TW201718026A - 抗dll3抗體藥物結合物及使用方法 - Google Patents

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布萊恩 史林格蘭
泰焄 韓
約翰 皮迪
霍格 卡遜基
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Abstract

本發明提供新穎抗DLL3抗體及抗體藥物結合物以及使用該等抗DLL3抗體及抗體藥物結合物治療癌症之方法。

Description

抗DLL3抗體藥物結合物及使用方法 相關申請案之交叉參考
本申請案主張於2015年8月20提出申請之美國臨時申請案第62/207,830號、於2016年4月18日提出申請之美國臨時申請案第62/323,998號及於2016年8月11日提出申請之美國臨時申請案第62/373,906號之權益，其各自係全文以引用方式併入本文中。
序列表
本申請案含有已以ASCII格式經由EFS-Web提交之序列表且其全文皆以引用方式併入本文中。該ASCII拷貝創建於2016年8月8日，命名為sc1607_p3_Sequence_Listing_08082016且大小為591KB(605,521個位元組)。
本申請案概言之係關於抗DLL3抗體或其免疫反應性片段(包括包含其之抗體藥物結合物(ADC))之新穎化合物及組合物以及投與抗DLL3抗體或其免疫反應性片段(包括包含其之抗體藥物結合物(ADC)來治療、診斷或預防癌症及其任何復發或轉移之方法。本發明之所選實施例提供投與該等抗DLL3抗體或抗體藥物結合物來治療癌症，包含減小致瘤細胞頻率。
幹細胞及祖細胞之分化及增殖係在器官發生、細胞修復及細胞 替代期間協同起支持組織生長作用之正常持續過程。該系統受嚴密調控以確保僅基於生物體需要生成適當信號。細胞增殖及分化通常僅視需要發生用於替代受損或死亡細胞或用於生長。然而，許多因素可引起該等過程中斷，包括多種信號傳導化學物質過少或過多、存在改變的微環境、遺傳突變或其組合。正常細胞增殖及/或分化之中斷可導致多種病症，包括增生性疾病，例如癌症。
癌症之習用治療性治療包括化學療法、放射性療法及免疫療法。通常，該等治療無效且手術切除可能無法提供可行的臨床替代方式。當前標準護理之限制在患者經受第一線治療且隨後再發之彼等情形下尤其明顯。在該等情形下，通常出現難治性腫瘤，其通常為攻擊性及不可治癒性腫瘤。許多實體腫瘤之總存活率多年來幾乎保持不變，此至少部分歸因於現有療法無法防止再發、腫瘤復發及轉移。因此，業內極大地需要研發出對增生性病症更具針對性且更強效之療法。本發明解決了此需要。
在廣泛態樣中，本發明提供包含特異性結合至人類DLL3決定子之經分離抗體及/或相應抗體藥物結合物的新穎化合物及組合物。在某些實施例中，DLL3決定子係在腫瘤細胞上表現之DLL3蛋白，而在其他實施例中，DLL3決定子在腫瘤起始細胞上表現。在所選態樣中，DLL3 ADC組合物將包含凍乾組合物。在其他態樣中，本發明提供投與所揭示化合物或組合物之新穎方法，其包括尤其有效之投藥方案及如本文所述鑑別之某些患者亞群之投藥。如下文更詳細論述，關於患者選擇及患者投藥之所揭示方法可證實尤其有效，此至少部分歸因於所得有利的治療指數及治療敏感群體。在其他實施例中，本發明提供包含DLL3 ADC及免疫治療化合物(包括檢查點抑制劑)之組合的某些治療方案，其似乎尤其有效。
在所選態樣中，本發明抗體結合至DLL3蛋白且與結合至人類DLL3蛋白上之表位之參照抗體競爭結合。在某些實施例中，本發明包含DLL3抗體或ADC，其中抗體或ADC結合結構域特異性結合至人類DLL3(hDLL3)且包含以下各項或與包含以下各項之抗體競爭結合：SEQ ID NO：21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：23之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；或SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；或SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；或SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；或SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；或SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；或SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；或SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；或SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；或SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；或SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；或SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；或SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；或SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH；或SEQ ID NO：81之VL及SEQ ID NO：83之VH；或SEQ ID NO：85之VL及SEQ ID NO：87之VH；或SEQ ID NO：89之VL及SEQ ID NO：91之VH；或SEQ ID NO：93之VL及SEQ ID NO：95之VH；或SEQ ID NO：97之VL及SEQ ID NO：99之VH；或SEQ ID NO：101之VL及SEQ ID NO：103之VH；或SEQ ID NO：105之VL及SEQ ID NO：107之VH；或SEQ ID NO：109之VL及SEQ ID NO：111之VH；或SEQ ID NO：113之VL及SEQ ID NO：115之VH；或SEQ ID NO：117之VL及SEQ ID NO：119之VH；或SEQ ID NO：121之VL及SEQ ID NO：123之VH；或SEQ ID NO：125之VL及SEQ ID NO：127之VH；或SEQ ID NO：129之VL及SEQ ID NO：131之VH；或SEQ ID NO：133之VL及SEQ ID NO：135之VH；或SEQ ID NO：137之VL及SEQ ID NO：139之VH；或SEQ ID NO：141之VL及SEQ ID NO：143之VH；或SEQ ID NO：145之VL及SEQ ID NO：147之VH；或SEQ ID NO：149之VL及SEQ ID NO：151之VH；或SEQ ID NO：153之VL及SEQ ID NO：155之VH；或SEQ ID NO：157之VL及SEQ ID NO：159之VH；或SEQ ID NO：161之VL及SEQ ID NO：163之VH；或SEQ ID NO：165之VL及SEQ ID NO：167之VH；或SEQ ID NO：169之VL及SEQ ID NO：171之VH；或SEQ ID NO：173之VL及SEQ ID NO：175之VH；或SEQ ID NO：177之VL及SEQ ID NO：179之VH；或SEQ ID NO：181之VL及SEQ ID NO：183之VH；或SEQ ID NO：185之VL及SEQ ID NO：187之VH；或SEQ ID NO：189之VL及SEQ ID NO：191之VH；或SEQ ID NO：193之VL及SEQ ID NO：195之VH；或SEQ ID NO：197之VL及SEQ ID NO：199之VH；或SEQ ID NO：201之VL及SEQ ID NO：203之VH；或SEQ ID NO：205之VL及SEQ ID NO：207之VH；或SEQ ID NO：209之VL及SEQ ID NO：211之VH；或SEQ ID NO：213之VL及SEQ ID NO：215之VH；或SEQ ID NO：217之VL及SEQ ID NO：219之VH；或SEQ ID NO：221之VL及SEQ ID NO：223之VH；或SEQ ID NO：225之VL及SEQ ID NO：227之VH；或SEQ ID NO：229之VL及SEQ ID NO：231之VH；或SEQ ID NO：233之VL及SEQ ID NO：235之VH；或SEQ ID NO：237之VL及SEQ ID NO：239之VH；或SEQ ID NO：241之VL及SEQ ID NO：243之VH；或SEQ ID NO：245之VL及SEQ ID NO：247之VH；或SEQ ID NO：249之VL及SEQ ID NO：251之VH；或SEQ ID NO：253之VL及SEQ ID NO：255之VH；或SEQ ID NO：257之VL及SEQ ID NO：259之VH；或SEQ ID NO：261之VL及SEQ ID NO：263之VH；或SEQ ID NO：265之VL及SEQ ID NO：267之VH；或SEQ ID NO：269之VL及SEQ ID NO：271之VH；或SEQ ID NO：273之VL及SEQ ID NO：275之VH；或SEQ ID NO：277之VL及SEQ ID NO：279之VH；或SEQ ID NO：281之VL及SEQ ID NO：283之VH；或SEQ ID NO：285之 VL及SEQ ID NO：287之VH；或SEQ ID NO：289之VL及SEQ ID NO：291之VH；或SEQ ID NO：293之VL及SEQ ID NO：295之VH；或SEQ ID NO：297之VL及SEQ ID NO：299之VH；或SEQ ID NO：301之VL及SEQ ID NO：303之VH；或SEQ ID NO：305之VL及SEQ ID NO：307之VH；或SEQ ID NO：309之VL及SEQ ID NO：311之VH；或SEQ ID NO：313之VL及SEQ ID NO：315之VH；或SEQ ID NO：317之VL及SEQ ID NO：319之VH；或SEQ ID NO：321之VL及SEQ ID NO：323之VH；或SEQ ID NO：325之VL及SEQ ID NO：327之VH；或SEQ ID NO：329之VL及SEQ ID NO：331之VH；或SEQ ID NO：333之VL及SEQ ID NO：335之VH；或SEQ ID NO：337之VL及SEQ ID NO：339之VH；或SEQ ID NO：341之VL及SEQ ID NO：343之VH；或SEQ ID NO：345之VL及SEQ ID NO：347之VH；或SEQ ID NO：349之VL及SEQ ID NO：351之VH；或SEQ ID NO：353之VL及SEQ ID