KR101586128B1 - 디술피드 안정화 ― Fv 단편을 포함하는 이중특이적 항체 - Google Patents

디술피드 안정화 ― Fv 단편을 포함하는 이중특이적 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중특이적 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

디술피드 안정화 ― Fv 단편을 포함하는 이중특이적 항체 {BISPECIFIC ANTIBODIES COMPRISING A DISULFIDE STABILIZED - FV FRAGMENT}
본 발명은 3가의 이중특이적 항체, 이의 제조 방법, 상기 항체를 함유하는 약학 조성물, 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 다양한 재조합 다중특이적 항체 형식이, 예를 들어, IgG 항체 형식 및 단일 사슬 도메인의 융합에 의한 4가 이중특이적 항체가 개발되어 왔다 (예를 들어, Coloma, M.J., et al, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001077342; 및 Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234 참조).
또한, 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더 이상 유지되지 않는 여러 기타 새로운 형식, 예컨대 2 개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일 사슬 형식 (scFv, Bis-scFv) 이 개발되어 왔다 (Holliger, P., et al, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al, Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297).
모든 이러한 형식은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어, scFv) 에 융합시키거나, 예를 들어, 2 개의 Fab 분절 또는 scFv 에 융합시키기 위한 링커를 사용한다 (Fischer N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 자연 발생적 항체에 대해 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 유지되는 복합체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 작용을 유지하는 것을 원할 수 있음을 숙지한다.
생물학적으로 활성인 항체 이량체의 제조 방법이 US 6,897,044 에 보고되어 있다. 펩티드 링커를 통해 서로 연결되는 4 개 이상의 가변 도메인을 갖는 다가의 FV 항체 구성물이 US 7,129,330 에 보고되어 있다. 이량체 및 다량체 항원 결합 구조가 US 2005/0079170 에 보고되어 있다. 연결 구조에 의해 서로 공유적으로 결합되는 3 개 또는 4 개의 Fab 단편을 포함하는 3가 또는 4가 단일특이적 항원-결합 단백질 (상기 단백질은 천연 면역글로불린이 아님) 이 US 6,511,663 에 보고되어 있다. WO 2006/020258 에서, 4가 이중특이적 항체가 원핵 및 진핵 세포에서 효율적으로 발현될 수 있는 것으로 보고되어 있고, 치료학적 및 진단학적 방법에서 유용하다. 폴리펩티드 이량체의 2 가지 유형을 포함하는 혼합물로부터 하나 이상의 사슬간 디술피드 연결을 통해 연결되지 않고 이량체로부터의 하나 이상의 사슬간 디술피드 연결을 통해 연결되는 이량체를 분리하는 방법, 또는 바람직하게는 이를 합성하는 방법이 US 2005/0163782 에 보고되어 있다. 이중특이적 4가 수용체는 US 5,959,083 에 보고되어 있다. 3 개 또는 그 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 WO 2001/077342 에 보고되어 있다. WO 2007/109254 에서, 안정화된 scFv 를 포함하거나 이로 구성되는 안정화된 결합 분자가 보고되어 있다.
WO 2007/024715 에서는, 조작된 다가의 및 다중특이적 결합 단백질로서의 이중 가변 도메인 면역글로불린이 보고되어 있다.
WO 2011/034605 은, 감긴 코일 및/또는 테터를 사용하여 구축된 조작 단백질 복합체, 복합체를 함유하는 다중특이적 항체 또는 다른 다중특이적 Fc 와 같은 복합체를 제조하는 방법, 이용하는 방법, 및 이를 정제하는 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 하기를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다:
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체;
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때, 둘 모두의 도메인은 디술피드 브릿지를 통해 연결됨),
(이때 VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 오직 하나가 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합됨).
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체가 3가이고, VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 하나가 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄에 융합되는 것을 특징으로 하는, 청구항 제 1 항에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 C-말단에, N-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 청구항 제 2 항에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체가 3가이고 VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 N-말단에, C-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 청구항 제 2 항에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체가 3가이고 VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, N-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에, C-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, N-말단 융합되거나, 또는 VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에, C-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, 이중특이적 항체가 3가이고 VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 하나가 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄에 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 C-말단에, N-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 3가의 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 N-말단에, C-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 3가의 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서, VH2 도메인 및 VL2 도메인이 하기 위치 사이에 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체:
i) VH2 도메인 위치 44 및 VL2 도메인 위치 100,
ii) VH2 도메인 위치 105 및 VL2 도메인 위치 43, 또는
iii) VH2 도메인 위치 101 및 VL2 도메인 위치 100.
(Kabat 넘버링에 따름)
하나의 구현예에서 VH2 도메인 및 VL2 도메인이 VH2 도메인 위치 44 및 VL2 도메인 위치 100 사이에서 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체.
하나의 구현예에서 전장 항체의 중쇄의 제 1 의 CH3 도메인 및 전장 항체의 제 2 의 CH3 도메인이, 항체 CH3 도메인 사이의 변경을 포함하는 계면에서 각각의 전장 항체가 만나는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체로서;
이때,
i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 더욱 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 강에서 위치할 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 융기를 생성하고,
ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서,
아미노산 잔기가 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써, 제 1 의 CH3 도메인의 계면 내의 융기가 위치할 수 있는 곳 내에서 제 2 의 CH3 도메인의 계면 내의 강을 생성한다.
본 발명의 하나의 양태는, 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법이다:
A) a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체; 및 b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때 둘 모두의 도메인은 디술피드 브릿지를 통해 연결됨) 를 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포에서 발현시키는 단계로서,
이때 Fv 단편은,
제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 둘 모두의 C-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 N-말단을 통해 융합되거나, 또는
제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 둘 모두의 N-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 C-말단을 통해 융합되며;
링커 중 하나는 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 단계, 및
B) 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
본 발명의 또다른 양태는 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체의 제조 방법이다:
A) a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체; 및 b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때 둘 모두의 도메인은 디술피드 브릿지를 통해 연결됨) 을 포함하는 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포에서 발현시키는 단계로서,
이때 Fv 단편은,
제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 둘 모두의 C-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 N-말단을 통해 융합되거나, 또는
제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 둘 모두의 N-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 C-말단을 통해 융합되며;
링커 중 하나는 Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 단계; 및
B) 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
하나의 구현예에서, 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 인 방법.
하나의 구현예에서, Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:15 인 방법.
포유동물 세포가, 하나의 구현예에서는 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포이고, 또다른 구현예에서 HEK293 세포 또는 CHO 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
본 발명의 하나의 양태는 그러한 재조합 방법에 의해 수득되는 항체이다.
본 발명의 하나의 양태는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물이다.
본 발명의 하나의 양태는 암 치료를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체이다.
본 발명의 하나의 양태는 암 치료용 약제의 제조를 위한 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 용도이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 항체의 유효량을 그러한 질환을 갖는 것으로 진단된 환자 (및 따라서 그러한 치료가 필요한 환자) 에게 투여하는 것을 포함하는, 예를 들어 암 또는 염증과 같은 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 항체는 바람직하게는 약학 조성물로 투여된다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 한편으로는, 상이한 항원에 대한 이들의 결합으로 인해 생물학적 활성과 같은 귀중한 특성을 나타낸다. 제 2 항원에 결합하는 디술피드 안정화된 Fv 단편은 높은 가요성으로 인한 탁월한 결합 특성을 나타내고 (하나의 펩티드 링커를 통해 전장 항체에 오직 융합되기 때문에) 링커 길이에 상당히 독립적이다.
다른 한편으로는, 이의 안정성, 낮은 응집성 및 약동학적 및 생물학적 특성으로 인해 약학 제형 및 제조에 적합하다. 이의 Ig 코어로 인해, 이들은 ADCC 및 CDC 와 같은 천연 항체의 특성을 여전히 보유한다.
도 1: 전형적인 순서로 가변 및 불변 도메인을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 2 개의 쌍을 갖는 첫번째 항원 1 에 특이적으로 결합하는 CH4 도메인이 없는 전장 항체의 도식적 구조.
도 2a-c: 첫번째 항원 1 에 특이적으로 결합하는 전장 항체 (CH3 도메인에서 임의적인 놉 인투 홀 변형을 가짐) , 및 이의 C 말단에 디술피드-안정화된 Fv 단편의 VH2 또는 VL2 중 하나의 N-말단을 통해 디술피드-안정화된 Fv 단편이 융합되는 두번째 항원 2 에 특이적으로 결합하는 디술피드-안정화된 Fv 단편을 포함하는, 본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체의 도식적 표시.
도 2d: 도 2a 에 나타낸 바와 같은 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 대한 중간체의 예시적인 도식적 표시.
도 3a-b: 첫번째 항원 1 에 특이적으로 결합하는 전장 항체 (CH3 도메인에서 임의적인 놉 인투 홀 변형을 가짐) 를 포함하고, 이의 N-말단에 두번째 항원 2 에 특이적으로 결합하고 디술피드-안정화된 Fv 단편이 디술피드-안정화된 Fv 단편의 VH2 또는 VL2 중 하나의 C-말단을 통해 융합되는, 본 발명에 따른 4가 이중특이적 항체의 도식적 표시.
도 3c: 도 3a 에서 나타낸 바와 같은 본 발명에 따른 이중특이적 항체에 대한 중간체의 예시적인 도식적 표시이다.
도 3d-e: 첫번째 항원 1 및 이의 N 말단에 두번째 항원 2 에 특이적으로 결합하는 디술피드-안정화된 Fv 단편이 특이적으로 결합하는 전장 항체 (CH3 도메인에서 임의적인 놉 인투 홀 변형을 가짐) 가 디술피드-안정화된 Fv 단편의 VH2 또는 VL2 의 C-말단을 통해 융합되는 것을 포함하는, 본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체의 도식적 표시.
도 4: 본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체 유도체의 조성.
a) 본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체 유도체의 모듈 조성,
b) Fv 단편 의 직접적인 어셈블리,
c) 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 산출하기 위한 발현 동안/또는 발현 후 절단되는, 프로테아제 절단 부위를 갖는 제 2 링커를 갖는 중간체를 통해 개선된 어셈블리,
d) 상기 c) 하에서 접근하는 중간체에 대해 단백질 분해성 Processingin 표적 세포 (퓨린에 의해) 또는 시험관내 (Prescission 프로테아제에 의해) 에 대한 인지 서열을 갖는 커넥터-펩티드.
도 5: 이중특이적 dsFv-함유 항체 유도체의 발현 및 정제.
(a) 단백질-A 및 SEC 정제 후 단백질 제조의 환원 SDS Page.
도 6: 프로테아제 절단 전 감소된 결합 친화도: 프로테아제 절단 전 및 후의 이중특이적 항체 유도체의 환원 SDS-Page.
(a) Prescission 절단 부위를 함유하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 감소된 결합 친화도를 갖고 생성되고 Prescission 프로테아제에 노출시 활성화됨.
(b) 퓨린 절단 부위를 함유하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체가 감소된 결합 친화도를 갖고 생성되고 퓨린에 노출시 후속적으로 활성화됨.
도 7: 생세포에 대한 제한된 및 제한되지 않은 3가의 Her3-cMet 이중특이적 항체의 결합.
Her3-발현에 대한 2가의 제한되지 않은 Her3-모듈의 결합, cMet 음성 T47D 세포를 좌측 판넬에 나타냄. Her3-음성, cMet 발현 A549 세포에 대한 상이한 제한된 cMet-모듈의 결합을 우측 판넬에 나타냄. 특이적인 프로테아제에 의한 촉발이 완전한 결합을 야기하고 세포 상의 축적을 야기하는 제한된 모듈에 대한 불량한 결합이 관찰됨.
도 8: 세포성 신호화 검정에서 3가의 Her3-cMet 독립체의 저해 기능성
(a) 인산화-Her3 을 검출하는 웨스턴 블롯은 제한되지 않은 Her3-독립체에 의한 신호화의 간섭을 나타내고,
(b) 인산화-ACT 를 검출하는 ELISA 는, 제한된 형태의 동일한 분자가 더욱 낮은 활성을 가지면서 제한되지 않은 cMet-독립체에 의한 HGF/c-Met 신호화를 효과적으로 간섭함을 나타냄.
도 9: Her3-cMet-3C-FS1 의 환원 SDS PAGE 분석은, 퓨린 가공에 의해 생성되는 생성물 (52 kD, 12 kD) 의 존재를 나타냄.
도 10: 추가의 단일- 및 이중특이적 항체의 도식적 표시.
더욱 낮은 판넬은 퓨린에 의해 가공되기 전 (좌측) 및 퓨린에 의해 가공된 후 (우측), 상이한 표적 항원에 결합하는 본 발명에 따른 이중특이적 항체를 나타냄.
도 11: 이중특이적 퓨린-가공된 dsFv-함유 항체 유도체 VEGFR_Dig_6C_FS1 및 CD22_Dig_6C_FS1 의 발현 및 정제.
정제된 단백질 제제에서 응집물의 거의 완전한 부재 및 균질성을 나타내는 크기 배제 특성이 나타남.
도 12: 단백질-A 및 SEC 정제 후 단백질 제제의 비환원 및 환원 SDS Page 는, 정제된 이중특이적 항체 유도체의 가공 후 균질성 및 올바른 조성을 나타냄.
도 13: 단백질-A 및 SEC 정제 후 단백질 제제의 질량 분광분석은, 정제된 이중특이적 항체 유도체 CD22-Dig 및 VEGFR-Dig 의 가공 후 균질성 및 올바른 조성 (퓨린 가공 공정에서의 완료) 을 나타냄.
