CN116648256A

CN116648256A - 稳定化的tcr构建体及使用方法

Info

Publication number: CN116648256A
Application number: CN202180086149.4A
Authority: CN
Inventors: E·埃斯科巴-卡布瑞拉; L·弗赖伯格; D·T·巴顿; L·G·普雷斯塔; P·法伯; C·M·史蒂文斯
Original assignee: Yeast Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Yeast Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2021-12-21
Publication date: 2023-08-25
Also published as: JP2023554119A; WO2022133592A1; CA3167637A1; EP4263593A1; US20240052009A1; AU2021408160A1; KR20230123474A

Abstract

稳定化的TCR构建体，其包含具有可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域的TCRα链多肽和具有可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域的TCRβ链多肽。通过向Cα结构域和/或Cβ结构域中引入稳定化突变来稳定TCR构建体，所述稳定化突变诸如在Cα结构域和Cβ结构域之间的非天然存在的二硫键(链间二硫键)、非天然存在的链内二硫键、点突变、环截短突变及其组合。还描述了包含一个或多个TCR构建体和支架和/或其他生物活性部分的TCR融合蛋白。

Description

稳定化的TCR构建体及使用方法

技术领域

本公开涉及用作治疗剂的可溶性T细胞受体的领域，并且尤其涉及稳定的TCR构建体和TCR融合蛋白。

背景技术

T细胞受体(TCR)是T细胞表面上存在的蛋白质。TCR通过与细胞表面上存在的I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)结合来调节免疫响应。呈递经由TCR激活T细胞的肽序列的MHC会触发免疫响应。在癌症的情况下，经突变或过表达的肽序列可以呈递在癌细胞的表面上。TCR可以区分具有单个氨基酸突变的肽，并从而提供特异性靶向这些突变肽-MHC复合物的机会。

TCR属于蛋白质的免疫球蛋白超家族(IgSF)并与抗体具有某些结构相似性。类似于抗体的Fab部分，TCR包括两条独特的链，每条链含有一个可变结构域和一个恒定结构域，该可变结构域中的高度可变环(CDR)提供TCR的结合选择性。

TCR是含有跨膜结构域的膜结合蛋白。人们对开发可溶性形式的TCR作为治疗剂一直感兴趣，但是可溶性TCR是具有低表达和低稳定性的固有不稳定蛋白。已经描述了提高可溶性TCR的稳定性的修饰。国际专利公开号WO 2004/074322描述了一种稳定化的可溶性TCR，其在恒定结构域残基之间包含不存在于天然TCR中的二硫键。国际专利公开号WO2016/070814描述了一种高稳定性的可溶性TCR，其包含连接TCRα和β链的恒定结构域的人工链间二硫键，并且国际专利公开号WO 2016/184258描述了一种稳定化的可溶性异源二聚体TCR，其在α链可变区和β链恒定区之间含有人工链间二硫键。也已经描述了改善可溶性TCR的稳定性的点突变(参见，Shusta等人，2000，Nature Biotechnol.，18：754-759，和Gunnarsen等人，2013，Scientific Reports，3：1162)。

TCR胞外部分与人免疫球蛋白(Ig)的不同结构域融合也已经被用作增加TCR的表达和/或改善其稳定性的策略(参见，Lunde等人，2010，BMC Biotechnol.，10：61；Ozawa等人2012，Biochem.Biophys.Res.Commun.，422：245-249；和Wu等人，2015，MAbs，7：364-376)。

国际专利公开号WO 1999/018129描述了一种单链TCR(sc-TCR)，其中TCR的α链和β链以柔性接头连接。经证实sc-TCR具有改善的稳定性。还描述了sc-TCR融合蛋白，其包括与免疫球蛋白轻链恒定区融合的共价连接的TCR Vα链和Vβ链。美国专利号6,534,633和8，105,830描述了通过肽接头序列共价连接到至少一种单链抗体(sc-Ab)的sc-TCR。

提供该背景信息的目的在于使申请人相信的已知信息成为与本公开可能相关的信息。不一定旨在承认，也不应该解释为，任何前述信息构成了针对所要求保护的发明的现有技术。

发明内容

本文描述了稳定化的TCR构建体及使用方法。在一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含：稳定化突变，所述稳定化突变包含在所述Cα结构域和所述Cβ结构域之间的第一链间二硫键；和一个或多个额外的稳定化突变，所述一个或多个额外的稳定化突变选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 128和TRBC11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；j)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；k)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；l)在位置TRAC26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；o)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；q)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；r)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；s)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；t)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；u)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及v)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，其中氨基酸的编号是IMGT编号，并且其中与仅包含第一非天然存在的二硫键的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

在另一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含一个或多个选自以下的稳定化突变：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 39和TRAC85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；i)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；j)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；k)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；l)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；o)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；p)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；q)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；r)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；s)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；t)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及u)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，其中氨基酸的编号是IMGT编号，并且其中与不包含一个或多个稳定化突变的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

在另一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域一起包含两个或多个选自以下的稳定化突变：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 84.2和TRBC79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；j)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；k)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；l)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；o)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；p)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；q)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；r)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；s)在位置TRBC36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；t)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；u)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；v)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及w)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，其中氨基酸的编号是IMGT编号，并且其中与不包含两个或多个稳定化突变的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

在另一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，所述TCR构建体包含对于表2所示任一变体阐述的氨基酸突变组合，其中所述氨基酸的编号是IMGT编号。

在另一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，所述TCR构建体包含对于表3所示任一变体阐述的氨基酸突变组合，其中所述氨基酸的编号是IMGT编号。

在另一方面，本发明涉及一种TCR融合蛋白，其包含一个或多个本文所述的TCR构建体和支架，其中所述TCR构建体中的至少一个融合到所述支架上。

在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白以及药学上可接受的载剂或稀释剂。

在另一方面，本公开涉及一种多核苷酸或多核苷酸集合，其编码如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白。

在另一方面，本公开涉及一种制备如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白的方法，其包括用编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或多核苷酸集合转染细胞，并在适于表达TCR构建体或TCR融合蛋白的条件下培养细胞。

在另一方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白。

在另一方面，本公开涉及如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白在治疗中的用途。

附图说明

图1呈现了如本文和实施例中所述的示例性TCR融合蛋白和对照的示意图。(A)对照单臂抗体(OA-scFv)；(B)包含两条scFv臂的对照抗体(双scFv)；(C)TCR-scFv；(D)单臂α融合物；(E)单臂α融合物-DS；(F)双α融合物-DS；(G)双融合物；(H)单臂β融合物；(I)单臂β融合物-DS；(J)双β融合物-DS；(K)双特异性α融合物；(L)双特异性β融合物；(M)嵌合体双特异性；(N)双特异性串联β融合物；(O)2x1双特异性β融合物；(P)3x1双特异性β融合物；(Q)4x1双特异性C端β融合物；(R)4x1双特异性轻链β融合物；(S)单臂α融合物，和(T)单臂β融合物。TRAC和TRBC结构域之间的黑条表示链间二硫键(“DS”)。

图2呈现了包含如本文所述的示例性稳定化突变的TCR融合蛋白的差示扫描量热(DSC)热谱图(v21230：IC二硫键；v22712：TRBC/6.VAL-＞LEU+IC二硫键，和v28881：TRBC/6.VAL-＞ILE+IC二硫键)。DSC热谱图上的每个峰对应于一个热转变。有三个期望热转变：TCR、CH2(～71℃)和CH3(～80℃)。TCR的转变包括TRAV-TRBV和TRAC-TRBC界面。

图3呈现了在(A)37℃和(B)32℃下表达后，本文所述的示例性TCR融合蛋白(变体v21230，含有IC二硫键)的UPLC-SEC迹线的比较。单分散物质在2.6分钟时洗脱。高分子量物质(聚集体)在单分散物质之前洗脱。2.8分钟和3.25分钟的峰分别对应于错配的抗CD3scFv同源二聚体和未配对的抗CD3 scFv。

图4呈现了差示扫描量热(DSC)热谱图，其显示了与仅包含IC二硫键的TCR融合蛋白(v21230)相比，包含本文所述的TRAC-铰链二硫键的示例性TCR融合蛋白(v22752：IC二硫键+TRAC-铰链二硫键)的Tm变化。DSC热谱图上的每个峰对应于图2所述的热转变。

图5示出了通过流式细胞术测得的以下示例性TCR融合蛋白与靶细胞表面肽-MHC复合物的结合：(A)变体v21230(包含IC二硫键的对照)，以及变体v22705、v22707和v22709；(B)变体v21230(包含IC二硫键的对照)，以及变体v22712、v22716、v22720和v22722；(C)变体v21230(包含IC二硫键的对照)，以及变体v22729、v22730、v22748和v22752，以及(D)变体v21230(包含IC二硫键的对照)，以及变体v22772、v22837、v22840和v22842。(参见表4.1和表8.1中变体的描述)。

图6呈现了针对示例性TCR融合蛋白与靶细胞表面肽-MHC复合物的结合所测量的EC₅₀值(通过流式细胞术评估)。虚线对应于含有IC二硫键的对照变体v21230的EC₅₀。

图7呈现了在具有不同格式的示例性TCR融合蛋白中使用低亲和力TCR组分的亲合力效果评估的结果。变体v30972(双特异性串联β融合物)、v30964(双特异性β融合物)、v30975(单臂β融合物)和v30968(2x1双特异性β融合物)包含低亲和力抗gp100 TCR组分。变体v29011(单臂β融合物)和v31327(双特异性β融合物)包含较高亲和力的抗gp100 TCR组分。变体v30968包含TCR组分的2个拷贝，所有其他变体包含TCR组分的一个拷贝。

图8呈现了两种示例性TCR融合蛋白的UPLC-SEC迹线：(A)变体v32548，其是包含抗NY-ESO1 TCR的“4x1串联”格式，和(B)变体v32549，其是包含抗NY-ESO1 TCR的“4x1 LC”格式。

图9呈现了TCRα链恒定区(TRAC；SEQ ID NO：1)和TCRβ链恒定区(TRBC1；SEQ IDNO：2和TRBC2；SEQ ID NO：3)的氨基酸序列，以及标准的IMGT编号。TRBC1和TRBC2序列之间的差异以粗斜体示出。

图10示出了具有不同格式的TCR融合蛋白的细胞毒性作用，如通过T2 T细胞依赖性细胞毒性测定所测量的。TCR融合蛋白包含稳定的亲和力成熟的1G4-33A抗NY-ESO1 TCR和抗CD3 Fab或scFv。变体v31185是缺乏抗CD3组分的对照单臂TCR构建体。

图11呈现了包含稳定化突变的示例性组合的TCR融合蛋白变体的表(表2)。

图12呈现了包含稳定化突变的示例性组合的TCR融合蛋白变体的表(表3)。

具体实施方式

本公开涉及稳定的TCR构建体。所述TCR构建体包含具有可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域的TCRα链多肽和具有可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域的TCRβ链多肽，并且通过将稳定化突变引入Cα结构域和/或Cβ结构域而被稳定。稳定化突变可以包括一个或多个非天然存在的链间二硫键、一个或多个非天然存在的链内二硫键、一个或多个点突变、一个或多个环截短突变或其组合。

在某些实施方案中，稳定化突变包括在Cα结构域和Cβ结构域之间引入非天然存在的二硫键(链间二硫键)，以及一个或多个额外的稳定化突变。额外的稳定化突变可包括额外的非天然存在的链间二硫键、非天然存在的链内二硫键、点突变、环截短突变或其组合。

本文还公开了TCR融合蛋白，其包含一个或多个如本文所述的TCR构建体，其融合到支架诸如免疫球蛋白(Ig)Fc区上。Ig Fc区可以是例如IgG或IgA Fc区。

TCR构建体和TCR融合蛋白可用作例如治疗剂或诊断剂。

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。

如本文所用，术语“约”是指与给定值相差大约+/-10％的变化。应当理解，无论是否特别提及，此类变化总是包括在本文提供的任何给定值中。

除非上下文中另有明确规定，否则词“一”或“一种(个)”当在本文中连同术语“包含”使用时可意指“一个”，但是也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或一个以上”的含义一致。

如本文所用，术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的，并且不排除附加的、未列举的要素和/或方法步骤。当在本文中结合组合物、用途或方法一起使用时，术语“基本上由……组成”表示可以存在附加的要素和/或方法步骤，但是这些附加不会实质性影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。术语“由......组成”当在本文中与组合物、用途或方法相连使用时，排除了额外要素和/或方法步骤的存在。本文描述为包含某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法也可以在某些实施方案中基本上由那些要素和/或步骤组成，而在其他实施方案中由那些要素和/或步骤组成，无论是否特别提及了这些实施方案。

当本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白的两个组分“融合”时，意指所述组分通过肽键直接连接或经由肽接头连接。

术语“源自”和“基于”当关于重组氨基酸序列使用时，意指重组氨基酸序列与相应的野生型氨基酸序列基本上相同。例如，源自(或基于)野生型Ig Fc序列的Ig Fc氨基酸序列与野生型Ig Fc序列基本上相同(例如，具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性)。

在本文中提供值的范围的情况下，例如将值定义为在上限值和下限值“之间”的情况下，应该理解该范围涵盖上限值和下限值以及每个中间值。

考虑到本文讨论的关于TCR构建体的任何实施方案可以关于本文公开的任何融合蛋白、方法、用途或组合物来实现。

胞外TCR结构域中的氨基酸残基根据IMGT编号系统进行编号(Lefranc等人，2005，Developmental and Comparative Immunology，29：185-203.也参见图9)。

TCR构建体

本公开的TCR构建体基于αβTCR异源二聚体，并且包含具有可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域的TCRα链多肽及具有可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域的TCRβ链多肽。通过将稳定化突变引入Cα结构域和/或Cβ结构域来稳定TCR构建体。

人野生型αβTCR包含Cα结构域(T细胞受体α恒定结构域(TRAC))和Cβ结构域(T细胞受体β恒定结构域1(TRBC1)或T细胞受体β恒定结构域2(TRBC2))。TRBC1和TRBC2的序列只有3个残基不同：位置TRBC/1.4在TRBC1中是Asn并且在TRBC2中是Lys，位置TRBC/1.3在TRBC1中是Lys并且在TRBC2中是Asn，以及位置TRBC/29在TRBC1中是Phe并且在TRBC2中是Tyr。在图9中示出了人TRAC(SEQ ID NO：1)、TRBC1(SEQ ID NO：2)和TRBC2(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。

如本文所用，术语“Cα结构域”是指TRAC Cα结构域的氨基酸序列，不包括任何跨膜序列。本文所述的TCR构建体包含的Cα结构域可任选地包含位置TRAC/128处的天然存在的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，TCR构建体包含的Cα结构域具有如SEQ ID NO:1中所示的人TRAC Cα结构域的氨基酸序列(即终止于位置TRAC/127)。在一些实施方案中，例如当TCR构建体包含牵涉位置TRAC/128处的天然存在的半胱氨酸残基的二硫键时，TCR构建体包含的Cα结构域具有如SEQ ID NO:4所示的人TRAC Cα结构域的氨基酸序列(即包括位置TRAC/128处的半胱氨酸残基)。

如本文所用，术语“Cβ结构域”是指TRBC Cβ结构域的氨基酸序列，不包括任何跨膜序列。在一些实施方案中，TCR构建体包含的Cβ结构域具有终止于位置TRBC/126的人TRBC1或TRBC2 Cβ结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，TCR构建体包含的Cβ结构域具有如SEQ ID NO:2中所示的人TRBC1 Cβ结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，TCR构建体包含的Cβ结构域具有如SEQ ID NO:3中所示的人TRBC2 Cβ结构域的氨基酸序列。在一些实施方案中，TCR构建体包含的Cβ结构域具有人TRBC1 Cβ结构域的氨基酸序列，其中位置85.1已经从半胱氨酸突变为丙氨酸，如SEQ ID NO:43所示。

在某些实施方案中，TCRβ链多肽还包含在Cβ结构域的C端的半胱氨酸残基，其与如本文所述的TCRα链多肽的Cα结构域中的半胱氨酸残基形成非天然存在的二硫键。TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的半胱氨酸残基可以是单个氨基酸添加，或者所述半胱氨酸残基可以是如本文所述的TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的短氨基酸延伸的一部分。在一些实施方案中，所述半胱氨酸残基可以是TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处，短氨基酸延伸(例如长度在1至约10个氨基酸之间)的一部分。在一些实施方案中，所述半胱氨酸残基可以是TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处，短氨基酸延伸(例如长度在1至约10个氨基酸之间)的一部分，其中所述氨基酸延伸包含IgG1铰链区序列的全部或一部分，例如3个或更多个连续氨基酸，诸如EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]或EPKSCDKTHTCPPCP[SEQ ID NO:21]。

引入本公开的TCR构建体的Cα结构域和/或Cβ结构域中的稳定化突变可以包括非天然存在的链间二硫键、非天然存在的链内二硫键、点突变、环截短突变及其组合，如下文详细描述的。与不包含稳定化突变的TCR构建体相比，所述TCR构建体包含的稳定化突变改善TCR构建体的稳定性。在这种情况下改善TCR构建体的稳定性可以包括改善TCR构建体的热稳定性，改善TCR构建体的胶体稳定性，或两者。

在某些实施方案中，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体相比，本公开的TCR构建体显示出热稳定性的改善。可以例如通过测量TCR构建体的解链温度(Tm)来评估TCR构建体的热稳定性。因此，在一些实施方案中，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的Tm。

在某些实施方案中，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，本公开的TCR构建体的Tm增加0.5℃或更多。在一些实施方案中，所述TCR构建体的Tm与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃或更多，例如，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，增加2℃或更多、3℃或更多、4℃或更多或5℃或更多。

