RU2797506C2 - Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний легкого - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение агента, связывающего AMHRII человека, в качестве активного ингредиента для предотвращения или лечения рака легкого у пациента, выбранного из эпидермоидного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC, плоскоклеточной карциномы NSCLC, плеоморфной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC. Указанный агент включает моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент. Также предложен способ определения чувствительности индивидуума, страдающего от NSCLC, к лечению рака с помощью указанного агента, связывающего AMHRII человека. Способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного индивидуума, белка AMHRII на поверхности клетки, причем индивидуум чувствителен к лечению рака с помощью указанного агента, если определено, что образец опухолевой ткани демонстрирует наличие экспрессии AMHRII на клеточной поверхности. Изобретение обеспечивает дополнительные инструменты для лечения немелкоклеточного рака легкого. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 21 ил., 12 табл., 5 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области лечения рака легкого.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рак легкого представляет собой злокачественную трансформацию и рост легочной ткани, и ежегодно приводит к смерти 1,3 миллиона человек во всем мире. Это самая распространенная причина смерти от рака у мужчин и вторая по частоте среди женщин.

Всемирная организация здравоохранения классифицирует рак легкого по четырем основным гистологическим типам: (1) плоскоклеточная карцинома (SCC), (2) аденокарцинома, (3) крупноклеточная карцинома и (4) мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC). Термин немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC) включает плоскоклеточную карциному, аденокарциному и крупноклеточную карциному.

Немелкоклеточные раки легкого (NSCLC) объединены в одну группу, так как их прогноз и лечение примерно одинаковы. Существует три основных подтипа: плоскоклеточная карцинома легкого, аденокарцинома и крупноклеточная карцинома легкого. Плоскоклеточная карцинома, на которую приходится 29% случаев рака легкого, также начинается в более крупных бронхах, но растет медленнее. Размер этих опухолей зависит от диагноза. Аденокарцинома является наиболее распространенным подтипом NSCLC, на ее долю приходится 32% случаев рака легкого. Это форма, которая начинается вблизи газообменной поверхности легкого. Большинство случаев аденокарциномы связаны с курением. Однако среди людей, которые никогда не курили («некурящие»), аденокарцинома является наиболее распространенной формой рака легкого. Подтип аденокарциномы, бронхиолоальвеолярная карцинома, чаще встречается у некурящих женщин, и может иметь различные реакции на лечение. Другими подтипами NSCLC являются нейроэндокринные опухоли легкого (NE), рак легкого ацинарного типа (AT) и крупноклеточная карцинома, быстрорастущая форма, на которую приходится 9% случаев рака легкого, который растет вблизи поверхности легкого.

Мелкоклеточный рак легкого (SCLC, также называемый «овсяно-клеточная карцинома») является менее распространенной формой рака легкого. Она имеет тенденцию начинаться в больших дыхательных трубках и быстро растет, становясь довольно крупной. Наиболее распространенным онкогеном является L-myc. «Овсяная» клетка содержит плотные нейросекреторные гранулы, которые создают ассоциацию эндокринного/паранеопластического синдрома. Первоначально он является более чувствительным к химиотерапии, но в конечном итоге имеет худший прогноз и часто при проявлении является метастатическим. Этот тип рака легкого тесно связан с курением.

Другие типы рака легкого включают карциноидную, аденокистозную карциному (цилиндрому) и мукоэпидермоидную карциному.

Раннее выявление является трудным, поскольку клинические симптомы часто не наблюдаются до тех пор, пока болезнь не достигнет поздней стадии. В настоящее время в диагностике помогают применение рентгенографии грудной клетки, анализ типа клеток, содержащихся в мокроте, и фиброскопическое исследование бронхиальных путей. Схемы лечения определяются типом и стадией рака и включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и/или химиотерапию. Несмотря на значительные исследования в области лечения этого заболевания, рак легкого по-прежнему трудно поддается лечению.

Известные способы лечения рака легкого включают хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию и таргетную терапию лекарственными средствами.

Таргетная терапия, и особенно таргетная иммунотерапия, могут быть благоприятными для пациентов с раком легкого, для которых более традиционная химиотерапия или лучевая терапия не являются эффективными. Таргетная иммунотерапия включает применение моноклональных антител.

Моноклональные антитела бевацизумаб (анти-VEGF антитело) и рамуцирумаб (анти-VEGFR2 антитело) направлены на предотвращение образования новых кровеносных сосудов опухолями, тогда как нецитумумаб (анти-EGFR) нацелен на рост посредством предотвращения действия другого фактора роста. В настоящее время существует по меньшей мере два таргетных антитела, ингибитора иммунных контрольных точек (пембролизумаб/анти-PD1 и ниволумаб/анти-PD1), утвержденных для пациентов с раком легкого. В настоящее время с помощью таких основанных на иммунной терапии средств, как ингибиторы контрольных точек, моноклональные антитела, терапевтические вакцины и адоптивная клеточная терапия, могут быть получены длительные ремиссии и более высокие показатели выживаемости.

Тем не менее, в данной области все еще остается потребность в дополнительных инструментах для лечения рака легкого, которые могут быть альтернативными или дополнительными к существующим способам лечения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к агенту, связывающему AMHRII (рецептор антимюллеровского гормона типа II) человека, для его применения для предотвращения или лечения рака легкого. Кроме того, настоящее изобретение относится к агенту, связывающему AMHRII человека, для его применения в способе предотвращения или лечения рака легкого у пациента, страдающего раком легкого.

Рак легкого может быть выбран из группы, включающей немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), и особенно NSCLC, выбранный из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

В предпочтительных вариантах реализации агент, связывающий AMHRII человека, применяют для лечения указанных выше раковых заболеваний легкого, которые экспрессируют AMHRII на клеточной мембране на достаточном уровне экспрессии.

В наиболее предпочтительных вариантах реализации указанный достаточный уровень экспрессии выражается как пороговое значение показателя экспрессии AMHRII, которое подробно описано в других разделах настоящего описания.

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII человека, состоит из моноклонального антитела к AMHRII.

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII человека, состоит из конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC).

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII человека, состоит из сконструированного AMHRII-связывающего рецептора.

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII человека, состоит из клетки, экспрессирующей сконструированный AMHRII-связывающий рецептор, такой как CAR (химерный рецептор антигена)-T-клетка или NK (естественный киллер)-T-клетка, экспрессирующая сконструированный AMHRII-связывающий рецептор.

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII, объединен с одним или более отдельным(-и) противораковым(-и) агентом(-ами).

Настоящее изобретение также относится к способу определения подходит ли индивидуум для лечения рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, как определено выше, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани легкого, предварительно полученным от указанного индивидуума, белка AMHRII на поверхности клетки.

Настоящее изобретение относится к способу определения наличия ответной реакции индивидуума на лечение рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, как определено выше, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани легкого, предварительно полученным от указанного индивидуума, белка AMHRII на поверхности клетки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 иллюстрирует аминокислотные последовательности доменов VH и VL множества вариантов моноклонального антитела 3C23. Фигура 1А иллюстрирует VH домен каждого варианта антитела. Фигура 1В иллюстрирует VL домен каждого варианта антитела.

Фигура 2 иллюстрирует экспрессию AMHRII различными линиями раковых клеток.

Фигура 2А иллюстрирует экспрессию мРНК AMHRII линиями раковых клеток. Ось абсцисс: слева направо на фигуре 2А: HCT116 (колоректальная карцинома толстой кишки), COV434-WT (гранулезная опухоль яичника человека), K562 (миелогенный лейкоз человека) и OV90 (злокачественная папиллярная серозная аденокарцинома человека). Ось ординат: уровень экспрессии мРНК AMHRII по данным количественной ПЦР в реальном времени, выраженный в относительных единицах (RQ).

Фигуры 2B-2F: мембранная экспрессия белка AMHRII теми же линиями раковых клеток, что и на фигуре 2А: HCT116 (фигура 2B), COV434-WT (фигура 2C), K562 (фигура 2D), NCI-H295R (фигура 2E) и OV90 (фигура 2F). Ось абсцисс: интенсивность сигнала флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ось ординат: количество клеток.

Фигура 3 иллюстрирует экспрессию AMHRII различными клетками рака легкого, измеренную с помощью проточной цитометрии.

Фигура 3А иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками ксенотрансплантата, полученного у пациентов с плоскоклеточной карциномой легкого (Ref Lu7860). Фигура 3B иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками ксенотрансплантата, полученного у пациентов с крупноклеточной карциномой легкого (Ref Lu7166). Фигура 3С иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками ксенотрансплантата, полученного у пациентов с плоскоклеточной карциномой легкого (Ref Lu7298). Фигура 3D иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками ксенотрансплантата, полученного у пациентов с плоскоклеточной карциномой легкого (Ref Lu7414). Фигура 3E иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками ксенотрансплантата, полученного у пациентов с плеоморфной карциномой легкого (Ref Lu7558). Ось абсцисс: интенсивность флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ось ординат: количество клеток.

Фигура 3F иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками, взятыми со здорового края хирургически резецированного NSCLC человека (профиль FACS которого показан на фигуре 3G).

Фигура 3G иллюстрирует мембранную экспрессию белка AMHRII клетками из свежего образца хирургически резецированного NSCLC человека.

На фигурах 3: (i) Пик на левой стороне: клетки, инкубированные с неродственным изотипом антитела; (ii) пик с правой стороны: клетки, инкубированные анти-AMHRII антителом 3C23K.

Ось абсцисс: интенсивность флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ось ординат: количество клеток.

Фигура 4 иллюстрирует вероятную относительную массу тела животных, которым введен ксенотрансплантат клеток рака легкого человека. Лечение начинали на 18 день после имплантации SC131. Носитель и GM102 в количестве 20 мг/кг вводили один раз в две недели в.в. (внутривенно) в течение 3 недель. Доцетаксел в количестве 20 мг/кг вводили медленно, внутривенно, однократно в D0. Цисплатин в количестве 5 мг/кг и гемцитабин в количестве 100 мг/кг вводили еженедельно, и.п. (интраперитонеально), в течение от 1 до 3 недель. Начальный размер группы: 9 животных. Ось ординат: относительная масса тела, выраженная в кг (среднее +/- СОС). Ось абсцисс: ● Носитель; ■ GM102 20 мг/кг; ▲ Доцетаксел 20 мг/кг; ▼ Комбинация GM102 и доцитаксела; ♦ Комбинация цисплатина 5 мг/кг и гемцитабина 100 мг/кг; ○ Комбинация GM102, Цисплатина и Гемцитабина.

Фигура 5 иллюстрирует изменения роста опухоли, вызванные анти-AMHRII антителом 3C23K в комбинации или без других противораковых агентов, у животных, которым введен ксенотрансплантат клеток рака легкого человека. Лечение начинали на 18 день после имплантации SC131. Носитель и GM102 в количестве 20 мг/кг вводили один раз в две недели, в.в., в течение 3 недель. Доцетаксел в количестве 20 мг/кг вводили медленно, внутривенно, однократно в D0. Цисплатин в количестве 5 мг/кг и гемцитабин в количестве 100 мг/кг вводили еженедельно, и.п., в течение от 1 до 3 недель. Начальный размер группы: 9 животных. Ось ординат: Объем опухоли, выраженный в мм³ (среднее +/- СОС). Ось абсцисс: • Носитель; ■ GM102 20 мг/кг; ▲ Доцетаксел 20 мг/кг; ▼ Комбинация GM102 и доцитаксела; ♦ Комбинация цисплатина 5 мг/кг и гемцитабина 100 мг/кг; ○ Комбинация GM102, Цисплатина и Гемцитабина.

Фигура 6 иллюстрирует противоопухолевую активность анти-AMHRII антитела 3C23K в комбинации или без других противораковых агентов у животных, которым введен ксенотрансплантат клеток рака легкого человека. Лечение начинали на 18 день после имплантации SC131. Носитель и GM102 в количестве 20 мг/кг вводили один раз в две недели, в.в., в течение 3 недель. Доцетаксел в количестве 20 мг/кг вводили медленно, внутривенно, однократно в D0. Цисплатин в количестве 5 мг/кг и гемцитабин в количестве 100 мг/кг вводили еженедельно, и.п., в течение от 1 до 3 недель. Начальный размер группы: 9 животных. Ось ординат: ТС, выраженный в процентах. Ось абсцисс: ● Носитель; ■ GM102 20 мг/кг; ▲ Доцетаксел 20 мг/кг; ▼ Комбинация GM102 и доцитаксела; ♦ Комбинация цисплатина 5 мг/кг и гемцитабина 100 мг/кг; ○ Комбинация GM102, Цисплатина и Гемцитабина.

Фигура 7 иллюстрирует изменения роста опухоли, индуцированные GM102 (анти-AMHRII антитело с низким содержанием фукозы), у животных, которым вводили ксенотрансплантат плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого. Каждая пунктирная кривая: животные с ксенотрансплантатом, которым вводили раствор носителя. Каждая непрерывная кривая: животные с ксенотрансплантатом, которым вводили GM102. Ось абсцисс: период времени после начала лечения, выраженный в днях. Ось ординат: объем опухоли, выраженный в мм³.

Фигура 8 иллюстрирует изменения роста опухоли, индуцированные GM102 (анти-AMHRII антитело с низким содержанием фукозы), у животных, которым вводили ксенотрансплантат плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого, на 28-й день после начала лечения. Фигуры 8А и 8В, ось ординат: объем опухоли, выраженный в мм³. Фигуры 8А и 8В, ось абсцисс: (i) левая сторона: животные с ксенотрансплантатом, которым вводили раствор носителя; (ii) правая сторона: животные с ксенотрансплантатом, которым вводили GM102. Фигура 8А: абсолютные результаты для каждого испытуемого животного с ксенотрансплантатом. Фигура 8В: среднее значение +/- стандартное отклонение, рассчитанное по результатам, изображенным на фигуре 8А.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что рецептор AMHRII экспрессируется на клеточной мембране тканей немелкоклеточного рака легкого и, в особенности, подтипов эпидермоидного NSCLC, аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC, плеоморфной карциномы NSCLC, плоскоклеточной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC. С другой стороны, AMHRII не был обнаружен на мембранном уровне при SCLC или NSCLC нейроэндокринных или ацинарных подтипов.

Термин «AMHR-II» обозначает рецептор человеческого антимюллерового гормона типа II. Последовательность человеческого AMHR-II описана в настоящей заявке как SEQ ID NO. 18 (без сигнального пептида MLGSLGLWALLPTAVEA (SEQ ID NO: 17).

В настоящей заявке термин «PDX» (Patient-Derived Xenograft) является аббревиатурой от выражения «ксенотрансплантат, полученный от пациента». Ксенотрансплантаты, полученные от пациента, широко применяют в in vivo моделях рака, где ткани или клетки опухоли пациента имплантированы, то есть «трансплантированы», иммунодефицитному млекопитающему, не являющемуся человеком, например, иммунодефицитной мыши.

Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, авторы настоящего изобретения обнаружили, что AMHRII экспрессируется на клеточной мембране тканей рака легкого, с переменной частотой, зависящей от рассматриваемого подтипа рака легкого.

Согласно данным авторов настоящего изобретения, в настоящей заявке впервые показана мембранная экспрессия AMHRII в клетках рака легкого.

В качестве иллюстрации, как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, AMHRII экспрессируется чаще раковыми клетками, полученными из опухолевой ткани от пациентов, страдающих от эпидермоидного или аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC рака легкого, чем раковыми клетками, полученными из опухолевой ткани от пациентов, страдающих от плоскоклеточного или крупноклеточного NSCLC. Относительно высокая обнаруженная частота означает, что онкопациенты, страдающие от одного из этих четырех типов рака легкого, чаще подходят, то есть будут чаще чувствительными к противораковому лечению, нацеленному на AMHRII, но такое противораковое лечение будет менее актуальным для лечения пациентов, страдающих от нейроэндокринного NSCLC.

Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, любой NSCLC рак легкого можно лечить с помощью агента, связывающего AMHRII, при условии, что опухолевые клетки из указанной опухоли, не относящейся к гинекологической, экспрессируют AMHRII на своей мембране, таким образом, при условии, что присутствие белков AMHRII на клеточной мембране опухоли может быть обнаружено или определено любым способом.

Таким образом, экспериментальные данные, представленные в приведенных в настоящей заявке примерах, показывают, что один и тот же агент, связывающий AMHRII, в данном случае моноклональное антитело к AMHRII, эффективен для лечения множества отдельных видов NSCLC рака легкого при условии, что целевой белок AMHRII экспрессируется на мембране опухолевых клеток.

Впрочем, в области противораковых активных ингредиентов, состоящих из молекул, связывающие мишень, таких как антитела, связывающие мишень, ситуация, где один и тот же активный ингредиент эффективен для лечения множества отдельных видов рака, не является беспрецедентной. В качестве иллюстрации, анти-PD1 антитело под названием пембролизумаб было одобрено Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) в качестве активного ингредиента, подходящего для лечения разнообразия различных видов раковых заболеваний, при условии, что указанные раковые заболевания имеют одинаковые физиологические особенности.

В настоящей заявке экспрессия AMHRII на клеточной мембране клеток рака легкого обозначает, что указанные клетки рака легкого экспрессируют AMHRII на заданном уровне, который может быть количественно измерен, или выше указанного уровня, который может быть количественно измерен.

Согласно некоторым вариантам реализации ответная реакция индивидуума, страдающего от рака легкого, на лечение с помощью молекулы, связывающей AMHRII, может быть оценена посредством определения наличия экспрессии AMHRII клетками рака легкого из образца, предварительно полученного от указанного индивидуума, на их мембранах.

Согласно некоторым вариантам реализации ответная реакция индивидуума, страдающего от рака легкого, на лечение с помощью молекулы, связывающей AMHRII, может быть оценена посредством определения наличия экспрессии AMHRII клетками рака легкого из образца, предварительно полученного от указанного индивидуума, на их мембранах выше определенной пороговой величины.

Уровень мембранной экспрессии AMHRII, который можно применять в некоторых вариантах реализации для определения наличия ответной реакции пациента, страдающего от негинекологического рака, на лечение агентом, связывающим AMHRII, например, анти-AMHRII антителом, можно оценивать различными способами, которые включают (i) процент опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, которые экспрессируют AMHRII на их мембране, (ii) среднее количество белков AMHRII на мембране опухолевой клетки и (iii) сигнальный FACS профиль AMHRII опухолевых клеток, содержащихся в тестируемом образце опухолевых клеток.

Согласно некоторым вариантам реализации клетки рака легкого, содержащиеся в образце опухоли, предварительно полученном от индивидуума, страдающего от рака легкого, можно оценивать как экспрессирующие мембранный AMHRII, когда мембранный AMHRII обнаруживают в 5% или более опухолевых клеток легкого, содержащихся в указанном образце опухоли.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации индивидуум, страдающий от рака легкого, считается имеющим ответную реакцию на лечение агентом, связывающим AMHRII, когда 5% или более опухолевых клеток легкого, содержащихся в образце опухоли, предварительно полученном от указанного индивидуума, экспрессируют AMHRII на их мембране.

Способы определения частоты (например, процента) опухолевых клеток, экспрессирующих мембранные белки AMHRII, раскрыты в других разделах настоящей заявки, включая приведенные в настоящей заявке примеры.

Согласно некоторым вариантам реализации ответная реакция пациента, страдающего от рака легкого, на лечение рака с помощью агента, связывающего AMHRII, например, анти-AMHRII антитела, можно оценить путем определения среднего количества белков AMHRII, присутствующих на мембране опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, предварительно полученном от указанного пациента.

В некоторых вариантах реализации пациента, страдающего от рака легкого, можно классифицировать как имеющего ответную реакцию на лечение агентом, связывающим AMHRII, например, имеющего ответную реакцию на лечение анти-AMHRII антителом, когда среднее количество мембранных белков AMHRII, экспрессируемых опухолевыми клетками, содержащимися в образце опухоли, предварительно полученном от указанного пациента, составляет 10000 белков AMHRII или более.

Оценка количества белков AMHRII, экспрессируемых на мембране опухолевых клеток легкого, может быть выполнена с применением традиционных способов, включающих (а) стадию инкубации образца, содержащего клетки образца опухолевой ткани, предварительно полученного от пациента, с определяемым соединением, которое специфически связывается с белком AMHRII, таким как флуоресцентно меченное анти-AMHRII антитело, и дополнительно (b) стадию определения количества указанных определяемых соединений, например, количество флуоресцентно меченных анти-AMHRII антител, связанных с каждой тестируемой клеткой указанного образца. Оценку количества белков AMHRII, экспрессируемых на мембране опухолевых клеток, можно проводить, например, с применением хорошо известного метода флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS), как это показано в приведенных примерах настоящей заявки.

В других вариантах реализации пациента, страдающего от рака легкого, можно классифицировать как имеющего ответную реакцию на лечение агентом, связывающим AMHRII, например, классифицировать как имеющего ответную реакцию на лечение анти-AMHRII антителом, посредством анализа FACS профиля AMHRII опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, предварительно полученном от указанного пациента.

В других вариантах реализации пациента, страдающего от рака легкого, можно классифицировать как имеющего ответную реакцию на лечение агентом, связывающим AMHRII, например, классифицировать как имеющего ответную реакцию на лечение анти-AMHRII антителом, когда в способе флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) соотношение (i) величины средней интенсивности флуоресценции (MFI), полученной для опухолевых клеток, инкубированных с изотипическим флуоресцентно меченным антителом, к (ii) средней интенсивности флуоресценции опухолевых клеток, инкубированных с анти-AMHRII флуоресцентно меченным антителом, составляет 1,5 или более.

Для определения указанного соотношения средней интенсивности флуоресценции как изотипическое антитело, так и анти-AMHRII антитело метят одним и тем же флуоресцентным агентом, таким как краситель Alexa Fluor 488, продаваемый компанией ThermoFisher Scientific, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах.

В некоторых дополнительных вариантах реализации ответная реакция индивидуума, имеющего рак легкого, на лечение агентом, связывающим AMHRII, можно определять путем вычисления показателя экспрессии AMHRII, позволяющего различать (i) экспрессирующие мембранный AMHRII клетки рака легкого, полученные из рака легкого, которые можно лечить агентом, связывающим AMHRII, и (ii) экспрессирующие мембранный AMHRII клетки рака легкого, полученные из рака легкого, которые нельзя лечить агентом, связывающим AMHRII.

