RU2816523C2 - Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний - Google Patents

Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний Download PDF

Info

Publication number
RU2816523C2
RU2816523C2 RU2019131534A RU2019131534A RU2816523C2 RU 2816523 C2 RU2816523 C2 RU 2816523C2 RU 2019131534 A RU2019131534 A RU 2019131534A RU 2019131534 A RU2019131534 A RU 2019131534A RU 2816523 C2 RU2816523 C2 RU 2816523C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
ser
amhrii
thr
cancer
gly
Prior art date
Application number
RU2019131534A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2019131534A3 (ru
RU2019131534A (ru
Inventor
Жан-Марк БАРРЕ
Жан-Франсуа ПРОСТ
Меди ЛАМАР
Стефан ДЕГОВ
Оливье ДЮБРЕЙ
Андре НИКОЛА
Дидье МЕЗЕР
Original Assignee
Экселиксис, Инк.
Энститю Кюри
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Экселиксис, Инк., Энститю Кюри filed Critical Экселиксис, Инк.
Priority claimed from PCT/EP2018/059548 external-priority patent/WO2018189379A1/en
Publication of RU2019131534A publication Critical patent/RU2019131534A/ru
Publication of RU2019131534A3 publication Critical patent/RU2019131534A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2816523C2 publication Critical patent/RU2816523C2/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложено применение агента, связывающего AMHRII человека, в качестве активного ингредиента для профилактики или лечения негинекологического рака, который экспрессирует AMHRII на поверхности опухолевой клетки. Агент, связывающий AMHRII человека, включает моноклональное антитело против AMHRII или его фрагмент, связывающий AMHRII. Негинекологический рак представляет собой рак толстой кишки или рак печени. Также предложен способ определения чувствительности пациента на лечение рака с помощью указанного агента, связывающего AMHRII. Способ включает определение наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, полученным от пациента, белка AMHRII на поверхности клетки. Образец опухолевой ткани получают из негинекологического рака, выбранного из рака толстой кишки и рака печени. Определяют, что пациент чувствителен к лечению рака, если указанный образец демонстрирует наличие экспрессии AMHRII. Изобретение обеспечивает отсутствие токсических явлений в процессе in vivo лечения негинекологического рака. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 23 ил., 14 табл., 7 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к области лечения рака.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Одной из основных причин смерти среди населения мира является рак или злокачественная опухоль, ранжирование смертности в порядке убывания представляется как: рак легких, рак желудка, рак печени, колоректальный рак, рак молочной железы и рак шейки матки. Одна треть всех людей только в Соединенных Штатах Америки заболевает раком. Хотя пятилетняя выживаемость резко возросла почти на пятьдесят процентов в результате прогресса в ранней диагностике и терапии, рак по-прежнему остается второй причиной смерти в Соединенных Штатах Америки после кардиологических заболеваний. Двадцать процентов американцев умирают от рака, при этом половина из-за рака легких, молочной железы и прямой кишки. Кроме того, рак кожи остается опасным для здоровья.
Разработка эффективных способов лечения больных раком представляет собой серьезную проблему. Применяемая в настоящее время схема хирургической резекции, наружная дистанционная лучевая терапия и/или системной химиотерапии отчасти имела успех при некоторых видах злокачественных новообразований, но не обеспечивала удовлетворительных результатов при других. Кроме того, эти подходы часто имеют неприемлемую токсичность.
Как радиация, так и хирургия имеют один и тот же теоретический недостаток. Признано, что с учетом способности одной клоногенной злокачественной клетки производить потомство в количестве, достаточном для гибели хозяина, вся популяция опухолевых клеток должна быть уничтожена. См., в общем, Goodman and Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8th Edition) (pp. 1202-1204). Эта концепция «полного уничтожения клеток» подразумевает, что полное удаление опухоли необходимо для обеспечения хирургического подхода, и для способа лечения облучением необходимо полное разрушение всех раковых клеток, если необходимо достичь излечения. На практике такая возможность является редкой; более того, в случае наличия метастаз, это не является возможным.
Более того, традиционное химиотерапевтическое лечение рака также редко приводит к полной ремиссии опухоли, а значительные уровни дозирования, необходимые для получения даже умеренного ответа, часто сопровождаются неприемлемой токсичностью. Противораковые агенты обычно оказывают негативные гематологические эффекты (например, прекращение митоза и распад сформировавшихся элементов в костном мозге и лимфоидных тканях) и иммуносупрессивное действие (например, снижение количества клеток), а также серьезное воздействие на эпителиальные ткани (например, слизистую оболочку кишечника), репродуктивные ткани (например, нарушение сперматогенеза) и нервную систему. P. Calabresi and B. A. Chabner, In: Goodman and Gilman The Pharmacological Basis of Therapeutics (Pergamon Press, 8th Edition) (pp. 1209-1216). Высокие уровни дозирования и связанная с этим токсичность в значительной степени обусловлены отсутствием целевой специфичности самих противораковых агентов. Лекарственное средство должно различать раковые клетки хозяина и клетки хозяина, не являющиеся раковыми. На этом уровне подавляющее большинство противоопухолевых лекарственных средств не являются избирательными и обладают значительной характерной токсичностью. Арсенал противораковой терапии недавно был обогащен иммунотерапевтическими препаратами, известными как ингибиторы контрольных точек. Эти продукты (против PD1, против PDL1, против CTLA4) способны разблокировать иммунную систему, противодействуя механизмам, благодаря которым раковые клетки избегают иммунного надзора и уничтожения клеток. Несмотря на то, что эти продукты привели к выдающимся долгосрочным результатам при некоторых видах рака (таких как меланома и рак легких), процент пациентов с положительным ответом на лечение остается низким или умеренным, а спектр их показаний остается относительно ограниченным (DM. Pardoll, Nature Review 2012)
Все еще существует потребность в альтернативных или дополнительных противораковых методах лечения по сравнению с традиционными хирургическими методами, лучевой терапией и химиотерапией. Одна из таких многообещающих альтернативных или дополнительных терапий заключалась в специфическом таргетировании терапевтических агентов на раковые клетки посредством распознавания антигенов, экспрессируемых опухолевыми клетками. В 2017 году такие терапевтические стратегии, специфичные для опухолевых клеток, в основном проиллюстрированы основанной на антителах терапией посредством биспецифических антител и терапией на основе CAR-T-клеток (CAR - химерный антигенный рецептор), которые могут быть сконструированы для увеличения вовлечения иммунных клеток, таких как NK (естественные клетки киллеры) и макрофаги (например, глико-инженерные антитела) или таких как киллерные Т-лимфоциты (такие как биспецифические форматы CD3). Антитела также могут быть оснащены различными цитотоксическими агентами в формате конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Наконец, сами T-клетки могут быть генетически сконструированы таким образом, чтобы непосредственно распознавать опухолевые клетки и активировать передачу сигналов TCR (T-клеточный рецептор) (CAR-T-клетки). Чем сильнее действие этих агентов, тем больше потребность в мишенях, селективных к опухолям.
За последние 15 лет была разработана основанная на антителах терапия рака, и в настоящее время она является одной из наиболее успешных и важных стратегий лечения пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями и солидными опухолями. Ключевая задача заключалась в выявлении антигенов, которые подходят для терапевтических средств на основе антител. Такие терапевтические средства могут функционировать через опосредование изменений в функции антигена или рецептора (таких как функции агониста или антагониста), модуляции иммунной системы (например, изменения функции Fc и активации Т-клеток) или доставки специфического лекарственного средства, которое конъюгировано с антителом, которое нацелено на специфический антиген (Van den Eynde, B. J. & Scott, A. M. Encyclopedia of Immunology (eds Roitt, D. P. J. & Roitt, I. M.) 2424-2431 (Academic Press, London, 1998)., Scott, A. M. et al. A Phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptor. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 4071-4076 (2007)., Hughes, B. Antibody-drug conjugates for cancer: poised to deliver? Nature Rev. Drug Discov. 9, 665-667 (2010)., Weiner, L. M., Surana, R. & Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nature Rev. Immunol. 10, 317-327 (2010).). Молекулярные методы, которые могут изменять фармакокинетику антител, эффекторную функцию, размер и иммуногенность, стали ключевыми элементами в разработке новых видов основанной на антителах терапии. Подтверждения клинических испытаний антител у онкологических пациентов показали важность итерационных подходов для выбора антигенных мишеней и оптимальных антител, включая сродство и авидность антител, выбор конструкции антител, терапевтический подход (такой как аннулирование передачи сигналов или иммунная эффекторная функция) и необходимость принципиального изучения фармакокинетических и фармакодинамических свойств антител в ранних клинических испытаниях. В этом обзоре обобщены стадии, необходимые для превращения моноклональных антител (mAb) в реагенты для применения человеком, успех антител в лечении больных раком, проблемы выбора мишеней и конструкций, а также решающая роль иммунной системы в терапии антителами.
Со времени первой коммерциализации терапевтического моноклонального антитела в 1986 году этот класс биофармацевтических продуктов значительно вырос, таким образом, к концу 2014 года в Соединенных Штатах Америки или в Европе были одобрены сорок семь моноклональных антител, в частности, для лечения рака. Ожидается, что к 2020 году на рынке появится около 70 моноклональных антител.
CAR-T-клеточная терапия основана на изготовлении химерных антигенных Т-клеточных рецепторов (CAR). Химерные антигенные рецепторы представляют собой генетически сконструированные рецепторы, которые прививают новую специфичность иммунной эффекторной клетке. Обычно их применяют для прививания специфичности моноклонального антитела Т-клетке. CAR-T-клетки исследуют в качестве терапии рака. Обычно, CAR-T терапия включает инфузию сконструированных Т-клеток, которые экспрессируют химерный антигенный рецептор на своей клеточной мембране. Этот рецептор содержит внешний домен, связывающий мишень, который предназначен для распознавания специфического опухолевого антигена, и внутренний домен активации, ответственный за активацию Т-клетки, когда CAR-T связывает антиген-мишень. Клинические испытания CAR-T для лечения рака показали огромные показатели ремиссии, до 94 % при тяжелых формах рака, что особенно впечатляет, учитывая, что для большинства испытаний набирают пациентов, которые не отреагировали на все другие доступные методы лечения их формы рака. До 2017 года было проведено около 300 клинических испытаний CAR-T.
В данной области все еще существует потребность в дополнительных инструментах для терапии рака, которые могут быть альтернативными или дополнять существующие способы лечения определенных видов рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к связывающему AMHRII человека агенту для применения в способе профилактики или лечения негинекологического рака.
В частности, настоящее изобретение относится к связывающему AMHRII человека агенту для применения в способе профилактики или лечения негинекологического рака, выбранного из группы раковых заболеваний, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз. Рак толстой кишки охватывает колоректальную карциному. Рак почки охватывает почечно-клеточную карциному.
В некоторых вариантах реализации указанный связывающий AMHRII человека агент состоит из моноклонального антитела против AMHRII.
В некоторых вариантах реализации указанный связывающий AMHRII человека агент состоит из конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC).
В некоторых вариантах реализации указанный связывающий AMHRII человека агент состоит из сконструированного связывающего AMHRII рецептора.
В некоторых вариантах реализации указанный связывающий AMHRII человека агент состоит из клетки, экспрессирующей сконструированный связывающий AMHRII рецептор, такой как CAR-T-клетка или NK-T-клетка, экспрессирующая сконструированный связывающий AMHRII рецептор.
Настоящее изобретение также относится к способу определения, подходит ли пациент для получения лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, как определено выше, то есть, является ли пациент чувствительным к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента, как определено выше, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного пациента, белка AMHRII на поверхности клетки.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения чувствительности пациента на лечение рака с помощью связывающего AMHRII агента, как определено выше, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного пациента, белка AMHRII на поверхности клетки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1 иллюстрирует аминокислотные последовательности доменов VH и VL множества вариантов моноклонального антитела 3C23. Фигура 1А иллюстрирует VH домен каждого варианта антитела. Фигура 1В иллюстрирует VL домен каждого варианта антитела.
Фигура 2 иллюстрирует экспрессию AMHRII различными линиями раковых клеток.
Фигура 2А иллюстрирует экспрессию мРНК AMHRII линиями раковых клеток. Абсцисса: слева направо на фигуре 2А: HCT116 (колоректальная карцинома толстой кишки), COV434-WT (гранулезная опухоль яичника человека), K562 (миелогенный лейкоз человека) и OV90 (злокачественная папиллярная серозная аденокарцинома человека). Ордината: Уровень экспрессии мРНК AMHRII по данным количественной ПЦР в реальном времени, выраженный в относительных единицах (RQ).
Фигуры 2B-2F: Мембранная экспрессия белка AMHRII теми же линиями раковых клеток, что и на фигуре 2А: HCT116 (фигура 2B), COV434-WT (фигура 2C), K562 (фигура 2D), NCI-H295R (фигура 2E) и OV90 (фигура 2F). Абсцисса: интенсивность сигнала флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ордината: количество клеток.
Фигура 3 иллюстрирует поверхностную экспрессию AMHRII в различных образцах первичной ткани опухоли человека. Абсцисса: тип рака; слева направо на фигуре 3: рак толстой кишки, рак печени, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи. Ордината: Индекс позитивности AMHRII определяли по общему показателю AMHRII, больше или равному 1,5. Этот общий гистологический показатель был установлен как сумма среднего цитоплазматического и мембранного показателя. Каждый из этих показателей использует частоту, умноженную на среднее значение показателей интенсивности (от 0 до 3). Частоту определяли как процент клеток, экспрессирующих AMHRII, а интенсивность классифицировали по явному коричневому мечению мембраны и/или цитоплазмы опухолевых клеток с применением следующей системы оценки: интенсивность мечения определяли как 0 для отрицательного, 1 для слабого, 2 для умеренного и 3 для сильного мечения, как показано для положительного контроля COV434; числа, расположенные над каждым столбцом: частота экспрессии AMHRII для соответствующего рака в исследуемой популяции людей.
Фигура 4 иллюстрирует поверхностную экспрессию AMHRII различными ксенотрансплантатами опухоли человека. Абсцисса, слева направо на фигуре 4: лейкоз, остеосаркома, рак желудочно-кишечного тракта, рак головного мозга, саркома, меланома, плевромезотелиома, липосаркома, рак яичка, рак толстой кишки, рак почки. Ордината: Общий показатель AMHR2, выраженный в относительных единицах.
Фигура 5 иллюстрирует противоопухолевую активность in vivo антитела 3C23K против модели PDX гепатокарциномы человека (HCC). Абсцисса: Период времени после начала лечения, выраженный в днях. Ордината: объем опухоли, выраженный в мм3. ●: носитель; ▲ 3C23K антитело в дозе 20 мг/кг; ■ : Антитело 3C23K в дозе 50 мг/кг с; ▼: сравнительное лечение сорафенибом в дозе 50 мг/кг. Ордината: Объем опухоли, выраженный в мм3. Абсцисса: ● носитель; ▲ 3C23K антитело в дозе 20 мг/кг; ■ 3C23K антитело в дозе 50 мг/кг; ▼ сорафениб в дозе 50 мг/кг.
Фигура 6 иллюстрирует противоопухолевую активность in vivo конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC), состоящего из цитотоксического конъюгата антитела 3C23K (обозначенного GM103), как описано в заявке PCT № WO 2017/025458, против модели PDX гепатокарциномы человека (HCC). Абсцисса: Период времени после начала лечения, выраженный в днях. Ордината: объем опухоли, выраженный в мм3. ●: носитель; ▼: GM103 ADC в дозе 1 мг/кг; ▲: GM103 ADC в дозе 5 мг/кг; ■: GM103 ADC в дозе 10 мг/кг;
Фигура 7 иллюстрирует мембранную экспрессию AMHRII опухолевыми клетками, происходящими из образцов опухоли от четырех пациентов (фигуры 7А; 7В, 7С, 7D), пораженных колоректальным раком, по данным проточной цитометрии (FACS). Абсцисса: интенсивность сигнала флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ордината: количество клеток. На фигурах 7A, 7B, 7C, 7D: (i) пик на левой стороне: клетки, инкубированные с неродственным изотипом антитела; (ii) пик с правой стороны: клетки, инкубированные антителом 3C23K против AMHRII.
Фигура 8: иллюстрирует мембранную экспрессию AMHRII четырьмя различными ксенотрансплантатами колоректального рака человека (фигуры 8А, 8В, 8С, 8D) у мышей, что измерено проточной цитометрией (FACS). Абсцисса: интенсивность сигнала флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ордината: количество клеток. На фигурах 8A, 8B, 8C, 8D: (i) пик на левой стороне: клетки, инкубированные с неродственным изотипом антитела; (ii) пик с правой стороны: клетки, инкубированные антителом 3C23K против AMHRII.
Фигура 9: иллюстрирует мембранную экспрессию AMHRII опухолевыми клетками, происходящими из образцов опухоли от двух пациентов (фигуры 9А; 9В), пораженных почечно-клеточной карциномой, по данным проточной цитометрии (FACS). Абсцисса: интенсивность сигнала флуоресценции (краситель FL2-A), выраженная в относительных единицах. Ордината: количество клеток. На фигурах 9A, 9B: (i) пик на левой стороне: клетки, инкубированные с неродственным изотипом антитела; (ii) пик с правой стороны: клетки, инкубированные антителом 3C23K против AMHRII.
Фигура 10 иллюстрирует противоопухолевую активность in vivo антитела GM102 против AMHRII против модели PDX колоректальной карциномы человека (CRC). Абсцисса: Период времени после начала лечения, выраженный в днях. Ордината: объем опухоли, выраженный в мм3. ●: носитель; ■: GM102 в дозе 20 мг/кг; ▲: иринотекан в дозе, составляющей 100 мг/кг.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения неожиданно показали, что AMHRII, рецептор AMH, экспрессируется на клеточной мембране множества различных негинекологических раковых тканей.
Термин «AMHR-II» обозначает рецептор человеческого антимюллерового гормона типа II. Последовательность человеческого AMHRII описана в настоящей заявке как SEQ ID NO: 18 (без сигнального пептида MLGSLGLWALLPTAVEA (SEQ ID NO: 17).
В настоящей заявке термин «негинекологический» рак охватывает любой рак, который не охвачен термином «гинекологический» рак.
В настоящей заявке «гинекологический» рак выбран из группы, состоящей из рака яичников, рака шейки матки, рака эндометрия, гестационного трофобластического ракового заболевания (хориокарциномы), саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы и рака фаллопиевых труб.
Затем, в настоящей заявке, «негинекологический» рак включает рак, не включающий рак, выбранный из группы, состоящей из рака яичников, рака шейки матки, рака эндометрия, гестационного трофобластического ракового заболевания, саркомы матки, рака влагалища, рака вульвы и рака фаллопиевых труб.
В настоящей заявке термин «PDX» (Patient-Derived Xenograft) является сокращением от выражения «ксенотрансплантат, полученный от пациента». Ксенотрансплантаты, полученные от пациента, получили широкое применение в моделях рака in vivo, и особенно в моделях рака человека in vivo, где ткани или клетки опухоли пациента имплантированы, то есть «привиты», иммунодефицитному млекопитающему, не являющемуся человеком, например, иммунодефицитной мыши.
Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, авторы настоящего изобретения обнаружили, что AMHRII экспрессируется на клеточной мембране негинекологических раковых тканей, с переменной частотой, зависящей от типа рассматриваемого негинекологического рака. В качестве иллюстрации, как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, AMHRII чаще экспрессируется раковыми клетками, полученными из опухолевой ткани от пациентов, пораженных раком надпочечников, чем раковыми клетками, полученными из опухолевой ткани от пациентов, пораженных раком головы и шеи. Это означает, что эти два типа рака подходят для противораковой терапии, нацеленной на AMHRII, но что такая противораковая терапия будет менее актуальной для лечения пациентов, страдающих от рака головы и шеи.
Как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке, любой негинекологический рак, например, рак печени, колоректальный рак или рак почки, можно лечить с помощью связывающего AMHRII агента, при условии, что опухолевые клетки из указанной опухоли, не относящейся к гинекологической, экспрессируют AMHRII на своей мембране, таким образом, при условии, что присутствие белков AMHRII в клеточной мембране опухоли может быть обнаружено или определено любым методом.
Таким образом, экспериментальные данные, представленные в приведенных в настоящей заявке примерах, показывают, что один и тот же связывающий AMHRII агент, в данном случае моноклональное антитело против AMHRII, эффективен для лечения множества различных видов рака при условии, что целевой белок AMHRII экспрессируется в мембране опухолевых клеток.
