KR102411491B1 - 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도 - Google Patents

가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102411491B1
KR102411491B1 KR1020217017337A KR20217017337A KR102411491B1 KR 102411491 B1 KR102411491 B1 KR 102411491B1 KR 1020217017337 A KR1020217017337 A KR 1020217017337A KR 20217017337 A KR20217017337 A KR 20217017337A KR 102411491 B1 KR102411491 B1 KR 102411491B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
amino acid
heterodimer
ser
domain
acid substitutions
Prior art date
Application number
KR1020217017337A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20210070401A (ko
Inventor
아담 루이스 코퍼
둔자 우로세브
스테이시 에이. 엘. 톰-유
더스틴 웨일랜드 블루 블레일
토마스 슈프레터 폰 크로이덴스타인
수르지트 딕시트
폴라 아이린 라리오
마리오 산체스
Original Assignee
자임워크스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50826996&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR102411491(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 자임워크스 인코포레이티드 filed Critical 자임워크스 인코포레이티드
Priority to KR1020227020444A priority Critical patent/KR102545617B1/ko
Publication of KR20210070401A publication Critical patent/KR20210070401A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102411491B1 publication Critical patent/KR102411491B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)

Abstract

본 발명은 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있는 이형이합체 쌍을 제공하고, 여기서 각 이형이합체는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 및 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편을 포함한다. 이들 이형이합체 중에서 최소한 하나는 C H 및/또는 C L 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형, V H 및/또는 V L 도메인에서 하나 또는 그 이상 아미노산 변형, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 변형된 아미노산(들)은 경쇄와 중쇄 사이에 경계면의 일부일 수 있고, 그리고 이형이합체 쌍의 2개의 중쇄와 2개의 경쇄가 세포에서 공동발현될 때, 첫 번째 이형이합체의 중쇄가 다른 것보다는 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기하도록, 각 중쇄 및 원하는 경쇄 사이에 우선적 짝짓기를 창출하기 위해 전형적으로 변형된다. 유사하게, 두 번째 이형이합체의 중쇄는 전형적으로, 첫 번째 경쇄보다는 두 번째 경쇄와 우선적으로 짝짓기한다.