在某些实施方案中，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，本公开的TCR构建体的Tm增加0.5℃至约10℃。在一些实施方案中，所述TCR构建体的Tm与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃至约10℃，例如，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃至约9℃、1℃至约8℃或1℃至约7℃。在一些实施方案中，所述TCR构建体的Tm与不包含稳定化突变的相应TCR构建体的Tm相比，增加2℃至约10℃、2℃至约9℃、2℃至约8℃或2℃至约7℃。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含在Cα结构域和Cβ结构域之间的非天然存在的二硫键(“第一非天然存在的链间二硫键”)，以及一个或多个如本文所述的额外的稳定化突变，并且与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体相比，具有增加的Tm。

在某些实施方案中，所述TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，并且Tm与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加0.5℃或更多，例如与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃或更多、2℃或更多、3℃或更多、4℃或更多或5℃或更多。

在某些实施方案中，所述TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，并且Tm与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加0.5℃至约10℃，例如与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃至约10℃、1℃至约9℃、1℃至约8℃或1℃至约7℃。在一些实施方案中，包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变的TCR构建体的Tm与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加2℃至约10℃、2℃至约9℃、2℃至约8℃或2℃至约7℃。

TCR构建体的Tm可以测量，例如，通过使用标准技术的圆二色谱法(CD)、差示扫描量热法(DSC)或差示扫描荧光测定法(DSF)测量。在某些实施方案中，与规定的相应对照TCR构建体(例如，不包含稳定化突变的相应TCR构建体或仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体)相比，所述TCR构建体具有增加的Tm，其中Tm通过DSC测量。

在某些实施方案中，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体相比，本公开的TCR构建体显示出胶体稳定性的改善。例如，可以通过测量在TCR构建体表达期间出现的TCR构建体的高分子量(HMW)物质(或聚集物)的量来评估胶体稳定性。因此，在一些实施方案中，当在相同条件下表达时，与不包含稳定化突变的相应TCR构建体相比，本公开的TCR构建体显示HMW物质(聚集物)的量减少。在某些实施方案中，所述TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，并且与仅包含第一非天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体相比，当在相同条件下表达时，显示出HMW物质(聚集物)的量减少。

TCR构建体制剂中存在的HMW物质的量可以通过本领域已知的各种标准技术来评估。例如，TCR构建体制剂中HMW物质的量可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)，例如使用UPLC-SEC或动态光散射(DLS)来评估。在某些实施方案中，与规定的相应对照TCR构建体相比，所述TCR构建体显示HMW物质的量减少，其中HMW物质的量通过UPLC-SEC进行评估。

先前已经描述了在位置TRAC/84.THR-TRBC/79.SER处的半胱氨酸取代之间的非天然存在的链间二硫键，其稳定可溶性αβTCR(Boulter等,2003,PEDS,16:707-711)。这种TRAC/84.THR-TRBC/79.SER二硫键在本文中称为“IC二硫键”。在某些实施方案中，与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体相比，本公开的TCR构建体具有增加的Tm。在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含第一非天然存在的二硫键和一个或多个如本文所述的额外的稳定化突变(其中第一非天然存在的二硫键是IC二硫键)，并且与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体相比具有增加的Tm。

在某些实施方案中，与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，本公开的TCR构建体的Tm增加0.5℃或更多。在一些实施方案中，所述TCR构建体的Tm与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃或更多，例如，与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加2℃或更多、3℃或更多、4℃或更多或5℃或更多。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体的Tm与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加0.5℃至约10℃，例如与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加1℃至约10℃、1℃至约9℃、1℃至约8℃或1℃至约7℃。在一些实施方案中，所述TCR构建体的Tm与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体的Tm相比，增加2℃至约10℃、2℃至约9℃、2℃至约8℃或2℃至约7℃。

在某些实施方案中，当在相同条件下表达时，与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体相比，本公开的TCR构建体显示HMW物质的量基本上相同或减少。在HMW物质的量的上下文中“基本上相同”意指当在相同条件下表达时，对于测试TCR构建体测得的HMW物质的量是对于仅包含IC二硫键的相应TCR构建体测得的HMW物质的量的±10％。在某些实施方案中，HMW物质的量通过UPLC-SEC测量。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含IC二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，并具有以下特性中的一种或多种：(i)与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体相比，Tm增加，和/或(ii)当在相同条件下表达时，与仅包含IC二硫键的相应TCR构建体相比，HMW物质的量减少。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含第一天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，并具有以下特性中的一种或多种：(i)与仅包含第一天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体相比，Tm增加，和/或(ii)当在相同条件下表达时，与仅包含第一天然存在的链间二硫键的相应TCR构建体相比，HMW物质的量减少。

稳定化突变

本发明的TCR构建体包含的稳定化突变是通过本文所述的结构和计算指导的设计和实验筛选的迭代过程鉴定的。使用基于蛋白质数据库(PDB)结构的TCR模型的计算机模拟建模用于鉴定TRAC和TRBC结构域中可潜在地改善TCR的热稳定性和/或胶体稳定性的突变设计，并且这些随后进行实验测试。

通过这种方法鉴定的成功改善TCR构建体的热稳定性和/或胶体稳定性的突变设计包括二硫键(非天然存在的链间二硫键和/或非天然存在的链内二硫键)、点突变、环截短突变及其组合。

I.二硫键

通过上述方法鉴定的稳定化二硫键包括非天然存在的链间二硫键和非天然存在的链内二硫键。在这种情况下，非天然存在的链间二硫键是TCR构建体的Ca结构域中的半胱氨酸残基与TCR构建体的Cβ结构域中的半胱氨酸残基之间的二硫键，其在野生型TCR中不存在。非天然存在的链间二硫键的一个或两个半胱氨酸残基通过用半胱氨酸残基取代给定位置的野生型残基(“半胱氨酸残基取代”或“半胱氨酸取代”)或通过在Ca结构域或Cβ结构域的C端添加半胱氨酸残基而引入。

非天然存在的链内二硫键是TCR构建体的Cα结构域中两个半胱氨酸残基之间或TCR构建体的Cβ结构域中两个半胱氨酸残基之间的二硫键，其在野生型TCR中不存在。非天然存在的链内二硫键的一个或两个半胱氨酸残基通过用半胱氨酸残基取代给定位置的野生型残基(“半胱氨酸残基取代”或“半胱氨酸取代”)或通过在Ca结构域或Cβ结构域的C端添加半胱氨酸残基而引入。

a)链间二硫键

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含至少一个非天然存在的链间二硫键。

在某些实施方案中，TCR构建体可包含的非天然存在的链间二硫键包括“铰链二硫键”。如本文所用的“铰链二硫键”是指在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基与TCRα链多肽的Cα结构域中的半胱氨酸残基之间形成的二硫键。

在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基可以是单个氨基酸添加，或者所述半胱氨酸残基可以是TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的短氨基酸延伸的一部分。在半胱氨酸残基作为氨基酸延伸的一部分添加在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的那些实施方案中，氨基酸延伸的长度通常为10个氨基酸或更少。在一些实施方案中，在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基是氨基酸延伸的一部分，所述氨基酸延伸的长度为10个氨基酸或更少，例如，长度为9个氨基酸或更少，长度为8个氨基酸或更少，长度为7个氨基酸或更少，长度为6个氨基酸或更少，或长度为5个氨基酸或更少。

在一些实施方案中，在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基是氨基酸延伸的一部分，所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸。在一些实施方案中，在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基是氨基酸延伸的一部分，所述氨基酸延伸的长度为1至约9个氨基酸，例如，长度为1至约8个氨基酸，长度为1至约7个氨基酸，长度为1至约6个氨基酸，或长度为1至约5个氨基酸。在一些实施方案中，在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基是氨基酸延伸的一部分，所述氨基酸延伸的长度为2至约10个氨基酸，例如，长度为2至约9个氨基酸，例如长度为2至约8个氨基酸，长度为2至约7个氨基酸，长度为2至约6个氨基酸，或长度为2至约5个氨基酸。

在某些实施方案中，氨基酸延伸包含半胱氨酸残基和一个或两个“接头”，其中所述接头由除半胱氨酸以外的氨基酸组成。因此，在一些实施方案中，TCRβ链多肽的Cβ结构域包含在C端的氨基酸延伸，所述氨基酸延伸具有下列结构之一(从N端到C端)：

接头-Cys，

Cys-接头或

接头-Cys-接头。

当存在时，接头允许氨基酸延伸的半胱氨酸残基相对于其在TCRα链多肽的Cα结构域中的同源半胱氨酸残基呈现正确的构象，从而形成所需的二硫键。接头肽可以具有本领域已知的许多氨基酸序列中的一种，以在多肽和蛋白质序列中成功地起到接头或间隔区的作用。

在一些实施方案中，接头肽可包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr，或其组合。有用的接头的实例包括但不限于甘氨酸-丝氨酸接头，诸如(GS)_n、(GSGGS)_n、(GGGGS)_n和(GGGS)_n(其中n是1至4之间的整数)，以及具有类似构型的甘氨酸-丙氨酸接头和丙氨酸-丝氨酸接头。

在一些实施方案中，氨基酸延伸可包含来自免疫球蛋白或来自TCR的铰链区序列的全部或一部分。在此类实施方案中，氨基酸延伸中包括的半胱氨酸残基可以天然存在于铰链区序列中，或者可以是通过氨基酸取代引入的。氨基酸延伸可包含其全部或一部分(例如，至少2、3、4、5、6个或更多个连续氨基酸)的铰链区序列的非限制性实例包括：ESSCDVKLVEKSFET(SEQ ID NO:5)(TCRα)；DCGFT S(SEQ ID NO:6)(TCRβ)；DVITMDPKDNCSKDAN(SEQ ID NO:7)(TCRγ)；DHVKPKETENTKQPSKSCHKPK(SEQ ID NO:8)(TC Rδ)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:9)(IgG1)；ERKCCVECP PCP(SEQ ID NO：10)(IgG2)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：11)(IgG3-H1)；EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO：12)(IgG3-H2，IgG3-H3 and IgG3-H4)；ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO：13)(IgG4)；VPPPPP(SEQ ID NO：14)(IgA2)。

免疫球蛋白铰链区序列可分为“上部”铰链区、“核心”铰链区和“下部”铰链区。例如，对于IgG1而言，完整的铰链区序列是：EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(SEQ ID NO：15)。IgG铰链的上部铰链区通常定义为从Glu216延伸到Thr225(EU编号)(即EPKSCDKTHT(SEQ ID NO：16))，核心铰链区通常定义为从Cys226延伸到Pro230(EU编号)(即CPPCP(SEQ ID NO：17))，并且下部铰链区通常定义为从Ala231延伸到Pro238(EU编号)(即APELLGG(SEQ ID NO：18))(参见，Burton，1985，Molec.Immunol.，22：161-206)。

在某些实施方案中，氨基酸延伸包含免疫球蛋白铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含免疫球蛋白上部和/或核心铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含免疫球蛋白上部铰链区序列的全部或一部分。

在一些实施方案中，氨基酸延伸包含IgG1铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含IgG1上部和/或核心铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含IgG1上部铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含序列：EPKSC[SEQ ID NO：19]。在一些实施方案中，氨基酸延伸包含序列：EPKSCDKTHT[SEQ ID NO：16]。

TCRα链多肽的Cα结构域中与在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基形成铰链二硫键的半胱氨酸残基可以是天然存在的半胱氨酸残基(例如，位置TRAC 128处的天然存在的半胱氨酸残基)，或者可以是靠近TCRα链多肽C端的位置的半胱氨酸取代。在这种情况下“靠近”意指在TCRα链多肽的C端的10个氨基酸内。

在某些实施方案中，TCRα链多肽的Cα结构域中与在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端添加的半胱氨酸残基形成铰链二硫键的半胱氨酸残基，是位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基。

在某些实施方案中，TCR构建体包含在以下两者之间形成的非天然存在的链间二硫键：

i)在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，与

ii)TCRα链多肽的Cα结构域中位置TRAC 128处的天然存在的半胱氨酸残基。

i)在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸中的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]，与

TCR构建体可包含的其他非天然存在的链间二硫键包括：

i)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

ii)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

iii)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

iv)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

v)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

vi)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及

vii)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

在某些实施方案中，TCR构建体包含的非天然存在的链间二硫键可包括IC二硫键(人在TCRα链多肽中的位置TRAC 84与TCRβ链多肽中的位置TRBC 79的半胱氨酸残基取代之间的二硫键)。

在某些实施方案中，TCR构建体包含选自以下的非天然存在的链间二硫键：

(a)在以下两者之间形成的二硫键：i)TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸(例如，氨基酸延伸包含来自免疫球蛋白或来自TCR的铰链区序列的全部或一部分，诸如氨基酸延伸具有以下序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16])，和ii)TCRα链多肽的Cα结构域中位置TRAC 128处的天然存在的半胱氨酸残基；

b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

c)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

d)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

e)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

f)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

g)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及

i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

c)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

d)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

e)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及

g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

b)链内二硫键

可以作为稳定化突变包括在TCR构建体中的链内二硫键包括TCR构建体的Cα结构域中的两个半胱氨酸残基之间的二硫键和TCR构建体的Cβ结构域中的两个半胱氨酸残基之间的二硫键。通常，构成链内二硫键的半胱氨酸残基中的至少一个是Cα结构域或Cβ结构域中天然存在的残基的半胱氨酸取代。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含一个或多个链内二硫键。在一些实施方案中，TCR构建体包含TCR构建体的Cα结构域中的两个半胱氨酸残基之间的链内二硫键。在一些实施方案中，TCR构建体包含TCR构建体的Cα结构域中的两个半胱氨酸残基之间的链内二硫键，其中二硫键中牵涉的两个半胱氨酸残基都是半胱氨酸取代。

在某些实施方案中，可包括在TCR构建体中的非天然存在的链内二硫键包括：i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键，和ii)在位置TRAC 26和TRAC85.1处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

在本公开的TCR构建体包含链间二硫键的某些实施方案中，TCR构建体还可以包含一个或多个链内二硫键作为额外的稳定化突变。

II.点突变和环截短突变

通过上文概述并在实施例中描述的方法鉴定了许多稳定化点突变和环截短突变。本公开的TCR构建体可以包括这些稳定化点突变和/或环截短突变中的一个或多个。

如本文所用的“点突变”是指用不同的氨基酸取代野生型序列中出现的氨基酸。在某些实施方案中，TCR构建体包含一个或多个稳定化点突变，其是在一个或多个下列位置的氨基酸取代：TRAC 4、TRAC 26、TRAC 39、TRAC 85、TRAC 105、TRAC 120、TRBC 6、TRBC 36、TRBC 86和TRBC 45.3。

在某些实施方案中，TCR构建体包含一个或多个选自以下的稳定化点突变：

i)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

ii)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

iii)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

iv)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

v)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

vi)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

vii)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

viii)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

ix)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；以及

x)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代。

在某些实施方案中，在位置TRAC 4处的氨基酸取代是从Val到Ile。在某些实施方案中，在位置TRAC 26处的氨基酸取代是从Thr到Ile。在某些实施方案中，在位置TRAC 39处的氨基酸取代是从Val到Ile。在某些实施方案中，在位置TRAC 85处的氨基酸取代是从Ala到Val。在某些实施方案中，在位置TRAC 105处的氨基酸取代是从Ala到Ser。在某些实施方案中，在位置TRAC 120处的氨基酸取代是从Phe到Tyr。在某些实施方案中，在位置TRBC 6处的氨基酸取代是从Val到Ile或Leu。在某些实施方案中，在位置TRBC 36处的氨基酸取代是从His到Phe。在某些实施方案中，在位置TRBC 86处的氨基酸取代是从Ser到Thr。在某些实施方案中，在位置TRBC 45.3处的氨基酸取代是从Val到Thr。

i)在位置TRAC 4处从Val到Ile的氨基酸取代；

ii)在位置TRAC 26处从Thr到Ile的氨基酸取代；

iii)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

iv)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

v)在位置TRAC 105处从Ala到Ser的氨基酸取代；

vi)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr的氨基酸取代；

vii)在位置TRBC 6处从Val到Ile或Leu的氨基酸取代；

viii)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代；

ix)在位置TRBC 86处从Ser到Thr的氨基酸取代；以及

x)在位置TRBC 45.3处从Val到Thr的氨基酸取代。

如本文所用的“环截短突变”是指因环中一个或多个氨基酸的缺失，或因环的全部或一部分被较短的氨基酸序列置换而缩短野生型TCR序列中天然存在的环的突变。在某些实施方案中，TCR构建体可以包含缩短TCR构建体的Cβ结构域中的DE环的环截短突变。Cβ结构域中的DE环长度为13个氨基酸并且从位置TRBC 84.1延伸到位置TRBC 85.1。在一些实施方案中，环截短突变将TCR构建体的Cβ结构域中的DE环缩短1至10个氨基酸。在一些实施方案中，环截短突变将TCR构建体的Cβ结构域中的DE环缩短1至9个氨基酸、1至8个氨基酸、1至7个氨基酸、1至6个氨基酸、1至5个氨基酸或1至4个氨基酸。

在某些非人物种中，TCR Cβ结构域中的DE环在氨基酸序列上不同于人TCR Cβ结构域中的DE环，并且明显比人TCR DE环短3或4个残基。因此，在某些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是TCR构建体的Cβ结构域中DE环的一个或多个氨基酸，例如1至4个连续氨基酸，或1至3个连续氨基酸的缺失。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是位置TRBC 84.5至85.6的氨基酸的缺失。

在某些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是TCR构建体的Cβ结构域中DE环的全部或一部分被较短的氨基酸序列置换，使得DE环缩短1至8个氨基酸，例如1至7个氨基酸或1至6个氨基酸。

在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是DE环的5至13个连续氨基酸被较短的氨基酸序列置换。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是DE环的5至10个连续氨基酸，例如5至9个、5至8个或5至7个连续氨基酸被较短的氨基酸序列置换。