Впрочем, в области противораковых активных ингредиентов, состоящих из молекул, связывающихся с мишенью, таких как антитела, связывающиеся с мишенью, ситуация, когда один и тот же активный ингредиент эффективен для лечения множества различных видов рака, не является беспрецедентной. В качестве иллюстрации, антитело против PD1 под названием пембролизумаб, было одобрено Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) в качестве активного ингредиента, подходящего для лечения различных видов раковых заболеваний, при условии, что указанные виды раковых заболеваний имеют одинаковые физиологические особенности.
Таким образом, пациента, пораженного негинекологическим раком, можно лечить от указанного рака с помощью связывающего AMHRII агента, как описано в настоящей заявке, когда мембранная экспрессия AMHRII опухолевыми клетками, предварительно собранными у указанного пациента, обнаружена или иным образом определена подходящим способом.
В некоторых вариантах реализации экспрессия AMHRII на клеточной мембране раковых клеток охватывает то, что указанные раковые клетки экспрессируют AMHRII на заданном количественном уровне или выше указанного количественного уровня.
Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации чувствительность пациента, пораженного негинекологическим раком, к лечению связывающей AMHRII молекулой может быть оценена посредством определения наличия экспрессии AMHRII негинекологическими раковыми клетками из образца, предварительно собранного у указанного пациента, на их мембранах.
Согласно некоторым вариантам реализации чувствительность пациента, пораженного негинекологическим раком, к лечению связывающей AMHRII молекулой может быть оценена посредством определения наличия экспрессии AMHRII негинекологическими раковыми клетками из образца, предварительно собранного у указанного пациента, на их мембранах выше определенной пороговой величины.
Уровень мембранной экспрессии AMHRII, который можно применять в некоторых вариантах реализации для определения чувствительности пациента, пораженного негинекологическим раком, к лечению связывающим AMHRII агентом, например, антителом против AMHRII, можно оценивать различными способами, которые включают (i) процент опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, которые экспрессируют AMHRII на их мембране, (ii) среднее количество белков AMHRII на мембране опухолевой клетки и (iii) сигнальный FACS профиль AMHRII опухолевых клеток, содержащихся в тестируемом образце опухолевых клеток.
Согласно некоторым вариантам реализации раковые клетки, содержащиеся в образце опухоли, предварительно собранном у пациента, пораженного негинекологическим раком, можно оценивать как экспрессирующие мембранный AMHRII, когда мембранный AMHRII обнаруживают у 5 % или более опухолевых клеток, содержащихся в указанном образце опухоли.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации пациент, пораженный негинекологическим раком, считается чувствительным к лечению связывающим AMHRII агентом, когда 5 % или более опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, предварительно собранном у указанного пациента, экспрессируют AMHRII на их мембране.
Способы определения частоты (например, процента) опухолевых клеток, экспрессирующих мембранные белки AMHRII, раскрыты в других частях настоящей заявки, включая приведенные в настоящей заявке примеры.
Согласно некоторым вариантам реализации чувствительность пациента, пораженного негинекологическим раком, к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента, например, антитела против AMHRII, можно оценить путем определения среднего количества белков AMHRII, присутствующих на мембране опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, предварительно собранном у указанного пациента.
В некоторых вариантах реализации пациента, пораженного негинекологическим раком, можно классифицировать как чувствительного к лечению связывающим AMHRII агентом, например, чувствительным к лечению антителом против AMHRII, когда среднее количество мембранных белков AMHRII, экспрессируемых опухолевыми клетками, содержащимися в образце опухоли, предварительно собранном у указанного пациента, составляет 10000 белков AMHRII или более.
Оценка количества белков AMHRII, экспрессируемых на мембране опухолевых клеток, может быть выполнена с применением традиционных способов, включающих (а) стадию инкубации образца, содержащего клетки образца опухолевой ткани, предварительно отобранного у пациента, с детектируемым соединением, которое специфически связывается с белком AMHRII, таким как флуоресцентно меченное антитело против AMHRII, и далее (b) стадия определения количества указанных детектируемых соединений, например, количество флуоресцентно меченных антител против AMHRII, связанных с каждой тестируемой клеткой из указанного образца. Оценку количества белков AMHRII, экспрессируемых на мембране опухолевых клеток, можно проводить, например, с применением хорошо известного метода сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS), как это показано в приведенных в настоящей заявке примерах.
В других вариантах реализации пациента, пораженного негинекологическим раком, можно классифицировать как чувствительного к лечению связывающим AMHRII агентом, например, классифицировать как чувствительного к лечению антителом против AMHRII, с применением анализа FACS профиля AMHRII опухолевых клеток, содержащихся в образце опухоли, предварительно собранном у указанного пациента.
В других вариантах реализации пациента, пораженного негинекологическим раком, можно классифицировать как чувствительного к лечению связывающим AMHRII агентом, например, классифицировать как чувствительного к лечению антителом против AMHRII, когда в методе сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) соотношение (i) средней интенсивности флуоресценции опухолевых клеток, инкубированных с флуоресцентно меченным антителом против AMHRII, к (ii) величине средней интенсивности флуоресценции (MFI), полученной для опухолевых клеток, инкубированных с изотипическим флуоресцентно меченным антителом, составляет 1,5 или более.
Для определения указанного соотношения средней интенсивности флуоресценции как изотипическое антитело, так и антитело против AMHRII метят одним и тем же флуоресцентным агентом, таким как краситель Alexa Fluor 488, продаваемый компанией ThermoFisher Scientific, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах.
В некоторых дополнительных вариантах реализации чувствительность пациента, имеющего негинекологический рак, к лечению связывающим AMHRII агентом можно определять путем вычисления показателя экспрессии AMHRII, позволяющего различать (i) экспрессирующие мембранный AMHRII раковые клетки, полученные из раковых опухолей, которые можно лечить связывающим AMHRII агентом и (ii) экспрессирующие мембранный AMHRII раковые клетки, полученные из раковых опухолей, которые нельзя лечить связывающим AMHRII агентом.
Таким образом, авторы настоящего изобретения определили, что пациенты, страдающие от негинекологического рака, описанного в настоящем документе, которые особенно подходят для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, описанного в настоящем документе, т.е. которые особенно чувствительны к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента, описанного в настоящей заявке, включают пациентов, которые имеют раковые опухоли, экспрессирующие AMHRII на клеточной мембране на достаточно высоком уровне, чтобы представлять соответствующие клеточные мишени, подлежащие уничтожению.
Затем, в согласно этим другим вариантам реализации авторы настоящего изобретения определили, что минимальный уровень экспрессии AMHRII, измеренный в образце раковых клеток от пациента с негинекологическим раком, может подтвердить, что указанный пациент реагирует на лечение с помощью связывающего AMHRII агента, и что указанного пациента таким образом можно лечить с помощью связывающего AMHRII агента, описанного в настоящей заявке.
Таким образом, чувствительность пациента, страдающего от негинекологического рака, к лечению связывающим AMHRII агентом также можно определять, когда уровень экспрессии AMHRII раковыми клетками, содержащимися в образце, предварительно собранном у указанного пациента, оценивают с помощью обоих определений (i) частоты опухолевых клеток, экспрессирующих мембранный AMHRII, например, процента опухолевых клеток, экспрессирующих AMHRII на их мембране, и (ii) уровня мембранной экспрессии AMHRII указанными опухолевыми клетками, например, среднего количества мембранных белков AMHRII на клетку.
Таким образом, в некоторых из других вариантов реализации чувствительность пациента, страдающего от негинекологического рака, к связывающему AMHRII человека агенту, например, к антителу против AMHRII человека, в образце опухолевых клеток, предварительно собранных у указанного пациента, можно оценить посредством определения, что (i) опухолевые клетки, содержащиеся в указанном образце, демонстрируют минимальное среднее количество человеческих белков AMHRII на их мембране, и что (ii) частота клеток, экспрессирующих AMHRII человека на их мембране, например, процент клеток, экспрессирующих AMHRII человека на их мембране, имеют по меньшей мере пороговое значение.
Соответственно, в настоящей заявке также описан дополнительный способ, который также можно применять для определения конкретного значения показателя экспрессии AMHRII, позволяющего выявлять различие между (i) пациентами с негинекологическим раком, которые не подходят для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, т.е. пациентами с негинекологическим раком, которые не являются чувствительными к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента, и (ii) пациентами с негинекологическим раком, которые подходят для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, то есть пациентами с негинекологическим раком, которые являются чувствительными к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента.
Точнее, согласно вариантам реализации вышеупомянутого способа пациенты, страдающие от негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, и которые могут получать лечение рака с помощью связывающего AMHRII агента, как описано в настоящей заявке, могут предпочтительно представлять собой пациентов, у которых показатель экспрессии AMHRII был определен в значении 1,0 или более, включая тех, для которых показатель экспрессии AMHRII был определен в значении 1,5 или более.
Показатель мембранной экспрессии AMHRII может быть основан на иммуногистохимической оценке экспрессии AMHRII протестированными раковыми клетками, и при этом индивидуальный показатель мембранной экспрессии AMHRII для данного образца раковых клеток (i) задают равным 0, если детектируется отсутствие экспрессии AMHRII, (ii) задают равным 1, если детектируется значительная экспрессия AMHRII, и (iii) задают равным 2, если детектируется высокая экспрессия AMHRII, и (iv) задают равным 3, если детектируется избыточная экспрессия AMHRII.
Более того, существует взаимосвязь между (i) показателем, заданным для уровня мембранной экспрессии AMHRII посредством вышеописанной иммуногистохимической оценки, и (ii) средним количеством экспрессируемых белков AMHRII на раковую клетку. В приведенных в настоящей заявке примерах показано, что уровень мембранной экспрессии AMHRII, позволяющий задавать индивидуальный показатель мембранной экспрессии AMHRII, также можно оценивать путем определения среднего количества мембранных белков AMHRII на клетку, начиная с образца опухолевых клеток, который был предварительно собран у пациента, страдающего от негинекологического рака.
Согласно вышеописанным вариантам реализации определения чувствительности пациента, страдающего от негинекологического рака, к лечению связывающим AMHRII агентом, то есть к лечению антителом против AMHRII, для данного образца раковых клеток определяют показатель мембранной экспрессии AMHRII, принимая во внимание как (i) частоту экспрессирующих AMHRII клеток в указанном образце раковых клеток, так и (ii) уровень экспрессии AMHRII указанными экспрессирующими AMHRII клетками. Обчно, показатель экспрессии AMHRII данного образца раковых клеток определяют по следующей формуле (I):
E-SCORE=FREQ x AMHRII_LEVEL, где
- E-SCORE обозначает значение показателя экспрессии AMHRII для данного образца раковых клеток,
- FREQ обозначает частоту клеток, содержащихся в указанном образце раковых клеток, для которых обнаружена мембранная экспрессия AMHRII, и
- AMHRII_LEVEL обозначает уровень экспрессии AMHRII экспрессирующими AMHRII клетками, содержащимися в указанном образце данных раковых клеток.
В качестве иллюстрации, E-SCORE, составляющий 1,0, определяют для данного образца раковых клеток, где (i) 50 % клеток экспрессируют AMHRII (значение FREQ составляет 0,5) и (ii) уровень экспрессии AMHRII (AMHRII_LEVEL) составляет 2.
В предпочтительных вариантах реализации показатель экспрессии AMHRII (или E-SCORE) определяют иммуногистологическими способами, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах. Согласно указанным предпочтительным вариантам реализации мембранную экспрессию AMHRII оценивают с применением детектируемого антитела, специфичного к AMHRII, и посредством (i) определения частоты клеток, с которыми связано указанное антитело против AMHRII, и (ii) определения интенсивности сигнала, генерируемого указанным детектируемым антителом против AMHRII после его связывания с экспрессируемым на мембране AMHRII.
Хотя, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах, раковые клетки, экспрессирующие AMHRII, имеющие показатель экспрессии AMHRII 1,5 или более, были определены для различных видов рака, хотя и с разными частотами. В качестве иллюстрации авторы настоящего изобретения в настоящей заявке показали, что раковые клетки, полученные из опухолей толстой кишки, классифицируются как AMHRII-положительные (т.е. имеющие показатель AMHRII 1,5 или более) с более высокой частотой, чем раковые клетки, полученные из опухолей головы и шеи.
Для определения уровня мембранной экспрессии AMHRII наиболее предпочтительно проводить детектирование AMHRII на клеточной мембране с применением моноклонального антитела против AMHRII, обладающего высокой аффинностью и высокой специфичностью к AMHRII, что проиллюстрировано в примерах с помощью моноклонального антитела 3C23K против AMHRII.
Кроме того, определение экспрессии AMHRII иммуногистохимическим методом с целью определения показателя экспрессии AMHRII наиболее предпочтительно включает тщательную предварительную обработку образца ткани перед приведением указанного образца в контакт с подходящим реагентом для детектирования (например, высокоаффинным моноклональным антителом против AMHRII, таким как моноклональное антитело 3C23K, имеющее значение Kd, составляющее 55,3 пМ для связывания с AMHRII). Предварительная обработка образца должна обеспечивать повышение доступности реагента для детектирования молекул AMHRII, экспрессируемых на поверхности клетки. В качестве иллюстрации, как показано в приведенных в настоящей заявке примерах, способ окрашивания включает соответствующую комбинацию определенных стадий, таких как (i) высокотемпературная депарафинизация посредством воздействия источника микроволнового излучения и (ii) система для амплификации сигнала, генерируемого связыванием связывающего AMHRII реагента, такого как биотинилированное антитело против AMHRII, которое впоследствии может образовать комплекс со стрептавидин-конъюгированным детектируемым реагентом. Стадия депарафинизации перед обработкой оказалась важной для устранения эффекта ослабления сигнала детектирования из-за предшествующей стадии фиксации ткани. Авторы настоящего изобретения показали, что способность AMHRII к детектированию особенно чувствительна к действию формалина, который применяют на стадии фиксации ткани.
В контексте настоящего изобретения это означает, что связывающий AMHRII агент, такой как антитело против AMHRII, будет являться подходящим терапевтическим агентом чаще для лечения пациентов, пораженных раком толстой кишки, чем для лечения пациентов, пораженных раком головы и шеи. Это также означает, что, хотя связывающий AMHRII агент может быть подходящим терапевтическим агентом для лечения пациентов, пораженных раком головы и шеи, предпочтительно предварительно проверить экспрессию AMHRII раковыми клетками, полученными из опухоли, для принятия решения о введении конкретному пациенту связывающего AMHRII агента, как описано в настоящей заявке.
Кроме того, авторы настоящего изобретения показали, что антитела против AMHRII можно предпочтительно применять для лечения этих негинекологических раковых заболеваний.
Таким образом, в настоящей заявке авторы настоящего изобретения показали, что фармацевтические агенты, нацеленные на AMHRII, подходят в качестве новых терапевтических средств для предотвращения или лечения негинекологических раковых заболеваний.
Согласно настоящему изобретению выражение «содержащий», например в выражении «содержащий стадию», также следует понимать как «состоящий из», например в выражении «состоящий из стадий», также следует понимать как «состоящий из», например «состоящий из стадий».
Рецептор AMH (AMHR или AMHR2 или AMHRII) представляет собой серин/треонинкиназу с одним трансмембранным доменом, принадлежащим к семейству рецепторов типа II TGF-бета-связанных белков. Рецепторы типа II связывают лиганд сами по себе, но требуют присутствия рецептора типа I для передачи сигнала. Imbeaud и другие (1995, Nature Genet, Vol. 11: 382-388,) клонировали ген рецептора AMH типа II человека. Белок рецептора AMH человека состоит из 573 аминокислот: 17, 127, 26 и 403 из 573 аминокислот образуют сигнальную последовательность, внеклеточный домен (ECD), трансмембранный домен и внутриклеточный домен, содержащий домен серин/треонинкиназы, соответственно.
В настоящей заявке термин «AMHRII» относится к рецептору человеческого антимюллерового гормона типа II, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.
Экспрессия рецептора антимюллерового гормона (AMHRII) уже была описана в данной области техники для гинекологических раковых заболеваний, опухолей, которые в основном инфильтрированы иммунными миелоидными клетками. AMHRII был идентифицирован как молекула-мишень для лечения гинекологического рака. Антитела, направленные на AMHRII, были получены в качестве терапевтических средств для лечения этих видов рака. В частности, можно привести антитело 12G4 против AMHRII и его варианты, описанные в заявках PCT № WO 2008/053330 и WO 2011/141653 для лечения рака яичников, а также антитело против AMHRII 3C23K, описанное в заявке РСТ. Также можно упомянуть заявку PCT № WO 2017/025458, в которой описана конкретная стратегия лечения рака яичника с применением конъюгатов антитело-лекарственное средство против AMHRII.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что AMHRII экспрессируется на поверхности различных раковых клеток человека, которые включают рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что не существует никакой связи между (i) экспрессией гена AMHRII раковыми клетками и (ii) экспрессией белка AMHRII на клеточной мембране теми же раковыми клетками.
Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, касающиеся поверхностной экспрессии AMHRII раковыми клетками человека, в основном получены с помощью иммуногистохимических анализов с антителом против AMHRII, которые были выполнены с применением образцов солидной опухоли человека, предварительно полученных от пациентов, страдающих от рака. Результаты, полученные авторами настоящего изобретения, касающиеся поверхностной экспрессии AMHRII раковыми клетками человека, также были получены с помощью иммуногистохимических анализов с антителом против AMHRII, которые были выполнены с применением образцов опухолевой ткани, происходящих из ксенотрансплантатов первичных раковых клеток человека у мышей.
Авторы настоящего изобретения также показали, что антитела против AMHRII подходят для лечения негинекологических раковых заболеваний человека, которые экспрессируют AMHRII на поверхности опухолевых клеток, и особенно тех раковых заболеваний, экспрессирующих AMHRII, которые описаны в настоящей заявке. Примечательно, что хорошая противораковая активность была продемонстрирована иммуноконъюгатами, содержащими антитела против AMHRII, конъюгированные с цитотоксической молекулой.
Авторы настоящего изобретения показали, что антитело против AMHRII, для которого доказана противоопухолевая эффективность против гинекологического рака, экспрессирующего AMHRII, что известно из данной области техники, также подходит для предотвращения или лечения негинекологического рака, экспрессирующего AMHRII, и особенно рака, экспрессирующего AMHRII, описанного в настоящей заявке.
Точнее, в приведенных в настоящей заявке примерах показано, что антитело против AMHRII, называемое 3C23K, проявляет противоопухолевую активность in vivo против рака печени человека. Важно, что противоопухолевая активность антитела против AMHRII 3C23K in vivo против рака печени человека имеет тот же порядок величины, что и сорафениб, который является хорошо известным противораковым средством для лечения рака печени, и особенно гепатоцеллюлярной карциномы.
Кроме того, приведенные в настоящей заявке примеры также показали, что антитело 3C23K против AMHRII не вызывает обнаруживаемых токсических явлений in vivo, тогда как лечение сорафенибом в тех же условиях in vivo вызывало значительную потерю массы тела.
Кроме того, как описано в настоящем документе, токсичное иммуноконъюгатное производное антитела 3C23K против AMHRII (ADC для конъюгата антитело-лекарственное средство) проявляет хорошую противораковую активность против раковых заболеваний, которые экспрессируют белок AMHRII на поверхности клетки.
Таким образом, настоящее изобретение относится к связывающему AMHRII человека агенту для его применения для предотвращения или лечения рака, выбранного из группы раковых заболеваний, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.
Настоящее изобретение также относится к применению связывающего AMHRII человека агента для получения лекарственного средства для предотвращения или лечения рака, выбранного из группы раковых заболеваний, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактики или лечения рака, выбранного из группы раковых заболеваний, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз, где указанный способ включает стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, связывающего AMHRII агента, как описано в настоящей заявке.
Связывающий AMHRII агент, который можно применять согласно настоящему изобретению, не требует имитации активности природного лиганда MIS. Таким образом, нет необходимости в том, чтобы связывающий AMHRII агент, который можно применять согласно настоящему изобретению, активировал любой путь передачи сигналов клетки при его связывании с AMHRII. Вместо этого необходима только способность указанного агента связываться с AMHRII, поскольку указанный агент применяют исключительно для таргетирования на индуцирующую цитотоксичность активность, например, индуцирующую цитотоксичность единицу, которая включает в себя цитотоксический иммуноконъюгат против AMHRII, индуцирующее ADCC или индуцирующее ADC антитело против AMHRII или CAR-Т-клетку, экспрессирующую сконструированный связывающий AMHRII рецептор.
Связывающий AMHRII агент
В настоящей заявке связывающий AMHRII агент охватывает любой агент, который специфически связывается с AMHRII и который, когда представлен соответствующим образом, вызывает гибель клеток-мишеней, экспрессирующих AMHRII на их поверхности, после связывания указанного агента с экспрессированным на клеточной мембране AMHRII.
