TW201800111A - 用於治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤的抗dll3藥物結合物 - Google Patents

用於治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤的抗dll3藥物結合物 Download PDF

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羅伯特 A 史督
丹尼爾 R 海督克
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Abstract

本發明提供使用抗δ樣配體3(DLL3)抗體藥物結合物(antibody drug coniugates；ADC)治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤之方法。

Description

用於治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤的抗DLL3藥物結合物
本申請案概言之係關於治療癌症及其任何再發、復發或轉移之方法。在廣泛態樣中，本發明係關於δ樣配體3(DLL3)抗體藥物結合物用於治療癌症之用途。
用於癌症之習用治療包括化學療法、放射療法、手術、免疫療法、靶向治療劑或其組合。不幸地，某些癌症對該等治療沒有反應或反應極小。舉例而言，雖然所選療法具有一般有效性，但在一些患者中，腫瘤展現賦予其非反應性之基因突變。此外，端視癌症之類型及其呈現形式，一些有用治療(例如手術)可能不是可行的替代。當嘗試治療已經歷先前治療且隨後復發之患者時，目前標準照護治療劑固有之限制特別明顯。在該等情形下，失敗之治療方案及所得患者劣化可促成難治及/或復發之腫瘤，此通常表明其為最終證實不可治癒之相對侵襲性疾病。鑒於復發疾病之高度侵襲性性質，愈晚檢測到復發並加以治療，預後愈好。
儘管近年來已在癌症之診斷及治療中取得重大改良，但由於現有療法無法預防復發、腫瘤再發及轉移，許多實體腫瘤之總體存活率基本上保持不變。因此，研發尤其用於患有再發癌症之患者之更有靶向性且強效的 癌症療法仍為挑戰。
在廣泛態樣中，本發明提供治療具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之方法及減少或抑制具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之再發之方法。本發明之其他態樣提供經分離抗DLL3抗體、經分離抗ASCL1抗體及相應抗體藥物結合物(ADC)。
在一個實施例中，提供治療個體之具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之方法。此一方法包含向個體投與治療有效量之抗DLL3抗體藥物結合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該抗體藥物結合物(ADC)包含式M-[L-D]n，其中：M包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含細胞毒性劑；且n為1至20之整數。在某些實施例中，腺癌在轉型為神經內分泌表型之前表現相對極少或不可檢測量之DLL3。顯著地，在某些實施例中，腺癌在利用DLL3 ADC治療時表現相對極少或不可檢測量之DLL3蛋白(例如，其係DLL3-/低)，但其可表現指示其具有轉型為包含神經內分泌表型之腫瘤之風險之標記物蛋白(例如，ASCL1)。
在另一實施例中，提供減少或抑制個體之具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之再發之方法。此一方法包含向個體投與治療有效量之抗DLL3抗體藥物結合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該抗體藥物結合物(ADC)包含式M-[L-D]n其中：M包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含細胞毒性劑；且n為1至20之整數。在所選實施例中，腺癌在轉型為神經內分泌表型之前表現相對極少或不可檢測量之DLL3。再次，在某些實施例中，腺癌在利用DLL3 ADC治療時表現相對極少或不可檢測量之DLL3蛋白(例如，其係DLL3-/低)，但其可表現指示其具有轉型為包含神經 內分泌表型之腫瘤之風險之標記物蛋白(例如，ASCL1)。
在一些實施例中，腺癌包含ASCL1+細胞。在某些實施例中，與對照試樣相比，腺癌顯示以下中之一或多者之降低之表現：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SAM pointed domain-containing Ets transcription factor，SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。在其他實施例中，與對照試樣相比，腺癌顯示父系性地表現10(PEG10)有經增加之表現。
在本發明之一些態樣中，個體正在或已經經歷靶向療法或化學療法。在其他態樣中，腺癌係再發、難治、復發或具有抗性的。在再其他態樣中，個體先前已經歷減瘤程序。
如所指示，本發明提供治療腺癌之方法及預防、減少或抑制具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之再發之方法。在一些態樣中，腺癌發生在肺、前列腺、泌尿生殖道(包括膀胱)、胃腸道、甲狀腺或腎中。
在一態樣中，腺癌包含前列腺癌。在某些實施例中，前列腺癌包含去勢抵抗性前列腺癌(CPRC)。在其他實施例中，腺癌對雄激素去除療法具有抗性，且在某些實施例中，CPRC對雄激素去除療法具有抗性(AR-CPRC)。
在另一態樣中，腺癌包含肺癌。在某些實施例中，肺癌包含非小細胞肺癌。在另一實施例中，腺癌之特徵為具有活化性EGFR突變。在另一實施例中，腺癌對EGFR抑制劑療法具有抗性。
本發明包含抗DLL3抗體或包含抗DLL3抗體之ADC。在一些態樣中，抗DLL3抗體特異性結合至DLL3蛋白之DSL結構域內之如SEQ ID NO：3或4所闡述之表位。在某些態樣中，抗DLL3抗體特異性結合至包含胺基酸G203、R205及P206之表位(SEQ ID NO：4)。
在一個實施例中，抗DLL3抗體包括包含如SEQ ID NO：149所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：151所闡述之重鏈可變區之抗體或與該抗體競爭結合至人類DLL3蛋白。在另一實施例中，抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：149所述輕鏈可變區之三個互補決定區及如SEQ ID NO：151所述重鏈可變區之三個互補決定區。在另一實施例中，抗DLL3抗體包含CDR-L1之SEQ ID NO：149之殘基24-34、CDR-L2之SEQ ID NO：149之殘基50-56、CDR-L3之SEQ ID NO：149之殘基89-97、CDR-H1之SEQ ID NO：151之殘基31-35、CDR-H2之SEQ ID NO：151之殘基50-65及CDR-H3之SEQ ID NO：151之殘基95-102，其中該等殘基係根據Kabat來編號。在某些實施例中，抗DLL3抗體包括包含如SEQ ID NO：405所闡述之胺基酸序列之輕鏈可變區及包含如SEQ ID NO：407所闡述之胺基酸序列之重鏈可變區。
在一些態樣中，抗DLL3抗體選自由以下組成之群：單株抗體、靈長類化抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、雙價抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段及ScFv片段；或其免疫反應性片段。在某些態樣中，抗DLL3抗體選自由以下組成之群：嵌合抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。
如所指示，本發明之某些實施例包含式M-[L-D]n之抗體藥物結合物，其中D包含細胞毒性劑。在一些實施例中，細胞毒性劑係吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奧裏斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴素(calicheamicin)或放射性同位素。在某些實施例中，細胞毒性劑係吡 咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些態樣中，PBD經由連接體共價連接至抗DLL3抗體。
在某些態樣中，本發明包含ADC，其中細胞毒性劑係包含式AC之吡咯并苯并二氮呯(PBD)：
其中：虛線指示可選雙鍵之存在，且其中所給環中虛線中僅一條可為雙鍵；R2選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、OSO2R、CO2R、COR及鹵基，其中RD選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9各自獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R10係聯結至抗DLL3抗體之連接體L；Q選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O，R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR’，R及R’連同其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；X選自O、S及N(H)；R2”、R6”、R7”、R9”及X”分別如根據R2、R6、R7、R9及X所定義；且R”係C3-12伸烷基，其包含視情況雜有一或多個雜原子、一或多個環或一或多個雜原子及一或多個環之鏈，其中該可選一或多個環視情況經取代。在某些態樣中，R2係R，其中R係視情況經取 代之C1-12烷基；R6及R9係H；R7係OR，且其中R係C1烷基；Q係O，且其中R11係H；及/或X及X”係O。
在另一態樣中，本發明包含ADC，其中在自任一連接體裂解之後，PBD包含：
及
在本發明之其他態樣中，ADC包含連接體。在一態樣中，連接體包含可裂解連接體。在某些態樣中，可裂解連接體包含二肽。在其他態樣中，二肽係Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Ala-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg或Trp-Cit。在再一態樣中，二肽係Val-Ala。在再其他態樣中，連接體進一步包含馬來醯亞胺基團。
在某些態樣中，抗體藥物結合物包含以下結構：
其中星號指示連接體與細胞毒性劑之附接點，且其中波形線指示與連接體剩餘部分之附接點。
本發明之另一態樣提供選擇利用抗DLL3抗體藥物結合物(ADC)進行治療之個體之方法。該等方法包含：(a)使自個體獲得之腫瘤試樣與ASCL1抗體接觸，其中該ASCL1抗體可包括包含以下各項之抗體或與該抗體競爭結合至人類ASCL1蛋白：如SEQ ID NO：521所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：523所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：525所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：527所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：529所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：531所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：533所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：535所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：537所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：539所 闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：541所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：543所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：545所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：547所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：549所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：551所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：553所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：555所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：557所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：559所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：561所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：563所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：565所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：567所闡述之重鏈可變區；如SEQ ID NO：569所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：571所闡述之重鏈可變區；或如SEQ ID NO：521所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：573所闡述之重鏈可變區；(b)檢測結合至腫瘤試樣之ASCL1抗體；及(c)選擇具有ASCL1+腫瘤試樣之個體以利用抗DLL3抗體藥物結合物(ADC)進行治療。在某些實施例中，ASCL1抗體包含上文所提及之抗體或與該等抗體競爭。在檢測ASCL1抗體之步驟中，可使抗體與可檢測標記結合或以其他方式締合，或此步驟可使用特異性結合至ASCL1抗體以擴增信號之二級及/或三級抗體來實施，如業內所熟知。在其他所選實施例中，所選個體在選擇時可表現相對極少或不可檢測量之DLL3。
在另一態樣中，本發明包含結合至人類ASCL1且包含輕鏈可變區及重鏈可變區之抗體，其中該輕鏈可變區具有如SEQ ID NO：521、SEQ ID NO：525、SEQ ID NO：529、SEQ ID NO：533、SEQ ID NO：537、SEQ ID NO：541、SEQ ID NO：545、SEQ ID NO：549、SEQ ID NO：553、SEQ ID NO：557、SEQ ID NO：561、SEQ ID NO：565或SEQ ID NO：569所闡述之輕鏈可變區之三個CDR，且重鏈可變區具有如SEQ ID NO：523、SEQ ID NO：527、SEQ ID NO：531、SEQ ID NO：535、SEQ ID NO：539、SEQ ID NO：543、SEQ ID NO：547、SEQ ID NO：551、SEQ ID NO：555、SEQ ID NO：559及SEQ ID NO：563、SEQ ID NO：567、SEQ ID NO：571或SEQ ID NO：573所闡述之重鏈可變區之三個CDR。如下文相當詳細地闡述，CDR可根據Kabat、Chothia、MacCallum或AbM方法來定義。
應瞭解，選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法之某些態樣包含使用ASCL1抗體用於免疫組織化學。在一個實施例中，檢測ASCL1抗體係使用免疫組織化學來實施。在一些實施例中，腫瘤試樣係以化學方式固定。在某些實施例中，腫瘤試樣係使用福馬林(formalin)以化學方式固定。在其他實施例中，腫瘤試樣係經石蠟包埋。
在其他態樣中，選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法可進一步包含以下步驟中之任何或所有步驟：使腫瘤試樣與一或多種檢測以下各項中之一或多者之藥劑接觸：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)；檢測腫瘤試樣中之該一或多種藥劑；及觀察與對照試樣相比以下中之一或多者之降低之表現：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。
在再其他態樣中，選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法可進一步包含以下步驟：使腫瘤試樣與檢測父系性地表現10(PEG10)之藥 劑接觸；檢測腫瘤試樣中之藥劑；及觀察與對照試樣相比父系性地表現10(PEG10)之表現的增加。
在再一態樣中，上文所提及之選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法中之每一者可進一步包含向個體投與抗DLL3抗體藥物結合物之步驟。
就此而言，本發明之某些態樣包含治療罹患具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤之個體之方法，其包含以下步驟：(a)使自個體獲得之腫瘤試樣與ASCL1抗體接觸；(b)檢測結合至腫瘤試樣之ASCL1抗體；(c)選擇具有ASCL1+腫瘤表型之個體；及(d)利用抗DLL3抗體藥物結合物(DLL3 ADC)治療在步驟(c)中選擇之個體。在某些較佳態樣中，腫瘤包含腺癌。在其他實施例中，可測試個體之DLL3表現(例如，使用DLL3抗體)。在該等實施例中，即便腺癌包含ASCL1+ DLL3-/低表型，個體亦可利用DLL3 ADC來治療。
在上文所提及之選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法之一些態樣中，腫瘤具有轉型為神經內分泌表型之風險。在某些態樣中，個體正在及/或已經經歷靶向療法或化學療法。在其他態樣中，腫瘤係再發、難治、復發或具有抗性的。在再其他態樣中，個體先前已經歷減瘤程序。
在選擇利用抗DLL3 ADC進行治療之個體之方法之某些態樣中，腫瘤發生在肺、前列腺、泌尿生殖道、胃腸道、甲狀腺或腎中。
在一態樣中，腫瘤包含前列腺癌。在某一態樣中，前列腺癌包含去勢抵抗性前列腺癌。在再一態樣中，前列腺癌對雄激素去除療法具有抗性。
在另一態樣中，腫瘤包含肺癌。在某些態樣中，肺癌包含小細胞肺 癌。在另一態樣中，肺癌包含非小細胞肺癌。在再一態樣中，腫瘤之特徵為具有活化性EGFR突變。在再一態樣中，腫瘤對EGFR抑制劑療法具有抗性。
上述內容為發明內容，且因此必須含有細節之簡化、概述及省略；因此，熟習此項技術者應瞭解，發明內容僅具有闡釋性且不欲以任何方式進行限制。在本文所述之教示中將明瞭本文所述方法、組合物及/或器件及/或其他標的物之其他態樣、特徵及優點。提供該發明內容以按簡化形式引入下文在實施方式中進一步闡述之概念精選。此發明內容並非意欲鑑別所主張標的物之關鍵特徵或本質特徵，亦不欲用作確定所主張標的物範圍之輔助。
圖1A及圖1B以表格形式提供多種鼠類及人類化實例性DLL3抗體之輕鏈及重鏈可變區之鄰接胺基酸序列(SEQ ID NO：21-407，奇數)；圖2以示意圖形式繪示實例性DLL3抗體之結構域層級映射分析之結果；圖3A至3C以表格形式提供輕鏈(圖3A)及重鏈(圖3B)可變區之鄰接胺基酸序列，及實例性鼠類抗ASCL1抗體之輕鏈及重鏈可變區之核苷酸序列(圖3C)(SEQ ID NO：521-573)；圖4繪示雄激素抗性去勢抵抗性前列腺癌(AR-CRPC)中之DLL3表現；圖5繪示轉移性前列腺癌中之DLL3表現；圖6繪示具有神經內分泌分化之雄激素抗性前列腺癌(NEPC)中之DLL3表現； 圖7繪示在腫瘤初始消退但以NEPC快速復發時在小鼠宿主去勢期間隨時間之DLL3表現；圖8繪示在腫瘤初始消退但以NEPC快速復發時在小鼠宿主去勢期間在LTL331中隨時間之PEG10、DLL3、SPDEF、PTGER4及ERG表現；圖9繪示AR-CRPC之DLL3表現；圖10繪示在小細胞轉變及EMT之後展現升高之DLL3含量之EGFR突變之TKI抗性肺腺癌腫瘤；圖11繪示具有多種類型腫瘤之常見癌症陣列上之DLL3及CHGA表現；且圖12以表格形式提供利用抗ASCL1抗體純系SC72.2之各個小細胞肺癌PDX試樣中ASCL1表現之免疫組織化學結果。
交叉參考申請案
本申請案主張2016年5月20日提出申請之美國臨時申請案第62/339,776號及2017年5月12日提出申請之美國臨時申請案第62/505,539號之權益，其各自以全文引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有已以ASCII格式經由EFS-Web提交之序列表且其全文以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝在2017年5月16日創建，命名為sc1606TWO1_Sequence_Listing且大小為663KB(679,869個位元組)。
本發明可以許多不同形式來體現。本文揭示本發明之例示其原理之非限制性、闡釋性實施例。本文所用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應理解為限制所闡述之標的物。出於本發明之目的，除非另有說明，否則所有 鑑別序列登錄號可參見NCBI參考序列(RefSeq)數據庫及/或NCBI基因庫®檔案序列數據庫。
I. 導論
已驚奇地發現DLL3表現與多種腫瘤類型相關，且其可作為決定子進行開發以治療該等腫瘤。在該等腫瘤中，已發現腺癌中之DLL3表現與對靶向癌症療法或化學療法具有抗性且已轉型為神經內分泌表型之腫瘤相關。本發明提供鑑別具有轉型為神經內分泌表型之風險之腫瘤，使得具有所揭示風險因素之患者可鑑別為利用抗DLL3抗體藥物結合物進行治療之候選者之方法及組合物。舉例而言，如本文所詳述，在轉型為神經內分泌表型期間及在可檢測DLL3表現之前在腫瘤中表現若干種蛋白質。即使腫瘤在治療時表現相對極少或不可檢測量之DLL3，該等標記物蛋白亦可指示對DLL3 ADC之治療有反應之個體。亦如本文所揭示，先前利用靶向療法治療之腫瘤特別容易遭受經歷神經內分泌轉型且易受如本文所揭示之治療或預防方法之影響。因此，所揭示之風險因素及/或如本文所揭示生物標記之鑑別提供利用抗DLL3抗體藥物結合物來治療DLL3-/低腫瘤之新穎治療策略。應瞭解，該等治療可用於預防或延遲最終可展現神經內分泌表型之再發、難治、復發或抗性腫瘤之發生。
II. 神經內分泌轉型之風險因素
諸多腫瘤且具體而言腺癌可轉型、轉變或分化為神經內分泌表型且呈現神經內分泌特徵。此轉型之機制尚未被充分瞭解，但神經內分泌表型可由存在於原始腫瘤中之罕見神經內分泌細胞引起。在某些治療性治療之後，在原始腫瘤之細胞經消除時，該等細胞可優先存活及擴增。或者，腫瘤可經歷至神經內分泌細胞之組織學轉變。在任一情形下，該等轉型可由 經設計以治療腫瘤之治療介入刺激、誘導或以其他方式觸發。在其他情形下，該等神經內分泌轉型可為自發的。
本申請案提供能夠或可能轉型為神經內分泌表型之腫瘤之風險因素。在本發明之一個態樣中，具有神經內分泌轉型風險之腫瘤係藉由特定標記物(例如，ASCL1)之增加之表現及/或如本文所揭示之所選標記物之降低之表現來鑑別。在本發明之另一態樣中，本發明者已發現先前利用如本文所定義之靶向療法治療之腫瘤亦具有轉型為神經內分泌表型之風險。儘管該等腫瘤在治療時顯示DLL3之陰性或低表現(DLL3-/低)，但該等具有風險之腫瘤可使用抗DLL3抗體藥物結合物有效地治療。
A. 神經內分泌表型
由瀰漫性內分泌系統引起之真正或經典神經內分泌腫瘤(NET)相對罕見，其中發病率為2/100,000至5/100,000，但其具有高度侵襲性。神經內分泌腫瘤發生在腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(甲狀腺髓樣癌)及肺(小細胞肺癌及大細胞神經內分泌癌)中。該等腫瘤可分泌若干種可造成衰竭性症狀(稱為類癌症候群)之激素(包括血清素及/或染色顆粒素A)。該等腫瘤可藉由陽性免疫組織化學標記物(例如神經元特異性烯醇酶(NSE，亦稱為γ烯醇酶，基因符號=ENO2)、CD56(或NCAM1)、染色顆粒素A(CHGA)及突觸素(SYP))或藉由已知展現升高之表現之基因(例如ASCL1)來表示。不幸地，傳統化學療法在治療NET中並非特別有效且肝轉移係常見結果。
假神經內分泌腫瘤(pNET)係基因型或表型模擬經典神經內分泌腫瘤、與其類似或展現其常見性狀之腫瘤。假神經內分泌腫瘤或具有神經內分泌特徵之腫瘤係由瀰漫性神經內分泌系統之細胞引起或由神經內分泌分 化級聯在致癌過程期間已異常再活化之細胞引起之腫瘤。該等pNET通常與傳統定義之神經內分泌腫瘤共有某些表型或生物化學特徵，包括產生生物活性胺、神經傳遞質及肽激素之子集之能力。在組織學上，該等腫瘤(NET及pNET)共有通常顯示具有極少溫和細胞病理學細胞質及圓形至卵圓形斑點狀核之緊密聯結小細胞之常見外觀。出於本發明之目的，在本文中經鑑別為表徵神經內分泌轉型之風險之因素同樣適用於鑑別假神經內分泌轉型之風險。
B. 用於鑑別具有神經內分泌轉型風險之腫瘤之生物標記
如本文所揭示，可使用各種生物標記表現之變化來鑑別具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤。代表性生物標記物包括(1)以下各項中之一或多者之表現之增加：哺乳動物無剛毛鱗甲同系物1(Achaete-Scute Homolog1，ASCL1)、父系性地表現之10(PEG10)或絲胺酸/精胺酸重複性矩陣4(SRRM4)，及(2)以下各項中之一或多者之表現的降低或減少：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)或ETS相關基因(ERG)。該等相對表現變化可歸因於表現標記物之細胞之數量變化，亦即，試樣內可描述為具有陽性、低的或陰性表現之細胞可增加或減少。另一選擇為或另外，該等相對變化可能為任一給定或細胞組中表現程度變化之結果。
在本發明之所選態樣中，所選決定子之表現可使用包含螢光抗體染色之流式細胞術來量測。當使用該等技術時，腫瘤細胞可基於螢光信號定義為展現正性、低的及負性標記物含量。具有陰性表現(即「FMO-」)之細胞可定義為表現小於或等於在螢光通道中在標記其他螢光發射通道中之 其他所關注蛋白質之完全抗體染色混合劑存在下利用同型對照抗體所觀察到表現之95%的彼等細胞。熟習此項技術者應瞭解，用於定義陰性事件之此程序稱作「螢光減一對照」或「FMO對照」。表現大於使用上述FMO染色程序利用同型對照抗體所觀察到表現之95%的細胞可定義為「陽性」(即「FMO+」)。如本文所定義，有各種細胞群體廣泛定義為「陽性」，包括可定義為FMO+之彼等。若抗原之所觀察到之平均表現大於如上文所述使用FMO染色利用同型對照抗體測定之95%，則將細胞定義為FMO+。若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且在95%之一個標準偏差內，則陽性細胞可稱為具有低表現(即「FMO-lo」)之細胞。另一選擇為，若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且大於95%以上之一個標準偏差，則陽性細胞可稱為具有高表現(即「FMO-hi」)之細胞。在其他實施例中，可較佳使用99%作為陰性與陽性FMO染色之間之區別點。與對照試樣相比，對特定標記物呈FMO+(例如，ASCL1+)之試樣具有可檢測之標記物表現程度。對特定標記物呈陽性之腫瘤可在一或多個細胞中具有可檢測之標記物含量。
在本發明之某些態樣中，給定標記物(ASCL1+)之增加之表現意欲涵蓋與對照試樣(例如，正常、非致瘤組織)中相應標記物之表現程度相比，在試樣(例如，腫瘤試樣)中該標記物之表現程度之任何顯著增加。舉例而言，與對照試樣中之參考表現程度相比，給定標記物之增加或提高之表現程度可為標記物表現程度之至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、200%、400%或更多之任何統計顯著增加。根據本發明，在與適當對照相比時，顯示該等表現增加之腫瘤試樣可分類為「+」或 「hi」。或者，給定標記物之表現程度之增加可為超過對照試樣中相應標記物之表現程度之值的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍或更多倍之任何倍數增加。根據本發明，當與適當對照相比時，顯示該等表現程度增加之腫瘤試樣可分類為「+」或「hi」。在任一情形下，如在試樣中觀察到之特定標記物之增加之表現可為試樣中表現標記物之陽性細胞之數量增加及/或試樣內任一給定細胞或細胞組之標記物表現程度增加的結果。
與對照試樣中相應標記物之表現程度相比，給定標記物之表現程度降低、下降或減少或表現損失係指試樣中標記物之表現程度之任何顯著降低。舉例而言，與對照試樣中之參考表現程度相比，個體試樣中標記物之表現程度之顯著減少為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。根據本發明，當與適當對照相比時，顯示該等表現程度增加之腫瘤試樣可分類為「-」或「低的」。或者，與對照試樣中給定標記物之表現程度相比，相應標記物之表現程度之降低可為至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍或更多倍之任何倍數降低。根據本發明，當與適當對照相比時，顯示該等表現程度增加之腫瘤試樣可分類為「-」或「低的」。在試樣中觀察到之特定標記物之降低之表現可為試樣中表現標記物之陽性細胞之數量降低及/或試樣內任一給定細胞或細胞組之標記物表現程度降低的結果。
對照或對照試樣為量測試樣中標記物表現之變化提供參考點。對照可為基於試樣組之預定值或其可為基於個別試樣之單一值。對照可為與個體試樣平行測試之試樣。在某些態樣中，對照試樣可包含(例如)任一正常 組織試樣或任一尚未經歷至神經內分泌表型之轉型之腫瘤試樣。
應瞭解，標記物之表現程度可藉由任一給定標記物之蛋白質表現程度或藉由任一給定標記物之核酸表現程度(例如，編碼標記物之RNA之表現程度)來量測。此外，可藉助使用不同檢測試劑(例如，不同抗體)或藉助不同方法之組合測定給定試樣之一種以上標記物之表現程度。可單獨或以組合使用該等表現量測來提供闡述性細胞或腫瘤表型(例如，ASCL1+,DLL3-/低)。
用於量測標記物之表現之各種分析已為業內已知且更詳細地論述於下文及實例中。用於評價蛋白質含量之代表性技術包括(例如)螢光檢測分析(例如螢光顯微鏡術或流式細胞術)、免疫分析(例如免疫組織化學)或酶檢測分析。在較佳態樣中，將使用免疫組織化學(IHC)技術根據本文之教示及標記物來提供細胞或腫瘤表型。舉例而言，本文揭示特異性識別哺乳動物無剛毛鱗甲同系物1(ASCL1)、父系性地表現之10(PEG10)或絲胺酸/精胺酸重複性矩陣4(SRRM4)、視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)或ETS相關基因(ERG)之抗體，其可自市面購得或另外在業內已知且可用於IHC。用於量測該等標記物之RNA表現程度之代表性分析包括(例如)RT-PCR，例如定量RT-PCR。根據本發明可使用用於評價蛋白質或RNA表現程度之任何業內公認之技術來評價指示神經內分泌轉型之風險之如本文所述標記物表現。
在某些較佳實施例中，該分析可包含免疫組織化學(IHC)分析或其變化形式(例如，螢光、發色、標準ABC、標準LSAB等)或免疫細胞化學或其變化形式(例如，直接、間接、螢光、發色等)。
就此而言，本發明之某些態樣包含使用經標記之ASCL1用於免疫組織化學(IHC)。更具體而言，可使用IHC(例如，ASCL1 IHC)作為診斷工具以輔助診斷各種增殖性疾病(包括具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤)及監測對治療(例如，DLL3 ADC療法)之潛在反應。可對已經化學固定(相容性技術包括(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(相容性方法包括(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容性診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定投藥方案及時刻。
如業內已知，可如業內已知使用針對所揭示標記物之抗體使用免疫組織化學技術來衍生H評分。簡言之，觀察腫瘤切片(較佳藉由亮視野顯微術)且記錄切片腫瘤上之標記物(例如，ASCL1)表現以衍生H評分。可藉由以下公式獲得實例性H評分：3×強染色細胞核之百分比+2×中等染色細胞核之百分比+弱染色細胞核之百分比，得到0至300之範圍。
可使用該等H評分來指示哪些患者可適於利用適宜組合物(例如，抗DLL3 ADC)來治療。在所選實施例中可使用點量表上約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190或約200或更高300之H評分，來指示哪些患者可對本發明之治療方法(例如，利用DLL3 ADC及/或化學治療劑)具有有利反應。舉例而言，在某些實施例中，欲利用DLL3 ADC治療之患者將具有300點量表上至少90(即，腫瘤係ASCL1+)之ASCL1 H評分。在其他實施例中，欲利用如本發明所述之DLL3 ADC治療之患者將具有至少120之ASCL1 H評分。在再其他實施例中，欲利用本發明之DLL3 ADC治療之患者將具有至少180之H評 分。出於本發明之目的，展現300點量表上90或更高之H評分之任一腫瘤將視為ASCL1+並使其經受可用於治療神經內分泌腫瘤之任一已知療法之治療(包括靶向ASCL1之轉錄靶標)，如下文進一步闡述。
在其他所選實施例中，亦可使用包含200點量表之H評分來選擇或診斷可對如本文所揭示治療具有反應之患者。在該等200 H評分量表中，120之H評分約等效於300 H評分量表上180之H評分。在兩種情形(例如，120/200或180/300)下，該等H評分可分類為陽性(例如，ASCL1+，其中其均高於300點量表上90之H評分及/或10%之組成細胞表現ASCL1，如下文所闡述)且暗示患者可對本發明之治療方法具有有利反應。
在其他實施例中，患者選擇可基於腫瘤試樣中陽性染色細胞之百分比之量測。就此而言，當利用標記物抗體(例如抗ASCL1抗體)探測時，在IHC試樣中展現一定百分比之陽性染色細胞之患者可視為ASCL1+且可根據本文之教示來選擇進行治療。在該等實施例中，當量測為陽性細胞百分比時，展現大於10%、大於20%、大於30%、大於40%或大於50%陽性細胞染色之腫瘤試樣可分類為對標記物呈陽性(例如，ASCL1+)。在其他實施例中，當量測為陽性百分比時，展現大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或大於95%陽性細胞染色之腫瘤試樣可分類為標記物陽性。在某些較佳態樣中，在量測為陽性百分比時，ASCL1+腫瘤將以組成細胞之10%、20%、30%、40%或50%表現ASCL1。在上述實施例中之每一者中，罹患ASCL1百分比陽性腫瘤之患者可利用如本文所闡述之DLL3 ADC來治療。儘管例示了ASCL1標記物，但應瞭解其他所揭示標記物(例如，PEG10及SRRM4)亦可預測哪些患者將為本發明治療方案之候選者且其明確包括在本發明之範圍內。
在再其他實施例中，患者選擇可基於具有某一強度之標記物陽性細胞染色之百分比來預測。舉例而言，>20%之細胞展現2+ ASCL1強度或更大強度之腫瘤將為ASCL1+及利用DLL3 ADC進行治療之候選者。在其他實施例中，若在利用標記物抗體(例如，抗ASCL1抗體)染色並根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時，20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在其他某些實施例中，若在利用標記物抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時，20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在再其他所選實施例中，若在利用標記物抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時，10%、20%、30%、40%或50%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在再其他實施例中，若在利用標記物抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時，10%、20%、30%、40%或50%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。又一實施例包含治療患有腫瘤(包含其中在利用標記物抗體染色且根據標準IHC方案檢查時10%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度之腫瘤細胞)之個體的方法，該方法包含投與抗DLL3 ADC之步驟。就上文所提及實施例中之每一者而言，應瞭解經標記物抗體染色之強度可容易地使用熟習此項技術者熟悉之標準病理學技術及方法來測定。
在某些態樣中，本發明提供藉由檢測腫瘤試樣中之ASCL1表現來選 擇利用抗DLL3抗體藥物結合物進行治療之個體之方法。此一方法可包含(a)使抗ASCL1抗體與自個體獲得之腫瘤試樣接觸；(b)檢測腫瘤試樣中之抗ASCL1抗體；及(c)選擇具有ASCL1+腫瘤試樣之個體以利用抗DLL3抗體藥物結合物(ADC)進行治療。可同時或依序使用特異性結合至本文所揭示其他標記物(例如，PEG10、SRRM4、RB1、REST、SAM、SPDEF、PTGER4及ERG)中之一或多者之抗體來進一步評價或表徵神經內分泌轉型之風險。舉例而言，可將特定標記物之組合量化為呈現不同的風險程度以指導選擇適當治療(包括抗DLL3 ADC療法)。在某些實施例中，腫瘤試樣將表現相對低含量之DLL3。
如上文所論述，與對照試樣中之參考表現程度相比，某些標記物含量及DLL3表現將降低或減少。更特定而言，具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤可表現較低含量之選自由以下組成之群之一種標記物：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。另外，該等腫瘤可表現相對低含量之DLL3蛋白且可分類為ASCL1+、DLL3-/低，其中DLL3-可指示不可檢測或幾乎不可檢測之表現程度且DLL3低可指示見於某些腫瘤(例如，腺癌)之相對降低之DLL3含量。就此而言，DLL3低將意欲指包含與對照試樣(例如，DLL3+或hi腫瘤)中之參考表現程度相比降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多之DLL3表現程度之任一腫瘤。在某些實施例中，與對照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在再其他實施例中，與對 照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，而在其他實施例中，與對照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在所選實施例中，在與自DLL3+腫瘤獲得之試樣相比時，DLL3表現將減少至少90%、至少95%、至少97%或至少99%。
在其他實施例中，可將腫瘤試樣與已知不表現DLL3之對照腫瘤試樣(陰性對照)相比較。當作出該等比較時，自個體獲得之腫瘤試樣若展現與陰性對照實質上相同之DLL3含量則可分類為DLL3-。
在再其他實施例中，DLL3-/低腫瘤可容易地由受訓病理學家根據本發明使用IHC來鑑別。更特定而言，可獲得腫瘤試樣，較佳進行固定並利用如本文所揭示之抗DLL3抗體進行染色且使用業內公認之技術來讀取。在某些實施例中，DLL3之表現可由病理學家使用適當陽性及陰性對照目視測定。在其他實施例中，評分可基於衍生之H評分，其可包含量測腫瘤試樣中陽性染色細胞之百分比。就後者而言，若使用標準IHC技術，小於約20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之細胞染色為陽性，則可發現腫瘤為DLL3-/低。在其他實施例中，若當利用如本文所闡述之DLL3抗體探測時小於約0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%之細胞染色呈陽性，則可發現腫瘤為DLL3-/低。因此，在較佳態樣中，本發明包含治療罹患其中DLL3-/低腫瘤中在利用DLL3抗體探測時染色呈陽性之細胞之百分比小於約10%之腫瘤的患者。在另一較佳態樣中，本發明包含治療罹患其中DLL3-/低腫瘤中在利用DLL3抗體探測時染色呈陽性之細胞之百分比小於約5%之腫瘤的患者。且在另一較佳態樣中，本發明包含治療罹患其中DLL3-/低腫瘤中在利用DLL3抗體探測時染色呈陽性之細胞之百分比小 於約1%之腫瘤的患者。
在其他實施例中，熟習此項技術者可在檢查載玻片後基於諸如相對強度、染色圖案、試樣來源及製備、所用抗體及報導子等因素作出關於DLL3-/低腫瘤之構成之定性判斷。如先前所提及之關於DLL3表現程度之任何測定均係在適當陽性及陰性對照之背景下作出且相對準確。因此，該等測定指示哪些患者能利用如本文所闡述之DLL3 ADC來治療。
更通常，基於本文之教示，熟習此項技術者可使用多種相容技術容易地確定哪些腫瘤包含DLL3-/低表型及為使用所揭示方法利用抗DLL3 ADC進行治療之候選者(如潛在神經內分泌腫瘤)。
此外，用於該等方法中之代表性抗體包括如本文所提供實例中所闡述產生之新穎抗DLL3及抗ASCL1抗體。圖1A及圖1B及圖3A及圖3B分別提供多種抗DLL3及抗ASCL1結合結構域之注釋序列。更具體而言，ASCL1抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之胺基酸序列分別繪示於圖3A及圖3B中，且係由SEQ ID NO：521-573(奇數)表示。類似地，與所揭示之診斷及治療方法相容之代表性抗DLL3抗體闡述於圖1A及圖1B中(SEQ ID NO：21-407，奇數)。
C. 與神經內分泌轉型之風險相關之靶向療法
如本文所用靶向癌症療法係靶向特定類型之癌症、靶向與腫瘤相關之特定分子及/或靶向為腫瘤發展、腫瘤存活、腫瘤生長及/或轉移所需之特定分子的療法。靶向癌症療法提供以下益處：使特定治療劑與腫瘤之潛在分子變化匹配、得到對腫瘤細胞之選擇性抑制性效應之改良，同時最小化對正常細胞及組織之毒性副作用。此策略包括靶向腫瘤中之驅動致癌基因突變或改變之基因表現路徑。作為一個實例，去除前列腺癌生長所必需 之雄激素之雄激素去除療法係對於許多患有前列腺腺癌之患者之有效之治療。作為另一實例，發生在一些肺腺癌中之表皮生長因子受體(EGFR)蛋白質或退行性淋巴瘤激酶(ALK)基因座中之腫瘤特異性畸變可分別由EGFR酪胺酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)(如厄洛替尼(erlotinib)及吉非替尼(gefitinib))或靶向ALK抑制劑(如克唑替尼(crizotinib)及色瑞替尼(ceritinib))(Roviello,PMID：26082421)靶向。
儘管使用靶向療法通常觀察到初始臨床反應，但多名患者最終經由各種機制發展對藥劑之抗性。另外，本發明者已發現與已利用非靶向療法(亦即，對於許多或所有腫瘤類型皆有效之療法，例如化學療法及輻射)治療之腫瘤相比，利用靶向療法治療之腫瘤呈現更高的轉型為神經內分泌表型的發生率。