在一些实施方案中，选择较短的氨基酸序列，使其单独地或与插入位点的侧翼氨基酸组合提供β-转角基序，从而允许形成β-转角。使用例如本领域已知的序列分析软件和程序，可以容易地鉴定允许形成β-转角的氨基酸序列。在此类实施方案中，较短的氨基酸序列长度通常为2至4个氨基酸。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是DE环的5至13个连续氨基酸，例如5至10个连续氨基酸、5至9个、5至8个或5至7个连续氨基酸被允许形成β-转角的较短的氨基酸序列置换。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是DE环的5至13个连续氨基酸，例如5至10个连续氨基酸、5至9个、5至8个或5至7个连续氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的较短的氨基酸序列置换。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的较短的氨基酸序列置换。在一些实施方案中，TCR构建体包含环截短突变，其是位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

在某些实施方案中，TCR构建体包含一个或多个选自以下的环截短突变：

TCR构建体的Cβ结构域中DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

TCR构建体的Cβ结构域中DE环的5至7个连续氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

TCR构建体的Cβ结构域中DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

位置TRBC 84.5至85.6处的氨基酸的缺失，以及

位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

III.稳定化突变的组合

本公开的TCR构建体可以包含本文所述的稳定化突变中的一种或组合。

在某些实施方案中，TCR构建体包含以下稳定化突变中的一种或多种：

a)在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基；

f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

h)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

i)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

j)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

k)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

p)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

t)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

u)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

在一些实施方案中，TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸包含来自免疫球蛋白或来自TCR的铰链区序列的全部或一部分。在一些实施方案中，TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]。

在一些实施方案中，在位置TRAC 4处的氨基酸取代是从Val到Ile。在一些实施方案中，在位置TRAC 26处的氨基酸取代是从Thr到Ile。在一些实施方案中，在位置TRAC 39处的氨基酸取代是从Val到Ile。在一些实施方案中，在位置TRAC 85处的氨基酸取代是从Ala到Val。在一些实施方案中，在位置TRAC 105处的氨基酸取代是从Ala到Ser。在一些实施方案中，在位置TRAC 120处的氨基酸取代是从Phe到Tyr。在一些实施方案中，在位置TRBC 6处的氨基酸取代是从Val到Leu或Ile。在一些实施方案中，在位置TRBC 36处的氨基酸取代是从His到Phe。在一些实施方案中，在位置TRBC 86处的氨基酸取代是从Ser到Thr。在一些实施方案中，在位置TRBC 45.3处的氨基酸取代是从Val到Thr。

在一些实施方案中，TCR构建体的Cβ结构域中DE环的1至4个连续氨基酸的缺失是位置TRBC 84.5至85.6的氨基酸的缺失。

在一些实施方案中，位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

还考虑了TCR构建体的任何前述实施方案的组合，并且每个组合形成了用于本公开目的的独立实施方案。

在一些实施方案中，TCR构建体包含以下稳定化突变中的一种或多种：

a)在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基；

h)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

j)在位置TRAC 4处从Val到Ile的氨基酸取代；

k)在位置TRAC 26处从Thr到Ile的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 105处从Ala到Ser的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr的氨基酸取代；

p)在位置TRBC 6处从Val到Leu或Ile的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 86处从Ser到Thr的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 45.3处从Val到Thr的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 84.5至85.6处的氨基酸的缺失，以及

u)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含本文所述的稳定化突变中的两种或更多种的组合。TCR构建体可包含的稳定化突变的组合包括非天然存在的链间二硫键的组合、非天然存在的链内二硫键的组合、点突变和环截短突变的组合，以及包含不同类别的稳定化突变的组合。

在某些实施方案中，TCR构建体包含以下稳定化突变中的两种或更多种：

b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

j)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

k)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

l)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

p)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

q)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

u)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

v)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

w)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

在一些实施方案中，TCR构建体包含以下稳定化突变中的两种或更多种：

b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

j)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

l)在位置TRAC 4处从Val到Ile的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 26处从Thr到Ile的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

p)在位置TRAC 105处从Ala到Ser的氨基酸取代；

q)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 6处从Val到Ile或Leu的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 86处从Ser到Thr的氨基酸取代；

u)在位置TRBC 45.3处从Val到Thr的氨基酸取代；

v)在位置TRBC 84.5至85.6处的氨基酸的缺失，以及

w)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

在某些实施方案中，TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变的组合，其中所述额外的稳定化突变可以是额外的非天然存在的链间二硫键、非天然存在的链内二硫键、点突变、环截短突变或其组合，如本文所述。

在TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变的一些实施方案中，第一非天然存在的链间二硫键可以是已知的稳定化链间二硫键，或者可以是本文所述的稳定化链间二硫键之一。已知的稳定化链间二硫键的实例包括但不限于表1中列出的链间二硫键。

表1：增强TCR稳定性的链间二硫键

1该参考文献中使用的TRAC和TRBC编号与Garboczi等人，1996，Nature，384(6605)：134-141中使用的相同

在某些实施方案中，TCR构建体包含的第一非天然存在的链间二硫键是IC二硫键(即在TCRα链多肽中的位置TRAC 84与TCRβ链多肽中的位置TRBC 79的半胱氨酸残基取代之间的二硫键)。

在某些实施方案中，TCR构建体包含的第一个非天然存在的链间二硫键选自：

c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及

h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

在一些实施方案中，TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸包含来自免疫球蛋白或来自TCR的铰链区序列的全部或一部分。

在一些实施方案中，TCR构建体包含的第一个非天然存在的链间二硫键选自：

a)在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸中的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基；

a)在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基，以及

b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

a)在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸中的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基，以及

b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键，以及

c)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键(IC二硫键)。

在某些实施方案中，与第一非天然存在的链间二硫键组合的所述一个或多个额外的稳定化突变选自以下，其中第一非天然存在的链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的：

g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

j)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

k)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

u)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

v)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

在一些实施方案中，与第一非天然存在的链间二硫键组合的所述一个或多个额外的稳定化突变选自以下，其中第一非天然存在的链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的：

i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

k)在位置TRAC 4处从Val到Ile的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 26处从Thr到Ile的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 105处从Ala到Ser的氨基酸取代；

p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 6处从Val到Ile或Leu的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 86处从Ser到Thr的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 45.3处从Val到Thr的氨基酸取代；

u)在位置TRBC 84.5至85.6处的氨基酸的缺失，以及

v)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

在某些实施方案中，与非天然存在的链间二硫键组合的所述一个或多个额外的稳定化突变选自以下：

a)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

b)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

c)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；以及

d)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代。

a)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

b)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

c)在位置TRBC 6处从Val到Ile的氨基酸取代；以及

d)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代。

在某些实施方案中，与非天然存在的链间二硫键组合的所述额外的稳定化突变是以下的：

a)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

b)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

c)在位置TRBC 6处从Val到Ile的氨基酸取代；以及

d)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代。

在某些实施方案中，TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，其中第一非天然存在的二硫键是在以下两者之间形成的二硫键：i)在TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)TCRα链多肽的Cα结构域中位置TRAC 128处的天然存在的半胱氨酸残基，并且所述一个或多个稳定化突变包含选自以下的额外的非天然存在的链间二硫键：

a)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

在一些实施方案中，TCR构建体包含的第一非天然存在的链间二硫键是在以下两者之间形成的二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸中的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸具有序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]或EPKSCDKTHT[SEQ IDNO:16]，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的天然存在的半胱氨酸残基。

在某些实施方案中，TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变，其中第一非天然存在的二硫键是在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键，并且所述一个或多个稳定化突变包含选自以下的额外的非天然存在的链间二硫键：

b)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变的组合，其中所述组合是对于表2(图11)中列出的任一变体阐述的组合之一。在一些实施方案中，本公开的TCR构建体包含第一非天然存在的链间二硫键和一个或多个额外的稳定化突变的组合，其中所述组合是对于表3(图12)中列出的任一变体阐述的组合之一。

在某些实施方案中，本公开的TCR构建体包含两种或多种稳定化突变的组合，其中所述稳定化突变是点突变和/或环截短突变。在一些实施方案中，TCR构建体包含两个或更多个选自以下的稳定化突变：

i)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

ii)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

iv)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

vi)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

vii)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

viii)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

ix)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

x)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；

xi)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及

xii)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被允许形成β-转角的2至4个氨基酸的氨基酸序列置换。

在一些实施方案中，TCR构建体包含两个或更多个选自以下的稳定化突变：

i)在位置TRAC 4处从Val到Ile的氨基酸取代；

ii)在位置TRAC 26处从Thr到Ile的氨基酸取代；

iii)在位置TRAC 39处从Val到Ile的氨基酸取代；

iv)在位置TRAC 85处从Ala到Val的氨基酸取代；

v)在位置TRAC 105处从Ala到Ser的氨基酸取代；

vi)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr的氨基酸取代；

vii)在位置TRBC 6处从Val到Ile或Leu的氨基酸取代；

viii)在位置TRBC 36处从His到Phe的氨基酸取代；

ix)在位置TRBC 86处从Ser到Thr的氨基酸取代；

x)在位置TRBC 45.3处从Val到Thr的氨基酸取代；

xi)在位置TRBC 84.5至85.6处的氨基酸的缺失，以及

xii)位置TRBC 84.4至85.4的氨基酸被氨基酸Gly-Asn置换。

TCR融合蛋白

本公开的某些实施方案涉及TCR融合蛋白，其包含一个或多个如本文所述的TCR构建体，所述构建体可操作地连接至支架和/或一个或多个额外的生物活性部分。如本文使用的术语“可操作地连接”意指所述组分处于容许它们中的每一个以它们预期的方式起作用的关系。TCR构建体可以直接或间接连接到TCR融合蛋白中的支架或额外的生物活性部分。间接连接意指给定的TCR构建体经由另一组分，例如接头或第二TCR构建体，连接至支架或生物活性部分。考虑了TCR融合蛋白的各种形式，如下文更详细描述的。

本公开的TCR融合蛋白可以包含一个TCR构建体，或者它们可以包含多个TCR构建体。TCR融合蛋白可包含的TCR构建体的数目将取决于融合蛋白包含的支架和/或额外的生物活性部分的性质。通常，本公开的TCR融合蛋白包含1至24个TCR构建体。在某些实施方案中，TCR融合蛋白可包含1至12个TCR构建体、1至8个TCR构建体、1至6个TCR构建体、1至4个TCR构建体或1至3个TCR构建体。

支架

在某些实施方案中，本公开的TCR融合蛋白包含支架。支架可以是例如蛋白质(包括肽或多肽)、聚合物、纳米颗粒或另一种化学实体。当支架是蛋白质时，TCR融合蛋白包含的每个TCR构建体通常连接到蛋白质支架的N端或C端，但是在某些实施方案中也考虑了连接到除N端或C端以外的区域，例如，经由有或没有接头的氨基酸侧链连接。

在支架是蛋白质的实施方案中，TCR构建体可以通过遗传融合或化学缀合连接至支架。在支架是聚合物或纳米颗粒的实施方案中，TCR构建体通常通过化学缀合连接至支架。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含蛋白质支架。蛋白质支架的实例包括免疫球蛋白(Ig)Fc区、白蛋白、白蛋白类似物和衍生物、毒素、细胞因子、趋化因子、生长因子和蛋白质对，诸如亮氨酸拉链结构域(例如，Fos和Jun)(Kostelny等人，1992，J Immunol，148：1547-53；Wranik等人2012，J.Biol.Chem.，287：43331-43339)、bamase barstar对(Deyev等人，2003，Nat Biotechnol，21：1486-1492)和分裂荧光蛋白对(国际公开号WO 2011/13504)。白蛋白衍生物的实例包括在国际公开号WO 2012/116453和WO 2014/012082中描述的那些，其可以任选地经由接头与多达四个不同的TCR构建体融合。

在某些实施方案中也考虑了已经描述的与各种结合结构域组合的其他蛋白质支架(例如，参见Müller等人，2007，J Biol Chem，282：12650-12660；McDonaugh等人2012，MolCancer Ther，11：582-593；Vallera等人，2005，Clin Cancer Res，11：3879-3888；Song等人，2006，Biotech Appl Biochem，45：147-154；美国专利申请公开号US2009/0285816及国际公开号WO 2012/116453和WO 2014/012082)。

Fc区

在某些实施方案中，本文所述的TCR融合蛋白包含基于免疫球蛋白(Ig)Fc区的支架。如本文中可互换使用的术语“Fc区”、“Fc”和“Fc结构域”是指含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc区的两个多肽之一，即包含能够稳定自我缔合的免疫球蛋白重链的C端恒定区的多肽。

除非本文另有说明，否则Ig的Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)所述。

Fc区可以仅包含CH3结构域，或者同时包含CH3结构域和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列，每个序列被二聚Fc的两个Fc多肽之一包含。类似地，CH2结构域包含两个CH2序列，每个序列被二聚Fc的两个Fc多肽之一包含。

TCR融合蛋白包含的Ig Fc区可以基于IgG、IgA或IgM Fc区。在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于IgG Fc的支架。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于IgG1 Fc的支架。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于人IgG Fc的支架。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于人IgG1 Fc的支架。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含的Ig Fc区可以是变体Fc区，其在CH3结构域、CH2结构域或两者中包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含的Ig Fc区可以是变体Fc区，其是包含两种不同Fc多肽的异源二聚Fc。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于变体IgG Fc的支架，其中CH3结构域包含一个或多个氨基酸修饰(“经修饰的CH3结构域”)。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于变体IgG Fc的支架，其中CH2结构域包含一个或多个氨基酸修饰(“经修饰的CH2结构域”)。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于变体IgG Fc的支架，其中CH3结构域包含一个或多个氨基酸修饰并且CH2结构域包含一个或多个氨基酸修饰。

经修饰的CH3结构域

在某些实施方案中，本文所述的TCR融合蛋白包含异源二聚Ig Fc，其包含经修饰的CH3结构域。在一些此类实施方案中，经修饰的CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰。如本文所用，“不对称的氨基酸修饰”是指其中第一Fc多肽上特定位置处的氨基酸不同于第二Fc多肽上相应位置处的氨基酸的修饰。这些不对称的氨基酸修饰可以包括在每个Fc多肽上相应位置处的两个氨基酸中仅一个的修饰，或者它们可以包括在第一和第二Fc多肽上相应位置处的两个氨基酸的修饰。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含异源二聚Fc，其包含经修饰的CH3结构域，其中经修饰的CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰，所述不对称的氨基酸修饰促进异源二聚Fc的形成超过同源二聚Fc的形成。可对Fc的CH3结构域进行氨基酸修饰以便促进异源二聚Fc的形成是本领域已知的，包括例如国际公开号WO 96/027011(“杵-臼”)、Gunasekaran等人，2010，J Biol Chem，285，19637-46(“静电操纵”)、Davis等人，2010，ProtEng Des Sel，23(4)：195-202(链交换工程化结构域(SEED)技术)和Labrijn等人，2013，Proc Natl Acad Sci USA，110(13)：5145-50(Fab臂交换)中描述的那些。其他实例包括如国际公开号WO 2012/058768和WO 2013/063702中描述的结合阳性和阴性设计策略以产生稳定的不对称修饰的Fc区的方法。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含是具有经修饰的CH3结构域的异源二聚Fc的支架，如国际公开号WO 2012/058768或国际专利公开号WO 2013/063702中所述。

在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含是具有经修饰的CH3结构域的异源二聚人IgG1 Fc的支架。下面表4提供了人IgG1 Fc序列的氨基酸序列，其对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH2结构域通常被定义为包含全长人IgG1重链的氨基酸231-340，并且CH3结构域通常被定义为包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含具有经修饰的CH3结构域的异源二聚Fc，所述经修饰的CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰，所述不对称的氨基酸修饰促进异源二聚Fc的形成超过同源二聚Fc的形成，其中经修饰的CH3结构域包含在位置F405和Y407处包含氨基酸取代的第一Fc多肽，和在位置T366和T394处包含氨基酸取代的第二Fc多肽。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一Fc多肽的位置F405处的氨基酸取代是F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一Fc多肽的位置Y407处的氨基酸取代是Y407I或Y407V。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第二Fc多肽的位置T366处的氨基酸取代是T366I、T366L或T366M。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第二Fc多肽的位置T394处的氨基酸取代是T394W。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一Fc多肽还包含位置L351处的氨基酸取代，其为L351Y。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第二Fc多肽还包含位置K392处的氨基酸取代，其选自K392F、K392L和K392M。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一和第二Fc多肽中的一者或两者还包含氨基酸取代T350V。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含具有经修饰的CH3结构域的异源二聚Fc，所述经修饰的CH3结构域包含一个或多个不对称的氨基酸修饰，所述不对称的氨基酸修饰促进异源二聚Fc的形成超过同源二聚Fc的形成，其中经修饰的CH3结构域包含：第一Fc多肽，其包括氨基酸取代F405A、F405I、F405M、F405S、F405T或F405V连同氨基酸取代Y407I或Y407V；和第二Fc多肽，其包括氨基酸取代T366I、T366L或T366M连同氨基酸取代T394W。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一Fc多肽还包括氨基酸取代L351Y，和/或经修饰的CH3结构域的第二Fc多肽还包括氨基酸取代K392F、K392L或K392M。在一些实施方案中，经修饰的CH3结构域的第一和第二Fc多肽中的一者或两者还包含氨基酸取代T350V。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含异源二聚Fc，其包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域具有第一Fc多肽和第二Fc多肽，所述第一Fc多肽包含位置F405和Y407处的氨基酸取代并且任选地还包含位置L351处的氨基酸取代，所述第二Fc多肽包含在位置T366和T394处的氨基酸取代并且任选地还包含在位置K392处的氨基酸取代，如上所述；并且所述第一Fc多肽还包含在位置S400或Q347中的一处或两处的氨基酸取代，和/或所述第二Fc多肽还包含在位置K360或N390中的一处或两处的氨基酸取代，其中位置S400处的氨基酸取代是S400E、S400D、S400R或S400K；位置Q347处的氨基酸取代是Q347R、Q347E或Q347K；位置K360处的氨基酸取代是K360D或K360E，并且位置N390处的氨基酸取代是N390R、N390K或N390D。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含异源二聚Fc，其包含经修饰的CH3结构域，所述经修饰的CH3结构域包含如表4所示的变体1、变体2、变体3、变体4或变体5中任一个的氨基酸取代。

