294；Mimura，Y.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)45539-45547；Radaev，S.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)16478-16483；Shields，R.，L.，等人，J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Shields，R.，L.，等人，J.Biol.Chem.277(2002)26733-26740；Simmons，L.，C.，等人，J.Immunol.Methods263(2002)133—147)。
在本发明的一个方面，根据本发明的单价抗原结合蛋白的特征在于，a)和b)的经修饰的重链是IgG1型，且抗原结合蛋白是afucosylated，具有在Asn297处的寡糖(糖)总量的80％或更低的岩藻糖量。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是afucosylated，具有在Asn297处的寡糖(糖)总量的65％至5％的岩藻糖量。
术语“afucosylated抗原结合蛋白”指在Fc区Asn297位具有降低的岩藻糖残基水平的具有改变的糖基模式的IgG1或IgG3同种型(优选IgG1同种型)的抗原结合蛋白。人IgG1或IgG3的糖基化发生在Asn297位上，为核心岩藻糖基化的二分支复杂寡糖糖基化，以至多2个Gal残基终止。取决于末端Gal残基的量，将这些结构指定为G0，G1(α1,6或α1，3)或G2聚糖残基(Raju，T.S.，BioProcess Int.1(2003)44-53)。抗体Fc部分的CHO型糖基化例如在Routier，F.H.，Glycoconjugate J.14(1997)201-207中描述。在无糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常在Asn297位以至少85％的量被岩藻糖基化。应当理解，本文中使用的术语afucosylated抗体包括在其糖基化模式中没有岩藻糖的抗体。众所周知，在抗体中的典型的糖基化的残基位置是根据EU编号系统的第297位的天冬酰胺(“Asn297”)。
因此，根据本发明的afucosylated抗原结合蛋白表示IgG1或IgG3同种型(优选IgG1同种型)的抗体，其中岩藻糖的量是Asn297位的寡糖(糖)总量的80％或更低(例如80％至1％)(这表示在Fc区Asn297位的至少20％或更多的寡糖是afucosylated)。在一个实施方案中，岩藻糖的量是在Fc区Asn297位的寡糖的65％或更低(例如65％至1％)，在一个实施方案中，从65％至5％，在一个实施方案中，从40％至20％。根据本发明，“岩藻糖的量”表示相对附着于Asn297的所有寡糖(糖)的总和(例如复杂、混合和高甘露糖结构)，在Asn297位的寡糖(糖)链内的所述寡糖(岩藻糖)的量，所述量通过MALDI-TOF质谱测量并以平均值计算(有关测定岩藻糖量的详细程序，见例如WO2008/077546)。此外，在一个实施方案中，Fc区的寡糖是二分支的。根据本发明的afucosylated抗体可在糖修饰的宿主细胞中表达，所述宿主细胞经改造以足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖的量表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一个实施方案中，具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。可选地，可根据US6,946,292降低或消除宿主细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶活性，以产生糖修饰的宿主细胞。可通过例如发酵条件(例如发酵时间)或通过组合至少2种具有不同岩藻糖基化量的抗体预先确定抗体岩藻糖基化的量。这样的afucosylated抗原结合蛋白和对应的糖改造方法在WO2005/044859，WO2004/065540，WO2007/031875，Umana，P.，等人，NatureBiotechnol.17(1999)176-180，WO99/154342，WO2005/018572，WO2006/116260，WO2006/114700，WO2005/011735，WO2005/027966，WO97/028267，US2006/0134709，US2005/0054048，US2005/0152894，WO2003/035835，WO2000/061739中描述。根据本发明的经糖改造的抗原结合蛋白具有增加的ADCC(相比亲本抗原结合蛋白)。产生根据本发明的afucosylated抗原结合蛋白的其他糖改造的方法在例如Niwa，R..等人，J.Immunol.Methods306(2005)151—160；Shinkawa，T.，等人，J.Biol.Chem，278(2003)3466-3473；WO03/055993或US2005/0249722中描述。
因此本发明的一个方面是用于治疗癌症的根据本发明的afucosylated抗原结合蛋白，其是IgG1同种型或IgG3同种型(优选IgG1同种型)，具有在Ash297位的寡糖(糖)总量的60％或更低(例如60％至1％)的岩藻糖量。本发明的另一个方面是具有在Ash297位的寡糖(糖)总量的60％或更低的岩藻糖量的，特异性结合CD20的IgG1或IgG3同种型(优选IgG1同种型)的afucosylated抗CD20抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。在一个实施方案中，岩藻糖量在Asn297位的寡糖(糖)总量的60％至20％之间。在一个实施方案中，岩藻糖量在Asn297位的寡糖(糖)总量的60％至40％之间。在一个实施方案中，岩藻糖量占Asn297位的寡糖(糖)总量的0％之间。
当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基或位置时，一般使用“EU编号系统”或“EU索引(根据Kabat)”(例如，在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中报导了EU索引，将其明确引入本文作为参考)。
术语“糖链显示了附着于CHO细胞中重组表达的抗体的Asn297的N-连接聚糖的特征”表示，根据本发明的全长亲本抗体的Asn297位的糖链除了岩藻糖残基以外与在未修饰的CHO细胞中表达的相同抗体(例如在WO2006/103100中报导的抗体)具有相同的结构和糖残基序列。
在本申请中使用的术语“NGNA”表示糖残基N-羟乙酰神经氨酸。
根据本发明的抗体通过重组手段产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明的抗体的核酸，并且另一个方面是包含所述编码根据本发明的抗体的核酸的细胞。重组产生的方法是现有技术众所周知的，并且包括在原核和真核细胞中的蛋白质表达，和随后分离抗体并通常纯化至可药用的纯度。为了在宿主细胞中表达上述抗体，通过标准方法将编码各个经修饰的轻和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，并从细胞(上清或裂解后的细胞)中回收抗体。用于重组产生抗体的一般方法是现有技术熟知的，并例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等人，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中描述。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，例如蛋白质A-琼脂糖、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离根据本发明的单价抗原结合蛋白。
使用常规程序容易地分离和测序编码单克隆抗体的DNA和RNA。杂交瘤细胞可作为这样的DNA和RNA的来源。一旦被分离，可将DNA插入表达载体，然后将其转染进否则不产生免疫球蛋白的宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以获得在宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。
