CN106661121A - 经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途 - Google Patents

经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体的异源二聚体对，其中每个异源二聚体包含免疫球蛋白重链或其片段和免疫球蛋白轻链或其片段。所述异源二聚体中的至少一个可包含CH1和/或CL结构域中的一个或多个氨基酸修饰，VH和/或VL结构域中的一个或多个氨基酸修饰，或它们的组合。所述经修饰的氨基酸可以是所述轻链和重链之间的界面的一部分，并且通常修饰为在每个重链和所需的轻链之间产生优先配对，使得当所述异源二聚体对的所述两条重链和两条轻链在细胞中共表达时，所述第一异源二聚体的所述重链优先地与所述轻链中的一者而非另一者配对。同样，所述第二异源二聚体的所述重链通常优先地与第二轻链而非第一轻链配对。

Description

经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求提交于2014年5月28日的美国临时申请No.62/003,663和提交于2015年4月28日的美国临时申请No.62/154,055的优先权，这些专利申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。
本专利申请涉及提交于2013年11月28日的PCT/CA2013/050914、提交于2012年11月28日的美国临时申请No.61/730,906、提交于2013年2月6日的美国临时申请No.61/761,641、提交于2013年5月2日的美国临时申请No.61/818,874和提交于2013年8月23日的美国临时申请No.61/869,200，这些专利申请中的每一个的全部公开内容据此以引用的方式整体并入用于所有目的。
序列表
本专利申请包含以ASCII格式的电子版本提交的序列表，并且据此以引用的方式整体并入。所述ASCII副本创建于2015年5月29日，命名为97993-945204(000110PC)_SL.txt，大小为27,012字节。
背景
双特异性抗体能够结合至两个不同的表位。该表位可在相同的抗原上，或每个表位可在不同的抗原上。双特异性抗体的该特征使其成为用于各种治疗应用的引人注目的工具，其中该抗体具有在疾病治疗中靶向或募集超过一个分子的治疗有益效果。形成双特异性抗体的一种方法将涉及两条独特的抗体重链和两条独特的抗体轻链的同时表达。正确形成类似于野生型的双特异性抗体形式仍然是挑战，因为抗体重链涉及以相对混杂的方式结合抗体轻链。作为该混杂配对的结果，两条抗体重链和两条抗体轻链的同时表达自然地导致重链-轻链配对混杂。该错配仍然是制备双特异性治疗剂的主要挑战，其中均一配对是良好工艺和生物学效力的基本要求。
多种双特异性抗体制备方法已有所描述，其中特定的抗体轻链或片段与特定的抗体重链或片段配对。解决该问题的各种方法的评述可见于Klein等，(2012)mAbs 4：6，1-11。国际专利申请No.PCT/EP2011/056388(WO 2011/131746)描述了用于制备异源二聚体蛋白的体外方法，其中将不对称突变引入两个单特异性起始蛋白的CH3区，以便在还原条件下孵育时驱动两个单特异性IgG4或IgG4样抗体之间的定向“Fab臂”或“半分子”交换。
Schaefer等(Roche Diagnostics GmbH)描述了在不使用人工接头的情况下将来源于两种现有抗体的两条重链和两条轻链组装到人二价双特异性IgG抗体的方法(PNAS(2011)108(27)：11187-11192)。该方法涉及交换双特异性抗体的一半的抗原结合片段(Fab)内的重链和轻链结构域。
Strop等(Rinat-Pfizer Inc.)描述了通过单独表达和纯化两种所关注的抗体，然后在指定的氧化还原条件下将它们混合在一起来制备稳定双特异性抗体的方法(J.Mol.Biol.(2012)420：204-19)。
Zhu等(Genentech)工程改造了双抗体构建体(由完全缺乏恒定结构域的可变结构域抗体片段构成)的VL/VH界面中的突变，并制备了异源二聚体双抗体(Protein Science(1997)6：781-788)。相似地，Igawa等(Chugai)也工程改造了单链双抗体的VL/VH界面中的突变以有助于双抗体的选择性表达和抑制双抗体的构造异构化(Protein Engineering，Design&Selection(2010)23：667-677)。
美国专利公开No.2009/0182127(Novo Nordisk，Inc.)描述了通过修饰轻链-重链对的Fc界面和CH1：CL界面处的氨基酸残基来制备双特异性抗体，该修饰降低了一对的轻链与另一对的重链相互作用的能力。
美国专利公开No.2014/0370020(Chugai)描述了通过用带电氨基酸置换CH1和CL区之间的界面上存在的氨基酸来调节抗体这些区之间的缔合。
概述
本文描述了包含至少第一异源二聚体和第二异源二聚体的分离的抗原结合多肽构建体，该第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中第一异源二聚体的H1或L1序列中的至少一个不同于第二异源二聚体的对应H2或L2序列，并且其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL)；并且H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少一个氨基酸修饰，其中与L2相比H1优先地与L1配对，且与L1相比H2优先地与L2配对。
在一些方面，该构建体还包含异源二聚体Fc，该Fc包含至少两个CH3序列，其中该Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到第一异源二聚体和第二异源二聚体，其中二聚化CH3序列具有约68℃或更高的熔融温度(Tm)(如差示扫描量热法(DSC)所测定)，并且其中该构建体是双特异性的。
在一些方面，至少一个氨基酸修饰选自表格或实施例所示的至少一个氨基酸修饰。
在一些方面，当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1、H2、L1和L2共生成时，或当H1、H2、L1和L2经由氧化还原生成方法共生成时，与L2相比H1优先地与L1配对，且与L1相比H2优先地与L2配对。
在一些方面，H1、H2、L1和L2中的至少一个包含VH和/或VL结构域的至少一个氨基酸修饰和CH1和/或CL结构域的至少一个氨基酸修饰，使得与L2相比H1优先地与L1配对，和/或与L1相比H2优先地与L2配对。
在一些方面，如果H1包含CH1结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含CL结构域中的至少一个氨基酸修饰；和/或如果H1包含VH结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含VL结构域中的至少一个氨基酸修饰。
在一些方面，H1、L1、H2和/或L2包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。在一些方面，H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
在一些方面，当L1和L2二者与H1和H2中的至少一个共表达时，H1-L1和H2-L2异源二聚体对中的至少一个的相对配对与各自对应的H1-L2或H2-L1异源二聚体对之比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中经修饰的H1-L1或H2-L2异源二聚体对的相对配对大于无至少一个氨基酸修饰的对应的H1-L1或H2-L2异源二聚体对中观察到的各自相对配对。
在一些方面，第一和第二异源二聚体中的至少一个的以熔融温度(Tm)计量的热稳定性(如DSF所测定)在无至少一个氨基酸修饰的对应的异源二聚体的Tm的约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之内。在一些方面，每个包含至少一个氨基酸修饰的异源二聚体的以熔融温度(Tm)计量的热稳定性(如DSF所测定)在无至少一个氨基酸修饰的对应的异源二聚体的Tm的约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之内。在一些实施方案中，每个包含至少一个氨基酸修饰的异源二聚体的以熔融温度(Tm)计量的热稳定性(如DSF所测定)在无至少一个氨基酸修饰的对应的异源二聚体的Tm的约0、1、2或3℃之内。
在一些方面，每个异源二聚体对其结合的抗原的亲和力在各自未经修饰的异源二聚体对相同的抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10倍内(如表面等离振子共振(SPR)或FACS所测定)。
在一些方面，H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1非配对时产生更大的氨基酸空间互补。在一些方面，H2和L2的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的氨基酸空间互补。在一些方面，H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补。在一些方面，H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补。
在一些方面，至少一个氨基酸修饰是表格或实施例中的至少一个所示的一组突变。
在一些方面，该构建体还包含Fc，该Fc包含至少两个CH3序列，其中该Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到第一异源二聚体和第二异源二聚体。
在一些方面，该Fc是人Fc、人IgG1 Fc、人IgA Fc、人IgG Fc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc或人IgG4Fc。在一些方面，该Fc是异源二聚体Fc。在一些方面，该Fc包含CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，该二聚化CH3序列具有约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融温度(Tm)(如DSC所测定)。在一些方面，在制备时，该Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体；或其中在表达时或在通过单个细胞表达时，该Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体。在一些方面，该Fc包含CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰，该修饰有助于形成稳定性相当于野生型同源二聚体Fc的异源二聚体Fc。在一些方面，该Fc还包含至少一个CH2序列。在一些方面，该Fc的CH2序列包含一个或多个修饰。在一些方面，该Fc包含有助于Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，该Fc包含：
i)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1 Fc；
ii)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iii)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iv)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc；或
v)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc。
在一些方面，该Fc通过一个或多个接头偶联到异源二聚体，或其中该Fc通过一个或多个接头偶联到H1和H2。在一些方面，所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个修饰。在一些方面，所述一个或多个接头的一个或多个修饰有助于Fc-γ受体的选择性结合。
在一些方面，至少一个氨基酸修饰为至少一个氨基酸突变，或其中至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸置换。
在一些方面，H1、H2、L1和L2中的每一个的序列来源于人序列。
在一些方面，构建体是多特异性的或双特异性的。在一些方面，构建体是多价的或二价的。
在一些方面，本文所述的异源二聚体优先地配对形成双特异性抗体。例如，在一些实施方案中，重链多肽序列H1和H2包含全长重链序列，该全长重链序列包含重链恒定结构域(CH1结构域)、CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，双特异性抗体(例如，H1-L1：H2-L2)中正确配对的重链和轻链的百分比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
本文还描述了包含编码本文所述的构建体或重链或轻链的至少一个序列的分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组。在一些方面，该多核苷酸或多核苷酸组是cDNA。本文还描述了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个的载体或载体组。在一些方面，该载体或载体组选自质粒、多顺反子载体、病毒载体、非游离型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
本文还描述了包含本文所述的多核苷酸或多核苷酸组或本文所述的载体或载体组的分离的细胞。在一些方面，该细胞是杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
本文还描述了包含本文所述的构建体和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些方面，该组合物还包含一种或多种选自缓冲液、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂的物质。
本文还描述了将本文所述的构建体或本文所述的药物组合物用于治疗受试者中的疾病或病症或癌症或血管疾病或用于药物制造中的用途。
本文还描述了治疗患有疾病或病症或癌症或血管疾病的受试者的方法，其包括向受试者施用本文所述的构建体或本文所述的组合物。
本文还描述了从宿主细胞培养物获得本文所述的构建体的方法，该方法包括以下步骤：(a)获得包含至少一种宿主细胞的宿主细胞培养物，该宿主细胞包含一种或多种编码该构建体的核酸序列；以及(b)从该宿主细胞培养物回收该构建体。
本文还描述了获得本文所述的构建体的方法，其包括以下步骤：(a)获得H1、L1、H2或L2；(b)允许与L2相比H1优先地与L1配对，且与L1相比H2优先地与L2配对；以及(c)获得该构建体。
本文还描述了制备本文所述的构建体的方法，其包括：获得编码至少一种构建体的多核苷酸或多核苷酸组；确定用于引入至少一种宿主细胞的多核苷酸或多核苷酸组中的每一个的最佳比率，其中该最佳比率通过评估与在H1、L1、H2或L2表达时形成的错配的H1-L2和H2-L1异源二聚体对相比在H1、L1、H2或L2表达时形成的H1-L1和H2-L2异源二聚体对相对于的量来确定；选择优选的最佳比率，其中用所述优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组的转染至少一种宿主细胞导致所述构建体表达；用最佳比率的多核苷酸或多核苷酸组转染至少一种宿主细胞；以及培养至少一种宿主细胞以表达该构建体。
在一些方面，最佳比率的选择通过在瞬时转染系统中转染来评估。在一些方面，用优选的最佳比率的多核苷酸或多核苷酸组转染至少一种宿主细胞导致构建体最佳表达。在一些方面，该构建体包含Fc，该Fc包含至少两个CH3序列，其中该Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到第一异源二聚体和第二异源二聚体。在一些方面，该Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
本文还描述了存储数据集的计算机可读存储介质，该数据集包含表示第一异源二聚体和第二异源二聚体中的互补突变的数据，该第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；且该第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中互补突变的数据集包含表示表格或实施例中列出的那些突变或那些突变的子集的数据；以及用于确定与L2相比H1优先地与L1配对和/或与L1相比H2优先地与L2配对的可能性的计算机可执行代码。
本文还描述了用于确定优先配对的计算机实施的方法，其包括：获得数据集，该数据集包含表示第一异源二聚体和第二异源二聚体中的互补突变的数据，该第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；且该第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中互补突变的数据集包含表示表格或实施例中列出的那些突变或那些突变的子集的数据；以及通过计算机处理器确定与L2相比H1优先地与L1配对和/或与L1相比H2优先地与L2配对的可能性。在一些方面，该方法还包括制备本文所述的构建体。
本文还描述了制备双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述双特异性构建体包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，该第一异源二聚体包含来自第一单特异性抗原结合多肽的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；且第二异源二聚体包含来自第二单特异性抗原结合多肽的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，该方法包括：将来自本文所述的数据集的一个或多个互补突变引入第一异源二聚体和/或第二异源二聚体；以及使第一异源二聚体和第二异源二聚体在至少一种宿主细胞中共表达，以制备包含双特异性构建体的表达产物。
在一些方面，该方法还包括确定该表达产物相对于其他多肽产物中双特异性构建体的量，以选择优选的互补突变子集。在一些方面，该双特异性构建体相较于其他多肽产物，以大于70％(例如，大于75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)的纯度生成。在一些方面，该数据集是本文所述的数据集。在一些方面，该方法还包括将另外的氨基酸修饰添加至H1、H2、L1或L2中的至少一个，以提高双特异性构建体相较于其他多肽产物的纯度的步骤。在一些方面，该构建体包含Fc，该Fc包含至少两个CH3序列，其中该Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到第一异源二聚体和第二异源二聚体。在一些方面，该Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。在一些方面，该抗原结合多肽是抗体、Fab或scFv。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。例如，在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124R、L124E、K145M、K145T、D146N、Q179E、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含选自Q124E、S131R、S131K、V133G、Q160E、S176R、S176D、T178D、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L124E、K145M、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自S131R、S131K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、V133G、Q160E、S176D、T178D、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰S131K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q124、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124E、L124R、L143E、L143D、K145T、K145M、D146N、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q124K、Q124E、V133G、Q160K、S176R、S176D、T178E、T178K、T178R、T178D和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L124E、L143E、L143D、K145T和K145M或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q124K、V133G、Q160K、S176R、T178K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、V133G、S176D、T178E、T178D和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和Q179K；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含Q39、L45、L124、L143、F122和H172处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、F122C、L124E、L124R、L143F、H172T和H172R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124C、S131T、S131E、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K、S176D、T178Y和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自Q39E、L45P、F122C、L124E、L143F、H172T和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q38R、P44F、Q124C、S131T、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K和T178Y或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自Q39R、L124R和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q38E、S131E、V133G、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰Q39E和L124E；L1包含氨基酸修饰Q38R、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰Q39R和L124R；并且L2包含氨基酸修饰Q38E、V133G和S176D。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L45P和L124E；L1包含氨基酸修饰P44F、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E和L143F；L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰F122C和L124E；L1包含氨基酸修饰Q124C、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R；并且L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E和H172T；L1包含氨基酸修饰V133G、N137K、S174R和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和H172R；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、A125、H172和K228处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含S121、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A125S、A125R、H172R、H172T和K228D的至少一个或一组氨基酸修饰；并且(ii)L1和/或L2包含选自S121K、V133G、N137K、S174R、S176K、S176R、S176D和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L124E、A125S、H172R和K228D或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自S121K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124R、A125R和H172T或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自V133G、N137K、S174R、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E和K228D；L1包含氨基酸修饰S121K、V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和A125R；并且L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E和H172R；L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R和H172T；并且L2包含氨基酸修饰V133G、S174R和S176D。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、A139和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含F116、V133、L135和S176处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A139W、A139G和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自F116A、V133G、L135V、L135W、S176R和S176D的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L124E和A139W或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自F116A、V133G、L135V和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124R、A139G和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自V133G、L135W和S176D或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124E和A139W；L1包含氨基酸修饰F116A、V133G、L135V和S176R；H2包含氨基酸修饰L124R、A139G和V190A；并且L2包含氨基酸修饰V133G、L135W和S176D。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含Q39、L45、K145、H172、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、Q160、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、K145T、H172R、Q179E和S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124E、S131K、Q160E、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自Q39E、L45P、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q38R、P44F和S131K或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自Q39R、H172R和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q38E、Q124E、Q160E、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰Q39E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰Q38R和S131K；H2包含氨基酸修饰Q39R和S186R；并且L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L45P、K145T、H172R和Q179E；L1包含氨基酸修饰P44F和S131K；H2包含氨基酸修饰H172R和S186R；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含F116、Q124、L135、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自A139W、A139G、L143E、K145T、Q179E、Q179K和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自F116A、Q124R、Q124E、L135V、L135W、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自A139W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自F116A、Q124R、L135V和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自A139G、Q179K和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、L135W、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰A139W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰F116A、Q124R、L135V和T178R；H2包含氨基酸修饰Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、L135W、Q160E和T180E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含Q39、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q38、Q124、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L143E、K145T、D146G、H172R、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、Q124R、Q124E、Q160K、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自Q39E、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q38R、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自Q39R、H172R和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q38E、Q124E、D146G、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰Q39E、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰Q38R、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修饰Q39R、H172R和Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L45、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、N137、Q160、S174、T178、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L45P、L143E、K145T、D146G、H172R、H172T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且(ii)L1和/或L2包含选自Q38E、P44F、Q124R、Q124E、N137K、Q160K、Q160E、S174R、T178R、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L45P、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自P44F、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自D146G、H172R、H172T和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q38E、Q124E、N137K、Q160E、S174R、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L45P、L143E和K145T；L1包含氨基酸修饰P44F、Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修饰D146G和Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和H172R；L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修饰H172T和Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E、N137K、S174R和T180E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124W、L124A、L143E、L143F、K145T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q124R、Q124K、Q124E、S131K、V133A、V133W、S176T、T178R、T178L、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L124W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q124R、Q124K、S131K、V133A、S176T、T178R和T178L或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124A、L143F和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、V133W、S176T、T178L、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L124W、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰Q124R、V133A、S176T和T178R；H2包含氨基酸修饰L124A、L143F和Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含F116、Q124、V133、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自A139C、L143E、L143D、L143R、L143K、K145T、Q179E、Q179D、Q179R、Q179K、S186K、S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q124E、V133E、V133D、Q160K、Q160E、T178R、T178K、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自A139C、L143E、L143D、K145T、Q179E和Q179D或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q160K、T178R和T178K或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L143R、L143K、Q179R、Q179K、S186K和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、V133E、V133D、Q160E、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰A139C、L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰F116C、Q124R和T178R；H2包含氨基酸修饰Q179K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；H2包含氨基酸修饰S186K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T178E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；H2包含氨基酸修饰L143R；并且L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
在该构建体的一些实施方案中，H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179、S186和S188处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1和/或H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143E、L143K、K145T、D146G、Q179R、Q179E、Q179K、S186R、S186K和S188L的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1和/或L2包含选自Q124R、Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160K、Q160M、S176L、T178R、T178E、T178F、T178Y和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自L143E、K145T、Q179E和S188L或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143K、D146G、Q179R、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且L2包含选自Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160M、S176L、T178E、T178F、T178Y和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；H2包含氨基酸修饰S186K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、S176L和T180E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；H2包含氨基酸修饰S186K；并且L2包含氨基酸修饰Q124E、S131T、T178Y和T180E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；H2包含氨基酸修饰S186K；并且L2包含氨基酸修饰S131E。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；L1包含氨基酸修饰Q124R；H2包含氨基酸修饰L143R；并且L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