도 14: 본 발명에 따른 추가의 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 분석. 상부 판넬: Biacore 분석에 대해, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 대조군 항체는 항-Fc 항체에 의한 칩에 포획되고 세포 표면 상의 표적 항원의 가용성 형태로 노출됨 (= 표적 1). 온/오프 속도는 표준 기술에 의한 결합 곡선으로부터 계산됨. 좌측 판넬: 표적 1 및 표적 2 특이성의 동시적인 결합을 나타내는 LeY-Dig 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 분석.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 표적 1 항원 (제 1 결합 곡선) 의 가용성 형태에 노출된 후 표적 2 항원에 노출된, 항-Fc 항체에 의한 칩에 의해 포획됨. 제 1 결합 곡선의 2nd 항원 유래 곡선 '꼭대기 (on-top)' 의 존재는, 이중특이적 항체에 동시에 결합하는 것을 증명함.
도 15: 본 발명에 따른 추가의 퓨린-가공된이중특이적 항체 CD22-Dig 의 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 분석. 상부 판넬: Biacore 분석에 대해, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 및 대조군 항체는 고정된 표적 1 항원 CD22 에 의하 칩에 포획되었고 이후 표적 2 항원으로서 Dig-siRNA 에 노출됨. 온/오프 속도는 표준 기술에 의한 결합 곡선으로부터 계산됨. 좌측 판넬: CD22-Dig 이중특이적 항체의 표면 플라즈몬 공명에 의한 결합 분석은 표적 1 및 표적 2 특이성의 동시 결합을 나타냄. 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 CD22 결합에 의한 칩에 포획됨. 제 1 의 결합 곡선의 2nd 항원 유래된 곡선 'on-top' 의 출현은, 둘 모두의 항원이 이중특이적 항체에 동시에 결합됨을 증명함.
도 16: 본 발명에 따른 추가의 이중특이적 항체의 생세포로의 결합. FACS 분석에 대해, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 표적 세포로 우선 인큐베이션된 후 이어서 항-huC카파 중 하나로 인큐베이션되거나 (이중특이적 항체를 검출하기 위해), 또는 디곡시게닌화 형광단으로 인큐베이션되며, 이로써, 둘 모두의 특이성의 결합 기능성이 동시에 평가될 수 있음. 세포 연계된 신호는 오직 세포 (표적 1 에 대한 기능성) 에 이중특이적으로 결합할 때만 검출되고 이후 Dig-payload (표적 2 에 대한 기능성) 를 포획할 때 검출됨. 세포 표면 표적을 인지하지 않는 이중특이성은 동일한 실험 세팅에서 현저한 세포 연계 신호를 생성함 (예상되는 바와 같음).
본 발명은
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체;
b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때 둘 모두의 도메인 디술피드 브릿지를 통해 연결됨)
을 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이며,
이때 VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 오직 하나가 펩티드 링커를 통해 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 융합되며 (VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 다른 하나는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄에 펩티드 링커를 통해 융합되지 않음).
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단에, N-말단 융합되는 것을 특징으로 하고; CH1 도메인이, C-말단 VH2 도메인에 N-말단 융합되고, CL 도메인이 C-말단 VL2 도메인에 N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다 (예를 들어, 도 2c 참조).
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 N-말단 에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VL2 도메인이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 경쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는,
a) 이중특이적 항체가 3가이고,
b) VH2 도메인 또는 VL2 도메인 중 하나가, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄에, 펩티드 링커를 통해 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 3가의 이중특이적 항체는, VH2 도메인 또는 VL2 도메인이, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 C-말단에, 펩티드 링커를 통해, N-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 그러한 3가의 이중특이적 항체는, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 N-말단에, 펩티드 링커를 통해, C-말단 융합되는 것을 특징으로 한다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인 및 VL2 도메인이 하기 위치 사이에 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결되는 것을 특징으로 한다:
i) VH2 도메인 위치 44 및 VL2 도메인 위치 100 사이,
ii) VH2 도메인 위치 105 및 VL2 도메인 위치 43 사이, 또는
iii) VH2 도메인 위치 101 및 VL2 도메인 위치 100 사이
(넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, VH2 도메인 및 VL2 도메인이 VH2 도메인 위치 44 및 VL2 도메인 위치 100 사이의 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결된다 (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).
안정화를 위한 비천연 디술피드 브릿지를 도입하기 위한 기술이 예를 들어 하기 문헌에 기술되어 있다: [WO 94/029350, US 5,747,654, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. 10 (1997) 1453-1459; Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Reiter; Y., et al., Protein Engineering; 8 (1995) 1323-1331; Webber, K.O., et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter, Y., et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter, Y., et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter, Y., et al., Inter. J. of Cancer 58 (1994) 142-149, 또는 Reiter, Y., Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718]. 하나의 구현예에서, 단계 b) 및 c) 하의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이의 임의적인 디술피드 결합은, 중쇄 가변 도메인 위치 44 및 경쇄 가변 도메인 위치 100 사이이다. 하나의 구현예에서, 단계 b) 및 c) 하의 폴리펩티드의 가변 도메인 사이의 임의적인 디술피드 결합은, 중쇄 가변 도메인 위치 105 및 경쇄 가변 도메인 위치 43 (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름) 사이이다. 하나의 구현예에서, 단일 사슬 Fab 단편의 가변 도메인 VH 및 VL 사이에서 임의적인 디술피드 안정화가 없는 3가의 이중특이적 항체가 바람직하다.
용어 "전장 항체" 는 2 개의 "전장 항체 중쇄" 및 2 개의 "전장 항체 경쇄" 로 이루어지는 항체를 나타낸다 (도 1 참조). "전장 항체의 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 중쇄 도메인 1 (CH1), 항체 힌지 영역 (HR), 항체 중쇄 불변 도메인 2 (CH2), 및 항체 중쇄 불변 도메인 3 (CH3) (VH-CH1-HR-CH2-CH3 으로 축약됨); 및 서브클래스 IgE 의 항체인 경우 임의로 항체 중쇄 불변 도메인 4 (CH4) 로 이루어지는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 "전장 항체의 중쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 VH, CH1, HR, CH2 및 CH3 으로 이루어지는 폴리펩티드이다. "전장 항체의 경쇄" 는 N-말단에서 C-말단 방향으로 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 및 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 으로 이루어지는 폴리펩티드이다 (VL-CL 으로 축약됨). 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 은 κ(카파) 또는 λ (람다) 일 수 있다. 전장 항체 사슬은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이 및 전장 항체 중쇄의 힌지 영역 사이의 상호-폴리펩티드 다이설파이드 결합을 통해 함께 연결되어 있다. 전형적 전장 항체의 예는 자연 항체 예컨대 IgG (예를 들어 IgG1 및 IgG2), IgM, IgA, IgD, 및 IgE 이다. 발명에 따른 전장 항체는 단일 종 예를 들어 인간으로부터일 수 있거나, 또는 키메라 또는 인간화 항체일 수 있다. 발명에 따른 전장 항체는 동일한 항원에 특이적으로 결합하는 한 쌍의 VH 및 VL 에 의해 각각 형성된 2 개의 항원 결합 자리를 포함한다. 상기 전장 항체의 중쇄 또는 경쇄의 C-말단은 상기 중쇄 또는 경쇄의 C-말단의 마지막 아미노산을 나타낸다.
단계 b) 하의 폴리펩티드의 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 단계 c) 하의 폴리펩티드의 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 의 N 말단은, VH 또는 VL 도메인의 N-말단에서 마지막 아미노산을 나타낸다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "Fv 단편" 은, 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 VH2 도메인 및 VL2 도메인을 지칭하고, 둘 모두의 도메인은 함께 Fv 단편을 형성한다. 본 발명에 따른 이중특이적 항체 내에서 제 2 항원에 결합하는 Fv 단편은 둘 모두의 도메인 VH2 VL2, 즉 도메인 도메인 VH2 도메인 사이의 (사슬간) 디술피드 브릿지를 포함하고, 둘 모두는 안정화를 위한 비천연 디술피드 브릿지를 통해 연결되고, 이는 예를 들어 문헌 [WO 94/029350, US 5,747,654, Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. 10 (1997) 1453-1459; Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Reiter; Y., et al., Protein Engineering; 8 (1995) 1323-1331; Webber, K.O., et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter, Y., et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter, Y., et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter, Y., et al., Inter. J. of Cancer 58 (1994) 142-149, 또는 Reiter, Y., Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718] 에 기술되는 기술에 의해 도입된다
본 발명에 따른 이중특이적 항체 내에서 제 2 항원에 결합하는 Fv 단편의 VH2 VL2 도메인이, 서로 다른 펩티드 링커를 통해 연결되지 않는다 (즉 VH2 VL2 가 단일 사슬 Fv 단편을 형성하지 않음). 따라서, 용어 "VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때, 이때 둘 모두의 도메인은 디술피드 브릿지를 통해 연결됨)" 은, 둘 모두의 도메인이 둘 모두의 도메인 사이에서 오직 공유 연결로서의 디술피드 브릿지만을 통해 연결되며 추가의 공유 연결을 통해 연결되지 않는 Fv 단편을 지칭한다 (예를 들어 펩티드 링커를 통한 단일 사슬 Fv 단편에서와 같음).
Fv 단편의 도메인 VH2 VL2 는, 예를 들어 파지 디스플레이와 같은 다른 기술 또는 전장 항체로부터 유래될 수 있다.
하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 3가의 이중특이적 항체이고, Fv 단편 (제 2 항원에 결합함) 은, 제 1 항원에 결합하는 전장 항체의 중쇄에 융합된다. 본 출원에서 사용되는 용어 "가" 는 항체 분자 내의 특정 수의 결합 자리의 존재를 나타낸다. 예를 들어 자연 항체 또는 발명에 따른 전체 항체는 2 개의 결합 자리를 갖고 이가이다. 그와 같이, 용어 "3가" 는 항체 분자 내의 3 개의 결합 자리의 존재를 나타낸다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "3가, 삼중특이적" 항체는 또다른 항원 (또는 항원의 또다른 에피토프) 에 각각 결합하는 3 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다. 본 발명의 항체는 3 개 또는 4 개의 결합 부위를 가지며, 즉 3가 또는 4가 (바람직하게는 3가) 이고 이중특이적이다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인식을 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다. 이중특이적 항체는, 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 하나 초과의 특이성을 갖는 경우, 인지되는 에피토프는 하나 초과의 항원과 또는 단일 항원과 연계될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단일특이적" 항체는 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
본 발명에 따른 전형적인 3가의 이중특이적 항체를 예를 들어, 도 2a 및 2b, 3d 및 3c 에 나타낸다.
본 발명에 따른 3가 이중특이적 항체에 대해, 2 개의 상이한 중쇄의 헤테로이량화를 증강시키는 CH3 도메인에서의 변형이 특히 유용하다 (도 2a 및 2b, 3d 및 3c 참조).
따라서, 그러한 3 가의 이중특이적 항체에 대해, 본 발명에 따른 상기 전장 항체의 CH3 도메인은, 예를 들어 WO 96/027011, [Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621]; 및 [Merchant, A.M., et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998) 677-681] 에서 여러 예로 상세히 기재된 "놉-인투-홀 (knob-into-holes)" 기술에 의해 변경될 수 있다. 이러한 방법에서 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면이 변경되어 이들 2 개의 CH3 도메인을 함유하는 양쪽 중쇄의 이종이량체화를 증가시킨다. (2 개의 중쇄의) 2 개의 CH3 도메인 각각이 "놉" 일 수 있고, 한편 다른 것은 "홀" 이다. 다이설파이드 브릿지의 도입은 이종이량체를 추가로 안정화시키고 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35), 수율을 증가시킨다.
따라서 본 발명의 하나의 양태에서, 상기 3가의 이중특이적 항체는, 전장 항체의 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 전장 항체의 다른 중쇄의 CH3 도메인이, 각각, 항체 CH3 도메인 사이에서 본래의 계면을 포함하는 계면에서 만나는 것을 추가의 특징으로 하며,
이때 상기 계면은 2가 이중특이적 항체의 형성을 촉진하도록 변경되며,
이때 변경은 a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이, 본래 계면 내에서 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 2가 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 본래 계면을 만나도록 변경되는 것을 특징으로 하고,
아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 강에서 위치할 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내에서 융기를 생성시키는 것을 특징으로 하고;
b) 다른 중쇄의 CH3 도메인이, 제 2 의 CH3 도메인의 본래 계면 내에서 3가의 이중특이적 항체 내에서 제 1 의 CH3 도메인의 본래 계면을 만나도록 변경되고,
아미노산 잔기가 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써 융기가 제 1 의 CH3 도메인의 게면 내에서 위치할 수 있는 내에서 제 2 의 CH3 도메인의 계면 내에서 강을 생성하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게는, 더욱 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는, 더욱 적은 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V) 으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 둘 모두의 CH3 도메인은, 둘 모두의 CH3 도메인 사이의 디술피드 브릿지가 형성될 수 있도록 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에서 아미노산으로서 시스테인 (C) 의 도입에 의해 추가로 변경된다.
바람직한 구현예에서, 상기 3가의 이중특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인에 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다. 예를 들어 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내로 Y349C 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내로 E356C 돌연변이 또는 S354C 돌연변이를 도입함으로써 CH3 도메인 사이의 부가적 사슬간 다이설파이드 브릿지가 또한 사용될 수 있다 (Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16 (1998) 677-681). 따라서 또다른 바람직한 구현예에서, 상기 3가의 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 E356C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함한다 (하나의 CH3 도메인 내의 부가적 Y349C 돌연변이 및 다른 CH3 도메인 내의 부가적 E356C 또는 S354C 돌연변이가 사슬간 다이설파이드 브릿지를 형성함) (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름). 그러나 EP 1 870 459A1 에 기재된 다른 놉-인-홀 기술이 대안적으로 또는 부가적으로 또한 사용될 수 있다. 상기 이중특이적 항체의 바람직한 예는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다 (넘버링은 항상 Kabat 의 EU 인덱스에 따름).