Связывающий AMHRII агент, который применяют для лечения рака, как описано в настоящей заявке, в настоящей заявке также можно называть «терапевтическим связывающим AMHRII агентом».
Как правило, связывающий AMHRII агент охватывает белок или нуклеиновую кислоту, которая специфически связывается с AMHRII.
Связывающие AMHRII белки в основном охватывают белки, содержащие один или более участков, определяющих комплементарность (CDR), которые происходят из антитела против AMHRII или из связывающего AMHRII фрагмента антитела против AMHRII, при этом следует понимать, что указанные связывающие AMHRII белки могут экспрессироваться как химерные антигенные рецепторы (CAR) с помощью сконструированных клеток, таких как CAR-T-клетки, CAR-NK T-клетки или CAR-макрофаги.
Связывающие AMHRII нуклеиновые кислоты в основном охватывают аптамеры нуклеиновых кислот, которые были специально отобраны по их специфическим свойствам связывания с AMHRII.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации связывающий AMHRII агент представляет собой антитело против AMHRII или его связывающий AMHRII фрагмент.
В наиболее предпочтительных вариантах реализации связывающий AMHRII агент представляет собой моноклональное антитело против AMHRII или его связывающий AMHRII фрагмент.
В соответствии с этими предпочтительными вариантами реализации моноклональные антитела против AMHRII охватывают химерные антитела против AMHRII, гуманизированные антитела против AMHRII и человеческие антитела против AMHRII, а также связывающие AMHRII фрагменты и их связывающие AMHRII производные.
Различные антитела против AMHRII известны в данной области техники и могут быть применены согласно настоящему изобретению в качестве связывающих AMHRII агентов. Для реализации настоящего изобретения специалист в данной области может применять, например, рекомбинантный человеческий агент против AMHRII, продаваемый Creative Biolabs под номером MHH-57.
В некоторых вариантах реализации антитело против AMHRII, которое можно применять согласно настоящему изобретению, представляет собой гуманизированное антитело 12G4, раскрытое в заявке PCT № WO 2008/053330.
В некоторых других вариантах реализации указанные антитела против AMHRII представляют собой гуманизированные антитела, описанные в заявке PCT № WO 2011/141653, в которых гуманизированные антитела включают антитела 3C23, а также их варианты, при этом варианты включают гуманизированное антитело 3C23K.
В других вариантах реализации указанные антитела против AMHRII представляют собой антитела, описанные в заявке РСТ № WO 2017/025458. Согласно дополнительным вариантам реализации в заявке PCT № WO 2017/025458 раскрыты связывающие AMHRII агенты в форме конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC), где указанные антитела против AMHRII связаны с цитотоксическим агентом.
Моноклональное антитело против рецептора мюллерового гормона типа II (и его гуманизированные производные) было разработано в данной области техники для лечения рака яичников (см. ЕР 2097453B1 и патент США № 8278243, который включен в настоящую заявку посредством ссылки во всей своей полноте).
Среди связывающих AMHRII агентов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, специалист в данной области техники может применять моноклональное антитело 12G4 (mAb 12G4) или его химерные или гуманизированные варианты, включая такое антитело, которое было дериватизировано лекарственным средством или детектируемой меткой для образования ADC. Гибридома, продуцирующая mAbl2G4, депонирована в Национальной коллекции культур микроорганизмов (CNCM, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Франция), в соответствии с условиями Будапештского договора, 26 сентября 2006 г.) и имеет номер депозита CNCM 1-3673. Вариабельный домен легкой и тяжелой цепей mAb 12G4 был секвенирован, как и участки, определяющие комплементарность (CDR) mAb 12G4 (см. EP 2097453B1 и патент США № 8278423, который полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки). mAb 12G4 и его химерные или гуманизированные варианты можно применять для получения ADC, как описано в настоящей заявке.
В заявке PCT № PCT/FR2011/050745 (международная публикация № WO/2011/141653) и патенте США № 9012607, каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки, раскрыты новые гуманизированные антитела, полученные из мышиных антител 12G4. Эти гуманизированные антитела можно применять в качестве связывающих AMHRII агентов для задач настоящего изобретения. В конкретных вариантах реализации, раскрытых в заявке PCT № WO/2011/141653, антитела представляют собой антитела, идентифицированные как 3C23 и 3C23K. Последовательности нуклеиновых кислот и полипептидные последовательности этих антител представлены в настоящей заявке как SEQ ID NO: 1-16. В некоторых аспектах настоящего изобретения представляющие интерес антитела против AMHRII называются как «содержащие легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO:». Таким образом, в различных вариантах реализации особенно предпочтительные антитела, в том числе для генерации ADC, включают:
а) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 2, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 4 (последовательности VL и VH 3C23 без лидерных последовательностей);
b) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 6, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 8 (последовательности VL и VH 3C23K без лидерных последовательностей);
c) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 10, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 12 (легкая и тяжелая цепи 3C23 без лидерных последовательностей);
d) легкую цепь, содержащую SEQ ID NO: 14, и тяжелую цепь, содержащую SEQ ID NO: 16 (легкая и тяжелая цепи 3C23K без лидерных последовательностей).
Другие антитела (например, гуманизированные или химерные антитела), которые могут иметь в основе последовательности тяжелой и легкой цепей, представленные на фигурах 1А и 1В (например, антитела, такие как гуманизированные или химерные антитела, содержащие последовательности CDR, раскрытые в фигурах), можно применять в качестве представляющих интерес связывающих агентов против MAHRII-, в том числе для образования ADC. Таким образом, настоящее изобретение также относится к применению антител против AMHRII, включающих/содержащих CDR, включающих (или состоящих из) следующие последовательности:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NO: 65), где X1 и X2 независимо представляют собой S или P, X3 представляет собой R, или W, или G, X4 представляет собой T или D и X5 представляет собой I или T;
- CDRL-2 представляет собой PTSSLX6S (SEQ ID NO: 66), где X6 представляет собой K или E; и
- CDRL-3 представляет собой LQWSSYPWT (SEQ ID NO: 67);
- CDRH-1 представляет собой KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NO: 68), где X7 представляет собой S или T, X8 представляет собой S или G и X9 представляет собой Y или N;
- CDRH-2 представляет собой WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 69), где X10 представляет собой G или E, и
- CDRH-3 представляет собой GDRFAY (SEQ ID NO: 70).
Настоящее изобретение также относится к применению ADC, образованных с применением указанных антител против AMHRII, для лечения негинекологических раковых заболеваний, указанных в настоящей заявке.
Антитела (например, химерные или гуманизированные) в объеме настоящей заявки включают антитела, описанные в следующей таблице. В качестве альтернативы, человеческие моноклональные антитела, которые специфически связываются с AMHR-II, можно применять для получения ADC. Антитело 3C23K определяют как:
-SEQ ID NO: 19 для аминокислотной последовательности VH
-SEQ ID NO: 36 для аминокислотной последовательности VL
Ниже в таблице 1 перечислены гуманизированные антитела против AMHRII, которые можно применять согласно настоящему изобретению.
Таблица 1: Антитела против AMHRII
Антитело Мутации
Мутации VH SEQ ID в перечне последовательностей Мутации VL SEQ ID в перечне последовательностей
3C23K 19 36
3C23 19 L-K55E 37
3C23KR H-R3Q 20 36
6B78 H-R3Q 20 L-T48I, L-P50S 38
5B42 H-R3Q, H-T73A 21 L-T48I, L-K55E 39
K4D-24 H-Q1R 22 36
6C59 H-Q1R 22 L-S27P, L-S28P 40
K4D-20 H-Y32N 23 36
K4A-12 H-A16T 24 36
K5D-05 H-S31G 25 36
K5D-14 H-T28S 26 36
K4D-123 H-R44S 27 36
K4D-127 H-I69T 28 36
6C07 H-I69T 28 L-M4L, L-T20A 41
5C14 H-I69F 29 36
5C26 H-V67M 30 L-S27P 42
5C27 H-L45P 31 36
5C60 H-E10K, H-K12R 32 36
6C13 H-G53E 33 36
6C18 H-T93A 34 36
6C54 H-S84P 35 L-M4L, L-S9P, L-R31W 43
K4D-25 19 L-M4L 44
K4A-03 19 L-I33T 45
K4A-08 19 L-M4L, L-K39E 46
K5D-26 19 L-T22P 47
5C08 19 L-Y32D 48
5C10 19 L-S27P 42
5C18 19 L-Q37H 49
5C42 19 L-G97S 50
5C44 19 L-S12P 51
5C52 19 L-19A 52
5C56 19 L-T72A 53
6C03 19 L-R31W 54
6C05 19 L-M4L, L-M39K 55
6C16 19 L-I2N 56
6C17 19 L-G63C, L-W91C 57
6C28 19 L-R31G 58
725C02 19 L-I75F 59
725C17 19 L-I2T 60
725C21 19 L-I2T, L-K42R 61
725C33 19 L-Y49H 62
725C42 19 L-M4L, L-T20S, L-K39E 63
725C44 19 L-S27P 42
725C57 19 L-T69P 64
Антитела против AMHRII, связывающие AMHRII фрагменты или связывающие AMHRII производные антител против AMHRII
Термин «антитело» используется в самом широком смысле и включает моноклональные антитела (включая полноразмерные или интактные моноклональные антитела), поликлональные антитела, поливалентные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител (см. ниже), если они проявляют желаемую биологическую активность.
Таким образом, в настоящей заявке термин «антитело» в совокупности относится к иммуноглобулинам или иммуноглобулиноподобным молекулам, включая, в качестве примера и без ограничения, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их комбинации и аналогичные молекулы, продуцируемые во время иммунного ответа у любого позвоночного, например, у млекопитающих, таких как люди, козы, кролики и мыши, а также у видов, не относящихся к млекопитающим, например, иммуноглобулины акул. Если специально не указано иное, термин «антитело» включает интактные иммуноглобулины и «фрагменты антитела» или «антигенсвязывающие фрагменты», которые специфически связываются с AMHRII, что существенно исключает связывание с другими молекулами (т.е. молекулами, неродственными по отношению к AMHRII). Термин «антитело» также включает генетически сконструированные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (такие как биспецифичные антитела). См. также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 7th Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 2013.
В настоящей заявке термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в небольших количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного антигена. Более того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор «моноклональный» не следует истолковывать как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть получены посредством гибридомного способа, впервые описанного Kohler и соавторами, Nature 256:495 (1975), или могут быть получены с помощью способов рекомбинантных ДНК (см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител с использованием методов, описанных у Clackson и соавторов, Nature 352:624-628 (1991) или Marks и соавторов, J. MoI Biol. 222:581-597 (1991), например.
Термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела и относится к антигенным определяющим вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv, линейные антитела, антитела scFv и полиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.
Термин «тяжелая цепь антитела» в настоящей заявке относится к большей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антитела в их природных конформациях.
Термин «легкая цепь антитела» в настоящей заявке относится к меньшей из двух типов полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антитела в их природных конформациях, κ и λ легкие цепи относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.
В настоящем документе термин «участок, определяющий комплементарность» или «CDR» относится к части двух вариабельных цепей антител (тяжелой и легкой цепей), которые распознают и связываются с конкретным антигеном. CDR представляют собой наиболее вариабельную часть вариабельных цепей и обеспечивают антитело со своей специфичностью. На каждой из вариабельной тяжелой (VH) цепи и вариабельной легкой (VL) цепи существует три CDR, и, таким образом, на молекулу антитела приходится всего шесть CDR. CDR в первую очередь ответственны за связывание с эпитопом антигена. CDR каждой цепи обычно обозначают как CDR1, CDR2 и CDR3, пронумерованные последовательно, начиная с N-конца, и также обычно идентифицируются цепью, в которой находится конкретный CDR. Таким образом, VHCDR3 расположен в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором он обнаружен, тогда как VLCDR1 представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором он обнаружен. Антитело, которое связывает LHR, будет иметь специфическую VH-область и последовательность VL-области и, следовательно, специфические последовательности CDR. Антитела с различной специфичностью (то есть разными сайтами связывания для разных антигенов) имеют разные CDR. Хотя именно CDR варьируются от антитела к антителу, только ограниченное число положений аминокислот в CDR непосредственно участвует в связывании антигена. Эти положения в CDR называются остатками, определяющими специфичность (SDR).
«Каркасные области» (далее FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличающиеся от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно имеет четыре FR, идентифицированные как FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR определены согласно Kabat, остатки FR легкой цепи расположены примерно в остатках 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а тяжелые остатки FR цепи расположены примерно в остатках 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) в остатках тяжелой цепи.
Фрагменты «одноцепочечных Fv» или «scFv» антител содержат домены антител VH и VL, где эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL, который позволяет scFv образовывать необходимую структуру для связывания антигена. В качестве обзора scFv см. Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, VoI 113, Rosenburg and Moore eds. Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
Термин «диатела» относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, причем фрагменты одержат вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одной и той же полипептидной цепи (VH и VL). При применении линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить спаривание двух доменов в одной цепи, домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более полно, например, в EP 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Диатела или биспецифические антитела можно условно разделить на две категории: молекулы, подобные иммуноглобулину G (IgG), и молекулы, не являющиеся подобными IgG. IgG-подобные bsAb сохраняют Fc-опосредованные эффекторные функции, такие как антителозависимая клеточно-обусловленная цитотоксичность (ADCC), комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP) (Spiess et al., 2015, Mol Immunol., Vol. 67(2) :. 95-106.). Fc-область bsAb облегчает очистку и улучшает растворимость и стабильность. Биспецифические антитела в IgG-подобных форматах обычно имеют более длительный период полужизни в сыворотке благодаря их большему размеру и FcRn-опосредованной рециркуляции (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies. Drug Discov Today Vol. 20(7) : 838-47). Не являющиеся подобными IgG bsAb имеют меньший размер, что приводит к улучшенному проникновению в ткани (Kontermann et al., 2015, Bispecific antibodies. Drug Discov Today Vol. 20(7) : 838-47).
Согласно некоторым предпочтительным вариантам реализации биспецифичные антитела согласно настоящему изобретению содержат (i) первый антигенсвязывающий сайт, который связывается с AMHRII, и (ii) второй антигенсвязывающий сайт, который связывается с антигеном-мишенью, которая отличается от AMHRII, и особенно антигеном-мишенью, которая может экспрессироваться раковыми клетками или иммунными клетками микроокружения опухоли, такими как Т-клетки, NK или макрофаги. В некоторых вариантах реализации в таких биспецифических антителах указанный второй антигенсвязывающий сайт связывается с антигеном-мишенью, которая представляет собой CD3, и обеспечивает возможность вовлечения Т-клеток. Этот целевой антиген также может представлять собой PDL1 для освобождения Т-клеток или CD16 для активации NK или макрофагов.
Моноклональные антитела, указанные в настоящей заявке, конкретно включают «химерные» антитела против AMHRII (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих конкретному классу или подклассу антител, в то время как остаток цепи (цепей) идентичен или гомологичен соответствующим последовательностям в антителах, полученных из другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они демонстрируют желаемую биологическую активность (Патент США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 :6851-6855 (1984)).
Моноклональные антитела, указанные в настоящей заявке, также включают гуманизированные антитела против AMHRII. «Гуманизированные» формы нечеловеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области вида, не являющегося человеком (донорское антитело), такого как мышь, крыса, кролик или не являющийся человеком примат, имеющими необходимую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасной области Fv (FR) человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживают в реципиентном антителе или в донорском антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антител. В целом, гуманизированное антитело включает по существу все, по меньшей мере один, и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют таковым у иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или по существу все FR области представляют собой последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело необязательно также содержит по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно константной области иммуноглобулина человека. Для более подробной информации см. Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
Моноклональные антитела против AMHRII, указанные в настоящей заявке, дополнительно включают человеческие антитела против AMHRII. «Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует последовательности антитела, продуцируемого человеком, и/или была получена с применением любого из методов получения антител человека, как описано в настоящей заявке. Это определение человеческого антитела конкретно исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки нечеловеческого происхождения. Человеческие антитела могут быть получены с применением различных методов, известных в данной области. В одном варианте реализации человеческое антитело выбрано из фаговой библиотеки, при этом эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. MoI. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. MoI. Biol, 222:581 (1991)). Человеческие антитела также могут быть получены путем введения локусов человеческого иммуноглобулина трансгенным животным, например мышам, у которых гены эндогенного иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. При провокации наблюдается продуцирование человеческих антител, которое во всех отношениях очень похоже на то, которое наблюдается у людей, включая перегруппировку генов, сборку и спектр антител. Этот подход описан, например, в патенте США № 5545807; 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661016 и в следующих научных публикациях: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). В качестве альтернативы человеческое антитело может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, продуцирующих антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены от пациента или могут быть иммунизированы in vitro). См., например, Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); и патент США № 5750373.
В настоящей заявке термин «антитело мутант» или «вариант антитела» относится к варианту аминокислотной последовательности видозависимого антитела, где один или более аминокислотных остатков видозависимого антитела были модифицированы. У таких мутантов идентичность последовательности или сходство с видозависимым антителом обязательно составляет менее 100 %. В одном варианте реализации антитело мутант будет иметь аминокислотную последовательность, имеющую идентичность или сходство аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена тяжелой или легкой цепи видозависимого антитела, составляющую по меньшей мере 75 %, более предпочтительно по меньшей мере 80 %, более предпочтительно по меньшей мере 85 %, более предпочтительно по меньшей мере 90 % и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95 %. Идентичность или сходство в отношении этой последовательности определяется в настоящей заявке как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными (т.е. одинаковые остатки) или сходными (то есть аминокислотные остатки из одной и той же группы на основании общих свойств боковых цепей, см. ниже) с видозависимыми остатками антител, после выравнивания последовательностей и введения брешей, если необходимо, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Ни одно из N-концевых, С-концевых или внутренних расширений, делеций или вставок в последовательности антител вне вариабельного домена не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или сходство последовательности.
Гуманизированные антитела могут быть получены посредством получения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих домены CDR, и конструирования гуманизированных антител в соответствии с методами, известными в данной области техники. Способы получения гуманизированных антител на основе традиционных рекомбинантных ДНК и методы трансфекции генов хорошо известны в данной области (см., например, Riechmann L. et al. 1988; Neuberger M S. et al. 1985). Антитела могут быть гуманизированы с применением различных методов, известных в данной области техники, включая, например, CDR-прививание (EP 239400; публикация PCT WO91/09967; патенты США № 5225539; 5530101; и 5585089), венирование или перекладку (EP 592106; EP 519596; Padlan E A (1991); Studnicka G M et al. (1994); Roguska M A. et al. (1994)), и перестановку цепей (патент США N 5565332). Общая технология рекомбинантных ДНК для получения таких антител также известна (см. Европейскую патентную заявку ЕР 125023 и Международную патентную заявку WO 96/02576).
Может быть необходимо модифицировать антитело против AMHRII, указанное в настоящей заявке, в отношении эффекторной функции, например чтобы усилить антигензависимую клеточно-обусловленную циотоксичность (ADCC) и/или комплементзависимую цитотоксичность (CDC) антитела. Это может быть достигнуто путем введения замен одной или более аминокислот в Fc-область антитела. В качестве альтернативы или дополнения, цистеиновый остаток (остатки) может быть введен в Fc-область, что позволяет образовывать межцепочечные дисульфидные связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может обладать улучшенной способностью к интернализации и/или повышенным комплементозависимым уничтожением клеток и антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC). См. Caron et al, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерные антитела с повышенной противоопухолевой активностью также могут быть получены с применением гетеробифункциональных поперечных линкеров, как описано в Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). В качестве альтернативы можно сконструировать антитело, которое имеет двойные Fc-области и может, таким образом, обладать улучшенными возможностями комплементозависимого лизиса и ADCC. См. Stevenson et al. Anti- Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). В WO 00/42072 (Presta, L.) описаны антитела с улучшенной функцией ADCC в присутствии эффекторных клеток человека, где антитела содержат замены аминокислот в их Fc-области. Предпочтительно, антитело с улучшенным ADCC содержит замены в положениях 298, 333 и/или 334 Fc-области (Eu нумерация остатков). Предпочтительно измененная Fc-область представляет собой Fc-область человеческого IgG1, содержащую или состоящую из замен в одном, двух или трех из этих положений. Такие замены необязательно объединяют с заменой (заменами), которые увеличивают связывание CIq и/или CDC.
Антитела с измененным CIq-связыванием и/или комплементозависимой цитотоксичностью (CDC) описаны в WO 99/51642, патенте США № 6194551 Bl, патенте США № 6242195 Bl, патенте США № 6528624 Bl и патенте США № 6538124 (Idusogie et al). Антитела содержат замену аминокислот в одном или более аминокислотных положениях 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 и/или 334 в их Fc-области (Eu нумерация остатков).
