CN110891970A - 用于预防或治疗癌症的amhrii结合化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗选自包括以下的癌症组的癌症的用途：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌和白血病。

Description

用于预防或治疗癌症的AMHRII结合化合物
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域。
背景技术
世界人口的主要死亡原因之一是癌症或恶性肿瘤，其中，死亡率排序是肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、乳腺癌和子宫颈癌。仅在美国，所有个人中的三分之一会患上癌症。尽管由于早期诊断和疗法的进步，五年存活率已显著提高了近百分之五十，但在美国，癌症仍然是仅次于心血管疾病的死因。百分之二十的美国人死于癌症，一半是由于肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌。此外，皮肤癌仍然对健康有害。
为癌症患者设计有效的治疗代表一项重大挑战。手术切除、外部束放射疗法和/或全身性化疗的当前方案在某些类型的恶性肿瘤中已部分成功，但在其他类型的恶性肿瘤中却未取得令人满意的结果。此外，这些方法通常具有不可接受的毒性。
放射和手术都遭受相同的理论缺陷。已经认识到，考虑到单个克隆源性的恶性细胞可以产生足够的后代来杀死宿主，必须消灭整个瘤细胞群。通常参见Goodman和Gilman的The Pharmacological Basis of Therapeutics(Pergamon Press，第8版)(第1202-1204页)。“彻底杀死细胞”这一概念意味着，如果要实现治愈，则对于手术方法必须将肿瘤完全切除，并且在放射方法中需要彻底摧毁所有癌细胞。实际上，这几乎是不可能的；实际上，在有转移的情况下，这是不可能的。
此外，传统的化学治疗性癌症治疗也很少导致肿瘤完全缓解，并且产生甚至中等响应所需的显著剂量水平通常伴随着不可接受的毒性。抗癌剂通常具有血液学副作用(例如，停止有丝分裂和分解骨髓和淋巴组织中的有形成分)和免疫抑制作用(例如，细胞计数降低)，以及对上皮组织(例如，肠粘膜)、生殖组织(例如，精子发生受损)和神经系统的严重影响。P.Calabresi和B.A.Chabner，In:Goodman和Gilman的The Pharmacological Basisof Therapeutics(Pergamon Press，第8版)(第1209-1216页)。高剂量水平和所得的毒性在很大程度上是由抗癌剂本身的靶特异性缺乏所引起的。该药物需要区分癌性的宿主细胞和非癌性的宿主细胞。在这个水平上，绝大多数的抗癌药物都是不加区别的，并且具有明显的固有毒性。抗癌医疗设备最近被称为检查点抑制剂的免疫疗法所丰富。那些产品(抗-PD1、抗-PDL1、抗-CTLA4)能够通过抵消癌细胞逃避免疫监视和杀死细胞的机制来解锁免疫系统。尽管事实是这些产品在多种癌症(如黑素瘤和肺癌)中产生了显著的长期效果，但响应者的比例仍处于中低水平，并且适应症的这个范围仍然相对受限(DM.Pardoll，NatureReview2012)。
仍需要对常规手术疗法、放射疗法和化学疗法的可替代疗法或补充抗癌疗法。此类有前途的替代疗法或补充疗法之一在于由通过治疗剂对肿瘤细胞表达的抗原的识别来特异性地靶向癌细胞。在2017年，此类肿瘤细胞特异性的治疗策略主要通过基于抗体的疗法双特异性抗体和基于CAR-T细胞的疗法为例证，其可以经工程化来增加免疫细胞参与，诸如NK和巨噬细胞(如糖-工程化的抗体)或诸如杀灭T-淋巴细胞(如CD3双特异性形式)。抗体也可以通过处于抗体药物缀合物(ADC)形式的各种细胞毒性剂武装。最后，T细胞本身可以经遗传工程化以直接识别肿瘤细胞并活化TCR信号传导(CAR-T细胞)。那些试剂越有效，对肿瘤选择性靶标的需求增加越多。
在过去的15年中，已经建立癌症的基于抗体的疗法，并且该疗法现在是用于治疗患有血液病学恶性肿瘤和实体瘤的患者的最成功和重要的策略之一。关键的挑战是识别适合于基于抗体的治疗剂的抗原。此类治疗剂可以通过以下起作用：介导抗原或受体功能(诸如激动剂或拮抗剂功能)的改变，调节免疫系统(例如，改变Fc功能和T细胞活化)或递送缀合至靶向特异性抗原的抗体的特异性药物(Van den Eynde,B.J.&Scott,A.M.Encyclopedia of Immunology(编辑Roitt,D.P.J.&Roitt,I.M.)2424-2431(AcademicPress，伦敦，1998)，Scott,A.M.等人A Phase I clinical trial with monoclonalantibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growthfactor receptor.Proc.Natl Acad.Sci.USA 104,4071-4076(2007)，Hughes,B.Antibody-drug conjugates for cancer:poised to deliver？Nature Rev.Drug Discov.9,665-667(2010).,Weiner,L.M.,Surana,R.&Wang,S.Monoclonal antibodies:versatileplatforms for cancer immunotherapy.Nature Rev.Immunol.10,317-327(2010))。可以改变抗体药代动力学、效应物功能、尺寸和免疫原性的分子技术已成为开发新的基于抗体的疗法的关键要素。来自癌症患者中的抗体的临床试验的证据表明，迭代方法对于选择抗原靶标和最佳抗体(包括抗体的亲和力(affinity)和亲合力(avidity)、抗体构建体的选择、治疗方法(诸如信号传导消除或免疫效应物功能))的重要性以及在早期临床试验中严格检查抗体的药代动力学和药效动力学性质的需要。这篇综述总结了将单克隆抗体(mAb)转化为供人使用的试剂所必需的步骤、抗体在治疗癌症患者中的成功、靶标和构建体选择的挑战、以及免疫系统在抗体疗法中的关键作用。自1986年首次将治疗性单克隆抗体商业化以来，该类生物制药产品已显著增长，因此，截至2014年底，已有47种单克隆抗体在美国或欧洲获得批准，特别是用于治疗癌症。预计到2020年在市场上将有约70种单克隆抗体。
CAR-T细胞疗法基于制造嵌合性抗原T细胞受体(CAR)。嵌合性抗原受体是经遗传工程化的受体，其将新的特异性移植至免疫效应细胞上。这些通常用于将单克隆抗体的特异性移植至T细胞上。正在研究CAR-T细胞作为癌症的疗法。通常，CAR-T疗法涉及在其细胞膜上表达嵌合性抗原受体的经工程化的T细胞的输注。该受体包括经设计以识别特异性肿瘤抗原的外部靶标结合结构域和当CAR-T结合抗原靶标时负责活化T细胞的内部活化结构域。用于治疗癌症的CAR-T临床试验显示出在严重的癌症形式中高达94％的很大缓解率，这尤其令人印象深刻，考虑到大多数试验招募的患者均未对其癌症形式的所有其他可用治疗做出响应。到2017年为止，已进行了约300项CAR-T临床试验。
在本领域中仍然需要用于癌症疗法的其他工具，所述工具可以替代或补充用于治疗特定种类的癌症的现有疗法。
发明内容
本发明涉及人AMHRII结合剂在用于预防或治疗非妇科癌症的方法中的用途。
特别地，本发明涉及人AMHRII结合剂在用于预防或治疗选自包括以下的癌症组的非妇科癌症的方法中的用途：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。结肠癌涵盖结肠直肠癌。肾癌涵盖肾细胞癌。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由抗AMHRII单克隆抗体构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由抗体药物缀合物(ADC)构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由AMHRII结合工程化受体构成。
在一些实施方式中，所述人AMHRII结合剂由表达AMHRII结合工程化受体的细胞构成，该细胞诸如表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞或NK T细胞。
本发明还涉及用于确定个体是否适合于如上限定的使用AMHRII结合剂的癌症治疗(即，个体是否对如上限定的使用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应)的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
因此，本发明还涉及用于确定个体是否对如上限定的使用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
附图说明
图1示出3C23单克隆抗体的多个变体的VH结构域和VL结构域的氨基酸序列。图1A示出每种抗体变体的VH结构域。图1B示出每种抗体变体的VL结构域。
图2示出各种癌细胞系的AMHRII表达。
图2A示出癌细胞系的AMHRII mRNA表达。横坐标：从图2A的左至右：HCT116(结肠结肠直肠癌)、COV434-WT(人卵巢粒层细胞肿瘤)、K562(人骨髓性白血病)和OV90(人恶性乳头状浆液性腺癌)。纵坐标：如通过RT-qPCR测定的AMHRII mRNA表达水平，以任意单位(RQ)表示。
图2B至图2F：通过与图2A相同的癌细胞系的AMHRII蛋白膜表达：HCT116(图2B)，COV434-WT(图2C)，K562(图2D)，NCI-H295R(图2E)和OV90(图2F)。横坐标：以任意单位表示的荧光信号强度(FL2-A染料)。纵坐标：细胞计数。
图3示出在各种人肿瘤原发性组织样品中的AMHRII表面表达。横坐标：癌症类型；图3的左至右：结肠癌、肝癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌。纵坐标：AMHRII阳性指数由AMHRII总体评分≥1.5定义。通过细胞质评分+膜评分的平均值确定该总组织学评分。这些评分中的每一个都使用频率×强度评分的平均值(0至3)。频率定义为表达AMHRII的细胞的百分比，并且强度通过以下评分系统分类为肿瘤细胞膜或细胞质的明确棕色标记：标记强度定义为0(对于阴性)，1(对于弱)，2(对于中等)和3(对于强，如COV434阳性对照中所示)；位于每个条上方的数字：经测试的人群中相应癌症的AMHRII表达频率。
图4示出通过各种人肿瘤异种移植物的AMHRII表面表达。横坐标，图4的左至右：白血病、骨肉瘤、胃肠癌、脑癌、肉瘤、黑素瘤、胸膜间皮瘤、脂肪肉瘤、睾丸癌、结肠癌、肾癌。纵坐标：如以任意单位表示的AMHR2总评分。
图5示出3C23K抗体针对PDX模型人肝癌(HCC)的体内抗肿瘤活性。横坐标：如以天表示的治疗开始后的时间段。纵坐标：如以mm3表示的肿瘤体积。●：媒介物；
Figure BDA0002320262930000064
剂量为20mg/kg的3C23K抗体；■：剂量为50mg/kg s的3C23K抗体；
Figure BDA0002320262930000061
使用剂量为50mg/kg的索拉非尼的对比治疗。纵坐标：如以mm3表达的肿瘤体积。横坐标：●：媒介物；
Figure BDA0002320262930000065
剂量为20mg/kg的3C23K抗体；■：剂量为50mg/kg的3C23K抗体；
Figure BDA0002320262930000062
剂量为50mg/kg的索拉非尼。
图6示出由如PCT申请No.WO 2017/025458中公开的3C23K抗体细胞毒性缀合物(称为GM103)构成的抗体药物缀合物(ADC)针对PDX模型人肝癌(HCC)的体内抗肿瘤活性。横坐标：如以天表示的治疗开始后的时间段。纵坐标：如以mm3表示的肿瘤体积。●：媒介物；
Figure BDA0002320262930000063
剂量为1mg/kg的GM103ADC；
Figure BDA0002320262930000066
剂量为5mg/kg的GM103 ADC；■剂量为10mg/kg的GM103 ADC；
图7示出如由流式细胞术(FACS)测量的源自患有结肠直肠癌的四名患者的肿瘤样品的肿瘤细胞(图7A；图7B，图7C，图7D)的AMHRII膜表达。横坐标：以任意单位表示的荧光信号强度(FL2-A染料)。纵坐标：细胞计数。在图7A、图7B、图7C、图7D中：(i)左侧峰：用无关的同种型抗体孵育的细胞；(ii)右侧峰：用3C23K抗AMHRII抗体孵育的细胞。
图8：示出如通过流式细胞术(FACS)测量的小鼠中四种不同的结肠直肠癌人异种移植物(图8A、图8B、图8C、图8D)的AMHRII膜表达。横坐标：如以任意单位表示的荧光信号强度(FL2-A染料)。纵坐标：细胞计数。在图8A、图8B、图8C、图8D中：(i)左侧峰：用无关的同种型抗体孵育的细胞；(ii)右侧峰：用3C23K抗AMHRII抗体孵育的细胞。
图9：示出如通过流式细胞术(FACS)测量的源自患有肾细胞癌的两名患者的肿瘤样品的肿瘤细胞(图9A；图9B)的AMHRII膜表达。横坐标：如以任意单位表示的荧光信号强度(FL2-A染料)。纵坐标：细胞计数。在图9A、图9B中：(i)左侧峰：用无关的同种型抗体孵育的细胞；(ii)右侧峰：用3C23K抗AMHRII抗体孵育的细胞。
图10示出抗AMHRII抗体GM102针对人结肠直肠癌(CRC)的PDX模型的体内抗肿瘤活性。横坐标：如以天表示的治疗开始后的时间段。纵坐标：如以mm3表示的肿瘤体积。●：媒介物；■：剂量为20mg/kg的GM102；
Figure BDA0002320262930000071
剂量为100mg/kg的伊立替康。
具体实施方式
本发明人出乎意料地表明，AMHRII(AMH受体)在多种非妇科癌症组织的细胞膜处表达。
术语“AMHR-II”表示人抗苗勒激素II型受体。人AMHR-II的序列在本文中描述为SEQ ID NO.18(缺少信号肽MLGSLGLWALLPTAVEA(SEQ ID NO:17)。
如本文所用，“非妇科”癌症涵盖术语“妇科”癌症未涵盖的任何癌症。
如本文所用，“妇科”癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养层细胞疾病癌(绒毛膜癌)、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和输卵管癌。
那么，如本文所用，“非妇科”癌症由以下癌症组成：该癌症不由选自由卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、妊娠滋养层细胞疾病癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和输卵管癌组成的组的癌症组成。
如本文所用，术语“PDX”为表述“患者来源的异种移植物”的首字母缩写。患者来源的异种移植物是高度使用的癌症体内模型，尤其是人癌症的体内模型，其中将来自患者肿瘤的组织或细胞植入(即“移植”)到免疫缺陷的非人哺乳动物(例如免疫缺陷小鼠)体内。
如本文的示例所示，本发明人发现AMHRII在非妇科癌症组织的细胞膜处表达，可变频率取决于所考虑的非妇科癌症类型。说明性地，如本文的示例中所示，与来源于源自患有头颈癌的患者的肿瘤组织的癌细胞相比，AMHRII更频繁地由来源于源自患有肾上腺皮质癌的患者的肿瘤组织的癌细胞表达。这意味着这两种类型的癌症都适合于靶向AMHRII的抗癌治疗，但是此类抗癌治疗对于治疗患有头颈癌的患者是较不频繁地相关的。
如本文的示例所示，任何非妇科癌症(例如肝癌、结肠直肠癌或肾癌)都可以通过AMHRII结合剂治疗，前提是来自所述非妇科肿瘤的肿瘤细胞在其膜处表达AMHRII，因此前提是可以根据任何方法检测或确定肿瘤细胞膜处AMHRII蛋白的存在。
因此，本文的示例中提供的实验数据表明，相同的AMHRII结合剂(此处为抗AMHRII单克隆抗体)对于治疗多种不同种类的癌症都是有效的，前提是AMHRII靶蛋白在肿瘤细胞膜处表达。