Description

가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도{Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof}
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2012년 11월 28일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/730,906, 2013년 2월 6일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/761,641, 2013년 5월 2일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/818,874, 그리고 2013년 8월 23일자 제출된 U.S. 가출원 번호 61/869,200에 우선권을 주장하고, 이들 각각의 전체 개시는 본원에 모든 점에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-웹을 통해 제출되었고 본원에 전체적으로 참조로서 편입되는 서열 목록을 내포한다. 2013년 XXX일자에 작성된 상기 ASCII 사본은 XXX_sequencelisting.txt로 명명되고, 그리고 크기에서 XXX 바이트이다.
배경
이중특이적 항체는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 에피토프는 동일한 항원 상에 있을 수 있고, 또는 각 에피토프는 상이한 항원 상에 있을 수 있다. 이중특이적 항체의 이러한 특질은 이들을, 질환의 치료에서 하나 이상의 분자를 표적화하거나 또는 동원하는 것에 치료적 이익이 있는 다양한 치료적 적용을 위한 매력적인 도구로 만든다. 이중특이적 항체를 형성하는 접근법 중에서 한 가지는 2개의 독특한 항체 중쇄 및 2개의 독특한 항체 경쇄의 부수적 발현을 수반할 것이다. 야생형과 유사한 형태에서 이중특이적 항체를 정확하게 형성하는 것은 과제로서 남아있는데, 그 이유는 항체 중쇄가 항체 경쇄에 상대적으로 불규칙한 방식으로 결합하도록 진화하였기 때문이다. 이러한 불규칙한 짝짓기의 결과로서, 2개의 항체 중쇄 및 2개의 항체 경쇄의 부수적 발현은 중쇄 - 경쇄 짝짓기의 스크램블링을 자연적으로 야기한다. 이러한 틀린짝짓기는 이중특이적 치료제의 산출을 위한 주요 과제로서 남아있는데, 여기서 균질한 짝짓기가 우수한 제조가능성 및 생물학적 효능을 위한 필수적인 요건이다.
특정 항체 경쇄 또는 단편이 특정 항체 중쇄 또는 단편과 짝짓기하는 이중특이적 항체를 준비하기 위한 여러 접근법이 설명되었다. 이러한 문제를 해소하기 위한 다양한 접근법의 재고는 Klein et al., (2012) mAbs 4:6, 1-11에서 발견될 수 있다. 국제 특허 출원 번호 PCT/EP2011/056388 (WO 2011/131746)은 환원 조건 하에 배양 시에 2개의 단일특이적 IgG4- 또는 IgG4-유사 항체 사이에서 지향성 "Fab-팔" 또는 "절반-분자" 교환을 주동하기 위해, 비대칭 돌연변이가 2개의 단일특이적 출발 단백질의 CH3 영역 내로 도입되는 이형이합체성 단백질을 산출하기 위한 시험관내 방법을 설명한다.
Schaefer et al. (Roche Diagnostics GmbH)은 인공 링커의 이용 없이, 2개의 현존하는 항체로부터 유래된 2개의 중쇄와 2개의 경쇄를 인간 이가 이중특이적 IgG 항체로 조립하는 방법을 설명한다 (PNAS (2011) 108(27): 11187-11192). 상기 방법은 이중특이적 항체의 한쪽 절반의 항원-결합 단편 (Fab) 내에서 중쇄와 경쇄 도메인을 교환하는 것을 수반한다.
Strop et al. (Rinat-Pfizer Inc.)은 관심되는 2개의 항체를 개별적으로 발현하고 정제하며, 그리고 이후 특정된 산화환원 조건 하에 이들을 함께 혼합함으로써 안정된 이중특이적 항체를 생산하는 방법을 설명한다 (J. Mol. Biol. (2012) 420:204-19).
Zhu et al. (Genentech)은 불변 도메인을 완전하게 결여하는 변이체 도메인 항체 단편으로 구성되는 디아바디 구조체의 VL/VH 경계면에서 돌연변이를 가공하고, 그리고 이형이합체성 디아바디를 산출하였다 (Protein Science (1997) 6:781-788). 유사하게, Igawa et al. (Chugai)은 또한, 디아바디의 선별적인 발현을 증진하고 입체형태적 이성화를 저해하기 위해, 단일-사슬 디아바디의 VL/ VH 경계면에서 돌연변이를 가공하였다 (Protein Engineering, Design & Selection (2010) 23:667-677).
US 특허 공개 번호 2009/0182127 (Novo Nordisk, Inc.)은 다른 쌍의 중쇄와 상호작용하는 한 쌍의 경쇄의 능력을 감소시키는 경쇄-중쇄 쌍의 Fc 경계면에서 및 CH1:CL 경계면에서 아미노산 잔기를 변경함으로써 이중특이적 항체의 산출을 설명한다.
요약
최소한 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함하는 단리된 항원 결합 폴리펩티드 구조체가 본원에서 설명되고, 첫 번째 이형이합체는 첫 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H1), 그리고 첫 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L1)을 포함하고; 그리고 두 번째 이형이합체는 두 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H2), 그리고 두 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L2)을 포함하고, 여기서 첫 번째 이형이합체의 H1 또는 L1 서열 중에서 최소한 하나는 두 번째 이형이합체의 상응하는 H2 또는 L2 서열과 상이하고, 그리고 여기서 H1과 H2는 최소한 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1 도메인)을 각각 포함하고; L1과 L2는 최소한 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인) 및 경쇄 불변 도메인 (CL 도메인)을 각각 포함하고; 그리고 H1, H2, L1과 L2 중에서 최소한 하나는 최소한 하나의 불변 도메인 및/또는 최소한 하나의 가변 도메인의 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 여기서 H1은 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 H2는 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기한다.
일부 양상에서, 구조체는 이형이합체성 Fc를 더욱 포함하고, 상기 Fc는 최소한 2개의 CH3 서열을 포함하고, 여기서 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체에 연계되고, 여기서 이합화된 CH3 서열은 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 계량될 때 약 68 ℃ 또는 더욱 높은 융해 온도 (Tm)를 갖고, 그리고 여기서 상기 구조체는 이중특이적이다.
일부 양상에서, 최소한 하나의 아미노산 변형은 표 또는 실시예에서 도시된 최소한 하나의 아미노산 변형에서 선별된다.
일부 양상에서, H1, H2, L1과 L2가 세포 또는 포유류 세포에서 공동발현될 때, 또는 H1, H2, L1과 L2가 무세포 발현 시스템에서 공동발현될 때, 또는 H1, H2, L1과 L2가 공동생산될 때, 또는 H1, H2, L1과 L2가 산화환원 생산 시스템을 거쳐 공동생산될 때, H1은 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 H2는 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기한다.
일부 양상에서, H1, H2, L1과 L2 중에서 최소한 하나는 H1이 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고 및/또는 H2가 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기하도록, VH 및/또는 VL 도메인의 최소한 하나의 아미노산 변형 및 CH1 및/또는 CL 도메인의 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 양상에서, H1이 CH1 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하면, L1과 L2 중에서 최소한 하나는 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하고; 및/또는 H1이 VH 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하면, L1과 L2 중에서 최소한 하나는 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함한다.
일부 양상에서, H1, L1, H2, 및/또는 L2는 최소한 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 돌연변이를 포함한다. 일부 양상에서, H1, H2, L1과 L2 중에서 최소한 하나는 최소한 하나의 불변 도메인 및/또는 최소한 하나의 가변 도메인의 최소한 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 아미노산 변형을 포함한다.
일부 양상에서, L1과 L2 둘 모두 H1 및 H2 중에서 최소한 하나와 공동발현될 때, 개별 상응하는 H1-L2 또는 H2-L1 이형이합체 쌍의 상대적 짝짓기에 대한 H1-L1과 H2-L2 이형이합체 쌍 중에서 최소한 하나의 상대적 짝짓기는 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%보다 크고, 그리고 여기서 변형된 H1-L1 또는 H2-L2 이형이합체 쌍의 상대적 짝짓기는 최소한 하나의 아미노산 변형이 없는 상응하는 H1-L1 또는 H2-L2 이형이합체 쌍에서 관찰된 개별 상대적 짝짓기보다 크다.
일부 양상에서, 첫 번째와 두 번째 이형이합체 중에서 최소한 하나의 DSC에 의해 계량될 때 융해 온도 (Tm)에 의해 계량된 열 안정성은 최소한 하나의 아미노산 변형이 없는 상응하는 이형이합체의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10℃의 범위 안에 있다. 일부 양상에서, 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하는 각 이형이합체의 DSC에 의해 계량될 때 융해 온도 (Tm)에 의해 계량된 열 안정성은 최소한 하나의 아미노산 변형이 없는 상응하는 이형이합체의 Tm의 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10℃의 범위 안에 있다.
일부 양상에서, 자신이 결합하는 항원에 대한 각 이형이합체의 친화성은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 또는 FACS에 의해 계량될 때 동일한 항원에 대한 개별 변형되지 않은 이형이합체의 친화성의 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50-배의 범위 안에 있다.
일부 양상에서, H1과 L1 중에서 최소한 하나는 L2와 비교하여, H1이 L1과 짝짓기할 때 아미노산의 더욱 큰 입체 상보성을 유발하는 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, H2와 L2 중에서 최소한 하나는 L1과 비교하여, H2가 L2와 짝짓기할 때 아미노산의 더욱 큰 입체 상보성을 유발하는 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, H1과 L1 중에서 최소한 하나는 L2와 비교하여, H1이 L1과 짝짓기할 때 하전된 아미노산 사이에 더욱 큰 정전 상보성을 유발하는 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, H2와 L2 중에서 최소한 하나는 L1과 비교하여, H2가 L2와 짝짓기할 때 하전된 아미노산 사이에 더욱 큰 정전 상보성을 유발하는 최소한 하나의 아미노산 변형을 포함하는 최소한 하나의 도메인을 포함한다
일부 양상에서, 최소한 하나의 아미노산 변형은 표 또는 실시예 중에서 최소한 하나에서 도시된 한 세트의 돌연변이이다. 일부 양상에서, 최소한 하나의 변형은 H1-Q39E, L1-Q38K, H2-Q39K, 그리고 L2-Q38E가 아니다. 일부 양상에서, 최소한 하나의 변형은 H1-Q39E, L1-Q38E, H2-Q39K, 그리고 L2-Q38K가 아니다.
일부 양상에서, 구조체는 최소한 2개의 CH3 서열을 포함하는 Fc를 더욱 포함하고, 여기서 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체에 연계된다.
일부 양상에서, Fc는 인간 Fc, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgG Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc, 또는 인간 IgG4 Fc이다. 일부 양상에서, Fc는 이형이합체성 Fc이다. 일부 양상에서, Fc는 CH3 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, 이합화된 CH3 서열은 DSC에 의해 계량될 때 약 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 또는 85 ℃ 또는 더욱 높은 융해 온도 (Tm)를 갖는다. 일부 양상에서, Fc는 생산될 때 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%보다 큰 순도에서 형성된 이형이합체이거나; 또는 Fc는 발현될 때 또는 단일 세포에 의해 발현될 때 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%보다 큰 순도에서 형성된 이형이합체이다. 일부 양상에서, Fc는 야생형 동종이합체성 Fc에 필적하는 안정성으로 이형이합체성 Fc의 형성을 증진하는, CH3 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 최소한 하나의 CH2 서열을 더욱 포함한다. 일부 양상에서, Fc의 CH2 서열(들)은 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선별적인 결합을 증진하는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다.
일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 이형이합체에 연계되거나, 또는 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 H1과 H2에 연계된다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 링커이다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 IgG1 힌지 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커에 대한 하나 또는 그 이상의 변형은 Fc-감마 수용체의 선별적인 결합을 증진한다.
일부 양상에서, 최소한 하나의 아미노산 변형은 최소한 하나의 아미노산 돌연변이이거나, 또는 최소한 하나의 아미노산 변형은 최소한 하나의 아미노산 치환이다.
일부 양상에서, H1, H2, L1과 L2 각각의 서열은 인간 서열로부터 유래된다.
일부 양상에서, 구조체는 다중특이적 또는 이중특이적이다. 일부 양상에서, 구조체는 다가 또는 이가이다.
또한 본원에서 설명된 구조체를 인코딩하는 최소한 하나의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드들의 세트가 본원에서 설명된다. 일부 양상에서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트는 cDNA이다.
또한 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터들의 세트가 본원에서 설명된다. 일부 양상에서, 벡터 또는 벡터들의 세트는 플라스미드, 다중시스트론 벡터, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유류 벡터, 발현 벡터, 그리고 재조합 발현 벡터로 구성되는 군에서 선별된다.
또한 본원에서 설명된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트, 또는 본원에서 설명된 벡터 또는 벡터들의 세트를 포함하는 단리된 세포가 본원에서 설명된다. 일부 양상에서, 세포는 하이브리도마, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 HEK293 세포이다.
또한 본원에서 설명된 구조체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물이 본원에서 설명된다. 일부 양상에서, 조성물은 완충액, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트화제, 안정제, 그리고 부형제로 구성되는 군에서 선별된 하나 또는 그 이상의 물질을 더욱 포함한다.
또한 개체에서 또는 약제의 제조에서 질환 또는 장애 또는 암 또는 혈관병의 치료를 위한 본원에서 설명된 구조체 또는 본원에서 설명된 제약학적 조성물의 용도가 본원에서 설명된다.
또한 본원에서 설명된 구조체 또는 본원에서 설명된 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애 또는 암 또는 혈관병을 앓는 개체의 치료 방법이 본원에서 설명된다.
또한 세포를 본원에서 설명된 구조체 또는 본원에서 설명된 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 내에 또는 세포에 신호를 저해하거나, 감소시키거나 또는 차단하는 방법이 본원에서 설명된다.
또한 본원에서 설명된 구조체를 숙주 세포 배양액으로부터 획득하는 방법이 본원에서 설명되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 상기 구조체를 인코딩하는 하나 또는 그 이상의 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 배양액을 획득하는 단계; 그리고 (b) 상기 구조체를 숙주 세포 배양액으로부터 회수하는 단계.
또한 본원에서 설명된 구조체를 획득하는 방법이 본원에서 설명되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) H1, L1, H2와 L2를 획득하는 단계; (b) H1이 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 H2가 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기할 수 있도록 하는 단계; 그리고 (c) 구조체를 획득하는 단계.
또한 본원에서 설명된 구조체를 제조하는 방법이 본원에서 설명되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: 최소한 하나의 구조체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트를 획득하는 단계; 최소한 하나의 숙주 세포 내로 도입을 위한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트 각각의 최적 비율을 결정하는 단계, 여기서 최적 비율은 H1, L1, H2와 L2의 발현 시에 형성된 틀린짝짓기된 H1-L2와 H2-L1 이형이합체 쌍과 비교하여 H1, L1, H2와 L2의 발현 시에 형성된 H1-L1과 H2-L2 이형이합체 쌍의 양을 사정함으로써 결정되고; 바람직한 최적 비율을 선별하는 단계, 여기서 바람직한 최적 비율의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트로 최소한 하나의 숙주 세포의 형질감염은 구조체의 발현을 유발하고; 최소한 하나의 숙주 세포를 최적 비율의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트로 형질감염시키는 단계; 그리고 최소한 하나의 숙주 세포를 배양하여 구조체를 발현하는 단계.
일부 양상에서, 최적 비율을 선별하는 것은 일시적인 형질감염 시스템에서 형질감염에 의해 사정된다. 일부 양상에서, 바람직한 최적 비율의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드들의 세트로 최소한 하나의 숙주 세포의 형질감염은 구조체의 최적 발현을 유발한다. 일부 양상에서, 구조체는 최소한 2개의 CH3 서열을 포함하는 Fc를 포함하고, 여기서 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체에 연계된다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 임의선택적으로 포함하는 이형이합체이다.
또한 첫 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H1) 및 첫 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L1)을 포함하는 첫 번째 이형이합체; 그리고 두 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H2) 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L2)을 포함하는 두 번째 이형이합체에서 상보성 돌연변이를 나타내는 데이터를 포함하는 데이터세트, 여기서 H1과 H2는 최소한 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1 도메인)을 각각 포함하고; 여기서 L1과 L2는 최소한 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인) 및 경쇄 불변 도메인 (CL 도메인)을 각각 포함하고, 그리고 여기서 상보성 돌연변이의 데이터세트는 표 또는 실시예에서 열거된 돌연변이 또는 이들 돌연변이의 부분집합을 나타내는 데이터를 포함하고; 그리고 H1이 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고 및/또는 H2가 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기하는 가능성을 결정하기 위한 컴퓨터 실행가능한 코드를 저장하는 컴퓨터-판독가능한 저장 매체가 본원에서 설명된다.
또한 우선적 짝짓기를 결정하기 위한 컴퓨터 실행된 방법이 본원에서 설명되고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: 첫 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H1) 및 첫 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L1)을 포함하는 첫 번째 이형이합체; 그리고 두 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H2) 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L2)을 포함하는 두 번째 이형이합체에서 상보성 돌연변이를 나타내는 데이터를 포함하는 데이터세트를 획득하는 단계, 여기서 H1과 H2는 최소한 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1 도메인)을 각각 포함하고; 여기서 L1과 L2는 최소한 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인) 및 경쇄 불변 도메인 (CL 도메인)을 각각 포함하고, 그리고 여기서 상보성 돌연변이의 데이터세트는 표 또는 실시예에서 열거된 돌연변이 또는 이들 돌연변이의 부분집합을 나타내는 데이터를 포함하고; 그리고 H1이 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고 및/또는 H2가 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기하는 가능성을 컴퓨터 프로세서에 의해 결정하는 단계. 일부 양상에서, 상기 방법은 본원에서 설명된 구조체를 생산하는 것을 더욱 포함한다.
또한 이중특이적 항원 결합 폴리펩티드 구조체를 생산하는 방법이 본원에서 설명되고, 상기 이중특이적 구조체는 첫 번째 단일특이적 항원 결합 폴리펩티드로부터 첫 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H1) 및 첫 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L1)을 포함하는 첫 번째 이형이합체; 그리고 두 번째 단일특이적 항원 결합 폴리펩티드로부터 두 번째 면역글로불린 중쇄 폴리펩티드 서열 (H2) 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L2)을 포함하는 두 번째 이형이합체를 포함하고, 여기서 H1과 H2는 최소한 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1 도메인)을 각각 포함하고; 여기서 L1과 L2는 최소한 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인) 및 경쇄 불변 도메인 (CL 도메인)을 각각 포함하고, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: H1, H2, L1 및/또는 L2 내로 변형의 부분집합의 도입 시에, 검사 시스템에서 H1이 L2와 비교하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 H2가 L1과 비교하여 L2와 우선적으로 짝짓기하도록, H1, H2, L1과 L2 내에 한 세트의 아미노산 변형을 나타내는 데이터를 포함하는 데이터세트를 획득하는 단계; 데이터세트로부터 하나 또는 그 이상의 변형의 부분집합을 첫 번째 이형이합체 및/또는 두 번째 이형이합체 내로 도입하는 단계; 그리고 최소한 하나의 숙주 세포에서 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 공동발현하여 이중특이적 구조체를 포함하는 발현 산물을 생산하는 단계.
일부 양상에서, 상기 방법은 발현 산물에서 다른 폴리펩티드 산물에 비하여 이중특이적 구조체의 양을 결정하는 것을 더욱 포함한다. 일부 양상에서, 이중특이적 구조체는 다른 폴리펩티드 산물과 비교하여 70%보다 큰 순도에서 생산된다. 일부 양상에서, 데이터세트는 본원에서 설명된 데이터세트이다. 일부 양상에서, 상기 방법은 다른 폴리펩티드 산물과 비교하여 이중특이적 구조체의 순도를 증가시키기 위해 H1, H2, L1, 또는 L2 중에서 최소한 하나에 추가 아미노산 변형을 부가하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 양상에서, 구조체는 최소한 2개의 CH3 서열을 포함하는 Fc를 포함하고, 여기서 상기 Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체에 연계된다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 임의선택적으로 포함하는 이형이합체이다. 일부 양상에서, 항원 결합 폴리펩티드는 항체, Fab, 또는 scFv이다.
도면의 간단한 설명
도면 1은 VH 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 만들어진 LCCA 설계 세트에서, 본원에서 설명된 항원-결합 구조체로부터 이형이합체의 우선적 짝짓기를 보여주는 표를 제공한다.
도면 2는 CH1 또는 CL 도메인에 아미노산 변형이 만들어진 LCCA 설계 세트에서, 이형이합체의 우선적 짝짓기를 보여주는 표를 제공한다.
도면 3은 본원에서 설명된 항원-결합 구조체로부터 선별된 우선적으로 짝짓기된 또는 틀린짝짓기된 이형이합체의 경우에서 열 안정성 및 항원에 대한 친화성을 보여주는 표를 제공한다.
도면 4는 선별된 이형이합체에 대한 열 풀림 곡선을 제공한다.
도면 5는 선별된 이형이합체에 대한 크기 배제 크로마토그래피 프로필을 제공한다.
도면 6은 가변, 불변 및 J-영역 분절에 대한 정준 인간 생식계열 서열에 대하여 정렬된 D3H44 중쇄와 경쇄 아미노산 서열을 묘사한다. (도면에서 표기법: * 서열 동일성, # 경계면 핫스팟 (특이성 드라이버), + 설계에서 검사된 돌연변이된 잔기). 도면 6A는 인간 VH 생식계열 하위군을 묘사한다 (하나의 대표적인 서열이 각 패밀리에 대해 전시된다). VH3 및 IGHJ3*02에 대하여 D3H44의 정렬에 기초된 서열 동일성. 도면 6B는 인간 카파 VL 생식계열 하위군을 묘사한다 (하나의 대표적인 서열이 각 패밀리로부터 전시된다). VKI 및 IGKJ1*01에 대하여 D3H44의 정렬에 기초된 서열 동일성. 도면 6C는 인간 람다 VL 생식계열 하위군을 묘사한다 (하나의 대표적인 서열이 각 패밀리로부터 전시된다). VL1 및 IGLJ1*01에 대하여 D3H44의 정렬에 기초된 서열 동일성. 도면 6D는 인간 CH1 대립형질 서열을 묘사한다. 도면 6E는 인간 카파 및 람다 대립형질 서열을 묘사한다.
도면 7은 이중특이적 항체를 설계하기 위한 전략을 개설하는 흐름도를 묘사한다.
도면 8은 이중특이적 Mab (단일클론 항체)를 형성하기 위한 가공 요건, 그리고 중쇄 경쇄 쌍을 정량하는데 필요한 검정 요건의 높은 수준 계통도 개요를 도시한다. 높은 순도 (즉, 틀린짝짓기된 H-L 연관이 거의 또는 전혀 없음)를 갖는 이중특이적 Mab를 가공하는 설계 목적은 독특한 동계 경쇄에 대한 2개의 독특한 중쇄의 우선적 짝짓기를 합리적으로 가공 (특정한 아미노산 돌연변이의 도입을 통해)함으로써 달성될 수 있다. 이러한 과정은 개략적으로 도시된다; 여기서 H1은 L1와 우선적으로 짝짓기하지만 L2와는 그렇지 않도록 가공되었다. 유사하게, H2는 L2와 우선적으로 짝짓기하지만 L1과는 그렇지 않도록 가공되었다. 이중특이적 Mab 설계의 실험적 스크리닝은 H1-L1:H1-L2 및 H2-L2:H2-L1을 동시에 정량할 수 있는 검정을 필요로 한다. 이들 검정 요건은 각 이중특이적 Fab 팔이 독립적으로 가공될 수 있다고 추정함으로써 단순화될 수 있다. 이러한 사례에서, 검정은 단지 H1-L1:H1-L2 또는 H2-L2:H2-L1을 정량하는 것을 필요로 하고, 그리고 둘 모두를 동시에 정량하는 것을 필요로 하지 않을 것이다.
도면 9는 중쇄와 경쇄가 태그되고 우선적 짝짓기가 결정되는 방식을 묘사하는 계통도를 제공한다. 이러한 계통도에서, 원은 3개의 구조체가 형질감염되는 세포를 나타낸다. 발현 산물은 세포로부터 분비되고, 그리고 상층액 (SPNT)은 검출 장치, 이러한 사례에서 SPR 칩 위에 흘러진다. 중쇄 짝짓기에 대해 경쟁하는 2개의 경쇄에 융합된 2개의 상이한 태그의 검출 수준에 기초하여, 2개의 경쇄에 대한 중쇄의 우선적 짝짓기의 정량적 추정치가 추정될 수 있다.
도면 10은 2개의 전장 중쇄 각각이 2개의 상이한 경쇄와 독립적으로 공동발현될 때 예상된 중쇄 연관된 산물을 묘사한다. 우선적 짝짓기는 MCA를 이용하여 사정된다.
도면 11은 H1이 L2에 비하여 L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 H2가 L1에 비하여 L2와 우선적으로 짝짓기하도록 설계된 H1, L1, H2, L2 사슬의 예시적인 세트를 묘사한다. 가변 영역 중쇄와 경쇄 경계면의 3D 결정 구조의 카툰 표시가 제공된다. 경계면에서 도입된 돌연변이는 우선적으로 형성하는 절대 쌍에 대해 각각 가변 영역 경계면의 2개 세트에서 정전과 입체 상보성을 달성한다. 다른 한편, 부정확한 쌍에는 불리한 입체와 정전 불일치가 존재하고, 이것은 불일치 쌍에 대한 감소된 짝짓기 성향뿐만 아니라 감소된 안정성을 유발할 것이다.
도면 12는 도면 11에서 도시된 H1, L1, H2, L2 사슬의 예시적인 세트에 기초하여, H1, L1과 L2가 공동발현될 때 (왼쪽 패널) 및 H2, L1과 L2가 공동발현될 때 (오른쪽 패널), 결과의 LC/MS 스펙트럼을 묘사한다.
도면 13은 도면 11에서 도시된 설계에 기초된 H1-L1과 H2-L2 쌍의 생물물리학적 성질의 사정을 묘사한다. 도면 13A는 단백질 A 정제 전후에 H1-L1과 H2-L2 쌍의 비환원 SDS-PAGE 분석을 보여주고, 그리고 산물의 수율은 겔의 아래쪽에 도시된다; 도면 13B는 H1-L1과 H2-L2 짝짓기된 산물의 DSC 온도기록도를 보여준다; 그리고 도면 13C는 H2-L2 쌍의 UPLC-SEC (H2-L2) 프로필을 보여준다.
도면 14는 2개의 상이한 경쇄가 세포에서 2개의 상이한 중쇄와 공동발현될 때 예상된 중쇄 연관된 산물을 묘사한다. 우선적 짝짓기는 SMCA (단일클론 항체 경쟁 검정)를 이용하여 사정된다.
도면 15는 도면 11에서 도시된 설계에 기초된 이중특이적 항원-결합 구조체 (H1-L1_H2-L2)에 대한 LC/MS 스펙트럼을 묘사한다.
도면 16A 왼쪽 패널은 도면 11에서 묘사된 바와 같은 설계 세트로부터 유래된 이중특이적 항원-결합 구조체의 순도의 사정을 묘사한다. 도면은 이형이합체성 Fc를 갖는 Her2 결합 Mab로 구성된 대조 변이체와 함께, SMCA 변이체의 쿠마시 염색된 비환원 SDS-PAGE를 보여준다. 단백질 A (ProtA) 정제 후, SMCA 변이체의 순도는 높고 대조에 정성적으로 동등하다. SMCA 변이체의 추정된 포스트-ProtA 수율은 20 mg/L이고 40 mg/ml의 대조 수율에 필적한다. 오른쪽 패널 (도면 16B)은 전술한 이중특이적 구조체의 SEC 프로필을 묘사한다. 관찰된 주요 피크 (>90% 전체 피크 구역)는 ~150KDa의 분자량에서 이동하고 Mab 단위체로 구성된다. 관찰된 마이너 피크는 ~75KDa에서 이동하고 절반-항체로 구성된다. 유의미한 더욱 높은 분자량 피크 (응집 종류를 잠재적으로 지시함)는 관찰되지 않는다.
도면 17A는 도면 11에서 묘사된 설계 세트에 기초된 이중특이적 구조체에 의한 TF 또는 Her2 항원에 대한 단일특이적 결합을 보여주는 SPR 데이터를 묘사한다 (주의: 이러한 SMCA 설계는 도면 11에서 묘사된 바와 동일한 H1-L1과 H2-L2 MCA 설계를 활용한다).
도면 17B는 이중특이적 항원 결합 구조체에 의한 TF와 Her2 항원의 동시 이중특이적 결합을 보여주는 SPR 데이터를 묘사한다.
도면 18은 결정적인 경계면 잔기를 확인하기 위한, 그리고 우선적 중쇄-경쇄 짝짓기로 설계의 계산적 모형화를 위한 흐름도를 묘사한다.
도면 19는 본 발명에서 제공된 절대 돌연변이 쌍의 라이브러리를 이용하여 이중특이적 항체를 제조하는 방법을 묘사하는 계통도를 도시한다.
상세한 설명
첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있는 항원 결합 폴리펩티드 구조체 (또한 이형이합체 쌍으로서 지칭됨)가 본원에서 제공되고, 여기서 각 이형이합체는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편 및 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 이형이합체 중에서 최소한 하나는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 1 (CH1)에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형 및 면역글로불린 경쇄 불변 도메인 (CL)에서 하나 또는 그 이상 아미노산 변형; 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 (VH)에서 하나 또는 그 이상 아미노산 변형 및 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (VL)에서 하나 또는 그 이상 아미노산 변형; 또는 중쇄와 경쇄의 불변과 가변 도메인 둘 모두에 선행한 아미노산 변형의 조합을 포함할 수 있다. 변형되는 아미노산은 전형적으로, 경쇄와 중쇄 사이에 경계면의 일부이고, 그리고 첫 번째 이형이합체의 중쇄가 다른 것보다는 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기하도록, 각 중쇄 및 원하는 경쇄 사이에 우선적 짝짓기를 창출하기 위해 변형된다. 유사하게, 두 번째 이형이합체의 중쇄는 첫 번째 경쇄보다는 두 번째 경쇄와 우선적으로 짝짓기할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본원에서 설명된 아미노산 변형의 특정한 조합은 중쇄와 특정한 경쇄의 우선적 짝짓기를 증진하고, 따라서 이중특이적 단일클론 항체 (Mab) 발현이 미미한 또는 제한된 틀린짝짓기에서 발생할 수 있도록 하고, 그리고 바람직하지 않은, 또는 틀린짝짓기된 산물로부터 원하는 이형이합체를 정화하는 필요를 최소화한다. 이들 이형이합체는 아미노산 변형을 포함하지 않는 이형이합체에 필적하는 열 안정성을 전시할 수 있고, 그리고 또한, 아미노산 변형을 포함하지 않는 이형이합체에 필적하는 항원에 대한 결합 친화성을 증명할 수 있다.
첫 번째와 두 번째 이형이합체의 설계는 2개의 상이한 치료적 표적을 표적으로 하거나 또는 동일한 항원 내에 2개의 상이한 에피토프 (중복 또는 비중복)를 표적으로 하는 이중특이적 항체를 창출하는데 이용될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 이형이합체 쌍을 제조하는 방법을 더욱 제공한다.
정의
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 청구된 요부가 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 용어에 대한 복수의 정의가 존재하는 경우에, 본 섹션에서 정의가 우선한다. URL 또는 다른 이런 식별자 또는 주소가 언급되는 경우에, 이런 식별자가 변할 수 있고 인터넷 상에서 특정 정보가 오고갈 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷을 검색함으로써 발견될 수 있는 것으로 이해된다. 그것에 참고는 이런 정보의 이용가능성 및 공공 전파를 증거한다.
전술한 일반적 설명 및 다음 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적이며 청구된 임의의 요부를 제한하지 않는 것으로 이해된다. 본 출원에서, 단수의 이용은 달리 특정되지 않으면, 복수를 포함한다.
현재의 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않으면, 언급된 범위 내에 임의의 정수의 값 및 적절하면, 이의 분율 (가령, 정수의 10분의 1 및 100분의 1)을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "약"은 달리 지시되지 않으면, 지시된 범위, 값, 순서, 또는 구조의 ± 10%를 의미한다. 용어 "a" 및 "an"은 본원에서 이용된 바와 같이, 문맥에 의해 달리 지시되거나 또는 구술되지 않으면 열거된 성분 중에서 "하나 또는 그 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 하다. 대안 (가령, "또는")의 이용은 대안 중에서 한쪽, 양쪽, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "포함한다 (include)" 및 "포함한다 (comprise)"는 동의어로서 이용된다. 이에 더하여, 본원에서 설명된 구조와 치환체의 다양한 조합으로부터 유래된 개별 단일 사슬 폴리펩티드 또는 면역글로불린 구조체는 마치 각 단일 사슬 폴리펩티드 또는 이형이합체가 개별적으로 진술된 것과 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시되는 것으로 이해되어야 하다. 따라서, 개별 단일 사슬 폴리펩티드 또는 이형이합체를 형성하기 위한 특정 성분의 선별은 본 발명의 범위 안에 있다.
본원에서 이용된 섹션 표제는 단지 조직화를 목적으로 하고, 그리고 설명된 요부 (subject matter)를 한정하는 것으로 해석되지 않는다. 특허, 특허 출원, 논문, 서적, 매뉴얼, 그리고 조약이 포함되지만 이들에 한정되지 않는, 본 출원에서 인용된 모든 문서, 또는 문서의 부분은 어떤 목적으로든 본원에서 명확히 전체적으로 참조로서 편입된다.
본원에서 설명된 방법과 조성물은 본원에서 설명된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 구조체, 그리고 시약에 한정되지 않고, 그리고 따라서 변할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고, 그리고 본원에서 설명된 방법과 조성물의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않는 것으로 이해되고, 이들은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정될 것이다.
본원에서 언급된 모든 간행물과 특허는 예로서, 본원에서 설명된 방법, 조성물과 화합물과 관련하여 이용될 수 있을 지도 모르는, 간행물에서 설명되는 구조체와 방법론을 설명하고 개시하는 목적으로 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 본원에서 논의된 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 개시 목적으로만 제공된다. 본원에서 어느 것도 본원에서 설명된 발명자가 선행 발명에 의하여 또는 임의의 다른 이유로, 이런 개시에 앞서는 권리가 없음을 인정하는 것으로 간주되지 않는다.
본 출원에서, 아미노산 이름 및 원자 이름 (가령, N, O, C 등)은 Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org)에 의해 규정된 바와 같이 이용되는데, 이것은 Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)에서 수정판과 함께, IUPAC 명명법 (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (잔기 이름, 원자 이름 등), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)에 기초된다. 용어 "아미노산 잔기"는 일차적으로, 20개 자연 발생 아미노산, 다시 말하면, 알라닌 (Ala 또는 A), 시스테인 (Cys 또는 C), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 E), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소류신 (Ile 또는 I), 리신 (Lys 또는 K), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 프롤린 (Pro 또는 P), 글루타민 (Gln 또는 Q), 아르기닌 (Arg 또는 R), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 발린 (Val 또는 V), 트립토판 (Trp 또는 W), 그리고 티로신 (Tyr 또는 Y) 잔기로 구성되는 군에 내포된 아미노산 잔기를 지시하는 것으로 의도된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다. 다시 말하면, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드의 설명 및 단백질의 설명에 동등하게 적용되고, 그리고 그 반대로도 그렇다. 이들 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 비자연적으로 인코딩된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 이들 용어는 아미노산 잔기가 공유 펩티드 결합에 의해 연결되는, 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포괄한다.
용어 "뉴클레오티드 서열" 또는 "핵산 서열"은 2개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속성 스트레치를 지시하는 것으로 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 유전체학, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
"세포", "숙주 세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 본원에서 교체가능하게 이용되고, 그리고 모든 이런 용어는 세포의 성장 또는 배양으로부터 발생하는 자손을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. "형질전환" 및 "형질감염"은 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 과정을 지칭하기 위해 교체가능하게 이용된다.
용어 "아미노산"은 자연 발생과 비자연 발생 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연적으로 인코딩된 아미노산은 20개 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프랄린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 그리고 발린) 및 피롤리신과 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 염기성 화학적 구조, 다시 말하면, 수소에 결합되는 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 그리고 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이런 유사체는 변형된 R 기 (가령, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 중추를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 염기성 화학적 구조를 유지한다. 아미노산에 대한 언급은 예로서, 자연 발생 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예를 들면, 아미노산 변이체와 유도체; 자연 발생 비단백질생성 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 오르니틴 등; 그리고 아미노산의 특징인 것으로 당분야에서 공지된 성질을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비자연 발생 아미노산의 실례에는 □-메틸 아미노산 (가령, 메틸 알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산 (가령, 2-아미노-히스티딘, 히드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 측쇄에서 추가 메틸렌을 갖는 아미노산 ("동종" 아미노산), 그리고 측쇄에서 카르복실산 기능기가 술폰산 기 (가령, 시스테인산)로 대체되는 아미노산이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 합성 비선천적 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 또는 그 이상의 D-아미노산을 비롯한 비자연 아미노산의 본 발명의 단백질 내로 함입은 다양한 상이한 방식에서 유리할 수 있다. D-아미노산-내포 펩티드 등은 L-아미노산-내포 대응물과 비교하여 시험관내에서 또는 생체내에서 증가된 안정성을 전시한다. 따라서, D-아미노산을 함입하는 펩티드 등의 작제는 더욱 큰 세포내 안정성이 요망되거나 또는 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 더욱 특정하게는, D-펩티드 등은 내인성 펩티드분해효소와 프로테아제에 내성이고, 따라서 분자의 향상된 생체이용률, 그리고 생체내에서 연장된 수명이 바람직할 때 이런 성질을 제공한다. 부가적으로, D-펩티드 등은 T 보조 세포에 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한된 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없고, 그리고 이런 이유로, 전체 생물체에서 체액성 면역 반응을 유도할 개연성이 낮다.
아미노산은 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장된 그들의 통상적으로 공지된 3 문자 기호 또는 1 문자 기호에 의해 본원에서 지칭된다. 뉴클레오티드는 유사하게, 그들의 통상적으로 인정되는 1 문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
"보존성으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘 모두에 적용된다. 특정 핵산 서열에 대하여, "보존성으로 변형된 변이체"는 동일한 또는 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산, 또는 핵산이 아미노산 서열을 인코딩하지 않는 경우에, 본질적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축중성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 소정의 단백질을 인코딩한다. 가령, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두 아미노산 알라닌을 인코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 상기 코돈은 인코딩된 폴리펩티드를 변화시키지 않으면서, 설명된 상응하는 코돈 중에서 한 가지로 변경될 수 있다. 이런 핵산 변이는 "침묵 변이"인데, 이들은 보존성으로 변형된 변이의 한 가지 종류이다. 폴리펩티드를 인코딩하는 본원에서 모든 핵산 서열은 또한, 핵산의 모든 가능한 침묵 변이를 설명한다. 당업자는 핵산에서 각 코돈 (통상적으로 메티오닌에 대한 유일 코돈인 AUG, 그리고 통상적으로 트립토판에 대한 유일 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 산출하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 설명된 서열에서 함축적이다.
아미노산 서열과 관련하여, 당업자는 인코딩된 서열에서 단일 아미노산 또는 작은 백분율의 아미노산을 변경하거나, 부가하거나 또는 결실하는, 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 대한 개별 치환, 결실 또는 부가는 "보존성으로 변형된 변이체"라는 것을 인식할 것인데, 여기서 상기 변성은 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 유발한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 공지된다. 이런 보존성으로 변형된 변이체는 본 발명의 다형성 변이체, 종간 동족체, 그리고 대립형질에 더해지고 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 공지된다. 다음 8가지 군은 각각, 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산을 내포한다:
1) 알라닌 (A), 글리신 (G);
2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E);
3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q);
4) 아르기닌 (R), 리신 (K);
5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V);
6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W);
7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 그리고
8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M)
(가령, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)을 참조한다).
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은 다음 서열 비교 알고리즘 (또는 당업자에게 가용한 다른 알고리즘) 중에서 한 가지를 이용하여 또는 수동 정렬 및 시각적 검사에 의해 계량된, 비교 윈도우, 또는 지정된 영역 위에서 최대 상응을 위해 비교되고 정렬될 때, 그들이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율 (즉, 특정된 영역 위에서 약 50% 동일성, 약 55% 동일성, 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 동일성)을 가지면, "실제적으로 동일"하다. 이러한 정의는 또한, 검사 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 길이에서 최소한 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에서, 또는 길이에서 75-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에서, 또는 특정되지 않는 경우에, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터 동족체를 비롯하여, 본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 엄격한 혼성화 조건 하에 라이브러리를 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지화된 프로브로 스크리닝하고, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 내포하는 전장 cDNA와 유전체학 클론을 단리하는 단계를 포함하는 공정에 의해 획득될 수 있다. 이런 혼성화 기술은 당업자에게 널리 공지된다.
폴리펩티드의 유도체 또는 변이체는 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열이 본래 펩티드로부터 100개 아미노산 서열과 최소한 50% 동일성을 가지면, 상기 펩티드와 "상동성"을 공유하거나 또는 "상동한" 것으로 일컬어진다. 일정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 최소한 75% 동일하다. 일정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 최소한 85% 동일하다. 일정한 구체예에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 최소한 90% 동일하다. 일부 구체예에서, 유도체의 아미노산 서열은 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 최소한 95% 동일하다. 일정한 구체예에서, 유도체 또는 변이체는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 펩티드의 단편과 최소한 99% 동일하다.
본원에서 이용된 바와 같이, "단리된" 폴리펩티드 또는 구조체는 자연 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 구조체 또는 폴리펩티드를 의미한다. 자연 환경의 오염 성분은 이형다합체에 대한 진단적 또는 치료적 이용을 전형적으로 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 이용된 바와 같이, 본원에서 설명된 "단리된" 항원-결합 구조체는 자연 세포 배양 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 이형이합체 또는 이형이합체 쌍을 포함하는 이형이합체 쌍 또는 "단리된" 이형이합체 쌍을 포함한다. 자연 환경의 오염 성분은 이형이합체 또는 항원-결합 구조체에 대한 진단적 또는 치료적 이용을 간섭하는 물질이고, 그리고 효소, 호르몬, 그리고 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다.
이형이합체 및 항원-결합 구조체와 이형이합체 쌍은 일반적으로, 실제적으로 균질하게 정제된다. 관용구 "실제적으로 균질한", "실제적으로 균질한 형태" 및 "실제적인 균질성"은 산물이 바람직하지 않은 폴리펩티드 조합으로부터 기원된 부산물 (가령, 동종이합체)을 실질적으로 결여한다는 것을 지시하는데 이용된다. 순도의 면에서 표현된, 실제적인 균질성은 부산물의 양이 10%를 초과하지 않고, 그리고 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만, 가장 바람직하게는 0.5% 미만이라는 것을 의미하고, 여기서 이들 백분율은 중량에 의한다.
관용구 "선별적으로 (또는 특이적으로) 혼성화한다"는 특정 뉴클레오티드 서열이 복합체 혼합물 (전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA가 포함되지만 이들에 한정되지 않음) 내에 존재할 때 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 서열에만 분자의 결합, 이중화, 또는 혼성화를 지칭한다.
항체 기술의 분야의 당업자에 의해 이해되는 용어는 본원에서 명확히 상이하게 규정되지 않으면, 당해 분야에서 획득된 의미가 각각 제공된다. 항체는 가변 영역, 힌지 영역, 그리고 불변 도메인을 갖는 것으로 알려져 있다. 면역글로불린 구조와 기능은 예로서, Harlow et al, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에서 재고된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항체" 및 "면역글로불린" 또는 "항원 결합 폴리펩티드"는 교체가능하게 이용된다. "항원 결합 폴리펩티드"는 피분석물 (항원)에 특이적으로 결합하는, 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드, 또는 이의 하나 또는 그 이상의 단편을 지칭한다. 인정되는 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론과 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되고, 이들은 차례로, 면역글로불린 아이소타입, IgG, IgM, IgA, IgD, 그리고 IgE를 각각 규정한다. 게다가, 항체는 다수의 아형 중에서 한 가지에 속할 수 있다, 가령, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위부류에 속할 수 있다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조적 단위는 폴리펩티드 사슬의 2개 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 1개의 "가벼운" (약 25 kD) 사슬 및 "무거운" (약 50-70 kD) 사슬을 갖는다. 용어 "경쇄"는 전장 경쇄 및 결합 특이성을 부여하는데 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인, VL, 그리고 불변 영역 도메인, CL을 포함한다. 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노-말단이다. 경쇄는 카파 사슬 및 람다 사슬을 포함한다. 용어 "중쇄"는 전장 중쇄 및 결합 특이성을 부여하는데 충분한 가변 영역 서열을 갖는 이의 단편을 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인, VH, 그리고 3개의 불변 영역 도메인, CH1, CH2와 CH3을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, 그리고 CH 도메인은 카르복실 말단에 있는데, CH3이 폴리펩티드의 카르복시 말단에 가장 가깝다. 중쇄는 IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 하위부류 포함), IgA (IgA1 및 IgA2 하위부류 포함), IgM 및 IgE를 비롯한 임의의 아이소타입일 수 있다. 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항원 인식을 일반적으로 책임지고, 중쇄 (VH)에서 대략 아미노 말단 120 내지 130개 아미노산 및 경쇄 (VL)에서 약 100 내지 110개 아미노 말단 아미노산을 전형적으로 포함하는 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 일부를 지칭한다. "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 항원 결합 특이성 및 친화성에 기여하는 아미노산 서열이다. "프레임워크" 영역 (FR)은 CDR의 적절한 입체형태를 유지하여 항원 결합 영역 및 항원 사이에 결합을 증진하는데 보조할 수 있다. 구조적으로, 프레임워크 영역은 항체에서 CDR 사이에 위치될 수 있다. 가변 영역은 전형적으로, 3개의 초가변 영역, CDR에 의해 결합된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 전시한다. 각 쌍의 2개 사슬로부터 CDR은 전형적으로, 프레임워크 영역에 의해 정렬되는데, 이들은 특정한 에피토프에 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄와 중쇄 가변 영역 둘 모두 전형적으로, 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 그리고 FR4를 포함한다. 각 도메인에 아미노산의 배정은 달리 언급되지 않으면, 전형적으로 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991))의 정의에 따른다. 일정한 구체예에서, 면역글로불린 구조체는 치료적 폴리펩티드에 연결된 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE로부터 최소한 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 면역글로불린 구조체 내에 포함된 면역글로불린 도메인은 면역글로불린 기초된 구조체, 예를 들면, 디아바디, 또는 나노바디로부터 유래된다. 일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 면역글로불린 구조체는 중쇄 항체, 예를 들면, 낙타 항체로부터 최소한 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다. 일정한 구체예에서, 본원에서 제공된 면역글로불린 구조체는 포유류 항체, 예를 들면, 소 항체, 인간 항체, 낙타 항체, 생쥐 항체 또는 임의의 키메라 항체로부터 최소한 하나의 면역글로불린 도메인을 포함한다.