表4：人IgG1 Fc序列和变体

经修饰的CH2结构域

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于IgG Fc的支架，所述IgG Fc具有经修饰的CH2结构域，例如包含导致与一个或多个Fc受体(FCR)的结合改变的氨基酸修饰的CH2结构域。在一些实施方案中，CH2结构域中的氨基酸修饰导致与Fc受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类中的一种或多种的结合改变。

对CH2结构域的选择性改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力的多种氨基酸修饰是本领域已知的。导致结合增加的氨基酸修饰和导致结合减少的氨基酸修饰可各自用于某些适应症。例如，增加Fc对FcγRIIIa(一种活化受体)的结合亲和力导致抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)增加，这转而导致靶细胞溶解增加。降低与FcγRIIb(一种抑制性受体)的结合在某些情况下同样可能是有益的。在某些适应症中，可能需要降低或消除ADCC和补体介导的细胞毒性(CDC)。在此类情况下，包含导致与FcγRIIb的结合增加的氨基酸修饰或降低或消除Fc区与所有Fcγ受体的结合的氨基酸修饰的经修饰的CH2结构域(“敲除”变体)可能是有用的。

对CH2结构域的改变Fcγ受体对Fc的结合的氨基酸修饰的实例包括但不限于以下：S298A/E333A/K334A和S298A/E333A/K334A/K326A(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Lu等人，2011，J Immunol Methods，365(1-2)：132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L(增加对FcγR IIIa的亲和力)(Stavenhagen等人，2007，Cancer Res，67(18)：8882-90)；F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(增加对FcγRIIIa的亲和力)(NordstromJL等人，2011，BreastCancer Res，13(6)：R123)；F243L(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Stewart等人，2011，Protein Eng Des Sel.，24(9)：671-8)；S298A/E333A/K334A(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Shields等人，2001，J Biol Chem，276(9)：6591-604)；S239D/1332E/A330L and S239D/I332E(增加对FcγRIIIa的亲和力)(Lazar等人，2006，Proc Natl Acad Sci USA，103(11)：4005-10)以及S239D/S267E和S267E/L328F(增加对FcγRIIb的亲和力)(Chu等人，2008，MolI mmunol，45(15)：3926-33)。

影响Fc与Fcγ受体的结合的另外的修饰在Therapeutic Antibody Engineering中有所描述(Strohl&Strohl，Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11，ISBN1907568379，2012年10月，第283页)。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含基于具有经修饰的CH2结构域的IgG Fc的支架，其中经修饰的CH2结构域包含一个或多个氨基酸修饰，所述氨基酸修饰导致Fc区与所有Fcy受体的结合降低或消除(即“敲除”变体)。

各种出版物描述了已经用于工程化Fc区以产生“敲除”变体的策略(参见，例如，Strohl，2009，Curr Opin Biotech 20：685-691，以及Strohl和Strohl，“AntibodyFcengineering for optimal antibody performance”In Therapeutic AntibodyEngineering，Cambridge：Woodhead Publishing，2012，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化修饰(下文有更详细描述)、使用IgG2/IgG4支架或在Fc的铰链或CH2结构域中引入突变来降低效应子功能(参见，例如美国专利公开号2011/0212087、国际公开号WO 2006/105338、美国专利公开号2012/0225058、美国专利公开号2012/0251531以及Strop等人，2012，J.Mol.Biol.，420：204-219)。

减少FcγR和/或补体与Fc的结合的已知氨基酸修饰的具体、非限制性实例包括表5中标识的那些。

表5：减少Fcγ受体或补体与Fc的结合的修饰

另外的实例包括在国际公开号WO 2014/190441中描述的经工程化为在CH2结构域中包括氨基酸取代L235A/L236A/D265S和不对称的氨基酸修饰的Fc区。

糖基化变体

在某些实施方案中，本文所述的TCR融合蛋白可包含基于IgG Fc的支架，其中天然糖基已进行修饰。如本领域已知的，Fc的糖基可以进行修饰以增加或降低效应子功能。

例如，位置297处的保守天冬酰胺残基突变为丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸或组氨酸(即N297A、N297Q、N297K或N297H)产生缺乏所有效应子功能的无糖基化Fc(Bo1t等人，1993，Eur.J.Immunol.，23：403-411；Tao和Morrison，1989，J.Immunol.，143：2595-2601)。

相反，基于与FcγRIIIa的结合改善，已经证实从重链N297连接的寡糖中去除岩藻糖会增强ADCC(参见，例如，Shields等人，2002，J Biol Chem.，277：26733-26740，及Niwa等人，2005，J.Immunol.Methods，306：151-160)。此类低岩藻糖抗体可以例如在以下细胞中产生：缺乏岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲除型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Yamane-Ohnuki等人，2004，Biotechnol.Bioeng，87：614-622)；变体CHO细胞系Lec 13，其将岩藻糖附接至N297连接的碳水化合物上的能力降低(国际公开号WO 2003/035835)；或生成无糖基化抗体的其他细胞(参见，例如，Li等人，2006，Nat Biotechnol，24：210-215；Shields等人，2002，同上，以及Shinkawa等人，2003，J.Biol.Chem.，278：3466-3473)。另外，国际公开号WO 2009/135181描述了在抗体产生期间向培养基中添加岩藻糖类似物，以抑制岩藻糖掺入抗体上的碳水化合物中。

产生在Fc糖基化位点(N297)上几乎没有岩藻糖的抗体的其他方法是本领域已知的。例如，技术(ProBioGen AG)(参见von Horsten等人，2010，Glycobiology，20(12)：1607-1618和美国专利号8,409,572)。

其他糖基化变体包括具有二等分寡糖的那些，例如，其中附接到抗体Fc区的双天线寡糖被N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)二等分的变体。此类糖基化变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能(参见，例如，国际公开号WO 2003/011878、美国专利号6,602,684和美国专利申请公开号US 2005/0123546)。有用的糖基化变体还包括在附接到Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的那些变体，其可具有改善的CDC功能(参见，例如，国际公开号WO1997/030087、WO 1998/58964和WO 1999/22764)。

额外的生物活性部分

在某些实施方案中，本公开的TCR融合蛋白可包含一个或多个融合或共价附接到TCR构建体和/或当TCR融合蛋白包含支架时附接到支架的额外的生物活性部分。TCR融合蛋白可包含的额外的生物活性部分的实例包括但不限于抗原结合结构域、配体、受体、受体片段(诸如胞外部分)、细胞因子和抗原。当TCR融合蛋白包含一个以上额外的生物活性部分时，这些部分可以相同或者可以不同。

在某些实施方案中，本公开的TCR融合蛋白包含一个或多个额外的生物活性部分。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含1至6个额外的生物活性部分。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含1至4个额外的生物活性部分。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白可包含一个或多个额外的生物活性部分，所述生物活性部分是抗原结合结构域。在一些实施方案中，TCR融合蛋白可包含两个或更多个抗原结合结构域，例如2、3、4、5或6个抗原结合结构域。当TCR融合蛋白包含两个或更多个抗原结合结构域时，所述抗原结合结构域可以结合相同的抗原，或者它们可以结合不同的抗原。

在一些实施方案中，TCR融合蛋白中可包含的抗原结合结构域的非限制性实例包括Fab片段、Fv片段、单链Fv片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白可包含一个或多个额外的生物活性部分，所述生物活性部分是细胞因子或其生物活性片段。

格式

本公开的TCR融合蛋白可以具有各种格式。在TCR融合蛋白内，TCR构建体可以经由TCRα链多肽或TCRβ链多肽或两者融合或共价附接到融合蛋白的第二元件上。例如，TCR构建体可以经由TCRα链多肽或TCRβ链多肽或两者融合或共价附接到支架、额外的生物活性部分或另一个TCR构建体上。TCR构建体可以通过相关TCR多肽的N端或C端融合或共价附接到融合蛋白的第二元件上，并且可以直接或间接(例如，通过接头)附接到第二元件上。

在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含TCR构建体，其经由TCRβ链多肽融合或共价附接到支架或额外的生物活性部分上。在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含TCR构建体，其经由TCR构建体的多肽之一的C端融合或共价附接到支架或额外的生物活性部分上。在某些实施方案中，TCR融合蛋白包含TCR构建体，其经由TCR构建体的TCRβ链多肽的C端融合或共价附接到支架或额外的生物活性部分上。

在TCR融合蛋白包含支架和多个TCR构建体的那些实施方案中，TCR构建体可以串联融合或共价附接到支架上，或者它们可以融合或共价附接到支架的不同部分上。在TCR融合蛋白包含支架、TCR构建体和额外的生物活性部分的那些实施方案中，TCR构建体和额外的生物活性部分可以串联融合或共价附接到支架上，或者它们可以融合或共价附接到支架的不同部分上。在TCR融合蛋白包含两个以上TCR构建体的那些实施方案中，一些TCR构建体可以串联融合或共价附接到支架上，而其他TCR构建体可以融合或共价附接到支架的不同部分上，或者所有TCR构建体可以融合或共价附接到支架的不同部分上。

在某些实施方案中，本公开的TCR融合蛋白包含TCR构建体和额外的生物活性部分。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含直接或间接融合到抗原结合结构域或细胞因子的TCR构建体。

在某些实施方案中，本公开的TCR融合蛋白包含一个或多个TCR构建体和支架。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含一个或多个TCR构建体和Ig Fc支架。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含一个或多个TCR构建体、Ig Fc支架和一个或多个额外的生物活性部分。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含一个或多个TCR构建体、Ig Fc支架和一个或多个抗原结合结构域。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含1至12个TCR构建体、Ig Fc支架和1至6个抗原结合结构域。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含1至8个TCR构建体、Ig Fc支架和1至6个抗原结合结构域。在一些实施方案中，TCR融合蛋白包含1至6个TCR构建体、Ig Fc支架和1至4个抗原结合结构域。

图1示出了包含作为支架的IgG Fc和一个或多个TCR构建体的TCR融合蛋白的格式的各种非限制性实例，以及包含作为支架的IgGFc、一个或多个TCR构建体和一个或多个额外的生物活性部分(以抗原结合结构域例示)的TCR融合蛋白的格式的非限制性实例。图1(C)示出了一种TCR融合蛋白，其包含融合到抗原结合结构域(scFv)的TCR(“TCR-scFv”)。图1(D)和图1(E)示出了一种单臂TCR融合蛋白，其TCRα多肽融合Fc支架(“单臂α融合物”(D)和“单臂α融合物-DS”(E)，其包括链间二硫键)。图1(F)示出了一种包含两个TCR构建体的TCR融合蛋白，每个构建体经由TCRα多肽独立地融合到Fc支架的多肽上，并且每个构建体在TCRα多肽和TCRβ多肽之间包括链间二硫键(“双α融合物-DS”)。图1(G)示出了一种TCR融合蛋白，其TCRα多肽和TCRβ多肽各自独立地融合到Fc支架上(“双融合物”)。图1(H)和图1(I)示出了一种单臂TCR融合蛋白，其TCRβ多肽融合到Fc支架(“单臂β融合物”(H)和“单臂β融合物-DS”(I)，其包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键)。图1(J)示出了一种包含两个TCR构建体的TCR融合蛋白，每个构建体经由TCRβ多肽独立地融合到Fc支架上，并且每个构建体在TCRα多肽和TCRβ多肽之间包括链间二硫键(“双β融合物-DS”)。图1(K)示出了一种TCR融合蛋白，其包含经由TCRα链融合到Fc支架的一个多肽的TCR构建体和融合到另一Fc多肽的scFv，TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“双特异性α融合物”)。图1(L)示出了一种TCR融合蛋白，其包含经由TCRβ多肽融合到Fc支架的一个多肽的TCR构建体和融合到另一Fc多肽的scFv，TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“双特异性β融合物”)。图1(M)示出了一种TCR融合蛋白，其中一条臂包含融合到CH1结构域的TRAV结构域和融合到CL结构域的TRBC结构域，并且第二条臂包含scFv，每条臂独立地融合到Fc支架的多肽上(“双特异性嵌合体”)。图1(N)示出了一种单臂TCR融合蛋白，其包含融合到Fc支架的一个多肽的Fab和经由TCRβ多肽融合到Fab的TCR构建体，所述TCR构建体包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“双特异性串联β融合物”)。图1(O)示出了一种TCR融合蛋白，其包含融合到Fc支架的一个多肽的Fab，经由TCRβ多肽融合到Fab的第一TCR构建体，和经由TCRβ多肽融合到另一Fc多肽的第二TCR构建体，每个TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“2x1双特异性β融合物”)。图1(P)示出了一种TCR融合蛋白，其包含融合到Fc支架的一个多肽的Fab，经由TCRβ多肽融合到Fab的第一TCR构建体，经由TCRβ多肽融合到第二Fc多肽的第二TCR构建体和经由TCRβ多肽融合到第二Fc多肽的C端的第三TCR构建体，每个TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“3x1双特异性β融合物”)。图1(Q)示出了一种TCR融合蛋白，其包含融合到Fc支架的一个多肽的Fab，经由TCRβ多肽融合到Fab的第一TCR构建体，经由TCRβ多肽融合到第二Fc多肽的第二TCR构建体，经由TCRβ多肽融合到第二TCR的第三TCR构建体，以及经由TCRβ多肽融合到第二Fc多肽的C端的第四TCR构建体，每个TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“4x1双特异性C端β融合物”)。图1(R)示出了一种TCR融合蛋白，其包含融合到Fc支架的一个多肽的Fab，经由TCRβ多肽融合到Fab的第一TCR构建体，经由TCRβ多肽融合到第二Fc多肽的第二TCR构建体，经由TCRβ多肽融合到第二TCR的第三TCR构建体，以及融合到Fab轻链的C端的第四TCR构建体，每个TCR包括TCRα和TCRβ多肽之间的链间二硫键(“4x1双特异性轻链β融合物”)。图1(S)示出了一种TCR融合蛋白，其包含经由TCRα多肽融合到Fc支架的一个多肽的C端的TCR(“单臂α融合物”)。图1(T)示出了一种TCR融合蛋白，其包含经由TCRβ多肽融合到Fc支架的一个多肽的C端的TCR(“单臂β融合物”)。

图1所示的TCR融合蛋白的实施方案仅是说明性的，而非限制性的。本公开考虑并涵盖其他构象，包括如图1所示的TCR融合蛋白，其采用其他抗原结合结构域或其他生物活性部分来替代例示的那些，以及包括除了例示的链间二硫键之外的本文所述的稳定化突变或除例示的链间二硫键以外还包括本文所述的稳定化突变的TCR构建体。

TCR构建体和TCR融合蛋白的制备

本文所述的TCR构建体和TCR融合蛋白可以使用本领域已知的标准重组方法产生。通常，为了重组产生TCR构建体或TCR融合蛋白，生成编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或多核苷酸集合，并将其插入一个或多个载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸可通过本领域已知的标准方法产生(参见，例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NewYork，1994年及其更新，以及“Antibodies：A Laboratory Manual，”第2版，Greenfield编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，2014)。TCR构建体或TCR融合蛋白表达所需的多核苷酸数目将取决于构建体或蛋白质的格式，包括构建体是否包含支架。当需要多个多核苷酸时，可以将它们掺入一个载体中(例如多顺反子载体)或掺入一个以上的载体中。

通常，为了表达，将编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或多核苷酸集合与一个或多个调控元件(诸如多核苷酸有效转录所需的转录元件)一起掺入表达载体中。此类调控元件的实例包括但不限于启动子、增强子、终止子和聚腺苷酸化信号。本领域技术人员将认识到，调控元件的选择取决于为表达TCR构建体或TCR融合蛋白而选择的宿主细胞，并且此类调控元件可以源自多种来源，包括细菌、真菌、病毒、哺乳动物或昆虫基因。表达载体可以任选地进一步含有异源核酸序列，其利于表达或纯化所表达的蛋白质。实例包括但不限于信号肽和亲和标签，诸如金属亲和标签、组氨酸标签、抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白编码序列、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)编码序列和生物素编码序列。表达载体可以是染色体外载体或整合载体。

用于克隆或表达TCR构建体或TCR融合蛋白的合适宿主细胞包括本领域已知的各种原核或真核细胞。原核宿主细胞包括，例如，大肠埃希氏菌(E.coli)、鲑鱼气单胞菌(A.salmonicida)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞。真核宿主细胞包括，例如，哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞和酵母细胞(诸如酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)细胞)。在某些实施方案中，真核微生物诸如丝状真菌或酵母可能是合适的表达宿主细胞。已经开发了其糖基化途径已进行“人源化”的真菌和酵母菌株，导致产生具有部分或完全人类糖基化模式的抗体构建体(参见，例如，Gerngross，2004，Nat.Biotech.22：1409-1414，以及Li等人.，2006，Nat.Biotech.24：210-215)并且在某些实施例中可能是有用的。