在该构建体的一些实施方案中，H1包含F122和C233处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且L1包含Q124和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自F122C和C233S的至少一个或一组氨基酸修饰；并且L1包含选自Q124C和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1包含选自F122C和C233S或它们的组合的氨基酸修饰；L1包含选自Q124C和C214S或它们的组合的氨基酸修饰；H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，H1包含氨基酸修饰F122C和C233S；L1包含氨基酸修饰Q124C和C214S；H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该构建体包含选自本文的表格的SMCA设计9561-9095_1、9561-9095_2、9121-9373_1、9121-9373_2、9116-9349_1、9116-9349_2、9134-9521_1、9134-9521_2、9286-9402_1、9286-9402_2、9667-9830_1、9667-9830_2、9696-9848_1、9696-9848_2、9060-9756_1、9060-9756_2、9682-9740_1、9682-9740_2、9049-9759_1、9049-9759_2、9820-9823_1和9820-9823_2的氨基酸修饰。在一些实施方案中，该构建体包含选自本文的表格的SMCA设计9327-6054_1、9815-9825_1、9815-9825_2、9587-9735_1、9587-9735_2、3522_1、3522_2、3519_1和3519_2的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，H1和/或H2不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰Q179E和/或H2不包含氨基酸修饰Q179K。在一些实施方案中，L1不包含位置S131处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰S131K。在一些实施方案中，L2不包含位置T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2不包含氨基酸修饰T180E。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含Q179E，L1包含S131K，H2包含Q179K，并且L2包含T180E。
在一些实施方案中，H1不包含位置Q39和/或Q179处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰Q39E和/或Q179E。在一些实施方案中，L1不包含位置Q160处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰Q160K。在一些实施方案中，H2不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H2不包含氨基酸修饰Q179K。在一些实施方案中，L2不包含位置Q38、Q160和/或T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2不包含氨基酸修饰Q38E、Q160E和/或T180E。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含Q39E和/或Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和/或T180E。例如，在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中：(i)H1包含Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q160E和T180E；(ii)H1包含Q39E和Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和T180E；或(iii)H1包含Q39E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含Q38E、Q160E和T180E。
在一些实施方案中，H1不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰Q179K或Q179E。在一些实施方案中，L1不包含位置Q160和/或T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰Q160E、Q160K和/或T180E。在一些实施方案中，H2不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H2不包含氨基酸修饰Q179K或Q179E。在一些实施方案中，L2不包含位置Q160和/或T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2不包含氨基酸修饰Q160K、Q160E和/或T180E。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含Q179K或Q179E，L1包含Q160E、Q160K和/或T180E，H2包含Q179K或Q179E，并且L2包含Q160K、Q160E和/或T180E。
在一些实施方案中，H1和/或H2不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰Q179K和/或H2不包含氨基酸修饰Q179E。在一些实施方案中，L1不包含位置T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰T180E。在一些实施方案中，L2不包含位置S131处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2不包含氨基酸修饰S131K。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含Q179K，L1包含T180E，H2包含Q179E，并且L2包含S131K。
在一些实施方案中，H1不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰Q179E。在一些实施方案中，L1不包含位置Q160处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰Q160K。在一些实施方案中，H2不包含位置Q179处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，H2不包含氨基酸修饰Q179K。在一些实施方案中，L2不包含位置T180处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L2不包含氨基酸修饰T180E。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含Q179E，L1包含Q160K，H2包含Q179K，并且L2包含T180E。
在一些实施方案中，H1不包含位置A139处的氨基酸修饰。在一些实施方案中，H1不包含氨基酸修饰A139C。在一些实施方案中，L1不包含位置F116处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，L1不包含氨基酸修饰F116C。在一些实施方案中，该构建体不包含这样的氨基酸修饰组合，其中H1包含A139C，并且L1包含F116C。
在一些实施方案中，该构建体不包含重链和轻链之间的天然二硫键。例如，在一些实施方案中，L1和/或L2的位置214处的半胱氨酸被修饰为另一个氨基酸。在一些实施方案中，L1和/或L2包含氨基酸修饰C214S。在一些实施方案中，H1和/或H2的位置233处的半胱氨酸被修饰为另一个氨基酸。在一个实施方案中，H1和/或H2包含氨基酸修饰C233S。
本文所述的实施方案适用于Fab形式和全抗体形式的构建体。
附图简述
图1示出了D3H44重链和轻链氨基酸序列与典型人生殖系序列的可变区、恒定区和J区片段比对(图中注释：*序列同一性)。图1A示出了人VH生殖系亚群(每个家族显示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44与VH3和IGHJ3*02的比对。图1B示出了人κVL生殖系亚群(每个家族显示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44与VKI和IGKJ1*01的比对。图1C示出了人λVL生殖系亚群(每个家族显示一个代表性序列)。序列同一性基于D3H44与VL1和IGLJ1*01的比对。图1D示出了人CH1等位基因序列。图1E示出了人κ和λ等位基因序列。
图2示出了用于鉴定关键界面残基和用于利用优先的重链-轻链配对进行设计的计算建模的流程图。
图3示出了H1、L1、H2、L2链的示例性组，它们设计为使得与L2相比H1优先地与L1配对，且与L1相比H2优先地与L2配对。提供了可变区重链和轻链界面的3D晶体结构的动画表示。引入界面的突变实现了优先地分别形成专性对H1-L1和H2-L2的静电和空间互补。另一方面，不正确的配对中存在不利的空间和静电错配，这将导致错配对的配对倾向减小以及稳定性降低。
图4示出了形成双特异性Mab(单克隆抗体)的工程改造要求和重链-轻链对定量所需的分析要求的高水平示意性概览图。高纯度(即，H-L缔合很少错配或无错配)工程改造双特异性Mab的设计要求可通过合理地工程改造(通过引入特定的氨基酸突变)两条独特的重链与其独特的同源轻链的优先配对实现。该过程已示意性地示出；此处H1被工程改造为优先地与L1而非L2配对。同样，H2被工程改造为优先地与L2而非L1配对。双特异性Mab设计的实验筛选要求分析能够同时定量H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1。这些分析要求可通过每个双特异性Fab臂可独立地工程改造的假设简化。在这种情况下，该分析只需定量H1-L1∶H1-L2或H2-L2∶H2-L1即可，无需同时对二者进行定量。
图5提供了如何测定重链和轻链的标签和优先配对的示意图。在该示意图中，圆圈表示其中转染了3个构建体的细胞。表达产物从细胞分泌，使上清液(SPNT)流过检测设备(在这种情况下SPR芯片)。根据融合至竞争重链配对的两条轻链的两个不同标签的检测水平，可进行重链与两条轻链的优先配对的定量估计。
图6示出了箱线图，其示出每个簇的配对：错配的Fab异源二聚体的平均LCCA性能值为至少86∶14。
图7示出了A)WT Fab异源二聚体以及B)代表性设计的Fab异源二聚体的代表性UPLC-SEC图谱(LCCA设计9735、9737和9740的H1L1Fab部件)。
图8示出了两条不同的轻链与两条不同的重链在细胞中共表达时，预期的可能重链缔合产物。优先配对使用SMCA(单克隆抗体竞争分析)评估。
图9示出了a)D3H44/曲妥单抗、b)D3H44/西妥昔单抗(cetuximab)和c)曲妥单抗/西妥昔单抗双特异性系统中的偏爱性/链利用偏好性。不同种类的链利用评估通过LC-MS观察。x-轴表示H1∶H2∶L1∶L2DNA比率，Y-轴示出了不同转染实验中每条链的对应百分比。在平衡系统中，所有H和L链具有25％。在所有双特异性系统中观察一条轻链利用的偏爱性。
图10示出了WT异源二聚体以及工程改造的异源二聚体抗体的代表性UPLC-SEC图谱。图10a和10b分别涉及D3H44/曲妥单抗WT和9060-9756_1。图10c和10d分别涉及D3H44/西妥昔单抗WT和9820-9823_1。图10e和10f分别涉及曲妥单抗/西妥昔单抗WT和9696-9848_1。
图11示出了正确配对的Fab部件与所有利用相同的重链、错配的Fab部件的变化百分比(H1∶L1与所有H1种类相对于野生型竞争D3H44/曲妥单抗和D3H44/西妥昔单抗；H2∶L2与所有H2种类相对于野生型的变化竞争曲妥单抗/西妥昔单抗)以及所需的双特异性抗体相对于野生型竞争每个簇的工程改造双特异性抗体样品的变化百分比的箱线图。示出了每个系统的正确配对的Fab部件与所有利用相同的重链与簇、错配的Fab部件的变化百分比，其中a)D3H44/曲妥单抗、c)D3H44/西妥昔单抗和e)曲妥单抗/西妥昔单抗。示出了每个系统的所需的双特异性抗体相对于野生型与簇的变化百分比，其中b)D3H44/曲妥单抗、d)D3H44/西妥昔单抗和f)曲妥单抗/西妥昔单抗。在所有双特异性系统中，正确配对的Fab部件与所有利用相同的重链与簇、错配的Fab部件的变化百分比示于图11g中，所需的双特异性抗体相对于野生型与簇的变化百分比示于图11h中。注意到，所报告的值还包括工程改造的双特异性抗体样品的预计变化，其中对应的野生型构建体不通过SMCA评估。
图12示出了使用本文提供的专性突变对文库制备双特异性抗体的方法。
详述
本文提供了抗原结合多肽构建体(也称为异源二聚体对)，该构建体可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，其中每个异源二聚体包含免疫球蛋白重链或其片段和免疫球蛋白轻链。两个异源二聚体可包含免疫球蛋白重链恒定结构域1(CH1)中的一个或多个氨基酸修饰和免疫球蛋白轻链恒定结构域(CL)中的一个或多个氨基酸修饰；免疫球蛋白重链可变结构域(VH)中的一个或多个氨基酸修饰和免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)中的一个或多个氨基酸修饰；或前述氨基酸修饰与重链和轻链的恒定和可变结构域二者的组合。经修饰的氨基酸通常是轻链和重链之间的界面的一部分，并且经修饰以生成每个重链和所需的轻链之间的优先配对，使得第一异源二聚体的重链优先地与一条轻链而非另一条轻链配对。同样，第二异源二聚体的重链可优先地与第二轻链而非第一轻链配对。
如上文所述，本文所述的氨基酸修饰的特定组合有助于重链与特定的轻链的优先配对，从而使双特异性单克隆抗体(Mab)以可忽略或有限的错配表达，并且使从不需要的或错配的产物纯化所需的异源二聚体的需要最小化。异源二聚体可表现出相当于不包括氨基酸修饰的异源二聚体的热稳定性，也可显示出相当于不包括氨基酸修饰的异源二聚体的抗原结合亲和力。第一和第二异源二聚体的设计可用于生成靶向两个不同的治疗靶标或靶向相同抗原中的两个不同表位(重叠或非重叠)的双特异性抗体。
本文还提供了异源二聚体对的制备方法。
定义
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与要求保护的主题所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。如果本文的术语有多个定义，则以本部分为准。当引用URL或其他此类标识符或地址时，应当理解此类标识符可改变，互联网上的具体信息是不断变化的，但等同的信息可通过搜索互联网获得。此类信息引用证实了其可用性和公开传播。
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在本发明的具体实施方式中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列范围内的任何整数值，以及(如适用)它们的分数(例如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指明。如本文所用，“约”意指指示范围、值、序列或结构的±10％，除非另外指明。应当理解，如本文所用，术语“一个”和“一种”是指所列组分中的“一个或多个”，除非上下文另外指明或要求。替代词(例如，“或”)的使用应理解为意指替代形式的一者、两者或它们的任何组合。如本文所用，术语“包括”和“包含”可作为同义词使用。此外，应当理解，本专利申请公开了来源于本文所述的结构和取代基的各种组合单个单链多肽或免疫球蛋白构建体，以达到似乎每个单链多肽或异源二聚体单独示出的程度。因此，形成单个单链多肽或异源二聚体的具体组分的选择在本公开的范围内
本文所用的小标题仅用于组织目的，并且不应理解为限制所述的主题。本专利申请引用的所有文档或文档的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论述据此明确地全文以引用方式并入用于任何目的。
应当理解，本文所述的方法和组合物不限于本文所述的具体方法、方案、细胞系、构建体和试剂，因此可以是变化的。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方式的目的，并且不旨在限制本文所述的方法和组合物的范围，该范围仅通过所附权利要求进行限制。
本文提及的所有公开和专利全文以引用方式并入本文用于描述和公开目的，例如公开中描述的构建体和方法可结合本文所述的方法、组合物和化合物使用。本文讨论的公开单独提供，以在本专利申请的提交日期之前进行公开。本文不应理解为根据前述发明或出于任何其他原因，允许本文所述的发明人提前了解此类公开内容。
在本专利申请中，氨基酸名称和原子名称(例如N、O、C等)的使用如ProteinDataBank(PDB)(www.pdb.org)所定义，这些名称基于IUPAC命名法(IUPAC Nomenclatureand Symbolism for Amino Acids and Peptides(氨基酸和肽的IUPAC命名法和符号(残基名称、原子名称等))，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)及其修正版Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。术语“氨基酸残基”主要旨在表示由20种天然存在的氨基酸，即丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、赖氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、缬氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)残基组成的组中包含的氨基酸残基。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。即涉及多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述，反之亦然。该术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括其中氨基酸残基通过共价肽键连接的全长蛋白质。
术语“核苷酸序列”或“核酸序列”旨在表示两个或更多个核苷酸分子的连续片段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源的或它们的任何组合。
“细胞”、“宿主细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”在本文中可互换使用，并且所有此类术语应理解为包括细胞生长或培养产生的子代。“转化”和“转染”可互换使用，是指将核酸序列引入细胞的过程。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即碳结合至氢、羧基基团、氨基基团和R基，诸如、高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基(诸如，正亮氨酸)或经修饰的肽主链，但保持与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸的引用包括例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸；经化学修饰的氨基酸D-氨基酸，诸如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白质性氨基酸，诸如丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域已知是氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于-甲基氨基酸(例如甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、羟基-组氨酸、高组氨酸)、侧链中具有另外的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及其中侧链中的羧酸官能团被磺酸基团(例如，磺基丙氨酸)取代的氨基酸。将非天然的氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、置换的氨基酸或一种或多种D-氨基酸)以多种不同方式掺入本发明的蛋白质可为有利的。含D-氨基酸肽等表现出比含L-氨基酸肽的对应物体外或体内稳定性增加。因此，当期望或需要更大的细胞内稳定性时，掺入D-氨基酸的肽等的构建可为特别有用的。更具体地讲，D-肽等是耐内源性肽酶和蛋白酶的，从而当期望此类性质时，提供了改善的分子生物利用率并延长了体内寿命。另外，对于II类主要组织相容性复合物限制的呈现至辅助T细胞，D-肽等不能有效加工，因此，在整个生物体中不可能引起体液免疫应答。
氨基酸在本文中通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的熟知的三字母符号或通过一字母符号表示。同样，核苷酸可通过广泛接受的单字母密码表示。
“经保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列二者。就特定的核酸序列而言，“经保守修饰的变体”是指这样的核酸：其编码相同的或基本上相同的氨基酸序列，或其中该核酸不编码氨基酸序列，基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何指定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码丙氨酸氨基酸。因此，在其中密码子指定的丙氨酸的每个位置，可将密码子改为任何对应的所述密码子，而不改变所编码的多肽。此类核酸变型是“沉默变型”，是经保守修饰的变型的一个种类。本文编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每个可能的沉默变型。本领域的普通技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)均可修饰得到功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变型暗含在每个所述序列中。
就氨基酸序列而言，本领域的普通技术人员将认识到，核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个置换、缺失或增加(其改变、增加或删除编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸)是“经保守修饰的变体”，其中该变化导致氨基酸的缺失、氨基酸的增加或将氨基酸置换为化学上类似的氨基酸。保守置换表提供了功能上类似的氨基酸，该表是本领域的普通技术人员已知的。此类经保守修饰的变体还包括且不排除本发明的多态性变体、种类间同系物和等位基因。
保守置换表提供了功能上类似的氨基酸，该表是本领域的普通技术人员已知的。以下八个组中的每个均包含作为彼此的保守置换的氨基酸：
丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；
天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；
天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；
精氨酸(R)、赖氨酸(K)；
异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；
丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及
半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)
(参见例如，Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W HFreeman&Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或多个核酸或多肽序列的语境中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。当在比较窗口或指定的区上进行最大对应的比较和对齐时，如果序列的氨基酸残基或核苷酸的百分比相同，则该序列是“基本上相同的”(即，与指定的区具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)，如使用以下序列比较算法中的一者(或本领域的普通技术人员可用的其他算法)或通过手动对齐和目视检查所测定。该定义也涉及测试序列的互补序列。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区，或在不指定的情况下，在整个多核苷酸或多肽序列上。编码本发明的多肽(包括来自除人之外的物种的同系物)的多核苷酸可通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下使用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库，以及分离全长cDNA和包含所述多核苷酸序列的基因组克隆。此类杂交技术是技术人员熟知的。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与初始肽的100个氨基酸序列具有至少50％同一性，则该衍生物或变体被认为与肽共有“同源性”或与肽是“同源的”。在某些实施方案中，该衍生物或变体与氨基酸残基的数量与衍生物相同的肽或肽的片段至少75％相同。在某些实施方案中，该衍生物或变体与氨基酸残基的数量与衍生物相同的肽或肽的片段至少85％相同。在某些实施方案中，该衍生物的氨基酸序列与氨基酸残基的数量与衍生物相同的肽或肽的片段至少90％相同。在一些实施方案中，该衍生物的氨基酸序列与氨基酸残基的数量与衍生物相同的肽或肽的片段至少95％相同。在某些实施方案中，该衍生物或变体与氨基酸残基的数量与衍生物相同的肽或肽的片段至少99％相同。
如本文所用，“分离的”多肽或构建体意指从其天然细胞培养环境的组分鉴定和分离和/或回收的构建体或多肽。其天然环境的污染组分是通常妨碍异源多聚体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。
在某些实施方案中，如本文所用，本文所述的“分离的”抗原结合多肽构建体包括异源二聚体对或“分离的”异源二聚体对，包括从其天然细胞培养环境的组分鉴定和分离和/或回收的异源二聚体或异源二聚体对。其天然环境的污染组分是妨碍异源二聚体或抗原结合多肽构建体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质性或非蛋白质性溶质。
异源二聚体和抗原结合多肽构建体和异源二聚体对通常纯化至基本上均一。短语“基本上均一的”、“基本上均一的形式”和“基本上均一”用于表示基本上不含来源于不期望的多肽组合(例如同源二聚体)的副产物的产物。在该语境中，所关注的种类是包含H1和L1(H1-L1)或H2和L2(H2-L2)的异源二聚体。污染物包括包含H1和L2(H1-L2)或H2和L1(H2-L1)的异源二聚体或包含H1和L1或H2和L2(无论Fab部分是正确配对的还是错配的)。就纯度而言，基本上均一意指副产物的量不超过10％，例如混合物中存在的所有种类的总LC-MS强度小于5％、小于1％或小于0.5％，其中该百分比反映了质谱分析的结果。
短语“选择性(或特异性)杂交至”是指当该序列存在于复合混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时，在严格杂交条件下分子仅与特定的核苷酸序列结合、成对或杂交。
抗体技术领域的技术人员理解的术语，每个均具有本领域赋予的含义，除非在本文中明确地具有不同的定义。已知抗体具有可变区、铰链区和恒定结构域。免疫球蛋白结构和功能在例如Harlow等编，Antibodies：A Laboratory Manual，第14章(Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1988)中有所评述。
如本文所用，术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“抗原结合多肽构建体”可互换使用。“抗原结合多肽构建体”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因，或它们的一个或多个片段编码的多肽，该多肽特异性地结合分析物(抗原)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被归类为κ或λ。重链被归类为γ、μ、α、δ或ε，继而分别定义免疫球蛋白同种型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。另外，抗体可属于多个亚型之一，例如，IgG可属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。术语“轻链”包括具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的全长轻链及其片段。全长轻链包括可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域位于多肽的氨基末端。轻链包括κ链和λ链。术语“重链”包括具有足够的可变区序列以赋予结合特异性的全长重链及其片段。全长重链包括可变区结构域VH和三个恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域位于多肽的氨基末端，CH结构域位于羧基末端，其中CH3最靠近多肽的羧基末端。重链可属于任何同种型，包括IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)、IgA(包括IgA1和IgA2亚类)、IgM和IgE。术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体的一部分轻链和/或重链，通常负责抗原识别，通常包括大约重链(VH)中的氨基末端120至130个氨基酸和轻链(VL)中的约100至110个氨基末端氨基酸。“互补决定区”或“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区(FR)可有助于维持CDR的适当构象，以促进抗原结合区和抗原之间的结合。在结构上，框架区可位于CDR之间的抗体。可变区通常表现出相同的相对保守框架区(FR)的通式结构，该框架区通过三个高变区CDR连接。每对的两条链的CDR通常通过框架区对齐，该框架区可允许与特定表位结合。从N-末端至C-末端，轻链和重链可变区二者通常包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4结构域。每个结构域的氨基酸分配通常根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1987and 1991))的定义进行，除非另外指明。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体包含连接至治疗多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽构建体中包括的免疫球蛋白结构域来自基于免疫球蛋白的构建体，诸如双抗体或单体。在某些实施方案中，本文所述的抗原结合多肽构建体包含来自重链抗体诸如羊驼抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽构建体包含来自哺乳动物抗体诸如牛抗体、人抗体、羊驼抗体(单结构域和非单结构域)、啮齿类抗体、人源化抗体、非人源化抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文提供的抗原结合多肽构建体包含来自合成文库生成的抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
“双特异性”、“双重特异性”或“双功能”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白。双特异性抗原结合蛋白和抗体是一种多特异性抗原结合蛋白抗体种类。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个结合位点将结合两个不同的表位，该表位可存在于相同或不同的分子靶标。“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”是靶向超过一个抗原或表位的抗体。“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。在一些情况下，两个结合位点具有相同的抗原特异性。二价抗原结合蛋白和二价抗体可以是双特异性的，参见下文。在某些实施方案中，除“多特异性”或“多功能”抗体之外的二价抗体通常被理解为每个结合位点是相同的。
术语“优先配对”在本文中用于描述第一多肽与第二多肽的配对方式，例如抗原结合多肽构建体和本文所述的异源二聚体对中的免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链。因此，“优先配对”是指在第一和第二多肽之间发生配对的同时存在一种或多种另外的不同多肽时，第一多肽与第二多肽的优选配对。通常优先配对的发生是第一和第二多肽中的一者或二者的修饰(例如，氨基酸修饰)的结果。通常，优先配对产生第一和第二多肽配对，是配对发生后存在的最丰富的二聚体。本领域已知，如果免疫球蛋白重链(H1)与两条不同的免疫球蛋白轻链(L1和L2)共表达，将在统计学上等几率地与两条轻链配对，产生H1与L1配对和H1与L2配对的大约50∶50混合物。在该语境中，当H1与L1和L2二者共表达时，如果H1-L1重链-轻链异源二聚体的量大于H1-L2异源二聚体的量，“优先配对”将发生在例如H1和L1之间。因此，在这种情况下，与L2相比H1优先地与L1配对。
然而，在从两个起始抗体系统生成野生型双特异性抗体的语境中，本领域还已知，在一些情况下，当一个抗体系统的轻链优先地与两个抗体系统的重链配对时，存在固有偏爱性。因此，当在双特异性抗原结合构建体的语境中确定设计强度时，与野生型系统中的配对程度相比，评估该设计的配对程度可为必要的。因此，在一个实施方案中，如果所需的双特异性抗体的量大于在野生型系统中获得的所需的双特异性抗体的量，则设计被认为显示出优先配对。在另一个实施方案中，如果在抗体的较弱臂中，配对的量大于野生型系统中存在的量，则设计被认为显示出优先配对。
抗体重链与抗体轻链配对，并且在一个或多个“界面”彼此会合或接触。“界面”包括第一多肽的一个或多个“接触”氨基酸残基，所述残基与第二多肽的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用。例如，界面存在于二聚化CH3结构域的CH3多肽序列之间、重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间以及重链的VH结构域和轻链的VL结构域之间。“界面”可来源于IgG抗体，例如来源于人IgG1抗体。
如本文所用，术语“氨基酸修饰”包括但不限于氨基酸突变、插入、缺失、置换、化学修饰、物理修饰和重排。
抗原结合多肽构建体和异源二聚体对
本文所述的抗原结合多肽构建体可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体；每个异源二聚体通过免疫球蛋白重链与免疫球蛋白轻链的配对获得。免疫球蛋白重链和轻链的恒定和可变结构域的结构和组织是本领域熟知的。免疫球蛋白重链通常包含一个可变(VH)结构域和三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。免疫球蛋白轻链通常包含一个可变(VL)结构域和一个恒定(CL)结构域。可对这些典型的形式作出各种修饰。
本文所述的抗原结合多肽构建体和异源二聚体对可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，每个异源二聚体包含具有至少VH和CH1结构域的免疫球蛋白/抗体重链或其片段，以及具有VL结构域和CL结构域的免疫球蛋白/抗体轻链。在一个实施方案中，异源二聚体对和抗原结合多肽构建体的两个异源二聚体包含全长免疫球蛋白重链。在另一个实施方案中，异源二聚体对或抗原结合多肽构建体的两个异源二聚体包含免疫球蛋白重链(包括至少VH和CH1结构域)的片段。在一个实施方案中，异源二聚体对的两个异源二聚体包含免疫球蛋白重链(包含至少VH和CH1结构域)的氨基末端片段。在另一个实施方案中，异源二聚体对的两个异源二聚体包含免疫球蛋白重链(包含至少VH和CH1结构域)的羧基末端片段。
异源二聚体对的每个异源二聚体可特异性结合至抗原或表位。在一个实施方案中，每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链源自已知抗体例如治疗抗体的一个或多个修饰或由其工程化。治疗抗体是用于在患有或倾向于患有疾病或病症的哺乳动物中治疗疾病或病症的抗体。每个异源二聚体来源的合适的治疗抗体包括但不限于阿巴伏单抗(abagovomab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿伦单抗(alemtuzumab)、aurograb、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、布雷奴单抗(briakinumab)、卡那单抗(canakinumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、聚乙二醇化塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗、达利珠单抗(daclizumab)、地诺单抗(denosumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、加利昔单抗(galiximab)、吉妥珠单抗奥加米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈里木单抗(golimumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英夫利昔单抗(infliximab)、依匹木单抗(ipilimumab)、鲁昔单抗(lumiliximab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫维珠单抗(motavizumab)、莫罗单抗(muromonab)、mycograb、那他珠单抗(natalizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马佐单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、雷尼珠单抗(ranibizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、特普利珠单抗(teplizumab)、托西珠单抗(tocilizumab/atlizumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥单抗(trastuzumab)、普罗昔铵(ProxiniumTM)、RencarexTM、优特克单抗(ustekinumab)和扎鲁目单抗(zalutumumab)。
在一个实施方案中，每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链源自结合分子的抗体的一个或多个修饰或由其工程化，该分子包括但不限于以下蛋白质列表，以及属于以下蛋白质列表的亚基、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体化激素；高血糖素；凝血因子诸如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和温韦伯氏因子；抗凝血因子诸如蛋白C；心房利尿钠因子；肺表面活性剂；血纤维蛋白溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿或组织型血纤维蛋白溶酶原活化剂(t-PA)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(活化时调节的正常T细胞表达和分泌因子)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白诸如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；胞毒T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体，诸如例如EGFR、VEGFR；干扰素诸如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子诸如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子诸如AFGF和PFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(大脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白诸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；促红细胞生成素；骨生成诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，例如IL-1至IL-13；TNF-α，超氧物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如AIDS包膜的一部分，例如gp120；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；细胞粘附分子诸如LFA-1、Mac 1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM，a4/p7整合素和(Xv/p3整合素包括或其亚基，整合素α亚基诸如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整合素β亚基诸如CD29、CD 18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整合素亚基组合包括但不限于αVβ3、αVβ5和α4β7；细胞凋亡途径的成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mp1受体；CTLA-4；蛋白C；Eph受体诸如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)诸如HLA-DR；补体蛋白诸如补体受体CR1、C1Rq和其他补体因子诸如C3和C5；糖蛋白受体诸如GpIb.α.、GPIIb/IIIa和CD200；以及任何上述列出的多肽的片段。
