CN109922864B - 有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有两个或多个互补位的双特异性或多特异性抗体分子。至少一个互补位是Fv或scFv，而其他互补位为单价或双价Fab形式。这些新型分子还具有允许在体内的半衰期延长的Fc部分。

Description

有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月9日提交的美国临时专利申请No.62/483,456的优先权，其全部内容通过引用并入本文用于所有目的。
技术领域
本发明涉及双互补位和多互补位抗体构建体，其中每个抗体构建体包含两个或多个不同的互补位。不同的互补位与来自同一抗原或来自两种不同抗原的不同表位相互作用。这些双互补位抗体包括至少两个不同的重链可变结构域，每个重链可变结构域与共同轻链可变结构域配对。提供了制备这些的方法。还公开了其用于诊断和治疗人类疾病的用途。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2，又称ErbB2)是酪氨酸蛋白激酶受体ErbB家族的成员。它是I型膜蛋白，具有单通道跨膜结构域、胞外结构域和胞质激酶结构域。通过其胞外结构域的结构域II，HER2与其他ErbB家族成员(诸如EGFR(ErbB1或HER1)、HER3(ErbB3)或HER4(ErbB4))形成异二聚体。HER2基因在大约20％的乳腺癌患者中被扩增到(HER2+)。已证明用单克隆抗体靶向HER2在治疗HER2扩增性乳腺癌患者中是非常有效的。小鼠抗HER2单克隆抗体4D5(mAb 4D5)在HER2过表达的癌细胞中通过结合HER2的胞外结构域的结构域IV特异性靶向HER2(美国专利5,821,337)。曲妥珠单抗(赫赛汀
Figure BDA0002040694840000011
)是mAb 4D5的人源化形式，已在1998年获FDA批准用于治疗HER2+乳腺癌。它起作用的原理是通过抑制HER2介导的细胞信号转导，以及也通过抗体依赖性细胞毒效应(ADCC)，包括外周血中的效应细胞，诸如NK细胞和巨噬细胞。
尽管HER2是酪氨酸激酶受体，但它没有任何生理上对应的配体。相反，它与ErbB家族的其他成员(诸如分别与其对应的配体EGF、调蛋白(heregulin)1和2、调蛋白3和4结合的EGFR、HER3或HER4)形成异二聚体。帕妥珠单抗(rhuMab 2C4，
Figure BDA0002040694840000021
美国专利No.7,862,817)是另一种人源化抗HER2单克隆抗体，但与HER2ECD的结构域II结合，结构域II是与HER2上与曲妥珠单抗的表位分开的表位。由于HER2ECD的结构域II参与二聚作用，帕妥珠单抗与HER2的结合阻止了HER2与另一受体(诸如EGFR、HER3或HER4)二聚化。帕妥珠单抗与曲妥珠单抗的组合显示出相比于单独的曲妥珠单抗或帕妥珠单抗更卓越的功效，并已被FDA批准用于HER2+转移性乳腺癌(2012)，且一年后用于HER2+乳腺癌新辅助治疗(2013)。
用一个双互补位分子靶向两个抗原或同一抗原上的两个表位，已被证明比单独用单个抗体或用两个单独的抗体的组合靶向效果更好。前一种情况的实例是靶向HER3和EGFR两者的双互补位分子，被称为双重可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig,Gu J.et al.,PLoSOne10(5):e0124135,2015)。后一种情况的实例是DVD-Ig分子，其中两个互补位都靶向HER2，但是在两个不同的表位(Gu J.et al.,PLoS One 9(5):e97292,2014)，相比于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合用于抗曲妥珠单抗治疗的异种移植肿瘤模型表现出功效的提升。
然而，在识别HER2上的两个表位的双互补位DVD-Ig分子的情况下，虽然该DVD-Ig分子已被证明是多个癌细胞系的拮抗剂，但已被证明对N87癌细胞系具有激动活性(Gu etal.,2014)。
可替代地，双互补位分子也可以以其他形式构建，诸如具有两个不同重链的异二聚体mAb。当使用两个不同轻链时，除了重链和轻链的正确配对以产生互补位A和互补位B之外，还可能出现不正确的重链-轻链配对而导致非功能互补位。
克服不正确的重链和轻链配对的策略之一是使用共同轻链。该技术领域中已经公开了由曲妥珠单抗和帕妥珠单抗设计的靶向HER2的结构域II和结构域IV两者。US20170029529公开了具有除使用曲妥珠单抗的CDR-L3外，使用基于帕妥珠单抗轻链的共同轻链的异二聚体形式的双互补位分子。
WO2016110267公开了另一种双互补位分子，具有使用基于帕妥珠单抗或曲妥珠单抗的轻链的共同轻链的异二聚体形式，分别在CDR-L1中的残基31处有Thr或Ile替换，以及在CDR-L3中的残基94处有Thr或Tyr替换。在这种情况下，无法同时保持两个互补位的结合亲和性。
发明内容
本公开的实施方式涉及对同一抗原或不同抗原中的至少两个表位具有特异性的多互补位抗体构建体，特别是双互补位抗体构建体。这些抗体构建体包括能够与至少两个不同的重链可变结构域配对以形成功能互补位的共同的轻链。多互补位抗体构建体可用于治疗癌症，在该癌症中由抗体构建体互补位识别(结合)的抗原在肿瘤中表达。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)HER2的结构域II的第一互补位。在一些实施方式中，该互补位源自帕妥珠单抗。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)HER2的结构域IV的第二互补位。在一些实施方式中，该互补位源自曲妥珠单抗。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括识别(结合)血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)的第二互补位。在一些实施方式中，该互补位源自雷莫芦单抗。
在其他实施方式中，第一和/或第二互补位源自另一种抗体，该抗体识别在包括癌(瘤)细胞和肿瘤血管细胞的肿瘤细胞表面表达的另一种抗原。
在一些实施方式中，对一个或多个互补位的重链可变结构域进行优化，以在与共同轻链配对时保留或改进互补位与对应表位的结合。优化可以包括在可变结构域中且特别是在CDR中进行氨基酸替换。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体包括优化的共同轻链。共同轻链可以基于来自至少两个亲本抗体之一的轻链。与典型的轻链相比，或与特定多互补位抗体构建体的其他亲本抗体的轻链相比，亲本轻链对互补位的贡献可能最小。
一些实施方式涉及基于曲妥珠单抗的轻链的共同轻链，但包含改善其与源自第二亲本抗体的可变结构域的相互作用的突变。在一些实施方式中，帕妥珠单抗是第二亲本抗体。各种实施方式包括位于CDR-L2的56位或CDR-L3的91、94或96位的突变，例如：S56T、S56A或S56Y；H91Y、H91F或H91W；T94Y、T94F或T94W；或者P96Y、P96F或P96W；或者在这些位置中的1、2、3或4个处的替换的组合。在一些实施方式中，曲妥珠单抗相关的共同轻链还包括在CDR-L1的30位处的突变，例如：N30A或N30S，用于解决与N30脱酰胺相关的稳定性问题。
一些实施方式涉及基于雷莫芦单抗的轻链的共同轻链，但包含改善其与源自第二亲本抗体的可变结构域的相互作用的突变。在一些实施方式中，帕妥珠单抗是第二亲本抗体。各种实施方式包括位于CDR-L2的55位或CDR-L3的91或96位的突变，例如：D55Y；A91Y；P96Y；或者这些位置中的1、2或3个处的替换的组合。
在互补位之一源自帕妥珠单抗的实施方式中，帕妥珠单抗相关的重链可变结构域未被修改，或包括位于CDR-H2中54位处的突变或位于CDR-H3中98位处的突变，例如：T30A、T30S、T30N或T30D；G56A、G56S或G56T；或者在这些位置的每个处的替换的组合。
在互补位之一源自曲妥珠单抗的实施方式中，曲妥珠单抗相关的重链可变结构域未被修改，或包括位于CDR-H1中30位处的突变或位于CDR-H2中56位处的突变，例如：N54S、N54T或N54A；D98W、D98S、D98T或D98R；或者在这些位置的每个处的替换的组合。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体是双互补位的。在一些实施方式中，双互补位抗体构建体具有Fab-Ig形式。在一些实施方式中，双互补位抗体构建体具有Ig-Fab形式。在一些实施方式中，双互补位构建体具有异二聚体形式。在一些实施方式中，双互补位构建体具有一个基础，向该基础添加额外的抗原结合域，以形成对对应表位的一种或另一种具有更高价的多互补位抗体构建体，其识别更多数量的表位，或两者兼有。
在一些实施方式中，多互补位抗体构建体已修改Fc区，以调节它们介导各种免疫活动(诸如ADCC、ADCP和CDC)，或它们与亲和纯化试剂的相互作用的能力。在一些实施方式中，多互补位抗体构建体的Fc区已经被修改以增加其血清半衰期。在特定实施方式中，增加血清半衰期的修改为M428L。
一些实施方式是编码多互补位抗体构建体的核酸，包括这些编码核酸序列的表达载体，以及用这些表达载体转化的宿主细胞。在一些实施方式中，编码序列已经过密码子优化。
一些实施方式是治疗癌症的方法，其中向有需要的患者给药多互补位抗体构建体。在一些实施方式中，治疗方法还包括外科手术、放射治疗或给药其他抗癌药物，包括化疗、靶向疗法和激素治疗。在一些实施方式中，多互补位抗体构建体与药物缀合。其他实施方式涉及多互补位抗体构建体在治疗癌症或在制造用于治疗癌症的药物中的用途，以及包括多互补位抗体构建体的组合物用于治疗癌症的用途。
附图说明
图1：抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的轻链的可变结构域的氨基酸序列的比对。编号基于Vajdos et al.,J.Mol.Biol.320:415(2002)，使用Kabat编号(Kabatet al.,NIH publication no.91-3242,pp 662,680,689(1991)。
图2：抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的重链的可变结构域的氨基酸序列的比对。编号基于Vajdos et al.,(2002)，使用Kabat编号。
图3.抗体A和抗体B的示意图，描述了这些抗体的不同结构域。
图4.由抗体A和抗体B设计的具有共同轻链的双互补位分子的Fab-Ig形式的示意图。
图5.由抗体A和抗体B设计的具有共同轻链的双互补位分子的Ig-Fab形式的示意图。
图6.由抗体A和抗体B设计的具有共同轻链的双互补位分子的异二聚体IgG形式的示意图。使用杵臼结构(knob-in-holes)突变(Atwell S et al.,J Mol Biol.270(1):26-35,1997；Merchant AM et al.,Nat Biotechnol.16(7):677-81,1998)。
图7.由抗体A和抗体B设计的具有共同轻链的双互补位分子的异二聚体IgG形式的示意图。使用电荷对突变。(Gunasekaran K et al.,J Biol Chem.285(25):19637-46,2010)。
图8通过ELISA描绘了当共同轻链与(A)帕妥珠单抗的重链(mAb T1至T11)和(B)曲妥珠单抗的重链(mAbs T13至T22)配对时共同轻链中突变对结合的作用。子图C描绘了mAbT12(曲妥珠单抗重链与帕妥珠单抗轻链配对)的ELISA结果。
图9通过ELISA描绘了当与野生型轻链配对时(A)帕妥珠单抗和(B)曲妥珠单抗的突变重链对结合的作用。
图10通过ELISA描绘了当与共同轻链配对时(A)帕妥珠单抗和(B)曲妥珠单抗的突变重链对结合的作用。
图11示出了在哺乳动物细胞HEK293中表达的纯化双互补位抗体构建体T51和T54的电泳之后的聚丙烯酰胺凝胶。
图12通过ELISA描绘了(A)双互补位抗体构建体的结合效力和(B)它们的EC50。
图13描绘了(A)双互补位抗体构建体T51和(B)T54在抑制耐HERCEPTIN药物的BT474乳腺癌细胞系的生长中的作用。
图14描绘了(A)双互补位抗体构建体T51和(B)T54在抑制NCI-N87胃癌细胞系的生长中的作用。
具体实施方式
本文公开了双特异性抗体构建体，每个包括来自两个不同的亲本抗体的至少两个抗原识别位点(互补位)(如图3所示)，该两个不同的亲本抗体识别来自同一抗原或来自两个不同抗原的两个不同的表位。这些双互补位分子包括一个共同轻链的拷贝和在相同重链上或在两个不同的重链上的两个不同的重链可变结构域的一个或多个拷贝。
如本文所用，术语“抗体”是指具有天然存在的哺乳动物免疫球蛋白(Ig)(IgG是其范例)的一般结构的分子。即包括一个可变结构域和一个恒定结构域的两条相同的轻链以及包括一个可变结构域和三个恒定结构域的两个条同的重链。轻链和重链通过它们的可变结构域，以及轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域相互联合。这两条重链通过第2和第3恒定结构域相互联合。抗体的抗原结合位点由两个可变结构域形成，且特别地由每个可变结构域的三个互补决定区(CDR)形成。如果抗体能够特异性地与分子相互作用并吸附到分子上，则称抗体与分子(抗原)结合。抗体结合不包括非特异性或低亲和力的相互作用。虽然“抗体”的本意是指天然存在的免疫球蛋白的结构，但它也包括保留这种一般结构的设计的分子，诸如嵌合、CDR移植和人源化抗体。
如本文所用，术语“抗体构建体”是指其中天然存在的哺乳动物免疫球蛋白的一般结构已被修改的分子，特别是通过——但不一定限于——设计两个非相同的重链的联合或添加额外的结构域。在本文公开的优选的实施方式中，额外的结构域形成与抗体Fab片段(抗原结合片段)相对应的结构。在其他实施方式中，抗体结构的其他额外的结构域可以形成与其他抗体片段相对应的结构，其他抗体片段诸如Fv(可变片段，由VH和VL组成)、单链Fv(scFv)或抗体的一些其他抗原结合部分。
如本文所用，术语“亲本抗体”是指多互补位抗体构建体的互补位源自其中的抗体的一个或另一个。源自意为互补位的氨基酸序列信息是从亲本抗体中获得的。除了互补位的氨基酸序列信息之外，还可以从亲本抗体中获得额外的氨基酸序列信息。应理解的是，在亲本抗体中形成互补位的可变结构域的氨基酸序列可以不经修改使用或者可经过修改使用，例如，修改以优化当使用共同轻链时互补位的形成和亲和力。
如本文所用，术语“表位”是指通过与抗体(或抗体构建体)的抗原结合位点进行接触而介导与抗体的抗原特异性结合的抗原的部分。
如本文所用，术语“互补位”是指通过与抗原的表位进行接触而介导与抗原的抗原特异性结合的抗体(或抗体构建体)的部分。
如本文所用，术语“双互补位抗体构建体”表示具有两个不同的表位结合位点的构建体。抗体构建体对于一个或两个互补位可以是单价的、二价的或多价的。
如本文所用，术语“共同轻链”是指包括能成效地与多个重链可变结构域联合以形成互补位的可变结构域的免疫球蛋白轻链，每个重链可变结构域能够与被抗体结合的表位特异性结合，其中重链可变结构域是最初遇到的。
各种抗体重链或轻链或其部分，在本文是指与列举的或特定指定的抗体的对应链或其部分“相关”。这表示该链或其部分与列举的或特定指定的抗体的对应链或其部分具有相同的序列，除非特别指明的修改，诸如氨基酸替换，而这些修改可能没有。在可替代的实施方式中，相关链或其部分与列举的或特定指定的抗体的对应链或其部分具有至少90、95、96、97、98或99百分比的序列同一性。
如本文所用，术语“修改”、“突变”和“替换”(及其语法形式)是指氨基酸序列中工程化的变化。除非上下文另有说明，否则突变不是指无辅助的生物过程引起的序列变化。常规地，替换应当用参考序列中的氨基酸的单字母码、在参考序列中位置和产生的序列中的氨基酸的单字母码来表示。例如，A26S表示在参考序列中第26位处的丙氨酸在产生的序列中被改变为丝氨酸。