在某些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白在真核宿主细胞中表达。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白在哺乳动物细胞系中表达。在这方面，适于混悬生长的哺乳动物细胞系特别有用。实例包括但不限于，由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系、人胚肾(HEK)293系(“293细胞”)(参见，例如，Graham等人，1977，J.Gen Virol.，36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞尔托利氏TM4细胞(参见，例如，Mather，1980，Biol Reprod，23：243-251)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌(HeLa)细胞、犬肾细胞(MDCK)、buffalo大鼠肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(参见，例如Mather等人，1982，Annals N.Y.AcadSci，383：44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(包括DHFR-CHO细胞，参见Urlaub等人，1980，Proc Natl Acad Sci USA，77：4216)和骨髓瘤细胞系(诸如Y0、NS0和Sp2/0)。示例性的哺乳动物宿主细胞系在Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷，第255-268页中有综述(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，N.J.，2003)。

在某些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白在瞬时或稳定的哺乳动物细胞系中表达。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白在HEK293、CHO、HeLa、NS0或COS细胞中表达。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白在HEK293细胞中表达。

可以使用常规方法培养包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞，以产生TCR构建体或TCR融合蛋白。在某些实施方案中，在降低的温度下培养包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞可以提高表达和/或降低TCR构建体或TCR融合蛋白的HMW物质(聚集物)的量。在某些实施方案中，包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞可以在低于37℃的温度下培养。在一些实施方案中，包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞可以在约30℃至约36℃，例如在约30℃至约35℃，或在约30℃至约34℃的温度下培养。在一些实施方案中，包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞可以在约32℃的温度下培养。

通常，TCR构建体和TCR融合蛋白在表达后纯化。可以用本领域技术人员已知的各种方法分离或纯化蛋白质(参见，例如，Protein Purification:Principles andPractice，第3版，Scopes,Springer-Verlag,NY,1994)。标准的纯化方法包括色谱技术，包括离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、分级色谱法或凝胶过滤和反相色谱法，在大气压或高压下使用诸如FPLC和HPLC的系统进行。其他纯化方法包括电泳技术、免疫学技术、沉淀技术、透析技术和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术与蛋白质浓缩结合也可以是有用的。

特定的融合配偶体也可以利于纯化。例如，如果采用GST融合物，则可以使用谷胱甘肽树脂纯化TCR构建体和TCR融合蛋白，如果采用His标签，则可以通过Ni⁺²亲和色谱法纯化，或者如果使用flag标签，则可以通过固定的抗flag抗体纯化。

在TCR融合蛋白包含Ig Fc支架和/或抗体Fab区的某些实施方案中，纯化可以包括使用结合Fc或Fab的多种天然蛋白之一。例如，细菌蛋白质A和G结合至Fc区。同样，细菌蛋白质L结合至一些抗体的Fab区。

必要的纯化程度将根据TCR构建体或TCR融合蛋白的预期用途而变化。在一些情况下，可能不必需纯化。在某些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白是基本上纯的。术语“基本上纯的”(或“基本上纯化的”)当关于本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白使用时，意指TCR构建体或TCR融合蛋白基本上或基本不含通常伴随它在其中表达的宿主细胞中的蛋白质或与之相互作用的组分。在某些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白的基本上纯的制剂是具有少于约10％污染蛋白的蛋白制剂。在这种情况下污染蛋白意指不是TCR构建体或TCR融合蛋白的任何蛋白，但不包括TCR构建体或TCR融合蛋白的聚集形式(即HMW物质)。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白的基本上纯的制剂是具有少于约8％的污染蛋白，例如，少于约7％、少于约6％或少于约5％的污染蛋白的蛋白制剂。

在某些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白制剂包含最少量的HMW物质(聚集物)。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白制剂包含约40％或更少的HMW物质。在一些实施方案中，TCR构建体或TCR融合蛋白制剂包含约35％或更少的HMW物质，例如，约30％或更少、约25％或更少、约20％或更少、或约15％或更少的HMW物质。在某些实施方案中，HMW物质的量通过尺寸排阻色谱法(SEC)，例如通过UPLC-SEC测定。

本公开的某些实施方案涉及一种制备如本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白的方法，所述方法包括在适于TCR构建体或TCR融合蛋白表达的条件下，培养已经向其中引入了编码TCR构建体或TCR融合蛋白的一种或多种多核苷酸或一种或多种表达载体的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或从宿主细胞培养基)中回收TCR构建体或TCR融合蛋白。在某些实施方案中，所述方法包括在低于37℃的温度下培养包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在约30℃至约36℃，例如约30℃至约35℃，或约30℃至约34℃的温度下，培养包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在约32℃的温度下培养包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或表达载体的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是人胚肾(HEK)细胞，诸如HEK273细胞。

多核苷酸、载体和宿主细胞

本公开的某些实施方案涉及一种编码本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白的分离的多核苷酸或多核苷酸集合。在这种情况下多核苷酸可以编码TCR构建体或TCR融合蛋白的全部或一部分。

术语“核酸”、“核酸分子”和“多核苷酸”在本文可互换使用并且是指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸的非限制性实例包括基因、基因片段、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、分离的DNA、分离的RNA、核酸探针和引物。

“编码”给定多肽的多核苷酸是当置于适当的调控序列的控制下时，在体内转录(在DNA的情况下)或翻译(在mRNA的情况下)成多肽的多核苷酸。编码序列的边界由在5′(氨基)端的起始密码子和在3′(羧基)端的翻译终止密码子来确定。转录终止序列可位于编码序列的3′。

本公开的某些实施方案涉及包含一种或多种编码本文所述的TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸的载体(诸如表达载体)。多核苷酸可包含在单一载体中，或者它可包含在多于一种载体中。在一些实施方案中，多核苷酸包含在多顺反子载体中。

本公开的某些实施方案涉及宿主细胞，其包含：编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或包含所述多核苷酸的一种或多种载体。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人胚肾(HEK)细胞。

药物组合物

对于治疗用途，TCR构建体和TCR融合蛋白可以以包含TCR构建体或TCR融合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂的组合物的形式提供。所述组合物可以使用熟知且容易获得的成分通过已知程序制备。

可将药物组合物配制成用于通过例如口服(包括例如经颊或舌下)、局部、肠胃外、直肠或阴道途径，或通过吸入或喷雾施用于受试者。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下注射，以及皮内、关节内、静脉内、肌肉内、血管内、胸骨内、鞘内注射或输注。药物组合物通常将配制成适于施用于受试者的形式，例如糖浆剂、酏剂、片剂、糖锭剂、锭剂、硬胶囊或软胶囊、丸剂、栓剂、油性或水性混悬液、可分散性粉剂或粒剂、乳液、注射剂或溶液。药物组合物可以作为单位剂量配制物提供。

在某些实施方案中，包含TCR构建体或TCR融合蛋白的药物组合物配制用于肠胃外施用。在一些实施方案中，包含TCR构建体或TCR融合蛋白的药物组合物配制成单位剂量注射形式，例如冻干配制物或水溶液，用于肠胃外施用。

药学上可接受的载剂和稀释剂在所采用的剂量和浓度下通常对受者无毒。此类载剂和稀释剂中可包括的组分的实例包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双铵、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白或明胶；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；金属络合物，诸如锌-蛋白质络合物；以及非离子表面活性剂诸如聚乙二醇(PEG)。

在某些实施方案中，包含TCR构建体或TCR融合蛋白的组合物可以是无菌可注射的水性或油性溶液或混悬液的形式。此类混悬液可以使用本领域已知的合适的分散剂或湿润剂和/或混悬剂来配制。无菌注射溶液或混悬液可以包含在无毒的胃肠外可接受的载剂或稀释剂中的TCR构建体或TCR融合蛋白。可以采用的可接受的载剂和稀释剂包括例如1,3-丁二醇、水、林格氏溶液(Ringer’s solution)或等渗氯化钠溶液。另外，可以使用无菌的不挥发性油。为此，可采用各种温和的不挥发性油，包括合成甘油单酯或甘油二酯。另外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射剂。佐剂，诸如局部麻醉剂、防腐剂和/或缓冲剂也可以包含在可注射溶液或混悬液中。

在某些实施方案中，包含TCR构建体或TCR融合蛋白的组合物可以配制用于向受试者静脉内施用。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和/或局部麻醉剂，诸如利多卡因，以减轻注射部位的疼痛。通常，分开或在单位剂型中混合在一起提供各种成分，例如，作为密封容器中干燥的冻干粉末或无水浓缩物，所述密封容器诸如表明活性剂的量的安瓿或小药囊。当组合物将通过输注施用的情况下，可以用包含无菌药物级水或盐水的输液瓶将其分配。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供无菌注射用水或盐水的安瓿，使得可以在施用之前将成分混合。

其他药物组合物和制备药物组合物的方法是本领域已知的，并且例如在“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”(原名“RemingtonsPharmaceutical Sciences”)；Gennaro,A.,Lippincott,Wi lliams&Wilkins,Philadelphia,PA(2000)中进行了描述。

使用方法

本公开的某些实施方案涉及本文所述的TCR构建体和TCR融合蛋白的治疗用途。例如，如本文所述的TCR构建体和TCR融合蛋白可用于靶向各种类型的疾病细胞或感染细胞，或特定的组织类型或器官。因此，本公开的某些实施方案涉及用于治疗疾病或疾患的方法，其包括向有需要的受试者施用TCR构建体或TCR融合蛋白。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，受试者是人。

根据TCR构建体或TCR融合蛋白靶向的特定疾病细胞、感染细胞、组织或器官，可以治疗各种疾病、病症和疾患。实例包括但不限于癌症、细菌感染、病毒感染、感染性疾病和免疫病症，包括免疫缺陷病症和疾病，以及自身免疫疾病和疾患。在一些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白可用于治疗癌症的方法中。在一些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白可用于治疗细菌或病毒感染或感染性疾病的方法中。在一些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白可用于治疗免疫病症的方法中。在一些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白可用于治疗免疫缺陷病症或疾病的方法中。在某些实施方案中，TCR构建体和TCR融合蛋白可用于治疗自身免疫疾病或疾患的方法中。

本文所述的治疗方法包括向有需要的受试者施用TCR构建体或TCR融合蛋白。TCR构建体或TCR融合蛋白将通过适当的施用途径施用于受试者。施用的途径和/或模式将根据待治疗的疾病或疾患以及所需结果而变化，并且可以由医学领域的技术人员容易地确定。

可替代地，在一些实施方案中，包含编码TCR构建体或TCR融合蛋白的表达载体的宿主细胞可以治疗性或预防性地用于将TCR构建体或TCR融合蛋白递送至受试者，或者可将编码TCR构建体或TCR融合蛋白的多核苷酸或表达载体施用于来自受试者的离细胞，然后将细胞返回到受试者体内。

治疗通过施用“治疗有效量”的TCR构建体或TCR融合蛋白来实现。“治疗有效量”是指在必要的剂量下持续必要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。治疗有效量也可以是治疗有益作用超过TCR构建体或TCR融合蛋白的任何毒性或有害作用的量。

熟练的医疗从业者可以确定TCR构建体或TCR融合蛋白的合适剂量。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的特定TCR构建体或TCR融合蛋白的活性，施用途径，施用时间，所述构建体或蛋白质的排泄速率，治疗持续时间，与TCR构建体或TCR融合蛋白组合使用的其他药物、化合物和/或材料，治疗的受试者的年龄、性别、体重、疾患、总体健康状况和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。

本公开的某些实施方案涉及TCR构建体和TCR融合蛋白的诊断用途。例如，TCR构建体或TCR融合蛋白可用于体外或体内检测携带TCR构建体或TCR融合蛋白特异性结合的肽的抗原呈递细胞。对于诊断用途，TCR构建体或TCR融合蛋白通常用适当的可检测标记进行标记。

提供以下实施例是为了说明的目的，而非旨在以任何方式限制本公开的范围。

实施例

实施例1：TCR融合蛋白的设计和克隆

以下实施例中描述了各种格式的TCR融合蛋白和对照。下文概述了TCR融合蛋白和对照的设计和构建。

所有TCR融合蛋白都含有胞外Vα和VβTCR结构域，连同胞外Cα和CβTCR结构域或IgG1 CL和CH结构域，及IgG1 Fc。除非另有说明，否则对照也含有胞外TCR结构域和IgG1Fc。Fc区中的氨基酸残基根据EU索引进行编号。胞外TCR结构域中的氨基酸残基根据IMGT编号系统进行编号(Lefranc等人，2005，Developmental and Comparative Immunology,29：185-203；参见图9)。

为了优化TCR融合蛋白的制备，IgG1 Fc包含促进异源二聚Fc形成的CH3结构域氨基酸取代。具体地，TCR融合蛋白所含的IgG1Fc是包含以下CH3结构域氨基酸取代的人IgG1异源二聚Fc(在整个实施例中称为“Het Fc”修饰)：

链A(“Het FcA”)：T350V/L351Y/F405A/Y407V

链B(“Het FcB”)：T350V/T366L/K392L/T394W。

对于一些TCR融合蛋白，IgG1 Fc的两条链也包含废除FcγR结合的以下CH2氨基酸取代(在整个实施例中称为“FcKO”)：L234A/L235A/D265S。

制备单价、二价、三价和四价TCR融合蛋白。图1中示出了每种TCR融合蛋白格式的示意图。为了产生图1所示格式的每种最终TCR融合蛋白，制备以下重链构建体(从N端到C端)：

a)Vα-Cα-铰链-CH2-CH3

b)Vβ-Cβ-铰链-CH2-CH3

c)Vα-Cα-铰链-CH2-CH3

d)Vβ-Cβ-铰链-CH2-CH3-Vβ-Cβ-铰链

e)Vβ-Cβ-铰链-Vβ-Cβ-铰链-CH2-CH3-Vβ-Cβ-铰链

f)Vβ-Cβ-铰链-VH-CH1-CH2-CH3

g)Vβ-Cβ-铰链-VH-CH1-CH2-CH3-Vβ-Cβ-铰链

h)VL-VH-铰链-CH2-CH3

i)铰链-CH2-CH3。

所有重链构建体都包括HetFc修饰。除了上述两条重链以外，大多数TCR融合蛋白还包含互补的α或βTCR链，其含有相应的可变结构域和恒定结构域。包含抗体Fab的那些TCR融合蛋白还包含单一抗体轻链。

“铰链”序列对应于人IgG1铰链序列的上部区域(EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16])，除了当“铰链”后面是“CH2”时，在这种情况下，人IgG1铰链的下部区域也包括在内(体序列是EPKSCDKTHTCPPCP[SEQ ID NO:21])。TCRα链由胞外Vα和Cα结构域组成。该序列以TRAC/127终止。TCRβ链由胞外Vβ和Cβ结构域组成。该序列以TRCB/126终止。野生型TCRβ链恒定区包括半胱氨酸残基(TRBC1*01和TRBC2*01的外显子1中的残基85.1)，其不参与链间或链内二硫键的形成。这个位置通常突变为Ala以消除潜在的错配。以下实施例中描述的所有TCR融合蛋白都掺入这种TRBC/85.1.CYS->ALA突变。

如以下实施例中所示，一些TCR融合蛋白包括已知的TRAC/84.THR-TRBC/79.SER二硫键，已经证实所述二硫键会提高TCR蛋白的表达和稳定性(Boulter等人.,2003,PEDS,16:707-711)。TRAC/84.THR-TRBC/79.SER二硫键在整个实施例中称为“IC二硫键”。

还如以下实施例中所示，一些TCR融合蛋白包括突变TRAC/1.5.GLN->LYS和TRBC/97.GLN->ASP。这些突变不会改变TCR的活性或稳定性。

表1.1提供了所制备的TCR融合蛋白的汇总。每种TCR融合蛋白包含的TCR“臂”(肽-MHC靶向结构域)的数目和抗CD3“臂”(CD3靶向结构域)的数目在“格式”栏中标明。例如，“1x0”指示TCR融合蛋白包含一条TCR臂且不含抗CD3臂，“1x1”指示TCR融合蛋白包含一条TCR臂和一条抗CD3臂，等等。如前所述，抗CD3臂为scFv或Fab格式。

表1.1：示例性的TCR融合蛋白格式

用于表达TCR融合蛋白的载体如下构建。所有构建体都使用pTT5载体(Durocher等人，2002，Nucl.Acids Res.，30(2)：e9)和以下信号序列：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQID NO：22](Barash等人，2002，Biochem and Biophys Res.Comm.，294：835-842)。

编码TCRα链的载体包含插入物：5’-EcoRI限制位点-信号肽-α链-TGA终止子-BamH1限制位点-3’。

编码TCRβ链的载体包含插入物：5’-EcoRI限制位点-信号肽-β链-TGA终止子-BamH1限制位点-3’。

编码IμG1重链的载体包含插入物：5’-EcoR1限制位点-信号肽-终止于G446(EU编号)的IgG1 CH2结构域和CH3结构域-TGA终止子-BamH1限制位点-3’。

编码IgG1轻链的载体包含插入物：5’-EcoRI限制位点-信号肽-IgG1轻链-TGA终止子-BamH1限制位点-3’。

融合至IgG1 Fc的N端的TCR链在位置E216(EU编号)处连接到IgG1重链的上部铰链，并且包括终止于位置G446(EU编号)处的CH2结构域和CH3结构域，随后是TGA终止密码子和BamH1限制位点。

在TCR链融合到IgG1 Fc的C端的情况下，TCR链的后面是从E216开始并且终止于T225(EU编号)的上部铰链的短序列。

对所有表达载体进行测序，以确认编码DNA的正确读码框和序列。

实施例2：不同格式的TCR融合蛋白表达的比较

使用哺乳动物瞬时转染方案产生表2.1所示格式的TCR融合蛋白。测试的格式包括以不同取向融合的TCR结构域，以确定取向是否影响融合蛋白的产生。在融合蛋白中使用经修饰的抗gp100 TCR结构域和抗CD3 scFv。包括TRAC和TRBC结构域两者的所有TCR融合蛋白也含有IC二硫键(参见实施例1)。

如下所述，使TCR融合蛋白的相关TCRα、TCRβ、IgG1重链和scFv链在2.5mL的Expi293F^TM细胞(Thermo Fisher，Waltham，MA)培养物中共表达。