在一个实施方案中，每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和/或轻链源自特异性结合癌症抗原的抗体的一个或多个修饰或由其工程化，该抗体包括但不限于ALK受体(多效生长因子受体)、多效生长因子、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸；前列腺特异性抗原(PSA)；黑素瘤相关抗原p97；黑素瘤抗原gp75；高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多态性上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结肠直肠肿瘤相关抗原诸如：CEA、TAG-72、C017-1A、GICA 19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑素瘤特异性抗原诸如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植型细胞表面抗原(TSTA)；病毒引起的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原甲胎蛋白诸如结肠的CEA、514癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原；分化抗原诸如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤的抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；拟糖蛋白；神经鞘脂类；乳腺癌抗原诸如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多态性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；分化抗原，诸如存在于胎儿红细胞的I抗原；存在于成人红细胞的原内胚层I抗原；植入前胚胎；存在于胃腺癌的I(Ma)；存在于乳腺上皮的M18、M39；存在于骨髓细胞的SSEA-1；VEP8；VEP9；Myl；Va4-D5；存在于结肠直肠癌的D156-22；TRA-1-85(血型H)；存在于睾丸和卵巢癌的SCP-1；存在于结肠腺癌的C14；存在于肺腺癌的F3；存在于胃癌的AH6；Y半抗原；存在于胚胎癌性细胞的Ley；TL5(血型A)；存在于A431细胞的EGF受体；存在于胰腺癌的E1系列(血型B)；存在于胚胎癌性细胞的FC10.2；胃腺癌抗原；存在于腺癌的CO-514(血型Lea)；存在于腺癌的NS-10；CO-43(血型Leb)；存在于A431细胞的EGF受体的G49；存在于结肠腺癌的MH2(血型ALeb/Ley)；存在于结肠癌症的19.9；胃癌粘蛋白；存在于骨髓细胞的T5A7；存在于黑素瘤的R24；存在于胚胎癌性细胞的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1∶22∶25∶8以及存在于4至8细胞期胚胎的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；Sialy Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12valiant A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关大脑-睾丸癌抗原(肿瘤性神经抗原MA2；副肿瘤神经元抗原)；神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4-a、MAGE-4-b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)以及任何上述列出的多肽的片段。
人抗体可归类为同种型，包括IgG、IgA、IgE、IgM和IgD。在一个实施方案中，Fc来源于IgG同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgA同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgE同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgM同种型。在另一个实施方案中，Fc来源于IgD同种型。
人IgG抗体也可分为亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，在一些实施方案中，设想了Fc可来源于抗体的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。
异源二聚体对的每个异源二聚体可特异性结合至抗原或表位。在一个实施方案中，异源二聚体对的每个异源二聚体结合相同的表位。在另一个实施方案中，异源二聚体对的第一异源二聚体特异性结合一个抗原上的表位，异源二聚体对的第二异源二聚体特异性结合相同抗原上不同的表位。在另一个实施方案中，异源二聚体对的第一异源二聚体特异性结合第一抗原上的表位，异源二聚体对的第二异源二聚体特异性结合不同于第一抗原的第二抗原上的表位。例如，在一个实施方案中，第一异源二聚体特异性结合组织因子，而第二异源二聚体特异性结合抗原Her2(ErbB2)，反之亦然。在可供选择的实施方案中，第一异源二聚体特异性结合组织因子，而第二异源二聚体特异性结合EGFR，反之亦然。在另一个实施方案中，第一异源二聚体特异性结合EGFR，而第二异源二聚体特异性结合抗原Her2，反之亦然。在另一个实施方案中，第一异源二聚体特异性结合上述分子或癌症抗原。在另一个实施方案中，第二异源二聚体特异性结合上述分子或癌症抗原。
如上所述，在一些实施方案中，每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链源自已知治疗抗体或结合各种靶标分子或癌症抗原的抗体的一个或多个修饰或由其工程化。许多此类分子的氨基酸和核苷酸序列是易得的(参见例如GenBank：AJ308087.1(人源化抗人组织因子抗体D3H44轻链可变区和CL结构域)；GenBank：AJ308086.1(人源化抗人组织因子抗体D3H44重链可变区和CH1结构域)；GenBank：HC359025.1(帕妥珠单抗Fab轻链基因模块)；GenBank：HC359024.1(帕妥珠单抗Fab重链基因模块)；GenBank：GM685465.1(抗体曲妥单抗(＝贺癌平(Herceptin))-野生型；轻链)；GenBank：GM685463.1(抗体曲妥单抗(＝贺癌平)-野生型；重链)；GenBank：GM685466.1(抗体曲妥单抗(＝贺癌平)-GC优化的轻链)；以及GenBank：GM685464.1(抗体曲妥单抗(＝贺癌平)-GC优化的重链))。本文所述的每个GenBank编号的序列可得自NCBI网站，最后更新2012年11月28日，并且各自以引用的方式整体并入用于所有目的。西妥昔单抗的氨基酸和核苷酸序列也是本领域已知的，参见例如由Canadian Institutes of Health Research.Alberta Innovates-Health Solutions和The Metabolomics Innovation Centre(TMIC)提供支持的Drug Bank网站，登录号DB00002。
在一些方面，分离的抗原结合多肽构建体包含与本文公开的表格或登录号示出的氨基酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，分离的抗原结合多肽构建体包含与本文公开的表格或登录号示出的核苷酸序列或其片段具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。
免疫球蛋白重链和轻链的氨基酸修饰
异源二聚体对的异源二聚体中的至少一个可包含免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的一个或多个氨基酸修饰，使得第一异源二聚体的重链优先地与轻链中的一者而非其他轻链配对。同样，第二异源二聚体的重链可优先地与第二轻链而非第一轻链配对。所述一条重链与两条轻链中的一者优先配对可基于包含一条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的设计集(称为LCCA设计集)，其中当免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，免疫球蛋白重链优先地与两条免疫球蛋白轻链中的一者而非另一者配对。因此，LCCA设计集可包含一条免疫球蛋白重链、第一免疫球蛋白轻链和第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰包含一个或多个氨基酸置换。
在一个实施方案中，LCCA设计集中示出的优先配对通过修饰作为轻链和重链之间的界面的一部分的一个或多个氨基酸来建立。在一个实施方案中，LCCA设计集中示出的优先配对通过修饰免疫球蛋白重链的CH1结构域、第一免疫球蛋白轻链的CL结构域以及第二免疫球蛋白轻链的CL结构域中的至少一个中的一个或多个氨基酸来建立。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸修饰被限制于可变(VH、VL)和恒定(CH1、CL)结构域的保守框架残基，如残基的Kabat编号所示。例如，Almagro[Frontiers InBioscience(2008)13：1619-1633]根据Kabat、Chotia和IMGT编号方案提供了框架残基的定义。
在一个实施方案中，异源二聚体中的至少一个包含引入彼此互补的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的一个或多个突变。重链和轻链界面处的互补可在空间和疏水接触、静电/电荷相互作用或多种相互作用的组合的基础上实现。蛋白质表面之间的互补在文献中以锁钥配合、钮入扣、凸起和凹槽、供体和受体等进行了广泛描述，这些均暗示了两个相互作用表面之间的结构和化学匹配的性质。在一个实施方案中，异源二聚体中的至少一个包含一个或多个突变，其中引入免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的突变，在界面处的轻链和重链之间引入新的氢键。在一个实施方案中，异源二聚体中的至少一个包含一个或多个突变，其中引入免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的突变，在界面处的轻链和重链之间引入新的盐桥。
合适的LCCA设计集的非限制性实例在实施例、表格和附图中有所描述。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中无任何氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在另一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含CH1结构域中具有至少三个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、CL结构域中具有至少四个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及CL结构域中具有至少三个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集中示出的优先配对通过修饰免疫球蛋白重链的VH结构域、第一免疫球蛋白轻链的VL结构域以及第二免疫球蛋白轻链的VL结构域中的至少一个中的一个或多个氨基酸来建立。合适的LCCA设计集的非限制性实例如下列表格和实施例所示。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中无氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少一个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中无氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中具有至少两个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，LCCA设计集包含VH结构域中具有至少两个氨基酸修饰的免疫球蛋白重链、VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第一免疫球蛋白轻链以及VL结构域中具有至少一个氨基酸修饰的第二免疫球蛋白轻链。
在一个实施方案中，可组合LCCA设计集以提供包含两个不同的免疫球蛋白重链(H1和H2)和两个不同的免疫球蛋白轻链(L1和L2)的组合，其中当H1、H2、L1和L2共表达时，H1优先地与L1配对，H2优先地与L2配对。在一些实施方案中，本文所述的氨基酸修饰处于双特异性抗体构建体的语境中。例如，本文所述的设计集可掺入到全长免疫球蛋白重链，使得该全长重链优先地与免疫球蛋白轻链配对。在一些实施方案中，全长免疫球蛋白重链包含有助于在Fc区中二聚化的氨基酸修饰，如实施例所述。
本文所述的特定氨基酸修饰转移至其他抗体的可转移性：
虽然上述免疫球蛋白重链和轻链的特定氨基酸修饰结合D3H44抗组织因子胞外结构域抗体曲妥单抗和西妥昔单抗免疫球蛋白重链和轻链进行了描述，但就下文而言，本文设想和示出(参见实施例、附图和表格)这些氨基酸修饰可转移至其他免疫球蛋白重链和轻链，产生一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链中的一者优先配对的类似方式。
在免疫球蛋白重链和轻链之间的界面中VH∶VL和CH1∶CL界面残基是相对较保守的(Padlan等，1986，Mol.Immunol.23(9)：951-960)。该序列保守性是进化约束的结果，增加了在轻链和重链的组合配对期间形成功能活化的抗体结合结构域的可能性。由于该序列保守性，允许上述D3H44特定实例中的序列修饰(其驱动优先配对)转移至其他重链和轻链对异源二聚体，就优先配对而言获得大约等同的结果，因为该区在抗体中显示出高度序列保守性；另外，当出现序列差异时，这些差异通常位于CH1∶CL界面的远侧。特别是对于CH1和CL结构域来说，情况就是这样。然而，就CDR(互补决定区)环残基(和长度)，特别是CDR-H3而言，抗原结合位点处存在一些序列波动。因此，在一个实施方案中，本文所述的异源二聚体对包含这样的异源二聚体：其中当抗原结合位点的氨基酸序列与D3H44抗体的显著不同时，至少一个异源二聚体包含位于CDR环的远侧的VH和/或VL结构域中的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，本文所述的异源二聚体对包含这样的异源二聚体：其中当抗原结合位点的氨基酸序列与D3H44抗体的基本上相同时，至少一个异源二聚体包含位于CDR环的近侧或远侧的VH和/或VL结构域中的一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可根据人或人源化IgG1/κ转移至抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类IgG1/κ链的非限制性实例包括奥法木单抗(对于人)或曲妥单抗、帕妥珠单抗或贝伐单抗(对于人源化)。
在另一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可利用常用的VH和VL亚群转移至抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类抗体的非限制性实例包括帕妥珠单抗。
在一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至框架接近生殖系的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类抗体的实例包括奥奴珠单抗(Obinutuzumab)。
在一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至VH∶VL结构域间角接近所观察的重链和轻链对的平均值的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。该类型抗体的实例包括但不限于帕妥珠单抗。在另一个实施方案中，本文所述的氨基酸修饰可转移至具有典型CL和CH1结构域的抗体的免疫球蛋白重链和轻链。此类抗体的合适实例包括但不限于曲妥单抗。
在一些实施方案中，本文所述的氨基酸修饰的某些子集用于上文提供的抗原结合构建体中的可变结构域。
实施例、附图和表格显示，氨基酸修饰(例如，在包含可变区和恒定区的一个或多个Fab片段内)可转移至其他免疫球蛋白重链和轻链，产生一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链中的一者优先配对的类似方式。
优先配对
如上所述，本文所述的抗原结合构建体/异源二聚体对的至少一个异源二聚体可包含其免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的一个或多个氨基酸修饰，使得一个异源二聚体的重链例如H1优先地与一条轻链例如L1而非另一条轻链L2配对，另一个异源二聚体的重链H2优先地与轻链L2而非轻链L1配对。换句话讲，所需的优先配对被认为在H1和L1之间以及H2和L2之间。相对于对应的H1/L1对与不含一个或多个氨基酸修饰的H2/L2对的各自配对，当H1与L1和L2组合时，如果H1-L1异源二聚体的产率大于错配的H1-L2异源二聚体的产率，则认为在例如H1和L1之间发生优先配对。同样，相对于对应的H1-L1对与不含一个或多个氨基酸修饰的H2-L2对的各自配对，当H2与L1和L2组合时，如果H2-L2异源二聚体的产率大于错配的H2-L1异源二聚体的产率，则认为在H2和L2之间发生优先配对。在该语境中，包含H1和L1(H1-L1)或H2和L2(H2-L2)的异源二聚体在本文中称为优先配对的、正确配对的、专性配对的或所需的异源二聚体，而包含H1和L2(H1-L2)或H2和L1(H2-L1)的异源二聚体在本文中称为错配的异源二聚体。两条重链和两条轻链对应的突变集意味着实现H1-L1和H2-L2的选择性配对，该突变集称为设计集。
因此，在一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于55％。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于60％。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于70％。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于80％。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于90％。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体的相对产率大于95％。
在上述实例中，当H1与L1和L2共表达时，如果所需的H1-L1异源二聚体的量大于错配的H1-L2异源二聚体的量，则认为在H1-L1之间发生优先配对。相似地，当H2与L1和L2共表达时，如果所需的H2-L2异源二聚体的量大于错配的H2-L2异源二聚体的量，则认为在H2-L2之间发生优先配对。因此，在一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于1.25∶1。在一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于1.5∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于2∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于3∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于5∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于10∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于25∶1。在另一个实施方案中，当异源二聚体的一条免疫球蛋白重链与两条免疫球蛋白轻链共表达时，所需的异源二聚体与错配的异源二聚体的比率大于50∶1。
在一些实施方案中，本文所述的异源二聚体优先地配对形成双特异性抗体。在一些实施方案中，该构建体包含优先地配对形成选自D3H44/曲妥单抗、D3H44/西妥昔单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗的双特异性抗体的异源二聚体。在一些实施方案中，双特异性抗体包含表28a-28c中描述的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，两个全长重链构建体与两个独特的轻链构建体共表达，得到十种可能的抗体种类：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2、H1-L1∶H1-L2、H2-L1∶H2-L1、H2-L2∶H2-L2、H2-L1∶H2-L2、H1-L1∶H2-L1、H1-L2∶H2-L2、H1-L2∶H2-L1和H1-L1∶H2-L2。H1-L1∶H2-L2种类被视为正确配对的双特异性抗体种类。在一些实施方案中，选择DNA比率以得到最大量的正确配对的双特异性抗体种类。例如，在一些实施方案中，H1∶H2∶L1∶L2的比率为15∶15∶53∶17。在一些实施方案中，H1∶H2∶L1∶L2的比率为15∶15∶17∶53。
在一些实施方案中，正确配对的双特异性种类相对于所有种类的百分比为至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(参见例如，表29a-29c和30a-30c)。在一些实施方案中，正确配对的双特异性种类的百分比大于对应的不含表28a-28c中描述的氨基酸修饰的野生型H1、H2、L1和L2共表达获得的正确配对的双特异性种类的百分比。在一些实施方案中，与不含表28a-28c中描述的氨基酸修饰野生型H1、H2、L1和L2共表达获得的正确配对的双特异性种类的百分比相比，正确配对的双特异性种类的百分比降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或75％。
异源二聚体的热稳定性
除有助于优先配对之外，选择氨基酸置换以使得突变不会使Fab异源二聚体变得不稳定。因此，在大多数情况下，Fab异源二聚体的稳定性测量值非常接近野生型Fab(例如，在野生型Fab的3℃内)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的异源二聚体对的每个异源二聚体具有的热稳定性相当于包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、但不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体。在一个实施方案中，热稳定性通过熔融温度或Tm的测定。因此，在一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约10℃内。因此，在一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约5℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约3℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约2℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约1.5℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约1℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约0.5℃内。在另一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约0.25℃内。
此外，在一些实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性相对于包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体出乎意料地改善(即，增加)。因此，在一个实施方案中，本文描述的异源二聚体的热稳定性与包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体相比增加约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.5、5.0℃或更多。
异源二聚体对抗原的亲和力
在一个实施方案中，异源二聚体对的每个异源二聚体对其各自抗原的亲和力相同或相当于包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、但不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体。在一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约50倍内。在一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约25倍内。在一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约10倍内。在另一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约5倍内。在另一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约2.5倍内。在另一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约2倍内。在另一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力在包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体的约1.5倍内。在另一个实施方案中，异源二聚体对的异源二聚体对其各自抗原的亲和力与包含相同的免疫球蛋白重链和轻链、不含本文所述的CH1、CL、VH或VL结构域的氨基酸修饰的异源二聚体大约相同。
另外的任选修饰
在一个实施方案中，本文所述的异源二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链可进一步修饰(即，通过各种类型分子的共价连接)，以使得共价连接不妨碍重链和轻链之间的优先配对，或影响异源二聚体结合其抗原的能力，或影响其稳定性。此类修饰包括例如但不限于糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封端基团衍生化、蛋白酶切割、连接至细胞配体或其他蛋白质等。可通过已知的技术进行任何多种化学修饰，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
在另一个实施方案中，本文所述的异源二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链可缀合(直接或间接)至修饰给定的生物学应答的治疗剂或药物部分。治疗剂或药物部分不应解释为限于经典的化疗剂。例如，药物部分可以是具有所需的生物学活性的蛋白质或多肽。此类蛋白质可包括例如毒素诸如相思豆毒素、蓖麻毒素A、豹蛙抗瘤酶(Onconase)(或另一种胞毒RNA酶)、假单胞菌外毒素、霍乱毒素或白喉毒素；蛋白质诸如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、细胞凋亡剂例如TNF-α、TNF-β、AIM I(参见国际专利公开No.WO 97/33899)、AIM II(参见国际专利公开No.WO 97/34911)、Fas配体(Takahashi等，1994，J.Immunol.，6：1567)和VEGI(参见国际专利公开No.WO 99/23105)；血栓生成剂或抗血栓生成剂例如血管抑素或内皮抑素；或生物学应答调节剂诸如例如淋巴因子(例如，白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))或生长因子(例如，生长激素(“GH”))。
此外，在替代实施方案中，抗体可缀合至治疗部分，诸如用于缀合放射性金属离子的放射性物质或大环螯合剂(参见上文放射性物质的实例)。在某些实施方案中，大环螯合剂是1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″-四乙酸(DOTA)，它可通过接头分子连接至抗体。此类接头分子是本领域熟知的，并且在Denardo等，1998，Clin Cancer Res.4：2483；Peterson等，1999，Bioconjug.Chem.10：553；以及Zimmerman等，1999，Nucl.Med.Biol.26：943中有所描述。
在一些实施方案中，异源二聚体的免疫球蛋白重链和轻链以包含标签的融合蛋白表达，该标签有利于纯化和/或测试等。如本文所述，“标签”是任何添加的氨基酸系列，可存在于蛋白质的C-末端、N-末端或内部，以便有助于蛋白质的鉴定或纯化。合适的标签包括但不限于本领域技术人员已知的用于纯化和/或测试的标签，诸如白蛋白结合结构域(ABD)、His标签、FLAG标签、谷胱甘肽-s-转移酶、血凝素(HA)和麦芽糖结合蛋白。此类标记蛋白也可工程改造为包含切割位点，诸如凝血酶、肠激酶或因子X切割位点，以便于在纯化之前、期间或之后移除标签。
在一些实施方案中，形成链间二硫键的轻链(位置214，Kabat编号)和重链(位置233，Kabat编号)的Fab结构域底部的一个或多个半胱氨酸残基可修饰为丝氨酸或丙氨酸或非半胱氨酸或不同的氨基酸。
设想可对免疫球蛋白重链作出另外的氨基酸修饰，以提高优先配对水平和/或异源二聚体对的热稳定性。例如，可对免疫球蛋白重链Fc结构域作出另外的氨基酸修饰，以驱动异源二聚体对相对于同源二聚体对之间的优先配对。此类氨基酸修饰是本领域已知的，并且包括例如美国专利公开No.2012/0149876描述的那些修饰。或者，也可利用驱动异源二聚体对相对于同源二聚体对之间的优先配对的替代策略，诸如例如，“钮入扣”、具有离子相互作用的带电残基以及链交换工程改造结构域(SEED)技术。后面的策略在本领域中有所描述，并且在Klein等，出处同上中有所评述。Fc结构域的进一步讨论如下。
Fc结构域
在其中抗原结合多肽构建体包含全长免疫球蛋白重链的实施方案中，构建体将包含Fc。在一些方面，该Fc包含至少一个或两个CH3结构域序列。在一些方面，当抗原结合多肽构建体包含异源二聚体(仅包含重链的Fab区)时，该Fc通过或不通过一个或多个接头连接至第一异源二聚体和/或第二异源二聚体。在一些方面，该Fc是人Fc。在一些方面，该Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面，该Fc是异源二聚体Fc。在一些方面，该Fc包含至少一个或两个CH2结构域序列。
在一些方面，该Fc包含CH3结构域序列中的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，该Fc包含CH2结构域序列中的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单条多肽。在一些方面，Fc是多条肽，例如两条多肽。
在一些方面，该Fc包含CH3序列中的至少一个的一个或多个修饰。在一些方面，该Fc包含CH2序列中的至少一个中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc是单条多肽。在一些方面，Fc是多条肽，例如两条多肽。
在一些方面，Fc是提交于2011年11月4日的专利申请PCT/CA2011/001238或提交于2012年11月2日的PCT/CA2012/050780中描述的Fc，每个专利申请的全部公开内容据此以引用的方式整体并入用于所有目的。
在一些方面，本文所述的构建体包含这样的异源二聚体Fc：其包含经不对称修饰的修饰CH3结构域。异源二聚体Fc可包含两条重链恒定结构域多肽：第一重链多肽和第二重链多肽，它们可互换使用，前提条件是Fc包含一条第一重链多肽和一条第二重链多肽。一般来讲，第一重链多肽包含第一CH3序列，第二重链多肽包含第二CH3序列。
当两个CH3序列二聚化时，包含以不对称方式引入一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列通常产生异源二聚体Fc而非同源二聚体。如本文所用，“不对称氨基酸修饰”是指其中第一CH3序列上的特定位置处的氨基酸不同于相同位置处第二CH3序列上的氨基酸的任何修饰，并且第一和第二CH3序列优先地配对形成异源二聚体而非同源二聚体。此异源二聚化可以是仅修饰每个序列上相同的对应氨基酸位置处两个氨基酸中的一者；或修饰第一和第二CH3序列中的每个的相同的对应位置处每个序列上的两个氨基酸的结果。异源二聚体Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或超过一个不对称氨基酸修饰。
表X提供了全长人IgG1重链的氨基酸231至447对应的人IgG1Fc序列的氨基酸序列。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
通常Fc可包括能够二聚化的两个邻接的重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包括以下位置处的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390(使用EU编号)。在一些方面，Fc包括表X示出的突变体序列。在一些方面，Fc包括变体1A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体2A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体3A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体4A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体5A-B的突变。
第一和第二CH3序列可包含本文结合全长人IgG1重链的氨基酸231至447所述的氨基酸突变。在一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置F405和Y407处的氨基酸修饰，并且第二CH3序列具有位置T394处的氨基酸修饰。在一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有选自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰，第二CH3序列具有选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，第一或第二CH3序列中的一者还包含位置Q347处的氨基酸修饰，其他CH3序列还包含位置K360处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，第一或第二CH3序列中的一者还包含位置Q347处的氨基酸修饰，其他CH3序列还包含位置K360处的氨基酸修饰，所述CH3序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列中的一者还包含氨基酸修饰D399R或D399K，其他CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列中的一者还包含氨基酸修饰D399R或D399K，其他CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一个或多个，所述CH3序列中的一者或二者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异源二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其中第一CH3序列具有位置L351、F405和Y407处的氨基酸修饰，第二CH3序列具有位置T366、K392和T394处的氨基酸修饰，其中所述CH3序列中的一者或两者还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异源二聚体Fc包括包含以下氨基酸修饰的经修饰的CH3结构域，其中“A”表示第一CH3序列的氨基酸修饰，“B”表示第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407V、B：T366L_K392M_T394W、A：L351Y_F405A_Y407V、B：T366L_K392L_T394W、A：T350V_L351Y_F405A_Y407V、B：T350V_T366L_K392L_T394W、A：T350V_L351Y_F405A_Y407V、B：T350V_T366L_K392M_T394W、A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
一个或多个不对称氨基酸修饰可有助于异源二聚体Fc的形成，其中异源二聚体CH3结构域具有相当于野生型同源二聚体CH3结构域的稳定性。在一个实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰有助于异源二聚体Fc结构域的形成，其中异源二聚体Fc结构域具有相当于野生型同源二聚体Fc结构域的稳定性。在一个实施方案中，一个或多个不对称氨基酸修饰有助于异源二聚体Fc结构域的形成，其中异源二聚体Fc结构域具有在差示扫描量热研究中通过熔融温度(Tm)观察的稳定性，并且其中熔融温度在所观察的对应的对称野生型同源二聚体Fc结构域的4℃内。在一些方面，Fc包含CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰，该修饰有助于形成稳定性相当于野生型同源二聚体Fc的异源二聚体Fc。
在一个实施方案中，CH3结构域的稳定性可通过例如利用差示扫描量热法(DSC)测定CH3结构域的熔融温度来评估。因此，在另外的实施方案中，CH3结构域具有约68℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约70℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约72℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约73℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约75℃或更高的熔融温度。在另一个实施方案中，CH3结构域具有约78℃或更高的熔融温度。在一些方面，二聚化CH3序列具有约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高的熔融温度(Tm)。
在一些实施方案中，与表达产物中的同源二聚体Fc相比，包含经修饰的CH3序列的异源二聚体Fc可以至少约75％的纯度形成。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc以大于约80％的纯度形成。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc以大于约85％的纯度形成。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc以大于约90％的纯度形成。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc以大于约95％的纯度形成。在另一个实施方案中，异源二聚体Fc以大于约97％的纯度形成。在一些方面，Fc在表达时是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体。在一些方面，Fc在通过单个细胞表达时是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体。
修饰单体Fc多肽以便有助于异源二聚体Fc形成的另外的方法在国际专利公开No.WO 96/027011(纽入扣)、Gunasekaran等(Gunasekaran K.et al.(2010)J BiolChem.285，19637-46，electrostatic design to achieve selectiveheterodimerization)、Davis等(Davis，JH.et al.(2010)Prot Eng Des Sel；23(4)：195-202，strand exchange engineered domain(SEED)technology)和Labrijn等[Efficientgeneration of stable bispecific IgG1by controlled Fab-arm exchange.LabrijnAF，Meesters JI，de Goeij BE，van den Bremer ET，Neijssen J，van Kampen MD，Strumane K，Verploegen S，Kundu A，Gramer MJ，van Berkel PH，van de Winkel JG，Schuurman J，Parren PW.Proc Natl Acad Sci US A.2013Mar 26；110(13)：5145-50]中有所描述。在一些实施方案中，本文所述的分离的构建体包括结合抗原的抗原结合构建体；以及相对于不包括相同的Fc多肽的抗原结合构建体，具有优良的生物物理学性质如稳定性，并且易于制备的二聚体Fc多肽构建体。Fc的重链序列中的许多突变在本领域中已知可选择性改变抗体Fc对不同的Fcγ受体的亲和力。在一些方面，该Fc包含有助于Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰。
CH2结构域是表X示出的序列的氨基酸231-340。示例性突变如下：