通过在抗体DNA中引入合适的核苷酸改变，或通过核苷酸合成制备单价抗原结合蛋白的氨基酸序列变体(或突变体)。然而，这样的修饰仅可在例如上文所述的很有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述抗体特征(例如IgG同种型和抗原结合)，但可改善重组生产的产量、蛋白质稳定性或有助于纯化。
在本申请中使用的术语“宿主细胞”表示任意类型的细胞系统，其可被改造以产生根据本发明的抗体。在一个实施方案中，使用HEK293细胞和CHO细胞作为宿主细胞。本文中使用的表达法“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用且所有这些名称包括后代。因此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代所述细胞和源自其的培养物，不管转移次数。也应当理解，由于故意或无意突变，所有后代在DNA内容上不精确相同。也包括具有与用于筛选原始经转化的细胞相同的功能或生物活性的变体后代。
例如，Barnes，L.M.，等人，Cytotechnology32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等人，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述了在NS0细胞中的表达。例如，Durocher，Y.，等人，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述了瞬时表达。Orlandi，R.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)3833-3837；Carter，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等人，J.Immuno1.Methods204(1997)77-87描述了可变结构域的克隆。Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在Cytotechnology30(1999)71—83中和Schlaeger，E.-J.，在J.Immunol.Methods194(1996)191—199中描述了优选的瞬时表达系统(HEK293)。
适合原核细胞的控制序列包括例如启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。
当核酸被置于和另一种核酸序列的功能关系中时，其是“有效连接的”。例如，如果前序列或分泌前导DNA被表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽DNA是有效连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列是有效连接的；或如果核糖体结合位点的位置有助于翻译，则其与编码序列是有效连接的。一般地，“有效连接的”表示连接的DNA序列是连续的，并且，在分泌性前导序列的情况下，是连续的和符合读框的。然而，增强子不必须是连续的。通过在方便的限制位点的连接完成连接。如果这样的位点不存在，依照常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
通过标准技术进行单价抗原结合蛋白的纯化以去除细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质(例如副产物)，所述技术包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术(见Ausubel，F.，等人(编)，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York(1987))。用于蛋白质纯化的不同方法是建立完善和广泛使用的，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如蛋白质A或蛋白质G亲和层析)，离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，亲硫吸附(例如使用β-巯基乙醇和其他SH配体)，疏水相互作用或芳族吸附层析(例如使用苯基琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸)，金属螯合剂亲和层析(例如，使用Ni(II)和Cu(II)亲和材料)，大小排阻层析和电泳方法(例如，凝胶电泳、毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93—102)。在实施例1和对应的图3至8中描述了纯化的例子。
本发明的一个方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是根据本发明的抗体用于制造药物组合物的用途。本发明的另一个方面是制造包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含与药物载体一起配制的根据本发明的抗体。
本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的根据本发明的单价抗原结合蛋白。
本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。
本发明的一个实施方案是根据本发明的单价抗原结合蛋白，其用于治疗癌症。
本发明的另一个方面是根据本发明的抗体用于制造治疗癌症的药物的用途。
本发明的另一个方面是通过对需要这样的治疗的患者施用根据本发明的抗体治疗患有癌症的患者的方法。
本文中使用的“药物载体”包括生理上相容的任意和所有溶剂、分散介质、涂料、抗菌和抗真菌剂、等渗和延迟吸收剂，等等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、脊髓或表皮施用(例如通过注射或输注)。
可通过本领域已知的多种方法施用本发明的组合物。熟练技术人员将理解，施用途径和/或模式将根据期望的结果而变化。为了通过某些施用途径施用本发明的化合物，可能必须用避免其失活的材料包被化合物，或将所述材料与化舍物共同施用，例如，可对对象施用在合适的载体，例如脂质体或稀释剂中的化合物。可药用的稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括用于临时制备无菌注射溶液或分散剂的无菌水溶液或分散剂和无菌粉末。用于药物活性物质的这些介质和活性剂的使用是本领域已知的。
本文中使用的短语“胃肠外施用”和“肠胃外施用的”表示非肠和局部施用的施用模式，通常通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下的、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本文中使用的术语癌症指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头部或颈部的癌症、皮肤或眼内黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区的癌症、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、阴户癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统的癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆道癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、神经鞘瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任意上述癌症的难治形式，或一种或多种上述癌症的组合。