顺便提及，在由靶结合分子(例如靶结合抗体)构成的抗癌活性成分的领域中，其中相同活性成分对治疗多种不同癌症有效的情况并非前所未有。说明性地，名为派姆单抗的抗PD1抗体已被美国食品和药品管理局(FDA)授权为可用于治疗多种不同种类的癌症的活性成分，前提是所述癌症共有相同的生理特征。
因此，当检测到或以其他形式通过适当的方法确定先前从患有非妇科癌症的个体收集的肿瘤细胞的AMHRII膜表达时，可以用如本文所述的AMHRII结合剂治疗所述个体的所述癌症。
在一些实施方式中，在癌细胞的细胞膜处表达AMHRII涵盖了所述癌细胞以给定的可定量水平或以高于所述可定量水平的水平表达AMHRII。
因此，根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有非妇科癌症的个体收集的样品的非妇科癌细胞是否在其膜处表达AMHRII，可以评估所述个体对AMHRII结合分子治疗的响应性。
根据一些实施方式，通过确定来自先前从患有非妇科癌症的个体收集的样品的非妇科癌细胞是否在其膜处高于确定的阈值表达AMHRII，可以评估所述个体对AMHRII结合分子治疗的响应性。
可以在一些实施方式中用于确定患有非妇科癌症的患者对AMHRII结合剂(例如抗AMHRII抗体)治疗的响应性的AMHRII膜表达水平可以用多种技术评估，所述多种技术包括(i)在其膜处表达AMHRII的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞的百分比，(ii)肿瘤细胞膜处的AMHRII蛋白的平均数量和(iii)经测试的肿瘤细胞样品中包含的肿瘤细胞的FACS AMHRII信号图。
根据一些实施方式，当在先前从患有非妇科癌症的个体收集的肿瘤样品中包含的5％或更多的肿瘤细胞中检测到膜AMHRII时，包含在所述肿瘤样品中的癌细胞可以评估为表达膜AMHRII。
因此，在一些实施方式中，当在先前从患有非妇科癌症的个体收集的肿瘤样品中包含的5％或更多的肿瘤细胞在其膜处表达AMHRII时，所述个体被确定为对AMHRII结合剂治疗有响应。
用于确定表达膜AMHRII蛋白的肿瘤细胞的频率(例如百分比)的方法在本说明书的其他地方公开，包括在本文的示例中。
根据一些实施方式，通过确定先前从患有非妇科癌症的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞膜处存在的AMHRII蛋白的平均数量，可以评估所述患者对AMHRII结合剂(例如抗AMHRII抗体)的癌症治疗的响应性。
在一些实施方式中，当先前从患有非妇科癌症的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞表达的膜AMHRII蛋白的平均数量具有10000个AMHRII蛋白或更多时，所述患者可以归类为对AMHRII结合剂治疗有响应，例如对抗AMHRII抗体治疗有响应。
可以通过使用常规方法进行在肿瘤细胞膜处表达的AMHRII蛋白的数量的评估，所述常规方法包括：(a)将含有来自先前从患者收集的肿瘤组织样品的细胞的样品与特异性结合AMHRII蛋白的可检测化合物(诸如荧光标记的抗AMHRII抗体)孵育的步骤，和另外的(b)确定与来自所述样品的每个测试细胞结合的所述可检测化合物的数量(例如，荧光标记的抗AMHRII抗体的数量)的步骤。如在本文的示例中显示的，评估肿瘤细胞膜处表达的AMHRII蛋白的数量可以例如通过使用众所周知的荧光激活细胞分选(FACS)技术来进行。
在另外的其他实施方式中，通过分析先前从患有非妇科癌症的患者收集的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞的AMHRII FACS曲线，可以将所述患者归类为对AMHRII结合剂治疗有响应，例如归类为对抗AMHRII抗体治疗有响应。
根据这些其他实施方式，在荧光激活细胞分选(FACS)的方法中，当(i)用抗AMHRII荧光标记的抗体孵育的肿瘤细胞的平均荧光强度与(ii)用同种型荧光标记的抗体孵育的肿瘤细胞获得的平均荧光强度(MFI)值的比率为1.5或更大时，可以将患有非妇科癌症的患者归类为对AMHRII结合剂治疗有响应，例如归类为对抗AMHRII抗体治疗有响应。
为了确定所述平均荧光强度比率，同种型抗体和抗AMHRII抗体都用相同的荧光剂(诸如赛默飞世尔科学公司(Company ThermoFisher Scientific)出售的Alexa Fluor 488染料)标记，如本文的示例所示。
在一些另外的实施方式中，通过计算允许区分(i)来源于可以用AMHRII结合剂治疗的癌症的表达膜AMHRII的癌细胞和(ii)来源于不可以用AMHRII结合剂治疗的癌症的表达膜AMHRII的癌细胞的AMHRII表达评分，可以确定非妇科癌症个体对AMHRII结合剂治疗的响应性。
因此，本发明人已经确定特别适合于使用本文所述的AMHRII结合剂的癌症治疗的患有本文所述的非妇科癌症的患者(即，特别是对使用本文所述的AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的患者)涵盖了具有在细胞膜处以足够用于组成待破坏的相关细胞靶标的高水平表达AMHRII的癌症肿瘤的那些患者。
然后，根据这些进一步的实施方式，本发明人已经确定在来自非妇科癌症患者的癌细胞样品中测量的最小AMHRII表达水平可以证实所述患者对使用AMHRII结合剂的治疗有响应，因此可以通过本文所述的AMHRII结合剂治疗所述患者。
因此，当通过测定(i)表达膜AMHRII的肿瘤细胞的频率(例如在其膜处表达AMHRII的肿瘤细胞的百分比)和(ii)所述肿瘤细胞的AMHRII膜表达的水平(例如每细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量)来评估先前从患有非妇科癌症的个体收集的样品中包含的癌细胞的AMHRII表达水平时，还可以确定所述个体对使用AMHRII结合剂的治疗的响应性。
因此，在这些另外的实施方式的一些实施方式中，在先前从患有非妇科癌症的患者收集的肿瘤细胞的样品中，所述患者对人AMHRII结合剂(例如对抗人AMHRII抗体)的响应性可以通过测定以下来评估：(i)所述样品中包含的肿瘤细胞在其膜处具有最少平均数量的人AMHRII蛋白以及(ii)在其膜处表达人AMHRII的细胞的频率(例如在其膜处表达人AMHRII的细胞的百分比)如果至少为阈值。
因此，本文还描述了另一种方法，该方法也可以用于确定特定的AMHRII表达评分值，以允许区分(i)不适合使用AMHRII结合剂的癌症治疗的非妇科癌症患者(即，对用AMHRII结合剂的癌症治疗无响应的非妇科癌症患者)和(ii)适合使用AMHRII结合剂的癌症治疗的非妇科癌症患者(即，对用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的非妇科癌症患者)。
更精确地，根据上述方法的实施方式，患有本文所述的非妇科癌症并且可以针对癌症用如本说明书所述的AMHRII结合剂来治疗的患者优选为已确定AMHRII表达评分为1.0或更大的那些患者，这包括已确定AMHRII表达评分为1.5或更大的那些患者。
膜AMHRII表达评分可以基于所测试的癌细胞的AMHRII表达的免疫组织化学评价，并且其中，(i)如果未检测到AMHRII表达，则给定癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为0，(ii)如果检测到显著的AMHRII表达，则给定癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为1，(iii)如果检测到高的AMHRII表达，则给定癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为2，和(iv)如果检测到AMHRII的过表达，则给定癌细胞样品的个体膜AMHRII评分被指定为3。
实际上，在(i)通过上述免疫组织化学评价指定给膜AMHRII表达水平的评分与(ii)每个癌细胞表达的AMHRII蛋白的平均数量之间存在关系。在本文的示例中显示，从先前从患有非妇科癌症的患者收集的肿瘤细胞的样品开始，通过确定每个细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量，也可以评估使得能够指定个体膜AMHRII评分的膜AMHRII表达水平。
根据确定患有非妇科癌症的个体对用AMHRII结合剂的治疗(即，对用抗AMHRII抗体的治疗)的响应性的以上实施方式，对于给定的癌细胞样品，通过考虑以下两者测定膜AMHRII表达评分：(i)所述癌细胞样品中AMHRII表达细胞的频率和(ii)所述AMHRII表达细胞的AMHRII表达的水平。通常，给定的癌细胞样品的AMHRII表达评分由下式(I)确定：
E评分＝频率x AMHRII_水平，其中
-E评分意指给定的癌细胞样品的AMHRII表达评分值，
-频率意指针对检测到膜AMHRII表达的所述癌细胞样品中包含的细胞的频率，和
-AMHRII_水平意指所述给定的癌细胞样品中包含的AMHRII表达细胞的AMHRII表达的水平。
说明性地，给定的癌细胞样品的E评分确定为1.0，其中(i)50％的细胞表达AMHRII(频率值为0.5)，并且(ii)AMHRII表达水平(AMHRII_水平)为2。
在优选的实施方式中，AMHRII表达评分(或E评分)通过如本文的示例所示的免疫组织学方法确定。根据这些优选的实施方式，通过使用对AMHRII有特异性的可检测抗体并通过(i)确定结合有所述抗AMHRII抗体的细胞的频率和(ii)确定由所述可检测的抗AMHRII抗体在结合至膜表达的AMHRII之后产生的信号的强度来评估AMHRII膜表达。
尽管，如本文的示例所示，对于各种癌症已经确定了具有1.5或更大的AMHRII表达评分的AMHRII表达癌细胞，尽管频率不同。说明性地，本发明人已在本文中显示将来源于结肠肿瘤的癌细胞归类为AMHRII阳性(即，AMHRII评分为1.5或更大)，其频率高于来源于头颈癌的癌细胞。
为了确定AMHRII膜表达的水平，检测在细胞膜处的AMHRII应该最优选通过使用对AMHRII具有高亲和力和高特异性的抗AMHRII单克隆抗体来进行，该抗AMHRII单克隆抗体在示例中由3C23K抗AMHRII单克隆抗体来说明。
此外，考虑到确定AMHRII评分，通过免疫组织化学方法确定AMHRII表达最优选涉及在使组织样品与适当的检测试剂(例如高亲和力抗AMHRII单克隆抗体，诸如单克隆3C23K抗体，对于结合至AMHRII具有55.3pM的Kd值)接触之前仔细的预处理所述样品。样品预处理应允许增加在细胞表面处表达的AMHRII分子的检测试剂的利用率。说明性地，如本文的示例中所示，染色方法可以包括诸如以下的特定步骤的适当组合：(i)通过暴露于微波源的高温脱蜡和(ii)用于放大由可以随后与链霉亲和素缀合的可检测试剂复合的AMHRII结合试剂(诸如生物素化的抗AMHRII抗体)的结合产生的信号的系统。由于先前的组织固定步骤，预处理脱蜡步骤对于逆转检测信号消光效应似乎很重要。本发明人已经表明，AMHRII可检测性对用于组织固定步骤的福尔马林的作用是特别灵敏的。
在本发明的上下文中，这意味着AMHRII结合剂(诸如抗AMHRII抗体)将是有用的治疗剂，其用于治疗患有结肠癌的患者的频率高于用于治疗患有头颈癌的患者的频率。这也意味着，尽管AMHRII结合剂可能是用于治疗患有头颈癌的患者的相关治疗剂，但优选是先测试肿瘤来源的癌细胞的AMHRII表达，以决定特定的患者将施用如本文所述的AMHRII结合剂。
此外，本发明人已经表明抗AMHRII抗体可以有利地用于治疗那些非妇科癌症。
因此，本发明人在本文中已经表明，靶向AMHRII的药剂可用作预防或治疗非妇科癌症的新型治疗工具。
根据本发明，诸如在“包括以下步骤”中的表述“包括”也理解为“由以下组成”，诸如“由以下步骤组成”也理解为“由以下组成”，诸如“由以下步骤组成”。
AMH受体(AMHR或AMHR2或AMHRII)是具有单个跨膜结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶，属于TGF-β-相关蛋白的II型受体家族。II型受体本身结合配体，但需要存在I型受体才能用于信号转导。Imbeaud等人(1995，Nature Genet，第11卷:382-388)克隆了人AMH II型受体基因。人AMH受体蛋白由573个氨基酸构成：这573个氨基酸中的17个氨基酸、127个氨基酸、26个氨基酸和403个氨基酸分别形成信号序列、胞外结构域(ECD)、跨膜结构域和胞内结构域(含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域)。
如本文所用，术语“AMHRII”是指具有SEQ ID NO.17的氨基酸序列的人抗苗勒激素II型受体。
抗苗勒激素受体(AMHRII)的表达已在本领域中描述于妇科癌症(即，大部分被免疫髓样细胞浸润的肿瘤)中。AMHRII已被鉴定为用于治疗妇科癌症的靶分子。针对AMHRII的抗体已作为用于治疗这些癌症的治疗性工具产生。可以特别引用在PCT申请No.WO 2008/053330和No.WO 2011/141653中描述的用于治疗卵巢癌的12G4抗AMHRII抗体及其变体，以及PCT申请中描述的3C23K抗AMHRII抗体。还可以提及PCT申请No.WO 2017/025458，其公开了通过使用抗AMHRII抗体药物缀合物来针对卵巢癌的具体治疗策略。
本发明人现已出乎意料地发现，AMHRII在各种人癌细胞的表面处表达，该癌细胞包括结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。本发明人还发现(i)癌细胞的AMHRII基因表达和(ii)相同癌细胞的细胞膜AMHRII蛋白表达之间没有关系。
本发明人关于人癌细胞的AMHRII表面表达的发现尤其来自使用抗AMHRII抗体的免疫组织化学测试，所述免疫组织化学测试通过使用先前从癌症患者获得的人实体瘤组织样品进行。本发明人关于人癌细胞的AMHRII表面表达的发现也是从用抗AMHRII抗体的免疫组织化学测试获得的，所述免疫组织化学测试在小鼠中对源自人原代癌细胞异种移植物的肿瘤组织样品进行。
本发明人还显示抗AMHRII抗体可用于治疗在肿瘤细胞表面处表达AMHRII的非妇科人癌症，尤其是本说明书中公开的那些表达AMHRII的癌症。值得注意的是，包含与细胞毒性分子缀合的抗AMHRII抗体的免疫缀合物已显示出良好的抗癌活性。
本发明人已经表明，在本领域中已经证明对表达AMHRII的妇科癌症具有抗肿瘤功效的抗AMHRII抗体也可用于预防或治疗表达AMHRII的非妇科癌症，尤其是本说明书中公开中的那些表达AMHRII的癌症。
更精确地，在本文的示例中显示，称为3C23K的抗AMHRII抗体在体内发挥针对人肝癌的抗肿瘤活性。重要的是，抗AMHRII 3C23K抗体针对人肝癌的体内抗肿瘤活性与索拉非尼的数量级相同，索拉非尼是用于治疗肝癌、尤其是肝细胞癌的众所周知的抗癌剂。
更进一步，本文的示例还显示抗AMHRII 3C23K抗体在体内不诱导可检测到的毒性事件，而在相同体内条件下用索拉非尼治疗引起显著的体重减轻。
更进一步，如本文所公开的，抗AMHRII 3C23K抗体的毒性免疫缀合物衍生物(ADC表示抗体药物缀合物)针对在细胞表面处表达AMHRII蛋白的癌症发挥良好的抗癌活性。
因此，本发明涉及人AMHRII结合剂用于预防或治疗选自包括结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病的癌症组的癌症的用途。
本发明还涉及人AMHRII结合剂用于制备用于预防或治疗选自包括结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病的癌症组的癌症的药剂的用途。
本发明还涉及用于预防或治疗选自包括结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病的癌症组的癌症的方法，其中，所述方法包括向有需要的个体施用如本说明书中公开的AMHRII结合剂的步骤。