S298A/E333A/K334A，S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y、Verne s JM、Chiang N等，J Immunol Methods.，2011年2月28日，365(1-2)：132-41)；F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB、Gorlatov S、Tuaillon N等，Cancer Res.，2007年9月15日，67(18)：8882-90；Nordstrom JL、Gorlatov S、Zhang W等，Breast Cancer Res.，2011年11月30日，13(6)：R123)；F243L(Stewart R、Thom G、Levens M等，Protein Eng Des S el.，2011年9月，24(9)：671-8.)、S298A/E333A/K334A(ShieldsRL、Namenuk AK、Hong K等，J Biol Chem.，2001年3月2日、276(9)：6591-604)；S239D/I332E/A330L、S239D/I332E(Lazar GA、Dang W、Karki S等，Proc Natl Acad Sci U S A.，2006年3月14日、103(11)：4005-10)；S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY、Vostiar I、KarkiS等，Mol Immunol.，2008年9月，45(15)：3926-33)；S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D以及WO2011/120134和WO2011/120135列出的其他突变，这些突变以引用的方式并入本文。Therapeutic Antib ody Engineering(by William R.Strohland Lila M.Strohl，Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11，ISBN 1907568 37 9，2012年10月)第283页列出了突变。
在一些实施方案中，CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域包含有助于FcγR的选择性结合的一个或多个不对称氨基酸修饰。在一些实施方案中，CH2结构域允许本文所述的分离的构建体的分离和纯化。
FcRn结合和PK参数
如本领域已知，FcRn的结合使内吞的抗体从核内体循环回血流(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12：181-220；Ghetie等，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766)。该过程与肾过滤排除(由于全长分子的分子量较大)结合，得到在一至三周范围内的有利抗体血清半衰期。Fc结合到FcRn还在抗体转运中发挥关键作用。因此，在一个实施方案中，本发明的构建体能够结合FcRn。
改善效应子功能的另外的修饰。
在一些实施方案中，可修饰本文所述的构建体，以改善其效应子功能。此类修饰是本领域已知的，包括去盐藻糖基化，或工程改造抗体的Fc部分对活化的受体的亲和力主要是FCGR3a对ADCC和C1q对CDC。下表Y汇总了文献中报道的用于效应子功能工程改造的各种设计。
因此，在一个实施方案中，本文所述的构建体可包括包含一个或多个氨基酸修饰的二聚体Fc，所述氨基酸修饰如上表所述赋予改善的效应子功能。在另一个实施方案中，构建体可去盐藻糖基化，以改善效应子功能。
接头
本文所述的构建体可包括本文所述的一个或多个异源二聚体，该异源二聚体可操作地偶联到本文所述的Fc。在一些方面，Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到所述一个或多个异源二聚体。在一些方面，Fc直接偶联到所述一个或多个异源二聚体。在一些方面，Fc通过一个或多个接头偶联到所述一个或多个异源二聚体。在一些方面，Fc通过接头偶联到每个异源二聚体的重链。
在一些方面，所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。在一些方面，所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
异源二聚体对的制备方法
如上所述，本文所述的异源二聚体对可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，每个异源二聚体包含具有至少VH和CH1结构域的免疫球蛋白重链或其片段，以及具有VL结构域和CL结构域的免疫球蛋白轻链。异源二聚体的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链可易于使用本领域已知的重组DNA技术制备。标准技术诸如例如Sambrook and Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第3版，2001)；Sambrook等，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第2版，1989)；Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等，John Wiley and Sons，NewYork，第4版，1999)；以及Glick and Pasternak，Molecular Biotechnology：Principlesand Applications of Recombinant DNA(ASM Press，Washington，D.C.，第2版，1998)描述的那些技术可用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养、转基因掺入和重组蛋白质表达。或者，本文所述的异源二聚体和异源二聚体对可以是化学合成的。
衍生异源二聚体的抗体的免疫球蛋白重链和轻链的核酸和氨基酸序列是本领域已知的，或可易于使用核酸和/或蛋白质测序方法测定。将本文所述的标签基因融合至免疫球蛋白重链和/或轻链的方法是本领域已知的，并且这些方法中的一些在下文和实施例中有所描述。
例如，在宿主细胞中表达和共表达免疫球蛋白重链和轻链的方法是本领域熟知的。此外，使用重组DNA技术标记重链和/或轻链的方法也是本领域熟知的。适用于重链和轻链表达的表达载体和宿主细胞也是本领域熟知的，如下文所述。
双特异性抗体制备方法不依赖于仅使用表达全部四条链的单克隆或瞬时细胞系，该方法是本领域已知的(Gramer等，(2013)mAbs 5，962；Strop等，(2012)J Mol Biol 420，204.)。这些方法仅依赖在涉及双特异性抗体形成(氧化还原生成)的两对轻链和重链的氧化还原条件下进行的生成后臂交换。在该方法中，H1∶L1和H2∶L2对可在两种不同的细胞系中表达，以独立地生成两个Fab臂。随后，在选择氧化还原条件下混合两个Fab臂，以实现两条独特的重链H1和H2的再缔合，以形成包含L1∶H1∶H2∶L2链的双特异性抗体。可设想使用本文所述的设计文库/数据集利用氧化还原生成方法或该方法的改进形式来制备双特异性抗体。
某些实施方案中，利用无细胞蛋白质表达系统，而不使用活细胞来共表达多肽(例如，重链和轻链多肽)。相反，将DNA转录为RNA并将RNA翻译为蛋白质所需的所有组分(例如核糖体、tRNA、酶、辅因子、氨基酸)以溶液提供，供体外使用。在某些实施方案中，体外表达需要(1)编码重链和轻链多肽的遗传模板(mRNA或DNA)以及(2)包含必要的转录和翻译分子机器的反应溶液。在某些实施方案中，细胞提取物基本上提供了反应溶液的组分，例如：用于mRNA转录的RNA聚合酶、用于多肽翻译的核糖体、tRNA、氨基酸、酶辅因子、能量源和蛋白质正确折叠的关键细胞组分。无细胞蛋白质表达系统可使用来源于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、人细胞的裂解物或它们的组合制备。此类细胞裂解物可提供翻译所需的酶和结构单元的正确组合物和比例。在一些实施方案中，移除细胞膜，仅留下细胞的胞质溶胶和细胞器组分。
许多无细胞蛋白质表达系统是本领域已知的，如Carlson等，(2012)Biotechnol.Adv.30：1185-1194所评述。例如，无细胞蛋白质表达系统可基于原核或真核细胞获取。原核无细胞表达系统的实例包括来自大肠杆菌(E.coli.)的那些。真核无细胞蛋白质表达系统可基于例如兔网状细胞、小麦胚芽和昆虫细胞的提取物获取。此类原核和真核无细胞蛋白质表达系统可从诸如Roche、Invitrogen、Qiagen和Novagen的公司商购获得。本领域的技术人员可易于选择可生成能够彼此配对的多肽(例如，重链和轻链多肽)的合适无细胞蛋白质表达系统。另外，无细胞蛋白质表达系统也可补充分子伴侣(例如BiP)和异构酶(例如，二硫键异构酶)，以提高IgG折叠的效率。
在一些实施方案中，利用无细胞表达系统共表达来自DNA模板(转录和翻译)或mRNA模板(仅翻译)的重链和轻链多肽。
载体和宿主细胞
重链和轻链的重组表达需要构建包含编码重链或轻链(例如，抗体或融合蛋白)的多核苷酸的表达载体。一旦获得编码重链或轻链的多核苷酸，用于生成重链或轻链的载体可使用本领域熟知的技术通过重组DNA技术生成。因此，本文描述了通过表达包含编码重链或轻链的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域的技术人员熟知的方法可用于构建包含重链或轻链编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供包含可操作地连接至启动子的编码重链或轻链的核苷酸序列的可复制载体。
通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染细胞，以生成用于本发明的方法的经修饰的重链或轻链。在具体的实施方案中，在宿主细胞中共表达该方法所用的重链和轻链，以表达整个免疫球蛋白分子，如下文所详述。
许多宿主表达载体系统可用于表达经修饰的重链和轻链。此类宿主表达系统表示可生成和随后纯化所关注的编码序列的工具，还表示在转化或转染适当的核苷酸编码序列时，可原位表达经修饰的重链和轻链的细胞。这些宿主表达系统包括但不限于微生物，诸如转化有包含经修饰的重链和轻链编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；转化有包含经修饰的重链和轻链编码序列的重组酵母表达载体的酵母(例如，酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia))；转染有包含经修饰的重链和轻链编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)的昆虫细胞系统；转染有包含经修饰的重链和轻链编码序列重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或转化有包含经修饰的重链和轻链编码序列重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)的植物细胞系统；或具有包含来源于哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来源于哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、HEK-293、NSO和3T3细胞)。在某些实施方案中，将细菌细胞诸如大肠杆菌或真核细胞用于表达经修饰的重链和轻链，该重链和轻链是重组抗体或融合蛋白分子。例如，哺乳动物细胞(诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO))，结合载体(诸如来自人细胞巨化病毒的主要立即早期基因启动子元件)是抗体的有效表达系统(Foecking等，1986，Gene 45：101；和Cockett等，1990，Bio/Technology 8：2)。在具体实施方案中，编码每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和轻链的核苷酸序列的表达由组成型启动子、诱导型启动子或组织特异性启动子调控。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用许多基于病毒的表达系统。在其中腺病毒用作表达载体的情况下，所关注的经修饰的重链和轻链编码序列可连接至腺病毒转录/翻译控制复合物，例如晚期启动子和三联前导序列。然后该嵌合基因可通过体外或体内重组插入腺病毒基因组。插入病毒基因组的非必需区(例如，区域E1或E3)将产生存活的并且能够在感染的宿主中表达经修饰的重链和轻链的重组病毒(例如，参见Logan&Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：355-359)。特定的起始信号也可以是插入的抗体编码序列的有效翻译必须的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻的序列。此外，起始密码子必须与所需的编码序列的阅读框同相，以确保整个插入序列的翻译。这些外源翻译控制信号和起始密码子可具有许多来源，天然和合成均可。表达的效率可通过包括适当的转录增强子元件、转录终止子等来提高(参见例如，Bittner等，1987，Methods in Enzymol.153：516-544)。
异源二聚体的免疫球蛋白重链和轻链的表达可通过本领域已知的任何启动子或增强子元件控制。可用于控制编码经修饰的重链和轻链(例如，抗体或融合蛋白)的基因表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist and Chambon，1981，Nature 290：304-310)、劳氏肉瘤病毒的3′长末端重复序列中包含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78.1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，Nature 296：39-42)、四环素(Tet)启动子(Gossen等，1995，Proc.Nat.Acad.Sci.USA89：5547-5551)；原核细胞表达载体诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25；还可参见″Useful proteins from recombinantbacteria″in Scientific American，1980，242：74-94)；包含胭脂碱合成酶启动子区的植物表达载体(Herrera-Estrella等，Nature 303：209-213)或花椰菜花叶病毒35S RNA启动子(Gardner等，1981，Nucl.Acids Res.9：2871)以及光合作用酶核酮糖二磷酸羧化酶的启动子(Herrera-Estrella等，1984，Nature 310：115-120)；酵母或其他真菌的启动子元件诸如Gal 4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子以及以下表现出组织特异性并且用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等，1984，Cell 38：639-646；Ornitz等，1986，ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7：425-515)；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature 315：115-122)、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell 38：647-658；Adames等，1985，Nature 318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell45：485-495)、在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes andDevel.1：268-276)、在肝脏中有活性的α-胎儿球蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science 235：53-58)；在肝脏中有活性的α-1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在骨髓细胞中有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315：338-340；Kollias等，1986，Cell 46：89-94)；在大脑中的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314：283-286)；在神经元细胞中有活性的神经元特异性烯醇化酶(NSE)(Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)；在神经元细胞中有活性的脑源性神经营养因子(BDNF)基因控制区(Tabuchi等，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253：818-823)；在星形细胞中有活性的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Gomes等，1999，Braz J MedBiol Res 32(5)：619-631；Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)以及在下丘脑有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science 234：1372-1378)。
此外，可选择调节插入序列的表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。可在存在某些诱导物的情况下提高从某些启动子的表达；因此，可控制基因工程的融合蛋白的表达。此外，不同的宿主细胞具有用于翻译和翻译后加工和修饰(例如，蛋白质的糖基化、磷酸化)的特征和特定机制。可选择适当的细胞系或宿主系统来确保所表达的外源蛋白质的所需修饰和加工。例如，在细菌系统中表达将生成未糖基化的产物，在酵母中的表达将生成糖基化的产物。可使用具有基因产物的初级转录物的适当加工(例如，糖基化和磷酸化)的细胞机器的真核宿主细胞。此类哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERY、BHK、Hela、COS、MDCK、HEK-293、3T3、WI38、NSO，尤其是神经元细胞系，诸如例如SK-N-AS、SK-N-FI、SK-N-DZ人神经母细胞瘤(Sugimoto等，1984，J.Natl.Cancer Inst.73：51-57)、SK-N-SH人神经母细胞瘤(Biochim.Biophys.Acta，1982，704：450-460)、Daoy人小脑髓母细胞瘤(He等，1992，Cancer Res.52：1144-1148)、DBTRG-05MG胶质母细胞瘤细胞(Kruse等，1992，In Vitro Cell.Dev.Biol.28A：609-614)、IMR-32人神经母细胞瘤(Cancer Res.，1970，30：2110-2118)、1321N1人星形细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1977，74：4816)、MOG-G-CCM人星形细胞瘤(Br.J.Cancer，1984，49：269)、U87MG人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤(ActaPathol.Microbiol.Scand.，1968，74：465-486)、A172人胶质母细胞瘤(Olopade等，1992，Cancer Res.52：2523-2529)、C6大鼠胶质瘤细胞(Benda等，1968，Science 161：370-371)、Neuro-2a小鼠神经母细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1970，65：129-136)、NB41A3小鼠神经母细胞瘤(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1962，48：1184-1190)、SCP绵羊脉络丛(Bolin等，1994，J.Virol.Methods 48：211-221)、G355-5、PG-4猫正常星形细胞(Haapala等，1985，J.Virol.53：827-833)、Mpf雪貂大脑(Trowbridge等，1982，In Vitro 18：952-960)和正常细胞系，诸如例如CTX TNA2大鼠正常大脑皮质(Radany等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6467-6471)，诸如例如CRL7030和Hs578Bst。此外，不同的载体/宿主表达系统可以不同的程度影响加工反应。
就重组蛋白质的长期、高产率生成而言，稳定表达通常是优选的。例如，可工程改造稳定表达本发明的经修饰的重链和轻链(例如，抗体或融合蛋白)的细胞系。宿主细胞可转化适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和选择性标记控制的DNA，而不使用包含病毒复制起点的表达载体。在引入外源DNA后，允许工程改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后切换到选择培养基。重组质粒中的选择性标记赋予选择抗性，允许细胞将质粒稳定整合进染色体并生长形成灶，继而可克隆该灶并扩大至细胞系。
可使用许多选择系统，包括但不限于可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(Szybalska&Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺嘌呤磷酸核苷转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)基因。另外，抗代谢物抗性可用作dhfr(赋予甲氨蝶呤抗性)(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527)；gpt(赋予霉酚酸抗性)(Mulligan&Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo(赋予氨基糖苷G-418抗性)(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和hygro(赋予潮霉素抗性)(Santerre等，1984，Gene 30：147)基因选择的基础。
重链和轻链的共表达
本文所述的异源二聚体对的免疫球蛋白重链和轻链可在哺乳动物细胞中共表达，如上文所述。在一个实施方案中，一条重链与两条不同的轻链以上述LCCA设计集共表达，其中重链优先地与两条轻链中的一者配对。在另一个实施方案中，两条独特的重链与两条独特的轻链共表达，其中每条重链优先地与一条轻链配对。
异源二聚体对的测试
如上所述，本文所述的异源二聚体对的至少一个异源二聚体可包括其免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链的一个或多个氨基酸修饰，使得当异源二聚体对的两条独特的重链和两条独特的轻链在哺乳动物细胞中共表达时，第一异源二聚体的重链优先地与一条轻链而非另一条配对。同样，第二异源二聚体的重链优先地与第二轻链而非第一轻链配对。可以例如使用下文描述的方法评估优先配对的程度。可以如下文所述测试异源二聚体对的每个异源二聚体与其各自抗原的亲和力。还可如下文所述测试异源二聚体对的每个异源二聚体的热稳定性。
优先配对的测定方法
LCCA
在一个实施方案中，免疫球蛋白重链和轻链之间的优先配对通过进行轻链竞争分析(LCCA)来测定。提交于2013年10月3日的共同拥有的专利申请PCT/US2013/063306描述了LCCA的各种实施方案，该专利申请以引用的方式整体并入本文用于所有目的。该方法允许在共表达的蛋白质混合物中进行重链与特定的轻链配对的定量分析，并且可用于确定当重链和轻链共表达时，一条特定的免疫球蛋白重链是否与两条免疫球蛋白轻链中的一者选择性缔合。该方法简述如下：使至少一条重链和两条不同的轻链以使得重链是限制配对反应物的比率在细胞中共表达；任选地从细胞分离分泌蛋白；从其余的分泌蛋白分离结合重链的免疫球蛋白轻链多肽，以生成分离的重链配对级分；测定分离的重链级分中每条不同的轻链的量；以及分析分离的重链级分中每条不同的轻链的相对量，以确定至少一条重链与一条轻链选择性配对的能力。
该方法提供了合理的通量，是稳定(即，对操作，诸如使用者或流速的微小变化不灵敏)和准确的。该方法提供了可测定蛋白质序列的小变化的效果的灵敏分析。大表面区域的混杂蛋白质-蛋白质；结构域-结构域；链-链相互作用通常需要多个突变(更换)，以引入选择性。蛋白质产物不需要分离和纯化，这允许了更有效的筛选。关于该方法的实施方案的另外详情在实施例中有所描述。
优先配对的替代测定方法
检测优先配对的替代方法包括使用LC-MS(液相色谱-质谱)定量包括每条轻链的相对异源二聚体群体，使用其分子量的差异鉴定每种不同的种类。抗原活性分析也可用于定量包含每条轻链的相对异源二聚体群体，由此测定的结合程度(相对于对照)可用于估计每种各自的异源二聚体群体。
另外的方法诸如SMCA在实施例、附图和表格中有所描述。
热稳定性
异源二聚体的热稳定性可根据本领域已知的方法测定。每个异源二聚体的熔融温度是其热稳定性的表征。异源二聚体的解链温度可使用诸如差示扫描量热法的技术测定(Chen等，(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等，(1999)Immunol Lett 68：47-52)。或者，异源二聚体的热稳定性可使用圆二向色性测定(Murray等，(2002)J.Chromatogr Sci40：343-9)。
抗原的亲和力
异源二聚体与各自抗原的结合亲和力以及相互作用的解离速率可根据本领域熟知的方法通过竞争性结合分析测定。竞争性结合分析的一个实例是放射性免疫分析，包括在未标记抗原的量增加的情况下孵育标记抗原(例如，3H或125I与所关注的分子例如本发明的异源二聚体)，以及检测结合至标记配体的分子。本发明的异源二聚体与抗原的亲和力以及解离速率可从Scatchard分析的饱和数据测定。
本文所述的异源二聚体的动力学参数也可使用本领域已知的基于表面等离振子共振(SPR)的分析(例如，BIAcore动力学分析)测定。基于SPR的技术的评述，参见Mullet等，2000，Methods 22：77-91；Dong等，2002，Review in Mol.Biotech.，82：303-23；Fivash等，1998，Current Opinion in Biotechnology 9：97-101；Rich等，2000，Current Opinion inBiotechnology 11：54-61。另外，本发明的方法设想了美国专利No.6,373,577、6,289,286、5,322,798、5,341,215、6,268,125中描述的任何SPR仪器以及用于测定蛋白质-蛋白质相互作用的基于SPR的方法。如本领域已知，FACS也可用于测定亲和力。
使用双特异性抗体突变设计集的文库由Mab1和Mab2生成双特异性抗体。
在一个实施方案中，描述了双特异性抗体突变设计集，旨在从两种典型抗体Mab1和Mab2(分别由抗原结合片段Fab1和Fab2构成)选择性形成双特异性抗体。该设计集由Fab1、Fab2和Fc分别对应的同源突变构成。在一个实施方案中，设计集文库以表5、表12或表15至17中的任一者中包括的设计集表示。在存在竞争Fab2的轻链和重链的情况下，将突变引入Fab1的轻链和重链的界面，以实现两条专性链之间的选择配对。选择配对在界面处的某些热点框架残基之间的空间、疏水或静电互补的基础上，通过在两条专性轻链和重链中引入有利的互补突变实现，同时涉及这些突变残基与非专性链对的不利的界面相互作用。在每个设计集中，在存在竞争Fab1的轻链和重链的情况下，也可将选择配对突变引入Fab2的轻链和重链的界面，以实现这两条专性链之间的选择配对。该突变旨在减少Fab1的轻链与Fab2的重链(反之亦然)的错配。将突变引入Fc界面，以实现重链的选择配对，从而形成包含两条不同的重链的不对称抗体分子。抗体的轻链和重链的某些界面残基位置处的工程改造通常可导致有害影响，诸如该抗体的抗原结合亲和力、稳定性、溶解度、聚集倾向等丧失。许多相关性质可受到影响，诸如kon和koff速率、熔融温度(Tm)、应力状态如酸、碱、氧化、冻/融、搅拌、压力等的稳定性。这通常受到所关注的抗体的互补决定区(CDR)的影响。假设不同抗体的CDR通常是不相同的，则突变设计集对上述性质的影响在所有抗体中可以不是相同的。此处提供了创建相对于其他含污染物的不正确配对的抗体样结构，具有显著纯度的双特异性抗体，从而得到任何两个可用抗体Mab1和Mab2的方法。在引入每个突变设计集的同源突变后，使Mab1和Mab2的轻链和重链共表达，分析筛选所表达的抗体产物，以估计优选的双特异性抗体，相对于在蛋白质产物中表达的其他Mab样种类的纯度。在一些实施方案中，分析筛选工序可基于LC-MS技术。在一些实施方案中，分析筛选工序可基于根据电荷分离诸如毛细管等电聚焦(cIEF)技术，或色谱技术。基于SMCA工序的筛选技术的实例提供于实施例9中。在一些实施方案中，双特异性抗体的显著纯度定义为在所表达的蛋白质产物中大于所有获得的Mab样种类的70％。在一些实施方案中，双特异性抗体的显著纯度定义为在所表达的蛋白质产物中大于所有获得的Mab样种类的90％。制备和选择双特异性Mab设计集，得到Mab1和Mab2的工序如图12示意性地示出。
药物组合物
本发明还提供包含本文所述的异源二聚体或异源二聚体对的药物组合物。此类组合物包含治疗有效量的异源二聚体或异源二聚体对和药学上可接受的载体。在具体实施方式中，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准或在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他熟知的药典列出用于动物，更具体地讲人。术语“载体”是指与治疗一起施用的稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物。此类药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝蔴油等等。当药物组合物静脉内施用时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，尤其是注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等等。如果需要，组合物还可包含微量润湿或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释制剂等等的形式。组合物可配制为具有传统基料和载体诸如甘油三酯的栓剂。口服制剂可包括标准载体，诸如药品等级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药用载体的实例如由E.W.Martin所述得“Remington′s Pharmaceutical Sciences″。此类组合物将包含治疗有效量的化合物(优选地纯的形式)以及适当量的载体，以得到适当施用于患者的形式。该制剂应适合施用模式。
在某些实施方案中，包含异源二聚体或异源二聚体对的组合物根据常规工序配制为适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常，静脉内施用的组合物是溶于无菌等渗水性缓冲液的溶液。在必要时，组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂诸如利多卡因(lignocaine)，以缓解注射部位的疼痛。一般来讲，成分以单位剂型单独或混合在一起提供，该单位剂型例如密封容器中的冻干粉末或无水浓缩物，该密封容器诸如标明活化剂的量的安瓿瓶或小袋。当组合物通过输注施用时，可使用包含药品等级无菌水或盐水的输液瓶配药。当组合物通过注射施用时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿瓶，以使得成分可在施用前混合。
在某些实施方案中，本文所述的组合物可配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的那些药学上可接受的盐，诸如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些阴离子，以及与阳离子形成的那些药学上可接受的盐，诸如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些阳离子。
本文所述的组合物的量将有效地用于异常表达相关的疾病或病症的治疗、抑制和预防和/或治疗蛋白的活性，所述量可通过标准临床技术测定。此外，体外分析可任选地用于帮助鉴定最佳剂量范围。用于制剂的精确剂量还依赖于给药途径和疾病或病症的严重性，并且应根据执业医生的判断和每个患者的情况决定。有效剂量从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断。
异源二聚体对的使用
如上所述，本文所述的异源二聚体对可包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，其中每个异源二聚体的免疫球蛋白重链和/或免疫球蛋白轻链包含已知治疗抗体或结合分子的已知抗体的一个或多个修饰。因此，设想包含这些抗体的修饰的异源二聚体可用于治疗或预防与可使用已知治疗抗体或已知抗体相同的疾病、病症或感染。
在另一个实施方案中，本文所述的异源二聚体对也可有利地与本领域已知的其他治疗剂组合用于治疗或预防癌症、自身免疫疾病、炎性病症或感染性疾病。在具体实施方案中，本文所述的异源二聚体对可与单克隆或嵌合抗体、淋巴因子或造血生长因子(诸如例如，IL-2、IL-3和IL-7)组合使用，例如用于增加与分子相互作用的效应子细胞的数量或活性，以及增加免疫应答。本文所述的异源二聚体对也可有利地与一种或多种药物，诸如例如抗癌剂、抗炎剂或抗病毒剂组合用于治疗疾病、病症或感染。
试剂盒
本发明另外提供包括一种或多种异源二聚体对的试剂盒。该试剂盒的单个组分可包装在单独的容器中，并且此类容器还附有监管药物或生物产品的制造、使用或销售的政府机构的规定的注意事项，表明已获得制造、使用或销售机构的批准。该试剂盒可任选地包含概述异源二聚体对的使用方法或施用方案的说明或指导。
当该试剂盒的一种或多种组分以溶液例如水溶液或无菌水溶液提供时，容器意指本身可为可将溶液施用于或施加到受试者以及与试剂盒的其他组分混合的吸入器、注射器、吸管、滴眼管或其他此类类似设备。
该试剂盒的组分也可以干燥或冻干形式提供，并且该试剂盒可另外包含用于冻干组分复原的合适溶剂。无论容器的数量或类型如何，本发明的试剂盒还可包括帮助将组合物施用于受试者的仪器。此类仪器可以是吸入器、喷鼻设备、注射器、吸管、手术钳、量匙、滴眼管或类似的医疗核准递送工具。
计算机实施
在一个实施方案中，计算机包括连接到芯片集的至少一个处理器。连接到芯片集的还有存储器、存储设备、键盘、图形适配器、指点设备和网络适配器。显示器连接到图形适配器。在一个实施方案中，芯片集的功能由存储控制中心和I/O控制中心提供。在另一个实施方案中，存储器直接连接到处理器而非芯片集。
存储设备是能够保持数据的任何设备，如硬盘驱动器、光盘只读存储器(CD-ROM)、DVD或固态存储设备。存储器保持处理器使用的指令和数据。指点设备可以是鼠标、轨迹球或其他类型的指点设备，并且与键盘组合用于将数据输入计算机系统。图形适配器在显示器上显示图像和其他信息。网络适配器将计算机系统连接至局域网或广域网。
如本领域已知，计算机可具有与上文描述不同的和/或其他部件。此外，计算机可缺乏某些部件。此外，存储设备可以是计算机本地的和/或远程的(诸如包括在存储区域网络(SAN)内)。
如本领域已知，计算机能够执行计算机程序模块，以提供本文所述的功能。如本文所用，术语“模块”是指用于提供指定的功能的计算机程序逻辑。因此，模块可以硬件、固件和/或软件实施。在一个实施方案中，程序模块存储于存储设备上，加载到存储器并由处理器执行。应当理解，本文所述的实例和实施方案仅为了进行示意性的说明，并且据其进行的各种修改或变化将对本领域的技术人员作出提示，并且包括在本专利申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。
实施例
下文是执行本发明的具体实施方案的实例。这些实施例的提供仅为了进行示意性的说明，不旨在以任何方式限制本发明的范围。已作出努力来确保关于所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，当然应允许存在一些实验误差和偏差。
除非另外指明，本发明的实施将利用本领域内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学常规方法。此类技术在文献中充分解释。参见例如，T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，最新版)；Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg，AdvancedOrganic Chemistry，第3版(Plenum Press)，第A和B卷(1992)。
实施例1：分子建模和计算机引导的Fab界面工程改造
将结构和计算分子建模引导的方法用于生成重链和轻链突变设计的文库，该文库可在其他抗体(Ab)或其片段的范围中筛选，以鉴定在所关注的抗体中表现出所需特异性的突变。工程改造优先的重链(H)-轻链(L)配对的设计策略包括首先鉴定代表性Fab(即D3H44)。
如表1所示，该Fab的关键标准为：Fab是人/人源化的，具有常用的VH和VL亚群，并且包含最小框架区突变。此外，结构考虑为：VH∶VL结构域间角应接近所观察的抗体的平均值。在选择Fab D3H44后，使用双向方法进行Fab界面的计算机模拟分析，以鉴定和理解对重链和轻链之间相互作用重要的残基。
第一方法涉及Fab可变和恒定界面之间的序列保守性的全局分析，该方法通过已知抗体的序列和结构比对进行。各种抗体亚群的恒定和可变结构域序列的比对如图1所示。图1A示出了代表性人VH生殖系亚群的比对。图1B示出了代表性人κVL生殖系亚群的比对。图1C示出了代表性人λVL生殖系亚群的比对。图1D示出了人CH1等位基因序列的比对。图1E示出了人κ和λ等位基因序列的比对。第二方法涉及使用许多分子建模工具进行D3H44晶体结构界面的分析，如图2所示(例如ResidueContactsTM)。这些分析的结果是鉴定用于工程改造优先的H-L配对的热点位置列表。该分析确定的热点位置列于表2中。这些位置和氨基酸主要是框架残基(除CDR3环中的少数位置之外)，并且在λL链中也是基本上保守的。母体D3H44序列的氨基酸和Kabat编号提供于表3a-3b中。
然后，在3D晶体结构中热点位置以及邻近所关注的热点位置处的可能突变通过计算机模拟诱变和ZymepackTM堆积/建模模拟和鉴定。ZymepackTM是给出输入结构和一组突变，根据所提供的突变改变输入结构中的残基类型，并生成近似于突变蛋白的物理结构的新结构的软件包。另外，Zymepack通过计算许多定量度量评估突变蛋白的性质。这些度量包括空间和静电互补的测定值，该测定值与突变蛋白的稳定性、结合亲和力或异源二聚体特异性相关。
图3提供了可变结构域中重链和轻链界面处的热点位置子集，并且显示了如何将突变引入这些界面位置处，以促进专性链的选择配对，同时排斥不正确链对的形成。使用包括ZymepackTM的计算方法对空间互补进行建模，并且根据能量因素，诸如范德华堆积、空穴效果和疏水基团的紧密接触进行计算。相似地，对静电相互作用能量进行建模，并且根据电荷之间的库仑相互作用、氢键和去溶剂化效应进行评估。模拟通过引入所关注的突变获得的优选的重链和轻链对模型(诸如H1∶L1(或H2∶L2))和不正确对模型(诸如H1∶L2(和H2∶L1))二者，以计算相对空间和静电得分。这允许确定特定的突变集是否导致有利的能量，即相对于不正确(非专性)对，优选的(专性)重链-轻链对，具有更大的空间和/或静电互补。计算空间和静电能量是轻链和重链配对相关的自由能的分量。因此，更大的空间和静电互补是相对于非专性对的配对，专性对的配对相关的自由能变化更大的表征。更大的空间或静电互补产生专性重链和轻链的优先(选择性)配对(相对于非专性对)。
实施例2：设计的选择和描述
实施例1描述的方法用于设计表现出选择性或优先配对的重链-轻链异源二聚体对(例如H1-L1和H2-L2)。异源二聚体成对设计，称为“设计”或“设计集”，且包括促进优先配对的H1、L1、H2或L2链上的一组置换(表5)。设计集以“LCCA设计”初始测试(表4)，其中一条重链与两条轻链共表达，以评估相对配对。使用Kabat编号系统结合表3a、3b鉴定氨基酸置换。
将国际专利申请No.PCT/CA2013/050914的表30描述的设计文库用作鉴定表4所示的一些LCCA设计和表5所示的设计集的起始点。表4和表5中的一些设计是新的独立设计。表6示出了核心设计，以及相关的唯一标识符。大部分设计仅跨越恒定区，少数设计还包括可变区的修饰。这些设计的提出旨在进一步驱动配对特异性，同时还有利于其他抗体系统的可转移性。
对于衍生设计，将国际专利申请No.PCT/CA2013/050914的表30描述的设计文库用作起始点，该设计通过结构相似性成簇，并且根据配对特异性的强度、对抗原结合的作用以及通过差示扫描量热法(DSC)测定的稳定性排序。然后组合(参见表7中的实例)和/或优化(参见表8和表9中的实例)设计得到衍生设计。对于组合，设计中的至少一个表现出高配对特异性，其他设计表现出一系列有利的配对特异性。所有被选为组合和/或优化的设计表现出对抗原结合无作用/最小作用，以及对熔融温度(Tm)无作用/最小作用。
单独(在表5的设计类型列下被归类为独立)以及结合衍生设计(在表5的设计类型列下被归类为独立/组合；还可参见表10中的实例)测试独立的设计。
设计被堆积成D3H44的分子模型并计算度量(如实施例1所述)。然后根据风险(对稳定性以及免疫原性的可能影响)和影响(考虑驱动配对特异性的建议强度)选择最优设计。这些最优设计如表5所示。
实施例3：编码D3H44IgG重链和D3H44IgG轻链的Fab构建体的制备。
抗组织因子抗体D3H44的野生型Fab重链和轻链如下所述制备。D3H44Fab轻链(AJ308087.1)和重链(AJ308086.1)序列取自GenBank(表3c)，基因合成并对哺乳动物表达进行密码子优化。轻链载体插入序列由5’-EcoRI切割位点-HLA-A信号肽-HA或FLAG标签-轻链Ig克隆-“TGA终止”-BamH1切割位点-3’构成，连接至pTT5载体(Durocher Y等，Nucl.Acids Res.2002；30，No.2e9)。对所得的载体+插入序列测序，以确认阅读框和编码DNA的序列正确。同样，重链载体插入序列由5’-EcoR1切割位点-HLA-A信号肽-重链克隆(在T238终止；参见表3a)-ABD2-His6标签-TGA终止-BamH1切割位点-3’构成，连接至pTT5载体(ABD；白蛋白结合结构域)。同样对所得的载体+插入序列测序，以确认阅读框和编码DNA的序列正确。各种包含设计集的氨基酸置换的Fab D3H44构建体通过基因合成或定点诱变生成(Braman J，Papworth C&Greener A.，Methods Mol.Biol.(1996)57：31-44)。