Таким образом, авторы настоящего изобретения определили, что пациенты, страдающие от рака легкого, которые особенно подходят для лечения рака с помощью агента, связывающего AMHRII, описанного в настоящем документе, т.е. которые особенно чувствительны к лечению рака с помощью агента, связывающего AMHRII, описанного в настоящей заявке, включают пациентов, которые имеют раковые опухоли, экспрессирующие AMHRII на клеточной мембране на достаточно высоком уровне, чтобы представлять соответствующие клеточные мишени, подлежащие уничтожению.

Затем, согласно этим дополнительным вариантам реализации авторы настоящего изобретения определили, что минимальный уровень экспрессии AMHRII, измеренный в образце раковых клеток от пациента, страдающего от рака легкого, может подтвердить, что указанный пациент имеет ответную реакцию на лечение с помощью агента, связывающего AMHRII, и что указанного пациента, таким образом, можно лечить с помощью агента, связывающего AMHRII, описанного в настоящей заявке.

Таким образом, ответную реакцию индивидуума, страдающего от рака легкого, на лечение агентом, связывающим AMHRII, также можно определять, когда уровень экспрессии AMHRII клетками рака легкого, содержащимися в образце, предварительно полученном от указанного индивида, оценивают с помощью как определения (i) частоты опухолевых клеток, экспрессирующих мембранный AMHRII, например, процента опухолевых клеток, экспрессирующих AMHRII на их мембране, так и (ii) уровня мембранной экспрессии AMHRII указанными опухолевыми клетками, например, среднего количества мембранных белков AMHRII на клетку.

Таким образом, в некоторых из этих дополнительных вариантов реализации авторы настоящего изобретения определили, что для ответной реакции пациента, страдающего от рака легкого, на агент, связывающий AMHRII человека, например, анти-AMHRII антитело человека, необходимо, чтобы в образце опухолевых клеток, предварительно полученных от указанного пациента, (i) опухолевые клетки, содержащиеся в указанном образце, демонстрировали минимальное среднее количество белков AMHRII человека на их мембране, и (ii) частота клеток, экспрессирующих AMHRII человека на их мембране, например, процент клеток, экспрессирующих AMHRII человека на их мембране, имела по меньшей мере пороговое значение.

Соответственно, в настоящей заявке также описан дополнительный способ, который также можно применять для определения конкретного значения показателя экспрессии AMHRII, позволяющего различить (i) пациентов с раком легкого, которые не подходят для лечения рака с помощью агента, связывающего AMHRII, т.е. пациентов с раком легкого, которые не имеют ответной реакции на лечение рака с помощью агента, связывающего AMHRII, и (ii) пациентов с раком легкого, которые подходят для лечения рака с помощью агента, связывающего AMHRII, то есть пациентов с раком легкого, которые имеют ответную реакцию на лечение рака с помощью агента, связывающего AMHRII, например, антитела против AMHRII человека.

Более конкретно, согласно вариантам реализации вышеупомянутого способа пациенты, страдающие от рака легкого, описанные в настоящей заявке, и которые могут получать лечение рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, как описано в настоящей заявке, предпочтительно представляют собой пациентов, у которых определенное значение показателя мембранной экспрессии AMHRII составляет 1,0 или более.

Показатель мембранной экспрессии AMHRII может быть основан на иммуногистохимической оценке экспрессии AMHRII протестированными клетками рака легкого, и представляет собой среднее значение показателей мембранной экспрессии AMHRII, определенное из множества образцов клеток рака легкого, полученных от отдельных индивидуумов, страдающих от рака легкого, и при этом индивидуальный показатель мембранной экспрессии AMHRII для данного образца раковых клеток (i) обозначают равным 0, если детектируется отсутствие экспрессии AMHRII, (ii) обозначают равным 1, если детектируется значительная экспрессия AMHRII, и (iii) обозначают равным 2, если детектируется высокая экспрессия AMHRII, и (iv) обозначают равным 3, если детектируется избыточная экспрессия AMHRII.

Действительно, существует взаимосвязь между (i) показателем, заданным для уровня мембранной экспрессии AMHRII посредством вышеописанной иммуногистохимической оценки, и (ii) средним количеством экспрессируемых белков AMHRII на клетку рака легкого. В приведенных в настоящей заявке примерах показано, что уровень мембранной экспрессии AMHRII, позволяющий задавать индивидуальный показатель мембранной экспрессии AMHRII, также можно оценивать путем определения среднего количества мембранных белков AMHRII на клетку, начиная с образца клеток опухоли легкого, который был предварительно получен от пациента, страдающего от рака легкого.

Согласно вышеописанным вариантам реализации определения наличия ответной реакции индивидуума, страдающего от рака легкого, на лечение агентом, связывающим AMHRII, то есть к лечению анти-AMHRII антителом, для данного образца клеток рака легкого определяют показатель мембранной экспрессии AMHRII, принимая во внимание как (i) частоту AMHRII-экспрессирующих клеток в указанном образце клеток рака легкого, так и (ii) уровень мембранной экспрессии AMHRII указанными AMHRII-экспрессирующими клетками. Как правило, показатель мембранной экспрессии AMHRII данного образца клеток рака легкого определяют по следующей формуле (I):

E-SCORE=FREQ×AMHRII_LEVEL, где

- E-SCORE обозначает значение показателя мембранной экспрессии AMHRII для данного образца клеток рака легкого,

- FREQ обозначает частоту клеток, содержащихся в указанном образце клеток рака легкого, для которых обнаружена мембранная экспрессия AMHRII, и

- AMHRII_LEVEL обозначает уровень мембранной экспрессии AMHRII AMHRII-экспрессирующими клетками, содержащимися в указанном образце данных клеток рака легкого.

В качестве иллюстрации, E-SCORE равный 1,0 определяют для данного образца клеток рака легкого, где (i) 50% клеток экспрессируют AMHRII (значение FREQ составляет 0,5) и (ii) уровень экспрессии AMHRII (AMHRII_LEVEL) составляет 2.

В некоторых вариантах реализации показатель экспрессии AMHRII (или E-SCORE) определяют иммуногистологическими методами, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах. Согласно этим предпочтительным вариантам реализации мембранную экспрессию AMHRII оценивают с применением детектируемого антитела, специфичного к AMHRII, и посредством (i) определения частоты клеток, с которыми связано указанное анти-AMHRII антитело, и (ii) определения интенсивности сигнала, генерируемого указанным детектируемым анти-AMHRII антителом после его связывания с экспрессируемым на мембране AMHRII.

Хотя, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах, клетки рака легкого, экспрессирующие мембранный AMHRII, имеющие показатель экспрессии AMHRII 1,0 или более, были определены для различных видов рака легкого, хотя и с разными частотами.

Для определения уровня мембранной экспрессии AMHRII наиболее предпочтительно проводить детектирование AMHRII на клеточной мембране с применением моноклонального антитела к AMHRII, обладающего высокой аффинностью и высокой специфичностью к AMHRII, что проиллюстрировано в примерах с помощью моноклонального антитела к AMHRII 3C23K.

Кроме того, определение наличия экспрессии AMHRII иммуногистохимическим методом с целью определения показателя экспрессии AMHRII наиболее предпочтительно включает тщательную предварительную обработку образца ткани легкого перед приведением указанного образца в контакт с подходящим реагентом для детектирования (например, высокоаффинным моноклональным антителом к AMHRII, таким как моноклональное антитело 3C23K, имеющее значение Kd равное 55,3 пМ для связывания с AMHRII). Предварительная обработка образца должна обеспечивать повышение доступности реагента для детектирования молекул AMHRII, экспрессируемых на поверхности клетки. В качестве иллюстрации, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах, способ предварительной обработки включает соответствующую комбинацию определенных стадий, таких как (i) высокотемпературная депарафинизация посредством воздействия источника микроволнового излучения и (ii) система для амплификации сигнала, генерируемого связыванием AMHRII-связывающего реагента, такого как биотинилированное анти-AMHRII антитело, которое впоследствии может образовать комплекс со стрептавидин-конъюгированным детектируемым реагентом. Стадия депарафинизации перед обработкой является важной для устранения эффекта ослабления сигнала детектирования из-за предшествующей стадии фиксации ткани. Авторы настоящего изобретения показали, что способность AMHRII к детектированию особенно чувствительна к действию формалина, который применяют на стадии фиксации ткани.

Это означает, что, хотя агент, связывающий AMHRII, может быть подходящим терапевтическим агентом для лечения пациентов, страдающих от рака легкого, предпочтительно предварительно исследовать экспрессию AMHRII раковыми клетками, полученными из опухоли легкого, для принятия решения о введении конкретному пациенту агента, связывающего AMHRII, как описано в настоящей заявке.

Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что анти-AMHRII антитела можно предпочтительно применять для лечения рака легкого.

Таким образом, авторы настоящего изобретения показали, что фармацевтические агенты, нацеленные на AMHRII, подходят в качестве новых терапевтических средств для предотвращения или лечения таких видов рака, и особенно NSCLC, выбранного из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC и плоскоклеточную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

Согласно настоящему изобретению выражение «содержащий», например в выражении «содержащий стадию», также следует понимать как «состоящий из», например в выражении «состоящий из стадий», также следует понимать как «состоящий из», например «состоящий из стадий».

Рецептор AMH (AMHR или AMHR2 или AMHRII) представляет собой серин/треонинкиназу с одним трансмембранным доменом, принадлежащим к семейству рецепторов типа II TGF-β-связанных белков. Рецепторы типа II связывают лиганд сами по себе, но требуют присутствия рецептора типа I для передачи сигнала. Imbeaud и другие (1995, Nature Genet, Vol. 11: 382-388,) клонировали ген рецептора AMH типа II человека. Белок рецептора AMH человека состоит из 573 аминокислот: 17, 127, 26 и 403 из 573 аминокислот образуют сигнальную последовательность, внеклеточный домен (ECD), трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен серин/треонинкиназы, соответственно.

В настоящей заявке термин «AMHRII» относится к рецептору человеческого антимюллерового гормона типа II, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 17.

Экспрессия рецептора антимюллерового гормона (AMHRII) уже была описана в данной области техники для гинекологических раковых заболеваний, опухолей, которые в основном инфильтрированы иммунными миелоидными клетками. AMHRII был идентифицирован как молекула-мишень для лечения гинекологического рака. Антитела, направленные на AMHRII, были получены в качестве терапевтических средств для лечения этих видов рака. В частности, можно привести анти-AMHRII антитело 12G4 и его варианты, описанные в заявках PCT № WO 2008/053330 и WO 2011/141653, для лечения рака яичников, а также анти-AMHRII антитело 3C23K, описанное в заявке РСТ. Также можно упомянуть заявку PCT № WO 2017/025458, в которой описана конкретная стратегия лечения рака яичника с применением конъюгатов анти-AMHRII антитело-лекарственное средство.

Экспрессия гена рецептора антимюллерового гормона (ген AMHRII) также была описана Beck et al. (2016, Cell Reports, Vol. 16: 657-671). Эти авторы показали, что передача сигналов AMH была важным фактором для пластичности эпителия, передачи сигналов выживания и селективной устойчивости к лекарственным средствам при NSCLC. В работе Beck и соавторы (2016) предложили понимание внутриклеточных механизмов патогенеза NSCLC, в частности, посредством модуляции экспрессии различных представляющих интерес генов с помощью миРНК, идентификации и характеристики предварительно неопределенной аутокринной сигнальной оси в подмножестве опухолей NSCLC, включая антимюллеровый гормон и его рецептор типа II, как важный для реакции на ингибитор Hsp90 ганетеспиб и на одобренный химиотерапевтический препарат цисплатин. Эти авторы в экспериментах вестерн-блоттинга также обнаружили низкое содержание белков AMH и AMHR2, присутствующих в клетках трех клеточных линий, а именно A549 и H1299, образование которых блокируется путем нацеливания соответствующих генов с помощью миРНК.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что AMHRII также экспрессируется на поверхности различных клеток рака легкого человека, которые включают, в частности, клетки немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и, еще более конкретно, NSCLC, выбранных из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC и плоскоклеточную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC. Авторы настоящего изобретения также показали, что не существует связи между (i) экспрессией гена AMHRII раковыми клетками и (ii) экспрессией белка AMHRII на клеточной мембране теми же раковыми клетками.

Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, касающиеся поверхностной экспрессии AMHRII клетками рака легкого человека, в основном получены с помощью иммуногистохимических анализов с анти-AMHRII антителом, которые были выполнены с применением образцов ткани опухоли легкого человека, предварительно полученных от пациентов, страдающих от рака легкого. Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, касающиеся поверхностной экспрессии AMHRII клетками рака легкого человека, также были получены с помощью иммуногистохимических анализов с анти-AMHRII антителом, которые были выполнены с применением образцов опухолевой ткани легкого, происходящих из ксенотрансплантатов первичных клеток рака легкого человека у мышей.

Авторы настоящего изобретения также показали, что анти-AMHRII антитела подходят для лечения рака легкого человека, который экспрессирует AMHRII на поверхности опухолевых клеток, и особенно тех раковых заболеваний легкого, экспрессирующих AMHRII, которые раскрыты в настоящей заявке, которые включают немелкоклеточный рак легкого и особенно эпидермоидный NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, и плоскоклеточную карциному NSCLC, и нейроэндокринный NSCLC. Примечательно, что хорошая противораковая активность была показана с анти-AMHRII антителами, а также с анти-AMHRII антителами в комбинации с химическим противораковым агентом, таким как хорошо известные противораковые агенты доцетаксел, цисплатин и/или гемцитабин.

Авторы настоящего изобретения показали, что анти-AMHRII антитело, для которого доказана противоопухолевая эффективность против AMHRII-экспрессирующего гинекологического рака в данной области, также подходит для предотвращения или лечения AMHRII-экспрессирующего рака легкого, и особенно тех видов AMHRII-экспрессирующего рака легкого, которые раскрыты в настоящей заявке, таких как немелкоклеточный рак легкого и особенно эпидермоидный NSCLC, аденокарцинома NSCLC, крупноклеточный NSCLC и плоскоклеточная карцинома NSCLC, плеоморфная карцинома NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

Более конкретно, в приведенных в настоящей заявке примерах показано, что анти-AMHRII антитело, названное 3C23K, проявляет противоопухолевую активность in vivo против рака легкого человека, и особенно против немелкоклеточного рака легкого, раскрытого в настоящей заявке, в том числе, когда лечение указанным анти-AMHRII антителом комбинируют с лечением одним или более отдельными противораковыми агентами, такими как доцетаксел, цисплатин и/или гемцитабин.

Кроме того, авторы настоящего изобретения также показали, что анти-AMHRII антитело 3C23K не вызывает обнаруживаемых токсических явлений in vivo и, в частности, значительной потери массы тела.

Таким образом, настоящее изобретение относится к агенту, связывающему AMHRII человека, для его применения для предотвращения или лечения рака легкого, особенно немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и, более конкретно, немелкоклеточных раков легкого (NSCLC), выбранных из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному и нейроэндокринный NSCLC.

Настоящее изобретение также относится к применению агента, связывающего AMHRII человека, для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, и особенно рака легкого, выбранного из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или лечения рака легкого, и особенно рака легкого, выбранного из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC, где указанный способ включает стадию введения индивидууму, нуждающемуся в этом, агента, связывающего AMHRII, как описано в настоящей заявке.

Агент, связывающий AMHRII, который можно применять согласно настоящему изобретению, не требует имитации активности природного лиганда MIS. Таким образом, нет необходимости в том, чтобы агент, связывающий AMHRII, который можно применять согласно настоящему изобретению, активировал любой путь передачи сигналов клетки при его связывании с AMHRII. Вместо этого необходима только способность указанного агента связываться с AMHRII, поскольку указанный агент применяют исключительно для таргетирования на индуцирующую цитотоксичность активность, например, индуцирующую цитотоксичность единицу, которая охватывает цитотоксический анти-AMHRII иммуноконъюгат, индуцирующее ADCC (антителозависимая клеточная цитотоксичность) или индуцирующее ADC анти-AMHRII антитело или CAR-Т-клетку, экспрессирующую сконструированный AMHRII-связывающий рецептор.

Агент, связывающий AMHRII

В настоящей заявке агент, связывающий AMHRII, охватывает любой агент, который специфически связывается с AMHRII и который, когда представлен соответствующим образом, вызывает гибель клеток-мишеней, экспрессирующих AMHRII на их поверхности, после связывания указанного агента с экспрессированным на клеточной мембране AMHRII.

Агент, связывающий AMHRII, который применяют для лечения рака легкого, как описано в настоящей заявке, также можно называть «терапевтическим агентом, связывающим AMHRII».

Как правило, агент, связывающий AMHRII, охватывает белок или нуклеиновую кислоту, которая специфически связывается с AMHRII.

Связывающие AMHRII белки в основном охватывают белки, содержащие один или более участков, определяющих комплементарность (CDR), которые происходят из анти-AMHRII антитела или AMHRII-связывающего фрагмента анти-AMHRII антитела, при этом следует понимать, что указанные AMHRII-связывающие белки могут экспрессироваться как химерные рецепторы антигена (CAR) с помощью сконструированных клеток, таких как CAR-T-клетки, NK-T-клетки или CAR-макрофаги.

Связывающие AMHRII нуклеиновые кислоты в основном охватывают аптамеры нуклеиновых кислот, которые были специально выбраны по их специфическим свойствам связывания с AMHRII.

В некоторых предпочтительных вариантах реализации агент, связывающий AMHRII, представляет собой анти-AMHRII антитело или его AMHRII-связывающий фрагмент.

В наиболее предпочтительных вариантах реализации агент, связывающий AMHRII, представляет собой моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент.

В соответствии с этими предпочтительными вариантами реализации моноклональные антитела к AMHRII охватывают анти-AMHRII химерные антитела, анти-AMHRII гуманизированные антитела и человеческие анти-AMHRII антитела, а также AMHRII-связывающие фрагменты и их AMHRII-связывающие производные.

Различные анти-AMHRII антитела известны в данной области техники и могут быть применены согласно настоящему изобретению в качестве агентов, связывающих AMHRII. Для реализации настоящего изобретения специалист в данной области может применять, например, рекомбинантный человеческий анти-AMHRII, продаваемый Creative Biolabs под номером MHH-57.

В некоторых вариантах реализации анти-AMHRII антитело, которое можно применять согласно настоящему изобретению, представляет собой гуманизированное антитело 12G4, раскрытое в заявке PCT № WO 2008/053330.

В некоторых других вариантах реализации указанные анти-AMHRII антитела представляют собой гуманизированные антитела, описанные в заявке PCT № WO 2011/141653, в которых гуманизированные антитела охватывают антитела 3C23, а также их варианты, при этом их варианты включают гуманизированное антитело 3C23K.

В других дополнительных вариантах реализации указанные анти-AMHRII антитела представляют собой антитела, описанные в заявке РСТ № WO 2017/025458. Согласно этим дополнительным вариантам реализации в заявке PCT № WO 2017/025458 раскрыты агенты, связывающие AMHRII, в форме конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), где указанные анти-AMHRII антитела связаны с цитотоксическим агентом.

Моноклональное антитело против рецептора мюллерового гормона типа II (и его гуманизированные производные) было разработано в данной области техники для лечения рака яичников (см. ЕР 2097453B1 и патент США № 8278423, который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте).

Среди агентов, связывающих AMHRII, которые можно применять согласно настоящему изобретению, специалист в данной области техники может применять моноклональное антитело 12G4 (mAb 12G4) или его химерные или гуманизированные варианты, включая такое антитело, которое было дериватизировано с лекарственным средством или детектируемой меткой для образования ADC. Гибридома, продуцирующая mAbl2G4, депонирована в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Франция), в соответствии с условиями Будапештского договора, 26 сентября 2006 г.) и имеет номер депозита CNCM 1-3673. Вариабельный домен легкой и тяжелой цепей mAb 12G4 был секвенирован, как и участки, определяющие комплементарность (CDR) mAb 12G4 (см. EP 2097453B1 и патент США № 8278423, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки). mAb 12G4 и его химерные или гуманизированные варианты можно применять для получения ADC, как описано в настоящей заявке.

В заявке PCT № PCT/FR2011/050745 (международная публикация № WO/2011/141653) и патенте США № 9012607, каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки, раскрыты новые гуманизированные антитела, полученные из мышиных антител 12G4. Эти гуманизированные антитела можно применять в качестве агентов, связывающих AMHRII, для реализации назначения настоящего изобретения. В конкретных вариантах реализации, раскрытых в заявке PCT № WO/2011/141653, антитела представляют собой антитела, идентифицированные как 3C23 и 3C23K. Последовательности нуклеиновых кислот и полипептидные последовательности этих антител представлены в настоящей заявке как SEQ ID NO: 1-16. В некоторых аспектах настоящего изобретения представляющие интерес анти-AMHRII антитела называются как «содержащие легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: , и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: ». Таким образом, в различных вариантах реализации особенно предпочтительные антитела, в том числе для получения ADC, включают:

а) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 4 (безлидерные последовательности VL и VH 3C23);

b) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 6, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 8 (безлидерные последовательности VL и VH 3C23K);

c) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 10, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 12 (безлидерные легкая и тяжелая цепи 3C23);

d) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 14, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 16 (безлидерные легкая и тяжелая цепи 3C23K).

Другие антитела (например, гуманизированные или химерные антитела), которые могут иметь в основе последовательности тяжелой и легкой цепей, представленные на фигурах 1А и 1В (например, антитела, такие как гуманизированные или химерные антитела, содержащие последовательности CDR, раскрытые на фигурах), можно применять в качестве представляющих интерес анти-AMHRII-связывающих агентов, в том числе для получения ADC. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению анти-AMHRII антител, включающих/содержащих CDR, включающих (или состоящих из) следующие последовательности:

- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NO. 65), где X1 и X2 независимо представляют собой S или P, X3 представляет собой R, или W, или G, X4 представляет собой T или D, и X5 представляет собой I или T;

- CDRL-2 представляет собой PTSSLX6S (SEQ ID NO. 66), где X6 представляет собой K или E; и

- CDRL-3 представляет собой LQWSSYPWT (SEQ ID NO. 67);

- CDRH-1 представляет собой KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NO. 68), где X7 представляет собой S или T, X8 представляет собой S или G, и X9 представляет собой Y или N;

- CDRH-2 представляет собой WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NO. 69), где X10 представляет собой G или E, и

- CDRH-3 представляет собой GDRFAY (SEQ ID NO. 70).