儘管可使用抗DLL3抗體藥物結合物來治療具有轉型為神經內分泌表型風險之任何腺癌，但在本發明之特定態樣中，慮及目前用於治療該等癌症類型之靶向療法，該腺癌係前列腺癌、肺癌或膀胱癌。
C.1.肺癌
如上文所闡述，患有具有活化性EGFR突變之肺腺癌之患者可利用靶向療法使用EGFR抑制劑(例如EGFR-TKI)來治療。活化性表皮生長因子受體(EGFR)突變係引起表皮生長因子受體之活化之任何突變。舉例而言，活化性EGFR突變可包含EGFR外顯子19缺失或EGFR之外顯子21中之L858R點突變。
具有活化性EGFR突變且利用EGFR抑制劑來處理之癌細胞可獲得對EGFR抑制劑療法之抗性。對EGFR抑制劑療法具有抗性之腫瘤細胞具有轉型為神經內分泌表型之風險。後天抗性之若干機制已為人習知且包括 (例如)在位置790用甲硫胺酸取代蘇胺酸(T790M)、小細胞轉變、MET擴增、上皮-間質轉變及PIK3CA突變。
在10個月中值時間之後觀察到對EGFR-TKI之抗性。後天抗性之主要機制係出現顯性第二位EGFR T790M突變，如在50-65%之患者中觀察到。此管家基因突變可代表在EGFR-TKI療法之前存於腫瘤中之次要等位基因，其阻礙藥物結合EGFR蛋白質之活性構象之能力。深度測序技術已顯示在利用EGFR-TKI治療之前在高達68%之患者中檢測到預先存在的EGFR T790M純系，及利用EGFR-TKI治療使得出現對彼等抑制劑具有抗性之EGFR T790M腫瘤(Watanabe M.等人，2015)。第二代EGFR-TKI(例如，達克替尼(dacomitinib)、阿法替尼(afatinib)及來那替尼(neratinib))對EGFR具有較高親和力，但已顯示在具有後天抗性之患者中具有有限活性。或者，在對EGFR-TKI的後天抗性之後，抗EGFR單株抗體(如西妥昔單抗(cetuximab))顯示一些臨床益處，但將該等抗體與第二代EGFR-TKI組合具有不利副作用。經設計以選擇性靶向初始活化性及顯性後天T790M抗性突變之第三代EGFR-TKI(例如，羅西替尼(rociletinib)及AZD9291)已在早期試驗中顯示臨床活性，但其他致癌信號傳導分子之擴增最終可在患者中引起羅西替尼抗性(Haringsma等人，2015)。如EGFR-TKI之情形，服用靶向ALK抑制劑(如克唑替尼)之患者顯示優於標準化學療法之臨床益處，但不可避免地復發。在診療所中觀察到由額外第二位ALK突變或由於ALK基因擴增引起之對克唑替尼之後天抗性(Roviello G.等人，2015)。再次，克唑替尼抗性之該兩種機制可代表在由靶向治療引起之選擇壓力之背景下出現具有變化之靶標性質之腫瘤細胞亞純系。
對靶向療法之後天抗性之替代機制不涉及在治療靶標中獲得或選擇 二級突變或基因擴增；而是，腫瘤似乎經歷組織學轉變。舉例而言，在約10-15%之EGFR-突變體肺腺癌中，儘管該等腫瘤維持原始EGFR突變，但其不再對EGFR-TKI具有反應而是展示與小細胞肺癌(SCLC)類似之組織學轉變(Niederst M.J.等人，2015；Sequist L.V.等人，2011)。引人注目地，在復發之後生檢之12名患者中之2名(17%)中觀察到由SCLC轉變引起之對第三代EGFR-TKI之後天抗性(Piotrowska Z.等人，2015)。單獨地，已報導在利用第三代EGFR-TKI治療之後轉型為SCLC之EGFR突變肺腺癌之兩個其他例子(Ham J.S.等人，2015)。自SCLC轉變之EGFR-突變體肺腺癌生成之細胞系對吉非替尼以及第三代EGFR-TKI WZ4002具有抗性(Niederst M.J.等人，2015)。缺乏對EGFR-TKI之反應反映EGFR表現之減少或沉默，乃因該等腫瘤中之EGFR突變狀態相對於原始腫瘤未發生變化(Niederst M.J.等人，2015)。至SCLC表型之轉型伴有遺傳變化之獲得，該等遺傳變化包括神經內分泌標記物之表現、ASCL1表現之獲得及RB1之損失或減少(Niederst M.J.等人，2015)。
因應ALK抑制劑靶向療法克唑替尼及艾樂替尼(alectinib)亦已在六名患者中報導作為抗性機制之ALK重排肺腺癌至SCLC之轉變(Levacq D.等人，2016；Fujita S.等人，2016；Caumont C.等人，2016；Cha Y.J.等人2016；Takegawa,N.等人，2016；Miyamoto S.等人，2016)。該等轉變之腫瘤保留ALK易位且獲得通常在SCLC中觀察到之其他突變，包括RB1、TP53及PTEN之損失及突變。有時，在影響純系檢測之化學治療劑及靶標藥劑之情況下，腫瘤保留腺癌及SCLC之混合。
亦已觀察到在利用EGFR-TKI治療期間EGFR-突變體肺腺癌經歷至大細胞神經內分泌癌(LCNEC)之組織學轉變(Kogo M.等人，2015)。在一種 情形下，原始腫瘤表現EGFR及RB1蛋白(如藉由IHC檢測)，但在轉變為LCNEC之後EGFR及RB1蛋白之表現損失，然而保留EGFR突變(Kogo M.等人，2015)。同樣，已報導對ALK抑制劑克唑替尼之後天抗性係藉助至LCNEC之轉型發生(Omachi N.等人，2014；Caumont C.等人，2016)。再次，在LCNEC細胞中維持原始ALK融合，同時未檢測到可賦予抗性之其他ALK突變。
如在賦予靶向療法抗性之二級突變之獲得中觀察到的那樣，SCLC轉變之非小細胞肺瘤之出現可能代表自原始異質腫瘤對腫瘤細胞亞純系之選擇。儘管被分類為非小細胞肺癌，但約10-20%之非小細胞肺癌展現一些神經內分泌性質(Berendsen H.H.等人，1989)，且肺腺癌之子集(30/171；17%)表現ASCL1及其他神經內分泌基因，且具有差的預後(Fujiwara T.等人，2011)。該靶向療法可因腫瘤異質性而介導腫瘤表型之變化，此係藉由經診斷患有具有EGFR L858R突變之肺腺癌且利用厄洛替尼來治療且其腫瘤經歷至SCLC之轉變之患者的情形來例示。SCLC腫瘤以類似等位基因頻率保留原始EGFR突變，同時獲得常見SCLC突變，包括PIK3CA之活化性突變及TP53及RB1二者之損失或減少。利用針對SCLC之標準照護順鉑/依託泊苷(cisplatin/etoposide)來治療轉變之SCLC腫瘤導致具有對厄洛替尼亦敏感之L858R EGFR突變之肺腺癌再度出現。在生檢時，此患者在肺及肝中具有兩種SCLC轉變之腫瘤，以及具有腺癌組織學之肺病灶。所有三個位點皆具有原始EGFR突變，其中腺癌病灶具有T790M抗性突變，而SCLC病灶沒有T790M抗性突變(Niederst M.J.等人，2015)。總之，該等數據與存在於原始腫瘤中之罕見神經內分泌細胞一致，假定呈現或獲得其他突變(例如，RB1損失或減少)，則該等罕見神 經內分泌細胞在由靶向治療劑引起之選擇壓力之背景下變成腫瘤主體。
如在本文實例中所證明，在對EGFR抑制劑療法具有抗性且已轉型為神經內分泌表型之肺腺癌中DLL3表現增加。本發明提供可使用抗DLL3抗體藥物結合物作為對於患有經鑑別為具有轉型為神經內分泌表型之風險之肺腺癌之患者(包括已接受EGFR抑制劑療法之彼等患者)有效之治療性治療策略。
該等腫瘤通常再發、難治、復發或具有抗性。在本發明之特定態樣中，肺腺癌腫瘤包含先前已利用EGFR抑制劑療法治療之非小細胞肺癌。
C.2.前列腺癌
作為抗性機制之組織學轉變不限於肺腺癌；在前列腺腺癌中亦觀察到因應靶向療法之腫瘤轉變。早期前列腺腺癌係利用輻射來治療，而局部晚期及轉移性前列腺腺癌係利用醫學或手術去勢來治療以靶向雄激素受體(AR)驅動之腫瘤生長(Parimi V.等人，2014)。然而，大多數患者最終復發且變得對雄激素去除療法具有抗性，進展至疾病之致死階段(稱為去勢抵抗性前列腺癌(CPRC))。2015年在US估計CPRC殺死27,540人(American Cancer Society)，且CRPC之5年總體存活為12.6%，使得其為致命及侵襲性最強之前列腺癌亞型。與針對肺腺癌所觀察到者類似，在CRPC中發展靶向療法抗性背後之機制變化，但可分成以下幾組：(1)經由獲得二級突變或AR擴增而恢復AR信號傳導，(2)藉助在AR信號傳導路徑中獲得其他驅動致癌基因(oncogenic driver)由AR蛋白調介之直接信號傳導之繞道，或(3)完全AR獨立性(Watson等人，2015)。值得注意地，CRPC中之完全AR獨立性可表現為具有小細胞神經內分泌特徵(例如，經典神經內分泌標記物(如CHGA、ENO2、NCAM1、SYP等)之表現)之組 織學轉變之腫瘤。ASCL1係驅動SCLC之主要神經內分泌轉錄因子，其藉由雄激素去除上調且與CRPC中之神經內分泌表型之發作相關(Rapa I.等人，2013)。在CRPC中富集RB1之損失或減少及AURKA及MYCN之同時過表現(Robinson D.等人，2015；Beltran H.等人，2011)。
CRPC轉變為具有小細胞神經內分泌表型之腫瘤導致具有不同臨床特徵之疾病：具有大腫瘤團塊之快速進展、高頻發內臟疾病、頻繁骨轉移及大疾病負擔之非比例低的PSA含量、對激素療法之反應差及對化學治療劑之反應較短(中值存活1年)(Aparicio A.等人，2011)。死於CRPC之經屍體剖檢患者之約10-20%具有小細胞神經內分泌分化(Turbat-Herrera E.A.等人，1988；Tanaka M.等人，2001)。神經內分泌分化之程度隨疾病進展且因應雄激素去除療法增加(Parimi V.等人，2014)。隨著最近總雄激素阻斷療法之出現，具有神經內分泌特徵之CRPC可顯著增加(Zhang X.,2015)。雄激素去除療法與具有神經內分泌分化之CRPC之發展之間之直接聯繫可藉由比較間歇雄激素去除對連續雄激素去除療法之研究來進一步支持，其中觀察到間歇雄激素去除延遲或預防神經內分泌分化(Sciarra A.,2003)。
確定哪些前列腺腫瘤將經歷神經內分泌轉型之因素尚未充分瞭解。一些數據表明幾乎所有前列腺腺癌腫瘤皆與局灶神經內分泌分化之位點異質(Cindolo L.等人，2007；Nelson C.E.等人，2007)。神經內分泌細胞無法藉由常規蘇木素及伊紅染色與典型腺癌細胞區分開，但可與典型神經內分泌免疫組織化學區分開(CHGA、SYP、NCAM1等；Priemer D.S.等人，2016)。神經內分泌細胞之數量與贅瘤進展速率相關，且與個別分離之神經內分泌細胞相反之神經內分泌細胞簇與差預後相關(Cindolo L.等 人，2007)。罕見神經內分泌細胞可藉助產生支持細胞快速增殖且促進血管生成之神經肽及生長因子而促成前列腺腺癌。其他基因突變(如RB1之損失或減少或MYC之擴增)可進一步促成完全轉型為小細胞神經內分泌表型。已顯示在神經內分泌轉型發作時表現之一種早期標記物係PEG10(Akamatsu S.等人，2015)。另一顯著上調之基因係PTGER4(Terada N.等人，2010)，而SRRM4表現及由變化剪接引起之REST活性損失或減少亦與CRPC中神經內分泌表型之發作相關(Zhang X.等人，2015)。REST係非神經元組織中神經元基因表現之已知抑制劑，因此其損失或減少可先於神經內分泌基因之上調。
一般而言，在形態上NE轉變之CRPC(CRPC-NE)具有與保留腺癌形態之彼等(CRPC-Ad)類似之突變圖譜。CRPC-NE腫瘤與CRPC-Ad腫瘤之區別可在於具有更低之AR蛋白表現，但具有更少之AR突變、RB1之損失或減少、TP53之突變或損失或減少，及CYLD之損失或減少、超甲基化及SPDEF表現之損失或減少及更高之EZH2表現(Beltran H.等人，2016)。來自發展CRPC-NE之前及之後的患者及來自發展兩種類型抗性腫瘤(具有T790M EGFR突變之CRPC-Ad及CRPC-NE)的患者之多種生檢試樣的評估論證，常見腺癌前體由於指向轉移性CRPC之不同純系進化之類似分子遺傳學而產生多種純系(Beltran H.等人，2016)。在同一患者之CRPC-Ad與CRPC-NE腫瘤之間存在強表觀遺傳差異，且主要在CRPC-NE中觀察到異常DNA甲基化(Beltran H.等人，2016)，表明至NE狀態之轉型涉及表觀遺傳失調。
除雄激素去除療法與神經內分泌分化相關以外，已顯示放射療法亦可誘導前列腺癌神經內分泌分化，且利用放射療法治療之患者顯示升高之 血清染色顆粒素A含量，指示腫瘤中之神經內分泌細胞增加(Hu C.D.等人，2015)。此觀點支持罕見神經內分泌細胞可能存在於原始異質前列腺腺癌中之想法，且在可有效消滅腫瘤主體之療法之後，罕見神經內分泌細胞對該等療法具有抗性且轉變腫瘤之性質。
亦已提出大細胞神經內分泌表型係習用腺癌與小細胞神經內分泌癌之間之轉型階段，但通常觀察到腫瘤異質性且所有三種表型皆存在於同一腫瘤中(Aparicio A.等人，2011；Epstein J.L.等人，2014)。所有前列腺腺癌之約一半表現ERG或另一ETS基因家族成員，且ERG抑制參與神經內分泌分化之基因(Mounir Z.等人，2015)。雄激素去除療法下調ERG且導致腫瘤中對雄激素去除療法具有抗性之神經內分泌細胞快速增加(Mounir Z.等人，2015)。類似地，AR之基因擴增在CRPC發展及可能的至神經內分泌表型之分化中起作用(Priemer D.S.等人，2016)。
由於CRPC快速導致致命性，因此在檢測到成熟(full blown)轉移性疾病之前，具有轉型為神經內分泌表型之風險之患者可得益於治療。需要新穎策略來處理在利用不消滅存於腫瘤中之罕見神經內分泌細胞之靶向療法治療之後出現的神經內分泌分化之細胞。該等治療策略可涉及與雄激素去除組合來預防並阻斷CRPC發展之輔助療法。或者，可在發展CRPC之後投與補救療法，但由於疾病進展如此之快，較佳者係預防而非治療轉移性疾病。
如本文之實例中所證明，DLL3表現在對雄激素去除療法具有抗性且已轉型為神經內分泌表型之前列腺腺癌中增加。本發明提供可使用抗DLL3抗體藥物結合物作為對於患有經鑑別為具有轉型為神經內分泌表型之風險之前列腺腺癌之患者(包括患有去勢抵抗性前列腺癌之彼等患者， 例如已接受雄激素去除療法之患者)有效之治療性治療策略。該等有風險之腫瘤通常再發、難治、復發或具有抗性。
C.3.膀胱癌
如本文所提供之實例中所闡述，在膀胱腺癌試樣中存在DLL3陽性細胞。小細胞神經內分泌腫瘤在膀胱中出現且極具侵襲性，但此可能係由缺乏靶向療法引起，尚未報導利用標準化學療法治療之膀胱TCC會轉變為小細胞神經內分泌腫瘤。已闡述與神經內分泌癌同時發生之腺癌(Jiang Y 2014)，因此膀胱癌可因腫瘤異質性而具有轉型為神經內分泌表型之風險。
本發明提供可使用抗DLL3抗體藥物結合物作為對於患有經鑑別為具有轉型為神經內分泌表型之風險之膀胱腺癌(包括再發、難治、復發或抗性膀胱腫瘤)的患者有效之治療性治療策略。
C.4.其他腺癌
新生小細胞或神經內分泌腫瘤以極低頻率發生於其他組織(包括腎上腺、乳房、膽囊、卵巢、子宮頸、子宮內膜、腎、胰臟、結腸、胃及甲狀腺)中。腺癌發生在來自肺、結腸、胰臟、前列腺、乳房、食管、胃、腎、子宮頸、子宮內膜及甲狀腺之具有腺結構之細胞中。對於大多數該等腺癌，尚未研發出靶向驅動腫瘤形成之特定致癌路徑之療法。對靶向療法之抗性可藉助該等腺癌之小細胞轉變發生。
III.DLL3生理學
已發現，DLL3表型決定子在臨床上與各種增殖性病症(包括展現神經內分泌特徵之贅瘤)相關，且DLL3蛋白及其變體或同種型提供可用於治療相關疾病之有用腫瘤標記物。就此而言，本發明提供多種包含抗DLL3 抗體靶向劑及酬載(例如，包含PBD彈頭之酬載)之抗體藥物結合物。如下文更詳細論述，所揭示之抗DLL3 ADC可尤其有效地消除致瘤細胞，且因此可用於治療及預防某些增殖性病症或其進展或再發。
另外已發現，DLL3標記物或決定子(例如細胞表面DLL3蛋白)在治療上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永生細胞)相關且可有效地用於將其消除或沉默。藉助使用如本文所揭示之抗DLL3結合物選擇性減少或消除癌症幹細胞之能力令人驚奇之處在於，已知該等細胞通常抵抗許多習用治療。即，傳統以及最新靶向治療方法之有效性通常受限於即使在該等種種治療方法下仍能夠使腫瘤生長永生之抗性癌症幹細胞之存在及/或出現。另外，與癌症幹細胞相關之決定子通常因低或不一致表現、無法保持與致瘤細胞締合或無法存在於細胞表面而使治療靶較差。與先前技術之教示形成鮮明對比，本發明所揭示之ADC及方法可有效地克服此固有抗性，且特異性消除、清除、沉默或促進該等癌症幹細胞之分化，由此抵消其持續或再誘導潛在腫瘤生長之能力。
因此，DLL3結合物(例如本文所揭示之彼等)可有利地用於治療及/或預防所選增殖性(例如贅瘤性)病症或其進展或再發。應瞭解，儘管下文將特定地在特定結構域、區或表位方面或在癌症幹細胞或腫瘤(包含神經內分泌特徵及其與所揭示抗體藥物結合物之相互作用)之背景下廣泛論述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應瞭解該等實例性實施例並不限制本發明之範圍。而是，本發明之最廣泛實施例及隨附申請專利範圍廣泛且明確地關於所揭示之抗DLL3結合物及其在治療及/或預防各種DLL3相關或介導之病症(包括贅瘤性或細胞增殖性病症)中之用途，而與任何具體作用機制或特異性靶向之腫瘤、細胞或分子組分無關。
Notch信號傳導路徑首次在隱桿線蟲(C.elegans)及果蠅(Drosophila)中鑑別且隨後顯示自無脊椎動物至脊椎動物在進化上保守，其參與一系列基本生物過程，包括正常胚胎發育、成體組織穩態及幹細胞維持(D’Souza等人，2010；Liu等人，2010)。Notch信號傳導在特化、模式化及形態發生期間對多種細胞類型至關重要。通常，此藉助側抑制機制進行，其中表現Notch配體之細胞採取默認細胞命運，但經由Notch信號傳導之刺激抑制毗鄰細胞中之此命運(Sternberg,1988；Cabrera 1990)。發現由Notch信號傳導調介之此二元細胞命運選擇在多種組織中起作用，該等組織包括發育神經系統(de la Pompa等人，1997)、造血及免疫系統(Bigas及Espinosoa,2012；Hoyne等人，2011；Nagase等人，2011)、腸(Fre等人，2005；Fre等人，2009)、內分泌胰臟(Apelqvist等人，1999；Jensen等人，2000)、垂體(Raetzman等人，2004)及瀰漫性神經內分泌系統(Ito等人，2000；Schonhoff等人，2004)。執行此二元切換之一般化機制似乎保守，但Notch在默認細胞命運選擇係藉由稱為鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)蛋白之轉錄調節劑來決定之細胞中起作用之發育系統的範圍廣泛，Notch信號傳導導致一類Notch反應性基因之活化，此又抑制bHLH蛋白之活性(Ball,2004)。該等二元決定在允許Notch信號傳導以實現增殖或抑制其及觸發自我更新或抑制其之較廣泛的發育及信號傳導線索背景下發生。
在果蠅中，Notch信號傳導主要由一個Notch受體基因及兩個配體基因(稱為Serrate及Delta)來調介(Wharton等人，1985；Rebay等人，1991)。在人類中，存在四種已知Notch受體及五種DSL(Delta-Serrate LAG2)配體-Serrate之兩種同系物(稱為Jagged1及Jagged 2)及Delta之三 種同系物(稱為δ樣配體或DLL1、DLL3及DLL4)。一般而言，信號接受細胞表面上之Notch受體係藉由與在相對信號發送細胞表面上表現之配體之相互作用(稱為反式相互作用)來活化。該等反式相互作用引起一系列蛋白酶調介之Notch受體裂解。因此，Notch受體細胞內結構域自膜自由易位至細胞核，在細胞核中該Notch受體細胞內結構域與CSL家族轉錄因子(在人類中為RBPJ)合作並將該等轉錄因子自轉錄抑制子轉變成Notch反應性基因之活化劑。
在人類Notch配體中，DLL3之不同之處在於其似乎無法經由反式相互作用來活化Notch受體(Ladi等人，2005)。Notch配體亦可與Notch受體順式相互作用(在同一細胞上)從而導致抑制Notch信號，但順式-抑制之確切機制尚不清楚且可端視配體而變化(例如參見Klein等人，1997；Ladi等人，2005；Glittenberg等人，2006)。兩種假設抑制模式包括藉由預防反式相互作用，或藉由擾亂受體之處理或藉由以物理方式使受體存留於內質網或高爾基體(Golgi)中來降低細胞表面上Notch受體之量，來調節細胞表面處之Notch信號傳導(Sakamoto等人，2002；Dunwoodie,2009)。然而，顯而易見相鄰細胞上Notch受體及配體之表現之隨機差異可藉助轉錄及非轉錄過程來放大，且順式相互作用及反式相互作用之細微平衡可引起相鄰組織中Notch調介之不同細胞命運描繪之微調(Sprinzak等人，2010)。
DLL3(亦稱為δ樣3或SCDO1)係δ樣Notch DSL配體家族之成員。代表性DLL3蛋白直向同源物包括(但不限於)人類(基因庫登錄號NP_058637及NP_982353)、黑猩猩(基因庫登錄號XP_003316395)、小鼠(基因庫登錄號NP_031892)及大鼠(基因庫登錄號NP_446118)。在人類中，DLL3基 因由位於染色體19q13上跨越9.5kBp之8個外顯子組成。最後一個外顯子內之選擇式剪接產生兩個經處理轉錄本，一個具有2389個鹼基(基因庫登錄號NM_016941)且一個具有2052個鹼基(基因庫登錄號NM_203486)。前一轉錄本編碼618個胺基酸之蛋白質(基因庫登錄號NP_058637；SEQ ID NO：1)，而後一者編碼587個胺基酸之蛋白質(基因庫登錄號NP_982353；SEQ ID NO：2)。DLL3之該兩種蛋白質同種型跨越其細胞外結構域及其跨膜結構域共有總體100%一致性，不同之處僅在於較長同種型含有在蛋白質之羧基末端含有32個額外殘基之延伸之胞質尾區。同種型之生物關聯性尚不清楚，但可在腫瘤細胞中檢測到兩種同種型。一般而言，DSL配體係由一系列如下結構結構域組成：獨特N末端結構域，隨後保守DSL結構域、多串聯表皮生長因子(EGF)樣重複單元、跨膜結構域及在配體之間並不高度保守之細胞質結構域，但含有多個為藉由獨特E3泛蛋白連接酶進行泛蛋白化之潛在位點之離胺酸殘基的DSL配體除外。DSL結構域係必不可少但對於與Notch受體之相互作用不充分之簡併EGF-結構域(Shimizu等人，1999)。另外，大多數DSL配體之前兩種EGF樣重複單元含有較小蛋白質序列基序，該基序稱為DOS結構域，在活化Notch信號傳導時其與DSL結構域合作相互作用。
DLL3蛋白之細胞外區包含六個EGF樣結構域、單一DSL結構域及N末端結構域。通常，EGF結構域識別為在hDLL3(SEQ ID NO：1及2)之約胺基酸殘基216-249(結構域1)、274-310(結構域2)、312-351(結構域3)、353-389(結構域4)、391-427(結構域5)及429-465(結構域6)處出現，且DSL結構域在約胺基酸殘基176-215處出現，且N末端結構域在約胺基酸殘基27-175處出現。EGF樣結構域中之每一者、DSL結構域及N末 端結構域包含DLL3蛋白之如藉由不同胺基酸序列界定之部分。應注意，出於本發明之目的，各別EGF樣結構域可稱為EGF1至EGF6，其中EGF1距蛋白質之N末端部分最近。就蛋白質之結構組成而言，本發明之一個顯著態樣係可生成、製造、改造或選擇所揭示之DLL3調節劑以便與所選結構域、基序或表位反應。在某些情形下，該等位點特異性調節劑可端視其主要作用模式提供增強之反應性及/或效能。在尤佳實施例中，抗DLL3 ADC將結合至DSL結構域，且在甚至更佳實施例中，其將結合至DSL結構域內包含G203、R205、P206之表位(SEQ ID NO：4)。
應注意，如本文所用術語「成熟蛋白質」或如本文所用「成熟多肽」係指藉由在哺乳動物細胞中表現而產生之蛋白質之形式。通常假設在跨過粗糙內質網輸出生長蛋白質鏈已起始之後，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽(SP)序列，該信號肽(SP)序列自完整多肽裂解以產生蛋白質之「成熟」形式。在DLL3之兩種同種型中，成熟蛋白質包含可在細胞表面表現之前經剪切之26個胺基酸之信號肽。因此，在成熟蛋白質中，N末端結構域將自該蛋白質之位置27延伸至DSL結構域之開頭。當然，若蛋白質不以此方式處理，則N末端結構域可保持延伸至SEQ ID NO：3及4之位置1。
在各種δ樣配體中，DLL3與該家族中之其他配體最為不同，乃因其含有簡併DSL結構域，無DOS基序，且含有缺乏離胺酸殘基之細胞內結構域。簡併DSL及缺乏DOS基序與DLL3無法以反式(在細胞之間)觸發Notch信號傳導係一致的，表明DLL3(與DLL1或DLL4不同)僅充當Notch信號傳導之抑制劑(Ladi等人，2005)。研究已顯示DLL3可能主要存留於順面高爾基體中(Geffers等人，2007)，此可能與將Notch受體保留在細胞內或干 擾Notch受體之處理，從而防止其輸出至細胞表面而使其再靶向至溶酶體的假設能力一致(Chapman等人，2011)。然而，當在模型系統中人工過表現某一DLL3蛋白時(Ladi等人，2005)，該蛋白質可出現在細胞表面，但在正常生物環境中及在其中DLL3 mRNA轉錄本升高之腫瘤中顯然並非如此；有些令人驚訝地，在腫瘤類型中檢測到之蛋白質含量指示大量DLL3蛋白正在逃逸至各種腫瘤之細胞表面。
DLL3基因之缺陷與人類之脊椎肋骨發育不全相關，該脊椎肋骨發育不全係導致異常脊椎骨形成及肋骨異常之嚴重先天性出生缺陷(Dunwoodie,2009)。此與Notch信號傳導之變化相關，已知該Notch信號傳導在確定體節之極性及模式化中起關鍵作用，脊椎骨之胚胎前體在Notch、Wnt及FGF信號傳導路徑之間需要微調之振盪相互作用以用於適當發育(Kageyama等人，2007；Goldbeter及Pourquie，2008)。儘管DLL1及DLL3通常在發育中小鼠胚胎內之類似位置表現，但利用轉基因小鼠之實驗已證明DLL3不補償DLL1(Geffers等人，2007)。DLL1剔除小鼠係胚胎致死的，但DLL3突變體小鼠確實存活，但顯示與在患有脊椎肋骨發育不全之人類中所發現者類似之表型(Kusumi等人，1998；Shinkai等人，2004)。該等結果數據與對於正常發育至關重要的Notch反式相互作用及順式-相互作用之細微相互作用係一致的。
此外，如上文所論述，Notch信號傳導在神經內分泌細胞及展現神經內分泌特徵之腫瘤之發育及維持中起作用。就此而言，Notch信號傳導參與正常內分泌器官及瀰漫性神經內分泌系統中之眾多細胞命運決定。例如，在胰臟中，需要Notch信號傳導來抑制由bHLH轉錄因子NGN3調介之默認內分泌表型之發展(Habener等人，2005)。類似的Notch調介之內分 泌細胞命運抑制發生在腸內分泌細胞(Schonhoff等人，2004)、甲狀腺濾泡旁細胞(Cook等人，2010)中，用於指定垂體中神經內分泌細胞類型之相對比率(Dutta等人，2011)，且可能參與決定肺內之細胞採取神經內分泌或非神經內分泌表型(Chen等人，1997；Ito等人，2000；Sriuranpong等人，2002)。因此，顯而易見在許多組織中Notch信號傳導之抑制與神經內分泌表型相關。
在腫瘤中通常觀察到發育信號傳導路徑之不適當再活化或正常信號傳導路徑之失調，且在Notch信號傳導之情形下，其與多種腫瘤類型相關(Koch及Radtke,2010；Harris等人，2012)。Notch路徑已在淋巴瘤、結腸直腸、胰臟及一些類型之非小細胞肺癌中作為致癌基因得到研究(參見Zarenczan及Chen,2010及其中之參考文獻)。相比之下，據報導Notch可充當具有神經內分泌特徵之腫瘤之腫瘤抑制劑(參見Zarenczan及Chen,2010，上文文獻)。具有神經內分泌特徵之腫瘤通常發生在眾多原發性位點中，且儘管該等腫瘤之詳盡分類仍成問題(Yao等人，2008；Klimstra等人，2010；Klöppel,2011)，但其可分類為四種主要類型：低惡性度(low-grade)良性類癌、具有惡性性質之低惡性度分化良好型神經內分泌腫瘤、具有混合之神經內分泌及上皮特徵之腫瘤及高惡性度低分化型神經內分泌癌。在該等分類中，低分化型神經內分泌癌(包括小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)之子集)係具有不樂觀預後之癌症類型。已假定SCLC在來源方面為支氣管源性的，其部分地由肺神經內分泌細胞產生(Galluzzo及Bocchetta,2011)。不論具有神經內分泌表型之該等腫瘤中之每一者之起源之具體細胞來源如何，可預計藉由Notch路徑基因本身中之直接病灶或藉由抑制Notch信號傳導之其他基因之活化而抑制Notch信號 傳導，可導致獲得該等腫瘤之神經內分泌表型。引申開來，導致擾亂Notch路徑之基因可為具有神經內分泌表型之腫瘤之治療、特別是為目前具有差臨床結果之適應症提供治療靶標。
ASCL1係一個該基因，其似乎經由DLL3與Notch信號傳導路徑相互作用。ASCL1(哺乳動物無剛毛鱗甲同系物1)係鹼性螺旋-環-螺旋轉錄因子家族之成員且藉由結合至稱為E-盒(5’-CANNTG-3’)之DNA共有序列來控制轉錄。
代表性ASCL1蛋白直向同源物包括(但不限於)人類(基因庫登錄號NP_004307)、黑猩猩(基因庫登錄號XP_009424458)、食蟹猴(基因庫登錄號XP_005572101)、大鼠(基因庫登錄號NP_032579)及小鼠(基因庫登錄號NP_032579)。在人類中，ASCL1基因由染色體12q23.2處跨越約3kBp之2個外顯子組成。人類ASCL1基因座之轉錄產生2490個核苷酸之轉錄本(基因庫登錄號NM_004316)，該轉錄本編碼236個胺基酸之蛋白質(基因庫登錄號NP_004307)。一直未報導選擇性剪接之轉錄本或變體蛋白質。
顯而易見，許多神經內分泌腫瘤顯示低分化型(即部分地完全)內分泌表型，例如，各種內分泌蛋白質及多肽(例如染色顆粒素A，CHGA；降鈣素，CALCA；促黑細胞素，POMC；體抑素，SST)、與分泌囊泡相關之蛋白質(例如，突觸素，SYP)及參與負責合成生物活性胺之生物化學路徑之基因(例如，多巴去羧酶，DDC)顯著升高或表現。也許並不令人驚奇，該等腫瘤通常過表現ASCL1(在小鼠中亦稱為mASH1，或在人類中亦稱為hASH1)，該ASCL1係已知在編排基因級聯中起作用從而導致神經及神經內分泌表型之轉錄因子。儘管級聯之特定分子細節尚不清楚，但愈來愈 明顯，對於某些細胞類型、特別是甲狀腺濾泡旁細胞(Kameda等人，2007)、腎上腺髓質之嗜鉻細胞(Huber等人，2002)及見於肺瀰漫性神經內分泌系統中之細胞(Chen等人，1997；Ito等人，2000；Sriuranpong等人，2002)，ASCL1係微調發育調節環路之一部分，其中細胞命運選擇係由ASCL1調介及Notch調介之基因表現級聯之平衡調介。例如，發現ASCL1係在正常小鼠肺神經內分泌細胞中表現，而Notch信號傳導效應物HES1係在肺非神經內分泌細胞中表現(Ito等人，2000)。該兩個級聯處於良好平衡狀態，且愈發識到潛在的交叉調節。Notch效應物HES1已顯示下調ASCL1表現(Chen等人，1997；Sriuranpong等人，2002)。該等結果顯然證明Notch信號傳導可抑制神經內分泌分化。然而，證明ASCL1結合至DLL3啟動子活化DLL3表現(Henke等人，2009)且DLL3減弱Notch信號傳導之觀察(Ladi等人，2005)關閉基因迴路用於神經內分泌與非神經內分泌表型之間之細胞命運選擇。
考慮到Notch信號傳導似乎進化成放大相鄰細胞之間之細微差異以允許界限清晰之組織域具有不同分化路徑(例如，如上文所闡述之「側抑制」)，該等數據共同表明經微調發育調節環路在具有神經內分泌表型之癌症中已變得再活化及失調。儘管DLL3鑒於其正常存留於細胞之內膜隔室內(Geffers等人，2007)及假定的其與該隔室中Notch之相互作用不明顯可為研發抗體治療劑提供適宜細胞表面靶標，但所得到的神經內分泌腫瘤中DLL3表現之升高可為具有神經內分泌表型之腫瘤(例如，NET及pNET)提供獨特治療靶標。通常觀察到實驗室系統中蛋白質之巨大過表現可導致過表現蛋白質在細胞內錯誤定位。因此，可合理地假定，腫瘤中DLL3之過表現可引起蛋白質之一些細胞表面表現，且藉此為抗體治療劑之研發提 供靶標，但在沒有實驗驗證之情況下此並不明顯。
Ⅳ. 抗體 A.抗體結構
抗體及其變體及衍生物(包括接受之命名及編號系統)已廣泛闡述於例如以下文獻中：Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版),W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology(第8版),Garland Science。
「抗體」或「完整抗體」通常係指包含藉由共價二硫鍵及非共價相互作用保持在一起之兩條重(H)多肽鏈及兩條輕(L)多肽鏈之Y形四聚體蛋白質。每一輕鏈係由一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)構成。每一重鏈包含一個可變結構域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體之情形下其包含三個結構域，稱為CH1、CH2及CH3(IgM及IgE具有第四個結構域CH4)。在IgG、IgA及IgD類別中，CH1與CH2結構域藉由撓性鉸鏈區分開，該撓性鉸鏈區係具有可變長度(在各個IgG子類中為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈二者中之可變結構域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區連結至恆定結構域，且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區。每一類抗體進一步包含由成對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內二硫鍵。
如本文所用術語「抗體」包括多株抗體(polyclonal antibodies、multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長化抗體、CDR移植抗體、人類抗體、重組產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體(包括突變蛋白及其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')2、 F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子優先締合或結合即可。另外，除非上下文約束另外指示，否則該術語進一步包含所有類別之抗體(即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體類別之重鏈恆定結構域通常分別由相應的小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之輕鏈指配為兩種完全不同的類型，稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ)。
抗體之可變結構域顯示抗體之間胺基酸組成之相當變化，且主要負責抗原識別及結合。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得IgG抗體具有兩個結合位點(即其為二價)。VH及VL結構域包含三個極端可變區，其稱為超變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其藉由四個較不可變區(稱為框架區(FR))構架並分開。VH區與VL區之間之非共價締合形成含有抗體之兩個抗原結合位點中之一者之Fv片段(對於「可變片段」)。可藉由遺傳改造獲得之ScFv片段(對於可變單鏈片段)以單一多肽鏈締合抗體中由肽連接體分開之VH及VL區。
除非另有說明，否則如本文所用胺基酸至每一結構域、框架區及CDR之指配可根據以下文獻所提供方案中之一者進行：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版),US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開號91-3242；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編輯(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co或 AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。如業內所熟知，可變區殘基編號通常係如Chothia或Kabat中所闡述。如自Abysis網站數據庫(參見下文)所獲得，包含如由Kabat、Chothia、MacCallum(亦稱為Contact)及AbM定義之CDR之胺基酸殘基闡釋於下文中。注意，MacCallum使用Chothia編號系統。
抗體序列中之可變區及CDR可根據業內已研發出之一般規則(如上文所闡釋，例如Kabat命名系統)或藉由將該等序列與已知可變區之數據庫進行比對來鑑別。用於鑑別該等區之方法闡述於以下文獻中：Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000。抗體序列之實例性數據庫闡述於以下網站中且可經由其存取：「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs(由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England之A.C.Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl.Acids Res.,33(數據庫期號)：D671-D674(2005)中所闡述。
較佳使用Abysis數據庫來分析序列，該Abysis數據庫將來自Kabat、IMGT及蛋白質數據庫(PDB)之序列數據與來自PDB之結構數據整合在一 起。參見Dr.Andrew C.R.Martin書章節Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.Antibody Engineering Lab Manual(編者：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis數據庫網站進一步包括已經研發用於鑑別可根據本文教示使用之CDR之一般規則。除非另外指明，否則本文所述之所有CDR皆係根據Kabat等人根據Abysis數據庫網站衍生而來。
對於本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置，根據首次闡述於Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中之Eu索引來編號，該文獻闡述經報導為第一個經測序之人類IgG1之骨髓瘤蛋白Eu之胺基酸序列。Edelman之EU索引亦闡述於Kabat等人，1991(上文文獻)中。因此，術語「如Kabat中所述之EU索引」或「Kabat之EU索引」或「EU索引」或「Eu編號」在重鏈背景下係指基於Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體之殘基編號系統，如Kabat等人，1991(上文文獻)中所述。用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統以類似方式闡述於Kabat等人(上文文獻)中。與本發明相容之實例性κ輕鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： (SEQ ID NO：5)。
類似地，與本發明相容之實例性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： (SEQ ID NO：6)。
可使用標準分子生物學技術使所揭示之恆定區序列或其變化形式或衍生物與所揭示之重鏈及輕鏈可變區可操作締合，以提供可原樣使用或納入本發明之ADC中之全長抗體。
免疫球蛋白分子中存在兩類二硫橋或鍵：鏈間及鏈內二硫鍵。如業內所熟知，鏈間二硫鍵之位置及數量根據免疫球蛋白類別及種類變化。儘管本發明並非限於抗體之任一特定類別或子類，但出於闡釋目的在本發明通篇中應使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中，存在十二個鏈內二硫鍵(四個在每一重鏈上且兩個在每一輕鏈上)及四個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常受一定保護且較鏈間鍵相對更不易於還原。相反，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白之表面上，為溶劑可及且通常相對容易還原。在重鏈之間及每一重鏈中之一者至其各別輕鏈之間存在兩個鏈間二硫鍵。已證明，鏈間二硫鍵並非鏈締合所必需。IgG1鉸鏈區含有在重鏈中形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸，其提供結構支撐以及促進Fab移動之撓性。重鏈/重鏈IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229(Eu編號)處，而輕鏈與IgG1之重鏈之間(重鏈/輕鏈)之IgG1鏈間二硫鍵在κ或λ輕鏈之C214與重鏈上游鉸鏈區之C220之間形成。
B. 抗體生成及產生
本發明之抗體可使用業內已知之各種方法來產生。
1. 宿主動物中多株抗體之生成
在各種宿主動物中產生多株抗體已為業內熟知(例如參見，Harlow及Lane(編輯)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press；及Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press)。為產生多株抗體，用抗原蛋白或包含抗原蛋白之細胞或製劑免疫免疫活性動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)。一段時間後，藉由採血或殺死動物獲得含有多株抗體之血清。血清可以自動物獲得之形式使用或抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離之抗體製劑。
就此而言，可自在免疫勝任動物中誘導免疫反應之任何DLL3或ASCL1決定子生成本發明之抗體。如本文所用「決定子」或「靶標」意指可鑑別與特定細胞、細胞群體或組織締合或特定發現於特定細胞、細胞群體或組織中或其上之任何可檢測性狀、性質、標記物或因子。決定子或靶標之性質可為形態的、功能的或生物化學的且較佳係表型的。在較佳實施例中，決定子係由特定細胞類型或由某些條件下之細胞(例如，在細胞週期之特定點期間或特定生態位之細胞)差異表現(過表現或過少表現)之蛋白質。出於本發明之目的，決定子較佳在異常癌細胞上差異表現，且可包含DLL3蛋白，或其剪接變體、同種型、同源物或家族成員中之任一者，或其特定結構域、區或表位。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意指在引入免疫勝任動物中時可刺激免疫反應且由藉由該免疫反應產生之抗體識別的任何DLL3或ASCL1蛋白或其任何片 段、區或結構域。可使用本文所涵蓋之決定子之存在或不存在來鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如、腫瘤、致瘤細胞或CSC)。
可使用任何形式之抗原或含有該抗原之細胞或製劑來生成特異性針對DLL3決定子之抗體。如本文所闡述之術語「抗原」係以廣義使用且可包含所選靶標之任何免疫原性片段或決定子，包括單一表位、多表位、單一或多結構域或整個細胞外結構域(ECD)或蛋白質。抗原可為經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如，用在其表面上表現抗原之至少一部分之細胞免疫)或可溶性蛋白質(例如，僅用該蛋白質之ECD部分免疫)或蛋白質構築體(例如Fc-抗原)。抗原可在經遺傳修飾之細胞中產生。上文所提及抗原中之任一者可單獨使用或與一或多種業內已知之免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA(例如cDNA)，且可編碼足以誘發免疫原性反應之ECD之至少一部分。可採用任何載體來轉變其中表現抗原之細胞，包括(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體(例如陽離子脂質)。
2. 單株抗體
在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之使用。如業內已知，術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，即，除可能存在極少量可能突變(例如天然存在突變)外，構成該群體之個別抗體皆相同。