可以根据本发明使用的AMHRII结合剂不需要模拟MIS天然配体活性。因此，可以根据本发明使用的AMHRII结合剂在结合至AMHRII之后不需要活化任何细胞信号传导途径。相反，仅需要所述试剂具有与AMHRII结合的能力，因为所述试剂专门用于靶向诱导细胞毒性的活性(诸如细胞毒性诱导实体)，其涵盖抗AMHRII细胞毒性免疫缀合物、ADCC诱导的抗AMHRII抗体或ADC诱导的抗AMHRII抗体或表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞。
AMHRII结合剂
如本文所用，AMHRII结合剂涵盖特异性结合至AMHRII并且当以适当的方式呈递时将引起在试剂结合细胞膜表达的AMHRII之后在其表面处表达AMHRII的靶细胞死亡的任何所述试剂。
如本文所述的用于治疗癌症的AMHRII结合剂在本文中也可以称为“治疗性AMHRII结合剂”。
通常，AMHRII结合剂涵盖特异性结合至AMHRII的蛋白或核酸。
AMHRII结合蛋白主要涵盖包括来源于抗AMHRII抗体或抗AMHRII抗体的AMHRII结合片段的一个或多个互补决定区(CDR)的蛋白，应理解所述AMHRII结合蛋白可以由工程化细胞(诸如CAR-T细胞、CAR NK T细胞或CAR巨噬细胞)表达为嵌合性抗原受体(CAR)。
AMHRII结合核酸主要涵盖针对其与AMHRII的特异性结合性质而特别选择的核酸适体。
在一些优选的实施方式中，AMHRII结合剂是抗AMHRII抗体或其AMHRII结合片段。
在最优选的实施方式中，AMHRII结合剂是抗AMHRII单克隆抗体或其AMHRII结合片段。
根据这些优选的实施方式，抗AMHRII单克隆抗体涵盖嵌合性抗AMHRII抗体、人源化抗AMHRII抗体和人AMHRII抗体，以及其AMHRII结合片段和AMHRII结合衍生物。
各种AMHRII抗体是本领域已知的，并且可以根据本发明用作AMHRII结合剂。出于实施本发明的目的，本领域技术人员可以使用用于示例的由Creative Biolabs出售的编号为No.MHH-57的重组人抗AMHRII。
在一些实施方式中，可以根据本发明使用的抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO 2008/053330中公开的人源化12G4抗体。
在一些其他实施方式中，所述抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO2011/141653中描述的人源化抗体，所述人源化抗体涵盖3C23抗体以及其变体，所述其变体包括3C23K人源化抗体。
在更进一步的实施方式中，所述抗AMHRII抗体是PCT申请No.WO2017/025458中描述的那些。根据这些另外的实施方式，PCT申请No.WO2017/025458公开了抗体药物缀合物(ADC)形式的AMHRII结合剂，其中，所述抗AMHRII抗体连接至细胞毒性剂。
在本领域中已经开发了针对苗勒激素II型受体(及其人源化衍生物)的单克隆抗体用于治疗卵巢癌(参见EP 2097453B1和美国专利No.8,278,423，其在此通过引用整体并入)。
在可以根据本发明使用的AMHRII结合剂中，本领域技术人员可以使用单克隆抗体12G4(mAb 12G4)或其嵌合性变体或人源化变体，包括用药物或可检测标记衍生而来以形成ADC的抗体。产生mAbl2G4的杂交瘤根据2006年9月26日的布达佩斯条约条款保藏在国家微生物菌种保藏中心(CNCM，巴斯德研究所，法国75724巴黎第15区克鲁斯博士大街25号)，并且CNCM保藏号为1-3673。已经将mAb 12G4的轻链和重链的可变结构域测序为mAb 12G4的互补决定区(CDR)(参见EP 2097453B1和美国专利No.8,278,423，其在此通过引用整体并入)。mAb 12G4及其嵌合性变体或人源化变体可以用于产生如本文公开的ADC。
PCT申请No.PCT/FR2011/050745(国际公开No.WO/2011/141653)和美国专利No.9,012,607(其各自在此通过引用整体并入)公开了来源于鼠12G4抗体的新型人源化抗体。出于本发明的目的，这些人源化抗体可以用作AMHRII结合剂。在PCT申请No.WO/2011/141653中公开的具体实施方式中，抗体是鉴定为3C23和3C23K的那些抗体。这些抗体的核酸序列和多肽序列在本文中以SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:16提供。在本发明的一些方面，感兴趣的抗AMHRII抗体可以称为“包括包含SEQ ID NO:的轻链和包含SEQ ID NO:的重链”。因此，在各种实施方式中，特别优选的抗体(包括用于产生ADC的抗体)包括：
a)包含SEQ ID NO:2的轻链和包含SEQ ID NO:4的重链(无先导序列(leader)的3C23 VL序列和3C23 VH序列)；
b)包含SEQ ID NO:6的轻链和包含SEQ ID NO:8的重链(无先导序列的3C23K VL序列和3C23K VH序列)；
c)包含SEQ ID NO:10的轻链和包含SEQ ID NO:12的重链(无先导序列的3C23轻链和3C23重链)；
d)包含SEQ ID NO:14的轻链和包含SEQ ID NO:16的重链(无先导序列的3C23K轻链和3C23K重链)。
其他抗体(例如，人源化抗体或嵌合性抗体)可以基于图1A和图1B中提供的重链序列和轻链序列(例如，抗体，诸如含有所述图内公开的CDR序列的人源化抗体或嵌合性抗体)可以用作感兴趣的抗MAHRII结合剂，包括用于形成ADC的抗体。因此，本发明还涉及包括包含/含有以下序列(或由以下序列组成)的CDR的抗AMHRII抗体的用途：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A(SEQ ID NO.65)，其中X1和X2独立地是S或P、X3是R或W或G、X4是T或D、并且X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S(SEQ ID NO.66)，其中X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT(SEQ ID NO.67)；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH(SEQ ID NO.68)，其中X7是S或T、X8是S或G、并且X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG(SEQ ID NO.69)，其中X10是G或E；和
-CDRH-3是GDRFAY(SEQ ID NO.70)。
本发明还涉及使用此类抗AMHRII抗体产生的ADC用于治疗本文指定的非妇科癌症的用途。
在本申请的范围内的抗体(例如，嵌合性抗体或人源化抗体)包括下表中公开的那些：替选地，特异性结合至AMHR-II的人单克隆抗体可以用于制备ADC。3C23K抗体由以下限定：
-对于VH氨基酸序列的SEQ ID NO:19，
-对于VL氨基酸序列的SEQ ID NO:36。
下表1列出了可以根据本发明使用的抗AMHRII人源化抗体。
表1：抗AMHRII抗体
Figure BDA0002320262930000191
Figure BDA0002320262930000201
抗AMHRII抗体、抗AMHRII抗体的AMHRII结合片段或AMHRII结合衍生物
术语“抗体”以最广泛的意义使用，并且包括单克隆抗体(包括全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(见下文)，只要它们表现出所期望的生物活性。
因此，如本文所用，术语“抗体”统称指代免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，以举例的方式包括但不限于IgA、IgD、IgE、IgG、以及IgM、其组合以及在任何脊椎动物(例如，哺乳动物，诸如人、山羊、兔和小鼠，以及非哺乳动物物种)中免疫应答期间产生的类似分子(诸如鲨鱼免疫球蛋白)。除非另有特别说明，否则术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白和“抗体片段”或“抗原结合片段”，其特异性结合至AMHRII，基本上排除了与其他分子(即与AMHRII不相关的分子)的结合。术语“抗体”还包括经遗传工程化的形式，诸如嵌合性抗体(例如，人源化鼠抗体)、异源缀合物抗体(诸如，双特异性抗体)。还参见Pierce Catalog andHandbook，1994-1995(Pierce Chemical Co.，Rockford，111.)；Kuby,J.，Immunology，第7版，W.H.Freeman&Co.，纽约，2013。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即包括所述群体的各个抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体针对单个抗原是高度特异性的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰词“单克隆”不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler等人，Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法制备，或可以由重组DNA方法制备(参见，例如美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”还可以从噬菌体抗体文库使用例如Clackson等人，Nature 352:624-628(1991)或Marks等人，J.MoI Biol.222:581-597(1991)描述的技术分离。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和Fv片段，直链抗体，scFv抗体，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
如本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象的所有抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者，κ轻链和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指识别和结合至特定抗原的抗体的两条可变链(重链和轻链)的部分。CDR是可变链的最可变部分，并为抗体提供其特异性。可变重(VH)链和可变轻(VL)链的每个上都有三个CDR，因此每个抗体分子总共有六个CDR。CDR主要负责与抗原的表位结合。每条链的CDR通常称为从N末端开始依次编号的CDR1、CDR2和CDR3，并且通常还由特定CDR所在的链来鉴定。因此，VHCDR3位于发现它的抗体重链的可变结构域中，而VLCDR1是来自发现它的抗体轻链的可变结构域的CDR1。结合LHR的抗体将具有特定的VH区序列和VL区序列，因此具有特定的CDR序列。具有不同特异性(即针对不同抗原的不同结合位点)的抗体具有不同的CDR。尽管CDR随抗体的不同而不同，但CDR中只有有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR中的这些位置称为特异性决定残基(SDR)。
“框架区”(以下称为FR)是不同于CDR残基的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有被鉴定为FR1、FR2、FR3和FR4的四个FR。如果CDR是根据Kabat定义的，则轻链FR残基大约位于残基1-23(LCFR1)、残基35-49(LCFR2)、残基57-88(LCFR3)和残基98-107(LCFR4)，重链FR残基大约位于重链残基中的残基1-30(HCFR1)、残基36-49(HCFR2)、残基66-94(HCFR3)和残基103-113(HCFR4)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中，这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包括在VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，这使得scFv可以形成所期望的抗原结合结构。有关scFv的综述，请参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑Springer-Verlag，纽约，第269-315页(1994)。
术语“双链抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段包括与同一多肽链(VH和VL)中的轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而无法在同一条链上的两个结构域之间配对的接头，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点。双链抗体在例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)中更详细地描述。
双链抗体或双特异性抗体可以大致分为两类：免疫球蛋白G(IgG)样分子和非IgG样分子。IgG样bsAb保留了Fc介导的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)(Spiess等人，2015，MolImmunol.,第67(2)卷：95-106)。bsAb的Fc区有助于纯化并改善溶解度和稳定性。IgG样形式的双特异性抗体通常具有更长的血清半衰期，这是因为其尺寸较大以及FcRn介导的再循环(Kontermann等人，2015，Bispecific antibodies.Drug Discov Today，第20(7)卷：838-47)。非IgG样bsAb的尺寸较小，导致组织渗透性增强(Kontermann等人，2015，Bispecificantibodies.Drug Discov Today第20(7)卷：838-47)。
根据一些优选的实施方式，根据本发明的双特异性抗体包括：(i)结合至AMHRII的第一抗原结合位点，和(ii)结合至不同于AMHRII的靶抗原、特别是可以由肿瘤环境的癌细胞或免疫细胞(诸如T细胞、NK或巨噬细胞)表达的靶抗原的第二抗原结合位点。在一些实施方式中，在此类双特异性抗体中，所述第二抗原结合位点结合至靶抗原(其是CD3)并且使T细胞接合。该靶抗原还可以是PDL1以解锁T细胞、或是CD16以活化NK或巨噬细胞。
本文指定的单克隆抗体特别包括“嵌合性”抗AMHRII抗体(免疫球蛋白)，其中一部分的重链和/或轻链与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一种抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们展现出所期望的生物活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。
本文指定的单克隆抗体也涵盖人源化抗AMHRII抗体。“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是含有来源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合性抗体。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中来自接受者高变区的残基被具有所期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体，诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可能包含在接受者抗体或供体抗体中找不到的残基。这些修饰是为了进一步完善抗体性能进行的。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常是两个可变结构域中的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR区都是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。对于另外的细节，请参见Jones等人，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332:323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