所公开的抗体构建体可采用许多不同的总体结构。这些抗体构建体的描述将专注于双互补位抗体构建体，但应理解的是，可以向每个重链添加额外的可变结构域，使得重链包括例如3、4、5或更多的可变结构域，其促进形成相同数量的互补位。在这些多互补位抗体中，第三个互补位可能赋予对第三个表位的特异性，使抗体构建体具有三特异性。可替代地，第三个互补位可能对被前两个互补位中任一个所识别的表位之一有特异性，使得抗体构建体仍然是双特异性的，但是增加了对表位中的一个的价数。类似地，第4个互补位可能对第4个表位具有特异性，使得抗体构建体是四特异性的，或者它可能对被前三个互补位中的任一个所识别的表位之一有特异性，使得抗体构建体是三特异性的或双特异性的。等等。
双互补位或多互补位抗体构建体包括共同轻链的两个或多个拷贝，共同轻链包含本文公开的一个或多个突变，并具有可变结构域或其衍生物，与它所基于的未改变的序列具有＞80同一性、85％同一性、＞90％同一性、＞95％同一性、＞98％同一性。
双互补位抗体构建体可以为同二聚体形式(包括两个相同的重链)，诸如Fab-Ig(如图4所示)或Ig-Fab(如图5所示)。在Fab-Ig形式中，第二个重链可变结构域(VH B)和CH1融合到第一抗体的重链的N末端(VH B-CH1-接头-VH A-CH1-铰链-CH2-CH3，图4)。在Ig-Fab形式中，第二重链可变结构域(VH B)和CH1与Fc结构域(可结晶片段，基本上由CH2和CH3结构域组成)的C末端融合(VH A-CH1-铰链-CH2-CH3-接头-VH B-CH1)，其在规范位置中具有其可变结构域(VH A)(图5)。更高级的多互补位抗体构建体可以包含附加到这些基本设计的N-或C-末端的其它可变结构域。接头由任何组成的0至100个氨基酸组成。在一些优选的实施方式中，接头是(G4S)n或(G2SG2)n，其中n是1至20之间的任意数字。在其他一些优选的实施方式中，接头包括免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgD)或人血清白蛋白循环序列的全部或部分铰链区。当这些重链构建体与共同轻链一起表达时，每个分子具有两个不同的二价互补位(一共四个抗原结合位点)。
双互补位分子也可以是异二聚体Ig形式。来自两种不同抗体的两种不同的重链可以利用本领域中描述的技术来形成异二聚体，包括但不限于杵臼结构(knobs-into-holes)(图6，Ridgway JB,Protein Engineering 9:617,1996)，或静电转向机制(图7，Gunasekaran K et al.,2010)。当与共同轻链配对时，分子具有两个不同的单价互补位(与天然IgG分子一样，只有两个抗原结合位点)。
恒定结构域(CH1、CH2和CH3)为人免疫球蛋白的，诸如IgG、IgM、IgA、IgD。或IgG及其亚型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；或者从这些类型和亚型中重组的CH1、CH2和CH3结构域的组合。
为了消除两个互补位的重链和轻链的错误配对，使用共同轻链。通过鉴定其中互补位主要由重链中的残基组成的单克隆抗体来选择共同轻链。经搜索与其对应的抗原复合的抗体结构的数据库，帕妥珠单抗成为作为对互补位的贡献最小的轻链可变结构域的来源的很好的候选。大多数帕妥珠单抗与其在HER2ECD的结构域II中的表位相互作用来自其重链(Franklin et al.,Cancer Cell5:317-328,2004)。只有三个来自轻链的残基参与与HER2的相互作用，且在互补决定区(CDR)2和3中：CDR-L2的Y49和Y55，以及CDR-L3的Y94(Kabat编号系统，图1)。
对于用于产生双互补位分子的第二亲本抗体，不要求该互补位主要由重链组成。例如，曲妥珠单抗被用作第二互补位的来源。
产生共同轻链
使用曲妥珠单抗的轻链为起始点工程化共同轻链(图1)。对可变结构域进行了更改，并保留了本来的恒定结构域。然而，在可替代的实施方式中，恒定结构域被任何人轻链κ或λ恒定结构域替换。由于与HER2结合中所涉及的帕妥珠单抗轻链CDR-L2的残基Y49和Y55在曲妥珠单抗中也是Tyr，因此采用两种方法来产生共同轻链：第一种是使用帕妥珠单抗的CDR-L3，并将曲妥珠单抗的CDR-L1和CDR-L2中的残基突变为帕妥珠单抗中的残基。第二种方法是将CDR-L3的残基94突变为其他19种标准基因编码的氨基酸中的每个。这些轻链首先分别用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的重链进行测试，以选择保留分别与HER2ECD的结构域IV和II两者结合的突变。性能最好的轻链被用作共同轻链。在优选的实施方式中，T94突变为Tyr(T94Y)，如在帕妥珠单抗中自然存在的那样。在其他一些优选的实施方式中，T94突变为Phe(T94F)。然而，在其他一些优选的实施方式中，T94突变为Trp(T94W)。
在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化。例如，曲妥珠单抗轻链的CDR-L1的N30可以突变为另一种残基，诸如N30S，以消除现有技术中已知的曲妥珠单抗脱酰胺的热点。在一些实施方式中，N30S和T94Y组合(N30S/T94Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30S与T94F突变组合(N30S/T94F)。在其他一些优选的实施方式中，N30S与T94W突变组合(N30S/T94W)。
在一些优选的实施方式中，共同轻链中的N30突变为A(N30A)。在一些实施方式中，N30A和T94Y组合(N30A/T94Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与T94F突变组合(N30A/T94F)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与T94W突变组合(N30A/T94W)。
第三种优化共同轻链的方法涉及将CDR-L3的残基H91突变为其他19种标准基因编码的氨基酸。在一些优选的实施方式中，H91突变为Tyr(H94Y)，如在帕妥珠单抗中存在的。在其他一些优选的实施方式中，H91突变为Phe(H94F)。然而，在其他一些优选的实施方式中，H91突变为Trp(H91W)。
在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变(诸如N30S、N30A)组合。
在一些实施方式中，N30S与H91Y组合(N30S/H91Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30S与H91F突变组合(N30S/H91F)。在其他一些优选的实施方式中，N30S与H91W突变组合(N30S/H91W)。
在一些优选的实施方式中，共同轻链中的N30突变为A(N30A)。在一些实施方式中，N30A和H91Y组合(N30A/H91Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与H91F突变组合(N30A/H91F)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与H91W突变组合(N30A/H91W)。
第四种优化共同轻链的方法涉及将CDR-L3的残基P96突变为其他19种标准基因编码的氨基酸中的每个。在一些优选的实施方式中，P96突变为Tyr(P96Y)，如在帕妥珠单抗中的。在其他一些优选的实施方式中，P96突变为Phe(P96F)。然而，在其他一些优选的实施方式中，P96突变为Trp(P96W)。在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变(诸如N30S、N30A)组合。
在一些实施方式中，N30S与P96Y组合(N30S/P96Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30S与P96F突变组合(N30S/P96F)。然而在其他一些优选的实施方式中，N30S与P96W突变组合(N30S/P96W)。
在一些优选的实施方式中，共同轻链中的N30突变为A(N30A)。在一些实施方式中，N30A和P96Y组合(N30A/P96Y)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与P96F突变组合(N30A/P96F)。在其他一些优选的实施方式中，N30A与P96W突变组合(N30A/P96W)。
第五种优化共同轻链的方法涉及将CDR-L2的残基S56突变为其他19种标准基因编码的氨基酸中的每个。在一些实施方式中，S56突变为Thr，如在帕妥珠单抗中的。在优选的实施方式中，S56突变为Tyr(S56Y)。在一些实施方式中，共同轻链被进一步优化，包括与其他突变(诸如N30S、N30A)组合。在一些优选的实施方式中，N30S和S56Y组合(N30A/S56Y)。
在一些实施方式中，共同轻链具有在上述任何或所有位置处的替换的组合。例如，具有三种替换的组合的优选的实施方式是N30S/S56Y/T94W。在一些实施方式中，在通常情况下，或者关于特定的多互补位抗体构建体(诸如Fab-Ig、Ig-Fab或异二聚体)，一个或多个单独的替换被特别地排除。例如，在一些实施方式中，T94Y被完全排除，而在其他实施方式中对于异二聚体形式中的双互补位抗体，T94Y被排除。这样的排除可能仅限于一个或多个特定的氨基酸在所讨论位置的替换，也可能扩展到在该位置的所有可能的突变。一些实施方式容许额外的突变。其他实施方式排除在未明确描述突变的任何位置处的突变。这些教导可推广到基于除曲妥珠单抗轻链外的轻链的共同轻链，以及和与除帕妥珠单抗和曲妥珠单抗外的其他抗体相关的重链可变结构域的组合配对的共同轻链。
优化后的共同轻链分子与帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体结合，如下所述。
在可替代的实施方式中，可以使用雷莫芦单抗的轻链为起始点工程化共同轻链。该雷莫芦单抗衍生的共同轻链可变区(CDR1、CDR2和CDR3)主要包括来自雷莫芦单抗的轻链残基，但保留了来自帕妥珠单抗的轻链的几个关键氨基酸残基，包括CDR-L2中的Tyr55、CDR-L3中的Pro96和Tyr91的一个或多个氨基酸残基(Kabat编号方案)。一些轻链可变结构域残基在帕妥珠单抗和雷莫芦单抗之间是保守的(表1和表2)，且在一些实施方式中保留了这些残基。
表1.帕妥珠单抗和雷莫芦单抗的轻链的CDR2中的氨基酸序列
Figure BDA0002040694840000151
(一致的氨基酸由残基下面的*表示)
表2.帕妥珠单抗和雷莫芦单抗的轻链的CDR3中的氨基酸序列
Figure BDA0002040694840000152
(一致的氨基酸由残基下面的*表示)
在一些实施方式中，雷莫芦单抗衍生的共同轻链具有在上述任何或所有位置处的替换的组合。优化后的共同轻链分子与帕妥珠单抗和雷莫芦单抗的重链可变结构域或其突变体结合，如下所述。
抗体-A和抗体-B的重链的优化。
双互补位分子由具有以下突变的氨基酸残基的帕妥珠单抗重链可变结构域的一个或多个拷贝组成：T30(Kabat编号，图2)，诸如T30A、T30S、T30N、T30D；和G56(Kabat编号，图2)，诸如G56A、G56S、G56T，以及这些突变的组合(诸如T30A和G56A)。
双互补位分子由具有以下突变的氨基酸残基的曲妥珠单抗重链可变结构域的一个或多个拷贝组成：N54(Kabat编号，图2)，诸如N54S、N54T、N54A；D98(Kabat编号，图2)，诸如D98W、D98S、D98T、D98R；以及这些突变的组合(诸如N54T和D98W)。
在各种实施方式中，双互补位抗体构建体中具有0、1、2或更多突变的帕妥珠单抗重链可变结构域与具有0、1、2或更多突变的曲妥珠单抗重链可变结构域组合。一些实施方式排除了在特定位置处的一个或多个特定替换或突变。其他实施方式排除了在特定位置处的所有突变。一些实施方式容许额外的突变。其他实施方式排除在未明确描述突变的任何位置处的突变。在一些实施方式中，这些排除适用于特定的多互补位抗体构建体形式，诸如Fab-Ig、Ig-Fab或异二聚体。这些教导可推广到包括与除帕妥珠单抗和曲妥珠单抗之外的其他抗体相关的重链可变结构域的多互补位抗体构建体。
在其他实施方式中，在双互补位抗体构建体中包括其他重链可变结构域，而不是曲妥珠单抗重链可变结构域。用帕妥珠单抗作为第一抗体构建双互补位抗体时用作亲本第二抗体的抗体的实例包括但不限于抗VEGFR2抗体，诸如雷莫芦单抗。共同轻链基于这两种抗体，第一种抗体是帕妥珠单抗，且第二种抗体是雷莫芦单抗。
在另一实施方式中，第二抗体是抗EGFR抗体，诸如但不限于西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或扎鲁木单抗(zalutumumab)。
然而在另一实施方式中，第二抗体是抗VEGF抗体，诸如但不限于贝伐单抗。
在一些实施方式中，第二抗体是抗PD-1抗体，诸如但不限于帕博利珠单抗(pembrolizumab)或纳武单抗。
在一些实施方式中，第二抗体是抗PD-L1抗体，诸如但不限于阿特朱单抗或德瓦鲁单抗(durvalumab)。
在一些实施方式中，第二抗体是抗CTLA4抗体，诸如但不限于伊匹木单抗(ipilimumab)。
在一些实施方式中，第二抗体是抗CD3抗体，诸如但不限于OKT3、SP34或其衍生物，诸如人源化或亲和性修改的形式。
在一些方面，双互补位分子的Fc包含具有增加的ADCC、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性的Fc，其是由于与Fc受体(诸如CD16a、CD16b、CD32a、CD16b、CD64和C1q蛋白)的结合亲和力增强或减弱所致。这包括但不限于ADCC增强的非岩藻糖基化抗体，获得方法为(1)通过在具有岩藻糖基化缺陷(诸如敲除FUT8基因)的宿主细胞中产生双互补位分子(Yamane-Ohnuki N et al.,Biotechnol Bioeng.87(5):614-22,2004)；或(2)在抗体的Fc结构域中具有S239D、I332E、A330L替换(Kabat编号)或这些变异的任何或所有的组合(Lazar GA et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.103(11):4005–4010,2006)。
在一些方面，双互补位分子在Fc结构域中包含突变，以减小ADCC活性或CDC活性。这些可包括但不限于在(1)Fc结构域中的N297，诸如但不限于N297A、N297G；(2)L234，诸如L234A、L234G和/或L235，诸如L235A或L235；(3)P329，诸如P329G；或(4)D265，诸如D265A处的突变；或者在任何或所有这些位置处的替换的组合。
在一些方面，Fc突变(所有编号均为Kabat编号系统的Eu索引)包括增加血清半衰期的突变。在一种实施方式中，Fc具有以下替换：在CH3中的T250Q、或M428L、或T250Q/M428L双突变(Hinton et al.,J Biol Chem.279(8):6213-6,2004)。在另一实施方式中，双互补位抗体的Fc具有M252Y/S254T/T256E三重突变(Dall’Acqua WF et al.,J Immunol169(9):5171-80,2002)。然而在另一实施方式中，双互补位抗体的Fc具有N434A突变(Petkova SBet al.,International Immunology 18(12):1759–1769,2006.)或M428L/N434S双突变、或M428/N434A双突变(Zalevsky J et al.,Nat Biotechnol.28(2):157–159,2010)。
其他实施方式包括含有本文所述的双互补位分子的多互补位分子。在一些实施方式中，第三、第四或甚至更多的额外互补位被添加到双互补位分子中，以生成三互补位、四互补位或其他多互补位分子。额外的互补位(一个或多个)是Fab形式或dcFv或scFv形式的另一种抗体。额外的互补位(一种或多种)是配体结合结构域。这些额外的互补位是自然产生的或合成制备的。
制备组成的方法