"이중특이적," "이중특정한" 또는 "이중기능성" 항원 결합 단백질 또는 항체는 2개의 상이한 항원 결합 부위를 갖는 하이브리드 항원 결합 단백질이다. 이중특이적 항원 결합 단백질과 항체는 다중특이적 항원 결합 단백질 항체의 한 종류이다. 이중특이적 항원 결합 단백질 또는 항체의 2개 결합 부위는 동일한 또는 상이한 분자 표적 상에 체류할 수 있는 2개의 상이한 에피토프에 결합할 것이다. "다중특이적 항원 결합 단백질" 또는 "다중특이적 항체"는 하나 이상의 항원 또는 에피토프를 표적으로 하는 것이다. "이가 항원 결합 단백질" 또는 "이가 항체"는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 경우에, 이들 2개의 결합 부위는 동일한 항원 특이성을 갖는다. 이가 항원 결합 단백질 및 이가 항체는 이중특이적일 수 있다 (하기 참조). "다중특이적" 또는 "다중기능성" 항체 이외에 이가 항체는 일정한 구체예에서, 전형적으로 각 결합 부위가 동일한 것으로 이해된다.
용어 "우선적 짝짓기"는 첫 번째 폴리펩티드와 두 번째 폴리펩티드, 가령, 본원에서 설명된 항원-결합 구조체 및 이형이합체 쌍에서 면역글로불린 중쇄와 면역글로불린 경쇄의 짝짓기 패턴을 설명하기 위해 본원에서 이용된다. 따라서, "우선적 짝짓기"는 하나 또는 그 이상의 추가적인, 상이한 폴리펩티드가 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 사이에 짝짓기가 발생할 때와 동일한 시점에서 존재할 때, 첫 번째 폴리펩티드와 두 번째 폴리펩티드의 바람직한 짝짓기를 지칭한다. 전형적으로 우선적 짝짓기는 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드 중에서 하나 또는 둘 모두의 변형 (가령, 아미노산 변형)의 결과로서 발생한다. 전형적으로 우선적 짝짓기는 짝짓기된 첫 번째와 두 번째 폴리펩티드가 짝짓기가 발생한 후 존재하는 가장 풍부한 이합체가 되도록 유발한다. 면역글로불린 중쇄 (H1)는 2개의 상이한 면역글로불린 경쇄 (L1 및 L2)와 공동발현되면, 양쪽 경쇄와 통계학적으로 동등하게 짝짓기를 하고, L1과 짝짓기된 H1 및 L2와 짝짓기된 H1의 대략 50:50 혼합물을 유발하는 것으로 당분야에서 알려져 있다. 이러한 문맥에서, "우선적 짝짓기"는 예로서, H1-L1 중쇄-경쇄 이형이합체의 양이 H1이 L1 및 L2 둘 모두와 공동발현될 때 H1-L2 이형이합체의 양보다 크면, H1과 L1 사이에 발생할 것이다. 따라서, 이러한 사례에서, H1은 L2에 비하여 L1과 우선적으로 짝짓기한다.
항체 중쇄는 항체 경쇄와 짝짓기를 하고 "경계면"에서 서로 만나거나 또는 접촉한다. "경계면"은 두 번째 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기와 상호작용하는 첫 번째 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기를 포함한다. 한 문맥에서, 용어 경계면은 Fc의 이합화된 CH3 도메인의 경계면을 설명하는데 이용될 수 있고, 여기서 Fc는 바람직하게는, IgG 항체, 예를 들면, IgG1 및 가장 바람직하게는 인간 IgG1 항체로부터 유래된다.
항체 경쇄와 연관되는 항체 중쇄는 전형적으로 "경계면"에서 서로 만나거나 또는 접촉한다. 면역글로불린 경쇄는 "경계면"을 거쳐 면역글로불린 중쇄와 작동가능하게 연관한다. "경계면"은 면역글로불린 경쇄의 경계면에서 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기와 상호작용하는 면역글로불린 중쇄에서 하나 또는 그 이상의 "접촉" 아미노산 잔기를 포함한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 경계면은 면역글로불린 중쇄의 VH과 CH1 도메인 및 면역글로불린 경쇄의 VL과 CL 도메인을 포함할 수 있다. "경계면"은 IgG 항체 및 가장 바람직하게는 인간 IgG1 항체로부터 유래될 수 있다.
용어 "아미노산 변형"은 본원에서 이용된 바와 같이, 아미노산 돌연변이, 삽입, 결실, 치환, 화학적 변형, 물리적 변형, 그리고 재배열을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
항원 결합 구조체 및 이형이합체 쌍
본원에서 설명된 항원-결합 구조체는 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있다; 각 이형이합체는 면역글로불린 중쇄를 면역글로불린 경쇄와 짝짓기함으로써 획득된다. 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 불변과 가변 도메인의 구조와 조직화는 당분야에서 널리 공지된다. 면역글로불린 중쇄는 전형적으로, 1개의 가변 (VH) 도메인, 그리고 3개의 불변 도메인, CH1, CH2와 CH3을 포함한다. 면역글로불린 경쇄는 전형적으로, 1개의 가변 (VL) 도메인 및 1개의 불변 (CL) 도메인을 포함한다. 이들 전형적인 형식에 다양한 변형이 만들어질 수 있다.
본원에서 설명된 항원-결합 구조체 및 이형이합체 쌍은 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있고, 각 이형이합체는 최소한 VH 및 CH1 도메인을 갖는 면역글로불린/항체 중쇄 또는 이의 단편, 그리고 VL 도메인 및 CL 도메인을 갖는 면역글로불린/항체 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍 및 항원-결합 구조체의 양쪽 이형이합체는 전장 면역글로불린 중쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍 또는 항원-결합 구조체의 양쪽 이형이합체는 최소한 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 양쪽 이형이합체는 최소한 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 아미노 말단 단편을 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 양쪽 이형이합체는 최소한 VH 및 CH1 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 카르복시 말단 단편을 포함한다.
이형이합체 쌍의 각 이형이합체는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 공지된 치료적 항체로부터 유래되거나 또는 가공된다. 치료적 항체는 질환 또는 장애를 앓거나 또는 질환 또는 장애의 성향이 있는 포유동물에서 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 것이다. 각 이형이합체가 유래될 수 있는 적합한 치료적 항체에는 아바고보맙, 아달리무맙, 알렘투주맙, 오로그랩, 바피네우주맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 베바시주맙, 브리아키누맙, 카나키누맙, 카투막소맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 갈릭시맙, 젬투주맙 오조가마이신, 골리무맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 인플릭시맙, 이필리무맙, 루밀릭시맙, 메폴리주맙, 모타비주맙, 무로모나브, 미코그랩, 나탈리주맙, 니모투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라니비주맙, 레슬리주맙, 리툭시맙, 테플리주맙, 토실리주맙/아틀리주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, ProxiniumTM, RencarexTM, 우스테키누맙, 그리고 잘루투무맙이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
한 구체예에서, 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 다음 목록의 단백질뿐만 아니라 다음 목록의 단백질에 속하는 아단위, 도메인, 모티프 및 에피토프가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 분자에 결합하는 항체로부터 유래되거나 또는 가공된다: 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들면, 인자 VII, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 (TF), 그리고 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예를 들면, 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성제, 예를 들면, 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔린; RANTES (활성화에서 조절된 정상적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들면, 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안-저해 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들면, 베타 락탐아제; DNA분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA), 예를 들면, CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 맥관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예를 들면, 예로서 EGFR, VEGFR; 인터페론, 예를 들면, 알파 인터페론 (알파-IFN), 베타 인터페론 (베타-IFN) 및 감마 인터페론 (감마-IFN); 단백질 A 또는 D; 류마티스양 인자; 신경영양 인자, 예를 들면, 뼈-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자; 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF); 섬유모세포 성장 인자, 예를 들면, AFGF 및 PFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들면, TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4, 또는 TGF-5를 비롯한 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des (1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들면, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD34, CD40, CD40L, CD52, CD63, CD64, CD80 및 CD147; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들면, 인터페론-알파, -베타, 그리고 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF, 그리고 G-CSF; 인터류킨 (ILs), 가령, IL-1 내지 IL-13; TNF-알파, 초과산화물 디스뮤타아제; T 세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들면, 예로서 AIDS 외피의 부분, 예를 들면, gp120; 운반 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 세포 부착 분자, 예를 들면, LFA-1, Mac 1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, ICAM-3 및 VCAM, a4/p7 인테그린, 그리고 아단위를 비롯한 Xv/p3 인테그린, 인테그린 알파 아단위, 예를 들면, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, 알파7, 알파8, 알파9, 알파D, CD11a, CD11b, CD51, CD11c, CD41, 알파IIb, 알파IELb; 인테그린 베타 아단위, 예를 들면, CD29, CD 18, CD61, CD104, 베타5, 베타6, 베타7 및 베타8; 알파V베타3, 알파V베타5 및 알파4베타7이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 인테그린 아단위 조합; 아폽토시스 경로의 구성원; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mp1 수용체; CTLA-4; 단백질 C; Eph 수용체, 예를 들면, EphA2, EphA4, EphB2 등; 인간 백혈구 항원 (HLA), 예를 들면, HLA-DR; 보체 단백질, 예를 들면, 보체 수용체 CR1, C1Rq 및 다른 보체 인자, 예를 들면, C3, 그리고 C5; 당단백질 수용체, 예를 들면, GpIb.알파., GPIIb/IIIa 및 CD200; 그리고 상기-열거된 폴리펩티드 중에서 한 가지의 단편.
한 구체예에서, 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 ALK 수용체 (플레이오트로핀 수용체), 플레이오트로핀, KS 1/4 범-암종 항원; 난소 암종 항원 (CA125); 전립선 산 인산염; 전립선 특이적 항원 (PSA); 흑색종-연관된 항원 p97; 흑색종 항원 gp75; 고분자량 흑색종 항원 (HMW-MAA); 전립선 특이적 막 항원; 암배아 항원 (CEA); 다형성 상피 점액소 항원; 인간 유지방구 항원; 결장 종양-연관된 항원, 예를 들면: CEA, TAG-72, CO17-1A, GICA 19-9, CTA-1 및 LEA; 버킷 림프종 항원-38.13; CD19; 인간 B-림프종 항원-CD20; CD33; 흑색종 특이적 항원, 예를 들면, 강글리오시드 GD2, 강글리오시드 GD3, 강글리오시드 GM2 및 강글리오시드 GM3; 종양 특이적 이식 유형 세포 표면 항원 (TSTA); T-항원, DNA 종양 바이러스 및 RNA 종양 바이러스의 외피 항원을 비롯하여, 바이러스로 유도된 종양 항원; 종양태아 항원-알파 태아단백질, 예를 들면, 결장의 CEA, 514 종양태아 영양모세포 당단백질 및 방광 종양 종양태아 항원; 분화 항원, 예를 들면, 인간 폐 암종 항원 L6 및 L20; 섬유육종의 항원; 인간 백혈병 T 세포 항원-Gp37; 네오당단백질; 스핑고지질; 유방암 항원, 예를 들면, EGFR (표피 성장 인자 수용체); NY-BR-16; NY-BR-16 및 HER2 항원 (p185HER2); 다형성 상피 점액소 (PEM); 악성 인간 림프구 항원-APO-1; 분화 항원, 예를 들면, 태아 적혈구에서 발견된 I 항원; 성체 적혈구에서 발견된 원발성 내배엽 I 항원; 착상전 배아; 위 선암종에서 발견된 I(Ma); 유방 상피에서 발견된 M18, M39; 골수 세포에서 발견된 SSEA-1; VEP8; VEP9; Myl; Va4-D5; 결장 암에서 발견된 D156-22; TRA-1-85 (혈액형 H); 고환과 난소 암에서 발견된 SCP-1; 결장 선암종에서 발견된 C14; 폐 선암종에서 발견된 F3; 위암에서 발견된 AH6; Y 합텐; 배아 암종 세포에서 발견된 Ley; TL5 (혈액형 A); A431 세포에서 발견된 EGF 수용체; 췌장암에서 발견된 E1 계열 (혈액형 B); 배아 암종 세포에서 발견된 FC10.2; 위 선암종 항원; 선암종에서 발견된 CO-514 (혈액형 Lea); 선암종에서 발견된 NS-10; CO-43 (혈액형 Leb); A431 세포의 EGF 수용체에서 발견된 G49; 결장 선암종에서 발견된 MH2 (혈액형 ALeb/Ley); 결장암에서 발견된 19.9; 위암 점액소; 골수 세포에서 발견된 T5A7; 흑색종에서 발견된 R24; 배아 암종 세포에서 발견된 4.2, GD3, D1.1, OFA-1, GM2, OFA-2, GD2, 그리고 M1:22:25:8, 그리고 4 내지 8-세포 시기 배아에서 발견된 SSEA-3 및 SSEA-4; 피부 T 세포 림프종 항원; MART-1 항원; Sialy Tn (STn) 항원; 결장암 항원 NY-CO-45; 폐 암 항원 NY-LU-12 valiant A; 선암종 항원 ART1; 부종양성 연관된 뇌-고환-암 항원 (종양신경 항원 MA2; 부종양성 뉴런 항원); 신경종양학적 복측 항원 2 (NOVA2); 간세포 암종 항원 유전자 520; 종양-연관된 항원 CO-029; 종양-연관된 항원 MAGE-C1 (암/고환 항원 CT7), MAGE-B1 (MAGE-XP 항원), MAGE-B2 (DAM6), MAGE-2, MAGE-4-a, MAGE-4-b 및 MAGE-X2; 암-고환 항원 (NY-EOS-1) 및 상기-열거된 폴리펩티드 중에서 한 가지의 단편이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 암 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 유래되거나 또는 가공된다.
인간 항체는 IgG, IgA, IgE, IgM, 그리고 IgD를 비롯한 아이소타입으로 그룹화될 수 있다. 한 구체예에서, Fc는 IgG 아이소타입으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, Fc는 IgA 아이소타입으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, Fc는 IgE 아이소타입으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, Fc는 IgM 아이소타입으로부터 유래된다. 다른 구체예에서, Fc는 IgD 아이소타입으로부터 유래된다.
인간 IgG 항체는 또한, 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3, 그리고 IgG4로 나눠질 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, Fc는 항체의 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위부류로부터 유래될 수 있는 것으로 예기된다.
이형이합체 쌍의 각 이형이합체는 에피토프 또는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 각 이형이합체는 동일한 에피토프에 결합한다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 첫 번째 이형이합체는 한 항원 상에서 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 이형이합체 쌍의 두 번째 이형이합체는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 첫 번째 이형이합체는 첫 번째 항원 상에서 에피토프에 특이적으로 결합하고, 그리고 이형이합체 쌍의 두 번째 이형이합체는 첫 번째 항원과 상이한 두 번째 항원 상에서 에피토프에 특이적으로 결합한다. 가령, 한 구체예에서, 첫 번째 이형이합체는 조직 인자에 특이적으로 결합하고, 반면 두 번째 이형이합체는 항원 Her2(ErbB2)에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 첫 번째 이형이합체는 앞서 설명된 분자 또는 암 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 구체예에서, 두 번째 이형이합체는 앞서 설명된 분자 또는 암 항원에 특이적으로 결합한다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 이형이합체는 항원 CD3에 특이적으로 결합하고, 반면 두 번째 이형이합체는 항원 CD19에 특이적으로 결합한다.
상기 지시된 바와 같이, 일부 구체예에서, 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 공지된 치료적 항체로부터, 또는 다양한 표적 분자 또는 암 항원에 결합하는 항체로부터 유래되거나 또는 가공될 수 있다. 무수한 이런 분자의 아미노산과 뉴클레오티드 서열이 쉽게 가용하다 (예로서, GenBank: AJ308087.1 (인간화 항-인간 조직 인자 항체 D3H44 경쇄 가변 영역 및 CL 도메인); GenBank: AJ308086.1 (인간화 항-인간 조직 인자 항체 D3H44 중쇄 가변 영역 및 CH1 도메인); GenBank: HC359025.1 (페르투주맙 Fab 경쇄 유전자 모듈); GenBank: HC359024.1 (페르투주맙 Fab 중쇄 유전자 모듈); GenBank: GM685465.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - 야생형; 경쇄); GenBank: GM685463.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - 야생형; 중쇄); GenBank: GM685466.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - GC-최적화된 경쇄); 그리고 GenBank: GM685464.1 (항체 트라스투주맙 (= 헤르셉틴) - GC-최적화된 중쇄를 참조한다). 본원에서 설명된 각 GenBank 번호의 서열은 2012년 11월 28일자까지의 NCBI 웹사이트로부터 가용하고 각각 모든 점에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
일부 양상에서, 단리된 항원-결합 구조체는 본원에서 개시된 표 또는 수탁 번호에서 진술된 아미노산 서열 또는 이의 단편과 최소한 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 단리된 항원-결합 구조체는 본원에서 개시된 표 또는 수탁 번호에서 진술된 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 최소한 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다.
면역글로불린 중쇄와 경쇄에 아미노산 변형
이형이합체 쌍의 이형이합체 중에서 최소한 하나는 첫 번째 이형이합체의 중쇄가 다른 것보다는 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기하도록, 그들의 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 유사하게, 두 번째 이형이합체의 중쇄는 첫 번째 경쇄보다는 두 번째 경쇄와 우선적으로 짝짓기할 수 있다. 한 중쇄와 두 경쇄 중에서 한 가지의 이러한 우선적 짝짓기는 한 면역글로불린 중쇄 및 두 면역글로불린 경쇄를 포함하는 설계 세트에 기초될 수 있는데, 여기서 면역글로불린 중쇄는 면역글로불린 중쇄가 면역글로불린 경쇄 둘 모두와 공동발현될 때, 다른 것에 비하여 두 면역글로불린 경쇄 중에서 하나와 우선적으로 짝짓기한다. 따라서, LCCA 설계 세트는 한 면역글로불린 중쇄, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 및 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형은 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트에서 증명된 우선적 짝짓기는 경쇄와 중쇄 사이에 경계면의 일부인 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변경함으로써 확립된다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트에서 증명된 우선적 짝짓기는 면역글로불린 중쇄의 CH1 도메인, 첫 번째 면역글로불린 경쇄의 CL 도메인 및 두 번째 면역글로불린 경쇄의 CL 도메인 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변경함으로써 확립된다.
한 구체예에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형은 잔기의 Kabat 넘버링에 의해 지시된 바와 같이 가변 (VH, VL) 및 불변 (CH1, CL) 도메인의 보존된 프레임워크 잔기에 제한된다. 가령, Almagro [Frontiers In Bioscience (2008) 13: 1619-1633]는 Kabat, Chotia, 그리고 IMGT 넘버링 설계의 기초에서 프레임워크 잔기의 정의를 제공한다.
한 구체예에서, 이형이합체 중에서 최소한 하나는 서로에 상보적인 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄에서 도입된 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함한다. 중쇄와 경쇄 경계면에서 상보성은 입체와 소수성 접촉, 정전/전하 상호작용 또는 다양한 상호작용의 조합의 기초에서 달성될 수 있다. 단백질 표면 사이에 상보성은 자물쇠와 열쇠 적합, 구멍 내로 손잡이, 돌출과 공동, 공여자와 수용기 등의 면에서 기존 문헌에서 폭넓게 설명되는데, 이들 모두 2개의 상호작용 표면 사이에 구조적 및 화학적 정합 (match)의 성격을 암시한다. 한 구체예에서, 이형이합체 중에서 최소한 하나는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 내에 도입된 돌연변이는 경계면에서 경쇄와 중쇄를 교차하여 새로운 수소 결합을 도입한다. 한 구체예에서, 이형이합체 중에서 최소한 하나는 하나 또는 그 이상의 돌연변이를 포함하고, 여기서 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄 내에 도입된 돌연변이는 경계면에서 경쇄와 중쇄를 교차하여 새로운 염 가교를 도입한다.
적합한 LCCA 설계 세트의 무제한적 실례는 표 1에서 도시되고, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄 CH1 도메인 (H1) 및 두 면역글로불린 경쇄 CL 도메인 (L1 및 L2)에서 아미노산 변형을 보여주는데, 여기서 H1은 H1, L1과 L2가 공동발현될 때 L1과 우선적으로 짝짓기한다. 이들 LCCA 설계 세트에서 도시된 아미노산 변형은 항조직 인자 항체 D3H44 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열 에 기초된다.
Figure 112021065197780-pat00001
적합한 LCCA 설계 세트의 추가 무제한적 실례는 표 2에서 도시되고, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄 CH1 도메인 (H2) 및 두 면역글로불린 경쇄 CL 도메인 (L1 및 L2)에서 아미노산 변형을 보여주고, 여기서 H2는 H2, L1과 L2가 공동발현될 때 L2와 우선적으로 짝짓기한다:
Figure 112021065197780-pat00002
적합한 LCCA 설계 세트의 추가 무제한적 실례는 실시예, 표, 그리고 도면에서 설명된다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 임의의 아미노산 변형을 갖지 않는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 다른 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 CH1 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, CL 도메인에서 최소한 4개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 CL 도메인에서 최소한 3개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트에서 증명된 우선적 짝짓기는 면역글로불린 중쇄의 VH 도메인, 첫 번째 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인 및 두 번째 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 아미노산을 변경함으로써 확립된다. 적합한 LCCA 설계 세트의 무제한적 실례는 표 3에서 도시되고, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄 VH 도메인 (H1) 및 두 면역글로불린 경쇄 VL 도메인 (L1 및 L2)에서 아미노산 변형을 보여주는데, 여기서 H1은 H1, L1과 L2가 공동발현될 때 L1과 우선적으로 짝짓기한다:
Figure 112021065197780-pat00003
적합한 LCCA 설계 세트의 추가 무제한적 실례는 표 4에서 묘사되고, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄 VH 도메인 (H2) 및 두 면역글로불린 경쇄 VL 도메인 (L1 및 L2)에서 아미노산 변형을 보여주는데, 여기서 H2는 H2, L1과 L2가 공동발현될 때 L2와 우선적으로 짝짓기한다:
Figure 112021065197780-pat00004
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 아미노산 변형 없음을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 한 구체예에서, LCCA 설계 세트는 VH 도메인에서 최소한 2개의 아미노산 변형을 갖는 면역글로불린 중쇄, VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 면역글로불린 경쇄, 그리고 VL 도메인에서 최소한 하나의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 면역글로불린 경쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 표 1 내지 4에서 도시된 LCCA 설계 세트는 2개의 상이한 면역글로불린 중쇄 (H1 및 H2) 및 2개의 상이한 면역글로불린 경쇄 (L1 및 L2)를 포함하는 조합을 제공하기 위해 합동되고, 여기서 H1, H2, L1과 L2가 공동발현될 때, H1은 L1과 우선적으로 짝짓기하고 H2는 L2와 우선적으로 짝짓기한다. 한 구체예에서, 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 경쇄의 CL 도메인에 변형을 포함하는, 표 1로부터 LCCA 설계 세트는 중쇄의 CH1 도메인 및/또는 경쇄의 CL 도메인에 변형을 또한 포함하는, 표 2로부터 LCCA 설계 세트와 합동된다.
LCCA 설계 세트의 조합으로부터 유래된 설계 세트의 무제한적 실례는 표 5에서 도시된다:
Figure 112021065197780-pat00005
한 구체예에서, 중쇄의 VH 도메인 및/또는 경쇄의 VL 도메인에 변형을 포함하는, 표 3으로부터 LCCA 설계 세트는 중쇄의 VH 도메인 및/또는 경쇄의 VL 도메인에 변형을 또한 포함하는, 표 4로부터 LCCA 설계 세트와 합동된다. LCCA 설계 세트의 이런 조합으로부터 유래된 설계 세트의 무제한적 실례는 표 6에서 도시된다:
Figure 112021065197780-pat00006
본원에서 확인된 특정한 아미노산 변형의 다른 항체로의 이전성:
비록 상기 확인된 면역글로불린 중쇄와 경쇄에 특정한 아미노산 변형이 D3H44 항조직 인자 세포외 도메인 항체 면역글로불린 중쇄와 경쇄에 대하여 설명되었지만, 이들 아미노산 변형은 다음에 비추어, 다른 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하고, 한 면역글로불린 중쇄의 두 면역글로불린 경쇄 중에서 한 가지와의 우선적 짝짓기의 유사한 패턴을 유발하는 것으로 본원에서 예기되고 증명되었다 (실시예, 도면, 그리고 표 참조).
면역글로불린 중쇄와 경쇄 사이에 경계면에서 VH:VL 및 CH1:CL 경계면 잔기는 상대적으로 잘 보존된다 (Padlan et al., 1986, Mol. Immunol. 23(9): 951-960). 진화적 제약의 결과인 이러한 서열 보존은 기능적으로 활성 항체 결합 도메인이 경쇄와 중쇄의 조합 짝짓기 동안 형성될 가능성을 증가시킨다. 이러한 서열 보존의 결과로서, 우선적 짝짓기를 주동하는, D3H44에 대해 상기 언급된 특정한 실례에서 서열 변형은 다른 중쇄와 경쇄 쌍 이형이합체로 전달될 수 있고, 우선적 짝짓기에 대하여 대략 동등한 결과가 획득되는데, 그 이유는 이러한 영역이 항체를 교차하여 높은 서열 보존을 전시하기 때문이다; 게다가, 서열 차이가 발생할 때, 이들은 통상적으로, CH1:CL 경계면의 원위에 위치한다. 이것은 CH1과 CL 도메인의 경우에 특히 그러하다. 하지만, 특히 CDR-H3에 대한 CDR (상보성-결정 영역) 루프 잔기 (및 길이)에 대하여 항원-결합 부위에서 일부 서열 변이성이 있다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 D3H44 항체의 것과 유의미하게 상이할 때, 최소한 하나의 이형이합체가 CDR 루프의 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이형이합체를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 항원-결합 부위의 아미노산 서열이 D3H44 항체의 것과 실제적으로 동일할 때, 최소한 하나의 이형이합체가 CDR 루프의 근위 또는 원위에 위치하는 VH 및/또는 VL 도메인에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이형이합체를 포함한다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형은 인간 또는 인간화 IgG1/κ에 기초된 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하다. 이런 IgG1/κ 사슬의 무제한적 실례는 오파투무맙 (인간의 경우) 또는 트라스투주맙, 페르투주맙 또는 베바시주맙 (인간화의 경우)을 포함한다.
다른 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형은 통상적으로 이용된 VH와 VL 하위군을 활용하는 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하다. 이런 항체의 무제한적 실례는 페르투주맙을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형은 생식계열에 근접한 프레임워크를 갖는 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하다. 이런 항체의 실례는 오비누투주맙을 포함한다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형은 중쇄와 경쇄 쌍에 대해 관찰된 평균에 근접한 VH:VL 도메인간 각도를 갖는 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하다. 이러한 유형의 항체의 실례에는 페르투주맙이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 다른 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형은 정준 CL과 CH1 도메인을 갖는 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하다. 이런 항체의 적합한 실례에는 트라스투주맙이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
일부 구체예에서, 본원에서 설명된 아미노산 변형의 일정한 부분집합은 상기 제공된 항원 결합 구조체 내에 변이체 도메인에서 활용된다.
이들 실시예, 도면, 그리고 표는 아미노산 변형 (가령, 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 하나 또는 그 이상의 Fab 단편 내에)이 다른 면역글로불린 중쇄와 경쇄로 이전가능하고, 한 면역글로불린 중쇄의 두 면역글로불린 경쇄 중에서 한 가지와의 우선적 짝짓기의 유사한 패턴을 유발한다는 것을 증명한다.
우선적 짝짓기
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 항원 결합 구조체/이형이합체 쌍의 최소한 하나의 이형이합체는 한 이형이합체의 중쇄, 예를 들면, H1이 다른 경쇄, L2보다는 경쇄 중에서 한 가지, 예를 들면, L1과 우선적으로 짝짓기하고, 그리고 다른 이형이합체의 중쇄, H2가 경쇄 L1보다는 경쇄 L2와 우선적으로 짝짓기하도록, 그들의 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 다시 말하면, 원하는, 우선적 짝짓기는 H1과 L1 사이에, 그리고 H2와 L2 사이에 있는 것으로 고려된다. 예로서, H1과 L1 사이에 우선적 짝짓기는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 없는 H2/L2 쌍에 상응하는 H1/L1 쌍의 개별 짝짓기에 비하여, H1이 L1 및 L2와 합동될 때 H1-L1 이형이합체의 수율이 틀린짝짓기된 H1-L2 이형이합체의 수율보다 크면 발생하는 것으로 고려된다. 유사하게, H2와 L2 사이에 우선적 짝짓기는 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형이 없는 H2-L2 쌍에 상응하는 H1-L1 쌍의 개별 짝짓기에 비하여, H2가 L1 및 L2와 합동될 때 H2-L2 이형이합체의 수율이 틀린짝짓기된 H2-L1 이형이합체의 수율보다 크면 발생하는 것으로 고려된다. 이러한 문맥에서, H1과 L1 (H1-L1), 또는 H2와 L2 (H2-L2)를 포함하는 이형이합체는 본원에서 우선적으로 짝짓기된, 정확하게 짝짓기된, 절대 쌍, 또는 원하는 이형이합체로서 지칭되고, 반면 H1와 L2 (H1-L2), 또는 H2와 L1 (H2-L1)을 포함하는 이형이합체는 본원에서 틀린짝짓기된 이형이합체로서 지칭된다. H1-L1과 H2-L2의 선별적인 짝짓기를 달성하는 것으로 의미되는 두 중쇄 및 두 경쇄에 상응하는 돌연변이의 세트는 설계 세트로서 지칭된다.
따라서, 한 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 55%보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 60%보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 70%보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 80%보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 90%보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체의 상대적 수율은 95%보다 크다.
상기 실례에서, H1-L1 사이에 우선적 짝짓기는 H1이 L1 및 L2와 공동발현될 때 원하는 H1-L1 이형이합체의 양이 틀린짝짓기된 H1-L2 이형이합체의 양보다 크면 발생하는 것으로 고려된다. 유사하게, H2-L2 사이에 우선적 짝짓기는 H2가 L1 및 L2와 공동발현될 때 원하는 H2-L2 이형이합체의 양이 틀린짝짓기된 H2-L2 이형이합체의 양보다 크면 발생하는 것으로 고려된다. 따라서, 한 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 1.25:1보다 크다. 한 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 1.5:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 2:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 3:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 5:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 10:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 25:1보다 크다. 다른 구체예에서, 이형이합체의 한 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄와 공동발현될 때, 원하는 이형이합체 대 틀린짝짓기된 이형이합체의 비율은 50:1보다 크다.
이형이합체의 열 안정성
한 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍의 각 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것에 필적하는 열 안정성을 갖는다. 한 구체예에서, 열 안정성은 융해 온도, 또는 Tm의 계량에 의해 결정된다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 10℃의 범위 안에 있다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 5℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 3℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 2℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 1.5℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 1℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 0.5℃의 범위 안에 있다. 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체의 열 안정성은 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하는 이형이합체의 것의 약 0.25℃의 범위 안에 있다.
항원에 대한 이형이합체의 친화성
한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 각 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것에 동일하거나 또는 필적하는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 50 배, 또는 한 자릿수의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 25 배, 또는 한 자릿수의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 한 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 10 배, 또는 한 자릿수의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 5 배의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 2.5 배의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 2 배의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것의 약 1.5 배의 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다. 다른 구체예에서, 이형이합체 쌍의 이형이합체는 동일한 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 포함하지만 본원에서 설명된 CH1, CL, VH, 또는 VL 도메인에 아미노산 변형이 없는 이형이합체의 것과 거의 동일한 범위 안에 있는, 개별 항원에 대한 친화성을 갖는다.
추가 임의선택적 변형
한 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍의 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 공유 부착이 중쇄와 경쇄 사이에 우선적 짝짓기를 간섭하거나 또는 항원에 결합하는 이형이합체의 능력에 영향을 주거나, 또는 이의 안정성에 영향을 주지 않도록, 더욱 변형될 수 있다 (즉, 다양한 유형의 분자의 공유 부착에 의해). 이런 변형은 예로서, 하지만 제한 없이, 당화, 아세틸화, 페길화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백분해 개열, 세포 리간드 또는 다른 단백질에 연쇄 등을 포함한다. 무수한 화학적 변형 중에서 한 가지는 특정한 화학적 개열, 아세틸화, 포르밀화, 튜니카마이신의 물질대사 합성 등이 포함되지만 이들에 한정되지 않는 공지된 기술에 의해 수행될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍의 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 소정의 생물학적 반응을 변경하는 치료제 또는 약물 모이어티에 접합될 수 있다 (직접적으로 또는 간접적으로). 치료제 또는 약물 모이어티는 고전적 화학적 치료제에 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 가령, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 소유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이런 단백질은 예로서, 독소, 예를 들면, 아브린, 리신 A, 온코나아제 (또는 다른 세포독성 RNA분해효소), 슈도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들면, 종양 괴사 인자, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래된 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 아폽토시스 작용제, 가령, TNF-알파, TNF-베타, AIM I (국제 공개 번호 WO 97/33899 참조), AIM II (국제 공개 번호 WO 97/34911 참조), Fas 리간드 (Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567), 그리고 VEGI (국제 공개 번호 WO 99/23105 참조), 혈전성 작용제 또는 항신생혈관제, 예를 들면, 앤지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 조절제, 예를 들면, 예로서 림포카인 (가령, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 집락 자극 인자 ("GM-CSF"), 그리고 과립구 집락 자극 인자 ("G-CSF")), 또는 성장 인자 (가령, 성장 호르몬 ("GH"))를 포함할 수 있다.
게다가, 대안적 구체예에서, 항체는 방사선금속 이온을 접합하는데 유용한 치료적 모이어티, 예를 들면, 방사성 물질 또는 대환식 킬레이터에 접합될 수 있다 (방사성 물질의 실례에 대해 상기 참조). 일정한 구체예에서, 대환식 킬레이터는 링커 분자를 거쳐 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N''-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이런 링커 분자는 당분야에서 통상적으로 공지되고 Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; 그리고 Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943에서 설명된다.
일부 구체예에서, 이형이합체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 정제 및/또는 시험 등을 용이하게 하는 태그를 포함하는 융합 단백질로서 발현된다. 본원에서 지칭된 바와 같이, "태그"는 단백질의 확인 또는 정제에 기여하는, 단백질 내에 C 말단에서, N 말단에서, 또는 내적으로 제공되는 임의의 부가된 일련의 아미노산이다. 적합한 태그에는 정제 및/또는 시험에서 유용한 것으로 당업자에게 공지된 태그, 예를 들면, 알부민 결합 도메인 (ABD), His 태그, FLAG 태그, 글루타티온-s-전달효소, 적혈구응집소 (HA) 및 말토오스 결합 단백질이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 이런 태그된 단백질은 또한, 정제 이전에, 동안 또는 이후에 태그의 용이한 제거를 위해, 개열 부위, 예를 들면, 트롬빈, 엔테로키나아제 또는 인자 X 개열 부위를 포함하도록 가공될 수 있다.
일부 구체예에서, 사슬간 이황화 결합을 형성하는 경쇄 (위치 214, Kabat 넘버링) 및 중쇄 (위치 233, Kabat 넘버링)에서 Fab 도메인의 아래쪽에 시스테인 잔기 중에서 하나 또는 그 이상이 세린 또는 알라닌 또는 비-시스테인 또는 상이한 아미노산으로 변형될 수 있다.
이형이합체 쌍의 우선적 짝짓기, 및/또는 열 안정성의 수준을 증가시키기 위해, 면역글로불린 중쇄에 추가 아미노산 변형이 만들어질 수 있는 것으로 예기된다. 가령, 동종이합체 쌍에 비하여 이형이합체 쌍 사이에 우선적 짝짓기를 주동하기 위해, 면역글로불린 중쇄 Fc 도메인에 추가 아미노산 변형이 만들어질 수 있다. 이런 아미노산 변형은 당분야에서 공지되고 예로서, US 특허 공개 번호 2012/0149876에서 설명된 것들을 포함한다. 대안으로, 동종이합체 쌍에 비하여 이형이합체 쌍 사이에 우선적 짝짓기를 주동하기 위한 대체 전략, 예를 들면, 예로서 "구멍 내로 손잡이", 이온성 상호작용을 갖는 하전된 잔기, 그리고 가닥-교환 가공된 도메인 (SEED) 기술 역시 이용될 수 있다. 후자 전략은 당분야에서 설명되고 상기 Klein et al에서 재고된다. Fc 도메인의 추가 논의가 아래에 후행한다.
Fc 도메인
본원에서 설명된 구조체는 Fc를 더욱 포함할 수 있다. 일부 양상에서, Fc는 최소한 1개 또는 2개의 CH3 도메인 서열을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 첫 번째 이형이합체 및/또는 두 번째 이형이합체에 연계된다. 일부 양상에서, Fc는 인간 Fc이다. 일부 양상에서, Fc는 인간 IgG 또는 IgG1 Fc이다. 일부 양상에서, Fc는 이형이합체성 Fc이다. 일부 양상에서, Fc는 최소한 1개 또는 2개의 CH2 도메인 서열을 포함한다.
일부 양상에서, Fc는 CH3 도메인 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 CH2 도메인 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 양상에서, Fc는 복수의 펩티드, 가령, 2개의 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, Fc는 CH3 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 CH2 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 양상에서, Fc는 복수의 펩티드, 예를 들면, 2개의 폴리펩티드이다.
일부 양상에서, Fc는 2011년 11월 4일자 제출된 특허 출원 PCT/CA2011/001238, 또는 2012년 11월 2일자 제출된 PCT/CA2012/050780에서 설명된 Fc이고, 이들 각각의 전체 개시는 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
일부 양상에서, 본원에서 설명된 구조체는 비대칭적으로 변형된 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이형이합체성 Fc를 포함한다. 이형이합체성 Fc는 2개의 중쇄 불변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다: 첫 번째 중쇄 폴리펩티드 및 두 번째 중쇄 폴리펩티드, 이들은 Fc가 하나의 첫 번째 중쇄 폴리펩티드 및 하나의 두 번째 중쇄 폴리펩티드를 포함한다면, 교체가능하게 이용될 수 있다. 일반적으로, 첫 번째 중쇄 폴리펩티드는 첫 번째 CH3 서열을 포함하고, 그리고 두 번째 중쇄 폴리펩티드는 두 번째 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 2개의 CH3 서열은 일반적으로, 2개의 CH3 서열이 이합체화할 때 동종이합체보다는 이형이합체성 Fc를 유발한다. 본원에서 이용된 바와 같이, "비대칭 아미노산 변형"은 첫 번째 CH3 서열 상에서 특정한 위치에서 아미노산이 두 번째 CH3 서열 상에서 동일한 위치에서 아미노산과 상이하고, 그리고 첫 번째와 두 번째 CH3 서열이 우선적으로 짝짓기하여 동종이합체보다는 이형이합체를 형성하는 임의의 변형을 지칭한다. 이러한 이형이합체화는 각 서열 상에서 동일한 개별 아미노산 위치에서 두 아미노산 중에서 단지 한 가지의 변형; 또는 첫 번째와 두 번째 CH3 서열 각각에서 동일한 개별 위치에서 각 서열 상에서 양쪽 아미노산의 변형의 결과일 수 있다. 이형이합체성 Fc의 첫 번째와 두 번째 CH3 서열은 하나 또는 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 X는 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 상응하는, 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 341-447을 포함한다.
전형적으로, Fc는 이합체화할 수 있는 2개의 인접한 중쇄 서열 (A 및 B)을 포함할 수 있다. 일부 양상에서, Fc의 한쪽 또는 양쪽 서열은 EU 넘버링을 이용하여, 다음 위치에서 하나 또는 그 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함한다: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400, 및/또는 N390. 일부 양상에서, Fc는 표 X에서 도시된 돌연변이체 서열을 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 변이체 1 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 변이체 2 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 변이체 3 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 변이체 4 A-B의 돌연변이를 포함한다. 일부 양상에서, Fc는 변이체 5 A-B의 돌연변이를 포함한다.
Figure 112021065197780-pat00007
첫 번째와 두 번째 CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 관하여, 본원에서 설명된 바와 같은 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 L351Y, F405A 및 Y407V에서 선별된 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 T366L, T366I, K392L, K392M 및 T394W에서 선별된 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T366, K392 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 그리고 첫 번째 또는 두 번째 CH3 서열 중에서 한 가지는 위치 Q347에서 아미노산 변형을 더욱 포함하고, 그리고 다른 CH3 서열은 위치 K360에서 아미노산 변형을 더욱 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T366, K392 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 첫 번째 또는 두 번째 CH3 서열 중에서 한 가지는 위치 Q347에서 아미노산 변형을 더욱 포함하고, 그리고 다른 CH3 서열은 위치 K360에서 아미노산 변형을 더욱 포함하고, 그리고 상기 CH3 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽은 아미노산 변형 T350V를 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T366, K392 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 그리고 상기 첫 번째와 두 번째 CH3 서열 중에서 한 가지는 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 더욱 포함하고, 그리고 다른 CH3 서열은 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중에서 하나 또는 그 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T366, K392 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 첫 번째와 두 번째 CH3 서열 중에서 한 가지는 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 더욱 포함하고, 그리고 다른 CH3 서열은 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중에서 하나 또는 그 이상을 포함하고, 그리고 상기 CH3 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽은 아미노산 변형 T350V를 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서 아미노산 변형을 갖는 첫 번째 CH3 서열, 그리고 위치 T366, K392 및 T394에서 아미노산 변형을 갖는 두 번째 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 상기 CH3 서열 중에서 한쪽 또는 양쪽은 T350V의 아미노산 변형을 더욱 포함한다.
한 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 다음 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 "A"는 첫 번째 CH3 서열에 아미노산 변형을 나타내고, 그리고 "B"는 두 번째 CH3 서열에 아미노산 변형을 나타낸다: A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392M_T394W, A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392M_T394W, A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V, 및/또는 B:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W.