또다른 바람직한 구현예에서 상기 3가의 이중특이적 항체는 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 T366W 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
또다른 바람직한 구현예에서 상기 3가의 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이를 포함하거나, 또는 상기 이중특이적 항체는 2 개의 CH3 도메인 중 하나에 Y349C, T366W 돌연변이 및 2 개의 CH3 도메인 중 다른 하나에 S354C, T366S, L368A, Y407V 돌연변이 및 부가적으로 "놉 사슬" 의 CH3 도메인 내에 R409D; K370E 돌연변이 및 "홀 사슬" 의 CH3 도메인 내에 D399K; E357K 돌연변이를 포함한다.
본 발명에 따른 이중특이적 항체는 상이한 항원-결합 부위를 포함한다. 전장 항체는 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 2 개의 동일한 항원-결합 부위, 및 항체 중쇄 가변 도메인 VH2 를 포함하는데, 디술피드 안정화된 Fv 단편의 항체 경쇄 가변 도메인 VL2 은 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 항원 결합 부위를 함께 형성한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "결합 부위" 또는 "항원-결합 부위" 는, 각 항원이 실제로 특이적으로 결합하는 본 발명에 따른 상기 이중특이적 항체의 영역(들)을 나타낸다. 전장 항체 또는 Fv 단편에서 항원 결합 부위는, 항체 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인 (VH) 으로 이루어지는 쌍에 의해 각각 형성된다.
원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 부위는, 특히 이의 항원 단백질 또는 핵산 또는 단편 또는 파지 디스플레이를 사용하는 드 노보 면역화 방법에 의해 수득되는 a) 항원에 대해 공지된 항체로부터 또는 b) 신규 항체 또는 항체 단편으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 항체의 항원-결합 부위는, 항원에 대한 결합 부위의 친화도 정도에 기여하는 6 개의 상보 결정 영역 (CDR) 을 함유한다. 3 개의 중쇄 가변 도메인 CDR (CDRH1, CDRH2 및 CDRH3) 및 3 개의 경쇄 가변 도메인 CDR (CDRL1, CDRL2 및 CDRL3) 이 존재한다. CDR 및 골격 영역 (FR) 의 정도는, 영역이 서열 중에서 가변성에 따라 정의되는 아미노산 서열의 편집된 데이터베이스에 비교하여 측정된다.
항체 특이성은 항원의 특정 에피토프에 대한 항체의 선택적 인지를 지칭한다. 예를 들어, 천연 항체는 단일특이적이다. 본 발명에 따른 "이중특이적 항체" 는 2 개의 상이한 항원-결합 특이성을 갖는 항체이다. 항체가 하나 초과의 특이성을 갖는 경우, 인지되는 에피토프는 단일 항원 또는 하나 초과의 항원과 연계될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단일특이적" 항체는 이의 각각이 동일한 항원의 동일한 에피토프에 결합하는 하나 이상의 결합 부위를 갖는 항체를 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 용어 "가" 는 항체 분자 내의 특정 수의 결합 자리의 존재를 나타낸다. 예를 들어 자연 항체 또는 발명에 따른 전체 항체는 2 개의 결합 자리를 갖고 2가이다. 그와 같이, 용어 "3가" 는 항체 분자 내의 3 개의 결합 자리의 존재를 나타낸다. 그와 같이, 용어 "4가" 는 항체 분자 내의 3 개의 결합 부위의 존재를 나타낸다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 3가 또는 4가이다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 3가이다.
본 발명의 전장 항체는 하나 이상의 면역글로불린 클래스의 면역글로불린 불변 영역을 포함한다. 면역글로불린 클래스는 IgG, IgM, IgA, IgD, 및 IgE 아이소타입 (IgG 및 IgA 의 경우에서는 이들의 하위유형) 을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 전장 항체는 IgG 유형 항체의 불변 도메인 구조를 갖는다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "단일클론 항체" 또는 "단일클론 항체 조성물" 은 단일 아미노산 조성물의 항체 분자의 제조를 지칭한다.
"키메라 항체" 라는 용어는 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는, 하나의 원천 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 상이한 원천 또는 종 유래의 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 말한다. 쥐과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체" 의 기타 바람직한 유형은 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 유형들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "계열-스위칭 항체" 로서 언급된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체의 제조 방법에는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함되고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호를 참조한다.
"인간화 항체" 라는 용어는 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥐과 CDR 을 인간 항체의 골격 영역 내에 그래프트시켜 "인간화 항체" 를 제조한다. 예를 들어, [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 를 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라 항체에 대해 상기 주목된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체" 의 기타 형태는 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 부가적으로 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화 시, 내생 면역글로불린 생성 부재시에도 인간 항체의 전체 레퍼토아 또는 셀렉션을 생성할 수 있는 유전자 도입 동물 (예를 들어, 마우스) 에서 생성될 수 있다. 이러한 생식선 돌연변이체 마우스에서의 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 접종시 인간 항체 제조라는 결과를 낳을 것이다 (예를 들어, [Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258]; [Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40] 참고). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). [Cole et al. 및 Boerner et al.] 의 기술은 또한 인간 모노클론 항체의 제조에 이용가능하다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는 또한 불변 영역에 개질이 일어나, 예를 들어, "계열 스위칭" 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이 (예를 들어, IgG1 에서 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이로) 에 의해, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 그러한 항체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 인간 항체" 라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 제작되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 HEK293 세포, 및 CHO 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 유전자 도입된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리된 항체가 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이에 적용된다. 그러므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 서열인 반면, 생체 내 인간 항체 생식선 레퍼토아 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 도메인" (경쇄 (VL) 의 가변 도메인, 중쇄 (VH) 의 가변 영역) 은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 각각의 도메인은 3 개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된, 그 서열이 널리 보존되는 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 형태를 취하며, CDR 은 β-시트 구조와 연결되는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내의 CDR 은 골격 영역에 의해 그들의 3 차원 구조를 유지하며, 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.
본원에서 사용되는 경우 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분" 이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 각각의 사슬 상의 CDR 은 이러한 골격 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.
본원에서 사용되는 용어 "결합" 또는 "특이적으로 결합하는" 은 시험관내 검정에서, 바람직하게는 정제된 야생형 항원을 이용하는 플라스몬 공명 분석 (BIAcore, GE-Healthcare Uppsala, Sweden) 에서 항원의 에피토프에 대한 항체의 결합을 나타낸다. 결합 친화성은 ka (항체/항원 복합체로부터의 항체의 연합에 불변인 비율), kD (해리 상수), 및 KD (= kD/ka) 값으로 정의된다. '결합' 또는 '특이적으로 결합하는' 이란, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 M 의 결합 친화도 (KD) 를 의미한다. 따라서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 각 항원이 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 바람직하게는 10-9 M 내지 10-13 M 의 결합 친화도 (KD) 로 특이성을 갖고 특이적으로 결합한다.
"에피토프" 라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정소를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정소에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹이 포함되며, 특정 구현예에서는 특이적 3 차원 구조 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다.
특정 구현예에서는, 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우 상기 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.
발명에서 사용되는 용어 "펩티드 링커" 는 예를 들어 합성 기원의, 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다. 본 발명에 따른 이들 펩티드 커넥터는, 전장 항체의 중쇄 C- 또는 N-말단에 대한 제 2 항원에 디술피드 안정화된 Fv 단편을 융합 결합시키는데 사용된다. 바람직하게는 상기 펩티드 링커는 5 개 이상 아미노산 길이, 바람직하게는 10 내지 100 개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 25 내지 50 개 아미노산 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 하나의 구현예에서 상기 펩티드 링커는 예를 들어, (GxS)n 또는 (GxS)nGm [식 중, G = 글리신, S = 세린, 및 (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0 임] 이다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 항체 내에서 사용되는 바와 같은 "펩티드 링커" 는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는다. 펩티드 링커의 각 말단은 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, VH 도메인, VL 도메인, 항체 중쇄, 항체 경쇄, CH1-VH 사슬 등) 에 접합된다.
하기 기술되는 바와 같은 중간체 항체에 대해 사용되는 용어 "펩티드 링커" (이는 발현 동안 또는 발현 후 본 발명에 따른 항체로 가공됨) 는, 예를 들어 합성 기원의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 나타낸다. 바람직하게는 상기 펩티드 링커는 5 개 이상 아미노산 길이, 바람직하게는 5 내지 100 개 아미노산 길이, 더욱 바람직하게는 10 내지 50 개 아미노산 길이의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다. 펩티드 링커의 각 말단은 하나의 폴리펩티드 사슬 (예를 들어, VH 도메인, VL 도메인, 항체 중쇄, 항체 경쇄, CH1-VH 사슬 등) 에 접합된다.
중간체 이중특이적 항체 내의 펩티드 링커 중 하나는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않고 상기 기술되는 바와 같은 본 발명에 따른 최종 이중특이적 항체의 펩티드 링커와 동일하다. 하나의 구현예에서, 프로테아제 절단 부위를 갖지 않는 상기 펩티드 링커는 예를 들어 (GxS)n 또는 (GxS)nGm [식 중, G = 글리신, S = 세린, 및 (x = 3, n = 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3) 또는 (x = 4, n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0, 1, 2 또는 3), 바람직하게는 x = 4 및 n = 2, 3, 4, 5 또는 6, 및 m = 0 임] 이다.
하기 기술되는 바와 같은 중간체 항체의 기타 펩티드 링커는, 예를 들어, 발현 동안 (예를 들어, 퓨린에 의해) 또는 발현(/및 정제) 후 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함한다. 일반적으로 펩티드 링커 내의 프로테아제 절단 자리는 프로테아제에 의해 절단되는 아미노산 서열 또는 모티프이다. 상이한 프로테아제에 대한 자연 또는 합성 프로테아제 절단 자리가 예를 들어 [Database, Vol. 2009, Article ID bap015, doi:10.1093/database/bap015] 및 [referred MEROPS peptide database (http://merops.sanger.ac.uk/)] 에 기재되어 있다. 퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위는 예를 들어, QSSRHRRAL (퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 1 - SEQ ID NO. 13 의 FS1), 또는 LSHRSKRSL (퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 2 - SEQ ID NO. 14 의 FS2) 이다. PreScission 특이적인 프로테아제 절단 부위는 예를 들어, QSSRHRRAL (PreScission 특이적인 프로테아제 절단 부위 (SEQ ID NO. 15)) LEVLFQGP 이다.
퓨린은, 인간에서 퓨린 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이고 엔도 펩티다아제에 속한다 (엔도펩티다아제: 세린 프로테아제/세린 엔도펩티다아제 (EC 3.4.21)). 이는, FES 으로서 공지된 종양유전자의 업스트림 영역에서 존재하기 때문에 퓨린이라 불린다. 이 유전자는 FUR (FES 업스트림 영역) 으로서 알려져 있으며 따라서 단백질은 퓨린이라 불린다. 또한, 퓨린은 PACE (한 의 기본 미노산 소) 로서 공지되어 있다. 이러한 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 서브틸리신-유사 전단백질 전환효소 패밀리에 속하는 효소이다. 이러한 패밀리의 구성원은 잠재성 전구체 단백질을 이의 생물학적으로 활성인 생성물로 가공하는 전단백질 전환효소이다. 이는 이의 쌍으로 된 기본 아미노산 가공 부위에서 전구체 단백질을 효율적으로 절단할 수 있는 칼슘-의존적 세린 엔도프로테아제이다. 이의 기질 중 몇몇은 하기이다: 프로파라티오로이드 호르몬, 변형 성장 인자 베타 1 전구체, 프로알부민, 프로-베타- 세크리타아제, 막 유형-1 매트릭스 메탈로프로페아제, 전-신경 성장 인자의 베타 서브유닛 및 본 빌브랜드 팩터 (von Willebrand factor). 퓨린-유사 전-단백질 전환효소는 RGM (또한 헤모주벨린 (Hemojuvelin) 으로도 불림) (쥬벨린 헤모크로마토시스라 불리는 심각한 철-오버로드 장애와 관련된 유전자) 의 가공에 관련되었다. 둘 모두의 Ganz 및 Rotwein 그룹은, 퓨린-유사 전단백질 전환효소 (PPC) 가, 보존된 다기본 RNRR 부위에서, 끝을 자른 COOH-말단을 갖는 50 kDa HJV 내지 40 kDa 단백질의 전환에 책임이 있다. 이는, 설치류 및 인간의 혈액에서 발견되는 HJV/헤모쥬벨린 (s-헤모쥬벨린) 의 가용성 형태를 생성하기 위해 잠재적인 기전을 제안한다. 퓨린은 많은 포유동물 세포 (예를 들어, HEK293, CHO) 의 세포 표면 상의 몇몇 경우에서, 트랜스-골지 네트워크에서, 세포내 흡입 및 분비 베지클에서 존재한다. 이의 인지 부위는, 존재하는 다양한 분비되는 전구체 단백질 예컨대 프로-TGF 또는 프로-반 빌브랜드 팩터 (van Willebrand factor) 이 존재하는 모티프 RXK/RR 을 빈번히 함유한다. 따라서, 본 발명자들은 커넥터 서열을 함유하는 2 개의 퓨린 부위를 생성하기 위한 이들 인지 서열을 선택하였다 (퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 1 - SEQ ID NO:13 의 FS1 및 퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 2 - SEQ ID NO:14 의 FS2).
PreScission 프로테아제 (GE Healthcare Catalogue No. 27-0843-01) 는, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 및 GST 로 이루어진 유전적으로 조작된 융합 단백질이다. 이러한 프로테아제는, pGEX-6P 벡터 pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, 및 pGEX-6P-3; 참조, pGEX 벡터 ( GST 유전자 융합 시스템) 로부터 생산되는 GST 융합 단백질의 절단 및 동시에 프로테아제 고정을 허용함으로써, 프로테아제의 제거를 촉진하기 위해 특이적으로 설계되었다. PreScission 프로테아제는 LeuGluValLeuPheGln/GlyPro 의 인지 서열의 Gln 및 Gly 잔기 사이를 특이적으로 절단한다 (Walker, P.A., et al., BIO/TECHNOLOGY 12, (1994) 601-605; Cordingley, M.G., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 9062-9065).