Настоящее изобретение также относится к применению ADC, образованных с применением таких анти-AMHRII антител, для лечения рака легкого, и особенно немелкоклеточного рака легкого и мелкоклеточного рака легкого.

Антитела (например, химерные или гуманизированные) в объеме настоящей заявки включают антитела, описанные в следующей таблице: В качестве альтернативы, человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с AMHR-II, можно применять для получения ADC. Антитело 3C23K определяют как:

-SEQ ID NO: 19 для аминокислотной последовательности VH,

-SEQ ID NO: 36 для аминокислотной последовательности VL.

Ниже в таблице 1 перечислены гуманизированные анти-AMHRII антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению.

Таблица 1: анти-AMHRII антитела

Антитело	Мутации
	Мутации VH	SEQ ID в перечне последовательностей	Мутации VL	SEQ ID в перечне последовательностей
3C23K		19		36
3C23		19	L-K55E	37
3C23KR	H-R3Q	20		36
6B78	H-R3Q	20	L-T48I, L-P50S	38
5B42	H-R3Q, H-T73A	21	L-T48I, L-K55E	39
K4D-24	H-Q1R	22		36
6C59	H-Q1R	22	L-S27P, L-S28P	40
K4D-20	H-Y32N	23		36
K4A-12	H-A16T	24		36
K5D-05	H-S31G	25		36
K5D-14	H-T28S	26		36
K4D-123	H-R44S	27		36
K4D-127	H-I69T	28		36
6C07	H-I69T	28	L-M4L, L-T20A	41
5C14	H-I69F	29		36
5C26	H-V67M	30	L-S27P	42
5C27	H-L45P	31		36
5C60	H-E10K, H-K12R	32		36
6C13	H-G53E	33		36
6C18	H-T93A	34		36
6C54	H-S84P	35	L-M4L, L-S9P, L-R31W	43
K4D-25		19	L-M4L	44
K4A-03		19	L-I33T	45
K4A-08		19	L-M4L, L-K39E	46
K5D-26		19	L-T22P	47
5C08		19	L-Y32D	48
5C10		19	L-S27P	42
5C18		19	L-Q37H	49
5C42		19	L-G97S	50
5C44		19	L-S12P	51
5C52		19	L-19A	52
5C56		19	L-T72A	53
6C03		19	L-R31W	54
6C05		19	L-M4L, L-M39K	55
6C16		19	L-I2N	56
6C17		19	L-G63C, L-W91C	57
6C28		19	L-R31G	58
725C02		19	L-I75F	59
725C17		19	L-I2T	60
725C21		19	L-I2T, L-K42R	61
725C33		19	L-Y49H	62
725C42		19	L-M4L, L-T20S, L-K39E	63
725C44		19	L-S27P	42
725C57		19	L-T69P	64

Анти-AMHRII антитела, AMHRII-связывающие фрагменты или AMHRII-связывающие производные анти-AMHRII антител

Термин «антитело» используется в самом широком смысле и включает моноклональные антитела (включая полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител (см. ниже), если они проявляют желаемую биологическую активность.

Таким образом, в настоящей заявке термин «антитело» в совокупности относится к иммуноглобулинам или иммуноглобулиноподобным молекулам, включая, в качестве примера и без ограничения, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их комбинации и аналогичные молекулы, продуцируемые во время иммунного ответа у любого позвоночного, например, у млекопитающих, таких как люди, козы, кролики и мыши, а также у видов, не относящихся к млекопитающим, например, иммуноглобулины акул. Если специально не указано иное, термин «антитело» включает интактные иммуноглобулины и «фрагменты антитела» или «антигенсвязывающие фрагменты», которые специфически связываются с AMHRII, что существенно исключает связывание с другими молекулами (т.е. молекулами, неродственными по отношению к AMHRII). Термин «антитело» также включает генетически сконструированные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (такие как биспецифичные антитела). См. также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 7^th Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 2013.

В настоящей заявке термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигена. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор «моноклональный» не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены посредством гибридомного способа, впервые описанного Kohler и соавторами, Nature 256:495 (1975), или могут быть получены с помощью методов рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием технологий, описанных у Clackson и соавторов, Nature 352:624-628 (1991) или Marks и соавторов, J. MoI Biol. 222:581-597 (1991), например.

Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к антигенным определяющим вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, антитела scFv и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

Термин «тяжелая цепь антитела» в настоящей заявке относится к большей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антитела в их природных конформациях.

Термин «легкая цепь антитела» в настоящей заявке относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антитела в их природных конформациях, κ и λ легкие цепи относятся к двум основным изотипам легкого цепей антител.

В настоящем документе термин «определяющая комплементарность область» или «CDR» относится к части двух вариабельных цепей антител (тяжелой и легкой цепей), которые распознают и связываются с конкретным антигеном. CDR представляют собой наиболее вариабельную часть вариабельных цепей и обеспечивают антитело со своей специфичностью. На каждой из вариабельной тяжелой (VH) цепи и вариабельной легкой (VL) цепи существует три CDR, и, таким образом, на молекулу антитела приходится всего шесть CDR. CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи обычно обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, пронумерованные последовательно, начиная с N-конца, и также обычно идентифицируются цепью, в которой находится конкретный CDR. Таким образом, VHCDR3 расположен в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором он обнаружен, тогда как VLCDR1 представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором он обнаружен. Антитело, которое связывает LHR, будет иметь специфическую VH-область и последовательность VL-области и, следовательно, специфические последовательности CDR. Антитела с различной специфичностью (то есть разными сайтами связывания для разных антигенов) имеют разные CDR. Хотя именно CDR варьируются от антитела к антителу, только ограниченное число положений аминокислот в CDR непосредственно участвует в связывании антигена. Эти положения в CDR называются остатками, определяющими специфичность (SDR).

«Каркасные области» (далее FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличающиеся от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно имеет четыре FR, идентифицированные как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определены согласно Kabat, остатки FR легкой цепи расположены примерно в остатках 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), и тяжелые остатки FR цепи расположены примерно в остатках 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи.

Фрагменты «одноцепочечных Fv» или «scFv» антител содержат домены VH и VL антител, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать необходимую структуру для связывания антигена. В качестве обзора scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, VoI 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем фрагменты одержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH и VL). При применении линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание двух доменов в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Диатела или биспецифические антитела можно условно разделить на две категории: молекулы, подобные иммуноглобулину G (IgG), и молекулы, не являющиеся подобными IgG. IgG-подобные bsAb сохраняют Fc-опосредованные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность (ADCC), комплементозависимая цитотоксичность (CDC) и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) (Spiess et al., 2015, Mol Immunol., Vol. 67(2): 95-106.). Fc область bsAb облегчает очистку и улучшает растворимость и стабильность. Биспецифические антитела в IgG-подобных форматах обычно имеют более длительный период полужизни в сыворотке благодаря их большему размеру и FcRn-опосредованной рециркуляции (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies. Drug Discov Today Vol. 20(7): 838-47). Не являющиеся подобными IgG bsAb имеют меньший размер, что приводит к улучшенному проникновению в ткани (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies. Drug Discov Today Vol. 20(7): 838-47).

Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации биспецифичные антитела согласно настоящему изобретению содержат (i) первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с AMHRII, и (ii) второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с антигеном-мишенью, которая отличается от AMHRII, и особенно антигеном-мишенью, которая может экспрессироваться раковыми клетками или иммунными клетками микроокружения опухоли, такими как Т-клетки, NK или макрофаги. В некоторых вариантах реализации в таких биспецифических антителах указанный второй антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном-мишенью, которая представляет собой CD3, и обеспечивает возможность вовлечения Т-клеток. антиген-мишень также может представлять собой PDL1 для освобождения Т-клеток или CD16 для активации NK или макрофагов.

Моноклональные антитела, указанные в настоящей заявке, конкретно включают «химерные» анти-AMHRII антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи (цепей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (Патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).

Моноклональные антитела, указанные в настоящей заявке, также включают гуманизированные анти-AMHRII антитела. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, имеющими необходимую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживают в антителе-реципиенте или в донорском антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антител. В целом, гуманизированное антитело включает по существу все из по меньшей мере одного, и, как правило двух, вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым у иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или по существу все FR области представляют собой таковые иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно константной области иммуноглобулина человека. Для более подробной информации см. Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Моноклональные антитела к AMHRII, указанные в настоящей заявке, дополнительно включают человеческие анти-AMHRII антитела. «Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или была получена с применением любого из способов получения антител человека, как описано в настоящей заявке. Это определение человеческого антитела конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных методов, известных в данной области. В одном варианте реализации человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, при этом эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. MoI. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol, 222:581 (1991)). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенного иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. При провокации наблюдается продуцирование человеческих антител, которое во всех отношениях очень похоже на то, которое наблюдается у людей, включая перегруппировку генов, сборку и спектр антител. Этот подход описан, например, в патенте США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). В качестве альтернативы человеческое антитело может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены от индивидуума или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); и патент США № 5750373.

В настоящей заявке термин «мутант антитела» или «вариант антитела» относится к варианту аминокислотной последовательности видозависимого антитела, в котором один или более аминокислотных остатков видозависимого антитела были модифицированы. У таких мутантов идентичность последовательности или сходство с видозависимым антителом обязательно составляет менее 100%. В одном варианте реализации мутант антитела будет иметь аминокислотную последовательность, имеющую идентичность или сходство аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой или легкой цепи видозависимого антитела, составляющую по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется в настоящей заявке как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными (т.е. одинаковые остатки) или сходными (то есть аминокислотные остатки из одной и той же группы на основании общих свойств боковых цепей, см. ниже) с видозависимыми остатками антител, после выравнивания последовательностей и введения гэпов, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, С-концевых или внутренних расширений, делеций или вставок в последовательности антител вне вариабельного домена не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или сходство последовательности.

Гуманизированные антитела могут быть получены посредством получения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих домены CDR, и конструирования гуманизированных антител в соответствии с методами, известными в данной области техники. Способы получения гуманизированных антител на основе традиционных рекомбинантных ДНК и методы трансфекции генов хорошо известны в данной области (см., например, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985). Антитела могут быть гуманизированы с применением различных методов, известных в данной области техники, включая, например, CDR-трансплантацию (EP 239400; публикация PCT WO91/09967; патенты США № 5225539; 5530101; и 5585089), венирование или перекладку (EP 592106; EP 519596; Padlan E A (1991); Studnicka G M et al. (1994); Roguska M A. et al. (1994)), и перестановку цепей (патент США № 5565332). Общая технология рекомбинантных ДНК для получения таких антител также известна (см. Европейскую патентную заявку ЕР 125023 и Международную патентную заявку WO 96/02576).

Может быть необходимо модифицировать анти-AMHRII антитело, указанное в настоящей заявке, в отношении эффекторной функции, например чтобы усилить антигензависимую клеточно-обусловленную цитотоксичность (ADCC) и/или комплементозависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Это может быть достигнуто путем введения замен одной или более аминокислот в Fc-область антитела. В качестве альтернативы или дополнения, цистеиновый остаток (остатки) может быть введен в Fc-область, что позволяет образовывать межцепочечные дисульфидные связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенным комплементозависимым уничтожением клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также могут быть получены с применением гетеробифункциональных поперечных линкеров, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В качестве альтернативы можно сконструировать антитело, которое имеет двойные Fc-области и может, таким образом, обладать улучшенными возможностями комплементозависимого лизиса и ADCC. См. Stevenson et al. Anti- Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). В WO 00/42072 (Presta, L.) описаны антитела с улучшенной функцией ADCC в присутствии эффекторных клеток человека, где антитела содержат замены аминокислот в их Fc-области. Предпочтительно, антитело с улучшенным ADCC содержит замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (Eu нумерация остатков). Предпочтительно измененная Fc-область представляет собой Fc-область человеческого IgG1, содержащую или состоящую из замен в одном, двух или трех из этих положений. Такие замены необязательно объединяют с заменой (заменами), которые увеличивают связывание CIq и/или CDC.

Антитела с измененным CIq-связыванием и/или комплементозависимой цитотоксичностью (CDC) описаны в WO 99/51642, патенте США № 6194551 Bl, патенте США № 6242195 Bl, патенте США № 6528624 Bl и патенте США № 6538124 (Idusogie et al). Антитела содержат замену аминокислот в одном или более аминокислотных положениях 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 и/или 334 в их Fc-области (Eu нумерация остатков).

В некоторых вариантах реализации агенты, связывающие AMHRII, включают в себя глико-инженерные анти-AMHRII антитела.

В настоящей заявке термин «глико-инженерия» относится к любому известному в данной области способу изменения профиля гликоформы композиции связывающего белка. Такие способы включают экспрессию композиции связывающего белка в генетически сконструированной клетке-хозяине (например, клетке СНО), которая была генетически сконструирована для экспрессии гетерологичной гликозилтрансферазы или гликозидазы. В других вариантах реализации способы глико-инженерии включают культивирование клетки-хозяина в условиях, которые смещают определенные профили гликоформ.

В настоящей заявке термин «глико-инженерное антитело» охватывает (i) антитело, содержащее гипергалактозилированный фрагмент Fc, (ii) антитело, содержащее гипоманнозилированный фрагмент Fc, который включает аманнозилированный фрагмент Fc, и (iii) антитело, содержащее гипофукозилированный фрагмент Fc, который включает афукозилированный фрагмент Fc. Используемый в настоящей заявке глико-инженерный фрагмент включает фрагмент Fc, имеющий измененное гликозилирование, которое выбрано из группы, включающей одно или более из следующих измененных гликозилирований (i) гипергалактозилирование, (ii) гипоманнозилирование и (iii) гипофукозилирование. Следовательно, глико-инженерный Fc фрагмент из анти-AMHRII антитела, применяемый согласно настоящему изобретению, охватывает иллюстративные примеры гипергалактозилированного, гипоманнозилированного и гипофукозилированного Fc фрагмента.

Специалист в данной области техники может обратиться к хорошо известным методам получения анти-AMHRII антител, включающим гипергалактозилированные фрагменты Fc, гипоманнозилированные фрагменты Fc и гипофукозилированные фрагменты Fc, которые, как известно, связываются с рецепторами Fc с более высокой аффинностью, чем немодифицированные фрагменты Fc.

Глико-инженерные анти-AMHRII антитела включают в себя анти-AMHRII антитела, содержащие гипофукозилированный фрагмент Fc, который также можно назвать фрагментом Fc с низким содержанием фукозы.

Иммуноконъюгаты, особенно конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC)

Агенты, связывающие AMHRII, которые можно применять для реализации назначения настоящего изобретения, охватывают антитела, указанные в настоящей заявке, которые конъюгированы с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат). Такие конъюгаты антител охватывают конъюгаты, описанные в заявке РСТ № WO 2017/025458. В заявке PCT № WO 2017/025458, в частности, раскрыто анти-AMHRII антитело 3C23K, а также конъюгаты 3C23K ADC, для которых продемонстрирована противораковая активность in vivo в отношении негинекологического рака у человека.

Цитотоксические агенты охватывают ферментативно активные токсины. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно применять, включают А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

Для получения радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с применением множества бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как описанные в заявке PCT № WO 2017/025458.

Предпочтительными иммуноконъюгатами конъюгатов анти-AMHRII антител ADC являются описанные в заявке PCT № WO 2017/025458.

CAR-клетки, включая CAR-T-клетки, CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, связывающий AMHRII человека, представляет собой AMHRII-связывающий рецептор или экспрессирующую AMHRII-связывающий рецептор клетку, и особенно CAR-Т-клетку, экспрессирующую AMHRII-связывающий рецептор, NK-клетку, экспрессирующую AMHRII-связывающий рецептор, или CAR-макрофаг, экспрессирующий AMHRII-связывающий рецептор.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации агент, связывающий AMHRII человека, представляет собой сконструированный AMHRII-связывающий рецептор, и наиболее предпочтительно сконструированный AMHRII-связывающий рецептор, у которого его AMHRII-связывающая область получена из моноклонального антитела к AMHRII, раскрытого в настоящей заявке.

Как правило, сконструированный AMHRII-связывающий рецептор состоит из химерного рецептора антигена (CAR), содержащего (i) внеклеточный домен, (ii) трансмембранный домен и (iii) внутриклеточный домен, и где внеклеточный домен представляет собой AMHRII-связывающий фрагмент, который получен из моноклонального антитела к AMHRII, раскрытого в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного AMHRII-связывающего рецептора содержит (i) VH-цепь антитела, содержащую CDR, полученные из моноклонального антитела к AMHRII, описанного в настоящей заявке, и (ii) VL-цепь антитела, содержащую CDR, полученные из моноклонального антитела к AMHRII, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного AMHRII-связывающего рецептора включает VH-цепь и VL-цепь моноклонального антитела к AMHRII, раскрытого в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного AMHRII-связывающего рецептора представляет собой ScFv, содержащий CDR, полученные из VH-цепи и CH-цепи моноклонального антитела к AMHRII, раскрытого в настоящей заявке, соответственно. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного AMHRII-связывающего рецептора представляет собой ScFv, включающий VH-цепь и CH-цепь моноклонального антитела к AMHRII, раскрытого в настоящей заявке, соответственно.

Настоящая заявка также охватывает агент, связывающий AMHRII, состоящий из клетки, экспрессирующей такой AMHRII-связывающий рецептор, и особенно CAR-Т-клетки, CAR-NK-клетки или CAR-макрофага, экспрессирующей такой AMHRII-связывающий рецептор.

Термин «химерный рецептор антигена» (CAR), используемый в настоящей заявке, относится к слитому белку, содержащему внеклеточный домен, способный связываться с антигеном, трансмембранный домен, полученный из полипептида, отличного от полипептида, из которого получен внеклеточный домен, и по меньшей мере один внутриклеточный домен. «Химерный рецептор антигена (CAR)» иногда называют «химерным рецептором», «Т-body» или «химерным иммунным рецептором (CIR)». «Внеклеточный домен, способный связываться с AMHRII» обозначает любой олигопептид или полипептид, который может связываться с AMHRII. «Внутриклеточный домен» обозначает любой олигопептид или полипептид, о котором известно, что он функционирует как домен, который передает сигнал, вызывающий активацию или ингибирование биологического процесса в клетке. «Трансмембранный домен» обозначает любой олигопептид или полипептид, о котором известно, что он охватывает клеточную мембрану и который может функционировать для связывания внеклеточного и сигнального доменов. Химерный рецептор антигена может необязательно содержать «шарнирный домен», который служит линкером между внеклеточным и трансмембранным доменами.

CAR-Т-клетки представляют собой генетически сконструированные аутологичные Т-клетки, в которых одноцепочечные фрагменты антител (scFv) или лиганды присоединены к сигнальному домену Т-клеток, способному облегчать активацию Т-клеток (Maher, J. (2012) ISRN Oncol.2012:278093; Curran, K.J. et al. (2012) J. Gene Med. 14:405-415; Fedorov, V.D. et al. (2014) Cancer J. 20:160-165; Barrett, D.M. et al. (2014) Annu. Rev. Med. 65: 333-347).

Под «внутриклеточным сигнальным доменом» подразумевают ту часть CAR, которая обнаружена или сконструирована для обнаружения внутри Т-клетки. «Внутриклеточный сигнальный домен» может содержать или не содержать также «трансмембранный домен», который закрепляет CAR в плазматической мембране Т-клетки. В одном варианте реализации «трансмембранный домен» и «внутриклеточный сигнальный домен» получены из одного и того же белка (например, CD3ζ) в других вариантах реализации; внутриклеточный сигнальный домен и трансмембранный домен получены из разных белков (например, трансмембранный домен из молекулы CD3ζ и внутриклеточный сигнальный домен из молекулы CD28 или наоборот).

Под «костимулирующим эндодоменом» подразумевают внутриклеточный сигнальный домен или его фрагмент, полученный из костимулирующей молекулы Т-клетки. Неограничивающий перечень костимулирующих молекул Т-клеток включает CD3, CD28, OX-40, 4-1BB, CD27, CD270, CD30 и ICOS. Костимулирующий эндодомен может включать или не включать трансмембранный домен из того же или другого костимулирующего эндодомена.

Под «внеклеточным антигенсвязывающим доменом» подразумевается та часть CAR, которая специфически распознает и связывается с AMHRII.

В предпочтительных вариантах реализации «внеклеточный связывающий домен» получен из моноклонального антитела к AMHRII. Например, «внеклеточный связывающий домен» может включать весь или часть Fab-домена моноклонального антитела. В некоторых вариантах реализации «внеклеточный связывающий домен» включает участки, определяющие комплементарность, конкретного моноклонального антитела к AMHRII. В еще одном варианте реализации «внеклеточный связывающий домен» представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из указанного в настоящей заявке моноклонального антитела к AMHRII.

В предпочтительных вариантах реализации внеклеточный связывающий домен получен из любого из моноклональных антител к AMHRII, описанных в настоящей заявке, и особенно из моноклонального антитела к AMHRII 3C23K.

I. Внеклеточный антигенсвязывающий домен

В одном варианте реализации CAR согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен из одного из моноклональных антител к AMHRII, описанных в настоящей заявке.

В одном варианте реализации внеклеточный связывающий домен содержит следующие последовательности CDR:

- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NO. 65), где X1 и X2 независимо представляют собой S или P, X3 представляет собой R, или W, или G, X4 представляет собой T или D, и X5 представляет собой I или T;

- CDRL-2 представляет собой PTSSLX6S (SEQ ID NO. 66), где X6 представляет собой K или E; и

- CDRL-3 представляет собой LQWSSYPWT (SEQ ID NO. 67);

- CDRH-1 представляет собой KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NO. 68), где X7 представляет собой S или T, X8 представляет собой S или G, и X9 представляет собой Y или N;

- CDRH-2 представляет собой WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NO. 69), где X10 представляет собой G или E, и

- CDRH-3 представляет собой GDRFAY (SEQ ID NO. 70).

II. Линкер между VL и VH доменами KappaMab scFv

В дополнительном варианте реализации анти-AMHRII VL связан с анти-AMHRII VH посредством гибкого линкера. В частности, гибкий линкер представляет собой глицин/сериновый линкер, состоящий примерно из 10-30 аминокислот (например, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот), и включает структуру (Gly4Ser)³.