單株抗體可使用業內已知之眾多種技術來製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如XenoMouse®)或其一些組合。舉例而言，單株抗體可使用例如詳細闡述於以下文獻中之雜交瘤及生物化學及遺傳改造技術來產生：An,Zhigiang(編輯)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,John Wiley and Sons，第1版2009；Shire等人(編輯)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC，第1版2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。在產生多種特異性結合至決定子之單株抗體後，可基於例如對決定子之親和力或內化速率藉助各個篩選過程選擇特別有效之抗體。可使用如本文所闡述產生之抗體作為「來源」抗體且可進一步修飾以例如改良對靶標之親和力，改良其在細胞培養物中之產生，降低活體內免疫原性，產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細闡述陳述於下文及隨附實例中。
3. 人類抗體
在另一實施例中，抗體可包含全人類抗體。術語「人類抗體」係指具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用製備下文所述人類抗體之任一技術製備之抗體。
人類抗體可使用業內已知之各種技術來產生。一種技術係噬菌體展示，其中在噬菌體上合成(較佳人類)抗體之文庫，利用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，且分離結合抗原之噬菌體，自該結合抗原之噬菌體可獲得免疫反應性片段。製備及篩選該等文庫之方法已為業內熟知且用於生成噬菌體展示文庫之套組可自市面購得(例如，Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM噬菌體展示套組，目錄號240612)。業內亦存在可用於生成及 篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(例如參見U.S.P.N.5,223,409；PCT公開號WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：7978-7982(1991))。
在一個實施例中，可藉由篩選如上文所製備之重組組合抗體文庫來分離重組人類抗體。在一個實施例中，文庫係使用自B細胞分離之mRNA製備之人類VL及VH cDNA生成之scFv噬菌體展示文庫。
藉由原始文庫(天然或合成的)產生之抗體可具有中等親和力(Ka為約106M-1至107M-1)，但亦可藉由自如業內所闡述之二級文庫構築及再選擇在活體外模擬親和力成熟。舉例而言，可藉由使用易錯聚合酶在活體外隨機引入突變(如在Leung等人，Technique,1：11-15(1989)中報導)。另外，可藉由以下實施親和力成熟：在所選個別Fv純系中，使用(例如)利用攜載跨越所關注CDR之隨機序列之引子之PCR隨機突變一或多個CDR，並篩選較高親和力純系。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈之CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。另一有效方法係將藉由噬菌體展示選擇之VH或VL結構域與獲自未經免疫供體之天然存在的V結構域變體之譜重組，並在若干輪鏈重新改組中針對較高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol.,10：779-783(1992)中所闡述。此技術使得產生具有約10-9M或更小之解離常數KD(k解離/k締合)之抗體及抗體片段。
在其他實施例中，可使用包含在表面上表現結合對之真核細胞(例如，酵母)之文庫採用類似程序。例如參見，U.S.P.N.7,700,302及U.S.S.N.12/404,059。在一個實施例中，人類抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人Nature Biotechnology 14：309- 314(1996)；Sheets等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：6157-6162(1998))。在其他實施例中，可自在真核細胞(例如酵母)中生成之組合抗體文庫分離人類結合對。例如參見，U.S.P.N.7,700,302。該等技術有利於篩選大量候選調節劑且提供相對容易的候選序列操縱(例如，藉由親和力成熟或重組體改組)。
人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入其中內源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)中來製備。在攻擊時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面皆非常類似於在人類中觀察到之情形，包括基因重排、組裝及抗體譜。此方法闡述於例如以下文獻中：U.S.P.N.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016及關於XenoMouse®技術之U.S.P.N.6,075,181及6,150,584；及Lonberg及Huszar,Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。另一選擇為，可經由使產生針對靶標抗原之抗體之人類B淋巴球(該等B淋巴球可自患有贅瘤性病症之個體回收或可已在活體外經免疫)永生來製備人類抗體。例如參見，Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J.Immunol,147(1)：86-95(1991)；及U.S.P.N.5,750,373。
無論來源如何，應瞭解可使用業內已知之分子改造技術製造人類抗體序列並引入如本文所闡述之表現系統及宿主細胞中。該等非天然重組產生之人類抗體(及標的組合物)與本發明之教示完全相容且明確保持在本發明之範圍內。在某些選擇態樣中，本發明之ADC包含充當細胞結合劑之重組產生之人類抗體。
4. 衍生抗體
在如上文所闡述生成、選擇及分離來源抗體之後，其可經進一步改變以提供具有改良醫藥特徵之抗DLL3或抗ASCL1抗體。較佳地，使用已知分子改造技術修飾或改變來源抗體以提供具有期望治療性質之衍生抗體。
4.1. 嵌合及人類化抗體
所選本發明實施例包含免疫特異性結合至DLL3或免疫特異性結合至ASCL1且可視為「來源」抗體之鼠類單株抗體。在所選實施例中，可藉助可選修飾來源抗體之恆定區及/或表位結合胺基酸序列自該等「來源」抗體衍生本發明之抗體。在某些實施例中，若藉助缺失、突變、取代、整合或組合來改變來源抗體之所選胺基酸，則抗體「衍生」自來源抗體。在另一實施例中，「衍生」抗體係其中將來源抗體之片段(例如，一或多個CDR或整個重鏈及輕鏈可變區)組合與受體抗體序列或納入該受體抗體序列中以提供衍生性抗體(例如嵌合或人類化抗體)者。該等「衍生」抗體可使用如下文所闡述之標準分子生物學技術生成，例如以改良對決定子之親和力；以改良抗體穩定性；以改良細胞培養物產生及產量；以降低活體內免疫原性；以降低毒性；以促進活性部分之結合；或以產生多特異性抗體。該等抗體亦可藉由化學方式或轉譯後修飾來修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)衍生自來源抗體。
在一個實施例中，本發明之抗體包含自共價連結之至少兩個不同種類或類別之抗體之蛋白質區段衍生之嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係指如下構築體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來自特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體以及該等 抗體之片段的相應序列一致或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人，1984,PMID：6436822)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包含可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變區的全部或大部分。在其他所選實施例中，抗DLL3或抗ASCL1抗體可「衍生」自本文所揭示之小鼠抗體。
在其他實施例中，本發明之嵌合抗體係「CDR移植」抗體，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自特定物種或屬於特定抗體類別或子類，而抗體之其餘部分主要衍生自來自另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體。對於在人類中之應用，可將一或多個所選齧齒類動物CDR(例如小鼠CDR)移植至人類受體抗體中，替代人類抗體之一或多個天然存在的CDR。該等構築體通常具有提供最大強度人類抗體功能(例如，補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))，同時減少個體對抗體之不期望免疫反應的優點。在一個實施例中，CDR移植抗體包含一或多個自小鼠獲得之納入人類框架序列中之CDR。
「人類化」抗體與CDR移植抗體類似。如本文所用，「人類化」抗體係包含衍生自一或多種非人類抗體(供體或來源抗體)之一或多個胺基酸序列(例如CDR序列)之人類抗體(受體抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR之殘基經來自非人類物種供體抗體之相應殘基替代。該等回復突變可幫助維持移植CDR之適當三維組態且由此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自各種供體物種之抗體，包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。另外，人類化抗體可包含未在接受者抗體或供體抗體中發現之 新殘基，以例如進一步細化抗體性能。如下文實例中所闡述提供包含來源抗體之鼠類組分及受體抗體之人類組分之與本發明相容之CDR移植及人類化之抗體。
可使用各種業內公認技術來確定使用哪些人類序列作為受體抗體來提供本發明之人類化構築體。相容性人類種系序列之編譯及確定該等人類種系序列作為受體序列之適宜性之方法揭示於例如以下文獻中：Dubel及Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14：4628-4638)。V-BASE目錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(由Tomlinson,I.A.等人MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK)，亦可使用其來鑑別相容性受體序列。另外，例如U.S.P.N.6,300,064中所述之共有人類框架序列亦可證實為相容性受體序列且可根據本發明教示使用。一般而言，基於與鼠類來源框架序列之同源性以及來源及受體抗體之CDR經典結構之分析選擇人類框架受體序列。然後可使用業內公認技術合成衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區之衍生序列。
舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法闡述於U.S.P.N.6,180,370及5,693,762中。關於其他細節，例如參見Jones等人，1986(PMID：3713831)及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。
CDR移植或人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如本文所論述來測定，且在如此量測時將較佳共有至少60%或65% 序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基由具有具有類似化學性質(例如，電荷或疏水性)之側鏈(R基團)的另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。
應瞭解，如附圖1A、1B、3A及3B中所提供之經注釋CDR及框架序列係根據Kabat等人使用專有Abysis數據庫來定義。然而，如本文所論述，熟習此項技術者可根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義容易地鑑別CDR。因此，包含一或多個根據上文所提及系統中之任一者衍生而來之CDR之抗DLL3或抗ASCL1人類化抗體明確保持在本發明之範圍內。
4.2. 位點特異性抗體
本發明之抗體可經改造以促進結合至細胞毒素或其他抗癌劑(如下文更詳細論述)。就細胞毒素在抗體上之位置及藥物對抗體之比率(DAR)而言，抗體藥物結合物(ADC)製劑有利地包含ADC分子之均質群體。基於本發明，熟習此項技術者可容易地製造如本文所闡述之位點特異性經改造構築體。如本文所用「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意指其中重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸缺失、改變或經取代(較佳經另一胺基酸取代)以提供至少一個游離半胱胺酸之抗體或其免疫反應性片段。類似地，「位點特異性結合物」應意指包含位點特異性抗體及至少一種結合至未配對或游離半胱胺酸之細胞毒素或其他化合物(例如，報導子分子)之 ADC。在某些實施例中，未配對半胱胺酸殘基包含未配對之鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基包含未配對之鏈間半胱胺酸殘基。在再其他實施例中，游離半胱胺酸可改造至抗體之胺基酸序列中(例如，在CH3結構域中)。在任一情形下，位點特異性抗體可具有各種同型，例如，IgG、IgE、IgA或IgD；且在彼等類別內，該抗體可具有各種子類，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體，抗體之輕鏈可包含各自納入C214之κ或λ同型，在所選實施例中，該C214可由於在IgG1重鏈中缺乏C220殘基而未配對。
因此，除非上下文另有指示，否則如本文所用術語「游離半胱胺酸」或「未配對之半胱胺酸」可互換使用，且應意指抗體中無論係天然存在的抑或使用分子改造技術特定地納入所選殘基位置中的均不為在生理條件下天然存在(或「天然」)二硫鍵之一部分的任一半胱胺酸(或含硫醇)成分(例如，半胱胺酸殘基)。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包含天然存在之半胱胺酸，其天然鏈間或鏈內二硫橋伴侶已經取代、消除或以其他方式改變以斷裂生理條件下之天然存在之二硫橋，藉此使得未配對之半胱胺酸適於位點特異性結合。在其他較佳實施例中，游離或未配對之半胱胺酸包含選擇性地置於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內預定位點處之半胱胺酸殘基。應瞭解，在結合之前，游離或未配對之半胱胺酸可端視系統之氧化態以下列形式存在：硫醇(經還原半胱胺酸)、經封端半胱胺酸(經氧化)，或與相同或不同分子上之另一半胱胺酸或硫醇基團形成之非天然分子內或分子間二硫鍵(經氧化)之一部分。如下文更詳細地論述，適當改造之抗體構築體之輕度還原將提供可用於位點特異性結合之硫醇。因此，在尤佳實施例中，游離或未配對之半胱胺酸(無論係天然存在的抑或納入的) 將經受選擇性還原及後續結合以提供均質DAR組合物。
應瞭解，所揭示經改造結合物製劑所展現之有利性質至少部分地基於特異性引導結合且極大限制所製造結合物之結合位置及組合物之絕對DAR值的能力來預測。與大多數習用ADC製劑不同，本發明無需完全依賴於抗體之部分或全部還原來提供隨機結合位點及DAR種類之相對不受控生成。而是，在某些態樣中，本發明較佳藉由改造靶向抗體以斷裂天然存在(即，「天然」)之鏈間或鏈內二硫橋中之一或多者或在任一位置引入半胱胺酸殘基來提供一或多種預定的未配對(或游離)半胱胺酸位點。為此，應瞭解，在所選實施例中，可使用標準分子改造技術將半胱胺酸殘基沿抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈納入任一位置或附加至其中。在其他較佳實施例中，天然二硫鍵之斷裂可與引入非天然半胱胺酸(其然後包含游離半胱胺酸)、然後可使用該非天然半胱胺酸作為結合位點組合來實現。
在某些實施例中，改造抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文所用「鏈間半胱胺酸殘基」意指參與在抗體之輕鏈與重鏈之間或在抗體之兩條重鏈之間之天然二硫鍵的半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」係與同一重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然配對者。在一個實施例中，缺失或經取代之鏈間半胱胺酸殘基參與形成在輕鏈與重鏈之間之二硫鍵。在另一實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基參與在兩條重鏈之間之二硫鍵。在典型實施例中，因抗體之互補結構(其中輕鏈係與重鏈之VH及CH1結構域配對，且其中一條重鏈之CH2及CH3結構域係與互補重鏈之CH2及CH3結構域配對)所致，輕鏈中或重鏈中單一半胱胺酸之突變或缺失可在經改造抗體中產生兩個未配對之半胱胺 酸殘基。
在一些實施例中，鏈間半胱胺酸殘基缺失。在其他實施例中，鏈間半胱胺酸經另一胺基酸(例如，天然存在之胺基酸)取代。舉例而言，胺基酸取代可引起鏈間半胱胺酸經中性(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)殘基之替代。在所選實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸替代。
在本發明所涵蓋之一些實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基係於輕鏈(κ或λ)上，藉此在重鏈上留下游離半胱胺酸。在其他實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基係於重鏈上，在輕鏈恆定區上留下游離半胱胺酸。在組裝之後，應瞭解在完整抗體之輕鏈或重鏈中缺失或取代單一半胱胺酸產生具有兩個未配對半胱胺酸殘基之位點特異性抗體。
在一個實施例中，IgG輕鏈(κ或λ)之位置214處之半胱胺酸(C214)缺失或經取代。在另一實施例中，IgG重鏈上位置220處之半胱胺酸(C220)缺失或經取代。在其他實施例中，重鏈上位置226或位置229處之半胱胺酸缺失或經取代。在一個實施例中，重鏈上之C220經絲胺酸取代(C220S)以在輕鏈中提供期望之游離半胱胺酸。在另一實施例中，輕鏈中之C214經絲胺酸取代(C214S)以在重鏈中提供期望之游離半胱胺酸。該等位點特異性構築體更詳細地闡述於下文實例中。相容性位點特異性構築體之概述緊接示於下文表2中，其中編號通常係根據如Kabat中所闡述之Eu索引進行，WT代表沒有變化之「野生型」或天然恆定區序列，且代爾塔(△)指定胺基酸殘基之缺失(例如，C214△指示位置214處之半胱胺酸殘基已缺失)。
關於引入或添加一或多個半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(與斷裂天然二硫鍵相反)，熟習此項技術者可容易地辨別抗體或抗體片段上之相容性位置。因此，在所選實施例中，可將半胱胺酸引入CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域或其任一組合中，此端視期望之DAR、抗體構築體、所選酬載及抗體靶標而定。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL結構域中，且在尤佳實施例中，將其引入CL結構域之c末端區中。在每一情形下，可改變、去除或取代靠近半胱胺酸插入位點之其他胺基酸殘基以促進分子穩定性、結合效率或在酬載附接時為該酬載提供保護環境。在特定實施例中，經取代殘基係在抗體之任何可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代該等表面殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體上容易可及之位點且可選擇性還原，如本文進一步闡述。在特定實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團藉此位於抗體之可及位點且可用於選擇性結合抗體。在某些實施例中，下列殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。其他取代位置及製造相容性位點特異性抗體之方法闡述於U.S.P.N.7,521,541中，該案係以全文併入本文中。
生成如本文所揭示具有所定義位點及化學計量之載藥量之抗體藥物結合物之策略廣泛適用於所有抗DLL3或抗ASCL1抗體，乃因其主要涉及抗體之保守恆定結構域之改造。由於已充分記載每一類別及子類抗體之胺基酸序列及天然二硫橋，因此熟習此項技術者無需過多實驗即可容易地製造出各種抗體之經改造構築體，且因此，該等構築體明確涵蓋在本發明之範圍內。
用於生成如本文所揭示具有所定義位點及化學計量之載藥量之抗體-藥物結合物之策略廣泛適用於所有抗DLL3或抗ASCL1抗體，乃因其主要涉及抗體之保守恆定結構域之改造。由於已充分記載每一類別及子類抗體之胺基酸序列及天然二硫橋，因此熟習此項技術者無需過多實驗即可容易地製造出各種DLL3或ASCL1抗體之經改造構築體，且因此，該等構築體明確涵蓋在本發明之範圍內。
4.3 恆定區修飾及改變之醣基化
所選本發明實施例亦可包含恆定區(即Fc區)之取代或修飾，包括(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，此使得化合物具有包括(但不限於)以下之特徵：改變之藥物動力學、延長之血清半衰期、增加之結合親和性、降低之免疫原性、增加之產生、改變之Fc配體與Fc受體(FcR)之結合、增強或降低之ADCC或CDC、改變之醣基化及/或二硫鍵及改良之結合特異性。
具有改良之Fc效應物功能之化合物可例如藉助改變參與Fc結構域與Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間之相互作用之胺基酸殘基來生成，該改變可引起增加之細胞毒性及/或改變之藥物動力學，例如延長之血清半衰期(例如參見，Ravetch及Kinet,Annu.Rev. Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。
在所選實施例中，具有延長之活體內半衰期之抗體可藉由修飾(例如，取代、缺失或添加)經鑑別參與Fc結構域與FcRn受體之間之相互作用之胺基酸殘基來生成(例如，參見國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。就該等實施例而言，Fc變體可在哺乳動物、較佳人類中提供大於5天、大於10天、大於15天、較佳大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月或大於5個月之半衰期。延長之半衰期引起更高之血清效價，此由此降低抗體之投與頻率及/或降低欲投與抗體之濃度。可在(例如)表現人類FcRn之轉基因小鼠或經轉染人類細胞系中或在投與具有變體Fc區之多肽之靈長類動物中，分析人類FcRn高親和力結合多肽之活體內與人類FcRn之結合及血清半衰期。WO 2000/42072闡述具有改良或減少之與FcRn之結合之抗體變體。例如亦參見，Shields等人J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。令人驚訝的是，除用於提供可選位點特異性結合物之彼等以外，沒有任何抗體恆定區修飾之某些本發明ADC展現延長之終末半衰期(例如，約兩週)。
在其他實施例中，Fc變化可引起增強或降低之ADCC或CDC活性。如業內習知，CDC係指在補體存在下靶細胞之溶解，且ADCC係指一種形式之細胞毒性，其中結合至某些細胞毒性細胞(例如，天然殺手細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上所存在FcR上之經分泌Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原之靶細胞且隨後利用細胞毒素殺死靶細胞。在本發明之情形下，提供具有「改變」之FcR結合親和性之抗體變體，該 FcR結合親和性為與親代或未修飾之抗體或與包含天然序列FcR之抗體相比有所增強或減少之結合。與天然序列相比，展示降低之結合之該等變體可具有極少或不顯著結合，例如，0-20%與FcR之結合，例如如藉由業內熟知之技術所測定。在其他實施例中，與天然免疫球蛋白Fc結構域相比，變體將展現增強之結合。應瞭解，該等類型之Fc變體可有利地用於增強所揭示抗體之有效抗贅瘤性質。在其他實施例中，該等變化引起增加之結合親和性、降低之免疫原性、增加之產生、改變之醣基化及/或二硫鍵(例如，對於結合位點)、改良之結合特異性、增加之吞噬作用；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。
再其他實施例包含一或多種經改造糖型，例如，共價附接至蛋白質(例如，在Fc結構域中)之包含改變之醣基化型式或改變之碳水化合物組成之位點特異性抗體。例如參見，Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740。經改造糖型可用於各種目的，包括(但不限於)增強或減少效應物功能、增加抗體對靶標之親和力或促進抗體之產生。在某些實施例中，倘若期望減少之效應物功能，則分子可經改造以表現無醣基化形式。可引起消除一或多個可變區框架醣基化位點以藉此消除該位點之醣基化之取代已為人熟知(例如，參見U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反，可藉由在一或多個其他醣基化位點處進行改造來賦予含有Fc之分子增強之效應物功能或改良之結合。
其他實施例包括具有改變之醣基化組成之Fc變體，例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之平分型GlcNAc結構之抗體。已證實，該等經改變糖基化型式可增加抗體之ADCC能力。經改造糖型可藉由熟習此項技術者已知之任一方法來生成，例如藉由使用經改造 或變體表現菌株、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在各種生物體或來自各種生物體之細胞系中表現包含Fc區之分子或藉由在已表現包含Fc區之分子之後改質碳水化合物(例如參見，WO 2012/117002)。
4.4片段
根據本文教示，無論選擇哪種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實踐本發明，應瞭解可使用其免疫反應性片段(本身或作為抗體藥物結合物之一部分)。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文所用術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體中與所選抗原或其免疫原性決定子免疫特異性結合或反應或與衍生出片段用於特異性抗原結合之完整抗體競爭的多肽片段。
實例性位點特異性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單一結構域抗體片段、雙價抗體、直鏈抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包含抗體中保留與抗原/受質或受體相互作用之能力且以與完整抗體類似之方式對其進行修飾(但可能具有稍低之效率)之部分。該等抗體片段可經進一步改造以包含一或多個如本文所闡述之游離半胱胺酸。
在其他實施例中，抗體片段係包含Fc區且保留正常地與存在於完整抗體中之Fc區相關之生物學功能中之至少一者(例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)的抗體片段。在一個實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體類似之單價抗體。例如，此一抗體片段可包含連接至能賦予片段活體內穩定性之包含至少一個游離半胱胺酸之 Fc序列的抗原結合臂。
如熟習此項技術者將公認，可藉由分子改造或經由完整或完全抗體或抗體鏈之化學或酶處理(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)或藉由重組方式來獲得片段。關於抗體片段之更詳細闡述，例如參見Fundamental Immunology,W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1999)。
4.5 多價構築體
在其他實施例中，本發明之抗體及結合物可為單價或多價(例如，二價、三價等)。如本文所用術語「化合價」係指與抗體締合之潛在靶標結合位點之數量。每一靶標結合位點特異性結合一個靶標分子或靶標分子上之特定位置或基因座。當抗體為單價時，分子之每一結合位點將特異性結合至單一抗原位置或表位。當抗體包含一個以上靶標結合位點(多價)時，每一靶標結合位點可特異性結合相同或不同分子(例如，可結合至不同配體或不同抗原或同一抗原上之不同表位或位置)。例如參見，U.S.P.N.2009/0130105。
在一個實施例中，抗體係其中雙鏈具有不同特異性之雙特異性抗體，如Millstein等人，1983,Nature,305：537-539中所闡述。其他實施例包括具有額外特異性之抗體，例如三特異性抗體。其他更複雜的相容性多特異性構築體及其製造方法闡述於以下文獻中：U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methodsin Enzymology,121：210；及WO96/27011。
多價抗體可免疫特異性結合至期望靶標分子之不同表位或可免疫特異性結合至靶標分子以及異源表位(例如異源多肽或固體支撐材料)二者。儘管所選實施例可僅結合兩種抗原(即雙特異性抗體)，但本發明亦涵蓋具 有額外特異性之抗體(例如三特異性抗體)。雙特異性抗體亦包括交聯型或「異源結合物」抗體。舉例而言，異源結合物中之一種抗體可偶合至抗生物素蛋白，另一種抗體偶合至生物素。例如已提出該等抗體使免疫系統細胞靶向不期望細胞(U.S.P.N.4,676,980)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異源結合物抗體可使用任何便利交聯方法製得。適宜交聯劑已為業內熟知且連同多種交聯技術一起揭示於U.S.P.N.4,676,980中。
5. 抗體之重組產生
抗體及其片段可使用自產生抗體之細胞獲得之遺傳材料及重組技術來產生或修飾(例如參見；Dubel及Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell(編輯)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版),NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.；及U.S.P.N.7,709,611)。
本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純的形式存在。核酸係當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl分級、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內所熟知之其他技術)與其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時「經分離」或使其實質上純的。本發明核酸可為例如DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如肽核酸)，而無論係單鏈抑或雙鏈或RNA、RNA，且可或可不含有 內含子。在所選實施例中，核酸係cDNA分子。
本發明核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由雜交瘤(例如，如下文實例中所述製備之雜交瘤)表現之抗體，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體，可自該文庫回收編碼該抗體之核酸。
可藉由標準重組DNA技術進一步操縱編碼VH及VL區段之DNA片段，以例如將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段可操作地連接至編碼另一蛋白質或蛋白質片段(例如抗體恆定區或撓性連接體)之另一DNA片段。如在此上下文中所使用，術語「可操作地連接」意指連結兩個DNA片段，使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。
可藉由將編碼VH之DNA操作地連接至編碼重鏈恆定區(在IgG1之情形下CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人(1991)(上文文獻))，且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳係IgG1或IgG4恆定區。實例性IgG1恆定區闡述於SEQ ID NO：2中。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人 (1991)(上文文獻))，且涵蓋該等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳係κ恆定區。實例性相容性κ輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO：5中。
本文涵蓋展現與本發明多肽「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，衍生之人類化抗體VH或VL結構域可展現與來源(例如，鼠類)或受體(例如，人類)VH或VL結構域之序列相似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%序列一致性。如本文所用，兩個胺基酸序列之間之同源性%等效於兩個序列之間之一致性%。兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數變化而變化(即同源性%=一致位置數/總位置數×100)，考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之空位數及每一空位之長度。兩條序列之間之序列比較及一致性%測定可使用數學演算法來完成，如下文非限制性實例中所述。
兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之演算法(Comput.Appl.Biosci.、4：11-17(1988))、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
另外或另一選擇為，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序 列」來實施針對公共數據庫之檢索，以例如鑑別相關序列。該等檢索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(版本2.0)來實施。可利用XBLAST程式、評分=50、字長=3來實施BLAST蛋白質檢索以獲得與本發明之抗體分子同源之胺基酸序列。為獲得空位比對用於比較目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用空位BLAST。當使用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參數。
不一致之殘基位置可因保守胺基酸取代或不保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。在用不保守胺基酸取代之情形下，在實施例中，展現序列一致性之多肽將保留本發明多肽(例如抗體)之期望功能或活性。
本文亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之核酸。「同源序列」意指展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參考核酸之93%、95%或98%序列一致性。
本發明亦提供載體，其包含可操作地連接至啟動子之該等上述核酸(例如，參見WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；及真核分泌路徑之其他轉錄調節及處理控制元件。本發明亦提供具有彼等載體及宿主表現系統之宿主細胞。
如本文所用術語「宿主表現系統」包括可經改造以生成本發明之核 酸或多肽及抗體的任一類型細胞系統。該等宿主表現系統包括(但不限於)微生物(例如，大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(B.subtilis))，其經重組噬菌體DNA或質體DNA轉變或轉染；酵母(例如，酵母菌屬(Saccharomyces))，其經重組酵母表現載體轉染；或哺乳動物細胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)，其具有含有衍生自哺乳動物細胞或病毒基因體之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子)之重組表現構築體。宿主細胞可經兩種表現載體共轉染，例如，第一載體編碼重鏈衍生之多肽且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。
轉變哺乳動物細胞之方法已為業內所熟知。例如參見，U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主細胞亦可經改造以便能夠產生具有各種特徵之抗原結合分子(例如具有GnTIII活性之經修飾糖型或蛋白質)。
對於重組蛋白之長期、高產率產生而言，較佳者係穩定表現。因此，穩定表現所選抗體之細胞系可使用業內公認之標準技術來改造且形成本發明之一部分。宿主細胞可利用由適當表達控制元件(例如，啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記物來轉變，而不是利用含有病毒複製起點之表現載體。可使用業內熟知之任一選擇系統，包括麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供有效增強所選條件下之表現之方法。GS系統係結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N.5,591,639及5,879,936整體或部分地來論述。用於產生穩定細胞系之另一相容性表現系統係FreedomTM CHO-S套組(Life Technologies)。
在藉由重組表現或任何其他所揭示技術產生本發明抗體之後，可藉 由業內已知之方法對該本發明抗體進行純化或分離，使得其自其天然環境鑑別及分離及/或回收，且與可干擾抗體或相關ADC之診斷或治療用途之污染物分離。經分離抗體包括重組細胞內之原位抗體。
該等經分離製劑可使用各種業內公認之技術來純化，例如離子交換及粒徑篩析層析、透析、滲濾及親和層析、特別是蛋白質A或蛋白質G親和層析。相容性方法更全面地論述於下文實例中。
6. 產生後選擇
不論以何種方式獲得，均可針對合意特徵(包括例如，穩健生長、高抗體產生及合意抗體特徵(例如對所關注抗原之高親和力))對產生抗體之細胞(例如，雜交瘤、酵母群落等)進行選擇、選殖及進一步篩選。雜交瘤可在細胞培養物中進行活體外擴增或在同基因免疫受損動物中進行活體內擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤及/或群落之方法為熟習此項技術者已知。在鑑別出期望抗體後，可立即使用常用業內公認分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關遺傳材料。
由原始文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力(Ka為約106M-1至107M-1)。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶在活體外引入隨機突變)及自彼等二級文庫重新選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母展示)在活體外模擬親和力成熟。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。
可使用各種技術來選擇抗體，包括(但不限於)噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並自可獲得抗體或免疫反應性片段者分離 結合該抗原之噬菌體或酵母(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於產生噬菌體或酵母展示文庫之套組在市面上有售。業內亦存在可用於產生及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(參見U.S.P.N.5,223,409、WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供序列之相對較容易的操縱(例如藉由重組改組)。
V. 抗體之特徵
在某些實施例中，可選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤或酵母群落)之有利性質，包括例如穩健生長、高抗體產生及如下文更詳細論述之合意位點特異性抗體特徵。在其他情形下，可藉由選擇用於接種動物之特定抗原(例如特異性DLL3或ASCL1同種型)或靶標抗原之免疫反應性片段來賦予抗體之特徵。在再其他實施例中，所選抗體可如上文所述經改造以增強或細化諸如親和力或藥物動力學等免疫化學特徵。
A. 中和抗體
在某些實施例中，結合物包含「中和」抗體或其衍生物或片段。亦即，本發明可包含結合特定結構域、基序或表位且能阻斷、減少或抑制DLL3或ASCL1之生物學活性之抗體分子。更通常，術語「中和抗體」係指結合至靶標分子或配體或與其相互作用且預防靶標分子與結合伴侶(例如受體或受質)之結合或締合、藉此中斷原本可由分子之相互作用引起之生物學反應的抗體。
應瞭解，可使用業內已知之競爭性結合分析來評價抗體或免疫功能片段或其衍生物之結合及特異性。就本發明而言，當過量抗體使結合至DLL3或ASCL1之結合伴侶之量降低至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多時，如藉由(例如)Notch受體活性或在活體外競爭性結合分析中所量測，抗體或片段將保持抑制或減少DLL3或ASCL1與結合伴侶或受質之結合。在針對(例如)DLL3之抗體之情形下，中和抗體或拮抗劑將較佳使Notch受體活性改變至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更多。應瞭解，此經改變活性可直接使用業內公認之技術來量測或可藉由經改變活性對下游所具有的影響(例如，腫瘤形成、細胞存活或Notch反應性基因之活化或抑制)來量測。較佳地，抗體中和DLL3活性之能力係藉由對DLL3與Notch受體結合之抑制或藉由評價其減輕DLL3介導之Notch信號傳導抑制之能力來評價。
B. 內化抗體