본 발명에 따른 이중특이적 항체는, 생물학적 또는 약리학적 활성과 같은 귀중한 특성을 약물동태학 특성과 같은 귀중한 특징을 갖는다. 이들은, 예를 들어 암과 같은 질병의 치료를 위해 사용될 수 있다.
추가의 구현예에서, 본 발명에 따른 이중특이적 항체는 ErbB3 및 c-Met 에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "불변 영역" 은, 가변 영역과는 상이한 항체의 도메인의 합을 나타낸다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 다음 계열로 나뉜다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이들의 수 개는 하기의 서브클래스로 추가로 나뉠 수 있다: 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4, IgA1 및 IgA2. 항체의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ 로 불린다. 5 개의 항체 클래스에서 발견될 수 있는 경쇄 불변 영역 (CL) 은, κ(카파) 및 λ (람다) 로 불린다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "인간 기원으로부터 유래되는 불변 영역" 은, 서브클래스 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 의 인간 항체의 불변 중쇄 영역 및/또는 불변 경쇄 카파 또는 람다 영역을 나타낸다. 그러한 불변 영역은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 Kabat, E.A. 에 의한 문헌에 기술되어 있다 (참조, 예를 들어, [Johnson, G., 및 Wu, T.T., 핵산s Res. 28 (2000) 214-218; Kabat, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975) 2785-2788]).
IgG4 서브클래스의 항체가 감소된 Fc 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 나타내는 반면, IgG 서브클래스의 항체는 강한 결합을 나타낸다. 그러나, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 손실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, 및 His435 은, 변경되는 경우 감소되는 Fc 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434).
하나의 구현예에서, 본 발명에 따른 항체는, IgG1 항체에 비해 감소된 FcR 결합을 가지며, 전장 모 항체는 IgG4 서브클래스의 또는 S228, L234, L235 및/또는 D265 에서 돌연변이를 갖는 IgG1 또는 IgG2 서브클래스의, FcR 결합에 관한 것이고/이거나 PVA236 돌연변이를 함유한다. 하나의 구현예에서 전장 모 항체에서 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236 이다. 또다른 구현예에서, 전장 모 항체에서 돌연변이는 IgG4 S228P 및 IgG1 L234A 및 L235A 에서 존재한다.
항체의 불변 영역은, ADCC (항체-의존적 세포-중재된 세포독성) 및 CDC (상보-의존적 세포독성) 에 직접 연계된다. 상보 활성화 (CDC) 는, 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 불변 영역에 대한 상보 인자 C1q 의 결합에 의해 개시된다. C1q 의 항체로의 결합은, 소위 결합 부위에서 정의된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 이러한 결합 부위는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324]; 및 EP 0 307 434 에 기재되어 있다. 이러한 불변 영역 결합 부위는 예를 들어 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링, 하기 참조) 을 특징으로 한다.
용어 "항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)" 은, 효과기 세포의 존재 하에서 본 발명에 따른 항체에 의한 인간 표적 세포의 용균을 지칭한다. ADCC 는, 모노사이트 또는 자연 킬러 (NK) 세포 또는 영구히 성장하는 NK 세포주와 같은, 버피 코트로부터 정제된 효과기 세포 또는 신선하게 단리된 PBMC 와 같은 효과기 세포의 존재 하에 본 발명에 따른 항체를 이용하여 항원 발현 세포의 제조의 처리에 의해 바람직하게는 측정된다.
용어 "상보-의존성 세포독성 (CDC)" 은, 대부분의 IgG 항체 서브클래스의 Fc 부분에 대한 상보 인자 C1q 의 결합에 의해 개시되는 과정을 나타낸다. 항체에 대한 C1q 의 결합은, 소위 결합 부위에서 규정된 단백질-단백질 상호작용에 의해 야기된다. 그러한 Fc 부분 결합 부위는 당업계에 공지되어 있다 (상기 참조). 그러한 Fc 부분 결합 부위은, 예를 들어, 아미노산 L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, 및 P329 을 특징으로 한다 (넘버링은 Kabat 의 EU 인덱스에 따름). 서브클래스 IgG1, IgG2, 및 IgG3 의 항체는 통상 C1q 및 C3 결합을 포함하는 상보 활성화를 나타내는 반면, IgG4 는 상보계를 활성화시키기 않고 C1q 및/또는 C3 에 결합하지 않는다.
단일클론 항체의 세포-중재 효과기 기능은, 예를 들어 문헌 [Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 US 6,602,684 에서 기술되는 바와 같은 이들의 올리고사카라이드 성분을 조작함으로써 증강될 수 있다. IgG1 유형 항체 (가장 통상 사용되는 치료용 항체) 는, 각각 CH2 도메인에서 Asn297 에서 보존된 N-링크된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질이다. Asn297 에 부착된 2 개의 착물 이중안테나 올리고사카라이드는 CH2 도메인 사이에서 매장되어 있으며, 폴리펩티드 골격과의 광대한 접촉을 형성하고, 이의 존재는 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 기능을 중재하기 위해 항체에 필수적이다 (Lifely, M..R., et al., Glycobiology 5 (1995) 813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163 (1998) 59-76; Wright, A., 및 Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15 (1997) 26-32). 문헌 [Umana, P., et al. Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180] 및 WO 99/154342 는, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 III ("GnTIII") 시험관내 항체의 ADCC 활성을 현저히 증가시키는, 2등분된 올리고사카라이드의 형성을 촉매작용하는 글리코실트랜스퍼라아제의 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서의 과다발현을 나타냈다. Asn297 탄수화물의 조성에서의 변경 또는 이의 제거는 또한 FcγR 및 C1q 로의 결합에 영향을 미친다 (Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74 (2001) 288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002) 26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263 (2002) 133-147).
단일클론 항체의 세포-중재 효과기 기능을 증강시키는 방법은 예를 들어 WO 2005/044859, WO 2004/065540, WO2007/031875, 문헌 [P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180], WO 99/154342, WO 2005/018572, WO 2006/116260, WO 2006/114700, WO 2004/065540, WO 2005/011735, WO 2005/027966, WO 1997/028267, US 2006/0134709, US 2005/0054048, US 2005/0152894, WO 2003/035835 및 WO 2000/061739 또는 예를 들어, 문헌 [Niwa, R., et al., J. Immunol. Methods 306 (2005) 151-160]; [Shinkawa, T., et al., J. Biol. Chem. 278 (2003) 3466-3473]; WO 03/055993 및 US 2005/0249722 에 보고되어 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 이중특이적 항체는, (IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브클래스의 Fc 부분, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 Fc 부분을 포함하는 경우) Asn297 에서 당 사슬로 글리코실화되며, 이로 인해 상기 당 사슬 내에서 푸코오스의 양이 65 % 이하이다 (넘버링은 Kabat 에 따름). 또다른 구현예에서, 상기 당 사슬 내에서 푸코오즈의 양은 5 % 내지 65 % 이고, 바람직하게는 20 % 내지 40 % 이다. 대안적인 구현예에서, 푸코오즈의 양은, Asn297 에서 Fc 영역의 올리고사카라이드의 0% 이다. 본 발명에 따른 "Asn297" 은 Fc 영역에서 대략 위치 297 에서 위치하는 아미노산 아스파라긴을 의미한다. 항체의 소수의 서열 변이를 기초로 하여, Asn297 는 또한 위치 297 의 몇몇 아미노산 (통상적으로 +3 이하의 아미노산) 업스트림 또는 다운스트림에서, 즉 위치 294 내지 300 에서 위치할 수 있다. 하나의 구현예에서 본 발명에 따른 글리코실화 항체에서 IgG 서브클래스는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 서브클래스 또는 IgG3 서브클래스이다. 추가의 구현예에서, N-글리코릴뉴라민산 (NGNA) 의 양은 1% 이하이고/이거나 N-말단 알파-1,3-갈락토오스의 양은 상기 당 사슬 내에서 1% 이하이다. 당 사슬은 바람직하게는 CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체의 Asn297 에 부착되는 N-연결된 글리칸의 특징을 나타낸다.
용어 "CHO 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체의 Asn297" 에 부착되는 N-연결된 글리칸의 특성을 나타내는 당 사슬" 은, 본 발명에 따른 전장 모 항체의 Asn297 에서 당 사슬이 WO 2006/103100 에서 보고되는 바와 같이 변형되지 않은 CHO 세포에서 발현되는 동일한 항체의 것과 같은 푸코오즈 잔기를 예외로 하는 당 잔기 서열 및 동일 구조를 갖는다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "NGNA" 는, 당 잔기 N-글리콜릴뉴라민산을 나타낸다.
인간 IgG1 또는 IgG3 의 글리코실화는 Asn297 에서 2 개 이하의 Gal 잔기를 갖는 말단의 푸코실화 이중안테나 복합체 올리고사카라이드 코어로서 발생한다.
IgG1 또는 IgG3 서브클래스의 인간 불변 중쇄 영역은 문헌 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), 및 by Bruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527] 에 의해 상세히 보고되어 있다. 이들 구조는, 말단 Gal 잔기의 양에 따라 G0, G1 (α-1,6- 또는 α-1,3-), 또는 G2 글리칸 잔기로서 지정된다 (Raju, T.S., Bioprocess Int. 1 (2003) 44-53). 항체 Fc 부분의 CHO 유형 글리코실화는 예를 들어 문헌 [Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14 (1997) 201-207] 에 기술되어 있다. 비-글리코변형된 CHO 숙주 세포에서 재조합적으로 발현되는 항체는 통상적으로 Asn297 에서 85% 이상의 양으로 푸코실화된다. 전장 모 항체의 변형된 올리고사카라이드는 하이브리드되거나 복합체화될 수 있다. 바람직하게는, 2등분된, 환원된/푸코실화되지 않은 올리고사카라이드가 하이브리드된다. 또다른 구현예에서, 2등분된, 환원된/푸코실화되지 않은 올리고사카라이드는 복합체이다.
본 발명에 따라 "푸코오즈의 양" 은, Asn297 에서 당 사슬 내에서 상기 당의 양을 의미하며, 평균 값으로서 계산되고 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정된 Asn297 에 부착된 모든 글리코구조의 합 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노오즈 구조) 에 관련된다 (예를 들어, WO 2008/077546 참조). 푸코오즈의 관련 양은 MALDI-TOF 에 의한 N-글리코시다아제 F 처리된 샘플에서 확인되는 모든 글리코구조 (예를 들어, 각각 복합체, 하이브리드, 및 올리고- 및 고-만노오즈 구조) 에 관한 푸코오즈-함유 구조의 백분율이다.
발명에 따른 항체는 재조합 수단에 의해 생산된다. 따라서, 본 발명의 하나의 양상은 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산이고, 추가의 양상은 발명에 따른 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 세포이다. 재조합 생산 방법은 당업계에 널리 알려져 있고, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현 및 그 후 항체의 단리 및 통상적으로 약학적으로 허용가능한 순도까지의 정제를 포함한다. 숙주 세포에서 상기와 같은 항체의 발현을 위해, 각각의 수식 경쇄 및 중쇄를 인코딩하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터 내로 삽입된다. 발현은 적당한 원핵 또는 진핵 숙주 세포 예컨대 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, PER.C6 세포, 효모, 또는 대장균 세포에서 실시되고, 항체는 세포 (상청액 또는 용해 후 세포) 로부터 회수된다. 항체의 일반적 재조합 생산 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 리뷰 논문 Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880 에 기재되어 있다.
이중특이적 항체는 적합하게는 배양 배지로부터 종래의 면역글로불린 정제 절차 예컨대, 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화성 크로마토크래피에 의해 분리된다. 단일클론 항체를 인코딩하는 DNA 및 RNA 는 종래의 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA 및 RNA 의 공급원으로서의 역할을 할 수 있다. 일단 단리되면, DNA 는 발현 벡터 내로 삽입될 수 있고, 그 후 발현 벡터로 그렇지 않은 경우 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포 예컨대 HEK 293 세포, CHO 세포, 또는 골수종 세포를 트랜스펙션시켜, 숙주 세포에서 재조합 단일클론 항체가 합성된다.
이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이체) 는 항체 DNA 내로 적당한 뉴클레오타이드 변화를 도입함으로써, 또는 뉴클레오티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 수식은, 그러나, 매우 제한 범위에서, 예를 들어 위에 기재된 바와 같이, 실시될 수 있다. 예를 들어, 수식은 위에 언급된 항체 특성 예컨대 IgG 아이소형 및 항원 결합을 변경하지 않으나, 재조합 생산의 수율, 단백질 안정성을 개선하거나 정제를 촉진할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "숙주 세포" 는 본 발명에 따른 항체를 생성하도록 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포계를 나타낸다. 하나의 구현예에서 HEK293 세포 및 CHO 세포는 숙주 세포로서 사용된다. 본원에서 사용되는, 발현 "세포," "세포주" 및 "세포 배양" 은 호환되게 사용되고, 모든 그러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 전달의 수에 관계 없이 그로부터 유래하는 주제 세포 및 배양물을 포함한다. 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지 않을 것이라고 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. NS0 세포에서의 발현이, 예를 들어, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270 에 기재되어 있다. 일시적 발현이, 예를 들어, Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9 에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝이 Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87 에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 이 Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., Cytotechnology 30 (1999) 71-83 및 Schlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199 에 기재되어 있다.
원핵생물에 적합한 제어 서열은, 예를 들어, 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 자리를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때 "작동적으로 연결된" 다. 예를 들어, 전구서열 또는 분비 리더에 대한 DNA 는 그것이 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결된다; 프로모터 또는 인핸서는 그것이 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다; 또는 리보솜 결합 자리는 그것이 해독을 촉진하도록 위치하는 경우 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 일반적으로, "작동적으로 연결된" 은 연결된 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우, 인접하고 해독 프레임 내에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요가 없다. 연결은 가까운 제한 자리에서의 결찰에 의해 달성된다. 그러한 자리가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커는 종래의 관습에 따라 사용된다.
항체의 정제는 세포 성분 또는 기타 오염물질, 예를 들어 기타 세포 핵산 또는 단백질을 제거하기 위해, 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 칼럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동, 및 기타 당업계에 잘 알려진 것들을 포함하는 표준 기술에 의해 실시된다. Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 참조. 단백질 정제를 위한 상이한 방법, 예컨대 미생물 단백질을 이용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합 방식의 교환), 호황성 흡착 (예를 들어 베타-메르캅토에탄올 및 기타 SH 리간드를 이용함), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로스, 아자-아레노필릭 수지, 또는 m-아미노페닐보론산을 이용함), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질을 이용함), 크기 배제 크로마토그래피, 및 전기영동법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이 잘 정립되어 있고 널리 사용된다.
발명의 하나의 양상은 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물이다. 발명의 또다른 양상은 약학적 조성물의 제조를 위한 발명에 따른 항체의 용도이다. 발명의 추가의 양상은 발명에 따른 항체를 포함하는 약학적 조성물의 제조 방법이다. 또다른 양상에서, 본 발명은 약학적 담체와 함께 제형화된, 본 발명에 따른 항체를 함유하는 조성물, 예를 들어 약학적 조성물을 제공한다.
발명의 하나의 구현예는 암 치료를 위한 발명에 따른 3가의 이중특이적 항체이다.
발명의 또다른 양상은 암 치료를 위한 상기 약학적 조성물이다.
발명의 또다른 양상은 암 치료용 약제의 제조를 위한 발명에 따른 항체의 용도이다.
발명의 또다른 양상은 암을 앓는 환자의 치료 방법으로서 발명에 따른 항체를 그러한 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법이다.
본원에서 사용되는 "약학적 담체" 는 생리적으로 적합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장화 및 흡수지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한) 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여에 적합하다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자에게 잘 인식될 바와 같이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 특정 투여 경로에 의해 발명의 화합물을 투여하기 위해, 화합물을 그것의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 그 물질과 함께 동시투여해야 할 수도 있다. 예를 들어, 화합물은 대상에게 적당한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 중에 투여될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 희석제는 식염수 및 수성 완충 용액을 포함한다. 약학적 담체는 멸균 수성 용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 그러한 매질 및 물질의 사용이 당업계에 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 구절 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는" 은 경장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 통상적으로 주사에 의하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 각피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "암" 은 증식성 질환, 예컨대 림프종, 림프성 백혈병, 폐암, 소세포 폐 (NSCL) 암, 세기관지 세포 폐암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부 암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 대장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경관 암종, 질 암종, 음문 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 콩팥 또는 수뇨관 암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담관암, 중추신경계 (CNS) 의 신생물, 척추 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 상의세포종, 수모세포종, 뇌수막종, 편평 세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유윙 육종, 상기 임의의 암의 난치성 형태, 또는 상기 암 하나 이상의 조합을 나타낸다.
이들 조성물은 보조제 예컨대 보존제, 습윤화제, 유화제 및 분산제를 또한 함유할 수 있다. 미생물의 존재의 방지는 상기 멸균 절차에 의해, 및 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 등장화제, 예컨대 당, 염화 나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 겔라틴의 포함에 의해 주사용 약학적 형태의 지연된 흡수가 초래될 수 있다.
선택된 투여 경로에 관계 없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는, 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 종래의 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 투여 형태 내로 제형화된다.
환자에게 독성이 아니면서, 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에서 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록, 본 발명의 약학적 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준이 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 이용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 이용되는 특정 화합물의 배설 속도, 치료 지속기간, 이용되는 특정 조성물과 조합되어 사용되는 기타 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적 건강 및 이전 병력 등 의학 분야에서 잘 알려진 인자를 포함하는 다양한 약동학적 인자에 따라 다를 것이다.
조성물은 멸균되어야 하고 조성물이 주사기에 의해 전달가능할 정도로 유체여야 한다. 물에 더하여, 담체는 바람직하게는 등장성 완충 식염수이다.
예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 원하는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유체성이 유지될 수 있다. 많은 경우, 등장화제, 예를 들어 당, 다가알코올 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화 나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는, 용어 "세포," "세포주" 및 "세포 배양" 은 호환되게 사용되고, 모든 그러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 는 전달의 수에 관계 없이 그로부터 유래하는 1차 주제 세포 및 배양물을 포함한다. 의도적 또는 우발적 돌연변이로 인해, 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 동일하지 않을 것이라고 또한 이해된다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 별도의 지정이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 분명할 것이다.
본원에서 사용되는 용어 "형질전환" 은 숙주 세포 내로의 벡터/핵산의 전달 과정을 나타낸다. 가공할 세포 벽 장벽이 없는 세포가 숙주 세포로서 사용되는 경우, 트랜스펙션은 예를 들어 Graham, F.L., and van der Eb, A.J., Virology 52 (1973) 456-467 에 기재된 인산 칼슘 침전법에 의해 실시된다. 그러나, DNA 를 세포 내로 도입하는 다른 방법 예컨대 핵 주입 또는 원형질 융합이 또한 사용될 수 있다. 실질적 세포벽 구조를 함유하는 원핵 세포 또는 세포가 사용되고, 예를 들어 트랜스펙션 방법의 하나는 Cohen, S.N, et al, PNAS. 69 (1972) 2110-2114 에 기재된 염화 칼슘을 사용하는 칼슘 처리이다.
본원에서 사용되는 "발현" 은 핵산이 mRNA 로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA (또한 전사체로도 언급됨) 가 그 후 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 해독되는 과정을 나타낸다. 전사체 및 인코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 유전자 산물로 언급된다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 에서 유래하는 경우, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA 의 스플라이싱을 포함할 수 있다.
"벡터" 는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및/또는 숙주 세포 사이에 전달하는 핵산 분자, 특히 자가-복제 핵산 분자이다. 상기 용어는 DNA 또는 RNA 의 세포 내로의 삽입 (예를 들어, 염색체 통합) 을 위해 주로 기능하는 벡터, DNA 또는 RNA 의 복제를 위해 주로 기능하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA 의 전사 및/또는 해독을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한 포함되는 것은 위에 기재된 기능 하나 초과를 제공하는 벡터이다.
"발현 벡터" 는, 적당한 숙주 세포 내로 도입되었을 때, 폴리펩티드로 전사 및 해독될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템" 은 통상적으로 원하는 발현 산물을 산출하도록 기능할 수 있는 발현 벡터로 구성된 적합한 숙주 세포를 나타낸다.
하기 실시예, 서열 목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 청구항에 제시되어 있다. 발명의 정신에서 벗어나지 않으면서 제시된 절차에 변형이 가해질 수 있다고 이해된다.
아미노산 서열의 설명
Figure 112013016339437-pct00001
실험 절차
실시예
재조합 DNA 기술
문헌 [Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA 를 조작했다. 분자 생물학적 시약을 제조사의 지침에 따라 사용했다.
DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리
인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 서열에 관한 일반 정보가 Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242 에 제시되어 있다. 항체 사슬의 아미노산을 EU 넘버링 (Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242) 에 따라 넘버링한다. GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 의 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax's Vector NTI Advance 묶음 버전 8.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석달기 및 설명에 사용했다.
DNA 서열분석
SequiServe (Vaterstetten, Germany) 및 Geneart AG (Regensburg, Germany) 에서 이중 나선 서열분석을 실시하여 DNA 서열을 확인했다.
유전자 합성
원하는 유전자 분절을 Geneart AG (Regensburg, Germany) 가 합성 올리고뉴클레오티드 및 PCR 산물로부터 자동화된 유전자 합성에 의해 제조했다. 하나의 제한 엔도뉴클레아제 절단 자리가 측면에 있는 유전자 분절을 pGA18 (ampR) 플라스미드 내로 클로닝했다. 플라스미드 DNA 를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, 농도를 UV 분광분석법으로 측정했다. 서브클로닝된 유전자 조각의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인했다. 적당하고/거나 필요한 경우, 5'-BamHI 및 3'-XbaI 제한 자리를 사용했다. 모든 구축물을 진핵 세포에서 분비를 위한 단백질을 표적화하는 리더 펩티드를 코딩하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 디자인했다.
발현 플라스미드의 구축
모든 중 VH /또는 VL 융합 단백질 및 경쇄 단백질을 인코딩하는 발현 플라스미드의 구축에 Roche 발현 벡터를 사용했다. 상기 벡터는 하기 요소들로 구성된다:
- 선별 마커로서의 하이그로마이신 내성 유전자,
- 엡스타인-바바 바이러스 (EBV) 의 복제 기점, oriP,
- 대장균에서 이러한 플라스미드의 복제를 가능하게 하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기점,
- 대장균에서 암피실린 내성을 부여하는 베타-락타마제 유전자,
- 인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 로부터의 조기발현 인핸서 및 프로모터,
- 인간 1-면역글로불린 폴리아데닐화 ("poly A") 신호 서열, 및
- 유일 BamHI 및 XbaI 제한 자리.
면역글로불린 융합 유전자를 기재한 바와 같이 유전자 합성에 의해 제조하고 pGA18 (ampR) 플라스미드 내로 클로닝했다. 합성된 DNA 분절을 담고 있는 pG18 (ampR) 플라스미드 및 Roche 발현 벡터를 BamHI 및 XbaI 제한 효소 (Roche Molecular Biochemicals) 로 소화시키고 아가로스 겔 전기영동에 적용했다. 정제된 중쇄 및 경쇄 코딩 DNA 분절을 그 후 단리된 Roche 발현 벡터 BamHI/XbaI 조각에 결찰시켜 최종 발현 벡터를 초래했다. 최종 발현 벡터로 대장균을 형질전환시키고, 발현 플라스미드 DNA 를 단리하고 (Miniprep) 제한 효소 분석 및 DNA 서열분석에 적용했다. 맞는 클론을 150 ㎖ LB-Amp 배지에서 성장시키고, 다시 플라스미드 DNA 를 단리하고 (Maxiprep), 서열 완전성을 DNA 서열분석에 의해 확인했다.
HEK293 세포에서 면역글로불린 변이체의 일시적 발현
FreeStyle™ 293 발현 시스템을 제조사의 지침 (Invitrogen, USA) 에 따라 사용하여 인간 배아 콩팥 293-F 세포의 일시적 트랜스펙션에 의해 재조합 면역글로불린 변이체를 발현시켰다. 간략히, 현탁 FreeStyle™ 293-F 세포를 FreeStyle™ 293 발현 배지에서 37℃/8 % CO2 에서 배양하고, 트랜스펙션하는 날에 세포를 새로운 배지에 밀도 1-2x106 생세포/㎖ 로 파종했다. 325 ㎕ 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 ㎍ 의 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1 몰비로 250 ㎖ 최종 트랜스펙션 부피로 사용하여 Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 DNA-293fectin™ 복합체를 제조했다. Opti-MEM® I 배지 (Invitrogen, USA) 에서 325 ㎕ 의 293fectin™ (Invitrogen, Germany) 및 250 ㎍ 의 "놉-인투-홀" 중쇄 1 및 2 및 경쇄 플라스미드 DNA 를 1:1:2 몰비로 250 ㎖ 최종 트랜스펙션 부피로 사용하여 "놉-인투-홀" DNA-293fectin 복합체를 제조했다. 트랜스펙션한지 7 일 후에 14000 g 에서 30 분 동안 원심분리하여 항체 함유 세포 배양물 상청액을 수집하고 멸균 필터 (0.22 ㎛) 를 통해 여과시켰다. 정제 전까지 상청액을 -20℃ 에서 저장했다.
이중특이적 및 대조군 항체의 정제
단백질 A-SepharoseTM (GE Healthcare, Sweden) 를 사용하는 친화성 크로마토그래피 및 Superdex200 크기 배제 크로마토그래피에 의해 세포 배양물 상청액으로부터 이중특이적 및 대조군 항체를 정제했다. 간략히, PBS 완충액 (10 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형시킨 HiTrap 단백질A HP (5 ㎖) 칼럼에 멸균 여과된 세포 배양물 상청액을 적용했다. 결합되지 않은 단백질을 평형 완충액으로 씻어냈다. 항체 및 항체 변이체를 0.1 M 시트레이트 완충액, pH 2.8 로 용리하고, 단백질 함유 분획을 0.1 ㎖ 1 M Tris, pH 8.5 로 중화시켰다. 그 후, 용리된 단백질 분획을 모으고, Amicon Ultra 원심 필터 장치 (MWCO: 30 K, Millipore) 를 사용하여 부피 3 ㎖ 로 농축하고, 20mM 히스티딘, 140 mM NaCl, pH 6.0 으로 평형시킨 Superdex200 HiLoad 120 ㎖ 16/60 겔 투과 칼럼 (GE Healthcare, Sweden) 에 로딩했다. 정제된 이중특이적 및 대조군 항체와 5 % 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 분획을 모으고, 1.0 ㎎/㎖ 앨리쿼트로 -80℃ 에서 저장했다.
정제된 단백질의 분석
아미노산 서열에 기초하여 계산한 몰 흡광 계수를 사용하여, 280 ㎚ 에서 광학 밀도 (OD) 를 측정함으로써 정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 확인했다. 이중특이적 및 대조군 항체의 순도 및 분자 질량을 환원제 (5 mM 1,4-디티오트레이톨) 및 쿠마시브릴리언트블루 염색의 존재 및 부재 하에 SDS-PAGE 에 의해 분석했다. NuPAGE® 프리-캐스트 겔 시스템 (Invitrogen, USA) 을 제조사의 지침에 따라 사용했다 (4-20 % Tris-글라이신 겔). 25℃ 에서 200 mM KH2PO4, 250 mM KCl, pH 7.0 영동용 완충액 중에서 Superdex 200 분석적 크기-배제 칼럼 (GE Healthcare, Sweden) 을 사용하는 고성능 SEC 에 의해 이중특이적 및 대조군 항체 샘플의 응집체 함량을 분석했다. 25 ㎍ 단백질을 칼럼에 유속 0.5 ㎖/분 으로 주입하고 50 분에 걸쳐 등용매 용리했다. 안정성 분석을 위해, 농도 1 ㎎/㎖ 의 정제된 단백질을 4℃ 및 40℃ 에서 7 일 동안 인큐베이팅한 후, 고성능 SEC 에 의해 평가했다. 펩티드-N-글리코시다제 F (Roche Molecular Biochemicals) 에 의한 효소 처리에 의해 N-글리칸을 제거한 후 나노전기분사 Q-TOF 질량 분광분석법에 의해 환원된 이중특이적 항체 경쇄 및 중쇄의 아미노산 백본의 완전성을 확인했다.
실시예 1
본 발명에 따른 이중특이적 항체의 설계
첫번째 시도에서 제 2 항원에 특이적인 두번째 결합 부분으로서 하나의 부가적 Fv 를 보유하는 제 1 항원에 결합하는 전체 항체에 기초하여 유도체를 생성했다 (도 2a 참조). VHCys44 와 VLCys100 사이에 사슬간 다이설파이드을 도입했다 (ref. p17-18 A-M). dsFv 의 VHCys44 를 전체 항체의 첫번째 중쇄의 CH3 도메인에 융합시키고, 상응하는 VLCys100 모듈을 전체 항체의 두번째 중쇄의 CH3 도메인에 융합시켰다.
박테리아 봉입체 리폴딩 또는 주변세포질분비에 의해 적정한 수율로 별도로 발현된 모듈로부터 dsFvs 가 조립될 수 있음이 이전에 밝혀졌다 (WO 94/029350, US 5,747,654; Rajagopal, V., et al., Prot. Engin. (1997) 1453-1459; Reiter, Y., et al., Nature Biotechnology 14 (1996) 1239-1245; Reiter; Y., et al., Protein Engineering; 8 (1995) 1323-1331; Webber, K.O., et al., Molecular Immunology 32 (1995) 249-258; Reiter, Y., et al., Immunity 2 (1995) 281-287; Reiter, Y., et al., JBC 269 (1994) 18327-18331; Reiter, Y., et al., Inter. J. of Cancer 58 (1994) 142-149; Reiter, Y., Cancer Res. 54 (1994) 2714-2718).
포유동물 분비 시스템에서 연결없는 dsFv 의 제조를 위한 하나의 병목은, 샤페론의 도움이 없는 VH 및 VL 도메인의 효과 없는 어셈블리일 수 있다: dsFv 성분은 BIP 에 의해 인지되는 불변 영역을 함유하지 않는다 (도 4b 참조). 이러한 제한을 극복하기 위해, 본 발명자들은 중간체를 통해 VH 및 VL 도메인의 어셈블리에 접근하였다 (도 4c). 따라서, dsFv 의 하나의 성분 (VH 또는 VL) 을 커넥터 펩티드를 통해 하나의 H-사슬의 C-말단에, 상응하는 다른 성분을 또다른 커넥터 펩티드에 의해 두번째 H-사슬의 C-말단에 연결시켰으나, 이는 세포에서 발현 동안 절단될 수 있거나, 시험관내 정제 후 절단될 수 있는 하나 이상의 프로테아제 절단 부위를 함유한다. 중간체 이중특이적 항체의 예는 도 2d 에 나타나 있다 (도 2a 에서 나타낸 바와 같은 항체에 대해).
이러한 접근의 근거는 H-사슬의 효과적 이량체화가 dsFv 성분들을 함께 모으고 이질이량체화를 촉진하는 것이었다. 2 VH 또는 2 VL 모듈을 함유하는 분자의 비생산적 조립을 감소시키기 위해, 상보성 놉-인투-홀 돌연변이를 IgG 의 H-사슬에 도입했다. 이들 돌연변이는 상이한 H-사슬의 이질이량체화를 강제하기 위해 Merchant, A.M., et al., Nature Biotechnology 16 (1998) 677-681 and Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9 (1996) 617-621 에서 고안되었으며, 하나의 H-사슬 사슬 내의 T366W 돌연변이 및 상응하는 다른 사슬 내의 T366S, L368A 및 Y407V 돌연변이로 이루어진다. dsFv-함유 이중특이체 생성을 위한 우리의 디자인은 '놉' 을 VHCys44 에 융합된 CH3 도메인에, 상보성 '홀' 을 VLCys100 을 담고 있는 H-사슬 내로 도입하는 것이었다.
이종이량체 dsFv 의 양쪽 성분을 CH3 에 묶었다. VH 및 VL 을 그들의 N-말단에서 부피가 큰 CH3 도메인에 이렇게 동시 부착하는 것은 Fv 의 구조에 영향을 미치지 않는다. 그러나, 그것은 항원에 따라 (예를 들어 링커 길이 및 각각의 항원 구조에 따라) 항원에 대한 접근성을 제한할 수 있는데, 그 이유는 CDR 영역이 CH3 가 위치하는 방향을 가리키기 때문이다. 또한, 2 개의 연결점에서 묶는 것은 Fv 가 회전하거나 CH3 옆으로 이동하는 자유를 매우 제한한다. 그 때문에 항원은 CH3 과 Fv 사이에 비집고 들어가야 한다. 이는 항원으로의 접근성에 영향을 미치고 친화성을 감소시킬 수 있으며, 이를 본 발명자들은 실제로 이중특이적 항체의 이중-연결된 dsFv 부분에 대해 관찰했다 (표 2 의 SPR 데이터 참조). 입체 장애로 인한 항원 접근성 문제와 일관되게, 친화성 측정은 이중-묶인 dsFv 에 대한 유의하게 감소된 온-레이트 (on-rate) 를 밝혔다. 그럼에도 불구하고, Fv 의 구조적 완전성은 온전해 보이는데, 그 이유는 일단 항원이 결합하면, 오프-레이트 (off-rate) 가 비수식 항체의 경우와 동일기 때문이다. 이중특이적 항체의 IgG-유사 접근가능 팔의 결합에 대한, 뿐만 아니라 부가적 이중-묶인 dsFv 에 대한 친화성 값 (이는 예상대로 완전한 친화성을 가짐) 이 표 2 에 열거되어 있다. 여기서 이중-묶음 후 입체 장애로 인해 온-레이트가 감소된 dsFv 모듈에 대해 용어 '제한 또는 감소된 결합 방식' 을 사용한다.
예시적으로, 하기 중간체 항체 서열을 기초로 하여, 본 발명자들은, 전장 항체에 대한 디술피드-안정화된 Fv 단편의 오직 하나의 도메인을 통해 연결되는 본 발명에 따른 항체의 발현 및 정제 가공되는 하나의 링커를 절단함으로써 재조합적으로 발현시킬 수 있었다 (하기 기술되는 실험 부분 및 도 2 참조):
Figure 112013016339437-pct00002
예시적으로, 하기 중간체 항체 서열을 기초로 하여, 본 발명자들은, 전장 항체에 대한 디술피드-안정화된 Fv 단편의 오직 하나의 도메인을 통해 연결되는 본 발명에 따른 항체의 발현 동안 가공되는 하나의 링커를 절단함으로써 재조합적으로 발현시킬 수 있었다 (하기 실험 설명 부분 및 도 2 참조):
Figure 112013016339437-pct00003
실시예 2
a) 2단계 또는 1단계 공정의 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 발현 및 정제
2단계 공정:
1. 단계: 일시적 발현
분비된 이중특이적 항체 유도체의 생산을 위해 일시적 발현을 적용했다. L-사슬 및 수식 H-사슬을 인코딩하는 플라스미드로 HEK 293 현탁 세포를 동시-트랜스펙션시켰다. 분비된 항체 유도체를 함유하는 배양물 상청액을 1 주일 후에 수집했다. 이들 상청액은 수율에 영향을 미치지 않으면서 정제 전에 동결되고 -20 ℃ 에서 저장될 수 있었다. 단백질 A 에 결합하는데 완전히 적격임을 증명하는 종래의 IgG 과 동일한 방식으로 상청액으로부터 단백질 A 및 SEC 에 의해 이중특이적 항체를 정제했다.
세포 배양물 상청액 내의 발현 수율은 일시적으로 발현된 비수식 항체보다 낮았으나 여전히 적정 범위 내에 있었다. 모든 정제 단계를 완료한 후, 수율 4 ~ 10 ㎎/L 로 균일 단백질이 수득되었다. 부가적 dsFv 부분의 VH 와 VL 사이에 펩티드 링커가 없음에도 불구하고, 안정성 분석은 특이한 농도- 또는 온도 의존적 분해 또는 응집에 대한 징후를 밝히지 못했다. 단백질은 안정적이었고, 동결-해동이 잘 용인되었다. 환원 및 비-환원 조건 하의 3가 이중특이적 항체 유도체 및 그들의 성분의 크기, 균일성, 및 조성이 도 5 및 6 에 제시되어 있다. 각각의 단백질의 정체 및 조성을 질량 분광분석법에 의해 확인했다 (표 1).
CH3-도메인에 대한 dsFv 성분의 이중-묶음은 항원 접근을 감소시켜서 dsFv 의 기능을 불활성화시킨다. 하나의 커넥터 펩티드 주위에서의 Fvs 의 자유 회전은 아마도 항원에의 접근을 증가시킬 것이지만, 2 개의 연결점에서 dsFv 의 융합은 높은 정도의 유연성 또는 회전을 허용하지 않는다. 그러한 제한 dsFvs 부분의 불활성화된 결합 기능을 재활성화하기 위해, 본 발명자들은 2 개의 커넥터 펩티드 중 하나 내로 특이적 프로테아제 인지 자리를 도입했다 (도 4d 에 도식적으로 제시됨). 그러한 접근의 근거는 2 개의 연결 중 오직 하나의 해방을 위한 단백질분해 절단을 이용하는 것이었다. 단백질분해 가공시, dsFv 는 여전히 그것의 다른 커넥터를 통해 이중특이적 항체의 IgG 백본에 공유적으로 연결될 것이다. 그러나 이중-연결과 대조적으로, 오직 하나의 유연한 연결점에서의 부착은 유연성을 개선하고 자유 회전을 허용하여 항원에의 접근을 촉진할 수 있다. 도 1b 는 프로테아제에 의한 가공을 가능하게 하기 위해 적용한 상이한 커넥터 서열을 보여준다. 표준 비-절단가능 커넥터는 상이한 도메인으로 구성되는 융합 단백질을 생성하는데 빈번히 사용되어 온 모티프인, Gly4Ser-반복단위 6 개로 구성된다. 단백질분해 가공을 위해, 본 발명자들은 이러한 커넥터의 중심 영역 내로 특이적 인지 서열을 도입했다:
하나의 커넥터는, Prescission 프로테아제에 의해 절단되는 부위를 함유한다. 이러한 프로테아제는 제한된 형태로 발현되는 Fv 모듈의 기능성을 촉발시킬 수 있다. PreScission 프로테아제 (GE Healthcare Catalogue No. 27-0843-01) 는, 인간 리노바이러스 3C 프로테아제 및 GST 로 이루어진 유전적으로 조작된 융합 단백질이다. 이러한 프로테아제는, pGEX-6P 벡터 pGEX-6P-1, pGEX-6P-2, 및 pGEX-6P-3; 참조, pGEX Vectors ( GST Gene Fusion System ) 으로부터 제조되는 GST 융합 단백질의 절단 및 동시에 프로테아제 고정을 허용함으로써 프로테아제의 제거를 촉진하기 위해 특이적으로 설계되었다. PreScission 프로테아제는 LeuGluValLeuPheGln/GlyPro 의 인지 서열의 Gln 및 Gly 잔기 사이에서 특이적으로 절단한다.
2. 단계: 단백질 분해 가공 (절단)
정제 동안 또는 정제 후 적용될 수 있는 Prescission 로 가공됨.
1단계 공정:
발현 단계 동안 단백질 분해성 절단을 인식하기 위해, 퓨린에 의해 절단되고 인지될 수 있는 링커 서열을 사용하였다. 퓨린은, HEK293 을 포함하는 포유동물 세포의 트랜스-골지 네트워크 및 2차 구획 및 엔도좀에 존재하는 프로테아제이다. 본 발명자들은, 발현 공정 내에서 dsFv 가공을 가능하게 하기 위해 그러한 프로테아제 부위를 선택하였다. 제한된 dsFv 를 갖는 이중특이적 전체가 분비 동안 퓨린과 만날 것이다. 이에 의해, 이미 절단된 완전한 기능적 단백질이 세포에 의해 제조될 수 있다.
prescission 부위를 함유하는 이중특이적 항체가 제한된 형태로 발현되고 다운스트림 가공에서 활성화될 수 있다.
제한된 결합 모듈을 함유하는 이중특이적 항체 포맷의 하나의 적용은, 이를 제한된 형태로 발현하기 위한 것이고 이후 다운스트림 가공에서 하나의 단계로서 이를 활성화시킨다. 이러한 적용은, 예를 들어, 전체 기능성이 분비 공정, 세포 성장으로 간섭되기 때문에 발현에 대한 문제를 갖거나 프로듀서 세포에 독성인 결합 모듈의 고 활성의 경우에만 유리하다.
이러한 설정에 대한 예로서, 본 발명자들은 제한된 cMet dsFv 모듈을 갖는 Her3-cMet 이중특이적 항체를 발현시키고 정제하고, 이어서 Prescission 로 가공함으로써 dsFv 활성을 촉발시킨다. 도 5 는, 세포 배양 상청액으로부터 발현 및 정제 후, 이중특이적 Her3-cMet 독립체가 H-사슬에 밀접히 연결되는 dsFv 의 성분을 갖는 것으로 수득된다. 환원 SDS-PAGE 는, (Her3-전체의 표준 L-사슬에 더하여), 65 kD 의 높이에서 단백질 (이중) 밴드의 존재를 나타낸다. 이러한 밴드는, C-말단에서 VH 또는 VL 도메인 (13 kD) 및 추가의 커넥터 펩티드 (2 kd) 를 갖는 H-사슬 (50 kd) 을 나타낸다.
Her 3 에 대한 이들 완전히 접근가능한 결합 전체에 대한 이들 이중특이적 분자의 친화도 (Prescission 가공 전) 는 야생형 항체 (표 1) 의 그것과 동일하다. 대조적으로, cMet 에 대한 제한된 dsFv 부분의 친화도는 입체 방해로 인해 제대로 발휘되지 못한다. Biacore 분석은, 야생형 Fab (표 1) 의 그것과 비교시 > 20 배 감소된 친화도를 나타낸다.
표 1 : 예시적인 이중특이적 항체 유도체의 발현 및 정제
Figure 112013016339437-pct00004
CH3 과 VL 사이의 커넥터 내의 prescission 자리의 절단은 dsFv 의 제한을 해소하고, 오직 하나의 커넥터에 의해 IgG 에 부착되는 dsFv 를 갖는 분자가 가 생기게 한다. 환원 SDS PAGE 로, 이러한 공정의 결과는 확장된 H-사슬 중 하나가 정상 크기 (52 kd) 로 전환되고 13 kD 의 부가적 VL 도메인이 출현하는 것으로 볼 수 있다 (도 6a 참조). 크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석법에 의해 보여지는 바와 같이 절단되었을 때 분자는 여전히 안정적 다이설파이드 결합에 의해 함께 결합된다.
이중특이적 항체의 제한 및 MMP2 가공된 형태의 친화성의 비교가 표 2 에 열거되어 있다: 예상되었던 바와 같이, dsFv 부분에서의 가공은 이전에 이미 완전히 접근가능했던 항원 Her3 에 대한 결합을 변경하지 않았다. 반면, 하나의 커넥터를 절단함으로써 입체 장애의 해소는 연결없는 dsFv 모듈의 온-레이트를 완전히 개선시켰다: 촉발된 dsFv 의 친화도는 > 30 배까지 개선되었고, 모 항체의 친화도 수준으로 완전히 회복되었다 (표 2).
표 2 : 본 발명에 따른 이중특이적 항체 유도체의 결합 친화도 (및 모 항제와의 비교, 및 가능한 경우 (예를 들어 prescission 부위에 대해), 프로테아제 절단 전에 상응하는 중간체와의 비교)
Figure 112013016339437-pct00005
퓨린 부위를 함유하는 이중특이적 항체는 발현 동안 효과적으로 가공되고 결없는 dsFv 의 완전한 기능성을 나타낸다.
커넥터 내의 퓨린 부위는 제한되지 않은 기능성을 갖는 연결없는 dsFv 를 함유하는 이중특이적 항체의 직접적인 발현에 대해 사용될 수 있다. 퓨린은 엔도시토시스의 및 분비 소포체에서 존재하고, 트랜스골지 네트워크에서 존재하고, 몇몇 경우에서 많은 포유동물 세포의 세포 표면 상에 존재한다 (예를 들어, 이들 실험 내에서 사용되는 바와 같은 HEK293). 이의 인지 부위는 다양한 분비 전구체 단백질 (예컨대 프로-TGF 또는 프로-반 빌브랜드 팩터) 에 존재하는 모티프 RXK/RR 를 빈번히 함유한다. 따라서, 커넥터 서열을 함유하는 2 개의 퓨린 부위를 생성하기 위한 인지 서열을 선택하였다 (퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 1 - SEQ ID NO:13 의 FS1 및 퓨린 특이적인 프로테아제 절단 부위 변이체 2 - SEQ ID NO:14 의 FS2).
퓨린이 트랜스골지 네트워크 및 분비 소포체에서 존재하기 때문에, 절단은 생산 동안 세포 내에서 발생할 수 있다. 본 발명자들이 수득한 완전히 기능적 분자이며 가공된 제한되지 않은 퓨린의 발현 수율은 제한된 분자에 대해 관찰되는 것과 유사하였는데 (표 1), 이는 dsFv 가 완전히 접히고 퓨린 활성을 갖는 구획과 만나기 전에 조립되기 때문이다. 도 5 및 6b 는, 발현 및 정제 후 이미 정량적으로 가공된 정제 분자가 수득됨을 증명한다. 환원 PAGE 는, (표준 <Her3> L-사슬에 더하여) dsFv 의 VH 를 포함하는 65 kD 의 하나의 확장된 H-사슬 및 퓨린에 의해 정상 크기 (52 kd) 로 전환된 또다른 H-사슬을 나타낸다. 13 kD 의 추가의 VL 도메인이 또한 검출가능하다. 정제 과정이 단백질A 및 SEC 을 포함하기 때문에 (이의 둘 모두는 연결되지 않은 VL 도메인을 회복하지 않음), 이들 도메인의 검출은 완전히 가공된 기능적 이중특이체를 생성시킨다.
크기 배제 크로마토그래피 및 질량 분광분석으로, 모든 도메인이 적합한 디술피드에 의해 함께 보유된다는 사실을 추가로 확인하였다 (도식적으로 도 2 및 3 에 나타남).
퓨린을 통한 가공이 발현 공정 동안 발생하기 때문에, 정제 후 수득되는 제제는 촉발된 형태로 완전히 활성의 연결없는 dsFv 를 갖는 이중특이적 전체로 구성되어야만 한다. 이는 SPR 분석으로 확인될 수 있었다 (표 2). 이중특이적 항체의 모든 결합 독립체 (cMet 에 결합하는 dsFv 및 Her3 을 인지함) 는, 제한되지 않은 결합능을 갖는다. Her3 및 cMet 에 대한 이들의 친화도는 변형되지 않은 항체 또는 Fab 에 필적할만하다 (표 2).
포유동물 세포에서 발현 동안 이중특이적 항체 유도체의 퓨린-중재 가공을 분석하기 위한 질량 분석의 적용
본원에서 기술되는 이중특이적 항체 유도체는 전구체 형태로서 단백질로 번역된다. 이들은, 제한되지 않은 포맷으로 전환되기 위한 프로듀서 세포의 분비 경로 내에서 퓨린에 의한 절단을 필요로 한다. 제한되지 않은 분자에 대한 이중특이적 항체의 제한된 전구체 형태의 퓨린-중재 전환 정도를 결정하기 위해, 질량 분석을 적용하였다. 이러한 기술은 단백질 및 단백질 단편의 정확한 분자 질량을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
질량 분광 분석 전에, 항체를 N-글리코시다아제 F 를 사용하는 표준 프로토콜을 적용하여 탈-글리코실화시켜 스펙트럼 복잡성을 감소시키고 데이터 해석을 촉진하였다. 데이터 해석을 촉진하기 위한 추가의 척도로서, 분석될 분자를 IdeS 프로테아제에 의해 디술피드-가교된 Fc 및 F(ab)2 단편으로 절단시켰다. 이어서, 단편을 TCEP 로 환원시켜 이의 상이한 성분을 분리하여 동정 및 특징화를 촉진하였다. 이로써, 관련 퓨린 절단 이벤트는 탈-글리코실화되고 환원된 IdeS-유래된 Fc 단편의 규정된 질량으로서 검출될 수 있다.
샘플을 탈염시키고 이어서, "Quadrupole Time-of-Flight" 장치 (Q-Star, (ABI, Darmstadt) 또는 Maxis (Waters, Manchester)) 상에서 전기분사 이온화 (ESI) 질량 분석 처리하였다. "NanoMate system" (Triversa NanoMate System, Advion, Ithaka, USA) 을 이용하여 샘플을 ESI 나노분사원으로 도입하였다. 탈-글리코실화되고 환원된 항체에 대해 표준 MS 프로토콜을 사용하여 적합한 분무, 적절한 제거 및 분석물의 단편화가 없었다. 질량 스펙트럼은 5 초의 스캔 기간으로 획득되었다.
이들 분석의 결과는, 전구체 형태로서 번역되는 이중특이적 항체 유도체가 프로듀서 세포의 분비 경로 내에서 퓨린에 의해 이후 가공됨을 나타낸다. 단백질 제제 Her3_MetSS_KHSS_FS1 및 Her3_MetSS_KHSS_FS2 는 이들의 커넥터 내에서 삽입되는 2 개의 상이한 퓨린 인지 서열을 갖는다 (FS1 에 대해 SEQ ID NO:2 의 중쇄 융합 단백질에서 및 FS2 에 대해 SEQ ID NO:4 의 중쇄 융합 단백질에서). 둘 모두의 제제에서, 퓨린에 의해 완전히 가공됨이 관찰되었고 가공되지 않은 전구체 단편 (확장된 IdeS-Fc 단편) 이 검출불가능했다. 또한, 질량 분석으로, 퓨린-절단된 단백질 모듈의 추가의 카르복시말단 가공을 나타냈다. 퓨린 인지 서열의 형성 부분 및 절단 부위를 선행하는 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 퓨린-가공된 산물로부터 정량적으로 제거하였다.
이중특이적 항체 유도체의 또다른 단백질 제제로, 감소된 길이의 커넥터 정착 서열을 분석하였다 (Her3-cMet-3C-FS1).
Figure 112013016339437-pct00006
이러한 제제에서, 퓨린 가공의 산물이 명확하게 다시 검출되었다. 또한, 상기 기술된 바와 동일한 방식으로, 퓨린 인지 서열의 선행하여 형성된 부분인 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 퓨린-가공 산물로부터 정량적으로 제거하였다. 이러한 제제는 퓨린-가공 산물에 더하여 추가의 확장된 Fc 단편을 함유하였다. 이는, 이러한 단백질 배치가 여전히 몇몇 가공되지 않은 전구체 분자를 함유함을 나타내는 것이다.
이러한 Her3-cMet-3C-FS1 제제에서 가공되지 않은 전구체 분자의 존재 대 가공 정도를 추가로 분석하기 위해, SDS-PAGE 분석을 환원 조건 하에서 수행하였다. 이들 분석의 결과 (도 9) 는, 현저한 정도의 퓨린이 또한 이러한 제제에 대해 가공됨을 나타낸다: 퓨린 절단으로, 확장된 H-사슬 (63kD) 중 오직 하나만이 정상 크기 (50kD) 의 H-사슬로 전환되고 12 kD 의 단백질 단편을 방출시킨다. 이러한 가공 공정의 둘 모두의 산물이 명백히 검출될 수 있다.
완전히 가공된 산물 및 임의의 잔류하는 가공되지 않은 전구체-물질 사이의 비는, 이러한 방법에 의해 정확한 방식으로 측정될 수 없는데, 왜냐하면 상보적인 (절단될 수 없는) 확장된 H-사슬이 전구체와 겔 내에서 동일한 위치에 위치하기 때문이다. 그러나, 가공 상물의 검출가능한 양, 특히 12kD 단편의 명백한 가시적인 양 (이는 이의 적은 크기 때문에, 큰 단백질 단편보다 가시화시키기 훨씬 어렵다) 은, 꽤 효과적인 가공이 이러한 제제 내에서 발생함을 나타낸다.
수득된 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 기능성
수득된 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 기능성 (이는 전장 항체에 대한 디술피드-안정화된 Fv 단편의 하나의 도메인을 통해 오직 연결됨) 을 세포성 분석으로 추가로 조사하였다: FACS 실험 (도 7) 은, 이중특이적 항체의 제한되지 않은 암이 Her3-발현 암 세포에 특이적으로 결합하고 그러한 세포 상에서 축적을 야기하는 것을 나타낸다. 제한된 dsFv cMet 모듈 대 촉발된 dsFv cMet 모듈의 결합은 유사한 방식으로 cMet 발현 A549 세포 상에서 FACS 에 의해 분석되었다. 도 7 은, 발현 후 Prescission 로 절단하는 것, 또는 발현 동안 퓨린으로 절단하는 것이 제한된 dsFv 모듈에 비해 A549 세포 상에서 c-Met 의존적 축적을 현저히 개선시킴을 나타낸다. 또한, 신호화 경로를 간섭하는 cMet 모듈 기능성에 대해서는, cMet 을 인식하는 촉발된 dsFv 모듈에 대해 입증될 수 있었다: 제한되지 않은 cMet dsFv (퓨린 절단 또는 Prescission 절단을 통해) 은 모 항체로부터 유래된 1가 Fab 과 같이 효율적으로 HGF-매개 ACT 신호화를 간섭하였다 (도 8). 대조적으로, 제한된 dsFv 모듈은 이의 감소된 친화도와 상관관계를 나타내는 급격히 감소된 활성을 가졌다.
실시예 3
발현 동안 가공된 추가의 이중특이적 항체의 생성 및 생화학적 특성화
본 발명에 따른 이중특이적 항체 생산의 설계 및 가공을 일반화시킬 수 있는지 여부를 입증하기 위해, 다양한 추가적인 이중특이적 항체를 제조하고 특징화하였다. 이들 모두는 IgG 유도체에 대한 하나의 절단불가능한 펩티드 서열 및 절단가능한 하나의 퓨린을 통해 연결되는 디술피드-안정화된 Fv 독립체 (상기 기술된 바와 같음) 를 함유하는 전구체 분자로서 생성되었다. 이들 이중특이적 항체 유도체를 종양 (표적 1 로서) 및 항-디곡시게닌 결합 독립체 (표적 2 로서) 상의 세포 표면 항원에 접근하는 결합 모듈로 구성하였다. 많은 종양에서 발현되는 VEGFR2, 또는 암 세포 상에서 발현되는 암 연계된 LeY 탄수화물 항원 (LeY), CD22, CD33, Her2 또는 IGF1R 항원 중 하나에 세포 표면 표적화 특이성을 접근시켰다. 이들 결합 특이성을 갖는 항체 서열, 및 상응하는 Dig.-결합 항체 유도체를 상기 기술하였고 (WO 2011/003557 참조), 이로부터 유도할 수 있다. 본 발명에 따른 이중 기능성을 갖는 결합 분자의 조성을 도 10 에 예시적으로 나타냈다.