本文公开的抗体构建体(及其组成部分)可通过重组方法来产生。因此，本文公开了编码抗体构建体的核酸、包含编码抗体的核酸的表达载体以及包括编码抗体构建体的核酸的细胞。用于重组生产的方法在本领域中是众所周知的，且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，和随后分离抗体构建体，以及通常纯化至药学上可接受的纯度。对于在宿主细胞中的表达上述抗体构建体，通过标准方法将编码抗体构建体序列的核酸插入表达载体中。表达在适当的原核或真核宿主细胞中进行，如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6细胞、酵母或大肠杆菌(E.coli)细胞，且抗体从细胞(溶解后的细胞或上清液)中回收。
因此，本文公开的某些实施方式包括用于制备抗体构建体的方法，包括以下步骤：a)用包括编码抗体构建体的核酸分子的至少一种表达载体转化宿主细胞；b)在允许合成抗体构建体分子的条件下培养宿主细胞；c)从培养物中回收所述抗体构建体分子。
通过常规免疫球蛋白纯化程序，诸如蛋白A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基中适当地分离抗体构建体。
如本文所用，表达“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，且所有这样的名称都包括子代。因此，词语“转化株”和“转化细胞”包括初代受试细胞和由此衍生的培养物，而不考虑传代次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代的DNA含量可能并不准确相同。包括与在原转化细胞中筛选的功能或生物活性相同的变异子代。在意为不同名称的地方，将从上下文中清楚。
如本文所用，术语“转化”是指将载体/核酸转化到宿主细胞中的过程。如果使用没有强大细胞壁屏障的细胞作为宿主细胞，则可以例如通过磷酸钙沉淀法进行转染。然而，也可以使用用于将DNA引入细胞的其他方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含坚实细胞壁结构的细胞，则例如一种转染方法是使用氯化钙进行钙处理。
如本文所用，“表达”是指核酸转录成mRNA的过程和/或转录后的mRNA(也称为转录物)随后翻译成肽类、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可以统称为“基因产物”。如果多核苷酸包括源自基因组DNA的序列，则真核细胞中的表达可包括mRNA的剪接。
“载体”是核酸分子，特别是自主复制的核酸分子，它将插入的核酸分子转移到宿主细胞内和/或在宿主细胞之间转移。该术语包括主要用于将DNA或RNA插入细胞的载体(例如染色体整合)，主要用于DNA或RNA复制的复制载体，以及用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。
“表达载体”是当被引入适当的宿主细胞时，可以被转录并翻译成多肽的多核苷酸。“表达系统”通常是指包括可用于产生所需表达产物的表达载体的合适的宿主细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指可被工程化为产生本文公开的抗体的任何类型的细胞系统。在一种实施方式中，HEK293细胞和CHO细胞被用作宿主细胞。
适合于原核生物的控制序列例如包括启动子、任选地操作子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多聚腺苷酸化信号。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，它是“可操作地连接”的。例如，如果前序列或分泌型前导物的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点的定位是为了便于翻译，则其与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意为被连接的DNA序列是连续的，且在分泌型前导物的情况下是连续且在阅读框中的。然而，增强子不必是连续的。类似地，在一些情况下，内含子可存在于可操作地连接的核酸序列之间。通过在方便的限制性位点的连接反应来实现连接。如果不存在这样的位点，则按照常规实践使用合成寡核苷酸衔接子或接头。
编码抗体构建体的核酸序列可以很容易地从文献中获得，或者参照预期宿主细胞的优选的密码子通过反向翻译获得。编码核酸可以由化学合成的多核苷酸和/或之前克隆的抗体编码DNA组装而成，可能地借助于定点突变。
对于抗体构建体的重组生产，可以将编码该抗体的核酸分离并插入可复制载体中用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)可以很容易地对编码抗体构建体的DNA进行分离和测序。许多载体是可用的。载体成分一般包括但不限于以下一种或多种：信号序列、复制起点、一个或多个标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如US5,534,615中所述，其关于蛋白表达的全部公开通过引用具体并入本文。
本文用于在载体中克隆或表达DNA的合适的宿主细胞是上文所述的原核细胞、酵母或高等真核细胞。为此目的的合适的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性和革兰氏阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏杆菌(S.typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(S.marcescans)和志贺氏菌属(Shigella)，以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)等假单胞菌和链霉菌属(Streptomyces)。一种示例性大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)的其他菌株也是合适的。这些实例是说明性的，而非限制性的。
除原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是用于抗体构建体编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)是常见的面包酵母，是低等真核宿主微生物中最常用的酵母。然而，许多其他属、物种和菌株在本文中也是常见的且可用的，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、K.wickeramii(ATCC 24,178)、K.Waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母(Candida)：里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；雪旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如西方雪旺酵母(S.occidentalis)，以及丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)，以及曲霉属(Aspergillus)宿主，诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于糖基化抗体构建体的表达的合适的宿主细胞源自多细胞生物，包括无脊椎动物细胞，诸如植物和昆虫细胞。已经鉴定出许多杆状病毒株和变异体以及相应的允许的昆虫宿主细胞，诸如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。各种用于转染的病毒株均可公开获得，例如，苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕(B.mori)NPV的Bm-5株，且这样的病毒可以用作根据本发明的本文的病毒，特别是用于草地贪夜蛾细胞的转染。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可作为宿主。
然而，对脊椎动物细胞的兴趣最大，且在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已成为常规程序。可用的哺乳动物宿主细胞系的实例有通过SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚胎肾系(293或用于在悬浮培养物中生长的亚克隆293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO)；小鼠支持细胞(sertolicells)(TM4)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝癌细胞系(HepG2)。
用上述表达载体转化宿主细胞用于抗体生产，并在适合用于诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的改良的常规营养培养基中培养。
用于产生抗体构建体的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购的培养基诸如Ham's F10、最小必需培养基(MEM)、RPMI-1640和Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)适合于培养宿主细胞。此外，US4,767,704；US4,657,866；US4,927,762；US4,560,655；或US5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或US Re.30,985可以用作宿主细胞的培养基。任何这些培养基均可按需要补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺甘和胸苷)、抗生素(诸如庆大霉素TM)、微量元素(定义为通常在微摩尔的范围内存在于最终浓度的无机化合物)以及葡萄糖或等效的能量来源。任何其他必需的补充剂也可以以适当的浓度包括在内，其是本领域技术人员已知的。培养条件，诸如温度、pH等，是之前被选择用于表达的宿主细胞所使用的那些培养条件，且对于普通技术人员是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体构建体可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果抗体构建体是在细胞内产生的，则作为第一步，颗粒碎片，无论是宿主细胞还是溶解片段，都可以通过例如离心或超滤来去除。
可以使用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，亲和层析是优选的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体。推荐蛋白G用于所有小鼠同种型和用于人γ3。亲和配体所附连的基质最经常是琼脂糖，但也有其他基质。机械稳定的基质诸如可控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯允许比用琼脂糖可获得的更快的流速和更短的处理时间。当抗体包括CH3结构域时，BakerbondABXTM树脂可用于纯化。其他蛋白质纯化技术，诸如在离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱法、肝素SEPHAROSETM的色谱法阴离子或阳离子交换树脂上的色谱法(诸如聚天冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀也是可用的，取决于待回收的抗体构建体。
在任何初步纯化步骤(一步或多步)之后，包括感兴趣的抗体构建体和污染物的混合物可使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液进行低pH疏水作用色谱，优选地在低盐浓度(例如，从约0-0.25M盐)下进行。
一旦纯化之后，抗体构建体可以溶解于包括任何药学上可接受的缓冲液、盐或其他赋形剂的水性溶剂中。溶解的抗体构建体在使用之前可以冷藏或冷冻。可替代地，可以冻干并在使用前不久重构。
使用组合物的方法
本发明还涉及包括本发明的双互补位抗体的药物组合物。
术语“治疗”或“治疗”状态、疾患或病症包括：(1)预防或延迟在可能患有或有倾向患该状态、疾患或病症但还未经历或显示该状态、疾患或病症的临床或亚临床症状的受试者中发展的该状态、疾患或病症的至少一种临床或亚临床症状出现；或(2)抑制该状态、疾患或病症，即阻止、减少或延缓疾病的发展或其复发(在维持治疗的情况下)或者其至少一种临床症状或者亚临床症状；或(3)减轻疾病，即，导致该状态、疾患或病症或至少一种其临床或亚临床症状的减退。接受治疗的受试者所获得的益处在统计学上是显著的，或者至少对患者或医师来说是可察觉的。
如本文所用，术语“治疗有效”或“有效”应用于剂量或量是指当向受试者给药用于治疗(例如预防或改善)状态、疾患或病症时，足以使这样的治疗或预防产生有效结果的化合物或药物组合物的量。“治疗有效量”将根据所给药的化合物或细菌或类似物，以及疾病和其严重程度，和接受治疗的哺乳动物的年龄、体重、身体状况和反应情况而变化。
如与本公开的组合物一起使用的短语“药学上可接受的”，是指这样的组合物的分子实体和其他成分在生理上是可耐受的，并且当给药至哺乳动物(例如人类)时通常不会产生不良反应。在一些实施方式中，如本文所用，术语“药学上可接受的”意为被联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于哺乳动物且特别是用于人类。
术语“药物制剂”或“药物组合物”是指处于允许其中包含的活性成分的生物活性有效的形式且不包含对将被给药制剂的受试者有不可接受的毒性的额外的组分的制剂。
术语“载体”是指用于给药化合物的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成原料的无菌液体，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。特别是对于可注射溶液，使用水或水溶液盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为载体。可替代地，载体可以是固体剂型载体，包括但不限于一种或多种粘结剂(用于压缩丸)、助流剂、包封剂、调味剂和着色剂。在E.W.Martin的《雷明顿药学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》中描述了合适的药物载体。
其他实施方式涉及如本公开的双互补位抗体构建体用于治疗癌症的用途。在另一实施方式中，提供了双互补位抗体作为药物的用途。优选地，所述用途是用于治疗癌症。类似的实施方式包括其共同轻链的双互补位抗体构建体在制造用于治疗癌症的药物中的用途。其他类似的实施方式为癌症治疗方法，包括向有需要的患者给药治疗有效量的双互补位抗体构建体。在优选的实施方式中，受试者是哺乳动物。在特别优选的实施方式中，受试者是人类。
本文描述的优选实施方式的组合物可用于治疗疾病。例如，优选的实施方式基于帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的抗HER2双互补位分子可用于治疗癌症，诸如但非必须限于HER2+乳腺癌、胃癌、肺癌和/或卵巢癌。
该多互补位抗体构建体组合物可以单独给药，或者与其他适合治疗癌症的药剂联合给药。例如，该组合物可以与其他疗法联合使用，诸如用于化疗或靶向疗法，或用于免疫疗法。类似地，它们可以与放射疗法或外科手术联合使用。
多互补位抗体构建体也可以用于制备抗体-药物缀合物(ADC)。本领域中普遍倾向于位点特异性缀合，因为这可以促进产物的均一性和连接的稳定性。在使用多互补位抗体构建体的优选的ADC实施方式中，药物缀合到共同轻链上，例如在其恒定结构域中或其C末端处。这在同型二聚形式中是特别有利的，诸如Fab-Ig和Ig-Fab形式，因为双互补位构建体将递送四个缀合药物分子(假设每个轻链一个缀合位点)，从而使典型的ADC的有效荷载加倍。
多互补位抗体构建体组合物可以通过任何合适的途径递送。在一些实施方式中，通过注射或输注、通过皮肤贴片、通过库/泵装置或通过吸入来递送组合物。在这些实施方式的各个方面，通过静脉内、腹腔内、皮下或肌肉内给药多互补位抗体构建体组合物。