这些组合物也可包含佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可通过上述灭菌程序和加入多种抗菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等确保预防微生物的存在。也可能希望在组合物中包括等渗剂，例如糖、氯化钠等等。另外，可通过加入延迟吸收的活性剂，例如单硬脂酸铝和明胶导致可注射药物形式的延长的吸收。
不管选择的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将可以合适的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物配制为可药用的剂型。
可改变在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平，以得到在特定患者、组合物和施用模式下有效实现期望的治疗反应，而对患者无毒的活性成分量。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明的特定组合物的活性、施用途径、施用时间、应用的特定化合物的排泄率、治疗持续时间、与应用的特定组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、受治疗的患者的年龄、性别、体重、病况、一般健康和既往病史，和医学领域熟知的类似因素。
组合物必须足够无菌并且是流体，使得组合物可通过注射器递送。除了水以外，载剂优选地是等渗缓冲盐溶液。
可通过例如使用涂料例如卵磷脂，在分散剂的情况下通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂维持合适的流动性。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多醇例如甘露醇或山梨醇和氯化钠。
本文中使用的表达法“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用且所有这些名称包括后代。因此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代所述细胞和源自其的培养物，不管转移次数。也应当理解，由于故意或无意突变，所有后代在DNA内容上不精确相同。也包括具有与用于筛选原始经转化的细胞相同的功能或生物活性的变体后代。当表示不同的名称时，从上下文中将显而易见。
本文中使用的术语“转化”指将载体/核酸转移进宿主细胞的过程。如果使用没有难以逾越的细胞壁障碍的细胞作为宿主细胞，可通过例如Graham和Van der Eh，Virology52(1978)546描述的磷酸钙沉淀法进行转染。然而，也可使用其他将DNA引入细胞的方法，例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含大量细胞壁构造的细胞，例如，一种转染方法是，如Cohen，F.N，等人，PNAS.69(1972)7110描述的使用氯化钙的钙处理。
本文中使用的“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA(又称转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。将转录物和编码的多肽统称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，在真核细胞中的表达可包括mRNA的剪接。
“载体”是核酸分子，特别是自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移进宿主细胞和/或在宿主细胞之间转移插入。术语包括主要功能是将DNA或RNA插入细胞(例如染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。也包括提供超过一种上述功能的载体。
“表达载体”是多核苷酸，当其被引入合适的宿主细胞时可被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指由表达载体组成的合适的宿主细胞，所述宿主细胞可以发挥功能生产期望的表达产物。
提供以下实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在随附的权利要求书中陈述。应当理解，在不背离本发明的精神的前提下可对陈述的流程进行修改。
序列表描述
SEQ ID NO：1c-Met 5D5 MoAb(“wt”)-经修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO：2c-Met 5D5 MoAb(“wt”)-经修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO：3IGF1R AK18 MoAb(“wt”)-经修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO：4IGF1R AK18 MoAb(“wt”)-经修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO：5Her3 205 MoAb(“wt”)-经修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3
SEQ ID NO：6Her3 205 MoAb(“wt”)-经修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3
SEQ ID NO：7c-Met 5D5 MoAb KiH修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3结T366W，S354C
SEQ ID NO：8c-Met 5D5 MoAb KiH修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3孔L368A，Y407V，T366S，Y349C
SEQ ID NO：9IGF1R AK18 MoAb KiH修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3结T366W，S354C
SEQ ID NO：10IGF1R AK18 MoAb KiH修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3孔L368A，Y407V，T366S，Y349C
SEQ ID NO：11Her3 205 MoAb KiH修饰的重链a)VL-CH1-CH2-CH3结T366W，S354C
SEQ ID NO：12Her3 205 MoAb KiH修饰的重链b)VH-CL-CH2-CH3孔L368A，Y407V，T366S，Y349C
实验程序
A.材料和方法：
重组DNA技术
如Sambrook，J.，等人，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中描述的使用标准方法操纵DNA。根据制造商的说明书使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
有关人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIHPublication No91-3242中提供。根据EU编号(Edelman，G.M.，等人，PNAS63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH PublicationNo91-3242)编号抗体链的氨基酸。使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)软件包版本10.2和Infomax's Vector NTI Advance软件组版本8.0用于序列产生、作图、分析、注释和说明。
DNA测序
通过在SequiServe(Vaterstetten，德国)和Geneart AG(Regensburg，Germany)进行的双链测序测定DNA序列。
基因合成