하나 또는 그 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이형이합체성 CH3 도메인이 야생형 동종이합체성 CH3 도메인에 필적하는 안정성을 갖는 이형이합체성 Fc의 형성을 증진할 수 있다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이형이합체성 Fc 도메인이 야생형 동종이합체성 Fc 도메인에 필적하는 안정성을 갖는 이형이합체성 Fc 도메인의 형성을 증진한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이형이합체성 Fc 도메인이 시차 주사 열량측정법 연구에서 융해 온도 (Tm)에 의해 관찰된 안정성을 갖고, 그리고 상기 융해 온도가 상응하는 대칭 야생형 동종이합체성 Fc 도메인에 대해 관찰된 것의 4 ℃의 범위 안에 있는 이형이합체성 Fc 도메인의 형성을 증진한다. 일부 양상에서, Fc는 야생형 동종이합체성 Fc에 필적하는 안정성을 갖는 이형이합체성 Fc의 형성을 증진하는, CH3 서열 중에서 최소한 하나에서 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다.
한 구체예에서, CH3 도메인의 안정성은 예로서, 시차 주사 열량측정법 (DSC)에 의해 CH3 도메인의 융해 온도를 계량함으로써 사정될 수 있다. 따라서, 추가의 구체예에서, CH3 도메인은 약 68℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 다른 구체예에서, CH3 도메인은 약 70℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 다른 구체예에서, CH3 도메인은 약 72℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 다른 구체예에서, CH3 도메인은 약 73℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 다른 구체예에서, CH3 도메인은 약 75℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 다른 구체예에서, CH3 도메인은 약 78℃ 또는 더욱 높은 융해 온도를 갖는다. 일부 양상에서, 이합화된 CH3 서열은 약 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 또는 85 ℃ 또는 더욱 높은 융해 온도 (Tm)를 갖는다.
일부 구체예에서, 변형된 CH3 서열을 포함하는 이형이합체성 Fc는 발현된 산물에서 동종이합체성 Fc와 비교하여 최소한 약 75%의 순도에서 형성될 수 있다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 약 80%보다 큰 순도에서 형성된다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 약 85%보다 큰 순도에서 형성된다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 약 90%보다 큰 순도에서 형성된다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 약 95%보다 큰 순도에서 형성된다. 다른 구체예에서, 이형이합체성 Fc는 약 97%보다 큰 순도에서 형성된다. 일부 양상에서, Fc는 발현될 때 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%보다 큰 순도에서 형성된 이형이합체이다. 일부 양상에서, Fc는 단일 세포에 의해 발현될 때 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%보다 큰 순도에서 형성된 이형이합체이다.
이형이합체성 Fc 형성을 증진하기 위해 단위체 Fc 폴리펩티드를 변경하는 추가 방법은 국제 특허 공개 번호 WO 96/027011 (구멍 내로 손잡이), Gunasekaran et al. (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46, 선별적 이형이합체화를 달성하는 정전 설계), Davis et al. (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel ;23(4): 195-202, 가닥 교환 가공된 도메인 (SEED) 기술), 그리고 Labrijn et al [Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Labrijn AF, Meesters JI, de Goeij BE, van den Bremer ET, Neijssen J, van Kampen MD, Strumane K, Verploegen S, Kundu A, Gramer MJ, van Berkel PH, van de Winkel JG, Schuurman J, Parren PW. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50에서 설명된다.
일부 구체예에서 본원에서 설명된 단리된 구조체는 항원에 결합하는 항원 결합 구조체; 그리고 동일한 Fc 폴리펩티드를 포함하지 않는 항원 결합 구조체에 비하여 안정성 및 용이한 제조와 같은 우수한 생물물리학적 성질을 갖는 이합체성 Fc 폴리펩티드 구조체를 포함한다. 상이한 Fc감마 수용체에 대한 항체 Fc의 친화성을 선별적으로 변화시키기 위한 Fc의 중쇄 서열에서 다수의 돌연변이는 당분야에서 공지된다. 일부 양상에서, Fc는 Fc-감마 수용체의 선별적인 결합을 증진하기 위한 하나 또는 그 이상의 변형을 포함한다.
CH2 도메인은 표 X에서 도시된 서열의 아미노산 231-340이다. 예시적인 돌연변이는 아래에 열거된다:
S298A/E333A/K334A, S298A/E333A/K334A/K326A (Lu Y, Vernes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1-2):132-41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L, F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L (Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882-90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res. 2011 Nov 30;13(6):R123);
F243L (Stewart R, Thom G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671-8.), S298A/E333A/K334A (Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591-604);
S239D/I332E/A330L, S239D/I332E (Lazar GA, Dang W, Karki S, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Mar 14;103(11):4005-10);
S239D/S267E, S267E/L328F (Chu SY, Vostiar I, Karki S, et al. Mol Immunol. 2008 Sep;45(15):3926-33);
S239D/D265S/S298A/I332E, S239E/S298A/K326A/A327H, G237F/S298A/A330L/I332E, S239D/I332E/S298A, S239D/K326E/A330L/I332E/S298A, G236A/S239D/D270L/I332E, S239E/S267E/H268D, L234F/S267E/N325L, G237F/V266L/S267D 및 본원에서 참조로서 편입되는 WO2011/120134와 WO2011/120135에서 열거된 다른 돌연변이. Therapeutic Antibody Engineering (저자 William R. Strohl 및 Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012)는 283 페이지에서 돌연변이를 열거한다.
일부 구체예에서 CH2 도메인은 하나 또는 그 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구체예에서 CH2 도메인은 FcγR의 선별적인 결합을 증진하기 위한 하나 또는 그 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함한다. 일부 구체예에서 CH2 도메인은 본원에서 설명된 단리된 구조체의 분리와 정제를 허용한다.
FcRn 결합 및 PK 파라미터
당분야에서 공지된 바와 같이, FcRn에 결합은 엔도솜으로부터 세포내이입된 항체를 혈류로 역으로 재순환시킨다 (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). 전장 분자의 큰 크기에 기인한 신장 여과의 제외와 연계된 이러한 과정은 1 내지 3 주 범위에서 변하는 우호적인 항체 혈청 반감기를 유발한다. FcRn에 Fc의 결합 역시 항체 운반에서 핵심적인 역할을 한다. 따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 구조체는 FcRn에 결합할 수 있다.
작동체 기능을 향상시키는 추가 변형.
일부 구체예에서 본원에서 설명된 구조체는 작동체 기능을 향상시키기 위해 변형될 수 있다. 이런 변형은 당분야에서 공지되고 비푸코실화, 또는 ADCC의 경우에 활성화 수용체, 주로 FCGR3a를 향한, 그리고 CDC의 경우에 C1q를 향한 항체의 Fc 부분의 친화성의 가공을 포함한다. 다음 표 Y는 작동체 기능 가공을 위한 기존 문헌에서 보고된 다양한 설계를 요약한다.
Figure 112021065197780-pat00008
따라서, 한 구체예에서, 본원에서 설명된 구조체는 향상된 작동체 기능을 부여하는, 상기 표에서 지적된 바와 같은 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 이합체성 Fc를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 구조체는 작동체 기능을 향상시키기 위해 비푸코실화될 수 있다.
링커
본원에서 설명된 구조체는 본원에서 설명된 Fc에 작동가능하게 연계된 본원에서 설명된 하나 또는 그 이상의 이형이합체를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 링커로 또는 링커 없이, 하나 또는 그 이상의 이형이합체에 연계된다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 이형이합체에 직접적으로 연계될 수 있다. 일부 양상에서, Fc는 하나 또는 그 이상의 링커에 의해 하나 또는 그 이상의 이형이합체에 연계된다. 일부 양상에서, Fc는 링커에 의해 각 이형이합체의 중쇄에 연계된다.
일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드 링커이다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 항체 힌지 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 하나 또는 그 이상의 링커는 하나 또는 그 이상의 IgG1 힌지 영역을 포함한다.
이형이합체 쌍을 제조하는 방법
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있고, 각 이형이합체는 최소한 VH 및 CH1 도메인을 갖는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편, 그리고 VL 도메인 및 CL 도메인을 갖는 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 이형이합체의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 당분야에서 공지된 재조합 DNA 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있다. 표준 기술, 예를 들면, 예로서 Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 3rd ed., 2001); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2nd ed., 1989); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., John Wiley and Sons, New York, 4th ed., 1999); 그리고 Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press, Washington, D.C., 2nd ed., 1998)에서 설명된 것들이 재조합 핵산 방법, 핵산 합성, 세포 배양, 도입유전자 함입, 그리고 재조합 단백질 발현에 이용될 수 있다. 대안으로, 본 발명에 따른 이형이합체 및 이형이합체 쌍은 화학적으로 합성될 수 있다.
이형이합체가 유래되는 항체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 핵산과 아미노산 서열은 당분야에서 공지되거나 또는 핵산 및/또는 단백질 염기서열결정 방법을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 면역글로불린 중쇄 및/또는 경쇄에 본원에서 설명된 태그를 유전적으로 융합하는 방법은 당분야에서 공지되고, 그리고 일부가 아래 및 실시예에서 설명된다.
가령, 숙주 세포에서 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 발현하고 공동발현하는 방법은 당분야에서 널리 공지된다. 이에 더하여, 재조합 DNA 기술을 이용하여 중쇄 및/또는 경쇄를 태깅하는 방법 역시 당분야에서 널리 공지된다. 중쇄와 경쇄의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포 역시 하기에 설명된 바와 같이, 당분야에서 널리 공지된다.
4가지 모든 사슬을 발현하는 단일 클론 또는 일시적인 세포주만의 이용에 의존하지 않는 이중특이적 항체 생산 방법이 당분야에서 공지된다 (Gramer, et al. (2013) mAbs 5, 962; Strop et al. (2012) J Mol Biol 420, 204.). 이들 방법은 이중특이적 항체의 형성에 관련된 경쇄와 중쇄의 2개 쌍의 산화환원 조건 하에 생산 후 팔 교환에 의존한다 (산화환원 생산). 이러한 접근법에서 H1:L1 및 H2:L2 쌍이 2개의 Fab 팔을 독립적으로 생산하기 위해 2개의 상이한 세포주에서 발현될 수 있다. 차후에, 이들 2개의 Fab 팔은 L1:H1:H2:L2 사슬을 포함하는 이중특이적 항체를 형성하는 2개의 독특한 중쇄 H1과 H2의 재연관을 달성하기 위해 선별된 산화환원 조건 하에 혼합된다. 산화환원 생산 방법 또는 상기 방법의 변형된 이형을 이용한 이중특이적 항체의 생산에서 본원에서 설명된 설계의 라이브러리/데이터세트의 이용이 구상될 수 있다.
일정한 구체예에서, 무세포 단백질 발현 시스템이 생존 세포의 이용 없이, 폴리펩티드 (가령, 중쇄와 경쇄 폴리펩티드)를 공동발현하는데 활용된다. 대신에, DNA를 RNA로 전사하고 RNA를 단백질 (가령, 리보솜, tRNA, 효소, 보조인자, 아미노산)으로 번역하는데 필요한 모든 성분은 시험관내에서 이용을 위해 용해 상태로 제공된다. 일정한 구체예에서, 시험관내 발현은 (1) 중쇄와 경쇄 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자 원형 (mRNA 또는 DNA) 및 (2) 필요한 전사와 번역 분자 기구를 내포하는 반응 용액을 필요로 한다. 일정한 구체예에서, 세포 추출물은 반응 용액의 성분, 예를 들면: mRNA 전사를 위한 RNA 중합효소, 폴리펩티드 번역을 위한 리보솜, tRNA, 아미노산, 효소적 보조인자, 에너지 공급원, 그리고 적절한 단백질 접힘에 필수적인 세포 성분을 실제적으로 공급한다. 무세포 단백질 발현 시스템은 세균 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유류 세포, 인간 세포 또는 이들의 조합으로부터 유래된 용해물을 이용하여 제조될 수 있다. 이런 세포 용해물은 번역에 필요한 효소와 빌딩 블록의 정확한 조성과 비율을 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포막은 세포의 세포질과 소기관 성분만 남아있도록 제거된다.
여러 무세포 단백질 발현 시스템은 Carlson et al. (2012) Biotechnol. Adv. 30:1185-1194에서 재고된 바와 같이 당분야에서 공지된다. 가령, 무세포 단백질 발현 시스템은 원핵 또는 진핵 세포에 기초하여 가용하다. 원핵 무세포 발현 시스템의 실례는 대장균 (E. coli)으로부터 것들을 포함한다. 진핵 무세포 단백질 발현 시스템은 예로서, 토끼 망상적혈구, 맥아, 그리고 곤충 세포로부터 추출물에 기초하여 가용하다. 이런 원핵 및 진핵 무세포 단백질 발현 시스템은 기업, 예를 들면, Roche, Invitrogen, Qiagen, 그리고 Novagen으로부터 통상적으로 가용하다. 당업자는 서로 짝짓기할 수 있는 폴리펩티드 (가령, 중쇄와 경쇄 폴리펩티드)를 생산하는 적합한 무세포 단백질 발현 시스템을 쉽게 선별할 수 있을 것이다. 게다가, 무세포 단백질 발현 시스템은 또한, IgG 접힘의 효율을 향상시키기 위해 샤프론 (가령, BiP) 및 이성화효소 (가령, 이황화물 이성화효소)로 보충될 수 있다.
일부 구체예에서, 무세포 발현 시스템은 DNA 원형 (전사 및 번역) 또는 mRNA 원형 (번역 단독)으로부터 중쇄와 경쇄 폴리펩티드를 공동발현하는데 활용된다.
벡터 및 숙주 세포
중쇄와 경쇄의 재조합 발현은 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 (가령, 항체, 또는 융합 단백질)를 내포하는 발현 벡터의 작제를 필요로 한다. 일단 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 획득되면, 중쇄 또는 경쇄의 생산을 위한 벡터는 당분야에서 널리 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, 중쇄 또는 경쇄 인코딩 뉴클레오티드 서열을 내포하는 폴리뉴클레오티드를 발현함으로써 단백질을 제조하기 위한 방법이 본원에서 설명된다. 당업자에게 널리 공지된 방법이 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열 및 적절한 전사와 번역 제어 신호를 내포하는 발현 벡터를 작제하는데 이용될 수 있다. 이들 방법은 예로서, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 그리고 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 본 발명은 따라서, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 중쇄 또는 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다.
발현 벡터는 전통적인 기술에 의해 숙주 세포로 이전되고, 그리고 형질감염된 세포는 이후, 전통적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 방법에서 이용을 위한 변형된 중쇄 또는 경쇄를 생산한다. 특정한 구체예에서 상기 방법에서 이용을 위한 중쇄와 경쇄는 아래에 상술된 바와 같이, 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동발현된다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템이 변형된 중쇄와 경쇄를 발현하는데 활용될 수 있다. 이런 숙주-발현 시스템은 관심되는 코딩 서열이 생산되고 차후에 정제될 수 있는 운반제를 나타내지만, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염될 때, 변형된 중쇄와 경쇄를 원지 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들에는 미생물, 예를 들면, 변형된 중쇄와 경쇄 코딩 서열을 내포하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (가령, 대장균 (E. coli)과 바실러스 서브틸리스 (B. subtilis)); 변형된 중쇄와 경쇄 코딩 서열을 내포하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (가령, 사카로미세스 (Saccharomyces) 피치아 (Pichia)); 변형된 중쇄와 경쇄 코딩 서열을 내포하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (가령, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 변형된 중쇄와 경쇄 코딩 서열을 내포하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (가령, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)으로 감염된 또는 이들을 내포하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (가령, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 포유류 세포의 유전체 (가령, 메탈로티오닌 프로모터)로부터 또는 포유류 바이러스 (가령, 아데노바이러스 후기 프로모터; 우두 바이러스 7.5 K 프로모터)로부터 유래된 재조합 발현 구조체 내포 프로모터를 품는 포유류 세포 시스템 (가령, COS, CHO, BHK, HEK-293, NSO, 그리고 3T3 세포)가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 구체예에서, 세균 세포, 예를 들면, 대장균 (Escherichia coli), 또는 진핵 세포가 변형된 중쇄와 경쇄의 발현에 이용되고, 이것은 재조합 항체 또는 융합 단백질 분자이다. 가령, 벡터, 예를 들면, 인간 시토메갈로바이러스로부터 주요 중간 초기 유전자 프로모터 원소와 함께 포유류 세포, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 세포 (CHO)는 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking et al., 1986, Gene 45:101; 그리고 Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2). 특정 구체예에서, 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 구조성 프로모터, 유도성 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터에 의해 조절된다.
포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기초된 발현 시스템이 활용될 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 이용되는 경우에, 관심되는 변형된 중쇄와 경쇄 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들면, 후기 프로모터 및 삼부 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이후, 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 유전체 내에 삽입될 수 있다. 바이러스 유전체의 비필수적인 영역 (가령, 영역 E1 또는 E3) 내에 삽입은 감염된 숙주에서 생존가능하고 변형된 중쇄와 경쇄를 발현할 수 있는 재조합 바이러스를 야기할 것이다 (가령, Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :355-359 참조). 삽입된 항체 코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정한 개시 신호 역시 필요할 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 게다가, 개시 코돈은 전체 삽입물의 번역을 담보하기 위해 원하는 코딩 서열의 해독틀과 동조해야 한다. 이들 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원, 자연과 합성 둘 모두일 수 있다. 발현의 효율은 적절한 전사 인핸서 원소, 전사 종결인자 등의 포함에 의해 증강될 수 있다. (가령, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544 참조).
이형이합체의 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 발현은 당분야에서 공지된 임의의 프로모터 또는 인핸서 원소에 의해 제어될 수 있다. 변형된 중쇄와 경쇄 (가령, 항체 또는 융합 단백질)를 인코딩하는 유전자의 발현을 제어하는데 이용될 수 있는 프로모터에는 SV40 초기 프로모터 영역 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복에 내포된 프로모터 (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78.1441-1445), 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열 (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42), 테트라사이클린 (Tet) 프로모터 (Gossen et al., 1995, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551); 원핵 발현 벡터, 예를 들면, β-락타마아제 프로모터 (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), 또는 tac 프로모터 (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25; 또한 Scientific American, 1980, 242:74-94에서 "Useful proteins from recombinant bacteria" 참조); 노팔린 합성효소 프로모터 영역을 포함하는 식물 발현 벡터 (Herrera-Estrella et al., Nature 303:209-213) 또는 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 (Gardner et al., 1981 , Nucl. Acids Res. 9:2871), 그리고 광합성 효소 리불로스 비인산염 카르복실라아제의 프로모터 (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310:115-120); 효모 또는 다른 곰팡이류로부터 프로모터 원소, 예를 들면, Gal 4 프로모터, ADC (알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK (포스포글리세롤 키나아제) 프로모터, 알칼리 인산분해효소 프로모터, 그리고 조직 특이성을 전시하고 유전자도입 동물에서 활용된 다음 동물 전사 제어 영역: 췌장 샘꽈리 세포에서 활성인 엘라스타아제 I 유전자 제어 영역 (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 제어 영역 (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), 림프구양 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 제어 영역 (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), 고환, 유방, 림프구양과 비만 세포에서 활성인 생쥐 유방 종양 바이러스 제어 영역 (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), 간에서 활성인 알부민 유전자 제어 영역 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276), 간에서 활성인 알파 태아단백질 유전자 제어 영역 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58); 간에서 활성인 알파 1-항트립신 유전자 제어 영역 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1 :161-171), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 제어 영역 (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94; 뇌에서 희소돌기아교세포 세포에서 활성인 수초 염기성 단백질 유전자 제어 영역 (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 제어 영역 (Sani, 1985, Nature 314:283-286); 뉴런 세포에서 활성인 뉴런-특정한 에놀라아제 (NSE) (Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83); 뉴런 세포에서 활성인 뇌-유래된 신경영양 인자 (BDNF) 유전자 제어 영역 (Tabuchi et al., 1998, Biochem. Biophysic. Res. Com. 253:818-823); 별아교세포에서 활성인 신경교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 프로모터 (Gomes et al., 1999, Braz J Med Biol Res 32(5): 619-631 ; Morelli et al., 1999, Gen. Virol. 80:571-83) 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 제어 영역 (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378)이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.
이에 더하여, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 유전자 산물을 원하는 특정한 방식으로 변경하고 처리하는 숙주 세포 균주가 선택될 수 있다. 일정한 프로모터로부터 발현은 일정한 유도인자의 존재에서 상승될 수 있다; 따라서, 유전적으로 조작된 융합 단백질의 발현이 제어될 수 있다. 게다가, 상이한 숙주 세포는 번역 및 번역후 처리와 변형 (가령, 단백질의 당화, 인산화)을 위한 특징적이고 특정한 기전을 갖는다. 발현된 이종 단백질의 원하는 변형과 처리를 담보하는데 적절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택될 수 있다. 가령, 세균 시스템에서 발현은 당화되지 않은 산물을 생산할 것이고, 그리고 효모에서 발현은 당화된 산물을 생산할 것이다. 유전자 산물의 일차 전사체의 적절한 처리 (가령, 당화, 그리고 인산화)를 위한 세포 기구를 소유하는 진핵 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이런 포유류 숙주 세포에는 CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, HEK-293, 3T3, WI38, NSO, 그리고 특히, 뉴런 세포주, 예를 들면, 예로서 SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ 인간 신경모세포종 (Sugimoto et al., 1984, J. Natl. Cancer Inst. 73: 51-57), SK-N-SH 인간 신경모세포종 (Biochim. Biophys. Acta, 1982, 704: 450-460), Daoy 인간 소뇌 수모세포종 (He et al., 1992, Cancer Res. 52: 1144-1148) DBTRG-05MG 교모세포종 세포 (Kruse et al., 1992, In Vitro Cell. Dev. Biol. 28A: 609-614), IMR-32 인간 신경모세포종 (Cancer Res., 1970, 30: 2110-2118), 1321 N1 인간 성상세포종 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74: 4816), MOG-G-CCM 인간 성상세포종 (Br. J. Cancer, 1984, 49: 269), U87MG 인간 교모세포종-성상세포종 (Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1968, 74: 465-486), A172 인간 교모세포종 (Olopade et al., 1992, Cancer Res. 52: 2523-2529), C6 쥐 신경교종 세포 (Benda et al., 1968, Science 161 : 370-371), Neuro-2a 생쥐 신경모세포종 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1970, 65: 129-136), NB41A3 생쥐 신경모세포종 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1962, 48: 1184-1190), SCP 양 맥락막총 (Bolin et al., 1994, J. Virol. Methods 48: 211-221), G355-5, PG-4 Cat 정상적인 별아교세포 (Haapala et al., 1985, J. Virol. 53: 827-833), Mpf 흰담비 뇌 (Trowbridge et al., 1982, In Vitro 18: 952-960), 그리고 정상적인 세포주, 예를 들면, 예로서 CTX TNA2 쥐 정상적인 피질 뇌 (Radany et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6467-6471), 예를 들면, 예로서 CRL7030 및 Hs578Bst가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. 게다가, 상이한 벡터/숙주 발현 시스템은 반응을 상이한 정도까지 처리하는 것을 산출할 수 있다.
재조합 단백질의 장기간, 높은-수율 생산을 위해, 안정된 발현이 종종 바람직하다. 가령, 본 발명의 변형된 중쇄와 경쇄 (가령, 항체 또는 융합 단백질)을 안정되게 발현하는 세포주가 가공될 수 있다. 바이러스 복제 기점을 내포하는 발현 벡터를 이용하기 보다는, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소 (가령, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등)에 의해 제어된 DNA, 그리고 선별가능 마커로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 이후에, 가공된 세포는 영양강화 배지에서 1-2 일 동안 성장하도록 허용될 수 있고, 그리고 이후 선별가능 배지로 전환된다. 재조합 플라스미드에서 선별가능 마커는 선별에 내성을 부여하고, 그리고 세포가 플라스미드를 그들의 염색체 내로 안정되게 통합하고 성장하여 초점을 형성할 수 있도록 허용하고, 이것은 차례로, 세포주로 클로닝되고 확대될 수 있다.
단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제 (Wigler et al., 1977, Cell 11 :223), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실전달효소 (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026), 그리고 아데닌 포스포리보실전달효소 (Lowy et al., 1980, 세포 22:817) 유전자가 포함되지만 이들에 한정되지 않는 다수의 선별 시스템이 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포에서 각각 이용될 수 있다. 또한, 대사길항물질 내성이 메토트렉사트에 내성을 부여하는 dhfr (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare et al., 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); 미코페놀산에 내성을 부여하는 gpt (Mulligan & Berg, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); 아미노글리코시드 G-418에 내성을 부여하는 neo (Colberre-Garapin et al., 1981 , J. Mol. Biol. 150:1); 그리고 히그로마이신에 내성을 부여하는 hygro (Santerre et al., 1984, Gene 30:147) 유전자에 대한 선별의 기초로서 이용될 수 있다.
중쇄와 경쇄의 공동발현
본 발명에 따른 이형이합체 쌍의 면역글로불린 중쇄와 경쇄는 전술한 바와 같이, 포유류 세포에서 공동발현될 수 있다. 한 구체예에서, 전술한 바와 같은 LCCA 설계 세트에서 1개의 중쇄가 2개의 상이한 경쇄와 공동발현되고, 여기서 중쇄는 2개의 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기한다. 다른 구체예에서, 2개의 중쇄가 2개의 상이한 경쇄와 공동발현되고, 여기서 각 중쇄는 이들 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기한다.
이형이합체 쌍의 검사
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍의 최소한 하나의 이형이합체는 이형이합체 쌍의 2개 중쇄 및 2개 경쇄가 포유류 세포에서 공동발현될 때, 첫 번째 이형이합체의 중쇄가 다른 것보다는 이들 경쇄 중에서 한 가지와 우선적으로 짝짓기하도록, 그들의 면역글로불린 중쇄 및/또는 면역글로불린 경쇄에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 유사하게, 두 번째 이형이합체의 중쇄는 첫 번째 경쇄보다는 두 번째 경쇄와 우선적으로 짝짓기한다. 우선적 짝짓기의 정도는 예로서, 하기에 설명된 방법을 이용함으로써 사정될 수 있다. 개별 항원에 대한 이형이합체 쌍의 각 이형이합체의 친화성은 하기에 설명된 바와 같이 검사될 수 있다. 이형이합체 쌍의 각 이형이합체의 열 안정성 역시 하기에 설명된 바와 같이 검사될 수 있다.
우선적 짝짓기를 계량하는 방법
LCCA
한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄와 경쇄 사이에 우선적 짝짓기는 경쇄 경쟁 검정 (LCCA)을 수행함으로써 결정된다. 2013년 10월 3일자 제출된 공유 특허 출원 PCT/US2013/063306은 LCCA의 다양한 구체예를 설명하고 본원에서 모든 점에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 상기 방법은 공동발현된 단백질의 혼합물 내에 중쇄의 특정한 경쇄와의 짝짓기의 정량 분석을 허용하고, 그리고 중쇄와 경쇄가 공동발현될 때 한 특정 면역글로불린 중쇄가 두 면역글로불린 경쇄 중에서 한 가지와 선별적으로 연관하는 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 상기 방법은 아래와 같이 간략하게 설명된다: 최소한 하나의 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄는 중쇄가 제한 짝짓기 반응물질이 되도록 하는 비율로, 세포에서 공동발현된다; 분비된 단백질을 세포로부터 임의선택적으로 분리하고; 중쇄에 결합된 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드를 분비된 단백질의 나머지로부터 분리하여 단리된 중쇄 짝짓기된 분획물을 생산하고; 단리된 중쇄 분획물에서 각 상이한 경쇄의 양을 검출하고; 그리고 단리된 중쇄 분획물에서 각 상이한 경쇄의 상대적 양을 분석하여 이들 경쇄 중에서 한 가지와 선별적으로 짝짓기하는 최소한 하나의 중쇄의 능력을 결정한다.
상기 방법은 합리적인 처리량을 제공하고, 그리고 견실하고 (즉, 작업 동안 작은 변화, 예를 들면, 사용자 또는 유속에 둔감) 정확하다. 상기 방법은 단백질 서열에서 작은 변이의 효과를 계량할 수 있는 민감한 검정을 제공한다. 큰 표면적에서 불규칙한 단백질-단백질; 도메인-도메인; 사슬-사슬 상호작용은 선택성을 도입하기 위해, 통상적으로 복수의 돌연변이 (스왑)를 필요로 한다. 단백질 산물은 단리되고 정제될 필요가 없는데, 이것은 더욱 효율적인 스크리닝을 할 수 있게 한다. 이러한 방법의 구체예에 관한 추가 상세는 실시예에서 설명된다.
우선적 짝짓기를 결정하는 대안적 방법
우선적 짝짓기를 검출하기 위한 대안적 방법은 각 상이한 종류를 확인하기 위해 그들의 분자량에서 차이를 이용하여 각 경쇄를 포함하는 상대적 이형이합체 개체군을 정량하는 LC-MS (액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법)를 이용하는 것을 포함한다. 각 경쇄를 내포하는 상대적 이형이합체 개체군을 정량하기 위해 항원 활성 검정 또한 이용될 수 있었는데, 여기서 계량된 결합의 정도 (대조에 비하여)는 각 개별 이형이합체 개체군을 추정하는데 이용될 것이다.
추가 방법, 예를 들면, SMCA가 실시예, 도면, 그리고 표에서 설명된다.
열 안정성
이형이합체의 열 안정성은 당분야에서 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다. 각 이형이합체의 융해 온도는 열 안정성을 지시한다. 이형이합체의 융점은 시차 주사 열량측정법과 같은 기술을 이용하여 계량될 수 있다 (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). 대안으로, 이형이합체의 열 안정성은 환상 이색성을 이용하여 계량될 수 있다 (Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
항원에 대한 친화성
이형이합체의 그들의 개별 항원에 대한 결합 친화성 및 상호작용의 오프 레이트는 당분야에서 널리 공지된 방법에 따른 경쟁적 결합 검정에 의해 결정될 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 가지 실례는 증가하는 양의 표지되지 않은 항원의 존재에서 관심되는 분자 (가령, 본 발명의 이형이합체)와 함께 표지화된 항원 (가령, 3H 또는 125I)의 배양, 그리고 표지화된 리간드에 결합된 분자의 검출을 포함하는 방사면역검정이다. 항원에 대한 본 발명의 이형이합체의 친화성 및 결합 오프 레이트는 Scatchard 분석에 의해 포화 데이터로부터 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 이형이합체의 동적 파라미터는 또한, 당분야에서 공지된 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기초된 검정 (가령, BIAcore 동적 분석)을 이용하여 결정될 수 있다. SPR-기초된 기술의 재고를 위해, Mullet et al., 2000, Methods 22: 77-91; Dong et al., 2002, Review in Mol. Biotech., 82: 303-23; Fivash et al., 1998, Current Opinion in Biotechnology 9: 97-101; Rich et al., 2000, Current Opinion in Biotechnology 11: 54-61을 참조한다. 부가적으로, U.S. 특허 번호 6,373,577; 6,289,286; 5,322,798; 5,341,215; 6,268,125에서 설명된 단백질-단백질 상호작용을 계량하기 위한 임의의 SPR 기기 및 SPR 기초된 방법이 본 발명의 방법에서 예기된다. FACS 역시 당분야에서 공지된 바와 같이, 친화성을 계량하는데 이용될 수 있다.
제약학적 조성물
본 발명은 또한, 본원에서 설명된 이형이합체 또는 이형이합체 쌍을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다. 이런 조성물은 이형이합체 또는 이형이합체 쌍의 치료 효과량, 그리고 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 특정 구체예에서, 용어 "제약학적으로 허용되는"은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나 또는 U.S. 약전 또는 동물, 그리고 더욱 구체적으로 인간에서 이용을 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에서 열거된다는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제가 함께 투여되는 희석제, 어쥬번트, 부형제, 또는 운반제를 지칭한다. 이런 제약학적 담체는 무균 액체, 예를 들면, 물 및 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일, 예를 들면, 땅콩 오일, 콩 오일, 무기질 오일, 참기름 등을 비롯한 오일일 수 있다. 물은 제약학적 조성물이 정맥내 투여될 때 바람직한 담체이다. 식염수 및 수성 텍스트로스와 글리세롤 용액 역시 특히 주사가능 용액을 위한 액체 담체로서 이용될 수 있다. 적합한 제약학적 부형제는 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀가루, 석회분말, 실리카 겔, 나트륨 스테아르산염, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은 원하는 경우에, 소량의 적심제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 내포할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 유제, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지속된 방출 제제 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제와 담체, 예를 들면, 트리글리세리드를 이용하여 좌약으로서 조제될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예를 들면, 제약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아르산염, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 제약학적 담체의 실례는 E. W. Martin에 의한 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에서 설명된다. 이런 조성물은 환자에 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적합한 양의 담체와 함께, 치료 효과량의 화합물을 바람직하게는 정제된 형태에서 내포할 것이다. 제제는 투여 방식에 적합해야 한다.
일정한 구체예에서, 이형이합체 또는 이형이합체 쌍을 포함하는 조성물은 일과적인 절차에 따라, 인간에 정맥내 투여를 위해 적합된 제약학적 조성물로서 조제된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균 등장성 수성 완충액에서 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한, 용해화제 및 주사의 부위에서 통증을 경감하기 위한 국부 마취제, 예를 들면, 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들 성분은 활성제의 양을 지시하는 밀봉 차단된 용기, 예를 들면, 앰플 또는 봉지에서 개별적으로 공급되거나 또는 단위 약형에서, 예를 들면, 건성 냉동건조된 분말 또는 물 없는 농축물로서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이것은 무균 제약학적 등급 물 또는 식염수를 내포하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 이들 성분이 투여에 앞서 혼합될 수 있도록 주사용 무균수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다 .
일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 조성물은 중성 또는 염 형태로서 조제된다. 제약학적으로 허용되는 염은 음이온으로 형성된 것들, 예를 들면, 염화수소산, 인산, 아세트산, 옥살산, 주석산 등으로부터 유래된 것들, 그리고 양이온으로 형성된 것들, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들을 포함한다.
치료적 단백질의 일탈적인 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료, 저해 및 예방에서 효과적인 본원에서 설명된 조성물의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 최적 용량 범위를 확인하는데 도움이 되는 시험관내 검정이 임의선택적으로 이용될 수 있다. 제제에서 이용되는 정확한 분량은 또한, 투여 루트, 그리고 질환 또는 장애의 심각도에 의존할 것이고, 그리고 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 유래된 용량 반응 곡선으로부터 외삽된다.
이형이합체 쌍의 용도
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함할 수 있고, 여기서 각 이형이합체의 면역글로불린 중쇄 및 면역글로불린 경쇄는 공지된 치료적 항체로부터 또는 분자에 결합하는 공지된 항체로부터 유래되거나 또는 가공된다. 따라서, 이들 항체로부터 유래된 또는 가공된 이형이합체는 공지된 치료적 항체 또는 공지된 항체가 이용될 수 있는 동일한 질환, 장애, 또는 감염의 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 것으로 예기된다.
따라서, 한 구체예에서, 암 및 관련된 장애의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있는 치료적 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 갖는 이형이합체를 포함하는 본 발명에 따른 이형이합체 쌍 역시 암 및 관련된 장애의 치료 및/또는 예방에 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 개체에서 염증성 장애의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 또는 관리하는데 이용될 수 있는 치료적 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 갖는 이형이합체를 포함하는 본 발명에 따른 이형이합체 쌍 역시 개체에서 염증성 장애의 증상을 예방하거나, 치료하거나, 또는 관리하는데 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위해 이용될 수 있는 치료적 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 갖는 이형이합체를 포함하는 본 발명에 따른 이형이합체 쌍 역시 개체에서 자가면역 질환 또는 염증성 질환의 치료 또는 예방을 위해 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 개체에서 감염성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있는 치료적 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 갖는 이형이합체를 포함하는 본 발명에 따른 이형이합체 쌍 역시 개체에서 감염성 질환의 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 개체에서 혈관병의 치료에 이용될 수 있는 치료적 항체로부터 유래된 중쇄와 경쇄를 갖는 이형이합체를 포함하는 본 발명에 따른 이형이합체 쌍 역시 개체에서 혈관병의 치료에 이용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 또한, 암, 자가면역 질환, 염증성 장애 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방을 위한 당분야에서 공지된 다른 치료제와 조합으로 유리하게 활용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 예로서, 작동체 세포의 숫자 또는 활성을 증가시키는 역할을 하는 단일클론 또는 키메라 항체, 림포카인, 또는 조혈 성장 인자 (가령, 가령, IL-2, IL-3 및 IL-7)와 조합으로 이용될 수 있고, 이들 작동체 세포는 이들 분자와 상호작용하고 면역 반응을 증가시킨다. 본 발명에 따른 이형이합체 쌍은 또한, 질환, 장애, 또는 감염을 치료하는데 이용되는 하나 또는 그 이상의 약물, 예를 들면, 예로서 항암제, 항염증제 또는 항바이러스제와 조합으로 유리하게 활용될 수 있다.
키트
본 발명은 하나 또는 그 이상의 이형이합체 쌍을 포함하는 키트를 부가적으로 제공한다. 키트의 개별 성분은 별개의 용기에서 포장될 것이고, 그리고 이런 용기와 연관되어, 제약학적 또는 생물학적 산물의 제조, 이용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태에서 통지서일 수 있고, 이러한 통지서는 정부 기관에 의한 제조, 이용 또는 판매의 승인을 반영한다. 키트는 이형이합체 쌍에 대한 이용 방법 또는 투여 섭생을 개설하는 사용설명서 또는 지시사항을 임의선택적으로 내포할 수 있다.
키트의 하나 또는 그 이상의 성분이 용액, 예를 들면, 수용액, 또는 무균 수용액으로서 제공될 때, 용기 수단은 그 자체가 흡입제, 주사기, 피펫, 점안약, 또는 다른 이와 같은 유사한 장치일 수 있는데, 이로부터 용액이 개체에 투여되거나 또는 키트의 다른 성분에 적용되고 이들과 혼합될 수 있다.
키트의 성분은 또한, 건조된 또는 냉동건조된 형태로 제공될 수 있고, 그리고 키트는 냉동건조된 성분의 재구성을 위한 적합한 용매를 부가적으로 내포할 수 있다. 용기의 숫자 또는 유형과 상관없이, 본 발명의 키트는 또한, 환자에 조성물의 투여를 보조하기 위한 기기를 포함할 수 있다. 이런 기기는 흡입제, 코 스프레이 장치, 주사기, 피펫, 겸자, 계량된 스푼, 점안약 또는 유사한 의학적으로 승인된 전달 운반제일 수 있다.
컴퓨터 실행
한 구체예에서, 컴퓨터는 칩셋에 연계된 최소한 하나의 프로세서를 포함한다. 또한 메모리, 저장 장치, 자판, 그래픽 어댑터, 위치결정 장치, 그리고 네트워크 어댑터가 칩셋에 연계된다. 디스플레이가 그래픽 어댑터에 연계된다. 한 구체예에서, 칩셋의 기능성은 메모리 제어장치 허브와 I/O 제어장치 허브에 의해 제공된다. 다른 구체예에서, 메모리는 칩셋 대신에 프로세서에 직접적으로 연계된다.
저장 장치는 데이터를 유지할 수 있는 임의의 장치, 예를 들면, 하드 드라이브, 콤팩트 디스크 판독 전용 메모리 (CD-ROM), DVD, 또는 고체-상태 기억 장치이다. 메모리는 프로세서에 의해 이용되는 명령 및 데이터를 유지한다. 위치결정 장치는 마우스, 트랙 공, 또는 다른 유형의 위치결정 장치일 수 있고, 그리고 데이터를 컴퓨터 시스템 내로 입력하기 위해 자판과 조합으로 이용된다. 그래픽 어댑터는 이미지 및 다른 정보를 디스플레이 상에 전시한다. 네트워크 어댑터는 컴퓨터 시스템을 근거리 또는 광역 통신망에 연계한다.
당분야에서 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 앞서 설명된 것들 이외에 상이한 및/또는 다른 성분을 가질 수 있다. 이에 더하여, 컴퓨터는 일정한 성분을 결여할 수 있다. 게다가, 저장 장치는 컴퓨터로부터 근거리 및/또는 원격일 수 있다 (가령, 저장 광역 통신망 (SAN) 내에서 구현됨).
당분야에서 공지된 바와 같이, 컴퓨터는 본원에서 설명된 기능성을 제공하기 위한 컴퓨터 프로그램 모듈을 실행하도록 적합된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "모듈"은 특정된 기능성을 제공하는데 활용된 컴퓨터 프로그램 논리를 지칭한다. 따라서, 모듈은 하드웨어, 펌웨어, 및/또는 소프트웨어에서 실행될 수 있다. 한 구체예에서, 프로그램 모듈은 저장 장치 상에서 보관되고, 메모리 내로 로딩되고, 그리고 프로세서에 의해 실행된다.
본원에서 설명된 실례와 구체예는 단지 예시를 목적으로 하고, 그리고 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고 본 출원의 사상과 범위 및 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
실시예
아래는 본 발명을 수행하기 위한 특정한 구체예의 실례이다. 이들 실례는 단지 예시적인 목적으로만 제공되고, 그리고 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 이용된 숫자 (가령, 양, 온도 등)에 대하여 정확도를 담보하기 위한 노력이 이루어졌지만, 일부 실험 오차와 편차는 당연히, 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않으면, 당해 분야의 기술 범위 내에서, 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 전통적인 방법을 이용할 것이다. 이런 기술은 기존 문헌에서 충분히 설명된다. 가령, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 현재 추가); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A 및 B(1992)를 참조한다.
실시예 1: D3H44 IgG 중쇄 및 D3H44 IgG 경쇄를 인코딩하는 구조체의 제조.
본원에서 설명된 공동발현 세트에서 이용을 위한 항조직 인자 항체 D3H44의 야생형 중쇄와 경쇄는 하기와 같이 제조되었다. D3H44 Fab 경쇄 (AJ308087.1) 및 중쇄 (AJ308086.1) 서열은 GenBank (표 A, A1, 그리고 A2)로부터 획득되고, 유전자 합성되고, 그리고 포유류 발현을 위해 코돈 최적화되었다. 5'-EcoRI 절단부위 - HLA-A 신호 펩티드 - HA 또는 FLAG 태그 - 경쇄 Ig 클론 - 'TGA 종결' - BamH1 절단부위-3'으로 구성되는 경쇄 벡터 삽입물은 pTT5 벡터 내로 결찰되었다 (Durocher Y et al., Nucl. Acids Res. 2002; 30,No.2 e9). 결과의 벡터 + 삽입물은 코딩 DNA의 정확한 해독틀과 서열을 확증하기 위해 염기서열화되었다. 유사하게, 5'-EcoR1절단부위 - HLA-A 신호 펩티드 - 중쇄 클론 (T238에서 종결; 표 A1 참조) - ABD2-His6태그 - TGA 종결 - BamH1 절단부위-3'으로 구성되는 중쇄 벡터 삽입물은 pTT5 벡터 내로 결찰되었다 (ABD; 알부민 결합 도메인). 결과의 벡터 + 삽입물은 또한, 코딩 DNA의 정확한 해독틀과 서열을 확증하기 위해 염기서열화되었다. 유전자 합성에 의해 또는 부위-지향된 돌연변이유발에 의해 다양한 D3H44 구조체가 산출되었다 (Braman J, Papworth C & Greener A., Methods Mol. Biol. (1996) 57:31-44).
중쇄와 경쇄는 경쟁 검정-SPR 스크린을 통한 우선적 짝짓기의 사정을 용이하게 하기 위해, 각각 C-와 N-말단에서 태그되었다. ABD2-His6 중쇄 태그는 HC-LC 복합체가 항-his 태그 SPR 칩 표면 상에서 포획되도록 특이적으로 허용하는 반면, FLAG 및 HA 경쇄 태그는 상대적 LC1과 LC2 개체군이 정량되도록 허용하였다.
실시예 2: D3H44 IgG 경쇄 및/또는 중쇄에서 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정.
변형된 VL 및/또는 VH 도메인을 갖는 D3H44 중쇄와 경쇄를 포함하는 공동발현 세트에서 우선적으로 짝짓기하는 이형이합체의 능력이 결정되었고, 그리고 그 결과는 도면 1에서 도시된다. 도면 1에서 제공된 결과는 예비적이고, 그리고 결과의 더욱 완전한 세트가 하기에 제공된다. 도면 1 - 3에서 도시된 아미노산 변형은 D3H44 중쇄 및 D3H44 경쇄의 아미노산 서열에 관하여 확인된다. 표 A, A1, 그리고 A2를 참조한다.
1개의 D3H44 중쇄 구조체는 2개의 독특한 D3H44 경쇄 구조체와 공동발현되었고, 그리고 상대적 경쇄 짝짓기 특이성 (가령, H1-L1:H1-L2)은 경쟁 검정-SPR 스크린으로부터 결정되었다 (도면 1에서 "경쟁 검정 스크린 결과"라는 제목의 칼럼). 선별된 이형이합체 히트 (hit)는 경쇄 경쟁 검정 실증에 의해 실증되었는데, 여기서 L1:L2 DNA 비율이 형질감염 동안 40:60, 50:50 및 60:40에 의해 변화되었다 (도면 1에서 "경쟁 검정 실증 결과"라는 제목의 칼럼). 중쇄는 경쟁 검정 스크린 및 실증 둘 모두의 경우에 제한하는 양에서 유지되었다 (즉, HC < L1 + L2). 검정의 설계를 나타내는 계통도는 도면 8에서 도시된다.