本文指定的单克隆抗AMHRII抗体还涵盖抗AMHRII人抗体。“人抗体”是具有与由人产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用如本文公开的任何一种用于制备人抗体的技术制成的人抗体。人抗体的该定义特别排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可以使用本领域已知的各种技术来生产。在一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，Nature Biotechnology 14:309-314(1996):Sheets等人，Proc.Natl.Acad.Sci.95:6157-6162(1998))；Hoogenboom和Winter,J.MoI.Biol,227:381(1991)；Marks等人,J.MoI.Biol,222:581(1991))。人抗体也可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源性免疫球蛋白基因已部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)中制成。激发后，观察到人抗体产生，在各个方面都与在人中所见非常相似，包括基因重排、组装和抗体谱。该方法描述于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和以下科学出版物中：Marks等人,Bio/Technology10:779-783(1992)；Lonberg等人,Nature 368:856-859(1994)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14:845-51(1996)；Neuberger,Nature Biotechnology 14:826(1996)；Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995)。替选地，人抗体可以经由产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可以从个体回收或可以在体外免疫)。参见，例如Cole等人,MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,第77页(1985)；Boerner等人,J.Immunol,147(l):86-95(1991)；和美国专利No.5,750,373。
如本文所用，“抗体突变体”或“抗体变体”是指物种依赖性抗体的氨基酸序列变体，其中，物种依赖性抗体的氨基酸残基中的一个或多个已经被修饰。此类突变体必须与物种依赖性抗体具有小于100％的序列同一性或类似性。在一个实施方式中，抗体突变体将具有与物种依赖性抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的氨基酸序列具有至少75％、更优选至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％和最优选至少95％的氨基酸序列同一性或类似性的氨基酸序列。关于该序列的同一性或类似性在本文中定义为在比对序列和引入空位(如有必要)以达到最大序列同一性百分比之后，候选序列中与物种依赖性抗体残基相同(即相同残基)或相似(即来自相同基团的氨基酸残基，基于共同的侧链性质，参见下文)的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端或内部延长、缺失或插入可变结构域外部的抗体序列均不得解释为影响序列同一性或类似性。
人源化抗体可以通过获得编码CDR结构域的核酸序列并根据本领域已知技术构建人源化抗体来产生。用于基于常规重组DNA和基因转染技术产生人源化抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Riechmann L.等人，1988；Neuberger M S.等人，1985)。抗体可以使用本领域已知的多种技术人源化，所述技术包括例如CDR-移植(EP 239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利No.5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、镶饰(veneering)或表面重塑(resurfacing)(EP 592,106；EP 519,596；Padlan E A(1991)；Studnicka G M等人(1994)；Roguska M A.等人，(1994))和链更替(shuffling)(美国专利No.5,565,332)。用于制备此类抗体的通用重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
可能期望修饰本文关于效应子功能指定的抗AMHRII抗体，例如以增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)。这可以通过在抗体的Fc区中引入一个或多个氨基酸取代基来实现。替选地或另外地，可以在Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使该区域内链间二硫键形成。由此产生的同二聚体抗体可以具有改善的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。参见Caron等人，J.Exp Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.J.Immunol.148:2918-2922(1992)。还可以使用异双功能性交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体，如Wolff等人，CancerResearch 53:2560-2565(1993)中描述的。替选地，抗体可以是经工程化的，其具有双Fc区并因此可以具有增强的补体裂解和ADCC能力。参见Stevenson等人，Anti-Cancer DrugDesign 3:219-230(1989)。WO00/42072(Presta,L.)描述了在人效应细胞存在下具有改善的ADCC功能的抗体，其中该抗体包含在其Fc区中的氨基酸取代。优选地，具有改善的ADCC的抗体包括在Fc区的位置298、333和/或334(残基的Eu编号)处的取代。优选地，改变的Fc区是包含在这些位置的一个、两个或三个处的取代或由在这些位置的一个、两个或三个处的取代构成的人IgG1 Fc区。此类取代任选地与增加CIq结合和/或CDC的取代组合。
具有改变的CIq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)的抗体描述于WO99/51642、美国专利No.6,194,551Bl、美国专利No.6,242,195Bl、美国专利No.6,528,624Bl和美国专利No.6,538,124(Idusogie等人)中。抗体包含在其Fc区的氨基酸位置270、322、326、327、329、313、333和/或334(残基的Eu编号)中的一个或多个处的氨基酸取代。
在一些实施方式中，AMHRII结合剂涵盖糖工程化的抗AMHRII抗体。
如本文所用，术语“糖工程化”是指用于改变结合蛋白组合物的糖型谱(glycoformprofile)的任何本领域公认的方法。这样的方法包括在经遗传工程化以表达异源糖基转移酶或糖苷酶的经遗传工程化的宿主细胞(例如，CHO细胞)中表达结合蛋白组合物。在其他实施方式中，糖工程化方法包括在偏向特定糖型谱的条件下培养宿主细胞。
如本文所用，“糖工程化的抗体”涵盖(i)包含高半乳糖基化的Fc片段的抗体，(ii)包含低甘露糖基化的Fc片段(其涵盖甘露糖基化的Fc片段)的抗体，和(iii)包含低岩藻糖基化的Fc片段(其涵盖岩藻糖基化的Fc片段)的抗体。如本文所用，糖工程化的片段涵盖具有改变的糖基化的Fc片段，其选自包括以下改变的糖基化中的一个或多个的组：(i)高半乳糖基化，(ii)低甘露糖基化和(iii)低岩藻糖基化。结果，来自如根据本发明使用的抗AMHRII抗体的糖工程化的Fc片段涵盖高半乳糖基化的Fc片段、低甘露糖基化的Fc片段和低岩藻糖基化的Fc片段的说明性实例。
本领域技术人员可以参考用于获得包含已知以比非修饰的Fc片段更高的亲和力结合至Fc受体的高半乳糖基化的Fc片段、低甘露糖基化的Fc片段和低岩藻糖基化的Fc片段的抗AMHRII抗体的公知技术。
糖工程化的抗AMHRII抗体涵盖包含低岩藻糖基化的Fc片段(也可以称为“低岩藻糖”Fc片段)的抗AMHRII抗体。
免疫缀合物，特别是抗体药物缀合物(ADC)
可以用于本发明目的的AMHRII结合剂涵盖缀合至细胞毒性剂(诸如化学治疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物))的本文指定的抗体。此类抗体缀合物涵盖PCT申请No.WO 2017/025458中描述的那些。PCT申请No.WO 2017/025458尤其公开了抗AMHRII 3C23K抗体，以及3C23K ADC缀合物，本文显示了其针对非妇科人癌症的体内抗癌活性。
细胞毒性剂涵盖酶促活性毒素。可以使用的酶促活性毒素及其片段包括白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、莫迪素A链、α-八叠球菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、米托菌素、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。
多种放射性核素可用于产生放射缀合物抗体。
抗体和细胞毒性剂的缀合物使用多种双官能团蛋白偶联剂(诸如PCT申请No.WO2017/025458中公开的那些)制备。
抗AMHRII ADC抗体缀合物的优选免疫缀合物是PCT申请No.WO2017/025458中描述的那些。
CAR细胞，包括CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞
在一些实施方式中，人AMHRII结合剂是AMHRII结合受体或AMHRII结合受体表达细胞，并且特别是AMHRII结合受体表达CAR T细胞、AMHRII结合受体CAR NK细胞或AMHRII结合受体表达CAR巨噬细胞。
因此，在一些实施方式中，人AMHRII结合剂是AMHRII结合工程化受体，最优选是其AMHRII结合区来源于本说明书中公开的单克隆抗AMHRII抗体的AMHRII结合工程化受体。
通常，AMHRII结合工程化受体由包括以下的嵌合性抗原受体(CAR)构成：(i)胞外结构域，(ii)跨膜结构域和(iii)胞内结构域，并且其中，胞外结构域是来源于本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的AMHRII结合部分。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域包含(i)包含来源于本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的CDR的抗体VH链和(ii)包含来源于本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的CDR的抗体VL链。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域包含本文公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和VL链。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域是包含分别来源于来自本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和CH链的CDR的ScFv。在一些实施方式中，所述AMHRII结合工程化受体的胞外结构域是包含分别来自本说明书中公开的抗AMHRII单克隆抗体的VH链和CH链的ScFv。
本文还涵盖了由表达此类AMHRII结合受体的细胞、尤其是表达此类AMHRII结合受体的CAR T细胞、CAR NK细胞或CAR巨噬细胞构成的AMHRII结合剂。
如本文所用的术语“嵌合性抗原受体”(CAR)是指融合蛋白，其包括能够与抗原结合的胞外结构域、来源于与胞外结构域所来源的多肽不同的多肽的跨膜结构域、以及至少一个胞内结构域。“嵌合性抗原受体(CAR)”有时也称为“嵌合性受体”、“T体”或“嵌合性免疫受体(CIR)”。“能够结合至AMHRII的胞外结构域”意指可以结合至AMHRII的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”意指在细胞中已知用作传递信号以引起生物过程活化或抑制的结构域的任何寡肽或多肽。“跨膜结构域”意指已知跨细胞膜并且可以用于连接胞外结构域和信号传导结构域的任何寡肽或多肽。嵌合性抗原受体可以任选地包含用作胞外结构域和跨膜结构域之间的接头的“铰链结构域”。
CAR T细胞是经遗传工程化的自体T细胞，其中单链抗体片段(scFv)或配体附接至能够促进T细胞活化的T细胞信号传导结构域(Maher,J.(2012)ISRN Oncol.2012:278093；Curran,K.J.等人(2012)J.Gene Med.14:405-415；Fedorov,V.D.等人(2014)Cancer J.20:160-165；Barrett,D.M.等人(2014)Annu.Rev.Med.65:333-347)。
“胞内信号传导结构域”意指CAR的在T细胞内部发现或经工程化以待发现的部分。“胞内信号传导结构域”可以还包含或可以还不包含将CAR锚定在T细胞的质膜中的“跨膜结构域”。在一个实施方式中，“跨膜结构域”和“胞内信号传导结构域”来源于相同蛋白(例如CD3ζ)；在其他实施方式中，胞内信号传导结构域和跨膜结构域来源于不同蛋白(例如CD3ζ的跨膜结构域和CD28分子的胞内信号传导结构域，反之亦然)。
“共刺激内域(endodomain)”意指来源于T细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域或其片段。T细胞共刺激分子的非限制性列表包括CD3、CD28、OX-40、4-1BB、CD27、CD270、CD30和ICOS。共刺激内域可以包括或可以不包括来自相同或不同的共刺激内域的跨膜结构域。
“胞外抗原结合结构域”意指CAR的特异性识别AMHRII并结合至AMHRII的部分。
在优选的实施方式中，“胞外结合结构域”来源于抗AMHRII单克隆抗体。例如，“胞外结合结构域”可以包括来自单克隆抗体的Fab结构域的全部或部分。在某些实施方式中，“胞外结合结构域”包括特定的抗AMHRII单克隆抗体的互补决定区。在又一个实施方式中，“胞外结合结构域”是获自本文指定的抗AMHRII单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。
在优选的实施方式中，胞外结合结构域来源于本说明书中所述的抗AMHRII单克隆抗体中的任一个、特别来自3C23K抗AMHRII单克隆抗体。
I.胞外抗原结合结构域
在一个实施方式中，本发明的CAR包括来自本文所述的抗AMHRII单克隆抗体中的一者的胞外抗原结合结构域。