由Geneart AG(Regensburg，德国)通过自动化基因合成从合成的寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。将两侧具有单个限制性内切酶切割位点的基因区段克隆进pGA18(ampR)质粒。从经转化的细菌中纯化质粒DNA并通过紫外光谱测定浓度。通过DNA测序验证亚克隆的基因片段的DNA序列。通过基因合成制备两侧具有5'HpaI和3'NaeI限制位点的编码2条抗体链(VH-CL-CH2-CH3和VL-CH1-CH2-CH3)的DNA序列的完整片段。合成具有5'-BclI和3'-NaeI限制位点的编码“结入孔”的基因区段，“结入孔”表示一条抗体重链在CH3结构域中携带T366W突变和第二抗体重链在CH3结构域中携带T366S，L368A和Y407V突变。以类似的方式通过基因合成制备两侧具有BclI和NaeI限制位点的编码“结入孔”的DNA序列，即抗体重链在CH3结构域中携带S354C和T366W突变和第二抗体重链携带Y349C，T366S，L368A和Y407V突变。将所有构建体设计为具有编码前导肽的5’-末端DNA序列，所述前导肽靶向蛋白质在真核细胞中的分泌。
表达质粒的构建
使用Roche表达载体构建所有抗体链。载体由以下元件组成：
-Epstein-Barr病毒(EBV)的复制起点，oriP，
-pUC18载体的复制起点，其允许此质粒在大肠杆菌中复制
-β-内酰胺酶基因，其赋予在大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人1-免疫球蛋白多聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和
-唯一的HpaI，BclI和NaeI限制位点。
如上所述通过基因合成制备顺序为VH-CL-CH2-CH3和VL-CH1-CH2-CH3的免疫球蛋白基因和“结入孔”构建体并克隆进pGA18(ampR)质粒。用HpaI和NaeI或用BclI和NaeI限制酶(Roche Molecular Biochemicals)消化携带合成的DNA区段的pG18(ampR)质粒和Roche表达载体，并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将纯化的DNA区段连接至分离的Roche表达载体HpaI/NaeI或BclI/NaeI片段，产生最终的表达载体。将最终的表达载体转化进大肠杆菌细胞，分离表达质粒DNA(Miniprep)并进行限制酶分析和DNA测序。在150ml LB-Amp培养基中培养正确的克隆，再次分离质粒DNA(Maxiprep)，并通过DNA测序验证序列完整性。
免疫球蛋白变体在HEK293细胞中的瞬时表达
使用FreeStyleTM293表达系统，根据制造商的说明书(Invitrogen，USA)通过人胚胎肾293-F细胞的瞬时转染表达重组免疫球蛋白变体。简单来说，在FreeStyleTM293表达培养基中在37℃/8％CO2下培养悬浮的FreeStyleTM293-F细胞。在转染当天以1-2x106活细胞/ml的密度将细胞接种在新鲜的培养基中。在I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectinTM复合物，使用325μl293fectinTM(Invitrogen，Germany)和1：1摩尔比的250μg每种质粒DNA用于250ml的最终转染体积。转染后7天通过以14000g离心30分钟和过滤通过无菌滤器(0.22μm)收获包含抗体的细胞培养上清。将上清储存在-20℃直至纯化。
可选地，通过在HEK293-EBNA细胞中瞬时转染产生抗体。通过在补充10％超低IgGFCS(胎牛血清，Gibco)，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)和250μg/ml遗传霉素(Gibco)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基，Gibeo)中培养的粘附生长的HEK293-EBNA细胞(表达Epstein-Barr病毒核抗原的人胚胎肾细胞系293；美国模式培养物保藏所号ATCC#CRL-10852，Lot.959218)中瞬时共转染各个表达质粒来表达抗体。用于转染，以4：1(范围从3：1至6：1)的FuGENETM试剂(μl)与DNA(μg)的比例使用FuGENETM6转染试剂(Roche MolecularBiochemicals)。使用等摩尔比例的质粒从各自的质粒表达蛋白质。在第3天用L-谷氨酰胺ad4mM，葡萄糖[Sigma]和NAA[Gibco]饲养细胞。从转染后第5至11天通过离心收获包含双特异性抗体的细胞培养上清并储存在-20℃。有关在例如HEK293细胞中重组表达人免疫球蛋白的一般信息在Meissner，P.等人，Biotechnol.Bioeng.75(2001)197-203中提供。
抗体的纯化
使用蛋白质A-琼脂糖TM(GE Healthcare，瑞典)和Superdex200大小排阻层析通过亲和层析从细胞培养上清中纯化抗体。简单地说，将无菌过滤的细胞培养上清应用于用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡的HiTrap蛋白质AHP(5ml)柱。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH2.8洗脱抗体和抗体变体，用0.1ml1M Tris，pH8.5中和包含蛋白质的级分。然后合并洗脱的蛋白质级分，用Amicon超离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml的体积并装载至用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH6.0平衡的Superdex200HiLoad120ml16/60或26/60凝胶过滤柱(GEHealthcare，瑞典)。合并包含具有低于5％的高分子量聚集物的纯化抗体的级分，并以1.0mg/ml的等分试样储存于-80℃。
经纯化的蛋白质的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量在280am处的光密度(OD)测定经纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在存在或缺乏还原剂(5mM1,4-二硫苏糖醇)的情况下的SDS-PAGE分析抗体的纯度和分子量，并使用考马斯亮蓝染色。根据制造商的说明书使用预制凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-12％Tris-甘氨酸凝胶)。在25℃下在200mMKH2PO4，250mM KCl，pH7.0的运行缓冲液中使用Superdex200分析型大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)通过高效SEC分析抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白质以0.5ml/分钟的流速注入柱中并等度洗脱50分钟。用于稳定性分析，将1mg/ml浓度的经纯化的蛋白质在4℃和40℃孵育7天，然后通过高效SEC(例如HP SEC分析(经纯化的蛋白质)评估。在通过用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶促处理去除N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱证实还原的双特异性抗体轻和重链的氨基酸骨架的完整性。
质谱和SEC-MALLS
质谱
通过电喷射离子化质谱(ESI-MS)测定和证实了抗体的总去糖基化的质量。简单地说，用在100mM KH2PO4/K2HPO4，pH7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)对至多2mg/ml蛋白质浓度的100μg纯化抗体在37℃去糖基化12-24小时，并随后通过HPLC在Sephadex G25柱(GE Healthcare)上脱盐。在去糖基化和还原后通过ESI-MS测定各个重和轻链的质量。简单地说，将115μl的50μg抗体与60μl1M TCEP和50μl8M盐酸胍孵育，随后脱盐。在装备有NanoMate源的Q-Star Elite MS系统上通过ESI-MS测定被还原的重和轻链的总质量和质量。记录的质量范围取决于样品分子量。一般来说，对于还原的抗体将质量范围设定在从600-2000m/z，而对非还原的抗体或双特异性分子设定在从1000-3600m/z。