이들 방법은 하기와 같이 수행되었다: 경쇄 경쟁 검정 (LCCA)은 최소한 2개의 독특한 경쇄에 대한 한 중쇄의 상대적 짝짓기를 정량한다. 상기 검정 및 전술한 단계는 하기와 같이 요약될 수 있다: 1. 중쇄와 경쇄의 부수적 발현, 여기서 중쇄가 제한하는 양에서 존재한다 (가령, HC:LC1:LC2 = 1:1:1), 2. HC-LC 복합체의 단리 - his-태그 풀다운에 의해 중쇄를 SPR 칩에 결합시킴으로써 달성됨, 그리고 3) 상대적 HC-LC 개체군 (즉, H1-L1:H1-L2)의 정량. SPR 형식에서, 독특한 경쇄-태그된 개체군에 특이적인 항체가 정량에 이용된다. 주의: 이러한 검정은 H-L 이황화물의 존재 또는 부재에서 수행될 수 있다. 상기 방법을 나타내는 계통도는 도면 9에서 도시된다.
형질감염 방법
실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조된 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄 구조체를 포함하는 공동발현 세트는 하기와 같이 CHO-3E7 세포 내로 형질감염되었다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도에서 CHO-3E7 세포는 37℃에서, 4 mM 글루타민 및 0.1% 플루로닉 F-68 (Invitrogen cat# 24040-032)로 보충된 FreeStyleTM F17 배지 (Invitrogen cat# A-1383501)에서 배양되었다. 2ml의 총 체적은 1:2.5의 DNA:PEI 비율에서 PEI-pro (Polyplus cat# 115-010)를 이용하여 총 2 ug DNA로 형질감염되었다. DNA-PEI 혼합물의 첨가 후 24 시간에, 이들 세포는 32℃으로 이전되었다. 상층액은 7 일자에 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 발현에 대해 검사되고, 그 이후에 띠를 시각화하기 위한 쿠마씨 블루 염색이 이어졌다. HC: LC 비율은 표 7에서 지시된 바와 같다.
Figure 112021065197780-pat00009
경쟁 검정 SPR 방법
공동발현 세트에서 D3H44 중쇄에 대한 우선적 D3H44 경쇄 짝짓기의 정도는 각 경쇄의 N 말단에서 위치된 독특한 에피토프 태그의 SPR-기초된 판독을 이용하여 사정되었다.
표면 플라스몬 공명 (SPR) 물품. GLM 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트 (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염 (EDC), N-히드록시술포숙신이미드 (sNHS) 및 에탄올아민), 그리고 10mM 아세트산나트륨 완충액은 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입되었다. 재조합 Her-2 단백질은 eBioscience (San Diego, CA)로부터 구입되었다. 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) 완충액, 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA), 그리고 NaCl은 Sigma-Aldrich (Oakville, ON)로부터 구입되었다. 10% Tween 20 용액은 Teknova (Hollister, CA)로부터 구입되었다.
SPR 바이오센서 검정. 모든 표면 플라스몬 공명 검정은 25 ℃의 온도에서, PBST 작업 완충액 (PBS Teknova Inc, 0.05% Tween20 포함)으로 BioRad ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))를 이용하여 수행되었다. 항-펜타 His 포획 표면은 피분석물 (수평) 방향으로 100 μL/분에서 140 초 동안 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:5 희석액에 의해 활성화된 GLM 센서칩을 이용하여 산출되었다. 활성화 직후에, 10 mM NaOAc pH 4.5에서 항-펜타 His 항체 (Qiagen Inc.)의 25 μg/mL 용액이 대략 3000 공명 단위 (RUs)가 고정될 때까지 25 μL/분의 유속에서 피분석물 (수직) 방향으로 주입되었다. 나머지 활성 군은 피분석물 방향으로 100 μL/분에서 1M 에탄올아민의 140 초 주입에 의해 수냉되고, 그리고 이것은 또한, 모의-활성화된 인터스팟이 블랭크 참조를 위해 창출되도록 담보한다.
항-FLAG (Sigma Inc.) 및 항-HA (Roche Inc.) 단일클론 항체에 결합에 대한 이형이합체의 스크리닝은 2 단계에서 일어났다: 리간드 방향으로 항-펜타 His 표면 위에 이형이합체의 간접적인 포획, 그 이후에 피분석물 방향으로 항-FLAG와 항-HA 주입. 먼저, 리간드 방향으로 100 uL/분에서 30 초 동안 1회 완충액 주입이 기준선을 안정시키는데 이용되었다. 각 이형이합체 포획을 위해, 세포-배양 배지에서 정제되지 않은 이형이합체는 PBST에서 4 %로 희석되었다. 1 내지 5개 이형이합체 또는 대조 (즉, 100% HA-경쇄 또는 100% FLAG-경쇄를 내포하는 대조)가 유속 25 μL/분에서 240 초 동안 개별 리간드 통로에 동시에 주입되었다. 이것은 항-펜타 His 표면 위에 대략 300 내지 400 RU의 포화 이형이합체 포획을 유발하였다. 첫 번째 리간드 통로는 빈 채로 남겨졌고 필요하면, 블랭크 대조로서 이용되었다. 이러한 이형이합체 포획 단계는 기준선을 안정시키기 위해 피분석물 방향으로 2회 완충액 주입이 직후에 이어지고, 그리고 이후 5 nM 항-FLAG 및 5 nM 항-HA가 각각, 180 초 해리 시기에서 120 초 동안 50 μL/분에서 2중으로 주입되어, 각 포획된 이형이합체에 대한 완충액 참고로 한 세트의 결합 센서그램을 유발하였다. 가능한 경우에, 이형이합체가 결합하는 항원 역시 활성 대조로서 마지막 남아있는 피분석물 통로 위에 주입될 수 있다. 이형이합체는 다음 주입 주기를 위한 항-펜타 His 표면을 준비하기 위해 100 μL/분에서 18 초 동안 0.85% 인산의 18 초 펄스에 의해 재건되었다. 센서그램은 완충액 블랭크 주입 및 인터스팟을 이용하여 정렬되고 이중-참조되며, 그리고 결과의 센서그램은 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.0을 이용하여 분석되었다.
L1과 L2의 전체 백분율은 이론적으로, 100%로 귀결되어야 한다. 실제로, 일부 변이체의 경우에 L1과 L2의 전체 양은 100%보다 훨씬 적게 귀결되는 것으로 관찰되었다. 전체 경쇄 백분율에서 이러한 불일치는 부분적으로, SPR 칩에서 초기 이형이합체 포획 동안 가변 비특이적 결합의 발생에 기인하는 것으로 생각된다.
실시예 3: D3H44 IgG 경쇄 및/또는 중쇄에서 불변 (C L 또는 C H1 ) 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정.
변형된 CL 및/또는 CH1 도메인을 갖는 D3H44 중쇄와 경쇄를 포함하는 공동발현 세트에서 우선적으로 짝짓기하는 이형이합체의 능력은 실시예 2에서 가변 도메인 변형을 갖는 이형이합체에 대해 설명된 바와 같이 결정되고, 그리고 그 결과는 도면 2에서 도시된다. 1개의 D3H44 중쇄 구조체는 2개의 독특한 D3H44 경쇄 구조체와 공동발현되었고, 그리고 상대적 경쇄 짝짓기 특이성 (가령, H1-L1:H1-L2)은 경쟁 검정-SPR 스크린으로부터 결정되었다 (도면 2에서 "경쟁 검정 스크린 결과"라는 제목의 칼럼). 선별된 이형이합체 히트 (hit)는 변형된 경쟁 검정 실증에 의해 확증되었는데, 여기서 L1:L2의 DNA 비율이 형질감염 동안 40:60, 50:50 및 60:40에 의해 변화되었다 (도면 2에서 "경쟁 검정 실증 결과"라는 제목의 칼럼). 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 중쇄는 경쟁 검정 스크린 및 실증 둘 모두의 경우에 제한하는 양에서 유지되었다 (즉, HC < L1 + L2). 우선적 짝짓기의 사정은 실시예 2에서 설명된 바와 같이 수행되었다.
실시예 4: 생물물리학적 특성화를 위한 정률증가
짝짓기된 및 틀린짝짓기된 둘 모두의 선별된 이형이합체는 정률증가되고 (전형적으로 50ml까지), 그리고 열 안정성 및 항원 결합에 대해 검사하기 위해 하기와 같이 정제되었다. 도면 3에 나타나 있는 바와 같이 이형이합체 HD100-HD115가 발현되고 정제되었다. 각 이형이합체의 중쇄와 경쇄는 앞서 설명된 배양 조건 하에 CHO-3E7 세포의 50 ml 배양액에서 발현되었다. 세포는 원심분리되고, 그리고 이형이합체는 하기에 설명된 바와 같이 니켈로 충전된 Fractogel 칼럼에 상층액을 적하함으로써 정제되었다.
니켈 (His)로 충전된 Fractogel 칼럼에서 정제
칼럼을 니켈로 충전: 5 칼럼 부피 (CV)의 0.5 M NaCl (pH 조정 없음), 그 이후에 4 CV 200 mM의 NiCl2 (니켈) 및 2 CV의 0.5 M NaCl pH 5.0으로 순차적으로 세척한다. 표본 적하와 용리: 칼럼을 10 CV PBS로 평형시킨다. 표본을 적하하고 10 CV의 세척 완충액 #1 (50 mM 인산나트륨 pH 7.0, 300 mM NaCl), 그 이후에 10 CV의 세척 완충액 #2 (50 mM 인산나트륨 pH 7.0, 300 mM NaCl, 25 mM 이미다졸)로 세척하여 칼럼에 결합된 불순물을 제거한다. 이형이합체는 세척 완충액 #1 + 300 mM 이미다졸로 분획물에서 용리되었다. 각 분획물의 단백질 함량은 Bradford 단백질 검정에 의해 검사되었다. 단백질을 내포하는 분획물은 모아졌다. 정제된 이형이합체는 이후, 실시예 5에서 설명된 바와 같이 항원 결합 및 열 안정성에 대해 검정되었다.
실시예 5: 이형이합체의 열 안정성과 항원 친화성 계량.
선별된 이형이합체 쌍의 열 안정성 및 항원 친화성은 이들 특질을 야생형, 변형되지 않은 중쇄-경쇄 쌍의 것과 비교하기 위해 계량되었다. 공동발현 세트로부터 정확하게 짝짓기된 및 틀린짝짓기된 이형이합체는 개별적으로 정률증가되고, 정제되고 (즉, His 태그 친화성 정제), 그리고 하기에 설명된 바와 같이 열 안정성 및 항원 결합에 대해 사정되었다. 결과는 도면 3에서 도시된다.
열 안정성의 계량
선별된 이형이합체 쌍의 열 안정성은 하기와 같이 시차 주사 열량측정법 (DSC)을 이용하여 계량되었다.
각 이형이합체는 실시예 3에서 설명된 바와 같이 정제되고 PBS에서 0.2 mg/mL로 희석되고, 그리고 총 400 μL가 VP-모세관 DSC (GE Healthcare)를 이용한 DSC 분석에 이용되었다. 각 DSC 작업의 시작에서, 5회 완충액 블랭크 주입이 기준선을 안정시키기 위해 수행되고, 그리고 참고를 위해 각 이형이합체 주입에 앞서 완충액 주입이 배치되었다. 각 표본은 낮은 피드백, 8 초 필터, 5 분 preTstat, 그리고 70 psi 질소 압력으로, 20에서부터 100℃까지 60℃/시간 비율에서 스캔되었다. 결과의 온도기록도는 참조되고 Origin 7 소프트웨어를 이용하여 분석되었다.
검사된 이형이합체에 대한 열 풀림 곡선은 도면 4에서 도시된다. 이들 결과는 정확하게 짝짓기된 이형이합체 (설계 관점으로부터)가 의도된 틀린짝짓기된 이형이합체보다 통상적으로 훨씬 안정된다는 것을 지시한다 (가령, HD108과 대비하여 HD107). 이에 더하여, 많은 정확하게 짝짓기된 이형이합체는 야생형 Fab (가령, HD114)에 근접한 열 안정성을 전시한다.
항원 친화성의 계량
항원 (조직 인자 세포외 도메인)에 대한 이형이합체 쌍의 친화성은 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정을 이용하여 계량되었다. 모든 표면 플라스몬 공명 검정은 25℃의 온도에서, PBST 작업 완충액 (PBS Teknova Inc, 0.05% Tween20 포함)으로, BioRad ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)를 이용하여 수행되었다. 정제된 조직 인자 (TF) 표면은 리간드 (수직) 방향으로 100 μL/분에서 140 초 동안 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:10 희석액에 의해 활성화된 GLM 센서칩을 이용하여 산출되었다. 활성화 직후에, 10 mM NaOAc pH 4.5에서 TF의 25 μg/mL 용액은 대략 1000 공명 단위 (RUs)가 고정될 (또는 60nM FAB를 흘릴 때 100 RU 최고 반응에 충분할) 때까지, 25 μL/분의 유속에서 리간드 방향으로 주입되었다. 나머지 활성 군은 피분석물 방향으로 100 μL/분에서 1M 에탄올아민의 140 초 주입에 의해 수냉되었다. 각 주입 연속을 위해, 수평 주입에서 2회 완충액 블랭크 주입이 정제된 이형이합체를 선행하였다. 블랭크 완충액 대조로 각 이형이합체의 3-배 희석 연속 (60 nM, 20 nM, 6.7 nM, 2.2 nM)이 20 분 해리에서 120 초 동안 50 μL/분으로 동시에 주입되어, 각 이형이합체에 대한 완충액 참고로 한 세트의 결합 센서그램을 유발하였다. SPR 표면 상에서 이형이합체:TF 복합체는 다음 주입 주기를 위한 TF 표면을 준비하기 위해 100 μL/분에서 18 초 동안 0.85% 인산의 18 초 펄스에 의해 재건되었다. 센서그램은 완충액 블랭크 주입 및 인터스팟을 이용하여 정렬되고 이중-참조되며, 그리고 결과의 센서그램은 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.0 내에 1:1 결합 모델을 이용하여 분석되었다.
이들 결과는 정확하게 짝짓기된 이형이합체 (설계 관점으로부터)가 항원에 대한 넓은 범위의 친화성을 전시하고, 일부 설계가 항원에 대한 야생형 유사 결합 친화성을 보여준다는 것을 지시한다 (가령, HD107 및 HD114).
실시예 6: 야생형 태그된 D3H44 이형이합체 및 개별 우선적으로 짝짓기된 이형이합체의 대표적인 표본의 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 프로필
중쇄에서 C 말단 ABD2-His6 태그 및 경쇄에서 N 말단 FLAG 태그를 갖는 야생형 D3H44 이형이합체 (1개의 중쇄 및 1개의 경쇄)는 당분야에서 공지되고, 그리고 실시예 1과 4에서 설명된 것들과 유사한 방법에 따라 발현되고 정제되었다. 공동발현 세트로부터 우선적으로 또는 정확하게 짝짓기된 이형이합체 (이형이합체 HD100, HD105, 그리고 HD107, 도면 3에서 도시됨)는 실시예 4 및 SEC에서 설명된 바와 같이 개별적으로 정률증가되고 His 태그 친화성 정제에 의해 정제되었다.
SEC는 하기와 같이 수행되었다. 이형이합체 표본은 Pharmacia (GE Healthcare)
Figure 112021065197780-pat00010
KTA 정화장치 시스템에서 표본고정된 Superdex 200 HR 10/30 Pharmacia (GE Healthcare) 칼럼을 이용하여 분리되었다. PBS에서 이형이합체 표본 (0.3-0.5 ml)은 PBS로 충전된 0.5ml 루프 내로 수동으로 적하되었다. 표본은 이후, 칼럼 위에 자동적으로 주입되고 1 CV 용리 부피에서 0.5 ml/분으로 분해되었다. 단백질 용리는 OD280에서 모니터링되고 1ml 분획물에서 수집되었다.
도면 5에 나타나 있는 바와 같이, 정확하게 짝짓기된 이형이합체는 아미노산 변형이 없는 야생형 이형이합체에 대해 관찰된 것에 근접한 SEC 프로필을 전시하였다 (주요 피크 [*]:이형이합체). 동등한 결과는 야생형 이형이합체의 경쇄가 N 말단 HA 태그를 가질 때 획득된다.
실시예 7: 이형이합체의 안정성에 관련된 추가 데이터
표 8에서 도시된 설계는 향상된 HC-LC 선별성을 갖는 설계 드라이버의 조합으로서 강조되었다.
Figure 112021065197780-pat00011
잔기 넘버링은 Kabat 명명법을 따른다 (Kabat E.A. et al., (1983) Sequence of Proteins of Immunological Interest National Institutes of Health, Bethesda).
대다수의 설계는 표 9에 나타나 있는 바와 같이, 야생형 유사 열 안정성 (Tm) 및 TF 결합 친화성을 유지하였다.
Figure 112021065197780-pat00012
설계 12는 야생형 H2-L2 짝짓기를 내포한다 (표 8 참조). 결과적으로, H2-L2 Fab는 야생형 결합 친화성을 유지한다. 야생형 항-TF D3H44 Fab Tm = ~76 ℃ (데이터 제시되지 않음).
실시예 8: 추가 이형이합체 및 이들의 시험
표 10에서 설명된 바와 같은 추가 이형이합체 쌍이 제조되고 검사되었다. 이들 이형이합체는 Fab 핫스팟 적용범위를 증가시키도록 설계되었다.
Figure 112021065197780-pat00013
*표 10에서 잔기 넘버링은 D3H44 Fab의 결정 구조에서 잔기에 대해 이용된 규약을 따른다 (PDB ID= 1JPT [Faelber K et al., J. Mol. Biol. (2001) 313:83-97]; www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1JPT).
이들 이형이합체에 대한 안정성, 표적에 결합하는 능력, 그리고 선별적으로 짝짓기하는 능력은 실시예 5에서 설명된 바와 같이 결정되었고 표 11에서 도시된다.
Figure 112021065197780-pat00014
야생형 항-TF D3H44 Fab KD = 0.052 nM; 야생형 항-TF Fab Tm = ~76 ℃
실시예 9: 추가 이형이합체
다음 이형이합체 쌍 역시 제조되고, 그리고 선별적으로 짝짓기하는 그들의 능력에 대해 검사되었다.
Figure 112021065197780-pat00015
표 12에서 잔기 넘버링은 D3H44 Fab의 결정 구조에서 잔기에 대해 이용된 규약을 따른다 (PDB ID= 1JPT [Faelber K et al., J. Mol. Biol. (2001) 313:83-97]; www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1JPT).
Figure 112021065197780-pat00016
표 13에서 잔기 넘버링은 D3H44 Fab의 결정 구조에서 잔기에 대해 이용된 규약을 따른다 (PDB ID= 1JPT [Faelber K et al., J. Mol. Biol. (2001) 313:83-97]; www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=1JPT)
실시예 10: D3H44 중쇄와 경쇄 Fab 형식에서 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정
도면 1과 2에서 도시된 것들에 더하여 공동발현 세트가 설계되었다. 공동발현 세트의 설계에 따른 아미노산 변형을 포함하는 Fab 형식에서 D3H44 IgG 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 구조체가 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 우선적으로 짝짓기하는 D3H44 중쇄와 경쇄 Fab 쌍의 능력은 실시예 2와 3에서 설명된 바와 같이 사정되었다. 이들 설계의 안정성 및 결합 친화성은 실시예 5에서 설명된 바와 같이 결정되었다. 표 14와 15에서 도시된 결과는 누적적이고, 그리고 새로운 설계에 더하여 도면 1과 2에서 도시된 설계에 대한 결과를 포함한다. 이들 표에서 도시된 아미노산 변형은 D3H44 중쇄 및 D3H44 경쇄의 아미노산 서열에 관하여 확인된다. 표 A, A1, 그리고 A2를 참조한다.
주목할 점은 본 출원에서 "설계" 또는 "설계 세트"는 H1, L1, H2와 L2 사슬 상에서 한 세트의 돌연변이를 지칭한다는 것이다. "LCCA 설계"는 H1, L1 및 L2에서 돌연변이의 세트를 지칭한다.
H1, L1과 L2 돌연변이의 각 독특한 세트 (LCCA 형식)는 독특한 숫자, 또는 이른바 '독특한 식별자'가 배정되었다. 데이터가 H1 L1 H2 L2 형식 (Fab 쌍 형식 또는 SMCA)에서 제공될 때, 이런 설계 세트는 결과적으로, 이들 두 성분 LCCA에 대한 독특한 식별자로 구성된'독특한 식별자 세트'로 표시된다 (가령, 1-2). D3H44 LCCA 데이터 세트에서 특징된 설계가 먼저 배정되었다. 이러한 세트에는 존재하지 않지만, 상이한 균질한 또는 혼합된 시스템 데이터에서 및/또는 상이한 형식 (MCA)에서 존재하는 설계는 *로 부가적으로 표시된다. 무수한 표의 자동 처리를 통해 독특한 식별자를 배정하는 이러한 실시에서, 일부 중복성이 발생하였다. D3H44 이외의 시스템에서 상이한 야생형 아미노산이 동일한 위치를 점유하는 사례는 다음과 같다: 309* = 319* = 47, 316* =101, 317* =183, 318* =182, 310* = 48, 311* =102, 323* =180, 324* =179. LC/MS를 위해 추가 돌연변이가 통합된 사례는 다음과 같다: 442* = 326*, 그리고 443* = 23.
주목할 점은 대다수의 LCCA 실험이 불변 도메인에서 위치된 사슬간 Fab 이황화 결합(들)을 결여하는 구조체 (H/C233S-L/C214S)에서 수행되었다는 것이다.
표 14에서 55%: 45% (H1-L1:H1-L2 및 H2-L2:H2-L1) 또는 더욱 큰 정확한 짝짓기 특이성을 전시하는 설계가 제공된다. 우선적 짝짓기를 위한 특정 설계의 성공을 강조하기 위한 목적으로, 2개의 상보성 LCCA 세트 (H1, L1, L2 및 H2, L2, L1)가 쌍 Fab 형식에서 표현된다.
태그 (L: HA와 FLAG 및 H: ABD2)의 존재는 D3H44 야생형에 대한 ~50%: 50%의 예상된 중성 짝짓기에 영향을 주지 않는다 (이것은 실제 설계에 대한 짝짓기 결과에 의해 더욱 뒷받침된다; 따라서 태그 정보는 이러한 표에 포함되지 않는다).
표에서, 유관한 Fab 종류 (H1-L1, H1-L2 및 H2-L2, H2-L1)의 계량된 양은 비율 형식 (H1-L1:H1-L2 및 H2-L2:H2-L1)에서 포함되었다. 대다수의 사례에서, 여러 LCCA 실험 반복이 수행되었다 (스크리닝과 실증). 정중 H1-L1:H1-L2 및 H2-L2:H2-L1에 대한 정규화된 비율 (즉, 100% H1-L1과 H1-L2 합계까지)의 형식에서 요약 칼럼 역시 제공된다.
데이터는 열 안정성 데이터 (Tm) 및 항원 친화성 (표 버킷에서, 조직 인자 친화성에 대해 'TF' 표기법이 이용된다) 범주에 따라 군집되었다:
Tm1 (x=> 71℃); Tm2 (71℃ >x=> 66℃); Tm3 (66℃ >x). Tm3 범주는 또한, ND (실험 수행되지 않음) 사례를 포함한다.
참고로, D3H44 야생형 Fab (이황화 결합 없음)의 Tm은 ~76℃이다.
TF1 (x =< 야생형 정중 값의 5X KD); TF2 (5< x=< 야생형 정중 값의 20X KD); 그리고 NB 사례 (결합 없음: 야생형 정중의 ~10000 X KD인 500 nM보다 큰 KD의 경우)가 개별적으로 표지화된 x> 야생형 정중 값의 20X KD의 사례를 포함하는 기타 범주. 이러한 마지막 범주는 또한, ND 사례 (실험 수행되지 않음)를 포함한다.
참고로, D3H44 야생형 Fab의 정중 KD는 0.06 nM (0.1의 범위에서)이다.
주의: 항원 친화성 및 열 안정성을 언급하는 표 칼럼에서, 범위 (최소-최대 판독)는 수행된 실험의 횟수가 1보다 크면 (n>1) 지시된다.
각 버킷 내에서, 설계는 H1-L1:H1-L2의 내림 짝짓기 특이성, 그 이후에 H2-L2:H2-L1의 내림 짝짓기 특이성으로 정연된다.
표에서 판독 버킷 범주의 실례:
Tm1 단독 (H1-L1과 H2-L2 Tm 둘 모두 Tm1 범주에 속한다)
Tm1/Tm2 (H1-L1 또는 H2-L2 Tm은 Tm1에 속하고, 그리고 다른 것은 Tm2 범주에 속한다)
동일한 논리가 'TF' 범주에 적용된다.
추가 설계 주기 이후에 획득된, Fab 쌍 형식으로 또한 제공된 LCCA 결과의 추가 세트 (표 15)는 별개의 표에 포함된다. 데이터의 이러한 세트는 감소하는 짝짓기 특이성의 순서로 배열되고 열 안정성에 대하여 다소간 제한된 데이터를 내포한다.
표 14와 15에서 결과는 우리의 인실리코 설계 접근법이 다양한 세트의 설계 및 그들의 변이 전역에서 H1-L2에 비하여 H1-L1의 우선적 짝짓기 및 H2-L1에 비하여 H2-L2의 우선적 짝짓기의 달성을 야기한다는 것을 증명한다. 이들 설계는 일반적으로, 2가지 주요 범주에 속하였다: 정전 (수소 결합 또는 전하-전하 상호작용을 활용하는 특이성 드라이버에 기초됨) 및 입체 상보성. 이런 짝짓기의 특이성은 양쪽 LCCA 설계에 대해 중등도 내지 ~ 100% 정확한 짝짓기의 범위에서 변하였다. 표로부터 증거되는 바와 같이, 이들 설계 중에서 일부는 열 안정성 (Tm) 또는 항원 결합 친화성에 충격을 주지 않는 반면, 일부는 이들 두 성질에 대한 다양한 정도의 충격을 전시하였다. 게다가, 성공적인 설계가 불변과 가변 도메인 둘 모두에서 뿐만 아니라 도메인 설계 조합 형식에서 존재하였다.
실시예 11: 혼합된 Ab 또는 순수한 Ab 중쇄와 경쇄 Fab 형식에서 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정.
앞선 실시예에서 설명된 일정한 설계는 이형이합체 쌍이 상이한 Ab (D3H44에 비교) 또는 2개의 상이한 항체로부터 유래되는 시스템에서, 공동발현 세트의 설계가 이들 유형의 시스템에서 우선적 짝짓기를 유발하는 지를 사정하기 위해 검사되었다. 다수의 상이한 시스템이 검사되었다. 한 가지 실례에서, 한 이형이합체 쌍은 Fab 형식에서 D3H44 중쇄와 경쇄로부터 유래되고, 그리고 두 번째 이형이합체 쌍은 Fab 형식에서 페르투주맙 중쇄와 경쇄로부터 유래되었다. 다른 실례에서, 한 이형이합체 쌍은 Fab 형식에서 D3H44 중쇄와 경쇄로부터 유래되고, 그리고 두 번째 이형이합체 쌍은 Fab 형식에서 트라스투주맙 중쇄와 경쇄로부터 유래되었다.
공동발현 세트의 설계에 따른 아미노산 변형을 포함하는 Fab 형식에서 D3H44 IgG, 페르투주맙, 그리고 트라스투주맙 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 구조체는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 페르투주맙의 중쇄에 대한 염기 DNA 서열, 페르투주맙의 경쇄에 대한 염기 DNA 서열, 트라스투주맙의 중쇄에 대한 염기 DNA 서열, 그리고 트라스투주맙의 경쇄에 대한 염기 DNA 서열은 표 A, A1, 그리고 A2에서 도시된다. 아미노산 변형은 부위 지향된 돌연변이유발에 의해 이들 서열 내로 도입되거나, 또는 실시예 1에서 설명된 바와 같은 염기 서열로부터 아미노산 변형을 포함하는 DNA 서열이 합성되었다.
우선적으로 짝짓기하는 이형이합체 설계의 능력은 혼합된 시스템이 검사될 때, 이용된 비절대 사슬이 상이한 Fab에 속한다는 사실을 제외하고, 실시예 2와 3에서 설명된 바와 같이 사정되었다.
결과는 표 16에서 도시된다. 표 16에서 도시된 아미노산 변형은 D3H44 중쇄 및 D3H44 경쇄; 페르투주맙 중쇄 및 페르투주맙 경쇄; 트라스투주맙 중쇄 및 트라스투주맙 경쇄의 아미노산 서열에 관하여 확인된다. 표 A, A1, 그리고 A2를 참조한다.
D3H44 시스템에서 성공적인 우선적 짝짓기를 전시하는, 설계의 대표적이고 다양한 부분집합은 상이한 시스템 (트라스투주맙 (TRAS) 및 페르투주맙 (PERT))에서 뿐만 아니라 혼합된 시스템 (D3H44/TRAS, D3H44/PERT 및 TRAS/PERT) (Fab 이황화물을 결여하는 구조체, D3H44 LCCA에서처럼)에서 검사되었다.
데이터는 LCCA (표 16) 및 Fab 쌍 형식 (표 17) 둘 모두에서 제공된다. LCCA 데이터는 최소 '경쟁 단위' (즉, H1-L1:H1-L2)를 반영하고, 그리고 LCCA 설계가 Fab를 교차하여 성공적으로 전달될 수 있는 지를 해석하기 위한 최적 형식이다. 두 번째 Fab 쌍 (즉, H2-L2:H2-L1)을 포함하는 Fab 쌍 형식에서 분석은 전체 설계 (즉, H1-L1과 H2-L2)로 번역의 정도 및 이들 상이한 Fab 시스템에서 효능을 더욱 예증하였다. H1-L1:H1-L2의 비율과 별개로, 부정확한 짝짓기에 비하여 정확한 짝짓기의 상대적 성향이 스칼라로서 제공되고, 여기서 스칼라 = ln(H1-L1:H1-L2)이다.
혼합된 시스템 중에서 일부에서, 내재하는 교차-시스템 짝짓기 선호 (가령, H_D3H44는 L_D3H44보다 L_PERT와 우선적으로 짝짓기한다)가 관찰되었다 (표 17). 동일한 실례에서, H_D3H44의 L_PERT와의 우선적 짝짓기는 열 안정성 치수 (Tm)에 의해 또한 뒷받침되었는데, 이것은 H_D3H44-L_PERT 종류가 H_D3H44-L_D3H44보다 더욱 안정된다는 것을 지시하였다. 따라서, 계량된 실제 종류 양을 보고하는 것과 함께, 개별 야생형 LCCA 시스템 (REF) 행태에 대한 정규화된 데이터가 △스칼라(변이체-참고_야생형)의 형태로 제공되는데, 여기서 △스칼라 = ln (H1-L1:H1-L2/H2-L2:H2-L1)이다. 이러한 미터단위는 LCCA 설계의 실제 유용성의 지표이다. 이들 표에 포함된 데이터는 55%: 45% 또는 더욱 큰 짝짓기 특이성의 당량 (즉, △스칼라 (변이체-참고_야생형) > 0.2)을 산출하는 설계를 포함한다.
D3H44 시스템에서와 달리, 일정한 종류 비율은 때때로, 야생형 PERT 단독 및 야생형 TRAS ( 더욱 적은 정도로) 시스템에서 경쇄 태그에 의해 영향을 받는 것으로 보인다 (표 18). 이것은 짝짓기의 태그 간섭보다는, HA-태그 개열의 무작위 이벤트 (시스템이 Mab 형식에서 검사될 때 가용한 LC/MS 증거)에 기인하는 것으로 보인다. 따라서 태그는 유관한 표에서 결과를 나타낼 때 고려되었다.
상이한 시스템을 교차하여, LCCA와 Fab 쌍 형식 둘 모두에서 결과의 요약은 표 19와 20에서 보고된다. 이들 결과는 상이한 검사된 Fab 시스템을 교차하여 설계 이전성을 지시한다. 이들 결과는 이들 설계 중에서 일부가 다른 것들보다 우수하다는 것을 반드시 반영하는 것은 아니다; 또한 이들은 더욱 포괄적인 이전성 추정치를 반영하지 않는다. 표 19에서 제공된, 2가지 시스템 또는 그 이상에서 성공적인 LCCA 설계 (가령, 정중 △스칼라 (변이체-참고_야생형) > 0.2)는 이들 상이한 시스템에서 검사된 LCCA 설계의 대략 30%를 구성한다. 이것은 특정 시스템 및 설계에 따라, 이전성을 지시한다. 따라서, 독특한 설계의 수집물을 갖는 것은 다수의 시스템을 위한 이중특이적 쌍의 창출을 허용하였고, 그리고 관심되는 임의의 항체 (또는 항체 쌍)의 배경에서 평가될 수 있는 설계 세트의 라이브러리의 유용성을 강조한다. 본 실시예는 돌연변이 / 설계 세트가 혼합된 Ab 또는 순수한 Ab 중쇄와 경쇄 Fab 형식에서 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기를 달성하는데 이용될 수 있다는 것을 지시한다.
실시예 12: 전장 중쇄 (Mab) 형식에서 D3H44 중쇄와 경쇄에서 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정
이형이합체 공동발현 세트 설계는 중쇄가 전장 중쇄이고 Fab 일부가 아닌 형식 (Mab 형식)에서도 이들이 우선적 짝짓기를 허용하는 지를 결정하기 위해 사정되었다.
구조체의 제조:
공동발현 세트의 설계에 따른 아미노산 변형을 포함하는 D3H44 IgG 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 구조체는 하기와 같이 제조되었다. D3H44 Fab 경쇄 구조체는 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. D3H44 중쇄 서열은 전장 D3H44 중쇄가 힌지-CH2-CH3 도메인을 인코딩하는 IgG1*01 DNA 서열을 D3H44 Fab 중쇄의 C 말단에 부가함으로써 창출되었다는 점을 제외하고, 실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 중요하게는, 정준 C-말단 중쇄 리신 잔기가 C-말단 리신 클리핑에 기인한 LC-MS 신호 이질성을 예방하기 위해 제거되었다 (Lawrence W. Dick Jr. et al., Biotechnol. Bioeng. (2008) 100:1132-43).
Mab 검정 형식
우선적으로 짝짓기하는 D3H44 중쇄와 경쇄의 능력은 하기와 같이 사정되었다: 1개의 전장 D3H44 중쇄 구조체는 2개의 독특한 D3H44 경쇄 구조체와 공동발현되어, 3가지 가능한 항체 종류: H1-L1:H1-L1, H1-L2:H1-L2 및 H1-L1:H1-L2를 산출하였다 (도면 10 참조). 바람직한 H1-L1:H1-L1 종류 대 다른 것들의 양의 면에서 상대적 경쇄 짝짓기 특이성은 단백질A (pA) 정제 후 LC-MS를 이용하여 결정되었다. 가능한 경우에, 3개 사슬의 공동-형질감염으로부터 발생하는 3가지 가능한 Mab 종류가 서로로부터 최소한 50 Da에 의해 달라지면, 사슬은 태그되지 않은 상태로 남겨졌다. 질량 차이가 이러한 가능성을 배제할 때, 종류 사이에 충분한 질량 차별을 제공하기 위해 N-말단 HA 또는 FLAG 태그 융합을 갖는 최소한 하나의 경쇄가 작제되었다. 실시예 2에서 설명된 바와 같이, 중쇄는 제한하는 양 (즉, HC < L1 + L2)에서 유지되었다.
Mab 검정 형식에 대한 형질감염 방법
실시예 12에서 설명된 바와 같이 제조된 1개의 중쇄 및 2개의 경쇄 구조체를 포함하는 공동발현 세트는 하기와 같이 CHO-3E7 세포 내로 형질감염되었다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도에서 CHO-3E7 세포는 37℃에서, 4 mM 글루타민 및 0.1% 플루로닉 F-68 (Invitrogen cat# 24040-032)로 보충된 FreeStyle™ F17 배지 (Invitrogen cat# A-1383501)에서 배양되었다. 총 체적 50ml는 1:2.5의 DNA:PEI 비율에서 PEI-pro (Polyplus cat# 115-010)를 이용하여 총 50 ug DNA로 형질감염되었다. DNA-PEI 혼합물의 첨가 후 24 시간에, 이들 세포는 32℃으로 이전되었다. 상층액은 7 일자에 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 발현에 대해 검사되고, 그 이후에 띠를 시각화하기 위한 쿠마씨 블루 염색이 이어졌다. 이용된 HC: L1:L2 비율은 1:1:1이었다.
Mab 검정 형식에 대한 질량 분광분석법 방법
공동발현 세트에서 D3H44 중쇄에 우선적 D3H44 경쇄 짝짓기의 정도는 단백질 A 정제 및 탈당화 후 질량 분광분석법을 이용하여 사정되었다. 정제된 표본은 하기와 같이 PNGaseF로 탈당화되었다: 50mM Tris-HCl pH 8.0에서 0.2U PNGaseF/μg의 항체, 37℃에서 하룻밤 동안 배양, 최종 단백질 농도는 0.45 mg/mL이었다. 단백질 표본은 고유동 전기분무 경계면을 거쳐 LTQ-Orbitrap XL 하이브리드 질량분광계 (ThermoFisher Scientific)에 연계된 Agilent 1100 HPLC 시스템을 이용하여 LC-MS에 의해 분석되었다. 표본 (2.5μg)이 2.1 x 10 mm Poros R2 칼럼 (Applied Biosystems) 위에 주입되고 다음 구배 조건을 이용하여 용리되었다: 0-3 분: 20% 용매 B; 3-6 분: 20-90% 용매 B. 용매 A는 0.1% 포름산 수성이고, 그리고 용매 B는 65% ACN, 25% THF, 9.9% ddH2O, 0.1% 포름산이었다. 유속은 1 mL/분이었다. 흐름은 100μL/분을 전기분무 경계면으로 지향시키기 위해 포스트칼럼 분할되었다. 칼럼 및 용매는 단백질 피크 모양을 향상시키기 위해 80℃로 가열되었다. LTQ-Orbitrap XL은 ThermoFisher Scientific의 LTQ 양이온 ESI 보정 용액 (카페인, MRFA 및 Ultramark 1621)을 이용하여 보정되고, 그리고 CsI의 10 mg/mL 용액을 이용하여 조율되었다. 콘 전압 (공급원 단편화 세팅)은 40 V이고, FT 해상력은 7,500이고, 그리고 스캔 범위는 m/z 400-4,000이었다.
단백질 스펙트럼은 MassLynx 기기 제어 및 데이터 분석 알고리즘의 MaxEnt 모듈 (Waters)을 이용하여 디콘볼류션되었다. 간단히 말하면, 미가공 단백질 LC-MS 데이터는 먼저, Xcalibur (Thermo Scientific)의 스펙트럼 보기 모듈인 QualBrower에서 열리고, 그리고 Waters에 의해 제공된 파일 전환 프로그램인 Databridge를 이용하여 MassLynx와 양립하도록 전환되었다. 전환된 단백질 스펙트럼은 MassLynx의 스펙트럼 모듈에서 개관되고 MaxEnt를 이용하여 디콘볼류션되었다. 각 표본에서 상이한 항체 종류의 존재비는 결과의 분자량 프로필로부터 직접적으로 결정되었다.
결과는 표 21에서 도시된다. 표 21에서 도시된 아미노산 변형은 D3H44 중쇄 및 D3H44 경쇄의 아미노산 서열에 관하여 확인된다. 표 A, A1, 그리고 A2를 참조한다.
다양한 설계 세트를 또한 대표하는, D3H44 시스템에서 성공적인 우선적 짝짓기를 전시한 설계의 부분집합은 예로서, Fab 구조를 갖는 LCCA에서 Mab 구조에 기초된 Mab 경쟁 검정 (MCA)으로 형식 이전성의 사정을 위해 선택되었다.
표 21에 나타나 있는 바와 같이, Mab 경쟁 검정에서 이용된 D3H44 야생형은 50% H1-L1_H1-L2 및 25%의 각 H1-L1_H1-L1과 H1-L2_H1-L2의 예상된 이론적 종류 분포로부터 일탈을 전시하였는데, 여기서 경쇄는 태그 (HA 또는 FLAG)의 존재 또는 부재에 의해 식별되었다. 이러한 일탈은 태그 의존성 짝짓기보다는 태그 의존성 발현 수준의 있음직한 결과이다 (가령, 상이한 야생형 H1:L1:L2 비율에서 수행된 실험뿐만 아니라 설계 행태의 기초에서 간접적인 관찰에 기초됨). 실험 반복 및/또는 태그 정체에 의해 달라지는 변이체를 교차하여 모든 계량된 종류에 대한 정중 값 역시 포함되었다.
소정의 설계를 포함하는 2개의 성공적인 Mab 검정 변이체 (도면 11)의 LC/MS 스펙트럼의 실례는 도면 12에서 발견된다. 이들 변이체의 경우에 대다수의 계량된 종류는 원하는 H1-L1_H1-L1 종류에 상응하였다. 발현 프로필, UPLC-SEC (H2-L2_H2-L2 종류에 대해서만 도시됨 (H2-L2로서 표시된 도면에서)), 그리고 도면 13에서 보고된 DSC 온도기록도는 일정한 히트에 대해 수행된 변이체의 특성화에 전형적이다. 이러한 특정 사례에서 이들은 Fab 안정성에 대한 상대적으로 작은 충격을 갖는 충분히-발현된, 균질한 종류를 증명하였다.
표 21에서 결과는 Mab 형식으로 이전성이 LCCA 설계 사이에서 주목할 만큼 성공적으로 달성되었다는 것을 증명한다. 검사된 12개 LCCA 설계 중에서 11개는 이론적 25%에 동등한 또는 이보다 큰 정확하게 짝짓기된 종류를 전시하였다. 이러한 데이터는 설계 라이브러리의 초기 스크린으로서 이용된 LCCA 형식이 Mab 형식에서 설계 성공을 사정하고 및/또는 예측하는데 적합하다는 것을 지시한다.
실시예 13: 이중특이적 항체 형식에서 불변 도메인 및/또는 가변 도메인 변형을 포함하는 공동발현 세트에서 이형이합체의 우선적 짝짓기의 사정
이형이합체 공동발현 세트 설계는 이들이 이중특이적 Mab 항체 형식에서도 우선적 짝짓기를 허용하는 지를 결정하기 위해 사정되었다. 본 실시예에서, 각 이형이합체의 전장 중쇄의 Fc 영역은 동종이합체화와 비교하여 독특한 중쇄의 이형이합체화를 증진하기 위해 비대칭적으로 변형되었다.
구조체의 제조:
이형이합체 공동발현 세트 설계는 다음 이중특이적 항체: a) D3H44/페르투주맙, b) D3H44/트라스투주맙, c) D3H44/라무시루맙, 그리고 d) 트라스투주맙/라무시루맙의 배경에서 검사되었다. 불변 및/또는 가변 도메인에서 아미노산 변형을 포함하는 D3H44, 페르투주맙, 그리고 트라스투주맙 중쇄와 경쇄는 상보성 Fc 이형이합체화 돌연변이가 공동발현 설계 세트의 각 2개 중쇄 내로 도입된 점을 제외하고, 실시예 12에서 설명된 바와 같이 제조되었다. 라무시루맙 중쇄와 경쇄는 라무시루맙 중쇄와 경쇄에 대한 염기 DNA 서열에 기초하여 제조되었다. 표 A를 참조한다. 중쇄의 CH3 서열은 다음 아미노산 변형을 포함하였다:
a) D3H44/페르투주맙: 사슬 A: T371V_T389L_K420L_T422W, 사슬 B: T371V_L372Y_F436A_Y438V
b) D3H44/트라스투주맙: 사슬 A: T371V_T389L_K420L_T422W, 사슬 B: T371V_L372Y_F436A_Y438V
c) D3H44/라무시루맙: 사슬 A: T371V_T389L_K420L_T422W, 사슬 B: T371V_L372Y_F436A_Y438V
d) 트라스투주맙/라무시루맙: 사슬 A: T371V_T389L_K420L_T422W, 사슬 B: T371V_L372Y_F436A_Y438V
검정 형식 (SMCA)
우선적으로 짝짓기하여 이중특이적 항체를 형성하는 이형이합체 공동발현 세트 설계의 능력은 하기에 설명된 바와 같이 사정되었다. 검정은 4개의 사슬 (Ab1로부터 2개 및 Ab2로부터 2개)을 공동발현하고, 그리고 질량 분광분석법 (LC-MS)을 이용하여 정확하게 형성된 이중특이적 항체의 존재를 검출하는 것에 기초된다. 검정은 하기와 같이 수행되었다. 도면 14는 4개의 시작 폴리펩티드 사슬, 그리고 이형이합체 쌍의 중쇄와 경쇄 사이에 우선적 짝짓기의 부재에서 이들 시작 폴리펩티드 사슬의 공동발현으로부터 발생하는 잠재적 산물을 묘사하는 계통도를 제공한다. 2개의 전장 중쇄 구조체는 2개의 독특한 경쇄 구조체와 공동발현되어, 10개의 가능한 항체 종류: H1-L1:H1-L1, H1-L2:H1-L2, H1-L1:H1-L2, H2-L1:H2-L1, H2-L2:H2-L2, H2-L1:H2-L2, H1-L1:H2-L1, H1-L2:H2-L2, H1-L2:H2-L1 및 H1-L1:H2-L2를 산출하였다. 후자 종류는 정확하게 짝짓기된 이형이합체이다 (아래 도면 참조). 바람직한 종류 H1-L1:H2-L2 대 다른 것들의 양의 면에서 상대적 짝짓기 특이성은 pA 정제 후 LC-MS를 이용하여 결정되었다. 가능한 경우에, 모든 Mab와 절반-Ab 종류가 서로로부터 최소한 50 Da에 의해 달라지면, 사슬은 태그되지 않은 상태로 남겨졌다. 질량 차이가 이러한 가능성을 배제할 때, 종류 사이에 충분한 질량 차별을 제공하기 위해 경쇄 중에서 하나가 N-말단 HA 태그 융합을 갖도록 작제되었다. 이중특이적 항체의 발현과 스크리닝 단계를 수반하는 이러한 검정은 SMCA으로서 지칭된다.
형질감염 방법
실시예 1에서 설명된 바와 같이 제조된 2개 중쇄와 2개 경쇄 구조체를 포함하는 공동발현 세트는 하기와 같이 CHO-3E7 세포 내로 형질감염되었다. 1.7 - 2 x 106 세포/ml의 밀도에서 CHO-3E7 세포는 37℃에서, 4 mM 글루타민 및 0.1% 플루로닉 F-68 (Invitrogen cat# 24040-032)로 보충된 FreeStyle(TM) F17 배지 (Invitrogen cat# A-1383501)에서 배양되었다. 총 체적 20ml는 1:2.5의 DNA:PEI 비율에서 PEI-pro (Polyplus cat# 115-010)를 이용하여 총 20 ug DNA로 형질감염되었다. DNA-PEI 혼합물의 첨가 후 24 시간에, 이들 세포는 32℃으로 이전되었다. 상층액은 7 일자에 비환원 SDS-PAGE 분석에 의해 발현에 대해 검사되고, 그 이후에 띠를 시각화하기 위한 쿠마씨 블루 염색이 이어졌다. 이용된 H1:H2: L1:L2 비율은 발현 효율을 사정하기 위해, 초기에 중성 (15:15:35:35)으로 유지되었다. 한 세트의 H1:H2:L1:L2 DNA 비율이 이후, 어떤 조건(들)이 모든 사슬이 야생형일 때 상이한 종류의 이론적 분포를 반영하는 혼합물을 생산하는 지를 사정하기 위해 CHO 발현에서 검사되었다. 이들 비율은 2개의 상이한 항체의 중쇄와 경쇄 사이에 발현 수준에서 자연적 차이 및/또는 내재성 짝짓기 치우침을 보상한다.
SPR 바이오센서 검정
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 염산염; sNHS: N-히드록시술포숙신이미드; SPR: 표면 플라스몬 공명; EDTA: 에틸렌디아민테트라아세트산; HEPES: 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산; TF: 조직 인자.
SPR 물품. GLC 센서칩, Biorad ProteOn 아민 커플링 키트 (EDC, sNHS 및 에탄올아민), 그리고 10mM 아세트산나트륨 완충액은 Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON)로부터 구입되었다. 재조합 Her-2 단백질은 eBioscience (San Diego, CA)로부터 구입되었다. 0.05% Tween20을 포함하는 PBS 작업 완충액(PBST)은 Teknoca Inc. (Hollister, CA)로부터 구입되었다. 염소 다중클론 항-인간 Fc 항체는 Jackson Immuno Research Laboratories Inc. (West Grove, PA)로부터 구입되었다.
모든 표면 플라스몬 공명 검정은 25 ℃의 온도에서, PBST 작업 완충액으로 BioRad ProteOn XPR36 기기 (Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd. (Mississauga, ON))를 이용하여 수행되었다. 항-인간 Fc 포획 표면은 피분석물 (수평) 방향으로 100 μL/분에서 140 초 동안 주입된 표준 BioRad sNHS/EDC 용액의 1:5 희석액에 의해 활성화된 GLC 센서칩을 이용하여 산출되었다. 활성화 직후에, 10 mM NaOAc pH 4.5에서 항-인간 Fc 항체의 10 μg/mL 용액이 대략 3000 공명 단위 (RUs)가 고정될 때까지 25 μL/분의 유속에서 리간드 (수직) 방향으로 주입되었다. 나머지 활성 군은 피분석물 방향으로 100 μL/분에서 1M 에탄올아민의 140 초 주입에 의해 수냉되고, 그리고 이것은 또한, 모의-활성화된 인터스팟이 블랭크 참조를 위해 창출되도록 담보한다. Her2 또는 TF 항원 표적에 결합에 대한 항체 변이체의 스크리닝은 2 단계에서 일어났다: 리간드 방향으로 항-인간 Fc 항체 표면 위에 항체 변이체의 간접적인 포획, 그 이후에 피분석물 방향으로 이중 참조를 위한 정제된 항원의 5가지 농축물 및 하나의 완충액 블랭크의 동시 주입. 먼저, 리간드 방향으로 100 uL/분에서 30 초 동안 1회 완충액 주입이 기준선을 안정시키는데 이용되었다. 각 항체 변이체 포획을 위해, 세포-배양 배지에서 정제되지 않은 변이체는 PBST에서 4 %로 희석되었다. 1 내지 5개 변이체 또는 대조가 유속 25 μL/분에서 240 초 동안 개별 리간드 통로에 동시 주입되었다. 이것은 항-인간 Fc 표면 위에 대략 400 내지 600 RU의 포획을 유발하였다. 첫 번째 리간드 통로는 빈 채로 남겨졌고 필요하면, 블랭크 대조로서 이용되었다. 이러한 포획 단계는 기준선을 안정시키기 위해 피분석물 방향으로 2회 완충액 주입이 직후에 이어지고, 그리고 이후 완충액 블랭크와 함께 60nM, 20nM, 6.7nM, 2.2nM 및 0.74nM 항원 (TF 또는 Her2)이 300 초 해리 시기에서 120 초 동안 50 μL/분에서 동시 주입되었다. 포획된 항체 표면은 다음 주입 주기를 준비하기 위해 100 μL/분에서 18 초 동안 0.85% 인산의 18 초 펄스에 의해 재건되었다. 센서그램은 완충액 블랭크 주입 및 인터스팟을 이용하여 정렬되고 이중-참조되며, 그리고 결과의 센서그램은 ProteOn Manager 소프트웨어 v3.1을 이용하여 분석되었다. 이중-참조된 센서그램은 1:1 결합 모델에 적합되었다. 각 항원에 대한 Rmax 값은 각 변이체에 대한 항체 포획 수준에 정규화되고 100% 대조와 비교되었다.
이중특이적 항체의 안정성은 실시예 5에서 설명된 바와 같이 검사되었다. 이중특이적 항체의 LCMS 분석은 실시예 12에서 설명된 절차를 이용하여 수행되었다.
다수의 선별된 D3H44 LCCA 설계가 SMCA 형식에서 검사되었다. 게다가, 일부 설계는 단지 SMCA 형식에서만 직접적으로 평가되었다. 대다수의 설계는 D3H44/페르투주맙 시스템에서 검사되었다. 이러한 시스템에서 선별된 설계의 부분집합 (다양한 설계 수반)은 3가지 추가 이중특이적 Mab 시스템: D3H44/트라스투주맙, D3H44/라무시루맙 (RAMU), 그리고 트라스투주맙/라무시루맙 시스템에서 더욱 검사되었다.
LCCA 실험 (실시예 11)에서 D3H44/페르투주맙 및 D3H44/트라스투주맙에 대해 관찰된 내재하는 교차-시스템 경쇄/중쇄 선호는 완전한 항체 형식에서도 재현가능하였다. 게다가, 비록 상이한 교차-시스템 짝짓기 경향을 갖긴 하지만, 유사한 행태가 다른 2가지 시스템에 대해서도 관찰되었다 (표 22).
원하는 이중특이적 종류, H1-L1_H2-L2는 일반적으로, 틀린짝짓기된 유형: H1-L2_H2-L1로부터, LC/MS의 기초에서 실험적으로 식별될 수 없다. 따라서, 이중특이적 함량이 표에서 보고될 때, 이것이 이러한 유형의 틀린짝짓기된 종류를 내포하지 않는 것으로 완전하게 배제될 수는 없다. 하지만, H1-L2_H1-L2와 H2-L1_H2-L1뿐만 아니라 H1-L2와 H2-L1 절반 항체와 같은 종류에 대해 관찰된 매우 낮은 함량은 이들 이중특이적 종류의 있다 하더라도 극히 경미한 오염이 일어났다는 것을 지시한다. LC/MS에 의해 계량된 특정 표본에서 존재하는 모든 다른 종류는 표에 포함된다. 많은 경우에 MS 피크는 측면 피크를 동반하였다; 하지만 이들은 단지 이중특이적 종류에 대해서만 주해되었다. MS 피크 강도를 정규화할 때, 이들 부가적인 종류는 고려되지 않았다. 표에서 측면 피크(들)에 대해 표시된 숫자는 주요 이중특이적 피크에 대한 강도와의 강도 비교에 의해 획득되었다. 일부 예비 분석은 측면 피크가 리더 펩티드의 개열에서 부가물 또는 이질성의 형성을 수반하는 경쇄 태그의 존재와 상관되고, 그리고 이것이 아마도 주요 피크 종류를 대표한다는 것을 지시하였다.
최종적으로 모든 짝짓기된 종류는 짝짓기된: 틀린짝짓기된 칼럼에서 보고된 비율을 획득하기 위해, 틀린짝짓기된 종류에 추가하여 요약되었다. 이러한 특정 설계의 강도를 증명하기 위해, 실시예 11에서 설명된 수학적 접근법에 따라 △스칼라 (변이체-참고_야생형)를 계산하는데 더욱 이용되었다. 시스템 내에서, 설계는 스칼라 미터단위의 내림 값으로 정연되었다.
실시예 12에서 설명된 경쇄와 중쇄의 짝짓기에 대한 교차-시스템 자연 선호로 인해, H1:L1:H2:L2의 DNA 비율은 원하는 이중특이적 종류 (H1-L1_H2-L2)의 가장 높은 함량을 산출하기 위해, 변경 (가령, H2 (PERT)에 비하여 H1 (D3H44)의 과다발현)을 필요로 하였다. 최적 비율은 또한, 결과적으로 특정 설계에 따라서 어느 정도까지 변할 수 있다. DNA 비율은 이중특이적 종류: 짝짓기된 절반 항체 종류 (통상적으로 한 가지 유형: H1-L1 또는 H2-L2의)의 실제 비율에 주로 영향을 준다. 실례는 표 23에 포함되는데, 여기서 이러한 비율로 DNA 적정은 변하지만 짝짓기된: 틀린짝짓기된 종류의 전반적인 비율은 상대적으로 불변이었다.
D3H44/페르투주맙 시스템의 경우에, 제한된 세트의 DNA 적정이 대다수의 설계에 대해 수행되었다. 가장 높은 짝짓기된: 틀린짝짓기된 종류 함량을 유발한 비율에 대한 데이터는 표 22와 24에서 도시된다. 다른 3가지 시스템의 경우에, 형질감염은 표에서 보고된 바와 같이, 단지 한 비율에서만 수행되었다. 보고된 비율에서 실험이 반복되면, 평균 값이 표에 포함되었다. 태그 정체에 대한 정보는 포함되지 않았는데, 그 이유는 태그 영향이 야생형에 대해 관찰되지 않았기 때문이다 (표 26). 제공된 야생형 참고는 보고된 설계 데이터 사이에서 가장 흔한 DNA 비율을 대표하는 것으로서 선택되었다.
LC/MS 분석은 pH4에서 뿐만 아니라 pH7에서 보관된 표본에서 수행되었다. pH7에서 보관된 표본에서 실험은 D3H44/트라스투주맙, D3H44/라무시루맙 (RAMU), 그리고 트라스투주맙/라무시루맙 시스템의 경우에 검사되었다. 따라서 데이터는 2개의 표 (표 22 (pH4) 및 24 (pH7))에서 제공된다. 만족스러운 상관은 이들 두 실험 사이에 짝짓기된: 틀린짝짓기된 종류 비율에 대해 관찰되었고, pH가 LC/MS 실험에서, 다시 말하면, 현재하는 종류의 유형의 특성화에서 아마도 실제적인 역할을 하지 않는다는 것을 지시하였다.
도면 15는 MCA 형식에서 도면 11 및 도면 12에서 제공된 설계에 기초하여, TF 및 Her2를 표적으로 하는 이중특이적 구조체의 LC/MS 분석 결과를 제공한다. 절대 중쇄와 경쇄의 정확한 짝짓기를 갖는 바람직한 이중특이적 항체가 92%에 근접하게 관찰되었다. 도면 16은 상층액에서 단백질 산물의 발현 프로필 및 SDS PAGE에서 차후 단백질 A 정제뿐만 아니라 단백질 A 정제된 화합물의 SEC 프로필을 제공한다. 도면 17은 먼저 2가지 표적 (독립적으로 TF 및 Her2)에 대한, 그리고 이후 샌드위치 (가교화) 방식에서 이중특이적 분자의 이중특이적 표적 결합 특질을 제공한다.
일부 경우에, 제한된 세트의 변이체에서 특징된, H/S115 및 H/S156에서 돌연변이는 실제 설계의 일부가 아니었고, 오히려 LC/MS 실험의 목적으로 필요한 질량 차이를 획득하기 위한 실용적인 이유로 추가되었다. 이들 아미노산은 돌연변이의 실제 설계 세트로부터 충분히 멀리, 불변 도메인의 표면 상에서 위치되고, 그리고 항체의 행태에 충격을 주지 않을 것으로 예상된다.
열 안정성 및 항원 친화성이 D3H4/페르투주맙 시스템에서 다수의 설계에 대해 사정되고, 그리고 표 25에서 제공된다. Tm 값 (이탤릭체로 지시됨)은 수동으로 주해되었다. 동종이합체성 Mab 대조 (야생형)는 형질감염 반복 (pH 7에서)에서 발현된 산물: PERT (72.03-77.72) 및 D3H44 (77.97-78.88)에 대한 열 용융 (Tm)의 다음 안정성 범위를 전시하였다. 페르투주맙에 대해 관찰된 더욱 넓은 범위는 아마도 내재성 성질에 기인한다. 친화성 계량은 단지 pA 정제 후 착수되었다. 동종이합체성 Mab에 대한 관찰된 KD 범위는 다음과 같다: TF: 0.04-0.076 nM, HER2: 1.84-6.3 nM. 많은 경우에 이들 두 Fab에 대한 상기 지시된 상이한 범위로 인해 2가지 용융 전이를 기대할 것이다. Tm에 대한 단지 한 가지 값만 보고되는 경우에, 이것은 2가지 이유 중에서 한 가지로 인해 잠재적으로 발생하였다: 페르투주맙 안정성의 변이 및/또는 페르투주맙 Fab의 것과 일치할 수 있는 D3H44 Fab 상에서 설계의 불안정화. 결과는 SMCA 변이체의 선별이 열 안정성에 최소한으로 영향을 주는 것들의 범위에서 변할 뿐만 아니라 다양한 정도로 그러한 것들에 대한 항원 결합을 지시한다.
일부 설계는 가능한 Fc 돌연변이 배치 둘 모두로 검사되었다. 이들은 동일한 독특한 식별자를 가짐에 의해 인식가능하고 *D3H44 (또는 표 25에서 # 전술한 독특한 식별자 세트)로 표시된다. 표 22로부터 증거되는 바와 같이, Fc 돌연변이의 배치는 한 가지 제한된 예외를 제외하고, 짝짓기된: 틀린짝짓기된 종류 결과에 영향을 주지 않는 것으로 보인다.
SMCA 결과는 다양한 세트를 나타내는 실제적인 숫자의 설계가 Mab 형식에서 자연 교차-종류 짝짓기 경향을 극복할 수 있다는 것을 보여준다. 이들 사이에서, 검사된 설계 중에서 거의 한 쿼터가 높은 짝짓기된:틀린짝짓기된 비율 (>=80:20)의 범주에 속한다 (숫자는 더욱 철저하게 검사된 시스템, D3H44/페르투주맙에 대해 제공된다). 상이한 시스템을 교차하여 설계 유용성의 비교는 다양한 정도의 이전성을 드러낸다. 게다가, 표 27에서 열거된, 대략 60%의 설계는 D3H44 LCCA로부터 SMCA 형식으로 이전되고, 4가지 검사된 SMCA 시스템 중에서 최소한 하나에서 높은 정도의 우선적 짝짓기 (> 75%: 25%)를 유발하였다.
D3H44/페르투주맙 이외의 시스템에서 검사된 설계의 경우에, 설계 배치는 또한, 결합 도메인에 대하여 반전되었다, 가령, D3H44 결합 도메인 상에서 H1-L1 설계, TRAS 상에서 H2-L2 설계뿐만 아니라 TRAS 상에서 H1-L1 설계 및 D3H44 상에서 H2-L2 설계. 이들 결과는 대다수의 사례에서 설계의 유용성이 이런 반전된 배치에 의해 충격을 받을 수 있다는 것을 증명한다.
상기 논의된 결과는 설계의 이전성이 설계 성분의 주동 잠재력과 연계된 항원 결합 도메인의 조합에 의해 충격을 받을 수 있다는 것을 지시한다 (가령, H1L1L2 주동은 H2L2L1보다 나을 수 있다). 이들 결과는 다수의 염기 코어 설계가 다양한 Mab 쌍을 교차하여 효력을 나타내고 75%보다 큰 선별적인 짝짓기를 갖는 이중특이적 Ab를 형성한다는 것을 지시한다.
실시예 14: Fab 경계면의 분자 모형화 및 컴퓨터 유도된 가공
관심되는 항체에서 원하는 특이성을 전시하는 돌연변이를 확인하기 위해 다른 항체 또는 이들의 단편의 배경에서 스크리닝될 수 있는 중쇄와 경쇄 돌연변이 설계의 라이브러리를 생산하기 위한 구조 및 계산적 분자 모형화 유도된 접근법이 이용되었다. 우선적 HC-LC 짝짓기를 가공하기 위한 설계 전략은 먼저, 가지고 작업하기 위한 대표적인 Ab (즉, D3H44)를 확인하는 것을 포함하였다. 이러한 Ab의 핵심 규준은 표 28에서 도시된다.
Figure 112021065197780-pat00017
표 28에서 지시된 바와 같이, 이러한 항체에 의해 제공된 핵심 규준은 이것이 통상적으로 이용된 VH와 VL 하위군 및 최소 프레임워크 영역 돌연변이를 갖는 인간/인간화 Ab라는 것이었다. 이에 더하여, 구조적 고려 사항은 VH:VL 도메인간 각도가 Ab에 대해 관찰된 평균에 근접해야 한다는 것이었다. Fab의 선별 후, Fab 경계면의 인실리코 분석이 중요한 잔기를 확인하고 이해하는 목적으로 수행되었다. 2-갈래 접근법이 채택되었다. 먼저, Fab 가변과 불변 경계면 전역에서 서열 보존의 전체 분석이 공개적으로 가용한 Ab의 서열과 구조 정렬에 의해 수행되었다. 다양한 항체 하위군으로부터 불변과 가변 도메인 서열의 정렬은 도면 6에서 도시된다. 병렬적으로, 결정 구조 경계면 D3H44는 도면 18에서 열거된 다수의 분자 모형화 도구 (가령, ResidueContactsTM)를 이용하여 분석되었다. 이들 분석은 우선적 HC-LC 짝짓기를 가공하기 위한 핫스팟 위치의 목록의 확인을 유발하였다. 이러한 분석으로부터 결정된 핫스팟 위치는 표 29에서 열거된다.
Figure 112021065197780-pat00018
그 다음, 3D 결정 구조에서 핫스팟 위치에서 뿐만 아니라 관심되는 핫스팟에 인접한 위치에서 잠재력 돌연변이와 설계는 ZymepackTM로 인실리코 돌연변이유발 및 패킹 / 모형화를 통해 모의되고 확인되며, 그리고 입체와 정전 상보성을 비롯한 다수의 인자의 기초에서 채점되었다. 도면 11은 가변 도메인 내에 중쇄와 경쇄 경계면에서 제한된 숫자의 핫스팟 위치, 그리고 부정확한 사슬 쌍의 형성을 멀리하면서 절대 사슬의 선별적인 짝짓기를 조장하기 위해 돌연변이가 이들 경계면 위치에서 어떻게 도입될 수 있는 지를 제시한다. 입체 상보성은 모형화되고 또한, 에너지 인자, 예를 들면, 반 데르 발스 패킹, 공동 효과 및 소수성 기의 근접한 접촉의 기초에서 계산되었다. 유사하게, 정전 상호작용 에너지가 모형화되고 전하 사이에 쿨롱 상호작용, 수소 결합, 그리고 탈용매화 효과의 기초에서 평가되었다. 관심되는 돌연변이를 도입함으로써 획득된 바람직한 중쇄와 경쇄 쌍 모델 둘 모두, 예를 들면, H1:L1 (또는 H2:L2) 및 부정확한 쌍, 예를 들면, H1:L2 (및 H2:L1)은 상대적인 입체와 정전 점수를 계산하기 위해 모의되었다. 이것은 특정 돌연변이 세트가 부정확한 (비절대) 쌍에 비하여 바람직한 (절대) 중쇄 - 경쇄 쌍에 대한 우호적인 에너지, 다시 말하면, 더욱 큰 입체 또는 정전 상보성을 야기하는 지를 결정하는 것을 허용하였다. 계산된 입체와 정전 에너지는 경쇄와 중쇄 짝짓기와 연관된 자유 에너지의 성분이다. 따라서 더욱 큰 입체와 정전 상보성은 비절대 쌍의 짝짓기에 비하여 절대 쌍의 짝짓기와 연관된 더욱 큰 자유 에너지 변화를 지시한다. 더욱 큰 입체 또는 정전 상보성은 비절대 쌍에 비하여 절대 중쇄와 경쇄의 우선적 (선별적인) 짝짓기를 유발하고, 그리고 공동발현 시에 2가지 산물 (비절대 짝짓기된 중쇄와 경쇄에 대하여 절대 짝짓기된 중쇄와 경쇄)의 백분율의 면에서 검출될 수 있다. 절대 쌍에서 더욱 큰 입체 또는 정전 상보성은 또한, 비절대 쌍에 비하여 더욱 우수한/더욱 큰 열 안정성의 면에서 전형적으로 관찰될 수 있다. 후보 설계는 최종 후보자 명단에 넣어지고 순위매겨졌다. 설계는 LCCA 시스템을 이용하여 시험관내에서 초기에 검사되었다. 비최적 생물물리학적 특징, 예를 들면, 불량한 HC-LC 짝짓기 특이성, 낮은 열 안정성, 또는 감소된 항원 결합 친화성을 전시하는 중간 정도 성과 설계는 추가 라운드의 인실리코 설계 및 시험관내 스크리닝을 통해 더욱 향상되었다. 최선의 설계는 이후, 이중특이적 Mab 형식에서 검사되었다; 시험관내 스크리닝은 일차적으로 SMCA 형식을 통해 이루어졌다.