在一个实施方式中，胞外结合结构域包含以下CDR序列：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A(SEQ ID NO.65)，其中X1和X2独立是S或P、X3是R或W或G、X4是T或D、以及X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S(SEQ ID NO.66)，其中X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT(SEQ ID NO.67)；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH(SEQ ID NO.68)，其中X7是S或T、X8是S或G、以及X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG(SEQ ID NO.69)，其中X10是G或E，和
-CDRH-3是GDRFAY(SEQ ID NO.70)。
II.κMab scFv的VL结构域和VH结构域之间的接头
在另一个实施方式中，抗AMHRII VL经由柔性接头连接至抗AMHRII VH。具体地，柔性接头是约10个至约30个氨基酸(例如30个、25个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个氨基酸)的甘氨酸/丝氨酸接头，并包含结构(Gly4Ser)3。
III.胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域之间的间隔子
胞外抗原结合结构域通过使用“间隔子”与胞内信号传导结构域相连。间隔子经设计要足够柔性，以允许抗原结合结构域以有助于抗原识别和结合的方式取向。间隔子可以源自抗AMHRII免疫球蛋白本身，并且可以包括IgGl铰链区或IgG的CH2区和/或CH3区。
IV.胞内信号传导结构域
胞内信号传导结构域包含CD3链中的全部或部分。CD也被称为CD247，连同CD4 T细胞共受体或CD8 T细胞共受体一起负责偶联胞外抗原识别至胞内信号传导级联。
除了包括CD3ζ信号传导结构域之外，共刺激分子的纳入已显示增强了鼠科模型和临床试验中的CAR T细胞活性。已经研究了几种，包括CD28、4-IBB、ICOS、CD27、CD270、CD30和OX-40。
在某些实施方式中，公开了产生CAR表达细胞的方法，该方法包括以下或替选地基本上由以下组成：(i)用编码CAR的核酸序列转导经分离的细胞群，以及(ii)选择已用步骤(i)的所述核酸序列成功转导的细胞亚群。在一些实施方式中，经分离的细胞是T细胞、动物T细胞、哺乳动物T细胞、猫科动物T细胞、犬科动物T细胞或人T细胞，从而产生CAR T细胞。在某些实施方式中，经分离的细胞是NK细胞，例如，动物NK细胞、哺乳动物NK细胞、猫科动物NK细胞、犬科动物NK细胞或人NK细胞，从而产生CAR NK细胞。
CAR T细胞、CAR N细胞和CAR巨噬细胞的治疗性应用
包括本文所述的CAR T细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞的CAR细胞可以用于治疗表达的AMHRII非妇科肿瘤。本发明的CAR细胞优选用于治疗患有本文所述的一种癌症的患者中的表达AMHRII的肿瘤。在优选的实施方式中，本发明的CAR细胞优选用于治疗选自包括结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病的组的癌症。
本发明的CAR细胞可以单独施用或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或其他组分(诸如细胞因子)或具有免疫刺激性的其他细胞群联合施用。
本发明的方法方面涉及用于抑制有需要的对象中的肿瘤生长和/或用于治疗有需要的患者中的癌症的方法。在一些实施方式中，肿瘤是实体瘤。在一些实施方式中，肿瘤/癌症是甲状腺、乳腺、卵巢或前列腺肿瘤/癌症。
如本文所公开的CAR细胞可以单独施用或与稀释剂、已知的抗癌治疗剂和/或其他组分(诸如细胞因子)或具有免疫刺激性的其他细胞群联合施用。它们可以是一线疗法、二线疗法、三线疗法、四线疗法或另外疗法。它们可以与其他疗法联合。这样的非限制性实例包括化学疗法或生物制剂。适当的治疗方案将由主治医师或兽医确定。
包含本发明的CAR的药物组合物可以以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但施用的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素决定。
治疗性应用
如本说明书其他地方已经公开的那样，本文公开的AMHRII结合剂涵盖(i)本文公开的抗AMHRII抗体、(ii)本文公开的抗体药物缀合物和(iii)本文公开的CAR细胞(包括CART细胞、CAR NK细胞和CAR巨噬细胞)，该AMHRII结合剂由可以用于预防或治疗表达AMHRII的非妇科癌症、特别是选自包括以下的组的癌症的活性成分构成：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。
利用抗肿瘤抗原抗体或抗肿瘤抗原CAR细胞的癌症治疗方法是本领域技术人员众所周知的。
在一些实施方式中，测试癌症患者以确定在用AMHRII结合剂(诸如抗AMHRII抗体、抗AMHRII ADC、抗AMHRII CAR T细胞、抗AMHRII CAR NL细胞或抗AMHRII CAR巨噬细胞)进行治疗之前，他们的肿瘤细胞是否在其表面处表达AMHRII。
用于检测AMHRII的膜表达的此类初步测试优选用于治疗低频表达AMHRII的癌症。相反，对于治疗高频表达AMHRII的癌症，可能不进行用于检测AMHRII的膜表达的此类初步测试。
因此，在一些实施方式中，本发明涉及如本文指定的AMHRII结合剂用于预防或治疗患有选自包括以下的组的AMHRII阳性癌症的个体的用途：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。
本发明涉及AMHRII结合剂用于制备预防或治疗患有选自包括以下的组的AMHRII阳性癌症的个体的药剂的用途：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。
本发明还涉及用于预防或治疗患有选自包括以下的组的AMHRII阳性癌症的个体的方法：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病，其中，所述方法包括向所述个体施用抗AMHRII结合剂的步骤。
通过进行检测先前从个体获得的癌症组织样品上的细胞表面AMHRII蛋白表达的方法，可以将个体指定为所述患有AMHRII阳性癌症的个体。细胞表面AMHRII蛋白表达的检测可以根据本领域技术人员众所周知的多种方法进行。细胞表面AMHRII蛋白表达检测方法特别涵盖免疫组织化学方法以及荧光激活细胞分选方法，如本文的示例所示。
本发明还涉及用于确定个体是否适合于(即，响应于)用AMHRII结合剂的癌症治疗的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
因此，本发明还涉及用于确定患有选自包括以下的组的癌症的个体是否适合于用AMHRII结合剂的癌症治疗、即，是否对用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病，其中，所述方法包括以下步骤：
a)确定来自所述患者的癌细胞是否在其膜处表达AMHRII，和
b)推断：如果在步骤a)中确定了所述癌细胞的AMHRII的膜表达，则所述患者适合于用AMHRII结合剂的癌症治疗、即，对用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应。
在所述方法的优选的实施方式中，在步骤b)，当(i)在步骤a)确定AMHRII表达评分值时并且当(ii)所述AMHRII表达评分值是阈值评分值或更高时，推断所述患者适合于(即，响应于)用AMHRII结合剂的癌症治疗。AMHRII评分值最优选通过使用本说明书其他地方所述的式(I)计算。
因此，根据优选的实施方式，该方法的步骤a)通过免疫组织化学方法进行，诸如本文的示例所示。
在步骤a)使用的癌细胞通常源自先前从所述癌症患者收集的活检组织样品。
优选地，步骤a)通过使用选自本说明书中具体描述的那些抗体的抗AMHRII抗体、特别是3C23K抗体来进行，该抗体的AMHRII结合可以根据公知的抗体检测技术、诸如本文的示例中公开的那些技术，通过使用经标记的二级抗体来检测。
优选地，当根据下式(I)进行允许测定E评分值的评分方法时，当在来源于患有以上列出的癌症组中包括的癌症的癌症患者的癌细胞样品中确定AMHRII表达评分值为1.0或更大、最优选AMHRII表达评分值为1.5或更大时，确定所述患者适合于用AMHRII结合剂的癌症治疗、即确定为对用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应：
E评分＝频率x AMHRII_水平，其中
-E评分意指给定癌细胞样品的AMHRII表达评分值，
-频率意指检测到膜AMHRII表达的所述癌细胞样品中所含细胞的频率，并且
-AMHRII_水平意指在所述给定癌细胞样品中包含的表达AMHRII的细胞的AMHRII表达的水平。
本发明还涉及用于治疗患有选自包括以下的组的癌症的患者的方法：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病，其中，所述方法包括以下步骤：
a)确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白，和
b)如果已经在步骤a)确定了AMHRII的细胞表面表达，则用AMHRII结合剂治疗所述个体。
在一些优选的实施方式中，在步骤a)，当所述肿瘤样品具有根据上述式(I)计算的1.0或更大的AMHRII表达评分值“E评分”(涵盖1.5或更大的E-评分值)时，在步骤a)确定AMHRII表达。
在上述方法的最优选实施方式中，所述AMHRII结合剂由如本文所指定的抗AMHRII抗体或其片段构成、或者由如本文所指定的CAR细胞(例如CAR T细胞或CAR NK细胞)构成。
在一些实施方式中，所述AMHRII结合剂用作唯一的抗癌活性成分。
在一些其他实施方式中，用所述AMHRII结合剂的抗癌治疗还包括使所述个体经受一种或多种另外的抗癌治疗，其包括放射疗法治疗和化学治疗剂治疗。
因此，根据此类其他实施方式，用所述AMHRII结合剂的抗癌治疗还包括向所述个体施用一种或多种另外的抗癌活性成分。
因此，根据如本文所述的AMHRII结合剂的用途的一些实施方式，所述AMHRII结合剂与另一种抗癌治疗组合，诸如与一种或多种其他抗癌活性剂组合。
“抗癌剂”定义为可以干扰大分子(DNA、RNA、蛋白质等)的生物合成或抑制细胞增殖或导致细胞死亡(例如通过凋亡或细胞毒性)的任何分子。在抗癌剂中，可以提及的是烷基化剂、拓扑异构酶抑制剂和嵌入剂、抗代谢物、裂解剂、干扰微管蛋白的试剂、单克隆抗体。
根据特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和与AMHR-II结合的抗体、特别是本文所述的抗AMHRII抗体。
“药学上可接受的媒介物”是指与生物系统(诸如细胞、细胞培养物、组织或生物体)相容的无毒物质。
在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和与AMHR-II结合的抗体、特别是本文所述的抗AMHRII抗体。
在一些实施方式中，本发明涉及药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
可以与抗AMHRII抗体组合使用的其他抗癌剂涵盖紫杉醇或铂盐(诸如奥沙利铂、顺铂和卡铂)。
抗癌剂还可以选自除铂盐、小分子、单克隆抗体或其他抗血管形成肽体以外的化学治疗剂。
除铂盐以外的化学治疗剂包括嵌入剂(阻断DNA复制和转录)，诸如蒽环类药物(多柔比星、聚乙二醇化的脂质体多柔比星)，拓扑异构酶抑制剂(喜树碱和衍生物：Karenitecin、拓扑替康、伊立替康)，或者SJG-136，组蛋白脱乙酰酶的抑制剂(伏立诺他、贝利司他、丙戊酸)，烷基化剂(苯达莫司汀、葡磷酰胺、替莫唑胺)，抗有丝分裂植物生物碱(诸如紫杉烷(多西他赛、紫杉醇))，长春花生物碱(长春瑞滨)，埃博霉素(ZK-埃博霉素、伊沙匹隆)，抗代谢物(吉西他滨、艾西拉滨、卡培他滨)，纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂(伊斯平斯)，曲贝替定或者奥瑞布林(康普瑞汀A-4衍生物)。
在小分子中有聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂：奥拉帕尼，艾尼帕利，维利帕尼，卢卡帕尼，CEP-9722，MK-4827，BMN-673，激酶抑制剂(诸如酪氨酸激酶抑制剂(TKI))，其中可以提及的是抗-VEGFR分子(索拉非尼，舒尼替尼，西地尼布，凡德他尼，帕唑帕尼，BIBF1120，瑟玛沙尼，卡博替尼，莫特沙尼)，抗-HER2/EGFR分子(厄洛替尼，吉非替尼，拉帕替尼)，抗PDGFR分子(伊马替尼，BIBF 1120)，抗FGFR分子(BIBF 1120)，极光激酶/酪氨酸激酶抑制剂(ENMD-2076)，Src/Abl激酶抑制剂(塞卡替尼)，或还有哌立福辛，特罗莫司(mTOR抑制剂)，阿沃西地(细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂)，沃拉舍替(PLK1(保罗样激酶1)蛋白的抑制剂)，LY2606368(检查点激酶1(chk1)的抑制剂)，GDC-0449(Hedgehog途径抑制剂)，齐波腾坦(ETA-受体的拮抗剂)，硼替佐米，卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)，细胞因子(诸如IL-12、IL-18、IL-21、INF-α、INF-γ)。
在抗体中，可以提及的是抗VEGF：贝伐单抗，抗VEGFR：雷莫芦单抗，抗HER2/EGFR：曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗、MGAH22、马妥珠单抗，抗PDGFRα：IMC-3G3，抗叶酸受体：法拉图组单抗，抗CD27：CDX-1127，抗CD56：BB-10901，抗CD105：TRC105，抗CD276：MGA271，抗AGS-8：AGS-8M4，抗DRS：TRA-8，抗HB-EGF：KHK2866，抗间皮素：阿玛妥昔单抗、BAY 94-9343(免疫毒素)、卡妥索单抗(EpCAM/CD3双特异性抗体)，抗IL2R：达克珠单抗，抗IGF-1R：加尼妥单抗，抗CTLA-4：易普利姆玛，抗PD1：纳武单抗和派姆单抗，抗CD47：Weissman B6H12和Hu5F9，Novimmune 5A3M3，INHIBRX 2A1，Frazier VxP037-01LC1抗体，抗刘易斯Y：Hu3S193，SGN-15(免疫毒素)，抗CAl25：奥戈伏单抗，抗HGF：瑞洛妥木单抗，抗IL6：司妥昔单抗，抗TR2：替加妥珠单抗，抗α5β1整合素：沃洛赛昔单抗，抗HB-EGF：KHK2866。抗血管形成肽抗体选自AMG 386和CVX-241。
更具体地，本文描述了药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，所述抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
甚至更具体地，本文描述了药物组合物，其包含与药学上可接受的媒介物组合的作为活性成分的抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，在本文中称为3C23K的经突变的人源化单克隆抗体和抗癌剂选自包括以下的组：多西他赛、顺铂、吉西他滨、以及顺铂和吉西他滨的组合。
如本文公开的AMHRII结合剂、尤其是本文公开的抗AMHRII抗体可以以多种方式施用，包括经口施用、皮下施用和静脉内施用。
术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤的大小；抑制(即在一定程度上减慢、优选停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即在一定程度上减慢、优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与病症有关的一种或多种症状。在一定程度上，该药物可以阻止生长和/或杀灭现有的癌细胞，它可以抑制细胞生长和/或具有细胞毒性。对于癌症疗法，可以通过例如评估存活的持续时间、无进展存活(PFS)的持续时间、响应率(RR)、响应的持续时间和/或生活质量来测量体内功效。
