TW201725217A - 新穎抗－ｔｎｆｓｆ９抗體及使用方法 - Google Patents

新穎抗－ｔｎｆｓｆ９抗體及使用方法 Download PDF

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大衛 寇羅
羅拉 桑德斯
美運 李
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大衛 劉
厄爾 金
羅伯 Ａ 史杜爾
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Abstract

本發明提供新穎抗-TNFSF9抗體及抗體藥物偶聯物，及使用該等抗-TNFSF9抗體及抗體藥物偶聯物治療癌症之方法。

Description

新穎抗－ＴＮＦＳＦ９抗體及使用方法
本申請案大體上係關於新穎抗-TNFSF9抗體或其免疫反應性片段及包括其等之組合物(包含抗體藥物偶聯物)，其等係用於治療、診斷或預防癌症及任何癌症復發或轉移。本發明所選實施例提供該等抗-TNFSF9抗體或抗體藥物偶聯物以用於治療癌症(包括減低致瘤細胞頻率)之用途。
幹細胞及祖細胞之分化及增殖係器官形成、細胞修復及細胞代替期間協同扮演支持組織生長作用之正常持續過程。該系統受嚴密調控以確保僅產生基於生物體需要之適當信號。細胞增殖及分化通常僅視需要發生用於代替受損或死亡細胞或用於生長。然而，許多因素會引起該等過程中斷，包含多種信號傳導化學物質過少或過多、存在改變之微環境、遺傳突變或其組合。正常細胞增殖及/或分化之中斷可導致多種病症，包含增殖性疾病(例如癌症)。 癌症之習用治療性治療包含化學療法、放射性療法及免疫療法。該等治療經常係無效的且手術切除可能無法提供可行之臨床替代方式。當前標準護理之侷限性在患者經受第一線治療且隨後復發之彼等情形下尤其明顯。在該等情形下，經常出現難治性腫瘤，其通常係攻擊性及不可治癒性腫瘤。許多腫瘤之總存活率多年來幾乎保持不變，此至少部分地歸因於現有療法無法防止復發、腫瘤復發及轉移。因此，業內極大地需要研發出對增殖性病症更具針對性且更強效之療法。本發明解決了此需要。
在一廣泛態樣中，本發明提供特異性結合至人類TNFSF9決定子之經分離抗體及相應抗體藥物或診斷偶聯物(ADC)或其組合物。在某些實施例中，TNFSF9決定子係表現於腫瘤細胞上之TNFSF9蛋白，而在其他實施例中，TNFSF9決定子表現於腫瘤起始細胞上。在其他實施例中，本發明抗體結合至TNFSF9蛋白且與結合人類TNFSF9蛋白上之表位之抗體競爭結合。 在所選實施例中，本發明包括含有具有結合表現具有SEQ ID NO: 1之人類TNFSF9之細胞之經分離抗體的抗體或與其競爭結合，其中經分離抗體包括：(1) SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或(2) SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或(3) SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或(4) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或(5) SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或(6) SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或(7) SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或(8) SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或(9) SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或(10) SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或(11) SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或(12) SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或(13) SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或(14) SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；或(15) SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；或(16) SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；或(17) SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；或(18) SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；或(19) SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；或(20) SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；或(21) SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或(22) SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；或(23) SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；或(24) SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH；或(25) SEQ ID NO: 117之VL及SEQ ID NO: 119之VH；或(26) SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；或(27) SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；或(28) SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；或(29) SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；或(30) SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；或(31) SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；或(32) SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或(33) SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或(34) SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或(35) SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 151之VH。 在另一態樣中，本發明包括包括輕鏈可變區及重鏈可變區之結合TNFSF9之抗體，其中輕鏈可變區具有陳述為SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 105 SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 145或SEQ ID NO: 149之輕鏈可變區之三個CDR且重鏈可變區具有陳述為SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO:59及 SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO:119及SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 147或SEQ ID NO: 151之重鏈可變區之三個CDR。 在其他態樣中，本發明包括人類化抗體，該等人類化抗體具有包括SEQ ID NO: 161之VL及包括SEQ ID NO: 163之VH或具有包括SEQ ID NO: 165之VL及包括SEQ ID NO: 167之VH。在某些實施例中，該等人類化抗體包括位點特異性抗體。在其他實施例中，該等抗體包括N297A突變(MJ突變)。 在其他所選實施例中，本發明包括選自由以下組成之群之人類化抗體：hSC113.57 (SEQ ID NO: 170及171)、hSC113.57ss1 (SEQ ID NO: 170及173)、hSC113.57ss1MJ (SEQ ID NO: 170及175)、hSC113.118 (SEQ ID NO: 180及181)、hSC113.118ss1 (SEQ ID NO: 180及183)及hSC113.118ss1MJ (SEQ ID NO: 180及185)。 在本發明之一些態樣中，抗體包括嵌合、CDR移植、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。在本發明之其他態樣中，抗體(較佳地包括上文所提及之序列之全部或一部分)係內化抗體。在其他實施例中，抗體包括位點特異性抗體。在其他所選實施例中，本發明包括納入任一上文所提及之抗體之抗體藥物偶聯物。 在某些態樣中，本發明包括編碼本發明之抗-TNFSF9抗體或其片段之核酸。在其他實施例中，本發明包括含有一或多種上述核酸之載體或包括該等核酸或載體之宿主細胞。 如上文所提及，本發明另外提供抗-TNFSF9抗體藥物偶聯物，其中如本文所揭示之抗體偶聯至有效載物。在某些態樣中，本發明包括免疫優先地締合或結合至hTNFSF9之ADC。本發明之相容抗-TNFSF9抗體藥物偶聯物(ADC)可通常包括下式： Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中 a) Ab包括抗-TNFSF9抗體； b) L包括可選連接體； c) D包括藥物；且 d) n係約1至約20之整數。 在某些態樣中，本發明ADC包括抗-TNFSF9抗體(例如闡述於上文中者)或其免疫反應性片段。在其他實施例中，本發明ADC包括選自以下之細胞毒性化合物：放射性同位素、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、苯并二氮呯衍生物、奧裡斯他汀(auristatin)、多拉斯他汀(dolastatin)、多卡米星(duocarmycin)、類美登素(maytansinoid)或本文所闡述之其他治療部分。在某些較佳實施例中，所揭示ADC包括PBD。 進一步提供包括如本文所揭示之抗-TNFSF9 ADC之醫藥組合物。在某些實施例中，組合包括大於約50%、大於約60%、大於約70%、大於約80%、大於約90%或甚至大於約95%之所選藥物-抗體比率(DAR)。在一些實施例中所選DAR為2，而在其他實施例中所選DAR為4且在其他實施例中所選DAR為6且在其他實施例中所選DAR為8。 本發明之另一態樣係治療癌症之方法，其包括向有需要之個體投與醫藥組合物(例如本文所闡述者)。在某些態樣中，癌症包括血液學惡性腫瘤，例如急性骨髓樣白血病或瀰漫性大B-細胞淋巴瘤。在其他態樣中，個體患有實體腫瘤。就該等實施例而言，癌症較佳地選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、胰臟癌、肺癌(小細胞及非小細胞)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。在某些實施例中，個體患有非小細胞肺癌(NSCLC)或胃癌。在其他所選實施例中，個體患有結腸直腸癌。另外，在所選實施例中，上述治療癌症之方法包括除本發明之抗-TNFSF9 ADC向個體投與至少一種其他治療部分。 在再一實施例中，本發明包括減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包括使腫瘤起始細胞群體與如本文所闡述之ADC接觸(例如在活體外或在活體內)，藉此腫瘤起始細胞之頻率有所減小。 在一態樣中，本發明包括細胞毒素遞送至細胞之方法，其包括使細胞與任一上述ADC接觸。 在另一態樣中，本發明包括檢測、診斷或監測個體之癌症(例如胃癌或血液學惡性腫瘤)之方法，該方法包括使腫瘤細胞與TNFSF9檢測劑接觸(例如在活體外或在活體內)且檢測與腫瘤細胞締合之TNFSF9藥劑之步驟。在所選實施例中，檢測劑應包括抗-TNFSF9抗體或與TNFSF9基因型決定子締合之核酸探針。在相關實施例中，診斷方法包括免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)。熟習此項技術者應瞭解，該等藥劑視情況可經標記或與如下文所揭示之效應物、標記物或報告基因締合且使用諸多標準技術(例如MRI、CAT掃描、PET掃描等)中之任一者進行檢測。 類似地，本發明亦提供可用於診斷、監測或治療TNFSF9相關病症(例如癌症)之套組或器件及相關方法。為此，本發明較佳地提供可用於檢測、診斷或治療TNFSF9相關病症之製品，其包括含有TNFSF9 ADC之貯器及用於使用該TNFSF9 ADC治療、監測或診斷TNFSF9相關病症或提供其投藥方案之指導材料。在所選實施例中，器件及相關方法包括接觸至少一種循環腫瘤細胞之步驟。在其他實施例中，所揭示套組包括指示套組或器件用於診斷、監測或治療TNFSF9相關癌症或提供其投藥方案之說明書、標記、插頁、讀本或諸如此類。 前述內容為發明內容，且因此必須含有細節之簡化、概述及省略；因此，熟習此項技術者應瞭解，發明內容僅具有闡釋性且並不意欲以任何方式進行限制。在本文所闡述之教示內容中將明瞭本文所闡述之方法、組合物及/或器件及/或其他標的物之其他態樣、特徵及優點。提供該發明內容以按簡化形式引入下文在實施方式中進一步闡述之概念精選。
交叉參考申請案 本申請案主張以下案件之權益：2015年12月22日提出申請之美國臨時申請案第62/270,985號、2016年5月2日提出申請之美國臨時申請案第62/330,672號及2016年12月15日提出申請之美國臨時申請案第62/434,782號，該等案件中之每一者之全部內容以引用方式併入本文中。序列表 本申請案含有已以ASCII格式經由EFS-Web提交之序列表且其全文以引用方式併入本文中。於2016年12月14日創建之該ASCII拷貝命名為S69697_1350TW_sc11301TWO1_ST25.txt且大小為161 KB (165,351個字節)。 本發明可以許多不同形式來體現。本文揭示本發明之例示其原理之非限制性、闡釋性實施例。本文所用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應解釋為限制所闡述標的物。出於本發明目的，除非另外說明，否則所有鑑別序列登錄號可參見NCBI參考序列(RefSeq)資料庫及/或NCBI GenBank® 檔案序列資料庫。 已令人吃驚地發現，TNFSF9表型決定子在臨床上與各種增殖性病症(包含贅瘤)有關，且TNFSF9蛋白及其變體或同種型提供可用於治療相關疾病之有用腫瘤標記物。就此而言，本發明提供包括經改造抗-TNFSF9抗體靶向劑及細胞毒性有效載物之抗體藥物偶聯物。如下文更詳細論述且如隨附實例中所陳述，所揭示之抗-TNFSF9 ADC可尤其有效地消除致瘤細胞，且由此可用於治療及預防某些增殖性病症或其進展或復發。另外，在與包括相同組份之習用ADC組合物比較時，所揭示ADC組合物可展現相對較高DAR (=2)及意外穩定性，此可提供改良之治療指數。 此外，已發現，TNFSF9標記物或決定子(例如細胞表面TNFSF9蛋白)在治療上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永存細胞)相關且可有效地用於將其消除或沉默。經由使用如本文所揭示之抗-TNFSF9偶聯物選擇性減少或消除癌症幹細胞之能力令人驚奇之處在於，已知該等細胞通常抵抗許多習用治療。亦即，傳統以及最新靶向治療方法之有效性通常受限於即使在該等治療方法下仍能夠使腫瘤生長永存之抗性癌症幹細胞之存在及/或出現。另外，與癌症幹細胞有關之決定子通常因低或不一致表現、無法保持與致瘤細胞締合或無法存在於細胞表面而使治療靶較差。與先前技術之教示內容明顯不同，本發明所揭示之ADC及方法可有效地克服此固有抗性，且特異性消除、清除、沉默或促進該等癌症幹細胞之分化，由此抵消其持續或再誘導潛在腫瘤生長之能力。 因此，TNFSF9偶聯物(例如揭示於本文中者)可有利地用於治療及/或預防所選增殖性(例如贅瘤性)病症或其進展或復發。應瞭解，儘管下文將尤其在特定結構域、區域或表位方面或在癌症幹細胞或腫瘤(包括神經內分泌特徵及其與所揭示抗體藥物偶聯物之相互作用)之背景下廣泛論述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應瞭解該等實例性實施例並不限制本發明範圍。而是，本發明之最廣泛實施例及隨附申請專利範圍廣泛地且明確地係關於抗-TNFSF9抗體及偶聯物(包含揭示於本文中者)及其用於治療及/或預防各種TNFSF9相關或介導病症(包含贅瘤性或細胞增殖性病症)之用途，不論任一特定作用機制或特異性靶定腫瘤、細胞或分子組份如何。 I.TNFSF9 生理學 腫瘤壞死因子超家族9 (TNFSF9；亦稱為4-1BB配體(4-1BBL)或CD137L)係由254個胺基酸(aa)組成之單次II型跨膜蛋白。該蛋白質係由細胞質結構域(aa 1-28)、跨膜結構域(aa 29-49)及細胞外結構域(aa 50-254)構成。圖1提供人類TNFSF9之注釋胺基酸序列(SEQ ID NO: 1)，其中細胞質結構域包括未加粗小寫字體，跨膜結構域係以粗體斜體指示且細胞外結構域係藉由大寫字體來指示。 因C-末端中之高胺基酸同源性，TNFSF9已歸類為腫瘤壞死因子(TNF)家族之成員。TNF家族成員通常基於其序列及結構特性而分類為三組。第1組稱為習用組，且根據藉由連結CD、DF及DE鏈之三聚體及較長環產生之其鐘或盛開花朵型晶體結構來進行定義。第2組含有具有EF-二硫鍵及較短CD及EF環之產生更具球狀晶體結構之成員。第三組中之成員之特徵在於其不同序列，該等不同序列賦予其與第1組及第2組成員之相對較低同源性(15-20%)。TNFSF9以及其他TNF成員(例如CD27L、CD30L、GITRL及OX40L)屬第3組。然而，TNFSF9與其組中之其他成員極為不同，此乃因其TNF同源性結構域(THD) (約162個殘基)長於習用THD (約150個殘基)。較長殘基產生類似於三葉片推進器而非正規種型或盛開花朵型型三聚體之不同三聚體結構。此外，TNFSF9之N末端及C末端自分子之相對端延伸而非在同一端彼此靠近，如在其他TNF成員中可見(Won EY等人，2010；PMID: 20032458)。 在人類中，編碼TNFSF9之基因由跨越大約7.3kBp之4個外顯子組成且局部化於染色體19p13.3上。存在一種已知變體-轉錄變體X1 (XM_006722931)，其中在位於細胞質結構域中之位置17肽自脯胺酸變為丙胺酸。TNFSF9蛋白之代表性直向同源物包含(但不限於)人類(NP_003802，圖1，SEQ ID NO: 1)、小鼠(NP_033430)、大鼠(NP_852049)及黑猩猩(K7CYE1)直向同源物。將TNFSF9蛋白闡述為跨膜細胞介素，其用作用於TNFRSF9之配體(亦稱為4-1BB或CD137)且在發炎及T細胞活化中發揮作用。受體TNFRSF9可發現於活化T細胞、天然殺傷(NK)細胞、單核球、樹突狀細胞(DC)、B細胞及內皮細胞上(Dimberg等人，2006；PMID: 16596186)。如同許多TNF家族成員，據信，TNFSF9與其受體之交聯會誘發用於一系列免疫功能(例如存活、遷移及分化)之共刺激信號(Alderson M等人，2004；PMID: 8088337)。據信，TNFSF9信號傳導經由募集發炎性細胞且調介趨化介素產生而在調控發炎中發揮作用(Kwon, 2015；PMID: 26140043)。遵循不同細胞類型上之TNFRSF9-TNFSF9結合之各種活性匯總於Shao及Schwarz之綜述中(2011；PMID: 20643812)。亦已知TNFSF9及其受體共表現於不同類型之細胞上。受體可藉由兩個分子之間之順式相互作用來下調TNFSF9表現，從而產生TNFSF9之胞吞作用。據推測，此相互作用使得發炎信號傳導性質得以調控(Kwon, 2015；PMID: 26140043)。另外，TNFSF9可具有雙向信號傳導能力，此容許表現配體之細胞接收信號且將信號傳輸回表現配體之細胞上；此稱為反向信號傳導(Shao & Schwarz, 2011；PMID: 20643812)。 TNFSF9之正常組織表現可發現於抗原呈遞細胞(APC) (例如DC、巨噬球、單核球、活化B-細胞及T細胞)上(Salih等人，2000；PMID: 10946324)。該等細胞上之表面表現在在靜止狀態期間處於較低程度下，但可使用固定CD3單株抗體進行誘導(Cheuk等人，2004；PMID: 14671675)。TNFSF9表現亦記載於血液學惡性腫瘤及若干類實體腫瘤(包含卵巢癌、胰臟癌、結腸直腸癌及非小細胞肺癌(NSCLC))中。若干研究亦報導在患有多發性硬化、急性動脈血栓形成性中風、急性骨髓樣白血病及非何傑金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)之患者之血清中檢測到之可溶性TNFSF9形式(Liu等人，2006；PMID: 16970683)、(Yu等人，2014；PMID: 24899613)、(Hentschel等人，2006；PMID: 16800841)、(Scholl等人，2009；PMID: 19225975)、(Salih等人，2001；PMID: 11564827)。在癌性細胞上，據信，該配體參與T細胞-腫瘤細胞相互作用且藉由抑制腫瘤生長及腫瘤細胞中之存活信號而具有抗腫瘤效應。(Melero等人，2013；PMID: 23460535)。藉由TNFSF9-TNFRSF9交聯活化之反向信號傳導可抑制增殖，觸發細胞凋亡，上調淋巴球上之CD95 (亦稱為Fas，細胞表面死亡受體)之表現且刺激巨噬球釋放IL-8 (促炎性趨化介素)。在連接於癌性細胞上後，受體可誘導CD4 T細胞發生增殖且產生IL-2及IL-4並誘導CD8 T細胞產生IFN-γ (Salih等人，2000；PMID: 10946324)。與之相比，Shao及Schwarz提出，癌瘤細胞上之TNFSF9表現可支持腫瘤環境，此乃因IL-8用作一些癌症之生長因子且發炎通常支持腫瘤進展(Shao & Schwarz, 2011；PMID: 20643812)。 最近，Qian及同事發現，NSCLC上之TNFSF9表現與較佳整體存活相關。此外，其發現，NSCLC上之TNFSF9之表現及刺激可抑制細胞增殖且經由JNK信號傳導路徑(經由反向信號傳導之固有路徑)來誘導細胞凋亡。在使用TNFRSF9-Fc蛋白刺激表現高TNFSF9之細胞時，其可觸發細胞週期停滯。細胞週期分析展示，S期細胞(準備分裂之細胞)之百分比有所減小且G1期細胞(處於成熟狀態之細胞)之百分比有所增加。其亦展示，兩種促存活蛋白Bcl-2及Bcl-xL有所減少且促凋亡因子Bax有所增加(Qian等人，2015；PMID: 25631633)。 II. 癌症幹細胞 根據當前模型，腫瘤包括非致瘤細胞及致瘤細胞。即使在以過量細胞數移植至免疫受損小鼠中時，非致瘤細胞仍不具自我更新能力且不能可再生地形成腫瘤。通常構成0.01%-10%分率之腫瘤細胞群體之致瘤細胞(在本文中亦稱為「腫瘤起始細胞」 (TIC))具有形成腫瘤之能力。對於造血系統惡性腫瘤而言，TIC可極稀少(介於1:104 至1:107 之間，尤其在急性骨髓樣惡性腫瘤(AML)中)或極豐富(例如在B細胞譜系之淋巴瘤中)。致瘤細胞涵蓋兩種腫瘤永存細胞(TPC)，其可互換地稱為癌症幹細胞(CSC)及腫瘤祖細胞(TProg)。 支持正常組織中之細胞分級之CSC (例如正常幹細胞)能夠無限地自我複製，同時維持多向分化之能力。就此而言，CSC能夠產生致瘤子代及非致瘤子代二者，且能夠完全重演親代腫瘤之異質細胞組成，如藉由連續分離並將少數經分離CSC移植至免疫受損小鼠中所顯示。存在證據指示，除非消除該等「種子細胞」，否則腫瘤極可能轉移或復發，從而導致疾病復發且最終發生進展。 TProg (例如CSC)具有推動一次移植中之腫瘤生長之能力。然而，與CSC不同，其無法重演親代腫瘤之細胞異質性，且在再引發後續移植中之腫瘤形成方面不夠有效，此乃因TProg通常僅能夠使有限數量之細胞分裂，如藉由將少數經高度純化之TProg連續移植至免疫受損小鼠中所顯示。TProg可進一步分成早期TProg及晚期TProg，其可藉由表型(例如細胞表面標記物)及其不同之重演腫瘤細胞架構之能力來區分。儘管二者重演腫瘤之程度皆不與CSC相同，但早期TProg具有強於晚期TProg重演親代腫瘤特性之能力。儘管具有前述不同，但已展示，一些TProg群體可在個別情況下獲得通常歸因於CSC之自我更新能力且其本身可變成CSC。 CSC與下列各項相比展現更高之致瘤性且通常相對更靜止：(i) TProg (早期及晚期TProg二者)；及(ii)可源自CSC且通常構成腫瘤本體之非致瘤細胞，例如最終分化腫瘤細胞及腫瘤浸潤細胞，例如纖維母細胞/間質、內皮及造血細胞。鑒於習用療法及方案在很大程度上已經設計以減積腫瘤並攻擊快速增殖之細胞，CSC由此對習用療法及方案比更快速增殖之TProg及其他本體腫瘤細胞群體(例如非致瘤細胞)更具抗性。可使CSC對習用療法具有相對化學抗性之其他特性為增加之多藥物抗性運輸蛋白表現、增強之DNA修復機制及抗-細胞凋亡基因表現。該等CSC性質與標準治療方案之失敗有關以在患有晚期贅瘤形成之患者中提供持續反應，此乃因標準化學療法不能有效靶向實際上刺激持續腫瘤生長及復發之CSC。 已令人吃驚地發現，TNFSF9表現與各種致瘤細胞亞群體以使得後者對如本文所陳述之治療敏感之方式有關。本發明提供尤其可用於靶向致瘤細胞且可用於沉默、敏化、中和、減小頻率、阻斷、廢除、干擾、減少、阻礙、限制、控制、清除、緩和、調介、減小、再程式化、消除、殺滅或以其他方式抑制(統稱為「抑制」)致瘤細胞，由此幫助治療、管控及/或預防增殖性病症(例如癌症)之抗- TNFSF9抗體。有利地，本發明之抗- TNFSF9抗體可經選擇以使其在投與個體後較佳地減小致瘤細胞之頻率或致瘤性，不論TNFSF9決定子(例如表型或基因型)如何。致瘤細胞頻率之減小可因以下各項所致：(i)致瘤細胞之抑制或消滅；(ii)控制致瘤細胞之生長、擴增或復發；(iii)中斷致瘤細胞之引發、繁殖、維持或增殖；或(iv)藉由其他方式阻礙致瘤細胞之存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，致瘤細胞之抑制可由一或多個生理路徑改變所致。無論藉由抑制或消除致瘤細胞、改變其潛力(例如藉由誘導分化或生態位破壞)抑或以其他方式干擾致瘤細胞影響腫瘤環境或其他細胞之能力造成之路徑改變允許藉由抑制腫瘤形成、腫瘤維持及/或轉移及復發來更有效地治療TNFSF9相關病症。另外應瞭解，所揭示抗體之相同特性使得其尤其有效地治療已證實對標準治療方案具有抗性或難治性之復發性腫瘤。 可用於評價致瘤細胞頻率之減小之方法包含(但不限於)細胞術或免疫組織化學分析，較佳地藉由活體外或活體內限制性稀釋分析(Dylla等人，2008, PMID: PMC2413402及Hoey等人，2009, PMID: 19664991)。 可藉由以下方式來實施活體外限制性稀釋分析：在引起菌落形成之固體培養基上培養經分級分離或未分級分離之腫瘤細胞(例如分別來自經處理及未處理腫瘤)且對生長之菌落進行計數及表徵。或者，可將腫瘤細胞連續稀釋於孔含有液體培養基之板上且每一孔可針對菌落形成在接種之後之任一時間(但較佳地在接種之後10天以上)評分為陽性或陰性。 藉由以下方式來實施活體內限制性稀釋：將來自未處理對照或來自暴露於所選治療劑之腫瘤之腫瘤細胞以連續稀釋液形式移植至免疫受損小鼠中且隨後將每一小鼠針對腫瘤形成評分為陽性或陰性。評分可發生於移植腫瘤可檢測之後之任一時間，但較佳地在在移植之後60天或更長天數時進行。較佳地，使用帕松分佈(Poisson distribution)統計學或藉由評價預定確定事件(例如能否在活體內生成腫瘤之能力)之頻率來分析測定致瘤細胞頻率之限制性稀釋實驗之結果(Fazekas等人，1982, PMID: 7040548)。 流式細胞術及免疫組織化學法亦可用於測定致瘤細胞頻率。兩種技術採用一或多種結合已知富集致瘤細胞之業內公認細胞表面蛋白質或標記物之抗體或試劑(參見WO 2012/031280)。如業內已知，流式細胞術(例如螢光活化細胞分選(FACS))亦可用於表徵、分離、純化、富集或分選包含致瘤細胞之各種細胞群體。流式細胞術藉由使懸浮有混合細胞群體之流體流通過能夠每秒量測高達數千個顆粒之物理及/或化學特性之電子檢測裝置來量測致瘤細胞含量。免疫組織化學法所提供之其他資訊在於，其使得能夠藉由使用結合至致瘤細胞標記物之經標記抗體或試劑對組織試樣染色來原位(例如在組織切片中)觀察致瘤細胞。 因此，本發明抗體可用於經由諸如流式細胞術、磁性活化細胞分選(MACS)、雷射調介之分區或FACS等方法來鑑別、表徵、監測、分離、分區或富集致瘤細胞之群體或亞群體。FACS係用於以大於99.5%之純度基於特定細胞表面標記物來分離細胞亞群體之可靠方法。用於表徵及操縱細胞(包含CSC)之其他相容技術可參見(例如) U.S.P.N. 12/686,359、12/669,136及12/757,649。 下文列示與CSC群體有關且用於分離或表徵CSC之標記物：ABCA1、ABCA3、ABCB5、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、ALDH、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD117、CD123、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD33、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CD96、CEACAM6、CELSR1、CLEC12A、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚醣、easyh1、easyh2、EDG3、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、HAVCR2、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、NANOG、NB84、NES、NID2、NMA、NPC1、OSM、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、SMARCA3、SMARCD3、SMARCE1、SMARCA5、SOX1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、TFRC、TRKA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1及CTNNB1。例如參見Schulenburg等人，2010, PMID: 20185329、 U.S.P.N. 7,632,678及U.S.P.N. 2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221。 類似地，與某些腫瘤類型之CSC有關之細胞表面表型之非限制性實例包含CD44hi CD24低 、ALDH+ 、CD133+ 、CD123+ 、CD34+ CD38− 、CD44+ CD24− 、CD46hi CD324+ CD66c− 、CD133+ CD34+ CD10− CD19− 、CD138− CD34− CD19+ 、CD133+ RC2+ 、CD44+ α2 β1 hi CD133+ 、CD44+ CD24+ ESA+ 、CD271+ 、ABCB5+ 以及業內已知之其他CSC表面表型。例如參見Schulenburg等人，2010 (上文文獻)，Visvader等人，2008, PMID: 18784658及U.S.P.N. 2008/0138313。本發明尤其關注包括實體腫瘤中之CD46hi CD324+ 表型及白血病中之CD34+ CD38- 之CSC製劑。 「陽性」、「低」及「陰性」表現程度在其應用於標記物或標記物表型時定義如下。具有陰性表現(亦即「-」)之細胞在本文中定義為表現小於或等於在螢光通道中在標記其他螢光發射通道中之其他所關注蛋白質之完全抗體染色混合劑存在下使用同型對照抗體所觀察到表現之95%之彼等細胞。熟習此項技術者應瞭解，用於定義陰性事件之此程序稱為「螢光減一」或「FMO」染色。表現大於使用上述FMO染色程序使用同型對照抗體所觀察到表現之95%之細胞在本文中定義為「陽性」 (亦即「+」)。如本文所定義，多個細胞群體在廣義上定義為「陽性」。若抗原之所觀察到之平均表現大於如上文所闡述使用FMO染色利用同型對照抗體測定的95%，則細胞定義為陽性。若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且在95%之一個標准偏差內，則陽性細胞可稱為具有低表現(亦即「lo」)之細胞。或者，若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且大於95%以上之一個標准偏差，則陽性細胞可稱為具有高表現(亦即「hi」)之細胞。在其他實施例中，較佳可使用99%作為陰性與陽性FMO染色之間之區別點，且在一些實施例中，百分位可大於99%。 CD46hi CD324+ 或CD34+ CD38- 標記物表型及上文剛剛例示之彼等可與標準流式細胞術分析及細胞分選技術聯合使用來表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體以供進一步分析。 因此，可使用上述技術及標記物來測定本發明抗體減小致瘤細胞頻率之能力。在一些情況下，抗-TNFSF9抗體可將致瘤細胞之頻率減小10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，致瘤細胞頻率可減小約40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示化合物可使致瘤細胞之頻率減小70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，致瘤細胞頻率之任何減小皆可能引起贅瘤之致瘤性、持久性、復發及攻擊性之相應減小。 III.抗體 A.抗體結構 抗體及其變體及衍生物(包含公認命名及編號系統)已廣泛闡述於(例如) Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology (第6版), W.B. Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology (第8版), Garland Science。 「抗體」或「完整抗體」通常係指包括藉由共價二硫鍵及非共價相互作用保持在一起之兩個重多肽鏈(H)及兩個輕多肽鏈(L)之Y形四聚體蛋白質。每一輕鏈係由一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)構成。每一重鏈包括一個可變結構域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體之情形下其包括三個結構域，稱為CH1、CH2及CH3 (IgM及IgE具有第四結構域CH4)。在IgG、IgA及IgD種類中，CH1與CH2結構域藉由撓性鉸鏈區分開，該撓性鉸鏈區係可變長度(在不同IgG子類中為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈二者中之可變結構域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區連結至恆定結構域，且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區。每一類抗體進一步包括由成對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內二硫鍵。 如本文中所使用，術語「抗體」包含多株抗體(polyclonal antibodies、multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長化抗體、CDR移植抗體、人類抗體(包含重組產生之人類抗體)、重組產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗-獨特型抗體、合成抗體(包含突變蛋白及其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')2 、F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包含Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子優先締合或結合即可。此外，除非藉由上下文約束另外指示，否則該術語進一步包括所有種類之抗體(亦即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(亦即IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體種類之重鏈恆定結構域通常分別由相應之小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之輕鏈分配為兩種完全不同之類型，稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ)。 抗體之可變結構域展示抗體之間胺基酸組成之相當變化，且主要負責抗原識別及結合。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，從而IgG抗體具有兩個結合位點(亦即其為二價)。VH及VL結構域包括三個極端可變區，其稱為超變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其藉由四個較不可變區(稱為框架區(FR))構架並分開。VH區與VL區之間之非共價締合形成含有抗體之兩個抗原結合位點中之一者之Fv片段(對於「可變片段」)。 如本文中所使用，除非另有所述，否則可根據由以下文獻所提供之方案之一來將胺基酸分配至每一結構域、框架區及CDR：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest (第5版), US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，1987, PMID: 3681981；Chothia等人，1989, PMID: 2687698；MacCallum等人，1996, PMID: 8876650；或Dubel編輯(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies ，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co or AbM (Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。如業內所熟知，可變區殘基編號通常係如Chothia或Kabat中所陳述。包括如由Kabat、Chothia、MacCallum (亦稱為接觸)及AbM所定義且如自Abysis網站資料庫(見下文)所獲得之CDR之胺基酸殘基陳述於下表1中。應注意，MacCallum使用Chothia編號系統。表 1 抗體序列中之可變區及CDR可根據業內已研發出之一般規則(如上文所闡釋，例如Kabat編號系統)或藉由比對該等序列與已知可變區之資料庫來鑑別。用於鑑別該等區域之方法闡述於以下文獻中：Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering, Springer, New York, NY, 2001；以及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons Inc.，Hoboken, NJ, 2000。抗體序列之實例性資料庫闡述於以下網站且可經由其存取：「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs (由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London, London, England之A.C. Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl. Acids Res., 33中所闡述(資料庫期號): D671 -D674 (2005)。 較佳使用Abysis資料庫來分析序列，該Abysis資料庫將來自Kabat、IMGT及蛋白質資料庫(PDB)之序列數據與來自PDB之結構數據整合在一起。參見Dr. Andrew C. R. Martin之書之章節Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains .Antibody Engineering Lab Manual (編者：Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg, ISBN-13: 978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis資料庫網站進一步包含經研發用於鑑別可用於本文教示內容中之CDR之一般規則。附圖8F及8G展示SC113.57及SC113.118抗體之實例性重鏈及輕鏈可變區(VH及VL)之注釋之該分析的結果。除非另外指示，否則本文所陳述之所有CDR皆係由Kabat等人根據Abysis資料庫網站衍生而來。 對於本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置，根據首次闡述於Edelman等人，1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63(1): 78-85中之Eu指數來編號，該文獻闡述經報導為第一個經測序之人類IgG1之骨髓瘤蛋白Eu之胺基酸序列。