실시예 15: 이중특이적 항체 돌연변이 설계 세트의 라이브러리를 이용하여 Mab1과 Mab2를 고려한 이중특이적 항체의 산출.
한 구체예에서, 각각 항원 결합 단편 Fab1 및 Fab2를 포함하는 2개의 정준 항체 Mab1과 Mab2를 고려한 이중특이적 항체를 선별적으로 형성하는 것을 목표로 하는 이중특이적 항체 돌연변이 설계 세트가 본원에서 제공된다. 설계 세트는 각각 Fab1, Fab2 및 Fc에 상응하는 동계 돌연변이로 구성된다. 돌연변이는 Fab2의 경쟁하는 경쇄와 중쇄의 존재에서 이들 두 절대 사슬 사이에 선별적인 짝짓기를 달성하기 위해 Fab1의 경쇄와 중쇄의 경계면에서 도입된다. 선별적인 짝짓기는 비절대 사슬 쌍에 대한 불리한 경계면 상호작용에서 이들 돌연변이된 잔기를 수반하면서, 경계면에서 일정한 핫스팟 프레임워크 잔기 사이에 입체, 소수성 또는 정전 상보성의 기초에서 2개의 절대 경쇄와 중쇄에서 우호적인 상보성 돌연변이를 도입함으로써 달성된다. 각 설계 세트에서 선별적인 짝짓기 돌연변이는 또한, Fab1의 경쟁하는 경쇄와 중쇄의 존재에서 이들 두 절대 사슬 사이에 선별적인 짝짓기를 달성하기 위해 Fab2의 경쇄와 중쇄의 경계면에서 도입될 수 있다. 이들 돌연변이는 Fab1로부터 경쇄와 Fab2의 중쇄의 틀린짝짓기 및 그 반대를 감소시키는 것을 목표로 한다. 돌연변이는 2개의 상이한 중쇄를 포함하는 비대칭 항체 분자를 형성하는 중쇄의 선별적인 짝짓기를 달성하기 위해 Fc 경계면에서 도입된다.
항체의 경쇄와 중쇄의 일정한 경계면 잔기 위치에서 가공은 유해한 효과, 예를 들면, 상기 항체의 항원 결합 친화성, 안정성, 용해도, 응집 성향 등에서 상실을 종종 야기할 수 있다. 다수의 관련된 성질, 예를 들면, kon와 koff 비율, 융해 온도 (Tm), 스트레스 조건, 예를 들면, 산, 염기, 산화작용, 동결/해동, 교반, 압력 등에 대한 안정성이 영향을 받을 수 있다. 이것은 종종, 관심되는 항체의 상보성 결정 영역 (CDR's)에 의해 충격을 받는다. 항체의 CDR이 일반적으로 동일하지 않다는 점을 고려하면, 돌연변이 설계 세트의 충격은 모든 항체를 교차하여 동일하지 않을 수 있다. 다른 구체예에서, 이중특이적 항체 돌연변이 설계 세트의 라이브러리를 구성하는 다수의 상이한 이중특이적 돌연변이 설계 세트가 규정되는데, 이들은 경계면에서 상이한 핫스팟 위치에서 돌연변이를 수반한다. 이런 이중특이적 항체 돌연변이 설계 세트의 라이브러리는 표 30에서 도시된다. 임의의 2가지 가용한 항체 Mab1과 Mab2를 고려하여, 부정확하게 짝짓기된 항체-유사 구조를 내포하는 다른 오염체에 비하여 지정된 순도를 갖는 이중특이적 항체를 창출하는 방법이 본원에서 제공된다. Mab1과 Mab2의 경쇄와 중쇄는 각 돌연변이 설계 세트의 동계 돌연변이를 도입한 후 공동발현되고, 그리고 발현된 항체 산물은 단백질 산물에서 발현된 다른 Mab 유사 종류에 비하여 바람직한 이중특이적 항체의 순도를 추정하기 위해 분석적으로 스크리닝된다. 일부 구체예에서 분석적 스크리닝 절차는 LC-MS 기술에 기초될 수 있다. 일부 구체예에서 분석적 스크리닝 절차는 전하 기초된 분리, 예를 들면, 모세관 등전 초점조절 (cIEF) 기술에 기초될 수 있다. 스크리닝 기술의 실례는 SMCA 절차에 기초하여 실시예 13에서 제공된다. 일부 구체예에서 이중특이적 항체의 지정된 순도는 발현된 단백질 산물에서 모든 획득된 Mab 유사 종류의 70%보다 큰 것으로 규정된다. 일부 구체예에서 이중특이적 항체의 지정된 순도는 발현된 단백질 산물에서 모든 획득된 Mab 유사 종류의 90%보다 큰 것으로 규정된다. Mab1과 Mab2를 고려한 이중특이적 Mab 설계 세트의 제조와 선별을 위한 절차는 도면 19에서 개략적으로 도시된다.
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 본원에서 참조로서 편입되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 지시되는 것과 동일한 정도로 본 명세서 내로 참조로서 편입된다.
본 발명이 특히, 바람직한 구체예 및 다양한 교체 구체예에 관하여 도시되고 설명되었지만, 형태와 상세에서 다양한 변화가 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 그 안에 만들어질 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다.
본 명세서의 본문 내에서 인용된 모든 참고문헌, 허여된 특허 및 특허 출원은 모든 점에서 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다.
Figure 112021065197780-pat00019
Figure 112021065197780-pat00020
Figure 112021065197780-pat00021
Figure 112021065197780-pat00022
Figure 112021065197780-pat00023
Figure 112021065197780-pat00024
Figure 112021065197780-pat00025
Figure 112021065197780-pat00026
Figure 112021065197780-pat00027
Figure 112021065197780-pat00028
Figure 112021065197780-pat00029
Figure 112021065197780-pat00030
Figure 112021065197780-pat00031
Figure 112021065197780-pat00032
Figure 112021065197780-pat00033
Figure 112021065197780-pat00034
Figure 112021065197780-pat00035
Figure 112021065197780-pat00036
Figure 112021065197780-pat00037
Figure 112021065197780-pat00038
Figure 112021065197780-pat00039
Figure 112021065197780-pat00040
Figure 112021065197780-pat00041
Figure 112021065197780-pat00042
Figure 112021065197780-pat00043
Figure 112021065197780-pat00044
Figure 112021065197780-pat00045
Figure 112021065197780-pat00046
Figure 112021065197780-pat00047
Figure 112021065197780-pat00048
Figure 112021065197780-pat00049
Figure 112021065197780-pat00050
Figure 112021065197780-pat00051
Figure 112021065197780-pat00052
Figure 112021065197780-pat00053
Figure 112021065197780-pat00054
Figure 112021065197780-pat00055
Figure 112021065197780-pat00056
Figure 112021065197780-pat00057
Figure 112021065197780-pat00058
Figure 112021065197780-pat00059
Figure 112021065197780-pat00060
Figure 112021065197780-pat00061
Figure 112021065197780-pat00062
Figure 112021065197780-pat00063
Figure 112021065197780-pat00064
Figure 112021065197780-pat00065
Figure 112021065197780-pat00066
Figure 112021065197780-pat00067
Figure 112021065197780-pat00068
Figure 112021065197780-pat00069
Figure 112021065197780-pat00070
Figure 112021065197780-pat00071
Figure 112021065197780-pat00072
Figure 112021065197780-pat00073
Figure 112021065197780-pat00074
Figure 112021065197780-pat00075
Figure 112021065197780-pat00076
Figure 112021065197780-pat00077
Figure 112021065197780-pat00078
Figure 112021065197780-pat00079
Figure 112021065197780-pat00080
Figure 112021065197780-pat00081
Figure 112021065197780-pat00082
Figure 112021065197780-pat00083
Figure 112021065197780-pat00084
Figure 112021065197780-pat00085
Figure 112021065197780-pat00086
Figure 112021065197780-pat00087
Figure 112021065197780-pat00088
Figure 112021065197780-pat00089
Figure 112021065197780-pat00090
Figure 112021065197780-pat00091
Figure 112021065197780-pat00092
Figure 112021065197780-pat00093
Figure 112021065197780-pat00094
Figure 112021065197780-pat00095
Figure 112021065197780-pat00096
Figure 112021065197780-pat00097
Figure 112021065197780-pat00098
Figure 112021065197780-pat00099
Figure 112021065197780-pat00100
Figure 112021065197780-pat00101
Figure 112021065197780-pat00102
Figure 112021065197780-pat00103
Figure 112021065197780-pat00104
Figure 112021065197780-pat00105
Figure 112021065197780-pat00106
Figure 112021065197780-pat00107
Figure 112021065197780-pat00108
Figure 112021065197780-pat00109
Figure 112021065197780-pat00110
Figure 112021065197780-pat00111
Figure 112021065197780-pat00112
Figure 112021065197780-pat00113
Figure 112021065197780-pat00114
Figure 112021065197780-pat00115
Figure 112021065197780-pat00116
Figure 112021065197780-pat00117
Figure 112021065197780-pat00118
Figure 112021065197780-pat00119
Figure 112021065197780-pat00120
Figure 112021065197780-pat00121
Figure 112021065197780-pat00122
Figure 112021065197780-pat00123
Figure 112021065197780-pat00124
Figure 112021065197780-pat00125
Figure 112021065197780-pat00126
Figure 112021065197780-pat00127
Figure 112021065197780-pat00128
Figure 112021065197780-pat00129
Figure 112021065197780-pat00130
Figure 112021065197780-pat00131
Figure 112021065197780-pat00132
Figure 112021065197780-pat00133
Figure 112021065197780-pat00134
Figure 112021065197780-pat00135
Figure 112021065197780-pat00136
Figure 112021065197780-pat00137
Figure 112021065197780-pat00138
Figure 112021065197780-pat00139
Figure 112021065197780-pat00140
Figure 112021065197780-pat00141
Figure 112021065197780-pat00142
Figure 112021065197780-pat00143
Figure 112021065197780-pat00144
Figure 112021065197780-pat00145
Figure 112021065197780-pat00146
Figure 112021065197780-pat00147
Figure 112021065197780-pat00148
Figure 112021065197780-pat00149
Figure 112021065197780-pat00150
Figure 112021065197780-pat00151
Figure 112021065197780-pat00152
Figure 112021065197780-pat00153
Figure 112021065197780-pat00154
Figure 112021065197780-pat00155
Figure 112021065197780-pat00156
Figure 112021065197780-pat00157
Figure 112021065197780-pat00158
Figure 112021065197780-pat00159
Figure 112021065197780-pat00160
Figure 112021065197780-pat00161
Figure 112021065197780-pat00162
Figure 112021065197780-pat00163
Figure 112021065197780-pat00164
Figure 112021065197780-pat00165
Figure 112021065197780-pat00166
Figure 112021065197780-pat00167
Figure 112021065197780-pat00168
Figure 112021065197780-pat00169
Figure 112021065197780-pat00170
Figure 112021065197780-pat00171
Figure 112021065197780-pat00172
Figure 112021065197780-pat00173
Figure 112021065197780-pat00174
Figure 112021065197780-pat00175
Figure 112021065197780-pat00176
Figure 112021065197780-pat00177
Figure 112021065197780-pat00178
Figure 112021065197780-pat00179
Figure 112021065197780-pat00180
Figure 112021065197780-pat00181
Figure 112021065197780-pat00182
Figure 112021065197780-pat00183
Figure 112021065197780-pat00184
Figure 112021065197780-pat00185
Figure 112021065197780-pat00186
Figure 112021065197780-pat00187
Figure 112021065197780-pat00188
Figure 112021065197780-pat00189
Figure 112021065197780-pat00190
Figure 112021065197780-pat00191
Figure 112021065197780-pat00192
Figure 112021065197780-pat00193
Figure 112021065197780-pat00194
Figure 112021065197780-pat00195
Figure 112021065197780-pat00196
Figure 112021065197780-pat00197
Figure 112021065197780-pat00198
Figure 112021065197780-pat00199
Figure 112021065197780-pat00200
Figure 112021065197780-pat00201
Figure 112021065197780-pat00202
Figure 112021065197780-pat00203
Figure 112021065197780-pat00204
Figure 112021065197780-pat00205
Figure 112021065197780-pat00206
Figure 112021065197780-pat00207
Figure 112021065197780-pat00208
Figure 112021065197780-pat00209
Figure 112021065197780-pat00210
Figure 112021065197780-pat00211
Figure 112021065197780-pat00212
Figure 112021065197780-pat00213
Figure 112021065197780-pat00214
Figure 112021065197780-pat00215
Figure 112021065197780-pat00216
Figure 112021065197780-pat00217
Figure 112021065197780-pat00218
Figure 112021065197780-pat00219
Figure 112021065197780-pat00220
Figure 112021065197780-pat00221
Figure 112021065197780-pat00222
Figure 112021065197780-pat00223
Figure 112021065197780-pat00224
Figure 112021065197780-pat00225
Figure 112021065197780-pat00226
Figure 112021065197780-pat00227
Figure 112021065197780-pat00228
Figure 112021065197780-pat00229
Figure 112021065197780-pat00230
Figure 112021065197780-pat00231
Figure 112021065197780-pat00232
Figure 112021065197780-pat00233
Figure 112021065197780-pat00234
Figure 112021065197780-pat00235
Figure 112021065197780-pat00236
Figure 112021065197780-pat00237
Figure 112021065197780-pat00238
Figure 112021065197780-pat00239
Figure 112021065197780-pat00240
Figure 112021065197780-pat00241
Figure 112021065197780-pat00242
Figure 112021065197780-pat00243
Figure 112021065197780-pat00244
Figure 112021065197780-pat00245
Figure 112021065197780-pat00246
Figure 112021065197780-pat00247
Figure 112021065197780-pat00248
Figure 112021065197780-pat00249
Figure 112021065197780-pat00250
Figure 112021065197780-pat00251
Figure 112021065197780-pat00252
Figure 112021065197780-pat00253
Figure 112021065197780-pat00254
Figure 112021065197780-pat00255
SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> ENGINEERED IMMUNOGLOBULIN HEAVY CHAIN-LIGHT CHAIN PAIRS AND USES THEREOF <130> V87006WO <140> PCT/CA2013/050914 <141> 2013-11-28 <150> 61/869,200 <151> 2013-08-23 <150> 61/818,874 <151> 2013-05-02 <150> 61/761,641 <151> 2013-02-06 <150> 61/730,906 <151> 2012-11-28 <160> 85 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 2 His His His His His His 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic Penta His tag <400> 3 His His His His His 1 5 <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 5 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 6 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 7 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 8 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Glu Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Leu Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 9 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 10 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 11 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 12 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 12 gccaccatgg ccgtgatggc tcctagaacc ctggtgctgc tgctgtctgg agctctggct 60 ctgactcaga cctgggctgg agaggtgcag ctggtggaaa gcggaggagg actggtgcag 120 ccaggaggat ctctgcgact gagttgcgcc gcttcaggat tcaacatcaa ggacacctac 180 attcactggg tgcgacaggc tccaggaaaa ggactggagt gggtggctcg aatctatccc 240 actaatggat acacccggta tgccgactcc gtgaagggga ggtttactat tagcgccgat 300 acatccaaaa acactgctta cctgcagatg aacagcctgc gagccgaaga taccgctgtg 360 tactattgca gtcgatgggg aggagacgga ttctacgcta tggattattg gggacagggg 420 accctggtga cagtgagctc cgcctctacc aagggcccca gtgtgtttcc cctggctcct 480 tctagtaaat ccacctctgg agggacagcc gctctgggat gtctggtgaa ggactatttc 540 cccgagcctg tgaccgtgag ttggaactca ggcgccctga caagcggagt gcacactttt 600 cctgctgtgc tgcagtcaag cgggctgtac tccctgtcct ctgtggtgac agtgccaagt 660 tcaagcctgg gcacacagac ttatatctgc aacgtgaatc ataagccctc aaatacaaaa 720 gtggacaaga aagtggagcc caagagctgt gataagaccc acacctgccc tccctgtcca 780 gctccagaac tgctgggagg acctagcgtg ttcctgtttc cccctaagcc aaaagacact 840 ctgatgattt ccaggactcc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggac 900 cccgaagtga agttcaactg gtacgtggat ggcgtggaag tgcataatgc taagacaaaa 960 ccaagagagg aacagtacaa ctccacttat cgcgtcgtga gcgtgctgac cgtgctgcac 1020 caggactggc tgaacgggaa ggagtataag tgcaaagtca gtaataaggc cctgcctgct 1080 ccaatcgaaa aaaccatctc taaggccaaa ggccagccaa gggagcccca ggtgtacaca 1140 ctgccaccca gcagagacga actgaccaag aaccaggtgt ccctgacatg tctggtgaaa 1200 ggcttctatc ctagtgatat tgctgtggag tgggaatcaa atggacagcc agagaacaat 1260 tacaagacca cacctccagt gctggacagc gatggcagct tcttcctgta ttccaagctg 1320 acagtggata aatctcgatg gcagcagggg aacgtgttta gttgttcagt gatgcatgaa 1380 gccctgcaca atcattacac tcagaagagc ctgtccctgt ctcccggctg a 1431 <210> 13 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 13 gccactatgg ctgtgatggc ccctaggacc ctggtgctgc tgctgtccgg agctctggct 60 ctgactcaga cctgggctgg agacatccag atgacccagt ctccatcctc cctgtctgca 120 tctgtaggag acagagtcac catcacttgc cgggcaagtc aggacgttaa caccgctgta 180 gcttggtatc agcagaaacc agggaaagcc cctaagctcc tgatctattc tgcatccttt 240 ttgtacagtg gggtcccatc aaggttcagt ggcagtcgat ctgggacaga tttcactctc 300 accatcagca gtctgcaacc tgaagatttt gcaacttact actgtcaaca gcattacact 360 accccaccca ctttcggcca agggaccaaa gtggagatca aacgaactgt ggctgcacca 420 tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480 tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540 ctccaatcgg gtaactccca agagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600 agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660 tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720 tgttga 726 <210> 14 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 14 gccaccatgg ccgtgatggc tcctagaaca ctggtcctgc tgctgtcagg ggcactggca 60 ctgactcaga cttgggctgg ggaggtccag ctggtccagt ccggaggagg actggtgaag 120 cctggaggga gtctgcgact gtcatgcgcc gctagcgggt tcacctttag ctcctacagc 180 atgaactggg tgcgacaggc accaggcaaa ggactggaat gggtgtctag tatctcaagc 240 tcctctagtt acatctacta tgcagacagc gtgaagggcc ggttcaccat cagcagagat 300 aacgccaaaa attccctgta tctgcagatg aacagcctgc gagccgagga caccgctgtc 360 tactattgcg cacgggtgac agacgccttc gatatttggg gacagggcac catggtcaca 420 gtgtcaagcg cctccaccaa gggaccaagc gtgttcccac tggctccatc ctctaaaagc 480 acttccggag gaaccgcagc cctgggatgt ctggtgaagg attacttccc agagcccgtc 540 acagtgtcat ggaacagcgg ggctctgacc tctggagtcc acacatttcc agcagtgctg 600 cagagttcag gactgtacag cctgagctcc gtggtcacag tgccctctag ttcactgggc 660 actcagacct atatctgcaa cgtgaatcac aagccaagca atactaaagt cgacaagaaa 720 gtggaaccca agtcctgtga taaaacacat acttgcccac cttgtcctgc accagagctg 780 ctgggaggac catccgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacactct gatgatttct 840 aggacacccg aagtcacttg cgtggtcgtg gacgtgagcc acgaggaccc cgaagtcaag 900 tttaactggt acgtggatgg cgtcgaggtg cataatgcta agacaaaacc tagggaggaa 960 cagtacaaca gtacatatag agtcgtgtca gtcctgactg tgctgcatca ggactggctg 1020 aacggaaagg aatataagtg caaagtgagc aataaggctc tgcccgcacc tatcgagaaa 1080 actatttcca aggctaaagg ccagcctaga gaaccacagg tgtacaccct gcctccatct 1140 agggacgagc tgactaagaa ccaggtcagt ctgacctgtc tggtgaaagg cttctatcct 1200 agcgatatcg cagtggagtg ggaatccaat gggcagccag agaacaatta caagaccaca 1260 ccccctgtgc tggactccga tgggtctttc tttctgtata gtaagctgac cgtcgataaa 1320 tcacggtggc agcagggaaa cgtgttcagc tgtagtgtca tgcacgaagc actgcacaat 1380 cattacaccc agaagagcct gtcactgtca cccggatga 1419 <210> 15 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 gccaccatgg ctgtgatggc acctagaaca ctggtcctgc tgctgtccgg ggcactggca 60 ctgactcaga cttgggctgg cgatattcag atgacccaga gtccaagctc cgtgtccgcc 120 tctatcggcg accgagtcac cattacatgc agagctagcc agggcatcga taactggctg 180 gggtggtacc agcagaagcc tggaaaagcc ccaaagctgc tgatctacga cgcttccaat 240 ctggatacag gcgtgccctc taggttcagt ggctcaggga gcggaactta ctttactctg 300 accatctcta gtctgcaggc tgaggacttc gcagtgtatt tttgccagca ggcaaaagcc 360 ttccccccta cctttggcgg gggaacaaaa gtcgacatca aggggaccgt ggccgctccc 420 tcagtcttca tttttccacc cagcgatgag cagctgaagt ctggaacagc cagtgtggtc 480 tgtctgctga acaatttcta ccctcgggaa gcaaaagtgc agtggaaggt cgacaacgcc 540 ctgcagtccg gcaacagcca ggagagtgtg actgaacagg actcaaaaga tagcacctat 600 tccctgtcaa gcacactgac tctgtccaag gctgattacg aaaagcacaa agtgtatgca 660 tgtgaggtca cccatcaggg gctgtcaagt ccagtcacaa aaagtttcaa ccgaggagag 720 tgctga 726 <210> 16 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 16 gccacaatgg ccgtgatggc tcctagaaca ctggtcctgc tgctgtccgg ggctctggct 60 ctgactcaga cttgggctgg ggaggtgcag ctggtcgaat ctggaggagg actggtgcag 120 ccaggagggt cactgagact gagctgcgcc gcttccggct tcaacatcaa ggagtactat 180 atgcactggg tgaggcaggc acctggcaaa ggactggagt gggtgggact gatcgaccca 240 gaacagggga acaccatcta cgaccctaag tttcaggata gggcaaccat ttctgccgac 300 aacagtaaaa atacagctta tctgcagatg aacagcctga gggctgaaga tactgcagtg 360 tactattgcg cacgcgacac cgcagcctac ttcgattatt ggggacaggg caccctggtc 420 acagtgagct ccgcatcaac taagggaccc agcgtgtttc cactggcccc ctctagtaaa 480 tccacttctg gaggcaccgc tgcactgggc tgtctggtga aggattactt cccagagccc 540 gtcacagtga gctggaactc cggggccctg accagcggag tccatacatt tcctgctgtg 600 ctgcagtcaa gcgggctgta ctccctgtcc tctgtggtca ccgtgccaag ttcaagcctg 660 ggaactcaga cctatatctg caacgtgaat cacaagcctt caaatacaaa agtcgacaag 720 aaagtggaac caaagagctg tgataaaaca catacttgcc caccttgtcc tgcaccagag 780 ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt ccacccaagc ccaaagacac cctgatgatt 840 tcccgcacac cagaagtcac ttgcgtggtc gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagttcaact ggtacgtgga tggcgtcgag gtgcataatg ccaagacaaa accccgggag 960 gaacagtaca actccacata tagagtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggactgg 1020 ctgaacggga aggagtataa gtgcaaagtg agtaataagg ccctgcccgc tcctatcgag 1080 aaaacaatta gcaaggccaa aggccagcct cgagaaccac aggtgtacac tctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgactaa gaaccaggtc agtctgacct gtctggtgaa aggattctat 1200 cccagcgata tcgctgtgga gtgggaatcc aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc 1260 acaccccctg tgctggactc tgatggcagt ttctttctgt atagtaagct gaccgtcgat 1320 aaatcacgat ggcagcaggg gaacgtgttc agctgttcag tgatgcacga agccctgcac 1380 aaccattaca cccagaagag cctgagcctg tctcccggct ga 1422 <210> 17 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 17 gccacaatgg ctgtgatggc accccgaacc ctggtcctgc tgctgagtgg agcactggca 60 ctgacccaga catgggcagg cgacatccag atgacacagt cccctagctc cctgagtgcc 120 tcagtggggg acagagtcac tatcacctgc cgggcttcca gagatattaa gtcttacctg 180 aactggtatc agcagaagcc aggcaaagca cccaaggtgc tgatctacta tgccaccagt 240 ctggctgaag gagtgccttc acggttcagc ggctccgggt ctggaactga ctacacactg 300 actatttcta gtctgcagcc tgaggatttc gctacctact attgcctgca gcacggcgaa 360 tccccatgga cttttggcca ggggaccaaa gtggagatca agaggacagt ggccgctcca 420 tccgtcttca tttttccccc ttctgacgaa cagctgaaat caggaactgc cagcgtggtc 480 tgtctgctga acaatttcta cccccgcgag gcaaaagtgc agtggaaggt cgataacgcc 540 ctgcagagtg gcaattcaca ggagagcgtg acagaacagg actccaaaga ttctacttat 600 agtctgtcaa gcaccctgac actgtctaag gctgattacg agaagcacaa agtgtatgca 660 tgcgaagtca cccatcaggg gctgtcctct cccgtgacaa agagctttaa tcggggagag 720 tgttga 726 <210> 18 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 18 gccacaatgg ctgtgatggc tccaagaacc ctggtcctgc tgctgtccgg ggctctggct 60 ctgactcaga cctgggccgg ggaagtgcag ctggtcgaat ctggaggagg actggtgcag 120 ccaggagggt ccctgcgcct gtcttgcgcc gctagtggct tcacttttac cgactacacc 180 atggattggg tgcgacaggc acctggaaag ggcctggagt gggtcgccga tgtgaaccca 240 aatagcggag gctccatcta caaccagcgg ttcaagggcc ggttcaccct gtcagtggac 300 cggagcaaaa acaccctgta tctgcagatg aatagcctgc gagccgaaga tactgctgtg 360 tactattgcg cccggaatct ggggccctcc ttctactttg actattgggg gcagggaact 420 ctggtcaccg tgagctccgc ctccaccaag ggaccttctg tgttcccact ggctccctct 480 agtaaatcca catctggggg aactgcagcc ctgggctgtc tggtgaagga ctacttccca 540 gagcccgtca cagtgtcttg gaacagtggc gctctgactt ctggggtcca cacctttcct 600 gcagtgctgc agtcaagcgg gctgtacagc ctgtcctctg tggtcaccgt gccaagttca 660 agcctgggaa cacagactta tatctgcaac gtgaatcaca agccatccaa tacaaaagtc 720 gacaagaaag tggaacccaa gtcttgtgat aaaacccata catgcccccc ttgtcctgca 780 ccagagctgc tgggaggacc aagcgtgttc ctgtttccac ccaagcctaa agatacactg 840 atgattagta ggaccccaga agtcacatgc gtggtcgtgg acgtgagcca cgaggacccc 900 gaagtcaagt ttaactggta cgtggacggc gtcgaggtgc ataatgccaa gactaaaccc 960 agggaggaac agtacaacag tacctatcgc gtcgtgtcag tcctgacagt gctgcatcag 1020 gattggctga acgggaaaga gtataagtgc aaagtgagca ataaggctct gcccgcacct 1080 atcgagaaaa caatttccaa ggcaaaagga cagcctagag aaccacaggt gtacactctg 1140 cctccatcaa gggatgagct gacaaagaac caggtcagcc tgacttgtct ggtgaaagga 1200 ttctatccct ctgacattgc tgtggagtgg gaaagtaatg gccagcctga gaacaattac 1260 aagaccacac cccctgtgct ggactcagat ggcagcttct ttctgtatag caagctgacc 1320 gtcgacaaat cccggtggca gcaggggaat gtgtttagtt gttcagtcat gcacgaggca 1380 ctgcacaacc attacaccca gaagtcactg tcactgtcac cagggtga 1428 <210> 19 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 19 gccacaatgg ctgtgatggc acctagaaca ctggtcctgc tgctgagcgg ggcactggca 60 ctgacacaga cttgggccgg ggatattcag atgacccagt ccccaagctc cctgagtgcc 120 tcagtgggcg accgagtcac catcacatgc aaggcttccc aggatgtgtc tattggagtc 180 gcatggtacc agcagaagcc aggcaaagca cccaagctgc tgatctatag cgcctcctac 240 cggtataccg gcgtgccctc tagattctct ggcagtgggt caggaacaga ctttactctg 300 accatctcta gtctgcagcc tgaggatttc gctacctact attgccagca gtactatatc 360 tacccatata cctttggcca ggggacaaaa gtggagatca agaggactgt ggccgctccc 420 tccgtcttca tttttccccc ttctgacgaa cagctgaaaa gtggcacagc cagcgtggtc 480 tgtctgctga acaatttcta ccctcgcgaa gccaaagtgc agtggaaggt cgataacgct 540 ctgcagagcg gcaacagcca ggagtctgtg actgaacagg acagtaaaga ttcaacctat 600 agcctgtcaa gcacactgac tctgagcaag gcagactacg agaagcacaa agtgtatgcc 660 tgcgaagtca cacatcaggg gctgtcctct cctgtgacta agagctttaa cagaggagag 720 tgttga 726 <210> 20 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Glu Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Leu Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 21 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 22 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 22 Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asn Asp Asp Lys Arg Tyr Ser Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala His Arg 100 <210> 23 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 24 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 25 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 26 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 50 55 60 Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn 65 70 75 80 Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Arg 100 <210> 27 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Asn Pro Thr Tyr Ala Gln Gly Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 28 Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 1 5 10 15 Val Ser Ser <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 29 Ala Glu Tyr Phe Gln His Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 30 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 30 Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 1 5 10 15 Ser <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 31 Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 32 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 34 Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 1 5 10 15 Thr Val Ser Ser 20 <210> 35 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro 85 90 95 <210> 36 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro 85 90 95 <210> 37 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro 100 <210> 38 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 <210> 39 <211> 101 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Thr Pro 100 <210> 40 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 40 Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Ala Phe Met Ser Ala Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Lys Val Asn Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 30 Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ile Phe Ile Ile 35 40 45 Gln Glu Ala Thr Thr Leu Val Pro Gly Ile Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Asn Ile Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Tyr Tyr Phe Cys Leu Gln His Asp Asn Phe Pro 85 90 95 <210> 41 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 42 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 43 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 44 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 45 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 46 Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 48 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 48 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Glu Ala Pro Arg Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly <210> 49 <211> 99 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Ser 85 90 95 Asn Asn Phe <210> 50 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 50 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala 20 25 30 Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gln Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ala 85 90 95 <210> 51 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Leu Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Leu Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Ile Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Glu His Ser Thr Tyr Thr 20 25 30 Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ser Pro Gln Tyr Ile Met 35 40 45 Lys Val Lys Ser Asp Gly Ser His Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp 50 55 60 Arg Phe Met Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Phe Ser 65 70 75 80 Asn Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Glu Tyr His Cys Gly Glu Ser His 85 90 95 Thr Ile Asp Gly Gln Val Gly 100 <210> 52 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Ser Ala Ser Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Ala Arg Leu Thr Cys Thr Leu Pro Ser Asp Ile Asn Val Gly Ser 20 25 30 Tyr Asn Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Tyr 35 40 45 Leu Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asp Ser Asp Lys Gly Gln Gly Ser Gly Val 50 55 60 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Thr Gly Ile 65 70 75 80 Leu Leu Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys 85 90 95 Met Ile Trp Pro Ser Asn Ala Ser 100 <210> 53 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser Ile Ala Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Gln Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45 Ile Tyr Glu Asp Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Ile Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly 65 70 75 80 Leu Lys Thr Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser 85 90 95 Ser Asn <210> 54 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Ala Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Tyr Pro Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ala 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Lys His Ser Trp Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly 85 90 95 Ala Gln <210> 55 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Tyr Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Thr 35 40 45 Leu Ile Tyr Ser Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Val Leu Tyr Met Gly Ser 85 90 95 Gly Ile <210> 56 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gly Tyr Ser Asn Tyr Lys 20 25 30 Val Asp Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Gly Pro Arg Phe Val Met 35 40 45 Arg Val Gly Thr Gly Gly Ile Val Gly Ser Lys Gly Asp Gly Ile Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Val Leu Gly Ser Gly Leu Asn Arg Tyr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Lys Asn Ile Gln Glu Glu Asp Glu Ser Asp Tyr His Cys Gly Ala Asp 85 90 95 His Gly Ser Gly Ser Asn Phe Val 100 <210> 57 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Gln Ala Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Lys Gly Leu Arg Gln 1 5 10 15 Thr Ala Thr Leu Thr Cys Thr Gly Asn Ser Asn Asn Val Gly Asn Gln 20 25 30 Gly Ala Ala Trp Leu Gln Gln His Gln Gly His Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ser Tyr Arg Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Ser Glu Arg Leu Ser 50 55 60 Ala Ser Arg Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ala Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Ala <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Ile Ile Leu 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Trp Val Phe Gly Glu Gly Thr Glu Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Asn Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 1 5 10 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 <210> 66 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val <210> 67 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 68 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 69 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Tyr Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 70 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 71 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 72 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Thr Ile Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val <210> 73 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 74 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Asn Phe Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val <210> 75 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 76 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 78 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 79 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Gly Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Arg Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Glu Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 81 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 82 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 83 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45 Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 84 <211> 104 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 65 70 75 80 Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 85 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Ala Val Lys Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val 35 40 45 Asn Thr Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80 His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu 85 90 95 Lys Thr Val Ala Ala Thr Glu Cys Ser 100 105