В некоторых вариантах реализации связывающие AMHRII агенты включают в себя глико-инженерные антитела против AMHRII.
В настоящей заявке здесь термин «гликоинженерия» относится к любому известному в данной области способу изменения профиля гликоформы состава связывающего белка. Такие способы включают экспрессию композиции связывающего белка в генетически сконструированной клетке-хозяине (например, клетке СНО), которая была генетически сконструирована для экспрессии гетерологичной гликозилтрансферазы или гликозидазы. В других вариантах реализации способы глико-инженерии включают культивирование клетки-хозяина в условиях, которые смещают определенные профили гликоформ.
В настоящей заявке термин «гликоинженерное антитело» охватывает (i) антитело, содержащее гипергалактозилированный фрагмент Fc, (ii) антитело, содержащее гипоманнозилированный фрагмент Fc, который включает аманнозилированный фрагмент Fc, и (iii) антитело содержащий гипофукозилированный фрагмент Fc, который включает афукозилированный фрагмент Fc. Используемый в настоящей заявке глико-инженерный фрагмент включает фрагмент Fc, имеющий измененное гликозилирование, которое выбрано из группы, включающей одно или более из следующих измененных типов гликозилирования (i) гипергалактозилирование, (ii) гипоманнозилирование и (iii) гипофукозилирование. Следовательно, глико-инженерный Fc фрагмент из антитела против AMHRII, применяемый согласно настоящему изобретению, охватывает иллюстративные примеры гипергалактозилированного, гипоманнозилированного и гипофукозилированного Fc фрагмента.
Специалист в данной области техники может обратиться к хорошо известным методам получения антител против AMHRII, включающим гипергалактозилированные фрагменты Fc, гипоманнозилированные фрагменты Fc и гипофукозилированные фрагменты Fc, которые, как известно, связываются с рецепторами Fc с более высокой аффинностью, чем немодифицированные фрагменты Fc.
Гликоинженерные антитела против AMHRII включают в себя антитела против AMHRII, содержащие гипофукозилированный фрагмент Fc, который также можно назвать фрагментом Fc с низким содержанием фукозы.
Иммуноконъюгаты, особенно конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC)
Связывающие AMHRII агенты, которые можно применять для реализации задач настоящего изобретения, охватывают антитела, указанные в настоящей заявке, которые конъюгированы с цитотоксическим агентом, таким как химиотерапевтический агент, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивный изотоп (то есть радиоконъюгат). Такие конъюгаты антител охватывают конъюгаты, описанные в заявке РСТ № WO 2017/025458. В заявке PCT № WO 2017/025458, в частности, раскрыто антитело против AMHRII 3C23K, а также конъюгаты 3C23K ADC, для которых продемонстрирована противораковая активность in vivo в отношении негинекологического рака у человека.
Цитотоксические агенты охватывают ферментативно активные токсины. Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно применять, включают А-цепь дифтерийного токсина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), А-цепь рицина, А-цепь абрина, А-цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор момордики хоранция, курцин, кротин, ингибитор мыльнянки лекарственной, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.
Для получения радиоконъюгированных антител доступны различные радионуклиды.
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента получают с применением множества бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как описанные в заявке PCT № WO 2017/025458.
Предпочтительными иммуноконъюгатами конъюгатов антител против AMHRII ADC являются описанные в заявке PCT № WO 2017/025458.
CAR-клетки, включая CAR-T-клетки, CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения связывающий AMHRII человека агент представляет собой связывающий AMHRII рецептор или экспрессирующую связывающий AMHRII рецептор клетку, и особенно CAR-Т-клетку, экспрессирующую связывающий AMHRII рецептор, CAR-NK-клетку, экспрессирующую связывающий AMHRII рецептор, или CAR-макрофаг, экспрессирующий связывающий AMHRII рецептор.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации связывающий AMHRII человека агент представляет собой сконструированный связывающий AMHRII рецептор, и наиболее предпочтительно сконструированный связывающий AMHRII рецептор, у которого его связывающая AMHRII область происходит из моноклонального антитела против AMHRII, раскрытого в настоящей заявке.
Как правило, сконструированный связывающий AMHRII рецептор состоит из рецептора химерного антигена (CAR), содержащего (i) внеклеточный домен, (ii) трансмембранный домен и (iii) внутриклеточный домен, и где внеклеточный домен представляет собой связывающий AMHRII фрагмент, который происходит из моноклонального антитела против AMHRII, раскрытого в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного связывающего AMHRII рецептора содержит (i) VH-цепь антитела, содержащую CDR, полученные из моноклонального антитела против AMHRII, описанного в настоящей заявке, и (ii) VL-цепь антитела, содержащую CDR, полученные из моноклонального антитела против AMHRII, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного связывающего AMHRII рецептора включает VH-цепь и VL-цепь моноклонального антитела против AMHRII, раскрытого в настоящей заявке. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного связывающего AMHRII рецептора представляет собой ScFv, содержащий CDR, полученные из VH-цепи и CH-цепи из моноклонального антитела против AMHRII, раскрытого в настоящей заявке, соответственно. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен указанного сконструированного связывающего AMHRII рецептора представляет собой ScFv, включающий VH-цепь и CH-цепь из моноклонального антитела против AMHRII, раскрытого в настоящей заявке, соответственно.
Настоящая заявка также охватывает связывающий AMHRII агент, состоящий из клетки, экспрессирующей такой связывающий AMHRII рецептор, и особенно CAR-Т-клетки, CAR-NK-клетки или CAR-макрофага, экспрессирующего такой связывающий AMHRII рецептор.
Термин «рецептор химерного антигена» (CAR), используемый в настоящей заявке, относится к слитому белку, содержащему внеклеточный домен, способный связываться с антигеном, трансмембранный домен, полученный из полипептида, отличного от полипептида, из которого получен внеклеточный домен, и по меньшей мере один внутриклеточный домен. «Химерный антигенный рецептор (CAR)» иногда называют «химерным рецептором», «Т-body» или «химерным иммунным рецептором (CIR)». «Внеклеточный домен, способный связываться с AMHRII» обозначает любой олигопептид или полипептид, который может связываться с AMHRII. «Внутриклеточный домен» обозначает любой олигопептид или полипептид, о котором известно, что он функционирует как домен, который передает сигнал, вызывающий активацию или ингибирование биологического процесса в клетке. «Трансмембранный домен» обозначает любой олигопептид или полипептид, о котором известно, что он охватывает клеточную мембрану и который может функционировать для связывания внеклеточного и сигнального доменов. Химерный антигенный рецептор может необязательно содержать «шарнирный домен», который служит линкером между внеклеточным и трансмембранным доменами.
CAR-Т-клетки представляют собой генетически сконструированные аутологичные Т-клетки, в которых одноцепочечные фрагменты антител (scFv) или лиганды присоединены к сигнальному домену Т-клеток, способному облегчать активацию Т-клеток (Maher, J. (2012) ISRN Oncol.2012:278093; Curran, K.J. et al. (2012) J. Gene Med.14:405-415; Fedorov, V.D. et al. (2014) Cancer J.20:160-165; Barrett, D.M. et al. (2014) Annu. Rev. Med.65:333-347).
Под «внутриклеточным сигнальным доменом» подразумевают ту часть CAR, которая обнаружена или сконструирована для обнаружения внутри Т-клетки. «Внутриклеточный сигнальный домен» может содержать или не содержать также «трансмембранный домен», который закрепляет CAR в плазматической мембране Т-клетки. В одном варианте реализации «трансмембранный домен» и «внутриклеточный сигнальный домен» получены из одного и того же белка (например, CD3ζ) в других вариантах реализации; внутриклеточный сигнальный домен и трансмембранный домен получены из разных белков (например, трансмембранный домен из молекулы CD3ζ, и внутриклеточный сигнальный домен из молекулы CD28 или наоборот).
Под «костимулирующим эндодоменом» подразумевают внутриклеточный сигнальный домен или его фрагмент, полученный из костимулирующей молекулы Т-клеток. Неограничивающий перечень костимулирующих молекул Т-клеток включает CD3, CD28, OX-40, 4-1BB, CD27, CD270, CD30 и ICOS. Костимулирующий эндодомен может включать или не включать трансмембранный домен из того же или другого костимулирующего эндодомена.
Под «внеклеточным антигенсвязывающим доменом» подразумевается та часть CAR, которая специфически распознает и связывается с AMHRII.
В предпочтительных вариантах реализации «внеклеточный связывающий домен» получен из моноклонального антитела против AMHRII. Например, «внеклеточный связывающий домен» может включать весь или часть Fab-домена из моноклонального антитела. В некоторых вариантах реализации «внеклеточный связывающий домен» включает участки, определяющие комплементарность, конкретного моноклонального антитела против AMHRII. В еще одном варианте реализации «внеклеточный связывающий домен» представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из указанного в настоящей заявке моноклонального антитела против AMHRII.
В предпочтительных вариантах реализации внеклеточный связывающий домен получен из любого одного из моноклональных антител против AMHRII, описанных в настоящей заявке, и особенно из моноклонального антитела 3C23K против AMHRII .
I. Внеклеточный антигенсвязывающий домен
В одном варианте реализации CAR согласно настоящему изобретению содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен из одного из моноклональных антител против AMHRII, описанных в настоящей заявке.
В одном варианте реализации внеклеточный связывающий домен содержит следующие последовательности CDR:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NO: 65), где X1 и X2 независимо представляют собой S или P, X3 представляет собой R или W или G, X4 представляет собой T или D и X5 представляет собой I или T;
- CDRL-2 представляет собой PTSSLX6S (SEQ ID NO: 66), где X6 представляет собой K или E; и
- CDRL-3 представляет собой LQWSSYPWT (SEQ ID NO: 67);
- CDRH-1 представляет собой KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NO: 68), где X7 представляет собой S или T, X8 представляет собой S или G и X9 представляет собой Y или N;
- CDRH-2 представляет собой WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 69), где X10 представляет собой G или E, и
- CDRH-3 представляет собой GDRFAY (SEQ ID NO: 70).
II. Линкер между VL и VH доменами KappaMab scFv
В дополнительном варианте реализации VL против AMHRII связан с VH против AMHRII посредством гибкого линкера. В частности, гибкий линкер представляет собой глицин/сериновый линкер, состоящий примерно из 10-30 аминокислот (например, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот), и включает структуру (Gly4Ser)3.
III. Спейсеры между внеклеточным антигенсвязывающим доменом и внутриклеточным сигнальным доменом
Внеклеточный антигенсвязывающий домен связан с внутриклеточным сигнальным доменом с помощью «спейсера». Спейсер сконструирован достаточно гибким, чтобы обеспечить ориентацию антигенсвязывающего домена таким образом, чтобы облегчить распознавание и связывание антигена. Спейсер может быть получен из самих иммуноглобулинов против AMHRII и может включать шарнирную область IgG1 или CH2 и/или CH3 область IgG.
IV. Внутриклеточный сигнальный домен
Внутриклеточный сигнальный домен включает всю или часть цепи CD3. CD, также известный как CD247, совместно с корецептором CD4 или CD8 Т-клеток, отвечает за связывание внеклеточного антигена с внутриклеточными сигнальными каскадами.
В дополнение к включению сигнального домена CD3ζ, включение костимулирующих молекул, как было показано, усиливает активность CAR-Т-клеток в мышиных моделях и клинических испытаниях. Были исследованы некоторые из них, включая CD28, 4-IBB, ICOS, CD27, CD270, CD30 и OX-40.
В определенных вариантах реализации раскрыты способы получения клеток, экспрессирующих CAR, включающие или, в качестве альтернативы, состоящие по существу из: (i) трансдукции популяции выделенных клеток с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CAR, и (ii) отбора субпопуляции клеток, которые были успешно трансдуцированы указанной последовательностью нуклеиновой кислоты из стадии (i). В некоторых вариантах реализации выделенные клетки представляют собой T-клетки, T-клетки животных, T-клетки млекопитающих, T-клетки кошек, T-клетки собак или T-клетки человека, таким образом, продуцирующие CAR-T-клетки. В некоторых вариантах реализации выделенная клетка представляет собой NK-клетку, например, NK-клетку животного, NK-клетку млекопитающего, NK-клетку кошки, NK-клетку собаки или NK-клетку человека, таким образом, продуцирующую CAR-NK-клетку.
Терапевтическое применение CAR-T-клеток, CAR-N-клеток и CAR-макрофагов.
CAR-клетки, которые включают CAR-T-клетки, CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги, описанные в настоящей заявке, можно применять для лечения негинекологических опухолей, экспрессирующих AMHRII. CAR-клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для лечения опухолей, экспрессирующих AMHRII, у пациентов, пораженных одним раковым заболеванием, описанным в настоящей заявке. В предпочтительных вариантах реализации CAR-клетки согласно настоящему изобретению предпочтительно применяют для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака яичка, рака щитовидной железы, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака почки, липосаркомы, фибросаркомы, плевромезотелиомы, меланомы, саркомы, рака головного мозга, остеокарциномы, рака молочной железы, рака простаты и лейкоз.
CAR-клетки согласно настоящему изобретению можно вводить отдельно или в комбинации с разбавителями, известными противораковыми лекарственными средствами и/или с другими компонентами, такими как цитокины или другие популяции клеток, которые являются иммуностимулирующими.
Аспекты способа согласно настоящему описанию относятся к способам ингибирования роста опухоли у субъекта, нуждающегося в этом, и/или лечения больного раком, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах реализации опухоль представляет собой солидную опухоль. В некоторых вариантах реализации опухоли/рак представляет собой опухоли/рак щитовидной железы, молочной железы, яичника или предстательной железы.
CAR-клетки, как описано в настоящей заявке, можно вводить отдельно или в комбинации с разбавителями, известными противораковыми лекарственными средствами и/или с другими компонентами, такими как цитокины или другие популяции клеток, которые являются иммуностимулирующими. Это может быть первая линия, вторая линия, третья линия, четвертая линия терапии или дополнительная терапия. Она может сочетаться с другими видами терапии. Неограничивающие примеры включают химиотерапию или биологические препараты. Подходящий режим лечения будет определен лечащим врачом или ветеринаром.
Фармацевтические композиции, содержащие CAR согласно настоящему изобретению, можно вводить способом, соответствующим заболеванию, которое следует лечить или предотвращать. Количество и частота введения будут определяться такими факторами, как состояние пациента, а также тип и тяжесть заболевания пациента, хотя соответствующие дозировки могут быть определены посредством клинических исследований.
Терапевтическое применение
Как уже описано в других частях настоящей заявки, связывающие AMHRII агенты, описанные в настоящей заявке, которые охватывают (i) антитела против AMHRII, описанные в настоящей заявке, (ii) конъюгаты антитело-лекарственное средство, описанные в настоящей заявке, и (iii) CAR-клетки (включая CAR-Т-клетки , CAR-NK-клетки и CAR-макрофаги), описанные в настоящей заявке, состоят из активных ингредиентов, которые можно применять для предотвращения или лечения негинекологического AMHRII-экспрессирующего рака, и особенно рака, выбранного из группы, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.
Способы лечения рака, в которых применяют антитела против опухолевого антигена или CAR-клетки против опухолевого антигена, хорошо известны специалисту в данной области техники.
В некоторых вариантах реализации проводят тестирование пациентов, страдающих от рака, для определения наличия экспрессии AMHRII на поверхности опухолевых клеток перед осуществлением лечения с помощью связывающего AMHRII агента, такого как антитело против AMHRII, ADC против AMHRII, CAR-Т-клетка против AMHRII, CAR-NL-клетка против AMHRII или CAR-макрофаг против AMHRII.
Такое предварительное тестирование для выявления мембранной экспрессии AMHRII является предпочтительным для лечения рака, экспрессирующего AMHRII с низкой частотой. Напротив, такое предварительное тестирование для выявления мембранной экспрессии AMHRII можно не проводить для лечения рака, экспрессирующего AMHRII с высокой частотой.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к связывающему AMHRII агенту, как описано в настоящей заявке, для его применения для профилактики или лечения пациента, страдающего от AMHRII-положительного рака, выбранного из группы, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.
Настоящее изобретение относится к применению связывающего AMHRII агента для получения лекарственного средства для профилактики или лечения пациента, страдающего от AMHRII-положительного рака, выбранного из группы, включающей рак толстой кишки, рак печени, гепатоцеллюлярную карциному, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак желудочно-кишечного тракта, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак головы и шеи, рак почки, липосаркому, фибросаркому, плевромезотелиому, меланому, саркому, рак головного мозга, остеокарциному, рак молочной железы, рак простаты и лейкоз.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактики или лечения пациента, страдающего от AMHRII-положительного рака, выбранного из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака яичка, рака щитовидной железы, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака почки, липосаркомы, фибросаркомы, плевромезотелиомы, меланомы, саркомы, рака головного мозга, остеокарциномы, рака молочной железы, рака простаты и лейкоза, при этом указанный способ включает стадию введения указанному пациенту связывающего AMHRII агента.
Пациент может быть определен как пациент, страдающий от AMHRII-положительного рака, путем реализации способа выявления наличия экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности в образце раковой ткани, предварительно полученном от указанного пациента. Выявление наличия экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности может быть выполнено в соответствии с множеством способов, которые хорошо известны специалисту в данной области техники. Способы выявления наличия экспрессии белка AMHRII на клеточной поверхности, в частности, охватывают способы иммуногистохимии, а также способы сортировки флуоресцентно-активированных клеток, которые проиллюстрированы в приведенных в настоящей заявке примерах.
Настоящее изобретение также относится к способу определения, подходит ли пациент (т. е. чувствителен) для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного пациента, белка AMHRII на поверхности клетки.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу определения возможности лечения рака у пациента, страдающего раком, выбранным из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака яичка, рака щитовидной железы, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака почки, липосаркомы, фибросаркомы, плевромезотелиомы, меланомы, саркомы, рака головного мозга, остеокарциномы, рака молочной железы, рака простаты и лейкоз, с помощью связывающего AMHRII агента, т.е. чувствительности к лечению рака с помощью связывающего AMHRII агента, при этом указанный способ включает стадии:
a) определения наличия экспрессии AMHRII раковыми клетками указанного пациента на их мембране, и
b) заключения о том, что указанный пациент подходит для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, то есть реагирует на лечение рака с помощью связывающего AMHRII агента, если на стадии а) была определена мембранная экспрессия AMHRII указанными раковыми клетками.
В предпочтительных вариантах реализации указанного способа на стадии b) делают заключение о том, что указанный пациент подходит (т. е. чувствителен) для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, когда (i) значение показателя экспрессии AMHRII определяют на стадии a) и когда (ii) указанное значение показателя экспрессии AMHRII представляет собой пороговое значение показателя или более. Значение показателя AMHRII наиболее предпочтительно рассчитывают с применением формулы (I), описанной в других частях настоящей заявки.
Таким образом, согласно предпочтительны вариантам реализации стадии а) способа выполняют иммуногистохимическим способом, таким как показано в примерах, приведенных в настоящей заявке.
Раковые клетки, которые применяют на стадии а), как правило, происходят из образца ткани, полученной посредством биопсии, который предварительно был взят от указанного пациента, страдающего от рака.
Предпочтительно стадия а) осуществляют с применением антитела против AMHRII, выбранного из тех, которые конкретно описаны в настоящей заявке, и, в частности, антитела 3C23K, связывание с AMHRII которого можно детектировать с применением вторично меченого антитела в соответствии с хорошо известными способами детектирования антител, такие как раскрытые в примерах настоящей заявки.
Предпочтительно, пациента, страдающего от рака, включенного в вышеперечисленную группу раковых заболеваний, определяют как подходящего для лечения рака с помощью связывающего AMHRII агента, т. е. определяют как реагирующего на лечение рака с помощью связывающего AMHRII агента, когда значение показателя экспрессии AMHRII, составляющее 1,0 или более, и наиболее предпочтительно значение показателя экспрессии AMHRII, составляющее 1,5 или более, определяют в образце раковых клеток, полученном от указанного пациента, больного раком, при выполнении способа оценки, позволяющего определить значение E-SCORE в соответствии с формулой (I) ниже:
E-SCORE=FREQ x AMHRII_LEVEL, где
- E-SCORE обозначает значение показателя экспрессии AMHRII для данного образца раковых клеток,
- FREQ обозначает частоту клеток, содержащихся в указанном образце раковых клеток, для которых обнаружена мембранная экспрессия AMHRII, и
- AMHRII_LEVEL обозначает уровень экспрессии AMHRII экспрессирующими AMHRII клетками, содержащимися в указанном образце данных раковых клеток.