可以一天一次或更少的频率给药一些实施方式中的组合物。例如，在一些实施方式中，每两天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月、每两个月一次、每三个月一次或每六个月一次给药组合物。
有效分子的最佳剂量水平将取决于多种因素，包括患者的年龄、体重、身体状况、与其他药物的可能组合以及病情的严重程度。具体剂量可由本领域技术人员以与用于已知细胞因子分子组合物的类似的方法来确定。
试剂盒、单位剂型和制造物品
本应用还提供了包括本文所述组合物的试剂盒、单位剂型和制造物品。试剂盒、单位剂型、和制造物品可包括，例如，包括本文所述组合物的小瓶(诸如密封小瓶)预充注射器以及自注射器(笔型)。
本文通过根据IUPAC-IUB生物化学命名委员会的氨基酸常见的3字母符号或1字母符号来指代氨基酸(参见下表3)。
实施例
下面的实施例使用各种抗体和抗体构建体，每个分配有mAb编号。表3至表6列出了它们的重链和轻链组分。尽管在表中没有显示，但双互补位抗体构建体在Fc区中包含M428L替换以提高如上所述的血清半衰期。表8和表9分别示出了用于示例性双互补位抗体构建体的完整氨基酸和核苷酸序列。
表3重链-轻链配对
这些抗体将帕妥珠单抗重链(Per-HC)或曲妥珠单抗重链(Tra-HC)与野生型(WT)或有指示的氨基酸替换的基于曲妥珠单抗轻链(Tra_LC)的共同轻链配对。
Figure BDA0002040694840000291
*该表使用Kabat编号
表4帕妥珠单抗重链的突变
mAb# 重链 重链突变* 轻链 注释
T1 Per-HC 无 Per_LC 帕妥珠单抗
T24 Per-HC_v2x CDR-H2 T30A Per_LC
T25 Per-HC_v8x CDR-H2 G56A Per_LC
T26 Per-HC_v16x CDR-H2 T30A/CDR-H2 G56A Per_LC
*该表使用Kabat编号
表5曲妥珠单抗重链的突变
mAb# 重链突变* 轻链 注释
T22 无 Tra_LC 曲妥珠单抗
T28 CDR-H2N54T Tra_LC
T29 CDR-H3D98T Tra_LC
T31 CDR-H3D98S Tra_LC
T32 CDR-H3D98R Tra_LC
T33 CDR-H3D198W Tra_LC
T34 CDR-H2N54T/CDR-H3D98T Tra_LC
T35 CDR-H2N54T/CDR-H3D98W Tra_LC
*该表使用Kabat编号
表6双互补位mAb构建体的突变
Figure BDA0002040694840000301
*除Fc区中的替换使用Eu编号外，本表使用Kabat编号。
实施例1.包括帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和共同轻链的抗体的结合效力。
使用ELISA试验测定抗体与抗原HER2的结合效力。通过添加0.2ug/100ul/孔的HER2细胞外结构域溶液，将HER2细胞外结构域包被于96孔板上过夜。用PBS洗涤板6次，并用3％BSA封闭，并温育2小时。再次用PBS洗涤板6次。然后将抗HER2抗体按图中指示的各种浓度添加到每个孔中。结合1小时后，用PBS洗涤板6次。加入辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二次抗体并温育1hr。向每个孔中加入HRP基底TMB，并在板读数器上读取发光。然后将数据拟合成4参数的S形曲线以生成IC50。每个样本一式三份进行。
图8A示出了各种轻链与帕妥珠单抗重链配对的结果(参见表3)。可以看出，用除T6外所有的共同轻链形成的mAb表现与帕妥珠单抗(mAb T1)相似，甚至是野生型曲妥珠单抗轻链(mAbT11)。图8B和图8C示出了各种轻链与曲妥珠单抗重链配对的结果。可以看出，用所有共同轻链形成的mAb表现与用曲妥珠单抗的野生型轻链形成的mAb相似，并优于用帕妥珠单抗的野生型轻链形成的mAb(mab T12；图8B)。
实施例2.包括修改后的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和对应的野生型轻链的抗 体的结合效力。
使用上述相同的ELISA测试，测定了修改后的重链与其野生型轻链配对形成的mAb的结合效力(参见表4)。与帕妥珠单抗(mAb T1)相比，用所有三种修改后的帕妥珠单抗重链形成的mAb表现出改善的性能(图9A)。与曲妥珠单抗(mAb T22)相比，用所有修改后的曲妥珠单抗重链形成的mAb表现出大致相似的性能，六个中有四个表现出中度的改善。(图9B)。
实施例3.包括修改后的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗重链和各种共同轻链的抗体的 结合效力。
使用上述相同的ELISA测试，测定了修改后的重链与各种共同轻链配对形成的mAb的结合效力(参见表5)。对于使用修改后的帕妥珠单抗重链的mAb，本实验中性能最好的是在重链中包含T30A和G56A替换两者，且其与在曲妥珠单抗轻链中包含N30S、S56Y和T94W替换的共同轻链配对的mAb T43。这种轻链在其他配对中表现良好(考虑T44和T45；图10)。对于使用有N54T和D98T替换的修改后的曲妥珠单抗重链的mAb，性能是大致相同的。共同轻链缺少S56Y替换的mAb T47性能最差，而含有N30S、S56Y和T94W替换的共同轻链mAb T46表现最好(图10B)。
实施例4.抗HER2抗体构建体的表达和纯化
使用标准分子生物学技术制备表达构建体。在Freestyle 293表达培养基(ThermoFisher)中在37℃下5％CO2下培养HEK293E细胞。用2-4ug/ml PEI用表达构建体的质粒DNA(每1×106细胞0.5至2ug DNA)转染细胞(1×106细胞/ml)。在存活力下降到～70％百分比之后收获细胞。根据制造商的说明用蛋白-A珠(Mabselect Sure(GE Life Tech))纯化培养基中的抗体。将抗体在PBS中透析，并在4％至10％SDS-PAGE凝胶上分析(图11)。
实施例5.双互补位抗体构建体的结合效力
使用上述相同的ELISA试验，测定不同形式的双互补位抗体构建物的结合效力(参见表5)。在该结合试验中，除了双互补位mAb T57表现稍差于其他之外，所有被测试的构建体均表现优于帕妥珠单抗并类似于曲妥珠单抗(图12A)。该试验不能区分对于两个表位为单价的异二聚体形式抗体，和对于两个表位为二价的Fab-Ig和Ig-Fab形式。双互补位抗体构建体的EC50的范围为从双互补位mAb T57的377ng/ml至双互补位mAb T56的174ng/ml。相比之下，曲妥珠单抗(mAb T22)和帕妥珠单抗(mAb T1)的EC50分别为211和5460ng/ml(图12B)。
实施例6.双互补位抗HER2mAb构建体抑制耐赫赛汀BT474乳腺癌细胞系的增殖
为了测定抗体抑制BT474耐赫赛汀药物细胞(BT474-HerDR)的增殖，在37℃和5％CO2下在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中，将细胞以5000细胞/孔铺板在96孔板中的90μl培养基中。24小时后，将用培养基稀释至各种浓度的10μl的抗体构建体添加到细胞培养液中。在培养细胞额外72小时后，用CellTiterGlo(Promega)测定细胞存活力。将未添加抗体的孔设为100％细胞存活力，并使用多西紫杉醇作为细胞毒性的阳性对照。然后将数据拟合成4参数的S形曲线以生成IC50。这些样本一式三份地进行。
测试了两种不同的双互补位抗体构建体，双互补位mAb构建体T51和T54(参见表6)且两者均表现出细胞毒性(存活力降低)(图13，顶部的两个子图)。相比之下，
Figure BDA0002040694840000331
(曲妥珠单抗)没有效果。由于曲妥珠单抗通过ADCC起作用，因此其在本测试中缺乏效果并不令人惊讶，因为其他成分不存在细胞毒性。因此，双互补位抗体构建体的细胞毒性作用是令人惊讶的，且是对临床有用性的令人鼓舞的预期。
实施例7.测定抗体抑制NCI-N87(N87)细胞增殖的效力
最初通过将细胞以各种密度铺板于96孔组织培养板上来测定NCI-N87的生长曲线。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中生长。发现1000细胞/孔的初始细胞密度是合适的，其在培养96小时后达到融合，并选择该细胞密度来测试双互补位抗体构建体抑制生长的能力。
为了测定双互补位抗体构建体用于抑制NCI-N87细胞增殖的效力，在37℃和5％CO2下在补充有10％FBS的RPMI-1640培养基中，将细胞以1000细胞/孔铺板在96孔板中的90μl培养基中。24小时后，将用培养基稀释至各种浓度的10μl的抗体构建体添加到细胞培养液中。在培养细胞额外72小时后，通过添加10μl的CCK-8试剂(Sigma)测定细胞增殖率。在无光下培养3小时后，在OD450nm处读取板。将未添加抗体的孔设为100％细胞存活力，并使用多西紫杉醇作为细胞毒性的阳性对照。然后将数据拟合成4参数的S形曲线以生成IC50。这些样本一式三份地进行。
测试了三种不同的双互补位抗体构建体，双互补位mAb构建体T51、T52和T54(参见表6)且均抑制生长(图14B)并具有比帕妥珠单抗(mAb T1)或曲妥珠单抗(mAb T22)更强的作用(图14A)。如上，由于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗通过ADCC起作用，因此其在该测试中作用最小并不令人惊讶，因为其他组分不存在细胞毒性。帕妥珠单抗的较强的作用可能与帕妥珠单抗抑制配体介导的细胞内信号转导的能力有关。因此，双互补位抗体构建体的细胞毒性作用是令人惊讶的，且是对临床有用性的令人鼓舞的预期。此外，如上所述，发现Gu的DVD-Ig分子在该系统中具有净激动作用。因此，这些双互补位抗体构建体抑制而不是促进该癌细胞系的生长，也预示着它们的临床应用前景良好。
表7：氨基酸命名法
Figure BDA0002040694840000351
表8氨基酸序列
Figure BDA0002040694840000361
Figure BDA0002040694840000371
Figure BDA0002040694840000381
Figure BDA0002040694840000391
Figure BDA0002040694840000401
Figure BDA0002040694840000411
Figure BDA0002040694840000421
*V-区替换用Kabat编号表示；Fc区替换用Eu编号表示。
表9核酸序列
Figure BDA0002040694840000422
Figure BDA0002040694840000431
Figure BDA0002040694840000441
Figure BDA0002040694840000451
Figure BDA0002040694840000461
Figure BDA0002040694840000471
Figure BDA0002040694840000481
Figure BDA0002040694840000491
Figure BDA0002040694840000501
Figure BDA0002040694840000511
Figure BDA0002040694840000521
序列表
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除非本文另有说明或明显违背上下文，否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)所使用的术语“一个”、“一种”、“所述/该”以及类似指示词应被解释为既包括单数也包括复数。对本文数值范围的叙述仅旨在用作为引用落入该范围的每个单独的值的简写方法(shorthand method)。除非本文另有说明，每个单独的值都被并入说明书，就像其被单独地并入本文一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则，本文所描述的所有方法都可按任何适宜的顺序执行。本文提供的任何和所有的实施例或示例性语言(例如“诸如”)的使用，仅仅旨在更好地阐明本发明并且不是对本发明的范围进行限制，除非另有说明。说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明的实施所必需的任何非要求的元素。
本文公开的本发明的可替代的元素或实施方式的分组不应被解释为限制。各个组成员可以单独地或者以与所述组的其他成员或者本文内的其他要素任意组合被指代且要求保护。可以预料的是组中的一个或多个成员可因便利性和/或专利性原因包含在组中或从组中删除。当任何这类包括或删除发生时，本申请文件被认为含有经修改的组，以满足对附加的权利要求书中所用的所有马库什组的书面描述。
本文描述了本发明的某些实施方案，包括发明人已知的实施本发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述之后，这些所描述的实施方式的变体对于本领域普通技术人员将是显而易见的。本发明人预期普通的技术人员能适当地采用这类变体，且本发明人旨在使得本发明以与本文特定描述不同的方式应用。因此，如适用的法律允许，本发明包括在此附上的权利要求书中述及的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或上下文另有明确相反指示，否则本发明涵盖上述元素以所有可能的变体的任何组合。
本文公开的特定实施方式可以通过使用由……组成或基本上由……组成的语言进一步在权利要求中得到限制。当用于权利要求时，无论是提交还是按照修改添加，过渡术语“由……组成”排除未在权利要求中指明的任何元素、步骤或成分。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制在特定材料或步骤以及那些不会实质上影响基本和新颖的特性(一个或多个)的材料或步骤。所要求保护的本发明的实施方式在本文内在地或明确地描述并实现。
另外，在整个本说明书中引用了大量专利和印刷出版物作为参考文献。上述各参考文献和印刷出版物的全部内容通过引用各自并入本文。
最后，应理解本文公开的本发明的实施方式仅用于阐明本发明的原理。可以采用的其他修改形式也在本发明的范围内。因此，通过举例而非限制的方式，可根据本文的教导利用本发明的可替代的配置。因此，本发明不局限于精确显示和描述的内容。
序列表
<110> 肖守华 （Xiao, Shouhua）
朱晓东 （Zhu, Xiaodong）
<120> 有共同轻链的双互补位和多互补位抗体和使用方法
<130> PZ19009684
<150> US 62/483,456
<151> 2017-04-09
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链可变区
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗重链可变区
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗重链
<400> 4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗轻链可变区
<400> 5
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗轻链
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗重链可变区
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗重链
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Gly Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 446
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC11
<400> 13
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ala Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