分别在C-和N-末端标记重链和轻链，以便有利于通过竞争分析-SPR筛选评估优先配对。ABD2-His6重链标签特异性允许H-L复合物捕获在抗-his标签SPR芯片表面，而FLAG和HA轻链标签允许定量相对L1和L2群体。
实施例4：包含D3H44IgG轻链和/或重链的恒定结构域修饰或恒定和可变结构域修饰组合的Fab异源二聚体的优先配对评估。
包含根据表12的LCCA设计集的氨基酸修饰的Fab形式的编码D3H44IgG重链和轻链的构建体如实施例3所述制备。在LCCA设计集(H1，L1，L2)的范围中，构建体优先配对形成所需的H1-L1异源二聚体的能力使用轻链竞争分析(LCCA)测定。
LCCA定量一条重链与至少两条独特的轻链的相对配对，并且可汇总如下。一条D3H44重链Fab构建体与两条独特的D3H44轻链Fab构建体共表达，相对轻链配对特异性(例如H1-L1∶H1-L2)以竞争分析-SPR筛选测定，重复进行。通过减少L1(设计为优先地与H链配对)相对于L2的量(例如L1∶L2＝1∶3，以重量计)，同时保持有限量的重链(即H1∶L1+L2为1∶3)，使LCCA筛选比率失真，以鉴定强驱动。所形成的每个异源二聚体的量(即H1-L1和H1-L2)如下所述测定：通过his-标签下拉使重链结合至SPR芯片，然后使用这些标签特异性的抗体检测每个轻链标签(HA或FLAG)的量。随后，通过轻链竞争分析检验选择异源二聚体命中，据此L1∶L2DNA比率在转染期间以1∶3和1∶9变化，同时保持有限量的重链。还注意到，在D3H44系统中，轻链标签(HA或FLAG)不影响LCCA配对(参见国际专利申请No.PCT/CA2013/050914的实施例10)。分析设计的示意性表示如图4所示。图5示出了如何标记重链和轻链以及如何评估优先配对。LCCA的实验详情在下文提供。
转染方法
包含一条重链和两条轻链构建体的LCCA设计如实施例3所述制备，如下所述转染至CHO-3E7细胞。CHO-3E7细胞以1.7-2x106个细胞/ml的密度在37℃下、补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Koliphor P188(Sigma#K4894)的FreeStyleTM F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中培养。使用PEI-pro(Polyplus transfection#115-375)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，对2ml的总体积转染总共2μg DNA。在二十四小时后加入DNA-PEI混合物，将细胞转移至32℃。在第7天通过非还原SDS-PAGE分析，然后用考马斯蓝染色观察条带，以测试上清液的表达。H∶L比率如表11所示。
竞争分析SPR方法
在LCCA设计中，D3H44轻链与D3H44重链优先配对的程度使用位于每条轻链的N-末端的独特的表位标签的基于SPR的读数评估。
表面等离振子共振(SPR)供应商。GLC传感器芯片、Biorad ProteOn胺耦合试剂盒(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基磺基琥珀酰亚胺(sNHS)和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)和NaCl购自Sigma-Aldrich(Oakville，ON)。10％Tween 20溶液购自Teknova(Hollister，CA)。
SPR互物传感分析。所有表面等离振子共振分析使用BioRad ProteOn XPR36仪器(Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液(PBSTeknova Inc，含0.05％Tween20)在25℃的温度下进行。抗五His捕获表面使用GLM传感器芯片生成，该传感器芯片通过1∶5稀释的标准BioRad sNHS/EDC溶液以100μL/min沿分析物(水平)方向注射140s活化。在活化后，立即以25μL/min的流速沿分析物(垂直)方向注射25μg/mL溶于10mM NaOAc pH4.5的抗五His抗体(Qiagen Inc.)溶液，直到固定大约3000个共振单位(RU)。其余的活化组通过以100μL/min沿分析物方向注射1M乙醇胺140s猝灭，这还确保生成用于空白参照的模拟活化中间点。
筛选结合抗FLAG(Sigma Inc.)和抗HA(Roche Inc.)单克隆抗体的异源二聚体以两步进行：沿配体方向使异源二聚体间接捕获在抗五His表面上，然后沿分析物方向注射抗FLAG和抗HA。首先，以100μL/min沿配体方向注射PBST一次30s，用于稳定基线。对于每次异源二聚体捕获，在PBST中将细胞培养基中未纯化的异源二聚体稀释至4％。以25μL/min的流速沿单个配体通道同时注射一至五个异源二聚体或对照(即包含100％HA-轻链或100％FLAG-轻链的对照)240s，在抗五His表面上得到大约300至400RU的饱和异源二聚体捕获。如果需要，第一配体通道留空，用作空白对照。在该异源二聚体捕获步骤后，立即沿分析物方向进行两次缓冲液注射以稳定基线，然后5nM抗FLAG和5nM抗HA各自以50μL/min注射120s两次，其中解离阶段180s，得到一组含每个捕获的异源二聚体的缓冲液参照的结合传感图。在最后剩余的分析物通道上注射异源二聚体结合的组织因子(TF)抗原作为活性对照。异源二聚体通过100μL/min脉冲0.85％磷酸18s再生，以准备下一次注射循环的抗五His表面。将传感图进行比对并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参照，使用ProteOn Manager软件v3.0分析所得的传感图。
结果
LCCA结果如表12、13a和14a所示。注意到，在表13和14中，“唯一标识符”可以不与表5准确对应，因为两个组成LCCA的唯一标识符可沿任何一个方向((集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2))。每个LCCA设计的优先配对的评估如表12的最后3列所示。相同的数据还包括在表13a和14a的第5、6和8或10、11和13列的设计对范围中。给每个独特的H1、L1和L2突变(LCCA设计)组分配独特编号或‘集#’(例如9567或9087)。当数据以H1L1 H2 L2形式(Fab对形式或设计集)呈现时，从而此类设计集以包括两个组成LCCA的集编号(例如9567-9087)的“唯一标识符”表示。注意到，大部分LCCA实验对包含位于恒定结构域中的链间Fab二硫键(H/C233-L/C214，Kabat编号)的构建体进行。在表13(a和b)和14(a和b)中，为加亮显示特别设计相对于优先配对的成功，两个互补LCCA集(H1、L1、L2和H2、L2、L1)以Fab对的形式表示。标签的存在(L链：HA和FLAG，H链：ABD2-His6)不影响D3H44WT的预期～50％∶50％中性配对。
在表中，所报告的LCCA数据是比率形式的中值(H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1)(归一化为1∶1的L1∶L2DNA比率)。此外，LCCA数据归一化为100％，因为据观察一些变体的L1和L2的总量显著不同于100％。据信该总轻链百分比的不一致部分是由于在初始异源二聚体捕获于SPR芯片上期间出现可变非特异性结合。由于LCCA实验以2个不同的L1∶L2DNA比率(L1∶L2分别为1∶3和1∶9)进行，两个LCCA归一化比率列于表中。注意到，一些LCCA实验的LCCA数据未报告，因为所获得的实验数据未满足纳入标准(例如捕获于SPR芯片上的Fab小于100，或L1和L2的LCCA总量落在60至140的范围之外)。
表12列出了数据已获得的所有LCCA设计(530个)。考虑到两个L1∶L2DNA比率为1∶3和1∶9，在530个LCCA设计中，这些LCCA设计中的490个(92.5％)具有至少60％的正确配对(L1∶L2DNA比率归一化为1∶1)。其余的LCCA设计包括主要为中性的LCCA设计(32/530或6.0％)以及少量产生不一致结果的LCCA设计(8/530或1.5％)。表12所示的设计主要为静电的(基于利用氢键或电荷-电荷相互作用的特异性驱动)，一些设计还包括空间互补和/或链间共价二硫键。一些设计还包括用于在不存在天然链间二硫键(通过H/C233-L/C214形成)的情况下形成新二硫键的突变。
对于设计集的两个异源二聚体，表13(a和b)和14(a和b)列出了提供LCCA数据的447个设计。表13a和14a示出，实施例1描述的计算机模拟设计方法在许多不同组的设计及其变型中实现了H1-L1而非H1-L2以及H2-L2而非H2-L1的优先配对。
表13(a和b)列出了配对：错配的Fab异源二聚体的平均LCCA性能(对于H1-L1∶H1-L2和H2-L2∶H2-L1，归一化为1∶1的L1∶L2比率的中值平均值)为至少86∶14的那些设计，而表14(a和b)列出了配对：错配的Fab异源二聚体的平均LCCA性能小于86∶14的那些设计。每个LCCA的性能归一化为100％以及1∶1的L1∶L2DNA比率(如上文该实施例所述)，并且由标量值((ln(r1/f1)或ln(r2/f2))(其中r1和r2分别对应于实验比率下H1L1∶H1L2和H2L2∶H2L1的中值，f1和f2对应于各自的实验比率)以及配对：错配的Fab异源二聚体的比率描述。每个设计还具有相关平均LCCA性能标量值(0.5(ln(r1/f1)+ln(r2/f2)))，该值还归一化为100％以及1∶1的L1∶L2DNA比率(如上文该实施例所述)。此外，示出了设计的每个LCCA的标量范围(LCCA1和LCCA2分别对应于H1L1∶H1L2和H2L2∶H2L1实验)。在447个Mab设计中，354个(79.2％)表现出至少86∶14的LCCA性能平均值(表13a和b)。表13(a和b)内的设计还根据设计的相似性表征为13个簇。每个簇内的设计按照平均LCCA性能标量值从最高到最低排列。
此外，表13a内的LCCA数据还在图7中图解表示。图7示出了箱线图，其示出每个簇的配对：错配的Fab异源二聚体的平均LCCA性能值为至少86∶14。每个箱的底部表示第一四分位(Q1)，它是最小值和中值之间的中值平均LCCA性能值，使得小于第1四分位的值表示最小的25％的数据。箱内部的水平条表示第二四分位，它是簇的中值平均LCCA性能值。每个箱的顶部表示第三四分位(Q3)，它是最大值和中值之间的中值平均LCCA性能值，使得大于第3四分位的值表示最大的25％的数据。四分位距是Q3和Q1之间的差值。在两个方向垂直延伸的箱须表示在Q1-(1.5*IQR)或Q3+(1.5*IQR)内的那些值的数据范围。覆盖箱须的水平条表示该范围内的最大和最小值。存在于箱线图和箱须外部的数据被鉴定为异常值，适度异常值以点表示(与Q1或Q3的差异为1.5*IQR至3*IQR)，极限异常值以加号表示(与Q1或Q3的差异大于3*IQR)。
实施例5：生物物理学表征的放大
放大(通常至20m1)唯一标识符组(表5)所示的正确配对的异源二聚体，并且如下所述纯化以测试热稳定性和抗原结合。每个异源二聚体的重链和轻链在20ml CHO-3E7细胞培养物中表达。CHO-3E7细胞以1.7-2x106个细胞/ml的密度在37℃下、补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Koliphor P188(Sigma#K4894)的FreeStyleTM F17培养基(Invitrogen cat#A-1383501)中培养。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-375)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，对20ml的总体积转染总共20μg DNA。在二十四小时后加入DNA-PEI混合物，将细胞转移至32℃。
在转染7天后离心细胞，通过高通量镍亲和层析纯化从上清液纯化异源二聚体，如下文所述。上清液在平衡缓冲液(无钙、镁和酚红(HyCloneTM#SH30028.02)的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS))中稀释至20-25％细胞培养上清液，然后与Ni-NTA树脂(Thermo Scientific#PT-88222)(也预先用平衡缓冲液平衡)一起搅拌孵育12小时。然后通过离心收集树脂，转移至96孔烧结板，用平衡缓冲液洗涤三次，并使用洗脱缓冲液(Sigma-Aldrich#H5413)洗脱。
在纯化后，通过非还原高通量蛋白质表达(High Throughput Protein Express)分析、使用Caliper LabChip GXII(Perkin Elmer#760499)评估异源二聚体表达。工序根据HT Protein Express LabChip User Guide(HT蛋白质表达LabChip用户指南)第2版LabChip GXII User Manual(LabChip GXII用户手册)进行，并作出以下修改。将2μl或5μl异源二聚体样品(浓度范围5-2000ng/μl)以及7μl HT蛋白质表达样品缓冲液(HT ProteinExpress Sample Buffer)(Perkin Elmer#760328)加入96孔板(BioRad#HSP9601)中单独的孔。然后使异源二聚体样品在70℃下变性15min。LabChip仪器使用HT蛋白质表达芯片(HTProtein Express Chip)(Perkin Elmer#760499)和Ab-200分析设置运行。在使用后，用MilliQ水清洗芯片，并保存在4℃。
实施例6：通过DSF进行Fab异源二聚体的热稳定性测定。
为评估热稳定性，使用差示扫描荧光(DSF)作为从野生型、未经修饰的重链-轻链对筛选所有正确配对的异源二聚体的高通量方法。异源二聚体如实施例5所述制备。
热稳定性的测定
使用DSF如下所述测定所有异源二聚体对的热稳定性。每个异源二聚体如实施例5所述纯化，并且在DPBS(HyClone Cat#SH30028.02)中稀释至0.5mg/mL。对于大部分样品，Sypro Orange凝胶染色的工作储液(Life Technologies Cat#S-6650)通过将4μL SyproOrange凝胶染色稀释至2ml DPBS来制备。DSF样品通过将14μL 0.5mg/mL蛋白质加入60μL稀释的Sypro Orange凝胶染色工作储液来制备。然而，对于小于0.5mg/mL的蛋白质，每个DSF样品通过将14μL未稀释的蛋白质加入60μL Sypro Orange染料工作储液(即在DPBS中稀释至1∶1500)来制备。然后使用Rotor-Gene 6000qPCR仪器(QiaGen Inc)对20μl等分试样重复进行DSF分析。从30℃至94℃间隔1℃扫描每个样品，每个步骤之间平衡10秒，开始时等待时间30秒。使用470nM的激发滤光器和610nM的发射滤光器，增益为9。使用变性曲线的一阶导数的最大值作为Tm，通过Rotor-Gene 6000软件分析数据。使用以下不改变测定Tm值的方案修改类似地制备和分析其余的DSF样品：1)通过将1μL Sypro Orange凝胶染色稀释至2mlDPBS来制备工作储液，2)分析30μl等分试样以及3)使用10的增益。
DSF结果如表12、13b和14b所示。在LCCA设计的范围中H1∶L1Fab的热稳定性(与野生型相比DSF值和DSF值的变化)如表12的第3和4列所示。相同的DSF值也包括在表13b和14b的第7和8列的设计对范围中。对于其中进行重复的每个Fab异源二聚体，所报告的Tm值为中值。Fab异源二聚体Tm值相对于野生型Fab异源二聚体(包含HA标签的野生型Fab构建体，中值Tm为81.0℃)的Tm值的比较在H1L1_dTm_dsf列中报告。注意到，对于缺乏天然链间二硫键(在H链C233和L链C214之间)的新Fab异源二聚体，不评估未确定为缺乏天然链间二硫键的对应的野生型Fab的H1L1_dTm_dsf值。还注意到，由于相应实验的品质(例如低产率、低强度、部分封闭的峰以及Fab异源二聚体的重复序列之间的波动大于1℃)，未报告一些Fab异源二聚体的Tm值(Fab异源二聚体的17/230或7.4％)。对于这些Fab异源二聚体的一些，报告类似的Fab异源二聚体的Tm值对应的预计Tm值，所述类似的Fab异源二聚体的不同之处仅为存在/不存在或鉴定到连接的L链标签(HA或FLAG)。对于预计Tm值，对应的野生型Tm值(81.2℃)是从所有野生型Fab异源二聚体构建体(即包含HA标签或FLAG标签的Fab构建体)获得的中值。HA或FLAG标签不会显著影响野生型Fab异源二聚体的Tm值。总之，与WT相比，Fab异源二聚体表现出类似的Tm值。在包含天然链间二硫键以及可获得DSF数据的Fab异源二聚体中，93％(195/209)的Fab异源二聚体相对于WT表现出降低3℃或更少。此外，受影响最大的Fab异源二聚体相对于WT表现出降低6.5℃。表12列出了Tm降序排列的LCCA设计。
此外，鉴定了Fab异源二聚体的稳定性基本上改善的十三个氨基酸置换(参见表34)。在包括稳定突变的Fab异源二聚体与不同之处为不存在稳定突变的类似Fab异源二聚体的比较之后，鉴定稳定突变。重链稳定突变包括A125R、H172R、L143F、Q179D、Q179E、Q39R、S188L和V190F。轻链稳定突变包括Q124E、Q124R、Q160F、S176L和T180E。总之，稳定突变增加稳定性0.4℃至2.1℃。重链稳定突变A125R、H172R、L143F、Q179D、Q179E、Q39R、S188L和V190F分别增加稳定性0.4℃至0.6℃、0.4℃至2.1℃、0.4℃、0.5℃至0.6℃、0.5℃至0.8℃、1.1℃至1.6℃、0.4℃至1.2℃和1℃。轻链稳定突变Q124E、Q124R、Q160F、S176L和T180E分别增加稳定性0.4℃至0.5℃、0.8℃至0.9℃、0.6℃、0.4℃至1.0℃和0.5℃。
实施例7：Fab异源二聚体抗原亲和力测定。
评估Fab异源二聚体结合组织因子的能力，以确定氨基酸置换是否对异源二聚体结合抗原的能力具有影响。每个Fab异源二聚体对组织因子的亲和力如下所述通过SPR测定。
SPR供应商。GLC传感器芯片、Biorad ProteOn胺耦合试剂盒(EDC、sNHS和乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自Bio-Rad Laboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON)。含0.05％Tween20(PBST)的PBS运行缓冲液购自Teknoca Inc.(Hollister，CA)。
Fab异源二聚体的分批。纯化的Fab异源二聚体分3批A、B和C测试。批次A和B保存在4℃大约1个月，然后进行SPR分析，而批次C的纯化的Fab异源二聚体保存在4℃大约2个月，然后进行SPR分析。批次C的Fab异源二聚体在表12中以对应的KD值之后的“+”表示。
所有表面等离振子共振分析使用BioRad ProteOn XPR36仪器(Bio-RadLaboratories(Canada)Ltd.(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液在25℃的温度下进行。抗五His捕获表面使用GLC传感器芯片生成，该传感器芯片通过1∶5稀释的标准BioRadsNHS/EDC溶液以100μL/min沿分析物(水平)方向注射140s活化。在活化后，立即以25μL/min的流速沿分析物(垂直)方向注射25μg/mL溶于10mM NaOAc pH4.5的抗五His抗体(QiagenInc.)溶液，直到固定大约3000个共振单位(RU)。其余的活化组通过以100μL/min沿分析物方向注射1M乙醇胺140s猝灭，这还确保生成用于空白参照的模拟活化中间点。
筛选结合TF抗原的Fab异源二聚体以两步进行：沿配体方向使Fab异源二聚体间接捕获在抗五His抗体表面上，然后沿分析物方向同时注射5个浓度的纯化的抗原和一次缓冲液空白双重参照。首先，以100uL/min沿配体方向注射缓冲液一次30s，以稳定基线。一至五个变体或对照以3.4μg/ml的浓度溶于PBST，将它们以25μL/min的流速沿单个配体通道同时注射240s。对于批次A和B，这在抗五His表面上得到大约1000RU的平均捕获，对于批次C，在抗五His表面上得到大约600RU的平均捕获。如果需要，第一配体通道留空，用作空白对照。在该捕获步骤后，立即沿分析物方向进行两次缓冲液注射，每次100μL/min 30s，以稳定基线，然后以50μL/min同时注射60nM、20nM、6.7nM、2.2nM和0.74nM抗原(TF)以及缓冲液空白120s，其中解离阶段600s。捕获抗体表面通过100μL/min脉冲0.85％磷酸持续18s，18s两次再生，以准备下一次注射循环。将传感图进行比对并使用缓冲液空白注射和中间点进行双重参照，使用ProteOn Manager软件v3.1分析所得的传感图。双重参照传感图拟合至1∶1结合模型。每个抗原的Rmax值归一化为每个变体的抗体捕获水平，并与100％对照比较。
Fab异源二聚体样品的抗原亲和力(KD)值在表12、13b和14b中报告。在LCCA设计的范围中H1∶L1Fab的KD值(KD、KD值的范围以及与野生型相比KD值中值的变化)分别如表12的第5、6和7列所示。在表13b和14b的第3列(H1-L1Fab异源二聚体的KD)、第4列(与野生型相比H1-L1Fab异源二聚体的KD的变化)、第5列(H2-L2Fab异源二聚体的KD)和第6列(与野生型相比H2-L2Fab异源二聚体的KD的变化)中，相同的KD值也包括在设计对的范围中。仅测定表现出至少100RU的Fab异源二聚体捕获的Fab异源二聚体样品的KD值。参照野生型KD(0.157nM)反映了其中轻链包含FLAG标签的野生型Fab异源二聚体的中值。野生型Fab异源二聚体(包含FLAG或HA标签)表现出类似的KD值，使得观察到最大值和最小值之间存在2.6倍差异。在表12、13b和14b中，示出了相对于野生型抗原结合亲和力的KD差值，该差值使用-(log(KD)设计-log(KD)野生型)计算，使得正值表示与野生型相比，Fab异源二聚体对抗原结合亲和力的KD值减小，而负值表示KD值增加。注意到，一些Fab异源二聚体缺乏测定KD值。在这些情况的一些中，评估Fab异源二聚体，但SPR实验显示Fab异源二聚体捕获减少(即小于100RU)，因此不可能准确测定KD值。对于表现出与其他Fab异源二聚体相似的那些Fab异源二聚体(即不同之处仅为存在/不存在或鉴定到连接的L链标签(HA或FLAG))，提供类似的Fab异源二聚体的KD值对应的预计KD值(如表12、13b和14b所示)。对应的预计野生型KD值(0.15nM)是从所有野生型Fab异源二聚体构建体(即包含HA标签或FLAG标签的Fab构建体)获得的中值。总之，结果显示，正确配对的异源二聚体(从设计的角度)表现出类似于野生型的抗原结合亲和力(在参照野生型亲和力的大约2.3倍内)。
实施例8.野生型标记的D3H44异源二聚体和优先配对的异源二聚体的超效液相色谱尺寸排阻色谱(UPLC-SEC)图谱。
根据本领域已知和实施例5所描述类似的方法表达和纯化重链上具有C-末端ABD2-His6标签、轻链上具有N-末端标签(一个构建体中具有FLAG，另一个构建体中具有HA)的野生型D3H44异源二聚体(一条重链和一条轻链)。如实施例5所述，通过His标签亲和纯化单独放大和纯化优先或正确配对的异源二聚体。
UPLC-SEC使用Waters BEH200SEC色谱柱(2.5mL、4.6x150mm、不锈钢、1.7μm颗粒)进行，该色谱柱设定为30℃并且安装在具有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上。运行时间包括7min，Hyclone DPBS/改良-钙-镁运行缓冲液(部件No.SH30028.02)的每次注射总体积2.8mL，0.4ml/min。通过200-400nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并提取280nm下的色谱图。使用Empower 3软件进行峰积分。
图6示出了代表性WT Fab异源二聚体对(L链上包含FLAG标签)以及代表性(LCCA设计9735、9737和9740的H1L1Fab部件)设计Fab异源二聚体对的UPLC-SEC图谱。一般来讲，与WT相比，设计Fab异源二聚体对表现出类似的UPLC-SEC图谱。
实施例9：在包含双特异性抗体形式的恒定结构域或恒定结构域和可变结构域修饰的共表达集中，异源二聚体的优先配对评估
评估异源二聚体设计，以确定它们是否还允许双特异性抗体形式的优先配对。在该实例中，为促进独特的重链的异源二聚化，对每个异源二聚体的全长重链的Fc区进行不对称修饰，使得一条重链包含突变T350V、L351Y、F405A和Y407V，另一条重链包含突变T350V、T366L、K392L和T394W(EU编号)。
构建体的制备：
在以下双特异性抗体的范围中测试异源二聚体设计：a)D3H44/曲妥单抗、b)D3H44/西妥昔单抗和c)曲妥单抗/西妥昔单抗。注意到，D3H44是人抗体，曲妥单抗是人源化抗体，西妥昔单抗是由人IgG1和小鼠Fv区构成的嵌合抗体。根据设计，编码包含氨基酸修饰的D3H44、曲妥单抗和西妥昔单抗IgG重链和轻链的构建体如下所述制备。D3H44、曲妥单抗和西妥昔单抗的重链和轻链的基本DNA序列如表3C所示。D3H44、曲妥单抗和西妥昔单抗轻链序列如实施例3所述制备，不同的是一些序列缺乏标签，而另一些序列包含FLAG或HA标签。D3H44、曲妥单抗和西妥昔单抗重链序列如实施例3所述制备，不同的是全长重链通过所附编码铰链-CH2-CH3结构域的IgG1*01DNA序列创建，并且修饰为促进Fab重链的CH1结构域的C-末端上的异源二聚化。值得注意的是，移除典型C-末端重链赖氨酸残基，以防止由于C-末端赖氨酸剪切而导致的LC-MS信号不均一(Lawrence W.Dick Jr.等，Biotechnol.Bioeng.(2008)100：1132-43)。
分析形式(SMCA)
如下文所述评估异源二聚体共表达集设计优先配对形成双特异性抗体的能力。该分析基于四条链(一个抗体的H1和L1链，另一个抗体的H2和L2链)的共表达，并使用质谱(LC-MS)检测正确形成的双特异性抗体的存在。图8提供了描述四条起始多肽链以及在不存在异源二聚体对的重链和轻链之间的优先配对的情况下，这些起始多肽链的共表达获得的可能产物的示意图。两个全长重链构建体与两个独特的轻链构建体共表达，得到十种可能的抗体种类：H1-L1∶H1-L1、H1-L2∶H1-L2、H1-L1∶H1-L2、H2-L1∶H2-L1、H2-L2∶H2-L2、H2-L1∶H2-L2、H1-L1∶H2-L1、H1-L2∶H2-L2、H1-L2∶H2-L1和H1-L1∶H2-L2。H1-L1∶H2-L2种类是正确配对的双特异性抗体(参见图8)。在pA纯化和去糖基化后使用LC-MS测定优选种类H1-L1∶H2-L2相对于其他种类的量的相对配对特异性。如果可能，使链保留未标记，得到彼此不同为至少50Da的所有Mab和半抗体种类。当质量差排除该可能性时，将N-末端标签(HA或FLAG)添加至轻链，以提供足够的种类间质量区分。
该分析涉及双特异性抗体的表达和筛选步骤，称为SMCA。
质谱方法
在蛋白A纯化和非变性去糖基化后使用质谱评估共表达集中D3H44轻链与D3H44重链的优先配对程度。由于D3H44/曲妥单抗异源二聚体仅包含Fc N-连接聚糖，所以仅用一种酶N-糖苷酶F(PNGase-F)处理该系统。纯化的样品如下所述用PNGaseF去糖基化：0.2UPNGaseF/μg抗体溶于50mM Tris-HCl pH7.0，在37℃下孵育过夜，最终蛋白质浓度0.5mg/mL。对于D3H44/西妥昔单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗系统，由于西妥昔单抗的Fab区中具有另外的N-连接聚糖，所以用N-糖苷酶F加上多种外切糖苷酶处理该系统。通常，将四种酶混合物用于该用途：N-糖苷酶F、β-半乳糖苷酶(Prozyme)、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶(NewEngland Biolabs)和神经氨酸苷酶。N-糖苷酶F移除Fc N-连接聚糖，而外切糖苷酶将FabN-连接聚糖修剪为均一的核心结构M3F(GlcNAc2Man3Fuc1)。如下所述，使用四种酶混合物使纯化的样品去糖基化：0.2U PNGaseF/μg抗体、0.002U α-神经氨酸苷酶/μg抗体、0.0001Uβ-半乳糖苷酶/μg抗体和0.2U β-N-乙酰氨基葡糖苷酶/μg抗体溶于50mM Tris-HCl pH7.0，在37℃下孵育过夜，最终蛋白质浓度0.5mg/mL。然而，在一些情况下，三种酶处理(N-糖苷酶F、β-半乳糖苷酶和神经氨酸苷酶)是优选的，以避免LC-MS分析中样品组分的质量重叠。在这些情况下，Fab聚糖被还原为稍大的结构G0F(Man3GlcNAc2Fuc1GlcNAc2)。使用三种酶混合物，利用如四种酶混合物所述相同的浓度和条件使纯化的样品去糖基化。在去糖基化后，将样品保存在4℃下，然后进行LC-MS分析。
去糖基化的蛋白质样品使用Agilent 1100 HPLC系统(通过Ion Maxelectrospray离子源(ThermoFisher)连接到LTQ-Orbitrap XL质谱仪(ThermoFisherScientific))通过完整LC-MS进行分析。将样品(5μg)注射到2.1x30mm Poros R2反相柱(Applied Biosystems)，并使用以下梯度条件解析：0-3min：20％溶剂B；3-6min：20-90％溶剂B；6-7min：90-20％溶剂B；7-9min：20％溶剂B。溶剂A为脱气0.1％甲酸水溶液，溶剂B为脱气乙腈。流速为3mL/min。在柱后分流，将100μL引入电喷界面。将柱加热至82.5℃，在柱前将溶剂加热至80℃，以改善蛋白质峰形。使用ThermoFisher Scientific’s LTQ PositiveIon ESI校正溶液(咖啡因、MRFA和Ultramark 1621)校正LTQ-Orbitrap XL，并使用10mg/mLCsI溶液调谐。锥孔电压(源碎裂设置)为40V，FT分辨率为7,500，扫描范围为m/z 400-4,000。LTQ-Orbitrap XL调谐用于大型蛋白(＞50kDa)的最佳检测。
使用仪器控制和数据分析软件MassLynx(Waters)的MaxEnt 1模块将包含全抗体(m/z 2000-3800)和半抗体(m/z 1400-2000)。简而言之，首先在Xcalibur(ThermoScientific)的谱查看模块QualBrower中打开原始蛋白质LC-MS数据，并使用Waters提供的文件转换程序Databridge转换为MassLynx兼容格式。在MassLynx的谱模块中查看转换的蛋白质谱，并使用MaxEnt 1反卷积。直接从所得的分子量图谱测定每个样品中不同抗体种类的丰度。
SMCA分析的代表性设计
从簇1至12选择总共25个具有高平均LCCA性能值的代表性设计，用于以SMCA形式测试。使用类似的驱动同时还共有类似的突变的，根据占据类似空间的对应设计集选择代表性设计。从每个簇选择至少一个代表性设计。一些簇以一个代表性设计表示(即簇1、5、7、8、10)。其余的簇具有超过一个代表性设计，因为这些簇很大(即簇2)或由小簇构成(即簇3、4、6、9、11和12)。虽然每个簇内的设计共有序列相似性，但簇内的小簇的差异为至少一组驱动突变。对于包含小簇的簇，从每个小簇选择另外的代表性设计。
每个簇的氨基酸置换列于表15至27中，并标明每个簇/小簇的对应的代表性氨基酸置换。对于簇1，仅选择一个设计(9134-9521)来表示簇，因为这些设计利用占据类似空间的类似静电驱动(参见表15)。对于该簇的所有成员，H1设计为允许带负电的置换(L124E和Q179E)与L1带正电的置换(S176R和S131K或S131R)形成盐桥。H2设计为允许带正电的置换(L124R和Q179K或S186K)与L2带负电的置换(S176D和T178D或T178E和/或T180E)形成盐桥。H1L2和H2L1的错配是排斥的，主要原因是静电排斥。
对于簇2，选择两个代表性设计(9279-9518和9286-9402)来表示大簇(参见表16)。该簇内的设计利用占据类似空间的类似静电驱动。对于该簇的所有成员，H1设计为允许带负电的置换(L124E和L143E或L143D)与L1带正电的置换(S176R和(Q124K和/或T178K)或(Q124K和Q160K)的组合)形成盐桥。H2设计为允许带正电的置换(L124R和Q179K或S186K或S186R)与L2带负电的置换(S176D和T178D或T178E和/或T180E)形成盐桥。H1L2和H2L1的错配是排斥的，主要原因是静电排斥。
对于簇3，选择五个代表性设计(9338-9748、9815-9825、6054-9327、9066-9335和9121-9373)来表示五个小簇中的每个(参见表17)。该簇的所有成员利用H1(L124E)、L1(S176R)、H2(L124R)和L2(S176D)上的类似静电驱动，其允许在优先配对的异源二聚体中形成盐桥，而错配对是排斥的，主要原因是静电排斥。为表示主要利用那些恒定区驱动的那些设计，选择6054-9327设计来表示该小簇。除这些静电相互作用之外，一个小簇还包括可变区空间驱动(H1L45P和L1P44F)，因此选择包括该可变区驱动的代表性设计来表示该小簇(9338-9748)。另一个小簇还包括两个Fab异源二聚体中的可变区静电驱动(H1Q39E、L1Q38R、H2Q39R、L2Q38E)，因此选择包括该可变区驱动的代表性设计来表示该小簇(9815-9825)。此外，由一个成员从而一个代表性设计(9066-9335)构成的一个小簇包括H1F122C和L1Q124C之间的工程改造二硫键。以9121-9373表示的其余小簇主要利用具有另外的置换(H1中的H172T和L1中的S174R)的恒定区驱动来稍微修改H1L1恒定区驱动的相互作用，同时还探测HC2中H172R的效应。
对于簇4，选择两个代表性设计(9168-9342和9118-6098)来表示两个小簇中的每个(参见表18)。该簇的所有成员利用H1(L124E)、L1(S176R或S176K)、H2(L124R)和L2(S176D)上的类似静电驱动，该驱动允许在优先配对的异源二聚体中形成盐桥，而错配对是排斥的，主要原因是静电排斥。以9118-6098表示的一个小簇主要将共有的静电驱动用于优先配对，而以9168-9342表示的其他小簇还利用允许形成另外的盐桥的H1(K228D)和L1(S121K)的置换。
以唯一标识符9116-9349表示的簇5仅由1个成员构成(参见表19)。该设计利用H1(L124E)、L1(S176R)、H2(L124R)和L2(S176D)上的两个静电驱动，以及H1(A139W)、L1(F116A_V133G_L135V)、H2(A139G_V190A)和L2(V133G_L135W)上的空间驱动。因此，对于优先配对的异源二聚体，带电置换允许形成盐桥。对于错配的Fab异源二聚体，由于静电排斥以及另外的空间效应，其形成是排斥的。
对于簇6，选择两个代表性设计来表示两个小簇中的每个(参见表20)。该簇的所有成员利用恒定区中的类似静电驱动(H1上的Q179E、L1上的S131K、H2上的S186R以及L2上的Q124E、Q160E和T180E)，该驱动允许在优先配对的异源二聚体中形成盐桥，而错配对是排斥的，主要原因是静电排斥。此外，该小簇还由不同的可变区驱动构成。以唯一标识符9814-9828表示的一个小簇利用可变区中的静电驱动(H1上的Q39E、L1上的Q38R、H2上的Q39R和L2上的Q38E)。其他小簇利用由H1中的L45P和L1中的P44F构成的可变区空间驱动。因此，对于该小簇，由于引入的空间效应，错配对也是排斥的。注意到，该小簇以来源于唯一标识符9745-9075的设计表示，该设计的不同之处仅为不存在L2上的Q38E。
对于簇7，仅选择一个设计(9060-9756)来表示簇，因为这些设计利用类似的静电和空间驱动(参见表21)。共有的静电驱动包括H1上的L143E和Q179E、L1上的Q124R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E。共有的空间驱动包括H1上的A139W、L1上的F116A_L135V以及L2上的L135W。因此，对于优先配对的异源二聚体，Fab区中的带电置换允许形成盐桥。对于错配的异源二聚体，由于静电排斥以及另外的空间效应，其形成是排斥的。
对于簇8，仅选择一个设计(9820-9823)来表示簇，因为这些设计利用类似的静电驱动(参见表22)。在可变区中，利用H1上的Q39E、L1上的Q38R、H2上的Q39R以及L2上的Q38E。在恒定区中，利用H1上的L143E、L1上的Q124R、Q160K和T178R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E。对于优先配对的异源二聚体，Fab区中的带电置换允许形成盐桥，而对于错配的异源二聚体，主要由于静电排斥，其形成是排斥的。
对于簇9，选择两个代表性设计来表示两个小簇中的每个(参见表23)。该簇的所有成员利用恒定区中的类似静电驱动(H1上的L143E、L1上的Q124R、H2上的Q179K以及L2上的Q124E、Q160E和T180E)，该驱动允许在优先配对的异源二聚体中形成盐桥，而错配对是排斥的，主要原因是静电排斥。此外，小簇的不同之处为存在/不存在可变区驱动(H1上的L45P和L1上的P44F)。因此，对于包含可变区驱动的小簇，由于引入的空间效应，错配对也是排斥的。包括可变区驱动的该小簇的代表性设计来源于唯一标识符9751-9065，该设计的不同之处仅为不存在L2上的Q38E。缺乏可变区置换的小簇的代表性设计是9611-9077。
对于簇10，仅选择一个设计(9561-9095)来表示簇，因为这些设计利用占据类似空间的类似静电和空间驱动(参见表24)。共有的静电驱动包括H1上的L143E和Q179E、L1上类似位置的Q124R、Q124K或S131K、H2上的Q179K以及L2上的Q124E和T180E。共有的空间驱动包括H1上的L124W、L1上的V133A以及L2上的V133W。因此，对于优先配对的异源二聚体，Fab区中的带电置换允许形成盐桥。对于错配的异源二聚体，由于静电排斥以及另外的空间效应，其形成是排斥的。
对于簇11，选择三个设计(9049-9759、9682-9740和9667-9830)来表示三个小簇中的每个(参见表25)。该簇的所有成员利用静电置换来驱动异源二聚体的优先配对。因此，对于优先配对的异源二聚体，Fab区中的带电置换允许形成盐桥。对于错配的异源二聚体，主要由于静电排斥，其形成是排斥的。对于以唯一标识符9667-9830表示的小簇，共有置换包括H1上的带负电的置换(L143E或L143D和Q179E或Q179D)、L1上的带正电的置换(T178R或T178K)、H2上的带正电的置换(S186K或S186R或Q179K或Q179R)以及L2上的带负电的置换(Q124E)。以该小簇的单个成员(唯一标识符9049-9759)表示的另一个小簇还包含用于形成工程改造的二硫键的置换。以唯一标识符9682-9740表示的其余的簇利用与另外两个小簇类似的H1和L1的驱动；然而，利用不同的恒定区H2和L2驱动。H2利用L143R或L143K，而除Q124E置换(与另外两个小簇共有)之外，L2利用V133E或V133D。
对于簇12，选择四个设计(9696-9848、9986-9978、9692-9846和9587-9735)来表示四个小簇中的每个(参见表26)。该簇的所有成员利用静电置换来驱动异源二聚体的优先配对。一些成员还利用空间驱动。以唯一标识符9696-9848表示的小簇利用静电和空间驱动二者。该小簇内的共有静电置换由H1上的L143E、L1上的Q124R和T178R、H2上类似位置的S186K或S186R或Q179K或Q179R以及L2上的Q124E和T180E构成。该小簇内共有空间置换由H1上的S188L和L2上的S176L或V133Y或V133W构成；对于利用L2上的V133Y或V133W的设计，L143A或L124A也存在于H2上，以容纳大体积突变。对于以唯一标识符9692-9846表示的小簇，与以唯一标识符9696-9848表示的小簇相比，利用类似的静电驱动；对于一些成员，利用类似位置的置换T178E，而非L2上的T180E。此外，该小簇的子集还利用类似位置的置换T178Y或T178F，而非L2上的S176L的类似空间驱动。以唯一标识符9986-9978表示的小簇仅利用静电驱动来驱动优先配对。类似的共有置换用于H1、L1和H2；然而，利用不同的L2置换(S131E)。以唯一标识符9587-9735表示的其余的小簇利用H1和L1上的类似静电驱动(不同的是L1上的T178R不用于该小簇内的所有成员)；然而，不同的静电驱动用于H2(L143R或L143K)和L2(Q124E和V133E或Q124E和V133D)。该小簇内的两个成员还利用类似的空间驱动，该空间驱动由H1上的S188L和L2上的S176L构成。总之，对于优先配对的异源二聚体，Fab区中的带电置换允许形成盐桥。对于错配的异源二聚体，由于静电排斥，其形成是排斥的。此外，对于同样利用空间驱动的设计，由于空间效应，其形成也是排斥的。簇13由一个成员9122-9371构成(参见表27)。该设计利用H1F122C和L1Q124C之间的工程改造二硫键，作为异源二聚体的优先配对的共价驱动。此外，由于该设计还缺乏天然链间二硫键，二硫键的形成通过非还原和还原SDS-PAGE凝胶确认。该设计未以SMCA形式测试；然而，在存在天然链间二硫键的情况下，与另外的恒定区驱动(簇3，代表性设计9066-9335)组合测试工程改造的二硫键。
转染方法
如下文所述，将包含两条重链和两条轻链构建体的共表达集转染至CHO-3E7细胞。CHO-3E7细胞以1.7-2x106个细胞/ml的密度在37℃下、补充有4mM谷氨酰胺和0.1％Pluronic F-68(Invitrogen cat#24040-032)的FreeStyle(TM)F17培养基(Invitrogencat#A-1383501)中培养。使用PEI-pro(Polyplus cat#115-010)、以1∶2.5的DNA∶PEI比率，对50ml的总体积转染总共50ug DNA。在二十四小时后加入DNA-PEI混合物，将细胞转移至32℃并孵育7天，然后收集。通过离心收集培养基并使用Steriflip 0.2μM过滤器真空过滤。然后如下文所述使用蛋白A MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare#17-5438-02)纯化过滤的培养基。将过滤的培养基施加到此前使用PBS平衡的柱(Hyclone DPBS/改良，无钙，无镁，#SH-300028.02)。然后使用PBS洗涤异源二聚体抗体种类，并在Amicon ultra 15离心过滤器Ultracel 10K(Millipore#SCGP00525)中使用100mM柠檬酸盐pH3.6洗脱。然后使用PBS交换缓冲液，并通过卡尺评估样品，然后进行去糖基化和LC-MS。