通过将具有期望纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，来制备用于储存的、冻干制剂或水溶液形式的根据本发明使用的试剂(例如，抗体)的治疗性制剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980))。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子，诸如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
活性成分也可以被包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合来制备的微胶囊(例如分别羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)中、或在大乳液中。此类技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。
用于体内施用的制剂可以是无菌的。这容易借由通过无菌过滤膜过滤实现。
在另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，在旨在通过静脉内途径或腹膜内途径施用的制剂中。
在另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，单克隆抗体和抗癌剂旨在用于分开、同时或依次施用。
抗体和抗癌剂可以在同一药物组合物内组合，或者可以以同时或依次施用的分开的药物组合物的形式使用。特别地，产品可以分开施用，即同时或独立地(例如有时间间隔)施用。
更具体地，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，抗体和抗癌剂组合在同一药物组合物内。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗AMHRII抗体的治疗有效量的范围为约0.07mg至约35000mg、优选约0.7mg至约7000mg、优选约0.7mg至约1400mg、优选约0.7mg至约700mg、更优选约0.7mg至约70mg。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗癌剂的治疗有效量的范围为约10mg至约700mg，优选范围为约20mg至约350mg、优选约110mg。
根据另一个特定的方面，本发明涉及组合物在预防或治疗本文所述的非妇科癌症中作为药用产品的用途，该组合物包含抗癌剂和结合AMHR-II的抗体，其中，施用给患者的抗体的治疗有效量为约70mg，施用给患者的抗癌剂的剂量为约110mg。
通过以下实施例、但不以任何方式限于以下实施例，进一步说明本发明。
实施例
实施例1：差异的AMHRII基因表达和AMHRII蛋白表达
A.材料和方法
A.1.细胞系和培养物
将COV434 WT细胞系(ECACC No.07071909)维持在补充有10％FBS、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的DMEM/GlutaMax(Gibco)中。以400μg/ml添加遗传霉素(Gibco)用于COV434 MISRII转染的细胞系。将红白血病K562细胞系(
Figure BDA0002320262930000401
CCL-243TM)悬浮培养在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的IMDM培养基(西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich))中，并以1x 105至1x 106个细胞/ml的密度维持在T75烧瓶中。将OV90细胞系(
Figure BDA0002320262930000402
CRL-11732TM，卵巢浆液性腺癌)培养在含终浓度为1.5g/l碳酸氢钠的MCDB 105培养基(西格玛奥德里奇)和含终浓度为2.2g/l碳酸氢钠的培养基199(西格玛奥德里奇)(补充有15％FBS和青霉素/链霉素)的1:1混合物中。将NCI-H295R细胞系(肾上腺皮质癌，
Figure BDA0002320262930000403
CRL-2128TM)维持于补充有iTS+Premix(康宁(Corning))、2.5％Nu-Serum(Falcon)和青霉素/链霉素的DMEM:F12培养基(西格玛奥德里奇)中。将细胞在37℃在具有8％CO2的潮湿气氛中生长，并取决于细胞系，每周更换培养基一次或两次。
A.2.通过RT-qPCR的AMHR2 mRNA的相对定量
提取RNA.根据制造商的使用说明，使用
Figure BDA0002320262930000404
Plus RNA纯化试剂盒(Ambion)制备来自1x106至5x106个细胞团块的总RNA。简而言之，在苯酚/氯仿提取后，裂解细胞的RNA吸附在二氧化硅基质上，用DNA酶处理，然后用30μl无RNA酶的水洗涤并洗脱。用分光光度计(NanoDrop，赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))评估RNA浓度和质量。
cDNA合成.使用Maxima H Minus第一链cDNA合成试剂盒(Ambion)和寡-dT引物通过以下步骤将RNA(1μg)逆转录：在25℃下孵育10min用于引发并在50℃下孵育15min用于逆转录，然后在85℃下孵育5min用于逆转录酶失活。
定量PCR.使用最终体积为20μl的Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix(Ambion)在96孔微孔板中的Light Cycler 480(罗氏(Roche))中进行定量PCR。使用以下引物：对于AMHR2，正向5’-TCTGGATGGCACTGGTGCTG-3’(SEQ ID NO.71)和反向5’-AGCAGGGCCAAGATGATGCT-3’(SEQ ID NO.72)；对于TBP，正向5’-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3’(SEQ ID NO.73)和反向5’-CACATCACAGCTCCCCACCA-3’(SEQ ID NO.74)。使用cDNA模板(100ng当量RNA)和以下方案进行扩增：在50℃下UDG预处理2min，在95℃下变性10min，然后在95℃下15s/在60℃下30s/在70℃下30s进行40个循环。在每个实验结束时进行熔化曲线分析，以控制没有基因组DNA和二聚体引物。一式两份测试每个cDNA样品和对照(“无模板样品”和“无逆转录物RNA”)。计算循环阈值(Ct)的平均值，并将AMHR2相对定量(RQ)表示为
Figure BDA0002320262930000412
其中△△Ct＝△Ct样品-△Ct校准品和△Ct＝CtAMHR2-CtTBP。HCT116样品用作校准品，并且TBP作为管家基因用于归一化。
下表2描绘了使用上述Q-PCR方法在测试的细胞系中的AMHRII表达水平。
表2
Figure BDA0002320262930000411
A.3.通过流式细胞术分析评价膜AMHR2表达
为了荧光激活细胞分选(FACS)分析，将4x 105个细胞用25μg/ml的3C23K在4℃下孵育30min。用PBS-BSA2％洗涤后，通过缀合至荧光团的抗物种二级抗体检测一级抗体。通过缀合至藻红素(1:1000，Beckman-Coulter，IM0550)的抗人F(ab’)2检测3C23K。用PBS洗涤后，在BD AccuriTMC6流式细胞仪(BD生物科学(BD Bioscience))的FL2通道中实现了重悬细胞的FACS分析。
B.结果
结果描绘于图2中。结果表明，尽管COV434-WT细胞系具有人AMHRII蛋白的显著膜表达水平，但重组细胞系COV434-WT(对于细胞系NCI-H295R测得的AMHRII基因表达水平约为3％)。
这些结果表明AMHRII基因表达与膜AMHRII蛋白表达之间完全没有相关性。
实施例2：非妇科癌症(人肿瘤样品)中的AMHRII表达
A.材料和方法
A.1.目标
用于使用生物素化的3C23K单克隆抗体检测抗苗勒激素2型受体(AMHR2)表达的小鼠中人癌细胞异种移植物(PDX)的免疫组织化学研究。
A.2.方案和方法
-细胞系：固定在甲醛乙酸醇(AFA)中，具有细胞块构造。
-人肿瘤：外部样品固定在福尔马林中，并且来自居里研究所的载玻片固定在AFA中。
-在将样品脱蜡并在pH9下暴露(在90℃下微波EZ Retriever 15’，然后在20’内冷却)后，免疫组织化学(IHC)技术是可能的。
-通过免疫过氧化物酶技术和DAB生色底物揭示的抗苗勒激素II型受体检测。
-在封闭内源性过氧化物酶活性后，将载玻片用稀释的生物素化的一级抗体(1/800，8μg/mL)在室温下孵育90分钟。然后将组织切片用PBS洗涤，并用亲和素/生物素ABC[载体]复合物孵育30分钟。使用DAB底物溶液(DAB+底物缓冲液/液体DAB+色原体，10分钟孵育)检测免疫反应信号。最后，用梅尔氏苏木精(里利氏改良)将切片轻轻地复染。
-阴性对照是通过在免疫组织化学染色程序中用同种型对照免疫球蛋白(R565)或单独的抗体稀释剂(阴性缓冲液对照)替代一级抗体获得的。
-通过使用AMHR2转染的COV434细胞和人粒层细胞肿瘤样品获得阳性对照。
-处理后，经由Philips IMS通过数字化观察切片。所有样本均由2位病理学家独立评分。
-详细描述了标记的定位：细胞质和/或膜。
-通过以下评分系统将强度分类为肿瘤细胞膜和/或细胞质的明确棕色标记：将标记的强度定义为：0(阴性)，1(弱)，2(中度)，以及3(强，如COV434阳性对照所示)。
-频率定义为表达AMHRII的细胞的百分比。从分析中排除了坏死区域。通过使用频率x强度评分平均值(0至3)累积膜表达和细胞质表达来建立总组织学评分。
-将所有载玻片妥善保存。
B.结果
图3还描绘了各种原代人癌细胞的AMHRII膜表达的结果，其中，AMHRII表达评分代表一组不同的癌细胞类型。
结果描绘于图3。结果表明，AMHRII在多种非妇科人癌症的细胞表面处表达，这些非妇科人癌症包括结肠癌、肝癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、膀胱癌、胰腺癌、以及头颈癌。
实施例3：非妇科癌症(人肿瘤异种移植物)中的AMHRII表达
A.材料和方法
A.1.目标
用于使用生物素化的3C23K单克隆抗体检测抗苗勒激素2型受体(AMHR2)表达的小鼠中人癌细胞异种移植物(PDX)的免疫组织化学研究。
A.2.方案和方法
-细胞系：固定在甲醛乙酸醇(AFA)中，具有细胞块构造。
-人肿瘤：外部样品固定在福尔马林中，并且来自居里研究所的载玻片固定在AFA中。
-在将样品脱蜡并在pH9下暴露(在90℃下微波EZ Retriever 15’，然后在20’内冷却)后，免疫组织化学(IHC)技术是可能的。
-通过免疫过氧化物酶技术和DAB生色底物揭示的抗苗勒激素II型受体检测。
-在封闭内源性过氧化物酶活性后，将载玻片用稀释的生物素化的一级抗体(1/800，8μg/mL)在室温下孵育90分钟。然后将组织切片用PBS洗涤，并用亲和素/生物素ABC[载体]复合物孵育30分钟。使用DAB底物溶液(DAB+底物缓冲液/液体DAB+色原体，10分钟孵育)检测免疫反应信号。最后，用梅尔氏苏木精(里利氏改良)将切片轻轻地复染。
-阴性对照是通过在免疫组织化学染色程序中用同种型对照免疫球蛋白(R565)或单独的抗体稀释剂(阴性缓冲液对照)替代一级抗体获得的。
-通过使用AMHR2转染的COV434细胞和人粒层细胞肿瘤样品获得阳性对照。
-处理后，经由Philips IMS通过数字化观察切片。所有样本均由2位病理学家独立评分。
-详细描述了标记的定位：细胞质和/或膜。
-通过以下评分系统将强度分类为肿瘤细胞膜和/或细胞质的明确棕色标记：将标记的强度定义为：0(阴性)，1(弱)，2(中度)，以及3(强，如COV434阳性对照所示)。
-频率定义为AMHRII表达细胞的百分比。从分析中排除了坏死区域。通过使用频率x强度评分平均值(0至3)累积膜表达和细胞质表达来建立总组织学评分。
-将所有载玻片妥善保存。
B.结果
a)对照
-阴性对照和同种型对照对肿瘤细胞没有反应性。
-阳性对照样品(经扩增的COV434 AMHRII)显示了细胞的弥散性免疫染色(强度评分：3)。标记是均匀的(频率评分：100％)，具有细胞质定位和膜定位。
-阳性粒层细胞对照样品显示出肿瘤细胞的强免疫染色(强度评分3)。标记是均匀的(频率评分：100％)，具有细胞质定位和膜定位。
b)筛选患者来源的异种移植物(PDX)样品。
重要的是要注意，当将样品固定在福尔马林中与样品在AFA中处理相比时，AMHR2的膜表达似乎被低估了。
小鼠内异种移植的各种人肿瘤的AMHRII膜表达的结果描绘于图4中，其中，AMHRII表达评分代表一组不同的癌细胞类型。
下表3总结了人肿瘤异种移植物的AMHRII表达的部分结果。
表3：人肿瘤异种移植物中的AMHRII表达
Figure BDA0002320262930000451
c)结论
在对AMHR2转录呈阳性的6个PDX模型的4个中，确认了AMHR2蛋白表达。这些PDX改自神经胶质瘤(ODA14-RAV)和结肠(TC306-BAU)癌。表达水平中等但显著，特征在于总评分为1至1.5。这些数据表明，除妇科癌症以外，均可以表达AMHR2。
这些模型将来可以用于表征抗AMHR2疗法。
实施例4：抗AMHRII抗体针对表达AMHRII的非妇科癌症的体内功效
A.材料和方法
A.1.缩写
表4和表5中都显示了该方案中的常用缩写。
表4.给药相关的缩写
Figure BDA0002320262930000461
表5.该实施例中使用的其他常见缩写
Figure BDA0002320262930000462
Figure BDA0002320262930000471
A.2.研究目标
为了临床前评价加马玛布斯(GamaMabs)的抗AMHR2单克隆抗体(称为GM102)在Balb/C裸小鼠中治疗
Figure BDA0002320262930000472
HCC异种移植物模型LI1097的体内功效。模型LI1097是在筛选由中美冠科(CrownBio)使用RNAseq(转录组测序)对AMHR2转录后选择的。此外，该模型的AMHR2膜蛋白表达已由法国居里研究所使用IHC证实。
A.3.实验设计
表6.功效研究的研究设计
Figure BDA0002320262930000481
注释：N：每组动物数量
A.4.动物
-品系：BALB/c裸
-年龄：7周至8周(治疗开始时)
-性别：雌性
-总数#：32只小鼠+备用
A.5.动物圈养
将小鼠圈养在以下条件下的单独通风笼中(每笼4只)：
Figure BDA0002320262930000482
温度：20℃至26℃
Figure BDA0002320262930000483
湿度：30％至70％
Figure BDA0002320262930000484
光周期：光照12小时，黑暗12小时
Figure BDA0002320262930000485
尺寸为325mm×210mm×180mm的聚砜笼
Figure BDA0002320262930000486
垫底材料为玉米芯，并且每周更换
Figure BDA0002320262930000487
饮食：在整个研究期间，动物将自由获得经辐射灭菌的干颗粒食品。
Figure BDA0002320262930000488
水：动物将自由获得无菌饮用水
Figure BDA0002320262930000489
笼识别标签：动物数量，性别，品系，接收日期，治疗，研究号，组号和治疗开始日期
Figure BDA00023202629300004810
动物识别：将动物用耳标签标记
A.6.