SEC-MALLS
使用SEC-MALLS(具有多角度激光散射的大小排阻层析)测定溶液中蛋白质的近似分子量。根据光散射理论，MALLS允许评估大分子的分子量，不管其分子性状或其他假定。SEC-MALLS基于通过SEC层析和随后的浓度和散射光敏感的检测器根据蛋白质的大小(流体力学半径)分离蛋白质。SEC-MALLS一般产生允许清楚分辨单体、二聚体、三聚体等的精度的分子量评估，前提是SEC分离是充分的。
在此工作中使用以下仪器：Dionex Ultimate3000HPLC；柱：Superose610/300(GEHealthcare)；洗脱液：1x PBS；流速：0.25mL/分钟；检测器：OptiLab REX(Wyatt Inc.，Dernbach)，MiniDawn Treos(Wyatt Inc.，Dernbach)。使用Astra软件，版本5.3.2.13计算分子量。将50和150μg之间的蛋白质量装载至柱上，并使用BSA(Sigma Aldrich)作为参考蛋白质。
动态光散射(DLS)时间进程
使在20mM His/HisCl，140mM NaCl，pH6.0中的浓度约1mg/mL的样品(30μL)通过384孔过滤板(0.45μm孔大小)过滤进入384孔光学板(Corning)并用20μL石蜡油覆盖(Sigma)。使用DynaPro DLS平板阅读器(Wyatt)在40℃恒温下在5天期间重复收集动态光散射数据。用Dynamics V6.10(Wyatt)处理数据。
c-Met磷酸化测定
在HGF刺激前一天，在6孔板的每个孔中在具有0.5％FCS(胎牛血清)的RPMI中接种5x10e5个A549细胞。第二天，将生长培养基替换为含0.2％BSA(牛血清白蛋白)的RPMI1小时。然后加入12,5μg/mL双特异性抗体至培养基并孵育细胞15分钟，然后加入终浓度为25ng/mL的HGF(R&D，294-HGN)，再孵育10分钟。用含1mM钒酸钠的冰冷PBS洗一次细胞，然后将其置于冰上，并用100μL裂解缓冲液(50mM Tris-ClpH7.5，150mM NaCl，1％NP40，0.5％DOC，抑肽酶，0.5mM PMSF，1mM钒酸钠)在细胞培养板中裂解。将细胞裂解物转移至eppendorf离心管并允许裂解在冰上继续进行30分钟。使用BCA法(Pierce)测定蛋白质浓度。在4-12％Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50μg裂解物，将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。用含5％BSA的TBS-T封闭膜1小时，根据制造商的说明书用针对Y1349的磷酸特异性c-Met抗体(Epitomics，2319-1)显像。用结合非磷酸化的c-Met的抗体(Santa Cruz，sc-161)再次探测免疫印迹。
Her3(ErbB3)磷酸化测定
在完全生长培养基(RPMI1640，10％FCS)中在12孔板的每个孔中接种2x10e5个MCF7细胞。允许细胞在2天内生长至90％汇合。然后将培养基替换为含0.5％FCS的饥饿培养基。第二天补充指示浓度的各个抗体，1小时后加入500ng／mL调蛋白(R&D)。在加入调蛋白后再培养细胞10分钟，然后收获并裂解细胞。使用BCA法(Pierce)测定蛋白质浓度。在4-12％Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50μg裂解物，并将凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。用含5％BSA的TBS-T封闭膜1小时，并用特异性识别Tyr1289的磷酸特异性Her3／ErbB3抗体(4791，Cell Signaling)显像。
FACS
分离A549并计数。在圆锥形96孔板的每个孔中接种1.5x10e5个细胞。离心细胞(1500rpm，4℃，5分钟)并在50μL含2％FCS(胎牛血清)的PBS中的各个双特异性抗体的稀释系列物中在冰上孵育细胞30分钟。再次离心细胞并用200uL含2％FCS的PBS洗细胞一次，接着用5μg／mL在含2％FCS的PBS中稀释的针对人Fc的Alexa488偶联的抗体(Jackson1mmunoresearch，109116098)再次孵育细胞30分钟。将细胞用200μL含2％FCS的PBS离心洗涤2次，重悬在BD CellFix溶液(BD Biosciences)中并在冰上至少孵育10分钟。通过流式细胞仪(FACS Canto，BD)测定细胞的平均荧光强度(mfi)。通过至少一式两份的两次独立染色测定Mfi。使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞术谱。使用XLFit4.0(IDBS)和剂量响应一位点模型205测定半最大结合。
表面等离子共振
使用Biacore仪器(Biacore，GE-Healthcare，Uppsala)，通过表面等离子共振(SPR)技术分析单价抗IGF-IR抗体的结合性能。此系统用于研究分子相互作用是建立完善的。其允许连续实时监控配体／分析物结合，并因此测定在多种测定设置中的缔合速率常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术是基于测量金包被的生物传感芯片表面附近的折射率。折射率的变化指示由固定的配体与溶液中注入的分析物的相互作用引起的表面上的质量变化。如果分子结合表面上固定的配体则质量增加，在解离的情况下则质量减少。用于捕获，使用胺偶联化学将抗人IgG抗体固定在CM5生物传感芯片的表面上。以5μl／分钟的流速用0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M3-(N，N-二甲氨基)丙基-N-乙基碳化二亚胺的1：1混合物活化流动池。在醋酸钠，pH5.0中注入10μg／ml的抗人IgG抗体。以相同的方式处理参考对照流动池，但仅用运载体缓冲液代替捕获抗体。注射1M乙醇胺／HC1pH8.5封闭表面。在HBS-P中稀释IGF-1R抗体并注射。所有相互作用在25℃(标准温度)下进行。在每个结合循环后以5μl/分钟流速注射60秒3M氯化镁再生溶液以去除任何非共价结合的蛋白质。以每秒1个信号的速度检测信号。注射浓度增加的样品。图17描述了应用的测定格式。选择低装载密度的捕获抗体密度和IGF-1R抗体以强制单价结合。
用于亲和性测量，通过用与表面偶联的抗His抗体(Penta-His，Qiagen)捕获His标记的受体，将人FcgIIIa固定在CM-5传感芯片上，所述抗His抗体通过标准胺偶联和封闭化学偶联在SPR仪器(Biacore T100)的表面上。在FcgRIIIa捕获后，在25℃以5μL／分钟的流速注射50nM IGF1R抗体。之后用10mM甘氨酸-HC1，pH2.0溶液的60秒脉冲再生芯片。
抗体依赖性细胞的细胞毒性测定(ADCC)
测定通过抗IGF-IR抗体的抗体介导的效应子功能。为了测定产生的抗体引发免疫效应子机制的能力，进行了抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)研究。为了研究抗体在ADCC中的效应，在细胞培养箱中在37℃下用1μl／ml的BATDA溶液(Perkin Elmer)标记DU145IGF-IR表达细胞(1x106个细胞／ml)25分钟。之后，用10ml RPMI-FM／PenStrep洗4次细胞并以200x g离心10分钟。在最后一个离心步骤前，测定细胞数并在来自之后的沉淀的RPMI-FM／PenStrep培养基中稀释至1x10e5个细胞／ml。在圆底板每孔中放置50μl体积的5,000个细胞。对50μl细胞悬浮物加入在50μl细胞培养基体积中的终浓度范围在25-0.1μg／ml的HuMAb抗体。之后，以25：1的E：T比例加入50μl效应子细胞，新鲜分离的PBMC。以200x g离心板1分钟，接着是在37℃孵育2小时的步骤。孵育后，以200x g离心细胞10分钟，收获20μl上清并转移至Optiplate96-F板。加入200μl铕溶液(Perkin Elmer，在室温)并在振动台上孵育板15分钟。使用Perkin Elmer的Eu-TDA方案，在时间分辨的荧光剂(Victor3，Perkin Elmer)中定量荧光。以对各个靶细胞的TDA的自发释放修正的通过去垢剂裂解的靶细胞中的TDA荧光增强剂的最大释放的％表示通过ADCC的细胞裂解的程度。