为评估野生型双特异性抗体系统(其中一个系统的轻链优先地结合两个抗体系统的重链)中固有的双特异性系统偏爱性，在CHO表达中测试一组H1∶H2∶L1∶L2DNA比率。这些比率尝试补偿两个不同抗体的重链和轻链之间的表达水平的天然差异和/或内在配对偏爱性。对于所有双特异性抗体系统，观察所有测试比率之间的偏爱性(图9)。对于D3H44/曲妥单抗系统，观察对曲妥单抗的偏爱性，即D3H44重链优先地与曲妥单抗轻链配对(参见图9a)。对于D3H44/西妥昔单抗，观察对西妥昔单抗的偏爱性，即D3H44重链优先地与西妥昔单抗轻链配对(参见图9b)。对于曲妥单抗/西妥昔单抗系统，观察对曲妥单抗的偏爱性，即西妥昔单抗重链优先地与曲妥单抗轻链配对(参见图9c)。
对于测试每个双特异性抗体系统内25个代表性设计中的每个，所用的H1∶H2∶L1∶L2DNA比率是产生大量双特异性抗体种类，同时具有小量半抗体的对应的野生型双特异性系统的比率(参见表32a、b和c)。对于D3H44/曲妥单抗系统，所用的比率为15(H1)、15(H2)、53(L1)、17(L1)，其中H1和L1是指D3H44，H2和L2是指曲妥单抗。对于曲妥单抗/西妥昔单抗系统，所用的比率为15(H1)、15(H2)、17(L1)、53(L2)，其中H1和L1是指曲妥单抗，H2和L2是指西妥昔单抗。对于D3H44/西妥昔单抗系统，所用的比率为15(H1)、15(H2)、53(L1)、17(L2)，其中H1和L1是指D3H44，H2和L2是指西妥昔单抗。
此外，对于D3H44/西妥昔单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗双特异性系统，在两个方向测试设计，使得在一个方向，分别在双特异性抗体系统的抗体1(Ab1)和抗体2(Ab2)上测试H1L1和H2L2上存在的置换，在另一个“翻转”方向，分别在Ab2和Ab1上测试H1L1和H2L2上存在的置换(参见表28a和b)。唯一标识符所附的“_1”表示这样的设计：其中获得较强LCCA优先配对结果(参见表13a)的重链和相关的轻链置换置于其中重链弱竞争其相关的轻链，而非其他抗体的轻链的抗体上。唯一标识符所附的“_2”表示相反的“翻转”方向：其中获得较强LCCA优先配对结果(参见表13a)的重链和相关的轻链置换置于其中重链较强地竞争其相关的轻链，而非其他抗体的轻链的抗体上。对于D3H44/曲妥单抗系统，仅沿“_1”方向测试设计(参见表28c)。
SMCA结果
仅用一种酶(PNGase-F)处理D3H44/曲妥单抗系统并进行完全去糖基化。对于多酶处理，Fab区中的连接糖通常截短为核心M3F(使用四种酶处理)或G0F(使用3种酶处理)。总之，在大多数情况下，去糖基化处理产生能够鉴定LC-MS所鉴定的所有可能的不同种类的能力。在许多情况下，每种种类以单个LC-MS峰表示。例外包括可能对应于所需的双特异性种类的侧峰(可能是加合物或前导肽切割的不均一性)；然而，由于侧峰的模糊性，在双特异性种类的贡献中不考虑这些侧峰。此外，D3H44/西妥昔单抗(3519_1、3522_1)和曲妥单抗/西妥昔单抗(9748-9338_1)系统内的一些设计需要多个峰来解释由于所连接的高甘露糖的波动而产生的种类。所有这些设计在西妥昔单抗轻链中引入糖基化位点。注意到，在一些情况下，由于种类之间的质量分离较低(即差异小于50Da)，不可能区分一些小种类(包括小于所有种类的5％)。此外，所需的双特异性种类H1-L1_H2-L2通常不能基于LC/MS通过实验与错配类型H1-L2_H2-L1区分。因此，当在表格中报告双特异性含量时，不能完全排除其不包含该类型的错配种类。然而，观察到的含量非常低种类诸如H1-L2_H1-L2和H2-L1_H2-L1以及H1-L2和H2-L1半抗体是只出现微量(如果有的话)双特异性种类杂质的表征。
LC-MS数据提供于表29a、29b和29c中。作为比较，野生型数据也提供于表33a、33b和33c中，并且在“SMCA唯一标识符”列中以及“簇”列中以“NA”表示。全部三个双特异性野生型系统表现出失真的偏爱性，使得一条轻链优于结合两条重链(参见表33和图9)。此外，至少在曲妥单抗/西妥昔单抗系统中，标签位置似乎也对H1L1和H2L2配对具有显著影响。因此，为评估设计对所需的双特异性种类与野生型的可转移性和百分比的影响，以相同的H1∶H2∶L1∶L2DNA比率进行与对应的野生型双特异性构建体的比较，并报告于“％H1L1配对的变化(所有H1种类)，相对于野生型”、“％H2L2配对的变化(所有H2种类)，相对于野生型”和“％H1∶H2∶L1∶L2的变化，相对于野生型”(只考虑全抗体种类)列(参见表29)。注意到，对于％H1L1配对(所有H1种类)或％H2L2配对(所有H2种类)的评估，评估所有种类在Fab区中的配对。当不通过SMCA评估对应的野生型双特异性构建体时，与类似的野生型构建体进行比较。估计值以报告值之后的“***”表示。如下所述选择用于比较的类似野生型构建体。为评估可转移性，每个野生型构建体以表现出最高“％H1L1和％H2L2配对(所有种类)”的SMCA实验(以不同的比率进行)表示。为评估设计对所需的双特异性种类与野生型的百分比的影响，每个野生型构建体以表现出最高％H1∶H2∶L1∶L2(只考虑全抗体种类)的SMCA实验(以不同的比率进行)表示。就两种情况而言，在双特异性系统内的所有野生型构建体中，选择中值作为用于比较的野生型值。
对于每个设计，可转移性通过记录所有种类中相对于野生型的总体H∶L配对，特别是％H1L1/所有H1种类和/或％H2L2/所有H2种类的增加来评估。此外，还评估对所需的双特异性种类的百分比的影响，其着重于仅全抗体种类比较，因为半抗体(如果存在)可通过制备性SEC或通过另外的H1∶H2∶L1∶L2DNA滴定移除/最小化。表30a、b和c显示，制备性SEC可有效地用于半抗体种类的移除/最小化。表32a、b和c显示，半抗体种类的百分比也可在转染期间使用各种DNA滴定比率操作。
对于D3H44/西妥昔单抗系统(表29a)，转移除一个设计(9327-6054_2)之外的所有设计，如通过所有种类中相对于野生型的H1L1配对所评估。大部分设计(除9327-6054_2和9134-9521_2之外)还显示，当仅考虑全抗体种类时，所需的双特异性抗体的百分比增加。此外，除一个不转移的设计(9327-6054_2)之外，设计减少了野生型所观察的最初错配抗体种类(H1H2L2L2)。此外，除其他方向的9327-6054_2和对应的设计9327-6054_1之外，设计以两个方向转移，大部分设计在两个方向显示出类似的有效H∶L配对。
对于D3H44/曲妥单抗系统(表29b)，转移所有设计，如通过所有种类中相对于野生型的H1L1配对所评估。此外，所有设计显示出所需的双特异性抗体的百分比增加(当仅考虑全抗体种类时)。此外，大部分设计显著减少了野生型所观察的最初错配抗体种类(H1H2L2L2)。然而，注意到，由于缺少表达，未报告9611-9077_1的数据(表28c)。
对于曲妥单抗/西妥昔单抗系统(表29c)，49个设计中的至少35个显示出可转移性，如通过所有H2种类中(“％H2L2配对的变化(所有H2种类)，相对于野生型”列的正值)的H2L2配对所评估。似乎未转移的设计包括9279-9518_2、3522_2、9815-9825_2、9327-6054_2、9118-6098_2、9748-9338_2、9692-9846_2、9587-9735_2、9814-9828_2、3519_2、9986-9978_2、9168-9342_2和9066-9335_1(“％H2L2配对的变化(所有H2种类)，相对于野生型”列的负值)；然而，其他方向的设计表现出可转移性(注意到，由于缺乏样品，未测试9279-9518_1)。所有表现出可转移性的设计表现出野生型实验所观察的最初错配的抗体种类(H1H2L1L1)的百分比减少。此外，在转移的设计中，当仅考虑全抗体种类时，与野生型相比，仅2个设计(9134-9521_1和9279-9518_2)显示出所需的双特异性抗体的百分比减少。
一般来讲，大部分弱竞争抗体的H∶L配对增加的设计使所需的双特异性抗体的百分比减少(仅考虑全抗体)。就方向而言，与“_2”方向相比，“_1”方向的大部分设计表现出类似或更好的H∶L配对比较的可转移性(例外主要在曲妥单抗/西妥昔单抗系统中观察)。此外，表35a列出了所有3个测试双特异性系统(D3H44/西妥昔单抗、D3H44/曲妥单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗)中在两个方向转移的那些设计。表35b列出了所有3个双特异性系统(D3H44/西妥昔单抗、D3H44/曲妥单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗)中在一个方向转移，以及仅一个双特异性系统中在另一个方向转移的那些设计。此外，在指定方向上，相同的突变存在于所有3个双特异性系统中的重链和弱竞争同源轻链，并且轻链利用率至少大于10％。
对于簇的可转移性和性能，就D3H44/曲妥单抗双特异性系统而言，所有簇内的所有成员表现出可转移性(参见图11a)，以及所需的双特异性抗体百分比增加(仅考虑全抗体)(参见图11b)。就D3H44/西妥昔单抗双特异性系统而言，所有簇显示出可转移性，其中与野生型相比，在所有H1种类中，簇3内仅一个成员显示出H1L1配对减少(参见图11c)。另外，所有簇包括表现出所需的双特异性抗体相对于野生型的百分比增加的成员(仅考虑全抗体)；然而，3个簇(簇1、3和4)还包括显示出所需的双特异性抗体相对于野生型的百分比减少的成员(仅考虑全抗体)(参见图11d)。对于曲妥单抗/西妥昔单抗双特异性系统，所有簇包括表现出设计可转移性的变体；然而，仅几个簇(1、5、7、8、10、11)包括其中全部各自的成员表现出可转移性的变体(参见图11e)。此外，所有簇包括表现出所需的双特异性抗体相对于野生型的百分比增加的成员(仅考虑全抗体)(参见图11f)。对于其中所有成员显示出可转移性的那些簇，簇5、7、8、10和11内的所有成员还显示出所需的双特异性抗体相对于野生型的百分比增加(仅考虑全抗体)。
总之，当整体考虑全部3个双特异性系统时，簇1、5、7、8、10和11内的所有成员表现出可转移性(参见图11g)；簇5、7、8、10和11包括这样的成员，其中表现出所需的双特异性抗体相对于野生型的百分比增加的所有成员(仅考虑全抗体)(参见图11h)。
总之，大部分弱竞争抗体的H∶L配对增加的设计使所需的双特异性抗体的百分比减少(仅考虑全抗体)。就方向而言，与“_2”方向相比，“_1”方向的大部分设计表现出类似或更好的H∶L配对比较的可转移性(例外主要在曲妥单抗/西妥昔单抗系统中观察)。
实施例10：用于生物物理学表征的选择SMCA双特异性异源二聚体抗体和亲代Mab的制备性尺寸排阻色谱(SEC)。
选择SMCA样品的子集进行另外的生物物理学表征。大部分这些SMCA样品通常表现出半抗体种类的高配对(大于～80％配对，在H1L1+H2L2/所有种类列中)和低含量(小于-30％，考虑所有半抗体种类)。制备性SEC如下所述进行。使用安装在Pharmacia(GEHealthcare)Purifier系统上的Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)柱分离异源二聚体抗体样品。将溶于PBS(Hyclone DPBS/改良，无钙，无镁，Cat no SH-300028.02)的异源二聚体抗体样品(0.3-0.5ml)手动加载至0.5ml环(填充有PBS)。然后将样品自动注射到柱子，并使用1CV洗脱柱以0.5ml/min解析。监测OD280下的蛋白质洗脱，并收集0.5ml级分。对于每个SMCA样品，汇合那些包含主峰的级分，并进一步进行生物物理学表征。
实施例11：在制备性尺寸排阻色谱后，抗体形式的双特异性异源二聚体的优先配对评估
在制备性SEC后，如实施例9所述，使用LC-MS方法分析选择样品的双特异性异源二聚体抗体的优先配对。所有这些样品显示出所需双特异性抗体种类的百分比增加，以及半抗体种类的百分比减少(表29和30)。
实施例12：SMCA双特异性异源二聚体抗体的热稳定性。
在制备性SEC之后，测定选择SMCA双特异性异源二聚体抗体的热稳定性，并与亲代D3H44和曲妥单抗单克隆抗体以及西妥昔单抗单臂抗体进行比较。一般来讲，单臂抗体是指由一条全长重链、一条缺乏Fab区(包括C233S置换)的截短重链和一条轻链构成的构建体，其中重链异源二聚化如实施例9所述实现。
热稳定性的测定
选择双特异性异源二聚体抗体和野生型对照的热稳定性使用差示扫描量热法(DSC)如下文所述测定。在制备性SEC处理后，使用VP-Capillary DSC(GE Healthcare)对主要以0.2mg/ml或0.4mg/mL的浓度溶于PBS的400μL样品进行DSC分析。在每次DSC运行开始时，进行5次缓冲液空白注射以稳定基线，并且进行缓冲液注射，然后是每次样品注射参照。以60℃/小时的速率以及低反馈、8s过滤、5min preTstat和70psi氮气压从20℃至100℃扫描每个样品。参照所得的热谱曲线，并使用Origin 7软件分析。
结果示于表31a、b和c中。表格中报告的野生型Fab Tm值从D3H44(79℃)和曲妥单抗(81℃)的同源二聚体抗体以及西妥昔单抗(72℃)的单臂抗体获得。就WT D3H44/西妥昔单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗异源二聚体抗体而言，仅观察到Fab Tm对应的2个峰。未观察到CH2(由于与西妥昔单抗Fab重叠)或CH3(由于与D3H44和曲妥单抗Fab的Tm值重叠)的不同峰。就WT D3H44/曲妥单抗异源二聚体抗体而言，由于D3H44和曲妥单抗的两个Fab的Tm值相似，81℃下的峰值可能对应于两个Fab，而大约72℃下的峰值可能对应于CH2。
在表31a、b和c中，仅报告两个Fab对应的峰的Tm值，除非另外指明。还注意到，就一些异源二聚体样品而言，蛋白质浓度很低(小于0.4mg/mL)，导致基线的噪声增加。因此，在D3H44/曲妥单抗系统中，一些样品产生低峰值强度的DSC曲线，使得难以区分CH2峰和可能不稳定的Fab。在这些情况下，还报告70至72℃下的Tm值(表31a)。总之，大部分异源二聚体抗体表现出类似于对应的野生型分子的热稳定性(3℃或更小)。此外，大部分异源二聚体抗体不表现另外的峰，暗示CH2或CH3峰明显不稳定。一个例外包括从曲妥单抗/西妥昔单抗系统工程改造异源二聚体抗体9611-9077_2，其在60℃下表现出另外的峰，可能是由于CH2不稳定。
实施例13：双特异性异源二聚体抗体的抗原亲和力测定
评估双特异性抗体结合相关的抗原的能力，以确定氨基酸置换是否对抗原结合有影响。抗原结合亲和力如下文所述通过SPR测定。
SPR生物传感分析
EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；SPR：表面等离振子共振；EDTA：乙二胺四乙酸；TF：组织因子；EGFR ECD：表皮生长因子受体胞外域；Her2ECD：人上皮生长因子受体2胞外域。
SPR供应商。Series S传感器芯片CM5、Biacore胺耦合试剂盒(NHS、EDC和1M乙醇胺)和10mM乙酸钠缓冲液购自GE Healthcare Life Science(Mississauga，ON)。重组Her2胞外域(ECD)蛋白购自eBioscience(San Diego，CA)。含1％Tween20(PBST)的PBS运行缓冲液购自Teknova Inc.(Hollister，CA)。山羊多克隆抗人Fc抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.(West Grove，PA)。EDTA购自Bioshop(Burlington，ON)。
所有表面等离振子共振分析使用Biacore T200表面等离振子共振仪器(GEHealthcare Life Science，(Mississauga，ON))和PBST运行缓冲液(加入0.5M EDTA储液达到3.4mM的终浓度)在25℃的温度下进行。抗人Fc捕获表面利用Series S传感器芯片CM5，使用默认参数，借助Biacore T200控制软件的Immobilization Wizard(设定为靶向2000个共振单位(RU))生成。筛选结合Her2ECD、TF或EGFR ECD抗原靶标的抗体变体以两步进行：抗体变体间接捕获到抗人Fc抗体流动池表面，然后注射5个浓度的纯化抗原，使用单循环动力学方法进行动力学分析。用于捕获的变体或对照以1μg/mL在单个流动池上以10μL/min的流速注射60s。一般来讲，结果是抗人Fc表面上捕获大约50至100RU。第一流动池留空，用作空白对照。在该捕获步骤后，立即在所有四个流动池上以100μL/min按顺序注射五个浓度的抗原(TF或EGFR ECD抗原为5nM、2.5nM、1.25nM、0.63nM和0.31nM，或Her2ECD抗原为40nm、20nm、10nm、5nm和2.5nm)180s，EGFR ECD的解离阶段300s，Her2ECD的解离阶段1800s，TF的解离阶段3600s。捕获抗体表面通过10mM甘氨酸pH1.5、30μL/min、120s再生，以准备下一次注射循环。对于每次分析物注射，进行至少两次模拟缓冲液注射，以用作参照。使用BiacoreT200BiaEvaluation软件分析所得的单循环动力学传感图，并拟合至1∶1结合模型。
结合各自的野生型对照：D3H44的Mab、曲妥单抗OAA和西妥昔单抗OAA评估异源二聚体抗体的抗原亲和力。还获得了野生型双特异性抗体的抗原亲和力；然而，WT双特异性的SPR捕获可以是不均一的(例如涉及捕获错配的异源二聚体)，从而干扰KD测定(参见表31a和c)。就在D3H44/西妥昔单抗系统中测定抗原结合的异源二聚体抗体而言，抗原亲和力类似于对应的WT对照(参见表31b)。就在D3H44/曲妥单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗系统中测定抗原结合的大部分异源二聚体抗体而言，抗原亲和力类似于对应的WT对照(参见表31a和c)。例外包括不表现出Her2结合的十一个工程改造抗体。在D3H44/曲妥单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗系统中，未观察到六个工程改造异源二聚体抗体9049-9759_1和9682-9740_1和3522_1的her2结合。此外，就曲妥单抗/西妥昔单抗系统而言，五个另外的工程改造抗体9696-9848_1、9561-9095_2、9611-9077_2、9286-9402_2和9060-9756_2也缺乏Her2结合。这十一个工程改造抗体中的十个共有H链(L143E_K145T)和L链(Q124R_T178R)上的恒定区突变。另一个工程改造抗体9286-9402_2共有H链(L143E_K145T)上相同的恒定区突变和L链(Q124K和S176R)上的类似突变。
实施例14：工程改造异源二聚体抗体以及野生型异源二聚体和同源二聚体抗体的超效液相色谱尺寸排阻色谱(UPLC-SEC)图谱
在工程改造异源二聚体抗体以及对照野生型双特异性和同源二聚体抗体的制备性SEC之后，UPLC-SEC使用Waters BEH200SEC柱(2.5mL、4.6x150mm、不锈钢、1.7μm颗粒)进行，该色谱柱设定为30℃并且安装在具有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上。运行时间包括7min，每次注射总体积2.8mL，运行缓冲液为PBS和0.02％聚山梨醇酯20或20mMNaPO4、50mM KCl、0.02％聚山梨醇酯20、10％乙腈，pH7，0.4ml/min。通过210-400nm范围内的UV吸光度监测洗脱，并提取280nm下的色谱图。使用Empower 3软件进行峰积分。
图10示出了代表性工程改造异源二聚体抗体以及代表性野生型异源二聚体抗体的UPLC-SEC图谱。在大多数情况下，工程改造异源二聚体抗体显示出与对应的野生型异源二聚体抗体类似的UPLC-SEC图谱，就D3H44/曲妥单抗、D3H44/西妥昔单抗和曲妥单抗/西妥昔单抗而言，单体的平均百分比分别为99.18％、98.70％和98.77％(参见表31a、31b和31c)。
虽然结合优选的实施方案和各种替代实施方案特别展示和描述了本发明，但相关领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对其中的形式和详情作出各种改变。
本文公开的所有参考文献、公布专利、专利公开和序列登录号据此全文以引用方式并入用于所有目的。
表格
表1：Fab模型的关键标准
表2：D3H44中重链和轻链的界面处的热点氨基酸位置(典型的Fab包含κ轻链)。
重链＊ 轻链＊
V37 Y36
Q39 Q38
L45 P44
W47 L89
F100 F98
W103 F116
L124 F118
A139 V133
F174 L135
*Kabat编号
表4.具有一条免疫球蛋白重链和/或两条免疫球蛋白轻链的修饰的LCCA设计，其中H1优先地与L1配对
*Kabat编号；WT是指无氨基酸突变的野生型免疫球蛋白链。
**给每个独特的H1、L1和L2突变集(LCCA形式)分配集编号或“唯一标识符”。
表11：用于轻链竞争分析和检验的H1∶L1∶L2DNA比率
^另外的DNA：AKTdd pTT22是指包含组成型活性蛋白激酶B突变(显性正性AKT突变)的载体；ssDNA是指鲑精DNA。
表12. LCCA设计的LCCA性能、稳定性和抗原结合评估，以H1L1Fab异源二聚体的DSF值降序排列
*表示来源于不同之处仅为存在/不存在连接的L链标签(HA或FLAG)的其他Fab异源二聚体的估计值。
**值来源于333(H1)、250(L1)、749(L2)LCCA实验。
***值来源于333(H1)、100(L1)、899(L2)LCCA实验。
ND表示数据不可用。
表13a.满足正确配对：错配Fab异源二聚体为86∶14的LCCA平均性能标准的设计的LCCA性能
*值从LCCA实验(以1∶3的L1∶L2DNA比率进行)获得，并归一化为1∶1的L1∶L2DNA比率
**值从LCCA实验(以1∶9的L1∶L2DNA比率进行)获得，并归一化为1∶1的L1∶L2DNA比率
***“唯一标识符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的两个组成LCCA的唯一标识符构成
表13b.满足正确配对：错配Fab异源二聚体为86∶14的LCCA平均性能标准的设计的稳定性和抗原结合评估
*表示来源于不同之处仅为存在/不存在连接的L链标签(HA或FLAG)的其他Fab异源二聚体的估计值。
**“唯一标识符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的两个组成LCCA的唯一标识符构成
表14a.性能低于正确配对：错配Fab异源二聚体为86∶14的LCCA平均性能标准的设计的LCCA性能
*值从LCCA实验(以1∶3的L1∶L2DNA比率进行)获得，并归一化为1∶1的L1∶L2DNA比率
**值从LCCA实验(以1∶9的L1∶L2DNA比率进行)获得，并归一化为1∶1的L1∶L2DNA比率
***“唯一标识符”由沿(集#H1L1L2-集#H2L2L1)或(集#H2L2L1-集#H1L1L2)方向的两个组成LCCA的唯一标识符构成
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种包含至少第一异源二聚体和第二异源二聚体的分离的抗原结合多肽构建体，
所述第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中所述第一异源二聚体的所述H1或L1序列中的至少一个不同于所述第二异源二聚体的所述对应的H2或L2序列，并且其中
H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；
L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)；并且
H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个氨基酸修饰，其中与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；或
H1、H2、L1和L2包含一组氨基酸修饰，其中与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；
其中所述Fab区的热稳定性通过所述第一和第二异源二聚体中的至少一个的熔融温度(Tm)测定，所述熔融温度在无所述至少一个氨基酸修饰或氨基酸修饰组的所述对应的异源二聚体的所述Tm的约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之内。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
3.根据权利要求2所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124R、L124E、K145M、K145T、D146N、Q179E、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124E、S131R、S131K、V133G、Q160E、S176R、S176D、T178D、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
4.根据权利要求3所述的构建体，其中：
H1包含选自L124E、K145M、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自S131R、S131K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133G、Q160E、S176D、T178D、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
5.根据权利要求4所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰S131K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
6.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
7.根据权利要求6所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、L143E、L143D、K145T、K145M、D146N、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124K、Q124E、V133G、Q160K、S176R、S176D、T178E、T178K、T178R、T178D和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
8.根据权利要求7所述的构建体，其中：
H1包含选自L124E、L143E、L143D、K145T和K145M或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124K、V133G、Q160K、S176R、T178K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133G、S176D、T178E、T178D和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
9.根据权利要求8所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178E。
10.根据权利要求8所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
11.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L45、L124、L143、F122和H172处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。
12.根据权利要求11所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、F122C、L124E、L124R、L143F、H172T和H172R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124C、S131T、S131E、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K、S176D、T178Y和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。
13.根据权利要求12所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L45P、F122C、L124E、L143F、H172T和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、P44F、Q124C、S131T、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K和T178Y或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、L124R和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、S131E、V133G、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。
14.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E和L124E；
L1包含氨基酸修饰Q38R、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰Q39R和L124R；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、V133G和S176D。
15.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P和L124E；
L1包含氨基酸修饰P44F、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
16.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和L143F；
L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
17.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰F122C和L124E；
L1包含氨基酸修饰Q124C、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。
18.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和H172T；
L1包含氨基酸修饰V133G、N137K、S174R和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和H172R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
19.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、A125、H172和K228处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含S121、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。
20.根据权利要求19所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A125S、A125R、H172R、H172T和K228D至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自S121K、V133G、N137K、S174R、S176K、S176R、S176D和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。
21.根据权利要求20所述的构建体，其中
H1包含选自L124E、A125S、H172R和K228D或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自S121K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、A125R和H172T或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自V133G、N137K、S174R、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。
22.根据权利要求21所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和K228D；
L1包含氨基酸修饰S121K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和A125R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。
23.根据权利要求21所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和H172R；
L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和H172T；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S174R和S176D。
24.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、A139和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、V133、L135和S176处的至少一个或一组氨基酸修饰。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A139W、A139G和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116A、V133G、L135V、L135W、S176R和S176D的至少一个或一组氨基酸修饰。
26.根据权利要求25所述的构建体，其中
H1包含选自L124E和A139W或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116A、V133G、L135V和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、A139G和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自V133G、L135W和S176D或它们的组合的氨基酸修饰。
27.根据权利要求26所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和A139W；
L1包含氨基酸修饰F116A、V133G、L135V和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R、A139G和V190A；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、L135W和S176D。
28.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L45、K145、H172、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、Q160、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
29.根据权利要求28所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、K145T、H172R、Q179E和S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124E、S131K、Q160E、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
30.根据权利要求29所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L45P、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、P44F和S131K或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、H172R和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、Q160E、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。
31.根据权利要求30所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q38R和S131K；
H2包含氨基酸修饰Q39R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
32.根据权利要求30所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P、K145T、H172R和Q179E；
L1包含氨基酸修饰P44F和S131K；
H2包含氨基酸修饰H172R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。
33.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、L135、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
34.根据权利要求33所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自A139W、A139G、L143E、K145T、Q179E、Q179K和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116A、Q124R、Q124E、L135V、L135W、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
35.根据权利要求34所述的构建体，其中
H1包含选自A139W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116A、Q124R、L135V和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自A139G、Q179K和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、L135W、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
36.根据权利要求35所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰A139W、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰F116A、Q124R、L135V和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、L135W、Q160E和T180E。
37.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、Q124、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
38.根据权利要求37所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L143E、K145T、D146G、H172R、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、Q124R、Q124E、Q160K、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
39.根据权利要求38所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、H172R和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、D146G、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
40.根据权利要求39所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q38R、Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q39R、H172R和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
41.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L45、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、N137、Q160、S174、T178、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
42.根据权利要求41所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L45P、L143E、K145T、D146G、H172R、H172T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38E、P44F、Q124R、Q124E、N137K、Q160K、Q160E、S174R、T178R、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