将Expi293^TM细胞在37℃下在以125rpm旋转的轨道振荡器上的Expi293^TM表达培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中在8％CO₂的加湿气氛中培养。用总共2.5μgDNA转染2.5mL体积(总细胞计数为7.5x 10⁷个细胞)。转染前，将DNA在0.15mL Opti-MEM^TM I减血清培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中稀释，以提供DNA转染混合物。将8μL的ExpiFectamine^TM 293试剂(Thermo Fisher，Waltham，MA)在体积为0.15mL的Opti-MEM^TM I减血清培养基中稀释并且在孵育五分钟后，将溶液与DNA转染混合物合并一达到总体积为0.30mL。10至20分钟后，将DNA-ExpiFectamine^TM293试剂混合物添加到细胞培养物中。在37℃下孵育18-22小时后，向每种培养物中添加15μL的ExpiFectamine^TM 293增强子1和0.15mL的ExpiFectamine^TM 293增强子2(Thermo Fisher，Waltham，MA)。将细胞孵育五天并收获上清液。

上清液中的蛋白水平使用Octet^TM RED96(ForteBio，Fremont，CA)和蛋白A尖端进行定量。将各200μL培养物上清液转移到96孔板中。在120秒内测量样品3次。每次读数后，使尖端在100mM甘氨酸(pH1.5)中再生5秒，接着在PBS中中和5秒。将测量值与标准曲线进行比较，以获得每个样品的蛋白浓度。结果示于表2.1中。

表2.1：TCR融合蛋白的表达滴度

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¹参见图1 ²来自3mL表达体积

如可以从表2.1中看出，通过β链连接到Fc的TCR融合蛋白(v21230和v21232)显示出最高的表达滴度。总的来说，TCR融合蛋白的表达滴度低于scFv构建体的表达滴度。表2.1中列出的包括“-B”后缀的那些变体不包括Fc结构域，并因此仅由2个TCR或2个scFv组成。在所有情况下，这些同源二聚体变体显示出较低的表达滴度。

实施例3：TCR恒定结构域中潜在稳定化突变的鉴定

采用结构和计算指导的方法来产生TRAC和TRBC结构域中的突变设计文库，所述突变设计可潜在地提高TCR的热稳定性和/或胶体稳定性。这些突变是基于改善表面特性、界面相互作用和内部堆积来选择的，如下文更详细描述的。

突变的设计集中于稳定TRAC和TRBC结构域，因为这些结构域在TCR之间包含非常小的变异。TRAC结构域在所有人源性TCR中是相同的，而TRBC结构域只有两种不同的同种异型。在TRBC1和TRBC2之间TRBC序列只有3个残基不同：位置TRBC/1.4是TRBC1中的Lys并且TRBC2中的Gln，位置TRBC/1-3是TRBC1中的Gln并且TRBC2中的Lys，并且位置TRBC/29是TRBC1中的Tyr并且TRBC2中的Phe。

使用H27-14TCR(蛋白质数据库参考号(Protein Data Bank reference)：pdb：3VXS)作为框架来制备计算机模拟TCR模型。

疏水性斑块突变的鉴定

使用分子操作环境中的蛋白质斑块工具(Protein Patches tool in MolecularOperating Environment)(版本2019.01；Chemical Computing Group，Montreal，QC)鉴定疏水性斑块。位于TRAC或TRBC结构域中面积大于且具有表面暴露侧链的疏水性斑块内的所有非极性残基都带flag标记。

稳定化，点突变的鉴定

H27-14的晶体结构残基经由计算机模拟诱变和堆积/建模进行分析。在TCR的TRAC和TRBC结构域的每个位置处产生计算机模拟突变。每个残基被除脯氨酸和半胱氨酸之外的所有可能的氨基酸取代。这些分析导致鉴定了用于工程化优先α-β配对的热点位置的列表。将用于提高稳定性的突变分为不同的类别：

1)空腔-位于结构域核心内部并且改善疏水性堆积

2)界面-位于两个结构域的界面处并且改善界面相互作用

3)斑块-位于表面处并且减少表面暴露的疏水性斑块。

基于力场指标的改善，对空腔、界面和斑块突变进行分级。基于疏水性斑块的减少，进一步对斑块突变进行分级。

环截短突变体的鉴定

先前已经报道了Fab/TCR嵌合体中的TRBC FG环的截短以改善嵌合体的表达(Wu等人，2015，MABS，7：364-376)。对FG环的不同环截短进行研究，以确定这些截短是否可以改善全TCR中的表达。由于在许多非人TCR中TRBC DE环较短，所以还研究了人TRBC DE环的截短，以及添加Gly-Asnβ转角基序的截短。

稳定化突变体的分级

将3D晶体结构中在已鉴定的热点位置以及感兴趣热点邻近位置处的潜在稳定化突变和设计经由计算机模拟的诱变和堆积/建模进行模拟和鉴定，并基于包括空间和静电改善在内的许多因素进行评分。基于能量因素，诸如范德华堆积、空化效应和疏水基团的紧密接触，对空间改善进行建模，并还可进行计算。类似地，基于电荷、氢键和去溶剂化效应之间的库仑相互作用，对静电相互作用能进行建模和评价。通过该分析鉴定的潜在稳定化突变列于表3.1。

表3.1：计算机模拟鉴定的潜在稳定化突变

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实施例4：包含潜在稳定化突变的TCR融合蛋白的表达和表征

为了确定实施例3中鉴定的潜在稳定化突变对TCR稳定性的影响，如实施例1所述，以单臂(OA)格式构建包含突变的TCR融合蛋白，其中β链融合到Fc。使TCR融合蛋白表达并在体外测试其稳定性，以鉴定在表达、热稳定性和/或胶体稳定性方面提供最大改善的突变。在融合蛋白中使用经修饰的抗gp100 TCR结构域。所有TCR融合蛋白都含有IC二硫键(参见实施例1)。

将密度为1.5-2.2x10⁶个细胞/ml的HEK293-6E细胞在37℃下在FreeStyle^TM F17培养基(GIBCO目录号A13835-01)中培养，该培养基补充有G418硫酸盐(Wisent Bioproducts目录号400-130-IG)、4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic^TM F-68(GIBCO目录号24040-032)。对于α链、β链-Fc(A)和Fc(B)以40∶30∶30的比率，使用PEI-max(Polysciences目录号24765-2)以1∶2.5的DNA∶PEI比率对每ml HEK293-6E细胞总共1ug DNA(50％变体DNA、5％GFP、15％AKT、30％ssDNA)进行转染，并将细胞在37℃下孵育24小时。孵育后，向细胞中添加0.5mM丙戊酸(最终浓度)和0.5％w/v胰蛋白胨N1(最终浓度)。然后将细胞转移至37℃，并在收获前孵育7天。将培养基通过离心收获，并使用0.22μM过滤器(Millipore目录号SCGPU05RE)进行真空过滤。最初测试样品在0.8mL体积中的表达。将在SDS-PAGE凝胶上显示出蛋白质条带的样品放大到250-500mL培养物。

为了纯化TCR融合蛋白，首先通过以1000rcf离心15分钟从上清液中去除细胞。将蛋白A Gravitrap^TM柱通过使用10ml PBS平衡，接着分批施加10ml蛋白上清液来准备。一旦所有上清液流过该柱，就用2x10ml PBS洗涤该柱。将融合蛋白通过添加3ml 0.1M甘氨酸-HCl(pH 2.7)洗脱TCR。然后用1M Tris-HCl(pH 9)中和洗脱的TCR融合蛋白。基于280nm处的吸光度(A280 nm)对蛋白质产量进行定量(在样品中和后出现沉淀的情况下，在测量A280nm之前对样品进行短暂离心)。

通过UPLC-SEC评估TCR融合蛋白的同质性。使用设置为30℃且安装在具有光电二极管阵列(Photodiode Array，PDA)检测器的Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio系统上的Waters ACQUITY BEH200 SEC柱(2.5mL，4.6x 150mm，不锈钢，1.7μm颗粒)(Waters Ltd,Mississauga,ON)进行UPLC-SEC。运行时间为7分钟，每次注射的总体积为2.8mL，使用的运行缓冲液为杜尔贝科氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS)或含有0.02％吐温20(pH 7.4)的DPBS，流速为0.4ml/min。通过210-500nm范围内的紫外吸收度监测洗脱，并在280nm提取色谱图。使用Empower 3软件(Waters Ltd,Mississauga,ON)进行峰积分。

将具有可接受的同质性(>95％)的样品缓冲液交换到DPBS中，并在蛋白A纯化后无菌过滤。具有低同质性的样品如下进行SEC纯化。将样品上样到DBPS中的Akta人Avant 25色谱系统(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)上的200 10/30Increase柱(GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)上，流速为0.5mL/min。基于280nm处的吸光度收集经洗脱的蛋白质的级分，并将所述级分使用Caliper/>GXII(Perkin Elmer,Waltham,MA)通过非还原和还原性高通量蛋白质表达测定法进行评估。根据HT Protein Express/>用户指南第2版和LabChip GXII用户手册执行程序，其具有以下修改。将2μl或5μl(浓度范围为5-2000ng/μl)的TCR融合蛋白样品连同7μl的HT蛋白质表达样品缓冲液(HT Protein Express Sample Buffer，Perkin Elmer目录号760328)一起添加到96孔板(BioRad,Hercules,CA)的单独孔中。然后使TCR融合蛋白样品在70℃下变性15分钟。/>仪器使用HT蛋白质表达芯片(HT Protein Express Chip)(Perkin Elmer,Waltham,MA)和Ab-200测定设置进行操作。

通过差示扫描量热法(DSC)测定TCR融合蛋白的热稳定性。将每种纯化的TCR融合蛋白在PBS中稀释到1mg/mL。使用总共950μL进行用NanoDSC(TA Instruments，New Castle，DE)的DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次TCR融合蛋白注射之前布置缓冲液注射以进行参考。从25℃到95℃以60℃/小时的速率和60psi的氮气压力，对每个样品进行扫描。使用NanoAnalyze(TA Instruments，New Castle，DE)参考并分析所得的热谱图。DSC热谱图上的每个峰对应于一个热转变。有三个期望的热转变：TCR、CH2(～71℃)和CH3(～80℃)。TCR的转变包括TRAV-TRBV和TRAC-TRBC界面。

表4.1中示出了对每种TCR融合蛋白测定的产量、同质性和Tm。注意，转染步骤中使用的α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率没有优化，这影响所观察到的正确物质％。

表4.1：包含潜在稳定化突变的TCR融合蛋白的表达和表征

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¹所有变体都包含IC二硫键。列出的突变是除这种二硫键以外的。

²通过UPLC-SEC测定的。除非另有注明，否则变体在37℃下表达，产生更高量的HMW物质(参见实施例5)。

³ No Ex.＝无表达

⁴该变体在32℃下表达，经证实会减少TCR制剂中存在的HMW物质的量(参见实施例5)

⁵无法通过DSC测定Tm

⁶ 109-114->GLY-ASN符号指示位置109-114处的氨基酸被GLY-ASN置换

⁷ 109-114->LYS-PRO-SER-ASN符号指示位置109-114处的氨基酸被LYS-PRO-SER-ASN置换

⁸ 84.5-85.6->-n符号指示位置84.5-85.6处的氨基酸的缺失

⁹ 84.4-85.4->GLY-ASN符号指示位置84.4-85.4处的氨基酸被GLY-ASN置换。

与对照(v21230)相比，显示出高分子量(HMW)物质(聚集质)减少或Tm增加的变体被认为是稳定的。如从表4.1中可以看出，与v21230对照相比时，TCR融合蛋白v22705、v22707、v22709、v22712、v22716、v22722、v22837、v22840和v22772显示出HMW物质减少和Tm增加。TCR融合蛋白v28881与v21230对照相比时，也显示出HMW物质减少和Tm增加，然而，该蛋白在32℃下表达，因此预计会显示出HMW物质减少。TCR融合蛋白中的几种显示出HMW物质减少，对于v22709和v22837观察到HMW物质减少最大(分别从37.4％减少到20.2％和20.1％)。在显示Tm提高的TCR融合蛋白中，对于v22706、v22709和v28881观察到最大的增加。v22706和v22709两者都显示出Tm增加3℃(从53.7℃增加到56.7℃)，但是v22706并未显示出HMW物质减少，而v28881显示出Tm增加2.7℃(从53.7℃增加到56.4℃)。

由于除了表4.1中描述的点突变之外，所有TCR融合蛋白都含有相同的序列，因此观察到的同质性和/或Tm的提高可归因于这些点突变。

实施例5:温度和细胞系对TCR融合蛋白表达的影响

在如下所述的不同表达条件下产生TCR融合蛋白v21232，以便确定产生最高产量和最低HMW物质(聚集物)的条件。

包含抗gp100 TCR和抗CD3 scFv的TCR双特异性β融合TCR融合蛋白(v21232；参见实施例2)在2.5mL的Expi293F^TM细胞(Thermo Fisher,Waltham,MA)或ExpiCHO^TM细胞(Thermo Fisher,Waltham,MA)中表达，H1:H2:L1 DNA比率为30:30:40。

为了在Expi293F^TM细胞中表达，如实施例2中所述制备培养物，除了在转染步骤中α链、β链-Fc(A)和Fc(B)采用40:40:20的DNA比率以外。在37℃下孵育18-22小时后，向每种培养物中添加15μL的ExpiFectamine^TM 293增强子1和0.25mL的ExpiFectamine^TM 293增强子2(Thermo Fisher,Waltham,MA)。然后将培养物转移至37℃或32℃进行剩余时间的孵育，然后收获上清液。

为了在ExpiCHO^TM细胞中表达，将细胞在37℃下在以125rpm旋转的轨道振荡器上的ExpiCHO^TM表达培养基(Thermo Fisher,Waltham,MA)中在8％CO₂的加湿气氛中培养。用总共2μg DNA转染2.5ml体积的培养物(总细胞计数为1.5x 10⁸个细胞)，其中α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40:40:20。转染前，将DNA在0.1mL OptiPRO^TM SFM(Thermo Fisher,Waltham,MA)中稀释，以提供DNA转染混合物。将8μL的ExpiFectamine^TM CHO试剂(ThermoFisher,Waltham,MA)在体积为92μL的OptiPRO^TM SFM中稀释并且在孵育一至五分钟后，与DNA转染混合物合并以达到总体积为0.2mL。一至五分钟后，将DNA-ExpiFectamine^TM CHO试剂混合物添加到细胞培养物中。在37℃下孵育18-22小时后，向每种培养物中添加15μL的ExpiCHO^TM增强子和0.6mL的ExpiCHO^TM进料(Thermo Fisher,Waltham,MA)。然后将培养物转移至37℃或32℃并孵育7天。然后收获上清液。

如实施例2所述，通过生物层干涉测量法测量收获的上清液中的蛋白质滴度。在Expi293F^TM细胞中测得的滴度显著高于在ExpiCHO^TM细胞中(参见表5.1)，因此如实施例4中所述通过蛋白A纯化在Expi293F^TM细胞中表达的样品。如实施例4中所述，通过UPLC-SEC测定同质性。使用对应于正确分子量的峰面积以估计期望的单分散物质的百分比。结果示于表5.1和图3中。

表5.1：温度和细胞系对v21232表达的影响

¹通过UPLC-SEC测定。

如从表5.1中可以看出，在32℃的降低温度下，变体v21232在Expi293F^TM细胞中表达产生最大量的期望蛋白质。虽然较高的温度(37℃)增加了所产生的蛋白质总量，但是很大一部分蛋白质形成了高分子量物质。如从表5.1和图3中可以看出，在32℃下产生的TCR融合蛋白含有大大减少量的高分子物质和增加量的期望蛋白质。Expi293F^TM细胞始终比ExpiCHO^TM细胞产生更多的蛋白质。因此，仅通过UPLC-SEC纯化并表征从Expi293F^TM产生的样品。

实施例6：添加铰链样二硫键以稳定TCR融合蛋白

为了提高TCR融合蛋白的稳定性，如下制备包含二硫键的融合蛋白，所述二硫键模拟IgG1抗体中存在的轻链-上部铰链二硫键。

天然TCR序列包括位于恒定结构域和跨膜结构域之间的接头区的C端二硫键。设计了一种潜在的稳定性增强修饰，其在TCRα链上的天然C端半胱氨酸(称为位置TRAC/128.CYS，其通常从可溶性TCR构建体中省略)和位于β-Fc融合蛋白的Fc(220.CYS(EU编号))的上部铰链区中的天然半胱氨酸之间引入二硫键。这两个半胱氨酸之间形成的二硫键(即TRAC/128.CYS和铰链220.CYS)在本文中称为“TRAC-铰链二硫键”。

最初在两种TCR融合蛋白中对TRAC-铰链二硫键进行测试：融合到Fc的抗gp100TCR和融合到Fc的抗NY-ESO11G4-HA(高亲和力)TCR。两种TCR融合蛋白也含有IC二硫键。如实施例1所述，TCR融合蛋白以单臂格式构建，其中β链融合到Fc。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO：22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

如实施例4所述，最初在0.8mL的HEK293-6E细胞中表达TCR融合蛋白，并通过SDS-PAGE确认表达。随后如实施例4所述在250mL的HEK293-6E细胞中表达融合蛋白，但α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40：40：20。最初在37℃下孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育，随后如实施例4中所述通过UPLC-SEC纯化并表征。

通过差示扫描量热法(DSC)测定TCR融合蛋白的热稳定性。将每种纯化的TCR融合蛋白在PBS中稀释到0.4mg/mL。使用总共400μL，用MicroCal^TM VP-毛细管DSC(GEHealthcare Life Sciences，Chicago，IL)进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且在每次TCR融合蛋白注射之前布置缓冲液注射以进行参考。从20℃到100℃以60℃/小时的速率，以低反馈、8秒过滤器、5分钟preTstat和70psi的氮气压力，对每个样品进行扫描。使用Origin 7软件(OriginLab Corporation，Northampton，MA)参考并分析所得热谱图。DSC热谱图上的每个峰对应于一个热转变。有三个期望的热转变：TCR、CH2(～71℃)和CH3(～80℃)。TCR的转变包括TRAV-TRBV和TRAC-TRBC界面。

结果示于表6.1和图4中。

表6.1：包含TRAC-铰链二硫键的TCR融合蛋白的表达和表征

/>

¹通过UPLC-SEC测定。²通过DSC测定。

如从表6.1和图4中可以看出，与缺乏这种额外二硫键的相同融合蛋白相比，包含TRAC-铰链二硫键的抗gp100 TCR融合蛋白显示出Tm增加＞3℃(比较变体V21230和v22752)。类似地，与缺乏这种额外二硫键的相同融合蛋白相比，包含TRAC-铰链二硫键的抗NY-ESO1 1G4-HA TCR融合蛋白显示出Tm增加～2℃(比较变体v30930和v31185)。与缺乏TRAC-铰链二硫键的TCR融合蛋白相比，包含TRAC-铰链二硫键的抗NY-ESO 11G4-HA TCR融合蛋白也显示了正确物质增加29.4％。这些结果显示TRAC-铰链二硫键能够稳定TCR融合蛋白，并且也可转移到不同的TCR融合蛋白中。

实施例7：用于稳定TCR融合蛋白的额外二硫键的鉴定

为了改善TCR融合蛋白的稳定性，通过计算机模拟建模来鉴定为了引入新二硫键而包含在TRAC和/或TRBC结构域中的突变。

如实施例3中描述的TCR模型用于鉴定引入新二硫键的位置。计算位于TRAC和TRBC结构域中的每个非半胱氨酸残基与α链和β链中每个其他残基的Cβ-Cβ和Cα-Cα成对距离。在序列空间上被超过5个残基隔开的，或/>的残基对，被认为是潜在二硫键的阳性命中。目测检查所有带flag标记的残基对，以确认两个残基处于正确的取向以生成二硫键。通过上述标准的潜在二硫键在计算机模拟中作为模型生成。

每个二硫键的最低能量构象用于使用以下标准对模型进行分级：

·Katz&Kossiakoff，1986，J BiolChem，261(33)：15480-15485描述的二硫键二面角能量函数

·如通过主链和侧链均方根偏差(RMSD)测量的结构扰动程度

·结构中空间冲突的数目，以及

·分别引入链内和链间二硫键后折叠能或相互作用能的变化。

表7.1中列出了经过进一步实验研究的前几种命中。

表7.1：计算机模拟鉴定的前几种二硫键

实施例8：包含新链间二硫键的TCR融合蛋白的产生和表征

通过分析TCR融合蛋白的表达、热稳定性和胶体稳定性，在单臂格式的TCR融合蛋白中研究实施例7中鉴定的链间二硫键对稳定性的影响。

将实施例7中鉴定的每个高等级的链间二硫键(参见表7.1)引入融合到Fc的抗gp100 TCR中。如实施例1所述，TCR融合蛋白以单臂格式构建，其中β链融合到Fc。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO：22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体，但α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40：40：20。最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃或37℃下孵育，随后如实施例4中所述通过UPLC-SEC并且如实施例6中所述通过DSC进行纯化和表征。

结果示于表8.1中。

表8.1：包含链间二硫键的TCR融合蛋白的表达

¹通过UPLC SEC测定 ²通过DSC测定 ³在37℃下表达⁴在32℃下表达 ⁵在37℃下无表达

观察到已鉴定的链间二硫键中的两个表达并稳定TCR融合蛋白：TRAC/84.2TRBC/79(v22729)和TRAC/122TRBC/12(V31093)。两种变体都具有比v21230(IC二硫键)更低的Tm和更高的HMW物质。

实施例9：包含新链内二硫键的TCR融合蛋白的产生和表征

通过分析TCR融合蛋白的表达、热稳定性和胶体稳定性，在单臂格式的TCR融合蛋白中研究实施例7中鉴定的链内二硫键对稳定性的影响。

将实施例7中鉴定的每个高等级的链内二硫键(参见表7.1)引入融合到Fc的抗gp100 TCR中。如实施例1所述，TCR融合蛋白以单臂格式构建，其中β链融合到Fc。所有变体都含有TRAC/84.2TRBC/79二硫键(参见实施例8)和TRAC-铰链二硫键。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO：22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体，但α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40∶40∶20。最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育，随后如实施例4中所述通过UPLC-SEC并且如实施例6中所述通过DSC进行纯化和表征。

结果示于表9.1中。

表9.1：包含链内二硫键的TCR融合蛋白的表达

¹通过UPLC-SEC测定 ²通过DSC测定

³单独的TRAC/84.2TRBC/79二硫键和TRAC-铰链二硫键 ⁴无表达

如从表9.1中可以看出，变体v31085，其包含在位置TRAC/39.VAL_TRAC/85.ALA处的二硫键与TRAC/84.2.THR_TRBC/79.LEU链间二硫键和TRAC-铰链二硫键的组合，显示出Tm增加～5℃。

变体v31086，其包含在位置TRAC/26.THR_TRAC/85.1.SER处的二硫键与TRAC/84.2_TRBC/79二硫键(实施例8)和TRAC-铰链二硫键的组合，显示出Tm增加～2℃。

实施例10：稳定化的TCR融合蛋白与靶肽-MHC复合物的结合

通过如下的流式细胞术测试来自实施例4的TCR Tm等于或大于亲本TCR融合蛋白的TCR融合蛋白以及变体v22729和v22730(其包括新二硫键，参见实施例8)与其靶肽-MHC复合物的结合。

将T2细胞(ATCC CRL-1992)在RPMI-1640 10％FCS、1％青霉素-链霉素中培养。然后将细胞离心、重悬并与10uM gp100肽(YLEPGPVTA[SEQ ID NO：24])混合。在37℃下孵育两小时以使肽结合后，将细胞洗涤，重悬于PBS 1％FCS中并以每孔25ul添加到96V型孔板的孔中。使用平行板，使用1：3连续稀释制备TCR融合蛋白，从1：20原液稀释(原液浓度范围为0.54-1.09mg/m1)开始并延伸至11个样品(导致最低浓度为3-8pM)。然后离心细胞板，去除上清液并添加TCR融合蛋白溶液。将板在冰上保持30分钟，接着在PBS 1％FCS中洗涤一次，并重新混悬在1∶200抗人IgG Alexa 647缀合物(Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，West Grove，PA)中。将板在冰上再保持30分钟，接着用PBS 1％FCS洗涤两次。然后向孔中添加100ul的PBS 1％FCS，并且使用BD Fortessa^TM X-20(BD Biosciences，San Jose,CA)通过流式细胞术对板进行分析。

结果示于图5和图6中。如从图5中可以看出，除了变体v22730之外，所有TCR融合蛋白都显示出与靶肽-MHC复合物的结合。然而，变体v22730的UPLC-SEC迹线表明，大部分样品不是期望物质(参见实施例8)。所有其他TCR融合蛋白的EC₅₀相似(参见图6)。这些结果证明，引入TCR融合蛋白中的稳定化突变不影响所述蛋白质与其靶肽-MHC复合物的结合。

实施例11:包含稳定化突变组合的TCR融合蛋白

实施例4和实施例6-9描述鉴定了提高TCR融合蛋白的热稳定性和/或胶体稳定性的各种突变。构建包含这些突变的各种组合的TCR融合蛋白，以确定组合的突变是否可以进一步提高TCR融合蛋白的热稳定性和/或胶体稳定性。

如表11.1所概述，将实施例4和6-9中鉴定的单个突变组合，并引入融合到Fc的抗gp100 TCR中。如实施例1所述，TCR融合蛋白以单臂格式构建，其中β链融合到Fc。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中的表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体，但α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40:40:20。最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育5天，随后如实施例4中所述通过UPLC-SEC并且如实施例6中所述通过DSC进行纯化和表征。如实施例10中所述，使用流式细胞术确认TCR融合蛋白与靶肽-MHC复合物的结合。

结果示于表11.1中。表12中还包括变体v33047和v33048，这在实施例12中进一步讨论。

如从表11.1中可以看出，成功产生了包含稳定化突变的各种组合的TCR融合蛋白。唯一不成功的组合是变体v23953、v28893、v28903和v23398所包含的那些组合。

当与先前描述的IC二硫键组合时，观察到许多稳定化突变会提高热稳定性，包含包括IC二硫键的组合的几个变体与单独的IC二硫键相比，展示出约5℃的Tm增加。具体地+：

●v28897(TRAC/85Ala->Val，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

●v29002(TRAC/85Ala->Val，TRBC/45.3Val->Thr，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

●v29003(TRAC/85Ala->Val，TRBC/6Val->Leu，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

●v28914(TRAC/4Val->Ile，TRAC/85Ala->Val，TRBC/6Val->Leu，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

●v28915(TRAC/4Val->Ile，TRAC/85Ala->Val，TRBC/6Val->Leu，DTRBC/84.4-85.4->Gly-Asn，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

●v29012(TRAC/4Val->Ile，TRAC/85Ala->Val，TRAC/105Ala->Ser，TRBC/6Val->Leu，TRBC/36His->Phe，TRBC/86Ser->Thr，TRBC/45.3Val->Thr，TRAC-铰链二硫键和IC二硫键)

稳定化突变与TRAC/84.2_TRBC/79链间二硫键而不是IC二硫键的组合也提高了TCR融合蛋白的热稳定性。如从表11.1中可以看出，包含TRAC/84.2_TRBC/79链间二硫键和TRAC-铰链二硫键与3个或更多个其他稳定化突变组合的所有TCR融合蛋白显示出热稳定性高于单独IC二硫键的热稳定性(参见变体v29011、v31095、v31096、v31097、v31098、v31099、v31100、v31101、v31102、v31103、v31104和v33048)。

显示出热稳定性最大增加的缺乏IC二硫键的TCR融合蛋白是：

●v31099(TRAC/39Val->Ile，TRAC/85Ala->Val，TRBC/36His->Phe，TRAC/84.2Leu->Cys_TRBC/79Ser->Cys(二硫键)和TR AC-铰链二硫键)

●v33048(TRBC/6Val->Ile，TRBC/36His->Phe，TRAC/84.2Leu->Cys_TRBC/79Ser->Cys(二硫键),TRAC-铰链二硫键和TRAC/39Val->Cys_TRAC/85Ala->Cys(二硫键))。

/>

实施例12:包含至TRAC-铰链二硫键的替代二硫键的TCR融合蛋白

实施例11描述了能够在不存在IC二硫键的情况下提高TCR融合蛋白的热稳定性和/或胶体稳定性的突变的各种组合。所有鉴定的稳定化组合都包括TRAC铰链二硫键。由于某些格式的TCR融合蛋白可能不适应TRAC-铰链二硫键，因此研究了使用替代二硫键的突变组合，以鉴定那些能够提高TCR融合蛋白的热稳定性和/或胶体稳定性的组合。

构建包含模拟IgG4二硫键的TRAC-铰链二硫键的置换以及稳定化点突变的组合的TCR融合蛋白。置换二硫键由充当IgG4 CH1半胱氨酸的等效物的TRBC/11.CYS，以及充当轻链(LC)半胱氨酸的等效物的TRAC/124、125、126、127或128中的一种组成。

实施例8中描述的在位置TRAC/122.PRO_TRBC/12.ALA处引入的二硫键也位于TCR的C端附近，并用稳定化点突变的组合作为TRAC-铰链二硫键的另一种替代进行了测试。

还测试了包含链内二硫键TRAC/39.VAL_TRAC/85.ALA(参见实施例9)及稳定化点突变的组合，有和没有TRAC-铰链二硫键的变体(分别为变体v33048和v33047)。这两个变体充当对照，如下面更详细描述的。

所有TCR融合蛋白都包含TRAC/84.2_TRBC/79二硫键。测试的突变组合示于表12.1。

将每种突变的组合引入融合到Fc的抗gp100 TCR中。如实施例1所述，TCR融合蛋白以单臂格式构建，其中β链融合到Fc。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

结果示于表12.1中。如从表12.1可以看出，所有测试的组合都成功表达为TCR融合蛋白。将包含测试组合的TCR融合蛋白与含有TRAC-铰链二硫键的变体v33048进行比较。包含替代性二硫键的TCR融合蛋白的表达产量通常低于变体v33048的表达产量。对于包含替代性二硫键的TCR融合蛋白观察到的HMW物质的量与对于变体v33048观察到的量相当，对于变体v33049和v33055观察到的量最相似。所有其他变体都包含15％以下的HMW物质。

与缺乏替代性C端二硫键的变体v33047相比，包含替代性C端二硫键的所有TCR融合蛋白(即变体v33048、v33049、v33050、v33051、v33052、v33053、v33054、v33056和v33057)显示Tm增加。另外，与包含TRAC-铰链二硫键的变体v33048相比，包含替代性C端二硫键的几个变体显示Tm增加(参见表12.1中的变体v33050、v33053、v33054、v33056和v33057)。

总之，测试的所有替代性C端二硫键都成功地改善TCR融合蛋白的稳定性，并且可以用作TRAC-铰链二硫键的替代。

实施例13:包含稳定化突变的双特异性TCR融合蛋白

本实施例描述了包含抗CD3 scFv或Fab和一个或多个TCR的CD3接合双特异性TCR融合蛋白的构建、表达和表征。

TCR融合蛋白表达为具有一个或两个TCR组分和一个抗CD3组分的异源二聚体。抗CD3组分是人源化OKT3或UCHT-1，作为scFv或标准Fab格式中的互补位(参见国际专利公开号WO 2017/008169和WO 2010/133828)。

TCR组分是抗gp100 TCR或抗NY-ESO1 1G4-HA，其在CDR中具有取代以产生不同的亲和力，如表13.1所示(参见Li等,2005,Nature Biotechnology,23(3):349-354和国际专利公开号WO 2011/001152)。

所有TCR组分在TCR恒定区中都包含以下稳定化突变：TRAC/4.VAL->ILE，TRAC/85.ALA->VAL，TRAC/105.ALA->SER TRBC/6.VAL->LEU，TRBC/36.HIS->PHE，TRBC/86.SER->THR，TRBC/45.3->THR，Δ_TRBC/84.4-85.4->GLY-ASN，TRAC/84.2->CYS_TRBC/79.SER->CYS(二硫键)和TRAC-铰链二硫键。

如实施例1所述，TCR融合蛋白包含人IgG1异源二聚Fc，其包含促进异源二聚Fc形成的CH3结构域氨基酸取代。所有双特异性变体都包括敲除FcγR结合的以下CH2结构域氨基酸取代：L234A、L235A和D265S。

采用以下TCR融合蛋白格式：单臂β融合物(“OA”；参见图1H)、双特异性β-融合物(“杂交”；参见图1L)、2x1双特异性β-融合物(“2x1”；参见图1O)和双特异性串联β-融合物(“1x1串联”；参见图1N)。

如实施例1所述，制备编码每种双特异性TCR融合蛋白的载体插入物，并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ IDNO:22]。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中的表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体。在最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育，并如实施例4中所述纯化。如实施例4中所述，通过UPLC-SEC测量HMW物质的量。如实施例10所述，通过流式细胞术测量抗gp100TCR融合蛋白与靶肽-MHC复合物的结合。

结果示于表13.2和图7中。

表13·2:双特异性TCR融合蛋白的特征

¹通过UPLC-SEC测定

如从表13.2中可以看出，所有测试的格式都成功表达，蛋白A的纯化产量范围为24mg/L至54mg/L。存在的高分子量物质的量范围为3.7％至23.9％。包含Fab或第二TCR的格式保持了相似的表达产量和HMW物质。

包含抗gp100 TCR的所有变体保持与靶MHC-肽复合物的结合。OA变体v29011和双特异性变体v31327具有几乎相同的结合曲线(参见图7)，表明向TCR融合蛋白中添加第二结合部分(诸如抗CD3组分)不影响TCR组分与其靶MHC-肽复合物的结合。图7还显示了，与较高亲和力的抗gp100 TCR对照：v29011和v31327相比，用包含较低亲和力的抗gp100 TCR组分的变体：v30972、v30964、v30975和v30968，观察到预期的结合响应降低。

观察到增加融合蛋白上TCR部分的数目会改善结合响应。如从表13.2中可以看出，2x1变体(v31307、v30966、v30967和v30968)与包含单个TCR组分的相应变体相比，全部显示亲和力改善。包含两个拷贝的最弱亲和力的抗gp100 TCR组分的2x1变体v30968与包含单个拷贝的该TCR组分的变体v30975、30964和30972相比，显示EC₅₀降低(参见图7)。

实施例14:不同TCR种系序列对TCR融合蛋白表达的影响

为了确定种系序列是否影响TCR融合蛋白的表达和稳定性，将来自抗gp100 TCR的CDR移植到不同的TCR种系框架序列上，如下所述。

为了确定不同种系序列对TCR稳定性的影响，仅改变TCR融合蛋白的TCR组分的可变结构域中的框架区。基于IMGT定义选择CDR边界，并且使用来自抗gp100 TCR的α链和β链的CDR序列置换替代性种系序列中相应的CDR区。前五条α序列和前五条β序列的种系序列是基于使用IMGT/基因频率工具(通过国际ImMunoGeneT ics信息系统网站获得)确定的频率来鉴定的。前五个α序列被鉴定为TRAV19、TRAV14/DV4、TRAV17、TRAV9-2和TRAV8-4，并且前五个β序列被鉴定为TRBV28、TRBV30、TRBV19、TRB V27和TRBV5-1。抗gp100 TCR中的天然种系序列是TRAV17和TRBV19。