Claims (23)

  1. 최소한 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체를 포함하는 단리된 항원 결합 폴리펩티드 구조체로서,
    첫 번째 이형이합체는 첫 번째 인간 또는 인간화 면역글로불린 G (IgG) 중쇄 폴리펩티드 서열 (H1) 및 첫 번째 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L1)을 포함하고, 첫 번째 에피토프에 결합하며; 두 번째 이형이합체는 두 번째 인간 또는 인간화 면역글로불린 G (IgG) 중쇄 폴리펩티드 서열 (H2) 및 두 번째 인간 또는 인간화 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 (L2)을 포함하고, 두 번째 에피토프에 결합하며,
    여기서 첫 번째 이형이합체의 H1 또는 L1 서열 중 최소한 하나는 두 번째 이형이합체의 상응하는 H2 또는 L2 서열과 상이하고, H1 및 H2의 각각은 중쇄 가변 도메인 (VH 도메인) 및 중쇄 불변 도메인 (CH1 도메인)을 포함하고, L1 및 L2의 각각은 경쇄 가변 도메인 (VL 도메인) 및 경쇄 불변 도메인 (CL 도메인)을 포함하고;
    여기서 H1, L1, H2 및 L2는, L2와 비교한 H1의 L1과의 우선적 짝짓기 및 L1과 비교한 H2의 L2와의 우선적 짝짓기를 증진시키는, 카바트(Kabat) 넘버링 시스템에 따라 확인되는 위치에서의 하기 아미노산 치환을 포함하고:
    b) H1은 아미노산 치환 145L 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 146G 및 179K를 포함하고, L2는 아미노산 치환 124E, 160E 및 180E를 포함하거나;
    c) H1은 아미노산 치환 145T 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 186R을 포함하고, L2는 아미노산 치환 160E 및 180E를 포함하거나;
    e) H1은 아미노산 치환 145L 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 186R을 포함하고, L2는 아미노산 치환 124E, 160E 및 180E를 포함하거나;
    f) H1은 아미노산 치환 139W, 145T 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 116A 및 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 186R을 포함하고, L2는 아미노산 치환 135W, 160E 및 180E를 포함하거나,
    g) H1은 아미노산 치환 37W, 145T 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 98A 및 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 186R을 포함하고, L2는 아미노산 치환 98W, 160E 및 180E를 포함하거나,
    h) H1은 아미노산 치환 37W, 145T 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 98A 및 131K를 포함하고, L2는 아미노산 치환 98W를 포함하거나,
    i) H1은 아미노산 치환 145L 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 131K를 포함하고, H2는 아미노산 치환 186R을 포함하고, L2는 아미노산 치환 124E, 160E 및 178D를 포함하거나, 또는
    j) H1은 아미노산 치환 145L 및 179E를 포함하고, L1은 아미노산 치환 131K를 포함함;
    여기서 L1 및 L2 둘 다가 H1 및 H2 중 최소한 하나와 공동발현될 때, H1-L2에 대한 H1-L1의 짝짓기 및 H2-L1에 대한 H2-L2의 짝짓기는 아미노산 치환 부재 시의 H1-L2에 대한 H1-L1의 짝짓기 및 H2-L1에 대한 H2-L2의 짝짓기보다 큰 것인 구조체.
  2. 청구항 1에 있어서, H1, H2, L1 및 L2가 세포 또는 포유류 세포에서 공동발현되거나, H1, H2, L1 및 L2가 무세포 발현 시스템에서 공동발현되거나, H1, H2, L1 및 L2가 공동생산되거나, H1, H2, L1 및 L2가 산화환원 생산 시스템을 거쳐 공동생산되는 것인 구조체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 첫 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 및 두 번째 면역글로불린 경쇄 폴리펩티드 서열 중 최소한 하나가 카파 경쇄 폴리펩티드 서열인 구조체.
  4. 청구항 3에 있어서, 구조체가 2개의 CH3 서열을 포함하는 Fc를 추가로 포함하고, 여기서 Fc는 하나 이상의 링커로 또는 링커 없이 첫 번째 이형이합체 및 두 번째 이형이합체에 연계되는 것인 구조체.
  5. 청구항 4에 있어서, Fc가 인간 Fc, 인간 IgG1 Fc, 인간 IgA Fc, 인간 IgG Fc, 인간 IgD Fc, 인간 IgE Fc, 인간 IgM Fc, 인간 IgG2 Fc, 인간 IgG3 Fc 또는 인간 IgG4 Fc인 구조체.
  6. 청구항 5에 있어서, Fc가 이형이합체성 Fc인 구조체.
  7. 청구항 4에 있어서, Fc가 야생형 동종이합체성 Fc에 필적하는 안정성으로 이형이합체성 Fc의 형성을 증진하는 CH3 서열 중 최소한 하나에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 구조체.
  8. 청구항 7에 있어서, Fc가 인간 IgG Fc이고, 여기서
    a) CH3 서열 중 하나는 아미노산 치환 L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 다른 것은 아미노산 치환 T366L, K392M 및 T394W를 포함하거나;
    b) CH3 서열 중 하나는 아미노산 치환 L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 다른 것은 아미노산 치환 T366L, K392L 및 T394W를 포함하거나;
    c) CH3 서열 중 하나는 아미노산 치환 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 다른 것은 아미노산 치환 T350V, T366L, K392M 및 T394W를 포함하거나;
    d) CH3 서열 중 하나는 아미노산 치환 T350V, L351Y, F405A 및 Y407V를 포함하고, 다른 것은 아미노산 치환 T350V, T366L, K392L 및 T394W를 포함하거나; 또는
    e) CH3 서열 중 하나는 아미노산 치환 T350V, L351Y, S400E, F405A 및 Y407V를 포함하고, 다른 것은 아미노산 치환 T350V, T366L, N390R, K392M 및 T394W를 포함하고,
    여기서 CH3 서열의 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 시스템에 따른 것인 구조체.
  9. 청구항 4에 있어서, Fc가 최소한 하나의 CH2 서열을 추가로 포함하는 것인 구조체.
  10. 청구항 9에 있어서, Fc가 Fc-감마 수용체의 선별적인 결합을 증진하는 하나 이상의 변형을 포함하는 것인 구조체.
  11. 청구항 4에 있어서, 하나 이상의 링커가 하나 이상의 항체 힌지 영역 또는 하나 이상의 IgG1 힌지 영역을 포함하는 하나 이상의 폴리펩티드 링커인 구조체.
  12. 청구항 1 또는 2에 있어서, 다중특이적 또는 이중특이적인 것인 구조체.
  13. 청구항 1 또는 2에 있어서, 치료제 또는 약물에 접합된 것인 구조체.
  14. 청구항 1 또는 2의 구조체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 치료에 사용하기 위한 제약학적 조성물.
  15. 청구항 14에 있어서, 완충액, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트화제, 안정제 및 부형제로 구성되는 군에서 선별된 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 제약학적 조성물.
  16. 청구항 1 또는 2에 따른 구조체를 인코딩하는 최소한 하나의 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 세트.
  17. 청구항 16에 있어서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트가 cDNA인 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 세트.
  18. 청구항 16에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트.
  19. 청구항 18에 있어서, 플라스미드, 다중-시스트론 벡터, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유류 벡터, 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터로 구성되는 군에서 선별된 것인 벡터 또는 벡터의 세트.
  20. 청구항 16에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트, 또는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 중 하나 이상을 포함하는 벡터 또는 벡터의 세트를 포함하는 단리된 세포.
  21. 청구항 20에 있어서, 세포가 하이브리도마, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 HEK293 세포인 단리된 세포.
  22. 청구항 1 또는 2에 따른 구조체를 숙주 세포 배양액으로부터 획득하는 방법으로서,
    (a) 상기 구조체를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 최소한 하나의 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포 배양액을 획득하는 단계; 및
    (b) 상기 구조체를 숙주 세포 배양액으로부터 회수하는 단계
    를 포함하는 방법.
  23. 삭제
KR1020217017337A 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도 KR102411491B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227020444A KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261730906P 2012-11-28 2012-11-28
US61/730,906 2012-11-28
US201361761641P 2013-02-06 2013-02-06
US61/761,641 2013-02-06
US201361818874P 2013-05-02 2013-05-02
US61/818,874 2013-05-02
US201361869200P 2013-08-23 2013-08-23
US61/869,200 2013-08-23
PCT/CA2013/050914 WO2014082179A1 (en) 2012-11-28 2013-11-28 Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR1020157017124A KR102264570B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157017124A Division KR102264570B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227020444A Division KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210070401A KR20210070401A (ko) 2021-06-14
KR102411491B1 true KR102411491B1 (ko) 2022-06-22