在某些實施例中，抗體可包含內化抗體使得抗體將結合至決定子且將內化(連同任何結合之醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包括致瘤細胞)中。經內化抗體分子之數量可足以殺死抗原表現細胞，尤其抗原表現致瘤細胞。端視抗體或在一些情況下抗體藥物結合物之功效而定，單一抗體分子吸收至細胞中足以殺死抗體所結合之靶標細胞。就本發明而言，有證據表明經表現DLL3蛋白之相當大一部分保持與致瘤細胞表面締合，藉此使得所揭示抗體或ADC之定位及內化。在所選實施例中，該等抗體將與一或多種在內化時殺死細胞之藥物締合或結合。在一些實施例中，本發明之ADC包含內化位點特異性ADC。
如本文所用，「內化」之抗體係在結合至經締合決定子時(連同任何經結合細胞毒素一起)由靶標細胞吸收者。該等經內化ADC之數量將較佳足以殺死決定子表現細胞、尤其決定子表現癌症幹細胞。端視細胞毒素或在一些情況下整體ADC之功效而定，少數抗體分子吸收至細胞中足以殺死抗體所結合之靶標細胞。舉例而言，某些藥物(例如PBD或卡奇黴素)如此強效以致於內化結合至抗體之少數毒素分子即足以殺死靶標細胞。抗體在結合至哺乳動物細胞時是否內化可藉由各種業內公認之分析(例如，肥皂草毒素分析，例如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting系統)來確定。檢測內化至細胞中之抗體之方法亦闡述於U.S.P.N.7,619,068中。
C. 消耗性抗體
在其他實施例中，本發明抗體係消耗性抗體。術語「消耗性」抗體係指較佳結合至處於細胞表面上或附近之抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如，藉由CDC、ADCC或細胞毒性劑引入)之抗體。在實施例中，所選消耗性抗體將結合至細胞毒素。
較佳地，消耗性抗體將能殺死所定義細胞群體中至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之DLL3表現細胞或ASCL1表現細胞。在一些實施例中，細胞群體可包含經富集、切片、純化或分離之致瘤細胞，包括癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含完整腫瘤試樣或包含癌症幹細胞之異質腫瘤提取物。根據本文之教示可使用標準生物化學技術來監測及量化致瘤細胞之消耗。
D.結合親和性
本文揭示對特定決定子(例如DLL3或ASCL1)具有高結合親和力之抗體。術語「KD」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。 當解離常數KD(k解離/k締合)10-7M時，本發明抗體可免疫特異性結合其靶標抗原。抗體在KD 5×10-9M時以高親和力特異性結合抗原，且在KD 5×10-10M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體具有10-9M之KD及約1×10-4/sec之離解速率。在本發明之一個實施例中，離解速率<1×10-5/sec。在本發明之其他實施例中，抗體將以介於約10-7M與10-10M之間之KD結合至決定子，且在又一實施例中，其將以2×10-10M之KD結合。本發明之再其他所選實施例包含具有以下KD(k解離/k締合)之抗體：小於10-6M、小於5×10-6M、小於10-7M、小於5×10-7M、小於10-8M、小於5×10-8M、小於10-9M、小於5×10-9M、小於10-10M、小於5×10-10M、小於10-11M、小於5×10-11M、小於10-12M、小於5×10-12M、小於10-13M、小於5×10-13M、小於10-14M、小於5×10-14M、小於10-15M或小於5×10-15M。
在某些實施例中，免疫特異性結合至決定子(例如DLL3或ASCL1)之本發明抗體可具有以下締合速率常數或k 締合 (或k a )速率(抗體+ 抗原(Ag)k 締合←抗體-Ag)：至少105M-1s-1、至少2×105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107M-1s-1或至少108M-1s-1。
在另一實施例中，免疫特異性結合至決定子(例如DLL3或ASCL1)之本發明抗體可具有以下解離速率常數或k 解離 (或k d )速率(抗體+ 抗原(Ag)k 解離←抗體-Ag)：小於10-1 s-1、小於5×10-1 s-1、小於10-2 s-1、小於5×10-2 s-1、小於10-3 s-1、小於5×10-3 s-1、小於10-4 s-1、小於5×104 s-1、小於10-5 s-1、小於5×10-5 s-1、小於10-6 s-1、小於5×10-6 s-1、小於10-7 s-1、小於5×10-7 s-1、小於10-8 s-1、小於5×10-8 s-1、小於10-9 s-1、小於5×10-9 s-1或小於10-10 s-1。
結合親和力可使用業內已知之各種技術來測定，例如表面電漿子共振、生物層干涉術、雙極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱、ELISA、分析超速離心及流式細胞術。
E.分倉及表位映射
本文所揭示之抗體可根據其所締合之離散表位來表徵。「表位」係決定子中抗體或免疫反應性片段所特異性結合之部分。免疫特異性結合可基於如上文所闡述之結合親和性或藉由抗體對蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中之其靶標抗原之優先識別(例如在競爭分析中)來證實及定義。 「線性表位」係藉由抗原中容許抗體之免疫特異性結合之鄰接胺基酸形成。即使在抗原變性時亦通常維持優先結合線性表位之能力。相反，「構象表位」通常包含抗原之胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構之情況下該等非鄰接胺基酸足夠靠近以同時被單一抗體結合。當具有構象表位之抗原變性時，抗體通常將不再識別抗原。表位(鄰接或非鄰接)通常包括至少3個、且更通常至少5個或8至10個或12至20個呈獨特空間構象之胺基酸。
亦可根據本發明抗體所屬的群組或「倉」來表徵該等本發明抗體。「分倉」係指使用競爭性抗體結合分析來鑑別無法同時結合免疫原性決定子之抗體對，藉此鑑別「競爭」結合之抗體。競爭性抗體可藉由其中所測試抗體或免疫功能片段預防或抑制參考抗體與共用抗原之特異結合之分析來確定。通常，此一分析涉及結合至固體表面或細胞、未標記之測試抗體及經標記參考抗體之經純化抗原(例如DLL3、ASCL1或其結構域或片段)的使用。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。關於測定競爭性結合之方法之其他細節提供於本文實例 中。通常，在存在過量競爭性抗體時，其將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的參考抗體與共用抗原之特異性結合。在一些情況下，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。相反，當結合參考抗體時，其較佳將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的隨後添加之測試抗體(即，DLL3抗體或ASCL1抗體)之結合。在一些情況下，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。
通常，分倉或競爭性結合可使用各種業內公認技術來測定，例如免疫分析，例如西方墨點(western blot)、放射性免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析係常規的且為業內所熟知(參見Ausubel等人編輯(1994)Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(例如參見，WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Ed Harlow及David Lane)。
用於測定競爭性抑制(且因此「倉」)之其他技術包括：表面電漿子共振，其使用例如BIAcoreTM 2000系統(GE Healthcare)；生物層干涉術，其使用例如ForteBio® Octet RED(ForteBio)；或流式細胞術珠粒陣列，其使用例如FACSCanto II(BD Biosciences)或多重LUMINEXTM檢測分析(Luminex)。
Luminex係使得能夠進行大規模多重抗體配對之基於珠粒之免疫分析 平臺。該分析比較抗體對與靶標抗原之同時結合型式。該對之一種抗體(捕獲mAb)結合至Luminex珠粒，其中每一捕獲mAb結合至不同色彩之珠粒。另一抗體(檢測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析分析抗體與抗原之同時結合(配對)且將具有相似配對特徵之抗體分組在一起。檢測mAb及捕獲mAb之類似特徵指示兩種抗體結合至相同或密切相關之表位。在一個實施例中，可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)來測定配對特徵以鑑別與所測試抗體組中之任一特定抗體最密切相關之抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/檢測mAb經測定與參考/捕獲mAb在同一倉中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之數據之其他方法闡述於U.S.P.N.8,568,992中。Luminex分析100種不同類型之珠粒(或更多)之能力同時提供幾乎無限的抗原及/或抗體表面，從而在抗體表位剖析中產生與生物感測器分析相比經改良之通量及解析度(Miller等人，2011,PMID：21223970)。
類似地，包含表面電漿共振之分倉技術與本發明係相容的。如本文所用「表面電漿共振」係指容許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析實時特異性相互作用之光學現象。使用市售設備(例如BIAcoreTM 2000系統)，可容易地確定所選抗體是否彼此競爭結合至所定義抗原。
在其他實施例中，可用於確定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合之技術係「生物層干涉術」，其係分析自以下兩個表面反射之白光之干 涉圖案的光學分析技術：生物感測器尖端上經固定之蛋白質層及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子之任何數量變化使可實時量測之干涉圖案發生移位。該等生物層干涉術分析可使用ForteBio® Octet RED機器如下實施。將參考抗體(Ab1)捕獲至抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度之非結合抗體封阻晶片且收集基線。然後藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體重組靶蛋白，且將尖端浸至含有與對照相同之抗體(Ab1)之孔中或浸至含有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若如藉由比較與對照Ab1之結合量所測定未發生進一步結合，則Ab1及Ab2經測定為「競爭性」抗體。若利用Ab2觀察到額外結合，則確定Ab1及Ab2不彼此競爭。可擴大此過程以使用96孔板中代表獨特倉之一整列抗體篩選獨特抗體之大文庫。在實施例中，若參考抗體抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的測試抗體與共用抗原之特異性結合，則測試抗體將與參考抗體競爭。在其他實施例中，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。
在定義涵蓋一組競爭性抗體之倉後，可立即實施進一步表徵以確定抗原上該組抗體所結合之特異性結構域或表位。可使用Cochran等人，2004,PMID：15099763所述方案之修改實施結構域層級表位映射。精細表位映射係確定抗原上包含抗體所結合之決定子表位之特定胺基酸的過程。
在某些實施例中，可使用噬菌體或酵母展示實施精細表位映射。其他相容性表位映射技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點(Reineke,2004,PMID：14970513)或肽裂解分析。另外，可採用諸如抗原之表位切除、表位提取及化學修飾等方法(Tomer,2000,PMID：10752610)，其使用酶，例如蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶、胞內蛋白酶Glu-C、胞內蛋白酶Asp- N、胰凝乳蛋白酶等)；化學劑，例如琥珀醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及卡巴肼、游離胺基酸等。在另一實施例中，可根據每一抗體與經化學或酶修飾之抗原表面的結合特徵之相似性使用修飾輔助剖析(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(ASAP))來對大量針對同一抗原之單株抗體進行分類(U.S.P.N.2004/0101920)。
在確定抗原上之期望表位後，可立即例如藉由使用本文所闡述之技術用包含所選表位之肽免疫來生成針對該表位之其他抗體。
VI.抗體結合物
在一些實施例中，本發明抗體可與醫藥活性或診斷部分結合以形成「抗體藥物結合物」(ADC)或「抗體結合物」。術語「結合物」在廣義上使用且意指任一醫藥活性或診斷部分與本發明抗體之共價或非共價締合，而與締合方法無關。在某些實施例中，締合係藉助抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基來實現。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸結合至抗體。所揭示之ADC可用於治療及診斷目的。
應瞭解，本發明之ADC可用於將預定彈頭選擇性地遞送至靶標位置(例如，致瘤細胞及/或表現DLL3之細胞)。如本文所闡述之術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且將意指任何在引入個體中時具有生理效應或報導子功能之生物活性(例如，醫藥活性化合物或治療部分)或可檢測分子或化合物。為免生疑問，該等彈頭包括如下文所闡述之抗癌劑或細胞毒素。 「酬載」可包含藥物或彈頭與可選連接體化合物之組合(例如，治療性酬載)，該連接體化合物較佳提供相對穩定的醫藥複合物直至ADC到達靶標為止。舉例而言，結合物上之彈頭或藥物可包含代謝成活體內活性劑之 肽、蛋白質或前藥、聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在某些實施例中，藥物或彈頭將藉助連接體共價結合至抗體。在其他實施例(例如，放射性同位素)中，藥物或彈頭將直接結合至抗體或納入該抗體中。
在較佳實施例中，所揭示之ADC將所結合酬載(例如，藥物連接體)以相對無反應性、非毒性狀態定向至靶標位點，之後釋放並活化彈頭(例如，如本文所揭示之PBDS1-5)。彈頭之此靶向釋放較佳藉助酬載之穩定結合(例如，經由抗體上之一或多個半胱胺酸或離胺酸)及最小化過量結合之毒性ADC種類之ADC製劑之相對均質組合物來達成。與經設計以在遞送至腫瘤位點時極大釋放彈頭之藥物連接體偶合，本發明之結合物可實質上降低不合意之非特異性毒性。此有利地在腫瘤位點處提供相對高含量之活性細胞毒素，同時最小化非靶向細胞及組織之暴露，藉此提供增強之治療指數。
應瞭解，儘管本發明之一些實施例包含納入治療部分(例如，細胞毒素)之酬載，但納入診斷劑及生物相容性改質劑之其他酬載可得益於由所揭示結合物提供之靶向遞送。因此，除非上下文另有指示，否則關於實例性治療酬載之任何揭示內容亦適用於包含如本文所論述之診斷劑或生物相容性改質劑之酬載。所選酬載可共價或非共價連接至抗體且展現各個化學計量莫耳比，此至少部分地端視用於實現結合之方法而定。
本發明之結合物通常可由下式表示：Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗DLL3抗體；b)L包含可選連接體； c)D包含藥物；且d)n為約1至約20之整數。
熟習此項技術者將瞭解上文所提及式之結合物可使用多種不同連接體及藥物來製造且結合方法將端視組分之選擇而變化。因此，與所揭示抗體之反應性殘基(例如，半胱胺酸或離胺酸)締合之任何藥物或藥物連接體化合物均與本文之教示相容。類似地，可使得所選藥物與抗體結合(包括位點特異性結合)之任何反應條件均在本發明之範圍內。儘管存在上述內容，但本發明之一些較佳實施例包含使用穩定劑與溫和還原劑之組合使藥物或藥物連接體與游離半胱胺酸選擇性結合，如本文所闡述。該等反應條件往往提供具有較少非特異性結合及污染物及相應地較少毒性之更均質製劑。
A. 酬載及彈頭 1. 治療劑
如所論述，本發明抗體可與包含治療部分或藥物之任何醫藥活性化合物結合、連接或融合或以其他方式締合，該治療部分或藥物係例如抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑(細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改質劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。
實例性抗癌劑或細胞毒素(包括同系物及其衍生物)包含1-去氫睪固酮、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素(actinomycin)D、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包括n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素(cytochalasin)B、放線菌素(dactinomycin)(之前稱為放線菌素(actinomycin))、二羥基炭疽菌素二酮 (dihydroxy anthracin,dione)、多卡米星(duocarmycin)、吐根素(emetine)、泛艾黴素(epirubicin)、溴乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌素(gramicidin)D、利多卡因(lidocaine)、類美登素(例如DM-1及DM-4(Immunogen))、苯并二氮呯衍生物(Immunogen)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
其他相容性細胞毒素包含多拉斯他汀(dolastatin)及奧裏斯他汀(auristatin)，包括單甲基奧裏斯他汀E(MMAE)及單甲基奧裏斯他汀F(MMAF)(Seattle Genetics)；瓢菌素(amanitin)，例如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma)；DN小溝結合劑，例如多卡米星衍生物(Syntarga)；烷基化劑，例如經改質或二聚體吡咯并苯并二氮呯(PBD)、甲基二氯乙基胺、噻替派(thiotepa)、氮芥苯丁酸、美法侖(me1phalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II)(DDP、順鉑)；剪接抑制劑，例如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如，如U.S.P.N.7,825,267中所闡述之FR901464)；管狀結合劑，例如埃博黴素(epothilone)類似物及微管溶素(tubulysin)、太平洋紫杉醇及DNA損壞劑(例如卡奇黴素及埃斯培拉黴素(esperamicin))；抗代謝物，例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿 嘧啶達卡巴嗪(decarbazine)；抗有絲分裂劑，例如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine)及蒽環(例如道諾黴素(daunorubicin)(先前為道諾黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
在所選實施例中，本發明之抗體可與抗CD3結合分子締合以招募細胞毒性T細胞並使其靶向致瘤細胞(BiTE technology；例如參見，Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR摘要編號5625)。
在其他實施例中，本發明之ADC可包含使用適當連接體結合之包含治療放射性同位素之細胞毒素。可與該等實施例相容之實例性放射性同位素包括(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I、)、碳(14C)、銅(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、鐳(223R)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In、)、鉍(212Bi、213Bi)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、76Br、211At及225Ac。其他放射性核種亦可用作診斷及治療劑，尤其能量範圍為60keV至4,000keV之彼等。
在其他所選實施例中，本發明之ADC將結合至細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭。可結合至所揭示抗體之相容性苯并二氮呯衍生物(及可選連接體)闡述於(例如)U.S.P.N.8,426,402及PCT文件WO2012/128868及WO2014/031566中。與PBD一樣，據信相容性苯并二氮呯衍生物結合DNA之小溝且抑制核酸合成。該等化合物經報導具有強效抗腫瘤性質，且因此尤其適用於本發明ADC中。
在一些實施例中，本發明ADC可包含PBD及其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物作為彈頭。PBD係藉由共價結合至小溝中之DNA並抑制核酸合成而發揮抗腫瘤活性之烷基化劑。PBD已顯示具有強效抗腫瘤性質同時展現極少骨髓細胞減少。與本發明相容之PBD可使用若干類型之連接體(例如，包含具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至抗體，且在某些實施例中，為二聚體形式(即，PBD二聚體)。可結合至所揭示抗體之相容性PBD(及可選連接體)闡述於(例如)U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157及PCT文件WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。與本發明相容之PBD化合物之實例緊接在下文中進行更詳細論述。
就本發明而言，PBD已顯示具有強效抗腫瘤性質同時展現極少骨髓細胞減少。與本發明相容之PBD可使用若干類型連接體中之任一者(例如，包含具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至DLL3靶向劑，且在某些實施例中，其呈二聚體形式(即，PBD二聚體)。PBD具有一般結構：
PBD之取代基之數目、類型及位置、其芳香族A環及吡咯并C環二者及C環之飽和度各不相同。在B環中，在N10-C11位置處存在亞胺(N=C)、 甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其係負責烷基化DNA之親電子中心。所有已知天然產物皆在手性C11a位置處具有(S)-組態，此在自C環朝向A環察看時為其提供右撚。此給予該等天然產物適當三維形狀用於與B形式DNA小溝之等螺旋性，從而引起在結合位點處緊密擬合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3頁至第11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。其在小溝中形成加成物之能力使得其能夠干擾DNA處理，因此其可用作細胞毒性劑。如上文所提及，為增加PBD之功效，該等PBD通常係以可結合至如本文所述之抗DLL3抗體之二聚體形式來使用。
在尤佳實施例中，可結合至所揭示調節劑之相容性PBD闡述於U.S.P.N.2011/0256157中。在本發明中，PBD二聚體(亦即包含兩個PBD部分之彼等)可能較佳。因此，本發明之較佳結合物係具有式(AB)或(AC)之彼等：
其中： 虛線指示C1與C2之間或C2與C3之間雙鍵之可選存在；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R10係聯結至DLL3抗體或其片段或衍生物之連接體，如本文所闡述；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O，R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子；X選自O、S或N(H)且在所選實施例中包含O；R”係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如，O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR’，R及R’連同其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；且其中R2”、R6”、R7”、R9”、X”、Q”及R11”(倘若存在)係如分別根據R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定義，且RC係封端基團。
包含上文所提及結構之所選實施例緊接著更詳細地闡述於下文中。
雙鍵
在一個實施例中，在C1與C2之間及C2與C3之間不存在雙鍵。
在一個實施例中，虛線指示C2與C3之間雙鍵之可選存在，如下文所顯示：
在一個實施例中，當R2係C5-20芳基或C1-12烷基時，在C2與C3之間存在雙鍵。在較佳實施例中，R2包含甲基。
在一個實施例中，虛線指示C1與C2之間雙鍵之可選存在，如下文所顯示：
在一個實施例中，當R2為C5-20芳基或C1-12烷基時，在C1與C2之間存在雙鍵。在較佳實施例中，R2包含甲基。
R2
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為H。
在一個實施例中，R2獨立地為R，其中R包含CH3。
在一個實施例中，R2獨立地為=O。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CH-RD。在PBD化合物內，基團=CH-RD可具有下文所顯示之任一組態：
在一個實施例中，組態係組態(I)。
在一個實施例中，R2獨立地為=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地為=CF2。
在一個實施例中，R2獨立地為R。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C5-7芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之C8-10芳基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之苯基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之萘基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之吡啶基。
在一個實施例中，R2獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。
在一個實施例中，R2具有一個至三個取代基，且1及2個更佳，且單 取代之基團最佳。取代基可在任一位置。
倘若R2係C5-7芳基，則單一取代基較佳處於不毗鄰至化合物之剩餘部分之鍵之環原子上，亦即其較佳至化合物之剩餘部分之鍵之β或γ位。因此，倘若C5-7芳基為苯基，則取代基較佳在間位或對位，且更佳在對位。
在一個實施例中，R2選自：
其中星號指示附接點。
倘若R2係C8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基，則其可在喹啉或異喹啉環之任一位置帶有任一數量之取代基。在一些實施例中，其帶有一個、兩個或三個取代基，且該等取代基可處於近端環及遠端環或二者(若一個以上取代基)上。
在一個實施例中，倘若R2視情況經取代，則取代基選自在下文取代基部分中所給出之彼等取代基。
倘若R視情況經取代，則取代基較佳選自：鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰基氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一個實施例中，倘若R或R2視情況經取代，則取代基選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR’、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR’。
倘若R2為C1-12烷基，則可選取代基可另外包括C3-20雜環基及C5-20芳基。
倘若R2為C3-20雜環基，則可選取代基可另外包括C1-12烷基及C5-20芳 基。
倘若R2為C5-20芳基，則可選取代基可另外包括C3-20雜環基及C1-12烷基。
應理解，術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，倘若R2係視情況經取代之C1-12烷基，則應瞭解烷基視情況含有一或多個碳-碳雙鍵或三鍵，該等雙鍵或三鍵可形成共軛系統之一部分。在一個實施例中，視情況經取代之C1-12烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或三鍵，且此鍵係與存在於C1與C2之間或C2與C3之間之雙鍵共軛。在一個實施例中，C1-12烷基係選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12環烷基之基團。
若R2上之取代基為鹵基，則其較佳為F或Cl，更佳為Cl。
若R2上之取代基為醚，則其在一些實施例中可為烷氧基，例如，C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或其在一些實施例中可為C5-7芳基氧基(例如苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基)。
若R2上之取代基為C1-7烷基，則其較佳可為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R2上之取代基為C3-7雜環基，則其在一些實施例中可為含有氮之C6雜環基，例如嗎啉基、硫嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基。該等基團可經由氮原子結合至PBD部分之剩餘部分。該等基團可進一步經(例如)C1-4烷基取代。
若R2上之取代基為雙-氧基-C1-3伸烷基，則此較佳為雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸烷基。
針對R2之尤佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-六氫吡嗪基、嗎啉基及甲基-噻吩基。
尤佳經取代之R2基團包括(但不限於)4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一個實施例中，R2係鹵基或二鹵基。在一個實施例中，R2為-F或-F2，該等取代基係在下文分別作為(III)及(IV)來闡釋：
RD
在一個實施例中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一個實施例中，RD獨立地為R。
在一實施例中，RD獨立地為鹵基。
R6
在一個實施例中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地為H。
在一個實施例中，R6及R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p為1或2。
R7
R7選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；在一個實施例中，R7獨立地為OR。
在一個實施例中，R7獨立地為OR7A，其中R7A獨立地為視情況經取代之C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之飽和C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地為視情況經取代之C2-4烯基。
在一個實施例中，R7A獨立地為Me。
在一個實施例中，R7A獨立地為CH2Ph。
在一個實施例中，R7A獨立地為烯丙基。
在一個實施例中，化合物係二聚體，其中每一單體之R7基團一起形成連接單體之具有式X-R”-X之二聚體橋。
R9
在一個實施例中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R9獨立地為H。
在一個實施例中，R9獨立地為R或OR。
R10
較佳地，相容性連接體(例如本文所闡述之彼等)在R10位(即，N10)藉助共價鍵將DLL3抗體附接至PBD藥物部分。
Q
在某些實施例中，Q獨立地選自O、S及NH。
在一個實施例中，Q獨立地為O。
在一個實施例中，Q獨立地為S。
在一個實施例中，Q獨立地為NH。
R 11
在所選實施例中，R11為H或R，或倘若Q為O，則R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，R11為H。
在某些實施例中，R11為R。
在某些實施例中，倘若Q為O，則R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，倘若Q為O，則R11為H。
在某些實施例中，倘若Q為O，則R11為R。
X
在一個實施例中，X選自O、S或N(H)。
較佳地，X為O。
R”
R”係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，R”係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。
在一個實施例中，伸烷基視情況雜有一或多個選自O、S及NMe之雜 原子及/或芳香族環，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，芳香族環係C5-20伸芳基，其中伸芳基係指藉由自芳香族化合物之兩個芳香族環原子去除兩個氫原子獲得之二價部分，該部分具有5至20個環原子。
在一個實施例中，R”係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代。
在一個實施例中，R”係C3-12伸烷基。
在一個實施例中，R”選自C3、C5、C7、C9及C11伸烷基。
在一個實施例中，R”選自C3、C5及C7伸烷基。
在一個實施例中，R”選自C3及C5伸烷基。
在一個實施例中，R”係C3伸烷基。
在一個實施例中，R”係C5伸烷基。
上文所列示之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代。
上文所列示之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。
上文所列示之伸烷基可為未經取代之直鏈脂肪族伸烷基。
R及R’
在一個實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C3-20雜環基。
在一個實施例中，R獨立地為視情況經取代之C5-20芳基。
上文關於R2闡述了關於較佳烷基及芳基及可選取代基之一致性及數量之各個實施例。在R2適用於R時對R2闡述之較佳者適用於所有其他基團R(若適當)，例如在R6、R7、R8或R9為R時。
R之較佳者亦適用於R’。
在本發明之一些實施例中，提供具有取代基-NRR’之化合物。在一個實施例中，R及R’連同其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環。該環可含有另一雜原子，例如N、O或S。
在一個實施例中，雜環本身經基團R取代。倘若存在另一N雜原子，則取代基可在N雜原子上。
除上文所提及之PBD以外，某些實例性二聚體PBD已顯示特別具活性且可結合本發明使用。為此，本發明之抗體藥物結合物(即，如本文所揭示之ADC 1-6)可包含如下文緊接闡述為PBD 1-5之PBD化合物。注意，下文PBD 1-5包含在分離連接體之後釋放之細胞毒性彈頭，例如更詳細地闡述於本文中之彼等。作為藥物連接體化合物之組分之PBD 1-5中每一者之合成極詳細地呈現於WO 2014/130879中，其關於該合成之內容以引用方式併入本文中。根據WO 2014/130879，可包含本發明ADC之所選彈頭之細胞毒性化合物可如本文所闡述容易地生成及使用。因此，可在與連接體分離之後自所揭示ADC釋放之所選PBD化合物緊接闡述於下文中：
及
應瞭解，上文所提及二聚體PBD彈頭中之每一者較佳將在由靶標細 胞內化及連接體破壞後釋放。如下文更詳細地闡述，某些連接體包含可納入自犧牲部分以便能夠釋放活性PBD彈頭而不滯留連接體之任一部分的可裂解連接體。在釋放之後，PBD彈頭然後將與靶標細胞之DNA結合並交聯。該結合經報導可阻斷靶標癌細胞之分裂而不扭曲其DNA螺旋，由此潛在地避免常見的突然出現抗藥性之現象。在其他較佳實施例中，彈頭可藉助不包含自犧牲部分之可裂解連接體附接至DLL3靶向部分。
根據本發明，該等化合物在腫瘤位點處之遞送及釋放可證實在臨床上可有效治療或管控增殖性病症。就化合物而言，應瞭解所揭示PBD中之每一者在每一C環中具有兩個sp2中心，與每一C環中僅具有一個sp2中心之化合物相比，此可使得DNA小溝中之更強結合(且因此具有更大毒性)。因此，當用於如本文所闡述之DLL3 ADC中時，所揭示之PBD可證實可特別有效地治療增殖性病症而言。
上述內容提供與本發明相容之實例性PBD化合物且決非意欲對根據本文教示可成功地納入抗DLL3結合物中之其他PBD進行限制。而是，可結合至如本文所述及如下文實例中所述之抗體之任何PBD與所揭示結合物相容且明確地在本發明之公認範圍內。
除上文所提及之藥劑以外，本發明抗體亦可結合至生物學反應調節劑。在某些實施例中，生物學反應調節劑包含介白素2、干擾素或各種類型之群落刺激因子(例如，CSF、GM-CSF、G-CSF)。
更通常，經締合藥物部分可為具有期望生物學活性之多肽。該等蛋白質可包括(例如)毒素，例如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A)、抗腫瘤核糖核酸酶(或另一細胞毒性RNase)、假單胞菌屬外毒素(pseudomonas exotoxin)、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，例如腫瘤 壞死因子(例如TNF-α或TNF-β)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，1994,PMID：7826947)及VEGI(WO 99/23105)；血栓劑；抗血管生成劑，例如，血管抑素或內皮抑素；淋巴介質，例如，介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；或生長因子，例如，生長激素(GH)。
2. 診斷劑或檢測劑
在其他實施例中，本發明之抗ASCL1或抗DLL3抗體或其片段或衍生物係結合至診斷劑或可檢測劑、標記物或報導子，其可為(例如)生物分子(例如，肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素。經標記抗體可用於監測過度增殖病症之發生或進展或作為臨床測試程序之一部分來測定特定療法(包括所揭示抗體(即治療診斷劑))之效能或確定將來療程。該等標記物或報導子亦可用於純化所選抗體、用於抗體分析(例如，表位結合或抗體分倉)、分離(separating)或分離(isolating)致瘤細胞或用於臨床前程序或毒物學研究中。
該診斷、分析及/或檢測可藉由將抗體偶合至可檢測物質來完成，該等可檢測物質包括(但不限於)各種酶，包含例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，例如(但不限於)傘形酮、螢光黃、異硫氰酸螢光黃、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，例如(但不限於)發光胺；生物發光材料，例如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料，例如(但不限於)碘 (131I、125I、123I、121I、)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In、)及鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、89Zr、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117錫；使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、非放射性順磁性金屬離子及經放射標記或結合至特定放射性同位素之分子。在該等實施例中，適當檢測方法為業內熟知且易於自多種商業來源獲得。
在其他實施例中，抗體或其片段可融合或結合至標記物序列或化合物(例如肽或螢光團)以促進純化或診斷或分析程序，例如免疫組織化學、生物層干涉術、表面電漿共振、流式細胞術、競爭性ELISA、FAC等。在一些實施例中，標記物尤其包含例如由pQE載體(Qiagen)提供之組胺酸標籤，該載體中之許多在市面上有售。可用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素「HA」標籤，其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)及「flag」標籤(U.S.P.N.4,703,004)。
3. 生物相容性改質劑
在所選實施例中，本發明抗體可與可用於視需要調節、改變、改良或緩和抗體特徵之生物相容性改質劑結合。舉例而言，可藉由附接相對較高分子量之聚合物分子(例如可自市面購得之聚乙二醇(PEG)或類似生物相容性聚合物)來生成具有增加之活體內半衰期之抗體或融合構築體。熟習此項技術者應瞭解，PEG可以可經選擇以賦予抗體特定性質(例如可調整半衰期)之許多不同分子量及分子組態獲得。PEG可使用或不使用多功能 連接體經由使PEG結合至抗體或抗體片段之N末端或C末端或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基附接至該等抗體或抗體片段或衍生物。可使用產生最少生物活性損失之直鏈或具支鏈聚合物衍生。可藉由SDS-PAGE及質譜來嚴密監測結合程度以確保PEG分子與抗體分子之最佳結合。可藉由例如粒徑篩析或離子交換層析自抗體-PEG結合物分離未反應之PEG。以類似方式，所揭示抗體可結合至白蛋白以使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有更長的活體內半衰期。該等技術為業內熟知，參見例如WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413,622。其他生物相容性結合物為熟習此項技術者所明瞭且可容易地根據本文之教示來鑑別。
B. 連接體化合物
如上文所指示，與本發明相容之酬載包含一或多種彈頭及視情況將彈頭與抗體靶向劑締合之連接體。可使用多種連接體化合物將本發明抗體結合至相關彈頭。連接體僅需要與抗體上之反應性殘基(較佳半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物共價結合。因此，本發明之與所選抗體殘基反應且可用於提供相對穩定之結合物(位點特異性或以其他方式)之任何連接體均與本文之教示相容。