260 265 270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
275 280 285
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
305 310 315 320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
340 345 350
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
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530 535 540
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
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645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly Lys
705
<210> 14
<211> 2146
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC11
<400> 14
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
ctgcgcctgt cctgcgccgc cagcggcttc acctttgccg actacaccat ggactgggtg 180
cgccaggctc ccggcaaggg cctggagtgg gtggccgacg tgaaccccaa cagcggcggc 240
agcatctaca accagcgctt caagggccgc ttcaccctga gcgtggaccg cagcaagaac 300
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgc gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360
cgcaacctgg gccccagctt ctacttcgac tattgggggc agggcaccct ggtcaccgtg 420
agcagcgcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagctgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accagtgacc 540
gtgtcctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtcctgcag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa aggcggaggg agcggcggag gctccggagg cggcagcgga 780
ggcggagagg tgcagctggt ggagtctgga ggagggctgg tgcagccagg agggtccctg 840
agactgtctt gcgccgctag tggcttcaac atcaaggaca cctacatcca ctgggtgaga 900
caggcccccg gaaaaggcct ggagtgggtg gccaggatct accctaccac cggctacacc 960
aggtacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg ccgacaccag caagaacacc 1020
gcctacctgc agatgaacag cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcagcaga 1080
tggggcggca gcggcttcta cgccatggac tactggggac agggcacact ggtcactgtg 1140
tctagtgcct caacaaaggg gcctagcgtg tttccactgg ctccctcaag caaaagcact 1200
tccggaggca ccgctgcact gggatgtctg gtgaaggact acttcccaga gcccgtcacc 1260
gtgtcttgga acagtggggc tctgaccagc ggagtccaca catttcctgc agtgctgcag 1320
tcctctggcc tgtacagcct gagttcagtg gtcacagtcc caagctcctc tctggggacc 1380
cagacatata tctgcaacgt gaatcacaag ccaagcaata ctaaagtcga caagaaagtg 1440
gagcccaaga gctgtgataa aactcatacc tgcccccctt gtcctgcacc agaactgctg 1500
ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acaccctgat gatttcccgc 1560
acacccgagg tcacttgcgt ggtcgtggac gtgtctcacg aggaccccga agtcaagttc 1620
aactggtacg tggatggcgt cgaagtgcat aatgctaaga ccaaaccaag ggaggaacag 1680
tacaactcca catatcgcgt cgtgtctgtc ctgactgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1740
ggcaaagagt ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaact 1800
attagcaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtgt acaccctgcc tccatctcgg 1860
gacgaactga ctaagaacca agtcagtctg acctgtctgg tgaaagggtt ctatcctagc 1920
gacattgcag tggagtggga atccaatgga cagccagaga acaattacaa gaccacaccc 1980
cctgtgctgg actcagatgg aagcttcttt ctgtatagta agctgaccgt ggataaatca 2040
cgctggcagc agggcaacgt cttttcttgt agtgtgctgc atgaagccct gcacaatcat 2100
tacacacaga agtcactgag cctgtcccct ggcaaatgaa ggatcc 2146
<210> 15
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC12
<400> 15
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ala Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
260 265 270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
275 280 285
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
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Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
340 345 350
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
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370 375 380
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385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
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465 470 475 480
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
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565 570 575
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645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Lys
705
<210> 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC12
<400> 16
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aggtacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcg ccgacaccag caagaacacc 1020
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tggggcggca gcggcttcta cgccatggac tactggggac agggcacact ggtcactgtg 1140
tctagtgcct caacaaaggg gcctagcgtg tttccactgg ctccctcaag caaaagcact 1200
tccggaggca ccgctgcact gggatgtctg gtgaaggact acttcccaga gcccgtcacc 1260
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<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC13
<400> 17
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180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
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Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
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595 600 605
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Cys
705
<210> 18
<211> 2137
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC13
<400> 18
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC14
<400> 19
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Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
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Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
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Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
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Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
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Ser Pro Gly Lys
465
<210> 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC14
<400> 20
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
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gtgtcctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtcctgcag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgataa aactcatacc tgcccccctt gtcctgcacc agaactgctg 780
ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acaccctgat gatttcccgc 840
acacccgagg tcacttgcgt ggtcgtggac gtgtctcacg aggaccccga agtcaagttc 900
aactggtacg tggatggcgt cgaagtgcat aatgctaaga ccaaaccaag ggaggaacag 960
tacaactcca catatcgcgt cgtgtctgtc ctgactgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaact 1080
attagcaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtgt acaccctgcc tccatctcgg 1140
gacgaactga ctaagaacca agtcagtctg tggtgtctgg tgaaagggtt ctatcctagc 1200
gacattgcag tggagtggga atccaatgga cagccagaga acaattacaa gaccacaccc 1260
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cgctggcagc agggcaacgt cttttcttgt agtgtgctgc atgaagccct gcacaatcat 1380
tacacacaga agtcactgag cctgtcccct ggcaaatgaa ggatcc 1426
<210> 21
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC15
<400> 21
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile
35 40 45
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50 55 60
Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
325 330 335
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
340 345 350
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
405 410 415