III. Спейсеры между внеклеточным антигенсвязывающим доменом и внутриклеточным сигнальным доменом

Внеклеточный антигенсвязывающий домен связан с внутриклеточным сигнальным доменом с помощью «спейсера». Спейсер сконструирован достаточно гибким, чтобы обеспечить ориентацию антигенсвязывающего домена таким образом, чтобы облегчить распознавание и связывание антигена. Спейсер может быть получен из самих анти-AMHRII иммуноглобулинов и может включать шарнирную область IgG1 или CH2 и/или CH3 область IgG.

IV. Внутриклеточный сигнальный домен

Внутриклеточный сигнальный домен включает всю или часть цепи CD3. CD, также известный как CD247, совместно с корецептором CD4 или CD8 Т-клетки отвечает за связывание внеклеточного антигена с внутриклеточными сигнальными каскадами.

В дополнение к включению сигнального домена CD3ζ, включение костимулирующих молекул, как было показано, усиливает активность CAR-Т-клеток в мышиных моделях и клинических испытаниях. Были исследованы некоторые из них, включая CD28, 4-IBB, ICOS, CD27, CD270, CD30 и OX-40.

В определенных вариантах реализации раскрыты способы получения клеток, экспрессирующих CAR, включающие или, в качестве альтернативы, состоящие по существу из: (i) трансдукции популяции выделенных клеток с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, и (ii) отбора субпопуляции клеток, которые были успешно трансдуцированы указанной последовательностью нуклеиновой кислоты из этапа (i). В некоторых вариантах реализации выделенные клетки представляют собой T-клетки, T-клетки животного, T-клетки млекопитающего, T-клетки кошки, T-клетки собки или T-клетки человека, таким образом, продуцирующие CAR T-клетки. В некоторых вариантах реализации выделенная клетка представляет собой NK-клетку, например, NK-клетку животного, NK-клетку млекопитающего, NK-клетку кошки, NK-клетку собаки или NK-клетку человека, таким образом, продуцирующие CAR-NK-клетки.

Терапевтическое применение CAR-T-клеток, CAR-NK-T-клеток и CAR-макрофагов.

CAR-клетки, которые включают CAR-T-клетки, CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения опухолей легкого, экспрессирующих AMHRII. CAR-клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для лечения AMHRII-экспрессирующих опухолей легкого у пациентов, страдающих от рака легкого, описанного в настоящей заявке, и особенно от немелкоклеточного рака легкого или мелкоклеточного рака легкого.

CAR-клетки согласно настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с разбавителями, известными противораковыми лекарственными средствами и/или с другими компонентами, такими как цитокины или другие популяции клеток, которые являются иммуностимулирующими.

Аспекты способа согласно настоящему описанию относятся к способам ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, и/или лечения онкопациента, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой солидную опухоль легкого.

CAR-клетки, как описано в настоящей заявке, можно вводить отдельно или в комбинации с разбавителями, известными противораковыми лекарственными средствами и/или с другими компонентами, такими как цитокины или другие популяции клеток, которые являются иммуностимулирующими. Это может быть первая линия, вторая линия, третья линия, четвертая линия терапии или дополнительная терапия. Она может сочетаться с другими видами терапии. Неограничивающие примеры таких включают химиотерапию или биологические препараты. Подходящий режим лечения будет определен лечащим врачом или ветеринаром.

Фармацевтические композиции, содержащие CAR согласно настоящему изобретению, можно вводить способом, соответствующим заболеванию, которое следует лечить или предотвращать. Количество и частота введения будут определяться такими факторами, как состояние пациента, и тип и тяжесть заболевания пациента, хотя соответствующие дозировки могут быть определены посредством клинических исследований.

Терапевтическое применение

Как уже описано в других частях настоящей заявки, агенты, связывающие AMHRII, описанные в настоящей заявке, которые охватывают (i) анти-AMHRII антитела, описанные в настоящей заявке, (ii) конъюгаты антитело-лекарственное средство, описанные в настоящей заявке, и (iii) CAR-клетки (включая CAR-Т-клетки , CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги), описанные в настоящей заявке, состоят из активных ингредиентов, которые можно применять для предотвращения или лечения AMHRII-экспрессирующих раков легкого, особенно немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), и более конкретно NSCLC, выбранного из группы, состоящей из эпидермоидного NSCLC, аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC и плоскоклеточной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC.

Способы лечения рака, в которых применяют противоопухолевые антигенные антитела или противоопухолевые антигенные CAR-клетки, хорошо известны специалисту в данной области техники.

В некоторых вариантах реализации проводят тестирование пациентов, страдающих от рака, для определения наличия экспрессии AMHRII опухолевыми клетками на их поверхности перед осуществлением лечения с помощью агента, связывающего AMHRII, такого как анти-AMHRII антитело, анти-AMHRII ADC или анти-AMHRII CAR-Т-клетки.

Такое предварительное тестирование для выявления мембранной экспрессии AMHRII является предпочтительным для лечения раков легкого, экспрессирующих AMHRII с низкой частотой. Напротив, такое предварительное тестирование для выявления мембранной экспрессии AMHRII можно не проводить для лечения рака, экспрессирующего AMHRII с высокой частотой, например, эпидермоидного NSCLC.

Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к агенту, связывающему AMHRII, как определено в настоящей заявке, для его применения для предотвращения или лечения индивидуума, страдающего от AMHRII-положительного рака легкого, который включает немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), и особенно NSCLC, выбранный из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

Настоящее изобретение относится к применению агента, связывающего AMHRII, для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения индивидуума, страдающего от AMHRII-положительного рака легкого, который включает рак легкого, включающий немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), и особенно NSCLC, выбранный из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC.

Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения или лечения индивидуума, страдающего от AMHRII-положительного рака легкого, который включает немелкоклеточный рак легкого (NSCLC), и особенно NSCLC, выбранный из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC, плоскоклеточную карциному NSCLC, плеоморфную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC, где указанный способ включает стадию введения указанному индивидууму анти-AMHRII связывающего агента.

Индивидуум может быть определен как индивидуум, страдающий от AMHRII-положительного рака, путем осуществления способа выявления экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности в образце ткани рака легкого, предварительно полученном от указанного индивидуума. Выявление экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности может быть выполнено в соответствии с множеством способов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Способы выявления экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности, в частности, охватывают способы иммуногистохимии, а также способы флуоресцентно-активированной сортировки клеток, которые проиллюстрированы в приведенных в настоящей заявке примерах.

Настоящее изобретение также относится к способу определения, подходит ли индивидуум для лечения рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, то есть, является ли индивидуум имеющим ответную реакцию на лечение рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани легкого, предварительно полученным от указанного индивидуума, белка AMHRII на поверхности клетки.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения, подходит ли индивидуум, который страдает от рака легкого, в частности немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), и особенно NSCLC, выбранного из группы, включающей эпидермоидный NSCLC, аденокарциному NSCLC, крупноклеточный NSCLC и плоскоклеточную карциному NSCLC и нейроэндокринный NSCLC, для лечения рака с помощью агента, связывающего AMHRII, то есть является имеющим ответную реакцию на лечение рака с помощью агента, связывающего AMHRII, при этом указанный способ включает стадии:

a) определения наличия экспрессии AMHRII раковыми клетками указанного пациента на их мембране и

b) заключения о том, что указанный пациент подходит для лечения рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, то есть является имеющим ответную реакцию на лечение рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, если на этапе а) была определена мембранная экспрессия AMHRII указанными клетками рака легкого.

В предпочтительных вариантах реализации указанного способа на стадии b) делают заключение о том, что указанный пациент подходит (то есть имеет ответную реакцию) для лечения рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, когда (i) значение показателя экспрессии AMHRII определяют на стадии a) и когда (ii) указанное значение показателя экспрессии AMHRII представляет собой пороговое значение показателя или более. Значение показателя AMHRII наиболее предпочтительно рассчитывают с применением формулы (I), описанной в других частях настоящей заявки.

Таким образом, согласно предпочтительны вариантам реализации стадию а) способа выполняют иммуногистохимическим способом, таким как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке.

Раковые клетки, которые применяют на стадии а), как правило, происходят из образца ткани, полученного посредством биопсии, который предварительно был взят у указанного пациента, страдающего от рака.

Предпочтительно стадию а) осуществляют с применением анти-AMHRII антитела, выбранного из тех, которые конкретно описаны в настоящей заявке, и, в частности, антитела 3C23K, связывание с AMHRII которого можно детектировать с применением вторично меченого антитела в соответствии с хорошо известными способами детектирования антител, такими как раскрытые в примерах настоящей заявки.

Предпочтительно, пациента, страдающего от рака легкого, включенного в вышеперечисленную группу видов рака легкого, определяют как подходящего (т.е имеющего ответную реакцию) для лечения рака легкого с помощью агента, связывающего AMHRII, когда значение показателя мембранной экспрессии AMHRII, составляющее 1,0 или более, определяют в образце раковых клеток, полученном от указанного онкопациента, при выполнении способа оценки, позволяющего определить значение E-SCORE в соответствии с формулой (I) ниже:

E-SCORE=FREQ×AMHRII_LEVEL, где

- E-SCORE обозначает значение показателя мембранной экспрессии AMHRII для данного образца раковых клеток,

- FREQ обозначает частоту клеток, содержащихся в указанном образце клеток рака легкого, для которых обнаружена мембранная экспрессия AMHRII, и

- AMHRII_LEVEL обозначает уровень мембранной экспрессии AMHRII AMHRII-экспрессирующими клетками, содержащимися в указанном образце данных клеток рака легкого.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу лечения пациента, страдающего от немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), в котором указанный способ включает стадии:

а) определение наличия экспрессии белка AMHRII образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного индивидуума, на поверхности клеток, и

b) лечение указанного индивидуума агентом, связывающим AMHRII, если на стадии а) была определена экспрессия AMHRII на поверхности клеток.

В наиболее предпочтительных вариантах реализации экспрессию AMHRII определяют на стадии а), когда указанный образец опухоли имеет значение показателя мембранной экспрессии AMHRII «E-SCORE», рассчитанное в соответствии с вышеописанной формулой (I), составляющее 1,0 или более, которое охватывает значение E- SCORE, составляющее 1,5 или более.

В наиболее предпочтительных вариантах реализации описанного выше способа указанный агент, связывающий AMHRII, состоит из анти-AMHRII антитела или его фрагмента, как указано в настоящей заявке, или CAR-клетки (например, CAR-T-клетки или CAR-NK-клетки), как указано в настоящей заявке.

В некоторых вариантах реализации указанный агент, связывающий AMHRII, применяют в качестве единственного противоракового активного ингредиента.

В некоторых других вариантах реализации противораковое лечение указанным агентом, связывающим AMHRII, также включает одно или более дополнительное противораковое лечение указанного индивидуума, которое включает радиотерапевтическое лечение и химиотерапевтическое лечение.

Таким образом, в соответствии с такими другими вариантами реализации противораковое лечение указанным агентом, связывающим AMHRII, также включает введение указанному индивидууму одного или более дополнительных противораковых активных ингредиентов.

Комбинированная терапия

Как показано в приведенных в настоящей заявке примерах, эффективные терапии легкого против рака легкого охватывает такие, в которых моноклональное антитело к AMHRII комбинируют с одним или более отдельными противораковыми агентами. Приведенные в настоящей заявке примеры иллюстрируют комбинированную терапию против рака легкого, где анти-AMHRII антитело комбинируют с доцетакселом или с комбинацией цисплатина и гемцитабина.

«Противораковый агент» определяется как любая молекула, которая может либо мешать биосинтезу макромолекул (ДНК, РНК, белков и т. д.), либо ингибировать пролиферацию клеток, либо, например, приводить к гибели клеток в результате апоптоза или цитотоксичности. Среди противораковых агентов можно упомянуть алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы и интеркалирующие агенты, антиметаболиты, расщепляющие агенты, агенты, влияющие на тубулин, моноклональные антитела.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному материалу, который совместим с биологической системой, такой как клетка, клеточная культура, ткань или организм.

В соответствии с конкретным аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающееся с AMHR-II, и особенно анти-AMHRII антитело, описанное в настоящей заявке.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, и особенно анти-AMHRII антитело, описанное в настоящей заявке.

В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, где противораковый агент выбран из группы, содержащей доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.

Другие противораковые агенты, которые можно применять в комбинации с анти-AMHRII антителом, включают паклитаксел или соль платины, такую как оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин.

Противораковый агент также может быть выбран из химиотерапевтических агентов, отличных от солей платины, малых молекул, моноклональных антител или других пептидных антител против ангиогенеза.

Химиотерапевтические агенты, отличные от солей платины, включают интеркалирующие агенты (блокирующие репликацию и транскрипцию ДНК), такие как антрациклины (доксорубицин, пегилированный липосомальный доксорубицин), ингибиторы топоизомеразы (камптотецин и производные: каренитецин, топотекан, иринотекан) или SJG-136, ингибиторы гистондеацетилазы (вориностат, белиностат, вальпроевая кислота), алкилирующие агенты (бендамустин, глюфосфамид, темозоломид), антимитотические растительные алкалоиды, такие как таксаны (доцетаксел, паклитаксел), алкалоиды барвинка (винорелбин), эпотилоны (ZK-эпотилон, иксабепилон), антиметаболиты (гемцитабин, элацитарабин, капецитабин), ингибиторы белка кинезина веретена (KSP) (испинесиб), трабектедин или омбрабулин (производное комбретастатина А-4).

Среди малых молекул существуют ингибиторы поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (ПАРП): олапариб, инипариб, велипариб, рукапариб, CEP-9722, MK-4827, BMN-673, ингибиторы киназы, такие как ингибиторы тирозинкиназы (TKI), среди которых можно упомянуть молекулы анти-VEGFR (сорафениб, сунитиниб, седираниб, вандетаниб, пазопаниб, BIBF 1120, семаксаниб, кабозантиниб, мотесаниб), молекулы анти-HER2/EGFR (эрлотиниб, гефитиниб, лапатиниб), молекулы анти-PDGFR (иматиниб, BIBF 1120), молекулы анти-FGFR (BIBF 1120), ингибиторы аврора-киназы/тирозинкиназы (ENMD-2076), ингибитор Src/Abl-киназы (саракатиниб) или также перифозин, темсиролимус (ингибитор mTOR), альвоцидиб (ингибитор циклин-зависимой киназы), воласертиб (ингибитор белка PLK1 (Polo-подобная киназа 1)), LY2606368 (ингибитор киназы контрольной точки 1 (chk 1), GDC-0449 (ингибитор пути Hedgehog), зиботентан (антагонист ETA-рецептора), бортезомиб, карфилзомиб (ингибитор протеасомы), цитокины, такие как IL-12, IL-18, IL-21, INF-альфа, INF-гамма.

Среди антител можно упомянуть анти-VEGF: бевацизумаб, анти-VEGFR: рамуцирумаб, анти-HER2/EGFR: трастузумаб, пертузумаб, цетуксимаб, панитумумаб, MGAH22, матузумаб, анти-PDGFR-альфа: IMC-3G3, антифолатный рецептор: фарлетузумаб, анти-CD27: CDX-1127, анти-CD56: BB-10901, анти-CD105: TRC105, анти-CD276: MGA271, анти-AGS-8: AGS-8M4, анти-DRS: TRA-8, анти-HB-EGF: KHK2866, анти-мезотелины: аматуксимаб, BAY 94-9343 (иммунотоксин), катумаксомаб (биспецифическое антитело EpCAM/CD3), анти-IL2R: даклизумаб, анти-IGF-1R: ганитумаб, анти-CTLA-4: ипилимумаб, анти-PD1: ниволумаб и пембролизумаб, анти-CD47: Weissman B6H12 и Hu5F9, Novimmune 5A3M3, INHIBRX 2A1, Frazier VxP037-01LC1 антитела, анти-Льюис Y: Hu3S193, SGN-15 (иммунотоксин), анти-CAl25: ореговомаб, анти-HGF: рилотумумаб, анти-IL6: силтуксимаб, анти-TR2: тигатузумаб, анти-альфа5 бета1 интегрин: волоциксимаб, анти-HB-EGF: KHK2866. Пептидные антитела против ангиогенеза выбраны из AMG 386 и CVX-241.

Более конкретно, в настоящей заявке описана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, где противораковый агент выбран из группы, содержащей доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.

Еще более конкретно, в настоящей заявке описана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в котором мутированное гуманизированное моноклональное антитело, обозначенное в настоящей заявке как 3C23K, и противораковый агент выбран из группы, содержащей доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.

В конкретном аспекте в настоящей заявке описана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHRII, в форме, предназначенной для введения внутривенным или интраперитонеальным путем.

В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в форме, предназначенной для введения внутривенным или интраперитонеальным путем.

В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, причем моноклональное антитело и противораковый агент предназначены для раздельного, одновременного или последовательного введения.

Антитело и противораковый агент могут быть объединены в одной и той же фармацевтической композиции или могут применяться в форме отдельных фармацевтических композиций, которые можно вводить одновременно или последовательно. В частности, продукты можно вводить отдельно, а именно, одновременно или независимо, например, с временным интервалом.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в которой антитело и противораковый агент объединены в одной и той же фармацевтической композиции.

Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHRII, в которой терапевтически эффективное количество анти-AMHRII антитела, вводимое пациенту, находится в диапазоне от примерно 0,07 мг до примерно 35000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 7000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 1400 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 700 мг и более предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 70 мг.

Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHRII, в которой терапевтически эффективное количество противоракового агента, вводимое пациенту, находится в диапазоне от примерно 10 мг до примерно 700 мг, предпочтительно в диапазоне от примерно 20 мг до примерно 350 мг, и предпочтительно примерно 110 мг.

Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения рака легкого, включающей противораковый агент и антитело, связывающее AMHRII, в которой терапевтически эффективное количество антитела, вводимое пациенту, составляет примерно 70 мг, и доза противоракового агента, вводимая пациенту, составляет примерно 110 мг.

В предпочтительном варианте реализации дозировка противоракового агента, в частности доцетаксела или комбинации цисплатина и гемцитабина, находится в диапазоне от примерно 0,01 мг/кг до примерно 500 мг/кг, например от 0,1 мг/кг до 300 мг/кг, или от примерно 0,1 мг до 20 г в день.

Как вариант, можно также вводить более высокую начальную нагрузочную дозу, за которой следует одна или несколько более низких доз. В другом варианте также можно вводить начальную нагрузочную дозу, которая не является очень высокой, за которой следует одна или несколько более высоких доз.

В конкретном варианте реализации анти-AMHRII антитело и противораковый агент можно применять в массовом соотношении антитело/противораковый агент в диапазоне от примерно 10/1 до примерно 0,01/1, в частности от примерно 10/1 до примерно 0,05/1 или от примерно 5/1 до примерно 0,1/1.

В качестве иллюстрации, анти-AMHRII антитело и доцетаксел можно применять в массовом соотношении антитело/доцетаксел, составляющем 1/1, как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке.

Еще в качестве иллюстрации, анти-AMHRII антитело и цисплатин можно применять в массовом соотношении антитело/цисплатин, составляющем 4/1, как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке.

Еще в качестве иллюстрации, анти-AMHRII антитело и гемцитабин можно применять в массовом соотношении антитело/гемцитабин, составляющем 0,2/1, как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке.

В настоящем изобретении дополнительно описан продукт, содержащий антитело, связывающее рецептор антимюллерового гормона типа II (AMHR-II) человека, и противораковый агент, в форме комбинированного препарата для одновременного, последовательного или раздельного применения в качестве лекарственного средства, предназначенного для предотвращения или лечения AMHRII-экспрессирующего рака легкого.

Агент, связывающий AMHRII, описанный в настоящей заявке, и особенно анти-AMHRII антитело, описанное в настоящей заявке, можно вводить различными способами, которые включают пероральное введение, подкожное введение и внутривенное введение.

Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или ослабить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с расстройством. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность in vivo можно, например, измерить путем оценки продолжительности выживания, продолжительности выживания без прогрессирования (PFS), частоты ответа (RR), продолжительности ответа и/или качества жизни.

Терапевтические формы агентов (например, антител), применяемых согласно настоящему изобретению, получают для хранения путем смешивания антител, имеющих необходимую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный, и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА (Этилендиаминтетрауксусная кислота); сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов {например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ).

Активные ингредиенты также могут быть помещены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилат)-микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Формы, применяемые для введения in vivo, могут быть стерильными. Этого легко достичь путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, может быть введена любым подходящим путем введения, например, парентеральным, пероральным, сублингвальным, вагинальным, ректальным или трансдермальным путем, предпочтительно с помощью внутривенной, подкожной или интрадермальной инъекции. Также возможны внутримышечные, интраперитонеальные, интрасиновиальные, интратекальные или внутриопухолевые инъекции. Инъекции можно выполнять в форме болюса или путем непрерывной инфузии. Когда композицию антитела и композицию противоракового агента вводят раздельно, эти композиции могут находиться в идентичной или различной форме введения.

Препараты для парентерального введения могут включать стерильные водные или неводные растворы, суспензии или эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, или инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спирт/водные растворы и эмульсии или суспензии.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, преимущественно содержат один или более фармацевтически приемлемых экципиентов или носителей. Можно упомянуть, например, солевой раствор, физиологический, изотонический, забуференный растворы и т.д., совместимые с фармацевтическим применением и известные специалисту в данной области техники. Композиции могут содержать один или более агентов или носителей, выбранных из диспергирующих веществ, солюбилизирующих веществ, стабилизаторов, консервантов и т. д. Агенты или носители, применяемые в формах (жидкие и/или инъецируемые и/или твердые), представляют собой, в частности, метилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, полисорбат 80, маннит, желатин, лактозу, растительные масла, камедь и т. д. Композиции могут быть приготовлены в форме инъецируемых суспензий, гелей, масел, таблеток, суппозиториев, порошков, твердых желатиновых капсул, мягких капсул и т.д.

Согласно конкретному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и анти-AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество антитела, вводимое пациенту, находится в диапазоне от примерно 0,07 мг до примерно 35000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 7000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 1400 мг, предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 700 мг и более предпочтительно от примерно 0,7 мг до примерно 70 мг.

Дозировка активного ингредиента зависит, в частности, от пути введения и легко определяется специалистом в данной области техники. Терапевтически эффективное количество (единичная доза) антитела может варьироваться от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 500 мг/кг, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 20 мг/кг, предпочтительно от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг и более предпочтительно от 1 мг/кг до 10 мг/кг, за одно или несколько еженедельных введений в течение нескольких недель или месяцев. Таким образом, эффективная единичная доза может быть легко выведена из дозы, рассчитанной для «среднего» пациента массой 70 кг.

Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и анти-AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество противоракового агента, вводимого пациенту, находится в диапазоне от примерно 10 мг до примерно 700 мг, предпочтительно в диапазоне от примерно 20 мг до примерно 350 мг, и предпочтительно составляет примерно 110 мг.

Дозировка противоракового агента зависит, в частности, от способа введения и легко определяется специалистом в данной области техники. Терапевтически эффективное количество (единичная доза) может варьироваться от 0,2 мг/м² до 10 г/м², предпочтительно от 0,2 мг/м² до 1 г/м², предпочтительно от 2 мг/м² до 1 г/м², предпочтительно от 20 мг/м² до 1 г/м² и более предпочтительно от 20 мг/м² до 0,5 г/м² в одном или более еженедельном введении в течение нескольких недель или месяцев. Таким образом, эффективная единичная доза может быть выведена из дозы, рассчитанной для «среднего» пациента, площадь поверхности тела которого составляет примерно 1,8 м².

Согласно более конкретному аспекту настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и анти-AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество противоракового агента, вводимого пациенту, составляет примерно 110 мг, и терапевтически эффективное количество антитела, вводимого пациенту, составляет примерно 70 мг.

Настоящее изобретение также описывает композицию, содержащую противораковый агент и анти-AMHRII антитело, связывающее рецептор человеческого антимюллерового гормона типа II (AMHR-II), для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения AMHRII-экспрессирующего рака легкого.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, но никоим образом не ограничивается приведенными ниже примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Дифференциальная экспрессия гена AMHRII и экспрессия белка AMHRII

А. Материалы и способы

A.1. Клеточные линии и культуры

Клеточную линию COV434 WT (ECACC № 07071909) выдерживают в среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM)/GlutaMax (Gibco) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), пенициллина 100 Ед/мл и стрептомицина 100 мкг/мл. К трансфицированной клеточной линии COV434 MISRII добавляют генетицин (Gibco) в концентрации 400 мкг/мл. Клеточную линию эритролейкемии K562 (ATCC^® CCL-243™) культивируют в суспензии в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM) (Sigma-Aldrich), с добавлением 10% ФБС и пенициллина/стрептомицина и поддерживают при плотности от 1×10⁵ до 1×10⁶ клеток/мл в колбах Т75. Клеточную линию OV90 (ATCC^® CRL-11732™, серозная аденокарцинома яичника) культивируют в смеси 1:1 среды MCDB 105 (Sigma-Aldrich), содержащей бикарбоната натрия с конечной концентрацией 1,5 г/л, и среды 199 (Sigma-Aldrich), содержащей бикарбоната натрия с конечной концентрацией 2,2 г/л, с добавлением 15% ФБС и пенициллина/стрептомицина. Клеточную линию NCI-H295R (адренокортикальная карцинома, ATCC^® CRL-2128™) выдерживают в среде DMEM:F12 (Sigma-Aldrich), дополненной iTS⁺Premix (Corning), 2,5% сывороткой Nu-Serum (Falcon) и пенициллином/стрептомицином. Клетки выращивают при 37°C в увлажненной атмосфере с 8% CO2, и среду меняют один или два раза в неделю в зависимости от клеточных линий.

A.2. Относительная количественная оценка мРНК AMHR2 с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)

Экстракция РНК. Общую РНК из осадка клеток 1-5×10⁶ готовят с применением набора для очистки РНК Trizol® Plus (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, после экстракции фенолом/хлороформом РНК лизированных клеток адсорбируют на матрице из диоксида кремния, обрабатывают ДНКазой, затем промывают и элюируют 30 мкл воды, не содержащей РНКазу. Концентрации и качество РНК оценивают с помощью спектрофотометра (NanoDrop, ThermoFisher Scientific).

Синтез кДНК. РНК (1 мкг) подвергают обратной транскрипции с применением набора для синтеза кДНК Maxima H Minus First Strand (Ambion) и олиго-dT праймеров путем инкубации в течение 10 минут при 25°C для примирования и 15 минут при 50°C для обратной транскрипции, после чего 5 минут при 85°C для инактивации обратной транскриптазы.

Количественная ПЦР. Количественную ПЦР проводят в Light Cycler 480 (Roche) в 96-луночных микропланшетах с применением Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix (Ambion) в конечном объеме 20 мкл. Применяли следующие праймеры: для AMHR2, прямой 5'-TCTGGATGGCACTGGTGCTG-3' (SEQ ID NO. 71) и обратный 5'-AGCAGGGCCAAGATGATGCT-3' (SEQ ID NO. 72), для TBP, прямой 5'-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3' (SEQ ID NO. 73) и обратный 5'-CACATCACAGCTCCCCACCA-3' (SEQ ID NO. 74). Амплификации проводят с применением матрицы кДНК (100 нг эквивалентной РНК) и следующего протокола: после предварительной обработки УДГ (Урацил-ДНК-гликозилаза) в течение 2 мин при 50°С, денатурации в течение 10 мин при 95°С проводят 40 циклов по 15 с при 95°С/30 с при 60°С/30 с при 70°С. Анализ кривых плавления проводят в конце каждого эксперимента для контроля отсутствия геномной ДНК и димерного праймера. Каждый образец кДНК и контроли («без образца матрицы» и «без обратной транскрипционной РНК») тестируют в двух повторах. Рассчитывают средние значения порогового цикла (Ct), и относительное количество AMHR2 (RQ) выражают как 2^-ΔΔCt, где ΔΔCt=ΔCt_{образца}-ΔCt_{калибратора} и ΔCt=Ct_AMHR2-Ct_TBP. Образец HCT116 применяют в качестве калибровочного стандарта (калибратора), и TBP применяют в качестве «домашнего» гена для нормализации.

Таблица 2 ниже показывает уровень экспрессии AMHRII в тестируемых клеточных линиях с применением параметров метода Q-PCR, описанного выше.

Таблица 2

Клеточная линия	Среднее Ct amhr2	Среднее Ct TBP	RQ
HCT116	34,27	22,25	1
COV434 WT	31,34	22,82	11,3
K562	25,31	21,36	268,7
NCI-H295R	26,16	22,83	413,0
OV90	25,65	22,67	526,4

A.3. Оценка мембранной экспрессии AMHR2 методом проточной цитометрии.

Для анализа методом флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) 4×10⁵ клеток инкубируют с 25 мкг/мл 3C23K в течение 30 минут при 4°C. После промывки посредством 2% PBS (фосфатно-солевой буферный раствор)-BSA (бычий сывороточный альбумин) первичное антитело детектируют с помощью конъюгированного с флуорофором антивидового вторичного антитела. 3C23K детектируют с помощью античеловеческого F(ab')₂, конъюгированного с фикоэритрином (1:1000, Beckman-Coulter, IM0550). После промывки PBS FACS-анализ ресуспендированных клеток проводят в канале FL2 проточного цитометра BD Accuri™ C6 (BD Bioscience).

B. Результаты

Результаты изображены на фигуре 2. Результаты показывают, что рекомбинантная клеточная линия COV434-WT демонстрирует примерно 3% от уровня экспрессии гена AMHRII, измеренного для клеточной линии NCI-H295R, хотя клеточная линия COV434-WT имеет значимый уровень мембранной экспрессии человеческого белка AMHRII.

Эти результаты показывают, что не существует строгой корреляции между экспрессией гена AMHRII и экспрессией мембранного белка AMHRII.

Пример 2: Экспрессия AMHRII при раке легкого (образцы опухолей человека)

А. Материалы и способы

A.1. Задача

Иммуногистохимическое исследование ксенотрансплантатов раковых клеток человека у мышей (PDXs) для выявления экспрессии рецептора антимюллерового гормона типа 2 (AMHR2) с применением биотинилированного моноклонального антитела 3C23K.

A.2. Протокол и методология

- Клеточные линии: фиксируют в формальдегиде, уксусной кислоте и спирте (AFA) с составом клеточных блоков

- Опухоли человека: фиксируют в формалине для внешних образцов и в AFA для предметных стекол из Института Кюри

- Метод иммуногистохимии (IHC) возможно выполнять после депарафинизации образцов и демаскировки при pH 9 (микроволновая печь EZ Retriever 15' при 90°C с последующим охлаждением в течение 20').

- Рецептор антимюллерового гормона типа II детектируют методом иммунопероксидазы и выявляют хромогенный субстрат DAB.

- После блокирования активности эндогенной пероксидазы предметные стекла инкубируют с разбавленным биотинилированным первичным антителом (1/800, 8 мкг/мл) в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывают PBS и инкубируют с комплексом авидин/биотин ABC [Vector] в течение 30 минут. Иммунореактивные сигналы детектируют с применением раствора субстрата DAB (DAB и субстратный буфер/жидкий DAB и хромоген, 10 минут инкубации). Наконец, осуществляют легкое контрастное окрашивание срезов с гематоксилином Майера (модификация Лилли).

- Отрицательные контроли получают путем замены первичных антител изотипическим контрольным иммуноглобулином (R565) или только разбавителем антител (отрицательный буферный контроль) в процедуре иммуногистохимического окрашивания.

- Положительные контроли получают с применением клеток COV434, трансфицированных AMHR2, и образцов гранулезных опухолей человека.

- После обработки срезы исследуют с применением оцифровки с помощью Philips IMS. Все образцы независимо оценивают 2 патолога.

- Уточняют локализацию мечения: цитоплазматическое и/или мембранное.

- Интенсивность классифицируют по явному коричневому мечению мембраны и/или цитоплазмы опухолевых клеток с применением следующей системы подсчета: интенсивность маркировки определяют как 0 для отрицательного, 1 для слабого, 2 для умеренного и 3 для сильного мечения, как показано для положительного контроля COV434.

- Частоту определяют как процент клеток, экспрессирующих AMHRII. Участки некроза исключают из анализа. Общую гистологическую оценку устанавливают с применением частоты, умноженной на среднюю оценку интенсивности (от 0 до 3) кумулирования мембранной и цитоплазматической экспрессии.

- Все предметные стекла хранят надлежащим образом.

B. Результаты

Результаты мембранной экспрессии AMHRII различными первичными клетками рака легкого человека также представлены в таблице 3, где показатель экспрессии AMHRII представлен для панели различных типов клеток рака легкого.

Таблица 3: Экспрессия AMHRII образцами ткани рака легкого человека

Тип опухоли	Процент положительных образцов	Количество протестированных образцов
SCLC	0%	2
NSCLC (нейроэндокринный)	1,2%	78
NSCLC (ацинарного типа)	0%	2
NSCLC (эпидермоидный)	100%	4
NSCLC (плоскоклеточная карцинома)	35%	14
NSCLC (аденокарцинома)	45,8%	24
NSCLC (крупноклеточный)	33%	9

Результаты показали, что AMHRII экспрессируется на клеточной поверхности во множестве образцов рака легкого человека, особенно в образцах опухолей, полученных из NSCLC, и конкретнее в образцах опухолей, полученных от пациентов, страдающих от NSCLC, выбранного из группы, состоящей из эпидермоидного NSCLC, аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC и плоскоклеточной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC.

Пример 3: Экспрессия AMHRII при раке легкого

А. Материалы и способы

A.1. Задача

Проводили исследование клеток рака легкого человека, полученных либо из ксенотрансплантатов, полученных у пациента (PDX), либо из свежих образцов опухолей человека, для определения наличия экспрессии рецептора антимюллерового гормона типа 2 (AMHR2) с применением биотинилированного моноклонального антитела 3C23K.

A.2. Анализ мембранной экспрессии AMHRII с помощью поточной цитометрии

Подготовка клеток для анализа

- Ткани рассекают в течение 1 ч после операции, измельчают на фрагменты размером 1 мм² и промывают в RPMI, содержащем пенициллин (10%), стрептомицин (10%) и гентамицин (0,1 мг/мл; Sigma-Aldrich).

- Фрагменты ткани расщепляют коллагеназой и ДНКазой (2 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 2-4 ч с быстрым встряхиванием при 37°С.

- Слизь и крупные остатки удаляют фильтрацией через 40-мкм сито для клеток.

- Жизнеспособные клетки получают центрифугированием в градиенте Фиколла.

Количественное определение сайтов связывания AMHRII на ресуспендированных опухолевых клетках проводят с применением The QuantumTM Simply Cellular (Bangs Laboratory) в соответствии с инструкциями производителя:

- Вкратце, четыре популяции микрогранул, меченных различным калиброванным количеством мышиного анти-человеческого IgG, специфичного для Fc-части человеческих IgG-антител, окрашивают конъюгированным с AlexaFluor488 анти-AMHRII 3C23K. В пробирках FACS одну каплю из каждого флакона в наборе добавляют к 50 мкл PBS 1X:

1 - гранулы B (холостой)

2 - гранулы 1 + 3C23K-AF 10 мкг/мл

3 - гранулы 2 + 3C23K-AF 10 мкг/мл

4 - гранулы 3 + 3C23K-AF 10 мкг/мл

5 - гранулы 4 + 3C23K-AF 10 мкг/мл (концентрацию следует увеличить до 25 мкг/мл, если необходимо)

- Каждая популяция гранул связывает различные количества конъюгированного с AlexaFluor488 анти-AMHRII 3C23K, обеспечивая соответствующую интенсивность флуоресценции, которую анализируют на цитометре FACS Canto II (BD).

- Калибровочную кривую получают путем построения графика зависимости средней интенсивности флуоресценции каждой популяции гранул от ее определенной способности связывания антител (ABC).

Клетки обычно окрашивают в пробирках Эппендорфа объемом 1,5 мл.

- Все этапы центрифугирования осуществляют при 4°C.

- Все этапы инкубации осуществляют при 4°C, чтобы избежать интернализации антител.

- 3,5 миллиона клеток (трипсинизированные COV434-MISRII или недавно диссоциированные опухолевые клетки) центрифугируют при 200-300g в течение 5 минут и один раз промывают PBS (500 мкл на пробирку).

- Промывают охлажденным на льду PBS /2% ФБС (200-300g в течение 3 минут) и ресуспендируют в 700 мкл PBS 1X и 100 мкл распределяют в пробирке FACS для условий, описанных в таблице 4 ниже:

Таблица 4

COV434-MISRII	Свежие опухолевые клетки
Без антител
R565-AF (изотипический контроль) 10 мкг/мл
3C23K-AF 1 нг/мл
3C23K-AF 10 нг/мл
3C23K-AF 100 нг/мл
3C23K-AF 1 мкг/мл
3C23K-AF 10 мкг/мл (и до 25 мкг/мл при необходимости)

- Инкубируют с антителом 3C23K-AF488 в PBS /1% ФБС в течение 30 минут при 4°C

- Промывают в PBS/2% BSA два раза (200-300 g в течение 3 минут)

- Промывают в PBS два раза (200-300 g в течение 3 минут)

- Добавляют 300-400 мкл PBS и проводят анализ на FACS как можно скорее.

Этот протокол не содержит какого-либо этапа фиксации для внеклеточного окрашивания для поддержания целостности мембраны. Следовательно, обнаруживают только мембранный AMHRII.

A.3. Иммуногистохимия: протокол и методология

- Клеточные линии: фиксируют в формальдегиде, уксусной кислоте и спирте (AFA) с составом клеточных блоков.

- Опухоли человека: фиксируют в формалине для внешних образцов и в AFA для предметных стекол из Института Кюри.

- Метод иммуногистохимии (IHC) возможно выполнять после депарафинизации образцов и демаскировки при pH 9 (микроволновая печь EZ Retriever 15' при 90°C с последующим охлаждением в течение 20').

- Рецептор антимюллерового гормона типа II детектируют методом иммунопероксидазы и выявляют хромогенный субстрат DAB.

- После блокирования активности эндогенной пероксидазы предметные стекла инкубируют с разбавленным биотинилированным первичным антителом (1/800, 8 мкг/мл) в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывают PBS и инкубируют с комплексом авидин/биотин ABC [Vector] в течение 30 минут. Иммунореактивные сигналы детектируют с применением раствора субстрата DAB (DAB и субстратный буфер/жидкий DAB и хромоген, 10 минут инкубации). Наконец, осуществляют легкое контрастное окрашивание срезов с гематоксилином Майера (модификация Лилли).

- Отрицательные контроли получают путем замены первичных антител изотипическим контрольным иммуноглобулином (R565) или только разбавителем антител (отрицательный буферный контроль) в процедуре иммуногистохимического окрашивания.

- Положительные контроли получают с применением клеток COV434, трансфицированных AMHR2, и образцов гранулезных опухолей человека.

- После обработки срезы исследуют с применением оцифровки с помощью Philips IMS. Все образцы независимо оценивают 2 патолога.

- Уточняют локализацию мечения: цитоплазматическое и/или мембранное.

- Интенсивность классифицируют по явному коричневому мечению мембраны и/или цитоплазмы опухолевых клеток с применением следующей системы подсчета: интенсивность маркировки определяют как 0 для отрицательного, 1 для слабого, 2 для умеренного и 3 для сильного мечения, как показано для положительного контроля COV434.

- Частоту определяют как процент клеток, экспрессирующих AMHRII. Участки некроза исключают из анализа. Общую гистологическую оценку устанавливают с применением частоты, умноженной на среднюю оценку интенсивности (от 0 до 3) кумулирования мембранной и цитоплазматической экспрессии.

- Все предметные стекла хранят надлежащим образом.

B. Результаты

Контроли

- Отрицательный контроль и изотипический контроль не проявляют реактивности на опухолевых клетках.

- Образец положительного контроля (амплифицированный COV434 AMHRII) демонстрирует диффузное иммуноокрашивание клеток (показатель интенсивности: 3). Мечение является однородным (показатель частоты: 100%) при цитоплазматической и мембранной локализации.

- Образец гранулезной ткани в качестве положительного контроля демонстрирует сильное иммуноокрашивание опухолевых клеток (оценка интенсивности 3). Мечение является однородным (показатель частоты: 100%) при цитоплазматической и мембранной локализации.

Экспрессию AMHRII в образцах ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDX), оценивают с помощью IHC.

Важно отметить, что мембранная экспрессия AMHR2, по-видимому, занижена, когда образцы фиксируют в формалине по сравнению с образцами, обработанными в AFA.

Результаты мембранной экспрессии AMHRII различными опухолями человека, ксенотрансплантированными мышам, представлены на таблице 5, где показатель экспрессии AMHRII представлен для панели различных типов раковых клеток.

Часть результатов экспрессии AMHRII опухолевыми ксенотрансплантатами человека приведена в таблице 5 ниже.

Таблица 5: Экспрессия AMHRII в ксенотрансплантатах опухоли человека

Тип опухоли	Процент положительных PDX	Количество протестированных PDX
SCLC	0%	13
NSCLC (неопределенного подтипа)	15,4%	13
NSCLC (эпидермоидный)	26,9%	26
NSCLC (аденокарцинома)	7,7%	39
NSCLC (крупноклеточный)	40%	10

Результаты показали, что AMHRII экспрессируется на клеточной поверхности во множестве ксенотрансплантатов рака легкого человека, особенно в образцах опухолей, полученных из NSCLC, а точнее в образцах опухолей, происходящих от пациентов, страдающих от NSCLC, выбранного из группы, состоящей из эпидермоидного NSCLC, аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC и некоторых NSCLC неопределенного подтипа.

Экспрессия AMHRII в образцах ксенотрансплантатов, полученных от пациентов (PDX), по оценке с помощью поточной цитометрии (FACS).

Результаты, изображенные на фигурах 3А-3Е, показывают, что AMHRII экспрессируется на мембране опухолевых клеток, происходящих из ксенотрансплантатов, полученных от пациентов с раком легкого, независимо от вида рассматриваемого рака легкого. Результаты, изображенные на фигурах 3A-3E, показывают, что мембранную экспрессию белка AMHRII обнаруживают при плоскоклеточной карциноме легкого (фигуры 3A, 3C, 3D), крупноклеточной карциноме легкого (фигура 3B) и плеоморфной карциноме легкого (фигура 3E).

Кроме того, для тех же клеток рака легкого были измерены (i) количество AMHRII на клетку, а также (ii) процент раковых клеток, экспрессирующих AMHRII, в тех же протестированных образцах. Результаты изображены в таблице 6 ниже.

Таблица 6: FACS-анализ экспрессии AMHRII в клетках рака легкого человека, полученных из ксенотрансплантатов, полученных от пациента

Гистологический тип	Порядковый номер	Количество рецепторов AMHRII на клетку	Процент AMHRII положительных клеток (в%)	Положительные/отрицательные
Плоскоклеточная карцинома	Lu7860	519,000	100	положительный
Крупноклеточная карцинома	Lu7166	51,000	70	положительный
Плоскоклеточная карцинома	Lu7298	150,000	87	положительный
Плоскоклеточная карцинома	Lu7414	61,000	63	положительный
Плеоморфная карцинома	Lu7558	46,000	35	положительный

В таблице 6 экспрессию AMHRII оценивали в каждом образце опухоли путем (i) определения среднего количества белков AMHRII, присутствующих на мембране опухолевых клеток, и (ii) определения процента мембранных AMHRII-положительных клеток в образце опухоли. В левом столбце таблицы 6 указано, является ли соответствующий образец опухоли «положительным» или «отрицательным». Указание «положительный» означает, что опухолевые клетки пациента с раком легкого в значительной степени экспрессируют AMHRII на их мембране. Указание «отрицательный» означает, что AMHRII не детектируется в значительной степени на мембране опухолевых клеток.

Результаты таблицы 6 показывают, что все образцы опухолей экспрессируют мембранный AMHRII, хотя и с различными уровнями экспрессии.

Экспрессия AMHRII в свежих образцах опухолей человека по оценке с помощью поточной цитометрии (FACS)

Результаты, изображенные на фигурах 3F и 3G, показывают, что AMHRII экспрессируется на мембране опухолевых клеток, происходящих из хирургически иссеченного NSCLC человека (фигура 3G), в то время как AMHRII не экспрессируется на мембране клеток, происходящих из здорового края, полученного от того же пациента (фигура 3F).

e) Выводы

Экспрессия белка AMHR2 была подтверждена для моделей PDX рака легкого с положительной транскрипцией AMHR2. Эти PDX были адаптированы от рака легкого (IC8LC10 и SC131). Уровни экспрессии были умеренными, но значительными, характеризующимися общей оценкой от 1 до 1,5. Эти данные свидетельствуют о том, что рак, отличный от гинекологического, может экспрессировать AMHR2.