相容性連接體可有利地結合至親核性的經還原半胱胺酸及離胺酸。涉及經還原半胱胺酸及離胺酸之結合反應包括(但不限於)硫醇-馬來醯亞胺、硫醇-鹵代基(醯鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-二碸、硫醇-硫磺酸鹽、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文進一步論述，硫醇-馬來醯亞胺生物結合因其快速反應速率及溫和結合條件而成為最廣泛使用之方法之一。使用此方法之一個問題在於，逆向麥可反 應(retro-Michael reaction)之可能性及馬來醯亞胺基連接之酬載損失或自抗體轉移至血漿中之其他蛋白質(例如人類血清白蛋白)。然而，在一些實施例中，使用選擇性還原及如本文在下文實例中所述之位點特異性抗體可用於穩定結合且減少此不期望轉移。硫醇-醯鹵反應提供可不經歷逆向麥可反應、且因此更穩定之生物結合物。然而，硫醇-鹵化物反應通常具有與基於馬來醯亞胺之結合相比更緩慢之反應速率，且由此無法有效地提供不期望藥物對抗體比率。硫醇-吡啶基二硫化物反應係另一流行的生物結合途徑。吡啶基二硫化物經歷與游離硫醇之快速交換，從而得到混合二硫化物並釋放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在還原性細胞環境中裂解以釋放酬載。在生物結合方面獲得更多關注之其他方法係硫醇-乙烯基碸及硫醇-二碸反應，其各自與本文之教示相容且明確包括在本發明之範圍內。
在所選實施例中，相容性連接體將賦予ADC在細胞外環境中之穩定性、防止ADC分子聚集且保持ADC易溶於水性介質中並呈單體狀態。在輸送或遞送至細胞中之前，ADC較佳穩定且保持完整，即抗體保持連接至藥物部分。儘管連接體在靶標細胞外係穩定的，但其可經設計以在該細胞內以一定有效之速率裂解或降解。因此，有效連接體將：(i)維持抗體之特異性結合性質；(ii)容許結合物或藥物部分之細胞內遞送；(iii)保持穩定及完整，即不會裂解或降解直至結合物遞送或運輸至其靶向位點；及(iv)維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺死效應或細胞生長抑制效應(在一些情形下包括任何旁觀者效應)。ADC之穩定性可藉由諸如以下等標準分析技術來量測：HPLC/UPLC、質譜術、HPLC及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS。如上文所述，抗體及藥物部分之共價附接要求連接體具有兩個反應性官能基，即在反應意義上為二價。業內已知可用於附接兩個或更 多個功能或生物活性部分(例如MMAE及抗體)之二價連接體試劑，且已闡述多種方法來提供與本文教示相容之所得結合物。
與本發明相容之連接體可在廣義上分類為可裂解及非可裂解連接體。可裂解連接體可包括酸不穩定連接體(例如，肟及腙)、蛋白酶可裂解連接體及二硫化物連接體，其內化至靶細胞中且在細胞內在胞內體-溶酶體路徑中裂解。細胞毒素之釋放及活化依賴於促進酸不穩定化學鍵聯(例如腙或肟)裂解之胞內體/溶酶體酸性隔室。若將溶酶體特異性蛋白酶裂解位點改造成連接體，則細胞毒素將靠近其細胞內靶標釋放。或者，含有混合二硫化物之連接體提供以下方法，藉由該方法當細胞毒性酬載在細胞之還原環境中、但不在血流中之富氧環境中選擇性裂解時在細胞內釋放。相反，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔體之相容性不可裂解連接體在靶標細胞內在ADC之溶酶體降解期間釋放毒性酬載。在一些方面，連接體之選擇將端視結合物中所用之特定藥物、特定適應症及抗體靶標而定。
因此，本發明之某些實施例包含可藉由存在於細胞內環境中(例如，在溶酶體或胞內體或胞膜窖內)之裂解劑裂解之連接體。連接體可為(例如)藉由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶)裂解之肽基連接體。在一些實施例中，肽基連接體之長度為至少兩個胺基酸或至少三個胺基酸。裂解劑可包括細胞自溶酶B及D及胞漿素，已知其各自水解二肽藥物衍生物，從而在靶細胞內釋放活性藥物。可藉由硫醇依賴性蛋白酶細胞自溶酶-B裂解之實例性肽基連接體係包含Phe-Leu之肽，此乃因已發現細胞自溶酶-B在癌性組織中高度表現。該等連接體之其他實例闡述於(例如)U.S.P.N.6,214,345中。在特定實施例中，可藉由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接體係Val-Cit連接體、Val-Ala連接體或Phe-Lys連接 體。使用細胞內蛋白分解釋放治療劑之一個優點在於，該藥劑在結合時通常會減弱且結合物之血清穩定性相對較高。
在其他實施例中，可裂解連接體具有pH敏感性。通常，pH敏感性連接體將可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解之酸不穩定性連接體(例如，腙、肟、半卡腙、硫半卡腙、順式-烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或諸如此類)(例如，參見U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。該等連接體在中性pH條件(例如在血液中之彼等)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(為溶酶體之近似pH)下不穩定(例如可裂解)。
在再其他實施例中，連接體可在還原條件下裂解(例如，二硫化物連接體)。多種二硫化物連接體為業內已知，包括(例如)可使用以下化合物形成之彼等：SATA(S-乙醯基硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDB(3-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)及SMPT(N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。在再其他特定實施例中，連接體係丙二酸酯連接體(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15：1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接體(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3′-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在本發明之某些態樣中，所選連接體包含下式化合物：
其中星號指示與藥物之附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗DLL3抗體，L1包含連接體單元及視情況可裂解連接體單元，A係聯結L1與抗體上 之反應性殘基之聯結基團(視情況包含間隔體)，L2較佳為共價鍵，且可或可不存在之U可包含促進連接體在腫瘤位點處與彈頭徹底分離之自消性單元之全部或一部分。
在一些實施例(例如闡述於U.S.P.N.2011/0256157中之彼等)中，相容性連接體可包含：
其中星號指示與藥物之附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗DLL3抗體，L1包含連接體及視情況可裂解連接體，A係聯結L1至抗體上之反應性殘基之聯結基團(視情況包含間隔體)且L2係共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自消性部分。
應瞭解，L1及L2(若存在)之性質可廣泛變化。該等基團係基於其裂解特徵來選擇，該等裂解特徵可取決於遞送有結合物之位點處之條件。藉由酶之作用裂解之彼等連接體較佳，但亦可使用可藉由改變pH(例如酸或鹼不穩定)、溫度或在輻照後(例如光不穩定)裂解之連接體。可在還原或氧化條件下裂解之連接體亦可用於本發明中。
在某些實施例中，L1可包含鄰接胺基酸序列。該胺基酸序列可為酶裂解之靶標受質，藉此能夠釋放藥物。
在一個實施例中，L1可藉由酶之作用裂解。在一個實施例中，酶係酯酶或肽酶。
在另一實施例中，L1係呈細胞自溶酶不穩定性連接體形式。
在一個實施例中，L1包含二肽。二肽可表示為-NH-X1-X2-CO-，其 中-NH-及-CO-分別代表胺基酸基團X1之N末端及X2之C末端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任何組合。倘若連接體係細胞自溶酶不穩定性連接體，則二肽可為細胞自溶酶調介之裂解之作用位點。
另外，對於分別具有羧基或胺基側鏈官能基之彼等胺基酸基團(例如Glu及Lys)，CO及NH可代表該側鏈官能基。
在一個實施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit係瓜胺酸。
較佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
最佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之-X1-X2-係-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽包含-Val-Ala-。
在一個實施例中，L2存在且與-C(=O)O-一起形成自消性連接體。在一個實施例中，L2係酶活性之受質，藉此能夠釋放彈頭。
在一個實施例中，倘若L1可藉由酶之作用裂解且L2存在，則該酶裂解L1與L2之間之鍵。
L1及L2(若存在)可藉由選自以下之鍵來聯結：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
L1之聯結至L2之胺基可為胺基酸之N末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
L1之聯結至L2之羧基可為胺基酸之C末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。
L1之聯結至L2之羥基可衍生自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。
術語「胺基酸側鏈」包括見於以下各項中之彼等基團：(i)天然存在之胺基酸，例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸，例如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然存在之胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)其所有鏡像異構物、非鏡像異構物、異構物富集形式、經同位素標記形式(例如2H、3H、14C、15N)、經保護形式及外消旋混合物。
在一個實施例中，-C(=O)O-及L2一起形成以下基團：
其中星號指示至藥物之附接點或細胞毒性劑位置，波形線指示至連接體L1之附接點，Y為-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n為0至3。伸苯基環視情況經一個、兩個或三個取代基取代。在一個實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2、烷基或羥基烷基取代。
在一個實施例中，Y為NH。
在一個實施例中，n為0或1。較佳地，n為0。
倘若Y為NH且n為0，則自消性連接體可稱作對胺基苄基羰基連接體(PABC)。
在其他實施例中，連接體可包括自消性連接體及二肽一起形成基團- NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接體可包含基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其係如下文所闡釋：
其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點，且波形線指示至可結合至抗體之連接體剩餘部分(例如，間隔體-抗體結合區段)之附接點。在二肽之酶裂解之後，當遠端位點經活化時，自消性連接體將使得徹底釋放經保護化合物(即，細胞毒素)，此沿下文所顯示路線進行：
其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點且其中L*呈包含現有裂解肽基單元之連接體剩餘部分之活化形式。彈頭之徹底釋放確保其將維持期望之毒性活性。
在一個實施例中，A係共價鍵。因此，L1及抗體係直接聯結。舉例而言，倘若L1包含鄰接胺基酸序列，則該序列之N末端可直接聯結至抗體殘基。
在另一實施例中，A係間隔基團。因此，L1及抗體係間接聯結。
在某些實施例中，L1及A可選自以下之鍵來聯結：-C(=O)NH-、- C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
如下文將更詳細地論述，本發明之藥物連接體將較佳連接至半胱胺酸(包括游離半胱胺酸)上之反應性硫醇親核劑。為此，可藉由用各種還原劑(例如DTT或TCEP或溫和還原劑)處理使抗體之半胱胺酸具有反應性用於與連接體試劑結合，如本文所闡述。在其他實施例中，本發明之藥物連接體較佳將連接至離胺酸。
較佳地，連接體含有親電子官能基用於與抗體上之親核官能基反應。抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基團、(ii)側鏈胺基團(例如離胺酸)、(iii)側鏈硫醇基團(例如半胱胺酸)及(iv)糖羥基或胺基(其中抗體經醣基化)。胺、硫醇及羥基具有親核性且能夠反應以與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)馬來醯亞胺基團；(ii)經活化二硫化物；(iii)活性酯，例如NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(iv)烷基及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；及(v)醛、酮及羧基。
與本發明相容之實例性官能基緊接闡釋於下文中：
在一些實施例中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體之游離半胱胺酸)及 藥物-連接體部分之間之聯結係藉助硫醇殘基及存在於連接體上之末端馬來醯亞胺基團進行。在該等實施例中，抗體與藥物-連接體之間之聯結可為：
其中星號指示至藥物-連接體剩餘部分之附接點且波形線指示至抗體剩餘部分之附接點。在此實施例中，S原子較佳衍生自位點特異性游離半胱胺酸。
就其他相容性連接體而言，結合部分可包含末端碘乙醯胺，其可與抗體上之經活化殘基反應以提供期望之結合物。在任一情形下，熟習此項技術者可根據本發明容易地將所揭示藥物-連接體化合物中之每一者與相容性抗DLL3抗體(包括位點特異性抗體)結合。
根據本發明，本發明提供製備相容性抗體藥物結合物之方法，其包含將抗DLL3抗體與選自由以下組成之群之藥物-連接體化合物結合：
及
出於本申請案之目的，DL將作為「藥物連接體」(或式Ab-[L-D]n中之連接體-藥物「L-D」)之縮寫使用且將如上文所闡述之包含藥物連接體1-6(即，DL1、DL2、DL3、DL4 DL5及DL6)。注意，DL1及DL6包含相同彈頭及相同二肽子單元，但聯結基團間隔體有所不同。因此，在連接體裂解後，DL1及DL6二者將釋放PBD1。
應瞭解，可使用業內公認技術使連接體附加之末端馬來醯亞胺基部 分(DL1-DL4及DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)結合至所選DLL3抗體上之游離硫氫基。上文所提及化合物之合成途徑闡述於WO2014/130879中，其關於上文所提及DL化合物之合成以引用方式明確併入本文中，而結合該等PBD連接體組合之特定方法闡述於下文實例中。
因此，在所選態樣中，本發明係關於DLL3抗體，其結合至所揭示DL部分以提供實質上緊接闡述於下文ADC 1-6中之DLL3免疫結合物。因此，在某些態樣中，本發明係關於式Ab-[L-D]n之ADC，其包含選自由以下組成之群之結構： 及
其中Ab包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段且n為1至20之整數。在某些實施例中，n包含1至8之整數，且在所選實施例中，n包含2或4。
熟習此項技術者應瞭解，上文所提及之ADC結構係由式Ab-[L-D]n來定義且如其中所繪示之一個以上藥物連接體分子可共價結合至DLL3抗體(例如，n可為約1至約20之整數)。更具體而言，如下文更詳細地論述，應瞭解一個以上酬載可結合至每一抗體且上文示意代表必須如此來解釋。舉例而言，如上文所闡述之ADC1可包含結合至1、2、3、4、5、6、7或8或更多種酬載之DLL3抗體及該等ADC之組合物通常包含載藥種類之混合物。
在某些態樣中，本發明之DLL3 PBD ADC包含如隨附實例中所闡述之抗DLL3抗體或其免疫反應性片段。在特定實施例中，ADC3包含hSC16.56(例如，hSC16.56 PBD1)。在該等實施例中，ADC將較佳包含2種酬載。在其他較佳實施例中，DLL3 ADC包含其中n為2之ADC1。
C. 結合
應瞭解，可使用多種熟知之反應來將藥物部分及/或連接體附接至所選抗體。舉例而言，可使用採用半胱胺酸之硫氫基之各種反應來結合期望之部分。一些實施例包含包括一或多個游離半胱胺酸之抗體之結合，如下 文詳細論述。在其他實施例中，本發明之ADC可藉助使藥物結合至存在於所選抗體中之離胺酸殘基之溶劑暴露之胺基來生成。再其他實施例包含活化N末端蘇胺酸及絲胺酸殘基，然後可使用該等殘基將所揭示之酬載附接至抗體。所選結合方法將較佳經調整以最佳化附接至抗體之藥物之數量並提供相對高的治療指數。
用於將治療化合物結合至半胱胺酸殘基之各種方法為業內已知且將為熟習此項技術者明瞭。在鹼性條件下，半胱胺酸殘基將去質子化以生成可與弱親電子劑(例如馬來醯亞胺及碘乙醯胺)反應之硫醇鹽親核劑。通常，用於該等結合之試劑可與半胱胺酸硫醇直接反應以形成結合蛋白或與連接體-藥物直接反應以形成連接體-藥物中間體。在連接體之情形下，熟習此項技術者已知採用有機化學反應、條件及試劑之若干途徑，包括：(1)使本發明蛋白質之半胱胺酸基團與連接體試劑反應，以經由共價鍵形成蛋白質-連接體中間體，隨後與經活化化合物反應；及(2)使化合物之親核基團與連接體試劑反應，以經由共價鍵形成藥物連接體中間體，隨後與本發明蛋白質之半胱胺酸基團反應。如熟習此項技術者根據上述內容將明瞭，雙功能(或二價)連接體可用於本發明中。舉例而言，雙功能連接體可包含硫醇修飾基團(用於共價連接至半胱胺酸殘基)及至少一個附接部分(例如，第二硫醇修飾部分)(用於共價或非共價連接至化合物)。
在結合之前，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使抗體具有反應性用於與連接體試劑結合。在其他實施例中，可經由離胺酸與試劑(包括(但不限於)2-亞胺基四氫噻吩(喬特試劑(Traut’s reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)發生反應，使胺轉化成硫醇，將其他親核基團引入抗體中。
就該等結合而言，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基具有親核性且能夠與連接體試劑或化合物-連接體中間體或藥物上之親電子基團反應以形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；(iii)醛基、酮基、羧基及馬來醯亞胺基團；及(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，經由硫化物交換。化合物或連接體上之親核基團包括(但不限於)能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團反應以形成共價鍵之胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、肼甲酸酯及芳基醯肼基團。
結合試劑通常包括馬來醯亞胺、鹵代乙醯基、碘乙醯胺琥珀醯亞胺基酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及亞磷醯胺，但亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包括例如使用馬來醯亞胺、碘乙醯亞胺或鹵代乙醯基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸之硫醇反應以產生與化合物反應之硫醚。游離硫醇與經活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦可用於產生結合物(例如，使用5-硫基-2-硝基苯甲(TNB)酸)。較佳地，使用馬來醯亞胺。
如上文所指示，亦可使用離胺酸作為反應性殘基來實現結合，如本文所述。親核離胺酸殘基通常藉助胺反應性琥珀醯亞胺基酯來靶向。為獲得最佳去質子化離胺酸殘基數，水溶液之pH必須低於離胺酸銨基之pKa(為約10.5)，因此反應之典型pH為約8及9。常用於偶合反應之試劑係NHS-酯，其藉助離胺酸醯化機制與親核離胺酸反應。經歷類似反應之其他相容性試劑包含異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可結合本文之教示使用來提供ADC。在離胺酸活化後，可使用上文所提及連接基團中之許多將彈頭共價結合至抗體。
將化合物結合至蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳N末端殘基)之方法亦為業內已知。舉例而言，已闡述以下方法：其中自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇衍生出羰基前體，其可藉由過碘酸鹽氧化選擇性且快速轉化成醛形式。該醛與欲附接至本發明蛋白質之化合物中之半胱胺酸之1,2-胺基硫醇反應形成穩定的噻唑啶產物。此方法尤其可用於在N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處標記蛋白質。
在一些實施例中，可藉由引入1個、2個、3個、4個或更多個游離半胱胺酸殘基將反應性硫醇基引入所選抗體(或其片段)中(例如，製備包含一或多個游離非天然半胱胺酸胺基酸殘基之抗體)。該等位點特異性抗體或經改造抗體使得結合物製劑可展現增強之穩定性及實質均質性，此至少部分歸因於提供經改造之游離半胱胺酸位點及/或本文所述之新穎結合程序。與完全或部分還原鏈內或鏈間抗體二硫鍵中之每一者來提供結合位點(且完全與本發明相容)之習用結合方法不同，本發明另外提供某些所製備游離半胱胺酸位點之選擇性還原及將藥物連接體附接至該等位點。
就此而言，應瞭解，藉由經改造位點及選擇性還原所促進之結合特異性使得在期望位置處具有高百分比之位點定向結合。顯著地，該等結合位點(例如存在於輕鏈恆定區之末端區中之彼等)中之一些通常難以有效地結合，此乃因其往往與其他游離半胱胺酸會交叉反應。然而，藉助所得游離半胱胺酸之分子改造及選擇性還原，可獲得有效的結合率，此可顯著減少不期望之高DAR污染物及非特異性毒性。更通常而言，經改造之構築體及包含選擇性還原之所揭示新穎結合方法提供具有經改良之藥物動力學及/或藥效學及潛在地改良之治療指數的ADC製劑。
在某些實施例中，位點特異性構築體呈現游離半胱胺酸，其在還原 時包含具有親核性且能夠與連接體部分上之親電子基團(例如上文所揭示之彼等)反應形成共價鍵之硫醇基團。如上文所論述，本發明抗體具有可還原之未配對鏈間或鏈內半胱胺酸或經引入之非天然半胱胺酸，即提供該等親核基團之半胱胺酸。因此，在某些實施例中，經還原游離半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示藥物連接體之末端馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基團的反應將提供期望結合。在該等情形下，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使抗體之游離半胱胺酸具有反應性用於與連接體試劑結合。因此，理論上，每一游離半胱胺酸將呈現反應性硫醇親核劑。儘管該等試劑與分發明特別相容，但應瞭解，可使用熟習此項技術者通常已知之各種反應、條件及試劑來實現位點特異性抗體之結合。
另外已發現，可選擇性還原經改造抗體之游離半胱胺酸以提供增強之位點定向結合且減少不期望之潛在毒性污染物。更特定而言，已發現諸如精胺酸等「穩定劑」調節蛋白質中之分子內及分子間相互作用，且可與所選還原劑(較佳相對溫和)結合使用來選擇性還原游離半胱胺酸並促進位點特異性結合，如本文所述。如本文所用術語「選擇性還原(selective reduction)」或「選擇性還原(selectively reducing)」可互換使用且應意指還原游離半胱胺酸且不實質上斷裂存在於經改造抗體中之天然二硫鍵。在所選實施例中，此選擇性還原可受某些還原劑或某些還原劑濃度之影響。在其他實施例中，經改造構築體之選擇性還原包含使用穩定劑與還原劑(包括溫和還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性結合」應意指在如本文所述之細胞毒素存在下已經選擇性還原之經改造抗體之結合。就此而言，使用該等穩定劑(例如，精胺酸)與所選還原劑之組合可顯著改良位點特異 性結合之效率，如藉由抗體重鏈及/或輕鏈上之結合度及製劑之DAR分佈所確定。相容性抗體構築體以及選擇性結合技術及試劑廣泛揭示於WO2015/031698中，其關於該等方法及構築體之內容係以引用方式明確併入本文中。
儘管不希望受限於任何具體理論，但該等穩定劑可用於調節靜電微環境及/或調節期望結合位點處之構象變化，由此使得相對溫和之還原劑(其不會顯著還原完整天然二硫鍵)來促進期望游離半胱胺酸位點處之結合。已知該等藥劑(例如，某些胺基酸)形成鹽橋(經由氫鍵結及靜電相互作用)，且可以一定方式調節蛋白質-蛋白質相互作用以賦予可引起有利的構象變化及/或減少不利的蛋白質-蛋白質相互作用之穩定效應。此外，該等藥劑可用於抑制還原後不期望之分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，由此促進其中經改造位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳經由連接體)之期望結合反應。由於選擇性還原條件無法提供完整天然二硫鍵之顯著還原，故自然地將後續結合反應驅動至游離半胱胺酸上相對較少之反應性硫醇(例如，較佳2個游離硫醇/抗體)。如先前所提及，該等技術可用於顯著減少根據本發明製造之結合物製劑中之非特異性結合量及相應的不期望DAR種類。
在所選實施例中，與本發明相容之穩定劑通常包含具有至少一個具有鹼性pKa之部分之化合物。在某些實施例中，該部分包含一級胺，而在其他實施例中，胺部分包含二級胺。在再其他實施例中，胺部分包含三級胺或胍基。在其他所選實施例中，胺部分包含胺基酸，而在其他相容性實施例中胺部分包含胺基酸側鏈。在再其他實施例中，胺部分包含蛋白胺基酸。在再其他實施例中，胺部分包含非蛋白胺基酸。在一些實施例中，相 容性穩定劑可包含精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。在某些較佳實施例中，穩定劑包含精胺酸。另外，相容性穩定劑可包括具有鹼性pKa之胍及含氮雜環。
在某些實施例中，相容性穩定劑包含具有至少一個具有大於約7.5之pKa之胺部分之化合物，在其他實施例中，標的胺部分將具有大於約8.0之pKa，在再其他實施例中，胺部分將具有大於約8.5之pKa，且在再其他實施例中，穩定劑包含具有大於約9.0之pKa之胺部分。其他實施例包含其中胺部分將具有大於約9.5之pKa之穩定劑，而某些其他實施例包含展現至少一個具有大於約10.0之pKa之胺部分之穩定劑。在再其他實施例中，穩定劑包含具有pKa大於約10.5之胺部分之化合物，在其他實施例中，穩定劑包含具有pKa大於約11.0之胺部分之化合物，而在再其他實施例中，穩定劑包含pKa大於約11.5之胺部分。在再其他實施例中，穩定劑包含具有pKa大於約12.0之胺部分之化合物，而在再其他實施例中，穩定劑包含pKa大於約12.5之胺部分。熟習此項技術者應瞭解，相關pKa可容易地使用標準技術來計算或測定且用於確定所選化合物用作穩定劑之適用性。
顯示所揭示之穩定劑在與某些還原劑組合時可特別有效地靶向與游離位點特異性半胱胺酸之結合。出於本發明之目的，相容性還原劑可包括產生還原游離位點特異性半胱胺酸用於結合而不顯著斷裂經改造抗體之天然二硫鍵之任何化合物。在較佳由所選穩定劑及還原劑之組合所提供之該等條件下，經活化藥物連接體極大地限於與期望游離位點特異性半胱胺酸位點之結合。尤佳者係相對溫和之還原劑或以相對低的濃度使用來提供溫和條件之還原劑。如本文所用之術語「溫和還原劑」或「溫和還原條件」應意指由在游離半胱胺酸位點處提供硫醇且不實質上斷裂存在於經改造抗 體中之天然二硫鍵之還原劑(視情況在穩定劑存在下)帶來的任何藥劑或狀態。亦即溫和還原劑或條件(較佳與穩定劑組合)能夠有效地還原游離半胱胺酸(提供硫醇)且不顯著地斷裂蛋白質之天然二硫鍵。期望還原條件可由建立適用於選擇性結合之環境之多種基於硫氫基之化合物來提供。在實施例中，溫和還原劑可包含具有一或多個游離硫醇之化合物，而在一些實施例中，溫和還原劑包含具有單一游離硫醇之化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑之非限制性實例包含麩胱甘肽、n-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。
應瞭解，如上文所闡述之選擇性還原過程可特別有效地靶向與游離半胱胺酸之結合。就此而言，與位點特異性抗體中期望靶位點之結合度(在此處定義為「結合效率」)可藉由多種業內公認技術來測定。藥物與抗體之位點特異性結合之效率可藉由評價靶結合位點(例如每一輕鏈之c末端上之游離半胱胺酸)上相對於所有其他結合位點之結合百分比來確定。在某些實施例中，本文方法提供藥物與包含游離半胱胺酸之抗體之有效結合。在一些實施例中，結合效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更多，如藉由相對於所有其他結合位點之靶標結合百分比所量測。
應進一步瞭解，能夠結合之經改造抗體可含有當產生或儲存抗體時被封阻或封端之包含硫氫基之游離半胱胺酸殘基。該等帽包括與硫氫基相互作用且預防或抑制結合物形成之小分子、蛋白質、肽、離子及其他材料。在一些情形下，未結合之經改造抗體可包含結合相同或不同抗體上之 其他游離半胱胺酸之游離半胱胺酸。如本文所論述，該交叉反應性可在製造程序期間產生各種污染物。在一些實施例中，經改造抗體可需要在結合反應之前脫帽。在特定實施例中，本文抗體經脫帽且展示能夠結合之游離硫氫基。在特定實施例中，使本文抗體經受不擾亂或重排天然存在之二硫鍵之脫帽反應。應瞭解，在大多數情形下，脫帽反應將發生在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間。
D. DAR分佈及純化
在所選實施例中，與本發明相容之結合及純化方法有利地提供生成包含狹窄DAR分佈之相對均質之ADC製劑的能力。就此而言，根據藥物與經改造抗體之間之化學計量比及毒素位置，所揭示構築體(例如，位點特異性構築體)及/或選擇性結合提供試樣內ADC種類之均質性。如上文簡要論述，術語「藥物對抗體比率」或「DAR」係指ADC製劑中藥物對抗體之莫耳比。在某些實施例中，結合物製劑之DAR分佈可實質上均質，此意味著在ADC製劑內，關於負載位點(即，在游離半胱胺酸上)之具有特定載藥量(例如，2或4之載藥量)之位點特異性ADC之主要種類亦均一。在本發明之其他某些實施例中，可藉助使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及結合達成期望之均質性。在其他實施例中，可藉助使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合達成期望均質性。在再其他實施例中，可使用分析型或製備型層析技術來純化相容性製劑以提供期望均質性。在該等實施例中之每一者中，可使用業內已知之各種技術(包括(但不限於)質譜、HPLC(例如粒徑篩析HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳)分析ADC試樣之均質性。
就ADC製劑之純化而言，應瞭解，可採用標準醫藥製備方法來獲得 期望純度。如本文所論述之液相層析方法(例如反相(RP)及疏水相互作用層析(HIC))可藉由載藥量值分離混合物中之化合物。在一些情形下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)來分離具有特定載藥量之種類。
在任一情形下，所揭示ADC及其製劑可包含各個化學計量莫耳比之藥物及抗體部分，此端視抗體之組態且至少部分地端視用於實現結合之方法而定。在某些實施例中，每個ADC之載藥量可包含1至20個彈頭(即，n為1-20)。其他所選實施例可包含具有1至15個彈頭之載藥量之ADC。在再其他實施例中，ADC可包含1-12個彈頭或更佳1-10個彈頭。在一些實施例中，ADC包含1至8個彈頭。
儘管理論載藥量可能相對較高，但諸如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性等實際限制往往因聚集物及其他污染物而限制包含該DAR之均質製劑之生成。亦即，較高載藥量(例如>8或10)可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不溶性、毒性或細胞滲透性損失，此端視酬載而定。考慮到該等問題，本發明所提供之載藥量較佳在1至8種藥物/結合物之範圍內，即其中1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種藥物共價附接至每一抗體(例如，對於IgG1，其他抗體可端視二硫鍵之數量而具有不同的負載能力)。較佳地，本發明組合物之DAR將為約2、4或6，且在一些實施例中DAR包含約2。
儘管本發明提供相對較高程度之均質性，但所揭示組合物實際上包含具有一系列藥物化合物(例如，在IgG1情形下可能為1至8)之結合物之混合物。因此，所揭示之ADC組合物包括以下結合物之混合物：其中大部分組成抗體共價連接至一或多個藥物部分，及(儘管經改造構築體及選擇 性還原提供相關結合物特異性)其中藥物部分可藉由多個硫醇基團附接至抗體。亦即，在結合後，本發明之組合物包含在各個濃度下具有不同載藥量(例如，1至8種藥物/IgG1抗體)之ADC(連同主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物一起)之混合物。然而，使用選擇性還原及製造後純化，可將結合物組合物驅動至以下點：其中其主要含有單一主要期望ADC種類(例如，載藥量為2)及相對較低量之其他ADC種類(例如，載藥量為1、4、6等)。平均DAR值代表組合物整體(即，所有ADC種類一起)之載藥量之加權平均值。由於所用量化方法之固有不精確性及難以完全去除商業環境中之非主要ADC種類，故可接受之DAR值或規格通常呈現為平均值、範圍或分佈(即，2 +/- 0.5之平均DAR)。較佳地，將在醫藥環境中使用包含經量測在該範圍(即，1.5至2.5)內之平均DAR之組合物。
因此，在一些實施例中，本發明包含具有1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.5之平均DAR之組合物。在其他實施例中，本發明包含2、4、6或8 +/- 0.5之平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明包含2 +/- 0.5或4 +/- 0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，該範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.3之平均DAR，2、4、6或8 +/- 0.3之平均DAR，甚至更佳2或4 +/- 0.3之平均DAR或甚至2 +/- 0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1結合物組合物將較佳包含具有1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.4之平均DAR及相對較小量(即，小於30%)之非主要ADC種類之組合物。在其他實施例中，ADC組合物包含2、4、6或8各自+/- 0.4之平均DAR以及相對較少量(<30%)之非主要ADC種類。在一些實施例中，ADC組合物包含2 +/- 0.4之平均DAR以及相對較少量(<30%)之非主要ADC種類。在再其他實 施例中，當相對於存在於組合物中之所有其他DAR種類量測時，主要ADC種類(例如，載藥量為2或載藥量為4)將以下列濃度存在：大於50%之濃度、大於55%之濃度、大於60%之濃度、大於65%之濃度、大於70%之濃度、大於75%之濃度、大於80%之濃度、大於85%之濃度、大於90%之濃度、大於93%之濃度、大於95%之濃度或甚至大於97%之濃度。
如下文實例中所詳述，來自結合反應之ADC製劑中藥物/抗體之分佈可藉由諸如以下等習用方式來表徵：UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、質譜術、ELISA及電泳。亦可測定關於藥物/抗體之ADC之定量分佈。藉由ELISA，可測定特定ADC製劑中藥物/抗體之平均值。然而，藉由抗體-抗原結合及ELISA之檢測限值無法辨別藥物/抗體值之分佈。而且，用於檢測抗體-藥物結合物之ELISA分析無法確定藥物部分附接至抗體之位置(例如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基)。
VII. 診斷及篩選 A. 診斷
本發明提供用於檢測、診斷或監測增殖性病症之活體外及活體內方法以及篩選來自患者之細胞以鑑別腫瘤細胞(包括致瘤細胞)之方法。該等方法包括鑑別患有癌症之個體用於治療或監測癌症之進展，其包含使患者或自患者獲得之試樣與能夠特異性識別並締合DLL3或ASCL1之檢測劑(例如，抗體或核酸探針)接觸(活體內或活體外)，及檢測試樣中檢測劑之存在或不存在或締合量。在所選實施例中，檢測劑包含與如本文所闡述之可檢測標記或報導子分子締合之抗體。在再其他實施例(例如，原位雜交或ISH)中，將使用與基因組DLL3或ASCL1決定子反應之核酸探針來檢測、診斷或監測增殖性病症。
更通常而言，DLL3或ASCL1決定子之存在及/或含量可使用熟習此項技術者可獲得之多種技術中之任一者來量測用於蛋白質或核酸分析，該等技術為例如直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈式反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、分支寡核苷酸技術、北方墨點技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包含量測源自化學反應之信號，例如吸光度之變化、螢光之變化、化學發光或電化學發光之產生、反射率、折射率或光散射之變化、可檢測標記自表面之累積或釋放、氧化或還原或氧化還原物質、電流或電位、磁場之變化等。適宜檢測技術可經由標記之光致發光(例如，經由量測螢光、時間解析螢光、衰減波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如，經由引起吸光度或螢光之變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)量測該等標記以量測經標記結合試劑之參與來檢測結合事件。另一選擇為，可使用無需使用標記之檢測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿子共振量測)或分析物之固有發光之技術。
在一些實施例中，檢測劑與試樣中之特定細胞或細胞組分之締合指示該試樣可含有致瘤細胞，由此表示可使用如本文所述之抗體或ADC有效地治療患有癌症之個體。
在某些較佳實施例中，分析可包含免疫組織化學(IHC)分析或其變化形式(例如，螢光ABC、發色ABC、標準ABC、標準LSAB等)、免疫化學或其變化形式(例如，直接、間接、螢光、發色等)或原位雜交(ISH)或其變化形式(例如，發色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或 RNA-FISH))。
就此而言，本發明之某些態樣包含使用經標記之DLL3或經標記之ASCL1用於免疫組織化學(IHC)。更特定而言，可使用DLL3 IHC或ASCL1 IHC作為診斷工具來幫助診斷多種增殖性病症及監測對治療(包括DLL3抗體療法)之潛在反應。如本文所論述且如下文實例中所顯示，可對已經化學固定(相容性技術包括(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(相容性方法包括(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容性診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定投藥方案及時刻。
可使用免疫組織化學技術來衍生ASLC1 H評分，如業內已知。該等H評分可用於指示哪些患者可適於利用本發明之組合物來治療。在所選實施例中，300點量表上約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190或約200或更高之H評分可用於指示哪些患者可有利地對本發明之治療方法有反應。因此，在一個實施例中，欲利用本發明之DLL3 ADC治療之患者將具有300點量表上至少90(即，腫瘤為ASCL1+)之H評分。在其他實施例中，欲利用本發明之DLL3 ADC治療之患者將具有至少120之ASLC1 H評分。在再其他實施例中，欲利用本發明之DLL3 ADC治療之患者將具有至少180之ASLC1 H評分。出於本發明之目的，展現300點量表上90或更高之ASLC1 H評分之任何腫瘤將視為ASCL1+腫瘤且經受所揭示抗體或ADC之治療。
在再其他實施例中，患者選擇可基於經一定強度染色之標記物(例如，ASCL1)陽性細胞之百分比來預測。舉例而言，>20%之細胞展現2+ 強度或更大強度之腫瘤將為利用DLL3 ADC進行治療之候選者。在其他實施例中，若當利用標記物抗體(例如，抗ASCL1抗體)染色並根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在其他某些實施例中，若在利用標記物抗體染色並根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在再其他所選實施例中，若在利用標記物抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時10%、20%、30%、40%或50%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。在再其他實施例中，若在利用標記物抗體染色且根據如本文所揭示之標準IHC方案檢查時10%、20%、30%、40%或50%之腫瘤細胞展現2+強度或更大強度，則患者將為利用DLL3 ADC或其他化學治療劑進行治療之候選者。又一實施例包含治療患有腫瘤(包含其中當利用標記物抗體染色並根據標準IHC方案檢查時10%之腫瘤細胞展現1+強度或更大強度之腫瘤細胞)之個體之方法，其包含投與抗DLL3 ADC之步驟。就上文所提及實施例中之每一者而言，應瞭解經標記物抗體染色之強度可容易地使用熟習此項技術者熟悉之標準病理學技術及方法來測定。
如上文所論述，與對照試樣中之參考表現程度相比，某些標記物含量及DLL3表現將降低或減少。更特定而言，具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤可表現較低量之一種選自由以下組成之群之標記物：視網膜母 細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。另外，該等腫瘤可表現相對較低量之DLL3蛋白且可分類為ASCL1+、DLL3-/低，其中DLL3-可指示不可檢測或幾乎不可檢測的表現程度且DLL3低可指示相對降低量之DLL3，如在某些腫瘤(例如，腺癌)中所發現。就此而言，DLL3低將意指包含與對照試樣(例如，DLL3+或hi腫瘤)中之參考表現程度相比降低5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多之DLL3表現程度之任何腫瘤。在某些實施例中，與對照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在再其他實施例中，與對照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多，而在其他實施例中，與對照試樣中之參考表現程度相比，DLL3表現將減少90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。在所選實施例中，當與自DLL3+腫瘤獲得之試樣相比時，DLL3表現將減少至少90%、至少95%、至少97%或至少99%。