IGF-1R内化测定
根据本发明的抗体和抗原结合蛋白与IGF-1R的结合导致受体的内化和降解。可通过孵育IGF-1R表达HT29CRC细胞与IGF-1R靶向抗体，接着通过ELISA定量在细胞裂解物中剩余的IGF-1R蛋白质水平监控此过程。
为此目的，在37℃和5％CO2下在96孔MTP中在具有10％FCS的RPMI中过夜孵育1，5x104细胞／孔的HT29细胞以允许细胞附着。第二天早晨，吸去培养基并加入浓度从10nM至2pM的以1：3的稀释步骤在RPMI+10％FCS中稀释的100μl抗IGF-1R抗体。细胞与抗体在37℃下孵育18小时。之后，再次移除培养基并加入120μl MES裂解缓冲液(25mM MES pH6.5+完全)。
用于ELISA，在96孔链霉抗生物素包被的聚苯乙烯板(Nunc)中加入100μl以1：200在3％BSA／PBST中稀释的(终浓度2.4μg／m1)的MAK＜hu IGF-1Rα＞hu-1a-IgG-Bi(Ch.10)并在持续摇动下在室温孵育1小时。之后移除孔内含物，每孔用200μl PBST洗三次。每孔加入100μl细胞裂解溶液，在平板振荡器上再次在室温孵育1小时，并用200μl PBST洗三次。在移除上清后，加入100μl／孔的以1：750在3％BSA／PBST中稀释的PAK＜人IGF-1Rα＞Ra-C20-IgG(Santa Cruz#sc-713)，接着如上述进行同样的孵育和洗涤间隔。为了检测结合IGF-1R的特异性抗体，加入100μl/孔的以1：4000在3％BSA／PBST中稀释的多克隆辣根过氧化物酶偶联的兔抗体(Cell Signaling#7074)。又1小时后，通过如上述充分洗涤6次再次去除未结合的抗体。为了定量结合的抗体，加入100μl/孔的3,3'-5,5'-四甲基联苯胺(Roche，BM-BlueID.-Nr.11484281)并在室温孵育30分钟。最后通过加入25μl/孔的1M H2SO4终止显色反应，并在450nm波长处测量光吸收。使用未用抗体处理的细胞作为0％下调的对照，使用裂解缓冲液作为背景对照。
IGF-1R自磷酸化测定(IGF-1刺激）
IGF-1R抗体靶向IGF-1R导致抑制IGF-1诱导的自磷酸化。我们研究了没有结入孔的单价IGF-1R抗体相比亲本IGF-1R IgG1抗体的自磷酸化抑制。为此目的，在存在不同浓度的单价和二价IGF-1R抗体时，用10nM重组人IGF-1处理过表达人IGF-1R的鼠成纤维细胞系3T3-IGF-1R细胞10分钟。在细胞裂解后，通过磷酸-IGF-1R特异性ELISA与人IGF-1R特异性捕获抗体和磷酸-酪氨酸特异性检测抗体的组合，测定磷酸化的IGF-1R蛋白的水平。
PK性能的测定：小鼠中的单剂量动力学
方法
动物：
NMRI小鼠，雌性，饲养的，在化合物施用时点体重为23-32g。
研究方案：
用于10mg／kg的单次静脉注射剂量，将小鼠分为3组，每组2-3只动物。在给药后0.5，168和672小时从组1采集血样，在给药后24和336小时从组2采集血样，在给药后48和504小时从组3采集血样。
通过眼球后穿刺得到约100μL血样。在室温1小时后通过离心(9300xg)2.5分钟从血液中得到至少40μl血清样品。在离心后直接冷冻血清样品并冷冻储存于-20℃直至分析。
分析：
使用1％小鼠血清，用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定小鼠血清中人抗体的浓度。在第一步中，使针对人Fcγ的生物素化的单克隆抗体(mAb<hFcγＰAN＞IgG-Bi)结合链霉抗生物素包被的微滴定板。在下一步中，分别加入血清样品(以不同的稀释度)和参考标准物并使其与固定的mAb＜hFcγＰAN＞IgG-Bi结合。然后加入针对人Fcγ的地高辛化单克隆抗体(mAb＜hFcγＰAN＞IgG-Dig)。通过抗Dig-辣根过氧化物酶抗体缀合物检测人抗体。使用ABTS溶液作为辣根过氧化物酶的底物。使用的不与小鼠IgG交叉反应的捕获和检测抗体的特异性使得能够在小鼠血清样品中定量测定人抗体。
计算：
通过非隔室(non-compartmental)分析计算药物代谢动力学参数，使用药物代谢动力学评估程序WinNonlinTM，版本5.2.1。
表1：计算的药物代谢动力学参数：
使用以下药物代谢动力学参数评估人抗体：
·用于丸剂IV模型的估计的初始浓度(C0)。
·最大观察浓度(Cmax)，在(Tmax)时出现。
·最大观察浓度的时间(Tmax).
·浓度／时间曲线下的面积AUC(0-inf)，通过从时间0至无穷大的线性梯形法则(使用线性插值)计算。
·表观终末半寿期(T1／2)，来自等式：Tl／2=ln2／λz。
·总体清除率(CL)，以剂量／AUC(0-inf)计算。
·稳态分布容积(Vss)，以MRT(0-inf)x CL(MRT(0-inf)计算，定义为AUMC(0-inf)／AUC(0-inf)。
B.实施例：
实施例1：
单价抗体的产生
基于图1A中所示的设计原理，我们设计了针对c-Met(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；c-Met5D5MoAb(“wt”))，IGF-1R(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4.；IGFlR AKl8MoAb(“wt”))和HER3(SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；Her3205MoAb(“wt”))的单价抗原结合蛋白。另外，设计了针对c-Met(SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；c-Met5D5MoAb KiH)，IGF-1R(SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；IGFlR AK18MoAb KiH)和HER3(SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；Her3205MoAbKiH)的相同的单价抗体，其在CH3部分掺入突变以支持通过结入孔(knob-into-hole)(，KiH)技术(Merchant，A.M.，等人，Nat.Biotechno1.16(1998)677-681)的异源二聚化。如上述，在HEK293细胞中瞬时表达所有单价抗体，并随后通过蛋白质A亲和层析后接大小排阻纯化。
图3-5描述了没有结入孔的3种不同的单价抗原结合蛋白的大小排阻层析的层析图，以及对应的在非还原和还原条件下的SDS-PAGE。
通过SEC-MALLS(图4C)确认不同峰的大小，并通过质谱确认分离的蛋白质的身份。这些数据共同显示CHI-CL交叉允许容易地纯化纯的单价抗体(图3中的峰3，图4中的峰2，图5中的峰3)而无需在Fc部分中包括结入孔以强制进行异源二聚化。此产物可通过大小排阻层析与图1C中描述的在单价抗原结合蛋白峰之前的作为副产品的二价、二聚形式的抗原结合蛋白(，MoAb二聚体)基线分离。在二价、二聚构建体中交联二聚体的大多数半胱氨酸桥不是闭合的，这导致观察到在非还原条件下在SDS-PAGE中在100kDa处观察到的主要产物，而不是如预期的在200kDa处(图3中的峰2，图4中的峰1，图5中的峰2)。可观察到的c-Met5D5MoAb(“wt”)和Her3205MoAb(“wt”)的额外的峰(图3中的峰1，图5中的峰1)描述更高分子量的聚集物。这与在WO／2007／048037中描述的单价抗体不同，其中通过常规手段不能分离异源二聚和同源二聚的单价抗体混合物(图2)。
图6-5描述了具有结入孔的3种不同的单价抗原结合蛋白的大小排阻层析的层析图，以及对应的在非还原和还原条件下的SDS-PAGE。
通过应用此结入孔技术用于Fc异源二聚化，可提高异源二聚单价抗原结合蛋白较之二价MoAb二聚体的相对产量，如图6-8中所示。
实施例2：
c-Met磷酸化(图9)