Эти модели можно применять для характеристики анти-AMHR2 терапии в будущем.

Пример 4: Эффективность in vivo анти-AMHRII антител против рака легкого, экспрессирующего AMHRII

1. Краткое описание задачи

Проанализировать противоопухолевую эффективность тестируемого соединения GM102 от Gamamab (также называемого здесь антителом 3C23K), используемого в качестве отдельного агента или в комбинации либо с доцетакселом, либо с комбинацией цисплатин/гемцитабин, в модели SC131 ксенотрансплантата, полученного от пациента с немелкоклеточным раком легкого, вводимого самкам иммунодефицитных мышей.

2. Способы

Пятьдесят четыре (54) мыши с подкожно растущей опухолью SC131 (P22.1.3/0) между 62,5 и 220,5 мм³ были распределены для обработки, когда средний и медианный объемы опухоли достигали 130,76 и 126,00 мм³, соответственно.

Исследование эффективности XTS-1526 состояло из 6 групп по 9 мышей в каждой:

В группе 1 вводили носитель в дозе 5 мл/кг, в/в. 2 р/нед × 3;

В группе 2 вводили GM102 в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 3;

В группе 3 вводили доцетаксел в дозе 20 мг/кг, медленно в/в. однократно в D0;

В группе 4 вводили GM102 в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 1 или 2 в комбинации с доцетакселом 20 мг/кг, медленно в/в. однократно в D0;

В группе 5 вводили цисплатин в дозе 5 мг/кг в комбинации с гемцитабином в дозе 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 2 или 3;

В группе 6 вводили GM102 в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 1 или 2 в комбинации с цисплатином 5 мг/кг и гемцитабином 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 1 или 2.

Из мышей, не включенных в исследование эффективности, были протестированы 2 группы, включающие 8 мышей на группу:

В группе 7 вводили GM102 в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 3 в комбинации с цисплатином 5 мг/кг, и.п. 1 р/нед × 3;

В группе 8 вводили GM102 в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 3 в комбинации с гемцитабином 100 мг/кг, и.п. 1 р/нед × 3.

Опухоли измеряли, и мышей взвешивали три раза в неделю в течение экспериментального периода. Свежие образцы опухолей собирали у 3 мышей в группе без введения дополнительной дозы в D28 (для включения 2 и 3) или в D31 (для включения 1) для образцов с быстрозамороженной тканью и фиксированных формалином. Только быстрозамороженные ткани были направлены далее для последующего анализа. Образцы, фиксированные формалином, после отбора отбрасывали.

3. Цель исследования

Эксперимент, описанный в этом отчете, был направлен на определение противоопухолевой эффективности одного тестируемого соединения от Gamamabs, закодированного как GM102, используемого отдельно или в комбинации либо с доцетакселом, либо с комбинацией цисплатин/гемцитабин в модели SC131 ксенотрансплантата немелкоклеточного рака легкого, полученного от пациента.

Исследуемый продукт: GM102 (также называемый в настоящей заявке как 3C23K)

Анти-AMHR2 продукт, GM102, представляет собой гуманизированное mAb, направленное против рецептора антимюллерового гормона (AMHR2), в качестве альтернативы известного как рецептор II мюллерового ингибирующего фактора (MISRII). AMHR2 присутствует во внутриутробном периоде на уровне внутренних предшественников половых женских органов (Müllerian tractus) и ограничивается яичниками (гранулезные клетки) и яичками (клетки Лейдига) в зрелом возрасте. AMHR2 также экспрессируется при примерно 65% гинекологических раковых заболеваний, таких как рак яичника и эндометрия (Bakkum JN, Gynecol Oncol, 2007; Sahli I, Biochem, 2004; Anttonen M, Lab Invest, 2011; Song JY, Int J. Oncol, 2009).

Было показано, что антитело GM102 проявляет противоопухолевую эффективность на мышиных моделях ксенотрансплантата с применением AMHR2-трансфицированных линий опухолевых клеток человека. Эта эффективность, как было задокументировано, основана на вовлечении иммунных эффекторных клеток, запускаемых оптимизированным антителом на уровне опухоли. Кроме того, было показано, что эффективность GM102 является синергичной с карбоплатином и паклитакселом, основными химиотерапевтическими агентами, используемыми при раке яичников (Jacquet A., Cancer Res, 2012).

Модели ксенотрансплантата опухоли человека

Образцы опухолей человека различного гистологического происхождения получили с информированного согласия пациентов, которых лечили в онкологических центрах, и установили в качестве трансплантируемых ксенотрансплантатов для иммунодефицитных мышей. Привитые образцы представляют собой остаточный материал от первичных опухолей или метастазов, полученных до или после лечения. Эти модели ксенотрансплантата, полученные от пациента, (PDX) были созданы без предварительного культивирования in vitro и изучили на предмет гистологических, цитогенетических, генетических и других биологических маркеров, и также их ответной реакции на стандартную терапию (SOC).

Модель опухоли SC131 получали из метастазов кожи немелкоклеточного рака легкого с мутировавшими EGFR (R451F) и Kras (G12V), и дикого типа TP53 и PTEN.

SC131 слабо реагирует на доцетаксел и комбинацию цисплатин/гемцитабин и не имеет ответной реакции на другие протестированные агенты (данные получены на швейцарских голых мышах).

Для модели опухоли SC131 требуется примерно 17 дней, чтобы получить максимальные опухоли в диапазоне от 60 до 200 мм³ и от 35 до 40 дней, чтобы достичь 2000 мм³ со дня имплантации.

SC131 демонстрирует кахектические свойства.

4. Материалы

4.1. Животные и условия содержания

Самок белых нелинейных (nu/nu) мышей («HSD: Athymic Nude-Foxn1^nu») массой 18-25 граммов (ENVIGO, Gannat, Франция) размещали для акклиматизации в помещении для животных с доступом к пище и воде без ограничения в течение не менее 6 дней до манипуляции (Таблица 7).

Таблица 7: Характеристики животных

Вид	Штамм	Поставщик	Пол	Масса	Возраст при приеме
Мышь (Mus musculus)	Athymic Nude - Foxn1nu	ENVIGO, Франция	Женский	18-25	5 недель

4.2. Постановление о благополучии животных

Разрешение на использование животных в учреждениях CERFE было получено Управлением ветеринарных служб Министерства сельского хозяйства Франции (соглашение № B-91-228-107). Уход за животными и их содержание соответствуют нормативному законодательству Франции о защите лабораторных животных.

Все эксперименты были выполнены в соответствии с законодательством Франции о защите лабораторных животных и в соответствии с действующей в настоящее время лицензией на эксперименты на позвоночных животных, выданной Министерством сельского хозяйства и рыболовства Франции компании Guillaume Lang (№ A-75-1927 от 15 апреля 2012; срок действия: 5 лет).

4.3. Содержание животных

Мышей содержали в группах максимум из 7 животных в течение периода акклиматизации и максимум из 6 животных во время экспериментальной фазы. Мышей содержали в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) из полисульфонового (PSU) пластика (мм 213 Ш × 362 Д × 185 В, Аллентаун, США) со стерилизованными и беспыльными подстилками. Пищу и воду стерилизовали. Животных содержали в цикле свет-темнота (14-часовой циркадный цикл искусственного освещения), и контролировали комнатную температуру и влажность.

По запросу отслеживали условия окружающей среды, и данные сохраняли в архиве Центрального Вивария.

4.4. Обеспечение пищи и воды

Питьевая вода была предоставлена без ограничения. Каждой мыши ежедневно предлагали полностью гранулированную пищу (150-SP-25Type, SAFE) на протяжении всего исследования. Аналитический сертификат на корм и воду для животных хранится в помещении CERFE.

4.5. Идентификация животных

Всех животных взвешивали перед каждым экспериментом и идентифицировали по уникальному рисунку системы нумерации с помощью перфорации уха.

Каждую клетку идентифицировали по бумажной бирке с указанием: номера клетки, штамма и номера мыши, кода опухоли, даты эксперимента.

4.6. Тестируемое соединение и формы

Носитель PBS 1X готовили путем разбавления PBS 10X (Sigma PBS 10X, # P5493-1L, партия SLBJ2848) в 1/10 в стерильной деионизированной воде. Его хранили при 4°С для обработки аликвотами и разведения GM102 в течение 30 дней.

Концентрированные аликвоты GM102 (3C23K) (партия LP01 [R18H2-LP01]) были получены 7 июля 2016 года (4 флакона по 5 мл при 10,1 мг/мл) и хранились при 4°C. В каждый день дозирования исходный раствор разбавляли в холодном PBS 1X с получением 2 мг/мл рабочего раствора. Этот раствор хранили на льду или при 4°С и защищали от света до обработки, затем флакон хранили при комнатной температуре во время инъекции. Оставшийся рабочий раствор после обработки отбрасывали.

Исходный раствор доцетаксела (Taxotere®, Sanofi, партия 6F255A - Срок годности: 03-2018) в концентрации 10 мг/мл перед каждым дозированием должен быть разбавлен с помощью 0,9% NaCl в 1/5 до получения рабочей концентрации 2 мг/мл. Исходный раствор является стабильным в течение одного месяца после восстановления при 4°C и при защите от света.

Исходный раствор цисплатина (Cisplatin-Teva, партия 15A30MF - Срок годности: 01-2017) в концентрации 0,5 мг/мл был готов к применению. Этот раствор хранили при комнатной температуре и защищали от света до истечения срока годности, указанного поставщиком.

Исходный раствор гемцитабина (Gemzar®, Lilly, партия C442937D, Срок годности: 02-2018) в концентрации 40 мг/мл перед каждым дозированием должен быть разбавлен с помощью 0,9% NaCl в 1/4 до получения рабочей концентрации 10 мг/мл. Исходный раствор является стабильным в течение одного месяца после восстановления при 4°C и при защите от света.

5. Способы

5.1. Индукция модели трансплантата опухоли

Опухоли одного пассажа трансплантировали подкожно 3-24 мышам (мыши-доноры, пассаж (n-1)). Когда эти опухоли достигли 700-2000 мм³, мышей-доноров умерщвляли смещением шейных позвонков, опухоли асептически иссекали и рассекали. После удаления некротических участков опухоли разрезали на фрагменты размером приблизительно 20 мм³ и переносили в культуральную среду перед прививкой.

Восемьдесят девять (89) мышей подвергали анестезии с помощью 100 мг/кг кетамина гидрохлорида (партия 5D92 - Срок годности: 03-2017, Virbac) и 10 мг/кг ксилазина (партия KP0AX9X, Bayer), и затем кожу асептически обрабатывали раствором хлоргексидина, разрезали на уровне межлопаточной области, и фрагмент опухоли размером 20 мм³ помещали в подкожную ткань. Кожу закрывали зажимами.

Всем мышам из одного эксперимента осуществляли имплантацию в один и тот же день.

5.2. Фаза обработки

В части эффективности XTS-1526 выделяли 54 мыши с подкожно растущей опухолью SC131 (P22.1.3/0) между 62,5 и 220,5 мм³ в соответствии с их объемом опухоли, чтобы обеспечить однородное средний и медианный объем опухоли в каждой группе обработки. Обработку проводили, случайным образом выбирая коробки, вмещающие до 5 мышей, и начинали через 18 дней после имплантации опухоли (60% степень включения при ступенчатом включении). Исследование проводили с неравномерным включением сначала с 5 мышами на группу, а затем через 2 дня 4 мышами на группу. Исследование прекращали через 31 день после начала обработки.

Таблица 8

Группа	Агент	Среднее (мм3)	Медианное (мм3)	СОС
1	носитель	129,28	126	17,80
2	GM102 20 мг/кг	129,83	126	13,13
3	Доцетаксел 20 мг/кг	137,28	126	15,38
4	GM102 20 мг/кг Доцетаксел 20 мг/кг	130,33	126	12,15
5	Цисплатин 5 мг/кг Гемцитабин 100 мг/кг	132,67	126	17,50
6	GM102 20 мг/кг Цисплатин 5 мг/кг Гемцитабин 100 мг/кг	125,17	126	16,53

Для дополнительных групп 7 и 8 размер опухоли был выше и более неоднородным. Животные были включены через 32 дня после имплантации.

Таблица 9

Группа	Агент	Среднее (мм3)	Медианное (мм3)	СОС
7	GM102 20 мг/кг Цисплатин 5 мг/кг	310,63	288	57,03
8	GM102 20 мг/кг Гемцитабин 100 мг/кг	315,31	320	53,30

5.3. Измерения опухолей и осмотр животных

Объем опухоли (TV) оценивали путем измерения диаметров опухоли штангенциркулем три раза в неделю в течение периода обработки. Применяли формулу TV (мм³) = [длина (мм) × ширина (мм)²]/2, где длина и ширина представляют собой самый длинный и самый короткий диаметры опухоли, соответственно.

Всех животных взвешивали три раза в неделю в течение периода обработки. Неблагоприятное явление различных методов обработки определяли как:

Относительную массу тела (RBW) рассчитывали для каждого измерения путем деления массы тела на массу тела в начале обработки.

Индивидуальный процент потери массы тела (% BWL) = 100 - (BW_x/BW₀×100), где BW_x представляет собой BW в любой день во время обработки, и BW₀ представляет собой BW в 1-й день обработки.

Мышей осматривали каждый день на предмет внешнего вида, поведения и клинических изменений.

Все признаки болезни совместно с любым поведенческим изменением или реакцией на лечение регистрировали для каждого животного.

5.4. Дизайн исследования XTS-1526

В общей сложности применяли 8 групп, как показано в таблице 9. Для групп с 1 по 6 каждая группа первоначально включала 9 мышей. Для групп 7 и 8 каждая группа первоначально включала 8 мышей.

В группе 1 носитель вводили в дозе 5 мл/кг внутривенно два раза в неделю в течение 3 недель.

В группе 2 группе GM102 вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно два раза в неделю в течение 3 недель.

В группе 3 доцетаксел вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно один раз в день D0.

В группе 4 GM102 вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно два раза в неделю в течение 1 или 2 недель в комбинации с доцетакселом в дозе 20 мг/кг однократно внутривенно в день D0.

В 5-й группе цисплатин вводили в дозе 5 мг/кг в комбинации с гемцитабином в дозе 100 мг/кг интраперитонеально, один раз в неделю в течение 2 или 3 недель.

В группе 6 GM102 вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно два раза в неделю в течение 1 или 2 недель с комбинацией цисплатина в дозе 5 мг/кг и гемцитабина в дозе 100 мг/кг, интраперитонеально, один раз в неделю в течение 1 или 2 недель.

В группе 7 GM102 вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно два раза в неделю в течение 3 недель с цисплатином в дозе 5 мг/кг интраперитонеально один раз в неделю в течение 3 недель.

В группе 8 GM102 вводили в дозе 20 мг/кг внутривенно два раза в неделю в течение 3 недель с гемцитабином в дозе 100 мг/кг интраперитонеально один раз в неделю в течение 3 недель.

Все дозы обработки были скорректированы на массу тела при каждой инъекции.

Таблица 10: Дозы и схемы дозирования в исследовании эффективности XTS-1526

Гр.	N	1-й тестируемый агент				2-й тестируемый агент				3-й тестируемый агент
		Агент	Доза мг/кг	Путь	Схема	Агент	Доза мг/кг	Путь	Схема	Агент	Доза мг/кг	Путь	Схема
1	9	Носитель	-	в.в.	2 р/нед × 3	-	-	-	-	-	-	-	-
2	9	GM102	20	в.в.	2 р/нед × 3	-	-	-	-	-	-	-	-
3	9	-	-	-	-	Доцетаксел	20	Медленно в.в.	D0	-	-	-	-
4	9	GM102	20	в.в.	2 р/нед ×1-2	Доцетаксел	20	Медленно в.в.	D0	-	-	-	-
5	9	-	-	-	-	Цисплатин	5	ИП	D0, D7 и/или D14	Гемцитабин	100	ИП	D0, D7 и/или D14
6	9	GM102	20	в.в.	2 р/нед ×1-2	Цисплатин	5	ИП	D0 и D7	Гемцитабин	100	ИП	D0 и D7
7	8	GM102	20	в.в.	2 р/нед × 3	Цисплатин	5	ИП	1 р/нед × 3	-	-	-	-
8	8	GM102	20	в.в.	2 р/нед × 3	-	-	-	-	Гемцитабин	100	ИП	1 р/нед × 3

5.5. Действия, предпринимаемые в случае потери массы тела или неблагоприятного явления

Если наблюдались какие-либо побочные эффекты или наблюдалась потеря массы тела, больше или равная 15% по сравнению с днем включения, в день измерения опухоли и мониторинга массы тела (три раза в неделю), спонсора информировали в кратчайшие сроки с момента обнаружения побочных эффектов/проблем.

Затем выполняли следующие действия:

Обработку для соответствующего животного прекращали; обработку возобновляли, если потеря массы тела составляла менее 10%

Вся группа, в которой наблюдалась потеря массы тела, получала DietGel Recovery^®, и соответствующее животное взвешивали каждый день до тех пор, пока потеря массы тела не стала менее 10%; добавление DietGel Recovery^® прекращали, если потеря массы тела составляла менее 10%.

5.6. Критерии умерщвления согласно этике

Животных умерщвляли по следующим критериям:

Потеря массы тела (BWL) более или равная 20% по сравнению с 1-м днем обработки в течение 48 часов подряд (3 измерения).

Общее изменение поведения или клинических признаков.

Объем опухоли более или равен 2000 мм³.

5.7. Конечные точки/Окончание исследования

Только мышей, достигших этических критериев умерщвления, умерщвляли в соответствующее время.

Все экспериментальные группы умерщвляли в конце экспериментального периода.

Конечные точки для эксперимента составляли:

фаза лечения 4 недели,

отсутствие последующей фазы.

5.8. Отбор образцов крови, опухоли и ткани

5.8.1. Отбор образцов опухоли

5.8.1.1. Отбор образцов опухолей для FFPE (зафиксированное формалином и залитое парафином)

- ½ опухоли обрабатывали для FFPE: опухоль фиксировали в 10% формалине в течение 24 часов и переносили в 70% этанол, и затем отправляли в Histalim по следующему адресу для введения парафина (то есть 17 [из основного исследования] образцов опухоли FFPE):

Точное время и продолжительность фиксации в формалине отмечали для каждого образца опухоли.

Во время введения 5 поправки спонсор решил отказаться от образцов FFPE.

5.8.1.2. Отбор проб опухолей для мгновенного замораживания

- ½ опухоли обрабатывали для мгновенного замораживания: опухоль разрезали на кусочки размером 3×3×3 мм и быстро замораживали в жидком азоте, затем переносили в минус 80°C для хранения (т.е. 17 [из основного исследования] и 6 [из исследования переносимости в 2 группах]) быстрозамороженных образцов опухолей).

Точное время отбора образцов отмечали для каждого образца опухоли.

5.9. Анализ данных

5.9.1. Обработка данных

Все необработанные данные записывали в соответствующие формы, связанные в пронумерованных регистрах, сохраняли и обрабатывали компьютерной системой.

День 0 считали первым днем обработки. Дни эксперимента впоследствии считали в соответствии с этим определением.

Записанные данные выражены как среднее ± стандартная ошибка среднего (m ±СОС).

Кривые средней относительной массы тела получали путем построения графика зависимости средней относительной массы тела (RBW) от времени для каждой экспериментальной группы. Дельту относительной массы тела (относительная масса тела обработанной группы по сравнению с относительной массой тела контрольной группы) применяют для статистического анализа.

Средний процент потери массы тела (% BWL) = 100 - (средняя BW_x/средняя BW₀×100), где BW_x представляет собой среднюю BW в любой день во время обработки, а BW₀ представляет собой среднюю BW в 1-й день обработки.

Кривые роста опухоли получали путем построения графика среднего объема опухоли в мм³ в зависимости от времени для каждой экспериментальной группы. Дельту объемов опухоли (относительные объемы опухолей обработанной группы по сравнению с относительными объемами опухолей контрольной группы) применяли для статистического анализа.

Индивидуальные задержки роста опухоли (TGD) рассчитывали как время в днях, необходимое для того, чтобы отдельные опухоли достигли 3-5-кратного первоначального объема опухоли. Среднюю задержку роста в группах рассчитывали и представляли в таблицах.

Индекс задержки роста опухоли (TGDI) рассчитывали как среднюю задержку роста в обработанной группе, деленную на среднюю задержку роста в контрольной группе.

Рассчитывали процентное соотношение между средним объемом опухоли обработанной группы (T) и средним объемом опухоли контрольной группы (C).

Статистический анализ выполняли для каждого измерения с помощью непараметрического критерия сравнения Манна-Уитни. Каждую обработанную группу сравнивали с контрольной группой.

Стабилизацию опухоли (TS) определяли как количество мышей с постоянным размером опухоли в течение по меньшей мере 3 последовательных измерений.

Частичную регрессию опухоли (PR) определяли как количество мышей, у которых размер опухоли составлял меньше исходного размера опухоли в течение по меньшей мере 3 последовательных измерений.

Полную регрессию опухоли (CR) определяли как количество мышей с размером опухоли от 0 до 13,5 мм³ в течение по меньшей мере 3 последовательных измерений.

Выживание без опухоли (TFS) определяли как количество полных регрессий опухоли, зарегистрированных до дня закрытия группы.

6. Результаты

6,1. Данные о переносимости, клинические наблюдения

Среднее процентное изменение массы тела в течение периода обработки показано на фигуре 4.

В этом исследовании мышей взвешивали три раза в неделю в течение экспериментального периода.

В группе 1 носитель, вводимый в дозе 5 мл/кг, в/в., 2 р/нед × 3, хорошо переносился, но кахектический эффект опухоли индуцировал максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 8,3%, на 16 день, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 17,6%, на 28 день. Других нежелательных явлений не наблюдалось, но из-за кахектического эффекта опухоли животные получали DietGel Recovery® со 2-го включения в дни 18, 21, 25 и 26.

В группе 2 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в., 2 р/нед × 3, хорошо переносился, при максимальной средней потере массы тела, составляющей 9,8% на 14 день, и максимальной индивидуальной потере массы тела, составляющей 16,8%, на 16 день, соответствующей кахектическому эффекту опухоли, что видно в контрольной группе 1. Других нежелательных явлений не наблюдалось, но из-за кахектического эффекта опухоли животные получали DietGel Recovery® со 2-го включения в дни 11, 16, 18, с дня 21 до дня 27. Мышь #27 обнаружили мертвой на 27 день без каких-либо клинических признаков.