在其他實施例中，可將腫瘤試樣與已知不表現DLL3之對照腫瘤試樣(陰性對照)相比較。當作出該等比較時，自個體獲得之腫瘤試樣若展現與陰性對照實質上相同之DLL3含量則可分類為DLL3-。
在再其他實施例中，DLL3-/低腫瘤可容易地由受訓病理學家根據本發明使用IHC來鑑別。更特定而言，可獲得腫瘤試樣，較佳進行固定並利用如本文所揭示之抗DLL3抗體進行染色且使用業內公認之技術來讀取。在某些實施例中，DLL3表現可由病理學家使用適當的陽性及陰性對照目視 測定。在其他實施例中，評分可基於衍生之H評分，可包含量測腫瘤試樣中陽性染色細胞之百分比。就後者而言，若使用標準IHC技術，小於約20%、15%、10%、8%、5%、4%、3%、2%或1%之細胞染色為陽性，則可發現腫瘤為DLL3-/低。在其他實施例中，若當利用如本文所闡述之DLL3抗體探測時小於約0.8%、0.6%、0.4%、0.2%或0.1%之細胞染色呈陽性，則可發現腫瘤為DLL3-/低。其他實施例中，在基於諸如相對強度、染色圖案、所用試樣來源及製備、抗體及報導子等因素檢查載玻片時，熟習此項技術者可作出什麼構成DLL3-/低腫瘤之定性判斷。如先前所提及之關於DLL3表現程度之任何測定均係在適當陽性及陰性對照之背景下作出且相對準確。因此，該等測定可指示哪些患者能用如本文所闡述之DLL3 ADC來治療。
本發明之其他特別相容之態樣涉及使用原位雜交來檢測或監測DLL3或ASCL1決定子。原位雜交技術或ISH為熟習此項技術者所熟知。簡言之，將細胞固定且將含有特定核苷酸序列之可檢測探針添加至經固定細胞中。若該等細胞含有互補核苷酸序列，則可檢測到之探針將與其雜交。可使用本文所述之序列資訊設計探針來鑑別表現基因型DLL3或ASCL1決定子之細胞。探針較佳與對應於該等決定子之核苷酸序列雜交。雜交條件可以常規方式最佳化以藉由不完全互補雜交使背景信號最小化，但較佳地探針較佳與所選DLL3或ASCL1決定子完全互補。在所選實施例中，探針經附接至可容易地藉由標準螢光方法檢測之探針之螢光染料標記。
相容性活體內治療診斷劑或診斷分析可包含業內公認成像或監測技術，例如磁共振成像、電腦化斷層掃描(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線攝影、超音波等，如熟習此項技術者將已知。
在某些實施例中，可使用本發明抗體來檢測及量化患者試樣(例如，血漿或血液)中特定決定子(例如，DLL3蛋白或ASCL1蛋白)之含量，該等含量又可用於檢測、診斷或監測與相關決定子相關之增殖性病症。在相關實施例中，可使用本發明抗體在活體內或活體外檢測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。
在本發明之某些實施例中，可在療法或方案之前使用所揭示之抗體評價或表徵個體或個體試樣中之致瘤細胞來建立基線。在其他實例中，可評價源自所治療個體之試樣之致瘤細胞。
在另一實施例中，本發明提供活體內分析癌症進展及/或發病機制之方法。在另一實施例中，癌症進展及/或發病機制之活體內分析包含測定腫瘤進展之程度。在另一實施例中，分析包含腫瘤之鑑別。在另一實施例中，腫瘤進展之分析係在原發性腫瘤上實施。在另一實施例中，隨時間實施分析，此端視癌症之類型而定，如熟習此項技術者已知。在另一實施例中，在活體內執行源自原發性腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤之進一步分析。在另一實施例中，分析繼發性腫瘤之大小及形狀。在一些實施例中，實施進一步離體分析。
在另一實施例中，本發明提供活體內分析癌症進展及/或發病機制之方法，其包括測定細胞轉移或檢測並量化循環腫瘤細胞之量。在另一實施例中，細胞轉移之分析包含測定自原發性腫瘤不連續之位點處細胞之進行性生長。在一些實施例中，可實施程序以監測經由血管系統、淋巴、在體腔內或其組合分散之腫瘤細胞。在另一實施例中，根據細胞遷移、傳播、外滲、增殖或其組合來實施細胞轉移分析。
在某些實例中，可在療法之前使用所揭示抗體評價或表徵個體或個體試樣中之致瘤細胞來建立基線。在其他實例中，樣品源自所治療之個體。在一些實例中，在個體開始或終止治療後至少約1天、2天、4天、6天、7天、8天、10天、12天、14天、15天、16天、18天、20天、30天、60天、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月自個體獲取試樣。在某些實例中，在一定劑量數後(例如，在療法之2個、5個、10個、20個、30個或更多個劑量後)評價或表徵致瘤細胞。在其他實例中，在接受一或多種療法後1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更長時間表徵或評價致瘤細胞。
B. 篩選
在某些實施例中，可使用本發明抗體來篩選試樣以鑑別藉由與決定子相互作用而改變腫瘤細胞之功能或活性之化合物或藥劑(例如，抗體或ADC)。在一個實施例中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸，且該抗體或ADC可用於篩選表現某一靶(例如DLL3或ASCL1)之腫瘤細胞，以便鑑別該等細胞用於多個目的(包括(但不限於)診斷目的)、監測該等細胞以確定治療效能或針對該等靶標表現細胞富集細胞群體。
在另一實施例中，方法包括使腫瘤細胞與測試劑或化合物直接或間接接觸，及確定該測試劑或化合物是否調節決定子締合之腫瘤細胞之活性或功能，例如細胞形態或活力之改變、標記物之表現、分化或去分化、細胞呼吸、粒腺體活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、細胞凋亡或細胞死亡。直接相互作用之一個實例係物理相互作用，而間接相互作用包括(例如)組合物對中間分子之作用，該中間分子又作用於所提及實體(例如，細胞或細胞培養物)。
篩選方法包括高通量篩選，其可包括視情況位於或置於例如培養皿、管、燒瓶、滾瓶或板上之預定位置之細胞陣列(例如，微陣列)。高通量機器人或人工處置方法可探測化學相互作用並在短時間段內測定許多基因之表現程度。業內已研發出例如經由螢光團或微陣列(Mocellin及Rossi,2007,PMID：17265713)及以極快速之速率處理資訊之自動化分析(例如，參見Pinhasov等人，2004,PMID：15032660)利用分子信號之技術。可篩選之文庫包括例如小分子文庫、噬菌體展示文庫、全人類抗體酵母展示文庫(Adimab)、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。
VIII. 醫藥製備及治療用途
業內已充分闡述針對DLL3+腫瘤之抗DLL3 ADC療法。例如參見PCT公開案第WO 2013126746號及第WO 2014130879號；及Pietanza等人，EMSO Abstract 2015。具體而言，DLL3表現與轉型為神經內分泌表型且此後極難使用標準照護治療之腫瘤相關。本發明提供鑑別具有神經內分泌轉型風險之腫瘤，使得具有所揭示風險因素之患者可經鑑別為可用抗DLL3抗體藥物結合物治療為DLL3-/低之腫瘤之候選者之方法及組合物。如本文所詳述，風險因素包括(1)在轉型為神經內分泌表型期間及在大量DLL3表現之前在腫瘤中表現各種蛋白質，及(2)先前利用靶向療法之治療。
具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤之早期治療有益於減少或抑制腫瘤再發。具體而言，抗DLL3抗體藥物結合物可有效地治療顯示神經內分泌轉型之如本文所揭示一或多種風險因素之DLL3-/低腫瘤，藉此降低再發之發生率。在復發或再發癌症之情形下，具有風險之腫瘤包括先前利用靶向癌症療法治療之彼等。
在本發明之一個態樣中，抗DLL3 ADC係在腺癌完全轉型為神經內分泌表型之前投與患者，其中腫瘤通常為DLL3-/低。在相關態樣中，抗DLL3 ADC係在利用靶向癌症療法治療之前投與。在另一態樣中，抗DLL3 ADC係以與靶向癌症療法之組合療法投與，其中該投與可與抗DLL3 ADC同時或連續進行。在再一態樣中，抗DLL3抗體係在化學治療方案之前、在其之後或與其同時投與具有DLL3-/低腫瘤之個體。在又一態樣中，抗DLL3 ADC係在腺癌發展對靶向癌症療法之抗性或以其他方式顯示發展該抗性之風險之後投與患者。
減少或抑制再發意指與對照相比疾病再發之任何顯著降低。舉例而言，與對照相比顯著降低至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。或者，減少或抑制再發可為與對照相比至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、20倍或更多倍之任一倍數降低。代表性對照包括(例如)在不存在抗DLL3 ADC療法下接受給定靶向療法之患者群體中之再發率。
A. 調配物及投與途徑
端視抗體藥物結合物之形式、預期遞送模式、所治療或監測之疾病及多種其他變量，可視需要使用業內公認之技術調配本發明之組合物。在一些實施例中，本發明之治療組合物可純淨的或與極少量其他組分一起來投與，而其他可視情況經調配以含有業內熟知之適宜的醫藥上可接受之載劑(包含賦形劑及助劑)(例如，參見Gennaro,Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版(2003)；Ansel等人，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins(2004)；Kibbe等人，Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。各種醫藥上可接受之載劑包括媒劑、佐劑及稀釋劑，其易於自多種商業來源獲得。此外，亦可對醫藥上可接受之輔助物質進行分類，例如pH調節劑及緩衝劑、張力調節劑、穩定劑、潤濕劑及諸如此類。某些非限制性實例性載劑包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、水、甘油、乙醇及其組合。
更具體而言應瞭解，在一些實施例中，本發明之治療組合物可純淨的或與極少量其他組分一起來投與。相反，本發明之DLL3抗體藥物結合物可視情況經調配以含有適宜的醫藥上可接受之載劑(包含賦形劑及助劑)，該等載劑為業內熟知且為促進抗體藥物結合物之投與或輔助活性化合物處理成在醫藥上最佳化用於遞送至作用位點之製劑的相對惰性物質。舉例而言，賦形劑可賦予形式或稠度或充當稀釋劑，以改良抗體藥物結合物之藥物動力學或穩定性。適宜賦形劑或添加劑包括(但不限於)穩定劑、潤濕及乳化劑、用於改變滲透性之鹽、囊封劑、緩衝液及皮膚滲透增強劑。在某些較佳實施例中，醫藥組合物可以凍乾形式提供且在投與前在(例如)緩衝鹽水中重構。
用於全身投與之所揭示抗體藥物結合物可經調配用於腸內、非經腸或局部投與。實際上，可同時使用所有三種類型之調配物來達成活性成分之全身投與。用於非經腸及非注射藥物遞送之賦形劑以及調配物闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版，Mack Publishing,2000中。用於非經腸投與之適宜調配物包括呈水溶性形式(例如，水溶性鹽)之活性化合物水溶液。另外，可投與呈適於油性注射懸浮 液之活性化合物懸浮液。適宜親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，例如，己基取代之聚(乳酸交酯)、芝麻油或合成脂肪酸酯(例如，油酸乙酯或甘油三酯)。水性注射懸浮液可含有增加該懸浮液黏度之物質且包括(例如)羧甲基纖維素鈉、山梨醇及/或葡聚醣。視情況，懸浮液亦可含有穩定劑。亦可使用脂質體來囊封藥劑用於遞送至細胞中。
適於腸內投與之調配物包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入劑及其控制釋放形式。
一般而言，可藉由各種途徑將包含DLL3抗體藥物結合物之本發明化合物及組合物活體內投與需要其之個體，該等途徑包括(但不限於)經口、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌內、顱內、心內、室內、氣管內、經頰、直腸、腹膜內、真皮內、局部、經皮及鞘內或藉由植入或吸入。可將標的組合物調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑；包括(但不限於)、錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及氣溶膠。可根據預期施用及治療方案來選擇適當的調配物及投與途徑。
B. 劑量
類似地，特定劑量方案(即，劑量、時間及重複次數)將端視特定個體及該個體之醫學史以及經驗考慮(例如藥物動力學(例如半衰期、清除速率等))而定。投與頻率可在療程內進行確定及調整，且其係基於以下進行：降低增殖性或致瘤細胞之數量、維持該等贅瘤細胞之減少、減少贅瘤細胞之增殖或延遲轉移之發生。在其他實施例中，可調整或減少所投與劑量來管控潛在副作用及/或毒性。或者，標的治療組合物之持續連續釋放調配物可能適當。
一般而言，抗體藥物結合物可以各個範圍來投與。該等包括約10μg/kg體重至約100mg/kg體重/劑量；約50μg/kg體重至約5mg/kg體重/劑量；約100μg/kg體重至約10mg/kg體重/劑量。其他範圍包括約100μg/kg體重至約20mg/kg體重/劑量及約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重/劑量。在某些實施例中，劑量為至少約100μg/kg體重、至少約250μg/kg體重、至少約750μg/kg體重、至少約3mg/kg體重、至少約5mg/kg體重、至少約10mg/kg體重。
在所選實施例中，抗體藥物結合物將以約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100μg/kg體重/劑量來投與。其他實施例包含以200、300、400、500、600、700、800或900μg/kg體重/劑量投與抗體藥物結合物。在其他較佳實施例中，抗體藥物結合物係以1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg來投與。在再其他實施例中，抗體藥物結合物可以12、14、16、18或20mg/kg體重/劑量來投與。在再其他實施例中，抗體藥物結合物可以25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100mg/kg體重/劑量來投與。根據本文之教示，熟習此項技術者基於臨床前動物研究、臨床觀察及標準醫學及生物化學技術及量測可容易地確定適於各種抗體藥物結合物之劑量。在尤佳實施例中，該等抗體藥物結合劑量將經一定時間段以靜脈內方式來投與。此外，該等劑量可經所定義療程分多次來投與。
可基於體表面積(BSA)計算預測其他投藥方案，如U.S.P.N.7,744,877中所揭示。如所熟知，BSA係使用患者之身高及體重來計算且提供如由其身體之表面積表示之個體大小之量度。在某些實施例中，抗體藥物結合物可以下列劑量來投與：10mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至 500mg/m2及100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2。亦應瞭解，可使用業內公認及經驗技術來確定適當劑量。
在任一情形下，較佳視需要將DLL3抗體藥物結合物投與需要其之個體。投與頻率可由熟習此項技術者(例如主治醫師)基於考慮所治療病況、所治療個體之年齡、所治療病況之嚴重性及所治療個體之一般健康狀況及諸如此類來確定。通常，向個體投與一或多次有效劑量之DLL3抗體藥物結合物。更具體而言，每月一次、多於每月一次或少於每月一次向個體投與有效劑量之抗體藥物結合物。在某些實施例中，可投與多次有效劑量之DLL3抗體藥物結合物，包括持續至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年之時段或若干年之時段。在再其他實施例中，在抗體藥物結合物之投與之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)或甚至一年或若干年。
在某些較佳實施例中，涉及抗體藥物結合物之療程包含在數週或數月之時段內多個劑量之所選藥物產品。更特定而言，抗體藥物結合物可每天一次、每兩天一次、每四天一次、每週一次、每十天一次、每兩週一次、每三週一次、每月一次、每六週一次、每兩個月一次、每十週一次或每三個月一次來投與。就此而言，應瞭解，基於患者反應及臨床實踐，可改變劑量或可調整間隔。
在已給予一或多次投與之個體中，亦可憑經驗針對所揭示之治療組合物確定劑量及方案。例如，可給予個體遞增劑量之如本文所述產生之治療組合物。在所選實施例中，可分別基於經驗確定或所觀察到之副作用或 毒性逐漸增加或減少或減弱劑量。為評價所選組合物之效能，可如先前所闡述遵循特定疾病、病症或病況之標記物。在個體患有癌症之實施例中，該等評價包括經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤試樣之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測根據本文所述方法鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或抗原；疼痛或麻痺之減輕；經改良之與腫瘤相關之語言、視覺、呼吸或其他失能；增加之食欲；或如藉由公認測試所量測之生活品質之提高或存活期之延長。熟習此項技術者應明瞭，劑量將端視個體、贅瘤性病況之類型、贅瘤性病況之時期、贅瘤性病況是否已開始轉移至個體之其他位置及所使用之過去及同時治療而定。
C. 組合療法
如本文所闡述，腺癌腫瘤通常係異質的且可包含對靶向抗癌症療法具有抗性之罕見神經內分泌細胞。因此，有效治療策略包含以與抗癌劑之組合療法投與抗DLL3抗體藥物結合物。在一個實施例中，抗DLL3抗體藥物結合物係以與靶向抗癌症療法(例如靶向抗癌劑)之組合療法來投與。在一態樣中，抗DLL3抗體藥物結合物可與靶向抗癌症療法同時投與。在其他態樣中，抗DLL3抗體藥物結合物之投與係在腫瘤已變得對靶向抗癌症療法具有抗性之後進行。在再其他態樣中，抗DLL3抗體藥物結合物之投與係在投與靶向抗癌症療法之前進行。
組合療法特別可用於減少或抑制不期望之贅瘤性細胞增殖、減少癌症之發生、減少或預防癌症之再發或減少或預防癌症之擴散或轉移。在該等情形下，抗體藥物結合物可作為敏化劑或化學敏化劑藉由去除原本將支撐腫瘤團塊並使其永生之癌細胞來起作用，且由此使得更有效地使用當前 標準照護減瘤劑或抗癌劑。亦即，在某些實施例中，抗體藥物結合物可提供增強之效應(例如，在性質上加性或協同)來加強另一所投與治療劑之作用模式。在本發明背景下，「組合療法」應在廣義上理解且僅係指投與抗體藥物結合物及一或多種抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射療法及放射治療劑、靶向抗癌療法或藥劑(包括單株抗體及小分子實體二者)、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、輻射療法及抗轉移劑及免疫治療劑，包括特異性及非特異性方法二者。
組合結果無需係在單獨實施每一治療(例如，抗體藥物結合物及抗癌劑)時所觀察到之效應之加和。儘管通常期望至少加性效應，但大於單一療法中之一者之任何增加之抗腫瘤效應均係有益的。此外，本發明無需組合治療來展現協同效應。然而，熟習此項技術者應瞭解，利用某些包含較佳實施例之所選組合可觀察到協同作用。
在實踐組合療法中，抗體藥物結合物及抗癌劑(例如靶向抗癌療法)可以單一組合物或以兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。或者，抗體藥物結合物可在抗癌劑治療之前或之後以(例如)在數分鐘至數週範圍內之間隔進行。每一遞送之間之時間段使得抗癌劑及抗體藥物結合物能對腫瘤施加組合效應。在至少一個實施例中，抗癌劑及抗體藥物結合物係彼此在約5分鐘至約兩週內投與。在再其他實施例中，在投與抗體藥物結合物與抗癌劑之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)。
組合療法可投與一次、兩次或至少持續一定時間段直至病況經治 療、緩解或治癒為止。在一些實施例中，組合療法係投與多次，例如，每天三次至每六個月一次。投與可根據時間表進行，例如每天三次、每天兩次、每天一次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次或可經由微型幫浦連續投與。組合療法可經由如先前所述之任一途徑來投與。組合療法可在距腫瘤位點較遠之位點投與。
在一個實施例中，抗體藥物結合物係與一或多種抗癌劑(例如靶向抗癌症療法)組合在短治療週期內投與需要其之個體。本發明亦涵蓋不連續投與或分成若干部分投與之日劑量。抗體藥物結合物及抗癌劑可間隔數天或數週交替投與；或可給出抗體藥物結合物治療之順序，隨後利用抗癌劑療法治療一或多次。在任一情形下，如熟習此項技術者應瞭解，化學治療劑之適當劑量通常將約為已用於臨床療法(其中化學治療劑係單獨或與其他化學治療劑組合投與)中之彼等。
在另一較佳實施例中，抗DLL3抗體藥物結合物可用於維持療法中以減少或消除疾病初始呈現後腫瘤再發之機會。較佳地，將治療該病症且消除、減少或以其他方式改善初始腫瘤團塊，故患者為無症狀或處於緩解中。此時，即使使用標準診斷程序存在極少或無疾病之適應症，仍可向個體投與一或多次醫藥有效量之所揭示抗體藥物結合物。在一些實施例中，抗體藥物結合物將按照規則時間表經一定時間段(例如每週、每兩週、每月、每六週、每兩個月、每三個月、每六個月或每年)來投與。鑒於本文教示，熟習此項技術者可容易地確定有利劑量及投藥方案來降低疾病再發之可能性。另外，該等治療可持續數週、數月、數年或甚至無限時間之時段，此端視患者反應以及臨床及診斷參數而定。
在另一較佳實施例中，抗體藥物結合物可以預防方式或作為佐劑療法用於預防減瘤程序後之腫瘤轉移或降低其可能性。如本發明中所用，「減瘤程序」係經廣泛定義且應意指消除、減輕、治療或改善腫瘤或腫瘤增殖之任何程序、技術或方法。實例性減瘤程序包括(但不限於)手術、輻射治療(即，束輻射)、化學療法、免疫療法或燒蝕。可在由熟習此項技術者根據本發明容易確定之適當時間，如臨床、診斷或治療診斷程序所建議投與所揭示之抗體藥物結合物來減少腫瘤轉移。可如使用標準技術所測定以醫藥有效劑量投與一或多次抗體藥物結合物。較佳地，投藥方案是伴隨可容許修改該投藥方案之適當診斷或監測技術。
D. 抗癌劑
抗體藥物結合物可與抗癌劑組合使用。術語「抗癌劑」或「抗增殖劑」意指可用於治療細胞增殖性病症(例如癌症)之任何藥劑，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減瘤劑、化學治療劑、放射療法及放射性治療劑、靶向抗癌劑、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、輻射療法及抗轉移劑及免疫治療劑。
如本文所用術語「細胞毒性劑」意指對細胞具有毒性且會降低或抑制細胞之功能及/或引起細胞破壞之物質。通常，該物質係衍生自活生物體之天然存在之分子。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)細菌之小分子毒素或酶活性毒素(例如，白喉毒素(Diptheria toxin)、假單胞菌屬內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A))、真菌之小分子毒素或酶活性毒素(例如，α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限麴菌素(restrictocin))、植物之小分子毒素或酶活性毒素(例如，相思子素、蓖麻毒蛋白、莫迪素(modeccin)、槲寄生素(viscumin)、商陸抗病毒蛋白、肥 皂草毒素、白樹毒素、苦瓜毒素、天花粉蛋白、大麥毒素、光桐油(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca mericana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、米特格林(mitegellin)、侷限麴菌素、酚黴素、新黴素及單端孢黴烯)或動物之小分子毒素或酶活性毒素(例如細胞毒性RNA酶，例如細胞外胰臟RNA酶；DNA酶I，包括其片段及/或變體)。
出於本發明之目的，「化學治療劑」包含非特異性減少或抑制癌細胞之生長、增殖及/或存活之化學化合物(例如，細胞毒性或細胞生長抑制劑)。該等化學劑通常針對為細胞生長或分裂所需之細胞內過程，且因此可特別有效地針對通常快速生長及分裂之癌性細胞。例如，長春新鹼會使微管解聚合，且因此抑制細胞進入有絲分裂。一般而言，化學治療劑可包括抑制或經設計以抑制癌性細胞或可能變成癌性或生成致瘤子代(例如，TIC)之細胞的任何化學劑。該等藥劑通常係以組合、例如以諸如CHOP或FOLFIRI等方案投與，且通常最有效。
可與抗體藥物結合物組合使用之抗癌劑之實例包括(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基蜜胺、多聚乙醯、喜樹鹼(camptothecin)、苔蘚蟲素(bryostatin)、卡利斯他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻素(cryptophycin)、多拉斯他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑制素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、達內黴素(dynemicin)、雙磷酸鹽、埃斯培拉黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素 (aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素、偶氮絲胺酸、博萊黴素(bleomycin)、放線菌素C、坎磷醯胺(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、放線菌素、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑、厄洛替尼、威羅非尼(vemurafenib)、克唑替尼、色瑞替尼、索拉非尼、依魯替尼(ibrutinib)、恩雜魯胺(enzalutamide)、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺藥、葉酸補充劑(例如亞葉酸)、醋葡醛內酯(aceglatone)、醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)、胺基乙醯丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、貝司特布斯(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鳥胺酸(elfornithine)、伊利醋銨(elliptiniumacetate)、埃博黴素、依託格魯(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明(lonidainine)、類美登素(maytansinoid)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌達醇(mopidanmol)、硝胺丙吖啶(nitraerine)、噴斯他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼 酸、2-乙基醯肼、苯卡巴肼(procarbazine)、PSK®多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)、雷佐生(razoxane)；利索新(rhizoxin)；西左非蘭(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(尤其T-2毒素、黏液黴素(verracurin)A、桿孢菌素(triaziquone)A及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加賽特辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；GEMZAR®吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；NAVELBINE®長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；依班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar,CPT-11)、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視色素；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲硫四氫葉酸；奧沙利鉑(oxaliplatin)；減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A抑制劑及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。此定義亦包括用於調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素劑及選擇性雌激素受體調節劑、抑制芳香酶、調控腎上腺中之雌激素產生之芳香酶抑制劑及抗雄激素劑；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶(例如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制 劑)；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯培拉黴素及上述任一者之醫藥上可接受之鹽、酸或衍生物。
尤佳抗癌劑包含商業上或臨床上可獲得之化合物，例如厄洛替尼(TARCEVA®,Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(docetaxel)(TAXOTERE®,Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS編號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®,Lilly)、PD-0325901(CAS編號391210-10-9,Pfizer)、順鉑(順式-二胺、二氯鉑(II)，CAS編號15663-27-1)、卡鉑(carboplatin)(CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(trastuzumab)(HERCEPTIN®,Genentech)、替莫唑胺(temozolomide)(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]壬-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS編號85622-93-1,TEMODAR®、TEMODAL®,Schering Plough)、他莫昔芬(tamoxifen)((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺、NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)及多柔比星(ADRIAMYCIN®)。其他商業上或臨床上可獲得之抗癌劑包含奧沙利鉑(ELOXATIN®,Sanofi)、硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®,Millennium Pharm.)、舒癌特(sutent)(SUNITINIB®、SU11248,Pfizer)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®,Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC®,Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis,WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑、AZD6244,Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、 BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®,AstraZeneca)、甲硫四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®,Wyeth)、拉帕替尼(lapatinib)(TYKERB®、GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(lonafarnib)(SARASARTM、SCH 66336,Schering Plough)、索拉菲尼(NEXAVAR®、BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®,AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®,CPT-11,Pfizer)、替比法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM,Johnson & Johnson)、ABRAXANETM(不含克列莫佛(Cremophor))、太平洋紫杉醇之白蛋白改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(vandetanib)(rINN、ZD6474、ZACTIMA®,AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、替西羅莫司(temsirolimus)(TORISEL®,Wyeth)、帕唑帕尼(pazopanib)(GlaxoSmithKline)、坎磷醯胺(TELCYTA®,Telik)、噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN®、NEOSAR®)；長春瑞濱(NAVELBINE®)；卡培他濱(XELODA®,Roche)、他莫昔芬(包括NOLVADEX®；檸檬酸他莫昔芬、FARESTON®(檸檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))、MEGASE®(乙酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦(exemestane)；Pfizer)、福美坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏氯唑(vorozole))、FEMARA®(來曲唑；Novartis)及ARIMIDEX®(阿那曲唑(anastrozole)；AStraZeneca))。
在其他實施例中，抗體藥物結合物可與目前臨床試驗或市售之多種 抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。為此，抗體藥物結合物可與選自由以下組成之群之抗體組合使用：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿福圖珠單抗(afutuzumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、阿托珠單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗(bevacizumab)、比伐單抗(bivatuzumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立瓦妥珠單抗(clivatuzumab)、可那木單抗(conatumumab)、達雷木單抗(daratumumab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、杜昔妥單抗(dusigitumab)、地莫單抗(detumomab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、伐樂珠單抗(farlctuzumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達妥昔單抗(indatuximab)、伊珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗 (labetuzumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛伏珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)、納那妥單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、若莫單抗(nofetumomabn)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、昂妥珠單抗(onartuzumab)、莫奧珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕圖珠單抗(parsatuzumab)、帕圖單抗(patritumab)、帕圖莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉妥木單抗(racotumomab)、拉圖單抗(radretumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、司妥佐單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他妥珠單抗(tacatuzumab)、他妥莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替普莫單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗、托卡珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃妥珠單抗(vorsetuzumab)、沃圖莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8及其組合。
再其他尤佳實施例包含使用經批准用於癌症療法之抗體，該等抗體 包括(但不限於)利妥昔單抗、曲妥珠單抗、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamcin)、阿侖珠單抗、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、奧法木單抗、伊匹單抗及貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)。熟習此項技術者將能夠容易地鑑別與本文教示相容之其他抗癌劑。
E. 放射療法
本發明亦提供抗體藥物結合物與放射療法(即，用於誘導腫瘤細胞內之局部DNA損傷之任何機制，例如γ輻照、X射線、UV輻照、微波、電子發射及諸如此類)之組合。亦涵蓋使用將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之組合療法，且其可與靶向抗癌劑或其他靶向方式結合使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。輻射療法可投與患有頭頸癌之個體達約6至7週。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個連續劑量投與。
IX. 適應症
應瞭解，抗DLL3抗體藥物結合物可用於治療、預防、管控或抑制任何DLL3+癌症以及具有變成DLL3+之風險之彼等癌症(例如如本文所闡述具有神經內分泌轉型風險之彼等DLL3(-/低)腫瘤)之發生或再發。
因此，無論係單獨投與抑或與抗癌劑或放射療法組合投與，抗體藥物結合物通常尤其可用於治療患者或個體之贅瘤性病況，該等贅瘤性病況可包括良性或惡性腫瘤(例如，腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌、宮頸癌、子宮內膜癌、食道癌及子宮癌；肉瘤；神經膠母細胞瘤；及各種頭頸腫瘤)；白血病及淋巴樣惡性病；其他病症，例如神經元病症、 神經膠細胞病症、星狀神經膠細胞病症、下丘腦及其他腺病症、巨噬細胞病症、上皮病症、基質病症及囊胚腔病症；及發炎病症、血管生成病症、免疫學病症及由病原體造成之病症。具體而言，用於治療之關鍵靶標係贅瘤性病況(包含實體腫瘤)，但血液惡性病在本發明之範圍內。較佳地，欲治療之「個體」或「患者」將為人類，但如本文所用該等術語明確包含任何哺乳動物物種。
更特定而言，根據本發明經受治療之贅瘤性病況可選自包括(但不限於)以下各項之群：良性或惡性；實體腫瘤或其他血液贅瘤；且可選自包括(但不限於)以下之群：腎上腺瘤、AIDS相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、自主神經節瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、骨癌(牙釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、良性皮膚纖維組織細胞瘤、促結締組織增殖性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、尤因氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維發育不良、膽囊及膽管癌、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、頭頸癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌(肝胚細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、髓母細胞瘤、黑色素瘤、腦脊髓膜瘤、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、外周神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、前列腺癌、後代眼色素層黑色素瘤、罕見 血液病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。
在某些較佳實施例中，增殖性病症包含實體腫瘤，包括(但不限於)、腎上腺瘤、肝瘤、腎瘤、膀胱瘤、乳房瘤、胃瘤、卵巢瘤、子宮頸瘤、子宮瘤、食道瘤、結腸直腸瘤、前列腺瘤、胰臟瘤、肺瘤(小細胞及非小細胞二者)、甲狀腺瘤、癌、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸瘤。在其他較佳實施例中，抗體藥物結合物可尤其有效地治療小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)(例如，鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在一個實施例中，肺癌係難治、復發或對基於鉑之藥劑(例如，卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、托泊替康(topotecan))及/或紫杉烷(taxane)(例如，多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))具有抗性的。就小細胞肺癌而言，尤佳實施例包含投與抗體藥物結合物。在所選實施例中，抗體藥物結合物將投與展現侷限期疾病之患者。在其他實施例中，抗體藥物結合物將投與展現擴散期疾病之患者。在其他較佳實施例中，抗體藥物結合物將投與難治性患者(即，在完成初始療法期間或完成初始療法後不久即再發之彼等)。再其他實施例包含將抗體藥物結合物投與敏感患者(即，在主要療法後長於2-3個月復發之彼等)。