Настоящее изобретение дополнительно относится к способу лечения пациента, страдающего от рака, выбранного из группы, состоящей из рака толстой кишки, рака печени, гепатоцеллюлярной карциномы, рака яичка, рака щитовидной железы, рака желудка, рака желудочно-кишечного тракта, рака мочевого пузыря, рака поджелудочной железы, рака головы и шеи, рака почки, липосаркомы, фибросаркомы, плевромезотелиомы, меланомы, саркомы, рака головного мозга, остеокарциномы, рака молочной железы, рака простаты и лейкоза, при этом указанный способ включает стадии:
а) определение наличия экспрессии белка AMHRII образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного пациента, на поверхности клеток, и
b) лечение указанного пациента связывающим AMHRII агентом, если на стадии а) была определена экспрессия AMHRII на поверхности клеток.
В некоторых предпочтительных вариантах реализации наличие экспрессии AMHRII определяют на стадии а), когда указанный образец опухоли имеет значение показателя экспрессии AMHRII «E-SCORE», рассчитанное в соответствии с вышеописанной формулой (I), составляющее 1,0 или более, которое включает значение E-SCORE, составляющее 1,5 или более.
В наиболее предпочтительных вариантах реализации описанного выше способа указанный связывающий AMHRII агент состоит из антитела AMHRII или его фрагмента, как указано в настоящей заявке, или CAR-клетки (например, CAR-T-клетки или CAR-NK-клетки), как указано в настоящей заявке.
В некоторых вариантах реализации указанный связывающий AMHRII агент применяют в качестве единственного противоракового активного ингредиента.
В некоторых других вариантах реализации противораковое лечение указанным связывающим AMHRII агентом также включает одно или более дополнительное противораковое лечение указанного пациента, которое включает лечение радиотерапией и лечение химиотерапией.
Таким образом, в соответствии с такими другими вариантами реализации противораковое лечение указанным связывающим AMHRII агентом также включает введение указанному пациенту одного или более дополнительных противораковых активных ингредиентов.
Таким образом, в соответствии с некоторыми вариантами реализации связывающего AMHRII агента для его применения, как описано в настоящей заявке, указанный связывающий AMHRII агент объединяют с другим противораковым средством, например, объединяют с одним или более другим противораковым активным агентом(ами).
«Противораковый агент» определяется как любая молекула, которая может либо мешать биосинтезу макромолекул (ДНК, РНК, белков и т. д.), либо ингибировать пролиферацию клеток, либо, например, приводить к гибели клеток в результате апоптоза или цитотоксичности. Среди противораковых агентов можно упомянуть алкилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы и интеркалирующие агенты, антиметаболиты, расщепляющие агенты, агенты, влияющие на тубулин, моноклональные антитела.
В соответствии с конкретным аспектом настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем содержащей противораковый агент и антитело, связывающееся с AMHR-II, и особенно антитело против AMHRII, описанное в настоящей заявке.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к нетоксичному материалу, который совместим с биологической системой, такой как клетка, клеточная культура, ткань или организм.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, и особенно антитело против AMHRII, описанное в настоящей заявке.
В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем содержащей противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в котором противораковый агент выбран из группы доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.
Другие противораковые агенты, которые можно применять в комбинации с антителом против AMHRII, включают паклитаксел или соль платины, такую как оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин.
Противораковый агент также может быть выбран из химиотерапевтических агентов, отличных от солей платины, малых молекул, моноклональных антител или других пептидных антител против ангиогенеза.
Химиотерапевтические агенты, отличные от солей платины, включают интеркалирующие агенты (блокирующие репликацию и транскрипцию ДНК), такие как антрациклины (доксорубицин, пегилированный липосомальный доксорубицин), ингибиторы топоизомеразы (камптотецин и производные: каренитецин, топотекан, иринотекан) или SJG-136, ингибиторы гистондеацетилазы (вориностат, белиностат, вальпроевая кислота), алкилирующие агенты (бендамустин, глюфосфамид, темозоломид), антимитотические растительные алкалоиды, такие как таксаны (доцетаксел, паклитаксел), алкалоиды барвинка (винорелбин), эпотилоны (ZK-эпотилон, иксабепилон), антиметаболиты (гемцитабин, элацитарабин, капецитабин), ингибиторы белка веретена кинезина (KSP) (испинесиб), трабектедин или омбрабулин (производное комбретастатина А-4).
Среди малых молекул существуют ингибиторы поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (ПАРП): олапариб, инипариб, велипариб, рукапариб, CEP-9722, MK-4827, BMN-673, ингибиторы киназы, такие как ингибиторы тирозинкиназы (TKI), среди которых можно упомянуть молекулы против VEGFR (сорафениб, сунитиниб, седираниб, вандетаниб, пазопаниб, BIBF 1120, семаксаниб, кабозантиниб, мотесаниб), молекулы против HER2/EGFR (эрлотиниб, гефитиниб, лапатиниб), молекулы против PDGFR (иматиниб, BIBF 1120), молекулы против FGFR (BIBF 1120), ингибиторы аврора-киназы/тирозинкиназы (ENMD-2076), ингибитор Src/Abl-киназы (саракатиниб) или также перифозин, темсиролимус (ингибитор mTOR), альвоцидиб (ингибитор циклин-зависимой киназы), воласертиб (ингибитор белка PLK1 (Polo-подобная киназа 1), LY2606368 (ингибитор киназы контрольной точки 1 (chk 1), GDC-0449 (ингибитор пути Hedgehog), зиботентан (антагонист ETA-рецептора), бортезомиб, карфилзомиб (ингибитор протеасомы), цитокины, такие как IL-12, IL-18, IL-21, INF-альфа, INF-гамма.
Среди антител можно упомянуть антитела против VEGF: бевацизумаб, против VEGFR: рамуцирумаб, против HER2/EGFR: трастузумаб, пертузумаб, цетуксимаб, панитумумаб, MGAH22, матузумаб, против PDGFR-альфа: IMC-3G3, антифолатный рецептор: фарлетузумаб, против CD27: CDX-1127, против CD56: BB-10901, против CD105: TRC105, против CD276: MGA271, против AGS-8: AGS-8M4, против DRS: TRA-8, против HB-EGF: KHK2866, против мезотелина: аматуксимаб, BAY 94-9343 (иммунотоксин), катумаксомаб (биспецифическое антитело EpCAM/CD3), против IL2R: даклизумаб, против IGF-1R: ганитумаб, против CTLA-4: ипилимумаб, против PD1: ниволумаб и пембролизумаб, против CD47: Weissman B6H12 и Hu5F9, Novimmune 5A3M3, INHIBRX 2A1, Frazier VxP037-01LC1 антитела, анти-Льюис Y: Hu3S193, SGN-15 (иммунотоксин), против CAl25: ореговомаб, против HGF: рилотумумаб, против IL6: силтуксимаб, против TR2: тигатузумаб, против альфа5 бета1 интегрин: волоциксимаб, против HB-EGF: KHK2866. Пептидные антитела против ангиогенеза выбраны из AMG 386 и CVX-241.
Более конкретно, в настоящей заявке описана фармацевтическая композиция, содержащая противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, в которой противораковый агент выбран из группы, содержащей доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.
Еще более конкретно, в настоящей заявке описана фармацевтическая композиция, содержащая противораковый агент и антитело, связывающее AMHR-II, в качестве активного ингредиента в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, в которой мутированное гуманизированное моноклональное антитело обозначено в настоящей заявке как 3C23K, и противораковый агент выбран из группы, содержащей доцетаксел, цисплатин, гемцитабин и комбинацию цисплатина и гемцитабина.
Связывающий AMHRII агент, описанный в настоящей заявке, и особенно антитело против AMHRII, описанное в настоящей заявке, можно вводить различными способами, которые включают пероральное введение, подкожное введение и внутривенное введение.
Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству лекарственного средства, эффективному для лечения заболевания или расстройства у млекопитающего. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер опухоли; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать (то есть замедлять до некоторой степени и предпочтительно останавливать) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; и/или ослабить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с расстройством. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или уничтожать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим. Для терапии рака эффективность in vivo можно, например, измерить путем оценки продолжительности выживания, продолжительности выживания без прогрессирования (PFS), частоты ответа (RR), продолжительности ответа и/или качества жизни.
Терапевтические составы агентов (например, антител), применяемых согласно настоящему изобретению, готовят для хранения путем смешивания антител, имеющих необходимую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных составов или водных растворов. Приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и включают буферы, такие как фосфатный, цитратный и других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ (Твин Плюроникс) или полиэтиленгликоль (ПЭГ).
Активные ингредиенты также могут быть помещены в микрокапсулы, приготовленные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилат)-микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Составы, применяемые для введения in vivo, могут быть стерильными. Этого легко достичь путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHR-II антитело, в составе, предназначенном для введения внутривенным или внутрибрюшинным путем.
В другом конкретном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHR-II антитело, причем моноклональное антитело и противораковый агент предназначены для раздельного, одновременного или последовательного введения.
Антитело и противораковый агент можно объединять в одной и той же фармацевтической композиции или можно применять в форме отдельных фармацевтических композиций, которые можно вводить одновременно или последовательно. В частности, продукты можно вводить отдельно, а именно, одновременно или независимо, например, с временным интервалом.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHR-II антитело, в которой антитело и противораковый агент объединены в одной и той же фармацевтической композиции.
Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество антитела против AMHRII, вводимого пациенту, находится в диапазоне от примерно 0,07 до примерно 35000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 до примерно 7000 мг, предпочтительно от примерно 0,7 до примерно 1400 мг, предпочтительно от примерно 0,7 до примерно 700 мг и более предпочтительно от примерно 0,7 до примерно 70 мг.
Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество противоракового агента, вводимого пациенту, находится в диапазоне от примерно 10 до примерно 700 мг, предпочтительно в диапазоне от примерно 20 до примерно 350 мг, и предпочтительно примерно 110 мг.
Согласно другому конкретному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для применения в качестве лекарственного средства для предотвращения или лечения негинекологического рака, описанного в настоящей заявке, включающей противораковый агент и связывающее AMHRII антитело, в которой терапевтически эффективное количество антитела, вводимого пациенту, составляет примерно 70 мг, и доза противоракового агента, вводимого пациенту, составляет примерно 110 мг.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано, но никоим образом не ограничивается приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Дифференциальная экспрессия гена AMHRII и экспрессия белка AMHRII
А. Материалы и способы
A.1. Клеточные линии и культуры
Клеточную линию COV434 WT (ECACC № 07071909) поддерживают в минимальной эссенциальной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM)/GlutaMax (Gibco) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС), пенициллина 100 Ед/мл и стрептомицина 100 мкг/мл. К трансфицированной клеточной линии COV434 MISRII добавляют генетицин (Gibco) в концентрации 400 мкг/мл. Клеточную линию эритролейкоз K562 (ATCC® CCL-243™) культивируют в суспензии в среде Дульбекко, модифицированной по способу Исков (IMDM) (Sigma-Aldrich) с добавлением 10 % ФБС и пенициллина/стрептомицина и поддерживают при плотности от 1 · 105 до 1 · 106 клеток/мл в колбах Т75. Клеточную линию OV90 (ATCC® CRL-11732™, серозная аденокарцинома яичника) культивируют в смеси 1:1 среды MCDB 105 (Sigma-Aldrich) с конечной концентрацией 1,5 г/л бикарбоната натрия и среды 199 (Sigma-Aldrich) с конечной концентрацией 2,2 г/л бикарбоната натрия с добавлением 15 % ФБС и пенициллина/стрептомицина. Клеточную линию NCI-H295R (адренокортикальная карцинома, ATCC® CRL-2128™) поддерживают в среде DMEM:F12 (Sigma-Aldrich), дополненной iTS и премиксом (Corning), 2,5 % сывороткой Nu-Serum (Falcon) и пенициллином/стрептомицином. Клетки выращивают при 37 °C в увлажненной атмосфере с 8 % CO2, и среду меняют один или два раза в неделю в зависимости от клеточных линий.
A.2. Относительная количественная оценка мРНК AMHR2 с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR)
Экстракция РНК. Общую РНК из осадка клеток 1-5·106 готовят с применением набора для очистки РНК Trizol® Plus (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, после экстракции фенолом/хлороформом РНК лизированных клеток адсорбируют на матрице из диоксида кремния, обрабатывают ДНКазой, затем промывают и элюируют 30 мкл воды, не содержащей РНКазу. Концентрации и качество РНК оценивают с помощью спектрофотометра (NanoDrop, ThermoFisher Scientific).
Синтез кДНК. РНК (1 мкг) подвергают обратной транскрипции с применением набора для синтеза кДНК Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Ambion) и олиго-dT праймеров путем инкубации в течение 10 минут при 25 °C для примирования и 15 минут при 50 °C для обратной транскрипции, после чего 5 минут при 85 °C для инактивации обратной транскриптазы.
Количественная ПЦР. Количественную ПЦР проводят в Light Cycler 480 (Roche) в 96-луночных микропланшетах с применением Luminaris Color HiGreen qPCR Master Mix (Ambion) в конечном объеме 20 мкл. Применяют следующие праймеры: для AMHR2, прямой 5’-TCTGGATGGCACTGGTGCTG-3’ (SEQ ID NO: 71) и обратный 5’- AGCAGGGCCAAGATGATGCT-3’ (SEQ ID NO: 72), для TBP, прямой 5’-TGCACAGGAGCCAAGAGTGAA-3’ (SEQ ID NO: 73) и обратный 5’-CACATCACAGCTCCCCACCA-3’ (SEQ ID NO: 74). Амплификации проводят с применением матрицы кДНК (100 нг эквивалентной РНК) и следующего протокола: После предварительной обработки УДГ в течение 2 мин при 50 °С, денатурации в течение 10 мин при 95 °С проводят 40 циклов по 15 с при 95 °С/30 с при 60 °С/30 с при 70 °С. Анализ кривых плавления проводят в конце каждого эксперимента для контроля отсутствия геномной ДНК и димерного праймера. Каждый образец кДНК и контроли («без образца матрицы» и «без обратной транскрипционной РНК») тестируют в двух повторах. Рассчитывают средние значения порогового цикла (Ct), и относительное количество AMHR2 (RQ) выражают как 2-ΔΔCt, где ΔΔCt=ΔCtsample-ΔCtcalibrator и ΔCt=CtAMHR2-CtTBP. Образец HCT116 применяют в качестве калибровочного стандарта, и TBP применяют в качестве «домашнего» гена для нормализации.
Таблица 2 ниже показывает уровень экспрессии AMHRII в тестируемых клеточных линиях с применением параметров метода Q-PCR, описанного выше.
Таблица 2
Клеточная линия Среднее Ct amhr2 Среднее Ct TBP RQ
HCT116 34,27 22,25 1
COV434 WT 31,34 22,82 11,3
K562 25,31 21,36 268,7
NCI-H295R 26,16 22,83 413,0
OV90 25,65 22,67 526,4
A.3. Оценка мембранной экспрессии AMHR2 методом проточной цитометрии.
Для анализа методом сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) 4 · 105 клеток инкубируют с 25 мкг/мл 3C23K в течение 30 минут при 4 °C. После промывки посредством 2 % ФСБ-БСА(бычий сывороточный альбумин растворённый в фосфатно-солевом буфере) первичное антитело детектируют с помощью конъюгированного с флуорофором антивидового вторичного антитела. 3C23K детектируют с помощью античеловеческого F(ab’)2, конъюгированного с фикоэритрином (1:1000, Beckman-Coulter, IM0550). После промывки ФБС FACS-анализ ресуспендированных клеток проводят в канале FL2 проточного цитометра BD Accuri™ C6 (BD Bioscience).
B. Результаты
Результаты изображены на фигуре 2. Результаты показывают, что рекомбинантная клеточная линия COV434-WT демонстрирует примерно 3 % от уровня экспрессии гена AMHRII, измеренного для клеточной линии NCI-H295R, хотя клеточная линия COV434-WT имеет значимый уровень мембранной экспрессии человеческого белка AMHRII.
Эти результаты показывают, что не существует строгой корреляции между экспрессией гена AMHRII и экспрессией мембранного белка AMHRII.
Пример 2: Экспрессия AMHRII при негинекологическом раке (образцы опухолей человека)
А. Материалы и способы
A.1. Задача
Иммуногистохимическое исследование ксенотрансплантатов раковых клеток человека у мышей (PDXs) для выявления наличия экспрессии рецептора антимюллерового гормона типа 2 (AMHR2) с применением биотинилированного моноклонального антитела 3C23K.
A.2. Протокол и методология
- Клеточные линии: фиксируют в формальдегиде, уксусной кислоте и спирте (AFA) с составом клеточных блоков
- Опухоли человека: фиксируют в формалине для внешних образцов и в AFA для предметных стекол из Института Кюри
- Метод иммуногистохимии (IHC) возможно выполнять после депарафинизации образцов и демаскировки при pH 9 (микроволновая печь EZ Retriever 15’ при 90 °C с последующим охлаждением в течение 20’).
- Рецептор антимюллеровых гормонов типа II детектируют методом иммунопероксидазы и выявляют хромогенный субстрат DAB (диаминобензидин).
- После блокирования активности эндогенной пероксидазы предметные стекла инкубируют с разбавленным биотинилированным первичным антителом (1/800, 8 мкг/мл) в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывают ФСБ (фосфатно-солевой буфер) и инкубируют с комплексом авидин/биотин ABC [Vector] в течение 30 минут. Иммунореактивные сигналы детектируют с применением раствора субстрата DAB (DAB + субстратный буфер/жидкость DAB + хромоген, 10 минут инкубации). Наконец, осуществляют легкое контрастное окрашивание с гематоксилином Майера (модификация Лилли).
- Отрицательные контроли получают путем замены первичных антител изотипическим контрольным иммуноглобулином (R565) или только разбавителем антител (отрицательный буферный контроль) в процедуре иммуногистохимического окрашивания.
- Положительные контроли получают с применением клеток COV434, трансфицированных AMHR2, и образцов гранулезных опухолей человека.
- После обработки срезы исследуют с применением оцифровки с помощью Philips IMS. Все образцы независимо оценивают 2 патолога.
- Уточняют локализацию мечения: цитоплазматическое и/или мембранное.
- Интенсивность классифицируют по явному коричневому мечению мембраны и/или цитоплазмы опухолевых клеток с применением следующей системы оценки: интенсивность мечения определяют как 0 для отрицательного, 1 для слабого, 2 для умеренного и 3 для сильного мечения, как показано для положительного контроля COV434.
- Частоту определяют как процент клеток, экспрессирующих AMHRII. Участки некроза исключают из анализа. Общую гистологическую оценку устанавливают с применением частоты, умноженной на среднюю оценку интенсивности (от 0 до 3) кумулирования мембранной и цитоплазматической экспрессии.
- Все предметные стекла хранят надлежащим образом.
В. Результаты
Результаты мембранной экспрессии AMHRII различными первичными раковыми клетками человека также представлены на фигуре 3, где показатель экспрессии AMHRII представлен для панели различных типов раковых клеток.
Результаты изображены на фигуре 3. Результаты показывают, что AMHRII экспрессируется на поверхности клеток при множестве различных негинекологических раковых заболеваний человека, включая рак толстой кишки, рак печени, рак яичка, рак щитовидной железы, рак желудка, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы и рак головы и шеи.
Пример 3: Экспрессия AMHRII при негинекологическом раке (ксенотрансплантаты опухолей человека)
А. Материалы и способы
A.1. Задача
Иммуногистохимическое исследование ксенотрансплантатов раковых клеток человека у мышей (PDXs) для выявления экспрессии рецептора антимюллерового гормона типа 2 (AMHR2) с применением биотинилированного моноклонального антитела 3C23K.
A.2. Протокол и методология
- Клеточные линии: фиксируют в формальдегиде, уксусной кислоте и спирте (AFA) с составом клеточных блоков
- Опухоли человека: фиксируют в формалине для внешних образцов и в AFA для предметных стекол из Института Кюри
- Метод иммуногистохимии (IHC) возможно выполнять после депарафинизации образцов и демаскировки при pH 9 (микроволновая печь EZ Retriever 15’при 90 °C с последующим охлаждением в течение 20’).
- Рецептор антимюллеровых гормонов типа II детектируют методом иммунопероксидазы и выявляют хромогенный субстрат DAB.
- После блокирования активности эндогенной пероксидазы предметные стекла инкубируют с разбавленным биотинилированным первичным антителом (1/800, 8 мкг/мл) в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем срезы ткани промывают ФБС и инкубируют с комплексом авидин/биотин ABC [Vector] в течение 30 минут. Иммунореактивные сигналы детектируют с применением раствора субстрата DAB (DAB + субстратный буфер/жидкость DAB + хромоген, 10 минут инкубации). Наконец, осуществляют легкое контрастное окрашивание с гематоксилином Майера (модификация Лилли).