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
420 425 430
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
435 440 445
Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
450 455 460
Leu Ser Pro Gly Lys
465
<210> 22
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 双互补位抗体构建体HC15
<400> 22
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagtct ggaggagggc tggtgcagcc aggagggtcc 120
ctgagactgt cttgcgccgc tagtggcttc aacatcaagg acacctacat ccactgggtg 180
agacaggccc ccggaaaagg cctggagtgg gtggccagga tctaccctac caccggctac 240
accaggtacg ccgacagcgt gaagggcagg ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac 300
accgcctacc tgcagatgaa cagcctgagg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcagc 360
agatggggcg gcagcggctt ctacgccatg gactactggg gacagggcac actggtcact 420
gtgtctagtg cctcaacaaa ggggcctagc gtgtttccac tggctccctc aagcaaaagc 480
acttccggag gcaccgctgc actgggatgt ctggtgaagg actacttccc agagcccgtc 540
accgtgtctt ggaacagtgg ggctctgacc agcggagtcc acacatttcc tgcagtgctg 600
cagtcctctg gcctgtacag cctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggg 660
acccagacat atatctgcaa cgtgaatcac aagccaagca atactaaagt cgacaagaaa 720
gtggagccca agagctgtga taaaactcat acctgccccc cttgtcctgc accagaactg 780
ctgggaggac catccgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacaccct gatgatttcc 840
cgcacacccg aggtcacttg cgtggtcgtg gacgtgtctc acgaggaccc cgaagtcaag 900
ttcaactggt acgtggatgg cgtcgaagtg cataatgcta agaccaaacc aagggaggaa 960
cagtacaact ccacatatcg cgtcgtgtct gtcctgactg tgctgcacca ggattggctg 1020
aacggcaaag agtataagtg caaagtgagc aataaggccc tgcccgctcc tatcgagaaa 1080
actattagca aggctaaagg gcagcctcgc gaaccacagg tgtacaccct gcctccatct 1140
cgggacgaac tgactaagaa ccaagtcagt ctgagctgtg ccgtgaaagg gttctatcct 1200
agcgacattg cagtggagtg ggaatccaat ggacagccag agaacaatta caagaccaca 1260
ccccctgtgc tggactcaga tggaagcttc tttctggtga gtaagctgac cgtggataaa 1320
tcacgctggc agcagggcaa cgtcttttct tgtagtgtgc tgcatgaagc cctgcacaat 1380
cattacacac agaagtcact gagcctgtcc cctggcaaat gaaggatcc 1429
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头序列
<400> 23
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
<210> 24
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 24
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 25
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 25
Gly Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly
1 5 10 15
Gly Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly
20 25 30
Cys Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly Gly Ala
35 40 45
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoRI/Kozak序列
<400> 26
Gly Ala Ala Thr Thr Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BamHI克隆位点
<400> 27
aggatcc 7
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 信号序列
<400> 28
atgaactttg gcctgagcct gatttttctc gtcctgatcc tgaagggcgt gcagtgt 57
<210> 29
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_VH_V16xCH1FcML
<400> 29
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys
<210> 30
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tra_VH-VNT_DSCH1
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 31
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_VH_V16xCH1FcML-接头-Tra_VH-VNT_DSCH1
<400> 31
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
260 265 270
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
275 280 285
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
290 295 300
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
305 310 315 320
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
325 330 335
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
340 345 350
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
355 360 365
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
385 390 395 400
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
405 410 415
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
420 425 430
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
435 440 445
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
450 455 460
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
465 470 475 480
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
485 490 495
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
500 505 510
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
515 520 525
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
530 535 540
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
545 550 555 560
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
565 570 575
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
580 585 590
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
595 600 605
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
610 615 620
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
625 630 635 640
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
645 650 655
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
660 665 670
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
675 680 685
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
690 695 700
Ser Pro Gly Lys
705
<210> 32
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_Fab+Fc
<400> 32
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly
465
<210> 33
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tras_Fab
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 34
<211> 705
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_HC_v2x-Tra_HC_vNT_DS_ML
<400> 34
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
485 490 495
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
500 505 510
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
515 520 525
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
530 535 540
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
545 550 555 560
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
565 570 575
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
580 585 590
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
595 600 605
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
610 615 620
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
625 630 635 640
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
645 650 655
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
660 665 670
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
675 680 685
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
690 695 700
Cys
705
<210> 35
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_HC_v16x杵
<400> 35
Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210> 36
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tras_HC_臼
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Ser Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 37
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> gTra_HC_vNT_DT_ML
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Thr Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 38
<211> 741
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EcoRI-Kozak-Pert_VH_V16xCH1FcML
<400> 38
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
ctgcgcctgt cctgcgccgc cagcggcttc acctttaccg actacaccat ggactgggtg 180