43.根据权利要求42所述的构建体，其中
H1包含选自L45P、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自P44F、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自D146G、H172R、H172T和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、N137K、Q160E、S174R、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。
44.根据权利要求43所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰P44F、Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰D146G和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
45.根据权利要求43所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和H172R；
L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰H172T和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E、N137K、S174R和T180E。
46.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
47.根据权利要求46所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124W、L124A、L143E、L143F、K145T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124R、Q124K、Q124E、S131K、V133A、V133W、S176T、T178R、T178L、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
48.根据权利要求47所述的构建体，其中
H1包含选自L124W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124R、Q124K、S131K、V133A、S176T、T178R和T178L或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124A、L143F和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133W、S176T、T178L、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
49.根据权利要求48所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124W、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R、V133A、S176T和T178R；
H2包含氨基酸修饰L124A、L143F和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E。
50.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、V133、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
51.根据权利要求50所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自A139C、L143E、L143D、L143R、L143K、K145T、Q179E、Q179D、Q179R、Q179K、S186K、S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q124E、V133E、V133D、Q160K、Q160E、T178R、T178K、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
52.根据权利要求51所述的构建体，其中
H1包含选自A139C、L143E、L143D、K145T、Q179E和Q179D或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q160K、T178R和T178K或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L143R、L143K、Q179R、Q179K、S186K和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133E、V133D、Q160E、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
53.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰A139C、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰F116C、Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。
54.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T178E。
55.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰L143R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
56.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179、S186和S188处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
57.根据权利要求56所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143E、L143K、K145T、D146G、Q179R、Q179E、Q179K、S186R、S186K和S188L处的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124R、Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160K、Q160M、S176L、T178R、T178E、T178F、T178Y和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
58.根据权利要求57所述的构建体，其中
H1包含选自L143E、K145T、Q179E和S188L或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143K、D146G、Q179R、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160M、S176L、T178E、T178F、T178Y和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
59.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、S176L和T180E。
60.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、S131T、T178Y和T180E。
61.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰S131E。
62.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124R；
H2包含氨基酸修饰L143R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
63.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1包含F122和C233处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1包含Q124和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
64.根据权利要求63所述的构建体，其中
(i)H1包含选自F122C和C233S的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1包含选自Q124C和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
65.根据权利要求64所述的构建体，其中
H1包含选自F122C和C233S或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124C和C214S或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且
L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。
66.根据权利要求65所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰F122C和C233S；
L1包含氨基酸修饰Q124C和C214S；
H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且
L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。
67.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1、H2、L1和L2共生成时，或当H1、H2、L1和L2通过氧化还原生成方法共生成时，与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对。
68.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的至少一个包含VH和/或VL结构域的至少一个氨基酸修饰，和/或CH1和/或CL结构域的至少一个氨基酸修饰，使得与L2相比H1优先地与L1配对，和/或与L1相比H2优先地与L2配对。
69.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中如果H1包含所述CH1结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述CL结构域中的至少一个氨基酸修饰；和/或如果H1包含所述VH结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述VL结构域中的至少一个氨基酸修饰；或其中如果H2包含所述CH1结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述CL结构域中的至少一个氨基酸修饰；和/或如果H2包含所述VH结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述VL结构域中的至少一个氨基酸修饰。
70.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、L1、H2和/或L2包含所述Fab区中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
71.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
72.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中当L1和L2二者与H1和H2中的至少一个共表达时，H1-L1和H2-L2异源二聚体对中的所述至少一个的相对配对与所述各自对应的H1-L2或H2-L1异源二聚体对之比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中所述经修饰的H1-L1或H2-L2异源二聚体对的相对配对大于无所述至少一个氨基酸修饰的所述对应的H1-L1或H2-L2异源二聚体对中观察到的各自相对配对。
73.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述第一和第二异源二聚体中的至少一个的所述Fab区的热稳定性在无所述至少一个氨基酸修饰或氨基酸修饰组的所述对应的异源二聚体的所述Tm的约0、1、2或3℃之内。
74.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中每个异源二聚体对其结合的抗原的亲和力在所述各自未经修饰的异源二聚体对相同的抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍之内，如通过表面等离振子共振(SPR)或FACS所测定。
75.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中
H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的氨基酸空间互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的氨基酸空间互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的氨基酸空间和静电互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的氨基酸空间和静电互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域，其包含至少一个氨基酸修饰，在H1和L1之间产生共价键；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域，其包含至少一个氨基酸修饰，在H2和L2之间产生共价键。
76.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2包含一组选自表5至表6、表15至表27或表28a至表28c所示的唯一标识符设计集的氨基酸修饰。
77.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体还包含Fc，所述Fc包含第一CH3序列和第二CH3序列，其中所述第一CH3序列通过或不通过一个或多个接头连接至所述第一异源二聚体，并且所述第二CH3序列通过或不通过一个或多个接头连接至所述第二异源二聚体。
78.根据权利要求77所述的构建体，其中所述Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgA Fc、人IgGFc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc或人IgG4Fc。
79.根据权利要求77或78所述的构建体，其中所述Fc是异源二聚体Fc。
80.根据权利要求77至79中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的构建体，其中所述二聚化CH3序列具有如DSF所测定的约68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的熔融温度(Tm)。
82.根据权利要求77至81中任一项所述的构建体，其中在制备时，所述Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体；或其中在表达时或在经由单个细胞表达时，所述Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体。
83.根据权利要求77至82中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰，所述修饰有助于形成稳定性相当于野生型同源二聚体Fc的异源二聚体Fc。
84.根据权利要求78至84中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含：
i)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
ii)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iii)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iv)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc；或
v)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc。
85.根据权利要求77至84中任一项所述的构建体，其中所述Fc还包含至少一个CH2序列。
86.根据权利要求85所述的构建体，其中所述Fc的所述CH2序列包含一个或多个修饰。
87.根据权利要求77至86中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含一个或多个修饰以有助于Fc-γ受体的选择性结合。
88.根据权利要求77至87在任一项所述的构建体，其中所述Fc通过一个或多个接头偶联到所述异源二聚体，或其中所述Fc通过一个或多个接头偶联到H1和H2。
89.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。
90.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。
91.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个修饰。
93.根据权利要求92所述的构建体，其中所述一个或多个修饰有助于Fc-γ受体的选择性结合。
94.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸突变，或其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸置换。
95.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的每一个的序列来源于人序列。
96.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多特异性的或双特异性的。
97.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多价的或二价的。
98.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其包含至少一个编码根据前述权利要求中任一项所述的构建体序列。
99.根据权利要求98所述的分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其中所述多核苷酸或多核苷酸组是cDNA。
100.一种载体或载体组，其包含根据权利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。
101.根据权利要求100所述的载体或载体组，其选自质粒、多顺反子载体、病毒载体、非游离型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
102.一种分离的细胞，其包含根据权利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸组，或根据权利要求100或101所述的载体或载体组。
103.根据权利要求102所述的分离的细胞，其中所述细胞是酵母细胞、细菌细胞、杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
104.一种药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的构建体和药学上可接受的载体。
105.根据权利要求104所述的药物组合物，还包含一种或多种选自缓冲液、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂的物质。
106.根据权利要求1至96所述的构建体或根据权利要求104或105所述的药物组合物用于治疗受试者中的疾病或病症或用于药物制造中的用途。
107.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至96中任一项所述的构建体或根据权利要求104或105所述的药物组合物。
108.一种从宿主细胞培养物获得根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得包含至少一种宿主细胞的宿主细胞培养物，所述宿主细胞包含一个或多个编码所述构建体的核酸序列；以及
(b)从所述宿主细胞培养物回收所述构建体。
109.一种获得根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得H1、L1、H2或L2；
(b)允许与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；以及
(c)获得所述构建体。
110.一种制备根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括：
a.获得编码至少一种构建体的多核苷酸或多核苷酸组；
b.确定用于引入至少一种宿主细胞的所述多核苷酸或多核苷酸组中的每一个的最佳比率，其中所述最佳比率通过评估与在H1、L1、H2或L2表达时形成的错配的H1-L2和H2-L1异源二聚体对相比在H1、L1、H2或L2表达时形成的H1-L1和H2-L2异源二聚体对的量来确定；
c.选择优选的最佳比率，其中用所述优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组的转染至少一种宿主细胞导致所述构建体表达；
d.用所述最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组转染所述至少一种宿主细胞；以及
e.培养所述至少一种宿主细胞以表达所述构建体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中选择所述最佳比率通过在瞬时转染系统中转染来评估。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中用所述优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组转染所述至少一种宿主细胞导致所述构建体的最佳表达。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中所述构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
115.一种计算机可读存储介质，所述介质存储：
包含表示第一异源二聚体和第二异源二聚体中的互补突变的数据的数据集，所述第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中所述互补突变的数据集包含表示表4至表6、表15至表27、表28a至表28c列出的那些突变或那些突变的子集的数据。
116.一种制备双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述双特异性构建体包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，所述第一异源二聚体包含来自第一单特异性抗原结合多肽的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含来自第二单特异性抗原结合多肽的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，所述方法包括：
a.将根据权利要求115所述的数据集的一个或多个互补突变引入所述第一异源二聚体和/或所述第二异源二聚体；以及
b.使所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体在至少一种宿主细胞中共表达，以生成包含所述双特异性构建体的表达产物。
117.根据权利要求116所述的方法，其还包括确定所述表达产物相对于其他多肽产物中所述双特异性构建体的量，以选择优选的互补突变子集。
118.根据权利要求116或117所述的方法，其中与其他多肽产物相比，所述双特异性构建体以大于70％的纯度生成。
119.根据权利要求116至118中任一项所述的方法，其还包括将另外的氨基酸修饰添加至H1、H2、L1或L2中的至少一个，以提高所述双特异性构建体相较于其他多肽产物的纯度的步骤。
120.根据权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
122.根据权利要求116至121中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽是抗体、单链单克隆抗体、Fab或单链Fab。
123.一种制备根据权利要求1至96中任一项所述的分离的抗原结合多肽构建体的方法，所述方法包括在至少一个表达系统中表达H1、H2、L1和L2，以生成表达产物；表征所述表达产物；以及选择其中大于90％的所述表达产物是所述分离的抗原结合多肽构建体的所述表达系统。
124.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自对应于表35a的唯一标识符的SMCA设计
9561-9095_1、9561-9095_2，其中H1包含L124W、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R、V133A、S176T和T178R，H2包含L124A、L143F和Q179K，并且L2包含Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E；
9121-9373_1、9121-9373_2，其中H1包含L124E和H172T，L1包含V133G、N137K、S174R和S176R，H2包含L124R和H172R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；
9116-9349_1、9116-9349_2，其中H1包含L124E和A139W，L1包含F116A、V133G、L135V和S176R，H2包含L124R、A139G和V190A，并且L2包含V133G、L135W和S176D；
9134-9521_1、9134-9521_2，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131K、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；
9286-9402_1、9286-9402_2，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T178E；
9667-9830_1、9667-9830_2，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E；
9696-9848_1、9696-9848_2，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；
9060-9756_1、9060-9756_2，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；
9682-9740_1、9682-9740_2，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和V133E；
9049-9759_1、9049-9759_2，其中H1包含A139C、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116C、Q124R和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；以及
9820-9823_1、9820-9823_2，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
125.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自对应于表35b的唯一标识符的SMCA设计
9327-6054_1，其中H1包含L124E和L143F，L1包含V133G和S176R，H2包含L124R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；
9815-9825_1、9815-9825_2，其中H1包含Q39E和L124E，L1包含Q38R、V133G和S176R，H2包含Q39R和L124R，并且L2包含Q38E、V133G和S176D；
9587-9735_l、9587-9735_2，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和VI33E；
3522_1、3522_2，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；以及
3519_1、3519_2，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E。
126.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自对应于唯一标识符的SMCA设计
9060-9756，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；
9820-9823，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E，
3519，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E，
9049-9759，其中H1包含A139C、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116C、Q124R和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；
3522，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E；
9696-9848，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；
9692-9846，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S131T、T178Y和T180E；
9986-9978，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含S186K，并且L2包含S131E，以及
9667-9830，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E。
127.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自对应于唯一标识符的SMCA设计
9587-9735，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R，H2包含L143R，并且L2包含Q124E和V133E；
9561-9095，其中H1包含L124W、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R、V133A、S176T和T178R，H2包含L124A、L143F和Q179K，并且L2包含Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E；
9611-9077，其中H1包含L143E、K145T和H172R，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含H172T和Q179K，并且L2包含Q124E、N137K、Q160E、S174R和T180E；
9168-9342，其中H1包含L124E和K228D，L1包含S121K、V133G和S176R，H2包含L124R和A125R，并且L2包含V133G和S176D；
9164-9555，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131R、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T180E；
9279-9518，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和S186R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；
9290-9432，其中H1包含L124E、L143E和K145T，L1包含Q124K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T180E；
9142-9414，其中H1包含L124E、K145T和Q179E，L1包含S131K、V133G和S176R，H2包含L124R和Q179K，并且L2包含V133G、S176D和T178E；
9060-9756，其中H1包含A139W、L143E、K145T和Q179E，L1包含F116A、Q124R、L135V和T178R，H2包含Q179K，并且L2包含Q124E、L135W、Q160E和T180E；
9121-9373，其中H1包含L124E和H172T，L1包含V133G、N137K、S174R和S176R，H2包含L124R和H172R，并且L2包含V133G、S176D和T178D；
9066-9335，其中H1包含F122C和L124E，L1包含Q124C、V133G和S176R，H2包含L124R，并且L2包含V133G和S176D；
9820-9823，其中H1包含Q39E、L143E、K145T和Q179E，L1包含Q38R、Q124R、Q160K和T178R，H2包含Q39R、H172R和Q179K，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E；
9814-9828，其中H1包含Q39E、K145T和Q179E，L1包含Q38R和S131K，H2包含Q39R和S186R，并且L2包含Q38E、Q124E、Q160E和T180E；
9696-9848，其中H1包含L143E、K145T、Q179E和S188L，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、S176L和T180E；
9667-9830，其中H1包含L143E、K145T和Q179E，L1包含Q124R和T178R，H2包含S186K，并且L2包含Q124E、Q160E和T178E；
9986-9978，其中H1包含L143E和K145T，L1包含Q124R、Q160K和T178R，H2包含S186K，并且L2包含S131E；
3522，其中H1包含L45P、L143E和K145T，L1包含P44F、Q124R、Q160K和T178R，H2包含D146G和Q179K，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E，以及
3519，其中H1包含L45P、K145T、H172R和Q179E，L1包含P44F和S131K，H2包含H172R和S186R，并且L2包含Q124E、Q160E和T180E。

Claims (125)

1.一种包含至少第一异源二聚体和第二异源二聚体的分离的抗原结合多肽构建体，
所述第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中所述第一异源二聚体的所述H1或L1序列中的至少一个不同于所述第二异源二聚体的所述对应的H2或L2序列，并且其中
H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；
L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)；并且
H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个氨基酸修饰，其中与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；或
H1、H2、L1和L2包含一组氨基酸修饰，其中与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；
其中所述Fab区的热稳定性通过所述第一和第二异源二聚体中的至少一个的熔融温度(Tm)测定，所述熔融温度在无所述至少一个氨基酸修饰或氨基酸修饰组的所述对应的异源二聚体的所述Tm的约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃之内。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
3.根据权利要求2所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124R、L124E、K145M、K145T、D146N、Q179E、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124E、S131R、S131K、V133G、Q160E、S176R、S176D、T178D、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
4.根据权利要求3所述的构建体，其中：
H1包含选自L124E、K145M、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自S131R、S131K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133G、Q160E、S176D、T178D、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
5.根据权利要求4所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰S131K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
6.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
7.根据权利要求6所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、L143E、L143D、K145T、K145M、D146N、Q179K、S186R和S186K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124K、Q124E、V133G、Q160K、S176R、S176D、T178E、T178K、T178R、T178D和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
8.根据权利要求7所述的构建体，其中：
H1包含选自L124E、L143E、L143D、K145T和K145M或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124K、V133G、Q160K、S176R、T178K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、D146N、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133G、S176D、T178E、T178D和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
9.根据权利要求8所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178E。
10.根据权利要求8所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
11.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L45、L124、L143、F122和H172处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。
12.根据权利要求11所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、F122C、L124E、L124R、L143F、H172T和H172R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124C、S131T、S131E、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K、S176D、T178Y和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。
13.根据权利要求12所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L45P、F122C、L124E、L143F、H172T和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、P44F、Q124C、S131T、V133G、N137K、S174R、S176R、S176K和T178Y或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、L124R和H172R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、S131E、V133G、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。