c-Met已被描述为致癌酪氨酸激酶，其失调促进细胞转化。以前已描述了靶向c-Met的抗体。MetMAb／OA-5D5(Genentech)是抑制c-Met的配体依赖性活化的这样的抗体之一。因为二价抗体是活化的，其被改造为单臂构建体，其中缺失一个FAb臂，留下单价抗体。为了证明OA-5D5和单价抗原结合蛋白c-Met MoAb(c-Met5D5MoAb(“wt”))的类似效力，在缺乏或存在唯一已知的c-Met配体，HGF时孵育A549细胞和各个抗体。与二价MetMAb(MetMAb(biv.Ab))不同，无一抗体在缺乏HGF时具有活化潜能。此外，如预期地，c-Met MoAb(c-Met5D5MoAb(“wt”))与OA-5D5一样有效抑制配体诱导的受体磷酸化。非特异性人IgG对照抗体对HGF依赖性c-Met受体磷酸化没有影响。
实施例3：
与c-Met表达细胞系的细胞结合(图10)
在A549细胞上证明了单价抗原结合蛋白c-Met MoAb(c-Met5D5MoAb(“wt”))的细胞结合。将细胞悬浮物与指示的抗体的3倍稀释系列(100-0.0003μg／mL)孵育。使用结合人免疫球蛋白恒定区的Alexa488偶联的二抗显现结合的抗体。在FACS Canto(BDBiosciences)流式细胞仪上测量单细胞荧光强度。在c-Met MoAb和OA-5D5的结合中没有观察到区别，提示c-Met MoAb(c-Met5D5MoAb(“wt”))有效结合细胞表面c-Met。
半最大结合
OA-5D5： 1.45nM
c-Met MoAb 1.57nM
实施例4：
IGF-1R结合亲和力(图11)
通过表面等离子共振(SPR)比较了单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))和亲本<IGF-1R>IgG1抗体与IGF-1R胞外结构域的结合。图17描述了测定单价亲和力的SPR测定方案。分析(2次测定)显示在单价抗体中保留了IGF-1R结合亲和力。
实施例5：
与IGF-1R表达细胞系的细胞结合(图12)
在A549细胞上证明了单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))的细胞结合。使用Accutase(Sigma)分离处于对数生长期的A549细胞，并使用2x10e5个细胞用于每个单个抗体的孵育。加入三倍稀释系列(100-0.0003μg／mL)的MoAb。使用结合人免疫球蛋白恒定区的Alexa488偶联的二抗(5μg／mL)显现结合的抗体。用7-AAD(BD)对死细胞染色并从分析中排除。在FACS Canto(BD Biosciences)流式细胞仪上测量单细胞荧光强度。数据显示在与细胞的半最大结合中有差异，这是因为IGF-1R IgG1抗体可用两臂结合细胞上的IGF-1R并展示亲合力效应，而单价抗体仅可用单臂结合。
半最大结合
IGF-1R(150kDa)： 0.76nM
IGF-1R MoAb(100kDa)： 5.65nM
实施例6：
ADCC诱导(图13)
可使用供体来源的外周血单核细胞(PBMC)测量通过癌细胞的非糖改造和糖改造的抗体的效应子细胞募集。癌细胞的裂解与NK细胞介导的细胞毒性相关并与抗体募集NK细胞的能力成比例。在此特别的设置中，在缺乏和存在各个抗体时将DU145前列腺癌细胞以1：25的比例(DU145：PBMC)与PBMC孵育。2小时后，使用如上所述的BATDA/铕系统测定细胞裂解。以对各个靶细胞的TDA的自发释放修正的通过去垢剂裂解的靶细胞中的TDA荧光增强剂的最大释放的％表示通过ADCC的细胞裂解的程度。数据显示，尽管对细胞上的IGF-1R的表观亲和力较低，非糖改造的单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))比非糖改造的亲本IGF-1R抗体更好地在高浓度上诱导ADCC。令人惊讶的，非糖改造的单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))甚至比糖改造的亲本IGF-1R抗体更好地在高浓度上诱导ADCC，所述亲本IGF-1R抗体在走向高浓度时在ADCC测定中显示下降。这样的单价IGF-1R抗原结合蛋白(IGF1R AK18MoAb(“wt”))因此可代表靶向癌细胞上的IGF-1R的有前途的方法，所述单价IGF-1R抗原结合蛋白介导减少的IGF-1R内化和由于减少的内化增强的ADCC(见下)，并使占用效应细胞上的FcRIIIa受体的Fc部分的量加倍；作为非糖改造的抗体或作为糖改造的抗体。
实施例7：
IGF-1R内化测定(图14)
通过二价亲本IGF-1R抗体靶向IGF-1R导致IGF-1R的内化。我们研究了单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))的内化性能。图14中的数据显示，当单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1RAK18MoAb(“wt”))被结合时，IGF-1R的内化在效价和绝对内化方面都减少了。
通过二价IGF-1R抗体靶向肿瘤细胞上的IGF-1R导致IGF-1R的内化和溶酶体降解。我们研究了单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))的内化性能。为此，用不同浓度的单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))和二价亲本IGF-1R抗体处理HT29结肠癌细胞18小时。在细胞裂解后，通过IGF-1R特异性ELISA测定IGF-1R蛋白的剩余水平。
图20中的图显示，当单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))被结合时，IGF-1R的内化在效价和绝对内化方面都减少了。最大内化从83％(IgG1)减少至48％(MoAb)，半最大抑制所需浓度从0.027nM(IgG1)增加至1.5nM(MoAb)。
实施例8：
IGF-1R自磷酸化(IGF-1刺激)(图15)
通过IGF-1R抗体靶向IGF-1R导致IGF-1诱导的自磷酸化的抑制。我们研究了单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))相比亲本IGF-1R IgG1抗体的自身磷酸化抑制。为此目的，在存在不同浓度的单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))和二价亲本IGF-1R抗体时，用10nM重组人IGF-1处理过表达人IGF-1R的鼠成纤维细胞系3T3-IGF-1R细胞10分钟。在细胞裂解后，通过组合人IGF-1R特异性捕获抗体和磷酸-酪氨酸特异性检测抗体的磷酸-IGF-1R特异性ELISA测定磷酸化IGF-1R蛋白的水平。
图15中的数据显示，单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))可抑制IGF-1诱导的自磷酸化，尽管由于在细胞上的单价结合(缺乏由于二价结合的亲合力效应)在较高的浓度抑制。半最大抑制所需的浓度从1.44nM(IgG1)增加至27.9nM(MoAb)。因为单价和二价抗体在IGF-1R自磷酸化中的IC50值的差异(19倍)相比IGF-1R下调(59倍)稍较不显著，不能仅用对IGF-1R的亲和力降低解释单价结合对下调的降低的影响。
实施例9：
IGF-1R单价抗原结合蛋白的稳定性(图16)
通过如上所述的动态光散射研究单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))的稳定性。简单地说，通过在40℃的DLS时间进程实验评估单价抗原结合蛋白IGF1RMoAb的聚集倾向。经过5天时间，无法检测到分离的单体级分的流体力学半径(Rh)(参照图10)的可测量的增加(图22)。
实施例10：
PK性能的测定
如上所述(在方法章节中)在单剂量PK研究中在NMRI小鼠中测定根据本发明的单价抗体的药物代谢动力学性能，所述NMRI小鼠为雌性、饲养的、在化合物施用时点时体重为23-32g的小鼠。
在下表中提供了PK性能，并提示单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))相比亲本<IGF-1R>IgG1抗体具有改进的PK性能。
表2：PK性能总结
<IGF-1R>IgG1抗体 <IGF1R>MoAb
C0 μg／mL 81.9 298.32
Cmax μg／mL 80.7 290.2
Tmax h 0.5 0.5
AUC0-inf h＊μg／mL 9349 20159