Edelman之Eu指數亦陳述於Kabat等人，1991 (上文文獻)中。因此，術語「如Kabat中所陳述之EU指數」或「Kabat之EU指數」或「EU指數」或「Eu編號」在重鏈背景下係指基於Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體之殘基編號系統，如Kabat等人，1991 (上文文獻)中所陳述。用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統以類似方式陳述於Kabat等人，(上文文獻)中。與本發明相容之實例性κ (SEQ ID NO: 5)及λ (SEQ ID NO: 8)輕鏈恆定區胺基酸序列緊接陳述於下文中： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 5). QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS (SEQ ID NO: 8). 類似地，與本發明相容之實例性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列緊接陳述於下文中： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 2). 熟習此項技術者應瞭解，可使用標準分子生物學技術使該等重鏈及輕鏈恆定區序列(野生型(例如參見SEQ ID NO: 2、5或8)或如本文所揭示經改造以提供未配對半胱胺酸(例如參見SEQ ID NO: 3、4、6、7、9或10))可可操作地與所揭示重鏈及輕鏈可變區締合以提供可納入本發明之TNFSF9抗體藥物偶聯物中之全長抗體。構成本發明之所選抗體(hSC113.57、hSC113.57ss1、hSC113.57ss1MJ、hSC113.118、hSC113.118ss1及hSC113.118ss1MJ)之全長重鏈及輕鏈之序列陳述於附圖8E中。 在免疫球蛋白分子中存在以下兩類二硫橋或鍵：鏈間及鏈內二硫鍵。如業內所熟知，鏈間二硫鍵之位置及數量根據免疫球蛋白之種類及類別而有所變化。儘管本發明不限於任一特定種類或子類之抗體，但出於闡釋性目的IgG1免疫球蛋白應用於本發明通篇中。在野生型IgG1分子中，存在12個鏈內二硫鍵(4個位於每一重鏈上且兩個位於每一輕鏈上)及4個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常經輕微保護且較鏈間鍵相對較不易還原。相反，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白之表面上，易接近溶劑且通常相對易於還原。兩個鏈間二硫鍵存在於重鏈之間且一個鏈間二硫鍵自每一重鏈延伸至其各別輕鏈。已證實，鏈間二硫鍵對於鏈締合併非必不可少。IgG1鉸鏈區在重鏈中含有形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸，該等鏈間二硫鍵提供結構支持以及促進Fab移動之撓性。重/重IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229 (Eu編號)處，而IgG1之輕鏈與重鏈間之IgG1鏈間二硫鍵(重/輕)形成於κ或λ輕鏈之C214與重鏈上鉸鏈區中之C220之間。 B.抗體生成及產生 可使用業內已知之各種方法來產生本發明抗體。 1.宿主動物中多株抗體之生成 業內熟知各種宿主動物中多珠抗體之產生(例如參見Harlow及Lane (編輯) (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press；及Harlow等人(1989) Antibodies, NY, Cold Spring Harbor Press)。為產生多株抗體，使用抗原蛋白或包括抗原蛋白之細胞或製劑對免疫活性動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物等)實施免疫。一定時間段之後，藉由采血或處死動物來獲得含有多株抗體之血清。血清可以自動物獲得之形式使用或抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離之抗體製劑。 就此而言，可自在免疫活性動物中誘導免疫反應之任一TNFSF9決定子生成本發明抗體。如本文中所使用，「決定子」或「靶」意指可鑑別與特定細胞、細胞群體或組織締合或特定發現於特定細胞、細胞群體或組織中或其上之任何可檢測性狀、性質、標記物或因子。決定子或靶之性質可為形態的、功能的或生物化學的且較佳係表型的。在較佳實施例中，決定子係由特定細胞類型或由某些條件下之細胞(例如在細胞週期之特定點期間或特定生態位之細胞)差異表現(過度表現或過少表現)之蛋白質。出於本發明目的，決定子較佳在異常癌細胞上差異表現，且可包括TNFSF9蛋白，或其剪接變體、同種型、同系物或家族成員中之任一者，或其特定結構域、區域或表位。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原決定子」或「免疫原」意指在引入免疫活性動物中時可刺激免疫反應且由藉由該免疫反應產生之抗體識別的任何TNFSF9蛋白或其任何片段、區域或結構域。可使用本文所涵蓋TNFSF9決定子之存在或不存在來鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如腫瘤、致瘤細胞或CSC)。 可使用任何形式之抗原或含有該抗原之細胞或製劑來產生特異性用於TNFSF9決定子之抗體。如本文中所陳述，術語「抗原」係以廣義使用且可包括所選靶之任何免疫原性片段或決定子，包含單一表位、多表位、單一或多結構域或整個細胞外結構域(ECD)或蛋白質。抗原可為經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如使用在其表面上表現抗原之至少一部分之細胞實施免疫)或可溶性蛋白質(例如僅使用該蛋白質之ECD部分實施免疫)或蛋白質構築體(例如Fc-抗原)。抗原可在經基因修飾之細胞中產生。上文所提及抗原中之任一者可單獨使用或與一或多種業內已知之免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA (例如cDNA)，且可編碼足以誘發免疫原性反應之ECD之至少一部分。可採用任何載體來轉化表現抗原之細胞，包含(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體(例如陽離子脂質)。 2.單株抗體 在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之用途。如業內所已知，術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，亦即，除可能存在極少量可能突變(例如天然突變)外，構成該群體之個別抗體皆相同。 單株抗體可使用業內已知之眾多種技術來製備，包含雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如XenoMouse® )或其一些組合。舉例而言，單株抗體可使用(例如)以下文獻中更詳細闡述之雜交瘤以及生物化學及遺傳改造技術來產生：An, Zhigiang (編輯)Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic , John Wiley and Sons，第1版，2009；Shire等人(編輯)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing , Springer Science + Business Media LLC，第1版，2010；Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)。在產生多種特異性結合至決定子之單株抗體後，可基於(例如)對決定子之親和力或內化速率經由多個篩選過程選擇尤其有效之抗體。如本文所闡述產生之抗體可用作「源」抗體且進一步修飾以(例如)改良對靶之親和力，改良其在細胞培養物中之產生，降低活體內免疫原性，產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細闡述陳述於下文及隨附實例中。 3.人類抗體 在另一實施例中，抗體可包括全人類抗體。術語「人類抗體」係指具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用製備下文所闡述人類抗體之任一技術製備之抗體。 可使用業內已知之各種技術產生人類抗體。一種技術係噬菌體展示，其中在噬菌體上合成(較佳地人類)抗體之文庫，使用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，且分離結合抗原之噬菌體，自該噬菌體可獲得免疫反應性片段。製備及篩選該等文庫之方法在業內已眾所周知且用於生成噬菌體展示文庫之套組市面有售(例如Pharmacia Recombinant Phage Antibody System，目錄編號27-9400-01；及Stratagene SurfZAPTM 噬菌體展示套組，目錄編號240612)。業內亦存在可用於生成及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(例如參見U.S.P.N. 5,223,409；PCT公開案第WO 92/18619號、第WO 91/17271號、第WO 92/20791號、第WO 92/15679號、第WO 93/01288號、第WO 92/01047號、第WO 92/09690號；及Barbas等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991))。 在一實施例中，可藉由篩選如上文製備之重組組合抗體文庫來分離重組人類抗體。在一實施例中，文庫係使用自B細胞分離之mRNA製備之人類VL及VH cDNA產生的scFv噬菌體展示文庫。 藉由幼稚文庫(天然或合成)產生之抗體可具有適當親和力(Ka 約為106 至107 M-1 )，但亦可在活體外藉由構築如業內所闡述之二級文庫且自其進行再選擇來模擬親和力成熟。舉例而言，可在活體外藉由使用易錯聚合酶隨機引入突變(報導於Leung等人，Technique , 1: 11-15 (1989)中)。另外，可藉由以下方式來實施親和力成熟：使用(例如) PCR利用攜載跨越CDR所關注之隨機序列之引子在所選個別Fv純系中使一或多個CDR隨機突變且篩選較高親和力純系。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。另一有效方式係重組藉由噬菌體展示選擇之VH或VL結構域與自未免疫化供體獲得之天然V結構域變體之譜且在數輪鏈再改組針對較高親和力進行篩選，如Marks等人，Biotechnol ., 10: 779-783 (1992)中所闡述。此技術容許產生解離常數KD (k解離 /k締合 )約為10-9 M或更小之抗體及抗體片段。 在其他實施例中，可使用包括表現表面上之結合對之文庫之真核細胞(例如酵母)來採用類似程序。例如參見U.S.P.N. 7,700,302及U.S.S.N. 12/404,059。在一實施例中，人類抗體係選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表現人類抗體(Vaughan等人，NatureBiotechnology 14:309-314 (1996): Sheets等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6157-6162 (1998)。在其他實施例中，可自在真核細胞(例如酵母)中生成之組合抗體文庫分離人類結合對。例如參見U.S.P.N. 7,700,302。該等技術有利地容許篩選大量候選調節劑且相對較容易地操縱候選序列(例如藉由親和力成熟或重組改組)。 人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入內源免疫球蛋白基因已部分或完全失活且已引入人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)中來製備。在刺激時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面非常類似於在人類中可見之情形，包含基因重排、組裝及抗體譜。此方式闡述於(例如)以下文獻中：U.S.P.N. 5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016及U.S.P.N. 6,075,181及6,150,584 (涉及XenoMouse® 技術)；及Lonberg及Huszar,Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995)。或者，可經由使產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴球(該等B淋巴球可自患有贅瘤性病症之個體回收或可已在活體外經免疫)永生來製備人類抗體。例如參見Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy , Alan R. Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，J. Immunol , 147 (l):86-95 (1991)；及U.S.P.N. 5,750,373。 不論來源如何，應瞭解，可使用業內已知分子改造技術製作人類抗體序列且引入如本文所闡述之表現系統及宿主細胞中。該等非天然重組產生人類抗體(及個別組合物)與本發明之教示內容完全相容且明確屬本發明範圍內。在某些所選態樣中，本發明之TNFSF9 ADC包括用作細胞結合劑之重組產生人類抗體。 4.衍生抗體 ： 在如上文所闡述生成源抗體、選擇且分離後，可立即將其進一步改變以提供具有改良醫藥特性之抗-TNFSF9抗體。較佳地，使用已知分子改造技術修飾或改變源抗體以提供具有期望治療性質之衍生抗體。 4.1.嵌合及人類化抗體 本發明之所選實施例包括免疫特異性結合至TNFSF9且可視為「源」抗體之鼠類單株抗體。在所選實施例中，本發明抗體可自該等「源」抗體經由視情況修飾源抗體之恆定區及/或表位結合胺基酸序列來衍生。在某些實施例中，若經由缺失、突變、取代、整合或組合來改變源抗體之所選胺基酸，則抗體「源自」源抗體。在另一實施例中，「衍生」抗體係將源抗體之片段(例如一或多個CDR或結構域或整個重鏈及輕鏈可變區)與受體抗體序列組合或納入其中以提供衍生性抗體(例如嵌合、CDR移植或人類化抗體)者。可使用來自抗體產生細胞之基因材料及如下文所闡述之標準分子生物技術生成該等「衍生」抗體以(例如)改良對決定子之親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養物中之產量及產率；減小活體內免疫原性；減小毒性；促進活性部分之偶聯；或產生多特異性抗體。該等抗體亦可藉由化學方式或轉譯後修飾來修飾成熟分子(例如糖基化模式或聚乙二醇化)以源自源抗體。 在一實施例中，本發明抗體包括衍生自共價接合之至少兩個不同類別或種類之抗體之蛋白質區段之嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係指如下構築體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來自特定物種或屬特定抗體種類或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬另一抗體種類或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源(U.S.P.N. 4,816,567)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包括可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變區的全部或大部分。在其他所選實施例中，抗-TNFSF9抗體可「衍生」自本文所揭示之小鼠抗體且包括小於全部重鏈及輕鏈可變區之區域。 在其他實施例中，本發明之嵌合抗體係「CDR移植」抗體，其中CDR (如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自特定物種或屬特定抗體種類或子類，而抗體之其餘部分主要衍生自來自另一物種或屬另一抗體種類或子類之抗體。對於人類中之應用而言，可將一或多個所選齧齒類動物CDR (例如小鼠CDR)移植至人類受體抗體中，從而代替人類抗體之一或多個天然CDR。該等構築體通常具有以下優點：提供全強度人類抗體功能(例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))，同時減小個體對抗體之不期望免疫反應。在一實施例中，CDR移植抗體將包括一或多個自小鼠獲得之納入人類框架序列中之CDR。 類似於CDR移植抗體者係「人類化」抗體。如本文中所使用，「人類化」抗體係包括一或多個衍生自一或多種非人類抗體(供體或源抗體)之胺基酸序列(例如CDR序列)之人類抗體(受體抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個FR之殘基經來自非人類物種供體抗體之相應殘基代替。該等回復突變可幫助維持移植CDR之適當三維構形且由此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自多個供體物種之抗體，包含(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。另外，人類化抗體可包括未在接受者抗體或供體抗體中發現之新殘基以(例如)進一步細化抗體性能。可提供與本發明相容之包括來自源抗體之鼠類組份及來自受體抗體之人類組份的CDR移植及人類化抗體，如下文實例中所陳述。 可利用多種業內公認技術來確定使用哪個人類序列作為受體抗體來提供本發明之人類化構築體。確定適於作為受體序列之相容性人類種系序列及方法之編譯揭示於(例如)以下文獻中：Dubel及 Reichert (編輯) (2014)Handbook of Therapeutic Antibodies ，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson, I. A.等人(1992)J. Mol. Biol . 227:776-798；Cook, G. P.等人(1995)Immunol.Today 16: 237-242；Chothia, D.等人(1992)J. Mol. Biol. 227:799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14:4628-4638)。V-BASE目錄(VBASE2 - Retter等人，Nucleic Acid Res. 33; 671-674, 2005)提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(經Tomlinson, I. A.等人，MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK編譯)，亦可使用該目錄來鑑別相容性受體序列。另外，舉例而言，U.S.P.N. 6,300,064中所闡述之共有人類框架序列亦可證實為相容性受體序列且可根據本發明之教示內容使用。一般而言，基於與鼠類來源框架序列之同源性以及源及受體抗體之CDR規範結構之分析選擇人類框架受體序列。然後可使用業內公認技術合成衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區之衍生序列。 舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法闡述於U.S.P.N. 6,180,370及5,693,762中。關於其他細節參見(例如) Jones等人，1986, (PMID: 3713831)；以及U.S.P.N. 6,982,321及7,087,409。 CDR移植或人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如本文所論述來測定，且在如此量測時將較佳共有至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不同殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基由具有具有類似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。 應瞭解，如附圖8A及8B中所提供之注釋CDR及框架序列係根據Kabat等人使用專有Abysis資料庫來定義。然而，如本文所論述且圖8F與8G中所展示，熟習此項技術者可容易地根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義來鑑別CDR。因此，包括一或多個根據上文所提及系統中之任一者衍生而來之CDR之抗-TNFSF9人類化抗體明確保持在本發明範圍內。 4.2.位點特異性抗體 本發明抗體可經改造以促進至細胞毒素或其他抗癌劑(如下文更詳細論述)之偶聯。就細胞毒素在抗體上之位置及藥物對抗體比率(DAR)而言，抗體藥物偶聯物(ADC)製劑可有利地包括ADC分子之均質群體。基於本發明，熟習此項技術者可易於製作如本文所闡述之位點特異性改造構築體。如本文中所使用，「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意指如下抗體或其免疫反應性片段：其中重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸缺失、改變或取代(較佳地經另一胺基酸)以提供至少一個游離半胱胺酸。類似地，「位點特異性偶聯物」應意指包括位點特異性抗體及至少一種偶聯至未配對或游離半胱胺酸之細胞毒素或其他化合物(例如報告基因分子)之ADC。在某些實施例中，未配對半胱胺酸殘基包括未配對鏈內半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基包括未配對鏈間半胱胺酸殘基。在其他實施例中，可將游離半胱胺酸改造至抗體之胺基酸序列中(例如在CH3結構域中)。在任一情形下，位點特異性抗體可為各種同型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；及在彼等種類內，抗體可為各種子類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體而言，抗體之輕鏈可包括κ或λ同型，每一同型納入在所選實施例中可因在IgG1重鏈中缺乏C220殘基而未配對之C214。 因此，除非上下文另外指定，否則本文所用之術語「游離半胱胺酸」或「未配對半胱胺酸」可互換使用且應意指抗體中在生理學條件下並非天然(或「自然」)二硫鍵之一部分之任一半胱胺酸(或含硫醇)組份(例如半胱胺酸殘基)，不論天然存在或使用分子改造技術具體納入所選殘基位置中。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包括天然半胱胺酸，後者之自然鏈間或鏈內二硫橋配偶體已經取代、消除或以其他方式改變以在生理學條件下破壞天然二硫橋，由此致使未配對半胱胺酸適用於位點特異性偶聯。在其他較佳實施例中，游離或未配對半胱胺酸包括選擇性置於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內之預定位點之半胱胺酸殘基。應瞭解，在偶聯之前，端視系統之氧化態，游離或未配對半胱胺酸可以以下形式存在：硫醇(經還原半胱胺酸)、經封端半胱胺酸(經氧化)或作為與相同或不同分子上之另一半胱胺酸或硫醇基團之非自然分子內或分子間二硫鍵(經氧化)之一部分。如下文更詳細論述，經適當改造之抗體構築體之溫和還原將提供可用於位點特異性偶聯之硫醇。因此，在尤佳實施例中，對游離或未配對半胱胺酸(不論天然或納入)實施選擇性還原及後續偶聯以提供均質DAR組合物。 應瞭解，所揭示經改造偶聯物製劑展現之有益性質至少部分係基於特異性引導偶聯之能力且該等有利性質在偶聯位置及組合物之絕對DAR值方面顯著限制所製得偶聯物。不同於大部分習用ADC製劑，本發明無需完全依賴抗體之部分或完全還原來提供隨機偶聯位點及DAR物質之相對不受控生成。而是，在某些態樣中，本發明較佳地藉由改造靶向抗體以破壞一或多個天然(亦即「自然」)鏈間或鏈內二硫橋或在任一位置引入半胱胺酸殘基來提供一或多個預定未配對(或游離)半胱胺酸位點。為此，應瞭解，在所選實施例中，可使用標準分子改造技術將半胱胺酸殘基納入沿抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈之任一位置或附加至上面。在其他較佳實施例中，可與引入可然後用作偶聯位點之非自然半胱胺酸(其然後包括游離半胱胺酸)組合來破壞自然二硫鍵。 在某些實施例中，經改造抗體包括鏈內或鏈間半胱胺酸殘基之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文中所使用，「鏈間半胱胺酸殘基」意指涉及抗體之輕鏈與重鏈間或抗體之兩種重鏈間之自然二硫鍵的半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」係與相同重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然配對者。在一實施例中，缺失或取代之鏈間半胱胺酸殘基涉及輕鏈與重鏈之間二硫鍵之形成。在另一實施例中，缺失或取代之半胱胺酸殘基涉及兩條重鏈之間之二硫鍵。在典型實施例中，因抗體之互補結構(其中輕鏈與重鏈之VH及CH1結構域配對且其中一條重鏈之CH2及CH3結構域與互補重鏈之CH2及CH3結構域配對)，故輕鏈或重鏈中單一半胱胺酸之突變或缺失使得在經改造抗體中產生兩個未配對半胱胺酸殘基。 在一些實施例中，鏈間半胱胺酸殘基缺失。在其他實施例中，將鏈間半胱胺酸替換為另一胺基酸(例如天然胺基酸)。舉例而言，胺基酸取代可使得鏈間半胱胺酸經中性(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)殘基代替。在所選實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸代替。 在由本發明涵蓋之一些實施例中，缺失或取代之半胱胺酸殘基位於輕鏈(κ或λ)上，由此在重鏈上留下游離半胱胺酸。在其他實施例中，缺失或取代之半胱胺酸殘基位於重鏈上，從而在輕鏈恆定區中留下游離半胱胺酸。在組裝後，應瞭解，完整抗體之輕鏈或重鏈中單一半胱胺酸之缺失或取代使得產生具有兩個未配對半胱胺酸殘基之位點特異性抗體。 在一實施例中，缺失或取代IgG輕鏈(κ或λ)之位置214之半胱胺酸(C214)。在另一實施例中，缺失或取代之IgG重鏈上之位置220之半胱胺酸(C220)。在其他實施例中，缺失或取代重鏈上之位置226或位置229之半胱胺酸 。在一實施例中，重鏈上之C220經絲胺酸(C220S)取代以在輕鏈中提供期望游離半胱胺酸 。在另一實施例中，輕鏈中之C214經絲胺酸(C214S)取代以在重鏈中提供期望游離半胱胺酸。該等位點特異性構築體更詳細闡述於下文實例中。相容位點特異性構築體之匯總展示於緊鄰之下表2中，其中編號通常係根據如Kabat中所陳述之Eu索引，WT代表不含改變之「野生型」或自然恆定區序列且德耳塔(Δ)指定胺基酸殘基之缺失(舉例而言，C214Δ指示，位置214之半胱胺酸殘基已缺失)。表 2 與本發明之位點特異性構築體相容之實例性經改造輕鏈及重鏈恆定區緊接陳述下文中，其中SEQ ID NO: 3及4分別包括C220S IgG1及C220Δ IgG1重鏈恆定區，SEQ ID NO: 6及7分別包括C214S及C214Δκ輕鏈恆定區且SEQ ID NO: 9及10分別包括實例性C214S及C214Δλ輕鏈恆定區。在每一情形下，改變或缺失之胺基酸(以及側接殘基)之位點加下劃線。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 3) ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 4) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGES (SEQ ID NO: 6) RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE (SEQ ID NO: 7) QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTESS (SEQ ID NO: 9) QPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTES (SEQ ID NO: 10) 如上文所論述，重鏈及輕鏈變體中之每一者可與所揭示重鏈及輕鏈可變區(或其衍生物，例如人類化或CDR移植構築體)可可操作地締合以提供如本文所揭示之位點特異性抗-TNFSF9抗體。該等經改造抗體尤其適用於所揭示ADC中。 就引入或添加一或多個半胱胺酸殘基以提供游離半胱胺酸(與破壞自然二硫鍵不同)而言，熟習此項技術者可易於辨別抗體或抗體片段上之相容位置。因此，在所選實施例中，端視期望DAR、抗體構築體、所選有效載物及抗體靶，可將半胱胺酸引入CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域或其任一組合中。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL結構域且在尤佳實施例中引入CL結構域之c-末端區域中。在每一情形下，可改變、去除或取代鄰近半胱胺酸插入位點之其他胺基酸殘基以促進分子穩定性、偶聯效率或在附接有效載物後提供用於其之保護環境。在特定實施例中，經取代殘基在抗體之任一可及位點處出現。藉由使用半胱胺酸取代該等表面殘基，反應性硫醇基團由此定位於抗體上之易於可及位點處且可如本文進一步所闡述來選擇性還原。在特定實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由使用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此定位於抗體之可及位點處且可用於選擇性偶聯抗體。在某些實施例中，下列殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205 (Kabat編號)、重鏈之A118 (Eu編號)及重鏈Fc區之S400 (Eu編號)。其他取代位置及製作相容位點特異性抗體之方法陳述於U.S.P.N. 7,521,541中，該案件之全部內容併入本文中。 用於生成如本文所揭示具有藥物加載之界定位點及化學計量學之抗體藥物偶聯物之策略廣泛適用於所有抗-TNFSF9抗體，此乃因其主要涉及改造抗體之保守恆定結構域。因已充分記載每一種類及子類之抗體之胺基酸序列及自然二硫橋，故熟習此項技術者無需過多實驗即可易於製作各種抗體之經改造構築體且因此該等構築體明確涵蓋於本發明範圍內。 4.3.恆定區修飾及改變之糖基化 本發明之所選實施例亦可包括恆定區(亦即Fc區)之取代或修飾，該等 取代或修飾包含(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，其產生具有包含(但不限於)以下之特性之化合物：改變之藥物動力學、增加之血清半衰期、增加之結合親和力、減小之免疫原性、增加之產生、改變之至Fc受體(FcR)之Fc配體結合、增強或減小之ADCC或CDC、改變之糖基化及/或二硫鍵及修飾之結合特異性。 可(例如)經由改變涉及Fc結構域與Fc受體(例如FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間之相互作用之胺基酸殘基來生成具有改良Fc效應物功能的化合物，此可產生增加之細胞毒性及/或改變之藥物動力學，例如增加之血清半衰期(例如參見Ravetch及Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人，Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人，J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。 在所選實施例中，可藉由修飾(例如取代、缺失或添加)鑑別為涉及Fc結構域與FcRn受體間之相互作用之胺基酸殘基來生成具有增加之活體內半衰期的抗體(例如參見國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N. 6,737,056及U.S.P.N. 2003/0190311)。就該等實施例而言，Fc變體可在哺乳動物、較佳地人類中提供以下半衰期：大於5天、大於10天、大於15天、較佳地大於20天、大於25天、大於30天、大於35天、大於40天、大於45天、大於2個月、大於3個月、大於4個月或大於5個月。增加之半衰期產生較高血清效價，此由此減小抗體之投與頻率及/或減小擬投與抗體之濃度。可(例如)在轉基因小鼠或表現人類FcRn之經轉染人類細胞系中或在投與具有變體Fc區之多肽之靈長類動物中分析人類活體內FcRn結合及人類FcRn高親和力結合多肽的血清半衰期。WO 2000/42072闡述具有改良或減弱之FcRn結合之抗體變體。亦參見(例如) Shields等人，J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)。 在其他實施例中，Fc改變可使得增強或減小ADCC或CDC活性。如業內所已知，CDC係指在補體存在下靶細胞之裂解，且ADCC係指如下細胞毒性形式：其中存在於某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷細胞、嗜中性球及巨噬球)上之結合至FcR之所分泌Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至具抗原靶細胞且隨後殺滅具有細胞毒素之靶細胞。在本發明背景中，提供具有「改變」之FcR結合親和力之抗體變體，其與親代或未修飾抗體或包括自然序列FcR之抗體相比具有增強或減弱之結合。與自然序列相比，該等顯示降低之結合之變體可擁有極低或不具有可感知之至FcR的結合(例如0-20%結合)，例如如藉由業內熟知技術所測定。在其他實施例中，變體與自然免疫球蛋白Fc結構域相比展現增強結合。應瞭解，該等類型之Fc變體可有利地用於增強所揭示抗體之有效抗腫瘤性質。在其他實施例中，該等改變引起增加之結合親和力、減小之免疫原性、增加之產生、改變之糖基化及/或二硫鍵(例如關於偶聯位點)、經修飾結合特異性、增加之吞噬作用；及/或細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)之下調等。 其他實施例包括一或多種經改造糖型，例如包括經改變糖基化模式之位點特異性抗體或共價附接至蛋白質(例如在Fc結構域中)之經改變碳水化合物組合物。例如參見Shields, R. L.等人(2002)J. Biol. Chem. 277:26733-26740。經改造糖型可用於各種目的，包含(但不限於)增強或減小效應物功能、增加抗體對靶之親和力或促進抗體產生。在期望減小之效應物功能之某些實施例中，可改造分子以表現無醣基化形式。可使得消除一或多個可變區框架糖基化位點以由此消除該位點處之糖基化之取代已眾所周知(例如參見U.S.P.N. 5,714,350及6,350,861)。相反，可藉由在一或多個其他糖基化位點中進行改造來將增強之效應物功能或改良之結合賦予含Fc分子。 其他實施例包含具有經改變糖基化組成之Fc變體，例如具有減小之岩藻糖基殘基量之低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNAc結構之抗體。已證實，該等經改變糖基化模式增加抗體之ADCC能力。可藉由熟習此項技術者已知之任一方法生成經改造糖型，例如藉由使用經改造或變體表現菌株、藉由使用一或多種酶(例如N-乙醯基葡萄糖胺基轉移酶III (GnTIII))共表現、藉由在各種有機體或來自各種有機體之細胞系中表現包括Fc區之分子或藉由在表現包括Fc區之分子之後修飾碳水化合物(例如參見WO 2012/117002)。 4.4.片段 根據本文之教示內容，無論選擇哪種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實踐本發明，應瞭解，可使用其免疫反應性片段(自身或作為抗體藥物偶聯物之一部分)。「抗體片段」包括完整抗體之至少一部分。如本文中所使用，術語抗體分子之「片段」包含抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體中免疫特異性結合所選抗原或其免疫原性決定子或與其反應或與衍生片段之完整抗體競爭特異性抗原結合之多肽片段。 實例性免疫反應性片段包含：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單一結構域抗體片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包括抗體中保留其與抗原/受質或受體相互作用之能力且以類似於完整抗體之方式進行修飾(但可具有略小之效率)之部分。可進一步改造該等抗體片段以包括如本文所闡述之一或多個游離半胱胺酸。 在尤佳實施例中，TNFSF9結合結構域包括scFv構築體。如本文中所使用，「單鏈可變片段(scFv)」意指保留結合至抗原之能力之源自抗體之單鏈多肽。scFv之實例包含藉由重組DNA技術形成且免疫球蛋白重鏈及輕鏈片段之Fv區經由間隔體序列連接之抗體多肽。已知製備scFv之各種方法，且包含U.S.P.N. 4,694,778中所闡述之方法。 在其他實施例中，抗體片段係包括Fc區且保留正常地與存在於完整抗體中之Fc區相關之生物學功能中之至少一者(例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)者。在一實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體類似之單價抗體。舉例而言，此一抗體片段可包括連接至能夠賦予片段活體內穩定性之包括至少一個游離半胱胺酸之Fc序列之抗原結合臂。 如熟習此項技術者所充分認識到，片段可藉由分子改造或經由完整或完全抗體或抗體鏈之化學或酶促處理(例如木瓜酶或胃蛋白酶)或藉由重組方式來獲得。關於抗體片段之更詳細闡述，例如參見Fundamental Immunology, W. E. Paul編輯，Raven Press, N.Y. (1999)。 在所選實施例中，本發明之抗體片段包括可以各種構形使用之ScFv構築體。舉例而言，該抗-TNFSF9 ScFv構築體可用於接受性免疫性基因療法中以治療腫瘤。在某些實施例中，本發明抗體(例如ScFv片段)可用於生成與TNFSF9免疫選擇性反應之嵌合抗原受體(CAR)。根據本發明，抗-TNFSF9 CAR係包括本發明之抗-TNFSF9抗體或其免疫反應性片段(例如ScFv片段)、跨膜結構域及至少一種細胞內結構域之融合蛋白。在某些實施例中，可將經基因改造以表現抗-TNFSF9 CAR之T-細胞、天然殺傷細胞或樹突狀細胞引入患有癌症之個體中以刺激個體之免疫系統特異性靶向表現TNFSF9的腫瘤細胞。在一些實施例中，本發明CAR包括引發一級細胞質信號傳導序列之細胞內結構域，亦即經由T-細胞受體複合物引發抗原依賴性一級活化之序列，例如衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之細胞內結構域。在其他實施例中，本發明CAR包括引發二級或共刺激信號之細胞內結構域，例如衍生自CD2、CD4、CD5、CD8α、CD8β、CD28、CD134、CD137、ICOS、CD154、4-1BB及糖皮質激素誘導之腫瘤壞死因子受體之細胞內結構域(參見U.S.P.N. US/2014/0242701)。 4.5.多價構築體 在其他實施例中，本發明之抗體及偶聯物可為單價或多價(例如雙價、三價等)。如本文中所使用，術語「化合價」係指與抗體有關之潛在靶結合位點之數量。每一靶結合位點特異性結合靶分子或靶分子上之一個具體位置或基因座。在抗體為單價時，分子之每一結合位點特異性結合至單一抗原位置或表位。在抗體包括一個以上靶結合位點(多價)時，每一靶結合位點可特異性結合相同或不同分子(舉例而言，可結合至不同配體或不同抗原或同一抗原上之不同表位或位置)。例如參見U.S.P.N. 2009/0130105。 在一實施例中，抗體係雙特異性抗體，其中兩條鏈具有不同特異性，如Millstein等人，1983,Nature , 305:537-539中所闡述。其他實施例包含具有其他特異性之抗體(例如三特異性抗體)。其他更複雜相容多特異性構築體及其製作方法陳述於以下文獻中：U.S.P.N. 2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology , 121:210；及WO96/27011。 多價抗體可免疫特異性結合至期望靶分子之不同表位或可免疫特異性結合至二靶分子以及異源表位(例如異源多肽或固體載體材料)。儘管所選實施例可僅結合兩種抗原(亦即雙特異性抗體)，但具有其他特異性之抗體(例如三特異性抗體)亦涵蓋於本發明中。雙特異性抗體亦包含交聯或「異源偶聯」抗體。舉例而言，異源偶聯中之一種抗體可偶合至抗生物素蛋白，另一抗體可偶合至生物素。已提出，舉例而言，該等抗體使免疫系統細胞靶向不期望細胞(U.S.P.N. 4,676,980)且可用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異源偶聯抗體可使用任一便利交聯方法製得。適宜交聯劑以及諸多交聯技術在業內已眾所周知，且揭示於U.S.P.N. 4,676,980中。 5.抗體之重組產生 可使用自抗體產生細胞獲得之基因材料及重組技術來產生或修飾抗體及其片段(例如參見；Dubel及Reichert (編輯) (2014)Handbook of Therapeutic Antibodies ，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell (編輯) (2000)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , Wiley, John & Sons, Inc.；及U.S.P.N. 7,709,611)。 本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純淨之形式存在。