如上文所論述，抗DLL3抗體藥物結合物可用於預防、治療或診斷具有神經內分泌特徵或表型之腫瘤(包括神經內分泌腫瘤)。抗DLL3抗體藥物結合物亦可用於治療具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤，該風險可藉由本文所揭示之風險因子來鑑別。因此，抗DLL3抗體藥物結合物可用於治療上述癌症類型中之任一者之腫瘤，該等腫瘤之特徵為具有神經內分 泌轉型風險(藉由生物標記表現之變化及/或先前已接受靶向療法)。在本發明之特定態樣中，具有神經內分泌轉型風險之腫瘤包括在以下各項中出現之腺癌：肺、前列腺、膀胱、腎、泌尿生殖道(包括膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)；胃腸道，包括結腸及胃；甲狀腺，包括甲狀腺髓樣癌；及肺，包括小細胞肺癌及大細胞神經內分泌癌。
X. 製品
本發明包括包含一或多個容器或貯器之醫藥包裝及套組，其中容器可包含一或多個劑量之本發明抗體或ADC。該等套組或包裝可為診斷性或治療性。在某些實施例中，包裝或套組含有單位劑量，此意指預定量之包含例如本發明抗體或ADC、含或不含一或多種其他藥劑及視情況一或多種抗癌劑之組合物。在某些其他實施例中，包裝或套組含有可檢測量之抗DLL3抗體、抗ASCL1抗體或抗DLL3 ADC、含或不含相關報導子分子及視情況一或多種用於癌細胞之檢測、量化及/或可視化之其他藥劑。在再其他實施例中，與本發明相容之套組可包含一或多種可用於檢測選自由以下組成之群之標記物之藥劑：哺乳動物無剛毛鱗甲同系物1(ASCL1)、父系性地表現之10(PEG10)或絲胺酸/精胺酸重複性矩陣4(SRRM4)、視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。
在任一情形下，本發明之套組通常包含適宜容器或貯器中之本發明抗體或ADC(醫藥上可接受之調配物)及視情況在相同或不同容器中之一或多種抗癌劑。該等套組亦可含有其他醫藥上可接受之調配物或器件，用於診斷或組合療法。診斷器件或儀器之實例包括可用於檢測、監測、量化或 剖析與增殖性病症相關之細胞或標記物(關於該等標記物之全部清單參見上文)之彼等。在尤佳實施例中，該等器件可用於在活體內或活體外檢測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(例如參見WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。本發明所涵蓋之套組亦可含有適當試劑以組合本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑(例如參見U.S.P.N.7,422,739)。
當在一或多種液體溶液中提供套組之組分時，液體溶液可為非水性溶液，但通常水溶液較佳，且無菌水溶液尤佳。套組中之調配物亦可以可在添加適當液體後重構之乾燥粉末或凍乾形式提供。用於重構之液體可含於單獨容器中。該等液體可包含無菌、醫藥上可接受之緩衝劑或其他稀釋劑，例如抑菌性注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。倘若該套組包含本發明之抗體或ADC與其他治療劑或藥劑之組合，則溶液可以莫耳當量組合或以一種組分超過另一種組分之方式預混合。或者，可在投與患者之前將本發明之抗體或ADC及任何可選抗癌劑或其他藥劑單獨地維持在不同容器內。
該套組可包含一或多個容器或貯器，及於該等容器中或該等容器上或與該等容器締合之標記或包裝插頁，此指示所包封之組合物用於診斷或治療所選疾病病況(例如癌症)。適宜容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器、輸注袋(i.v.袋)等。該等容器可自各種材料(例如玻璃或醫藥上相容之塑膠)形成。在某些實施例中，該(等)容器可包含無菌輸液埠，例如，容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶。
在一些實施例中，該套組可含有向患者投與抗體及任何可選組分之構件，例如一或多個針或注射器(預填充或空的)、滴管、吸管或可將調配 物注射或引入個體中或施加至身體之患病區域之其他此類裝置。本發明套組通常亦將包括在商業規模用封閉限制中含有小瓶或諸如此類及其他組分之構件，例如其中放置且保留期望小瓶及其他裝置之吹模塑膠容器。
XI.雜項
除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包括兩個終點及該等終點之間之所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及2.0與3.0之間之所有點。
通常，本文所述細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及化學之技術為業內所熟知且常用之彼等。本文結合該等技術使用之術語亦為業內所常用。除非另外指示，否則本發明之方法及技術通常係根據業內所熟知且如本說明書通篇所引用之個個參考文獻中所述之習用方法來實施。
XII. 參考文獻
無論片語「以引用方式併入」是否用於特定參考文獻中，本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方式獲得之材料的完整揭示內容(包括例如基因庫及RefSeq中之例如核苷酸序列提交，及例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中之胺基酸序列提交，及基因庫及RefSeq中之注釋編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。上述詳細闡述及隨附實例僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所顯示及闡述之確切細節。熟習此項技術者所明瞭之變化形式包括在由申請專利範圍所定義之本發明中。本文所用之任何章節標題僅出於組織目 的，且不應理解為限制所述標的物方法。
XIII. 序列
隨附本申請案者係圖式及包含多個核酸及胺基酸序列之序列表。下表3提供所包括序列之概述。
如下文實例2中所論述，上表3可進一步用於表示圖1A及圖1B中所描繪之實例性Kabat CDR之SEQ ID NO。更具體而言，圖1A及圖1B表示每一重鏈(CDRH)及輕鏈(CDRL)可變區序列之三個Kabat CDR，且上表3提供可應用於輕鏈之每一CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈之每一CDRH1、CDRH2及CDRH3的SEQ ID名稱之指配。使用此方法，可為闡述於圖1A及圖1B中(亦及在圖3A及3B中)之每一獨特CDR指配連續SEQ ID NO且可用於提供本發明之衍生抗體。
XIV. 腫瘤列示
PDX腫瘤細胞類型係由縮寫加其後指示具體腫瘤細胞系之數字表示。所測試試樣之傳代次數指示為隨附試樣名稱之p0-p#，其中p0指示自患者腫瘤直接獲得之未傳代試樣，且p#指示在測試之前腫瘤藉助小鼠傳代之次數。如本文所用，腫瘤類型及亞型之縮寫於表4中顯示如下：
實例
藉由參照下列實例將更容易地理解上文由此通常闡述之本發明，該等實例係以闡釋方式提供且不欲對本發明加以限制。該等實例不欲表示下文實驗係所實施之所有實驗或唯一實驗。除非另有指示，否則份數係重量 份數，分子量係重量平均分子量，溫度以攝氏度表示，且壓力為大氣壓力或接近大氣壓力。
實例1 鼠類抗DLL3抗體之生成
抗DLL3鼠類抗體係如下產生。在第一次免疫活動中，利用經等體積之TiterMax®或明礬佐劑乳化之人類DLL3-fc蛋白質(hDLL3-Fc)接種三隻小鼠(以下品系中之每一者各有一隻：Balb/c、CD-1、FVB)。hDLL3-Fc融合構築體係購自Adipogen International(目錄號AG-40A-0113)。利用10μg hDLL3-Fc/小鼠於TiterMax中之乳液實施初始免疫。然後兩週一次用明礬佐劑中之5μg hDLL3-Fc/小鼠對小鼠實施加強免疫。用PBS中之5μg hDLL3-Fc/小鼠進行融合前之最終注射。
在第二次免疫活動中，用經等體積之TiterMax®或明礬佐劑乳化之人類DLL3-His蛋白質(hDLL3-His)接種六隻小鼠(以下品系中之每一者各兩隻：Balb/c、CD-1、FVB)。自經改造以過表現hDLL3-His之CHO-S細胞之上清液純化重組hDLL3-His蛋白質。利用10μg hDLL3-His/小鼠於TiterMax中之乳液實施初始免疫。然後兩週一次用明礬佐劑中之5μg hDLL3-His/小鼠對小鼠實施加強免疫。用經改造以過表現hDLL3之2×105個HEK-293T細胞進行最終注射。
使用固相ELISA分析來篩選小鼠血清之特異性針對人類DLL3之小鼠IgG抗體。大於背景之正信號指示特異性針對DLL3之抗體。簡言之，用ELISA塗佈緩衝液中之0.5μg/ml重組DLL3-His將96孔板(VWR International，目錄號610744)塗佈過夜。在用含有0.02%(v/v)Tween 20之PBS洗滌之後，在室溫(RT)下用PBS中之3%(w/v)BSA(200μL/孔)將 各孔封阻1小時。對小鼠血清進行滴定(1：100、1：200、1：400及1：800)且以50μL/孔添加至DLL3塗佈之板中並在RT下培育1小時。洗滌各板，且然後在RT下與50μL/孔在3% BSA-PBS或於PBS中之2% FCS中1：10,000稀釋之HRP標記之山羊抗小鼠IgG一起培育1小時。再次洗滌各板，且在RT下經15分鐘添加40μL/孔TMB受質溶液(Thermo Scientific 34028)。在顯影之後，添加等體積之2N H2SO4以終止受質顯影，且藉由分光光度計在OD 450下分析各板。
將血清陽性免疫之小鼠殺死，且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。藉由電細胞融合使用型號BTX Hybrimmune System(BTX Harvard Apparatus)，將B細胞之細胞懸浮液(來自hDLL3-Fc免疫之小鼠之約229×106個細胞，及來自hDLL3-His免疫之小鼠之510×106個細胞)與非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞以1：1之比率融合。將細胞再懸浮於由補充有偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清、10% BM Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM非必需胺基酸、1mM HEPES、100IU青黴素-鏈黴素(penicillin-streptomycin)及50μM 2-巰基乙醇之DMEM培養基組成之雜交瘤選擇培養基中，並在四個T225燒瓶中在100mL選擇培養基/燒瓶中培養。將燒瓶於含有5% CO2及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6至7天。
在融合後的第6天或第7天，自燒瓶收集雜交瘤文庫細胞並以於200μL經補充雜交瘤選擇培養基(如上文所闡述)中之1個細胞/孔(使用FACSAria I細胞分選儀)平鋪至64個Falcon 96孔板及48個96孔板中用於hDLL3-His免疫活動。將文庫之剩餘部分儲存於液氮中。
將雜交瘤培養10天且使用如下實施之流式細胞術針對特異性針對 hDLL3之抗體篩選上清液。將經改造以過表現人類DLL3、小鼠DLL3(利用染料預染色)或食蟹猴DLL3(利用Dylight800預染色)之1×105個HEK-293T細胞/孔與25μL雜交瘤上清液一起培育30分鐘。用PBS/2% FCS洗滌細胞，且然後與每試樣25μL以1：300於PBS/2% FCS中稀釋之DyeLight 649標記之山羊-抗小鼠IgG Fc片段特異性二級抗體一起培育。15分鐘之後，用PBS/2% FCS將細胞洗滌兩次且將其再懸浮於具有DAPI之PBS/2% FCS中，並藉由流式細胞術分析超過經同型對照抗體染色之細胞之螢光的螢光。將剩餘不用的雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中以供將來文庫測試及篩選。
hDLL3-His免疫活動產生約50種鼠類抗hDLL3抗體且hDLL3-Fc免疫活動產生約90種鼠類抗hDLL3抗體。
實例2 抗DLL3抗體之測序
基於上述內容，選擇以表觀高親和力結合經固定人類DLL3或h293-hDLL3細胞之多種實例性不同單株抗體用於測序及進一步分析。來自在實例1中生成之所選單株抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之序列分析證實許多抗體具有新穎互補決定區且通常展示新穎VDJ排列。
初始，將所選擇之表現期望抗體之雜交瘤細胞溶解於Trizol®試劑(Trizol® Plus RNA Purification System,Life Technologies)中以製備編碼該等抗體之RNA。將介於104個與105個之間之細胞再懸浮於1mL Trizol中並在添加200μL氯仿之後劇烈震盪。然後在4℃下將試樣離心10分鐘並將水相轉移至新微量離心管中並添加等體積之70%乙醇。將試樣加載於RNeasy Mini旋轉管柱上，將其置於2mL收集管中並根據製造商之說明書 進行處理。藉由用100μL不含RNase之水對旋轉管柱膜進行直接溶析來提取總RNA。藉由在1%瓊脂醣凝膠中分級分離3μL來測定RNA製備物之品質，之後將其儲存於-80℃直至使用。
使用包含32個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特異性前導序列引子之5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3’小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。類似地，使用含有32個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5’Vκ前導序列之引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一後置引子的組合來擴增κ輕鏈並測序。對於含有λ輕鏈之抗體，使用三個5’VL前導序列與一個特異性針對小鼠λ恆定區之反向引子之組合實施擴增。自100ng總RNA使用Qiagen一步RT-PCR套組如下擴增VH及VL轉錄本。對每一雜交瘤運行總共八次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行兩次，且對Vγ重鏈運行兩次。PCR反應混合物包括3μL RNA、0.5μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated Data Technologies定製合成)、5μL 5×RT-PCR緩衝劑、1μL dNTP、1μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物及0.4μL核糖核酸酶抑制劑RNasin(1個單位)。熱週期計程式為RT步驟50℃保持30分鐘、95℃保持15分鐘，隨後30個(95℃保持30秒、48℃保持30秒、72℃保持1分鐘)週期。然後在72℃下最終培育10分鐘。
使用與如上文針對可變區之擴增所闡述相同之特異性可變區引子對所提取PCR產物進行測序。為製備用於直接DNA測序之PCR產物，使用QIAquickTM PCR純化套組(Qiagen)根據製造商之方案對其進行純化。使用50μL無菌水自旋轉管柱溶析DNA且然後直接自兩個鏈測序(MCLAB)。
使用IMGT序列分析工具(http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)分析所選核苷酸序列來鑑別具有最高序列同源性 之種系V、D及J基因成員。藉由使用專有抗體序列數據庫將VH及VL基因與小鼠種系數據庫比對來比較該等衍生序列與Ig V區及J區之已知種系DNA序列。
圖1A繪示來自抗DLL3抗體之多個新穎鼠類輕鏈可變區及衍生自代表性鼠類抗DLL3抗體之可變輕鏈之實例性人類化輕鏈可變區的鄰接胺基酸序列(根據下文實例3)。圖1B繪示來自相同抗DLL3抗體之新穎鼠類重鏈可變區及衍生自提供人類化輕鏈之相同鼠類抗體之人類化重鏈可變區的鄰接胺基酸序列(根據下文實例3)。鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：21-387奇數中，而人類化輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：389-407奇數中。
因此，圖1A及圖1B一起提供以下各項之注釋序列：多種鼠類抗DLL3結合或靶向結構域，稱為SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、 SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150；及人類化抗體，稱為hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56。
在本發明之特定態樣中，ADC結合結構域特異性結合至hDLL3且包括包含以下各項之抗體或與該抗體競爭結合：SEQ ID NO：21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：23之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；或SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；或SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；或SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；或SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；或SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；或SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；或SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；或SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；或SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；或SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；或SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；或SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；或SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH；或SEQ ID NO：81之VL及SEQ ID NO：83之VH；或SEQ ID NO：85之VL及SEQ ID NO：87之VH；或SEQ ID NO：89之VL及SEQ ID NO：91之VH；或SEQ ID NO：93之VL及SEQ ID NO：95之VH；或SEQ ID NO：97之VL及SEQ ID NO：99之VH；或SEQ ID NO：101之VL及SEQ ID NO：103之VH；或SEQ ID NO：105之VL及SEQ ID NO：107之VH；或SEQ ID NO：109之VL及SEQ ID NO：111之VH；或SEQ ID NO： 113之VL及SEQ ID NO：115之VH；或SEQ ID NO：117之VL及SEQ ID NO：119之VH；或SEQ ID NO：121之VL及SEQ ID NO：123之VH；或SEQ ID NO：125之VL及SEQ ID NO：127之VH；或SEQ ID NO：129之VL及SEQ ID NO：131之VH；或SEQ ID NO：133之VL及SEQ ID NO：135之VH；或SEQ ID NO：137之VL及SEQ ID NO：139之VH；或SEQ ID NO：141之VL及SEQ ID NO：143之VH；或SEQ ID NO：145之VL及SEQ ID NO：147之VH；或SEQ ID NO：149之VL及SEQ ID NO：151之VH；或SEQ ID NO：153之VL及SEQ ID NO：155之VH；或SEQ ID NO：157之VL及SEQ ID NO：159之VH；或SEQ ID NO：161之VL及SEQ ID NO：163之VH；或SEQ ID NO：165之VL及SEQ ID NO：167之VH；或SEQ ID NO：169之VL及SEQ ID NO：171之VH；或SEQ ID NO：173之VL及SEQ ID NO：175之VH；或SEQ ID NO：177之VL及SEQ ID NO：179之VH；或SEQ ID NO：181之VL及SEQ ID NO：183之VH；或SEQ ID NO：185之VL及SEQ ID NO：187之VH；或SEQ ID NO：189之VL及SEQ ID NO：191之VH；或SEQ ID NO：193之VL及SEQ ID NO：195之VH；或SEQ ID NO：197之VL及SEQ ID NO：199之VH；或SEQ ID NO：201之VL及SEQ ID NO：203之VH；或SEQ ID NO：205之VL及SEQ ID NO：207之VH；或SEQ ID NO：209之VL及SEQ ID NO：211之VH；或SEQ ID NO：213之VL及SEQ ID NO：215之VH；或SEQ ID NO：217之VL及SEQ ID NO：219之VH；或SEQ ID NO：221之VL及SEQ ID NO：223之VH；或SEQ ID NO：225之VL及SEQ ID NO：227之VH；或SEQ ID NO：229之VL及SEQ ID NO：231之VH；或SEQ ID NO：233之VL及SEQ ID NO：235之VH；或SEQ ID NO：237之VL及SEQ ID NO：239之VH；或SEQ ID NO：241之 VL及SEQ ID NO：243之VH；或SEQ ID NO：245之VL及SEQ ID NO：247之VH；或SEQ ID NO：249之VL及SEQ ID NO：251之VH；或SEQ ID NO：253之VL及SEQ ID NO：255之VH；或SEQ ID NO：257之VL及SEQ ID NO：259之VH；或SEQ ID NO：261之VL及SEQ ID NO：263之VH；或SEQ ID NO：265之VL及SEQ ID NO：267之VH；或SEQ ID NO：269之VL及SEQ ID NO：271之VH；或SEQ ID NO：273之VL及SEQ ID NO：275之VH；或SEQ ID NO：277之VL及SEQ ID NO：279之VH；或SEQ ID NO：281之VL及SEQ ID NO：283之VH；或SEQ ID NO：285之VL及SEQ ID NO：287之VH；或SEQ ID NO：289之VL及SEQ ID NO：291之VH；或SEQ ID NO：293之VL及SEQ ID NO：295之VH；或SEQ ID NO：297之VL及SEQ ID NO：299之VH；或SEQ ID NO：301之VL及SEQ ID NO：303之VH；或SEQ ID NO：305之VL及SEQ ID NO：307之VH；或SEQ ID NO：309之VL及SEQ ID NO：311之VH；或SEQ ID NO：313之VL及SEQ ID NO：315之VH；或SEQ ID NO：317之VL及SEQ ID NO：319之VH；或SEQ ID NO：321之VL及SEQ ID NO：323之VH；或SEQ ID NO：325之VL及SEQ ID NO：327之VH；或SEQ ID NO：329之VL及SEQ ID NO：331之VH；或SEQ ID NO：333之VL及SEQ ID NO：335之VH；或SEQ ID NO：337之VL及SEQ ID NO：339之VH；或SEQ ID NO：341之VL及SEQ ID NO：343之VH；或SEQ ID NO：345之VL及SEQ ID NO：347之VH；或SEQ ID NO：349之VL及SEQ ID NO：351之VH；或SEQ ID NO：353之VL及SEQ ID NO：355之VH；或SEQ ID NO：357之VL及SEQ ID NO：359之VH；或SEQ ID NO：361之VL及SEQ ID NO：363之VH；或SEQ ID NO：365之VL及SEQ ID NO：367之VH；或SEQ ID NO：369之VL及SEQ ID NO：371之VH；或SEQ ID NO：373之VL及SEQ ID NO：375之VH；或SEQ ID NO：377之VL及SEQ ID NO：379之VH；或SEQ ID NO：381之VL及SEQ ID NO：383之VH；或SEQ ID NO：385之VL及SEQ ID NO：387之VH；或SEQ ID NO：389之VL及SEQ ID NO：391之VH；或SEQ ID NO：393之VL及SEQ ID NO：395之VH；或SEQ ID NO：397之VL及SEQ ID NO：399之VH；或SEQ ID NO：401之VL及SEQ ID NO：403之VH；或SEQ ID NO：405之VL及SEQ ID NO：407之VH。
出於本申請案之目的，每一特定抗體之SEQ ID NO為連續奇數。因此，單株抗DLL3抗體SC16.3包含分別針對輕鏈及重鏈可變區胺基酸之SEQ ID NO：21及23；SC16.4包含SEQ ID NO：25及27；SC16.5包含SEQ ID NO：29及31等等。每一抗體胺基酸序列之相應核酸序列包括在隨附序列表中且其SEQ ID NO緊接在相應胺基酸SEQ ID NO之前。因此，例如，SC16.3抗體之VL及VH之SEQ ID NO分別為21及23，且編碼SC16.3抗體之VL及VH之核酸序列之SEQ ID NO分別為SEQ ID NO：20及22。CDR係根據Kabat等人(上文文獻)使用Abysis數據庫之專有版本來定義。
實例3 嵌合及人類化抗DLL3抗體之生成
為提供與本發明相容之人類化結合結構域之基準，使用業內公認之技術如下生成嵌合抗DLL3抗體。自雜交瘤提取總RNA並如實例1中所闡述進行擴增。自衍生之核酸序列獲得關於鼠類抗體之VH及VL鏈之V、D及J基因區段之數據。使用以下限制性位點設計特異性針對抗體VH及VL鏈之前導序列之引子集合：AgeI及XhoI用於VH片段，且XmaI及DraIII用 於VL片段。使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物，然後用針對VH片段之限制酶AgeI及XhoI及針對VL片段之XmaI及DraIII消化。純化VL及VH消化之PCR產物並將其分別連接至κ CL(SEQ ID NO：5)人類輕鏈恆定區表現載體或IgG1(SEQ ID NO：6)人類重鏈恆定區表現載體。
在具有200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL經消化且經純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA之10μL總體積中實施連接反應。經由在42℃下用3μL連接產物熱震來轉變勝任大腸桿菌(E.coli)DH10B細菌(Life Technologies)，且以100μg/mL之濃度平鋪至具有胺苄青黴素(ampicillin)之板上。在純化並消化所擴增連接產物後，將VH片段選殖至pEE6.4HuIgG1表現載體(Lonza)之AgeI-XhoI限制性位點中，且將VL片段選殖至pEE12.4Hu-κ表現載體(Lonza)之XmaI-DraIII限制性位點中。
藉由用pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染HEK-293T細胞來表現嵌合抗體。在轉染之前，在標準條件下在150mm板中在補充有10%熱失活FCS、100μg/mL鏈黴素及100U/mL青黴素G之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中培養HEK-293T細胞。為進行瞬時轉染，使細胞生長至80%鋪滿。將各12.5μg之pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA添加至1.5mL Opti-MEM中之50μL HEK-293T轉染試劑中。在室溫下將混合物培育30分鐘並進行平鋪。在轉染後3至6天收穫上清液。藉由以800×g離心10分鐘自細胞碎片澄清含有重組嵌合抗體之培養物上清液且儲存在4℃下。使用蛋白質A親和層析純化重組嵌合抗體。
亦使用相同鼠類抗DLL3抗體(例如SC16.13、SC16.15、SC16.25、 SC16.34及SC16.56)來衍生CDR移植或人類化之結合結構域。使用專有電腦輔助CDR移植方法(Abysis Database，UCL Business)及標準分子改造技術如下人類化鼠類抗體。基於框架序列與人類種系抗體序列之CDR經典結構之間以及框架序列與相關小鼠抗體之CDR之間的最高同源性設計可變區之人類框架區。出於分析之目的，根據Kabat等人將胺基酸指配至每一CDR結構域。在選擇可變區後，其立即自合成基因區段生成(Integrated DNA Technologies)。使用上文針對嵌合抗體闡述之分子方法選殖及表現人類化抗體。
對於每一人類化抗體，所選人類受體可變區之遺傳組成緊接顯示於下表5中。繪示於表5中之序列對應於闡述於以下各項中之鄰接可變區序列：SEQ ID NO：389及391(hSC16.13)、SEQ ID NO：393及395(hSC16.15)、SEQ ID NO：397及399(hSC16.25)、SEQ ID NO：401及403(hSC16.34)及SEQ ID NO：405及407(hSC16.56)。表5顯示框架變化或回復突變皆非維持所選抗體之有利結合性質所必需。
儘管框架區中之殘基未發生變化，但將一個人類化純系(hSC16.13)突變引入重鏈CDR2中以解決穩定性問題。檢查具有經修飾CDR之抗體之結合親和力以確保其等效於相應嵌合或鼠類抗體。
在人類化之後，分析所得VL及VH鏈胺基酸序列以確定其與鼠類供體 及人類受體輕鏈及重鏈可變區之同源性。緊接顯示於下表6中之結果揭露人類化構築體一致地展現與人類受體序列之同源性高於與鼠類供體序列之同源性。與人類化抗體及供體雜交瘤蛋白序列之同源性(74%-83%)相比，鼠類重鏈及輕鏈可變區顯示類似的與人類種系基因之最接近匹配之總體同源性百分比(85%-93%)。
對於嵌合抗體，將人類化VL及VH經消化之PCR產物純化且分別連接至κ CL(SEQ ID NO：5)人類輕鏈恆定區表現載體或IgG1(SEQ ID NO：6)人類重鏈恆定區表現載體中。在表現後，使用表面電漿共振分析每一所衍生人類化構築體，以確定CDR移植過程是否已顯著改變其對DLL3蛋白之表觀親和力。將人類化構築體與包含鼠類親代(或供體)重鏈及輕鏈可變結構域及實質上等效於人類化構築體中所用之人類恆定區的嵌合抗體相比較。人類化抗DLL3抗體展現與嵌合親代抗體所顯示之結合特徵大致相當之結合特徵(數據未顯示)。
實例4 位點特異性抗體之生成
構築包含天然輕鏈(LC)恆定區及重鏈(HC)恆定區之經改造人類IgG1/κ抗DLL3位點特異性抗體，其中HC之上游鉸鏈區中與LC中之半胱胺酸214(C214)形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸220(C220)經絲胺酸取代(C220S)。在組裝時，HC及LC形成包含適於結合至治療劑之兩個游離半胱胺酸之抗體。除非另有說明，否則恆定區殘基之所有編號皆係根據如Kabat等人中所述之EU編號方案來進行。
如下生成經改造抗體。使用編碼全長人類化抗DLL3抗體hSC16.56之表現載體作為模板用於PCR擴增及定點誘變。定點誘變係使用Quick-change®系統(Agilent Technologies)根據製造商之說明書來實施。
在CHO-S細胞中使用天然全長κ輕鏈共轉染編碼hSC16.56之突變體C220S重鏈之載體且使用哺乳動物瞬時表現系統來表現。含有C220S突變體之經改造抗DLL3位點特異性抗體稱為hSC16.56ss1。在表現後，藉由SDS-PAGE來表徵經改造抗DLL3抗體以證實已生成正確的突變體。SDS-PAGE係在諸如DTT(二硫蘇糖醇)等還原劑存在及不存在下在來自life technologies之預澆注10% Tris-甘胺酸微型凝膠上實施。在電泳後，使用膠質考馬斯(Coomassie)溶液對凝膠進行染色。在還原條件下，觀察到對應於游離LC及游離HC之兩個條帶(數據未顯示)。此圖案係還原條件下IgG分子所特有的。在非還原條件下，條帶圖案不同於天然IgG分子，此指示在HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚體之約98kD之條帶。另外，觀察到對應於游離LC之模糊條帶及對應於LC-LC二聚體之約48kD之主要條帶。預期一定量之LC-LC種類之形成歸因於每一LC 之C末端上之游離半胱胺酸。
實例5 抗DLL3抗體之結構域及表位映射
為表徵及定位所揭示抗DLL3抗體所結合之表位，使用Cochran等人，2004(上文文獻)所述方案之修改來實施結構域層級表位映射。在酵母之表面上表現DLL3之包含特定胺基酸序列之個別結構域，且藉助流式細胞術測定每一抗DLL3抗體之結合。
產生酵母展示質體構築體用於表現以下構築體：DLL3細胞外結構域(胺基酸27-466)；DLL1-DLL3嵌合體，其係由融合至DLL3之EGF樣結構域1至6(胺基酸220-466)之DLL1之N末端區域及DSL結構域(胺基酸22-225)組成；DLL3-DLL1嵌合體，其係由融合至DLL1之EGF樣結構域1至8(胺基酸222-518)之DLL3之N末端區域及DSL結構域(胺基酸27-214)組成；EGF1(胺基酸215-249)；EGF2(胺基酸274-310)；EGF1及EGF2(胺基酸215-310)；EGF3(胺基酸312-351)；EGF4(胺基酸353-389)；EGF5(胺基酸391-427)；及EGF6(胺基酸429-465)。關於結構域資訊通常參見UniProtKB/Swiss-Prot數據庫條目Q9NYJ7。應注意，胺基酸編號參照具有納入SEQ ID NO.1中所述之序列中之前導序列的未經處理之DLL3蛋白。為分析N末端區或EGF結構域整體，使用具有家族成員DLL1之嵌合體(DLL1-DLL3及DLL3-DLL1)而非片段以最小化蛋白質摺疊之潛在問題。先前已顯示，結構域映射之抗體不與DLL1交叉反應，此指示與該等構築體之任何結合係經由與構築體之DLL3部分締合來進行。將該等質體轉變至酵母中，然後該等質體如Cochran等人中所述生長及誘導。
為測試與特定構築體之結合，於PBS+1mg/mL BSA(PBSA)中將 200,000個經誘導表現期望構築體之酵母細胞洗滌兩次，且在50μL PBSA中與0.1μg/mL生物素化抗HA純系3F10(Roche Diagnostics)及50nM經純化抗體或所培養雜交瘤之未經純化上清液之1：2稀釋物一起培育7天。將細胞在冰上培育90分鐘，隨後在PBSA中洗滌兩次。然後將細胞在50μL PBSA中與適當二級抗體一起培育：對於鼠類抗體，各自以1μg/mL添加Alexa 488結合鏈黴抗生物素蛋白及Alexa 647結合山羊抗小鼠(Life Technologies)；且對於人類化或嵌合抗體，各自以1μg/mL添加Alexa 647結合鏈黴抗生物素蛋白(Life Technologies)及R-藻紅素結合山羊抗人類(Jackson Immunoresearch)。在冰上培育20分鐘之後，用PBSA將細胞洗滌兩次並在FACS Canto II上分析。結合至DLL3-DLL1嵌合體之抗體指示為與N末端區域+ DSL結合。特異性結合至存在於特定EGF樣結構域上之表位之抗體指示為與其各別結構域結合(圖2)。
為將表位分類為構象表位(例如，不連續)或線性表位，在80℃下將展示DLL3 ECD之酵母熱處理30分鐘以使DLL3 ECD變性，且然後在冰冷PBSA中洗滌兩次。藉由FACS使用與上文所述相同之染色方案來測試抗DLL3抗體結合變性酵母之能力。結合至變性及天然酵母二者之抗體分類為與線性表位結合，而結合天然酵母但不結合變性酵母之抗體分類為構象特異性表位。
所測試抗體之結構域層級表位映射數據之示意性概述呈現於圖2中，其中結合線性表位之抗體加下劃線，倘若確定則相應倉以括號註明。圖2之綜述顯示大部分抗DLL3抗體往往映射至在DLL3或EGF2之N末端/DSL區中發現之表位。圖2以表格形式呈現關於各種抗DLL3抗體之倉確定及結構域映射之類似數據。
使用兩種方法中之一者對所選抗體進一步實施精細表位映射。第一種方法採用Ph.D.-12噬菌體展示肽文庫套組(New England Biolabs)，其係根據製造商之說明書來使用。將用於表位映射之抗體以3mL 0.1M碳酸氫鈉溶液(pH 8)中之50μg/mL塗佈至Nunc MaxiSorp管中(Nunc)過夜。用於碳酸氫鹽溶液中之3% BSA溶液封阻管。然後，容許PBS+0.1% Tween-20中之1011個輸入噬菌體結合，隨後用0.1% Tween-20連續洗滌10次以洗掉非結合噬菌體。在室溫下在輕輕攪動下用1mL 0.2M甘胺酸將剩餘噬菌體溶析10分鐘，隨後用150μL 1M Tris-HCl(pH 9)中和。將所溶析噬菌體擴增且在洗滌步驟期間再用1011個輸入噬菌體使用0.5% Tween-20淘選以增加選擇嚴格性。使用Qiaprep M13 Spin套組(Qiagen)分離第二輪所溶析噬菌體之24個噬菌斑之DNA並測序。使用ELISA分析證實純系噬菌體之結合，其中將所映射抗體或對照抗體塗佈至ELISA板上、封阻且暴露於每一噬菌體純系。使用辣根過氧化物酶結合之抗M13抗體(GE Healthcare)及1步Turbo TMB ELISA溶液(Pierce)來檢測噬菌體結合。使用載體NTI(Life Technologies)針對抗原ECD肽序列比對特異性結合噬菌體之噬菌體肽序列以確定結合表位。
或者，使用酵母展示方法(Chao等人，2007,PMID：17406305)來映射所選抗體之表位。利用易錯PCR使用核苷酸類似物8-側氧基-2’去氧鳥苷-5’-三磷酸及2’-去氧-對-核苷-5’三磷酸(TriLink Bio)針對一個胺基酸突變/純系之靶誘變速率來生成DLL3 ECD突變體文庫。將該等文庫轉變至酵母展示格式中。使用上文針對結構域層級映射所闡述之技術，針對HA及抗體結合以50nM對文庫進行染色。使用FACS Aria(BD)，對與野生型DLL3 ECD相比展現結合損失之純系進行分選。使該等純系再生長並經受 另一輪針對與靶抗體之結合損失之FACS分選。使用Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep套組(Zymo Research)，分離個別ECD純系並測序。倘若需要，則使用Quikchange定點誘變套組(Agilent)將突變重新格式化為單一突變體ECD純系。
接下來篩選個別ECD純系以確定結合損失是否歸因於表位突變或引起錯誤摺疊之突變。涉及半胱胺酸、脯胺酸及終止密碼子之突變因錯誤摺疊突變之可能性較大而自動丟棄。然後針對與非競爭性構象特異性抗體之結合篩選剩餘ECD純系。推斷出與非競爭性構象特異性抗體之結合損失之ECD純系含有錯誤摺疊突變，而推斷出保留與野生型DLL3 ECD之等效結合之ECD純系正確摺疊。推斷出後一組ECD純系中之突變處於表位中。
其衍生表位包含參與抗體結合之胺基酸殘基之所選抗體的概述列示於下表7中。抗體SC16.34及SC16.56與常見胺基酸殘基相互作用，此與圖2中所顯示之分倉資訊及結構域映射結果一致。此外，發現SC16.23與不同的鄰接表位相互作用且發現不與SC16.34或SC16.56分倉。應注意，出於隨附序列表之目的，SEQ ID NO：4包含位置204處之佔位胺基酸。
實例6 抗DLL3抗體至吡咯并苯并二氮呯(PBD)之結合
經由具有游離硫氫基之末端馬來醯亞胺基部分將人類化抗DLL3抗體(hSC16.56)及人類化位點特異性抗DLL3抗體(hSC16.56ss1)結合至吡咯并 苯并二氮呯(DL1、PBD1)，以產生稱為hSC16.56PBD1及hSC16.56ss1PBD1之ADC。在如其欲用於臨床試驗中之GMP條件下製備hSC16.56PBD1(即，SC16LD6.5)及hSC16.56ss1PBD1。以兩個不同階段(還原步驟及結合步驟)製備人類化DLL3(hSC16.56)抗體藥物結合物(ADC)，以使PBD1(DL1)結合至hSC16.56。然後藉助陽離子交換(CEX)層析、隨後藉由滲濾及調配步驟來處理ADC以產生原料藥。該製程詳細闡述於下文中。
藉由添加200mM Tris Base、32mM EDTA(pH 8.5)將抗體調節至pH 7.5。然後在20℃下，藉由預定莫耳添加mol參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)/mol抗體將pH經調節之DLL3抗體之半胱胺酸鍵部分還原90min。然後在20℃下經最短30分鐘，經由馬來醯亞胺連接體將所得部分還原之製劑結合至PBD1(如上文所述)。然後藉由添加與使用於水中製備之10mM原液之連接體-藥物相比過量之N-乙醯基半胱胺酸(NAC)來驟冷反應物。在最短20分鐘之驟冷時間後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至5.5。然後藉助陽離子交換(CEX)層析以結合及溶析模式利用階段溶析來處理ADC製劑，以去除在結合步驟期間形成之聚集物。然後藉由滲濾使用30kDa膜將CEX純化之ADC緩衝液交換至滲濾緩衝液中。然後用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾之抗DLL3 ADC調配至靶標最終濃度以產生原料藥。
使用經修改之部分還原製程結合位點特異性人類化抗DLL3(hSC16.56ss1)ADC。就此而言，期望產物係在每一LC恆定區上之未配對半胱胺酸(C214)上最大結合且最小化藥物對抗體比率(DAR)大於2(DAR>2)之ADC、同時最大化DAR為2(DAR=2)之ADC的ADC。為進一步改良結合之特異性，在與連接體-藥物結合之前使用包含穩定劑(例如L- 精胺酸)及溫和還原劑(例如麩胱甘肽)之製程選擇性還原抗體。然後經由製備型疏水相互作用層析(HIC)、隨後藉由滲濾及調配來處理步驟ADC以產生原料藥。該製程詳細闡述於下文中。
在室溫下，在含有1M L-精胺酸/5mM EDTA及預定濃度之還原麩胱甘肽(GSH)之緩衝液(pH 8.0)中，將位點特異性抗體構築體部分還原最短2小時。然後使用30kDa膜將所有製劑緩衝液交換至20mM Tris/3.2mM EDTApH 7.0緩衝液中以去除還原緩衝液。然後在20℃下經最短30min，經由馬來醯亞胺連接體將所得部分還原之製劑結合至PBD1(如上文所述)。然後藉由添加與使用於水中製備之10mM原液之連接體-藥物相比過量之NAC來驟冷反應物。在最短20分鐘之驟冷時間後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至6.0。然後經由製備型疏水相互作用層析(HIC)(Butyl Sepharose FF)以結合及溶析模式利用階段溶析來處理pH經調節之ADC以進一步純化DAR2種類。然後藉由滲濾使用30kDa膜將經純化ADC緩衝液交換至滲濾緩衝液中。然後用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾之抗DLL3 ADC調配至靶標最終濃度以產生位點特異性原料藥。
實例7 重組ASCL1融合蛋白之選殖及表現及過表現ASCL1蛋白之細胞系之改造編碼人類ASCL1及ASCL2蛋白質之DNA片段.