В группе 3 доцетаксел, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в. однократно в D0, индуцировал статистически значимую (p менее 0,01 с 4-го дня) максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 17,0%, на 16 день по сравнению с контрольной группой 1, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 23,8%, на 19 день. Других нежелательных явлений не наблюдалось, но из-за кахектического эффекта опухоли целая группа получала DietGel Recovery® с 7 до 27 дня (до дня 31 для животных из 1-го включения). Несмотря на данный DietGel, 4 мыши пришлось умерщвить до окончания исследования.

В группе 4 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 1, в комбинации с доцетакселом в дозе 20 мг/кг, в/в однократно на D0, индуцировал статистически значимую (p менее 0,01 с 4-го дня) максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 18,1%, на 14 день по сравнению с контрольной группой 1, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 24,1%, на 23 день. Других нежелательных явлений не наблюдалось, но из-за кахектического эффекта опухоли целая группа получала DietGel Recovery® в дни 4 и 5, затем с 7 дня по 27 день. Несмотря на данный DietGel, 5 мышей пришлось умерщвить до окончания исследования.

В 5 группе цисплатин, вводимый в дозе 5 мг/кг в комбинации с гемцитабином в дозе 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 2 или 3, индуцировал статистически значимую (p менее 0,01 с 2-го дня) максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 17,5%, по сравнению с контрольной группой 1, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 30,1%, на 11 день. Из-за комбинации токсичности комбинации соединений и кахектического эффекта роста опухоли животные из 2-го включения получали DietGel Recovery® в дни 2 и 3, затем вся группа в дни 4 и 7, затем с 9 дня по 27 день (до 31 дня для животных из 1-го включения). Несмотря на данный DietGel, 4 мыши пришлось умерщвить до окончания исследования, и 1 мышь была найдена мертвой на 12 день.

В 6 группе GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в.в. 2 р/нед × 1 или 2, в комбинации с цисплатином в дозе 5 мг/кг и гемцитабином в дозе 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 1 или 2, индуцировал статистически значимую (p менее 0,001 с 2-го дня) максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 21,1%, по сравнению с контрольной группой 1, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 27,5%, на 11 день. Из-за комбинации токсичности комбинации соединений и кахектического эффекта роста опухоли животные из 2-го включения получали DietGel Recovery® в дни 2 и 3, затем вся группа с 4 дня по 27 день (до 31 дня для животных из 1-го включения). Несмотря на данный DietGel, 7 мышей пришлось умерщвить до окончания исследования.

В дополнительной группе 7 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в., 2 р/нед × 3, с цисплатином в дозе 5 мг/кг, и.п. 1 р/нед × 3, и в комбинации с кахектическим эффектом роста опухоли индуцировал значительную максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 12,3%, на 18 день, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 28,9%, на 28 день. Из-за комбинации токсичности комбинации соединений и кахектического эффекта роста опухоли животные получали DietGel Recovery® в дни 9 и 11, затем с 13 дня по 28 день. Несмотря на данный DietGel, 2 мышей пришлось умерщвить до окончания исследования, и 1 мышь была найдена мертвой до окончания исследования. Более того, у 5/8 мышей обнаружено проявление шелушения и/или сухости кожи со дня 8 до окончания исследования.

В группе 8 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в., 2 р/нед × 3, с гемцитабином в дозе 100 мг/кг, и.п. 1 р/нед × 3, и в комбинации с кахектическим эффектом роста опухоли индуцировал значительную максимальную среднюю потерю массы тела, составляющую 13,4%, на 11 день, и максимальную индивидуальную потерю массы тела, составляющую 26,4%, на 28 день. Из-за комбинации токсичности комбинации соединений и кахектического эффекта роста опухоли животные получали DietGel Recovery® со 2 дня по 4 день, с 7 дня по 9 день, в дни 11 и 12, затем с 14 дня по 28 день. Несмотря на данный DietGel, 3 мышей пришлось умерщвить до конца исследования, и 1 мышь была найдена мертвой до окончания исследования. Более того, у 6/8 мышей обнаружено проявление шелушения и/или сухости кожи со дня 4 до окончания исследования.

6.2. Данные противоопухолевой эффективности

Кривые роста опухоли (средний объем опухоли от времени) показаны на фигуре 4. Значения T/C в процентах для каждой группы обработки представлены в таблице 11 и проиллюстрированы на фигурах 5 и 6. Статистический анализ представлен в таблице 12.

В этом исследовании опухоли измеряли три раза в неделю в течение экспериментального периода.

Во 2 группе GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 3, не продемонстрировал какой-либо противоопухолевой эффективности с TGDI равным 1,33 и наилучшим T/C равным 74,68% на 16 день (окончание для контрольной группы).

В группе 3 доцетаксел, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в. однократно в D0, продемонстрировал сильную и статистически значимую (p менее 0,01 на D4, затем p менее 0,001 от D7 до D16 по сравнению с контрольной группой 1 по критерию Ман-Уитни) противоопухолевую эффективность с TGDI больше 2,71 и наилучшим T/C равным 11,00% на 16 день (окончание для контрольной группы). Более того, наблюдалось 7/9 случаев кратковременной стабилизации опухоли и 2/9 случаев кратковременной частичной регрессии опухоли в течение периода обработки.

В группе 4 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в.в. 2 р/нед × 1 или 2, в комбинации с доцетакселом в дозе 20 мг/кг, в.в. однократно в D0, продемонстрировал сильную и статистически значимую (p менее 0,01 на D4, затем p менее 0,001 от D7 до D14 по сравнению с контрольной группой 1 по критерию Ман-Уитни) противоопухолевую эффективность с TGDI больше 2,71 и наилучшим T/C равным 11,34% на 16 день (окончание группы 4, n=6). Более того, наблюдалось 6/9 случаев кратковременной стабилизации опухоли и 3/9 случаев кратковременной частичной регрессии опухоли в течение периода обработки.

В группе 5 цисплатин, вводимый в дозе 5 мг/кг, в комбинации с гемцитабином в дозе 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 2 или 3, продемонстрировал статистически значимую (p менее 0,01 на D4, затем p менее 0,001 от D7 до D11 по сравнению с контрольной группой 1 по критерию Ман-Уитни) противоопухолевую эффективность с TGDI равным 2,30 и наилучшим T/C равным 27,16% на 16 день (окончание для группы 5, n=6). Более того, наблюдалось 5/9 случаев кратковременной стабилизации опухоли в течение периода обработки.

В группе 6 GM102, вводимый в дозе 20 мг/кг, в/в. 2 р/нед × 1 или 2, с комбинацией цисплатина в дозе 5 мг/кг и гемцитабина в дозе 100 мг/кг, оба и.п. 1 р/нед × 1 или 2, продемонстрировал статистически значимую (p менее 0,05 на D2, затем p менее 0,001 от D4 до D11 по сравнению с контрольной группой 1 по критерию Ман-Уитни) противоопухолевую эффективность с TGDI равным 1,98 и наилучшим T/C равным 33,71% на день 11 (окончание для группы 6, n=7). Более того, наблюдалось 6/9 случаев кратковременной стабилизации опухоли в течение периода обработки.

В дополнительных группах 7 и 8 сравнение с контрольной группой 1 было невозможно из-за более высокого среднего объема опухоли при включении, но в течение периода лечения наблюдались некоторые кратковременные стабилизации опухоли, 5/8 случаев для комбинации GM102/цисплатин и 6/8 случаев для комбинация GM102/гемцитабин.

7. Заключение

Результаты и обсуждение

Кахектический эффект модели опухоли SC131 оказался выше, чем ожидалось, и привел к аналогичной потере массы как в группе, получавшей носитель, так и в группе, получавшей GM102. Следовательно, можно считать, что GM102, используемый отдельно, хорошо переносился.

С другой стороны, токсичность, наблюдаемая в 4 других группах, была частично обусловлена стандартами обработки доцетакселом, цисплатином и гемцитабином, и вызывала гибель примерно половины мышей в каждой группе.

Антитело GM102, применяемое отдельно, индуцировало 25% ингибирование роста опухоли, эффект, который не достигал статистической значимости, в то время как стандарт групп обработки показал сильное ингибирование роста опухоли. Этот результат был неожиданным, так как данная модель была первоначально выбрана на основании ее мембранной экспрессии AMHRII (оценка 1+ по IHC). Однако когда мембранную экспрессию AMHRII оценивали на опухолях SC131 PDX параллельно с этим исследованием, было замечено, что мембранная экспрессия AMHRII снижалась после нескольких пассажей (оценка 0,2+; 40% положительных клеток оценивали на 0,5%). Эти данные подтвердили, что экспрессия AMHRII нестабильна в некоторых моделях in vitro и in vivo, и что мембранные экспрессии являются решающими для AMHRII противоопухолевой эффективности.

По той же причине не наблюдалось усиления противоопухолевой активности при сочетании GM102 с этими стандартами обработки.

Пример 5: Эффективность in vivo анти-AMHRII антител против рака легкого, экспрессирующего AMHRII

А. Материалы и способы

A.1. Мембранная экспрессия AMHRII с помощью иммуногистохимии

Таким образом, был разработан метод непрямой иммунофлюоресценции с анти-AMHRII антителом 3C23K, конъюгированным с Alexa Fluor® 488. Амплификацию сигнала проводили в два этапа с анти-AF488 антителом кролика и с анти-кроличьим антителом козы, конъюгированным с Alexa Fluor® 647.

Замороженные срезы тканей, которые получают с помощью криостата Leica CMD1950, выдерживают при минус 20°C. Замороженные ткани закрепляют на металлическом диске с помощью реактива OCT, и после отверждения их закрепляют на держателе диска. Готовят срезы 7 мкм и помещают на предметные стекла Superfrost Plus (Menzel Gläser) и немедленно помещают на хранение при минус 20°C.

Замороженные предметные стекла со срезами повторно гидратируют с помощью PBS 1X, и затем фиксируют 10 минут при минус 20°C, покрывая их 300 мкл холодного ацетона (VWR Prolabo), и повторно покрывают парафильмом, чтобы гарантировать, что вся ткань полностью покрыта раствором. После окончания действия PBS предметные стекла обрабатывают 300 мкл блокирующего буфера (PBS1X-BSA2% - козья сыворотка 10% - Triton X100 0,1%) 1 час в увлажненном боксе при комнатной температуре для блокирования неспецифических взаимодействий между антителами и тканевыми компонентами. 3C23K-AF488 или контроль изотипа R565-AF488, разведенный в концентрации 10 мкг/мл в блокирующем буфере, применяют в течение 30 минут при комнатной температуре в увлажненном боксе. После 3 промывок посредством 0,1% PBS1X-Triton X100 (3 раза по 10 мин) добавляют анти-AF488 антитело (Invitrogen), разведенное в 1/500 в блокирующем буфере (300 мкл), в течение 30 мин инкубации при комнатной температуре. После 3 промывок посредством 0,1% PBS1X-Triton X100 (3 раза по 10 мин) добавляют конъюгированное анти-кроличье антитело AF647 (Invitrogen), разведенное в 1/500 в блокирующем буфере (300 мкл), в течение 30 мин инкубации при комнатной температуре. Промывают (3 раза по 10 мин) посредством 0,1% PBS1X-Triton X100, затем применяют DAPI (4',6-диамидин-2-фенилиндол, Sigma-Aldrich) при 0,5 мкг/мл в течение 10 мин. После окончания действий с PBS и H₂O предметные стекла со срезами закрепляют под покровными стеклами (24×50 мм, Knittel Glass) с применением капли (50 мкл) флуоресцентной фиксирующей среды DAKO, избегая пузырьков воздуха, и хранят при 4°C в темноте до получения изображений.

Получение изображений осуществляли с применением флуоресцентного микроскопа Leica DM5000B, оборудованного CCD-камерой CoolSnap EZ, управляемой программным обеспечением Metavue (Molecular Devices). Последующую обработку изображений осуществляют с помощью программного обеспечения ImageJ free software (http://imagej.nih.gov/ij/).

A.2. Ксенотрансплантаты опухоли легкого человека

Фрагменты опухоли получали из ксенотрансплантатов при серийном пассаже у голых мышей. После удаления от мышей-доноров опухоли разрезали на фрагменты (длина края 3-4 мм) и помещали в PBS, содержащий 10% пенициллин/стрептомицин. Животных-реципиентов анестезировали ингаляцией изофлурана, и они получали односторонние или двусторонние опухолевые имплантаты в бок подкожно.

Модели LXFE2226 ксенотрансплантатов опухоли плоскоклеточного немелкоклеточного рака легкого имплантировали подкожно по одной опухоли на мышь (NMRI-Foxn1^nu от Charles River). Эксперимент состоял из двух групп мышей, из которых по три из них умерщвляли на 15 день для определения мембранной экспрессии AMHRII с помощью проточной цитометрии. Первая группа представляла собой контрольную группу, получавшую носитель, а вторая группа получала исследуемое антитело GM102, которое вводили интраперитонеально (т.е. и.п.) дважды в неделю при уровне дозы 20 мг/кг.

Противоопухолевую эффективность оценивали как минимальное значение T/C путем сравнения медианных относительных объемов опухолей в группе (RTV) в дни, когда была достигнута оптимальная эффективность. Эксперимент прекращали на 43 день после двухнедельного периода наблюдения без введения дозы.

Дизайн исследования:

ID группы	Терапия	Общая суточная доза [мг/кг/день]	Схема [Дни дозирования]	Путь введения	№ животных
1	PBS в качестве контрольного носителя	10 мл/кг	2 р/нед×4	и.п.	13#
2	GM102	20	2 р/нед×4 (h:0)	и.п.	14#

B. Результаты

B. Активность анти-AMHRII антитела GM 102 против опухолей легкого in vivo

Кривые роста опухоли (средний объем опухоли от времени) показаны на фигуре 7. Опухоли измеряли три раза в неделю в течение экспериментального периода.

Результаты, представленные на фигурах 7 и 8, показывают, что анти-AMHRII антитело GM102 продемонстрировало сильную противоопухолевую активность у всех обработанных животных с ксенотрансплантатами.

Измерения роста опухоли на 28-й день показывают, что анти-AMHRII антитело GM102 вызвало резкое уменьшение объема опухоли (p меньше 0,001), что означает, что анти-AMHRII антитело (i) предотвратило рост опухоли и (ii) эффективно вызвало лизис опухолевых клеток, первоначально содержащихся в опухолевых ксенотрансплантатах.

Таким образом, результаты примера 5 показали, что анти-AMHRII антитело оказывает высокоэффективный противоопухолевый эффект против клеток рака легкого, которые фактически экспрессируют белок AMHRII на своей мембране, независимо от уровня экспрессии гена, кодирующего AMHRII.

Таблица 11: Противоопухолевая активность GM102, отдельно или в комбинации со стандартом лечения для ксенотрансплантата SC131, исследование эффективности XTS-1526

XenTech T/C представляет собой средний объем опухоли у обработанных мышей/средний объем опухоли у контрольных мышей ×100 (рассчитано во время первого умерщвления согласно этике в контрольной группе); TGD (задержка роста опухоли) представляет собой время, необходимое для того, чтобы медианный объем опухоли достиг объема опухоли в D0 × 5; TGDI (индекс задержки роста опухоли) равен TGD у обработанных/TGD у контрольных мышей; TS (стабилизация опухоли) равна количество мышей с постоянным размером опухоли в течение по меньшей мере 3 последовательных измерений; PR (частичная регрессия) представляет собой количество мышей, у которых размер опухоли был меньше исходного размера опухоли в течение по крайней мере 3 последовательных измерений; CR (полная регрессия) представляет собой количество мышей с размером опухоли от 0 до 13 мм³ в течение по меньшей мере 3 последовательных измерений; TFS (выживание без опухоли) представляет собой количество полных регрессий, зарегистрированных до дня окончания группы. Лечение начинали на 18 день после имплантации.

Таблица 12: Краткий анализ Манна-Уитни объема опухоли на модели опухоли SC131, исследование эффективности XTS-1526

КРИТЕРИЙ МАННА-УИТНИ ДНИ			0	2	4	7	9	11	14	16
Носитель - 2р/нед × 3	против	GM 102 20 2р/нед × 3	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns	ns
Носитель - 2р/нед × 3	против	Доцетаксел 20 D0	ns	ns	**	***	***	***	***	***
Носитель - 2р/нед × 3	против	GM 102 20 2р/нед × 1-2 Доцетаксел 20 D0	ns	ns	**	***	***	***	***
Носитель - 2р/нед × 3	против	Цисплатин 5 1р/нед × 2-3 Гемцитабин 100 1р/нед × 2-3	ns	ns	**	***	***	***
Носитель - 2р/нед × 3	против	GM 102 20 2р/нед × 1-2 Цисплатин 5 1р/нед × 1-2 Гемцитабин 100 1р/нед × 1-2	ns	*	***	***	***	***

Групповые сравнения проводили с применением непараметрического критерия Манна-Уитни между обработанной группой и контрольной группой: ns = незначительно, * = P меньше 0,05, ** = P меньше 0,01 и *** = P меньше 0,001. Начальный размер группы: 9 животных.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GAMAMABS PHARMA

INSTITUT CURIE

<120> СОЕДИНЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ AMHRII, ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ РАКОВЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКОГО

<130> PR77729/KLP/CJ

<140> EP17305446.1

<141> 2017-04-14

<150> EP17305446

<151> 2017-04-14

<160> 74

<170> BiSSAP 1.3.2

<210> 1

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера"

<223> "3C_23 VL без лидера"

<223> "3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера"

<223> "3C_23 VL без лидера"

<223> "3C_23 VL без лидера"

<220>

<223> 3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера"

<223> "3C_23 VL без лидера

<220>

<223> 3C_23 VL без лидера" <223> "3C_23 VL без лидера

<220>

<223> 3C_23 VL без лидера

<220>

<223> 3C_23 VL без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..318

<400> 1

gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48

gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96

gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144

cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192

ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240

gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288

ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318

<210> 2

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..318 от SEQ ID NO 1"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..318 от SEQ ID NO 1

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 345

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера"

<223> "3C_23 VH без лидера"

<223> "3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера"

<223> "3C_23 VH без лидера"

<223> "3C_23 VH без лидера"

<220>

<223> 3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера"

<223> "3C_23 VH без лидера

<220>

<223> 3C_23 VH без лидера" <223> "3C_23 VH без лидера

<220>

<223> 3C_23 VH без лидера

<220>

<223> 3C_23 VH без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..345

<400> 3

cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48

tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96

cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144

ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192

cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240

atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288

aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336

gtc tcg agc 345

<210> 4

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..345 от SEQ ID NO 3"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..345 от SEQ ID NO 3

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 318

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера"

<223> "3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера"

<223> "3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера"

<223> "3C_23K VL без лидера"

<223> "3C_23K VL без лидера"

<220>

<223> 3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера" <223>

"3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера

<220>

<223> 3C_23K VL без лидера" <223> "3C_23K VL без лидера

<220>

<223> 3C_23K VL без лидера

<220>

<223> 3C_23K VL без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..318

<400> 5

gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48

gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96

gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144

cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192

ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240

gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288

ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318

<210> 6

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..318 от SEQ ID NO 5"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..318 от SEQ ID NO 5

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 345

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера"

<223> "3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера"

<223> "3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера"

<223> "3C_23K VH без лидера"

<223> "3C_23K VH без лидера"

<220>

<223> 3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера"

<223> "3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера

<220>

<223> 3C_23K VH без лидера" <223> "3C_23K VH без лидера

<220>

<223> 3C_23K VH без лидера

<220>

<223> 3C_23K VH без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..345

<400> 7

cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48

tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96

cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144

ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192

cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240

atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288

aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336

gtc tcg agc 345

<210> 8

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..345 от SEQ ID NO 7"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..345 от SEQ ID NO 7

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 639

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<220>

<223> 3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23 легкая цепь без лидера" <223> "3C_23 легкая цепь

без лидера

<220>

<223> 3C_23 легкая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23 легкая цепь без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..639

<400> 9

gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48

gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96

gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144

cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192

ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240

gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288

ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336

agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384

gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432

gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480

agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528

acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576

tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624

aac agg gga gag tgt 639

<210> 10

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..639 от SEQ ID NO 9"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая Конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..639 от SEQ ID NO 9

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 11

<211> 1335

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера"

<220>

<223> 3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь

без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223>

"3C_23 тяжелая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23 тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23 тяжелая цепь

без лидера

<220>

<223> 3C_23 тяжелая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23 тяжелая цепь без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..1335

<400> 11

cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48

tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96

cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144

ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192

cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240

atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288

aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336

gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384

tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432

aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480

ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528

ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576

acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624

gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672

cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720

ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768

gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816

ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864

ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912

acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960

gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008

gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056

cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104

ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152

ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200

tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248

cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296

cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335

<210> 12

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..1335 от SEQ ID NO 11"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..1335 от SEQ ID NO 11

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 13

<211> 639

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23K легкая цепь без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23K легкая цепь без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23K легкая цепь без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23K легкая цепь без лидера"

<223> "3C_23K легкая цепь без лидера"

<220>

<223> 3C_23K легкая цепь без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь

без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь без лидера" <223>

"3C_23K легкая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23K легкая цепь без лидера" <223> "3C_23K легкая цепь

без лидера

<220>

<223> 3C_23K легкая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23K легкая цепь без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..639

<400> 13

gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48

gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96

gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144

cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192

ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240

gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288

ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336

agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384

gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432

gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480

agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528

acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576

tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624

aac agg gga gag tgt 639

<210> 14

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..639 от SEQ ID NO 13"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..639 от SEQ ID NO 13

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 15

<211> 1335

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<220>

<223> 3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера"

<223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23K тяжелая цепь без лидера" <223> "3C_23K тяжелая цепь

без лидера

<220>

<223> 3C_23K тяжелая цепь без лидера

<220>

<223> 3C_23K тяжелая цепь без лидера

<220>

<221> КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ

<222> 1..1335

<400> 15

cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48

tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96

cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144

ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192

cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240

atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288

aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336

gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384

tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432

aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480

ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528

ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576

acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624

gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672

cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720

ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768

gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816

ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864

ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912

acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960

gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008

gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056

cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104

ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152

ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200

tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248

cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296

cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335

<210> 16

<211> 445

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> "[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..1335 от SEQ ID NO 15"

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

[КОДИРУЮЩАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ]:1..1335 от SEQ ID NO 15

<220>

<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 17

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<223> "сигнальный пептид" <223> сигнальный пептид <223> сигнальный пептид