核酸係在藉由標準技術(包含鹼性/SDS處理、CsCl分級、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內所熟知之其他技術)與其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時「經分離」或使其實質上純。本發明核酸可為(例如) DNA (例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如肽核酸)，而不論係單鏈抑或雙鏈DNA、RNA且可或可不含有內含子。在所選實施例中，核酸係cDNA分子。 本發明核酸可使用標準分子生物學技術獲得。對於由雜交瘤(例如如下文實例中所闡述製備之雜交瘤)表現之抗體，可藉由標準PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體而言，可自該文庫回收編碼該抗體之核酸分子。 編碼VH及VL區段之DNA片段可藉由標準重組DNA技術進一步操縱以(例如)將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段操作性連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，例如抗體恆定區或撓性連接體。如在此上下文中所使用，術語「操作性連接」意指，接合兩個DNA片段，從而由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框內。 可藉由將編碼VH之DNA操作性連接至編碼重鏈恆定區(在IgG1情形下，CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如參見Kabat等人(1991) (上文文獻))，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳係IgG1或IgG4恆定區。實例性IgG1恆定區陳述於SEQ ID NO: 2中。對於Fab片段重鏈基因而言，編碼VH之DNA操作性連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。 可藉由將編碼VL之DNA操作性連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如參見Kabat等人，(1991) (上文文獻))，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳係κ恆定區。實例性相容κ輕鏈恆定區陳述於SEQ ID NO: 5中，而實例性相容λ輕鏈恆定區陳述於SEQ ID NO: 8中。 在每一情形下，VH或VL結構域可操作性連接至其各別恆定區(CH或CL)，其中恆定區係位點特異性恆定區且提供位點特異性抗體。在所選實施例中，所得位點特異性抗體在重鏈上包括兩個未配對半胱胺酸，而在其他實施例中，位點特異性抗體在CL結構域中包括兩個未配對半胱胺酸。 本文涵蓋展現與本發明多肽之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，所衍生人類化抗體VH或VL結構域可與源(例如鼠類)或受體(例如人類) VH或VL結構域展現序列類似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%之序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%之序列一致性。如本文中所使用，兩個胺基酸序列之間之同源性%等效於兩個序列之間之一致性%。考慮為達成兩個序列最佳比對而需要引入之間隙數及各間隙長度，兩個序列之間之一致性百分比隨該等序列共有之一致位置數而變化(亦即同源性% = 一致位置數/總位置數乘以100)。兩個序列之間之序列對比及一致性百分比測定可使用數學算法來完成，如下文非限制性實例中所闡述。 兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E. Meyers及W. Miller之演算法(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988))、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970))演算法、使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。 另外或或者，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序列」來實施針對公共資料庫之檢索以(例如)鑑別相關序列。該等檢索可使用Altschul等人(1990)J. Mol. Biol. 215:403-10之XBLAST程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白質檢索可使用XBLAST程式、評分=50、字長=3來實施以獲得與本發明之抗體分子同源之胺基酸序列。為獲得空位比對用於對比目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402中所闡述使用空位BLAST。在使用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之缺省參數。 不一致之殘基位置可因保守胺基酸取代或不保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係胺基酸殘基經具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代將不實質上改變蛋白質之功能性質。倘若兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同，則可向上調節序列一致性百分比或類似性程度以校正取代之保守性質。倘若使用不保守胺基酸取代，則在實施例中，展現序列一致性之多肽將保留本發明多肽(例如抗體)之期望功能或活性。 本文亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之核酸。「同源序列」意指展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參考核酸93%、95%或98%之序列一致性。 本發明亦提供包括該等上述核酸之載體，該等載體可可操作地連接至啟動子(例如參見 WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N. 5,122,464)；及真核分泌路徑之其他轉錄調控及處理控制元件。本發明亦提供具有彼等載體及宿主表現系統之宿主細胞。 如本文中所使用，術語「宿主表現系統」包含可經改造以生成本發明之核酸或多肽及抗體之任一種類細胞系統。該等宿主表現系統包含(但不限於)使用重組細菌噬菌體DNA或質體DNA轉變或轉染之微生物(例如大腸桿菌(E. coli)或枯草芽胞桿菌(B. subtilis) )；使用重組酵母表現載體轉染之酵母(例如酵母菌屬(Saccharomyces ))；或具有含有衍生自哺乳動物細胞或病毒之基因體之啟動子(例如腺病毒晚期啟動子)之重組表現構築體的哺乳動物細胞(例如COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)。可使用兩種表現載體(例如編碼重鏈源多肽之第一載體及編碼輕鏈源多肽之第二載體)共轉染宿主細胞。 轉變哺乳動物細胞之方法在業內已眾所周知。例如參見U.S.P.N. 4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。亦可改造宿主細胞以容許產生具有各種特性之抗原結合分子(例如具有GnTIII活性之經修飾糖型或蛋白質)。 對於重組蛋白之長期、高產率產生而言，穩定表現係較佳的。因此，可使用業內認可之標準技術來改造穩定表現所選抗體之細胞系且形成本發明之一部分。不使用含有複製之病毒源之表現載體，可使用藉由適當表現控制元件(例如啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多聚腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選標記物來轉變宿主細胞。可使用業內熟知之任一選擇系統，包含麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供用於在所選條件下增強表現之有效方式。結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N. 5,591,639及5,879,936完全或部分地論述GS系統。用於研發穩定細胞系之另一相容表現系統係Freedom™ CHO-S套組(Life Technologies)。 在藉由重組表現或任一其他所揭示技術產生本發明抗體後，可立即藉由業內已知方法加以純化或分離，其中予以鑑別且自其天然環境分離及/或回收並與干擾抗體或相關ADC之診斷或治療應用之污染物分離。所分離抗體包含重組細胞內之原位抗體。 可使用各種業內公認技術(例如離子交換及粒徑篩析層析、透析、滲濾及親和力層析、尤其蛋白質A或蛋白質G親和力層析)來純化該等所分離製劑。相容方法更全面地論述於下文實例中。 6.產生後選擇 無論如何獲得，皆可選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤、酵母菌落等)之期望特性，包含(例如)穩健生長、高抗體產生及期望抗體特性(例如對所關注抗原之高親和力)。雜交瘤可在細胞培養物中進行活體外擴增或在同基因免疫受損動物中進行活體內擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤及/或菌落之方法為熟習此項技術者已知。在鑑別出期望抗體後，可立即使用常用業內公認分子生物學及生物化學技術分離、操縱及表現相關遺傳材料。 由原始文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力(Ka 約為106 M-1 至107 M-1 )。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如藉由使用易錯聚合酶在活體外引入隨機突變)及自彼等二級文庫重新選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母展示)在活體外模擬親和力成熟。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。 可使用各種技術來選擇抗體，包含(但不限於)噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，使用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並自可獲得抗體或免疫反應性片段者分離結合該抗原之噬菌體或酵母(Vaughan等人，1996, PMID: 9630891；Sheets等人，1998, PMID: 9600934；Boder等人，1997, PMID: 9181578；Pepper等人，2008, PMID: 18336206)。用於產生噬菌體或酵母展示文庫之套組市面有售。業內亦存在可用於產生及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(參見U.S.P.N. 5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991, PMID: 1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供序列之相對較容易之操縱(例如藉由重組改組)。IV. 抗體特性 在某些實施例中，可選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤或酵母菌落)之有利性質，包含(例如)穩健生長、高抗體產生及如下文更詳細論述之期望位點特異性抗體特性。在其他情形下，可藉由選擇用於接種動物之特定抗原(例如特異性TNFSF9同種型)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體之特性。在其他實施例中，所選抗體可如上文所闡述經改造以增強或精修諸如親和力或藥物動力學等免疫化學特性。 A.中和抗體 在所選實施例中，本發明抗體可為「拮抗劑」或「中和」抗體，此意味著，抗體可與決定子締合且直接或藉由防止決定子與結合配偶體(例如配體或受體)之締合來阻斷或抑制該決定子之活性，由此中斷原本源自分子之相互作用之生物反應。在過量中和或拮抗劑抗體將結合至決定子之結合配偶體之量減小至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更高時，該抗體實質上抑制決定子至其配體或受質之結合，如(例如)藉由靶分子活性或在活體外競爭性結合分析中所量測。應瞭解，經修飾活性可使用業內公認技術直接量測或可藉由改變之活性對下游(例如腫瘤形成或細胞存活)之影響來量測。此更直接顯示於下文實例15中，其中本發明抗體展示會調節TNFSF9配體與其受體TNFRSF9之相互作用(亦即「TNFSF9/TNFRSF9相互作用」)。 B.內化抗體 在某些實施例中，抗體可包括內化抗體，從而抗體結合至決定子且內化(與任一偶聯醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包含致瘤細胞)中。內化抗體分子之數量可足以殺滅抗原表現細胞、尤其抗原表現致瘤細胞。端視抗體或在一些情況下抗體藥物偶聯物之功效，單一抗體分子攝取至細胞中可足以殺滅抗體所結合之靶細胞。就本發明而言，有證據表明，實質性部分之經表現TNFSF9蛋白保持與致瘤細胞表面締合，由此使得所揭示抗體或ADC發生局部化及內化。在所選實施例中，該等抗體與一或多種在內化後殺滅細胞之藥物締合或偶聯。在一些實施例中，本發明ADC包括內化位點特異性ADC。 如本文中所使用，「內化」抗體係在結合至相關決定子後由靶細胞吸收者(與任一偶聯細胞毒素一起)。該等內化ADC之數量較佳地足以殺滅決定子表現細胞、尤其表現決定子之癌症幹細胞。端視細胞毒素或ADC之整體功效，在一些情況下，少量抗體分子攝取至細胞中足以殺滅抗體結合之靶細胞。舉例而言，某些藥物(例如PBD或卡奇黴素)較為強力，從而偶聯至抗體之少量毒素分子之內化足以殺滅靶細胞。可藉由各種業內公認分析(例如肥皂草毒素分析，例如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting Systems) (包含闡述於下文實例中者)來測定抗體在結合至哺乳動物細胞後是否內化。檢測抗體是否內化至細胞中之方法亦闡述於U.S.P.N. 7,619,068中。 C.消耗抗體 在其他實施例中，本發明抗體係消耗抗體。術語「消耗」抗體係指較佳地結合細胞表面上或靠近細胞表面之抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如藉由CDC、ADCC或藉由引入細胞毒性劑)之抗體。在實施例中，所選消耗抗體將偶聯至細胞毒素。 較佳地，消耗抗體能夠殺滅所定義細胞群體中之至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之TNFSF9表現細胞。本文所用之術語「表觀IC50」係指連接至毒素之一級抗體殺滅50%表現由一級抗體所識別抗原之細胞的濃度。毒素可直接偶聯至一級抗體，或可經由識別一級抗體之二級抗體或抗體片段與一級抗體締合，且該二級抗體或抗體片段直接偶聯至毒素。較佳地，消耗抗體之IC50小於5 μM、小於1 μM、小於100 nM、小於50 nM、小於30 nM、小於20 nM、小於10 nM、小於5 nM、小於2 nM或小於1 nM。在一些實施例中，細胞群體可包括富集、切片、純化或分離之致瘤細胞，包含癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包括全腫瘤試樣或包括癌症幹細胞之異質腫瘤萃取物。根據本文之教示內容，可使用標準生物化學技術來監測及量化致瘤細胞之消耗。 D.結合親和力 本文揭示對特定決定子(例如TNFSF9)具有高結合親和力之抗體。術語「KD 」係指特定抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。本發明抗體在解離常數KD (k解離 /k締合 ) ≤ 10-7 M時可免疫特異性結合其靶抗原。抗體在KD ≤ 5×10-9 M時以高親和力特異性結合抗原，且在KD ≤ 5×10-10 M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一實施例中，抗體具有≤ 10-9 M之KD 及約1×10-4 /sec之解離速率。在本發明之一實施例中，解離速率＜ 1×10-5 /sec。在本發明之其他實施例中，抗體以介於約10-7 M與10-10 M之間之KD 結合至決定子，且在又一實施例中，其以≤ 2×10-10 M之KD 結合至決定子。本發明之其他所選實施例包括KD (k解離 /k締合 )小於10-6 M、小於5×10-6 M、小於10-7 M、小於5×10-7 M、小於10-8 M、小於5×10-8 M、小於10-9 M、小於5×10-9 M、小於10-10 M、小於5×10-10 M、小於10-11 M、小於5×10-11 M、小於10-12 M、小於5×10-12 M、小於10-13 M、小於5×10-13 M、 小於10-14 M、小於5×10-14 M、小於10-15 M或小於5×10-15 M之抗體。 在某些實施例中，免疫特異性結合決定子(例如TNFSF9)之本發明抗體可具有至少105 M-l s-l 、至少2×105 M-l s-l 、至少5×105 M-l s-l 、至少106 M-l s-l 、 至少5×106 M-l s-l 、至少107 M-l s-l 、至少5×107 M-l s-l 或至少108 M-l s-l 之締合速率常數或k 締合 (或ka ) 速率(抗體+抗原(Ag)k 締合 ←抗體-Ag)。 在另一實施例中，免疫特異性結合決定子(例如TNFSF9)之本發明抗體可具有小於l0-l s- l 、小於5×l0-l s- l 、小於l0-2 s- l 、小於5×l0-2 s- l 、小於l0-3 s- l 、小於5×l0-3 s- l 、小於l0-4 s- l 、小於5×l04 s- l 、小於l0-5 s- l 、小於5×l0-5 s- l 、小於l0-6 s- l 、小於5×l0-6 s- l 、小於l0-7 s- l 、小於5×l0-7 s- l 、小於l0-8 s- l 、小於5×l0-8 s- l 、小於l0-9 s- l 、小於5×l0-9 s- l 或小於l0-10 s- l 之解離速率常數或k 解離 (或kd ) 速率(抗體+抗原(Ag)k 解離 ←抗體-Ag)。 結合親和力可使用業內已知之各種技術來測定，例如表面電漿共振、生物層干涉術、雙極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱、ELISA、分析超速離心及流式細胞術。 E.分倉及表位定位 可針對所締合之離散表位來表徵本文所揭示之抗體。「表位」係決定子中為抗體或免疫反應性片段所特異性結合之部分。可基於結合親和力(如上所述)或藉由抗體對蛋白質及/或大分子之複雜混合物中之其靶抗原之優先識別(例如在競爭分析中)來證實及定義免疫特異性結合。「線性表位」係藉由抗原中容許免疫特異性結合抗體之鄰接胺基酸所形成。即使在抗原變性時，通常亦維持優先結合線性表位之能力。相反，「構象表位」通常包括抗原胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構之背景中，該等非鄰接胺基酸足以近似為同時由單一抗體結合。在具有構象表位之抗原發生變性時，抗體通常不再識別抗原。表位(鄰接或非鄰接)通常包含至少3個及更通常至少5個或8-10個或12-20個呈獨特空間構象之胺基酸。 亦可針對本發明抗體所屬之組或「倉」來對其進行表徵。「分倉」係指使用競爭性抗體結合分析來鑑別不能同時結合免疫原性決定子之抗體對，由此鑑別「競爭」結合之抗體。可藉由所測試抗體或免疫學功能片段防止或抑制參考抗體至公用抗原之特異性結合之分析來測定競爭抗體。通常，此一分析涉及結合至固體表面或細胞、未經標記之測試抗體及經標記參考抗體之經純化抗原(例如TNFSF9或結構域或其片段)之使用。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。關於測定競爭性結合之方法之其他細節提供於本文實例中。通常，在存在過量競爭性抗體時，其將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之參考抗體與公用抗原之特異性結合。在一些情況下，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。相反，在結合參考抗體時，其較佳將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之隨後添加之測試抗體(亦即TNFSF9抗體)之結合。在一些情況下，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之測試抗體之結合。 通常，分倉或競爭性結合可使用各種業內公認技術來測定，例如免疫分析，例如西方印漬(western blot)、放射性免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析係常規的且為業內所熟知(參見Ausubel等人編輯(1994)Current Protocols in Molecular Biology ，第1卷，John Wiley & Son, Inc., New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(例如參見WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)Antibodies, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory， Harlow及David Lane編輯)。 用於測定競爭性抑制(且因此「倉」)之其他技術包含：表面電漿共振，其使用例如BIAcore™ 2000系統(GE Healthcare)；生物層干涉術，其使用(例如) ForteBio® Octet RED (ForteBio)；或流式細胞術珠粒陣列，其使用例如FACSCanto II (BD Biosciences)或多倍體LUMINEX™檢測分析(Luminex)。 Luminex係使得能夠進行大規模多倍體抗體配對之基於珠粒之免疫分析平臺。該分析比較抗體對與靶抗原之同時結合模式。該對之一種抗體(捕獲mAb)結合至Luminex珠粒，其中每一捕獲mAb結合至不同顏色之珠粒。另一抗體(檢測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析分析抗體與抗原之同時結合(配對)且將具有相似配對特徵之抗體分組在一起。檢測mAb及捕獲mAb之類似特徵指示，兩種抗體結合至相同或密切相關之表位。在一實施例中，可使用皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient)測定配對特徵以鑑別與所測試抗體組中之任一特定抗體最密切相關之抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/檢測mAb經測定與參考/捕獲mAb在同一倉中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之數據之其他方法闡述於U.S.P.N. 8,568,992中。Luminex分析100種不同類型之珠粒(或更多)之能力同時提供幾乎無限之抗原及/或抗體表面，從而在抗體表位剖析中產生與生物感測器分析相比經改良之通量及解析度(Miller等人，2011, PMID: 21223970)。 包括表面電漿共振之類似分倉技術與本發明相容。如本文中所使用，「表面電漿共振」係指容許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化分析實時特異性相互作用之光學現象。使用市售設備(例如BIAcore™ 2000系統)，可易於測定所選抗體是否彼此競爭結合至所定義抗原。 在其他實施例中，可用於測定測試抗體是否與參考抗體「競爭」結合之技術係「生物層干涉術」，其係一種分析自以下兩個表面反射之白光之干涉圖案的光學分析技術：生物感測器尖端上之固定蛋白質層及內部參考層。結合至生物感測器尖端之分子之任何數量變化使得可實時量測之干涉圖案發生移位。該等生物層干涉術分析可使用ForteBio® Octet RED機器如下實施。將參考抗體(Ab1)捕獲至抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度之非結合抗體封阻晶片且收集基線。然後藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體重組靶蛋白，且將尖端浸泡至含有與對照相同之抗體(Ab1)之孔中或浸泡至含有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若如藉由比較與對照Ab1之結合量所測定未發生進一步結合，則Ab1及Ab2經測定為「競爭性」抗體。若使用Ab2觀察到額外結合，則Ab1及Ab2經測定不彼此競爭。可擴大此過程以使用96孔板中代表獨特倉之一整列抗體篩選獨特抗體之大文庫。在實施例中，若參考抗體抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之測試抗體與公用抗原之特異性結合，則測試抗體將與參考抗體競爭。在其他實施例中，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更多之結合。 在定義涵蓋一組競爭性抗體之倉後，可立即實施進一步表徵以確定抗原上抗體組所結合之特異性結構域或表位。可使用Cochran等人，2004, PMID: 15099763所闡述方案之修改來實施結構域層級表位定位。精細表位定位係確定抗原上包括抗體所結合之決定子表位之特定胺基酸的過程。 在某些實施例中，可使用噬菌體或酵母展示來實施精細表位定位。其他相容表位定位技術包含丙胺酸掃描突變體、肽印漬(Reineke, 2004, PMID: 14970513)或肽裂解分析。另外，可採用諸如表位切除、表位提取及抗原化學修飾等方法(Tomer, 2000, PMID: 10752610)，其使用：酶，例如蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、內蛋白酶Glu-C、內蛋白酶Asp-N胰、凝乳蛋白酶等)；化學試劑，例如琥珀醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及碳醯肼、游離胺基酸等。在另一實施例中，可使用修飾輔助剖析(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(ASAP))根據每一抗體至經化學或酶促修飾之抗原表面的結合特徵之相似性來分類針對同一抗原之大量單株抗體(U.S.P.N. 2004/0101920)。 在確定抗原上之期望表位後，可立即(例如)藉由使用本文所闡述之技術使用包括所選表位之肽實施免疫來產生針對該表位之其他抗體。 V.抗體偶聯物 在一些實施例中，本發明抗體可與醫藥活性或診斷部分偶聯以形成「抗體藥物偶聯物」 (ADC)或「抗體偶聯物」。術語「偶聯物」係廣泛使用且意指任一醫藥活性或診斷部分與本發明抗體之共價或非共價締合(不論何種締合方法)。在某些實施例中，經由抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基來實現締合。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸偶聯至抗體。所揭示ADC可用於治療及診斷目的。 可使用本發明ADC將細胞毒素或其他有效載物遞送至靶位置(例如致瘤細胞及/或表現TNFSF9之細胞)。如本文所陳述，術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且意指生物活性或可檢測分子或藥物(包含如下文所闡述之抗癌藥或細胞毒素)。「有效載物」包括「藥物」或「彈頭」，可與可選連接體化合物之組合。偶聯物上之彈頭可包括在活體內代謝成活性劑之肽、蛋白質或前藥、聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在一較佳實施例中，在釋放及活化彈頭(例如如本文所揭示之PBDS 1-5)之前，所揭示ADC將所結合有效載物以相對無反應性、無毒狀態引導至靶位點。較佳地經由有效載物(例如經由抗體上之一或多個半胱胺酸)及最小化過度偶聯毒性ADC物質之ADC製劑之相對均質組合物之穩定偶聯來達成彈頭的此靶向釋放。在與經設計以在遞送至腫瘤位點後大量釋放彈頭之藥物連接體偶合下，本發明偶聯物可實質上減小不期望非特異性毒性。此有利地在腫瘤位點處提供相對較高含量之活性細胞毒素，同時最小化非靶向細胞及組織之暴露，由此提供增強之治療指數。 應瞭解，儘管本發明之一些實施例包括納入治療部分(例如細胞毒素)之有效載物，但納入診斷劑及生物相容修飾劑之其他有效載物可受益於由所揭示偶聯物提供之靶向釋放。因此，除非上下文另外指示，否則涉及實例性治療有效載物之任一揭示內容亦適用於如本文所論述包括診斷劑或生物相容修飾劑之有效載物。所選有效載物可以共價方式或非共價方式連接至抗體且至少部分地端視用於實現偶聯之方法而展現不同化學計量莫耳比率。 本發明偶聯物通常可由下式代表： Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中： a) Ab包括抗-TNFSF9抗體； b) L包括可選連接體； c) D包括藥物；且 d) n係約1至約20之整數。 熟習此項技術者應瞭解，上文所提及之式之偶聯物可使用諸多不同連接體及藥物來製作且偶聯方法端視所選組份而有所變化。因此，與所揭示抗體之反應性殘基(例如半胱胺酸或離胺酸)締合之任一藥物或藥物連接體化合物皆與本文之教示內容相容。類似地，容許所選藥物偶聯(包含位點特異性偶聯)至抗體之任一反應條件皆屬本發明範圍內。儘管具有前述內容，但本發明之一些較佳實施例包括使用如本文所闡述穩定劑與溫和還原劑之組合將藥物或藥物連接體選擇性偶聯至游離半胱胺酸。該等反應條件往往提供具有較少非特異性偶聯及污染物及相應地較小毒性之較均質製劑。 A.彈頭 1.治療劑 本發明抗體可偶聯、連接或融合至醫藥活性部分或以其他方式與其締合，該醫藥活性部分係治療部分或藥物，例如抗癌劑，包含(但不限於)細胞毒性劑(或細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射治療劑、靶定抗癌劑、生物反應修飾劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。 實例性抗癌劑或細胞毒素(包含其同系物及衍生物)包括1-去氫睪甾酮(1-dehydrotestosterone)、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素D (actinomycin D)、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包含 n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素B (cytochalasin B)、更生黴素(dactinomycin) (舊稱放線菌素)、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、多卡米星、吐根素(emetine)、表柔比星(epirubicin)、溴乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌素D (gramicidin D)、利多卡因(lidocaine)、類美登素(例如DM-1及DM-4 (Immunogen))、苯并二氮呯衍生物(Immunogen)、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 其他相容細胞毒素包括多拉斯他汀及奧裡斯他汀(包含單甲基奧裡斯他汀E (MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F (MMAF) (Seattle Genetics))、瓢菌素(例如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma))、DNA小溝結合劑(例如多卡米星衍生物(Syntarga))、烷基化劑(例如改質或二聚體吡咯并苯并二氮呯(PBD)、氮芥(mechlorethamine)、塞替派(thioepa)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine) (BCNU)、洛莫司汀(lomustine) (CCNU)、環磷醯胺、白消安、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II) (DDP)順鉑(cisplatin))、剪接抑制劑(例如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如FR901464，如U.S.P.N. 7,825,267中所陳述))、管式結合劑(例如埃博黴素(epothilone)類似物及微管溶素(tubulysin))、太平洋紫杉醇及DNA損害劑（例如卡奇黴素及埃斯培拉黴素(esperamicin)）、抗代謝物(例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(5-fluorouracil decarbazine))、抗有絲分裂劑(例如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine))及蒽環黴素(anthracycline) (例如柔紅黴素(daunorubicin) (舊稱道諾黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 在所選實施例中，本發明抗體可與抗CD3結合分子締合以募集細胞毒性T-細胞且使其靶向致瘤細胞(BiTE technology；例如參見Fuhrmann等人(2010) Annual Meeting of AACR文摘號5625)。 在其他實施例中，本發明ADC可包括細胞毒素(包括使用適當連接體偶聯之治療性放射性同位素)。可與該等實施例相容之實例性放射性同位素包含(但不限於)碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、銅(62 Cu、64 Cu、67 Cu)、硫(35 S)、鐳(223 R)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In、111 In)、鉍(212 Bi、213 Bi)、鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn、117 Sn、76 Br、211 At及225 Ac。其他放射性核素亦可用作診斷劑及治療劑，尤其在60 keV至4,000 keV之能量範圍內者。 在其他所選實施例中，本發明ADC偶聯至細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭。可偶聯至所揭示抗體之相容苯并二氮呯衍生物(及可選連接體)闡述於(例如) U.S.P.N. 8,426,402及PCT文檔WO2012/128868及WO2014/031566中。對於PBD而言，據信，相容苯并二氮呯衍生物結合於DNA之小溝中且抑制核酸合成。據報導，該等化合物具有強力抗腫瘤性質且因此尤其適用於本發明ADC中。 在一些實施例中，本發明ADC可包括PBD及其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物作為彈頭。PBD係藉由以共價方式結合至小溝中之DNA且抑制核酸合成來施加抗腫瘤活性之烷基化劑。PBD已展示具有強力抗腫瘤性質，而展現最小骨髓抑制。與本發明相容之PBD可使用若干類連接體(例如包括具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至抗體且在某些實施例中呈二聚體形式(亦即PBD二聚體)。可偶聯至所揭示抗體之相容PBD (及可選連接體)闡述於(例如)U.S.P.N. 6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157及PCT文檔WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。與本發明相容之PBD化合物之實例更詳細緊接論述於下文中。 就本發明而言，PBD已展示具有強力抗腫瘤性質，而展現最小骨髓抑制。與本發明相容之PBD可使用若干類型連接體中之任一者(例如包括具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至TNFSF9靶向劑且在某些實施例中呈二聚體形式(亦即PBD二聚體)。PBD具有以下一般結構：其取代基之數量、類型及位置、其芳香族A環及吡咯并C環及其C環之飽和程度有所相同。在B環中，一般在N10-C11位置存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，其係負責烷基化DNA之親電子中心。所有已知天然產物皆在對掌性C11a位置具有(S )-構形，此在自C環朝向A環察看時為其提供右撚。此賦予其適當三維形狀以與B型DNA之小溝具有等螺旋形，從而在結合位點處獲得滑動配合(Kohn, InAntibiotics III . Springer-Verlag, New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc. Chem. Res. ,19 , 230-237 (1986))。其在小溝中形成結合物之能力使得其能夠干擾DNA處理且用作細胞毒性劑。如上文所提及，為增加功效，通常使用二聚體形式之PBD，其可偶聯至如本文所闡述之抗-TNFSF9抗體。 在本發明之某些實施例中，可偶聯至所揭示調節劑之相容PBD闡述於U.S.P.N. 2011/0256157中。本發明提供展示為具有某些有利性質之PBD二聚體(亦即包括兩個PBD部分者)。就此而言，本發明之所選ADC包括具有式(AB)或(AC)之PBD毒素：其中： 虛線指示視情況存在於C1與C2或C2與C3之間之雙鍵； R2 獨立地選自H、OH、=O、=CH2 、CN、R、OR、=CH-RD 、=C(RD )2 、O-SO2 -R、CO2 R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基； 其中RD 獨立地選自R、CO2 R、COR、CHO、CO2 H及鹵基； R6 及R9 獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR′、NO2 、Me3 Sn及鹵基； R7 獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NHRR′、NO2 、Me3 Sn及鹵基； R10 係連結至如本文所闡述之TNFSF9抗體或其片段或衍生物之連接體； Q獨立地選自O、S及NH； R11 係H或R，或其中Q係O，R11 可為SO3 M，其中M係金屬陽離子； X係選自O、S或N(H)且在所選實施例中包括O； R''係C3-12 伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)； R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12 烷基、C3-20 雜環基及C5-20 芳基，且視情況對於基團NRR’而言，R及R’與其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環；且 其中R2" 、R6" 、R7" 、R9" 、X''、Q''及R11" (若存在)分別係如根據R2 、R6 、R7 、R9 、X、Q及R11 所定義，且RC 係封端基團。 包括上文所提及之結構之所選實施例更詳細緊接闡述於下文中。雙鍵 在一實施例中，在C1與C2及C2與C3之間不存在雙鍵。 在一實施例中，虛線指示視情況存在於C2與C3之間之雙鍵，如下文所展示：。 在一實施例中，在R2 係C5-20 芳基或C1-12 烷基時，雙鍵存在於C2與C3之間。在一較佳實施例中，R2 包括甲基。 在一實施例中，虛線指示視情況存在於C1與C2之間之雙鍵，如下文所展示：。 在一實施例中，在R2 係C5-20 芳基或C1-12 烷基時，雙鍵存在於C1與C2之間。在一較佳實施例中，R2 包括甲基。R2 在一實施例中，R2 獨立地選自H、OH、=O、=CH2 、CN、R、OR、=CH-RD 、=C(RD )2 、O-SO2 -R、CO2 R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。 在一實施例中，R2 獨立地選自H、OH、=O、=CH2 、CN、R、OR、=CH-RD 、=C(RD )2 、O-SO2 -R、CO2 R及COR。 在一實施例中，R2 獨立地選自H、=O、=CH2 、R、=CH-RD 及=C(RD )2 。 在一實施例中，R2 獨立地係H。 在一實施例中，R2 獨立地係R，其中R包括CH3 。 在一實施例中，R2 獨立地係=O。 在一實施例中，R2 獨立地係=CH2 。 在一實施例中，R2 獨立地係=CH-RD 。在PBD化合物內，基團=CH-RD 可具有下文所展示之任一構形：在一實施例中，構形係構形(I)。 在一實施例中，R2 獨立地係=C(RD )2 。 在一實施例中，R2 獨立地係=CF2 。 在一實施例中，R2 獨立地係R。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之C5-20 芳基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之C1-12 烷基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之C5-20 芳基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之C5-7 芳基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之C8-10 芳基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之苯基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之萘基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之吡啶基。 在一實施例中，R2 獨立地係視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。 在一實施例中，R2 具有一至三個取代基，其中1及2個更佳，且單一取代基團最佳。取代基可位於任一位置。 在R2 係C5-7 芳基之情形下，單一取代基較佳地位於不毗鄰至化合物之其餘部分之鍵之環原子上，亦即，其較佳地相對於至化合物之其餘部分之鍵位於β或 γ位置。因此，在C5-7 芳基係苯基之情形下，取代基較佳地位於間位或對位，且更佳地位於對位。 在一實施例中，R2 係選自：其中星號指示附接點。 在R2 係C8-10 芳基(例如喹啉基或異喹啉基)之情形下，其可在喹啉或異喹啉環之任一位置具有任一數量之取代基。在一些實施例中，其具有一個、兩個或三個取代基，且該等取代基可位於近端環及遠端環或二者上(若存在一個以上取代基)。 在一實施例中，在R2 視情況經取代之情形下，取代基係選自彼等在下文取代基部分中給出之取代基。 在R視情況經取代之情形下，取代基較佳地選自： 鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯基氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰基氧基、脲基、硝基、氰基及硫代醚。 在一實施例中，在R或R2 視情況經取代之情形下，取代基係選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR’、NO2 、鹵基、CO2 R、COR、CONH2 、CONHR及CONRR’。 在R2 係C1-12 烷基之情形下，可選取代基可進一步包含C3-20 雜環基及C5-20 芳基。 在R2 係C3-20 雜環基之情形下，可選取代基可進一步包含C1-12 烷基及C5-20 芳基。 在R2 係C5-20 芳基之情形下，可選取代基可進一步包含C3-20 雜環基及C1-12 烷基。 應理解，術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，在R2 係視情況經取代之C1-12 烷基之情形下，應理解，烷基視情況含有一或多個碳-碳雙鍵或三鍵，該等碳-碳雙鍵或三鍵可形成偶聯系統之一部分。在一實施例中，視情況經取代之C1-12 烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或三鍵，且此鍵與存在於C1與C2或C2與C3之間之雙鍵偶聯。在一實施例中，C1-12 烷基係選自飽和C1-12 烷基、C2-12 烯基、C2-12 炔基及C3-12 環烷基之基團。 若R2 上之取代基係鹵基，則其較佳係F或Cl，更佳係Cl。 若R2 上之取代基係醚，則其可在一些實施例中係烷氧基(例如C1-7 烷氧基(例如甲氧基、乙氧基))或其可在一些實施例中係C5-7 芳基氧基(例如苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基)。 若R2 上之取代基係C1-7 烷基，則其可較佳係C1-4 烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。 若R2 上之取代基係C3-7 雜環基，則其可在一些實施例中係C6 含氮雜環基，例如嗎啉基、硫嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基。該等基團可經由氮原子結合至PBD部分之其餘部分。該等基團可進一步經(例如) C1-4 烷基取代。 若R2 上之取代基係雙-氧基-C1-3 伸烷基，則此較佳係雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸乙基。 用於R2 之尤佳取代基包含甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-六氫吡嗪基、嗎啉基及甲基-噻吩基。 尤佳經取代R2 基團包含(但不限於) 4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。 在一實施例中，R2 係鹵基或二鹵基。在一實施例中，R2 係-F或-F2 ，該等取代基在下文中分別闡釋為(III)及(IV)： RD 在一實施例中，RD 獨立地選自R、CO2 R、COR、CHO、CO2 H及鹵基。 在一實施例中，RD 獨立地係R。 在一實施例中，RD 獨立地係鹵基。R6 在一實施例中，R6 獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR’、NO2 、Me3 Sn-及鹵基。 在一實施例中，R6 獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2 、NO2 及鹵基。 在一實施例中，R6 獨立地選自H及鹵基。 在一實施例中，R6 獨立地係H。 在一實施例中，R6 及R7 一起形成基團-O-(CH2 )p -O-，其中p係1或2。R7 R7 獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NHRR′、NO2 、Me3 Sn及鹵基。 在一實施例中，R7 獨立地係OR。 在一實施例中，R7 獨立地係OR7A ，其中R7A 獨立地係視情況經取代之C1-6 烷基。 在一實施例中，R7A 獨立地係視情況經取代之飽和C1-6 烷基。 在一實施例中，R7A 獨立地係視情況經取代之C2-4 烯基。 在一實施例中，R7A 獨立地係Me。 在一實施例中，R7A 獨立地係CH2 Ph。 在一實施例中，R7A 獨立地係烯丙基。 在一實施例中，化合物係二聚體，其中每一單體之R7 基團一起形成具有式X-R″-X且連接單體之二聚體橋。R9 在一實施例中，R9 獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2 、NHR、NRR’、NO2 、Me3 Sn-及鹵基。 在一實施例中，R9 獨立地係H。 在一實施例中，R9 獨立地係R或OR。R10 較佳地，相容連接體(例如本文所闡述之彼等)經由R10 位置(亦即N10)之共價鍵將TNFSF9抗體附接至PBD藥物部分。Q 在某些實施例中，Q獨立地選自O、S及NH。 在一實施例中，Q獨立地係O。 在一實施例中，Q獨立地係S。 在一實施例中，Q獨立地係NH。R11 在所選實施例中，R11 係H或R或(其中Q係O)可為SO3 M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+ 。 在某些實施例中，R11 係H。 在某些實施例中，R11 係R。 在某些實施例中，其中Q係O，R11 係SO3 M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+ 。 在Q係O之某些實施例中，R11 係H。 在Q係O之某些實施例中，R11 係R。X 在一實施例中，X係選自O、S或N(H)。 較佳地，X係O。R '' R''係C3-12 伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)。 在一實施例中，R''係C3-12 伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。 在一實施例中，伸烷基視情況間雜有一或多個選自O、S及NMe之雜原子及/或芳香族環，該等環視情況經取代。 在一實施例中，芳香族環係C5-20 伸芳基，其中伸芳基係關於藉由自芳香族化合物之兩個芳香族環原子去除兩個氫原子而獲得之二價部分，該部分具有5至20個環原子。 在一實施例中，R''係C3-12 伸烷基，該鏈可間雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶，該等環視情況經NH2 取代)。 在一實施例中，R''係C3-12 伸烷基。 在一實施例中，R''係選自C3 、C5 、C7 、C9 及C11 伸烷基。 在一實施例中，R''係選自C3 、C5 及C7 伸烷基。 在一實施例中，R''係選自C3 及C5 伸烷基。 在一實施例中，R''係C3 伸烷基。 在一實施例中，R''係C5 伸烷基。 上文所列示之伸烷基可視情況間雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶，該等環視情況經取代)。 上文所列示之伸烷基可視情況間雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。 上文所列示之伸烷基可為未經取代之直鏈脂肪族伸烷基。R 及 R’ 在一實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12 烷基、C3-20 雜環基及C5-20 芳基。 在一實施例中，R獨立地係視情況經取代之C1-12 烷基。 在一實施例中，R獨立地係視情況經取代之C3-20 雜環基。 在一實施例中，R獨立地係視情況經取代之C5-20 芳基。 上文針對R2 闡述關於較佳烷基及芳基及可選取代基之身份及數量之各種實施例。在R2 適用於R時針對R2 所陳述之優先性在適當時(例如在R6 、R7 、R8 或R9 係R時)適用於所有其他基團R。 用於R之優選者亦適用於R’。 在本發明之一些實施例中，提供具有取代基-NRR’之化合物。在一實施例中，R及R’與其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4-、5-、6-或7員雜環。環可含有另一雜原子，例如N、O或S。 在一實施例中，雜環自身經基團R取代。在存在另一N雜原子之情形下，取代基可位於N雜原子上。 除上文所提及之PBD外，某些二聚體PBD已展示尤其有效且可與本發明聯合使用。為此，本發明之抗體藥物偶聯物(亦即如本文所揭示之ADC 1 - 6)可包括下文緊接陳述為PBD 1 - 5之PBD化合物。應注意，下文之PBD 1-5包括在分離連接體(例如更詳細闡述於本文中者)後釋放之細胞毒性彈頭。作為藥物-連接體化合物之組份之PBD 1 - 5中之每一者的合成較詳細呈現於WO 2014/130879中，該案件關於該合成以引用方式併入本文中。鑒於WO 2014/130879，可包括本發明ADC之所選彈頭之細胞毒性化合物可易於生成且如本文所陳述來採用。因此，在與連接體分離後可自所揭示ADC釋放之所選PBD化合物緊接陳述於下文中：,,,及應瞭解，上文所提及之二聚體PBD彈頭中之每一者較佳地在由靶細胞內化且破壞連接體後釋放。如下文更詳細所闡述，某些連接體包括可納入自消性部分之可裂解連接體，該自消性部分容許釋放活性PBD彈頭且不會保留連接體之任一部分。在釋放後，PBD彈頭然後將結合靶細胞之DNA且與其交聯。據報導，該結合阻斷靶癌細胞之分裂且不會扭曲其DNA螺旋，由此潛在避免了突發藥物抗性之常見現象。在其他較佳實施例中，彈頭可經由不包括自消性部分之可裂解連接體附接至TNFSF9靶向部分。 可證實，該等化合物在腫瘤位點處之遞送及釋放在臨床上有效治療或管控本發明之增殖性病症。就化合物而言，應瞭解，所揭示PBD中之每一者在每一C-環中具有兩個sp2 中心，此可使得較在每一C-環中僅具有一個sp2 中心之化合物在DNA小溝中獲得較強結合(及由此較大毒性)。因此，在用於如本文所陳述之TNFSF9 ADC中時，所揭示PBD可證實尤其有效用於治療增殖性病症。 前文提供與本發明相容之實例性PBD化合物且決不意欲對於根據本文之教示內容可成功納入抗-TNFSF9偶聯物中之其他PBD進行限制。而是，可偶聯至如本文所闡述及下文實例中所陳述之抗體之任一PBD與所揭示偶聯物相容且明確屬本發明之界限及範圍內。 除上文所提及之藥劑外，本發明抗體亦可偶聯至生物反應修飾劑。在某些實施例中，生物反應修飾劑包括介白素2、干擾素或各種類型之菌落刺激因子(例如CSF、GM-CSF、G-CSF)。 更通常而言，相關藥物部分可為擁有期望生物活性之多肽。該等蛋白質可包含(例如)毒素，例如相思子素、蓖麻毒蛋白A、抗腫瘤核糖核酸酶(Onconase) (或另一細胞毒性RNase)、假單胞菌屬(pseudomonas)外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，例如腫瘤壞死因子(例如TNF- α或TNF-β)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板源生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、AIM I (WO 97/33899)、AIM II (WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，1994, PMID: 7826947)及VEGI (WO 99/23105)；血栓劑；抗血管生成劑，例如血管抑素或內皮抑素；淋巴因子，例如介白素-1 (IL-1)、介白素-2 (IL-2)、介白素-6 (IL-6)、顆粒球巨噬球菌落刺激因子(GM-CSF)及顆粒球菌落刺激因子(G-CSF)；或生長因子，例如生長激素(GH)。 2.診斷劑或檢測劑 在其他實施例中，本發明抗體或其片段或衍生物偶聯至可為(例如)生物分子(例如肽或核苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素之診斷劑或可檢測劑、標記物或報告基因。經標記抗體可用於監測過度增殖性病症之發生或進展或作為臨床測試程序之一部分來測定包含所揭示抗體之特定療法(亦即治療診斷劑)之效能或測定未來治療過程。該等標記物或報告基因亦可用於純化所選抗體，用於抗體分析學(例如表位結合或抗體分倉)，分離(separating或isolating)致瘤細胞或用於臨床前程序或毒理學研究中。 可藉由使抗體偶合至可檢測物質來達成該診斷、分析及/或檢測，該等可檢測物質包含(但不限於)各種酶，包括(例如)辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯基膽鹼酯酶；輔基，例如(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白生物素(streptavidinlbiotin)及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，例如(但不限於)傘形酮、螢光黃、螢光黃異硫氰酸酯、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，例如(但不限於)發光胺；生物發光材料，例如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料，例如(但不限於)碘(131 I、125 I、123 I、121 I)、碳(14 C)、硫(35 S)、氚(3 H)、銦(115 In、113 In、112 In、111 In)、鍀(99 Tc)、鉈(201 Ti)、鎵(68 Ga、67 Ga)、鈀(103 Pd)、鉬(99 Mo)、氙(133 Xe)、氟(18 F)、153 Sm、177 Lu、159 Gd、149 Pm、140 La、175 Yb、166 Ho、90 Y、47 Sc、186 Re、188 Re、142 Pr、105 Rh、97 Ru、68 Ge、57 Co、65 Zn、85 Sr、32 P、89 Zr、153 Gd、169 Yb、51 Cr、54 Mn、75 Se、113 Sn及117 Tin；使用各種正電子發射斷層成像術之正電子發射金屬、非放射性順磁金屬離子及經放射標記或偶聯至特定放射性同位素之分子。在該等實施例中，適當檢測方法為業內所熟知且可易於自諸多商業來源獲得。 在其他實施例中，抗體或其片段可融合或偶聯至標記物序列或化合物(例如肽或螢光團)以促進純化或診斷或分析程序(例如免疫組織化學、生物層干涉術、表面電漿共振、流式細胞術、競爭性ELISA、FACs等)。在一些實施例中，標記物包括組胺酸標籤(例如尤其由pQE載體(Qiagen)提供者)，許多標記物市面有售。可用於純化之其他肽標籤包含(但不限於)血球凝集素「HA」標籤(其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位) (Wilson等人，1984, Cell 37:767)及「flag」標籤(U.S.P.N. 4,703,004)。 3.生物相容修飾劑 在所選實施例中，本發明抗體可視需要與可用於調節、改變、改良或調整抗體特性之生物相容修飾劑偶聯。舉例而言，可藉由附接相對較高分子量之聚合物分子(例如市售聚乙二醇(PEG)或類似生物相容聚合物)來生成具有增加之活體內半衰期之抗體或融合構築體。熟習此項技術者應瞭解，PEG可以許多可經選擇以賦予抗體特定性質(舉例而言，可調整半衰期)之不同分子量及分子構形獲得。可使用或不使用多官能連接體經由將PEG偶聯至抗體或抗體片段之N-或C-末端或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基來將PEG附接至該等抗體或抗體片段或衍生物。可使用引起最小生物活性損失之直鏈或具支鏈聚合物衍生。可藉由SDS-PAGE及質譜密切監測偶聯程度以確保PEG分子至抗體分子之最佳偶聯。可藉由(例如)粒徑篩析或離子交換層析自抗體-PEG偶聯物分離未反應PEG。以類似方式，可將所揭示抗體偶聯至白蛋白以使抗體或抗體片段在活體內更穩定或在活體內具有較長半衰期。該等技術在業內已眾所周知，例如參見WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413, 622。其他生物相容偶聯物為熟習此項技術者所明瞭且可易於根據本文之教示內容來鑑別。 B.連接體化合物 如上文所指示，與本發明相容之有效載物包括一或多個彈頭及視情況使彈頭與抗體靶向劑締合之連接體。可使用諸多連接體化合物將本發明抗體偶聯至相關彈頭。連接體僅需與以共價方式與抗體上之反應性殘基(較佳係半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物結合。因此，與所選抗體殘基發生反應且可用於提供本發明之相對穩定偶聯物(位點特異性或其他)之任一連接體皆與本文之教示內容相容。 相容連接體可有利地結合至經還原親核性半胱胺酸及離胺酸。涉及經還原半胱胺酸及離胺酸之偶聯反應包含(但不限於)硫醇-馬來醯亞胺、硫醇-鹵基(醯鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-雙碸、硫醇-硫代磺酸酯、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文進一步所論述，硫醇-馬來醯亞胺生物偶聯因其快速反應速率及溫和偶聯條件而係最廣泛使用方式之一。關於此方式之一個問題在於可能發生逆向邁克爾反應(retro-Michael reaction)且自抗體至血漿中之其他蛋白質(例如人類血清白蛋白)損失或轉移馬來醯亞胺基連接之有效載物。然而，在一些實施例中，可使用選擇性還原及位點特異性抗體(如本文在下文實例中所陳述)來穩定偶聯且減少此不期望轉移。硫醇-醯鹵反應提供不能發生逆向邁克爾反應且由此較為穩定之生物偶聯物。然而，一般而言，硫醇-鹵化物反應之反應速率慢於基於馬來醯亞胺之偶聯且由此因提供不期望藥物對抗體比率而並不有效。硫醇-吡啶基二硫化物反應係另一流行生物偶聯途徑。吡啶基二硫化物與游離硫醇發生快速交換，從而得到混合二硫化物且釋放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在還原性細胞環境下裂解，從而釋放有效載物。關於生物偶聯獲得更多關注之其他方式係硫醇-乙烯基碸及硫醇-雙碸反應，該等反應中之每一者皆與本文之教示內容相容且明確包含於本發明範圍內。 在所選實施例中，相容連接體將在細胞外環境中賦予ADC穩定性，防止ADC分子發生聚集且維持ADC自由溶於水性介質中且呈單體狀態。在輸送或遞送至細胞中之前，ADC較佳地穩定且保持完整，亦即，抗體保持連接至藥物部分。儘管連接體在靶細胞外較為穩定，但其可經設計以在細胞內以一定有效速率裂解或降解。因此，有效連接體將：(i)維持抗體之特定結合性質；(ii)容許偶聯物或藥物部分之細胞內遞送；(iii)保持穩定及完整(亦即不裂解或降解)，直至將偶聯物遞送或輸送至其靶定位點為止；及(iv)維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺滅效應或細胞生長抑制效應(在一些情形下包含任一旁觀者效應)。可藉由標準分析技術(例如HPLC/UPLC、質譜、HPLC)及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS來量測ADC之穩定性。如上文所陳述，抗體及藥物部分之共價附接需要連接體具有兩個反應性官能基(亦即在反應性意義上為雙價)。已知可用於附接兩個或更多個功能或生物活性部分(例如MMAE及抗體)之雙價連接體試劑，且已闡述提供與本文之教示內容相容之所得偶聯物之方法。 與本發明相容之連接體可在廣義上分類為可裂解連接體及不可裂解連接體。可裂解連接體可包含酸不穩定性連接體(例如肟及腙)、蛋白酶可裂解連接體及二硫化物連接體，其內化至靶細胞中且在細胞內以胞內體-溶酶體路徑發生裂解。細胞毒素之釋放及活化依賴於促進酸不穩定性化學鏈接(例如腙或肟)之裂解之胞內體/溶酶體酸性腔室。若在連接體中設計有溶酶體特異性蛋白酶裂解位點，則細胞毒素將靠近其細胞內靶釋放。或者，含有混合二硫化物之連接體提供在細胞內釋放細胞毒性有效載物之方式，此乃因該等細胞毒性有效載物在細胞之還原環境中選擇性裂解，但不在血流之富氧環境中裂解。以相反方式，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔體之相容不可裂解連接體在ADC於靶細胞內發生溶酶體降解期間釋放毒性有效載物。在一些方面，連接體之選擇取決於用於偶聯之特定藥物、特定適應症及抗體靶。 因此，本發明之某些實施例包括可藉由存在於細胞內環境中(例如在溶酶體或胞內體或胞膜窖內)之裂解劑裂解之連接體。連接體可為(例如)藉由細胞內肽酶或蛋白酶(包含(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶)裂解之肽基連接體。在一些實施例中，肽基連接體至少長兩個胺基酸或至少長三個胺基酸。裂解劑可包含細胞自溶酶B及D及纖溶酶，其中之每一者已知會水解二肽藥物衍生物，從而使得在靶細胞內釋放活性藥物。可藉由硫醇依賴性蛋白酶細胞自溶酶-B裂解之實例性肽基連接體係包括Phe-Leu之肽，此乃因已發現細胞自溶酶-B高度表現於癌性組織中。該等連接體之其他實例闡述於(例如) U.S.P.N. 6,214,345中。在具體實施例中，可藉由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接體係Val-Cit連接體、Val-Ala連接體或Phe-Lys連接體。使用細胞內蛋白分解釋放治療劑之一個優點在於，該藥劑在偶聯時通常會減弱且偶聯物之血清穩定性相對較高。 在其他實施例中，可裂解連接體係pH敏感性。通常，pH敏感性連接體可在酸性條件下水解。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解之酸不穩定連接體(例如腙、肟、縮胺基脲、縮胺基硫脲、順烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或諸如此類) (例如參見U.S.P.N. 5,122,368、5,824,805、5,622,929)。該等連接體在中性pH條件下(例如血液中之彼等)相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0下(此係溶酶體之近似pH)不穩定(可裂解)。 在其他實施例中，連接體可在還原條件下裂解(例如二硫化物連接體)。各種二硫連接體為業內已知，包含(例如)可使用以下化合物形成者：SATA (S-乙醯基硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDP (3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDB (3-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)及SMPT (N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。在其他具體實施例中，連接體係丙二酸酯連接體(Johnson等人，1995,Anticancer Res. 15:1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接體(Lau等人，1995,Bioorg -Med -Chem. 3(10):1299-1304)或3′-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg -Med -Chem. 3(10):1305-12)。 在本發明之某些態樣中，所選連接體包括下式之化合物：其中星號指示至藥物之附接點，CBA (亦即細胞結合劑)包括抗-TNFSF9抗體，L1 包括連接體單元及視情況可裂解連接體單元，A係連結L1 與抗體上之反應性殘基之連結基團(視情況包括間隔體)，L2 較佳係共價鍵且U (其可或可不存在)可包括促進連接體與彈頭在腫瘤位點處之充分分離之自消性單元之全部或一部分。 在一些實施例中(例如陳述於U.S.P.N. 2011/0256157中者)，相容連接體可包括：其中星號指示至藥物之附接點，CBA (亦即細胞結合劑)包括抗-TNFSF9抗體，L1 包括連接體及視情況可裂解連接體，A係連結L1 與抗體上之反應性殘基之連結基團(視情況包括間隔體)且L2 係共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自消性部分。 應瞭解，L1 及L2 (若存在)之性質可寬幅變化。基於裂解特性(其可由遞送偶聯物之位點處之條件來指示)來選擇該等基團。藉由酶作用裂解之彼等連接體較佳，但亦可使用可藉由pH (例如酸或鹼不穩定)、溫度之變化或在輻照後(例如光不穩定性)裂解之連接體。可在還原或氧化條件下裂解之連接體亦可用於本發明中。 在某些實施例中，L1 可包括胺基酸之鄰接序列。胺基酸序列可為用於酶促裂解之靶受質，由此容許釋放藥物。 在一實施例中，L1 可藉由酶作用裂解。在一實施例中，酶係酯酶或肽酶。 在另一實施例中，L1 係呈細胞自溶酶不穩定連接體形式。 在一實施例中，L1 包括二肽。二肽可表示為-NH-X1 -X2 -CO-，其中-NH-及-CO-分別代表胺基酸基團X1 及X2 之N-末端及C-末端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任一組合。在連接體係細胞自溶酶不穩定連接體之情形下，二肽可為用於細胞自溶酶調介之裂解之作用位點。 另外，對於具有羧基或胺基側鏈官能基之彼等胺基酸基團(分別例如Glu及Lys)，CO及NH可代表該側鏈官能基。 在一實施例中，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -係選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit係瓜胺酸。 較佳地，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -係選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。 最佳地，二肽-NH-X1 -X2 -CO-中之基團-X1 -X2 -係-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽包括-Val-Ala-。 在一實施例中，L2 係以共價鍵形式存在。 在一實施例中，L2 存在且與-C(=O)O-一起形成自消性連接體。在一實施例中，L2 係用於酶促活性之受質，由此容許釋放彈頭。 在L1 可藉由酶作用裂解且L2 存在之一實施例中，酶裂解L1 與L2 之間之鍵。 L1 及L2 (若存在)可藉由選自以下之鍵連結：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。 L1 中連結至L2 之胺基可為胺基酸之N-末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。 L1 中連結至L2 之羧基可為胺基酸上之C-末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。 L1 中連結至L2 之羥基可衍生自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。 術語「胺基酸側鏈」包含彼等發現於以下物質中之基團：(i)天然胺基酸，例如丙胺酸、精胺酸、天門冬醯胺、天門冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸，例如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)其所有對映異構體、非對映異構體、異構體富集、同位素標記(例如2 H、3 H、14 C、15 N)、經保護形式及外消旋混合物。 在一實施例中，-C(=O)O-及L2 一起形成以下基團：其中星號指示至藥物或細胞毒性劑位置之附接點，波浪線指示至連接體L1 之附接點，Y係-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n為0至3。伸苯基環視情況經一個、兩個或三個取代基取代。在一實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2 、烷基或羥基烷基取代。 在一實施例中，Y係NH。 在一實施例中，n為0或1。較佳地，n為0。 在Y係NH且n為0之情形下，自消性連接體可稱為對-胺基苄基羰基連接體(PABC)。 在其他實施例中，連接體可包含自消性連接體且二肽一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接體可包括基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其圖解說明於下文中：其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點，且波浪線指示至可偶聯至抗體之連接體剩餘部分(例如間隔體-抗體結合區段)之附接點。在酶促裂解二肽後，在遠程位點活化時，自消性連接體將容許充分釋放經保護化合物(亦即細胞毒素)，沿該路線之進程展示如下：其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點且其中L* 係連接體中包括此時已裂解肽基單元之剩餘部分之活化形式。彈頭之充分釋放確保了其維持期望毒性活性。 在一實施例中，A係共價鍵。因此，L1 及抗體直接連結。舉例而言，在L1 包括鄰接胺基酸序列之情形下，該序列之N-末端可直接連結至抗體殘基。 在另一實施例中，A係間隔體基團。因此，L1 及抗體間接連結。 在某些實施例中，L1 及A可藉由選自以下之鍵連結：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。 如下文更詳細所論述，本發明之藥物連接體較佳地連接至半胱胺酸(包含游離半胱胺酸)上之反應性硫醇親核試劑。為此，可藉由使用如本文所陳述之各種還原劑(例如DTT或TCEP或溫和還原劑)進行處理來使得抗體之半胱胺酸對於與連接體試劑之偶聯而言具有反應性。在其他實施例中，本發明之藥物連接體較佳地連接至離胺酸。 較佳地，連接體含有親電子官能基以用於與抗體之親核性官能基進行反應。抗體上之親核基團包含(但不限於)：(i) N-末端胺基團、(ii)側鏈胺基團(例如離胺酸)、(iii)側鏈硫醇基團(例如半胱胺酸)及(iv)抗體發生糖基化之糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基係親核性且能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電基團反應形成共價鍵，該等親電基團包含：(i)馬來醯亞胺基團、(ii)活化二硫化物、(iii)活性酯(例如NHS (N-羥基琥珀醯亞胺)酯、HOBt (N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯及醯鹵)；(iv)烷基及苄基鹵化物，例如鹵基乙醯胺；及(v)醛、酮及羧基。 與本發明相容之實例性官能基緊接圖解說明如下：在一些實施例中，半胱胺酸(包含位點特異性抗體之游離半胱胺酸)與藥物-連接體部分之間之連結係經由硫醇殘基及存在於連接體上之末端馬來醯亞胺基團達成。在該等實施例中，抗體與藥物-連接體之間之連結可如下：其中星號指示至藥物-連接體之剩餘部分之附接點且波浪線指示至抗體之剩餘部分之附接點。在該等實施例中，S原子可較佳地衍生自位點特異性游離半胱胺酸。 就其他相容連接體而言，結合部分可包括可與抗體上之活化殘基進行反應以提供期望偶聯物之末端溴-或碘乙醯胺。在任一情形下，熟習此項技術者可易於偶聯每一所揭示藥物-連接體化合物與本發明之相容抗-TNFSF9抗體(包含位點特異性抗體)。 根據本發明，本發明提供製備相容抗體藥物偶聯物之方法，其包括使抗-TNFSF9抗體與選自由以下組成之群之藥物-連接體化合物偶聯： DL5 及 DL6 出於本申請案之目的，使用DL作為「藥物-連接體」之縮寫(或式Ab-[L-D]n中之連接體-藥物「L-D」)且包括如上文所陳述之藥物連接體1 - 6 (亦即DL1、DL2、DL3、DL4、DL5及DL6)。應注意，DL1及 DL6包括相同彈頭及相同二肽亞單元，但連結基團間隔體有所不同。因此，在裂解連接體後，DL1及DL6將釋放PBD1。 應瞭解，可使用如本文所揭示之業內公認技術將連接體附加之末端馬來醯亞胺基部分(DL1 - DL4及DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)偶聯至所選TNFSF9抗體上之游離硫氫基。用於上文所提及之化合物之合成途徑陳述於WO2014/130879中，該案件關於上文所提及之DL化合物之合成以引用方式明確併入本文中，而偶聯該等PBD連接體組合之具體方法陳述於下文實例中。 因此，在所選態樣中，本發明係關於偶聯至所揭示DL部分中以提供實質上陳述於下文緊接之ADC 1 - 6中之TNFSF9免疫偶聯物之TNFSF9抗體。因此，在某些態樣中，本發明係關於式Ab-[L-D]n之ADC，其包括選自由以下組成之群之結構：,, , , 及及其中Ab包括抗-TNFSF9抗體或其免疫反應性片段且n係約1至約20之整數。 熟習此項技術者應瞭解，上文所提及之ADC結構係藉由式Ab-[L-D]n所定義且如其中所繪示之一種以上藥物-連接體分子可以共價方式偶聯至TNFSF9抗體(舉例而言，n可係約1至約20之整數)。更特定而言，如下文更詳細所論述，應瞭解，一種以上有效載物可偶聯至每一抗體且必須如此解釋上述示意圖。舉例而言，ADC3可包括偶聯至1、2、3、4、5、6、7或8或更多種有效載物之TNFSF9抗體且該等ADC之組合物通常包括各藥物對抗體比率(DAR)物質之混合物。 在某些態樣中，本發明之TNFSF9 PBD ADC包括如隨附實例中所陳述之抗-TNFSF9抗體或其免疫反應性片段。在一特定實施例中，ADC3包括hSC113.57ss1MJ (例如hSC113.57ss1MJ PBD3)。在其他態樣中，本發明之TNFSF9 PBD ADC包括hSC113.118ss1MJ (例如hSC113.118ss1MJ PBD3)。 C.偶聯 應瞭解，可使用諸多熟知反應將藥物部分及/或連接體附接至所選抗體。舉例而言，可採用利用半胱胺酸之硫氫基各種反應來偶聯期望部分。一些實施例包括偶聯包括一或多個游離半胱胺酸之抗體，如下文所詳細論述。在其他實施例中，可經由將藥物偶聯至存在於所選抗體中之離胺酸殘基之溶劑暴露胺基來生成本發明ADC。其他實施例包括活化N-末端蘇胺酸及絲胺酸殘基，該等殘基然後可用於將所揭示有效載物附接至抗體。較佳地調整所選偶聯方法以最佳化附接至抗體之藥物數量且提供相對較高治療指數。 業內已知將治療化合物偶聯至半胱胺酸殘基之各種方法且為熟習此項技術者所明瞭。在鹼性條件下，半胱胺酸殘基發生去質子化以生成可與軟親電試劑(例如馬來醯亞胺及碘乙醯胺)反應之硫醇鹽親核試劑。通常，用於該等偶聯之試劑可與半胱胺酸硫醇直接反應以形成偶聯蛋白或與連接體-藥物直接反應以形成連接體-藥物中間體。在連接體之情形下，熟習此項技術者已知採用有機化學反應、條件及試劑之若干途徑，包含：(1)使本發明蛋白質之半胱胺酸基團與連接體試劑經由共價鍵進行反應以形成蛋白質-連接體中間體，隨後與活化化合物進行反應；及(2)使化合物之親核基團與連接體試劑經由共價鍵進行反應以形成藥物-連接體中間體，隨後與本發明蛋白質之半胱胺酸基團進行反應。如熟習此項技術者自前文所明瞭，雙官能(或雙價)連接體可用於本發明中。舉例而言，雙官能連接體可包括用於共價鏈接至半胱胺酸殘基之硫醇修飾基團及至少一種用於共價或非共價鏈接至化合物之附接部分(例如第二硫醇修飾部分)。 在偶聯之前，可藉由使用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))進行處理來使抗體對於與連接體試劑之偶聯而言具有反應性。在其他實施例中，可經由以下方式將其他親核基團引入抗體中：使離胺酸與包含(但不限於) 2-亞胺基硫雜環戊烷(Traut試劑)、SATA、SATP或SAT(PEG)4之試劑進行反應，從而將胺轉化成硫醇。 就該等偶聯而言，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基係親核性且能夠與連接體試劑或化合物-連接體中間體或藥物上之親電基團反應以形成共價鍵，該等親電基團包含：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基及苄基鹵化物，例如鹵基乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及馬來醯亞胺基團；及(iv)二硫化物，包含吡啶基二硫化物，經由硫化物交換。化合物或連接體上之親核基團包含(但不限於)胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫代半卡腙基、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等基團能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電基團進行反應以形成共價鍵。 常用偶聯試劑包含馬來醯亞胺、鹵基乙醯基、碘乙醯胺琥珀醯亞胺基酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及胺基磷酸酯，但亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包含(例如)使用馬來醯亞胺、碘乙醯胺或鹵基乙醯基/烷基鹵、氮雜環丙烷(aziridne)、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸之硫醇進行反應以產生與化合物具有反應性之硫醚。游離硫醇與活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦可用於產生偶聯物(例如使用5-硫代-2-硝基苯甲(TNB)酸)。較佳地，使用馬來醯亞胺。 如上文所指示，亦可使用離胺酸作為反應性殘基來實現偶聯，如本文所陳述。通常經由胺反應性琥珀醯亞胺基酯來靶向親核性離胺酸殘基。為獲得最佳數量之去質子化離胺酸殘基，水溶液之pH必須低於離胺酸銨基團之pKa (其約為10.5)，從而反應之典型 pH約為8及9。用於偶合反應之常用試劑係NHS-酯，其與親核性離胺酸經由離胺酸醯化機制進行反應。發生類似反應之其他相容試劑包括異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可與本文之教示內容聯合使用以提供ADC。在離胺酸已活化後，可立即使用許多上文所提及之連接基團使彈頭以共價方式結合至抗體。 業內亦已知使化合物偶聯至蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳係N-末端殘基)之方法。舉例而言，闡述如下方法：其中自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇衍生羰基前體，該等羰基前體可藉由過碘酸鹽氧化選擇性且快速轉化成醛形式。醛與化合物中擬附接至本發明蛋白質之半胱胺酸之1,2-胺基硫醇反應形成穩定噻唑啶產物。此方法尤其可用於標記N-末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處之蛋白質。 在一些實施例中，可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個游離半胱胺酸殘基(例如製備包括一或多個游離非自然半胱胺酸胺基酸殘基之抗體)來將反應性硫醇基團引入所選抗體(或其片段)中。該等位點特異性抗體或經改造抗體容許偶聯物製劑展現增強之穩定性及實質性均質性，此至少部分地係由於提供經改造游離半胱胺酸位點及/或本文所陳述之新穎偶聯程序。不同於完全或部分地還原每一鏈內或鏈間抗體二硫鍵以提供偶聯位點(且與本發明完全相容)之習用偶聯方法，本發明另外選擇性還原某些所製備游離半胱胺酸位點且將藥物-連接體附接至其上。 就此而言，應瞭解，藉由經改造位點及選擇性還原促進之偶聯特異性使得在期望位置達成較高百分比之定點偶聯。顯著地，該等偶聯位點中之一些(例如存在於輕鏈恆定區之末端區域中者)通常難以有效偶聯，此乃因其往往與其他游離半胱胺酸進行交聯反應。然而，經由所得游離半胱胺酸之分子改造及選擇性還原，可獲得有效偶聯率，此大大減少不期望高-DAR污染物及非特異性毒性。更通常而言，經改造構築體及包括選擇性還原之所揭示新穎偶聯方法提供具有改良藥物動力學及/或藥效動力學及(可能)改良治療指數之ADC製劑。 在某些實施例中，位點特異性構築體存在游離半胱胺酸，游離半胱胺酸在還原時包括親核性且能夠與連接體部分(例如上文所揭示者)上之親電基團反應以形成共價鍵之硫醇基團。如上文所論述，本發明抗體可具有可還原未配對鏈間或鏈內半胱胺酸或引入之非自然半胱胺酸，亦即提供該等親核基團之半胱胺酸。