為生成本發明所需要的涉及人類ASCL1(hASCL1)蛋白質(基因庫登錄號NP_004307)之所有細胞材料，使用標準分子技術，在框內及IgK信號肽序列之下游及9-組胺酸標籤或人類IgG2 Fc cDNA之上游將編碼ASCL1 mRNA(基因庫登錄號NM_004316,nts 572-1282)之開放閱讀框之合成DNA片段亞選殖至CMV驅動型表現載體中。該等CMV驅動型表現載體允 許在HEK-293T及/或CHO-S細胞中高程度的瞬時表現。利用該等表現構築體使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑轉染HEK-293T細胞之懸浮液或貼壁培養物或CHO-S細胞之懸浮液。轉染後三天至五天，分別使用AKTA explorer及Nickel-EDTA(Qiagen)或MabSelect SuReTM Protein A(GE Healthcare Life Sciences)管柱自澄清之細胞上清液純化重組His標記或Fc標記之蛋白質。使用編碼ASCL2 mRNA(基因庫登錄號NM_005170，nts 621-1202)之開放閱讀框之合成DNA片段類似地產生重組ASCL2蛋白質。
為產生編碼hASCL1蛋白之慢病毒載體質體，將編碼hASCL1開放閱讀框之合成DNA在框內亞選殖至慢病毒表現載體pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP(System Biosciences,Mountain View CA)之多個選殖位點(MCS)中，該慢病毒表現載體先前已經修飾而在多個選殖位點(MCS)之上游引入了編碼DDDK表位標籤之核苷酸序列。MCS下游之T2A序列促進肽鍵縮合之核糖體跳躍，引起兩種獨立蛋白質之表現：在T2A肽上游編碼之DDDK標記之蛋白質之高程度表現，以及在T2A肽之下游編碼之GFP標記物蛋白之共表現。此選殖步驟得到慢病毒載體質體pLMEGPA-hASCL1-NFlag。
細胞系改造
使用上述pLMEGPA-hASCL1-NFlag慢病毒載體構築過表現hASCL1蛋白之經改造細胞系，以使用熟習此項技術者熟知之標準慢病毒轉導技術來轉導HEK-293T細胞系。使用高表現性HEK-293T亞純系(例如，針對GFP呈強陽性之細胞，其用作在細胞中高細胞內ASCL1表現之替代)之螢光活化式細胞分選(FACS)來選擇hASCL1陽性細胞。
實例8 鼠類抗ASCL1抗體之生成
在兩次免疫活動中如下產生抗ASCL1鼠類抗體。利用10μg經等體積之TiterMax®佐劑乳化之hASCL1-Fc接種品系Balb/c、CD-1及FVB之小鼠。在初始接種後，每週兩次持續4週用經等體積之明礬佐劑加CpG乳化之10μg hASCL1蛋白注射小鼠。
將小鼠殺死，且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。產生B細胞之單細胞懸浮液，並藉由電細胞融合使用型號BTX Hybrimmune System(BTX Harvard Apparatus)將(122.5×106個細胞)與非分泌性SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1：1之比率融合。將細胞再懸浮於由補充有偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清(Thermo編號SH30080-03)、10% BM condimed(Roche編號10663573001)、1mM非必需胺基酸(Corning編號25-025-CI)、1mM HEPES(Corning編號25-060-CI)、100IU青黴素-鏈黴素(Corning編號30-002-CI)、100IU L-麩醯胺酸(Corning編號25-005-CI)之DMEM培養基組成之雜交瘤選擇培養基中，並在含有100mL選擇培養基之三個T225燒瓶中培養。將燒瓶於含有7% CO2及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6天。
在融合後的第6天，將雜交瘤文庫細胞暫時冷凍。將細胞在雜交瘤選擇培養基中解凍並容許在37℃加濕培育器中擱置1天。對燒瓶之細胞進行分選並以於90μL經補充雜交瘤選擇培養基(如上文所闡述)中之1個細胞/孔(使用BD FACSAria I細胞分選儀)平鋪至12個Falcon 384孔板中。將剩餘不用的雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中以供將來文庫測試及篩選。
將雜交瘤培養10天並使用以下方法藉由ELISA針對特異性針對hASCL1尚未與家族成員hASCL2交叉反應之抗體篩選12×384種純系之上清液。用0.5μg/mL於PBS緩衝液中之經純化hASCL1-Fc或hASCL2-Fc 塗佈各板並在4℃下培育過夜。然後用PBST洗滌各板並在37℃下用具有5% FBS之PBS封阻30min。去除封阻溶液並將15μl PBST添加至各孔中。添加25μl雜交瘤上清液並在4℃下培育過夜。在用PBST洗滌之後，在室溫下經30min添加30μL/孔在PBSA中以1：10,000稀釋之HRP標記之山羊抗小鼠IgG。洗滌各板並在室溫下藉由添加25μL/孔TMB受質溶液(Thermo Scientific)顯影約5min。添加等體積之0.2M H2SO4以終止受質顯影。然後藉由分光光度計在OD 450下分析試樣。ASCL1板上具有大於背景3倍之OD 450之上清液視為具有陽性反應性，而ASCL2板上亦具有大於背景3倍之OD 450之任何純系拒絕視為具有交叉反應性。篩選來自hASCL1-Fc免疫活動之該等12×384種純系，產生特異性結合至hASCL1但不結合至相關家族成員ASCL2之多種抗體，繼續處理其中的八十種用於進一步表徵。
類似於第一次實施第二次免疫活動，但具有以下修改：1)藉由電細胞融合使用型號BTX Hybrimmune System(BTX Harvard Apparatus)，將299×106個細胞與非分泌性SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1：1之比率融合。在融合後的第6天，雜交瘤細胞未冷凍且在當天進行分選。在培養10天後，藉由ELISA選擇對於hASCL1-GST(麩胱甘肽S-轉移酶)陽性之抗體來篩選6×384種純系，並針對經GST標記之不相關蛋白質進行複篩。作為此之一部分，代替以1：10：000稀釋之HRP標記之山羊抗小鼠IgG而使用在PBSA中以1：5000稀釋之ALK磷酸酶標記之山羊抗小鼠IgG。在OD405下而非OD450下分析ELISA試樣。
實例9 抗ASCL1抗體之測序
基於上述內容，選擇以表觀高親和力結合經固定人類ASCL1或h293-hASCL1細胞之多種實例性不同單株抗體用於測序及進一步分析。在實例8中生成之所選單株抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之序列分析證實，許多抗體具有新穎互補決定區且通常展示新穎VDJ排列。
如下文所闡述對在實例2中生成之抗ASCL1小鼠抗體進行測序。根據製造商之說明書使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)自所選雜交瘤細胞純化總RNA。每個試樣使用介於104個與105個之間之細胞。將經分離RNA試樣儲存在-80℃下直至使用。
使用包含86個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特異性前導序列引子之兩種5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3’小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。類似地，使用含有64個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5’Vκ前導序列之兩種引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一反向引子的組合來擴增κ輕鏈並測序。自100ng總RNA使用Qiagen一步RT-PCR套組如下擴增VH及VL轉錄本。對每一雜交瘤運行總共四次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行兩次，且對VH重鏈運行兩次。PCR反應混合物包括1.5μL RNA、0.4μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated DNA Technologies定製合成)、5μL 5×RT-PCR緩衝劑、1μL dNTP及0.6μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物。熱週期計程式為RT步驟50℃保持60min、95℃保持15min，隨後35個(94.5℃保持30秒、57℃保持30秒、72℃保持1min)週期。然後在72℃下最終培育10min。
使用與如上文針對可變區之擴增所闡述相同之特異性可變區引子對所提取PCR產物進行測序。將PCR產物發送至進行PCR純化及測序服務之 外部測序供應商(MCLAB)。使用在鑑別為http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html之網站上在線獲得IMGT序列分析工具分析核苷酸序列來鑑別具有最高序列同源性之種系V、D及J基因成員。藉由使用專有抗體序列數據庫將VH及VL基因與小鼠種系數據庫比對來比較該等衍生序列與Ig V區及J區之已知種系DNA序列。
圖3A繪示來自抗ASCL1抗體之新穎鼠類輕鏈可變區之鄰接胺基酸序列，而圖3B繪示來自相同抗ASCL1抗體之新穎鼠類重鏈可變區之鄰接胺基酸序列。鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列一起提供於SEQ ID NO：521-573奇數中。
更具體而言，圖3A及圖3B提供包含以下各項之鼠類抗ASCL1抗體之注釋序列：(1)SEQ ID NO：521之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：523之重鏈可變區(VH)；或(2)SEQ ID NO：525之VL及SEQ ID NO：527之VH；或(3)SEQ ID NO：529之VL及SEQ ID NO：531之VH；或(4)SEQ ID NO：533之VL及SEQ ID NO：535之VH；或(5)SEQ ID NO：537之VL及SEQ ID NO：539之VH；或(6)SEQ ID NO：541之VL及SEQ ID NO：543之VH；或(7)SEQ ID NO：545之VL及SEQ ID NO：547之VH；或(8)SEQ ID NO：549之VL及SEQ ID NO：551之VH；或(9)SEQ ID NO：553之VL及SEQ ID NO：555之VH；或(10)SEQ ID NO：557之VL及SEQ ID NO：559之VH；或(11)SEQ ID NO：561之VL及SEQ ID NO：563之VH；或(12)SEQ ID NO：565之VL及SEQ ID NO：567之VH；或(13)SEQ ID NO：569之VL及SEQ ID NO：571之VH；或(14)SEQ ID NO：521之VL及SEQ ID NO：573之VH。
所揭示抗體(或產生其之純系)以及其各別名稱(例如，SC72.2、SC72.28等)及可變區核酸或胺基酸SEQ ID NO(參見圖3A至圖3C)之概述緊接顯示於下表8中。
圖3A及圖3B中之VL及VH胺基酸序列經注釋以鑑別框架區(即FR1-FR4)及互補決定區(即，圖3A中之CDR-L1-CDR-L3或圖3B中之CDR-H1-CDR-H3)，如根據Kabat等人所定義。使用Abysis數據庫之專有版本分析可變區序列以提供CDR及FR名稱。儘管CDR係根據Kabat等人來定義，但熟習此項技術者應瞭解，CDR及FR名稱亦可根據Chothia、McCallum或任何其他公認命名系統來定義。另外，圖3C提供編碼闡述於 圖3A及圖3B中之胺基酸序列之核酸序列(SEQ ID NO：520-572，奇數)。
如在圖3A及圖3B及表8中看出，每一特定鼠類抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之SEQ ID NO通常係連續奇數。因此，單株抗ASCL1抗體SC72.2包含分別針對輕鏈及重鏈可變區之胺基酸SEQ ID NO：521及523；SC72.28包含SEQ ID NO：525及527；SC72.52包含SEQ ID NO：529及531等等。依序編號方案之唯一例外係SC72.93，其包含與純系SC72.2相同之輕鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：521)以及獨特重鏈可變區胺基酸序列(SEQ ID NO：573)。在任一情形下，編碼鼠類抗體胺基酸序列之相應核酸序列(闡述於圖3C中)之SEQ ID NO緊接在相應胺基酸SEQ ID NO之前。因此，例如，SC72.2抗體之VL及VH之核酸序列之SEQ ID NO分別為SEQ ID NO：520及522。
實例10 已經歷靶向療法之腫瘤中之DLL3表現
DLL3係轉錄因子ASCL1之靶標，且在SCLC及其他神經內分泌腫瘤中表現。針對DLL3表現分析可公開獲得之數據集且所得數據繪示於圖4至圖10中。此分析之結果表明在各種腺癌、具體而言先前已經歷靶向療法之彼等腫瘤轉變為神經內分泌表型後，DLL3表現上調。
圖4顯示闡述於Tzelepi,2012(PMID：22156612)中之數據之分析。此分析揭露，DLL3表現限於與正常前列腺試樣或維持AR表現(CR/AR+)之CRPC相反、損失AR表現(CR/AR-)且表現神經內分泌標記物(如CHGA及SYP)之CRPC之患者源性異種移植物(PDX)試樣。
圖5顯示闡述於Varambally,2005(數據庫GSE3325；PMID：16286247)中之數據之分析，其中該分析揭露在4個轉移性前列腺癌試樣 中之2個中具有DLL3表現，且在良性前列腺試樣或臨床侷限性前列腺腺癌中沒有DLL3表現。
圖6顯示闡述於Lin,2013(PMID：24356420中之數據之分析)，其中該分析揭露在神經內分泌轉變之CRPC(NEPC)中具有DLL3表現且在前列腺腺癌(PCa)中沒有。
圖7顯示闡述於Akamatsu,2015(PMID：26235627)中之數據之分析，其中該數據揭露LTL331(其為來自為AR+及PSA+之未經激素治療之前列腺腺癌之生檢)為DLL3陰性的。CRPC復發及發生(復發)後患者之後續生檢顯示高的DLL3表現。LTL331在小鼠宿主中確立為PDX，該小鼠宿主然後藉助比卡魯胺之治療進行閹割。時間點(去勢後天數)顯示沒有DLL3表現直至在闡割小鼠中發生CRPC(LTL331R)。神經內分泌標記物(包括ASCL1、ENO2、NCAM1及SYP)亦排他性地在LTL331R及復發後之患者生檢中表現。在第84天在即將發生CRPC之前開啟CHGA表現。
圖8顯示闡述於Akamatsu,2015(PMID：26235627)中之數據之進一步分析，其中該分析揭露某些標記物(包括PEG10)之表現在此患者復發前發生變化。更特定而言，PEG10表現在去勢後3週升高且在CRPC發生期間繼續上升。該分析亦揭露在小鼠宿主去勢早期開始的SPDEF、PTGER4及ERG表現之逐漸減少及/或損失，表明PEG10、SPDEF、PTGER4及ERG可用作具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之標記物。
圖9顯示闡述於Zhang,2015(PMID：26071481)中之數據之分析，其中該分析揭露20個前列腺腺癌(PR-Ad)PDX具有低的或無DLL3表現，而4個神經內分泌轉變之CRPC PDX表現高量之DLL3。
圖10顯示闡述於Niederst,2015(PMID 25758528)中之數據之分析， 其中該分析揭露在對EGFR TKI敏感(敏感)之EGFR突變體肺腺癌生檢中缺乏DLL3表現，以及在來自帶有T790M抗性突變(抗性-T790M)之肺腺癌患者之6個生檢試樣中缺乏DLL3表現。相反，在已經歷生理轉變且變得對EGFR TKI具有抗性之肺腺癌中觀察到升高之DLL3表現，此歸因於上皮至間質轉型(EMT)(抗性-EMT)或歸因於SCLC轉變(抗性-SCLC；同一患者2個生檢)。共同地，此分析顯示在已轉變為神經內分泌表型之CRPC及肺腺癌中具有升高之DLL3 RNA表現。
總之，該等數據顯示DLL3並非廣泛表現於具有EGFR活化性突變之前列腺腺癌或肺腺癌中。然而，在靶向療法(針對前列腺腺癌之雄激素去除療法或針對EGFR突變之肺腺癌之酪胺酸激酶抑制劑治療)之後，出現明顯具有神經內分泌組分之治療抗性腫瘤。該等治療抗性腫瘤現在表現DLL3。
實例11 在CRPC腫瘤上表現DLL3之抗DLL3 IHC證明
為證實在CRPC中觀察到DLL3蛋白表現，藉由免疫組織化學用抗DLL3抗體對來自CRPC患者之6個骨轉移生檢試樣進行染色。
基本上如下實施IHC。切割福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)組織之平面切片並將其安裝於玻璃顯微鏡載玻片上。在二甲苯去石蠟化之後，在99℃下用抗原修復溶液(Dako)將切片預處理20min，冷卻至室溫並保持20分鐘，且然後相繼利用於PBS中之0.3%過氧化氫及抗生物素蛋白/生物素封阻溶液(Vector Laboratories)處理。然後在室溫下用於PBS緩衝液中之3% BSA中之10%馬或驢血清將FFPE切片封阻30分鐘。在3% BSA/PBS中將抗DLL3抗體(純系SC16.65)稀釋至10μg/ml並在BSA/PBS中以1：200稀 釋染色顆粒素A(純系SP12,Spring Biosciences)抗體。將一級抗體施加至切片用於在室溫下培育60分鐘。在室溫下將FFPE切片與在3% BSA/PBS中稀釋至2.5μg/ml之生物素結合之馬抗小鼠(Vector Labs)或驢抗兔(Jackson Immunoresearch)二級抗體一起培育30min，隨後在鏈黴抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite Kit；Vector Laboratories)中培育。對於DLL3染色，使用擴增步驟。在室溫下將FFPE切片在生物素基酪胺中培育5分鐘，隨後在鏈黴抗生物素蛋白HRP(Perkin Elmer)中培育30分鐘。在室溫下利用3,3’-二胺基聯苯胺(Thermo Scientific)將發色檢測顯影5min並用邁爾氏蘇木素(Meyer’s hematoxylin)(IHC World)複染組織，用乙醇洗滌並浸沒於二甲苯中。然後藉由亮視野顯微術觀察切片並對DLL3及CHGA表現進行評分。
免疫組織化學發現在1/6 CRPC骨轉移生檢試樣中具有DLL3蛋白表現，此進一步指示所揭示之DLL3 ADC可用於治療CRPC。
實例12 在所選膀胱腫瘤上表現DLL3之IHC證明
如本文所闡述使用可自市面購得之腫瘤陣列生成IHC數據，以確定某些標記物是否可指示DLL3陽性膀胱腫瘤。
就此而言，圖11係在具有多種類型腫瘤之常見癌症陣列(Imgenex；IMH-327)之免疫組織化學染色之後的DLL3及CHGA表現之表格概述。該數據之進一步分析揭露9名前列腺腺癌中之3名顯示一些CHGA表現，且彼等CHGA陽性腫瘤中之一者就DLL3表現而言<1%之腫瘤細胞呈陽性。
此分析之結果表明，在利用雄激素去除療法之治療殺死大多數AR依賴性腫瘤細胞之後，腫瘤異質性可使得罕見神經內分泌轉變之細胞生長出 來。除前列腺以外，在3/9的膀胱移行細胞癌(TCC)生檢試樣及一個膀胱黏液性腺癌中觀察到罕見DLL3陽性細胞，但該等為CHGA陰性(圖11)。
小細胞神經內分泌腫瘤在膀胱中出現且極具侵襲性，但此可能係由缺乏靶向療法引起，尚未報導利用標準化學療法治療之膀胱TCC轉變為小細胞神經內分泌腫瘤。已闡述與神經內分泌癌同時發生之腺癌(Jiang Y 2014；PMID：25582251)，且因此，基於本文所呈現之分析，膀胱癌亦可因腫瘤異質性而鑑別為具有轉型為神經內分泌表型之風險。
實例13 PDX腫瘤中ASCL1 mRNA之表現
為在實體腫瘤存在於癌症患者中時表徵其細胞異質性且為闡明給定腫瘤適應症內之分子亞型，使用業內公認技術研發並維持PDX腫瘤庫。藉助使最初自患有各種實體腫瘤惡性病之癌症患者獲得之腫瘤細胞多次傳代，使包含大量離散腫瘤細胞系之PDX腫瘤庫在免疫受損小鼠中繁殖。低傳代PDX腫瘤代表其天然環境中之腫瘤，此提供對驅動腫瘤生長及對目前療法之抗性之潛在機制之臨床相關理解。然後如下文緊接所闡述探測胰臟、結腸直腸及肺瘤之所選PDX細胞系。
為實施ASCL1微陣列分析，在小鼠達到800mm3至2,000mm3之後自該等小鼠切除PDX腫瘤。使用業內公認之酶消化技術將所切除PDX腫瘤解離成單細胞懸浮液(例如參見，U.S.P.N.2007/0292414)。將經解離本體腫瘤細胞與4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起培育以檢測死亡細胞，與抗小鼠CD45及H-2Kd抗體一起培育以鑑別小鼠細胞，及與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。藉由以下方式自腫瘤細胞提取RNA：將該等細胞溶解於補充有1% 2-巰基乙醇之RLTplus RNA溶解緩衝 液(Qiagen)中，在-80℃下冷凍溶解物，且然後將溶解物解凍，以使用RNeasy分離套組(Qiagen)提取RNA。使用Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific)及/或Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies)量化RNA。正常組織RNA係購自各種來源(Life Technology、Agilent、ScienCell、BioChain及Clontech)。藉由微陣列分析(Agilent Technologies)評價所得總RNA製劑。
實施各種PDX系(及經改造之293細胞對照)上之微陣列實驗並如下分析數據：實質上如上文所闡述自PDX系提取1-2μg完整腫瘤總RNA。使用Agilent SurePrint GE Human 8x60 v2微陣列平臺分析RNA試樣，該微陣列平臺含有50,599個針對人類基因體中27,958個基因及7,419種lncRNA所設計之生物探針。使用標準工業實踐來正規化及轉變強度值以量化每一試樣之基因表現。ASCL1表現之正規化強度闡述於圖12中標題為「微陣列表現」之第1行中。
如圖12中所顯示，該微陣列分析證明ASCL1表現於多種肺癌細胞系中，此指示其可提供用於檢測、診斷或監測某些腫瘤性病症之標記物及具有神經內分泌表型轉型風險之腫瘤之潛在標記物。
實例14 藉由IHC評價之ASCL1之表現
在PDX腫瘤切片上實施微陣列分析及免疫組織化學(IHC)來評價腫瘤細胞中ASCL1之表現。
基本上如下實施IHC。切割福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)組織之平面切片並將其安裝於玻璃顯微鏡載玻片上。在二甲苯去石蠟化之後，在99℃下用抗原修復溶液(Dako)將5μm切片預處理20min，冷卻至75℃，且 然後相繼利用於PBS中之0.3%過氧化氫及抗生物素蛋白/生物素封阻溶液(Vector Laboratories)進行處理。然後用於PBS緩衝液中之3% BSA中之10%馬血清封阻FFPE載玻片，並在室溫下將其與在3% BSA/PBS中稀釋至10μg/ml之一級抗ASCL1抗體(純系SC72.2)一起培育30min。在室溫下將FFPE載玻片與在3% BSA/PBS中稀釋至2.5μg/ml之生物素結合之馬抗小鼠抗體(Vector Laboratories)一起培育30min，隨後在鏈黴抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite Kit；Vector Laboratories)中培育。在室溫下用3,3’-二胺基聯苯胺(Thermo Scientific)將發色檢測顯影5min並用邁爾氏蘇木素(IHC World)複染組織，用乙醇洗滌並浸沒於二甲苯中。然後藉由亮視野顯微術觀察切片並記錄ASCL1表現。該等研究之結果顯示於圖12中。
圖12之綜述顯示在經改造以表現ASCL1之293細胞(293-ASCL1)之細胞核(n)中檢測到ASCL1表現，但在幼稚293細胞中未檢測到。藉由IHC對PDX腫瘤進行染色(圖12)，且基於微陣列結果，藉由IHC之ASCL1蛋白表現與所預計ASCL1 mRNA表現相關。
熟習此項技術者將進一步瞭解，本發明可在不背離其精神或關鍵屬性之情況下以其他特定形式體現。鑒於本發明之先前闡述僅揭示其實例性實施例，應理解其他變化形式亦涵蓋在本發明之範圍內。因此，本發明並不限於本文已詳細闡述之特定實施例。相反，應提及隨附申請專利範圍來指示本發明之範圍及內容。
<110> 美商艾伯維史坦森特瑞斯有限責任公司
<120> 用於治療具有神經內分泌轉型風險之腫瘤的抗DLL3藥物結合物
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Claims (65)

  1. 一種治療個體中具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之抗DLL3抗體藥物結合物(antibody drug conjugates；ADC)或其醫藥上可接受之鹽，其中該抗體藥物結合物(ADC)包含式M-[L-D]n，其中：M包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含細胞毒性劑；且n為1至20之整數。
  2. 一種減少或抑制個體中具有轉型為神經內分泌表型風險之腺癌之再發之方法，該方法包含向該個體投與治療有效量之抗DLL3抗體藥物結合物(ADC)或其醫藥上可接受之鹽，其中該抗體藥物結合物(ADC)包含式M-[L-D]n，其中：M包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含細胞毒性劑；且n為1至20之整數。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該腺癌包含ASCL1+細胞。
  4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中與對照試樣相比，該腺癌以下 各項中之一或多者顯示係經降低之表現：視網膜母細胞瘤1(Retinoblastoma 1；RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(Repressor Element-1 Silencing Transcription Factor；REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SAM pointed domain-containing Ets transcription factor；SPDEF)、前列腺素E2受體4(Prostaglandin E2 Receptor 4；PTGER4)及ETS相關基因(ETS-related gene；ERG)。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中與對照試樣相比，該腺癌顯示父系性地表現之10(PEG10)會增加表現。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該腺癌係再發、難治、復發或具有抗性的。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該個體已經歷靶向療法。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該個體先前已經歷減瘤程序。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該腺癌發生在肺、前列腺、泌尿生殖道、胃腸道、甲狀腺或腎中。
  10. 如請求項9之方法，其中該腺癌包含前列腺癌。
  11. 如請求項10之方法，其中該前列腺癌包含去勢抵抗性前列腺癌。
  12. 如請求項10或11之方法，其中該腺癌對雄激素去除療法具有抗性。
  13. 如請求項9之方法，其中該腺癌包含肺癌。
  14. 如請求項13之方法，其中該肺癌包含非小細胞肺癌。
  15. 如請求項13或14之方法，其中該腺癌之特徵為具有活化性EGFR突變。
  16. 如請求項13至15中任一項之方法，其中該腺癌對EGFR抑制劑療法具有抗性。
  17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該腺癌為DLL3-/低。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該抗DLL3抗體係選自由以下組成之群：單株抗體、靈長類化抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、雙價抗體、Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段及ScFv片段；或其免疫反應性片段。
  19. 如請求項18之方法，其中該抗DLL3抗體係選自由以下組成之群：嵌合抗體、CDR移植抗體及人類化抗體。
  20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中該抗DLL3抗體特異性結合至如SEQ ID NO：1或2所闡述之DLL3蛋白之DSL結構域內的表位。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該抗DLL3抗體包括包含如SEQ ID NO：149所闡述之輕鏈可變區及如SEQ ID NO：151所闡述之重鏈可變區之抗體，或與該抗體競爭結合至人類DLL3蛋白。
  22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該抗DLL3抗體包含如SEQ ID NO：149所闡述之輕鏈可變區之三個互補決定區及如SEQ ID NO：151所闡述之重鏈可變區之三個互補決定區。
  23. 如請求項22之方法，其中該抗DLL3抗體包含CDR-L1之SEQ ID NO：149之殘基24-34、CDR-L2之SEQ ID NO：149之殘基50-56、CDR-L3之SEQ ID NO：149之殘基89-97、CDR-H1之SEQ ID NO：151之殘基31-35、CDR-H2之SEQ ID NO：151之殘基50-65及CDR-H3之SEQ ID NO：151之殘基95-102，其中該等殘基係根據Kabat編號。
  24. 如請求項22之方法，其中該抗DLL3抗體包括包含如SEQ ID NO：405所闡述之胺基酸序列之輕鏈可變區及包含如SEQ ID NO：407所闡述之胺基酸序列之重鏈可變區。
  25. 如請求項1至24中任一項之方法，其中該細胞毒性劑係吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奧裏斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、卡奇黴 素(calicheamicin)或放射性同位素。
  26. 如請求項25之方法，其中該細胞毒性劑係吡咯并苯并二氮呯(PBD)。
  27. 如請求項26之方法，其中該PBD係經由連接體共價連接至該抗DLL3抗體。
  28. 如請求項27之方法，其中該細胞毒性劑係包含式AC之吡咯并苯并二氮呯(PBD)： 其中：虛線指示雙鍵之存在是可選的，且其中特定環中該等虛線僅一條可為雙鍵；R2係選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、OSO2R、CO2R、COR及鹵基，其中RD選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9各自獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7係選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、 Me3Sn及鹵基；R10係聯結至該抗DLL3抗體之連接體L；Q係選自O、S及NH；R11為H或R，或倘若Q為O，則R11為SO3M，其中M係金屬陽離子；R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR’，R及R’連同其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；X係選自O、S及N(H)；R2”、R6”、R7”、R9”及X”係如分別根據R2、R6、R7、R9及X所定義；且R”係C3-12伸烷基，其包含視情況雜有一或多個雜原子、一或多個環或一或多個雜原子及一或多個環二者之鏈，其中該可選一或多個環視情況經取代。
  29. 如請求項28之方法，其中：R2係R，其中R係C5-20芳基；R6及R9係H；R7係OR，且其中R係C1烷基；Q係O，且其中R11係H；及/或X及X”係O。
  30. 如請求項27之方法，其中該PBD包含： 或
  31. 如請求項1至30中任一項之方法，其中該連接體包含可裂解連接體。
  32. 如請求項31之方法，其中該可裂解連接體包含二肽。
  33. 如請求項32之方法，其中該二肽係Phe-Lys、Val-Ala、Val-Lys、Ala-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Phe-Arg或Trp-Cit。
  34. 如請求項33之方法，其中該二肽係Val-Ala。
  35. 如請求項1至34中任一項之方法，其中該抗體藥物結合物包含以下結構： 其中星號指示該連接體至該細胞毒性劑之附接點，且其中波形線指示至該連接體剩餘部分之附接點。
  36. 如請求項30至35中任一項之方法，其中該連接體進一步包含馬來醯亞胺基團。
  37. 如請求項27之方法，其中經由連接體共價連接至該抗DLL3抗體之該PBD包含具有選自由以下組成之群之結構之ADC： 及 其中Ab包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段，且n為約1至約20之整數。
  38. 一種治療罹患具有轉型為神經內分泌表型風險之腫瘤之個體之方法，其包含以下步驟：(a)使獲自該個體之腫瘤試樣與ASCL1抗體接觸；(b)檢測結合至該腫瘤試樣之該ASCL1抗體；(c)選擇具有ASCL1+腫瘤表型之個體；及(d)利用抗DLL3抗體藥物結合物(DLL3 ADC)治療在步驟(c)中選擇之該個體，其中該腫瘤試樣包含DLL3-/低表型。
  39. 如請求項38之方法，其進一步包含使該腫瘤試樣與DLL3抗體接觸之步驟。
  40. 如請求項38及39之方法，其中檢測該ASCL1抗體係使用免疫組織化學來實施。
  41. 如請求項38至40之方法，其中該腫瘤試樣係以化學方式進行固定。
  42. 如請求項41之方法，其中該腫瘤試樣係使用福馬林(formalin)以化學方式進行固定。
  43. 如請求項38至42中任一項之方法，其中該腫瘤試樣係經石蠟包埋的。
  44. 如請求項38之方法，其進一步包含以下步驟：使該腫瘤試樣與檢測以下各項中之一或多者之藥劑接觸：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)；檢測該腫瘤試樣中之該藥劑；及觀察與對照試樣相比以下各項中之一或多者之經降低表現：視網膜母細胞瘤1(RB1)、抑制元件-1沉默轉錄因子(REST)、含有SAM指定結構 域之Ets轉錄因子(SPDEF)、前列腺素E2受體4(PTGER4)及ETS相關基因(ERG)。
  45. 如請求項38至44之方法，其進一步包含以下步驟：使該腫瘤試樣與檢測父系性地表現之10(PEG10)之PEG10劑接觸；檢測該腫瘤試樣中之該PEG10劑；及觀察與對照試樣相比，父系性地表現之10(PEG10)的表現有增加。
  46. 如請求項38至45中任一項之方法，其中該腫瘤係再發、難治、復發或具有抗性的。
  47. 如請求項38至46中任一項之方法，其中該個體已經歷靶向療法。
  48. 如請求項38至47中任一項之方法，其中該個體先前已經歷減瘤程序。
  49. 如請求項38至48中任一項之方法，其中該腫瘤包含腺癌。
  50. 如請求項49之方法，其中該腺癌發生在肺、前列腺、泌尿生殖道、胃腸道、甲狀腺或腎中。
  51. 如請求項50之方法，其中該腺癌包含前列腺癌。
  52. 如請求項51之方法，其中該前列腺癌包含去勢抵抗性前列腺癌。
  53. 如請求項51或52之方法，其中該前列腺癌對雄激素去除療法具有抗性。
  54. 如請求項50之方法，其中該腺癌包含肺癌。
  55. 如請求項54之方法，其中該肺癌包含小細胞肺癌。
  56. 如請求項55之方法，其中該肺癌包含非小細胞肺癌。
  57. 如請求項55或56之方法，其中該腺癌之特徵為具有活化性EGFR突變。
  58. 如請求項55至57中任一項之方法，其中該腺癌對EGFR抑制劑療法具有抗性。
  59. 如請求項38至58中任一項之方法，其中該ASCL1抗體係與可檢測標記結合或以其他方式締合。
  60. 如請求項38至58中任一項之方法，其中該ASCL1抗體未經標記。
  61. 如請求項60之方法，其中檢測該ASCL1抗體進一步包含使(b)之該腺 癌試樣與特異性結合至該ASCL1抗體之抗體接觸；及檢測特異性結合至該ASCL1抗體之該抗體。
  62. 如請求項38至61之方法，其中當以DLL3抗體探測時，該DLL3-/低腫瘤中染色呈陽性之細胞的百分比小於約10%。
  63. 如請求項38至62之方法，其中當以DLL3抗體探測時，該DLL3-/低腫瘤中染色呈陽性之細胞的百分比小於約5%。
  64. 如請求項38至63之方法，其中當以DLL3抗體探測時，該DLL3-/低腫瘤中染色呈陽性之細胞的百分比小於約2%。
  65. 如請求項38至64之方法，其中當以DLL3抗體探測時，該DLL3-/低腫瘤中染色呈陽性之細胞的百分比小於約1%。
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