14.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E和L124E；
L1包含氨基酸修饰Q38R、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰Q39R和L124R；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、V133G和S176D。
15.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P和L124E；
L1包含氨基酸修饰P44F、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
16.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和L143F；
L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
17.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰F122C和L124E；
L1包含氨基酸修饰Q124C、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。
18.根据权利要求13所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和H172T；
L1包含氨基酸修饰V133G、N137K、S174R和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和H172R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S176D和T178D。
19.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、A125、H172和K228处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含S121、V133、N137、S174、S176和T178处的至少一个或一组氨基酸修饰。
20.根据权利要求19所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A125S、A125R、H172R、H172T和K228D至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自S121K、V133G、N137K、S174R、S176K、S176R、S176D和T178D的至少一个或一组氨基酸修饰。
21.根据权利要求20所述的构建体，其中
H1包含选自L124E、A125S、H172R和K228D或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自S121K、V133G和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、A125R和H172T或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自V133G、N137K、S174R、S176D和T178D或它们的组合的氨基酸修饰。
22.根据权利要求21所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和K228D；
L1包含氨基酸修饰S121K、V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和A125R；并且
L2包含氨基酸修饰V133G和S176D。
23.根据权利要求21所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和H172R；
L1包含氨基酸修饰V133G和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R和H172T；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、S174R和S176D。
24.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、A139和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、V133、L135和S176处的至少一个或一组氨基酸修饰。
25.根据权利要求24所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124E、L124R、A139W、A139G和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116A、V133G、L135V、L135W、S176R和S176D的至少一个或一组氨基酸修饰。
26.根据权利要求25所述的构建体，其中
H1包含选自L124E和A139W或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116A、V133G、L135V和S176R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124R、A139G和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自V133G、L135W和S176D或它们的组合的氨基酸修饰。
27.根据权利要求26所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124E和A139W；
L1包含氨基酸修饰F116A、V133G、L135V和S176R；
H2包含氨基酸修饰L124R、A139G和V190A；并且
L2包含氨基酸修饰V133G、L135W和S176D。
28.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L45、K145、H172、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、S131、Q160、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
29.根据权利要求28所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L45P、K145T、H172R、Q179E和S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、P44F、Q124E、S131K、Q160E、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
30.根据权利要求29所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L45P、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、P44F和S131K或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、H172R和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、Q160E、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。
31.根据权利要求30所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q38R和S131K；
H2包含氨基酸修饰Q39R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
32.根据权利要求30所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P、K145T、H172R和Q179E；
L1包含氨基酸修饰P44F和S131K；
H2包含氨基酸修饰H172R和S186R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。
33.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和V190处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、L135、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
34.根据权利要求33所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自A139W、A139G、L143E、K145T、Q179E、Q179K和V190A的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116A、Q124R、Q124E、L135V、L135W、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
35.根据权利要求34所述的构建体，其中
H1包含选自A139W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116A、Q124R、L135V和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自A139G、Q179K和V190A或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、L135W、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
36.根据权利要求35所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰A139W、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰F116A、Q124R、L135V和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、L135W、Q160E和T180E。
37.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含Q39、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、Q124、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
38.根据权利要求37所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自Q39E、Q39R、L143E、K145T、D146G、H172R、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38R、Q38E、Q124R、Q124E、Q160K、Q160E、T178R和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
39.根据权利要求38所述的构建体，其中
H1包含选自Q39E、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q38R、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自Q39R、H172R和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、D146G、Q160E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
40.根据权利要求39所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰Q39E、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q38R、Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q39R、H172R和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
41.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L45、L143、K145、D146、H172和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q38、P44、Q124、N137、Q160、S174、T178、T180和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
42.根据权利要求41所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L45P、L143E、K145T、D146G、H172R、H172T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q38E、P44F、Q124R、Q124E、N137K、Q160K、Q160E、S174R、T178R、T180E和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
43.根据权利要求42所述的构建体，其中
H1包含选自L45P、L143E、K145T、H172R和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自P44F、Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自D146G、H172R、H172T和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q38E、Q124E、N137K、Q160E、S174R、T180E和C214S或它们的组合的氨基酸修饰。
44.根据权利要求43所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L45P、L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰P44F、Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰D146G和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q38E、Q124E、Q160E和T180E。
45.根据权利要求43所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和H172R；
L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰H172T和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E、N137K、S174R和T180E。
46.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145和Q179处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
47.根据权利要求46所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124W、L124A、L143E、L143F、K145T、Q179E和Q179K的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124R、Q124K、Q124E、S131K、V133A、V133W、S176T、T178R、T178L、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
48.根据权利要求47所述的构建体，其中
H1包含选自L124W、L143E、K145T和Q179E或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124R、Q124K、S131K、V133A、S176T、T178R和T178L或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124A、L143F和Q179K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133W、S176T、T178L、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
49.根据权利要求48所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L124W、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R、V133A、S176T和T178R；
H2包含氨基酸修饰L124A、L143F和Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、V133W、S176T、T178L和T180E。
50.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含A139、L143、K145、Q179和S186处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含F116、Q124、V133、Q160、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
51.根据权利要求50所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自A139C、L143E、L143D、L143R、L143K、K145T、Q179E、Q179D、Q179R、Q179K、S186K、S186R的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q124E、V133E、V133D、Q160K、Q160E、T178R、T178K、T178E和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
52.根据权利要求51所述的构建体，其中
H1包含选自A139C、L143E、L143D、K145T、Q179E和Q179D或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自F116C、Q124R、Q124K、Q160K、T178R和T178K或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L143R、L143K、Q179R、Q179K、S186K和S186R或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、V133E、V133D、Q160E、T178E和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
53.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰A139C、L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰F116C、Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰Q179K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T180E。
54.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、Q160E和T178E。
55.根据权利要求52所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T和Q179E；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰L143R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
56.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含L124、L143、K145、D146、Q179、S186和S188处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1和/或L2包含Q124、S131、V133、Q160、S176、T178和T180处的至少一个或一组氨基酸修饰。
57.根据权利要求56所述的构建体，其中
(i)H1和/或H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143E、L143K、K145T、D146G、Q179R、Q179E、Q179K、S186R、S186K和S188L处的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1和/或L2包含选自Q124R、Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160K、Q160M、S176L、T178R、T178E、T178F、T178Y和T180E的至少一个或一组氨基酸修饰。
58.根据权利要求57所述的构建体，其中
H1包含选自L143E、K145T、Q179E和S188L或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124R、Q160K和T178R或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含选自L124A、L143A、L143R、L143K、D146G、Q179R、Q179K、S186R和S186K或它们的组合的氨基酸修饰；并且
L2包含选自Q124E、S131E、S131T、V133Y、V133W、V133E、V133D、Q160E、Q160M、S176L、T178E、T178F、T178Y和T180E或它们的组合的氨基酸修饰。
59.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、S176L和T180E。
60.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E、K145T、Q179E和S188L；
L1包含氨基酸修饰Q124R和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E、S131T、T178Y和T180E。
61.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124R、Q160K和T178R；
H2包含氨基酸修饰S186K；并且
L2包含氨基酸修饰S131E。
62.根据权利要求58所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰L143E和K145T；
L1包含氨基酸修饰Q124R；
H2包含氨基酸修饰L143R；并且
L2包含氨基酸修饰Q124E和V133E。
63.根据权利要求1所述的构建体，其中
(i)H1包含F122和C233处的至少一个或一组氨基酸修饰，并且
(ii)L1包含Q124和C214处的至少一个或一组氨基酸修饰。
64.根据权利要求63所述的构建体，其中
(i)H1包含选自F122C和C233S的至少一个或一组氨基酸修饰；并且
(ii)L1包含选自Q124C和C214S的至少一个或一组氨基酸修饰。
65.根据权利要求64所述的构建体，其中
H1包含选自F122C和C233S或它们的组合的氨基酸修饰；
L1包含选自Q124C和C214S或它们的组合的氨基酸修饰；
H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且
L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。
66.根据权利要求65所述的构建体，其中：
H1包含氨基酸修饰F122C和C233S；
L1包含氨基酸修饰Q124C和C214S；
H2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列；并且
L2包含野生型或未经修饰的氨基酸序列。
67.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中当H1、H2、L1和L2在细胞或哺乳动物细胞中共表达时，或当H1、H2、L1和L2在无细胞表达系统中共表达时，或当H1、H2、L1和L2共生成时，或当H1、H2、L1和L2通过氧化还原生成方法共生成时，与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对。
68.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的至少一个包含VH和/或VL结构域的至少一个氨基酸修饰，和/或CH1和/或CL结构域的至少一个氨基酸修饰，使得与L2相比H1优先地与L1配对，和/或与L1相比H2优先地与L2配对。
69.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中如果H1包含所述CH1结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述CL结构域中的至少一个氨基酸修饰；和/或如果H1包含所述VH结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述VL结构域中的至少一个氨基酸修饰；或其中如果H2包含所述CH1结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述CL结构域中的至少一个氨基酸修饰；和/或如果H2包含所述VH结构域中的至少一个氨基酸修饰，则L1和L2中的至少一个包含所述VL结构域中的至少一个氨基酸修饰。
70.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、L1、H2和/或L2包含所述Fab区中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变。
71.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的至少一个包含至少一个恒定结构域和/或至少一个可变结构域的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸修饰。
72.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中当L1和L2二者与H1和H2中的至少一个共表达时，H1-L1和H2-L2异源二聚体对中的所述至少一个的相对配对与所述各自对应的H1-L2或H2-L1异源二聚体对之比大于50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，并且其中所述经修饰的H1-L1或H2-L2异源二聚体对的相对配对大于无所述至少一个氨基酸修饰的所述对应的H1-L1或H2-L2异源二聚体对中观察到的各自相对配对。
73.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述第一和第二异源二聚体中的至少一个的所述Fab区的热稳定性在无所述至少一个氨基酸修饰或氨基酸修饰组的所述对应的异源二聚体的所述Tm的约0、1、2或3℃之内。
74.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中每个异源二聚体对其结合的抗原的亲和力在所述各自未经修饰的异源二聚体对相同的抗原的亲和力的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45或50倍之内，如通过表面等离振子共振(SPR)或FACS所测定。
75.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中
H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的氨基酸空间互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的氨基酸空间互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的带电氨基酸之间的静电互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L2相比当H1与L1配对时产生更大的氨基酸空间和静电互补；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域：其包含至少一个氨基酸修饰，与L1相比当H2与L2配对时产生更大的氨基酸空间和静电互补；或
其中H1和L1中的至少一个包含至少一个这样的结构域，其包含至少一个氨基酸修饰，在H1和L1之间产生共价键；或
其中H2和L2中的至少一个包含至少一个这样的结构域，其包含至少一个氨基酸修饰，在H2和L2之间产生共价键。
76.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2包含一组选自表5至表6、表15至表27或表28a至表28c所示的唯一标识符设计集的氨基酸修饰。
77.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体还包含Fc，所述Fc包含第一CH3序列和第二CH3序列，其中所述第一CH3序列通过或不通过一个或多个接头连接至所述第一异源二聚体，并且所述第二CH3序列通过或不通过一个或多个接头连接至所述第二异源二聚体。
78.根据权利要求77所述的构建体，其中所述Fc是人Fc、人IgG1Fc、人IgA Fc、人IgGFc、人IgD Fc、人IgE Fc、人IgM Fc、人IgG2Fc、人IgG3Fc或人IgG4Fc。
79.根据权利要求77或78所述的构建体，其中所述Fc是异源二聚体Fc。
80.根据权利要求77至79中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰。
81.根据权利要求77至80中任一项所述的构建体，其中所述二聚化CH3序列具有如DSF所测定的约68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、77.5℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃或85℃或更高的熔融温度(Tm)。
82.根据权利要求77至81中任一项所述的构建体，其中在制备时，所述Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体；或其中在表达时或在经由单个细胞表达时，所述Fc是以大于约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度形成的异源二聚体。
83.根据权利要求77至82中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含所述CH3序列中的至少一个中的一个或多个修饰，所述修饰有助于形成稳定性相当于野生型同源二聚体Fc的异源二聚体Fc。
84.根据权利要求78至84中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含：
i)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
ii)具有第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iii)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体IgG1Fc；
iv)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc；或
v)具有第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异源二聚体IgG1Fc。
85.根据权利要求77至84中任一项所述的构建体，其中所述Fc还包含至少一个CH2序列。
86.根据权利要求85所述的构建体，其中所述Fc的所述CH2序列包含一个或多个修饰。
87.根据权利要求77至86中任一项所述的构建体，其中所述Fc包含一个或多个修饰以有助于Fc-γ受体的选择性结合。
88.根据权利要求77至87在任一项所述的构建体，其中所述Fc通过一个或多个接头偶联到所述异源二聚体，或其中所述Fc通过一个或多个接头偶联到H1和H2。
89.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头是一个或多个多肽接头。
90.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个抗体铰链区。
91.根据权利要求88所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个IgG1铰链区。
92.根据权利要求88至91中任一项所述的构建体，其中所述一个或多个接头包含一个或多个修饰。
93.根据权利要求92所述的构建体，其中所述一个或多个修饰有助于Fc-γ受体的选择性结合。
94.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸突变，或其中所述至少一个氨基酸修饰是至少一个氨基酸置换。
95.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中H1、H2、L1和L2中的每一个的序列来源于人序列。
96.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多特异性的或双特异性的。
97.根据前述权利要求中任一项所述的构建体，其中所述构建体是多价的或二价的。
98.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其包含至少一个编码根据前述权利要求中任一项所述的构建体序列。
99.根据权利要求98所述的分离的多核苷酸或分离的多核苷酸组，其中所述多核苷酸或多核苷酸组是cDNA。
100.一种载体或载体组，其包含根据权利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸组中的一个或多个。
101.根据权利要求100所述的载体或载体组，其选自质粒、多顺反子载体、病毒载体、非游离型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
102.一种分离的细胞，其包含根据权利要求98或99所述的多核苷酸或多核苷酸组，或根据权利要求100或101所述的载体或载体组。
103.根据权利要求102所述的分离的细胞，其中所述细胞是酵母细胞、细菌细胞、杂交瘤、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
104.一种药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的构建体和药学上可接受的载体。
105.根据权利要求104所述的药物组合物，还包含一种或多种选自缓冲液、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂质、螯合剂、稳定剂和赋形剂的物质。
106.根据权利要求1至96所述的构建体或根据权利要求104或105所述的药物组合物用于治疗受试者中的疾病或病症或用于药物制造中的用途。
107.一种治疗患有疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至96中任一项所述的构建体或根据权利要求104或105所述的药物组合物。
108.一种从宿主细胞培养物获得根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得包含至少一种宿主细胞的宿主细胞培养物，所述宿主细胞包含一个或多个编码所述构建体的核酸序列；以及
(b)从所述宿主细胞培养物回收所述构建体。
109.一种获得根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)获得H1、L1、H2或L2；
(b)允许与L2相比H1优先地与L1配对，并且与L1相比H2优先地与L2配对；以及
(c)获得所述构建体。
110.一种制备根据权利要求1至96中任一项所述的构建体的方法，所述方法包括：
a.获得编码至少一种构建体的多核苷酸或多核苷酸组；
b.确定用于引入至少一种宿主细胞的所述多核苷酸或多核苷酸组中的每一个的最佳比率，其中所述最佳比率通过评估与在H1、L1、H2或L2表达时形成的错配的H1-L2和H2-L1异源二聚体对相比在H1、L1、H2或L2表达时形成的H1-L1和H2-L2异源二聚体对的量来确定；
c.选择优选的最佳比率，其中用所述优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组的转染至少一种宿主细胞导致所述构建体表达；
d.用所述最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组转染所述至少一种宿主细胞；以及
e.培养所述至少一种宿主细胞以表达所述构建体。
111.根据权利要求110所述的方法，其中选择所述最佳比率通过在瞬时转染系统中转染来评估。
112.根据权利要求110或111所述的方法，其中用所述优选的最佳比率的所述多核苷酸或多核苷酸组转染所述至少一种宿主细胞导致所述构建体的最佳表达。
113.根据权利要求110至112中任一项所述的方法，其中所述构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
115.一种计算机可读存储介质，所述介质存储：
包含表示第一异源二聚体和第二异源二聚体中的互补突变的数据的数据集，所述第一异源二聚体包含第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，并且其中所述互补突变的数据集包含表示表4至表6、表15至表27、表28a至表28c列出的那些突变或那些突变的子集的数据。
116.一种制备双特异性抗原结合多肽构建体的方法，所述双特异性构建体包含第一异源二聚体和第二异源二聚体，所述第一异源二聚体包含来自第一单特异性抗原结合多肽的第一免疫球蛋白重链多肽序列(H1)和第一免疫球蛋白轻链多肽序列(L1)；并且所述第二异源二聚体包含来自第二单特异性抗原结合多肽的第二免疫球蛋白重链多肽序列(H2)和第二免疫球蛋白轻链多肽序列(L2)，其中H1和H2各自包含至少重链可变结构域(VH结构域)和重链恒定结构域(CH1结构域)；其中L1和L2各自包含至少轻链可变结构域(VL结构域)和轻链恒定结构域(CL结构域)，所述方法包括：
a.将根据权利要求115所述的数据集的一个或多个互补突变引入所述第一异源二聚体和/或所述第二异源二聚体；以及
b.使所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体在至少一种宿主细胞中共表达，以生成包含所述双特异性构建体的表达产物。
117.根据权利要求116所述的方法，其还包括确定所述表达产物相对于其他多肽产物中所述双特异性构建体的量，以选择优选的互补突变子集。
118.根据权利要求116或117所述的方法，其中与其他多肽产物相比，所述双特异性构建体以大于70％的纯度生成。
119.根据权利要求116至118中任一项所述的方法，其还包括将另外的氨基酸修饰添加至H1、H2、L1或L2中的至少一个，以提高所述双特异性构建体相较于其他多肽产物的纯度的步骤。
120.根据权利要求116至119中任一项所述的方法，其中所述构建体包含Fc，所述Fc包含至少两个CH3序列，其中所述Fc通过或不通过一个或多个接头偶联到所述第一异源二聚体和所述第二异源二聚体。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述Fc是异源二聚体，任选地包含一个或多个氨基酸修饰。
122.根据权利要求116至121中任一项所述的方法，其中所述抗原结合多肽是抗体、单链单克隆抗体、Fab或单链Fab。
123.一种制备根据权利要求1至96中任一项所述的分离的抗原结合多肽构建体的方法，所述方法包括在至少一个表达系统中表达H1、H2、L1和L2，以生成表达产物；表征所述表达产物；以及选择其中大于90％的所述表达产物是所述分离的抗原结合多肽构建体的所述表达系统。
124.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自表35a的SMCA设计9561-9095_1、9561-9095_2、9121-9373_1、9121-9373_2、9116-9349_1、9116-9349_2、9134-9521_1、9134-9521_2、9286-9402_1、9286-9402_2、9667-9830_1、9667-9830_2、9696-9848_1、9696-9848_2、9060-9756_1、9060-9756_2、9682-9740_1、9682-9740_2、9049-9759_1、9049-9759_2、9820-9823_1和9820-9823_2。
125.根据权利要求1所述的构建体，其中所述氨基酸修饰选自表35b的SMCA设计9327-6054_1、9815-9825_1、9815-9825_2、9587-9735_1、9587-9735_2、3522_1、3522_2、3519_1和3519_2。
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