Family

ID=50826996

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217017337A KR102411491B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
KR1020157017124A KR102264570B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
KR1020227020444A KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157017124A KR102264570B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
KR1020227020444A KR102545617B1 (ko) 2012-11-28 2013-11-28 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도

Country Status (12)

Country Link
US (3) US10077298B2 (ko)
EP (1) EP2925785A4 (ko)
JP (4) JP6347490B2 (ko)
KR (3) KR102411491B1 (ko)
CN (1) CN105026430A (ko)
AU (3) AU2013351888C1 (ko)
BR (1) BR112015012385A2 (ko)
CA (2) CA3206122A1 (ko)
HK (2) HK1217496A1 (ko)
MX (3) MX2015006758A (ko)
RU (1) RU2720472C2 (ko)
WO (1) WO2014082179A1 (ko)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
PT2635607T (pt) 2010-11-05 2019-12-11 Zymeworks Inc Design de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio do fc
NO2644698T3 (ko) 2010-11-17 2018-06-02
WO2012116927A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
AR085404A1 (es) 2011-02-28 2013-09-25 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno
JP6101638B2 (ja) 2011-03-03 2017-03-22 ザイムワークス，インコーポレイテッド 多価ヘテロマルチマー足場設計及び構築物
PT2773671T (pt) 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
WO2014012082A2 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Zymeworks Inc. Multivalent heteromultimer scaffold design an constructs
AU2013326974B2 (en) 2012-10-03 2019-01-03 Zymeworks Bc Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
KR102411491B1 (ko) 2012-11-28 2022-06-22 자임워크스 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
US9914785B2 (en) 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
JP6422956B2 (ja) 2013-10-11 2018-11-14 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性ドメイン交換共通可変軽鎖抗体
UA117289C2 (uk) * 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
US11306156B2 (en) * 2014-05-28 2022-04-19 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
EP3590961A1 (en) * 2015-03-25 2020-01-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
CN107787332B (zh) 2015-04-24 2022-09-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性抗原结合蛋白
CN106661121A (zh) * 2015-04-28 2017-05-10 酵活有限公司 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途
BR112017024610A2 (pt) 2015-06-24 2018-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag anticorpos para receptor antitransferrina com afinidade especificada
CA2991799A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Zymeworks Inc. Drug-conjugated bi-specific antigen-binding constructs
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
IL258317B1 (en) 2015-10-02 2024-08-01 Hoffmann La Roche Human anti–CD20/human transferrin receptor bispecific antibodies and methods of use
CN116396393A (zh) * 2015-10-08 2023-07-07 酵活英属哥伦比亚省公司 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途
CR20180365A (es) 2015-12-16 2018-09-28 Amgen Inc PROTEÍNAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO BISPECÍFICO DE ANTI-TL1A/ANTI-TNF-a Y SUS USOS
CN108779182A (zh) * 2015-12-28 2018-11-09 麻省理工学院 具有恒定区突变的双特异性抗体及其用途
CA3025162A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Mixtures of antibodies
TN2019000055A1 (en) * 2016-09-29 2020-07-15 Beijing Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Heterodimeric immunoglobulin constructs and preparation methods thereof
KR102247704B1 (ko) * 2016-11-18 2021-05-03 북경한미약품 유한공사 항 pd-1/항 her2 천연항체 구조 형태의 헤테로다이머 계의 이중특이성 항체 및 그 제조방법
CA3044416A1 (en) 2016-12-13 2018-06-21 Delinia, Inc. Multivalent regulatory t cell modulators
EP3585813A1 (en) 2017-02-22 2020-01-01 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/tim-3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
CN109922864B (zh) 2017-04-09 2022-03-22 轩竹生物科技股份有限公司 有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法
JOP20190222A1 (ar) 2017-04-11 2019-09-24 Zymeworks Inc الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لـ pd-l1 والمضادة لـ tim-3
WO2018213335A1 (en) 2017-05-16 2018-11-22 Scalmibio, Inc. Activatable antibodies and methods of use thereof
US20200079850A1 (en) 2017-05-24 2020-03-12 Sutro Biopharma, Inc. Pd-1/lag3 bi-specific antibodies, compositions thereof, and methods of making and using the same
CN110831978A (zh) * 2017-06-30 2020-02-21 酵活有限公司 稳定的嵌合fab
AR112603A1 (es) 2017-07-10 2019-11-20 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos inhibidores de punto de control
CN107602702A (zh) * 2017-09-22 2018-01-19 生标（上海）医疗器械科技有限公司 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的抗体及其应用
PE20210005A1 (es) * 2017-09-29 2021-01-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno multiespecifica que tiene actividad de sustitucion de la funcion de cofactor del factor viii de coagulacion de sangre (fviii) y formulacion farmaceutica que contiene tal molecula como ingrediente activo
WO2019153200A1 (zh) 2018-02-08 2019-08-15 北京韩美药品有限公司 抗pd-1/抗her2天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
WO2019199916A1 (en) * 2018-04-13 2019-10-17 Eli Lilly And Company Fab-based trispecific antibodies
WO2019229701A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
AU2019412561A1 (en) 2018-12-24 2021-08-12 Sanofi Multispecific binding proteins with mutant Fab domains
AU2020268399A1 (en) 2019-05-09 2021-10-28 Genentech, Inc. Methods of making antibodies
WO2020236797A1 (en) 2019-05-21 2020-11-26 Novartis Ag Variant cd58 domains and uses thereof
MX2021014164A (es) 2019-05-21 2022-01-04 Novartis Ag Moleculas de union a cd19 y usos de las mismas.
US20220396631A1 (en) 2019-05-21 2022-12-15 Lu HUANG Trispecific binding molecules against bcma and uses thereof
BR112022002067A2 (pt) 2019-08-08 2022-06-14 Regeneron Pharma Formatos de molécula de ligação ao antígeno
CN110428870B (zh) * 2019-08-08 2023-03-21 苏州泓迅生物科技股份有限公司 一种预测抗体重链轻链配对概率的方法及其应用
EP4054646A1 (en) 2019-11-05 2022-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. N-terminal scfv multispecific binding molecules
US20210188934A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Novel il2 agonists and methods of use thereof
CN113121696A (zh) * 2019-12-31 2021-07-16 周易 Fab改造诱导形成的双特异性抗体及其制备方法和用途
US20230128499A1 (en) 2020-03-27 2023-04-27 Novartis Ag Bispecific combination therapy for treating proliferative diseases and autoimmune diseases
US11673930B2 (en) 2020-05-12 2023-06-13 Regeneran Pharmaceuticals, Inc. IL10 agonists and methods of use thereof
JP2023544890A (ja) 2020-10-13 2023-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 分化抗原群ｉｖ及び／又はｖｉｉｉを調節するための生物工学的に作製されたｔ細胞媒介免疫、材料及び他の方法
WO2022097061A1 (en) 2020-11-06 2022-05-12 Novartis Ag Anti-cd19 agent and b cell targeting agent combination therapy for treating b cell malignancies
MX2023005353A (es) 2020-11-06 2023-05-22 Novartis Ag Moleculas de union a cd19 y usos de las mismas.
CN117203228A (zh) * 2021-01-11 2023-12-08 阿迪马布有限责任公司 被工程化为优先进行链配对的变体ch1结构域和变体cl结构域以及包括所述变体ch1结构域和所述变体cl结构域的多特异性抗体
EP4334353A1 (en) 2021-05-04 2024-03-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific fgf21 receptor agonists and their uses
CN117597365A (zh) 2021-05-04 2024-02-23 再生元制药公司 多特异性fgf21受体激动剂及其应用
KR20240035845A (ko) 2021-07-19 2024-03-18 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. Il12 수용체 효능제 및 그의 사용 방법
US20230110958A1 (en) 2021-08-16 2023-04-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il27 receptor agonists and methods of use thereof
CN118265726A (zh) * 2021-08-25 2024-06-28 广州凌腾生物医药有限公司 异源二聚体免疫球蛋白
AU2022383847A1 (en) 2021-11-11 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cd20-pd1 binding molecules and methods of use thereof
WO2023220647A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multispecific binding molecule proproteins and uses thereof
US20230382969A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
TW202413441A (zh) 2022-05-27 2024-04-01 英商葛蘭素史密斯克藍智慧財產發展有限公司 TNF-α結合蛋白及IL-7結合蛋白於醫藥治療之用途
WO2023235848A1 (en) 2022-06-04 2023-12-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interleukin-2 proproteins and uses thereof
WO2024040247A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon proproteins and uses thereof
US20240067691A1 (en) 2022-08-18 2024-02-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Interferon receptor agonists and uses thereof
WO2024110905A1 (en) 2022-11-24 2024-05-30 Beigene, Ltd. Anti-cea antibody drug conjugates and methods of use
WO2024130175A2 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antigen-binding molecules that bind to aav particles and uses
US20240247069A1 (en) 2023-01-13 2024-07-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fgfr3 binding molecules and methods of use thereof
WO2024151978A1 (en) 2023-01-13 2024-07-18 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Il12 receptor agonists and methods of use thereof
WO2024153168A2 (en) 2023-01-19 2024-07-25 Beigene, Ltd. Anti-cmet antibodies and methods of use
US20240287162A1 (en) 2023-02-28 2024-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent anti-spike protein binding molecules and uses thereof
US20240309072A1 (en) 2023-02-28 2024-09-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multivalent anti-spike protein binding molecules and uses thereof
US20240287186A1 (en) 2023-02-28 2024-08-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. T cell activators and methods of use thereof
WO2024183636A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Cd16a antibodies and methods of use
WO2024183637A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Muc1 antibodies and methods of use
WO2024183635A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Beigene, Ltd. Muc1 and cd16a antibodies and methods of use
WO2024184812A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 antibodies and methods of use
WO2024184810A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cldn6 and anti-cd3 multispecific antibodies and methods of use
WO2024184811A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Beigene Switzerland Gmbh Anti-cd3 multispecific antibodies and methods of use

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2012131555A2 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Hetero-dimeric immunoglobulins

Family Cites Families (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US731168A (en) 1902-06-16 1903-06-16 Clarence L Eaton Heel-seat and counter beating machine.
FI85768C (fi) 1990-07-04 1992-05-25 Valtion Teknillinen Foerfarande foer utfoerning av ytplasmonresonansmaetning samt i foerfarandet anvaendbar givare.
DE69110032T2 (de) 1991-06-08 1995-12-21 Hewlett Packard Gmbh Verfahren und Gerät zur Feststellung und/oder Konzentrationsbestimmung von Biomolekülen.
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
KR100497017B1 (ko) 1996-03-22 2005-11-29 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 고사유도분자ii
GB9623820D0 (en) 1996-11-16 1997-01-08 Secr Defence Surface plasma resonance sensor
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US7951917B1 (en) 1997-05-02 2011-05-31 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
ATE283364T1 (de) 1998-01-23 2004-12-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Mehrzweck-antikörperderivate
JP2002518663A (ja) 1998-05-20 2002-06-25 グラッフィニティ ファルマシューティカル デザイン ゲーエムベーハー 液体状態で存在する多数の試料を同時に測定するためのｓｐｒセンサー
US6289286B1 (en) 1998-05-29 2001-09-11 Biacore Ab Surface regeneration of biosensors and characterization of biomolecules associated therewith
EP1461674A4 (en) 2001-12-03 2007-10-24 Dyax Corp LIBRARY SCREENING
US20050069549A1 (en) 2002-01-14 2005-03-31 William Herman Targeted ligands
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
US8005620B2 (en) * 2003-08-01 2011-08-23 Dna Twopointo Inc. Systems and methods for biopolymer engineering
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
US8150634B1 (en) 2004-11-12 2012-04-03 Bristol-Myers Squibb Company Protein-ligand NOE matching for high-throughput structure determination
AU2006232287B2 (en) * 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
GEP20135917B (en) 2006-03-17 2013-09-10 Biogen Idec Inc Stabilized polypeptide compositions
CA2646965C (en) 2006-03-24 2016-06-21 Jonathan H. Davis Engineered heterodimeric protein domains
ES2654040T3 (es) 2006-03-31 2018-02-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método de modificación de anticuerpos para la purificación de anticuerpos biespecíficos
EP2799449A1 (en) 2006-05-25 2014-11-05 Bayer Intellectual Property GmbH Dimeric molecular complexes
ES2667863T3 (es) 2007-03-29 2018-05-14 Genmab A/S Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos
MX2010005927A (es) 2007-11-30 2010-06-15 Glaxo Group Ltd Construcciones de union de antigenos.
US8242247B2 (en) * 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
WO2009089004A1 (en) 2008-01-07 2009-07-16 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2010037838A2 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
AU2010206681A1 (en) 2009-01-23 2011-09-01 Biogen Idec Ma Inc. Stabilized Fc polypeptides with reduced effector function and methods of use
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
MX2011010158A (es) 2009-04-07 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.
KR101431319B1 (ko) 2009-05-27 2014-08-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 삼중특이성 또는 사중특이성 항체
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
DK2975051T3 (da) 2009-06-26 2021-04-26 Regeneron Pharma Let-at-isolere bispecifikke antistoffer med nativt immunoglobulinformat
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
JP2013511281A (ja) 2009-11-23 2013-04-04 アムジェン インコーポレイテッド 単量体抗体Ｆｃ
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
WO2011120135A1 (en) 2010-03-29 2011-10-06 Zymeworks, Inc. Antibodies with enhanced or suppressed effector function
MX353144B (es) 2010-04-20 2017-12-20 Genmab As Proteinas que contienen fc de anticuerpos heterodimericos y metodos para produccion de las mismas.
WO2011133886A2 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Genentech, Inc. Production of heteromultimeric proteins
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2575880B1 (en) 2010-05-27 2019-01-16 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2 epitope
CA2808154A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Medimmmune Limited Monomeric polypeptides comprising variant fc regions and methods of use
PT2606064E (pt) 2010-08-16 2015-06-08 Novimmune Sa Processos para a geração de anticorpos poliespecíficos e polivalentes
PT2635607T (pt) 2010-11-05 2019-12-11 Zymeworks Inc Design de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio do fc
CN102153650B (zh) 2011-01-27 2012-07-04 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种抗egfr人源化抗体l2-h3及其编码基因与应用
JP6177231B2 (ja) 2011-04-20 2017-08-09 ゲンマブ エー／エス Ｈｅｒ２に対する二重特異性抗体
WO2012163519A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Dutalys Antibodies with improved folding stability
EP4011913A1 (en) 2011-06-30 2022-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Heterodimerized polypeptide
EP2543680A1 (en) 2011-07-07 2013-01-09 Centre National de la Recherche Scientifique Multispecific mutated antibody Fab fragments
DK2748201T3 (en) 2011-08-23 2018-02-12 Roche Glycart Ag BISPECIFIC T-CELL ACTIVATING ANTIGIN BINDING MOLECULES
RS59166B1 (sr) 2011-10-27 2019-10-31 Genmab As Proizvodnja heterodimernih proteina
KR102168733B1 (ko) 2011-10-31 2020-10-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 중쇄와 경쇄의 회합이 제어된 항원 결합 분자
PT2773671T (pt) 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
PT2794905T (pt) 2011-12-20 2020-06-30 Medimmune Llc Polipéptidos modificados para estrutura de anticorpos bispecíficos
EP2836512B1 (en) 2012-04-11 2018-10-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Improved antibody light chains
EP2847230B1 (en) 2012-05-10 2020-08-12 Zymeworks Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the fc domain
WO2014004586A1 (en) 2012-06-25 2014-01-03 Zymeworks Inc. Process and methods for efficient manufacturing of highly pure asymmetric antibodies in mammalian cells
DE102012105864A1 (de) 2012-07-02 2014-02-20 Continental Reifen Deutschland Gmbh Fahrzeugluftreifen
AU2013326974B2 (en) * 2012-10-03 2019-01-03 Zymeworks Bc Inc. Methods of quantitating heavy and light chain polypeptide pairs
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US9914785B2 (en) * 2012-11-28 2018-03-13 Zymeworks Inc. Engineered immunoglobulin heavy chain-light chain pairs and uses thereof
KR102411491B1 (ko) * 2012-11-28 2022-06-22 자임워크스 인코포레이티드 가공된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 및 이들의 용도
EP2970435B1 (en) 2013-03-15 2020-08-12 Eli Lilly and Company Methods for producing fabs and bi-specific antibodies
ES2936810T3 (es) * 2014-05-16 2023-03-22 Pfizer Anticuerpos biespecíficos con interfaces CH1-CL de ingeniería
US11306156B2 (en) * 2014-05-28 2022-04-19 Zymeworks Inc. Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
CN116396393A (zh) * 2015-10-08 2023-07-07 酵活英属哥伦比亚省公司 包含κ和λ轻链的抗原结合多肽构建体及其用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090182127A1 (en) 2006-06-22 2009-07-16 Novo Nordisk A/S Production of Bispecific Antibodies
WO2012073985A1 (ja) 2010-11-30 2012-06-07 中外製薬株式会社 細胞傷害誘導治療剤
WO2012131555A2 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Hetero-dimeric immunoglobulins

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210070401A (ko) 2021-06-14
HK1217496A1 (zh) 2017-01-13
US11286293B2 (en) 2022-03-29
JP7080955B2 (ja) 2022-06-06
AU2020239780B2 (en) 2023-06-29
MX2015006758A (es) 2016-06-10
RU2720472C2 (ru) 2020-04-30
AU2018220048A1 (en) 2018-09-06
RU2015125486A (ru) 2017-01-10
MX2021009800A (es) 2021-12-10
AU2013351888C1 (en) 2018-10-11
AU2018220048B2 (en) 2020-06-25
KR102545617B1 (ko) 2023-06-20
WO2014082179A1 (en) 2014-06-05
CA2893562C (en) 2023-09-12
EP2925785A1 (en) 2015-10-07
AU2020239780A1 (en) 2020-10-22
AU2013351888A1 (en) 2015-06-04
JP6797862B2 (ja) 2020-12-09
JP2022116172A (ja) 2022-08-09
JP2018162253A (ja) 2018-10-18
BR112015012385A2 (pt) 2019-08-27
KR102264570B1 (ko) 2021-06-14
MX2021000156A (es) 2021-03-25
US10077298B2 (en) 2018-09-18
JP2021048850A (ja) 2021-04-01
EP2925785A4 (en) 2016-11-16
CA3206122A1 (en) 2014-06-05
US20190085055A1 (en) 2019-03-21
AU2013351888B2 (en) 2018-05-24
CN105026430A (zh) 2015-11-04
CA2893562A1 (en) 2014-06-05
JP2016508117A (ja) 2016-03-17
HK1216899A1 (zh) 2016-12-09
US20150307594A1 (en) 2015-10-29
KR20220086718A (ko) 2022-06-23
US20220227840A1 (en) 2022-07-21
JP6347490B2 (ja) 2018-06-27
KR20150103008A (ko) 2015-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7080955B2 (ja) 遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖－軽鎖対およびその使用
US20220251242A1 (en) Modified antigen binding polypeptide constructs and uses thereof
KR102669686B1 (ko) 변형된 항원 결합 폴리펩티드 작제물 및 이의 용도
RU2826203C1 (ru) Сконструированные пары тяжелая-легкая цепи иммуноглобулина и их применение

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant