JP2022527652A - Ｈｅｒ２に対する二重特異性抗体及びその応用 - Google Patents

Ｈｅｒ２に対する二重特異性抗体及びその応用 Download PDF

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Abstract

ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体を提供し、該ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及び細胞外ドメインＩＶを認識するための第１のタンパク質ドメイン及び第２のタンパク質ドメインを含み、上記第１のタンパク質ドメインが第１の重鎖と軽鎖を含み、上記第２のタンパク質ドメインが第２の重鎖と軽鎖を含む。さらに、前記二重特異性抗体を含む医薬組成物及びそれらの用途を提供する。前記二重特異性抗体及びそれを含む医薬組成物は、癌の治療に用いることができる。

Description

関連出願への相互参照
本願は、出願日が２０１９／２／３である中国特許出願２０１９１０１０９００８４の優先権を主張するものである。上記中国特許出願の全内容は参照により本願に組み入れられる。
本発明は、バイオ医薬品の分野に関し、具体的には、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体及びその応用に関する。
ＨＥＲ２は、１８５ｋＤａの細胞表面受容体型チロシンキナーゼ（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）と上皮成長因子受容体（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーであり、上記ＥＧＦＲファミリーは、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ－２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ－３及びＨＥＲ４／ＥｒｂＢ－４の４つの異なる受容体を含む。上記ＥＧＦＲファミリーの４つのメンバーは、ホモ二量体とヘテロ二量体を形成し、ＨＥＲ２が好ましく、かつ他のＥｒｂＢ受容体のうちの最も強力な二量体化パートナーである （Ｇｒａｕｓ－Ｐｏｒｔａら、Ｅｍｂｏ Ｊ １９９７、１６：１６４７－１６５５、Ｔａｏら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ２００８、１２１：３２０７－３２１７）。ＨＥＲ２は、過剰発現によって活性化することができるか、又はリガンド結合によって活性化可能な他のＥｒｂＢとのヘテロ二量体化によって活性化することができる（Ｒｉｅｓｅ及びＳｔｅｒｎ、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１９９８、２０：４１－４８）。ＨＥＲ２は、リガンドが同定されていない。ＨＥＲ２が活性化されると受容体リン酸化が起こり、これによって複数のシグナル伝達経路、例えば、ＭＡＰＫ、ホスホイノシチド３－キナーゼ／ＡＫＴ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、及びＰＫＣを介した下流シグナル伝達カスケードが誘発され、最終的に増殖、生存、及び分化などの複数の細胞機能が調節される（Ｈｕａｎｇら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ ＴＨＥＲ２００９、９：９７－１１０）。
腫瘍におけるＨＥＲ２への関心の多くは、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）におけるＨＥＲ２の役割に集中し、乳癌では症例の約２０％においてＨＥＲ２の過剰発現が報告されており、予後不良と関連する（Ｒｅｅｓｅら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ １９９７、１５：１－８、Ａｎｄｒｅｃｈｅｋら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ ＳＡ ２０００、９７：３４４４－３４４９及びＳｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８７、２３５：１７７－１８２）。乳癌に加えて、ＨＥＲ２発現は、前立腺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、卵巣癌、胃癌、結腸癌、食道癌、及び頭頚部の扁平上皮癌を含む他のヒト癌腫型とも関連する（Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ１９９３、８：２３３－２３９、Ｒｏｓｓら、Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ２００３、８：３０７－３２５、Ｏｓｍａｎら、Ｊ Ｕｒｏｌ２００５、１７４：２１７４－２１７７、Ｋａｐｉｔａｎｏｖｉｃら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ１９９７、１１２：１１０３－１１１３、Ｔｕｒｋｅｎら、Ｎｅｏｐｌａｓｍａ２００３、５０：２５７－２６１及びＯｓｈｉｍａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｍａｒｋｅｒｓ２００１、１６：２５０－２５４）。下記表に様々な由来腫瘍細胞におけるＨＥＲ２の発現状況を示す。
（表１）
腫瘍細胞及びＨＥＲ２の発現状況

Figure 2022527652000002
トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）は、ＨＥＲ２タンパク質ドメインＩＶに対する組換えヒト化モノクローナル抗体であるため、ＨＥＲ２が大幅に過剰発現している細胞内にリガンド非依存性ＨＥＲ２ホモ二量体化を阻止し、かつ低い程度でＨＥＲ２と他のファミリーメンバーとのヘテロ二量体化を阻止する（Ｃｈｏら、Ｎａｔｕｒｅ２００３、４２１：７５６－７６０及びＷｅｈｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００６、１０３：１９０６３－１９０６８）。ＨＥＲ２発現レベルが中程度の細胞において、トラスツズマブがＨＥＲ２／ＥＧＦＲヘテロ二量体の形成を阻害することが見出された（Ｗｅｈｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２００６、１０３：１９０６３－１９０６８、Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ２００９、３１５：６５９－６７０）。トラスツズマブは、抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）を媒介し、外部ドメインシェディング（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｓｈｅｄｄｉｎｇ）を阻止し、外部ドメインシェディングが阻止されなければ、ＨＥＲ２過剰発現細胞において切断型常時活性型タンパク質が形成されることになる。そして、トラスツズマブについては、高レベルのＨＥＲ２発現腫瘍細胞のインビトロ増殖及びインビボ増殖の阻害も報告されている（Ｎａｈｔａ及びＥｓｔｅｖａ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２００７、２６：３６３７－３６４３において概説されている）。トラスツズマブは、化学療法と併用するか、又は１種類もしくは複数種の化学療法後の単一薬剤として、ＨＥＲ２過剰発現転移乳癌のファーストライン療法と補助療法に用いられることがＮＭＰＡ及びＦＤＡによって許可されている。トラスツズマブは、ＨＥＲ２過剰発現乳癌患者の２０～５０％のみに有効であることが見出されており、多くの初期応答者（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）が数ヶ月後に再発する（Ｄｉｎｈら、Ｃｌｉｎ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ ２００７、５：７０７－７１７）。米国国立総合癌ネットワーク（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ、ＮＣＣＮ）は、２０１９版乳癌の臨床治療ガイドラインにおいて、ペルツズマブ及びトラスツズマブをドセタキセル（推奨の強さ１）又はパクリタキセルと組み合わせて、ＨＥＲ２陽性末期（転移性）乳癌と新規補助療法（即ち、手術前）のファーストライン投与計画とすると、乳癌手術の成功率を高め、再発率を低下させ、生存率と生活の質を向上させることが期待されている。
ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（ＯｍｎｉｔａｒｇＴＭ）は、別のヒト化モノクローナル抗体である。ペルツズマブは、ＨＥＲ２タンパク質ドメインＩＩに対して作られ、リガンド誘導性ヘテロ二量体化（即ち、リガンドが結合しているＥｒｂＢファミリーの別のメンバーとのＨＥＲ２二量体化）を阻害し、高いＨＥＲ２発現レベルを厳格に必要としないと機構であると報告されている（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ２００４、５：３１７－３２８）。ペルツズマブもＡＤＣＣを媒介するが、ペルツズマブの主な作用機構は、その二量体化への阻止に依存している（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ＴＨＥＲ２００９、８：１８８５－１８９２）。また、ペルツズマブがＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体の形成を阻害することによりＥＧＦＲ内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）及びダウンレギュレーションを増強することが見出されており、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２ヘテロ二量体の形成が阻害されなければ、ＥＧＦＲは上記ヘテロ二量体によって原形質膜に繋ぎ止められる（Ｈｕｇｈｅｓら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ＴＨＥＲ２００９、８：１８８５－１８９２）。これは、ＥＧＦＲホモ二量体がＥＧＦＲ／ＨＥＲ２二量体より効率的に内在化するという観察と関連する（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２００９、７：２７５－２８４）。ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ、ＮｅｏＳｐｈｅｒｅ、ＶＥＬＶＥＴ、ＰＥＲＵＳＥの最新の臨床研究結果によると、ＨＥＲ２の異なるエピトープを標的とするペルツズマブとトラスツズマブの併用投与は、ＨＥＲ２陽性乳癌患者の無増悪生存期間と生存期間中央値を大幅に改善することができる。
ＨＥＲ２に基づく治療法として提案された別のものは、異なるＨＥＲ２エピトープに対するＨＥＲ２抗体を組み合わせであり、インビトロとインビボの腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖の減少の面で単独のＨＥＲ２抗体よりも有効であることが報告されている（Ｅｍｄｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２０１１、３０：１６３１－１６４２、Ｓｐｉｒｉｄｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓ２００２、８：１７２０－１７３０）。例えば、報告によると、前のトラスツズマブ療法の間に進行した患者において両者を組み合わせると、ペルツズマブとトラスツズマブの補完的な作用機構は、抗腫瘍作用及び抗腫瘍効果を向上させる（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ２０１０、２８：１１３８－１１４４）。第ＩＩＩ相臨床試験（ＣＬＥＯＰＡＴＲＡ）では、未治療のＨＥＲ２陽性転移乳癌を患っている患者において、ペルツズマブとトラスツズマブの抗体の組み合わせがドセタキセルと併用されることにより、トラスツズマブとドセタキセルを併用する場合に比べて無増悪生存期間（ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）が延長されることが示されている。
ペルツズマブとトラスツズマブの併用は、単独投与に比べて効果がより明らかであり、ペルツズマブの単一薬剤の有害反応率が３．４％のみであるが、トラスツズマブとの併用場合の有害反応率が２１．４％に達することができる。それにもかかわらず、トラスツズマブとペルツズマブは、いずれもＨＥＲ２強陽性（ＩＨＣ検査結果が３＋である）の乳癌治療のみに適し、ＨＥＲ２弱陽性の乳癌に対して、トラスツズマブとペルツズマブの治療効果は、いずれも理想的ではない。近年、細胞治療は、血液腫瘍治療において並外れた成果を上げているため、科学者はトラスツズマブに基づくＨＥＲ２陽性乳癌の治療法を開発している。その結果、患者は、ＣＡＲ－Ｔ細胞注入後の５日目に重篤な副作用で死亡した（Ｍｏｒｇａｎら、Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ＆Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０１０、４：８４３－８５１）。ＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体は、ＨＥＲ２の表面の２つの異なるエピトープを認識するためのモノクローナル抗体医薬であり、２本の異なる抗体の重鎖可変領域と２本の同じ軽鎖可変領域を含み（ＣＮ１０５８２９３４７Ａ、ＣＮ１０５８２０２５１Ａ、ＣＮ１０５９８０４０９Ａ）、 ＨＥＲ２の表面の第２、第４のドメインと特異的に結合でき、目的がトラスツズマブ活性とペルツズマブ活性を持つ二重特異性抗体を提供して、現在の、臨床的にトラスツズマブとペルツズマブの２種類の抗体を併用した治療法を代替することである。しかしながら、従来技術（ＣＮ１０５８２９３４７Ａ、ＣＮ１０５８２０２５１Ａ、ＣＮ１０５９８０４０９Ａ）における抗体は、抗原との結合活性が低く、又は安定性が低く、沈殿が生成しやすいという特性を有するが、安定性は抗体創薬の必要条件である。
従来技術における、親和力が低く、安定性が低く、沈殿が生成しやすいという上記技術的欠陥に鑑み、本発明は、ＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体及びその応用を提供することを目的とする。本願の発明者は、それぞれペルツズマブとトラスツズマブの重鎖を用いて、天然トラスツズマブ軽鎖を共通の軽鎖として最適化すると、ＨＥＲ２標的第２、第４のドメインに対する親和性がそれぞれ野生型ペルツズマブとトラスツズマブと同等である二重特異性モノクローナル抗体を得ることができることを発見した。二重特異性及び高親和性の特徴により、本発明の抗体はＨＥＲ２弱陽性乳癌に対しても有効である可能性が高い。同時に、本発明の抗体が様々なＨＥＲ２発現腫瘍細胞に対して増強された増殖阻害効果を有することが予想外に発見されている。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第１の態様の技術手段は以下のとおりである。ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＶ及び細胞外ドメインＩＩを認識するための第１のタンパク質ドメイン及び第２のタンパク質ドメインを含み、前記第１のタンパク質ドメインは第１の重鎖と軽鎖を含み、前記第２のタンパク質ドメインは第２の重鎖と軽鎖を含み、前記第１の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列又はその突然変異アミノ酸配列に示される重鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその突然変異アミノ酸配列に示される重鎖可変領域を含み、前記軽鎖は軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列にＲ２４、Ｎ３０、Ｔ３１、Ａ３２、Ｆ５３、Ｌ５４、Ｓ５６、Ｒ６６、Ｈ９１、Ｔ９３、Ｔ９４及びＰ９６から選択される１つ以上の部位のアミノ酸置換を行う、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体を提供する。前記二重特異性抗体は、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ）２又はＩｇＧ様構造であってよい。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体は、軽鎖可変領域において、前記アミノ酸置換は、元のアミノ酸残基を、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｔｒｐ（Ｗ）及びＡｒｇ（Ｒ）から選択されるアミノ酸残基で置換する。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体は、軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、Ｒ２４Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｔ３１Ｉ、Ａ３２Ｇ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ、Ｓ５６Ｔ、Ｒ６６Ｇ、Ｈ９１Ｙ、Ｔ９３Ｉ、Ｔ９４Ｙ及びＰ９６Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を行う。好ましくは、Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ、Ｓ５６Ｔ及びＰ９６Ｙから選択される１つ以上の部位のアミノ酸残基置換を行う。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体は、軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体は、軽鎖定常領域をさらに含み、前記軽鎖定常領域は好ましくは、ヒト軽鎖定常領域λ軽鎖又はκ軽鎖である。好ましくは、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は好ましくは、ヒト重鎖定常領域である。好ましくは、前記二重特異性抗体の第１の重鎖と第２の重鎖はヘテロ二量体を形成し、前記第１の重鎖と第２の重鎖は好ましくは、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ構造によって接続される。より好ましくは、前記第２の重鎖の重鎖定常領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列に、Ｄ１０２Ｅ突然変異が発生する。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体の第１の重鎖の重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６－１３に示されるＨＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１４－１９に示されるＨＣＤＲ３のＣＤＲ配列を含み、
好ましくは、前記第１の重鎖の重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３を含む。
好ましい具体的な実施例では、前記二重特異性抗体は、フコース修飾を減少させ、好ましくは、前記抗体は、フコース非修飾抗体である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第２の態様の技術手段は以下のとおりである。以上に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分をコードする塩基配列を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第３の態様の技術手段は以下のとおりである。上記第２の態様における塩基配列を含む発現ベクターを提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第４の態様の技術手段は以下のとおりである。上記第３の態様における発現ベクターを含む原核細胞又は真核細胞を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第５の態様の技術手段は以下のとおりである。軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う軽鎖を提供する。好ましくは、前記軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含み、前記軽鎖定常領域は好ましくは、ヒト軽鎖定常領域λ軽鎖又はκ軽鎖である。より好ましくは、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第６の態様の技術手段は以下のとおりである。抗体の調製における上記第５の態様における軽鎖の応用であって、好ましくは、前記抗体がｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２又は全長抗体、又はモノクローナル抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、応用を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第７の態様の技術手段は以下のとおりである。以上に記載の二重特異性抗体と細胞毒性薬とで共有結合される、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体薬物複合体を提供する。好ましくは、前記細胞毒性薬は、チューブリン阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡ副溝阻害剤である。より好ましくは、前記チューブリン阻害剤は、マイタンシノイド化合物、又はオーリスタチン誘導体又はチューブリンであり、前記トポイソメラーゼ阻害剤は、ＤＸｄ又はその誘導体、又はＳＮ－３８、又はアドリアマイシン及びその誘導体であり、前記ＤＮＡ副溝阻害剤は、カリケアミシン（Ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシン（Ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ）及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン化合物ｐｙｒｒｏｌｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）又はインドリノベンゾジアゼピン化合物（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）である。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第８の態様の技術手段は以下のとおりである。以上に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、前記医薬組成物は、ヒアルロニダーゼをさらに含む。より好ましくは、前記ヒアルロニダーゼは、ｒＨｕＰＨ２０又は修飾されたｒＨｕＰＨ２０である。最も好ましくは、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第９の態様の技術手段は以下のとおりである。
前記重鎖をコードするヌクレオチド配列と前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を同じベクター又は異なるベクターに構築するステップ（１）と、
前記ステップで構築されたベクターを異なる宿主細胞又は同じ宿主細胞に発現させるステップ（２）とを含む、以上に記載の二重特異性抗体の調製方法を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第１０の態様の技術手段は以下のとおりである。好ましくは、前記陽性腫瘍が乳癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、咽頭癌、口腔癌、皮膚癌を含み、より好ましくは、乳癌、胃癌及び肺癌である、以上に記載のＨＥＲ２発現腫瘍を治療する医薬の調製における、以上に記載のＨＥＲ２に対する二重特異性抗体、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体薬物複合体、及び二重特異性抗体を含む医薬組成物の応用を提供する。
上記技術的課題を解決するために、本発明の第１１の態様の技術手段は以下のとおりである。以上に記載のＨＥＲ２に対する二重特異性抗体、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体薬物複合体、及び二重特異性抗体を含む医薬組成物を含むキットＡと、ＨＥＲ２又は他の標的を標的とする他の抗体、二重特異性抗体、遺伝子組換え細胞又は医薬組成物を含むキットＢとを含むキット組み合わせを提供する。前記キットＡとキットＢは、順不同で使用され、キットＡを使用してからキットＢを使用するか、又はキットＢを使用してからキットＡを使用する。
本発明の上記ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体、上記免疫複合体及び上記医薬組成物又は上記キット組み合わせは、関連腫瘍を治療するために患者に投与することができる。
本発明において、本発明のＨＥＲ２認識抗体又はその抗原結合部分又はそれらの混合物、又はその抗原結合部分を含む治療用免疫細胞は、また、化学療法薬及び／又は他の抗体と併用することができるため、本発明の組成物は、化学療法薬及び／又は他の抗体をさらに含むことができる。
本発明において、上記化学療法薬は、アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シクロホスファミド及びタキサン系［パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）］、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、タモキシフェン、アロマターゼ阻害剤（アナストロゾール、フェマーラ錠、アロマシン錠）、５－ＦＵプラスフォリン酸、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、エストラムスティング、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ）、プレドニゾン、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ）など、又はそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
本分野の常識に合致した上で、上記各好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の好ましい各実例を得ることができる。
本発明で使用される試薬及び原料は、全て市販されている。
本発明の積極的で進歩性のある効果は、トラスツズマブの軽鎖可変領域、ペルツズマブの重鎖可変領域、トラスツズマブの重鎖可変領域の指定されたアミノ酸を突然変異させることにより、親和性が高く、安定性に優れて、腫瘍細胞殺傷活性が強く、ＡＤＣＣ活性が高い二重特異性モノクローナル抗体を得ることである。
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５ｗとペルツズマブとの比較であり、Ｂがトラスツズマブとペルツズマブとの比較である。 二重特異性モノクローナル抗体のタンパク質電気泳動図を示す。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の細胞結合活性を示す。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７（Ａ）及びＭＣＦ－７（Ｂ）細胞に対するエンドサイトーシスの結果を示す。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－Ａの結果であり、ＢがＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＣがＫＪ０１５－Ｃの結果であり、ＤがＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＢＴ４７４細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－Ａの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＢとＫＪ０１５－Ｃの結果であり、ＣがＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＳＫ－ＢＲ－３細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－Ａの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＢとＫＪ０１５－Ｃの結果であり、ＣがＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－ＡとＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＣとＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＣａｌｕ－３細胞に対する増殖阻害活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－ＡとＫＪ０１５－Ｃの結果であり、ＢがＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＣがＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＪＩＭＴ－１細胞に対するＡＤＣＣ活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－ＡとＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＣとＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＳＫ－ＢＲ－３細胞に対するＡＤＣＣ活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－ＡとＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＣとＫＪ０１５－Ｄの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対するＡＤＣＣ活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－ＡとＫＪ０１５－Ｂの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＣとＫＪ０１５－Ｄの結果である。ＣがＫＪ０１５－Ｅの結果である。 ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞に対するＡＤＣＣ活性の結果を示し、ＡがＫＪ０１５－Ａ～ＫＪ０１５－Ｃの結果であり、ＢがＫＪ０１５－ＤとＫＪ０１５－Ｅの結果である。
以下、具体的な実施形態により本発明の技術手段をさらに説明する。当業者であれば、実施例は、本発明を理解するためのものに過ぎず、本発明を具体的に限定するものと見なすべきではないことを理解すべきである。
以下の実施例では、具体的な条件を明記していない実験方法は、通常の方法及び条件、又は製品マニュアルに従って行われる。
（実施例１）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の構築と発現
全遺伝子合成によりトラスツズマブ重鎖（ｋｎｏｂ構造を含む）、ペルツズマブ重鎖（ｈｏｌｅ構造を含む）及びトラスツズマブ軽鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）をコードするＤＮＡ断片を合成し、構築された発現ベクターにそれぞれクローニングし、発現ベクターは、
１）選択マーカーとしてのグルタミンシンテターゼ遺伝子、又は重鎖選択マーカーとしてのネオマイシン耐性遺伝子と、
２）ｏｒｉである複製起点と、
３）このプラスミドが大腸菌で複製することを可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点と、
４）大腸菌にアンピシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ遺伝子と、
５）ヒトサイトメガロウイルスからの最初期エンハンサー及びプロモーターと、
６）ヒト１－免疫グロブリンポリアデニル化（「ｐｏｌｙ Ａ」）シグナル配列との要素で構成され、
上述したように、遺伝子合成により、重鎖又は軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子を製造し、ｐＵＣ５７（Ａｍｐ）プラスミドにクローニングする。Ｈｉｎｄ ＩＩＩとＥｃｏＲＩを用いて、重鎖遺伝子を含むｐＵＣ５７（Ａｍｐ）プラスミド、軽鎖遺伝子を含むｐＵＣ５７（Ａｍｐ）プラスミド、及び対応する発現プラスミドを酵素切断し、それぞれ重鎖と軽鎖を対応するプラスミドに指向的にクローニングする。酵素切断と連結の操作は、市販のキットの説明書に従って行われる。
上記構築されたトラスツズマブ重鎖、ペルツズマブ重鎖及び軽鎖発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性クローンを取り出して５００ｍｌのＬＢ培地に接種し増殖する。Ｑｉａｇｅｎ社の超高純度プラスミド精製キット（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、メーカーの説明書に従ってＤＮＡを抽出し精製する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のリポフェクション法キットを用いて、上記重鎖と軽鎖コーディング配列を含むプラスミドＤＮＡを１：１：２～１：１：４の割合でＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣから購入されたチャイニーズハムスター卵巣細胞）に共導入し、操作は、メーカーの説明書に従って行われる。
導入の２４～４８時間後、細胞培地を選択薬含有の選択培地に変換し、細胞クローンを形成するまで３～４日ごとに選択培地を変換する。細胞クローンの直径が１～２ｍｍになると、クローニングリングを用いてプレートからモノクローンを取り出し、２４ウェルプレートに移す。単一細胞クローンが２４ウェルプレートでウェルプレートの５０～７０％を満たすように成長すると、各クローンの培養上清を取ってＥＬＩＳＡ検出を行い、発現量が高くかつ成長状態が良好な細胞を選択して増殖培養を行う。
上記ＥＬＩＳＡ検出方法として、トラスツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））、ペルツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））をそれぞれコーティング液（ｐＨ９．６ ＣＢＳ）で特定の濃度（２μｇ／ｍｌ）に希釈して９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルでコーティングし、２～８℃で一晩置く。ウェル内の液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水後に３００μｌ／ウェルのブロッキング液（１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を添加し、室温で２ｈｒ置き、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水する。標準品のトラスツズマブ、ペルツズマブを希釈液ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈し、１００ｎｇ／ｍＬから２倍希釈して７つの勾配濃度のサンプルを得る。発現上清を状況に応じて適切に希釈し、１００μｌ／ウェルの重複ウェルで９６ウェルプレートにアプライし、３７℃で１ｈｒインキュベートし、溶液を廃棄し、プレートを３回洗浄し、脱水する。酵素結合抗体（ＨＲＰ－ヒトＩｇＧγに対する軽鎖特異的抗体、Ｔｈｅｒｍｏ）を希釈液で特定の濃度（１：２０００）に希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１ｈｒ反応させ、溶液を廃棄し、プレートを３～６回洗浄し、脱水する。基質混合液を調製し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートする。反応終了液を５０μｌ／ウェルで添加して、反応を停止する。４９０ｎｍでの吸収値ＯＤを読み取り、標準曲線に従ってサンプルの含有量を計算する。
最後に、野生型ＫＪ０１５ｗ抗体発現細胞株を得る。各細胞株をＣＤ２基本培地（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））で１００ｍｌの容量まで増殖させ、流加培養を行い、３日目から毎日２％のＦｅｅｄ４（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を補充する。１２日浮遊培養した後、それぞれ培養上清を収集し、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、二重特異性モノクローナル抗体タンパク質サンプルを得る。
（実施例２）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体とＨＥＲ２との親和性測定
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて、単一標的のＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブ、ペルツズマブ、及びＨＥＲ２二重特異性抗体ＫＪ０１５ｗと３種類のＨＥＲ２抗原との親和性を測定する。
まず、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＡＨＣ）抗体をＣＭ５チップに結合し、次に、ＡＨＣで測定対象の抗体ＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）を捕捉して、異なる濃度の３種類の抗原分子がＩｇＧを捕捉したチップ表面を流れるようにし、ＨＥＲ２抗体と異なる濃度の抗原との結合活性を検出して、得られたデータをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェアによってフィッティングして、正確な動力学定数を得て、その比較結果を表２に示す。
（表２）
抗体ＫＪ０１５ｗと３種類のＨＥＲ２抗原との親和性の測定結果
Figure 2022527652000003
トラスツズマブ、ペルツズマブ及びＨＥＲ２に対する二重特異性抗体ＫＪ０１５ｗは、いずれもＨＥＲ２膜外ドメイン全長抗原に結合でき、ＨＥＲ２に対する二重特異性抗体ＫＪ０１５ｗは、ペルツズマブＨＥＲ２特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を認識するだけでなく、トラスツズマブＨＥＲ２特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を認識することができる。しかしながら、ペルツズマブＨＥＲ２特異的抗原との親和性はペルツズマブより２桁低い。
（実施例３）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の細胞増殖阻害活性の検出
ＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞培養フラスコを３７℃で、５％の二酸化炭素恒温培養器に入れて静置培養を行い、毎日に培地の色及び細胞のコンフルエントを観察し、細胞の倍加時間を記録する。２～４日ごとに細胞に継代培養を行う。細胞がフラスコの約８０％を満たすと、消化及びプレートへの接種を行う。培地を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して消化する。細胞をピペッティングして遠心管に収集して、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離する。上清を廃棄し、完全培地を添加して細胞を再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を取って計数する。２％ＦＢＳ含有培地で細胞密度を１×１０５個／ｍＬに調整し、ウェルあたり１００μＬで９６ウェルプレートに接種する。
２％ＦＢＳ含有培地で測定対象の薬剤を希釈し、まず、測定対象の薬剤を１５０μｇ／ｍＬに希釈し、４倍の勾配で８回希釈して、９つの濃度勾配の薬剤を得て、最後の点を陰性対照点とする。細胞によって抗体初期濃度が異なり、詳細については、結果図の初期濃度点を参照する。１００μＬの希釈した薬剤を細胞が接種されている９６ウェルプレートの対応するウェルに添加して、各点に２つの重複ウェルがある。９６ウェルプレートを二酸化炭素培養器に入れ、９６～１２０時間インキュベートし、反応させる。
インキュベートが終了した後、９６ウェルプレートにＣＣＫ８試薬（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を２０μＬ／ウェルで添加し、マイクロプレートシェーカーで振とうして均一に混合する。染色後の０．５～６時間に、マイクロプレートリーダーでＯＤ ４５０ｎｍの吸光度の値を読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、生のデータに対してカーブフィッティング分析を行う。
抗体の増殖に対する阻害活性の結果（図１Ａ）は、ＫＪ０１５ｗがＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞に対して増殖阻害活性を有することを示す。
（実施例４）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の構築と発現
全遺伝子合成により軽鎖変異体をコードする３種類のＤＮＡ断片を合成し［ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列に、それぞれＦ５３Ｙ（Ｍ１）、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ（Ｍ２）、Ｐ９６Ｙ（Ｍ３）からなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う］、構築された抗体の重鎖及び軽鎖発現ベクターにそれぞれクローニングする。
上記構築されたトラスツズマブ重鎖、ペルツズマブ重鎖及び軽鎖発現ベクターをそれぞれ大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、陽性クローンを取り出して５００ｍｌのＬＢ培地に接種し増殖する。Ｑｉａｇｅｎ社の超高純度プラスミド精製キット（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して、メーカーの説明書に従ってＤＮＡを抽出し精製する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のリポフェクション法キットを用いて、上記重鎖と軽鎖コーディング配列を含むプラスミドＤＮＡを特定の割合（１：１：２）でＣＨＯ－Ｋ１に共導入し、操作は、メーカーの説明書に従って行われる。
導入の２４～４８時間後、細胞培地を選択薬含有の選択培地に変換し、細胞クローンを形成するまで３～４日ごとに選択培地を変換する。細胞クローンの直径が１～２ｍｍになると、クローニングリングを用いてプレートからモノクローンを取り出し、２４ウェルプレートに移す。単一細胞クローンが２４ウェルプレートでウェルプレートの５０～７０％を満たすように成長すると、各クローンの培養上清を取ってＥＬＩＳＡ検出を行い、発現量が高くかつ成長状態が良好な細胞を選択して増殖培養を行う。
上記ＥＬＩＳＡ検出方法として、トラスツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））、ペルツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））をそれぞれコーティング液（ｐＨ９．６ ＣＢＳ）で特定の濃度（２μｇ／ｍｌ）に希釈して９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルでコーティングし、２～８℃で一晩置く。ウェル内の液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水後に３００μｌ／ウェルのブロッキング液（１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を添加し、室温で２ｈｒ置き、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水する。標準品のトラスツズマブ、ペルツズマブを希釈液ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈し、１００ｎｇ／ｍＬから２倍希釈して７つの勾配濃度のサンプルを得る。発現上清を状況に応じて適切に希釈し、１００μｌ／ウェルの重複ウェルで９６ウェルプレートにアプライし、３７℃で１ｈｒインキュベートし、溶液を廃棄し、プレートを３回洗浄し、脱水する。酵素結合抗体（ＨＲＰ－ヒトＩｇＧγに対する軽鎖特異的抗体、Ｔｈｅｒｍｏ）を希釈液で特定の濃度（１：２０００）に希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１ｈｒ反応させ、溶液を廃棄し、プレートを３～６回洗浄し、脱水する。基質混合液を調製し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートする。反応終了液を５０μｌ／ウェルで添加して、反応を停止する。４９０ｎｍでの吸収値ＯＤを読み取り、標準曲線に従ってサンプルの含有量を計算する。
最後に、野生型変異体ＫＪ０１５ｍ１、ＫＪ０１５ｍ２及びＫＪ０１５ｍ３抗体発現細胞株を得る。各細胞株をＣＤ２基本培地（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））で１００ｍｌの容量まで増殖させ、流加培養を行い、３日目から毎日２％のＦｅｅｄ４（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を補充する。１２日浮遊培養した後、それぞれ培養上清を収集し、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによって予備精製して、共通軽鎖を有する３つの二重特異性モノクローナル抗体タンパク質サンプルを得る（図２）。図２は、３つの二重特異性モノクローナル抗体のタンパク質純度がいずれも高いことを示す。
（実施例５）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体とＨＥＲ２との親和性検出
トラスツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））、ペルツズマブ特異的抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））、ＨＥＲ２全長抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））をそれぞれコーティング液（ｐＨ９．６ ＣＢＳ）で特定の濃度（２μｇ／ｍｌ）に希釈して９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルでコーティングし、２～８℃で一晩置く。ウェル内の液体を廃棄し、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水後に３００μｌ／ウェルのブロッキング液（１％ＢＳＡ ＰＢＳＴ）を添加し、室温で２ｈｒ置き、ＰＢＳＴで３回洗浄し、脱水する。標準品のトラスツズマブ、ペルツズマブを希釈液ＰＢＳ（ｐＨ７．０）で希釈し、２０００ｎｇ／ｍＬから３倍希釈して１０個の勾配濃度のサンプルを得て、１００μｌ／ウェルの重複ウェルで９６ウェルプレートにアプライし、３７℃で１ｈｒインキュベートし、溶液を廃棄し、プレートを３回洗浄し、脱水する。酵素結合抗体（ＨＲＰ－ヒトＩｇＧγに対する軽鎖特異的抗体、Ｔｈｅｒｍｏ）を希釈液で特定の濃度（１：２０００）に希釈し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１ｈｒ反応させ、溶液を廃棄し、プレートを３～６回洗浄し、脱水する。基質混合液を調製し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに添加し、３７℃で２０ｍｉｎインキュベートする。反応終了液を５０μｌ／ウェル添加して、反応を停止する。
（表３）
各ＨＥＲ２抗体とＨＥＲ２の異なるエピトープに対する抗原とのＥＬＩＳＡ親和性検出結果
Figure 2022527652000004
注：＊＊がＫＪ０１５ｗと比べると、Ｐ＜０．０１、＊＊＊がＫＪ０１５ｗと比べると、Ｐ＜０．００１。
表３の結果は、本発明の二重特異性抗体ＫＪ０１５ｍ１、ＫＪ０１５ｍ２及びＫＪ０１５ｍ３とペルツズマブ特異的抗原との結合親和性がいずれも野生型（即ち、ＫＪ０１５ｗ）の親和性よりも高い（Ｐ＜０．００１）ことを示す。本発明の二重特異性抗体は、トラスツズマブ特異的抗原との結合が、野生型との結合と同等であり、ＫＪ０１５ｍ３の親和性は、野生型の親和性よりわずかに優れている（Ｐ＜０．０１）。ＨＥＲ２全長抗原との結合試験では、ＫＪ０１５ｍ１、ＫＪ０１５ｍ２の親和性は野生型の親和性と同等であり、ＫＪ０１５ｍ３の親和性は、野生型の親和性より明らかに優れている（Ｐ＜０．００１）。
（実施例６）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の熱安定性検出
検出対象の抗体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅ染料（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を脱イオン水で４０×に希釈する。希釈したサンプルを１２．５μＬ取り、２．５μｌの４０×染料、５μＬの脱イオン水を添加し、ウェルあたり２０μｌで重複ウェルにローディングする。シーリングフィルムで封止した後にＰＣＲ装置に置き、２５℃で２分間、９５℃で２分間のＰＣＲ反応プログラムで反応させる。元の読み取り値を導出し、結果をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍに導入してカーブフィッティング分析を行う。検出した各サンプルのＴｍ値を表４に示し、結果は、Ｍ１～Ｍ３軽鎖変異体の熱安定性がいずれも良好であることを示す。
（表４）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の熱安定性データ
Figure 2022527652000005
（実施例７）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の重鎖修飾
軽鎖変異体Ｍ１～３を軽鎖として選択し、ペルツズマブの重鎖突然変異修飾を行う。Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３の混合軽鎖を用いて、ｋｕｎｋｅｌ技術で単一の重鎖テンプレートのターゲット領域にハイスループット突然変異を行って、突然変異領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３にあるライブラリー１と、突然変異領域がＨＣＤＲ２にあるライブラリー２との２つのライブラリーを構築する。それぞれスーパーコンピテントセルを電気的に形質転換し、増殖培養を行って、それぞれファージのライブラリー１とライブラリー２を得る。
抗原組換えタンパク質ＨＥＲ２ＥＣＤ（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））をｂａｉｔｓとして用いて、ｍａｘｉ－ｓｏｒｐ９６ウェルプレートの固相スクリーニングに基づいて、力価試験でファージが濃縮されているか否かを確認する。ライブラリー１とライブラリー２を用いてスクリーニングする。各ライブラリーのそれぞれの濃縮されたファージについて、４８個のモノクローンを選択して培養する。培養したファージを収集して、ＥＬＩＳＡ同定を行う。野生型抗体よりも親和性が高い陽性モノクローンを選択し、かつＤＮＡシークエンシングを行って、抗体配列を得る。
（実施例８）
候補配列の親和性定数の検出
実施例１のプラスミドに基づいて、重鎖及び軽鎖のコーディング配列のプラスミドＤＮＡを特定の割合（１：１）でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞株（Ｇｉｂｃｏ）に共導入し、操作は、Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標）トランスフェクションキットの説明書に従って行われる。導入後に、７～１０日培養し、培養上清を取って、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製して親和性定数の検出に用いる。
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００を用いて、単一標的ＨＥＲ２抗体とＨＥＲ２ＥＣＤ抗原（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））との親和性を測定する。まず、Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ Ｆｃ（ＡＨＣ）抗体をＣＭ５チップに結合し、ＡＨＣで測定対象の抗体ＩｇＧ（２μｇ／ｍｌ）を捕捉し、異なる濃度の３種類の抗原分子がＩｇＧを捕捉したチップ表面を流れるようにし、ＨＥＲ２抗体と異なる濃度の抗原との結合活性を検出して、得られたデータをＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェアによってフィッティングして、正確な動力学定数を得る。詳細な親和性定数の結果を表５に示す。親和性定数データによると、親和性が修飾されたペルツズマブ重鎖の親和性定数は、野生型ペルツズマブ重鎖に比べて２桁増加する。Ｄ１０２Ｅトラスツズマブ重鎖は、野生型トラスツズマブ重鎖に比べて、親和性が約３倍向上する。
（表５）
候補配列の親和性定数
Figure 2022527652000006
Figure 2022527652000007
注：表５の候補重鎖は、ペルツズマブ重鎖の可変領域配列に比べて、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３領域の突然変異のみが発生する。また、ＨＣＤＲ１の配列がいずれもＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。
（実施例９）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の調製
実施例１のプラスミドに基づいて、表７に従って抗体重鎖の遺伝子合成を行い、かつプラスミド抽出を行って対応する重鎖プラスミドを得る。同じ方法でＮ３０Ｓ Ｍ１軽鎖、Ｎ３０Ｓ Ｍ２軽鎖及びＤ１０２Ｅトラスツズマブ重鎖を構築する。Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標）の一過性トランスフェクションキットを用いて、上記重鎖と軽鎖コーディング配列を含むプラスミドＤＮＡを特定の割合（１：１：２）でＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ細胞株（Ｇｉｂｃｏ）に共導入し、操作は、Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標）トランスフェクションキットの説明書に従って行われる。導入後に、７～１０日培養し、培養上清を取って、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーによって精製して機能評価に用いる。精製した後、孔径０．２２μｍのメンブランフィルタを用いてサンプルを滅菌ろ過し、２～８℃で保存する。得られたサンプル情報を表６に示す。サンプルの保存中に、ＫＪ０１５－Ｅサンプルのみに沈殿現象が見られ、他のサンプルは透明であり、ＫＪ０１５－Ｅサンプルが不安定であることを示す。
（表６）
ＨＥＲ２二重特異性抗体配列の組み合わせ
Figure 2022527652000008
＃：重鎖の配列番号は、特許ＵＳ２０１７００２９５２９のＳＥＱ ＩＤ ＮＯに基づくものである。
（実施例１０）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の純度検出
サイズ排除クロマトグラフィー（中国薬典２０１０版第３部付録ＩＩＩＢ）によりＫＪ０１５抗体の純度検出を行う。親水性修飾シリカゲルを充填剤とし（ＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ ｍＡｂ ＨＲ、３００×７．８ｍｍ）、リン酸水素二ナトリウムとイソプロパノールの混合溶液（２８．４ｇのリン酸水素二ナトリウムを取り、精製水を添加して溶解し、８００ｍｌに希釈し、リン酸でｐＨを７．０に調節し、１０ｍｌのイソプロパノールを添加し、精製水で１Ｌに定容する）を流動相とし、流速を毎分０．７ｍｌとし、検出波長を２８０ｎｍとする。２０μｌの試料溶液を取り、液体クロマトグラフィーに注入して検出する。ピーク面積正規化法で抗体モノマーのピーク面積を計算する。ＵＳＰ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ及びＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公文書を参照し、ＰＡ８００ｐｌｕｓ機器を用いてＫＪ０１５サンプルのＣＥ－ＳＤＳ検出を行う。検出された各サンプルの純度値を表７に示す。各抗体の純度は高く、トラスツズマブ、ペルツズマブに近く、後続の活性評価に用いることができることが分かる。
（表７）
各検出対象の抗体サンプルの純度
Figure 2022527652000009
（実施例１１）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の熱安定性検出
検出対象の抗体をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに希釈し、ＳＹＰＲＯ ｏｒａｎｇｅ ｄｙｅ染料（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を脱イオン水で４０×に希釈する。希釈したサンプルを１２．５μＬ取り、２．５μｌの４０×染料、５μＬの脱イオン水を添加し、ウェルあたり２０μｌで重複ウェルにローディングする。シーリングフィルムで封止した後にＰＣＲ装置に置き、２５℃で２分間、９５℃で２分間のＰＣＲ反応プログラムで反応させる。元の読み取り値を導出し、結果をＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍに導入してカーブフィッティング分析を行う。検出された各サンプルのＴｍ値を表８に示す。各抗体のＴｍ値にはほとんど違いがなく、トラスツズマブ、ペルツズマブに近いことが分かる。
（表８）
各サンプルのＴｍ値
Figure 2022527652000010
（実施例１２）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の細胞結合活性
細胞培養フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素恒温培養器に入れて静置培養を行い、毎日に培地の色及び細胞のコンフルエントを観察し、細胞の倍加時間を記録する。２～４日ごとに細胞に継代培養を行う。細胞がフラスコの約８０％を満たすと、消化及びプレートへの接種を行う。培地を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して消化する。細胞をピペッティングして遠心管に収集して、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離する。上清を廃棄し、完全培地を添加して細胞を再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を取って計数する。ＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）で細胞を再懸濁し、細胞密度を３×１０６個／ｍＬに調整する。
２％ＦＢＳ含有培地で測定対象の薬剤を希釈し、まず、測定対象の薬剤を一定の濃度に希釈し、３倍の勾配で５回希釈して、６つの濃度勾配の薬剤を得る。細胞によって抗体初期濃度が異なり、詳細については、結果図の初期濃度点を参照する。１００μＬの再懸濁した細胞を取り、終濃度が３００ｎＭ～１ｎＭの検出対象の抗体を添加し、アイソタイプＩｇＧ（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標）を陰性対照とし、４℃で１時間インキュベートする。インキュベートが終了した後、予冷ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）で細胞を再懸濁し、抗ヒト蛍光二次抗体を添加し、４℃で半時間インキュベートする。インキュベートが終了した後、予冷ＰＢＳで３回洗浄し、検出装置に置いて検出する。
検出結果（図３）は、ＫＪ０１５Ａ～Ｄサンプルがいずれも結合活性を有し、トラスツズマブより高く、トラスツズマブ＋ペルツズマブの混合サンプルの結果と同等であることを示す。
（実施例１３）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のエンドサイトーシス活性
細胞培養フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素恒温培養器に入れて静置培養を行い、毎日に培地の色及び細胞のコンフルエントを観察し、細胞の倍加時間を記録する。２～４日ごとに細胞に継代培養を行う。細胞がフラスコの約８０％を満たすと、消化及びプレートへの接種を行う。培地を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して消化する。細胞をピペッティングして遠心管に収集して、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離する。上清を廃棄し、完全培地を添加して細胞を再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を取って計数する。ＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）で細胞を再懸濁し、細胞密度を３×１０６個／ｍＬに調整する。
１００μＬの再懸濁した細胞を取り、終濃度が１０μｇ／ｍＬ（ＮＣＩ－Ｎ８７）、５０μｇ／ｍＬ（ＭＣＦ－７）の検出対象の抗体を添加し、アイソタイプＩｇＧ（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を陰性対照とし、４℃で１時間インキュベートする。予冷ＰＢＳで３回洗浄し、１００μＬの完全培地で細胞を再懸濁し、３７℃の細胞培養器に入れて１時間インキュベートする。インキュベートが終了した後、予冷ＰＢＳで３回洗浄し、５０μＬのＰＢＳ（１％ＢＳＡ含有）で細胞を再懸濁し、抗ヒト蛍光二次抗体を添加し、４℃で半時間インキュベートする。インキュベートが終了した後、予冷ＰＢＳで３回洗浄し、検出装置に置いて検出する。エンドサイトーシス（％）＝１－（ＭＦＩある時点の試料処理群－ＭＦＩ該時点の対照ｈＩｇＧ）／（ＭＦＩ０時間の試料処理群－ＭＦＩ０時間の対照ｈＩｇＧ）×１００％に従って各検出対象抗体の各時点のエンドサイトーシス率を計算して作図する。
エンドサイトーシス結果を図４に示し、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞で、４つのサンプルのエンドサイトーシス効率はいずれもトラスツズマブとトラスツズマブ＋ペルツズマブのエンドサイトーシス効率の間にあり、ＭＣＦ－７細胞に対して、ＫＪ０１５－Ａサンプルの活性は、トラスツズマブ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブよりわずかに低く、ＫＪ０１５－Ｂサンプルの活性は、この２つの抗体の活性と同等であり、ＫＪ０１５－Ｃ、ＫＪ０１５－Ｄサンプルの活性は、トラスツズマブ、及びトラスツズマブ＋ペルツズマブの併用の場合の活性より高い。
（実施例１４）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体の増殖阻害活性
細胞増殖阻害方法を用いて、異なる変異体のＨＥＲ２に対する抗体が、ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞の発現を阻害することを評価し、使用する細胞株を表９に示す。
細胞培養フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素恒温培養器に入れて静置培養を行い、毎日に培地の色及び細胞のコンフルエントを観察し、細胞の倍加時間を記録する。２～４日ごとに細胞に継代培養を行う。細胞がフラスコの約８０％を満たすと、消化及びプレートへの接種を行う。培地を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して消化する。細胞をピペッティングして遠心管に収集して、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離する。上清を廃棄し、完全培地を添加して細胞を再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を取って計数する。２％ＦＢＳ含有培地で細胞密度を１×１０５個／ｍＬに調整し、ウェルあたり１００μＬで９６ウェルプレートに接種する。
２％ＦＢＳ含有培地で測定対象の薬剤を希釈し、まず、測定対象の薬剤を２０～６０００μｇ／ｍＬに希釈し、２．２～３倍の勾配で８～１０回希釈して、９～１１つの濃度勾配の薬剤を得て、最後の点を陰性対照点とする。細胞によって抗体初期濃度が異なり、詳細については、結果図の初期濃度点を参照する。１００μＬの希釈した薬剤を細胞が接種されている９６ウェルプレートの対応するウェルに添加して、各点に２つの重複ウェルがある。９６ウェルプレートを二酸化炭素培養器に入れ、９６～１２０時間インキュベートし、反応させる。
インキュベートが終了した後、９６ウェルプレートにＣＣＫ８試薬（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を２０μＬ／ウェルで添加し、マイクロプレートシェーカーで振とうして均一に混合する。染色後の０．５～６時間に、マイクロプレートリーダーでＯＤ ４５０ｎｍの吸光度の値を読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、生のデータに対してカーブフィッティング分析を行う。
（表９）
細胞増殖阻害率
Figure 2022527652000011
ＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞増殖阻害活性の結果（図５）は、Ａ～ＤサンプルがいずれもＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞の増殖を阻害でき、いずれも用量依存的であり、増殖阻害活性がトラスツズマブより明らかに高いことを示す。ＫＪ０１５－Ａ、Ｂサンプルの活性は、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の活性と同等であり、ＫＪ０１５－Ｃ、Ｄサンプルの最大阻害率は、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の最大阻害率の１．１倍であり、ＫＪ０１５－ＤサンプルのＥＣ５０値は、１．５μｇ／ｍｌであり、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用サンプルの２．３μｇ／ｍｌより低い。
ＢＴ４７４細胞増殖阻害活性の結果（図６）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤがＢＴ４７４細胞の増殖を阻害でき、いずれも用量依存的であることを示す。そのサンプルの増殖阻害活性は、トラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合より明らかに優れており、最大阻害率は、いずれもトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の最大阻害率の約１．２倍である。
ＳＫ－ＢＲ－３細胞増殖阻害活性の結果（図７）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤがＳＫ－ＢＲ－３細胞の増殖を阻害でき、いずれも用量依存的であることを示す。そのサンプルの増殖阻害活性は、トラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合より明らかに優れており、最大阻害率は、いずれもトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の最大阻害率の約２．２倍である。
ＮＣＩ－Ｎ８７細胞増殖阻害活性の結果（図８）は、４つの候補抗体のＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対する殺傷活性が基本的に同等であり、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対する最大殺傷率がいずれもトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合より高く、最大阻害率がいずれもトラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の最大阻害率の約１．６～１７倍であることを示す。
Ｃａｌｕ－３細胞増殖阻害活性の結果（図９）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤがＣａｌｕ－３細胞の増殖を阻害でき、いずれも用量依存的であることを示す。そのサンプルの増殖阻害活性は、トラスツズマブより明らかに高く、トラスツズマブ＋ペルツズマブ併用の場合の増殖阻害活性の約１．２倍である。
（実施例１５）
ヒトＨＥＲ２の異なるエピトープに対する二重特異性抗体のＡＤＣＣ活性
細胞培養フラスコを３７℃、５％の二酸化炭素恒温培養器に入れて静置培養を行い、毎日に培地の色及び細胞のコンフルエントを観察し、細胞の倍加時間を記録する。２～４日ごとに細胞に継代培養を行う。細胞がフラスコの約８０％を満たすと、消化及びプレートへの接種を行う。培地を廃棄し、ＰＢＳで１回洗浄し、０．２５％のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）を添加して消化する。細胞をピペッティングして遠心管に収集して、５００ｇで３ｍｉｎ遠心分離する。上清を廃棄し、完全培地を添加して細胞を再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を取って計数する。２％ＦＢＳ含有培地で細胞密度を２．５～７．５×１０５個／ｍＬに調整し、ウェルあたり１００μＬで９６ウェルプレートに接種する。
９６ウェルプレートで一晩培養した後、アプライする。１％ＦＢＳ含有培地で測定対象の薬剤を希釈し、まず、測定対象の薬剤を７５～３００μｇ／ｍＬに希釈し（細胞によって初期濃度を調整できる）、４～５倍の勾配で８回希釈して、９つの濃度勾配の薬剤を得て、最後の点を陰性対照点とする。細胞によって抗体初期濃度が異なり、詳細については、結果図の初期濃度点を参照する。２５μＬの希釈した薬剤を細胞が接種されている９６ウェルプレートの対応するウェルに添加して、各点に２つの重複ウェルがある。エフェクター細胞Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ／ＣＤ１６ａを１６４０＋１％ＦＢＳで１～３×１０６／ｍＬに希釈し、各ウェルに２５ｕＬを添加する。（細胞によってエフェクター細胞数を調整できる）９６ウェルプレートの縁部に十分な滅菌水を添加した後、９６ウェルプレートを二酸化炭素培養器に入れ、４～６時間インキュベートし、反応させる。
インキュベートが終了した後、検出対象の細胞を培養器から取り出し、室温（２２℃～２５℃）で少なくとも１５ｍｉｎ置いてから、室温でインキュベートしたルシフェラーゼ試薬（Ｒｈｉｎｏｇｅｎ（登録商標））を９６ウェルプレートに７５μＬ／ウェルで添加し、マイクロプレートシェーカーで振とうして均一に混合し、室温で３～５ｍｉｎ置き、マイクロプレートリーダーで蛍光値を読み取る。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを用いて、生のデータに対してカーブフィッティング分析を行う。
ＪＩＭＴ－１細胞ＡＤＣＣ活性の結果（図１０）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルがいずれもＡＤＣＣ活性を有し、かつ用量依存的であり、Ａサンプルの最大シグナル値がトラスツズマブの最大シグナル値の１．２倍で、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の最大シグナル値の１．２倍であり、Ｂサンプルの場合、１．３倍と１．２倍であり、Ｃサンプルの場合、１．５倍と１．３倍であり、Ｄサンプルの場合、１．５倍と１．３倍であることを示し、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルのＡＤＣＣ活性は、いずれもトラスツズマブ、トラスツズマブとペルツズマブ併用の場合より高いことを示す。
ＳＫ－ＢＲ－３細胞ＡＤＣＣ活性の結果（図１１）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルがいずれもＡＤＣＣ活性を有し、かつ用量依存的であり、Ａ～Ｄサンプルの最大シグナル値がそれぞれトラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の最大シグナル値の１．８倍、１．７倍、１．７倍、１．６倍であることを示し、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルのＡＤＣＣ活性は、いずれもトラスツズマブとペルツズマブ併用の場合より高いことを示す。
ＮＣＩ－Ｎ８７細胞ＡＤＣＣ活性の結果（図１２）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルがいずれもＡＤＣＣ活性を有し、かつ用量依存的であり、Ａ～Ｃサンプルの最大シグナル値がいずれもトラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の最大シグナル値の約１．２倍であることを示し、ＫＪ０１５－Ａ～ＣサンプルのＡＤＣＣ活性は、いずれもトラスツズマブとペルツズマブ併用の場合より高いことを示す。ＫＪ０１５－ＤサンプルのＡＤＣＣ活性は、トラスツズマブとペルツズマブ併用の場合のＡＤＣＣ活性と同等である。ＫＪ０１５－Ｅサンプルの活性の最大シグナル値は、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の最大シグナル値の０．９倍であり、ＥＣ５０値は、４６．０７ｎｇ／ｍｌであり、トラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の１０．１７ｎｇ／ｍｌとの差が明らかである。
ＭＤＡ－ＭＢ－１７５細胞ＡＤＣＣ活性の結果（図１３）は、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルがいずれもＡＤＣＣ活性を有し、かつ用量依存的であり、Ａ～Ｄサンプルの最大シグナル値がトラスツズマブとペルツズマブの併用の場合の最大シグナル値の約１．２倍、１．４倍、１．３倍、１．２倍であることを示し、ＫＪ０１５－Ａ～ＤサンプルのＡＤＣＣ活性は、いずれもトラスツズマブとペルツズマブ併用の場合より高いことを示す。ＫＪ０１５－ＥサンプルのＡＤＣＣ活性は、トラスツズマブとペルツズマブ併用の場合のＡＤＣＣ活性と同等である。
本発明の主に関与する配列を以下の表１０に示す。
（表１０）
本発明の抗体配列
Figure 2022527652000012
Figure 2022527652000013
以上、本発明の具体的な実施形態を説明したが、当業者であれば理解すべきこととして、これらは例に過ぎず、本発明の原理及び要旨を逸脱することなく、これらの実施形態に多様な変更又は修正を行うことができる。したがって、本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲によって決められる。

Claims (17)

  1. ＨＥＲ２の細胞外ドメインＩＩ及び細胞外ドメインＩＶを認識するための第１のタンパク質ドメイン及び第２のタンパク質ドメインを含み、前記第１のタンパク質ドメインは第１の重鎖と軽鎖を含み、前記第２のタンパク質ドメインは第２の重鎖と軽鎖を含み、前記第１の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列又はその突然変異アミノ酸配列に示される重鎖可変領域を含み、前記第２の重鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列又はその突然変異アミノ酸配列に示される重鎖可変領域を含み、前記軽鎖は軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列にＲ２４、Ｎ３０、Ｔ３１、Ａ３２、Ｆ５３、Ｌ５４、Ｓ５６、Ｒ６６、Ｈ９１、Ｔ９３、Ｔ９４及びＰ９６から選択される１つ以上の部位のアミノ酸置換を行う、ことを特徴とするＨＥＲ２に対する二重特異性抗体。
  2. 軽鎖可変領域において、前記アミノ酸置換は、元のアミノ酸残基を、Ｄ、Ｅ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ及びＲから選択されるアミノ酸残基で置換する、ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  3. 軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、Ｒ２４Ｋ、Ｎ３０Ｓ、Ｔ３１Ｉ、Ａ３２Ｇ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ、Ｓ５６Ｔ、Ｒ６６Ｇ、Ｈ９１Ｙ、Ｔ９３Ｉ、Ｔ９４Ｙ及びＰ９６Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を行い、好ましくは、Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ、Ｓ５６Ｔ及びＰ９６Ｙから選択される１つ以上のアミノ酸残基置換を行う、ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  4. 軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う、ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  5. 軽鎖定常領域をさらに含み、前記軽鎖定常領域は好ましくは、ヒト軽鎖定常領域λ軽鎖又はκ軽鎖であり、好ましくは、前記軽鎖は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う、ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  6. 第１の重鎖と第２の重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、前記重鎖定常領域は好ましくは、ヒト重鎖定常領域であり、好ましくは、第１の重鎖と第２の重鎖はヘテロ二量体を形成し、前記第１の重鎖と第２の重鎖は好ましくは、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ構造によって接続され、より好ましくは、前記第２の重鎖の重鎖定常領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示されるアミノ酸配列に、Ｄ１０２Ｅ突然変異が発生する、ことを特徴とする請求項１に記載の二重特異性抗体。
  7. 第１の重鎖の重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：６－１３に示されるＨＣＤＲ２、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１４－１９に示されるＨＣＤＲ３のＣＤＲ配列を含み、
    好ましくは、前記第１の重鎖の重鎖定常領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示されるＨＣＤＲ３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示されるＨＣＤＲ１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示されるＨＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示されるＨＣＤＲ３を含む、ことを特徴とする請求項１～６のいずれか１項の二重特異性抗体。
  8. フコース修飾を減少させ、好ましくは、フコース非修飾抗体である、ことを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体。
  9. 請求項１～７のいずれか１項に記載の二重特異性抗体又はその抗原結合部分をコードする塩基配列。
  10. 請求項９に記載の塩基配列を含む発現ベクター。
  11. 請求項１０に記載の発現ベクターを含む原核細胞又は真核細胞。
  12. 軽鎖可変領域を含み、前記軽鎖可変領域において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行い、好ましくは、軽鎖定常領域をさらに含み、前記軽鎖定常領域は好ましくは、ヒト軽鎖定常領域λ軽鎖又はκ軽鎖であり、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列に、（１）Ｆ５３Ｙ、（２）Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、（３）Ｐ９６Ｙ、（４）Ｎ３０Ｓ及びＦ５３Ｙ、（５）Ｎ３０Ｓ、Ｆ５３Ｙ、Ｌ５４Ｒ及びＳ５６Ｔ、又は（６）Ｎ３０Ｓ、Ｐ９６Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を行う、ことを特徴とする軽鎖。
  13. 抗体の調製における請求項１２に記載の軽鎖の応用であって、好ましくは、前記抗体がｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２又は全長抗体、又はモノクローナル抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体である、応用。
  14. 請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体と細胞毒性薬とで共有結合され、
    好ましくは、前記細胞毒性薬がチューブリン阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤又はＤＮＡ副溝阻害剤であり、
    より好ましくは、前記チューブリン阻害剤がマイタンシノイド化合物、オーリスタチン誘導体又はチューブリンであり、前記トポイソメラーゼ阻害剤がＤＸｄ又はその誘導体、ＳＮ－３８又はアドリアマイシン及びその誘導体であり、前記ＤＮＡ副溝阻害剤がカリケアミシン、デュオカルマイシン及びその誘導体、ピロロベンゾジアゼピン化合物又はインドリノベンゾジアゼピン化合物である、ことを特徴とするＨＥＲ２に対する二重特異性抗体薬物複合体。
  15. 好ましくは、ヒアルロニダーゼをさらに含み、より好ましくは、前記ヒアルロニダーゼがｒＨｕＰＨ２０又は修飾されたｒＨｕＰＨ２０であり、最も好ましくは、薬学的に許容される担体又は賦形剤をさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物。
  16. 前記重鎖をコードするヌクレオチド配列と前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列を同じベクター又は異なるベクターに構築するステップ（１）と、
    前記ステップで構築されたベクターを異なる宿主細胞又は同じ宿主細胞に発現させるステップ（２）とを含む、ことを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の二重特異性抗体の調製方法。
  17. 好ましくは、前記陽性腫瘍が乳癌、胃癌、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、食道癌、頭頸部癌、子宮内膜癌、悪性黒色腫、咽頭癌、口腔癌、皮膚癌を含み、より好ましくは、乳癌、胃癌及び肺癌である、ＨＥＲ２発現腫瘍を治療する医薬の調製における、請求項１～８のいずれか１項に記載のＨＥＲ２に対する二重特異性抗体、請求項１２又は１３に記載の軽鎖、請求項１４に記載のＨＥＲ２に対する二重特異性抗体薬物複合体、及び請求項１５に記載の二重特異性抗体を含む医薬組成物の応用。

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