term t1／2 h 106.2 148.9
Cl mL/min/kg 0.018 0.0083
Vss L／kg 0.16 0.082
实施例11：
ESI-MS实验IGF-1R MoAb(图17和18)
瞬时表达并通过蛋白质A层析和大小排阻层析纯化单价抗原结合蛋白IGF1R MoAb(IGF1R AK18MoAb(“wt”))。在制备性SEC后，收集在2个单独的峰(峰1和峰2)中洗脱的抗体。级分2(峰2)的分析性SEC对应于100kDa的分子量，提示确定的单体。SEC-MALS验证了最初的SEC结果，并显示级分2(单体)的Mw为99.5kDa。此级分在变性和还原条件下的SDS-PAGE分析显示了具有50-60kDa的表观分子量的一条主带。在非还原条件下级分2(单体)显示了约100kDa MW的主带。
级分1＝165mL
级分2＝190mL
来自级分2的去糖基化MoAb的ESI-MS谱显示对应于具有98151Da质量的单体的一个峰系列。
表3：来自级分2的非还原ESI-MS测量的MS数据总结。
级分 分子量，单体(理论值98162Da)
级分2 98151Da
级分2在还原条件下的MS测量显示构建体的正确序列和表达。来自级分2的MS数据显示了大约等量的具有47959Da和50211Da分子量的两条不同重链。
表4：来自级分2的还原条件下的还原ESI-MS测量的MS数据总结。
实施例12：
糖改造的抗原结合蛋白的生产
用于生产糖改造的抗原结合蛋白，使用磷酸钙法用4种质粒转染HEK-EBNA细胞。2种编码抗体链的质粒，一种用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，并且一种用于甘露糖苷酶II表达(高尔基体甘露糖苷酶II表达载体)，比例为4：4：1：1。在T瓶中使用补充10％FCS的DMEM培养基以粘附的单层培养物培养细胞，并当细胞为50-80％汇合时转染细胞。对于T150瓶的转染，在转染前24小时在补充了FCS(10％V／V终浓度)的25ml DMEM培养基中接种一千五百万个细胞，并将细胞置于具有5％CO2大气的培养箱中在37℃下过夜。对于每个待转染的T150瓶，通过混合94μg等分为轻和重链表达载体的总质粒载体DNA，水至终体积469μl，和469μl1M CaCl2溶液制备DNA，CaCl2和水的溶液。对此溶液加入938μl50mMHEPES，280mM NaCl，1.5mM pH为7.05的Na2HPO4溶液，立即混合10秒并在室温静置20秒。用10ml补充了2％FCS的DMEM稀释悬浮液并加入至T150中，替换现有的培养基。然后加入另外的13ml转染培养基。在37℃，5％CO2培养细胞约17至20小时，然后用25mlDMEM，10％FCS替换培养基。在培养基交换后约7天通过以210xg离心15分钟收获条件培养基，无菌过滤(0.22um滤器)溶液并加入终浓度为0.01％w／v的叠氮化钠，并保存于4℃。

Claims (16)

1.单价抗原结合蛋白，其包含
a)特异性结合抗原的抗体的经修饰的重链，其中VH结构域被所述抗体的VL结构域替换；和
b)所述抗体的经修饰的重链，其中CH1结构域被所述抗体的CL结构域替换。
2.根据权利要求1的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于
a)的抗体的经修饰的重链的CH3结构域与b)的抗体的经修饰的重链的CH3结构域各自在界面接触，所述界面包含抗体CH3结构域之间的原始界面；
其中改变所述界面以促进单价抗原结合蛋白的形成，其中所述改变的特征在于
i)改变一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的另一条重链的CH3结构域的原始界面接触的一条重链的CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较大侧链体积的氨基酸残基替换，从而在一条重链的CH3结构域的界面内产生凸起，所述凸起可置于另一条重链的CH3结构域的界面内的腔中
和
ii)改变另一条重链的CH3结构域，
使得在与单价抗原结合蛋白内的第一CH3结构域的原始界面接触的第二CH3结构域的原始界面中，
氨基酸残基被具有较小侧链体积的氨基酸残基替换，从而在第二CH3结构域的界面内产生腔，在所述腔中可放置第一CH3结构域的界面内的凸起。
3.根据权利要求2的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于
所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)，且所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T),缬氨酸(V)。
4.根据权利要求3的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于
通过引入半胱氨酸(C)作为在每个CH3结构域的对应位置处的氨基酸进一步改变两个CH3结构域，使得在两个CH3结构域之间能够形成二硫桥。
5.根据权利要求1至4中任一项的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于其为人IgG1同种型。
6.根据权利要求1的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于包含
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成；或
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:4的氨基酸序列组成；或
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成；或
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:7的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:8的氨基酸序列组成；或
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成；或
a)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:11的氨基酸序列组成；和
b)经修饰的重链，其由SEQ ID NO:12的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1、2、3、4或6中任一项的单价抗原结合蛋白，所述单价抗原结合蛋白特征在于a)和b)的经修饰的重链是IgG1同种型，且抗原结合蛋白是afucosylated，具有在Asn297处的寡糖总量的80％或更低的岩藻糖量。
8.包含根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白的药物组合物。
9.药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项的单价抗原结合蛋白和至少一种可药用的赋形剂。
10.根据权利要求1的单价抗原结合蛋白，其用于治疗癌症。
11.根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白用于制造治疗癌症的药物的用途。
12.治疗有效量的根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白用于制造治疗需要疗法的患者的药物的用途。
13.制备根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白的方法
所述方法包括以下步骤
a)用载体转化宿主细胞，所述载体包含编码根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白的核酸分子，
b)在允许合成所述单价抗原结合蛋白分子的条件下培养宿主细胞；和
c)从所述培养物中回收所述单价抗原结合蛋白分子。
14.编码根据权利要求1至7中任一项的单价抗原结合蛋白的核酸。
15.包含根据权利要求14的核酸的载体。
16.包含根据权利要求15的载体的宿主细胞。
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