- Отрицательные контроли получают путем замены первичных антител изотипическим контрольным иммуноглобулином (R565) или только разбавителем антител (отрицательный буферный контроль) в процедуре иммуногистохимического окрашивания.
- Положительные контроли получают с применением клеток COV434, трансфицированных AMHR2, и образцов гранулезных опухолей человека.
- После обработки срезы исследуют с применением оцифровки с помощью Philips IMS. Все образцы независимо оценивают 2 патолога.
- Уточняют локализацию мечения: цитоплазматическое и/или мембранное.
- Интенсивность классифицируют по явному коричневому мечению мембраны и/или цитоплазмы опухолевых клеток с применением следующей системы подсчета: интенсивность маркировки определяют как 0 для отрицательного, 1 для слабого, 2 для умеренного и 3 для сильного мечения, как показано для положительного контроля COV434.
- Частоту определяют как процент клеток, экспрессирующих AMHRII. Участки некроза исключают из анализа. Общую гистологическую оценку устанавливают с применением частоты, умноженной на среднюю оценку интенсивности (от 0 до 3) кумулирования мембранной и цитоплазматической экспрессии.
- Все предметные стекла хранят надлежащим образом.
B. Результаты
a) Контроли
- Отрицательный контроль и изотипический контроль не проявляют реактивности на опухолевых клетках.
- Образец положительного контроля (амплифицированный COV434 AMHRII) демонстрирует диффузное иммуноокрашивание клеток (показатель интенсивности: 3). Мечение является однородным (показатель частоты: 100 %) при цитоплазматической и мембранной локализации.
- Образец гранулезной ткани в качестве положительного контроля демонстрирует сильное иммуноокрашивание опухолевых клеток (оценка интенсивности 3). Мечение является однородным (показатель частоты: 100 %) при цитоплазматической и мембранной локализации.
b) Скрининг образцов ксенотрансплантата, полученных от пациента (PDX).
Важно отметить, что мембранная экспрессия AMHR2, по-видимому, занижена, когда образцы фиксируют в формалине по сравнению с образцами, обработанными в AFA.
Результаты мембранной экспрессии AMHRII различными опухолями человека, ксенотрансплантированными мышам, представлены на фигуре 4, где показатель экспрессии AMHRII представлен для панели различных типов раковых клеток.
Часть результатов экспрессии AMHRII опухолевыми ксенотрансплантатами человека приведена в таблице 3 ниже.
Таблица 3: Экспрессия AMHRII в ксенотрансплантатах опухоли человека
Тип опухоли Позитивность в опухолях (процент позитивности PDX) Количество протестированных PDX
Толстый кишечник 35 % 6
Печень 44 % 3
Почка 84 % 13
с) Выводы
Экспрессия белка AMHR2 была подтверждена для 4 из 6 моделей PDX с положительной транскрипцией AMHR2. Эти PDX были адаптированы от рака глиомы (ODA14-RAV) и толстой кишки (TC306-BAU). Уровни экспрессии были умеренными, но значительными, характеризующимися общей оценкой от 1 до 1,5. Эти данные свидетельствуют о том, что рак, отличный от гинекологического, может экспрессировать AMHR2.
Эти модели можно применять для характеристики терапии против AMHR2 в будущем.
Пример 4: Эффективность антител против AMHRII in vivo против негинекологического рака, экспрессирующего AMHRII
А. Материалы и способы
A.1. Сокращения
Часто используемые сокращения в данном протоколе представлены в таблицах 4 и 5.
Таблица 4. Сокращения, связанные с дозированием
Схема дозирования
Bid Дважды в сутки
Qd Один раз в сутки
Q2d Через день (а также один раз в два дня)
Q3d Один раз в три дня (один день дозирования и 2 дня перерыва)
Q4d Один раз в четыре дня (один день дозирования и 3 дня перерыва)
BIW Дважды в неделю
QW Один раз в неделю
Q3W Один раз в три недели
Путь введения (ROA)
и.п. внутрибрюшинный (но)
в.в. внвутривенный (но)
п.о. пероральный (но)
п.к. подкожный (но)
Таблица 5. Другие общие сокращения, используемые в данном примере
Сокращения Полное название и описание
ANOVA Дисперсионный анализ
BW Масса тела
BWL Потеря массы тела
GLP Надлежащая лабораторная практика
MTD Максимальная переносимая доза
MTV Средний объем опухоли
TV Объем опухоли
TGI Ингибирование роста опухоли, % TGI = (1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100; Ti представляет собой средний объем опухоли в группе лечения в день измерения; T0 представляет собой средний объем опухоли в группе лечения в D1; Vi представляет собой средний объем опухоли контрольной группы в день измерения; V0 представляет собой объем опухоли контрольной группы в D1.
T-C При расчёте T-C, T представляет собой время (в днях), требуемое для опухоли среднего размера в группе лечения для достижения предварительно определенного размера (например, 1000 мм3), а C представляет собой время (в днях) для опухоли среднего размера в контрольной группе, чтобы достичь того же размера.
T/C Значение T/C (%) является показателем ответа опухоли на лечение и одной из обычно используемых конечных точек противоопухолевой активности; Т и С представляют собой средний объем опухоли группы лечения и контроля, соответственно, в данный день.
REG Величины REG (%) рассчитывают с применением формулы: % REG = [(VTrдень0 - VTrденьx)/VTrдень0]×100 %.
SOC Стандарт медицинской помощи, используемый в условиях клиники для конкретного заболевания
FFPE Фиксированный формалином погруженный в парафин
A.2. Задача исследования
Провести доклиническую оценку in vivo эффективности моноклонального антитела против AMHR2 GamaMabs, называемого GM102, при лечении Huprime® HCC ксенотрансплантата модели LI1097 у голых мышей Balb/C. Модель LI1097 была выбрана после скрининга на наличие транскрипции AMHR2, проведенного CrownBio, с применением RNAseq (секвенирование транскриптома). Кроме того, экспрессия мембранного белка AMHR2 этой модели была подтверждена институтом Кюри, Франция, с применением IHC.
A.3. План эксперимента
Таблица 6. План исследования эффективности
Группа N Обработка Уровень дозы (мг/кг) Путь введения дозы Частота дозирования
1 8 Носитель (контроль сольвент) - в.в. BIW x 4 недели
2 8 Ab от GamaMabs 20 мг/кг в.в. BIW x 4 недели
3 8 Ab от GamaMabs 50 мг/кг в.в. BIW x 4 недели
4 8 Сорафениб 50 мг/кг п.о. QD x 4 недели
Примечание: N: количество животных в группе;
A.4. Животные
- Вид: BALB/c Nude (голые)
- Возраст: 7-8 недель (начало обработки)
- Пол: женский
- Итого #: 32 мыши плюс резерв
A.5. Размещение животных
Мышей размещают в индивидуальных вентилируемых клетках (4 на клетку) при следующих условиях:
- Температура: от 20 до 26 °C
- Влажность от 30 до 70 %
- Режим освещения: 12 часов при освещении и 12 часов в темноте
- Полисульфоновые клетки размером 325 мм × 210 мм × 180 мм
- Материал подстилки представляет собой початки кукурузы, и замену производят ежедневно
- Питание: Животные имеют свободный доступ к сухой гранулированной пище, стерилизованной излучением, в течение всего периода проведения исследования.
- Вода: Животные имеют свободный доступ к стерильной питьевой воде.
- Идентификационная этикетка на клетке: количество животных, пол, вид, дата получения, обработка, номер исследования, номер группы и дата начала обработки
- Идентификация животных: Животных маркируют с помощью ярлыка на ухе.
A.6. Профиль модели HuPrime®
Для данного исследования выбрали модель HuPrime® рака печени LI1097, полученную от HCC пациента мужского пола. Данная модель достигает 1000 мм3 за 20-25 дней после инокуляции.
A.7. Тестируемые продукты и положительный контроль
Идентификация продукта: Ab от GamaMabs (3C23K)
Производитель: GamaMabs Pharma
Номер лота: R18H2-LP01
Партия: 04GAM140513API
Необходимое количество: 255 мг на основании BW животного, составляющей 25 г, с 50 % резервом
Упаковка и условия хранения: [30мл/туба], 30мл, [2-8 °C]
Концентрация: 10,1 г/л
Идентификация продукта: Сорафениб
Производитель: Melonepharma
Номер лота: D1111A
Необходимое количество: 300 мг на основании BW животного, составляющей 25 г, с 50 % резервом
Упаковка и условия хранения: 400мг, [RT]
A.8. Экспериментальные способы и процедуры
A.8.1. Инокуляция опухоли и распределение групп
Фрагменты опухоли от исходных мышей, инокулированных отобранными первичными тканями рака человека, собирают и применяют для инокуляции голых мышей BALB/c. Каждую мышь подкожно инокулируют в правый бок фрагментом первичной HCC модели LI1097 человека (R12P4, диаметром 2-4 мм) для развития опухоли, 9 июня 2015 года. Родительской мыши присваивают номер # 80150, # 80151 и # 80153. Мышей делят на группы, когда средний размер опухоли достигает приблизительно 145 мм3 24 июня 2015 года. Мышей распределяют случайным образом на 4 экспериментальные группы в соответствии с размерами их опухоли. Каждая группа состоит из 8 мышей, по 4 мыши на клетку. Данный день обозначают как день 0. Тестируемые продукты вводят мышам с опухолями с 0 дня (24 июня 2015 г.) до 27 дня (21 июля 2015 г.) в соответствии с заранее определенной схемой, показанной в разделе 1.1 «План эксперимента».
A.8.2. Прекращение режима дозирования
Когда потеря массы тела отдельной мыши составляет более или равную 20 %, мышам обеспечивают отдых от лекарственного средства до тех пор, пока их масса тела не восстановится до исходного уровня. В этом исследовании ни одно дозирование не было остановлено.
A.8.3. Наблюдения
Все процедуры, связанные с обращением, уходом и обработкой животных в этом исследовании, выполняют в соответствии с инструкциями, одобренными Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) CrownBio, согласно указаниям Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC). Во время обычного мониторинга животных проверяют на любое действие роста опухоли на нормальное поведение, такое как подвижность, потребление пищи и воды (только визуально), увеличение/потерю массы тела, матирование глаз/волос и любое другое аномальное действие. Смерть и наблюдаемые клинические признаки регистрируют на основе количества животных в каждой подгруппе.
A.8.4. Измерения опухоли и конечные точки
Размер опухоли измеряют два раза в неделю в двух измерениях с использованием штангенциркуля, а объем выражают в мм3 по формуле: TV = 0,5 a × b2, где a и b представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Размер опухоли затем применяют для расчета значений TGI, T/C и T-C в соответствии с описанием в таблице 2 в сокращениях.
A.8.5. Окончание
Исследование заканчивают после 28 дней лечения, и мышей умерщвлялют.
При следующих условиях прижизненный эксперимент с отдельными животными или целыми группами прекращают гуманной эвтаназией, перед смертью или перед достижением коматозного состояния.
- В продолжающемся ухудшающемся состоянии с тяжелыми клиническими признаками сильного дистресса и/или боли достаточное питание или вода являются недоступными;
- значительная масса тела (истощенная) (больше 20%);
- отдельная мышь с размером опухоли более 3000 мм3 или MTV более 2000 мм3.
A.8.6. Статистический анализ
Сводная статистика, включая среднее значение и стандартную ошибку среднего (SEM), предоставлена для объема опухоли каждой группы в каждый момент времени. Статистический анализ различий в объеме опухоли между группами оценивают с применением одностороннего ANOVA с последующими многократными сравнениями с применением критерия Геймса-Хауэлла. Все данные анализируют с применением SPSS 16.0. P менее 0,05 считают статистически значимым.
B. Результаты
B.1. Массы тела
Измеряют результаты взвешивания и изменения массы тела у мышей с опухолями. Все мыши прошли курс обработки без отдыха от лекарственного средства. У мышей, получавших лечение посредством AB от GamaMabs, гибели животных или значительной потери массы тела не наблюдалось, но у мышей, получавших лечение сорафенибом, потеря массы тела составляет 7 %.
B.2. Объемы опухоли
Размеры опухолей разных групп в разные моменты времени представлены в таблице 7.
Таблица 7. Размеры опухолей в различных группах обработки
Дни Объем опухоли (мм3)
Носитель,
BIW x 2 недели 		Ab от GamaMabs, 20 мг/кг, BIW x 4 недели Ab от GamaMabs, 50 мг/кг, BIW x 4 недели Сорафениб,
50 мг/кг, QD x 4 недели
0 145,08±17,70 145,15±16,79 145,24±16,38 145,18±16,97
2 439,23±54,14 358,57±51,86 297,78±46,32 321,35±45,66
6 937,83±99,91 665,09±85,00 532,71±104,17 493,84±65,13
9 1556,55±248,13 952,12±171,45 751,81±176,15 695,20±66,81
13 2269,46±356,55 1179,90±232,26 1117,12±302,85 891,50±103,33
16 1479,51±292,49 1476,74±407,93 1135,40±133,62
20 1973,13±372,07 1602,61±481,85 1478,84±189,62
23 1814,59±231,17 1148,22±381,49 1627,4±202,91
27 2081,67±213,28 1454,47±479,27 1829,66±256,4
Примечание: данные выражены как среднее ± СОС
B.2. Ингибирование роста опухоли
Ингибирование роста опухоли обобщено в таблице 8.
Таблица 8. Противоопухолевая активность лечения посредством тестируемого соединения Ab от GamaMabs и сорафениба в модели HuPrime® ксенотрансплантата печени LI1097
Лечение Размер опухоли (мм3)
День 0		 Размер опухоли (мм3)
День 13		 TGI (%) T/C (%) T-C (дни) при 1000 мм3 P величинаb
G1 Носитель, 145,08±17,70 2269,46±356,55 - - - -
G2 Ab от GamaMabs, 20 мг/кг 145,15±16,79 1179,90±232,26 51,3% 48,7% 3 0,100
G3 Ab от GamaMabs, 50 мг/кг 145,24±16,38 1117,12±302,85 54,3% 45,7% 5 0,111
G4 Сорафениб, 50 мг/кг 145,18±16,97 891,50±103,33 64,9% 35,1% 8 0,024*
Примечание: a. Среднее ± СОС
b. По сравнению с носителем посредством множественных сравнений с применением критерия Геймса-Хауэлла.
*P менее 0,05, по сравнению с носителем G1.
B.3. Кривые роста опухоли
Кривые роста опухоли различных групп представлены на фигуре 5.
На фигуре 5 представлены объемы опухолей мышей в разных группах во время обработки тестируемым соединением Ab от GamaMabs и Сорафенибом в модели HuPrime® ксенотрансплантата печени LI1097.
B.4. Обобщенные результаты и обсуждение
В данном исследовании эффективность тестируемого соединения Ab от GamaMabs и лекарственного средства для положительного контроля сорафениб оценивают при обработке модели Huprime® ксенотрансплантата HCC LI1097 у самок голых мышей BALB/C.
В группе 1 (носитель, BIW x 2 недели, в.в.), группе 2 (Ab GamaMabs 20 мг/кг, BIW x 4 недели, в.в.), группе 3 (Ab 50 мг/кг GamaMabs, BIW x 4 недели, в.в.) и в группе 4 (сорафениб, 50 мг/кг, QD x 4 недели, п.о.) изменение массы тела в конце исследования составило 0,67 %, 2,68 %, минус 0,38 % и минус 7,63 % соответственно. Тестируемое соединение Ab от GamaMabs в дозах 20 мг/кг и 50 мг/кг имеет хорошую переносимость у мышей с опухолями LI1097. У мышей в группе, получавшей сорафениб 50 мг/кг, средняя максимальная потеря массы тела составляет 7,63 % на 27 день обработки.
Средний размер опухоли у мышей, получавших носитель, достигает 2269,46 мм3 на 13 день. Группа 2 (Ab от GamaMabs, 20мг/кг) и группа 3 (Ab от GamaMabs, 50 мг/кг) демонстрирует 50 % противоопухолевый ответ по сравнению с обработкой носителем с TGI 51,3 % и 54,3 % (P равно 0,100 и 0,111), соответственно. Группа 4 (сорафениб, 50 мг/кг) продемонстрировала значительную противоопухолевую активность с TGI 64,9 % на 13 день обработки (P равно 0,024). Результаты размеров опухолей в разных группах в разные моменты времени после лечения, представленные в таблице 8 и на фигуре 5, показывают, что ответы на лечение в группах 2 и 3 (AB от GamaMabs, 20 и 50 мг/кг, соответственно) сохраняются, как и в случае сорафениба, не менее 27 дней. Однако ответы опухолей в группах 2 и 3, вероятно, слишком неоднородны для получения лучшей статистической значимости.
Таким образом, в этом исследовании тестируемое соединение Ab от GamaMabs проявило противоопухолевую активность против первичной модели HuPrime® ксенотрансплантата HCC LI1097, близкую к активности, индуцированной сорафенибом, который является стандартом лечения данной патологии. Более того, противоопухолевая активность GM102 не сопровождалась какими-либо токсическими явлениями, в то время как лечение сорафенибом вызывало до 7 % средней потери массы тела.
Пример 5: Эффективность иммуноконъюгатов против AMHRII in vivo против негинекологического рака, экспрессирующего AMHRII
А. Материалы и способы
A.1. Сокращения
Используемые общие сокращения в данном примере являются аналогичными приведенным в таблице 3 и таблице 4 примера 4.
A.2. Задача
Провести доклиническую оценку эффективности GamaMabs соединения GM103 in vivo в обработке PDX модели LI1097 у голых мышей BALB/c женского пола.
A.3. Дизайн эксперимента
Таблица 9. План исследования эффективности
Группа N Лечение Уровень дозирования (мг/кг) Объем дозирования (мг/кг) Путь Схема
1 8 Носитель - 10 в.в. Одна единичная доза
2 8 GM103 1 10 в.в. Одна единичная доза
3 8 GM103 5 10 в.в. Одна единичная доза
4 8 GM103 10 10 в.в. Одна единичная доза
Примечание: N: количество животных в группе
A.4. Материалы
A.4.1. Животные
- Вид: голые мыши BALB/c
- Возраст: 6-8 недель
- Пол: Женский
- Итого #: 32 мыши плюс резерв
A.4.2. Размещение животных
Мышей размещают в индивидуальных вентилируемых клетках (4-5 на клетку) при следующих условиях:
- Температура: от 20 до 26 ºC
- Влажность от 30до 70 %
- Режим освещения: 12 часов при освещении и 12 часов в темноте
- Полисульфоновые клетки размером 325 мм × 210 мм× 180 мм
- Материал подстилки представляет собой початки кукурузы и замену производят ежедневно
- Питание: Животные имеют свободный доступ к сухой гранулированной пище, стерилизованной излучением, в течение всего периода проведения исследования.
- Вода: животные имеют свободный доступ к стерильной питьевой воде.
Идентификационная этикетка на клетке: количество животных, пол, вид, дата получения, обработка, идентификационный номер проекта, номер группы, идентификационный номер животного и дата начала обработки
- Идентификация животных: Животных маркируют с помощью ярлыка на ухе.
A.4.3. Информация о модели
Для данного исследования эффективности выбрали модель HuPrime® ксенотрансплантата рака печени LI1097.
A.4.4. Тестируемые продукты и контроль
Идентификация продукта: GM103
Производитель: GamaMabs Pharma
Физическое описание: раствор
Номер партии: GAM100-NC005-4
Необходимое количество: 4,48 мг на основании BW животного, составляющей 25 г с 40 % резервом
Упаковка и условия хранения: 4,3 мг/1,3 мл/флакон, хранили при 4 °C.
A.5. Экспериментальные способы
A.5.1. Инокуляция опухоли
Каждую мышь подкожно инокулируют в правый бок фрагментом первичной модели ксенотрансплантата рака печени человека LI1097 (диаметром 2-3 мм) для развития опухоли.
A.5.2. Распределение по группам
Когда средний размер опухоли достигает приблизительно 200 мм3, мышей случайным образом распределяют на 4 группы, показанные в таблице 3. Каждая группа состоит из 8 мышей.