因此，在某些實施例中，經還原游離半胱胺酸之游離硫氫基及所揭示藥物-連接體之末端馬來醯亞胺基或鹵基乙醯胺基團之反應將提供期望偶聯。在該等情形下，可藉由使用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))進行處理來使抗體之游離半胱胺酸對於與連接體試劑之偶聯而言具有反應性。每一游離半胱胺酸由此在理論上存在反應性硫醇親核試劑。儘管該等試劑尤其與本發明相容，但應瞭解，可使用熟習此項技術者通常已知之各種反應、條件及試劑來實現位點特異性抗體之偶聯。 另外，已發現，可選擇性還原經改造抗體之游離半胱胺酸以提供增強之定點偶聯且減少不期望之潛在毒性污染物。更具體而言，已發現，「穩定劑」 (例如精胺酸)會調節蛋白質中之分子內及分子間相互作用且可與所選還原劑(較佳地相對較溫和)聯合使用以選擇性還原游離半胱胺酸且促進如本文所陳述之位點特異性偶聯。如本文中所使用，術語「選擇性還原(selective reduction或selectively reducing)」可互換使用且應意指還原游離半胱胺酸且不實質上破壞存在於經改造抗體中之自然二硫鍵。在所選實施例中，可藉由使用某些還原劑或某些還原劑濃度來實現此選擇性還原。在其他實施例中，經改造構築體之選擇性還原包括使用穩定劑與還原劑(包含溫和還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性偶聯」應意指在如本文所闡述之細胞毒素存在下偶聯經選擇性還原之經改造抗體。就此而言，使用該等穩定劑(例如精胺酸)與所選還原劑之組合可明顯改良位點特異性偶聯之效率，如藉由抗體重鏈及輕鏈上之偶聯程度及製劑之DAR分佈所測定。相容抗體構築體及選擇性偶聯技術及試劑深度揭示於WO2015/031698中，該案件關於該等方法及構築體明確併入本文中。 儘管不期望受限於任何特定理論，但該等穩定劑可用於調節靜電微環境及/或調節期望偶聯位點處之構象變化，由此容許相對較溫和還原劑(其不實質上還原完整自然二硫鍵)以促進期望游離半胱胺酸位點處之偶聯。該等試劑(例如某些胺基酸)已知會形成鹽橋(經由氫鍵結及靜電相互作用)且可調節蛋白質-蛋白質相互作用，從而賦予可引起有利構象變化及/或減小不利蛋白質-蛋白質相互作用之穩定化效應。此外，該等試劑可用於抑制在還原之後不期望分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，由此促進期望偶聯反應，其中經改造位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳地經由連接體)。因選擇性還原條件不會顯著還原完整自然二硫鍵，故後續偶聯反應被天然驅動至游離半胱胺酸上之相對較少反應性硫醇(例如較佳地2個游離硫醇/抗體)。如先前所提及，可使用該等技術顯著減少非特異性偶聯之程度及根據本發明製得之偶聯物製劑中之相應不期望DAR物質。 在所選實施例中，與本發明相容之穩定劑通常包括含有至少一種具有鹼性pKa之部分之化合物。在某些實施例中，該部分包括一級胺，而在其他實施例中，胺部分包括二級胺。在其他實施例中，胺部分包括三級胺或胍鎓基團。在其他所選實施例中，胺部分包括胺基酸，而在其他相容實施例中，胺部分包括胺基酸側鏈。在其他實施例中，胺部分包括蛋白質胺基酸。在其他實施例中，胺部分包括非蛋白質胺基酸。在一些實施例中，相容穩定劑可包括精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。在某些較佳實施例中，穩定劑包括精胺酸。另外，相容穩定劑可包含具有鹼性pKa之胍及含氮雜環。 在某些實施例中，相容穩定劑包括具有至少一種pKa大於約7.5之胺部分之化合物，在其他實施例中，標的胺部分具有大於約8.0之pKa，在其他實施例中，胺部分具有大於約8.5之pKa且在其他實施例中，穩定劑包括pKa大於約9.0之胺部分。其他實施例包括胺部分具有大於約9.5之pKa之穩定劑，而某些其他實施例包括展現至少一種pKa大於約10.0之胺部分之穩定劑。在其他實施例中，穩定劑包括具有pKa大於約10.5之胺部分之化合物，在其他實施例中，穩定劑包括具有pKa大於約11.0之胺部分之化合物，而在其他實施例中，穩定劑包括pKa大於約11.5之胺部分。在其他實施例中，穩定劑包括具有pKa大於約12.0之胺部分之化合物，而在其他實施例中，穩定劑包括pKa大於約12.5之胺部分。熟習此項技術者應理解，相關pKa可易於使用標準技術來計算或測定且用於測定使用所選化合物作為穩定劑之適應性。 在與某些還原劑組合時，所揭示穩定劑展示尤其有效地使偶聯靶向游離位點特異性半胱胺酸。出於本發明目的，相容還原劑可包含任一產生偶聯用經還原游離位點特異性半胱胺酸且不會顯著破壞經改造抗體之自然二硫鍵之化合物。在該等條件(較佳地藉由組合所選穩定劑及還原劑來提供)下，活化藥物連接體主要限於結合至期望游離位點特異性半胱胺酸位點。以相對較低濃度使用以提供溫和條件之一或多種相對較溫和還原劑尤佳。如本文中所使用，術語「溫和還原劑」或「溫和還原條件」應意指在游離半胱胺酸位點處提供硫醇且不會實質上破壞存在於經改造抗體中之自然二硫鍵之任一試劑或由還原劑產生之狀態(視情況在穩定劑存在下)。亦即，溫和還原劑或條件(較佳地與穩定劑進行組合)能夠有效還原游離半胱胺酸(提供硫醇)且不會顯著破壞蛋白質之自然二硫鍵。可藉由諸多確立用於選擇性偶聯之適當環境之基於硫氫基之化合物來提供期望還原條件。在實施例中，溫和還原劑可包括具有一或多個游離硫醇之化合物，而在一些實施例中，溫和還原劑包括具有單一游離硫醇之化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑非限制性實例包括麩胱甘肽、n-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。 應瞭解，上述選擇性還原製程尤其有效地使偶聯靶向游離半胱胺酸。就此而言，可藉由各種業內公認技術來測定位點特異性抗體中之至期望靶位點之偶聯程度(在本文中定義為「偶聯效率」)。可藉由評價相對於所有其他偶聯位點在靶偶聯位點(例如每一輕鏈之c-末端上之游離半胱胺酸)上之偶聯百分比來測定藥物至抗體之位點特異性偶聯效率。在某些實施例中，本文之方法提供藥物至包括游離半胱胺酸之抗體之有效偶聯。在一些實施例中，偶聯效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更高，如藉由相對於所有其他偶聯位點之靶偶聯百分比所量測。 另外應瞭解，能夠偶聯之經改造抗體可含有包括硫氫基之游離半胱胺酸殘基，該等硫氫基產生或儲存抗體時被阻斷或封端。該等封蓋劑包含小分子、蛋白質、肽、離子及其他與硫氫基相互作用且防止或抑制偶聯物形成之材料。在一些情形下，未偶聯改造抗體可包括結合相同或不同抗體上之其他游離半胱胺酸之游離半胱胺酸。如本文所論述，該交叉反應性可在製作程序期間引起各種污染物。在一些實施例中，經改造抗體可需要在偶聯反應之前脫蓋。在具體實施例中，本文之抗體未封蓋且顯示能夠偶聯之游離硫氫基。在具體實施例中，本文之抗體經受不干擾或重排天然二硫鍵之脫蓋反應。應瞭解，在大部分情形下，脫蓋反應發生於正常還原反應(還原或選擇性還原)期間。 D.DAR 分佈及純化 在所選實施例中，與本發明相容之偶聯及純化方法能夠有利地生成包括窄DAR分佈之相對均質ADC製劑。就此而言，針對藥物與經改造抗體之間之化學計量比且針對毒素位置，所揭示構築體(例如位點特異性構築體)及/或選擇性偶聯提供試樣內ADC物質之均質性。如上文所簡要論述，術語「藥物對抗體比率」或「DAR」係指藥物對抗體之莫耳比率。在某些實施例中，偶聯製備可關於其DAR分佈實質上均質，此意指在ADC製劑內主要係具有特定DAR (例如DAR為2或4)之位點特異性ADC之物質，該物質關於載量位點亦係均勻的(亦即在游離半胱胺酸上)。在本發明之其他某些實施例中，可經由使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及偶聯來達成期望均質性。在其他實施例中，可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合來達成期望均質性。在其他實施例中，可使用分析或製備型層析技術來純化相容製劑以提供期望均質性。在該等實施例中之每一者中，可使用業內已知之各種技術來分析ADC試樣之均質性，包含(但不限於)質譜、HPLC (例如粒徑篩析HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳。 就ADC製劑之純化而言，應瞭解，可採用標準醫藥製備型方法以獲得期望純度。如本文中所論述，液體層析方法(例如反相(RP)及疏水性相互作用層析(HIC))可根據藥物載量值來分離混合物中之化合物。在一些情形下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)來分離具有特定藥物載量之物質。 端視抗體構形且至少部分地基於用於實現偶聯之方法，所揭示ADC及其製劑可以各種化學計量莫耳比率包括藥物及抗體部分。在某些實施例中，每一ADC之藥物載量可包括1-20個彈頭(亦即，n為1-20)。其他所選實施例可包括藥物載量為1至15個彈頭之ADC。在其他實施例中，ADC可包括1-12個彈頭或更佳地1-10個彈頭。在一些實施例中，ADC包括1至8個彈頭。 儘管理論藥物載量可相對較高，但實際限制(例如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性)往往因聚集物及其他污染物而限制包括該DAR之均質製劑之生成。亦即，端視有效載物，較高藥物載量(例如＞8或10)可引起聚集、不溶性、毒性或損失某些抗體-藥物偶聯物之細胞滲透性。鑒於該等問題，由本發明提供之藥物載量較佳地介於1至8個藥物/偶聯物製劑，亦即，其中1、2、3、4、5、6、7或8個藥物以共價方式附接至每一抗體(例如對於IgG1，其他抗體可端視二硫鍵數量具有不同載量能力)。較佳地，本發明組合物之DAR大約為2、4或6及且在一些實施例中，DAR包括大約2。 儘管本發明提供相對較高程度之均質性，但所揭示組合物實際上包括偶聯物與多種藥物化合物(在IgG1之情形下可能為1至8)之混合物。因此，所揭示ADC組合物包含偶聯物混合物，其中大部分組成抗體以共價方式連接至一或多個藥物部分且(儘管藉由經改造構築體及選擇性還原提供相對偶聯特異性)其中藥物部分可藉由各種硫醇基團附接至抗體。亦即，在偶聯之後，本發明之ADC組合物將包括以各種濃度具有不同藥物載量(例如1至8個藥物/IgG1抗體)之偶聯物(以及主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物)之混合物。然而，使用選擇性還原及製作後純化，偶聯物組合物可推進至以下情形：其主要含有單一主要期望ADC物質(例如藥物載量為2)且具有相對較低含量之其他ADC物質(例如藥物載量為1、4、6等)。平均DAR值代表用於組合物整體(亦即所有ADC物質之整體)之藥物載量之加權平均值。因所採用量化方法中之固有不確定性及在商業背景中難以完全去除非主要ADC物質，故可接受DAR值或規定通常呈現為平均值、範圍或分佈(亦即，平均DAR為2 +/- 0.5)。較佳地，將包括在一定範圍(亦即1.5至2.5)內之所量測平均DAR之組合物用於醫藥背景中。 因此，在一些實施例中，本發明包括平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.5)之組合物。在其他實施例中，本發明包括2、4、6或8 +/- 0.5之平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明包括2 +/- 0.5或4 +/- 0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物包括1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.3)之平均DAR、2、4、6或8 +/- 0.3之平均DAR、甚至更佳地2或4 +/- 0.3之平均DAR或甚至2 +/- 0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1偶聯物組合物較佳地包括平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8 (各自+/- 0.4)且具有相對較低含量(亦即小於30%)之非主要ADC物質之組合物。在其他實施例中，ADC組合物包括2、4、6或8 (各自+/- 0.4)之平均DAR及相對較低含量(＜ 30%)之非主要ADC物質。在一些實施例中，ADC組合物包括2 +/- 0.4之平均DAR及相對低含量(＜ 30%)之非主要ADC物質。在其他實施例中，在針對存在於組合物中之所有其他DAR物質量測時，主要ADC物質(例如DAR為2或DAR為4)係以以下濃度存在：以大於50%之濃度、以大於55%之濃度、以大於60%之濃度、以大於65%之濃度、以大於70%之濃度、以大於75%之濃度、以大於80%之濃度、以大於85%之濃度、以大於90%之濃度、以大於93%之濃度、以大於95%之濃度或甚至以大於97%之濃度。 如下文實例中所詳述，可藉由習用方式(例如UV-Vis分光光度測定法、反相HPLC、HIC、質譜、ELISA及電泳)來表徵來自偶聯反應之ADC製劑中之藥物/抗體之分佈。亦可測定ADC關於藥物/抗體之定量分佈。藉由ELISA，可測定特定ADC製劑中之藥物/抗體之平均值。然而，藉由抗體-抗原結合及ELISA之檢測限值不可辨別藥物/抗體值之分佈。同樣，用於檢測抗體-藥物偶聯物之ELISA分析不能測定藥物部分附接至抗體之位置(例如重鏈或輕鏈片段或特定胺基酸殘基)。 VI.診斷及篩選 A.診斷 本發明提供檢測、診斷或監測增殖性病症之活體外及活體內方法及自患者篩選細胞以鑑別腫瘤細胞(包含致瘤細胞)之方法。該等方法包含鑑別患有用於治療之癌症之個體或監測癌症進展，包括使患者或自患者獲得之試樣(活體內或活體外)與能夠特異性識別TNFSF9決定子且與其締合之檢測劑(例如抗體或核酸探針)接觸且檢測試樣中檢測劑之存在或不存在或締合程度。在所選實施例中，檢測劑包括與如本文所闡述之可檢測標記或報告基因分子締合之抗體。在某些其他實施例中，投與TNFSF9抗體且使用二級經標記抗體(例如抗鼠類抗體)進行檢測。在其他實施例(例如原位雜交或ISH)中，將使用與基因組TNFSF9決定子反應之核酸探針來檢測、診斷或監測增殖性病症。 更通常而言，TNFSF9決定子之存在及/或量可使用熟習此項技術者可獲得之諸多技術中之任一者來量測用於蛋白質或核酸分析，該等技術為(例如)直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、分枝寡核苷酸技術、北方印漬(Northern blot)技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包括量測源自化學反應之信號，例如吸光度之變化、螢光之變化、化學發光或電化學發光之產生、反射率、折射率或光散射之變化、可檢測標記自表面之累積或釋放、氧化或還原或氧化還原物質、電流或電位、磁場之變化等。適宜檢測技術可經由標記之光致發光(例如經由量測螢光、時間解析螢光、衰減波螢光、上轉換磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如經由引起吸光度或螢光之變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)量測該等標記以量測經標記結合試劑之參與來檢測結合事件。或者，可使用無需使用標記之檢測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿共振量測)或分析物之固有發光之技術。 在一些實施例中，檢測劑與試樣中之特定細胞或細胞組份之締合指示該試樣可含有致瘤細胞，由此表示可使用如本文所闡述之抗體或ADC有效地治療患有癌症之個體。 在某些較佳實施例中，分析可包括免疫組織化學(IHC)分析或其變化形式(例如螢光ABC、發色ABC、標準ABC、標準LSAB等)、免疫化學或其變化形式(例如直接、間接、螢光、發色等)或原位雜交(ISH)或其變化形式(例如發色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或RNA-FISH))。 就此而言，本發明之某些態樣包括使用經標記之TNFSF9用於免疫組織化學(IHC)。更特定而言，可使用TNFSF9 IHC作為診斷工具來幫助診斷多種增殖性病症及監測對治療(包含TNFSF9抗體療法)之潛在反應。在某些實施例中，TNFSF9抗體將偶聯至一或多個報告基因分子。在其他實施例中，TNFSF9抗體未經標記且使用與一或多個報告基因分子締合之單獨藥劑(例如抗鼠類抗體)進行檢測。如本文所論述且如下文實例中所展示，可對已經化學固定(包含(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(包含(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定投藥方案及時刻。 本發明之其他尤其相容之態樣涉及使用原位雜交來檢測或監測TNFSF9決定子。原位雜交技術或ISH為熟習此項技術者所熟知。簡言之，將細胞固定且將含有特定核苷酸序列之可檢測探針添加至經固定細胞中。若該等細胞含有互補核苷酸序列，則可檢測到之探針將與其雜交。可使用本文所陳述之序列資訊設計探針來鑑別表現基因型TNFSF9決定子之細胞。探針較佳與對應於該等決定子之核苷酸序列雜交。雜交條件可以常規方式最佳化以藉由不完全互補雜交使背景信號最小化，但較佳地探針較佳與所選TNFSF9決定子完全互補。在所選實施例中，探針經附接至可容易地藉由標準螢光方法檢測之探針之螢光染料標記。 相容活體內治療診斷劑或診斷分析可包含業內公認之成像或監測技術，例如磁共振成像、電腦化斷層掃描(例如CAT掃描)、正電子斷層掃描(例如PET掃描)、放射線攝影、超音波等，如熟習此項技術者將已知。 在某些實施例中，本發明抗體可用於檢測及量化特定決定子(例如TNFSF9蛋白)在患者試樣(例如血漿或血液)中之含量，此可繼而用於使用檢測、診斷或監測與相關決定子有關之增殖性病症。舉例而言，血液及骨髓試樣可與流式細胞術聯合使用以檢測及量測TNFSF9表現(或另一共表現標記物)且監測疾病進展及/或治療反應。在相關實施例中，本發明抗體可用於檢測、監測及/或量化活體內或活體外循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包括致瘤細胞。 在本發明之某些實施例中，可在療法或方案之前使用所揭示抗體評價或表徵個體或個體試樣中之致瘤細胞來確立基線。在其他實例中，可評價源自所治療個體之試樣之致瘤細胞。 在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症進展及/或發病機制之方法。在另一實施例中，癌症進展及/或發病機制之活體內分析包括測定腫瘤進展程度。在另一實施例中，分析包括鑑別腫瘤。在另一實施例中，針對原發性腫瘤來分析腫瘤進展。在另一實施例中，端視如熟習此項技術者已知之癌症類型，隨時間實施分析。在另一實施例中，在活體內進一步分析源自原發性腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤。在另一實施例中，分析繼發性腫瘤之大小及形狀。在一些實施例中，進一步實施離體分析。 在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症進展及/或發病機制之方法，其包含測定細胞轉移或檢測及量化循環腫瘤細胞之含量。在又一實施例中，細胞轉移分析包括測定在與原發性腫瘤不連續之位點處細胞之進展性生長。在一些實施例中，可實施程序以監測經由血管、淋巴管、在體腔內或其組合擴散之腫瘤細胞。在另一實施例中，針對細胞遷移、擴散、外滲、增殖或其組合實施細胞轉移分析。 在某些實例中，可在療法之前使用所揭示抗體來評價或表徵個體或來自個體之試樣中之致瘤細胞以確立基線。在其他實例中，試樣係衍生自經治療個體。在一些實例中，在個體開始或終止治療之後至少約1天、2天、4天、6天、7天、8天、10天、12天、14天、15天、16天、18天、20天、30天、60天、90天、6個月、9個月、12個月或＞12個月自個體獲取試樣。在某些實例中，在某一數量之劑量之後(例如在2、5、10、20、30或更多個療法劑量之後)評價或表徵致瘤細胞。在其他實例中，在接受一或多個療法之後，於1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更長時間之後表徵或評價致瘤細胞。 B.篩選 在某些實施例中，可使用本發明抗體篩選試樣以鑑別藉由與決定子相互作用來改變腫瘤細胞之功能或活性之化合物或藥劑(例如抗體或ADC)。在一實施例中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸，且可使用抗體或ADC針對表現某一靶(例如TNFSF9)之細胞來篩選腫瘤以鑑別用於一定目的(包含(但不限於)診斷目的)之該等細胞，監測該等細胞以測定治療效能或富集用於該等靶表現細胞之細胞群體。 在又一實施例中，方法包含使腫瘤細胞與測試藥劑或化合物直接或間接接觸且測定測試藥劑或化合物是否調節決定子相關腫瘤細胞之活性或功能(例如細胞形態或活力之變化、標記物表現、分化或去分化、細胞呼吸、線粒體活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、細胞凋亡或細胞死亡)。直接相互作用之一實例係物理相互作用，而間接相互作用包含(例如)組合物對中間分子之作用(中間分子繼而作用於參考實體(例如細胞或細胞培養物))。 篩選方法包含高通量篩選，其可包含視情況定位或放置於預定位置(例如在培養皿、管、燒瓶、滾瓶或板上)之細胞陣列(例如微陣列)。高通量機器人或人工處置方法可探測化學相互作用且測定許多基因在短時間段中之表現程度。已研發利用分子信號(例如經由螢光團或微陣列) (Mocellin及Rossi, 2007, PMID: 17265713)及以極快速速率處理資訊之自動化分析(例如參見 Pinhasov等人，2004, PMID: 15032660)之技術。可篩選之文庫包含(例如)小分子文庫、噬菌體展示文庫、全人類抗體酵母顯示文庫(Adimab)、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。 VII.醫藥製劑及治療用途 A.調配物及投與途徑 可以使用業內公認技術之各種方式來調配本發明之抗體或ADC。在一些實施例中，本發明之治療組合物可單獨或與最少量其他組份一起投與，而其他者可視情況經調配以含有適宜醫藥上可接受之載劑。如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括賦形劑、媒劑、佐劑及稀釋劑，其為業內所熟知且可購自商業來源以用於醫藥製劑中(例如參見Gennaro (2003)Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus ，第20版，Mack Publishing；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems ， 第7版，Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients ， 第3版，Pharmaceutical Press)。 適宜醫藥上可接受之載劑包括呈相對惰性且可幫助投與抗體或ADC或可幫助將活性化合物處理成經醫藥上最佳化以遞送至作用位點之製劑的物質。 該等醫藥上可接受之載劑包含可改變調配物之形式、稠度、黏性、pH、張力、穩定性、滲透度、藥物動力學、蛋白質聚集或溶解性之試劑，且包含緩衝劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、囊封劑及皮膚滲透劑。載劑之某些非限制性實例包含鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。用於全身投與之抗體可經調配用於腸內、非經腸或局部投與。實際上，可同時使用所有三種類型之調配物來達成活性成份之全身投與。用於非經腸及經腸藥物遞送之賦形劑以及調配物闡述於Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000)第20版，Mack Publishing中。 用於經腸投與之適宜調配物包含硬質或軟質明膠膠囊、丸劑、錠劑(包含包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或吸入物及其受控釋放形式。 適於非經腸投與(例如藉由注射)之調配物包含水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如溶液、懸浮液)，其中活性成份溶解、懸浮或以其他方式提供(例如於脂質體或其他微粒中)。該等液體可另外含有使調配物與預期接受者之血液(或其他相關體液)等滲之其他醫藥上可接受之載劑，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及溶質。賦形劑之實例包含(例如)水、醇、多元醇、甘油、植物油及諸如此類。適用於該等調配物中之醫藥上可接受之等滲載劑之實例包含氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸化林格氏注射液。 在尤佳實施例中，可凍乾本發明之經調配組合物以提供抗體或ADC之粉末化形式，其然後可在投與之前重構。可藉由以下方式來生成用於製備可注射溶液之無菌粉劑：凍乾包括所揭示抗體或ADC之溶液以得到包括活性成份以及任一可選共溶生物相容成份之粉劑。通常，藉由將活性化合物納入含有基本分散介質或溶劑(例如稀釋劑)及視情況其他生物相容成份之無菌媒劑中來製備分散液或溶液。相容稀釋劑係在醫藥上可接受者(對於投與人類而言安全且無毒)且可用於製備液體調配物(例如在凍乾之後重構之調配物)。實例性稀釋劑包含無菌水、注射用抑菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在一替代實施例中，稀釋劑可包含鹽及/或緩衝劑之水溶液。 在某些較佳實施例中，在與醫藥上可接受之糖組合下，將抗-TNFSF9抗體或ADC凍乾。在與所關注蛋白質組合時，「醫藥上可接受之糖」分子顯著防止或減小蛋白質在儲存時之化學及/或物理不穩定性。意欲凍乾調配物且然後重構。如本文中所使用，醫藥上可接受之糖亦可稱為「凍乾保護劑」。實例性糖及其相應糖醇包含：胺基酸，例如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲胺，例如甜菜鹼；溶致鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元或更高分子量糖醇，例如甘油、右旋糖酐、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS® ；及其組合。其他實例性凍乾保護劑包含甘油及明膠及蜜二糖、蜜三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖之實例包含葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳酮糖。非還原糖之實例包含選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物之非還原糖苷。較佳糖醇係單糖苷，尤其彼等藉由還原諸如乳糖、麥芽糖、乳酮糖及麥芽酮糖等二糖獲得之化合物。糖苷側基可為葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇之其他實例係山梨醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳醫藥上可接受之糖係非還原糖菌藻糖或蔗糖。將醫藥上可接受之糖以「保護量」(例如預凍乾)添加至調配物中，此意味著該蛋白質在儲存期間(例如在重構及儲存之後)基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。 熟習此項技術者應瞭解，可以以下範圍之濃度將相容凍乾保護劑添加至液體或凍乾調配物中：約1 mM至約1000 mM、約25 mM至約750 mM、約50 mM至約500 mM、約100 mM至約300 mM、約125 mM至約250 mM、約150 mM至約200 mM或約165 mM至約185 mM。在某些實施例中，可添加凍乾保護劑以提供約10 mM、約25 mM、約50 mM、約75 mM、約100 mM、約125 mM、約130 mM、約140 mM、約150 mM、約160 mM、約165 mM、約170 mM、約175 mM、約180 mM、約185 mM、約190 mM、約200 mM、約225 mM、約250 mM、約300 mM、約400 mM、約500 mM、約600 mM、約700 mM、約800 mM、約900 mM或約1000 mM之濃度。在某些較佳實施例中，凍乾保護劑可包括醫藥上可接受之糖。在尤佳態樣中，醫藥上可接受之糖包括海藻糖或蔗糖。 在其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包括某些化合物(包含胺基酸或其醫藥上可接受之鹽)以用作穩定劑或緩衝劑。可以介於約1 mM至約100 mM、約5 mM至約75 mM、約5 mM至約50 mM、約10 mM至約30 mM或約15 mM至約25 mM之間之濃度添加該等化合物。在某些實施例中，可添加緩衝劑以提供約1 mM、約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之濃度。在其他所選實施例中，可添加緩衝劑以提供約5 mM、約10 mM、約15 mM、約20 mM、約25 mM、約30 mM、約35 mM、約40 mM、約50 mM、約60 mM、約70 mM、約80 mM、約90 mM或約100 mM之濃度。在某些較佳實施例中，緩衝劑包括組胺酸鹽酸鹽。 在其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包括非離子表面活性劑(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80)作為穩定劑。可以介於約0.1 mg/ml至約2.0 mg/ml、約0.1 mg/ml至約1.0 mg/ml、約0.2 mg/ml至約0.8 mg/ml、約0.2 mg/ml至約0.6 mg/ml或約0.3 mg/ml至約0.5 mg/ml之間之濃度添加該等化合物。在某些實施例中，可添加表面活性劑以提供約0.1 mg/ml、約0.2 mg/ml、約0.3 mg/ml、約0.4 mg/ml、約0.5 mg/ml、約0.6 mg/ml、約0.7 mg/ml、約0.8 mg/ml、約0.9 mg/ml或約1.0 mg/ml之濃度。在其他所選實施例中，可添加表面活性劑以提供約1.1 mg/ml、約1.2 mg/ml、約1.3 mg/ml、約1.4 mg/ml、約1.5 mg/ml、約1.6 mg/ml、約1.7 mg/ml、約1.8 mg/ml、約1.9 mg/ml或約2.0 mg/ml之濃度。在某些較佳實施例中，表面活性劑包括聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯40。 用於非經腸投與(例如靜脈內注射)之所揭示抗體或ADC之相容調配物可包括約10 μg/mL至約100 mg/ mL之ADC或抗體濃度。在某些所選實施例中，抗體或ADC濃度包括 20 μg/ mL、40 μg/ mL、60 μg/ mL、80 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL、700 μg/mL、800 μg/mL、900 μg/mL或1 mg/mL。在其他實施例中，ADC濃度包括2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL、14 mg/mL、16 mg/mL、18 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL、30 mg/mL、35 mg/mL、40 mg/mL、45 mg/mL、50 mg/mL、60 mg/mL、70 mg/mL、80 mg/mL、90 mg/mL或100 mg/mL。 不論是否自凍乾粉末重構，可在投與之前進一步稀釋(較佳地在水性載劑中)液體TNFSF9 ADC調配物(例如如上文緊接所陳述)。舉例而言，上文所提及之液體調配物可進一步稀釋至含有0.9%氯化鈉注射液(USP)或等效物(經適當變通)之輸注袋中以達成期望投與劑量值。在某些態樣中，經由靜脈內輸注使用靜脈內裝置投與經完全稀釋之TNFSF9 ADC溶液。較佳地，所投與TNFSF9 ADC藥物溶液(不論藉由靜脈內(IV)輸注或注射)係澄清的、無色且不含可見微粒。 可藉由各種途徑將本發明之化合物及組合物在活體內投與有需要之個體，包含(但不限於)口服、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌內、心內、室內、氣管內、經頰、經直腸、腹膜腔內、真皮內、局部、經皮及鞘內或另外藉由植入或吸入。可將標的組合物調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑；包含(但不限於)錠劑、膠囊、粉劑、粒劑、軟膏、溶液、栓劑、灌腸劑、注射劑、吸入劑及氣溶膠。可根據預期應用及治療方案來選擇適當調配物及投與途徑。 B.劑量及投藥方案 特定劑量方案(亦即劑量、時刻及重複次數)將端視特定個體以及經驗考慮(例如藥物動力學(例如半衰期、清除速率等))而定。熟習此項技術者(例如主治醫師)可基於考慮病狀及所治療病狀之嚴重程度、所治療個體之年齡及一般健康狀況及諸如此類來確定投與頻率。投與頻率可在療法進程內基於所選組合物及投藥方案之效能之評價進行調節。該評價可基於特定疾病、病症或病狀之標記物來進行。在個體患有癌症之實施例中，該等評價包含經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤試樣之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測本文所鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或根據本文所闡述方法鑑別之抗原；增殖性或致瘤細胞數量之減少、該等贅瘤性細胞減少之維持；贅瘤性細胞增殖之減少；或轉移之發展延遲。 本發明之TNFSF9抗體或ADC可以各種範圍投與。該等範圍包含約5 μg/kg體重/劑量至約100 mg/kg體重/劑量、約50 μg/kg體重/劑量至約5 mg/kg體重/劑量、約100 μg/kg體重/劑量至約10 mg/kg體重/劑量。其他範圍包含約100 μg/kg體重/劑量至約20 mg/kg體重/劑量及約0.5 mg/kg體重/劑量至約20 mg/kg體重/劑量。在某些實施例中，劑量為至少約100 μg/kg體重、至少約250 μg/kg體重、至少約750 μg/kg體重、至少約3 mg/kg體重、至少約5 mg/kg體重、至少約10 mg/kg體重。 在所選實施例中，以大約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100 μg/kg體重/劑量投與(較佳地經靜脈內) TNFSF9抗體或ADC。其他實施例可包括以約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000 μg/kg體重/劑量投與抗體或ADC。在其他實施例中，以2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9或10 mg/kg投與所揭示偶聯物。在其他實施例中，可以12、14、16、18或20 mg/kg體重/劑量投與偶聯物。在其他實施例中，可以25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90或100 mg/kg體重/劑量投與偶聯物。使用本文之教示內容，熟習此項技術者可輕易地根據臨床前動物研究、臨床觀察及標準醫學及生物化學技術及量測來確定用於各種TNFSF9抗體或ADC之適當劑量。 其他投藥方案可基於體表面積(BSA)計算，如U.S.P.N. 7,744,877中所揭示。眾所周知，BSA係使用患者之身高及體重來計算且提供關於個體尺寸大小之量度(如由其體表面積所表示)。在某些實施例中，可以1 mg/m2 至800 mg/m2 、50 mg/m2 至500 mg/m2 之劑量及100 mg/m2 、150 mg/m2 、200 mg/m2 、250 mg/m2 、300 mg/m2 、350 mg/m2 、400 mg/m2 或450 mg/m2 之劑量投與偶聯物。亦應瞭解，可使用公認及經驗技術來測定適當劑量。 可根據具體時間表來投與抗-TNFSF9抗體或ADC。通常，向個體投與一或多次有效劑量之TNFSF9偶聯物。更特定而言，每月一次、多於每月一次或少於每月一次向個體投與有效劑量之ADC。在某些實施例中，可投與多次有效劑量之TNFSF9抗體或ADC，包含持續至少一個月、至少六個月、至少一年、至少兩年之時段或若干年之時段。在其他實施例中，在所揭示抗體或ADC之投與之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)或甚至一年或若干年。 在一些實施例中，涉及偶聯抗體之治療進程將包括在數週或數月之時段內多個劑量之所選藥物產物。更具體而言，本發明之抗體或ADC可每天一次、每兩天、每四天、每週、每十天、每兩週、每三週、每月、每六週、每兩個月、每十週或每三個月投與。就此而言，應瞭解，基於患者反應及臨床實踐，可改變各劑量或可調整間隔。本發明亦涵蓋不連續投與或分成若干部分投與之日劑量。本發明組合物及抗癌劑可交替數天或數週互換投與；或可給予一系列抗體治療，隨後給予一或多個抗癌劑療法治療。在任一情形下，如熟習此項技術者所理解，化學治療劑之適當劑量通常近似於臨床療法中已採用者，其中單獨或與其他化學治療劑組合投與化學治療劑。 在另一實施例中，本發明之TNFSF9抗體或ADC可用於維持療法中來減少或消除疾病初始呈現後腫瘤復發之機會。較佳地，將治療該病症且消除、減少或以其他方式改善初始腫瘤團塊，故患者為無症狀或處於緩解中。此時，即使使用標準診斷程序存在極少或無疾病之適應症，仍可向個體投與一或多次醫藥有效量之所揭示抗體。 在另一較佳實施例中，本發明之調節劑可以預防方式或作為佐劑療法用於預防減積程序後之腫瘤轉移或降低其可能性。如本發明中所使用，「減積程序」意指減小腫瘤質量或改善腫瘤負荷或腫瘤增殖之任一程序、技術或方法。實例性減積程序包含(但不限於)手術、輻射治療(亦即束輻射)、化學療法、免疫療法或燒蝕。可在由熟習此項技術者根據本發明容易確定之適宜時間下，如臨床、診斷或治療診斷程序所建議投與所揭示ADC來減少腫瘤轉移。 本發明之其他實施例包括向無症狀但具有罹患癌症風險之個體投與所揭示抗體或ADC。亦即，本發明之抗體或ADC可在真正預防意義下使用並給予已經檢查或測試且具有一或多個所述風險因子(例如基因組適應症、家族病史、活體內或活體外測試結果等)但尚未罹患贅瘤之患者。 亦可根據經驗確定在給予一或多個投與之個體中用於所揭示治療組合物之劑量及方案。舉例而言，可給予個體遞增劑量之如本文所闡述產生之治療組合物。在所選實施例中，可分別基於經驗確定或所觀察到之負效應或毒性逐漸增加或減少或減弱劑量。為評價所選組合物之效能，可如先前所闡述追蹤特定疾病、病症或病狀之標記物。對於癌症而言，該等評價包含經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤試樣之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢驗評價之改良；量測間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或根據本文所闡述方法鑑別之致瘤抗原；疼痛或癱瘓之降低；改良之言語、視力、呼吸或其他與腫瘤有關之失能；增加之食慾；或增加之生活品質(如藉由公認測試所量測)或存活延長。熟習此項技術者應明瞭，劑量將端視以下因素而變化：個體、贅瘤性病狀之類型、贅瘤性病狀之階段、贅瘤性病狀是否開始轉移至個體中之其他位置及所使用過去及當前治療。 C.組合療法 如上文所提及，組合療法可尤其可用於降低或抑制不期望贅瘤性細胞增殖、降低癌症發生、降低或預防癌症復發或降低或預防癌症之擴散或轉移。在該等情形下，本發明之抗體或ADC可藉由去除原本支持且保存腫瘤團塊之CSC而用作敏化劑或化學敏化劑且由此容許更有效地使用當前標準護理之減積劑或抗癌劑。亦即，在某些實施例中，所揭示抗體或ADC可提供加強另一投與治療劑之作用模式之增強效應(例如加和或協同性質)。在本發明背景中，「組合療法」應在廣義上詮釋且僅係指投與抗-TNFSF9抗體或ADC及一或多種抗癌劑(包含特異性及非特異性方式)，該一或多種抗癌劑包含(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射療法及放射治療劑、靶向抗癌劑(包含單株抗體及小分子實體)、BRM、治療抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、輻射療法及抗轉移劑及免疫治療劑。 當各療法(例如抗體及抗癌劑)單獨執行時，不要求所觀測的效應具有相加的組合結果。儘管通常期望至少為加和效應，但任何增加的抗腫瘤效應高於該等單一療法之一皆係有益的。另外，本發明不要求組合治療展現協同效應。然而，熟習此項技術者應瞭解，使用某些包括較佳實施例之所選組合，可觀察到協同作用。 因此，在某些態樣中，組合療法具有治療協同性或較以下情形在治療癌症時改良可量測治療效應：(i)單獨使用抗-TNFSF9抗體或ADC，或(ii)單獨使用治療部分，或(iii)使用治療部分與另一治療部分之組合但不添加抗-TNFSF9抗體或ADC。本文所用之術語「治療協同性」意指抗-TNFSF9抗體或ADC及一或多個治療部分之組合具有大於抗-TNFSF9抗體或ADC及一或多個治療部分之組合之加和效應的治療效應。 藉由與對照或基線量測比較來量化所揭示組合之期望結果。如本文中所使用，諸如「改良」、「增加」或「減少」等相對術語指示相對於對照(例如在同一個體中在開始本文所闡述治療之前之量測或在對照個體(或多個對照個體)中在本文所闡述之抗-TNFSF9抗體或ADC不存在下但在其他治療部分(例如標準護理治療)存在下之量測)的值。代表性對照個體係患有與所治療個體相同形式之癌症之個體，其與所治療個體之年齡大致相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當)。 對療法之反應之變化或改良通常在統計學上顯著。如本文中所使用，術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或更多個實體之間存在非隨機相關之可能性之統計學分析。