cgccaggctc ccggcaaggg cctggagtgg gtggccgacg tgaaccccaa cagcggcggc 240
agcatctaca accagcgctt caagggccgc ttcaccctga gcgtggaccg cagcaagaac 300
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgc gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360
cgcaacctgg gccccagctt ctacttcgac tattgggggc agggcaccct ggtcaccgtg 420
agcagcgcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagctgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accagtgacc 540
gtgtcctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtcctgcag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgacaa a 741
<210> 39
<211> 1360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tra_VH-VNT_DSCH1
<400> 39
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggg ctggtgcagc caggagggtc cctgagactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gagacaggcc 120
cccggaaaag gcctggagtg ggtggccagg atctacccta ccaccggcta caccaggtac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcag cagatggggc 300
ggcagcggct tctacgccat ggactactgg ggacagggca cactggtcac tgtgtctagt 360
gcctcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggctccct caagcaaaag cacttccgga 420
ggcaccgctg cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 480
tggaacagtg gggctctgac cagcggagtc cacacatttc ctgcagtgct gcagtcctct 540
ggcctgtaca gcctgagttc agtggtcaca gtcccaagct cctctctggg gacccagaca 600
tatatctgca acgtgaatca caagccaagc aatactaaag tcgacaagaa agtggagccc 660
aagagctgtg ataaaactca tacctgcccc ccttgtcctg caccagaact gctgggagga 720
ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgatttc ccgcacaccc 780
gaggtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtct cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtcgaagt gcataatgct aagaccaaac caagggagga acagtacaac 900
tccacatatc gcgtcgtgtc tgtcctgact gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960
gagtataagt gcaaagtgag caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa aactattagc 1020
aaggctaaag ggcagcctcg cgaaccacag gtgtacaccc tgcctccatc tcgggaggaa 1080
atgactaaga accaagtcag tctgacctgt ctggtgaaag ggttctatcc tagcgacatt 1140
gcagtggagt gggaatccaa tggacagcca gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1200
ctggactcag atggaagctt ctttctgtat agtaagctga ccgtggataa atcacgctgg 1260
cagcagggca acgtcttttc ttgtagtgtg ctgcatgaag ccctgcacaa tcattacaca 1320
cagaagtcac tgagcctgtc ccctggcaaa tgaaggatcc 1360
<210> 40
<211> 2127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_HC_v2x_Tra_HC_vNT_DS_ML
<400> 40
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
ctgcgcctgt cctgcgccgc cagcggcttc acctttaccg actacaccat ggactgggtg 180
cgccaggctc ccggcaaggg cctggagtgg gtggccgacg tgaaccccaa cagcggcggc 240
agcatctaca accagcgctt caagggccgc ttcaccctga gcgtggaccg cagcaagaac 300
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgc gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360
cgcaacctgg gccccagctt ctacttcgac tattgggggc agggcaccct ggtcaccgtg 420
agcagcgcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagctgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accagtgacc 540
gtgtcctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtcctgcag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgataa aactcatacc tgcccccctt gtcctgcacc agaactgctg 780
ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acaccctgat gatttcccgc 840
acacccgagg tcacttgcgt ggtcgtggac gtgtctcacg aggaccccga agtcaagttc 900
aactggtacg tggatggcgt cgaagtgcat aatgctaaga ccaaaccaag ggaggaacag 960
tacaactcca catatcgcgt cgtgtctgtc ctgactgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaact 1080
attagcaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtgt acaccctgcc tccatctcgg 1140
gaggaaatga ctaagaacca agtcagtctg acctgtctgg tgaaagggtt ctatcctagc 1200
gacattgcag tggagtggga atccaatgga cagccagaga acaattacaa gaccacaccc 1260
cctgtgctgg actcagatgg aagcttcttt ctgtatagta agctgaccgt ggataaatca 1320
cgctggcagc agggcaacgt cttttcttgt agtgtgctgc atgaagccct gcacaatcat 1380
tacacacaga agtcactgag cctgtcccct ggcggcggag ggagcggcgg aggctccgga 1440
ggcggcagcg gaggcggaga ggtgcagctg gtggagtctg gaggagggct ggtgcagcca 1500
ggagggtccc tgagactgtc ttgcgccgct agtggcttca acatcaagga cacctacatc 1560
cactgggtga gacaggcccc cggaaaaggc ctggagtggg tggccaggat ctaccctacc 1620
accggctaca ccaggtacgc cgacagcgtg aagggcaggt tcaccatcag cgccgacacc 1680
agcaagaaca ccgcctacct gcagatgaac agcctgaggg ccgaggacac cgccgtgtac 1740
tactgcagca gatggggcgg cagcggcttc tacgccatgg actactgggg acagggcaca 1800
ctggtcactg tgtctagtgc ctcaacaaag gggcctagcg tgtttccact ggctccctca 1860
agcaaaagca cttccggagg caccgctgca ctgggatgtc tggtgaagga ctacttccca 1920
gagcccgtca ccgtgtcttg gaacagtggg gctctgacca gcggagtcca cacatttcct 1980
gcagtgctgc agtcctctgg cctgtacagc ctgagttcag tggtcacagt cccaagctcc 2040
tctctgggga cccagacata tatctgcaac gtgaatcaca agccaagcaa tactaaagtc 2100
gacaagaaag tggagcccaa gagctgt 2127
<210> 41
<211> 1426
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pert_HC_v16x杵
<400> 41
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagagc ggcggcggcc tggtgcagcc cggcggcagc 120
ctgcgcctgt cctgcgccgc cagcggcttc acctttaccg actacaccat ggactgggtg 180
cgccaggctc ccggcaaggg cctggagtgg gtggccgacg tgaaccccaa cagcggcggc 240
agcatctaca accagcgctt caagggccgc ttcaccctga gcgtggaccg cagcaagaac 300
accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgc gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 360
cgcaacctgg gccccagctt ctacttcgac tattgggggc agggcaccct ggtcaccgtg 420
agcagcgcta gcaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc 480
tctgggggca cagctgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accagtgacc 540
gtgtcctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccctgc tgtcctgcag 600
tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgactgtgc cctctagcag cttgggcacc 660
cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 720
gagcccaaat cttgtgataa aactcatacc tgcccccctt gtcctgcacc agaactgctg 780
ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaaag acaccctgat gatttcccgc 840
acacccgagg tcacttgcgt ggtcgtggac gtgtctcacg aggaccccga agtcaagttc 900
aactggtacg tggatggcgt cgaagtgcat aatgctaaga ccaaaccaag ggaggaacag 960
tacaactcca catatcgcgt cgtgtctgtc ctgactgtgc tgcaccagga ttggctgaac 1020
ggcaaagagt ataagtgcaa agtgagcaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaaaact 1080
attagcaagg ctaaagggca gcctcgcgaa ccacaggtgt acaccctgcc tccatctcgg 1140
gaggaaatga ctaagaacca agtcagtctg tggtgtctgg tgaaagggtt ctatcctagc 1200
gacattgcag tggagtggga atccaatgga cagccagaga acaattacaa gaccacaccc 1260
cctgtgctgg actcagatgg aagcttcttt ctgtatagta agctgaccgt ggataaatca 1320
cgctggcagc agggcaacgt cttttcttgt agtgtgctgc atgaagccct gcacaatcat 1380
tacacacaga agtcactgag cctgtcccct ggcaaatgaa ggatcc 1426
<210> 42
<211> 774
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tras-优化的Fc
<400> 42
atgaactttg gcctgagcct gatttttctc gtcctgatcc tgaagggcgt gcagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgtcc 120
tgcgccgcca gcggcttcac ctttgccgac tacaccatgg actgggtgcg ccaggctccc 180
ggcaagggcc tggagtgggt ggccgacgtg aaccccaaca gcggcgccag catctacaac 240
cagcgcttca agggccgctt caccctgagc gtggaccgca gcaagaacac cctgtacctg 300
cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc gccgtgtact actgcgcccg caacctgggc 360