A.5.3. Подготовка дозирующего раствора тестируемого продукта
Тип объема: Объем дозирования регулируют по массе тела (объем дозирования равен 10 мкл/г)
Таблица 10. Подробные инструкции по приготовлению и хранению
Соединения Доза (мг/кг) Препарат Концентрация (мг/мл) Хранение
GM103 (1) 1 0,073 мл исходного раствора GM103 (3,308 мг/мл) разводят 2,372 мл физиологического раствора или ФCБ?. 0,1 Свежеприготовленный
GM103 (2) 5 0,363 мл исходного раствора GM103 (3,308 мг/мл) разводят 2,037 мл физиологического раствора или ФCБ?. 0,5 Свежеприготовленный
GM103 (3) 10 0,726 мл исходного раствора GM103 (3,308 мг/мл) разводят 1,674 мл физиологического раствора или ФCБ?. 1 Свежеприготовленный
A.5.4. Наблюдения
После инокуляции опухоли животных ежедневно проверяют на заболеваемость и смертность. Во время обычного мониторинга животных проверяют на любое действие, которое рост опухоли и обработка оказывают на нормальное поведение, такое как подвижность, потребление пищи и воды, увеличение/потерю массы тела, матирование глаз/шерсти и любое другое аномальное действие. Смерть и наблюдаемые клинические признаки регистрируют на основе количества животных в каждой подгруппе.
Размер опухоли измеряют штангенциркулем два раза в неделю в двух измерениях. Объем опухоли выражают в мм3 по формуле: TV = 0,5 a × b2, где a и b представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли, соответственно.
Массу тела измеряют два раза в неделю.
A.5.5. Конечные точки
Следующий анализ применяют в конечной точке: TGI (индекс роста опухоли) и TC.
A.5.6. Окончание
При следующих условиях прижизненный эксперимент с отдельными животными или целой группой прекращают гуманной эвтаназией, перед смертью или перед достижением коматозного состояния.
- В продолжающемся ухудшающемся состоянии с тяжелыми клиническими признаками сильного дистресса и/или боли достаточное питание или вода являются недоступными;
- Значительная потеря массы тела (истощение) (больше 20 %);
- Отдельная мышь с размером опухоли более 3000 мм3 или целая группа мышей с MTV более 2000 мм3.
A.5.7. Статистический анализ
Для сравнения среди трех или более групп проводят односторонний ANOVA с последующими процедурами множественных сравнений. Все данные анализируют с применением SPSS 16.0. P менее 0,05 считают статистически значимым.
A.6. Соблюдение режима лечения
Протокол и любая поправка(и) или процедуры, касающиеся ухода и применения животных в этом исследовании, рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) CrownBio до проведения. Во время исследования уход и использование животных осуществляют в соответствии с положениями Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAALAC).
B. Результаты
Результаты на фигуре 6 продемонстрировали противораковую активность иммуноконъюгата GM103 ADC in vivo в дозе 5 мг/кг или более.
Пример 6: Экспрессия AMHRII в других видах негинекологического рака
А. Материалы и способы
A.1. Анализ мембранной экспрессии AMHRII с помощью поточной цитометрии
Подготовка клеток для анализа
- Ткани рассекают в течение 1 ч после операции, измельчают на фрагменты размером 1 мм2 и промывают в RPMI, содержащей пенициллин (10 %), стрептомицин (10 %) и гентамицин (0,1 мг/мл; Sigma-Aldrich).
- Фрагменты ткани расщепляют коллагеназой и ДНКазой (2 мг/мл; Sigma-Aldrich) в течение 2-4 ч с быстрым встряхиванием при 37 °С.
- Слизь и крупные остатки удаляют фильтрацией через 40-мкм сито для клеток.
- Жизнеспособные клетки получают центрифугированием в градиенте Фиколла.
Количественное определение сайтов связывания AMHRII на ресуспендированных опухолевых клетках проводят с применением The QuantumTM Simply Cellular (Bangs Laboratory) в соответствии с инструкциями производителя:
- Вкратце, четыре популяции микрогранул, меченных различным калиброванным количеством мышиного анти-человеческого IgG, специфичного для Fc-части человеческих IgG-антител, окрашивают конъюгированным с AlexaFluor488 3C23K против AMHRII. В пробирках FACS одну каплю из каждого флакона в наборе добавляют к 50 мкл ФCБ 1X:
1 - гранулы B (холостой)
2 - гранулы 1 + 3C23K-AF 10 мкг/мл
3 - гранулы 2 + 3C23K-AF 10 мкг/мл
4 - гранулы 3 + 3C23K-AF 10 мкг/мл
5 - гранулы 4 + 3C23K-AF 10 мкг/мл (концентрацию следует увеличить до 25 мкг/мл, если необходимо)
- Каждая популяция гранул связывает различные количества конъюгированного с AlexaFluor488 3C23K против AMHRII, обеспечивая соответствующую интенсивность флуоресценции, которую анализируют на цитометре FACS Canto II (BD).
- Калибровочную кривую получают путем построения графика зависимости средней интенсивности флуоресценции каждой популяции гранул от ее определенной способности связывания антител (ABC).
Клетки обычно окрашивают в пробирках Эппендорфа объемом 1,5 мл.
- Все стадии центрифугирования осуществляют при 4 °C.
- Все стадии инкубации осуществляют при 4 °C, чтобы избежать интернализации антител.
- 3,5 миллиона клеток (трипсинизированные COV434-MISRII или недавно диссоциированные опухолевые клетки) центрифугируют при 200-300 g в течение 5 минут и один раз промывают ФСС (500 мкл на пробирку)
- Промывают охлажденным на льду ФСС/2 % ФБС (200-300g в течение 3 минут) и ресуспендируют в 700 мкл ФСС 1X и 100 мкл распределяют в пробирке FACS для условий, описанных в таблице 11 ниже:
Таблица 11
COV434-MISRII Свежие опухолевые клетки
Без антител
R565-AF (изотипический контроль) 10 мкг/мл
3C23K-AF 1 нг/мл
3C23K-AF 10 нг/мл
3C23K-AF 100 нг/мл
3C23K-AF 1 нг/мл
3C23K-AF 10 мкг/мл (и до 25 мкг/мл при необходимости)
- Инкубируют с антителом 3C23K-AF488 в ФCБ/1 % ФБС в течение 30 минут при 4 °C
- Промывают в ФCБ/2% БСА два раза (200-300 g в течение 3 минут)
- Промывают в ФCБ два раза (200-300 g в течение 3 минут)
- Добавляют 300-400 мкл ФСБ и проводят анализ на FACS как можно скорее
Этот протокол не содержит какой-либо стадии фиксации для внеклеточного окрашивания для поддержания целостности мембраны. Следовательно, обнаруживают только мембранный AMHRII.
A.2. Мембранная экспрессия AMHRII с помощью иммунофлуоресценции
Таким образом, был разработан метод непрямой иммунофлуоресценции с антителом 3C23K против AMHRII, конъюгированным с Alexa Fluor® 488. Амплификацию сигнала проводят в две стадии с антителом против AF488 кролика и с анти-кроличьим антителом козы, конъюгированным с Alexa Fluor® 647.
Замороженные срезы тканей получают с помощью криостата Leica CMD1950, выдерживают при минус 20 °C. Замороженные ткани закрепляют на металлическом диске с помощью реактива ОКТ, и после отверждения их закрепляют на держателе диска. Готовят срезы 7 мкм и помещают на предметные стекла Superfrost Plus (Menzel Gläser), и немедленно помещают на хранение при минус 20 °C.
Замороженные предметные стекла со срезами повторно гидратируют с помощью ФСБ 1X, и затем фиксируют 10 минут при минус 20 °C, покрывая их 300 мкл холодного ацетона (VWR Prolabo), и повторно покрывают парафильмом, чтобы гарантировать, что вся ткань полностью покрыта раствором. После промывания ФСБ предметные стекла обрабатывают 300 мкл блокирующего буфера (ФСБ1X-БСА2 % -козья сыворотка 10 % -Triton X100 0,1 %) 1 час в увлажненном боксе при комнатной температуре для блокирования неспецифических взаимодействий между антителами и тканевыми компонентами. 3C23K-AF488 или контроль изотипа R565-AF488, разведенный в концентрации 10 мкг/мл в блокирующем буфере, применяют в течение 30 минут при комнатной температуре в увлажненном боксе. После 3 промывок посредством 0,1 % ФСБ1X-Triton X100 (3 раза по 10 мин) добавляют антитело против AF488 (Invitrogen), разведенное в 1/500 в блокирующем буфере (300 мкл), в течение 30 мин инкубации при комнатной температуре. После 3 промывок посредством 0,1 % ФСБ1X-Triton X100 (3 раза по 10 мин) добавляют конъюгированное анти-кроличье антитело AF647 (Invitrogen), разведенное в 1/500 в блокирующем буфере (300 мкл), в течение 30 мин инкубации при комнатной температуре. Промывают (3 раза по 10 мин) посредством 0,1 % ФСБ1X-Triton X100, затем применяют DAPI (Sigma-Aldrich) при 0,5 мкг/мл в течение 10 мин. После окончания действий с ФСБ и H2O предметные стекла со срезами закрепляют под покровными стеклами (24 × 50 мм, Knittel Glass) с применением капли (50 мкл) флуоресцентной фиксирующей среды DAKO, избегая пузырьков воздуха, и хранят при 4 °C в темноте до получения изображений.
Изображения получают с применением флуоресцентного микроскопа Leica DM5000B, оборудованного CCD-камерой CoolSnap EZ, управляемой программным обеспечением Metavue (Molecular Devices). Последующую обработку изображений осуществляют с помощью программного обеспечения ImageJ free software (http://imagej.nih.gov/ij/).
B. Результаты
B.1. Экспрессия AMHRII в свежих образцах колоректального рака человека
Анализ FACS мембранной экспрессии AMHRII в образцах опухолей, предварительно собранных у четырех пациентов, пораженных колоректальной карциномой, изображен на фигурах 7А, 7В, 7С и 7D. Результаты показывают, что опухолевые клетки (CD3-Epcam+), содержащиеся в образцах опухоли, экспрессируют AMHRII на своей мембране.
Результаты образцов опухолей, предварительно собранных у 20 отдельных пациентов, пораженных колоректальной карциномой, представлены в таблице 12.
В таблице 12 экспрессию AMHRII оценивают в каждом образце опухоли путем (i) определения среднего количества белков AMHRII, присутствующих на мембране опухолевых клеток, и (ii) определения процента мембранных AMHRII-положительных клеток в образце опухоли. В левом столбце таблицы 12 указано, является ли соответствующий образец опухоли положительным или отрицательным. Указание «положительный» означает, что AMHRII в значительной степени экспрессируется на мембране опухолевых клеток. Указание «отрицательный» означает, что экспрессия AMHRII на клеточной мембране достоверно не обнаружена.
Результаты таблицы 12 показывают, что 15 из 20 образцов опухолей экспрессировали мембранный AMHRII, хотя и с различными уровнями экспрессии.
В зависимости от образцов опухоли среднее количество мембранных белков AMHRII на опухолевую клетку (называемое «количество рецепторов на клетку (опухоль)» в таблице 12) варьировалось от 540 до более чем 155 000.
В зависимости от образцов опухоли частота клеток, экспрессирующих мембранный белок AMHRII (в таблице 12 называемый «Процент AMHRII-положительных клеток (Epcam+)»), варьировалась от 20до 100 %.
Результаты в таблице 12 не продемонстрировали корреляции между средним количеством мембранного AMHRII на опухолевую клетку и частотой опухолевых клеток, экспрессирующих мембранный AMHRII.
B.2. Экспрессия AMHRII в ксенотрансплантатах колоректальной опухоли человека (ксенотрансплантаты, полученные от пациента)
Образцы ксенотрансплантатов опухоли человека получают, как описано в примере 3, и экспрессию AMHRII опухолевыми клетками оценивают с применением способов, описанных в разделе «Материалы и способы».
Анализ FACS мембранной экспрессии AMHRII в образцах опухолей, предварительно собранных у четырех отдельных пациентов, страдающих от колоректальной карциномы, а затем ксенотрансплантированных мышам, изображен на фигурах 8А, 8В, 8С и 8D. Результаты показывают, что опухолевые клетки (CD3-Epcam+), содержащиеся в ксенотрансплантированных образцах опухоли, экспрессируют AMHRII на своей мембране.
Результаты образцов опухолей, предварительно собранных у 12 отдельных пациентов, страдающих от колоректальной карциномы, и атем ксенотрансплантированных мышам, представлены в таблице 13.
В таблице 13 экспрессию AMHRII оценивают в каждом образце ксенотрансплантата опухоли путем (i) определения среднего количества белков AMHRII, присутствующих на мембране опухолевых клеток, и (ii) определения процента мембранных AMHRII-положительных клеток в образце ксенотрансплантата опухоли.
Результаты таблицы 13 показывают, что 6 из 12 образцов ксенотрансплантата опухолей экспрессируют мембранный AMHRII, хотя и с различными уровнями экспрессии.
В зависимости от образцов ксенотрансплантата опухоли среднее количество мембранных белков AMHRII на клетку (называемое «количество рецепторов на клетку (Epcam+)» в таблице 13) варьировалось от 16000 до примерно 100000.
В зависимости от образцов опухоли частота клеток, экспрессирующих мембранный белок AMHRII (в таблице 13 называемый «Процент AMHRII-положительных клеток (Epcam+)»), варьировалась от 0,5 до 87 %.
Результаты в таблице 13 не продемонстрировали четкой корреляции между средним количеством мембранного AMHRII на опухолевую клетку и частотой опухолевых клеток, экспрессирующих мембранный AMHRII.
В левом столбце таблицы 13 указано, является ли соответствующий образец опухоли «положительным» или «отрицательным». Указание «положительный» означает, что AMHRII в незначительной степени экспрессируется на мембране опухолевых клеток. Обозначение «отрицательный» означает, что экспрессия мембраны AMHRII опухолевыми клетками не детектируется в значительной степени.
B.3. Мембранная экспрессия AMHRII в свежих образцах почечно-клеточной карциномы
Образцы опухолей почечно-клеточной карциномы человека получают способами, описанными в разделе «Материалы и способы», и мембранную экспрессию AMHRII опухолевыми клетками (EpCam+) оценивают с помощью анализа FACS.
Результаты изображены на фигурах 9А и 9В.
Анализ FACS мембранной экспрессии AMHRII в образцах опухолей, предварительно собранных у двух отдельных пациентов, пораженных почечно-клеточной карциномой, изображен на фигурах 9А и 9В. Результаты показывают, что опухолевые клетки (CD3-Epcam+), содержащиеся в образцах опухоли почечно-клеточной карциномы, экспрессируют AMHRII на своей мембране.
Пример 7: Эффективность антител против AMHRII in vivo против негинекологического рака, экспрессирующего AMHRII
А. Материалы и способы
Исходным мышам (Athymic Nude-Foxn1nu от Envigo) имплантируют фрагменты опухоли от Champions TumorGraft® модели CTG-0401. После достижения опухолями 1000-1500 мм3, их собирают, и фрагменты опухоли имплантируют подкожно в левый бок самок исследуемых мышей. Каждому животному имплантируют партию определенного пассажа: пассаж 6 для CTG-0401. Рост опухоли контролируют два раза в неделю с применением цифровых штангенциркулей, а объем опухоли (TV) рассчитывают по формуле (0,52 × [длина × ширина2]). После достижения объема опухоли 175 ± 7 мм3, мышей отбирают по размеру опухоли и случайным образом распределяют по 4 группам по 12 животных в группе (день 0). После начала дозирования в день 0 животных взвешивают два раза в неделю с применением цифровой шкалы, и TV измеряют два раза в неделю, а также в последний день исследования. Исследование прекращают, когда средний объем опухоли в контрольной группе носителя достигает 1500 мм3 или не позднее дня 60, в зависимости от того, что наступило раньше. Дизайн исследования приведен в таблице 13 ниже.
Таблица 13: Дизайн исследования эффективности в модели CTG-0401 колоректального рака человека
Группа n Агент Доза (мг/кг) Объем дозирования (мл/кг) Путь Схема дозирования Итого # доз
1 12 Носитель GM102 Носитель Иринотекан 0
0		 10
10		 ИП
ИП		 BIWx4,
Q7Dx3		 8
3
2 12 GM102 20 10 ИП BIWx4 8
3 12 Иринотекан 100 10 ИП Q7Dx3 3
GM102 или носитель GM102 вводят перед иринотеканом или носителем иринотекана.
B Результаты
Результаты эксперимента изображены на фигуре 10.
Результаты на фигуре 10 показывают, что антитело GM102 против AMHRII обладает эффективным противоопухолевым эффектом in vivo против колоректальной опухоли человека, экспрессирующей AMHRII.
Примечательно, что антитело GM102 против AMHRII оказывает противоопухолевый эффект, который неотличим от противоопухолевого эффекта преимущественно применяемой молекулы иринотекана против рака толстой кишки (номер CAS: 100286-90-6).