為確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，可計算「p值」。低於使用者定義之截止點之P值視為顯著。小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005或小於0.001之p值可視為顯著。 協同治療效應可為由單一治療部分或抗-TNFSF9抗體或ADC誘發之治療效應，或由給定組合之抗-TNFSF9抗體或ADC或單一治療部分誘發之治療效應之和的至少約2倍或至少約5倍或至少約10倍或至少約20倍或至少約50倍或至少約100倍之效應。協同治療效應亦可觀察為與由單一治療部分或抗-TNFSF9抗體或ADC誘發之治療效應或由給定組合之抗-TNFSF9抗體或ADC或單一治療部分誘發之治療效應之和相比，治療效應增加至少10%或至少20%或至少30%或至少40%或至少50%或至少60%或至少70%或至少80%或至少90%或至少100%或更大。協同效應亦係在治療劑組合使用時容許減少治療劑投藥之效應。 在實踐組合療法中，抗-TNFSF9抗體或ADC及治療部分可以單一組合物或以兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。或者，使用抗-TNFSF9抗體或ADC之治療可在治療部分治療之前或之後以(例如)在數分鐘至數週範圍內之間隔進行。在一實施例中，彼此在約5分鐘至約兩週內投與治療部分及抗體或ADC二者。在其他實施例中，在投與抗體與治療部分之間可經過若干天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、若干週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或若干個月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)。 組合療法可經投與直至病狀按照不同時間表(例如每天一次、兩次或三次、每兩天一次、每三天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次、每三個月一次、每六個月一次)被治療、減輕或治癒，或可連續投與。抗體及治療部分可交替數天或數週投與；或可給出抗-TNFSF9抗體或ADC之序列，然後使用其他治療部分治療一或多次。在一實施例中，抗-TNFSF9抗體或ADC係與一或多個治療部分組合投與用於短治療週期。在其他實施例中，投與該組合治療用於長治療週期。該組合療法可經由任何途徑來投與。 在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可與檢查點抑制劑(例如PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑)聯合使用。PD-1以及其配體PD-L1係抗腫瘤T淋巴球反應之負調控劑。在一實施例中，組合療法可包括投與抗-TNFSF9抗體或ADC以及抗PD-1抗體(例如派姆單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab))及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法可包括投與抗-TNFSF9抗體或ADC以及抗PD-L1抗體(例如阿維魯單抗(avelumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab))及視情況一或多個其他治療部分。在又一實施例中，組合療法可包括向在使用檢查點抑制劑及/或靶向BRAF組合療法(例如威羅菲尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafinib))進行治療後繼續進展之患者投與抗-TNFSF9抗體或ADC以及抗PD-1抗體或抗PD-L1。 在一些實施例中，抗-TNFSF9抗體或ADC可與各種一線癌症治療組合使用。因此，在所選實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及細胞毒性劑(例如異環磷醯胺(ifosfamide)、絲裂黴素C、長春地辛(vindesine)、長春鹼、依託泊苷、伊立替康(ironitecan)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉烷(taxane)、長春瑞濱(vinorelbine)、胺甲喋呤及培美曲塞(pemetrexed)))及視情況一或多個其他治療部分。在某些贅瘤性適應症(例如血液學適應症，例如AML或多發性骨髓瘤)中，所揭示ADC可與諸如以下等細胞毒性劑組合使用：阿糖胞苷(AraC)以及蒽環黴素(阿柔比星(aclarubicin)、安吖啶(amsacrine)、多柔比星、柔紅黴素、艾達黴素(idarubixcin)等)或米托蒽醌、氟達拉濱(fludarabine)；羥基脲、氯法拉濱(clofarabine)、克羅他嗪(cloretazine)。在其他實施例中，本發明ADC可與G-CSF或GM-CSF啟動劑、去甲基化劑(例如阿紮胞苷(azacitidine)或地西他濱(decitabine))、FLT3-選擇性酪胺酸激酶抑制劑(例如米哚妥林(midostaurin)、來他替尼(lestaurtinib)及舒尼替尼(sunitinib))、全反視黃酸(ATRA)及三氧化砷(其中後兩種組合可尤其有效地用於急性前髓細胞性白血病(APL))組合投與。 在另一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及基於鉑之藥物(例如卡鉑(carboplatin)或順鉑)及視情況一或多個其他治療部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇；伊立替康；或培美曲塞)。 在某些實施例中，舉例而言，在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及一或多個闡述為「激素療法」之治療部分。本文所用之「激素療法」係指(例如)他莫昔芬(tamoxifen)；促性腺激素或促黃體激素釋放激素(GnRH或LHRH)；依韋莫司(everolimus)及依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦或氟維司群(fulvestrant))。 在另一實施例中，舉例而言，在BR-HER2之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及曲妥珠單抗(trastuzumab)或阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla)及視情況一或多個其他治療部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)及/或多西他賽)。 在一些實施例中，舉例而言，在轉移性乳癌之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)及視情況其他治療部分，例如蒽環黴素(例如多柔比星或表柔比星)及/或艾日布林(eribulin)。 在另一實施例中，舉例而言，在轉移性或復發性乳癌或BRCA突變體乳癌之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及甲地孕酮(megestrol)及視情況其他治療部分。 在其他實施例中，舉例而言，在BR-TNBC之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕尼(rucaparib)及維利帕尼(veliparib))及視情況其他治療部分。 在另一實施例中，組合療法包含使用抗-TNFSF9抗體或ADC及PARP抑制劑及視情況一或多個其他治療部分。 在另一實施例中，舉例而言，在乳癌之治療中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及環磷醯胺及視情況其他治療部分(例如多柔比星、紫杉烷、表柔比星、5-FU及/或胺甲喋呤)。 在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及阿法替尼(afatinib)及視情況一或多個其他治療部分(例如埃羅替尼(erlotinib)及/或貝伐珠單抗(bevacizumab))。 在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及埃羅替尼及視情況一或多個其他治療部分(例如貝伐珠單抗)。 在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及塞瑞替尼(ceritinib) (Zykadia)及視情況一或多個其他治療部分。 在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及克唑替尼(crizotinib) (Xalcori)及視情況一或多個其他治療部分。 在另一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況一或多個其他治療部分(例如吉西他濱或紫杉烷，例如多西他賽或太平洋紫杉醇；及/或鉑類似物)。 在另一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況環磷醯胺。 在一特定實施例中，用於治療鉑抗性腫瘤之組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及多柔比星及/或依託泊苷及/或吉西他濱及/或長春瑞濱及/或異環磷醯胺及/或甲硫四氫葉酸(leucovorin)調節之5-氟尿嘧啶(5-fluoroucil)及/或貝伐珠單抗及/或他莫昔芬；及視情況一或多個其他治療部分。 在所選實施例中，所揭示抗體及ADC可與某些類固醇組合使用以可能使得治療過程更為有效且減少副效應(例如發炎、噁心及過敏)。可與本發明ADC組合使用之實例性類固醇包含(但不限於)氫化可體松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)及普賴蘇濃(prednisolone)。在尤佳態樣中，類固醇包括地塞米松。 在一些實施例中，抗-TNFSF9抗體或ADC可與各種一線黑色素瘤治療組合使用。在一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及達卡巴嗪(dacarbazine)及視情況一或多個其他治療部分。在其他實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及替莫唑胺(temozolamide)及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及基於鉑之治療部分(例如卡鉑或順鉑)及視情況一或多個其他治療部分。在一些實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及長春花生物鹼治療部分(例如長春鹼、長春瑞濱、長春新鹼或長春地辛)及視情況一或多個其他治療部分。在一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及介白素-2及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療部分。 在其他實施例中，抗-TNFSF9抗體或ADC可與輔助黑色素瘤治療及/或手術程序(例如腫瘤切除術)組合使用。在一實施例中，組合療法包括使用抗-TNFSF9抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療部分。 本發明亦提供抗-TNFSF9抗體或ADC與放射療法之組合。本文所用之術語「放射療法」意指用於在腫瘤細胞內誘導局部DNA損害之任一機制，例如γ-輻照、X射線、UV-輻照、微波、電子發射及諸如此類。亦涵蓋使用放射性同位素至腫瘤細胞之定向遞送之組合療法，且可與本文所揭示之抗-TNFSF9抗體偶聯物組合使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個連續劑量投與。 在其他實施例中，抗-TNFSF9抗體或ADC可與下述一或多種化學治療劑組合使用。 D.抗癌劑 本文所用之術語「抗癌劑」係「治療部分」之一個子集，該「治療部分」進而係闡述為「醫藥活性部分」之藥劑的子集。更特定而言，「抗癌劑」意指可用於治療細胞增殖性病症(例如癌症)之任何藥劑(或其醫藥上可接受之鹽)，且包含(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應修飾劑、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。應注意，抗癌劑之前述分類並不彼此排斥且所選藥劑可屬一或多個種類中。舉例而言，相容抗癌劑可歸類為細胞毒性劑及化學治療劑。因此，前述術語中之每一者應根據本發明且然後根據其在醫學技術中之應用來加以解釋。 在較佳實施例中，抗癌劑可包含抑制或消除或經設計以抑制或消除癌性細胞或可能變成癌性或生成致瘤子代(例如致瘤細胞)之細胞的任何化學劑(例如化學治療劑)。就此而言，所選化學劑(細胞週期依賴性藥劑)通常針對為細胞生長或分裂所需之細胞內過程，且因此可尤其有效地針對通常快速生長及分裂之癌性細胞。舉例而言，長春新鹼使微管解聚合，且由此抑制快速分裂細胞進入有絲分裂。在其他情形下，所選化學劑係細胞週期獨立性藥劑，其在細胞生命週期之任一點處干擾細胞存活且可有效用於定向治療(例如ADC)中。舉例而言，某些吡咯并苯并二氮呯結合至細胞DNA之小溝且在遞送至細胞核後抑制轉錄。就組合療法或ADC組份之選擇而言，應瞭解，熟習此項技術者可易於根據本發明來鑑別相容細胞週期依賴性藥劑及細胞週期獨立性藥劑。 在任一情形下，且如上文所提及，應瞭解，除所揭示抗-TNFSF9抗體及本文所揭示之ADC外，所選抗癌劑可彼此組合投與(例如CHOP療法)。此外，應進一步瞭解，在所選實施例中，該等抗癌劑可包括偶聯物且可在投與之前與抗體締合。在某些實施例中，使所揭示抗癌劑連接至抗-TNFSF9抗體以提供如本文所揭示之ADC。 如本文中所使用，術語「細胞毒性劑」 (或細胞毒素)通常意指對細胞具有毒性之物質，其中該物質降低或抑制細胞功能及/或引起腫瘤細胞之破壞。在某些實施例中，該物質係衍生自活有機體之天然分子或其類似物(自天然來源純化或以合成方式製得)。細胞毒性劑之實例包含(但不限於)細菌之小分子毒素或酶促活性毒素(例如卡奇黴素、白喉毒素、假單胞菌屬內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A (Staphylococcal enterotoxin A))、真菌之小分子毒素或酶促活性毒素(例如α-帚麴菌素、侷限麴菌素)、植物之小分子毒素或酶促活性毒素(例如相思子素、蓖麻毒素、莫迪素(modeccin)、槲寄生素、商陸抗病毒蛋白、皂草素、白樹毒素、苦瓜毒素、天花粉蛋白、大麥毒素、光桐油(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca mericana)蛋白[PAPI、PAPII及PAP-S]、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、米特格林(mitegellin)、侷限麴菌素、酚黴素、新黴素及單端孢黴烯)或動物之小分子毒素或酶促活性毒素(例如細胞毒性RNA酶，例如細胞外胰臟RNA酶；DNA酶I，包含其片段及/或變體)。其他相容細胞毒性劑(包含某些放射性同位素、類美登素、奧裡斯他汀、多拉斯他汀、多卡米星、瓢菌素及吡咯并苯并二氮呯)陳述於本文中。 更通常而言，可與本發明抗體組合使用(或偶聯)之細胞毒性劑或抗癌劑之實例包含(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、阿那曲唑、瓢菌素、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基蜜胺、多聚乙醯、喜樹鹼(camptothecin)、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素(bryostatin)、海綿他汀(callystatin)、CC-1065、塞瑞替尼、克唑替尼、念珠藻素(cryptophycin)、多拉斯他汀、多卡米星、艾榴塞洛素(eleutherobin)、埃羅替尼、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑制素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙磷酸鹽、埃斯培拉黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麯黴素、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C、坎磷醯胺(canfosfamide)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、放線菌素D、柔紅黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星、表柔比星、依索比星(esorubicin)、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼(gefitinib)、艾達黴素、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮、絲裂黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、帕唑帕尼(pazopanib)、派來黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素、三鐵阿黴素(quelamycin)、雷帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉菲尼(sorafenib)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、塞替派(tepadina)、替比法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、氟氯唑(vorozole)、XL-147、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺藥、葉酸補充劑(例如亞葉酸)、醋葡醛內酯(aceglatone)、醛磷醯胺糖苷(aldophosphamide glycoside)、胺基乙醯丙酸、乙炔脲嘧啶(eniluracil)、安吖啶、貝司特布斯(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鳥胺酸(elfornithine)、伊利醋銨(elliptinium acetate)、埃博黴素、乙環氧啶(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多糖、氯尼達明(lonidainine)、類美登素、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌達醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、噴斯他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸、2-乙基醯肼、苯卡巴肼(procarbazine)、多糖複合物、雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；SF-1126、西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2''-三氯三乙胺；單端孢黴烯(T-2毒素、黏液黴素(verracurin) A、桿孢菌素(roridin) A及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)；環磷醯胺；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇(taxoid)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼；長春瑞濱；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙；道諾黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；依班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視色素；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲硫四氫葉酸；奧沙利鉑(oxaliplatin)；XL518、減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A抑制劑及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。此定義亦包含用於調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素劑及選擇性雌激素受體抗體、抑制芳香酶、調控腎上腺中之雌激素產生之芳香酶抑制劑及抗雄激素劑；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶(例如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑)；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN® 拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯培拉黴素及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。 相容細胞毒性劑或抗癌劑亦可包括在商業上或臨床上可獲得之化合物，例如埃羅替尼(TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(TAXOTERE®, Sanofi-Aventis)、5-FU (氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS編號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®, Lilly)、PD-0325901 (CAS編號391210-10-9, Pfizer)、順鉑(順式-二胺、二氯鉑(II)，CAS編號15663-27-1)、卡鉑(CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®, Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS編號85622-93-1、TEMODAR®、TEMODAL®, Schering Plough)、他莫昔芬((Z )-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N ,N -二甲基乙胺、NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)及多柔比星(ADRIAMYCIN®)。其他在商業上或臨床上可獲得之抗癌劑包括奧沙利鉑(ELOXATIN®, Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®, Millennium Pharm.)、舒癌特(sutent)(SUNITINIB®、SU11248, Pfizer)、來曲唑(FEMARA®, Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate) (GLEEVEC®, Novartis)、XL-518 (Mek抑制劑，Exelixis, WO 2007/044515)、ARRY-886 (Mek抑制劑、AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca)、SF-1126 (PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235 (PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147 (PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584 (Novartis)、氟維司群(FASLODEX®, AstraZeneca)、甲硫四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®, Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB®、GSK572016, Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASAR™、SCH 66336, Schering Plough)、索拉菲尼(NEXAVAR®、BAY43-9006, Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®, AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®、CPT-11, Pfizer)、替比法尼(ZARNESTRA™, Johnson & Johnson)、ABRAXANE™ (不含Cremophor)、太平洋紫杉醇之白蛋白改造之奈米顆粒調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Il)、凡德他尼(rINN、ZD6474、ZACTIMA®, AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571 (SU 5271；Sugen)、替西羅莫司(temsirolimus，TORISEL®, Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷醯胺(TELCYTA®, Telik)、塞替派及環磷醯胺(CYTOXAN®, NEOSAR®)；長春瑞濱(NAVELBINE®)；卡培他濱(XELODA®, Roche)、他莫昔芬(包含NOLVADEX®；檸檬酸他莫昔芬、FARESTON® (檸檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))、MEGASE® (乙酸甲地孕酮)、AROMASIN® (依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、RIVISOR® (氟氯唑)、FEMARA® (來曲唑；Novartis)及ARIMIDEX® (阿那曲唑；AstraZeneca))。 術語「醫藥上可接受之鹽」或「鹽」意指分子或大分子之有機或無機鹽。酸加成鹽可利用胺基形成。實例性鹽包含(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、水楊酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(亦即1,1′亞甲基-雙-(2-羥基3-萘酸鹽))。醫藥上可接受之鹽可涉及納入另一分子，例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。相對離子可為穩定母體化合物上之電荷之任一有機或無機部分。另外，醫藥上可接受之鹽可在其結構中具有一個以上之帶電原子。在多個帶電原子為醫藥上可接受之鹽之一部分時，該鹽可具有多個相對離子。因此，醫藥上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。 類似地，「醫藥上可接受之溶劑合物」或「溶劑合物」係指一或多個溶劑分子及一個分子或大分子之締合體。形成醫藥上可接受之溶劑合物之溶劑之實例包含(但不限於)水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。 在其他實施例中，本發明之抗體或ADC可與目前臨床試驗或市售之諸多抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。所揭示抗體可與選自由以下組成之群之抗體組合使用：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿福圖珠單抗(afutuzumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、阿托珠單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、阿納莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿替珠單抗、阿維魯單抗、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗、比伐單抗(bivatuzumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立瓦妥珠單抗(clivatuzumab)、可那木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、地莫單抗(detumomab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、德瓦魯單抗、杜昔妥單抗(dusigitumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、法來妥珠單抗(farletuzumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達妥昔單抗(indatuximab)、伊珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹木單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛伏珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)、納那妥單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼沃魯單抗、諾非圖單抗(nofetumomabn)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧拉帕尼、昂妥珠單抗(onartuzumab)、莫奧珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕圖珠單抗(parsatuzumab)、帕圖單抗(patritumab)、派姆單抗、帕圖莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗、匹利珠單抗、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉妥木單抗(racotumomab)、拉圖單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、司妥佐單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他妥珠單抗(tacatuzumab)、他妥莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替普莫單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗、托卡珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃妥珠單抗(vorsetuzumab)、沃圖莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MEDI0680、MDX-1105及其組合。 其他實施例包含經批准用於癌症療法之抗體之使用，該等抗體包含(但不限於)利妥昔單抗、吉妥單抗(gemtuzumab ozogamcin)、阿侖珠單抗、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕替木單抗(patitumumab)、奧法木單抗、伊匹木單抗及貝倫妥單抗-維多汀(brentuximab vedotin)。熟習此項技術者將能夠容易地鑑別與本文之教示內容相容之其他抗癌劑。 E.放射療法 本發明亦提供抗體或ADC與放射性療法(亦即用於誘導腫瘤細胞內之局部DNA損害之任何機制，例如γ-輻照、X射線、UV-輻照、微波、電子發射及諸如此類)之組合。亦涵蓋使用將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之組合療法，且所揭示之抗體或ADC可與靶向抗癌劑或其他靶向方式結合使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。輻射療法可投與患有頭頸癌之個體達約6至7週。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個連續劑量投與。 VIII.適應症 本發明提供本發明之抗體及ADC用於診斷、治療診斷、治療及/或預防各種病症(包含由病原體引起之贅瘤性、發炎性、血管生成及免疫學病症及病症)之用途。在某些實施例中，擬治療疾病包括贅瘤性病狀，包括實體腫瘤。在其他實施例中，擬治療疾病包括血液學惡性腫瘤。在某些實施例中，使用本發明之抗體或ADC來治療腫瘤或表現TNFSF9決定子之致瘤細胞。較佳地，擬治療之「個體」或「患者」係人類，但本文所用之該等術語明確包括任何哺乳動物物種。 應瞭解，可使用本發明之化合物及組合物來治療處於不同疾病階段及其治療循環之不同點之個體。因此，在某些實施例中，使用本發明之抗體及ADC作為一線療法且投與先前並未針對癌性病狀進行治療之個體。在所選實施例中，可使用本發明之化合物及組合物來治療患有復發性腫瘤之個體。在一些實施例中，使用本發明之化合物及組合物來治療先前已進行治療(使用本發明之抗體或ADC或使用其他抗癌劑)且已復發或經測定對於先前治療為難治性之個體。在其他實施例中，使用本發明之抗體及ADC來治療二線及三線患者(亦即彼等先前已分別針對相同病狀治療一或兩次之個體)。其他實施例包括治療已針對相同或相關病狀使用所揭示TNFSF9 ADC或使用不同治療劑治療三次或更多次之四線或更高級患者(例如胃癌或結腸直腸癌患者)。 在某些態樣中，增殖性病症包括實體腫瘤，包含(但不限於)腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食道腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤(小細胞及非小細胞)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他較佳實施例中，所揭示ADC可尤其有效地治療結腸直腸癌及在所選態樣中胃癌、非小細胞肺癌或乳癌。在某些實施例中，肺癌對於蒽環黴素及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽(larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))係難治性、復發性或抵抗性。在本發明之其他態樣中，可使用所揭示抗體及ADC來治療髓質甲狀腺癌、大細胞神經內分泌癌瘤(LCNEC)、神經膠母細胞瘤、神經內分泌前列腺癌(NEPC)、高級胃腸胰臟癌(GEP)及惡性黑色素瘤。 更通常而言，根據本發明經受治療之實例性贅瘤性病狀可為良性或惡性；實體腫瘤或血液學惡性腫瘤；且可選自包含(但不限於)以下之群：腎上腺瘤、AIDS相關癌症、軟組織腺泡狀肉瘤、星形細胞瘤、自主神經節瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌瘤)、囊胚腔病症、骨癌(牙釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌症、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、良性皮膚纖維組織細胞瘤、結締組織增殖性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維發育不良、膽囊及膽管癌、胃癌、胃腸疾病、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、腺病、頭頸癌、下視丘癌、腸癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝臟癌症(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬球病症、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦脊髓膜瘤、髓質甲狀腺癌、多發性內分泌瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、外周神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、前列腺癌、後代眼色素層黑色素瘤、罕見血液病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌、胃癌、間質病症、滑膜肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。 在某些態樣中，增殖性病症包括實體腫瘤，包含(但不限於)腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、黑色素瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食道腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤(小細胞及非小細胞)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在所選態樣中且如下文實例中所展示，所揭示ADC可可尤其有效治療結腸直腸癌、非小細胞肺癌、胃癌、腎癌、乳癌及胰臟癌。 在某些較佳實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與患有肺癌、胃癌、胰臟癌或結腸直腸癌之前線患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與患有相同病況之二線患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與具有肺癌、結腸直腸癌、胃癌或胰臟癌之三線患者。 所揭示ADC可尤其有效地治療胃癌，包含腸型、瀰漫型、胃賁門、胃基質型、類癌及戒環細胞胃腺癌。在一實施例中，胃癌對於輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)或其組合係難治性、復發性或抵抗性。在所選實施例中，可將抗體及ADC投與展現非轉移性或轉移性胃癌之患者。在其他實施例中，將向以下患者投與所揭示之偶聯抗體：難治性患者(亦即在初始療法進程期間或在完成初始療法進程後不久疾病復發之彼等)；敏感患者(亦即在一級療法後長於2-3個月復發之彼等)；或對放射、5-氟尿嘧啶及/或基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)展現抗性之患者。在每一情形下，應瞭解，端視所選投藥方案及臨床診斷，相容ADC可與其他抗癌劑組合使用。 在某些較佳實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與前線胃癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與二線胃癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與三線胃癌患者。 在其他所選態樣中，所揭示ADC可尤其有效地治療結腸直腸癌，包含腺癌、黏液腺癌、腸類癌、腸基質癌、平滑肌肉瘤、鱗狀細胞癌瘤、神經內分泌癌瘤及小腸、結腸及直腸之戒環細胞癌瘤。在一實施例中，結腸直腸癌對於輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向劑、VEGF受體靶向劑、EGFR靶向劑及其組合係難治性、復發性或抵抗性。在所選實施例中，可將抗體及ADC投與展現非轉移性或轉移性結腸直腸癌之患者。在其他實施例中，將所揭示偶聯抗體投與難治性患者(亦即疾病在初始療法進程期間或在完成初始療法進程之後不久復發者)、敏感性患者(亦即在一級療法之後復發長於2-3個月者)或對輻射、5-氟尿嘧啶、基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)、VEGF-A靶向劑、VEGF受體靶向劑及/或EGFR靶向劑展現抗性之患者。在每一情形下，應瞭解，端視所選投藥方案及臨床診斷，相容ADC可與其他抗癌劑組合使用。 因此，在某些較佳實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與前線結腸直腸癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與二線結腸直腸癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與三線結腸直腸癌患者。 在其他所選態樣中，所揭示ADC可尤其有效地治療肺癌(包含肺腺癌、小肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC) (例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌))。在一實施例中，肺癌對於基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)係難治性、復發性或抵抗性。