이들 퓨린-가공된 이중특이적 항체 유도체의 발현 및 정제를 실시예 2 에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 세포 배양 상청액 리터 당 발현 수율은, 많은 변형되지 않은 항체에서 관찰되는 바와 동일한 범주였다 (7-40 mg/L). 모든 이중특이적 항체 유도체는 오직 소량의 응집물을 함유하거나 전혀 함유하지 않은 균질한 전체 단백질 제제로 정제될 수 있었다. 많은 제제에서, 응집물이 전혀 검출될 수 없었고, 이들 제제를 SEC 분석하여 도 11 에 나타냈다. 배양 상청액 리터 당 정제된 균질 항체의 발현 수율은, 15 mg/L (LeY-Dig 에 대해), 19.5 mg/L (CD22-Dig 에 대해), 40mg/L (CD33-Dig 에 대해), 40.2 mg/L (VEGFR2-Dig 에 대해), 25mg/L (Her2-Dig 에 대해) 및 7mg/L (IGF1R-Dig 에 대해) 이었다.
필요한 경우, dsFv 를 IgG 골격에 융합하는 펩티드 커넥터 중 하나에서 퓨린 인식 부위의 존재는 발현 공정 동안 완전한 단백질 분해 가공을 야기하였다. 이는 환원 및 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 입증되었다: 큰 크기의 디술피드-결합된 이중특이적 항체는 비환원 조건 하에서 나타났고, 이는 환원시 예상 분자량의 개별 사슬로 분리시킨다 (도 12). 퓨린 절단으로, 확장된 H 사슬 (63kD) 중 오직 하나를 정상 크기 (50kD) 의 H-사슬로 전환시키고, 12 kD 의 단백질 단편을 방출시켰다. 이러한 가공 공정의 둘 모두의 산물은 환원 겔에서 명백히 검출될 수 있다.
단백질 산물의 규정된 조성 및 균질성을 질량 분석 (도 13) 으로 추가로 확인하여, 단백질 및 단백질 단편의 정확한 분자 질량을 측정하였다. 질량 분광분석 전에, N-글리코시다아제 F 를 사용하는 표준 프로토콜을 적용하여 항체를 탈-글리코실화하여, 스펙트럼 복잡성을 감소시키고 데이터 해석을 촉진하였다. 데이터 해석을 촉진하기 위한 추가의 척도로서, 분석 분자를 IdeS 프로테아제에 의해 디술피드-가교된 Fc 및 F(ab)2 단편으로 절단하였다. 이어서, 단편을 TCEP 로 환원시켜 이의 상이한 성분을 분리하여 상기 기술된 바와 같은 동정 및 특징화를 촉진하고, 이후 탈염시키고 이어서 전기분사 이온화 (ESI) 질량 분석으로 처리하였다. 이들 분석의 결과는, 전구체 형태로 번역되는 모든 분석된 이중특이적 항체 유도체가 이후 프로듀서 세포의 분비 경로 내에서 퓨린에 의해 가공됨을 나타낸다. 단백질 제제는, 퓨린에 의한 완전한 가공 (검출 한계 내에서) 을 나타내고 가공되지 않은 전구체 단편 (확장된 IdeS-Fc 단편) 이 검출되지 않았다. 또한, 질량 분석은 퓨린-절단된 단백질 모듈의 추가의 카르복시말단 가공을 나타냈다. 퓨린 인식 서열의 형성된 부분 및 절단 부위를 선행하는 아르기닌 및/또는 라이신 잔기는 퓨린-가공된 산물로부터 정량적으로 제거되었다.
이들 결과는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 가공 및 설계가 생성될 수 있음을 증명하는 것이다: 커넥터 펩티드 내에서 퓨린 인식 부위를 함유하는 다양한 이중특이적 항체가 생성되고, 제조되고 균질하게 정제될 수 있다.
실시예 Y
발현 동안 가공되는 추가의 이중특이적 항체의 기능적 특성화.
추가의 이중특이적 항체의 기능성 (전장 항체에 대한 디술피드-안정화된 Fv 단편의 오직 하나의 도메인을 통해 연결됨) 을 표면 플라즈몬 공명을 통해 결합 검정으로 조사하였다. 퓨린을 통한 가공이 발현 공정 동안 발생하기 때문에, 정제 후 수득되는 제제는 완전하게 활성인 연결없는 dsFvs 를 갖는 이중특이적 독립제로 이루어져야만 한다. 완전한 결합 적격성을 SPR 분석으로 확인하였고, 이는 이중특이적 항체의 모든 결합 독립체 및 디곡시게닌에 결합하는 dsFv 가 제한되지 않은 결합능을 갖는 것으로 나타났다. 표적 항원 1 및 표적 항원 2 디곡시게닌에 대한 이들의 친화도는, 변형되지 않은 항체 또는 Fab 와 필적할만하다. 예를 들어, 모 항체와 비교한, 본 발명에 따른 이중특이적 항체 유도체의 디곡시게닌화된 탑재에 대한 개별적인 결합은 Kd 22 nM (대조군 분자에 대해) 및 19 nM (퓨린-가공된 분자에 대해) 이었다 (도 14). 또한, 이들 SPR 실험 (도 14b 및 도 15b) 는, 이중특이적 항체 유도체가 2 개의 상이한 항원에 동시에 결합함을 명백히 입증하였다. 이는 표적 1 항원 LeY 및 CD22 에 대해 나타났다 (도 14 및 도 15).
LeY 및 Dig 에 결합하는 이중특이적 항체의 기능성 (이는 전장 항체에 대해 디술피드-안정화된 Fv 단편의 오직 하나의 도메인을 통해 연결됨) 을, 세포성 검정에서 추가로 조사하였다: FACS 실험 (도 16) 은, 본 발명에 따라 설계되고 생성된 이중특이적 항체가 MCF7 표적 세포를 발현하는 LeY 항원에 특이적으로 결합한다. 이는, 2차 항체를 통해 나타나며 (도 16a), 이는 퓨린-가공된 이중특이적 항체의 LeY-결합능이 본래의 LeY-결합 항체로부터 구별될 수 있음을 나타낸다. 또한, 이들 이중특이적 항체는 이들 표적 세포에 대해 2nd 특이성 (Dig-Cy5) 에 의해 결합되어 직접적으로 형광 탑재를 할 수 있으며, 이를 도 16b 에 나타낸다. 이로써, Dig-접합된 탑재는 표적 항원을 발현하지 않는 세포 상에서가 아닌 표적 세포 상에서 풍부하게 된다. Dig-탑재의 정량적 결합 및 세포성 축적은, 세포 상에서 표적화된 형광이 오직 하나의 Dig-결합 독립체 하나만을 갖는 이중특이체와 비교하여 2 개의 Dig-결합 독립체를 갖는 모듈에 비해 2 배이다.
이들 결과는, 본 발명에 따른 이중특이적 항체의 제조 공정 및 설계를 일반화시킬 수 있음을 증명하는 것이다: 커넥터 펩티드 내에서 퓨린 인식 부위를 함유하는 다양한 이중특이적 항체가 생성될 수 있으며, 이는 표적 1 및 표적 2 를 향한 완전한 결합 활성을 보유한다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific antibodies comprising a dsFv fragment <130> 26968 WO <150> EP10173914.2 <151> 2010-08-24 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Her3/MetSS_KHSS_FS1 - HC1 (SS_KnobsHC1_VHcMet) <400> 1 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 465 470 475 480 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 485 490 495 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Leu 500 505 510 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Gly Met 515 520 525 Ile Asp Pro Ser Asn Ser Asp Thr Arg Phe Asn Pro Asn Phe Lys Asp 530 535 540 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 545 550 555 560 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr 565 570 575 Tyr Arg Ser Tyr Val Thr Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 580 585 590 Val Thr Val Ser Ser 595 <210> 2 <211> 592 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Her3/MetSS_KHSS_FS1 - HC2 (SS_HolesHC2 _VLcMet_FS1) <400> 2 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ser Ser Arg His 450 455 460 Arg Arg Ala Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile 465 470 475 480 Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg 485 490 495 Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser Ser 500 505 510 Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 515 520 525 Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser 530 535 540 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 545 550 555 560 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr 565 570 575 Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 580 585 590 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Her3/MetSS_KHSS_FS1 - 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LC (Her3clone29_KO1_LC) <400> 9 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Arg Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 582 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Her3/MetSS-3C-FS1 - 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HC2 (SS_HolesHC2 _VLcMet_FS1) <400> 11 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Ala 20 25 30 Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asn Arg Phe Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asp Tyr Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp 450 455 460 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp 465 470 475 480 Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr Ser 485 490 495 Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 500 505 510 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro 515 520 525 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 530 535 540 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 545 550 555 560 Tyr Ala Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 565 570 575 Arg <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Her3/MetSS-3C-FS1 - LC (Her3clone29_KO1_LC) <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Arg Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Phe Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Furin specific protease cleavage site variant 1 - FS1 <400> 13 Gln Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Furin specific protease cleavage site variant 2 - FS2 <400> 14 Leu Ser His Arg Ser Lys Arg Ser Leu 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> PreScission specific protease cleavage site <400> 15 Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 1 5

Claims (25)

  1. a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하고 2 개의 항체 중쇄 및 2 개의 항체 경쇄로 이루어지는 전장 항체;
    b) VH2 도메인 및 VL2 도메인을 포함하는 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 Fv 단편 (이때, 둘 모두의 도메인은 디술피드 브릿지를 통해 연결됨)
    을 포함하는 이중특이적 항체로서,
    이때 Fv 단편은,
    제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 중쇄의 둘 모두의 C-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 N-말단을 통해 융합되거나, 또는
    제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄의 둘 모두의 N-말단에 VH2 도메인 및 VL2 도메인의 C-말단을 통해 융합되며;
    링커 중 하나는 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는 것을 특징으로 하거나; 또는
    링커 중 하나는 Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하고, 다른 링커는 프로테아제 절단 부위를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 3가인 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, VH2 도메인 및 VL2 도메인이, 제 1 및 제 2 의 펩티드 링커를 통해, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 전장 항체의 둘 모두의 C-말단에, N-말단 융합되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, VH2 도메인 및 VL2 도메인이 하기 위치 사이에 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체:
    i) VH2 도메인 위치 44 와 VL2 도메인 위치 100 사이,
    ii) VH2 도메인 위치 105 와 VL2 도메인 위치 43 사이, 또는
    iii) VH2 도메인 위치 101 과 VL2 도메인 위치 100 사이.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, VH2 도메인 및 VL2 도메인이 VH2 도메인 위치 44 와 VL2 도메인 위치 100 사이에서 도입되는 디술피드 브릿지를 통해 연결되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체의 중쇄의 제 1 의 CH3 도메인 및 전장 항체의 제 2 의 CH3 도메인이, 항체 CH3 도메인 사이에서 본래 계면의 변경을 포함하는 계면에서 각각 만나는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체로서;
    이때,
    i) 하나의 중쇄의 CH3 도메인에서,
    아미노산 잔기가 더욱 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 강에서 위치할 수 있는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 계면 내의 융기를 생성하고,
    ii) 다른 중쇄의 CH3 도메인에서,
    아미노산 잔기가 더욱 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되고, 이로써, 제 1 의 CH3 도메인의 계면 내에 융기가 위치할 수 있는 제 2 의 CH3 도메인 내에서 제 2 의 CH3 도메인의 계면 내의 강을 생성하는 이중특이적 항체.
  7. 제 6 항에 있어서, 더욱 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 및 트립토판 (W) 으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더욱 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 및 발린 (V) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  8. 제 6 항에 있어서, 둘 모두의 CH3 도메인이, CH3 도메인 사이에서 디술피드 브릿지를 형성할 수 있도록 각 CH3 도메인의 위치에서 시스테인 (C) 잔기의 도입에 의해 추가로 변경되는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 중 하나는 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  10. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 중 하나는 Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중특이적 항체.
  11. 제 9 항에 있어서, 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 인 이중특이적 항체.
  12. 제 10 항에 있어서, Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:15 인 이중특이적 항체.
  13. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체의 제조 방법:
    A) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포에서 발현시키는 단계; 및
    B) 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계.
  14. 하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체에서 펩티드 링커가 절단된 이중특이적 항체의 제조 방법으로서:
    A) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산을 포유동물 세포에서 발현시키는 단계; 및
    B) 상기 세포 또는 세포 배양 상청액으로부터 상기 항체를 회수하는 단계,
    이중특이적 항체의 (ⅰ) 발현 동안; 또는 (ⅱ) 발현 및 정제 후, 상기 프로테아제 절단 부위를 절단할 수 있는 프로테아제에 의해, 프로테아제 절단 부위를 포함하는 펩티드 링커를 절단하는 단계를 포함하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    (a) 펩티드 링커는 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하는데, 이때, 펩티드 링커는 이중특이적 항체의 발현 동안 퓨린에 의해 절단되거나; 또는
    (b) 펩티드 링커는 Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위를 포함하는데, 이때, 펩티드 링커는 이중특이적 항체의 정제 동안 또는 정제 후 Prescission 프로테아제에 의해 절단되는, 방법
  16. 제 13 항에 있어서, 퓨린에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:13 또는 SEQ ID NO:14 인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서, Prescission 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 프로테아제 절단 부위가 SEQ ID NO:15 인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 13 항에 있어서, 포유동물 세포가 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포 또는 PER.C6 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 13 항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체.
  20. 제 14 항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체.
  21. 제 15 항에 따른 방법에 의해 수득되는 항체.
  22. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물.
  23. 제 19 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물.
  24. 제 20 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물.
  25. 제 21 항에 따른 이중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물.

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