<223> сигнальный пептид

<223> сигнальный пептид" <223> сигнальный пептид

<223> сигнальный пептид

<223> сигнальный пептид

<220>

<223> сигнальный пептид" <223> сигнальный пептид <223> сигнальный пептид

<223> сигнальный пептид

<220>

<223> сигнальный пептид" <223> сигнальный пептид

<220>

<223> сигнальный пептид

<220>

<223> сигнальный пептид

<400> 17

Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu

1 5 10 15

Ala

<210> 18

<211> 556

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<223> "AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17"

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17"

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<220>

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17"

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<220>

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17"

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<220>

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<220>

<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17

<400> 18

Pro Pro Asn Arg Arg Thr Cys Val Phe Phe Glu Ala Pro Gly Val Arg

1 5 10 15

Gly Ser Thr Lys Thr Leu Gly Glu Leu Leu Asp Thr Gly Thr Glu Leu

20 25 30

Pro Arg Ala Ile Arg Cys Leu Tyr Ser Arg Cys Cys Phe Gly Ile Trp

35 40 45

Asn Leu Thr Gln Asp Arg Ala Gln Val Glu Met Gln Gly Cys Arg Asp

50 55 60

Ser Asp Glu Pro Gly Cys Glu Ser Leu His Cys Asp Pro Ser Pro Arg

65 70 75 80

Ala His Pro Ser Pro Gly Ser Thr Leu Phe Thr Cys Ser Cys Gly Thr

85 90 95

Asp Phe Cys Asn Ala Asn Tyr Ser His Leu Pro Pro Pro Gly Ser Pro

100 105 110

Gly Thr Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gln Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ile

115 120 125

Trp Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu

130 135 140

Leu Gly Ser Ile Ile Leu Ala Leu Leu Gln Arg Lys Asn Tyr Arg Val

145 150 155 160

Arg Gly Glu Pro Val Pro Glu Pro Arg Pro Asp Ser Gly Arg Asp Trp

165 170 175

Ser Val Glu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Leu Cys Phe Ser Gln Val Ile

180 185 190

Arg Glu Gly Gly His Ala Val Val Trp Ala Gly Gln Leu Gln Gly Lys

195 200 205

Leu Val Ala Ile Lys Ala Phe Pro Pro Arg Ser Val Ala Gln Phe Gln

210 215 220

Ala Glu Arg Ala Leu Tyr Glu Leu Pro Gly Leu Gln His Asp His Ile

225 230 235 240

Val Arg Phe Ile Thr Ala Ser Arg Gly Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ser

245 250 255

Gly Pro Leu Leu Val Leu Glu Leu His Pro Lys Gly Ser Leu Cys His

260 265 270

Tyr Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Asp Trp Gly Ser Ser Leu Arg Met Ala

275 280 285

Leu Ser Leu Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Glu Arg Trp Gln

290 295 300

Asn Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Ser Ser Gln

305 310 315 320

Asn Val Leu Ile Arg Glu Asp Gly Ser Cys Ala Ile Gly Asp Leu Gly

325 330 335

Leu Ala Leu Val Leu Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Trp Thr Pro

340 345 350

Thr Gln Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ile Met Glu Ala Gly Thr Gln Arg

355 360 365

Tyr Met Ala Pro Glu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Asp Leu Gln Asp Trp

370 375 380

Gly Met Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu

385 390 395 400

Trp Glu Ile Leu Ser Arg Cys Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ser Ser Pro

405 410 415

Pro Pro Phe Gln Leu Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asn Thr Pro Thr

420 425 430

Ser Asp Glu Leu Trp Ala Leu Ala Val Gln Glu Arg Arg Arg Pro Tyr

435 440 445

Ile Pro Ser Thr Trp Arg Cys Phe Ala Thr Asp Pro Asp Gly Leu Arg

450 455 460

Glu Leu Leu Glu Asp Cys Trp Asp Ala Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr

465 470 475 480

Ala Glu Cys Val Gln Gln Arg Leu Ala Ala Leu Ala His Pro Gln Glu

485 490 495

Ser His Pro Phe Pro Glu Ser Cys Pro Arg Gly Cys Pro Pro Leu Cys

500 505 510

Pro Glu Asp Cys Thr Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ile Leu Pro Cys Arg

515 520 525

Pro Gln Arg Ser Ala Cys His Phe Ser Val Gln Gln Gly Pro Cys Ser

530 535 540

Arg Asn Pro Gln Pro Ala Cys Thr Leu Ser Pro Val

545 550 555

<210> 19

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23

<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23

<223> 3C23K/3C23

<223> 3C23K/3C23

<220>

<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23

<220>

<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23

<220>

<223> 3C23K/3C23

<220>

<223> 3C23K/3C23

<400> 19

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78

<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78

<223> 3C23KR/6B78

<223> 3C23KR/6B78

<220>

<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78

<220>

<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78

<220>

<223> 3C23KR/6B78

<220>

<223> 3C23KR/6B78

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 21

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42

<223> 5B42 <223> 5B42

<223> 5B42

<223> 5B42

<220>

<223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42 <223> 5B42

<220>

<223> 5B42 <223> 5B42

<220>

<223> 5B42

<220>

<223> 5B42

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Ala Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59

<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59

<223> K4D-24/6C59

<223> K4D-24/6C59

<220>

<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59

<220>

<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59

<220>

<223> K4D-24/6C59

<220>

<223> K4D-24/6C59

<400> 22

Arg Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20

<223> K4D-20 <223> K4D-20

<223> K4D-20

<223> K4D-20

<220>

<223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20 <223> K4D-20

<220>

<223> K4D-20 <223> K4D-20

<220>

<223> K4D-20

<220>

<223> K4D-20

<400> 23

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12

<223> K4A-12 <223> K4A-12

<223> K4A-12

<223> K4A-12

<220>

<223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12 <223> K4A-12

<220>

<223> K4A-12 <223> K4A-12

<220>

<223> K4A-12

<220>

<223> K4A-12

<400> 24

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05

<223> K5D05 <223> K5D05

<223> K5D05

<223> K5D05

<220>

<223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05 <223> K5D05

<220>

<223> K5D05 <223> K5D05

<220>

<223> K5D05

<220>

<223> K5D05

<400> 25

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14

<223> K5D-14 <223> K5D-14

<223> K5D-14

<223> K5D-14

<220>

<223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14 <223> K5D-14

<220>

<223> K5D-14 <223> K5D-14

<220>

<223> K5D-14

<220>

<223> K5D-14

<400> 26

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123

<223> K4D-123 <223> K4D-123

<223> K4D-123

<223> K4D-123

<220>

<223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123 <223> K4D-123

<220>

<223> K4D-123 <223> K4D-123

<220>

<223> K4D-123

<220>

<223> K4D-123

<400> 27

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 28

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07

<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07

<223> K4D-127/6C07

<223> K4D-127/6C07

<220>

<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07 <223>

K4D-127/6C07

<220>

<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07

<220>

<223> K4D-127/6C07

<220>

<223> K4D-127/6C07

<400> 28

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14

<223> 5C14 <223> 5C14

<223> 5C14

<223> 5C14

<220>

<223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14 <223> 5C14

<220>

<223> 5C14 <223> 5C14

<220>

<223> 5C14

<220>

<223> 5C14

<400> 29

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 30

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26

<223> 5C26 <223> 5C26

<223> 5C26

<223> 5C26

<220>

<223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26 <223> 5C26

<220>

<223> 5C26 <223> 5C26

<220>

<223> 5C26

<220>

<223> 5C26

<400> 30

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Met Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 31

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27

<223> 5C27 <223> 5C27

<223> 5C27

<223> 5C27

<220>

<223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27 <223> 5C27

<220>

<223> 5C27 <223> 5C27

<220>

<223> 5C27

<220>

<223> 5C27

<400> 31

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Pro Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 32

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60

<223> 5C60 <223> 5C60

<223> 5C60

<223> 5C60

<220>

<223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60 <223> 5C60

<220>

<223> 5C60 <223> 5C60

<220>

<223> 5C60

<220>

<223> 5C60

<400> 32

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Lys Val Arg Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 33

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13

<223> 6C13 <223> 6C13

<223> 6C13

<223> 6C13

<220>

<223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13 <223> 6C13

<220>

<223> 6C13 <223> 6C13

<220>

<223> 6C13

<220>

<223> 6C13

<400> 33

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 34

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18

<223> 6C18 <223> 6C18

<223> 6C18

<223> 6C18

<220>

<223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18 <223> 6C18

<220>

<223> 6C18 <223> 6C18

<220>

<223> 6C18

<220>

<223> 6C18

<400> 34

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 35

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54

<223> 6C54 <223> 6C54

<223> 6C54

<223> 6C54

<220>

<223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54 <223> 6C54

<220>

<223> 6C54 <223> 6C54

<220>

<223> 6C54

<220>

<223> 6C54

<400> 35

Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 36

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K

<223> 3C23K <223> 3C23K

<223> 3C23K

<223> 3C23K

<220>

<223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K <223> 3C23K

<220>

<223> 3C23K <223> 3C23K

<220>

<223> 3C23K

<220>

<223> 3C23K

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E

<223> L-K55E <223> L-K55E

<223> L-K55E

<223> L-K55E

<220>

<223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E <223> L-K55E

<220>

<223> L-K55E <223> L-K55E

<220>

<223> L-K55E

<220>

<223> L-K55E

<400> 37

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 38

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S

<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S

<223> L-T48I, L-P50S

<223> L-T48I, L-P50S

<220>

<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S <223>

L-T48I, L-P50S

<220>

<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S

<220>

<223> L-T48I, L-P50S

<220>

<223> L-T48I, L-P50S

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E

<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E

<223> LT48I, L-K55E

<223> LT48I, L-K55E

<220>

<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E <223>

LT48I, L-K55E

<220>

<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E

<220>

<223> LT48I, L-K55E

<220>

<223> LT48I, L-K55E

<400> 39

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 40

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P

<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P

<223> LS27P, L-S28P

<223> LS27P, L-S28P

<220>

<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P <223>

LS27P, L-S28P

<220>

<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P

<220>

<223> LS27P, L-S28P

<220>

<223> LS27P, L-S28P

<400> 40

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Pro Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 41

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A

<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A

<223> L-M4L, L-T20A

<223> L-M4L, L-T20A

<220>

<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A <223>

L-M4L, L-T20A

<220>

<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A

<220>

<223> L-M4L, L-T20A

<220>

<223> L-M4L, L-T20A

<400> 41

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 42

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P

<223> L-S27P <223> L-S27P

<223> L-S27P

<223> L-S27P

<220>

<223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P <223> L-S27P

<220>

<223> L-S27P <223> L-S27P

<220>

<223> L-S27P

<220>

<223> L-S27P

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 43

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<220>

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L,

L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<220>

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<220>

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<220>

<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W

<400> 43

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 44

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L

<223> L-M4L <223> L-M4L

<223> L-M4L

<223> L-M4L

<220>

<223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L <223> L-M4L

<220>

<223> L-M4L <223> L-M4L

<220>

<223> L-M4L

<220>

<223> L-M4L

<400> 44

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 45

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T

<223> L-I33T <223> L-I33T

<223> L-I33T

<223> L-I33T

<220>

<223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T <223> L-I33T

<220>

<223> L-I33T <223> L-I33T

<220>

<223> L-I33T

<220>

<223> L-I33T

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Thr

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 46

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E

<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E

<223> L-M4L, L-K39E

<223> L-M4L, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E <223>

L-M4L, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-K39E

<400> 46

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P

<223> L-T22P <223> L-T22P

<223> L-T22P

<223> L-T22P

<220>

<223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P <223> L-T22P

<220>

<223> L-T22P <223> L-T22P

<220>

<223> L-T22P

<220>

<223> L-T22P

<400> 47

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 48

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D

<223> L-Y32D <223> L-Y32D

<223> L-Y32D

<223> L-Y32D

<220>

<223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D <223> L-Y32D

<220>

<223> L-Y32D <223> L-Y32D

<220>

<223> L-Y32D

<220>

<223> L-Y32D

<400> 48

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 49

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H

<223> L-Q37H <223> L-Q37H

<223> L-Q37H

<223> L-Q37H

<220>

<223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H <223> L-Q37H

<220>

<223> L-Q37H <223> L-Q37H

<220>

<223> L-Q37H

<220>

<223> L-Q37H

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 50

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S

<223> L-G97S <223> L-G97S

<223> L-G97S

<223> L-G97S

<220>

<223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S <223> L-G97S

<220>

<223> L-G97S <223> L-G97S

<220>

<223> L-G97S

<220>

<223> L-G97S

<400> 50

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Ser Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-S12P <223> L-S12P <223> L-S12P <223> L-S12P

<223> L-S12P <223> L-S12P

<223> L-S12P

<223> L-S12P

<220>

<223> L-S12P <223> L-S12P <223> L-S12P <223> L-S12P

<220>

<223> L-S12P <223> L-S12P

<220>

<223> L-S12P

<220>

<223> L-S12P

<400> 51

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 52

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A

<223> L-19A <223> L-19A

<223> L-19A

<223> L-19A

<220>

<223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A <223> L-19A

<220>

<223> L-19A <223> L-19A

<220>

<223> L-19A

<220>

<223> L-19A

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 53

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A

<223> L-T72A <223> L-T72A

<223> L-T72A

<223> L-T72A

<220>

<223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A <223> L-T72A

<220>

<223> L-T72A <223> L-T72A

<220>

<223> L-T72A

<220>

<223> L-T72A

<400> 53

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 54

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-R31W <223> L-R31W <223> L-R31W <223> L-R31W

<223> L-R31W <223> L-R31W

<223> L-R31W

<223> L-R31W

<220>

<223> L-R31W <223> L-R31W <223> L-R31W <223> L-R31W

<220>

<223> L-R31W <223> L-R31W

<220>

<223> L-R31W

<220>

<223> L-R31W

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K

<223> L-M4L, L-M39K

<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K

<223> L-M4L, L-M39K

<223> L-M4L, L-M39K

<220>

<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K

<220>

<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K

<220>

<223> L-M4L, L-M39K

<220>

<223> L-M4L, L-M39K

<400> 55

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 56

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N

<223> L-I2N <223> L-I2N

<223> L-I2N

<223> L-I2N

<220>

<223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N <223> L-I2N

<220>

<223> L-I2N <223> L-I2N

<220>

<223> L-I2N

<220>

<223> L-I2N

<400> 56

Asp Asn Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 57

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C

<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C

<223> L-G63C, L-W91C

<223> L-G63C, L-W91C

<220>

<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C

<220>

<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C

<220>

<223> L-G63C, L-W91C

<220>

<223> L-G63C, L-W91C

<400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cys Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 58

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-R31G <223> L-R31G <223> L-R31G <223> L-R31G

<223> L-R31G <223> L-R31G

<223> L-R31G

<223> L-R31G

<220>

<223> L-R31G <223> L-R31G <223> L-R31G <223> L-R31G

<220>

<223> L-R31G <223> L-R31G

<220>

<223> L-R31G

<220>

<223> L-R31G

<400> 58

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 59

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F

<223> L-I75F <223> L-I75F

<223> L-I75F

<223> L-I75F

<220>

<223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F <223> L-I75F

<220>

<223> L-I75F <223> L-I75F

<220>

<223> L-I75F

<220>

<223> L-I75F

<400> 59

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 60

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T

<223> L-I2T <223> L-I2T

<223> L-I2T

<223> L-I2T

<220>

<223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T <223> L-I2T

<220>

<223> L-I2T <223> L-I2T

<220>

<223> L-I2T

<220>

<223> L-I2T

<400> 60

Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 61

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R

<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R

<223> L-I2T, L-K42R

<223> L-I2T, L-K42R

<220>

<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R

<220>

<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R

<220>

<223> L-I2T, L-K42R

<220>

<223> L-I2T, L-K42R

<400> 61

Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 62

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H

<223> L-Y49H <223> L-Y49H

<223> L-Y49H

<223> L-Y49H

<220>

<223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H <223> L-Y49H

<220>

<223> L-Y49H <223> L-Y49H

<220>

<223> L-Y49H

<220>

<223> L-Y49H

<400> 62

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr His

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 63

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<220>

<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E

<400> 63

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 64

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P

<223> L-T69P <223> L-T69P

<223> L-T69P

<223> L-T69P

<220>

<223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P <223> L-T69P

<220>

<223> L-T69P <223> L-T69P

<220>

<223> L-T69P

<220>

<223> L-T69P

<400> 64

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile

20 25 30

Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr

35 40 45

Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 65

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRL-1 анти-AMHRII антител"

<223> CDRL-1 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-1 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-1 анти-AMHRII антител

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 4

<223> Xaa в положении 4 представляет собой S или P

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 5

<223> Xaa в положении 5 представляет собой S или P

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 7

<223> Xaa в положении 7 представляет собой R или W или G

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 8

<223> Xaa в положении 8 представляет собой T или D

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 9

<223> Xaa в положении 9 представляет собой I или T

<400> 65

Arg Ala Ser Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ala

1 5 10

<210> 66

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRL-2 анти-AMHRII антител "

<223> CDRL-2 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-2 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-2 анти-AMHRII антител

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 6

<223> Xaa в положении 6 представляет собой K или E

<400> 66

Pro Thr Ser Ser Leu Xaa Ser

1 5

<210> 67

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRL-3 анти-AMHRII антител"

<223> CDRL-3 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-3 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRL-3 анти-AMHRII антител

<400> 67

Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr

1 5

<210> 68

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRH-1 анти-AMHRII антител"

<223> CDRH-1 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-1 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-1 анти-AMHRII антител

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 6

<223> Xaa в положении 6 представляет собой S или T

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 9

<223> Xaa в положении 9 представляет собой S или G

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 10

<223> Xaa в положении 10 представляет собой Y или N

<400> 68

Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Xaa His Ile His

1 5 10

<210> 69

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRH-2 анти-AMHRII антител"

<223> CDRH-2 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-2 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-2 анти-AMHRII антител

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> 5

<223> Xaa в положении 5 представляет собой G или E

<400> 69

Trp Ile Tyr Pro Xaa Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 70

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<223> "CDRH-3 анти-AMHRII антител"

<223> CDRH-3 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-3 анти-AMHRII антител

<220>

<223> CDRH-3 анти-AMHRII антител

<400> 70

Gly Asp Arg Phe Ala Tyr

1 5

<210> 71

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "Прямой праймер AMHR2"

<223> "Прямой праймер AMHR2"

<220>

<223> Прямой праймер AMHR2

<220>

<223> Прямой праймер AMHR2

<400> 71

tctggatggc actggtgctg 20

<210> 72

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "Обратный праймер AMHR2"

<223> "Обратный праймер AMHR2"

<220>

<223> Обратный праймер AMHR2

<220>

<223> Обратный праймер AMHR2

<400> 72

agcagggcca agatgatgct 20

<210> 73

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "Прямой праймер TBP"

<223> "Прямой праймер TBP"

<220>

<223> Прямой праймер TBP

<220>

<223> Прямой праймер TBP

<400> 73

tgcacaggag ccaagagtga a 21

<210> 74

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<223> "Обратный праймер TBP"

<223> "Обратный праймер TBP"

<220>

<223> Обратный праймер TBP

<220>

<223> Обратный праймер TBP

<400> 74

cacatcacag ctccccacca 20

<---

Claims (27)

1. Применение агента, связывающего AMHRII (рецептор антимюллеровского гормона типа II) человека, в качестве активного ингредиента для предотвращения или лечения рака легкого у пациента, страдающего от рака легкого, выбранного из группы, состоящей из эпидермоидного немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), аденокарциномы NSCLC, крупноклеточного NSCLC, плоскоклеточной карциномы NSCLC, плеоморфной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC,

причем агент, связывающий AMHRII человека, включает моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент, содержащие CDRH-1, CDRH-2 и CDRH-3, как показано в VH (вариабельная область тяжелой цепи), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, и CDRL-1, CDRL-2 и CDRL-3, как показано в VL (вариабельная область легкой цепи), содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6.

2. Применение по п. 1, где указанный агент, связывающий AMHRII человека, который включает моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент, содержит следующие последовательности:

- CDRL-1 - RASSSVRYIA;

- CDRL-2 – PTSSLKS или PTSSLES;

- CDRL-3 - LQWSSYPWT;

- CDRH-1 - KASGYTFTSYHIH;

- CDRH-2 - WIYPGDDSTKYSQKFQG; и

- CDRH-3 - GDRFAY.

3. Применение по п. 1 или 2, где агент, связывающий AMHRII человека, представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих антител:

а) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 2, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 4 (безлидерные последовательности VL и VH 3C23);

b) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 6, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 8 (безлидерные последовательности VL и VH 3C23K);

c) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 10, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 12 (безлидерные легкая и тяжелая цепи 3C23);

d) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 14, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 16 (безлидерные легкая и тяжелая цепи 3C23K).

4. Применение по любому из пп. 1-3, где агент, связывающий AMHRII человека, состоит из конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC).

5. Применение по любому из пп. 1-4, где указанный агент, связывающий AMHRII человека, находится в комбинации с одним или более отдельным(-и) противораковым(-и) агентом(-ами).

6. Способ определения чувствительности индивидуума, страдающего от рака легкого, к лечению рака с помощью агента, связывающего AMHRII, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного индивидуума, белка AMHRII на поверхности клетки,

причем индивидуум чувствителен к лечению рака с помощью агента, связывающего AMHRII, если определено, что указанный образец опухолевой ткани демонстрирует наличие экспрессии AMHRII на клеточной поверхности;

агент, связывающий AMHRII человека, включает моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент, содержащие CDRH-1, CDRH-2 и CDRH-3, как показано в VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 8, и CDRL-1, CDRL-2 и CDRL-3, как показано в VL, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 6,

рак легкого выбран из группы, состоящей из эпидермоидного NSCLC, крупноклеточного NSCLC, плоскоклеточной карциномы NSCLC, плеоморфной карциномы NSCLC и нейроэндокринного NSCLC.

7. Способ по п. 6, где агент, связывающий AMHRII человека, который включает моноклональное антитело к AMHRII или его AMHRII-связывающий фрагмент, содержит следующие последовательности:

- CDRL-1: RASSSVRYIA;

- CDRL-2: PTSSLKS или PTSSLES;

- CDRL-3: LQWSSYPWT;

- CDRH-1: KASGYTFTSYHIH;

- CDRH-2: WIYPGDDSTKYSQKFQG; и

- CDRH-3: GDRFAY.

Images