然后将包含移植的CDR序列的α和β序列进行组合，使得每个α序列与每个β序列匹配，总共有25个组合。如实施例1所述，以单臂形式构建包含每种组合的TCR融合蛋白，其中β链融合到Fc。所有TCR融合蛋白都含有IC二硫键和TRAC-铰链二硫键。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:22]。如实施例1所述，制备载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中的表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体，但α链、β链-Fc(A)和Fc(B)的DNA比率为40:40:20。最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育，随后如实施例4中所述通过UPLC-SEC并且如实施例6中所述通过DSC进行纯化和表征。

结果示于表14.1中。

表14.1:包含不同种系序列的TCR融合蛋白的表达

¹通过UPLC-SEC测定²N/D＝由于HMW物质水平高而未测定³No Ex＝通过SDS-PAGE未观察到表达

如从表14.1中可以看出，只有两种变体产生单分散的可溶性蛋白：v31129和v31131。变体v31131包含种系序列TRAV17和TRBV19，它们对于抗gp100 TCR是天然的，并因此预期它们会表达。变体v31129包含种系序列TRAV17和TRBV28，并因此包含与天然抗gp100TCR相同的TRAV序列。对于变体v31129观察到的HMW物质的量略高于v31131，但是热稳定性相似：53.5℃对比53.3℃。因此TRBV28似乎与该TCR CDR集合和TRAV17相容。总之，表14.1中的结果表明，来自这种抗gp100 TCR的CDR集合与大多数其他种系不相容，并且天然种系序列可能为给定的TCR序列提供最佳稳定性。

实施例15：稳定化的TCR融合蛋白的长期稳定性

为了评估TCR融合蛋白的长期稳定性，将实施例4、6、9、11和14中描述的选定变体在40℃下孵育，并如下所述通过UPLC-SEC评估HMW物质的量。

测试的TCR融合蛋白列于表15.1中。在PBS缓冲液中，将这些选定的稳定化的TCR融合蛋白的蛋白浓度调节至1mg/mL。将各200ul变体溶液密封在Eppendorf管中，并在设定为40℃的孵育箱中孵育14天或30天。在以下时间点取每种变体的40ul样品：0、3、7、10和14天(对于14天的孵育)或0、5、20和30天(对于30天的孵育)。将样品立即在-80℃下冷冻。在孵育期结束时，将所有样品解冻，并且如实施例4中所述通过UPLC-SEC评估HMW物质的量。

结果示于表15.1中。

表15.1：在40℃下孵育的TCR融合蛋白的HMW物质的量的变化

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¹该变体包括如实施例1中所述的突变TRAC/1.5.GLN->LYS和TRBC/97.GLN->ASP

²该变体包含TRAV17和TRBV28种系序列

通过第一次测量(第0天)和最后一次测量(第14天或第30天)之间的差异来确定每种物质的变化％，并在培养期间进行平均。例如，报告的HMW物质增加0.70％相当于孵化14天后增加9.8％。

如从表15.1中可以看出，在测试的所有变体中仅含IC二硫键的TCR融合蛋白(v21230)显示出HMW物质(聚集物)的最大增长率。包含稳定化突变的组合的所有TCR融合蛋白与变体v21230相比，显示HMW物质的量减少，其中变体v28897、v31097和v31099与v21230相比显示出HMW物质的形成速率降低10倍以上。

表15.1中显示的结果指示，与仅包含IC二硫键的TCR融合蛋白相比，在TCR融合蛋白中包含前述实施例中描述的稳定化突变的组合会增加融合蛋白的长期胶体稳定性。

实施例16:多价TCR融合蛋白的产生和表征

增加TCR融合蛋白上TCR部分的数目可以改善与靶肽-MHC复合物的结合(如实施例13所示)，或者通过允许同时与多个肽-MHC复合物结合来提供额外的生物学功能。如下所述产生并表征化合价高达四个TCR的多价TCR融合蛋白。

构建以下格式的TCR融合蛋白：

(1)双特异性β融合物(“1x1”；参见图1L)

(2)2x1双特异性β融合物(“2x1”；参见图1O)

(3)3x1双特异性β融合物(“3x1”；参见图1P)

(4)4x1双特异性C端β融合物(“4x1串联”；参见图1Q)

(5)4x1双特异性轻链β融合物(“4x1 LC”；参见图1R)。

每种情况下的抗体组分是抗CD3 Fab或scFv。TCR组分是表16.1中列出的野生型1G4-WT抗NY-ESO1 TCR(“NY-ESO1-WT”)、亲和力成熟型1G4-33A抗NY-ESO1 TCR(“NY-ESO1-33A”)(Li人,2005,Nat.Biotechnol.,23:349-354)或抗PRAME TCR。所有TCR序列都含有TRAC/84.2_TRBC/79二硫键、TRAC/39.VAL->CYS_TRAC/85.ALA->CYS(二硫键)和TRAC-铰链二硫键稳定化突变。

如实施例1所述，制备编码每种TCR融合蛋白的载体插入物并将其克隆到用于表达的pTT5载体中。所有序列之前都有信号肽：MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG[SEQ ID NO:22]。

如实施例4中所述，最初测试TCR融合蛋白在0.8mL的HEK293-6E细胞中的表达。通过SDS-PAGE确认表达，随后如实施例4中所述，在250mL的HEK293-6E细胞中表达具有可观察到的蛋白质表达条带的变体。在最初孵育18-22小时后，将细胞在32℃下孵育，并如实施例4所述进行纯化。如实施例4中所述，通过UPLC-SEC测量单分散性。

结果示于表16.1中。

表16.1:多聚体TCR融合蛋白的表达和单分散性

¹野生型1G4-WT抗-NY-ESO1 TCR ²亲和力成熟型1G4-33A抗NY-ESO1 TCR

³没有可观察到的表达

如从表16.1可以看出，1x1格式的包含野生型抗NY-ESO1 TCR、高亲和力抗NY-ESO1TCR或抗PRAME TCR的TCR融合蛋白成功表达。包含多达四个抗NY-ESO1 TCR的TCR融合蛋白以足够的量表达，以便作为单分散样品进行分析和随后纯化。图8中示出了两种4x1 TCR融合蛋白v32548和v32549的示例性UPLC-SEC迹线。包含抗PRAME TCR的融合蛋白似乎通常不如包含抗NY-ESO1 TCR的融合蛋白稳定。虽然稳定化突变充分稳定抗PRAME TCR，以允许1x1格式的成功表达，但表达水平低于相同1x1格式的任一抗NY ES01TCR的表达水平，指示抗PRAME TCR可能是固有的低表达TCR。

实施例17:稳定化的TCR融合蛋白的T2T细胞依赖性细胞毒性测定

在T2 T细胞依赖性细胞毒性测定(TDCC)中，测试了来自实施例16的对NY-ESO1肽具有特异性的TCR融合蛋白对具有其靶肽-MHC复合物的细胞的细胞杀伤作用。表17.1中列出了测试的TCR融合蛋白。

使用前，将T2细胞(ATCC CRL-1992)在T75烧瓶中的RPMI1640+10％FBS中在37℃+5％CO₂下培养进行至少两次传代。将细胞通过在含10μM NY-ESO-1肽(SLLMWITQC[SEQ IDNO:23])和100ng/mLβ-2-微球蛋白(Sino Biological,Beijing,China)的培养基中重混悬进行脉冲，并在37℃+5％CO₂下孵育24小时。TDCC测定在96孔U形底板中的RPMI-1640+10％FBS+1％青霉素/链霉素测定培养基中准备。通过1:5连续稀释制备TCR融合蛋白，浓度范围为1μM-0.05pM，60μL/孔。使用制造商的方案(ThermoFisher,Waltham,MA)，用2μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)对T2细胞进行染色。染色后，将T2细胞重悬于RPMI1640+10％FBS中，并与新鲜解冻的T细胞(BioIVT,Westbury,NY)以5:1的比率混合。以60μL/孔添加细胞混合物，并将板在37℃+5％CO₂下孵育48小时。孵育后，将样品转移至96孔V形底板并用FACS缓冲液(PBS+2％FBS)洗涤2次。将样品以50μL/孔重悬于2μg/mL的7-氨基放线菌素D(7-AAD)(BioLegend，San Diego，CA)中。将板在室温下孵育15分钟，接着用FACS缓冲液洗涤两次。将样品重悬于50μL/孔的FACS缓冲液中，并使用BD Fortessa^TM X-20(BD Biosciences，SanJose，CA)通过流式细胞术对板进行分析。

表17.1中汇总了测量的EC₅₀值。也参见图10。TCR融合蛋白含有NY-ESO1-WT互补位(亲和力：32000nM)或NY-ESO1-33A互补位(亲和力：254nM)，如表17.1所示。

表17.1：T2 T细胞依赖性细胞毒性测定中多聚体TCR融合蛋白的EC₅₀

变体#	格式	EC₅₀(nM)	NY-ESO1互补位
				v31185	单臂β融合物-DS	无活性	NY-ESO-WT
v32545	双特异性β融合物	最低活性1	NY-ESO1-WT
				v32546	2x1双特异性β融合物	最低活性1	NY-ESO1-WT
v32547	3x1双特异性β融合物	最低活性1	NY-ESO1-WT
				v32548	4x1双特异性C端β融合物	最低活性1	NY-ESO1-WT
v32549	4x1双特异性轻链β融合物	最低活性1	NY-ESO1-WT
				v32550	双特异性β融合物	28.3	NY-ESO1-33A
v32551	2x1双特异性β融合物	8.4	NY-ESO1-33A
				v32552	3x1双特异性β融合物	2.0	NY-ESO1-33A
v32553	4x1双特异性C端β融合物	2.8	NY-ESO1-33A
				v32554	4x1双特异性轻链β融合物	最低活性¹	NY-ESO1-33A

¹仅在μM浓度下观察到活性

如从表17.1和图10中可以看出，TCR-抗CD3双特异性蛋白能够选择性杀伤展示出期望的MHC-肽复合物的靶细胞。靶向细胞杀伤仅发生在有双特异性分子的情况下-缺乏抗CD3互补位(v31185)的单臂TCR分子在任何观察浓度下都不产生杀伤作用。这证明多价格式是细胞杀伤所需的。另外，细胞杀伤从1X变体到3X变体增加约10倍，表明3X变体的亲合力作用提供了最大的细胞杀伤增强。用4X变体没有观察到EC₅₀的进一步增加，这可能是由于已经达到了最大效力，或者4X格式可能不是NY-ESO1 TCR的最佳格式。无论TCR的效价如何，包含较低亲和力TCR(NY-ESO1-WT)的变体全部显示出最小的响应。

总之，这些结果证明TCR-抗CD3双特异性蛋白可以选择性地杀伤靶细胞，并且这种活性可以通过增加TCR组分的效价而增加。

在本说明书中引用的所有专利、专利申请、出版物和数据库条目的公开内容特此通过引用明确地整体并入，如同明确单独地指出每个此类单独的专利、专利申请、出版物和数据库条目通过引用并入一样。

对本领域技术人员来说显而易见的本文描述的特定实施方法的修改旨在包括在以下权利要求的范围内。

序列表

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Claims

1.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，

其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含：稳定化突变，所述稳定化突变包含在所述Cα结构域和所述Cβ结构域之间的第一链间二硫键；和一个或多个额外的稳定化突变，所述一个或多个额外的稳定化突变选自：

a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；

b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

j)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

k)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

u)所述TCR构建体的Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，和

v)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，

其中氨基酸的编号是IMGT编号，

并且其中与仅包含第一非天然存在的二硫键的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

2.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：

b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

c)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

d)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

e)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

f)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

g)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；以及

i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，

并且其中所述第一个链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的。

3.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：

a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；

b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；和

c)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，

4.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：

a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；和

b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，

5.根据权利要求1至4中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的额外的链间二硫键：

6.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一非天然存在的链间二硫键是在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。

7.根据权利要求6所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的额外的链间二硫键：

8.根据权利要求1至7中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸长度为5个氨基酸或更少。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸包含IgG1上部铰链区的序列的全部或一部分。

10.根据权利要求9所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSC[SEQ IDNO:19]。

11.根据权利要求9所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSCDKTHT[SEQID NO:16]。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的链内二硫键：

在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；和

在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包括：

a)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

b)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

c)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；和

d)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代。

14.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，

其中所述Cα结构域和/或Cβ结构域包含一个或多个选自以下的稳定化突变：

c)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

d)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

e)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

h)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

i)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

j)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

k)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

l)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

p)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

q)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

t)所述TCR构建体的Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，和

u)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，

其中氨基酸的编号是IMGT编号，

并且其中与不包含所述一个或多个稳定化突变的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

15.根据权利要求14所述的TCR构建体，其还包含选自以下的链间二硫键：

在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；和

在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键。

16.根据权利要求14或15所述的TCR构建体，其中所述稳定化突变包含选自以下的第一链间二硫键：

f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；和

g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键。

17.根据权利要求16所述的TCR构建体，其中所述稳定化突变包含选自以下的第二链间二硫键：

g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，

其中所述第一和第二链间二硫键不同。

18.根据权利要求14至17中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸的长度为5个氨基酸或更少。

19.根据权利要求14至18中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸包含IgG1上部铰链区的序列的全部或一部分。

20.根据权利要求19所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSC[SEQ IDNO:19]。

21.根据权利要求19所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]。

22.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，

其中所述Cα结构域和Cβ结构域一起包含两个或更多个选自以下的稳定化突变：

e)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；

j)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

k)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；

l)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

m)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

n)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

o)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；

q)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；

r)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；

s)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；

t)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；

v)所述TCR构建体的Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，和

w)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β-转角，

其中氨基酸的编号是IMGT编号，

并且其中与不包含所述两个或更多个稳定化突变的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。

23.根据权利要求22所述的TCR构建体，其中所述稳定化突变包含第一链间二硫键和第二链间二硫键，其中所述第一和第二链间二硫键不同。

24.根据权利要求22或23所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸的长度为5个氨基酸或更少。

25.根据权利要求22至24中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸包含IgG1上部铰链区的序列的全部或一部分。

26.根据权利要求25所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSC[SEQ IDNO:19]。

27.根据权利要求25所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]。

28.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，所述TCR构建体包含选自对于表2所示任一变体阐述的氨基酸突变组合的氨基酸突变组合，其中氨基酸的编号是IMGT编号。

29.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，所述TCR构建体包含选自对于表3所示任一变体阐述的氨基酸突变组合的氨基酸突变组合，其中氨基酸的编号是IMGT编号。

30.根据权利要求1至29中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRα链多肽或所述TCRβ链多肽融合到免疫球蛋白(Ig)Fc区。

31.根据权利要求30所述的TCR构建体，其中所述Ig Fc区是IgG Fc区。

32.根据权利要求31所述的TCR构建体，其中所述IgG Fc区是IgG1 Fc区。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽融合到所述Ig Fc区。

34.一种TCR融合蛋白，其包含根据权利要求1至29中任一项所述的一个或多个TCR构建体和支架，其中所述TCR构建体中的至少一个融合到所述支架。

35.根据权利要求34所述的TCR融合蛋白，其中所述支架包含免疫球蛋白(Ig)Fc区。

36.根据权利要求35所述的TCR融合蛋白，其中所述Ig Fc区是IgG Fc区。

37.根据权利要求36所述的TCR融合蛋白，其中所述IgG Fc区是IgG1 Fc区。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的TCR融合蛋白，其中所述TCR融合蛋白包含一个、两个、三个或四个TCR构建体。

39.根据权利要求34至37中任一项所述的TCR融合蛋白，其中所述TCR融合蛋白包含两个或更多个TCR构建体。

40.根据权利要求39所述的TCR融合蛋白，其中所述TCR构建体中的两个串联融合。

41.根据权利要求34至40中任一项所述的TCR融合蛋白，其中所述TCR构建体中的至少一个经由所述TCRβ链多肽融合到所述支架。

42.根据权利要求34至41中任一项所述的TCR融合蛋白，其中所述TCR融合蛋白还包含一个或多个额外的生物活性部分。

43.根据权利要求42所述的TCR融合蛋白，其中所述一个或多个额外的生物活性部分包含抗原结合结构域。

44.根据权利要求43所述的TCR融合蛋白，其中所述抗原结合结构域是scFv或Fab。

45.根据权利要求42至44中任一项所述的TCR融合蛋白，其中所述生物活性部分中的至少一个融合到所述支架。

46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至33中任一项所述的TCR构建体和药学上可接受的载剂或稀释剂。

47.一种药物组合物，其包含根据权利要求34至45中任一项所述的TCR融合蛋白和药学上可接受的载剂或稀释剂。

48.一种多核苷酸或多核苷酸集合，其编码根据权利要求1至33中任一项所述的TCR构建体。

49.一种多核苷酸或多核苷酸集合，其编码根据权利要求34至45中任一项所述的TCR融合蛋白。

50.一种制备根据权利要求1至33中任一项所述的TCR构建体的方法，其包括用根据权利要求48所述的多核苷酸或多核苷酸集合转染细胞，并在适于表达所述TCR构建体的条件下培养所述细胞。

51.一种制备根据权利要求34至45中任一项所述的TCR融合蛋白的方法，其包括用根据权利要求49所述的多核苷酸或多核苷酸集合转染细胞，并在适于表达所述TCR构建体的条件下培养所述细胞。

52.根据权利要求50或51所述的方法，其中所述细胞在30℃至35℃的温度下培养。

53.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至33中任一项所述的TCR构建体，或根据权利要求34至45中任一项所述的TCR融合蛋白。

54.根据权利要求1至33中任一项所述的TCR构建体，其用于疗法中。

55.根据权利要求34至45中任一项所述的TCR融合蛋白，其用于疗法中。