在另一實施例中，擬治療個體患有大細胞神經內分泌癌瘤(LCNEC)。在其他實施例中，可使用所揭示組合物來治療肺腺癌。 在所選實施例中，可向展現侷限期疾病或擴散期疾病之肺癌患者投與抗體及ADC。在包括肺癌之其他實施例中，將所揭示偶聯抗體投與難治性患者(亦即疾病在初始療法進程期間或在完成初始療法進程之後不久復發者)；敏感性患者(亦即在一級療法之後復發長於2-3個月者)；或對基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋紫杉醇、拉羅他賽或卡巴他賽)展現抗性之患者。 在一特定態樣中，可使用所揭示ADC來治療小細胞肺癌。就該等實施例而言，可將偶聯調節劑投與展現侷限期疾病之患者。在其他實施例中，將所揭示ADC投與展現擴散期疾病之患者。在其他較佳實施例中，將所揭示ADC投與難治性患者(亦即在初始療法進程期間或在完成初始療法進程之後不久復發者)或復發性小細胞肺癌患者。其他實施例包括將所揭示ADC投與敏感性患者(亦即在一級療法之後復發長於2-3個月)。在每一情形下，應瞭解，端視所選投藥方案及臨床診斷，相容ADC可與其他抗癌劑組合使用。 在其他態樣中，可使用所揭示ADC來治療非小細胞肺癌。就該等實施例而言，可將偶聯調節劑投與展現侷限期疾病之患者。在其他實施例中，將所揭示ADC投與展現擴散期疾病之患者。在其他較佳實施例中，將所揭示ADC投與難治性患者(亦即在初始療法進程期間或在完成初始療法進程之後不久復發者)或復發性小細胞肺癌患者。其他實施例包括將所揭示ADC投與敏感性患者(亦即在一級療法之後復發長於2-3個月)。在每一情形下，應瞭解，端視所選投藥方案及臨床診斷，相容ADC可與其他抗癌劑組合使用。 因此，在某些較佳實施例中，可本發明之TNFSF9 ADC投與前線肺癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與二線肺癌患者。在其他實施例中，可將本發明之TNFSF9 ADC投與三線肺癌患者。 就血液學惡性腫瘤而言，應進一步瞭解，本發明之化合物及方法可尤其有效地治療各種白血病(包含急性骨髓樣白血病(AML，已知其基於FAB命名(M0-M7)、WHO分類、分子標記物/突變、核型、形態及其他特性之各種亞型)、譜系急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性骨髓樣白血病(CML)、慢性淋巴球性白血病(CLL)、毛細胞白血病(HCL)、慢性骨髓單核球性白血病(CMML)、青少年骨髓單核球性白血病(JMML)及巨粒淋巴球性白血病(LGL))以及B-細胞淋巴瘤(包含何傑金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma) (經典何傑金氏淋巴瘤及結節淋巴球為主何傑金氏淋巴瘤)、非何傑金氏淋巴瘤(包含瀰漫性大B-細胞淋巴瘤(DLBCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、低級/NHL濾泡性細胞淋巴瘤(FCC)、小淋巴球性淋巴瘤(SLL)、黏膜相關淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤(MCL)及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt lymphoma) (BL))；中級/濾泡性NHL、中級瀰漫性NHL、高級免疫母細胞性NHL、高級淋巴母細胞性NHL、高級小無核裂細胞NHL、巨塊型疾病NHL、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、AIDS相關淋巴瘤、單核球B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴腺病變、瀰漫性小核裂細胞淋巴瘤、大細胞免疫母細胞性淋巴母細胞瘤、小無核裂伯基特氏及非伯基特氏、濾泡性(主要係大細胞)淋巴瘤；濾泡性(主要係小核裂細胞)淋巴瘤；及濾泡性、混合小核裂及大細胞淋巴瘤)。參見Gaidono等人，「Lymphomas」, IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY，第2卷：2131-2145 (DeVita等人編輯，第5增刊版本，1997)。熟習此項技術者應明瞭，該等淋巴瘤通常因改變分類系統而具有不同名稱，且患有在不同名稱下分類之淋巴瘤之患者亦可受益於本發明之組合治療方案。 IX.製品 本發明包含含有一或多個容器或貯器之醫藥包裝及套組，其中容器可包括一或多個劑量之本發明之抗體或ADC。該等套組或包裝可具有診斷或治療性質。在某些實施例中，包裝或套組含有單位劑量，該單位劑量意指預定量之包括(例如)本發明之抗體或ADC且含有或不含一或多種其他藥劑及視情況一或多種抗癌劑之組合物。在某些其他實施例中，包裝或套組含有可檢測量之抗-TNFSF9抗體或ADC，且含有或不含相關報告基因分子及視情況一或多種用於檢測、量化及/或觀察癌性細胞之其他藥劑。 在任一情形下，本發明套組通常包括本發明之抗體或ADC (在適宜容器或貯器中，呈醫藥上可接受之調配物形式)及視情況一或多種抗癌劑(在相同或不同容器中)。該等套組亦可含有其他醫藥上可接受之調配物或器件，其用於診斷或組合療法。診斷器件或儀器之實例包含可用於檢測、監測、量化或剖析與增殖性病症有關之細胞或標記物(關於該等標記物之完整列表，參見上文)。在一些實施例中，該等器件可用於檢測、監測及/或量化活體內或活體外循環腫瘤細胞(例如參見WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包括致瘤細胞。本發明所涵蓋之套組亦可含有適當試劑以組合本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑(例如參見U.S.P.N. 7,422,739)。 在一或多種液體溶液中提供套組之組份時，液體溶液可為非水性，但水溶液通常較佳，且無菌水溶液尤佳。套組之調配物亦可以可在添加適宜液體時經重構之乾燥粉末或凍乾形式提供。用於重構之液體可含於單獨容器中。該等液體可包括無菌、醫藥上可接受之緩衝劑或其他稀釋劑，例如加抑菌劑注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。在該套組包括本發明之抗體或ADC與其他治療劑或藥劑之組合時，溶液可以等莫耳組合或以一種組份超過另一種組份之方式預混合。或者，在投與患者之前，本發明之抗體或ADC及任一可選抗癌劑或其他藥劑(例如類固醇)可分開保持於不同容器內。 在某些較佳實施例中，包括本發明組合物之上文所提及之套組包括指示套組內容物可用於治療、預防及/或診斷癌症之標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本。在其他較佳實施例中，套組可包括指示套組內容物可根據某一劑量或投藥方案投與以治療患有癌症之個體之標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本。在一尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本指示，套組內容物可用於治療、預防及/或診斷血液學惡性腫瘤(例如AML)或提供用於治療其之劑量或投藥方案。在其他尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀本指示，套組內容物可用於治療、預防及/或診斷肺癌(例如腺癌)或用於治療其之投藥方案。 適宜容器或貯器包含(例如)瓶、小瓶、注射器、輸注袋(靜脈內袋)等。該等容器可自各種材料(例如玻璃或醫藥相容塑膠)形成。在某些實施例中，貯器可包括無菌入口。舉例而言，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子之靜脈內溶液袋或小瓶。 在一些實施例中，該套組可含有向患者投與抗體及任何可選組份之構件，例如一或多個針或注射器(預填充或空的)、滴管、吸管或可將調配物注射或引入個體中或施加至身體之患病區域之其他此類裝置。本發明套組通常亦將包含在商業規模用封閉限制器中含有小瓶或諸如此類及其他組份之構件，例如放置且保留期望小瓶及其他裝置之吹模塑膠容器。 X.雜項 除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應具有熟習此項技術者通常所理解之含義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包含複數形式且複數術語應包含單數形式。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包含兩個終點及該等終點之間之所有點。因此，2.0至3.0之範圍包含2.0、3.0及2.0與3.0之間之所有點。 通常，本文所闡述之細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及化學之技術為業內所熟知且常用之彼等。本文結合該等技術使用之術語亦為業內所常用。除非另外指示，否則本發明之方法及技術通常係根據業內所熟知且如本說明書通篇所引用之多個參考文獻中所述之習用方法來實施。 XI.參考文獻 無論片語「以引用方式併入」是否用於具體參考文獻中，本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方式獲得之材料的完整揭示內容(包括(例如)GenBank及RefSeq中之(例如)核苷酸序列提交，及(例如) SwissProt、PIR、PRF、PDB中之胺基酸序列提交，及GenBank及RefSeq中之註解編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。前述詳細闡述及隨附實例係僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所展示及闡述之確切細節。熟習此項技術者所明瞭之變化形式包含於由申請專利範圍所定義之本發明中。本文所用之任一部分標題僅出於組織目的，且不應解釋為限制所闡述標的物。實例 藉由參照下列實例將更容易地理解上文通常闡述之本發明，該等實例係以闡釋方式提供且並不意欲對本發明加以限制。該等實例並不意欲表示下文實驗係所實施之所有實驗或唯一實驗。除非另外指示，否則份數係重量份數，分子量係重量平均分子量，溫度以℃表示，且壓力為大氣壓力或接近大氣壓力。序列表匯總 表3提供本文所包含之胺基酸及核酸序列之匯總。表 3 腫瘤細胞系匯總 PDX腫瘤細胞類型係由縮寫加其後指示特定腫瘤細胞系之數字表示。所測試試樣之傳代次數指示為隨附試樣名稱之p0-p#，其中p0指示自患者腫瘤直接獲得之未傳代試樣，且p#指示在測試之前腫瘤經由小鼠傳代之次數。如本文中所使用，腫瘤類型及亞型之縮寫在表4中展示如下：表 4 實例 1 TNFSF9 表現之鑑別 使用全轉錄組測序 為表徵實體腫瘤在其存在於癌症患者中時之細胞異質性去鑑別臨床相關治療靶，研發大PDX腫瘤庫且使用業內公認技術進行維持。經由使最初自患有各種實體腫瘤惡性腫瘤之癌症患者獲得之腫瘤細胞多次傳代來使包括大量離散腫瘤細胞系之PDX腫瘤庫在免疫受損小鼠中繁殖。低傳代PDX腫瘤代表處於其自然環境中之腫瘤，從而提供對於促成腫瘤生長及當前療法抗性之潛在機制之臨床相關視野。 如先前所提及，可將腫瘤細胞在廣義上分成兩類細胞亞群體：非致瘤細胞(NTG)及腫瘤起始細胞(TIC)。TIC能夠在移植至免疫受損小鼠中時形成腫瘤。癌症幹細胞(CSC)係能夠無限自我複製同時維持多種分化之能力之TIC之子組。NTG儘管有時能夠在活體內生長，但不能在移植時形成重現原始腫瘤之異質性之腫瘤。 為實施全轉錄組分析，在PDX腫瘤達到800 - 2,000 mm3 之後自小鼠切除PDX腫瘤或在骨髓中確定白血病之後(＜5%之人類起源之骨髓細胞性)切除AML。使用業內公認之酶促消解技術將所切除PDX腫瘤解離至單細胞懸浮液中(例如參見U.S.P.N. 2007/0292414)。將經解離本體腫瘤細胞與4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)一起培育以檢測死亡細胞，與抗小鼠CD45及H-2Kd 抗體一起培育以鑑別小鼠細胞且與抗人類EPCAM抗體一起培育以鑑別人類細胞。另外，將腫瘤細胞與經螢光偶聯之抗人類CD46及/或CD324抗體一起培育以鑑別CD46hi CD324+ CSC或CD46lo/- CD324- NTG細胞且然後使用 FACSAria細胞分選器(BD Biosciences)進行分選(參見U.S.P.N 2013/0260385、2013/0061340及2013/0061342)。 藉由以下方式自腫瘤細胞提取RNA：在補充有1% 2-巰基乙醇之RLTplus RNA裂解緩衝液(Qiagen)中裂解細胞，在-80℃下冷凍裂解物且然後解凍裂解物以用於使用RNeasy分離套組(Qiagen)進行RNA提取。使用Nanodrop分光光度計(Thermo Scientific)及/或Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)量化RNA。自各種來源(Life Technology、Agilent、ScienCell、BioChain及Clontech)購買正常組織RNA。藉由遺傳測序及基因表現分析來評價所得總RNA製劑。 更特定而已，使用兩種不同系統來實施高品質RNA之全轉錄組測序。使用Applied Biosystems (ABI) Sequencing by Oligo Ligation/Detection (SOLiD) 4.5或SOLiD 5500xl次世代測序系統(Life Technologies)分析一些試樣。使用Illumina HiSeq 2000或2500次世代測序系統(Illumina)分析其他試樣。 利用自1 ng來自本體腫瘤試樣之總RNA生成之cDNA使用來自ABI之經設計用於低輸入總RNA的經修改全轉錄組方案或Ovation RNA-Seq系統V2™ (NuGEN Technologies)來實施SOLiD全轉錄組分析。將所得cDNA文庫片段化，且添加條碼適配器以容許在測序運行期間彙集來自不同試樣之片段文庫。藉由SOLiD平臺生成之數據定位至如使用所公開人類基因組之NCBI hg19.2版藉由RefSeq 47版註解之34,609個基因，且提供大部分試樣中之RNA量之可驗證量測。使用定位於基因之外顯子區域之度量RPM (每百萬讀段)或RPKM (每百萬每千鹼基讀段)將來自SOLiD平臺之測序數據標稱表示為轉錄本表現值，此使得能夠將基本基因表現分析正規化且列舉為RPM_轉錄本或RPKM_轉錄本。就此而言，圖2A展示，在與相應NTG試樣(空白條)及正常組織(灰色條)比較時，TNFSF9 mRNA在CR及PA CSC群體(黑色條)中有所升高。 使用使用5 ng萃取自如上文所闡述分離之NTG或CSC腫瘤亞群體提取之總RNA生成之cDNA實施Illumina全轉錄組分析。使用TruSeq RNA試樣製備套組v2 (Illumina, Inc.)產生文庫。將所得cDNA文庫片段化且條碼化。使用定位於基因之外顯子區域之度量FPKM (每百萬每千鹼基讀段)將來自Illumina平臺之測序數據標稱表示為片段表現值，此使得能夠將基本基因表現分析正規化且列舉為RPKM轉錄本。如圖2B中所展示，CR、PA及GA CSC癌症幹細胞亞群體(黑色條)中之TNFSF9 mRNA表現通常高於正常細胞(灰色條)及NTG細胞群體(白色條)中之表現。 CR、PA及GA腫瘤CSC群體中之升高之TNFSF9 mRNA表現之鑑別指示，TNFSF9值得進一步評估為潛在診斷及免疫治療靶。另外，與NTG相比CSC在CR、PA及GA PDX腫瘤中之增加TNFSF9之表現指示，TNFSF9係該等腫瘤類型中之致瘤細胞之良好標記物。實例 2 使用 qRT-PCR 表現腫瘤中之 TNFSF9 mRNA 為證實腫瘤細胞中之TNFSF9 RNA表現，根據工業標準方案使用Fluidigm BioMark™ HD系統針對各種PDX細胞系實施qRT-PCR。如實例1中所闡述自本體PDX腫瘤細胞或經分選CSC及NTG亞群體提取RNA。根據製造商說明書使用高容量cDNA Archive套組(Life Technologies)將1.0 ng RNA轉化成cDNA。然後將使用TNFSF9探針特異性Taqman分析預擴增之cDNA材料用於後續qRT-PCR實驗。 將正常組織(NormTox或Norm)中之TNFSF9表現與CR、GA、LU-Ad、LU-SCC、OV及PAC/PDAC PDX腫瘤細胞系中之表現進行比較(圖3；每一點代表每一個別組織或PDX細胞系之平均相對表現，其中小水平線代表幾何平均值)。「NormTox」代表下列各種正常組織之試樣：腎上腺、結腸、背根神經節、內皮細胞(動脈、靜脈)、食道、心臟、腎、肝、肺、胰臟、骨骼肌、皮膚(纖維母細胞、角質細胞)、小腸、脾、胃及氣管。稱為「Norm」之另一組正常組織代表具有與ADC型藥物相關之假定較低毒性風險之正常組織的下列試樣：末梢血單核細胞及各種分選亞群體(B細胞、單核球、NK細胞、嗜中性球、T細胞)、脂肪、腦、乳房、黑素細胞、正常骨髓及各種分選亞群體、卵巢、前列腺及睪丸。圖3展示，平均而言，TNFSF9表現GA及CR、LU-Ad、LU-SCC、OV及PAC.PDAC之子組中有所升高，但該等腫瘤樣品中之幾何平均值整體較低。此數據支持TNFSF9在GA及所選CR、LU、OV及PA PDX中與在大部分正常組織中相比之升高表現之早期發現。實例 3 使用微陣列分析測定 TNFSF9 mRNA 在腫瘤中之表現 實施微陣列實驗以測定TNFSF9在各種腫瘤細胞系中之表現程度且如下所述來分析數據。實質上如實例1中所闡述自CR、GA、LU-Ad、LU-SCC、OV及PAC/PDAC細胞系提取1-2 µg全腫瘤總RNA。另外，自正常組織(例如結腸、心臟、腎、肝、肺、卵巢、胰臟、皮膚、脾、PBMC及胃)之試樣提取RNA。使用Agilent SurePrint GE人類8x60 v2微陣列平臺(其含有50,599個針對人類基因體中之27,958種基因及7,419種lncRNA所設計之生物探針)分析RNA試樣。使用標準工業實踐來正規化及轉變強度值以量化每一試樣之基因表現。將每一試樣中TNFSF9表現之正規化強度繪圖於圖4中且藉由水平條指示針對每一腫瘤類型所導出之幾何平均值。 圖4之仔細審查展示，與正常組織相比，TNFSF9表現大部分GA及CR腫瘤細胞系及LU-Ad、LU-SCC、OV及PAC/PDAC之腫瘤試樣之實質性子組中有所上調。據觀察，上文所提及之腫瘤類型中之TNFSF9表現有所升高，此可證實先前實例之結果。特定而言，所有三個平臺上之CR及GA腫瘤試樣分析展示實質上升高之TNFSF9表現。更通常而言，該等數據顯示，TNFSF9表現於諸多腫瘤亞型(包含LU-Ad、LU-SCC、OV及PAC/PDAC)中之大部分中，且可為用於研發該等適應症中之基於抗體之治療劑之良好靶。實例 4 使用癌症基因體圖譜之腫瘤中之 TNFSF9 表現 使用稱為癌症基因體圖譜(TCGA)之原發性腫瘤及正常試樣之較大公開獲得資料組來證實hTNFSF9 mRNA在各種腫瘤中之過度表現。自TCGA數據平臺(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp) 下載來自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平臺之hTNFSF9表現數據且加以分析以彙集來自每一基因之個別外顯子之讀段，從而生成單一值讀段/千鹼基外顯子/百萬定位讀段(RPKM)。圖5展示，與正常組織相比，TNFSF9表現在一些CR、GA、LU-Ad、LU-SCC、OV及PA腫瘤中有所升高。該等數據進一步證實， TNFSF9 mRNA之升高含量可發現於各種腫瘤類型中，從而指示抗-TNFSF9抗體及ADC可用於治療該等過度表現腫瘤。實例 5 重組 TNFSF9 蛋白之選殖及表現及 過度表現細胞表面 TNFSF9 蛋白之細胞系 之 改造 人類 TNFSF9 (hTNFSF9) 慢病毒 DNA 構築體 為生成過度表現全長hTNFSF9蛋白之細胞系，藉由將密碼子最佳化合成DNA片段(GeneArt)亞選殖至慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (System Biosciences)之多選殖位點中來構築含有編碼hTNFSF9蛋白(源自NCBI登陸號NM_003811)之開放閱讀框之慢病毒載體。合成片段亦在hTNFSF9開放閱讀框之3’端含有框內天門冬胺酸/離胺酸-標籤。所得慢病毒載體pLMEGPA-hTNFSF9-CFlag係雙重啟動子慢病毒構築體，其獨立於驅動copGFP T2A Puro報告基因及可選標記物之表現之下游EF1啟動子採用CMV啟動子來驅動加C-末端天門冬胺酸/離胺酸標籤之hTNFSF9蛋白的表現。T2A序列促進肽鍵縮合之核糖體跳躍，從而獲得以下兩種獨立蛋白質之表現：高含量表現T2A肽上游之報告基因copGFP且共表現T2A肽下游之Puro可選標記蛋白以容許在嘌呤黴素存在下選擇轉導細胞。編碼 hTNFSF9 細胞外結構域 (ECD) 融合蛋白之 DNA 構築體。 為生成含有hTNFSF9蛋白之ECD之融合蛋白，自GeneArt訂購編碼hTNFSF9 ECD之合成DNA片段。另外，對每一構築體實施突變以促進單體TNFSF9蛋白之產生(例如C51R處之突變)。使用標準分子技術，將該等DNA構築體亞選殖至CMV驅動之表現載體中，與免疫球蛋白κ (IgK)信號肽序列同框並在其下游，且在編碼9x-組胺酸標籤(得到pHTNFSF9ECD-His)或人類IgG2 Fc蛋白(得到pHTNFSF9ECD-Fc)之DNA上游並與其同框。該等CMV驅動之表現載體允許HEK293T及/或CHO-S細胞中之高含量瞬時表現。食蟹猴 TNFSF9 (cTNFSF9) DNA 構築體 為生成過度表現全長cTNFSF9蛋白之細胞系，藉由將cTNFSF9之密碼子最佳化合成DNA片段(GeneArt) (源自NCBI登錄號XM_005587715，在C-末端加框內天門冬胺酸/離胺酸—同位素標籤)亞選殖至慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP (System Biosciences)之多選殖位點中來構築慢病毒載體pLMEGPA-cTNFSF9-CFlag。此雙重啟動子慢病毒載體允許共表現加天門冬胺酸/離胺酸標籤之cTNFSF9蛋白以及GFP及嘌呤黴素N-乙醯基轉移酶選擇標記物。 為生成可溶性重組cTNFSF9蛋白，自GeneArt訂購編碼cTNFSF9 ECD之合成DNA片段且使用標準分子技術亞選殖至CMV驅動之表現載體中(與免疫球蛋白κ (IgK)信號肽序列同框並在其下游且在編碼9x-組胺酸標籤或人類 IgG2 Fc蛋白之DNA上游並與其同框)。TNFSF9 融合蛋白產生 使用聚乙烯亞胺聚合物作為轉染試劑，利用編碼hTNFSF9-His、hTNFSF9-Fc、cTNFSF9-His或cTNFSF9-Fc融合蛋白之表現構築體來轉染HEK293T細胞之懸浮液或黏附性培養物或CHO-S細胞懸浮液。在轉染之後3-5天，根據製造商說明書，使用Nickel-EDTA (Qiagen)或MabSelect SuRe™ 蛋白質A (GE Healthcare Life Sciences)管柱(若適用於標籤)自澄清細胞上清液純化His或Fc融合蛋白。細胞系改造 使用熟習此項技術者熟知之標準慢病毒轉導技術且使用兩種慢病毒載體-- pLMEGPA-hTNFSF9-CFlag或pLMEGPA-cTNFSF9-CFlag來分別產生過度表現hTNFSF9或cTNFSF9蛋白之基於HEK293T之穩定細胞系。使用嘌呤黴素選擇轉導細胞，隨後實施高表現HEK293T亞純系(例如對於係GFP及天門冬胺酸/離胺酸—標籤強陽性之細胞)之螢光活化之細胞分選(FACS)。實例 6 TNFSF9 抗體之生成 在第一活動中，藉由使用10 µg經等體積TiterMax® Gold佐劑(Sigma Aldrich)乳化之hTNFSF9-Fc蛋白接種一隻BALB/c小鼠、一隻CD-1小鼠及一隻FVB小鼠來產生抗-TNFSF9小鼠抗體。在初始接種後，每週兩次向小鼠注射10 µg經等體積Imject® Alum (ThermoScientific編號77161)及「CpG」 (InvivoGen ODN1826)乳化之TNFSF9蛋白。融合之前之最終注射係使用於含有「CpG」之PBS中之10 µg TNFSF9。將小鼠總共接種9次。 在第二活動中，藉由使用10 µg經等體積TiterMax® Gold佐劑(Sigma Aldrich)乳化之hTNFSF9-Fc蛋白接種兩隻BALB/c小鼠、兩隻CD-1小鼠及兩隻FVB小鼠來產生鼠類TNFSF9抗體。在初始接種後，每週兩次向小鼠注射10 µg經等體積Imject® Alum (ThermoScientific編號77161)及「CpG」 (InvivoGen ODN1826)乳化之TNFSF9蛋白。融合之前之最終注射係使用於含有「CpG」之PBS中之10 µg TNFSF9。將小鼠總共接種9次。 最後，在第三活動中，對應於發現於NP_003820中之胺基酸殘基52-83來設計肽免疫原。該等殘基對應於TNFSF9蛋白之近膜區。將其他C-末端Cys殘基附加至此序列上以使得蛋白質載劑能夠獲得標準偶聯化學。然後生成肽及偶聯至BSA、OVA、KLM或Blue載體蛋白之肽且向兩隻BALB/c小鼠、兩隻CD-1小鼠及兩隻FVB小鼠接種10 µg經等體積TiterMax® Gold佐劑(Sigma Aldrich)乳化之klh偶聯肽。在初始接種後，每週兩次向小鼠注射，三次注射10 µg經等體積Imject® Alum (ThermoScientific編號77161)及「CpG」 (InvivoGen ODN1826)乳化之klh-肽，且四次注射10ug經等體積Imject® Alum (ThermoScientific編號77161)及「CpG」乳化之bsa偶聯肽。融合之前之最終注射係使用於含有「CpG」之PBS中之10 µg klh-肽。將小鼠總共接種9次。 在每一情形下，將小鼠處死且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。藉由電細胞融合使用模型BTX Hybrimmune系統(BTX Harvard裝置)，使B細胞之單細胞懸浮液(122.5×106 個細胞)與非分泌SP2/0-Ag14骨髓瘤細胞(ATCC編號CRL-1581)以1:1之比率融合。將細胞再懸浮於由補充有氮雜絲胺酸、15%胎兒純系I血清(Thermo編號SH30080-03)、10% BM condimed (Roche編號10663573001)、1 mM非必需胺基酸(Corning編號25-025-CI)、1 mM HEPES (Corning編號25-060-CI)、100 IU青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin) (Corning編號30-002-CI)、100 IU L-麩醯胺酸(Corning編號25-005-CI)之DMEM培養基組成之雜交瘤選擇培養基中且培養於三個含有100 mL選擇培養基之T225燒瓶中。將燒瓶於含有7% CO2 及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6天。 在之融合後第6天，將雜交瘤文庫細胞暫時冷凍。將細胞在雜交瘤選擇培養基中解凍且容使其在加濕37℃培育器中靜置1天。自燒瓶分選細胞且以一個細胞/孔平鋪(使用BD FACSAria I細胞分選儀)於12 Falcon 384孔板之90 μL經補充雜交瘤選擇培養基(如上所述)中。將剩餘不用之雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中以供將來文庫測試及篩選。 將所分選選殖雜交瘤培養8天且收集上清液，重排於384孔板上，且使用如下流式細胞術針對表現於經轉染HEK/293T細胞(ATCC CRL-11268)之表面上之hTNFSF9及cTNFSF9之特異性抗體進行篩選。將每一孔中經hTNFSF9、cTNFSF9穩定轉導之293T細胞之混合物與25 μL雜交瘤上清液一起培育30分鐘且然後使用PBS/2% FCS洗滌。將細胞與25 μL/試樣稀釋於PBS/2%FCS中之Alexa Fluor® 647 AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG、Fcγ片段特異性二級抗體一起培育15分鐘，使用PBS/2%FCS洗滌兩次且再懸浮。 然後藉由流式細胞術(BD FACSCanto II)分析細胞。鑑別諸多hTNFSF9/cTNFSF9免疫特異性抗體。實例 7 TNFSF9 抗體之特性 使用各種方法針對同型、表位分倉、TNFSF9親和力及殺滅表現食蟹猴及人類TNFSF9之細胞之能力來表徵實例6中所生成之抗-TNFSF9小鼠抗體。圖6A提供匯總諸多實例性鼠類抗體之上文所提及之特性之表格。在圖6A中，空白細胞或「N/A」指示，在該情況下未生成數據。 根據製造商方案使用Milliplex小鼠免疫球蛋白同型套組(Millipore)來測定代表性數量抗體之同型。實例性TNFSF9特異性抗體之結果陳述於圖6A中之左手測欄中。 使用多樣性競爭免疫分析(Luminex)將抗體分組成倉。將100 μl每一獨特抗-TNFSF9抗體(捕獲mAb)以10 μg/mL之濃度與偶聯至抗小鼠κ抗體之磁珠(Luminex)一起培育1小時(Miller等人，2011, PMID: 21223970)。使用PBSTA緩衝液(於含有0.05% Tween20之PBS中之1% BSA)洗滌所捕獲mAb/偶聯珠粒複合物且然後彙集。在去除殘餘洗滌緩衝液後，將珠粒與2 μg/mL hTNFSF9-His蛋白一起培育1小時，洗滌且然後再懸浮於PBSTA中。將所彙集珠粒混合物分佈至96孔板(每一孔含有獨特抗-TNFSF9抗體(檢測mAb))中且在振盪下培育1小時。在洗滌步驟後，將偶聯至PE之抗小鼠κ抗體(與上文所使用者相同)以5 μg/ml之濃度添加至各孔中且培育1小時。再次洗滌珠粒且再懸浮於PBSTA中。使用Luminex MAGPIX儀器量測平均螢光強度(MFI)值。將抗體配對可視化為自抗體對之皮爾森相關係數計算之距離矩陣之樹狀圖。基於抗體對之樹狀圖及MFI值分析來測定分倉。使用空白單元表示對TNFSF9具有低親和力結合且不能置於特定倉中之抗體。數據呈現於標題為「倉」之欄中，其中圖6A展示，所篩選抗-TNFSF9抗體可根據hTNFSF9蛋白分組至至少4個獨特倉(A-D)。 藉由表面電漿共振使用Biacore 2000 (GE Healthcare)或Biacore T200測定抗-TNFSF9抗體對於人類或食蟹猴TNFSF9蛋白之動力學特性或親和力。使用抗小鼠抗體捕獲套組將小鼠抗-TNFSF9抗體固定於CM5生物感測器晶片上。在每一抗原注射循環之前，以2 μg/mL之濃度、1分鐘接觸時間及5 μL/min流速將小鼠抗體捕獲於表面上。來自基線之所捕獲抗體載量大約為80-120個反應單元(在Biacore 2000上)及30-80 (對於Biacore T200，因此儀器之增加之敏感性)。在抗體捕獲後，使實例5中所生成之單體hTNFSF9-His抗原在締合期期間以200nM之濃度流經Biacore 2000之表面，隨後以10 μL/min之流速進行4 min.解離期。在Biacore T200上，在捕獲後，使用單循環動力學方法以增加之濃度(11nM、33nM、100nM)將hTNFSF9-His連續注射3次，隨後進行3 min解離期。在每一循環後，使用1 min.接觸時間之10 mM甘胺酸(pH 1.7，10 μL/min.)再生抗小鼠抗體捕獲套組。 藉由自特異性抗體表面反應扣除對照小鼠IgG表面反應來處理數據且數據縮減至締合期及解離期。使用所得反應曲線評估在Biacore 2000上進行之實驗之抗體之動力學特性。對於收集於Biacore T200上之數據而言，利用1:1蘭格繆爾(langmuir)結合模型使用Biacore T200評估軟體(GE Healthcare)來擬合締合及解離數據。如圖6A中所展示，在標題為「Biacore」之欄下，所選抗體針對hTNFSF9展現通常在毫微莫耳範圍內之親和力。以類似方式測定對食蟹猴TNFSF9 (cTNFSF9)之親和力，其中抗體對cTNFSF9展現通常在數十毫微莫耳範圍內之親和力。 為測定本發明之抗-TNFSF9抗體是否能夠內化以調介細胞毒性劑至活腫瘤細胞之遞送，使用實例性抗-TNFSF9抗體及連接至肥皂草毒素之二級抗小鼠抗體FAB片段實施活體外細胞殺滅分析。肥皂草毒素係使核糖體鈍化、由此抑制蛋白質合成且引起細胞死亡之植物毒素。肥皂草毒素僅在細胞內具有細胞毒性，其中其可接近核糖體，但不能獨立內化。因此，該等分析中之肥皂草毒素介導之細胞毒性指示抗小鼠FAB-肥皂草毒素構築體在發生結合且相關抗-TNFSF9小鼠抗體內化至靶細胞中後內化之能力。 將過度表現hTNFSF9或cTNFSF9之HEK293T細胞之單細胞懸浮液(根據實例5製得)以及幼稚對照細胞以500個細胞/孔平鋪至BD組織培養板(BD Biosciences)中。一天後，向培養物中添加各種濃度之純化抗-TNFSF9抗體以及固定濃度之2 nM抗小鼠IgG FAB-肥皂草毒素構築體(Advanced Targeting Systems)。在培育96小時之後，根據製造商說明書使用CellTiter-Glo® (Promega)來計數活細胞。將使用含有僅使用二級FAB-肥皂草毒素偶聯物培育之細胞之培養物之原始發光計數設定為100%參考值且將所有其他計數計算為參考值的百分比。圖6A中在標記為IVK之欄中所展示之結果呈現為存活細胞之百分比。 該等數據顯示，濃度為250 pM之抗-TNFSF9抗體-肥皂草毒素偶聯物之子組以不同效能有效殺滅過度表現 hTNFSF9或cTNFSF9之HEK293T細胞(圖6A)，而幼稚293T對照在相同條件下不能消除。 為測定表位位置是否在抗體調介細胞殺滅之能力中發揮作用，以倉形式對圖6A中針對表現hTNFSF9之293細胞所陳述之殺滅數據進行繪圖以提供圖6B。圖6B之審查展示，在與如上文所陳述之肥皂草毒素聯合使用時，彼等定位至倉B及C之抗體展現較高細胞殺滅活性。該等數據指示，在用作如本文所揭示之抗體藥物偶聯物之組份時，倉B及C中之抗體可尤其有效。實例 8 腫瘤中之 TNFSF9 蛋白表現 考慮到與實例1-3中所闡述之各種腫瘤有關之升高之TNFSF9 mRNA轉錄物含量，實施一定操作以測試TNFSF9蛋白表現是否在PDX腫瘤中亦有所升高。為檢測及量化TNFSF9蛋白表現，使用MSD Discovery平臺(Meso Scale Discovery)研發電化學發光TNFSF9夾心式ELISA分析。 自小鼠切下PDX腫瘤且急凍於乾冰/乙醇上。將蛋白質提取緩衝液(Biochain Institute)添加至解凍腫瘤切片中且使用TissueLyser系統(Qiagen)粉碎。藉由離心(20,000 g, 20 min., 4℃)來澄清裂解物且使用二喹啉甲酸量化每一裂解物中之總蛋白質濃度。然後將蛋白質裂解物正規化至5 mg/mL且儲存於-80℃下直至使用。正常組織係購自商業來源。 MSD分析中所使用之ELISA夾心式抗體對係由SC113.57捕獲抗體及SC113.61檢測抗體組成。此對應仍對hTNFSF9具有特異性，此乃因捕獲抗體係TNFSF9特異性且應僅破壞TNFSF9蛋白。藉由內插來自標準蛋白質濃度曲線之值來測定來自裂解物試樣之TNFSF9蛋白濃度，標準蛋白質濃度曲線係使用純化重組hTNFSF9-His蛋白生成且如實例5中所闡述生成。TNFSF9蛋白標準曲線及蛋白質量化分析實施如下： 使用15 µL SC113.57捕獲抗體在2 µg/mL (於PBS中)及4℃下將MSD標準板塗覆過夜。在PBST中洗滌板且在振盪的同時於35 µL MSD 3%阻斷劑A溶液中阻斷一小時。在PBST中再次洗滌板。亦向各孔中添加於含有10%蛋白質提取緩衝液之MSD 1%阻斷劑A中之10 µL 10×稀釋裂解物(或連續稀釋之重組TNFSF9標準)且在振盪的同時培育兩小時。在PBST中再次洗滌板。然後根據製造商方案使用MSD® SULF0-TAG NHS Ester對SC113.61檢測抗體加磺基標籤。在室溫及振盪下經1小時，將10 µL加標籤SC113.61抗體以0.5 µg/mL (於MSD 1%阻斷劑A中)添加至洗滌板中。在PBST中洗滌板。將含有表面活性劑之MSD讀數緩衝液T在水中稀釋至1×且向每一孔中添加35 µL。在MSD Sector成像儀2400上使用積分軟體分析程式讀取板以經由自標準曲線內插來導出PDX試樣中之TNFSF9濃度。然後將值除以總蛋白質濃度以得到TNFSF9毫無克數/毫克總裂解物蛋白質。所得濃度陳述於圖7中，其中每一斑點代表源自單一PDX腫瘤系之TNFSF9蛋白濃度。儘管每一斑點係源自單一PDX系，但在大部分情形下，自相同PDX系測試多個生物試樣且將值平均化以提供數據點。 圖7展示，相對於正常組織，CR、GA、LIV、LU-Ad、OV、PA及MEL本體腫瘤試樣之代表性試樣展現升高之TNFSF9蛋白表現。以ng/mg總蛋白質形式給出每一試樣之TNFSF9蛋白表現程度且藉由水平條指示針對每一腫瘤類型所導出之中值。所測試正常組織包含腎上腺、動脈、結腸、食道、膽囊、心臟、腎、肝、肺、末梢及坐骨神經、胰臟、骨骼肌、皮膚、小腸、脾、胃、氣管、紅血細胞及白血細胞及血小板、膀胱、腦、乳房、眼睛、淋巴結、卵巢、腦下垂體、前列腺及骨髓。在任一正常組織中，未檢測到高於分析之量化下限(虛線)之TNFSF9蛋白表現程度。可看到，相對於正常組織，所選本體CR、GA、LIV、LU-Ad、OV、PA及MEL腫瘤顯示升高含量之TNFSF9。該等數據與上述針對TNFSF9表現之mRNA數據加以組合可大大強化以下主張：TNFSF9係用於基於抗體之治療干預之有吸引力靶。實例 9 TNFSF9 抗體之測序 如下文所闡述對實例6中所生成之抗-TNFSF9小鼠抗體進行測序。根據製造商說明書使用RNeasy Miniprep套組(Qiagen)自所選雜交瘤細胞純化總RNA。對每個試樣使用104 至105 個細胞。將經分離RNA試樣儲存在‑80℃下直至使用。 使用包括86個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特定前導序列引子之兩種5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3'小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。類似地，使用含有64個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5' Vκ前導序列之兩種引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一後置引子的組合來擴增κ輕鏈並測序。自100 ng總RNA使用Qiagen一步RT-PCR套組如下所述來擴增VH及VL轉錄物。對每一雜交瘤運行總共四次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行兩次且對VH重鏈運行兩次。PCR反應混合物包含1.5 μL RNA、0.4 μ 100 μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated DNA Technologies定製合成)、5 μL 5× RT-PCR緩衝液、1 μL dNTP及0.6 μL含有逆轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物。熱循環儀程式為RT步驟50℃ 60 min.、95℃ 15 min.，隨後35個循環(94.5℃ 30秒、57℃ 30秒、72℃ 1 min.)。然後最後在72℃下培育10 min。 使用與如上文針對可變區之擴增所闡述相同之特異性可變區引子來對所提取PCR產物進行測序。將PCR產物發送至進行PCR純化及測序服務之外部測序供應商(MCLAB)。使用IMGT序列分析工具(http://www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html )分析核苷酸序列以鑑別具有最高序列同源性之種系V、D及J基因成員。藉由使用專有抗體序列資料庫比對VH及VL基因與小鼠種系資料庫來將衍生序列與Ig V-及J-區之已知種系DNA序列進行比較。 圖8A繪示來自抗-TNFSF9抗體之若干新穎鼠類輕鏈可變區之鄰接胺基酸序列，而圖8B繪示來自相同抗-TNFSF9抗體之新穎鼠類重鏈可變區之鄰接胺基酸序列。總而言之，鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO: 21 - 151 (奇數)中。 