Таблица 12: Экспрессия AMHRII в свежих образцах опухоли колоректального рака человека
Образец Id Гистологический тип Количество рецепторов на клетку (опухоль) Процент AMHRII-положительных клеток (Epcam +) Положительные/
Отрицательные
# 1 C1 Аденокарцинома 15,600 100 % +
# 2 I1 Аденокарцинома 155,954 20 % +
# 3 E1 Аденокарцинома 23,548 100 % +
# 4 A2 Аденокарцинома 12,680 26 % +
# 5 N1 Аденокарцинома (левый столбец) 116,704 50 % +
# 6 N2 Аденокарцинома (левый столбец) 7,578 -
# 7 N3 Аденокарцинома (правый столбец) 34,677 100 % +
# 8 N4 Аденокарцинома (левый столбец) MSI 1,605 -
# 9 A1 Муцинозная аденокарцинома (сигмовидная кишка) 540 -
# 10 E2 Аденокарцинома 57,209 100 % +
# 11 I2 Аденокарцинома 155,473 27 % +
# 12 I3 Аденокарцинома 102,275 68 % +
# 13 N6 Аденокарцинома (левый столбец) 47,464 100 % +
# 14 N7 Аденокарцинома (левый столбец) 61,870 100 % +
# 15 E3 Аденокарцинома 4,090 -
# 16 E4 Аденокарцинома 32,153 75 % +
# 17 A3 Аденокарцинома (сигмовидная кишка) 6,400 -
# 18 E5 Аденокарцинома 13,152 37 % +
# 19 E6 Аденокарцинома 21,962 25 % +
# 20 A4 Аденокарцинома 42,596 56 % +
Таблица 13: AMHRII в опухолевых клетках ксенотрансплантатов опухолей человека
Порядковый Номер Гистологический тип Количество рецепторов на клетку (Epcam+) Процент AMHRII-положительных клеток (Epcam +) Положительные/
Отрицательные
CO14452B #1 Муцинозная аденокарцинома 63,181 16 % +
CO14744C #2 Аденокарцинома 25,269 1,5 % -
CO13196D #3 Аденокарцинома 21,313 4 % -
CO11291 #4 Аденокарцинома 20,629 0,5 % -
CO10619 #5 Аденокарцинома 16,327 0,5 % -
CO11690 #6 Аденокарцинома 17,802 1 % -
CO10069 #7 Аденокарцинома 44,511 2 % -
CO14592 #8 Аденокарцинома 83,762 87 % +
CO10708 #9 Аденокарцинома 43,109 7 % +
CO7935 #10 Аденокарцинома 99,959 73 % +
CO11101 #11 Аденокарцинома 28,951 44 % +
CO10748 #12 Аденокарцинома 29,821 56 % +
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ГАМАМА ФАРМА
ЭНСТИТЮ КЮРИ
<120> СОЕДИНЕНИЯ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ AMHRII, ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ
ЛЕЧЕНИЯ РАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
<130> PR77465
<140> EP17305445.3
<141> 2017-04-14
<150> EP17305445
<151> 2017-04-14
<160> 74
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 318
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VL 3C_23 без лидерной последовательности" <223> "VL 3C_23
без лидерной последовательности
<220>
<223> VL 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<223> VL 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..318
<400> 1
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 2
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..318 от SEQ ID NO
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VH 3C_23 без лидерной последовательности" <223> "VH 3C_23
без лидерной последовательности
<220>
<223> VH 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<223> VH 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..345
<400> 3
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 34
<210>
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..345 от SEQ ID NO
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VL 3C_23K без лидерной последовательности" <223> "VL
3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> VL 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> VL 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..318
<400> 5
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag 318
<210> 6
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..318 от SEQ ID NO
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 345
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> VH 3C_23K без лидерной последовательности" <223> "VH
3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> VH 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> VH 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..345
<400> 7
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc 34
<210>
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..345 от SEQ ID NO
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210>
<211> 63
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> легкая цепь 3C_23 без лидерной последовательности" <223> "
легкая цепь 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<223> легкая цепь 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<223> легкая цепь3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..639
<400> 9
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg gaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336
agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384
gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432
gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480
agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576
tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624
aac agg gga gag tgt 639
<210> 10
<211> 213
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..639 от SEQ ID NO
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 1335
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23 без лидерной последовательности" <223>
"тяжелая цепь 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23без лидерной последовательности
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23 без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..1335
<400> 11
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384
tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480
ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528
ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 12
<211> 445
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..1335 от SEQ ID NO 1
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 12
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 13
<211> 639
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> легкая цепь 3C_23K без лидерной последовательности" <223>
"легкая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> легкая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> легкая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..639
<400> 13
gac atc cag atg aca cag tcc cca tct acc ctg tct gct tcc gtg gga 48
gat cgg gtg act atc acc tgc aga gca agc tcc tcc gtg agg tac atc 96
gct tgg tac cag cag aag cca gga aag gcc cca aag ctg ctg acc tac 144
cca acc tcc tcc ctg aaa tcc ggg gtg ccc agc aga ttc tca ggc agt 192
ggc tcc ggc acc gaa ttc acc ctg acc atc agc tca ctg cag cct gac 240
gac ttc gca acc tac tac tgt ctg cag tgg agt agc tac cct tgg aca 288
ttc ggc ggc ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc gtc gcc gca cca 336
agt gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act 384
gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa 432
gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag 480
agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc agc agc 528
acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc tac gcc 576
tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc 624
aac agg gga gag tgt 639
<210> 14
<211> 213
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..639 от SEQ ID NO 1
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 15
<211> 1335
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23K без лидерной последовательности" <223>
"тяжелая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<223> тяжелая цепь 3C_23K без лидерной последовательности
<220>
<221> Кодирующая последовательность
<222> 1..1335
<400> 15
cag gtg cgg ctg gtg cag agc ggg gcc gag gtg aag aag cct gga gcc 48
tca gtg aag gtg agt tgc aag gcc tcc ggt tac acc ttc acc agc tac 96
cac atc cac tgg gtc aga cag gct ccc ggc cag aga ctg gag tgg atg 144
ggc tgg atc tac cct gga gat gac tcc acc aag tac tcc cag aag ttc 192
cag ggt cgc gtg acc att acc agg gac acc agc gcc tcc act gcc tac 240
atg gag ctg tct tcc ctg aga tct gag gat acc gca gtc tac tac tgt 288
aca cgg ggg gac cgc ttt gct tac tgg ggg cag ggc act ctg gtg acc 336
gtc tcg agc gcc agc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc 384
tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc 432
aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc 480
ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc tca gga 528
ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc 576
acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac acc aag 624
gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac aca tgc 672
cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg ggg gga ccg tca gtc ttc ctc 720
ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 768
gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 816
ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 864
ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 912
acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 960
gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc aaa 1008
gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 1056
cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 1104
ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 1152
ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 1200
tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 1248
cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 1296
cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa 1335
<210> 16
<211> 445
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <223> Синтетическая конструкция
[Кодирующая последовательность]:1..1335 от SEQ ID NO 1
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 16
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro
115 120 125
Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val
130 135 140
Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
145 150 155 160
Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly
180 185 190
Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 17
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Человек разумный
<220>
<223> сигнальный пептид " <223> сигнальный пептид
<220>
<223> сигнальный пептид
<220>
<223> сигнальный пептид
<400> 17
Met Leu Gly Ser Leu Gly Leu Trp Ala Leu Leu Pro Thr Ala Val Glu
1 5 10 15
Ala
<210> 18
<211> 556
<212> БЕЛОК
<213> Человек разумный
<220>
<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17"
<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17
<220>
<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17
<220>
<223> AMHR-II человека без сигнального пептида SEQ ID NO: 17
<400> 18
Pro Pro Asn Arg Arg Thr Cys Val Phe Phe Glu Ala Pro Gly Val Arg
1 5 10 15
Gly Ser Thr Lys Thr Leu Gly Glu Leu Leu Asp Thr Gly Thr Glu Leu
20 25 30
Pro Arg Ala Ile Arg Cys Leu Tyr Ser Arg Cys Cys Phe Gly Ile Trp
35 40 45
Asn Leu Thr Gln Asp Arg Ala Gln Val Glu Met Gln Gly Cys Arg Asp
50 55 60
Ser Asp Glu Pro Gly Cys Glu Ser Leu His Cys Asp Pro Ser Pro Arg
65 70 75 80
Ala His Pro Ser Pro Gly Ser Thr Leu Phe Thr Cys Ser Cys Gly Thr
85 90 95
Asp Phe Cys Asn Ala Asn Tyr Ser His Leu Pro Pro Pro Gly Ser Pro
100 105 110
Gly Thr Pro Gly Ser Gln Gly Pro Gln Ala Ala Pro Gly Glu Ser Ile
115 120 125
Trp Met Ala Leu Val Leu Leu Gly Leu Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu
130 135 140
Leu Gly Ser Ile Ile Leu Ala Leu Leu Gln Arg Lys Asn Tyr Arg Val
145 150 155 160
Arg Gly Glu Pro Val Pro Glu Pro Arg Pro Asp Ser Gly Arg Asp Trp
165 170 175
Ser Val Glu Leu Gln Glu Leu Pro Glu Leu Cys Phe Ser Gln Val Ile
180 185 190
Arg Glu Gly Gly His Ala Val Val Trp Ala Gly Gln Leu Gln Gly Lys
195 200 205
Leu Val Ala Ile Lys Ala Phe Pro Pro Arg Ser Val Ala Gln Phe Gln
210 215 220
Ala Glu Arg Ala Leu Tyr Glu Leu Pro Gly Leu Gln His Asp His Ile
225 230 235 240
Val Arg Phe Ile Thr Ala Ser Arg Gly Gly Pro Gly Arg Leu Leu Ser
245 250 255
Gly Pro Leu Leu Val Leu Glu Leu His Pro Lys Gly Ser Leu Cys His
260 265 270
Tyr Leu Thr Gln Tyr Thr Ser Asp Trp Gly Ser Ser Leu Arg Met Ala
275 280 285
Leu Ser Leu Ala Gln Gly Leu Ala Phe Leu His Glu Glu Arg Trp Gln
290 295 300
Asn Gly Gln Tyr Lys Pro Gly Ile Ala His Arg Asp Leu Ser Ser Gln
305 310 315 320
Asn Val Leu Ile Arg Glu Asp Gly Ser Cys Ala Ile Gly Asp Leu Gly
325 330 335
Leu Ala Leu Val Leu Pro Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ala Trp Thr Pro
340 345 350
Thr Gln Pro Gln Gly Pro Ala Ala Ile Met Glu Ala Gly Thr Gln Arg
355 360 365
Tyr Met Ala Pro Glu Leu Leu Asp Lys Thr Leu Asp Leu Gln Asp Trp
370 375 380
Gly Met Ala Leu Arg Arg Ala Asp Ile Tyr Ser Leu Ala Leu Leu Leu
385 390 395 400
Trp Glu Ile Leu Ser Arg Cys Pro Asp Leu Arg Pro Asp Ser Ser Pro
405 410 415
Pro Pro Phe Gln Leu Ala Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asn Thr Pro Thr
420 425 430
Ser Asp Glu Leu Trp Ala Leu Ala Val Gln Glu Arg Arg Arg Pro Tyr
435 440 445
Ile Pro Ser Thr Trp Arg Cys Phe Ala Thr Asp Pro Asp Gly Leu Arg
450 455 460
Glu Leu Leu Glu Asp Cys Trp Asp Ala Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr
465 470 475 480
Ala Glu Cys Val Gln Gln Arg Leu Ala Ala Leu Ala His Pro Gln Glu
485 490 495
Ser His Pro Phe Pro Glu Ser Cys Pro Arg Gly Cys Pro Pro Leu Cys
500 505 510
Pro Glu Asp Cys Thr Ser Ile Pro Ala Pro Thr Ile Leu Pro Cys Arg
515 520 525
Pro Gln Arg Ser Ala Cys His Phe Ser Val Gln Gln Gly Pro Cys Ser
530 535 540
Arg Asn Pro Gln Pro Ala Cys Thr Leu Ser Pro Val
545 550 555
<210> 19
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 3C23K/3C23 <223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<220>
<223> 3C23K/3C23
<400> 19
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 3C23KR/6B78 <223> 3C23KR/6B78
<220>
<223> 3C23KR/6B78
<220>
<223> 3C23KR/6B78
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 5B42 <223> 5B42
<220>
<223> 5B42
<220>
<223> 5B42
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Ala Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K4D-24/6C59 <223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<220>
<223> K4D-24/6C59
<400> 22
Arg Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K4D-20 <223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<220>
<223> K4D-20
<400> 23
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K4A-12 <223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<220>
<223> K4A-12
<400> 24
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K5D05 <223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<220>
<223> K5D05
<400> 25
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K5D-14 <223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<220>
<223> K5D-14
<400> 26
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K4D-123 <223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<220>
<223> K4D-123
<400> 27
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> K4D-127/6C07 <223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<220>
<223> K4D-127/6C07
<400> 28
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Thr Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 5C14 <223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<220>
<223> 5C14
<400> 29
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 5C26 <223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<220>
<223> 5C26
<400> 30
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Met Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 5C27 <223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<220>
<223> 5C27
<400> 31
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Pro Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 5C60 <223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<220>
<223> 5C60
<400> 32
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Lys Val Arg Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 6C13 <223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<220>
<223> 6C13
<400> 33
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 6C18 <223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<220>
<223> 6C18
<400> 34
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 6C54 <223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<220>
<223> 6C54
<400> 35
Gln Val Arg Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
His Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Asp Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> 3C23K <223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<220>
<223> 3C23K
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-K55E <223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<220>
<223> L-K55E
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-T48I, L-P50S <223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<220>
<223> L-T48I, L-P50S
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ser Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> LT48I, L-K55E <223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<220>
<223> LT48I, L-K55E
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> LS27P, L-S28P <223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<220>
<223> LS27P, L-S28P
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Pro Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L, L-T20A <223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<220>
<223> L-M4L, L-T20A
<400> 41
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ala Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-S27P <223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<220>
<223> L-S27P
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Pro Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W <223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<220>
<223> L-M4L, L-S9P, L-R31W
<400> 43
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Pro Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 44
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L <223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<220>
<223> L-M4L
<400> 44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-I33T <223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<220>
<223> L-I33T
<400> 45
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Thr
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L, L-K39E <223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-K39E
<400> 46
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-T22P <223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<220>
<223> L-T22P
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Pro Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-Y32D <223> L-Y32D
<220>
<223> L-Y32D
<220>
<223> L-Y32D
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Asp Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-Q37H <223> L-Q37H
<220>
<223> L-Q37H
<220>
<223> L-Q37H
<400> 49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 50
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-G97S <223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<220>
<223> L-G97S
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Ser Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-S12P <223> L-S12P
<220>
<223> L-S12P
<220>
<223> L-S12P
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 52
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-19A <223> L-19A
<220>
<223> L-19A
<220>
<223> L-19A
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-T72A <223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<220>
<223> L-T72A
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ala Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-R31W <223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<220>
<223> L-R31W
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Trp Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L, L-M39K <223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K
<220>
<223> L-M4L, L-M39K
<400> 55
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Met Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-I2N <223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<220>
<223> L-I2N
<400> 56
Asp Asn Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-G63C, L-W91C <223> L-G63C, L-W91C
<220>
<223> L-G63C, L-W91C
<220>
<223> L-G63C, L-W91C
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Cys Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Cys Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-R31G <223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<220>
<223> L-R31G
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-I75F <223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<220>
<223> L-I75F
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Phe Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-I2T <223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<220>
<223> L-I2T
<400> 60
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-I2T, L-K42R <223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<220>
<223> L-I2T, L-K42R
<400> 61
Asp Thr Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-Y49H <223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<220>
<223> L-Y49H
<400> 62
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr His
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 63
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E <223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<220>
<223> L-M4L, L-T20S, L-K39E
<400> 63
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Glu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 64
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> L-T69P <223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<220>
<223> L-T69P
<400> 64
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Thr Tyr
35 40 45
Pro Thr Ser Ser Leu Lys Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Pro Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 65
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRL-1 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRL-1 антитела против AMHRII
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 4
<223> Xaa в положении 4 может представлять собой S или P
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa в положении 5 может представлять собой S или P
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 7
<223> Xaa в положении 7 может представлять собой R или W или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 8
<223> Xaa в положении 8 может представлять собой T или D
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 9
<223> Waa в положении 9 может представлять собой I или T
<400> 65
Arg Ala Ser Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 66
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRL-2 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRL-2 антитела против AMHRII
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa в положении 6 может представлять собой K или E
<400> 66
Pro Thr Ser Ser Leu Xaa Ser
1 5
<210> 67
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRL-3 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRL-3 антитела против AMHRII
<400> 67
Leu Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 68
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRH-1 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRH-1 антитела против AMHRII
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 6
<223> Xaa в положении 6 может представлять собой S или T
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 9
<223> Xaa в положении 9 может представлять собой S или G
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 10
<223> Xaa в положении 10 может представлять собой Y или N
<400> 68
Lys Ala Ser Gly Tyr Xaa Phe Thr Xaa Xaa His Ile His
1 5 10
<210> 69
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRH-2 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRH-2 антитела против AMHRII
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> 5
<223> Xaa в положении 5 может представлять собой G или E
<400> 69
Trp Ile Tyr Pro Xaa Asp Asp Ser Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 70
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> CDRH-3 антитела против AMHRII
<220>
<223> CDRH-3 антитела против AMHRII
<400> 70
Gly Asp Arg Phe Ala Tyr
1 5
<210> 71
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер AMHR2
<220>
<223> прямой праймер AMHR2
<400> 71
tctggatggc actggtgctg 20
<210> 72
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер AMHR2
<220>
<223> обратный праймер AMHR2
<400> 72
agcagggcca agatgatgct 20
<210> 73
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> прямой праймер TBP
<220>
<223> прямой праймер TBP
<400> 73
tgcacaggag ccaagagtga a 21
<210> 74
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искуственная последовательность
<220>
<223> обратный праймер TBP
<220>
<223> обратный праймер TBP
<400> 74
cacatcacag ctccccacca 20
<---

Claims (36)

1. Применение агента, связывающего AMHRII человека, в качестве активного ингредиента для профилактики или лечения негинекологического рака, который экспрессирует AMHRII на поверхности опухолевой клетки,
причем указанный агент, связывающий AMHRII человека, включает моноклональное антитело против AMHRII или его фрагмент, связывающий AMHRII; и
негинекологический рак выбран из группы, состоящей из рака толстой кишки и рака печени.
2. Применение по п. 1, где агент, связывающий AMHRII человека, представляет собой моноклональное антитело, выбранное из группы, состоящей из следующих антител:
а) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 2, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 4 (последовательности VL и VH 3C23 без лидерных последовательностей);
b) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 6, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 8 (последовательности VL и VH 3C23K без лидерных последовательностей);
c) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 10, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 12 (легкая и тяжелая цепи 3C23 без лидерных последовательностей);
d) легкая цепь, содержащая SEQ ID NO: 14, и тяжелая цепь, содержащая SEQ ID NO: 16 (легкая и тяжелая цепи 3C23K без лидерных последовательностей).
3. Применение по п. 1, где агент, связывающий AMHRII человека, представляет собой моноклональное антитело, содержащее CDR (участок, определяющий комплементарность), содержащие следующие последовательности:
- CDRL-1: RASX1X2VX3X4X5A (SEQ ID NO: 65), где X1 и X2 независимо представляют собой S или P, X3 представляет собой R, или W, или G, X4 представляет собой T или D, и X5 представляет собой I или T;
- CDRL-2 представляет собой PTSSLX6S (SEQ ID NO: 66), где X6 представляет собой K или E; и
- CDRL-3 представляет собой LQWSSYPWT (SEQ ID NO: 67);
- CDRH-1 представляет собой KASGYX7FTX8X9HIH (SEQ ID NO: 68), где X7 представляет собой S или T, X8 представляет собой S или G, и X9 представляет собой Y или N;
- CDRH-2 представляет собой WIYPX10DDSTKYSQKFQG (SEQ ID NO: 69), где X10 представляет собой G или E; и
- CDRH-3 представляет собой GDRFAY (SEQ ID NO: 70).
4. Применение по п. 1, где указанный агент, связывающий AMHRII, представляет собой моноклональное антитело, содержащее CDR, содержащие следующие последовательности:
- CDRL-1 - RASSSVRYIA;
- CDRL-2 - PTSSLKS;
- CDRL-3 - LQWSSYPWT;
- CDRH-1 - KASGYTFTSYHIH;
- CDRH-2 - WIYPGDDSTKYSQKFQG; и
- CDRH-3 - GDRFAY.
5. Применение по п. 1, где указанный агент, связывающий AMHRII, представляет собой моноклональное антитело, содержащее CDR, содержащие следующие последовательности:
- CDRL-1 - RASSSVRYIA;
- CDRL-2 - PTSSLES;
- CDRL-3 - LQWSSYPWT;
- CDRH-1 - KASGYTFTSYHIH;
- CDRH-2 - WIYPGDDSTKYSQKFQG; и
- CDRH-3 - GDRFAY.
6. Применение по любому из пп. 1-5, где агент, связывающий AMHRII, применяется в комбинации с другим противораковым лечением.
7. Применение по п. 1, где агент, связывающий AMHRII человека, содержит VL и VH, где VL содержит CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, показанных в VL, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и VH содержит CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, показанные в VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или
где агент, связывающий AMHRII человека, содержит VL и VH, где VL содержит CDR1, CDR2 и CDR3, содержащие аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, показанные в VL, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и VH содержит CDR1, CDR2 и CDR3, состоящие из аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, показанных в VH, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.
8. Способ определения чувствительности пациента на лечение рака с помощью агента, связывающего AMHRII, где указанный способ включает стадию определения наличия экспрессии образцом опухолевой ткани, предварительно полученным от указанного пациента, белка AMHRII на поверхности клетки,
причем пациент чувствителен к лечению рака с помощью агента, связывающего AMHRII, если определено, что указанный образец опухолевой ткани демонстрирует наличие экспрессии AMHRII на клеточной поверхности;
указанный агент, связывающий AMHRII человека, включает моноклональное антитело против AMHRII или его фрагмент, связывающий AMHRII;
указанный образец опухолевой ткани получен от указанного пациента из негинекологического рака, выбранного из группы, состоящей из рака толстой кишки и рака печени.
RU2019131534A 2017-04-14 2018-04-13 Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний RU2816523C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP17305445.3 2017-04-14
EP17305445 2017-04-14
PCT/EP2018/059548 WO2018189379A1 (en) 2017-04-14 2018-04-13 Amhrii-binding compounds for preventing or treating cancers

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2019131534A RU2019131534A (ru) 2021-05-14
RU2019131534A3 RU2019131534A3 (ru) 2021-08-17
RU2816523C2 true RU2816523C2 (ru) 2024-04-01

Family

ID=

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160208018A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160208018A1 (en) * 2015-01-16 2016-07-21 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for ror1

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ЧУБЕНКО В.А., Осложнения таргетной терапии, ПРАКТИЧЕСКАЯ ОНКОЛОГИЯ, 2010, Т.11, N3, с.192-202. JAE YEN SONG et al., The expression of Mullerian inhibiting substance/anti-Mullerian hormone type II receptor protein and mRNA in benign, borderline and malignant ovarian neoplasia, INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY, 2009, vol.34, pp.1583-1591. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7494245B2 (ja) Ｃｄ４７及びｅｇｆｒの二重標的化による癌治療
CN109195991B (zh) 对糖基化pd-l1特异的双重功能抗体及其使用方法
JP2022025071A (ja) グリコシル化ｐｄ－１に対して特異的な抗体およびその使用方法
US20220144959A1 (en) Amhrii-binding compounds for preventing or treating cancers
CN106103486B (zh) 抗ox40抗体和使用方法
KR20180041717A (ko) 항-dll3 항체 약물 컨쥬게이트 및 그의 이용 방법
KR20170008202A (ko) 흑색종에 사용하기 위한 항-ｄｌｌ3 항체 및 약물 접합체
JP7289420B6 (ja) 肺癌を予防又は処置する為のａｍｈｒｉｉ結合性化合物
KR20150003169A (ko) Ｄｌｌ3 조절물질들 및 사용 방법
KR20160097336A (ko) 신규 항-ｄｐｅｐ3 항체 및 이의 사용 방법
KR20170045351A (ko) 신규한 항-mfi2 항체 및 사용 방법
TW201800111A (zh) 用於治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤的抗dll3藥物結合物
AU2016347516A1 (en) Prognostic method
US20230414778A1 (en) COMBINATION OF ANTIBODY-DRUG CONJUGATE WITH ANTI-SIRPalpha ANTIBODY
US20230001006A1 (en) Amhrii-binding antibody drug conjugates and their use thereof in the treatment of cancers
RU2816523C2 (ru) Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний
RU2797506C2 (ru) Соединения, связывающие AMHRII, для профилактики или лечения раковых заболеваний легкого
TW202400650A (zh) 抗體與cd47抑制劑之組合
TW202409087A (zh) 抗ror1抗體