cccagcttct acttcgacta ttgggggcag ggcaccctgg tcaccgtgag cagcgctagc 420
accaagggcc catccgtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480
gctgccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cagtgaccgt gtcctggaac 540
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccctgctg tcctgcagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gactgtgccc tctagcagct tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720
tgtgacaaag gcggagggag cggcggaggc tccggaggcg gcagcggagg cgga 774
<210> 43
<211> 1429
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Tras_HC_臼
<400> 43
gaattcgcca ccatgaactt tggcctgagc ctgatttttc tcgtcctgat cctgaagggc 60
gtgcagtgtg aggtgcagct ggtggagtct ggaggagggc tggtgcagcc aggagggtcc 120
ctgagactgt cttgcgccgc tagtggcttc aacatcaagg acacctacat ccactgggtg 180
agacaggccc ccggaaaagg cctggagtgg gtggccagga tctaccctac caccggctac 240
accaggtacg ccgacagcgt gaagggcagg ttcaccatca gcgccgacac cagcaagaac 300
accgcctacc tgcagatgaa cagcctgagg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcagc 360
agatggggcg gcagcggctt ctacgccatg gactactggg gacagggcac actggtcact 420
gtgtctagtg cctcaacaaa ggggcctagc gtgtttccac tggctccctc aagcaaaagc 480
acttccggag gcaccgctgc actgggatgt ctggtgaagg actacttccc agagcccgtc 540
accgtgtctt ggaacagtgg ggctctgacc agcggagtcc acacatttcc tgcagtgctg 600
cagtcctctg gcctgtacag cctgagttca gtggtcacag tcccaagctc ctctctgggg 660
acccagacat atatctgcaa cgtgaatcac aagccaagca atactaaagt cgacaagaaa 720
gtggagccca agagctgtga taaaactcat acctgccccc cttgtcctgc accagaactg 780
ctgggaggac catccgtgtt cctgtttcca cccaagccta aagacaccct gatgatttcc 840
cgcacacccg aggtcacttg cgtggtcgtg gacgtgtctc acgaggaccc cgaagtcaag 900
ttcaactggt acgtggatgg cgtcgaagtg cataatgcta agaccaaacc aagggaggaa 960
cagtacaact ccacatatcg cgtcgtgtct gtcctgactg tgctgcacca ggattggctg 1020
aacggcaaag agtataagtg caaagtgagc aataaggccc tgcccgctcc tatcgagaaa 1080
actattagca aggctaaagg gcagcctcgc gaaccacagg tgtacaccct gcctccatct 1140
cgggaggaaa tgactaagaa ccaagtcagt ctgagctgtg ccgtgaaagg gttctatcct 1200
agcgacattg cagtggagtg ggaatccaat ggacagccag agaacaatta caagaccaca 1260
ccccctgtgc tggactcaga tggaagcttc tttctggtga gtaagctgac cgtggataaa 1320
tcacgctggc agcagggcaa cgtcttttct tgtagtgtgc tgcatgaagc cctgcacaat 1380
cattacacac agaagtcact gagcctgtcc cctggcaaat gaaggatcc 1429
<210> 44
<211> 1360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gTra_HC_vNT_DT_ML 减去信号肽
<400> 44
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggg ctggtgcagc caggagggtc cctgagactg 60
tcttgcgccg ctagtggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt gagacaggcc 120
cccggaaaag gcctggagtg ggtggccagg atctacccta ccaccggcta caccaggtac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcgccgaca ccagcaagaa caccgcctac 240
ctgcagatga acagcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcag cagatggggc 300
ggcaccggct tctacgccat ggactactgg ggacagggca cactggtcac tgtgtctagt 360
gcctcaacaa aggggcctag cgtgtttcca ctggctccct caagcaaaag cacttccgga 420
ggcaccgctg cactgggatg tctggtgaag gactacttcc cagagcccgt caccgtgtct 480
tggaacagtg gggctctgac cagcggagtc cacacatttc ctgcagtgct gcagtcctct 540
ggcctgtaca gcctgagttc agtggtcaca gtcccaagct cctctctggg gacccagaca 600
tatatctgca acgtgaatca caagccaagc aatactaaag tcgacaagaa agtggagccc 660
aagagctgtg ataaaactca tacctgcccc ccttgtcctg caccagaact gctgggagga 720
ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagcct aaagacaccc tgatgatttc ccgcacaccc 780
gaggtcactt gcgtggtcgt ggacgtgtct cacgaggacc ccgaagtcaa gttcaactgg 840
tacgtggatg gcgtcgaagt gcataatgct aagaccaaac caagggagga acagtacaac 900
tccacatatc gcgtcgtgtc tgtcctgact gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa 960
gagtataagt gcaaagtgag caataaggcc ctgcccgctc ctatcgagaa aactattagc 1020
aaggctaaag ggcagcctcg cgaaccacag gtgtacaccc tgcctccatc tcgggaggaa 1080
atgactaaga accaagtcag tctgacctgt ctggtgaaag ggttctatcc tagcgacatt 1140
gcagtggagt gggaatccaa tggacagcca gagaacaatt acaagaccac accccctgtg 1200
ctggactcag atggaagctt ctttctgtat agtaagctga ccgtggataa atcacgctgg 1260
cagcagggca acgtcttttc ttgtagtgtg ctgcatgaag ccctgcacaa tcattacaca 1320
cagaagtcac tgagcctgtc ccctggcaaa tgaaggatcc 1360

Claims (20)

1.一种抗体轻链，其特征在于，所述抗体轻链的轻链可变结构域由对SEQ ID NO: 5所示的曲妥珠单抗轻链可变结构域进行如下修改获得：对互补决定区2（CDR-L2）进行S56Y修改；
所述抗体轻链能够作为多互补位抗体构建体中的共同轻链，所述多互补位抗体构建体包括：
帕妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体，和
曲妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体；
所述帕妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成，所述曲妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的抗体轻链，其特征在于，所述抗体轻链的轻链可变结构域还进行如下修改：对互补决定区3（CDR-L3）的T94W修改。
3.根据权利要求1所述的抗体轻链，其特征在于，所述抗体轻链的轻链可变结构域由对SEQ ID NO: 5所示的曲妥珠单抗轻链可变结构域进行如下修改获得：
（1）对互补决定区1（CDR-L1）的N30S修改和对互补决定区2（CDR-L2）的S56Y修改；或者，
（2）对互补决定区1（CDR-L1）的N30S修改、对互补决定区2（CDR-L2）的S56Y修改和对互补决定区3（CDR-L3）的T94W修改。
4.一种多互补位抗体构建体，包括：
帕妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体，和
曲妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体；以及
权利要求1-3中任一项所述的抗体轻链；
其中，
曲妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列组成；
帕妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成；
帕妥珠单抗的重链可变结构域的突变体由对SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的如下修改组成：T30A和/或G56A；
曲妥珠单抗的重链可变结构域的突变体由对SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的如下修改组成：
i） N54T、D98T、D98S、D98R或D98W；或者，
ii） N54T与D98T、N54T与D98W、或N54T与D98S。
5.根据权利要求4所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述多互补位抗体构建体是双互补位抗体构建体。
6.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体具有Fab-Ig形式。
7.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体具有Ig-Fab形式。
8.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体具有异二聚体Ig形式。
9.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体具有包括由M428L组成的替换的修改后的Fc区。
10.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体的Fc包含：
（1）增加抗体依赖性细胞毒效应的Fc，或
（2）增加抗体依赖性细胞吞噬作用的Fc，或
（3）增加补体依赖性细胞毒性活性的Fc。
11.根据权利要求5所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述双互补位抗体构建体为去岩藻糖基化抗体。
12.根据权利要求11所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述去岩藻糖基化抗体的获得方法为：由具有岩藻糖基化缺陷的宿主细胞产生。
13.根据权利要求12所述的多互补位抗体构建体，其特征在于，所述岩藻糖基化缺陷为敲除FUT8基因。
14.一种双互补位抗体构建体，包括
帕妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体，和
曲妥珠单抗的重链可变结构域或其突变体；
以及，共同轻链，
所述共同轻链的轻链可变结构域
由对SEQ ID NO: 5所示的曲妥珠单抗轻链可变结构域进行如下修改获得：
对互补决定区1（CDR-L1）的N30S修改和对互补决定区2（CDR-L2）的S56Y修改；
其中，
曲妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列组成；
帕妥珠单抗重链可变结构域由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成；
帕妥珠单抗的重链可变结构域的突变体由对SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的如下修改组成：T30A和/或G56A；
曲妥珠单抗的重链可变结构域的突变体由对SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列的如下修改组成：N54T和D98S；
所述双互补位抗体构建体为去岩藻糖基化抗体。
15.根据权利要求4-14任一项所述的抗体构建体，其特征在于，其具有杵臼结构。
16.根据权利要求15所述的抗体构建体，其特征在于，在杵部分的Fc区包括了M428L和T366W修改，在臼部分的Fc区包括了M428L、T366S、L368A和Y407V修改。
17.根据权利要求4-14任一项所述的抗体构建体，其特征在于，其重链的氨基酸序列分别如SEQ. ID NO. 19和SEQ. ID NO. 21所示。
18.一种组合物，包括权利要求1-3中任一项所述的抗体轻链或权利要求4-17中任一项所述的抗体构建体，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
19.权利要求18所述的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的应用。
20.权利要求1-3中任一项所述的抗体轻链或权利要求4-17中任一项所述的抗体构建体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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