更特定而已，圖8A及8B提供具有以下名稱之若干小鼠抗-TNFSF9抗體之注釋序列：SC113.14，具有SEQ ID NO: 21之VL及SEQ ID NO: 23之VH；SC113.15，具有SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；SC113.35，具有SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；SC113.36，具有SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；SC113.44，具有SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；SC113.46，具有SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；SC113.57，具有SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；SC113.61，具有SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；SC113.70，具有SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；SC113.105，具有SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；SC113.118，具有SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；SC113.119，具有SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；SC113.121，具有SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；SC113.133，具有SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；SC113.148，具有SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；SC113.150，具有SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；SC113.153，具有SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；SC113.167，具有SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；SC113.172，具有SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；SC113.187，具有SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；SC113.190，具有SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；SC113.201，具有SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；SC113.219，具有SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；SC113.301，具有SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH；SC113.310，具有SEQ ID NO: 117之VL及 SEQ ID NO: 119之VH；SC113.319，具有SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；SC113.330，具有SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；SC113.342，具有SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；SC113.400，具有SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；SC113.401，具有SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；SC113.402，具有SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；SC113.34a，具有SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；SC113.34b，具有SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 147之VH；SC113.34c，具有SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 147之VH；及SC113.51，具有SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 151之VH。 所揭示抗體(或產生其之純系)以及其各別可變區核酸或胺基酸SEQ ID NO (參見圖8A - 8C)之匯總緊接展示於下表5中。表 5 注釋圖8A及8B中之VL及VH胺基酸序列以根據Kabat等人所定義之鑑別框架區(亦即FR1 - FR4)及互補決定區(亦即圖8A中之CDRL1 - CDRL3或圖8B中之CDRH1 - CDRH3)。使用Abysis資料庫之專有版本分析可變區序列以提供CDR及FR名稱。儘管CDR係根據Kabat等人進行定義，但熟習此項技術者應瞭解，CDR及FR名稱亦可根據Chothia、McCallum或任何其他公認命名系統來定義。另外，圖8C提供編碼圖8A及8B中所陳述之胺基酸序列之核酸序列(SEQ ID NO: 20-150，偶數)。 如圖8A及8B及表5中可見，每一特定鼠類抗體之重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之SEQ ID NO.通常係連續奇數。因此，單株抗-TNFSF9抗體SC113.14之輕鏈及重鏈可變區分別包括胺基酸SEQ ID NO: 21及23；SC113.15包括SEQ ID NO: 25及27；SC113.35包括SEQ ID NO: 29及31，等等。圖8A及8B中所陳述依序編號方案之例外係：SC113.34b (SEQ ID NO: 37及147)，其包括與如抗體SC113.44中所發現相同之輕鏈可變區及與如SC113.34a及SC113.34c中所發現相同之重鏈可變區；(SEQ ID NO: 149及147)，其包括與如SC113.34a及SC113.34b中所發現相同之重鏈可變區締合之獨特輕鏈可變區；及SC113.51 (SEQ ID NO: 33及151)，其包括與純系113.36相同之輕鏈可變區以及獨特重鏈可變區。在任一情形下，編碼鼠類抗體胺基酸序列(陳述於圖8C中)之相應核酸序列具有緊接在相應胺基酸EQ ID NO.之前之SEQ ID NO。因此，舉例而言，SC113.14抗體之VL及VH之核酸序列之SEQ ID NO.分別為SEQ ID NO: 20及22。 除圖8A - 8C中之注釋序列外，圖8F及8G提供SC113.57及 SC113.118之輕鏈及重鏈可變區之CDR名稱，如使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法所測定。圖8F及8G中所繪示之CDR名稱係使用如上文所論述之Abysis資料庫之專有版本所衍生。如後續實例中所展示，熟習此項技術者應瞭解，可根據本發明將所揭示鼠類CDR移植至人類框架序列中以提供CDR移植或人類化抗-TNFSF9抗體。此外，根據本發明，可易於根據本文之教示內容測定所製備任一抗-TNFSF9抗體之CDR並測序且使用所衍生CDR序列提供CDR移植或人類化之本發明之抗-TNFSF9抗體。此尤其適用於具有圖8A - 8B中所陳述之重鏈及輕鏈可變區序列之抗體。實例 10 嵌合及人類化 TNFSF9 抗體之生成 使用業內公認技術如下所述來生成嵌合抗-TNFSF9抗體。 使用實例1中所闡述之方法自產生抗-TNFSF9抗體之雜交瘤提取總RNA，且對RNA進行PCR擴增。自本發明之抗-TNFSF9抗體之核酸序列(圖8C)獲得關於小鼠抗體之VH及VL鏈之V、D及J基因區段的數據。使用以下限制性位點設計特異性針對抗體VH及VL鏈之框架序列之引子集合：AgeI及XhoI用於VH片段，且XmaI及DraIII用於VL片段。使用Qiaquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物，然後用針對VH片段之限制酶AgeI及XhoI及針對VL片段之XmaI及DraIII消解。 將VH及VL消解之PCR產物純化且分別連接至IgH或Igκ表現載體中。在含有200 U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5 μL經消解且經純化之基因特異性PCR產物及25 ng線性化載體DNA之10 μL總體積中實施連接反應。經由在42℃下使用3 μL連接產物熱衝擊來轉變勝任大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)，且以100 μg/mL之濃度平鋪於胺苄青黴素(ampicillin)板上。在純化並消解所擴增連接產物後，將VH片段選殖至包括HuIgG1之pEE6.4表現載體(Lonza) (pEE6.4HuIgG1)之AgeI-XhoI限制性位點中，且將VL片段選殖至包括人類κ輕鏈恆定區之pEE12.4表現載體(Lonza) (pEE12.4Hu-κ)之XmaI-DraIII限制性位點中。 藉由使用pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染CHO-S細胞來表現嵌合抗體。將2.5 μg pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA添加至400 µL Opti-MEM中之15 μg PEI轉染試劑中。將混合物在室溫下培育10 min。且添加至細胞中。在轉染之後3至6天收穫上清液。藉由在800×g下離心10 min.自細胞碎片澄清含有重組嵌合抗體之培養物上清液且儲存在4℃下。使用蛋白質A珠粒純化重組嵌合抗體。 另外，藉助專有分析程式(Abysis資料庫，UCL Business)及標準分子改造技術如下所述來對所選鼠類抗-TNFSF9抗體(SC113.57及SC113.118)實施人類化。基於框架序列與人類種系抗體序列之CDR規範結構之間以及框架序列與相關小鼠抗體之CDR之間的最高同源性來選擇/設計可變區之人類框架區。出於分析目的，根據Kabat等人之編號將胺基酸分配至CDR結構域中之每一者中。在選擇可變區後，立即自合成基因區段生成(Integrated DNA Technologies)。使用上文針對嵌合抗體所闡述之分子方法選殖及表現人類化抗體。 分別自相應鼠類抗體SC113.57 (SEQ ID NO: 45及47)及SC113.118 (SEQ ID NO: 61及63)之VL及VH序列來衍生人類化抗體hSC113.57之VL及VH胺基酸序列(圖8D；SEQ ID NO: 161及163 (aa)及SEQ ID NO: 160及162 (na))及hSC113.118 (圖8D，SEQ ID NO: 165及167 (aa)及SEQ ID NO 164及166 (na))。下表6展示，在位置67及73 (Kabat編號，在圖8D中加下劃線)作出框架殘基變化以維持hSC113.57之結合親和力，但另外不使用其他框架變化。表 6 如下一實例中所論述，表6亦展示如本文所闡述製作之實例性位點特異性抗體(hSC113.57ss1)之組合物。另外，構築具有其他突變N297A之變體以改良人類化抗體之性質。 更特定而言，如實例11中所陳述，使用圖8D中所陳述之人類化VL及VH序列來製作位點特異性構築體。另外，將N297A突變(EU編號)引入人類化抗體中以減小抗體至Fc受體之結合，該結合可視為脫靶毒性之來源。可將此修飾引入ss1或野生型人類IgG1構築體中。在此情形下，將N297A修飾引入hSC113.57ss1及hSC113.118ss1抗體中，如由MJ後綴所表示(亦即hSC113.57ss1MJ及hSC113.118ss1MJ)。使用Quikchange誘變套組(ThermoFisher Scientific)將突變引入質體上以用於重鏈表現，且使用上述相同方法表現抗體並純化。 除上文所提及之VH及VL胺基酸及核酸序列(圖8D)外，圖8E亦提供用於表6中所陳述之實例性人類化抗體構築體之全長重鏈及輕鏈胺基酸序列。與每一人類化構築體有關之核酸及胺基酸序列之匯總緊接呈現於下表7中。應注意，諸多構築體採用呈不同配置之相同VL、VH或全長序列。表 7 此實例中所陳述之實例性人類化抗體顯示，可如本文所揭示來生成及衍生臨床相容抗體。在本發明之某些態樣中，可將該等抗體納入TNFSF9 ADC中以提供包括有益治療指數之組合物。此外，如下一實例中所論述，表7亦展示如本文所闡述製作之所選位點特異性抗體(hSC1133.57ss1及hSC113.118ss1)及所選位點特異性MJ抗體(hSC1133.57ss1MJ及hSC113.118ss1MJ)之序列組成。實例 11 位點特異性 TNFSF9 抗體之生成 除自然人類化IgG1抗-TNFSF9抗體(hSC113.57及hSC113.118)外，亦構築包括經突變以提供未配對半胱胺酸之自然輕鏈(LC)恆定區及重鏈(HC)恆定區之經改造人類IgG1/κ抗-TNFSF9位點特異性抗體。就此而言，HC之上鉸鏈區中之半胱胺酸220 (C220)經絲胺酸(C220S)取代以提供hSC113.57ss1及hSC113.118ss1。在組裝時，HC及LC形成在輕鏈恆定區之c-末端包括兩個適於偶聯至治療劑之游離半胱胺酸之抗體。除非另有所述，否則恆定區殘基之所有編號皆係根據EU編號方案，如Kabat等人所陳述。最後，如先前實例中所闡述，進一步改造位點特異性抗體之重鏈恆定區以納入N297A突變且提供hSC113.57ss1MJ及hSC113.118ss1MJ。 為生成人類化自然IgG1抗體及位點特異性構築體，將VH核酸選殖於含有HC恆定區(例如SEQ ID NO: 2)或其C220S突變(例如SEQ ID NO: 3)之表現載體上。在CHO-S細胞中使用編碼與野生型IgG1κ LC (SEQ ID NO: 5)可操作締合以提供hSC113.57 LC (SEQ ID NO: 170)之所選VL (hSC113.57, SEQ ID NO: 161)之載體共轉染編碼自然hSC113.57 HC (圖8E，SEQ ID NO: 171)、hSC113.57之突變體C220S HC (圖8E，SEQ ID NO: 173)或C220S N297A突變體HC (圖8E，SEQ ID NO: 175)的載體且使用哺乳動物瞬時表現系統進行表現。含有C220S突變體HC之所得抗-TNFSF9位點特異性抗體稱為hSC113.57ss1，而自然形式稱為hSC113.57及包括N297A突變hSC113.57ss1MJ之位點特異性構築體。就此而言，全長hSC113.57位點特異性抗體重鏈及輕鏈之胺基酸序列展示於圖8E中(以及自然人類化抗體hSC113.57及N297A類似物)，其中hSC113.57ss1包括分別SEQ ID NO: 170及173之LC及HC且hSC113.57包括SEQ ID NO: 170及171之LC及HC，而hSC113.57ss1MJ分別包括SEQ ID NO: 170及175之LC及HC。使用實質上相同製程且使用適當序列來提供hSC113.118類似物。兩組分子中之重鏈之位點特異性突變之位置在圖8E中加下劃線。 藉由SDS-PAGE表徵經改造抗-TNFSF9位點特異性抗體以證實已生成正確突變體。在來自Life Technologies之預澆注10% Tris-甘胺酸 mini凝膠上在存在及不存在還原劑(例如DTT (二硫蘇糖醇))下實施SDS-PAGE。在電泳後，使用膠質考馬斯溶液(coomassie solution)將凝膠染色(數據未展示)。在還原條件下，觀察到兩個對應於游離LC及游離HC之帶。此圖案典型係IgG分子在還原條件中所特有。在非還原條件下，帶圖案不同於自然IgG分子，此指示在HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚體之約98 kD帶。另外，觀察到對應於游離LC之弱帶及對應於LC-LC二聚體之約48 kD之主要帶。因每一LC之c-末端上之游離半胱胺酸，故形成一定量之 LC-LC物質。實例 12 抗 -TNFSF9 抗體 - 藥物偶聯物之製備 經由具有游離硫氫基之末端馬來醯亞胺基部分將9種鼠類及嵌合抗-TNFSF9抗體(SC113.14、SC113.44、SC113.57、SC113.62、SC113.118、SC113.121、SC113.150、SC113.153及SC113.187)及來自實例10及11之人類化抗體(自然、位點特異性及位點特異性N297A)偶聯至吡咯并苯并二氮呯細胞毒素(PBD1及PBD3)以產生抗體藥物偶聯物(ADC)。 如下所述來製備自然抗體抗-TNFSF9 ADC。 在室溫下於含有5 mM EDTA之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中，使用預定莫耳添加之mol參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)/mol抗體將抗-TNFSF9抗體之半胱胺酸鍵部分地還原90 min.。然後在室溫下經最少30 min.，經由馬來醯亞胺連接體將所得部分地還原之製劑偶聯至PBD1 (PBD1之結構提供於本說明書之上文中)。然後藉由相對於連接體-藥物添加過量N-乙醯基半胱胺酸(NAC) (使用在水中製得之10 mM儲備溶液)來終止反應。在20 min之最少驟冷時間之後，藉由添加0.5 M乙酸來將pH調節至6.0。藉由使用30 kDa膜進行滲濾來將ADC製劑緩衝液交換至滲濾緩衝液。然後使用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾抗-TNFSF9 ADC調配至靶最終濃度。分析所得抗-TNFSF9 ADC之蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物對抗體比率(DAR) (藉由反相HPLC (RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。 使用經修改部分還原製程來偶聯位點特異性人類化抗-TNFSF9 ADC (含有及不含N297突變)。期望產物係最大程度地偶聯於每一LC恆定區上之未配對半胱胺酸(C214)上且最小化藥物對抗體比率(DAR)大於2 (DAR＞2)之ADC而最大化DAR為2 (DAR=2)之ADC的ADC。為進一步改良偶聯特異性，在與連接體-藥物偶聯之前，使用包括穩定劑(例如L-精胺酸)及溫和還原劑(例如麩胱甘肽)之製程選擇性還原抗體，隨後進行滲濾及調配步驟。 在室溫下，使用預定濃度之pH 8.0經還原麩胱甘肽(GSH)在含有1M L-精胺酸/5mM EDTA之緩衝液中將每一抗體之製劑部分地還原最少兩小時。然後使用30 kDa膜(Millipore Amicon Ultra)將所以製劑緩衝液交換至20 mM Tris/3.2 mM EDTA pH 7.0緩衝液中以去除還原緩衝液。然後在室溫下經最少30 min. 經由馬來醯亞胺連接體將所得部分地還原之製劑偶聯至PBD1及PBD 3(結構提供於本說明書之上文中)。然後藉由相對於連接體-藥物添加過量NAC (使用在水中製得之10 mM儲備溶液)來終止反應。在20 min.之最少驟冷時間之後，藉由添加0.5 M乙酸來將pH調節至6.0。藉由使用30 kDa膜進行滲濾來將ADC製劑緩衝液交換至滲濾緩衝液。然後使用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾抗-TNFSF9 ADC調配至靶最終濃度。 分析所得抗-TNFSF9 ADC之蛋白質濃度(藉由量測UV)、聚集(SEC)、藥物對抗體比率(DAR) (藉由反相HPLC (RP-HPLC))及活性(活體外細胞毒性)。然後將其冷凍且儲存直至使用。實例 13 抗 -TNFSF9 抗體 調節 TNFSF9 與 TNFRSF9 之間之相互作用 實施使用Meso Scale Discovery (MSD)平臺之ELISA分析以測試實例6中所生成之抗-TNFSF9抗體拮抗或激動TNFRSF9 (受體)至TNFSF9 (配體)之結合(「TNFSF9/TNFRSF9相互作用」)的能力。就此而言，調節TNFSF9/TNFRSF9相互作用(例如在功能上激動或拮抗TNFSF9與TNFRSF9之相互作用)之實例性抗體陳述於附圖9中。數據審查指示，所選抗體可抑制或促進TNFSF9配體與其受體之結合。 使用30μl人類TNFRSF9 (R&D Systems，編號838-4B-100)以50 ng/mL (於PBS中)塗覆MSD標準板且在4℃下培育過夜。在使用含有0.05% tween20之PBS (PBST)洗滌板之後，使用於PBS中之3% (w/v) BSA在室溫下將其阻斷60 min.。在阻斷製程期間，將50 ng/ml人類TNFSF9 (R&D Systems；編號2295-4L-025/CF)與或不與1 μg/mL抗-TNFSF9抗體在於PBS + 0.05% tween 20中之1% (w/v) BSA (PBSA)中培育60 min.。在PBST中洗滌板且將25 μl抗體/蛋白質混合物添加至板中並培育120 min。在此培育步驟期間，根據製造商方案(Meso Scale Discovery，編號R32AC-5)使用MSD® 磺基-標籤NHS酯將山羊抗人類多珠抗-TNFSF9檢測抗體(R&D Systems，編號AF2295)加磺基標籤。MSD磺基-標籤NHS-酯係胺反應性N-羥基琥珀醯亞胺酯，其易於在溫和鹼性條件下偶合至蛋白質之一級胺基團以形成穩定醯胺鍵。在使用PBST洗滌之後，在室溫下經1小時添加10 μL/孔之磺基標籤標記之山羊抗人類多珠TNFSF9抗體(0.5 μg/ml，於PBSTA中)。在PBST中洗滌板且將含有表面活性劑之MSD讀數緩衝液T在水中稀釋至1×並向每一孔中添加150 µL。在MSD Sector成像儀2400上讀取板。將數據與不含抗TNFSF9抗體之孔進行比較且計算相互作用之阻斷百分比。激動抗體具有負阻斷百分比值，而拮抗抗體具有正阻斷百分比值。 如先前所提及，本發明之實例性TNFSF9特異性抗體之調節活性可以表格形式見於圖9中。令人吃驚地，據觀察，針對TNFSF9之抗體可調節TNFSF9至其受體TNFRSF9之結合(亦即TNFSF9/TNFRSF9相互作用)且增強或抑制配體與受體之間之相互作用。就此而言，在如緊接上文所陳述檢驗時，所選抗體顯示相對較寬範圍之激動及拮抗活性。 儘管不期望受限於任一特定理論或以任一方式限制本發明，但端視擬治療適應症，可期望採用拮抗或激動抗體。舉例而言，可期望增強TNFSF9調介之信號傳導(經由其受體)以活化T細胞且增強個體之免疫反應。在該等情形下，可期望使用可產生較強抗腫瘤活性之激動抗體(例如SC113.95或SC113.67)。在與配體及受體締合時，激動抗體亦可促進內化。在其他實施例中，可有益地使用阻斷配體受體相互作用之拮抗抗體。就此而言，文獻中已揭示，TNFSF9信號可抑制天然殺傷細胞(NK細胞)，在該情形下，受體-配體阻斷抗體(例如SC113.153或SC113.145)可增強NK細胞之抗腫瘤活性。實例 14 TNFSF9 表現在來自亞洲及高加索患者之胃腫瘤中有所升高 使用稱為癌症基因體圖譜(TCGA)之原發性腫瘤及正常試樣之較大公開獲得資料組來證實hTNFSF9 mRNA在來自亞洲患者及高加索患者之各種腫瘤中之過度表現。自TCGA數據平臺(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/tcgaDownload.jsp) 下載來自IlluminaHiSeq_RNASeqV2平臺之hTNFSF9表現數據且加以分析以彙集來自每一基因之個別外顯子之讀段，從而生成單一值讀段/千鹼基外顯子/百萬定位讀段(RPKM)。同時，考慮患者之種族(亦即亞洲或高加索)且用於進一步分析數據。 圖10展示，TNFSF9表現在來自亞洲及高加索患者之胃腺癌中以類似方式升高，從而進一步指示，TNFSF9可證明為各種種族患者群體中之有效免疫治療靶。實例 15 TNFSF9 表現在各種結腸直腸腫瘤亞型中有所升高 由Guinney等人(PMID: 26457759)將結腸直腸癌之4種共識分子亞型(CMS1-4)定義為：「CMS1 (微衛星不穩定性免疫，14%)，超突變、微衛星不穩定及強免疫活化；CMS2 (規範，37%)，上皮、經標記WNT及MYC信號傳導活化；CMS3 (代謝，13%)，上皮及明顯代謝失調；及CMS4 (間質，23%)，顯著轉變生長因子-β活化、基質侵襲及血管生成」。Guinney等人(PMID: 26457759)闡述隨機森林分類器，其獲取微陣列基因表現數據且輸出每一CMS分配之機率。自Synapse (Synapse ID syn2623706)下載此分類器模型之R代碼且應用於針對每一CR PDX腫瘤所獲得之Agilent微陣列資料組。將具有最高機率之CMS分配至每一PDX，且在分類器以相等機率向兩種亞型分配時，不分配亞型。 在已觀察到升高之TNFSF9蛋白表現程度在結腸直腸腺癌中發生一定程度之變化(例如參見圖7)下，獲得關於結腸直腸PDX腫瘤細胞系之MSD蛋白質量測(例如實例8中所闡述)以用於分離成個別CMS亞型之細胞群體。所得數據展示於圖11中。 就此而言，圖11指示，TNFSF9表現於所有CMS亞型中，但CMS1亞型中之中值表現略高於CMS2、3及4。數據之仔細審查展示，在大於0.04 ng/mg TNFSF9蛋白下CMS1結腸直腸腫瘤之頻率為83%，與之相比在CMS2、CMS3及CMS4中分別為大約47%、50%及44%。將CMS1亞型表徵為超突變、微衛星不穩定且具有強免疫活化。該等數據展示，該等群體可尤其易於使用所揭示抗體藥物偶聯物進行治療。實例 16 抗 -TNFSF9 抗體促進細胞毒性劑之活體外遞送 為測定本發明之抗-TNFSF9抗體是否能夠內化以調介細胞毒性劑至活腫瘤細胞之遞送，使用所選抗-TNFSF9抗體及連接至肥皂草毒素之二級抗小鼠抗體FAB片段實施活體外細胞殺滅分析。肥皂草毒素係使核糖體鈍化、由此抑制蛋白質合成且引起細胞死亡之植物毒素。肥皂草毒素僅在細胞內具有細胞毒性，其中其可接近核糖體，但不能獨立內化。因此，該等分析中之肥皂草毒素介導之細胞毒性指示抗小鼠FAB-肥皂草毒素構築體在發生結合且相關抗-TNFSF9小鼠抗體內化至靶細胞中後內化之能力。 將過度表現hTNFSF9之HEK293T細胞之單細胞懸浮液以500個細胞/孔平鋪至BD組織培養板(BD Biosciences)中。一天後，向培養物中添加各種濃度之純化抗-TNFSF9抗體(鼠類或人類化)以及固定濃度之2 nM抗小鼠IgG FAB-肥皂草毒素構築體(Advanced Targeting Systems)。在培育96小時之後，根據製造商說明書使用CellTiter-Glo® (Promega)來計數活細胞。將使用含有僅使用二級FAB-肥皂草毒素偶聯物培育之細胞之培養物之原始發光計數設定為100%參考值且將所有其他計數計算為參考值的百分比。 如圖12中可見，大子組之抗-TNFSF9抗體-肥皂草毒素偶聯物在100 pM之濃度下可有效以不同效能殺滅過度表現hTNFSF9之HEK293T細胞，而小鼠IgG1同型對照抗體在相同濃度下則不能。 此實例顯示，大量例示抗體發生內化且可用於將細胞毒性劑有效遞送至細胞內部。實例 17 抗 -TNFSF9 抗體藥物偶聯物在活體外殺滅 hTNFSF9+ 細胞 為測定本發明之抗-TNFSF9 ADC是否可有效調介直接偶聯細胞毒性劑至活細胞之遞送，使用上文實例12中所產生之抗-TNFSF9 ADC hSC113.57ss1來實施活體外細胞殺滅分析。抗體構築體偶聯至PBD1及PBD3，如上所述。 將過度表現hTNFSF9之HEK293T細胞或幼稚HEK293T細胞之單細胞懸浮液以500個細胞/孔平鋪至BD組織培養板(BD Biosciences)中。一天後，將各種濃度之偶聯至PBD1或PBD3之純化ADC或人類IgG1對照抗體添加至培養物中。將細胞培育96小時。在培育之後，根據製造商說明書使用CellTiter-Glo® (Promega)來計數活細胞。將使用含有未處理細胞之培養物之原始發光計數設定為100%參考值且將所有其他計數計算為參考值之百分比。 圖13展示，與人類IgG1對照ADC相比，所處理所有細胞對抗-TNFSF9 ADC (PBD1或PBD3)更為敏感。另外，與過度表現TNFSF9之HEK293T細胞相比，ADC對不過度表現TNFSF9之幼稚HEK293T細胞具有極少效應，從而顯示ADC對TNFSF9抗原之特異性。 上述結果顯示，抗-TNFSF9 ADC能夠特異性調介直接偶聯細胞毒性有效載物之內化及其至表現TNFSF9之細胞之遞送。實例 18 抗 -TNFSF9 抗體藥物偶聯物阻抑活體內腫瘤生長 使用業內公認活體內技術測試如(例如)上文實例12中所闡述生成之抗-TNFSF9 ADC以顯示其阻抑免疫缺陷小鼠中之人類胃癌(GA)、結腸直腸癌(CR)及非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤生長之能力。 使用業內公認技術，使表現TNFSF9之患者源異種移植物(PDX)腫瘤系(例如GA PDX腫瘤系)及不表現TNFSF9之對照腫瘤系經皮下生長於雌性NOD/SCID小鼠之側腹中。每週一次或兩次監測腫瘤體積及小鼠重量。在腫瘤體積達到150-250 mm3 時，將小鼠隨機分配至治療組中且經腹膜腔內注射單一劑量之0.2 mg/kg (SC113 PBD3)或1.6 mg/kg (SC113 PBD1)人類化抗-TNFSF9 ADC或單一劑量之mg/kg抗半抗原對照人類IgG ADC。在治療後，監測腫瘤體積及小鼠重量直至腫瘤超過800 mm3 或小鼠生病為止。 圖14A - 14C展示所揭示ADC對具有展現TNFSF9表現之不同腫瘤之小鼠中之腫瘤生長之影響。就此而言，使用偶聯至PBD1之實例性TNFSF9抗體SC113.57治療GA39 (胃腺癌)會延遲腫瘤生長，而偶聯至PBD3之SC113.57會使得腫瘤縮小並持續42天。類似地，使用偶聯至PBD1之實例性抗體SC113.57治療GA42 (不同胃腺癌)會在腫瘤開始再生長之前產生腫瘤縮小並持續26天，且偶聯至PBD3之SC113.57會使得腫瘤縮小並持續43天(圖14A)。 類似地，使用偶聯至PBD1或PBD3之實例性TNFSF9抗體SC113.57治療CR23 (結腸直腸腺癌)會使得腫瘤縮小並持續超過110天，且並不再生長。使用偶聯至PBD1或PBD3之實例性TNFSF9抗體SC113.57治療CR77 (不同結腸直腸腺癌)會使得腫瘤縮小並分別持續26或28天(圖14B)。 除上文所提及之PDX系列外，使用偶聯至PBD1之實例性TNFSF9抗體SC113.57治療LU123 (肺腺癌PDX模型)會使得腫瘤縮小27天，而偶聯至PBD3之SC113.57會使得腫瘤縮小並持續74天。類似地，使用偶聯至PBD1之實例性抗體SC113.57治療LU135 (衍生自不同患者之肺腺癌PDX模型)會產生28天腫瘤延遲直至開始再生長為止且偶聯至PBD3之SC113.57會使得腫瘤縮小並持續42天。使用偶聯至PBD1或PBD3之實例性TNFSF9抗體SC113.57治療LU296 (衍生自不同患者之肺腺癌PDX模型)會使得在腫瘤以適當速率重新開始生長之前腫瘤縮小33天。最後，使用偶聯至PBD1之實例性抗體SC113.57治療LU239 (衍生自不同患者之肺腺癌PDX模型)會誘導腫瘤體積在重新開始生長之前消退21天，而使用偶聯至PBD3之SC113.57進行治療使得腫瘤完全消退148天，藉此根據研究設計說明終止量測(圖14C)。 偶聯調節劑在活體內顯著縮小腫瘤體積延長時段之令人吃驚之能力進一步驗證，可使用抗-TNFSF9 ADC作為用於治療增殖性病症之治療劑。 熟習此項技術者將進一步瞭解，本發明可在不背離其精神或關鍵屬性之情況下以其他特定形式體現。鑒於本發明之先前闡述僅揭示其實例性實施例，應理解其他變化形式亦涵蓋在本發明範圍內。因此，本發明並不限於本文已詳細闡述之特定實施例。相反，應提及隨附申請專利範圍來指示本發明之範圍及內容。
圖1提供人類TNFSF9之注釋胺基酸序列； 圖2A及2B展示TNFSF9之表現程度，如經由衍生自患者源異種移植物(PDX)癌症幹細胞(CSC)及非致瘤(NTG)細胞以及正常組織之RNA之全轉錄組測序使用SOLiD平臺(圖2A)或Illumina平臺(圖2B)所量測； 圖3繪示TNFSF9轉錄物之相對表現程度，如藉由qRT-PCR在自正常組織及自各種PDX腫瘤分離之RNA試樣中所量測； 圖4展示藉由微陣列雜交在衍生自正常組織及各種PDX細胞系之RNA上量測之TNFSF9轉錄物表現之正規化強度值； 圖5展示正常組織及原發性腫瘤中之TNFSF9轉錄物之表現程度，如自癌症基因體圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA) (公開可獲得之資料組)所獲取； 圖6A及6B分別以表格形成及繪圖提供實例性抗-TNFSF9抗體之抗體親和力、同型、細胞殺滅及分倉特性(圖6A)及抗體隨其倉變化而繪圖之細胞殺滅活性(圖6B)； 圖7圖解說明諸多實例性PDX腫瘤細胞系中之TNFSF9蛋白表現程度； 圖8A-8G提供注釋胺基酸及核酸序列，其中圖8A及8B展示實例性鼠類抗-TNFSF9抗體之輕鏈(圖8A)及重鏈(圖8B)可變區之鄰接胺基酸序列(SEQ ID NO: 21-151，奇數)，圖8C展示編碼上文所提及之輕鏈及重鏈可變區之核酸序列(SEQ ID NO: 20-150，偶數)，圖8D繪示人類化VL及VH結構域之胺基酸序列及核酸序列，圖8E展示所選抗體構築體之全長重鏈及輕鏈之胺基酸序列且圖8F及8G繪示SC113.57及SC113.118鼠類抗體之輕鏈及重鏈可變區之CDR，如使用Kabat、Chothia、ABM及接觸方法所測定； 圖9以表格形式圖解說明某些本發明抗體調節TNFSF9與其受體TNFRSF9之相互作用之能力； 圖10展現高加索或亞洲患者之一級胃腫瘤中之TNFSF9 RNA表現程度； 圖11繪示結腸直腸PDX腫瘤中根據共識分子亞型(CMS)分類之TNFSF9蛋白表現程度，如使用微陣列分析所測定； 圖12顯示所選抗-TNFSF9鼠類抗體在暴露於過度表現TNFSF9蛋白之HEK293T細胞時發生內化之能力； 圖13展示，實例性抗-TNFSF9 ADC發生內化且殺滅過度表現TNFSF9之HEK293T細胞；且 圖14A - 14C顯示實例性TNFSF9 ADC在活體內阻抑胃PDX腫瘤(圖14A)、結腸直腸PDX腫瘤(圖14B)及非小細胞肺癌(NSCLC)腫瘤(圖14C)之生長之能力。

Claims (50)

  1. 一種經分離抗體，其結合至表現TNFSF9之腫瘤起始細胞。
  2. 一種經分離抗體，其結合至包括SEQ ID NO: 1之人類TNFSF9。
  3. 一種經分離抗體，其結合至TNFSF9且包括含有以下之抗體或與其競爭結合： SEQ ID NO: 21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO: 23之重鏈可變區(VH)；或 SEQ ID NO: 25之VL及SEQ ID NO: 27之VH；或 SEQ ID NO: 29之VL及SEQ ID NO: 31之VH；或 SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 35之VH；或 SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 39之VH；或 SEQ ID NO: 41之VL及SEQ ID NO: 43之VH；或 SEQ ID NO: 45之VL及SEQ ID NO: 47之VH；或 SEQ ID NO: 49之VL及SEQ ID NO: 51之VH；或 SEQ ID NO: 53之VL及SEQ ID NO: 55之VH；或 SEQ ID NO: 57之VL及SEQ ID NO: 59之VH；或 SEQ ID NO: 61之VL及SEQ ID NO: 63之VH；或 SEQ ID NO: 65之VL及SEQ ID NO: 67之VH；或 SEQ ID NO: 69之VL及SEQ ID NO: 71之VH；或 SEQ ID NO: 73之VL及SEQ ID NO: 75之VH；或 SEQ ID NO: 77之VL及SEQ ID NO: 79之VH；或 SEQ ID NO: 81之VL及SEQ ID NO: 83之VH；或 SEQ ID NO: 85之VL及SEQ ID NO: 87之VH；或 SEQ ID NO: 89之VL及SEQ ID NO: 91之VH；或 SEQ ID NO: 93之VL及SEQ ID NO: 95之VH；或 SEQ ID NO: 97之VL及SEQ ID NO: 99之VH；或 SEQ ID NO: 101之VL及SEQ ID NO: 103之VH；或 SEQ ID NO: 105之VL及SEQ ID NO: 107之VH；或 SEQ ID NO: 109之VL及SEQ ID NO: 111之VH；或 SEQ ID NO: 113之VL及SEQ ID NO: 115之VH；或 SEQ ID NO: 117之VL及SEQ ID NO: 119之VH；或 SEQ ID NO: 121之VL及SEQ ID NO: 123之VH；或 SEQ ID NO: 125之VL及SEQ ID NO: 127之VH；或 SEQ ID NO: 129之VL及SEQ ID NO: 131之VH；或 SEQ ID NO: 133之VL及SEQ ID NO: 135之VH；或 SEQ ID NO: 137之VL及SEQ ID NO: 139之VH；或 SEQ ID NO: 141之VL及SEQ ID NO: 143之VH；或 SEQ ID NO: 145之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或 SEQ ID NO: 37之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或 SEQ ID NO: 149之VL及SEQ ID NO: 147之VH；或 SEQ ID NO: 33之VL及SEQ ID NO: 151之VH。
  4. 如請求項1至3中任一項之經分離抗體，其係內化抗體。
  5. 如請求項1至4中任一項之經分離抗體，其係嵌合的、CDR移植的、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。
  6. 如請求項1至5中任一項之經分離抗體，其中該抗體定位至倉B。
  7. 如請求項1至5中任一項之經分離抗體，其中該抗體定位至倉C。
  8. 如請求項1至7中任一項之經分離抗體，其中該抗體包括位點特異性抗體。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中該抗體偶聯至有效載物。
  10. 一種醫藥組合物，其包括如請求項1至8中任一項之抗體。
  11. 一種核酸，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體之全部或一部分。
  12. 一種載體，其包括如請求項11之核酸。
  13. 一種宿主細胞，其包括如請求項11之核酸或如請求項12之載體。
  14. 一種式Ab-[L-D]n之ADC或其醫藥上可接受之鹽，其中： a) Ab包括抗-TNFSF9抗體； b) L包括可選連接體； c) D包括藥物；且 d) n係約1至約20之整數。
  15. 如請求項14之ADC，其中該抗-TNFSF9抗體包括嵌合的、CDR移植的、人類化或人類抗體或其免疫反應性片段。
  16. 如請求項14之ADC，其中Ab係如請求項1至8中任一項之抗-TNFSF9抗體。
  17. 如請求項14之ADC，其中n包括約2至約8之整數。
  18. 如請求項14之ADC，其中D包括選自由以下組成之群之化合物：多拉斯他汀(dolastatin)、奧裡斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、苯并二氮呯衍生物、卡奇黴素(calicheamicin)及瓢菌素。
  19. 一種醫藥組合物，其包括如請求項14至18中任一項之ADC。
  20. 一種治療癌症之方法，其包括向有需要其之個體投與如請求項10或19之醫藥組合物。
  21. 如請求項20之方法，其中該癌症包括血液學惡性腫瘤。
  22. 如請求項21之方法，其中該血液學惡性腫瘤包括白血病或淋巴瘤。
  23. 如請求項20之方法，其中該癌症包括實體腫瘤。
  24. 如請求項23之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：腎上腺癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、食道癌、結腸直腸癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰臟癌、肺癌(小細胞及非小細胞)、甲狀腺癌及神經膠母細胞瘤。
  25. 如請求項24之方法，其中該癌症包括結腸直腸癌。
  26. 如請求項24之方法，其中該癌症包括胃癌。
  27. 如請求項20之方法，其進一步包括向該個體投與至少一種其他治療部分。
  28. 一種減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包括使包括腫瘤起始細胞及除腫瘤起始細胞外之腫瘤細胞的腫瘤細胞群體與如請求項14至18之ADC接觸；藉此減低腫瘤起始細胞之頻率。
  29. 如請求項28之方法，其中該接觸係在活體內實施。
  30. 如請求項28之方法，其中該接觸係在活體外實施。
  31. 一種將細胞毒素遞送至細胞之方法，其包括使該細胞與如請求項14至18中任一項之ADC接觸。
  32. 診斷或監測個體之癌症之方法，該方法包括以下步驟：(a)使腫瘤細胞與如請求項1至9中任一項之抗體接觸；及(b)檢測該等腫瘤細胞上之該抗體。
  33. 如請求項32之方法，其中該接觸係在活體外實施。
  34. 如請求項32之方法，其中該接觸係在活體內實施。
  35. 一種產生如請求項14之ADC之方法，其包括使抗-TNFSF9抗體(Ab)與藥物(D)偶聯之步驟。
  36. 如請求項35之方法，其中該抗體包括位點特異性抗體。
  37. 一種調節TNFSF9與TNFRSF9之相互作用之方法，其包括使TNFSF9與結合至hTNFSF9之抗體接觸。
  38. 如請求項37之方法，其中該抗體包括如請求項1至9中任一項之抗體。
  39. 如請求項37之方法，其中該調節包括抑制該TNFSF9/TNFRSF9相互作用。
  40. 如請求項37之方法，其中該調節包括增強該TNFSF9/TNFRSF9相互作用。
  41. 一種套組，其包括： (a) 一或多個含有如請求項19之醫藥組合物之容器；及 (b) 與該一或多個容器相連之標記或包裝插頁，其指示該組合物係用於治療患有癌症之個體。
  42. 一種套組，其包括： (a) 一或多個含有如請求項19之醫藥組合物之容器；及 (b) 與一或多個容器相連之標記或包裝插頁，其指示用於患有癌症之個體之劑量方案。
  43. 如請求項41或42之套組，其中該癌症係結腸直腸癌。
  44. 一種式Ab-[L-D]n之ADC，其包括選自由以下組成之群之結構：,, , , 及 其中Ab包括抗-TNFSF9抗體或其免疫反應性片段，且n係約1至約20之整數。
  45. 如請求項44之ADC，其中抗-TNFSF9抗體包括N297A突變。
  46. 如請求項45之ADC，其中抗-TNFSF9抗體包括hSC113.57ss1MJ (SEQ ID NO: 170及175)。
  47. 如請求項45之ADC，其中抗-TNFSF9抗體包括hSC113.118ss1MJ (SEQ ID NO: 180及185)。
  48. 如請求項46之ADC，其包括兩個未配對半胱胺酸，其中每一半胱胺酸皆偶聯至有效載物。
  49. 一種式Ab-[L-D]n之ADC，其包括以下結構：其中Ab包括hSC113.57ss1MJ (SEQ ID NO: 170及175)，且n為2。
  50. 一種式Ab-[L-D]n之ADC，其包括以下結構：其中Ab包括hSC113.118ss1MJ (SEQ ID NO: 180及185)，且n為2。
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