Figure BDA0002320262930000491
模型特性
选择来源于雄性HCC患者的
Figure BDA0002320262930000492
肝癌模型LI1097用于该功效研究。该模型在接种后20天至25天内达到1000mm3。
A.7.测试品和阳性对照品
产品鉴定：加马玛布斯的抗体(3C23K)
制造商：加马玛布斯制药公司
批号：R18H2-LP01
批次：04GAM140513API
需要的量：基于25g的动物体重为255mg，50％备用
包装和储存条件：[30ml/管]，30ml，[2℃至8℃]
浓度：10.1g/L
产品鉴定：索拉非尼
制造商：美伦医药(Melonepharma)
批号：D1111A
需要的量：基于25g的动物体重为300mg，50％备用
包装和储存条件：400mg，[RT]
A.8.实验方法和程序
A.8.1.肿瘤接种和组分布
收获来自接种有选定的原代人癌组织的原代(stock)小鼠的肿瘤片段，并将其用于接种至BALB/c裸小鼠中。在2015年6月9日将每只小鼠右侧腹皮下接种原代人HCC模型LI1097片段(R12P4，直径2mm至4mm)用于肿瘤发展。亲本小鼠编号为#80150、#80151和#80153。在2015年6月24日，当平均肿瘤大小达到约145mm3时将小鼠分组。根据小鼠的肿瘤大小将其随机分配至4个实验组。每组由8只小鼠组成，每笼4只小鼠。将这天表示为第0天。根据第1.1节实验设计中所示的预定方案，从第0天(2015年6月24日)至第27天(2015年7月21日)，将测试品施用给带瘤小鼠。
A.8.2.停止给药方案
当个体小鼠的体重减轻≥20％时，将给予小鼠给药暂缓(holiday)，直到其体重恢复到基线为止。在这项研究中，没有停止给药。
A.8.3.观察
本研究中与动物处置、护理和治疗有关的所有程序均按照中美冠科机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的指导原则遵循实验室动物护理评估与鉴定协会(AAALAC)的指导进行。在常规监测时，检查动物受到肿瘤生长对正常行为的任何影响，诸如活动性、食物和水的消耗(仅通过看)、体重增加/减少、眼睛/头发无光泽以及任何其他异常影响。根据每个子集中的动物数量记录死亡和观察到的临床体征。
A.8.4.肿瘤测量和终点
使用卡尺每周两次在二维上测量肿瘤大小，并使用下式以mm3表示体积：TV＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后根据表2中缩写的描述，将肿瘤大小用于计算TGI值、T/C值和T-C值。
A.8.5.终止
治疗28天后研究终止，并处死小鼠。
在以下条件下，在死亡之前或达到昏迷状态之前，通过人道安乐死终止个体动物或整组的活体动物(in-life)实验。
√在持续恶化的情况下，有严重的痛苦和/或疼痛的严重临床体征，无法获得足够的食物或水；
√显著体重(消瘦)(>20％)；
√肿瘤大小超过3000mm3或MTV>2000mm3的单个小鼠。
A.8.6.统计分析
在每个时间点为每个组的肿瘤体积提供概括统计量，包括平均值和平均值标准误差(SEM)。使用单向方差分析(ANOVA)，然后使用Games-Howell的多重比较，评价各组肿瘤体积差异的统计分析。使用SPSS 16.0分析所有数据。认为P<0.05具有统计学显著性。
B.结果
B.1.体重
已经测量了带瘤小鼠的体重和体重变化的结果。所有的小鼠都完成了其治疗，且没有给药暂缓。在加马玛布斯的抗体治疗的小鼠中未观察到动物死亡或显著的体重减轻，但在索拉非尼治疗的小鼠中观察到7％的体重减轻。
B.2.肿瘤体积
表7显示了不同组在不同时间点的肿瘤尺寸。
表7不同治疗组中的肿瘤尺寸
Figure BDA0002320262930000511
注释：表达为平均值±SEM的数据。
B.2.肿瘤生长抑制
表8总结了肿瘤生长抑制。
表8
Figure BDA0002320262930000521
肝脏异种移植物模型LI1097中测试化合物加马玛布斯的抗体和索拉非尼治疗的抗肿瘤活性
Figure BDA0002320262930000522
注释：a.平均值±SEM
b.使用Games-Howell通过多重比较与媒介物比较
*P<0.05，与G1媒介物相比
B.3.肿瘤生长曲线
图5显示了不同组的肿瘤生长曲线。
图5表示在
Figure BDA0002320262930000523
肝脏异种移植物模型LI1097中测试化合物加马玛布斯的抗体和索拉非尼治疗期间不同组中小鼠的肿瘤体积。
B.4.结果概述和讨论
在这项研究中，评价了测试化合物加马玛布斯的抗体和阳性对照药物索拉非尼在治疗雌性BALB/c裸小鼠中的
Figure BDA0002320262930000524
HCC异种移植物模型LI1097中的功效。
在第1组(媒介物，BIW x 2周，i.v.)、第2组(加马玛布斯的抗体，20mg/kg，BIW x 4周，i.v.)、第3组(加马玛布斯的抗体，50mg/kg，BIW x 4周，i.v.)和第4组(索拉非尼，50mg/kg，QD x 4周，p.o.)中，研究终止时的体重变化分别为0.67％、2.68％、-0.38％和-7.63％。在带LI1097瘤小鼠中，20mg/kg和50mg/kg的测试化合物加马玛布斯的抗体耐受性良好。索拉非尼50mg/kg治疗组中的小鼠在治疗第27天展现出的平均最大体重减轻为7.63％。
在第13天，媒介物处理的小鼠的平均肿瘤大小达到2269.46mm3。第2组(加马玛布斯的抗体，20mg/kg)和第3组(加马玛布斯的抗体，50mg/kg)产生了50％抗肿瘤响应vs媒介物处理，TGI分别为51.3％和54.3％(P＝0.100和0.111)。第4组(索拉非尼，50mg/kg)在治疗的第13天产生显著的抗肿瘤活性，TGI为64.9％(P＝0.024)。表8和图5所示的治疗后不同时间点不同组中的肿瘤大小的结果表明，与索拉非尼一样，第2组和第3组(分别为20mg/kg和50mg/kg的加马玛布斯的抗体)对治疗的响应维持至少27天。然而，第2组和第3组中的肿瘤响应可能太异质而无法获得更好的统计学显著性。
总而言之，在这项研究中，测试化合物加马玛布斯的抗体对原代
Figure BDA0002320262930000531
HCC异种移植物模型LI1097产生了抗肿瘤活性，与索拉非尼(针对这种病理学的护理标准)所诱导的相似。此外，GM102的抗肿瘤活性没有伴随任何毒性事件，而索拉非尼治疗诱导高达7％的平均体重减轻。
实施例5：抗AMHRII免疫缀合物针对表达AMHRII的非妇科癌症的体内功效
A.材料和方法
A.1.缩写
该实施例中常用的缩写与实施例4的表3和表4的那些缩写相同。
A.2.目标
为了临床前评价加马玛布斯的化合物GM103在治疗雌性BALB/c裸小鼠中的PDX模型LI1097中的体内功效。
A.3.实验设计
表9.功效研究的研究设计
Figure BDA0002320262930000532
Figure BDA0002320262930000541
注释：N：每组动物数量
A.4.材料
A.4.1.动物
-品系：BALB/c裸
-年龄：6周至8周
-性别：雌性
-总数#：32只小鼠+备用
A.4.2.动物圈养
将小鼠圈养在以下条件下的单独通风笼中(每笼4只至5只小鼠)：
-温度：20℃至26℃
-湿度：30％至70％
-光周期：光照12小时，黑暗12小时
-尺寸为325mm×210mm×180mm的聚砜笼
-垫底材料为玉米芯，并且每周更换
-饮食：在整个研究期间，动物将自由获得经辐射灭菌的干颗粒食品
-水：动物将自由获得无菌饮用水
-笼识别标签：动物数量，性别，品系，接收日期，治疗，-项目ID，组号，动物ID和治疗开始日期
-动物识别：将动物用耳标签标记
A.4.3.模型信息
选择
Figure BDA0002320262930000542
肝癌异种移植物模型LI1097用于该功效研究。
A.4.4.测试品和对照品
产品鉴定：GM103
制造商：加马玛布斯制药公司
物理描述：溶液
批号：GAM100-NC005-4
所需的量：基于25g的动物BW为4.48mg，40％备用
包装和储存条件：4.3mg/1.3ml/小瓶，在4℃下储存。
A.5.实验方法
A.5.1.肿瘤接种
将每只小鼠右侧腹皮下接种原代人肝癌异种移植物模型LI1097片段(直径2mm至3mm)用于肿瘤发展。
A.5.2.组分配
当平均肿瘤大小达到约200mm3时，将小鼠随机分配至表3所示的4个组。每组含有8只小鼠。
A.5.3.测试品给药溶液制备
体积类型：根据体重调整给药体积(给药体积＝10μL/g)
表10.配制和储存的详细说明
Figure BDA0002320262930000551
A.5.4.观察
肿瘤接种后，将每天检查动物的发病率和死亡率。在常规监测时，将检查动物受到肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响，诸如活动性、食物和水的消耗、体重增加/减少、眼睛/头发无光泽以及任何其他异常影响。将根据每个子集内的动物数量记录死亡和观察到的临床体征。
每周两次用卡尺在二维上测量肿瘤大小。肿瘤体积将使用下式以mm3表示：TV＝0.5a×b2其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。
体重将每周测量两次。
A.5.5.终点
以下分析在终点时应用：TGI(肿瘤生长指数)和TC。
A.5.6.终止
在以下条件下，在死亡之前或达到昏迷状态之前，通过人道安乐死终止个体动物或整组的活体动物实验。
Figure BDA0002320262930000561
在持续恶化的情况下，有严重的痛苦和/或疼痛的严重临床体征，无法获得足够的食物或水；
Figure BDA0002320262930000562
显著体重减轻(消瘦)(>20％)；
Figure BDA0002320262930000563
肿瘤大小超过3000mm3的个体小鼠或MTV>2000mm3的整组小鼠。
A.5.7.统计分析
对于三个组或更多个组之间的比较，将进行单向ANOVA，然后进行多重比较程序。所有数据将使用SPSS 16.0分析。认为P<0.05具有统计学显著性。
A.6.依从性
本研究中涉及动物护理和使用的方案和任何修改或程序均由中美冠科机构动物护理和使用委员会(IACUC)在进行之前审查并批准。在研究期间，将按照实验室动物护理评估与鉴定协会(AAALAC)的规定进行动物的护理和使用。
B.结果
图6的结果显示了5mg/kg或更大剂量的GM103 ADC免疫缀合物的体内抗癌活性。
实施例6：另外的非妇科癌症中的AMHRII表达
A.材料和方法
A.1.通过流式细胞术的AMHRII膜表达分析
制备用于分析的细胞
-将组织在手术1小时内解剖，切成1-mm2片段，并在含有青霉素(10％)、链霉素(10％)和庆大霉素(0.1mg/mL；西格玛奥德里奇)的RPMI中洗涤。
-将组织片段用胶原酶和DNA酶(2mg/mL；西格玛奥德里奇)在37℃下快速振荡下消化2小时至4小时。
-借由通过40-lm细胞粗滤器过滤去除粘液和大碎片。
-通过Ficoll梯度离心获得活细胞。
根据制造商的使用说明，使用The QuantumTM Simply Cellular(BangsLaboratory)对重悬的肿瘤细胞上的AMHRII结合位点进行定量：
-简而言之，将标记有不同校准量的对人IgG抗体的Fc部分有特异性的小鼠抗人IgG的四个微珠群用AlexaFluor488缀合的抗AMHRII 3C23K染色。在FACS管中，将试剂盒中的每个小瓶的一滴加到50μl的PBS 1X中：
1-珠B(空白)
2-珠1+3C23K-AF 10μg/mL
3-珠2+3C23K-AF 10μg/mL
4-珠3+3C23K-AF 10μg/mL
5-珠4+3C23K-AF 10μg/mL(如果有必要，浓度可以增加至25μg/ml)。
-每个珠群结合不同量的AlexaFluor488缀合的抗AMHRII 3C23K，产生相应的荧光强度，将所述相应的荧光强度在FACS Canto II细胞仪(BD)上分析。
-通过绘制每个珠群的平均荧光强度相对于其指定的抗体结合能力(ABC)来生成校准曲线。
将细胞通常在1.5ml艾本德管中染色。
-所有离心步骤在4℃下进行。
-所有孵育步骤在4℃下进行以避免抗体内化。
-将350万个细胞(经胰蛋白酶化的COV434-MISRII或新鲜解离的肿瘤细胞)以200g至300g离心5分钟，并用PBS洗涤一次(每管500μl)。
-用冰冷的PBS/2％FBS洗涤(200g至300g，持续3min)，并重悬于700μl的PBS 1X中，并通过FACS管分配100μl，条件描述在下表11中：
表11
Figure BDA0002320262930000581
-用PBS/1％FBS中的抗体3C23K-AF488在4℃下孵育30min
-在PBS/2％BSA中洗涤两次(200g至300g，持续3min)
-在PBS中洗涤两次(200g至300g，持续3min)
-加入300μl至400μl的PBS，并尽快在FACS上分析
该方案不包括用于胞外染色的任何固定步骤，以保持膜的完整性。因此，仅检测到膜AMHRII。
A.2.通过免疫荧光的AMHRII膜表达
因此，开发了一种使用缀合至Alexa
Figure BDA0002320262930000582
488的抗AMHRII 3C23K抗体的间接免疫荧光的方法。然后用缀合至Alexa
Figure BDA0002320262930000583
647的兔抗AF488抗体和山羊抗兔抗体分两步进行信号放大。
冷冻组织切片是用保持在-20℃下的低温恒温器Leica CMD1950制成的。将冷冻的组织用OCT化合物固定在金属圆盘上，并且一旦固化后将它们固定在圆盘支架上。实现了7μm的切片，并将其放在Superfrost Plus载玻片(Menzel
Figure BDA0002320262930000584
)上，并立即在-20℃下储存。
将冷冻切片载玻片用PBS 1X再水化，然后通过用300μl冷丙酮(VWR Prolabo)覆盖它们在-20℃下固定10min，并用石蜡膜回收，以确保溶液完全回收所有组织。用PBS冲洗后，将载玻片在室温的湿盒中用300μl封闭缓冲液(PBS1X-BSA2％-山羊血清10％-Triton X1000.1％)处理1小时，以封闭抗体与组织组分之间的非特异性相互作用。将在封闭缓冲液中稀释为10μg/ml的3C23K-AF488或同种型对照R565-AF488在室温的湿盒中施加30min。用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤3次(3x10min)后，添加在封闭缓冲液中以1/500稀释的抗AF488抗体(Invitrogen)(300μl)在室温下孵育30min。用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤3次(3x10min)后，添加在封闭缓冲液中以1/500稀释的缀合的抗兔抗体AF647(Invitrogen)(300μl)在室温下孵育30min。实现用PBS1X-Triton X100 0.1％洗涤(3x10min)，然后施加0.5μg/ml的DAPI(西格玛奥德里奇)持续10min。用PBS和H2O冲洗后，将载玻片切片用一滴(50μl)DAKO荧光封固介质固定在盖玻片(24x50mm，Knittel Glass)下，避免气泡空气，并在黑暗中于4℃下储存直至使其成像。
使用配备有由Metavue软件(美谷分子仪器(Molecular Devices))控制的CoolSnap EZ CCD相机的荧光显微镜Leica DM5000B进行图像采集。使用ImageJ免费软件(http://imagej.nih.gov/ij/)进行图像后处理。
B.结果
B.1.新鲜人结肠直肠样品中的AMHRII表达
图7A、图7B、图7C和图7D描绘了来自先前从四名患有结肠直肠癌的不同个体收集的肿瘤样品的AMHRII膜表达的FACS分析。结果表明，包含在肿瘤样品中的肿瘤细胞(CD3-Epcam+)在其膜处表达AMHRII。
表12列出了先前从20名患有结肠直肠癌的不同个体收集的肿瘤样品的结果。
在表12中，通过(i)确定存在于肿瘤细胞膜处的AMHRII蛋白的平均数量和通过(ii)确定肿瘤样品中膜AMHRII阳性细胞的百分比，评估每个肿瘤样品中的AMHRII表达。表12的左栏中显示了将相应的肿瘤样品设置为“阳性”或“阴性”的指示。指示“阳性”意指AMHRII在肿瘤细胞膜处显著表达。指示“阴性”意指未显著检测到细胞膜处的AMHRII表达。
表12的结果显示，尽管有多种表达水平，但20个肿瘤样品中有15个表达了膜AMHRII。
根据肿瘤样品，每个肿瘤细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量(表12中称为“每细胞(肿瘤)的受体数量”)从540变化到超过155000。
根据肿瘤样品，膜AMHRII蛋白表达细胞的频率(表12中称为“AMHRII阳性细胞(Epcam+)的百分比”)从20％变化到100％。
表12的结果未显示出每个肿瘤细胞的膜AMHRII的平均数量与表达膜AMHRII的肿瘤细胞的频率之间的相关性。
B.2.人结肠直肠肿瘤异种移植物(患者来源的异种移植物)中的AMHRII表达
如实施例3中公开的，获得人肿瘤异种移植物样品，并使用材料和方法部分中公开的方法评估肿瘤细胞的AMHRII表达。
图8A、图8B、图8C和图8D描绘了来自先前从四名患有结肠直肠癌的不同个体收集和然后异种移植在小鼠内的肿瘤样品的AMHRII膜表达的FACS分析。结果表明，异种移植的肿瘤样品中包含的肿瘤细胞(CD3-Epcam+)在其膜处表达AMHRII。
表13呈现了先前从12名患有结肠直肠癌的不同个体收集和然后异种移植在小鼠内的肿瘤样品的结果。
在表13中，通过(i)确定存在于肿瘤细胞膜处的AMHRII蛋白的平均数量以及通过(ii)确定异种移植物肿瘤样品中膜AMHRII阳性细胞的百分比，评估每个异种移植物肿瘤样品中的AMHRII表达。
表13的结果显示，尽管有多种表达水平，但12个异种移植物肿瘤样品中有6个表达了膜AMHRII。
根据异种移植物肿瘤样品，每个细胞的膜AMHRII蛋白的平均数量(表13中称为“每细胞(Epcam+)的受体数量”)从超过16000变化到约100000。
根据肿瘤样品，膜AMHRII蛋白表达细胞的频率(表13中称为“AMHRII阳性细胞(Epcam+)的百分比”)从0.5％变化到87％。
表13的结果未显示出每个肿瘤细胞的膜AMHRII的平均数量与表达膜AMHRII的肿瘤细胞的频率之间的明显相关性。
表13的左栏中显示了将相应的肿瘤样品设置为“阳性”或“阴性”的指示。指示“阳性”意指AMHRII在肿瘤细胞膜处未显著表达。指示“阴性”意指未显著检测出肿瘤细胞的膜AMHRII表达。
B.3.新鲜肾细胞癌样品中的AMHRII膜表达
用材料和方法部分中公开的方法获得人肾细胞癌肿瘤样品，并通过FACS分析评估肿瘤细胞(EpCam+)的膜AMHRII表达。
结果描绘于图9A和图9B中。
图9A和图9B描绘了来自先前从两名患有肾细胞癌的不同个体收集的肿瘤样品的AMHRII膜表达的FACS分析。结果表明，肾细胞癌肿瘤样品中包含的肿瘤细胞(CD3-Epcam+)在其膜处表达AMHRII。
实施例7：针对表达AMHRII的非妇科癌症的抗AMHRII抗体的体内功效
A.材料和方法
将原代小鼠(来自Envigo的无胸腺裸-Foxn1nu)植入来自Champions
Figure BDA0002320262930000611
模型CTG-0401的肿瘤片段。肿瘤达到1000mm3至1500mm3后，将它们收获，并将肿瘤片段SC植入雌性研究小鼠的左侧腹。每只动物都植入了特定的传代批次：对于CTG-0401是第6代。使用数字卡尺每周两次监测肿瘤生长，并使用式(0.52×[长×宽2])计算肿瘤体积(TV)。肿瘤体积达到175±7mm3后，基于肿瘤尺寸选择小鼠，并将其随机分为4组，每组12只动物(第0天)。在第0天给药开始后，每周使用数字秤对动物称重两次，并且每周两次以及在研究的最后一天测量TV。当媒介物对照组中的平均肿瘤体积达到1500mm3或直至第60天时(以先发生者为准)，终止研究。研究设计总结在下表13中。
表13：人结肠直肠癌的模型CTG-0401中功效研究的设计
Figure BDA0002320262930000621
GM102或GM102媒介物在伊立替康或伊立替康媒介物之前施用。
B结果
该实验的结果描绘于图10中。
图10的结果显示，抗AMHRII抗体GM102对表达AMHRII的人结肠直肠肿瘤具有有效的体内抗肿瘤作用。
值得注意的是，抗AMHRII抗体GM102发挥与主要使用的抗结肠癌分子伊立替康(CAS编号：100286-90-6)的抗肿瘤作用没有区别的抗肿瘤作用。
Figure BDA0002320262930000631
Figure BDA0002320262930000641
Figure BDA0002320262930000651
Figure BDA0002320262930000661
序列表
<110> 加马玛布斯制药公司
居里研究所
<120> 用于预防或治疗癌症的AMHRII结合化合物
<130> PR77465
<140> EP17305445.3
<141> 2017-04-14
<150> EP17305445
<151> 2017-04-14
<160> 74
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL" <223> "无先导序列的3C_23 VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VL
<220>
<221> CDS
<222> 1..318
<400> 1
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 2
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 1的[CDS]:1..318
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23 VH
<220>
<221> CDS
<222> 1..345
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cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 345
<210> 4
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 3的[CDS]:1..345
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 5
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VL
<220>
<221> CDS
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<400> 5
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 5的[CDS]:1..318
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH" <223> "无先导序列的3C_23K VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K VH
<220>
<221> CDS
<222> 1..345
<400> 7
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 345
<210> 8
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 7的[CDS]:1..345
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23轻链
<220>
<221> CDS
<222> 1..639
<400> 9
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336
agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384
gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432
gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480
agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576
tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624
aac agg gga gag tgt 639
<210> 10
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 9的[CDS]:1..639
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链" <223> "无先导序列的3C_23重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23重链
<220>
<221> CDS
<222> 1..1335
<400> 11
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384
tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480
ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528
ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 12
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 11的[CDS]:1..1335
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链" <223> "无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K轻链
<220>
<221> CDS
<222> 1..639
<400> 13
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336
agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384
gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432
gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480
agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576
tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624
aac agg gga gag tgt 639
<210> 14
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 13的[CDS]:1..639
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 1335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链" <223> "无先导序列的3C_23K重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链
<220>
<223> 无先导序列的3C_23K重链
<220>
<221> CDS
<222> 1..1335
<400> 15
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384
tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480
ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528
ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 16
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体 <223> 合成构建体
来自SEQ ID NO 15的[CDS]:1..1335
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 信号肽" <223> 信号肽
<220>
<223> 信号肽
<220>
<223> 信号肽
<400> 17
Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 18
<211> 556
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 缺乏信号肽SEQ ID NO: 17的人AMHR-II" <223>
缺乏信号肽SEQ ID NO: 17的人AMHR-II
<220>
<223> 缺乏信号肽SEQ ID NO: 17的人AMHR-II
<220>
<223> 缺乏信号肽SEQ ID NO: 17的人AMHR-II
<400> 18
Pro Pro Asn Arg Arg Thr Cys Val Phe Phe Glu Ala Pro Gly Val Arg
1 5 10 15
Gly Ser Thr Lys Thr Leu Gly Glu Leu Leu Asp Thr Gly Thr Glu Leu
20 25 30
Pro Arg Ala Ile Arg Cys Leu Tyr Ser Arg Cys Cys Phe Gly Ile Trp
35 40 45
Asn Leu Thr Gln Asp Arg Ala Gln Val Glu Met Gln Gly Cys Arg Asp
50 55 60
Ser Asp Glu Pro Gly Cys Glu Ser Leu His Cys Asp Pro Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ala His Pro Ser Pro Gly Ser Thr Leu Phe Thr Cys Ser Cys Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Cys Asn Ala Asn Tyr Ser His Leu Pro Pro Pro Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gln Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ile
115 120 125
Trp Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Gly Ser Ile Ile Leu Ala Leu Leu Gln Arg Lys Asn Tyr Arg Val
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Val Pro Glu Pro Arg Pro Asp Ser Gly Arg Asp Trp
165 170 175
Ser Val Glu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Leu Cys Phe Ser Gln Val Ile
180 185 190
Arg Glu Gly Gly His Ala Val Val Trp Ala Gly Gln Leu Gln Gly Lys
195 200 205
Leu Val Ala Ile Lys Ala Phe Pro Pro Arg Ser Val Ala Gln Phe Gln
210 215 220
Ala Glu Arg Ala Leu Tyr Glu Leu Pro Gly Leu Gln His Asp His Ile
225 230 235 240
Val Arg Phe Ile Thr Ala Ser Arg Gly Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Pro Leu Leu Val Leu Glu Leu His Pro Lys Gly Ser Leu Cys His
260 265 270
Tyr Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Asp Trp Gly Ser Ser Leu Arg Met Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Glu Arg Trp Gln
290 295 300
Asn Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Ser Ser Gln
305 310 315 320
Asn Val Leu Ile Arg Glu Asp Gly Ser Cys Ala Ile Gly Asp Leu Gly
325 330 335
Leu Ala Leu Val Leu Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Trp Thr Pro
340 345 350
Thr Gln Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ile Met Glu Ala Gly Thr Gln Arg
355 360 365
Tyr Met Ala Pro Glu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Asp Leu Gln Asp Trp
370 375 380
Gly Met Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu
385 390 395 400
Trp Glu Ile Leu Ser Arg Cys Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ser Ser Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Gln Leu Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asn Thr Pro Thr
420 425 430
Ser Asp Glu Leu Trp Ala Leu Ala Val Gln Glu Arg Arg Arg Pro Tyr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Trp Arg Cys Phe Ala Thr Asp Pro Asp Gly Leu Arg
450 455 460
Glu Leu Leu Glu Asp Cys Trp Asp Ala Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr
465 470 475 480
Ala Glu Cys Val Gln Gln Arg Leu Ala Ala Leu Ala His Pro Gln Glu
485 490 495
Ser His Pro Phe Pro Glu Ser Cys Pro Arg Gly Cys Pro Pro Leu Cys
500 505 510
Pro Glu Asp Cys Thr Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ile Leu Pro Cys Arg
515 520 525
Pro Gln Arg Ser Ala Cys His Phe Ser Val Gln Gln Gly Pro Cys Ser
530 535 540
Arg Asn Pro Gln Pro Ala Cys Thr Leu Ser Pro Val
545 550 555
<210> 19
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<400> 19
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78
<220>
<223> 3C23KR/6B78
<220>
<223> 3C23KR/6B78
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5B42 <223> 5B42
<220>
<223> 5B42
<220>
<223> 5B42
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Ala Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<400> 22
Arg Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K4D-20 <223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<400> 23
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K4A-12 <223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<400> 24
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K5D05 <223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<400> 25
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K5D-14 <223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<400> 26
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K4D-123 <223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<400> 27
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<400> 28
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C14 <223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<400> 29
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C26 <223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<400> 30
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Met Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C27 <223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<400> 31
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 5C60 <223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<400> 32
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Lys Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6C13 <223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<400> 33
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6C18 <223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<400> 34
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6C54 <223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<400> 35
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 3C23K <223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-K55E <223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Pro Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<400> 41
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-S27P <223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L <223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-I33T <223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Thr
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<400> 46
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-T22P <223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-Y32D <223> L-Y32D
<220>
<223> L-Y32D
<220>
<223> L-Y32D
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-Q37H <223> L-Q37H
<220>
<223> L-Q37H
<220>
<223> L-Q37H
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-G97S <223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Ser Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-S12P <223> L-S12P
<220>
<223> L-S12P
<220>
<223> L-S12P
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-19A <223> L-19A
<220>
<223> L-19A
<220>
<223> L-19A
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-T72A <223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-R31W <223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K
<400> 55
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-I2N <223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<400> 56
Asp Asn Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C
<220>
<223> L-G63C, L-W91C
<220>
<223> L-G63C, L-W91C
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cys Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-R31G <223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-I75F <223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-I2T <223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<400> 60
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<400> 61
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-Y49H <223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr His
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<400> 63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L-T69P <223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-1
<220>
<221> 变体
<222> 4
<223> 位置4的Xaa可以是S或P
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5的Xaa可以是S或P
<220>
<221> 变体
<222> 7
<223> 位置7的Xaa可以是R或W或G
<220>
<221> 变体
<222> 8
<223> 位置8的Xaa可以是T或D
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9的Waa可以是I或T
<400> 65
Arg Ala Ser Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-2
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6的Xaa可以是K或E
<400> 66
Pro Thr Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRL-3
<400> 67
Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-1
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-1
<220>
<221> 变体
<222> 6
<223> 位置6的Xaa可以是S或T
<220>
<221> 变体
<222> 9
<223> 位置9的Xaa可以是S或G
<220>
<221> 变体
<222> 10
<223> 位置10的Xaa可以是Y或N
<400> 68
Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Xaa His Ile His
1 5 10
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-2
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-2
<220>
<221> 变体
<222> 5
<223> 位置5的Xaa可以是G或E
<400> 69
Trp Ile Tyr Pro Xaa Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-3
<220>
<223> 抗AMHRII抗体的CDRH-3
<400> 70
Gly Asp Arg Phe Ala Tyr
1 5
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AMHR2的正向引物
<220>
<223> AMHR2的正向引物
<400> 71
tctggatggc actggtgctg 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AMHR2的反向引物
<220>
<223> AMHR2的反向引物
<400> 72
agcagggcca agatgatgct 20
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBP的正向引物
<220>
<223> TBP的正向引物
<400> 73
tgcacaggag ccaagagtga a 21
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TBP的反向引物
<220>
<223> TBP的反向引物
<400> 74
cacatcacag ctccccacca 20

Claims (11)

1.人AMHRII结合剂在用于预防或治疗非妇科癌症的方法中的用途。
2.根据权利要求1所述的AMHRII结合剂的用途，其中，所述非妇科癌症选自包括以下的组：结肠癌、肝癌、肝细胞癌、睾丸癌、甲状腺癌、胃癌、胃肠癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌、肾癌、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、胸膜间皮瘤、黑素瘤、肉瘤、脑癌、骨癌、乳腺癌、前列腺癌和白血病。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂选自由以下组成的组：单克隆抗AMHRII抗体及其AMHRII结合片段。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是选自由以下抗体组成的组的单克隆抗体：
a)包含SEQ ID NO:2的轻链和包含SEQ ID NO:4的重链(无先导序列的3C23 VL序列和3C23 VH序列)；
b)包含SEQ ID NO:6的轻链和包含SEQ ID NO:8的重链(无先导序列的3C23K VL序列和3C23K VH序列)；
c)包含SEQ ID NO:10的轻链和包含SEQ ID NO:12的重链(无先导序列的3C23轻链和3C23重链)；
d)包含SEQ ID NO:14的轻链和包含SEQ ID NO:16的重链(无先导序列的3C23K轻链和3C23K重链)。
5.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是包括包含以下序列的CDR的单克隆抗体：
-CDRL-1：RASX1X2VX3X4X5A(SEQ ID NO.65)，其中，X1和X2独立地是S或P、X3是R或W或G、X4是T或D、并且X5是I或T；
-CDRL-2是PTSSLX6S(SEQ ID NO.66)，其中，X6是K或E；和
-CDRL-3是LQWSSYPWT(SEQ ID NO.67)；
-CDRH-1是KASGYX7FTX8X9HIH(SEQ ID NO.68)，其中，X7是S或T、X8是S或G、并且X9是Y或N；
-CDRH-2是WIYPX10DDSTKYSQKFQG(SEQ ID NO.69)，其中，X10是G或E；和
-CDRH-3是GDRFAY(SEQ ID NO.70)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，其中，所述结合剂由抗体药物缀合物(ADC)构成。
7.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是AMHRII结合工程化受体。
8.根据权利要求1所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是表达AMHRII结合工程化受体的细胞。
9.根据权利要求8所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂是表达AMHRII结合工程化受体的CAR T细胞或NK T细胞。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的人AMHRII结合剂的用途，所述人AMHRII结合剂与另一种抗癌治疗组合。
11.一种用于确定个体是否对如权利要求1至10中任一项所限定的使用AMHRII结合剂的癌症治疗有响应的方法，其中，所述方法包括确定先前从所述个体获得的肿瘤组织样品是否在细胞表面处表达AMHRII蛋白的步骤。
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