NO：355之VH；或SEQ ID NO：357之VL及SEQ ID NO：359之VH；或SEQ ID NO：361之VL及SEQ ID NO：363之VH；或SEQ ID NO：365之VL及SEQ ID NO：367之VH；或SEQ ID NO：369之VL及SEQ ID NO：371之VH；或SEQ ID NO：373之VL及SEQ ID NO：375之VH；或SEQ ID NO：377之VL及SEQ ID NO：379之VH；或SEQ ID NO：381之VL及SEQ ID NO：383之VH；或SEQ ID NO：385之VL及SEQ ID NO：387之VH；或SEQ ID NO：389之VL及SEQ ID NO：391之VH；或SEQ ID NO：393之VL及SEQ ID NO：395之VH；或SEQ ID NO：397之VL及SEQ ID NO：399之VH；或SEQ ID NO：401之VL及SEQ ID NO：403之VH；或SEQ ID NO：405之VL及SEQ ID NO：407之VH。在一個態樣中，本發明包含編碼本發明之抗DLL3抗體或其免疫反應性片段之核酸。在其他實施例中，本發明包含包括上述核酸中之一或多者之載體及/或包含該載體之宿主細胞。
在本發明之一些態樣中，抗體包含嵌合、CDR移植、人類化或人 類抗體或其免疫反應性片段。在本發明之其他態樣中，較佳包含上文所提及序列中之全部或一部分之抗體係內化抗體。在其他實施例中，抗體將包含位點特異性抗體。在其他所選實施例中，本發明包含納入上文所提及抗體中之任一者之抗體藥物結合物。
在某些實施例中，本發明包含式Ab-[L-D]n之抗體藥物結合物或其醫藥上可接受之鹽，其中：Ab包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含藥物；且n係1至20之整數。在一個態樣中，本發明ADC包含抗DLL3抗體(例如上文所述之彼等)或其免疫反應性片段。在其他實施例中，本發明ADC包含選自以下各項之細胞毒性化合物：卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯、奧裡斯他汀(auristatin)、多卡米星(duocarmycin)、類美登素(maytansinoid)或如本文所述之任一相容性治療部分。在某些實施例中，本發明包含醫藥組合物，其包含如上文所述之ADC。
在其他所選實施例中，本發明ADC具有經改良之藥物動力學及藥效學性質，此提供增強的治療指數且允許最佳化投藥方案。就此而言，當如本文所述量測時，所揭示ADC將具有超過6天之末端半衰期、超過7天之末端半衰期或超過8天之末端半衰期。本發明之其他態樣將包含具有超過9天之末端半衰期、超過10天之末端半衰期、超過11天之末端半衰期、超過12天之末端半衰期的ADC(各自係如在人類個體中所量測)。在其他實施例中，在人類個體中所揭示ADC將具有超過13天之末端半衰期、超過約14天之末端半衰期、超過15天之末端半衰期、超過約16天之末端半衰期、超過約17天之末端半衰期、超過18天之末端半衰期、超過約19天之末端半衰期、超過約20天之末端半衰期或超過3週之末端半衰期。在其他實施例中，本發明ADC將展現約6天之末端半衰期、約7天之末端半衰期、約8天之末端半衰期、約9天之末端半衰期、約10天之末端半衰期、約11天之末端半衰期、約12 天之末端半衰期、約13天之末端半衰期、約14天之末端半衰期、約15天之末端半衰期、約16天之末端半衰期、約17天之末端半衰期、約18天之末端半衰期、約19天之末端半衰期、約20天之末端半衰期或約3週之末端半衰期。熟習此項技術者應瞭解，該等延長的半衰期將允許較不頻繁地投用所揭示ADC，由此提供期望效能，同時展現相似或減小的毒性。
為此，本發明之其他態樣係關於治療癌症之方法，其包含向有需要之個體投與醫藥組合物，例如本文所述之彼等。在所選實施例中，該等方法將包含投與具有以下末端半衰期之ADC：超過約6天之末端半衰期、超過約7天之末端半衰期、超過約8天之末端半衰期、超過約9天之末端半衰期、超過約10天之末端半衰期、超過約11天之末端半衰期、超過約12天之末端半衰期、超過約13天之末端半衰期、超過約14天之末端半衰期、超過約15天之末端半衰期、超過約16天之末端半衰期、超過約17天之末端半衰期、超過約18天之末端半衰期、超過約19天之末端半衰期、超過約20天之末端半衰期或超過約3週之末端半衰期。
在某些其他實施例中，癌症將包含實體腫瘤，包括(但不限於)腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食道腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤、胰臟腫瘤、肺腫瘤(小細胞腫瘤及非小細胞腫瘤二者)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他所選態樣中，癌症選自包含以下之群：肺癌(包括小細胞肺癌或大細胞神經內分泌癌)、前列腺癌、結腸直腸癌及皮膚癌(例如黑色素瘤，例如表現野生型或突變BRAF之皮膚癌)。在一些實施例中，治療上述癌症之方法包含向個體投與除所揭示醫藥組合物外至少一種其他治療部分。在較佳態樣中，其他治療部分將包含抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
關於上文所提及之方法，在某些實施例中，本發明提供抗DLL3抗體藥物結合物用於治療癌症，其中該治療可包含以下列頻率投與有效量之抗DLL3抗體藥物結合物(DLL3 ADC)：至少每週一次(QW)、至少每2週一次(Q2W)、至少每3週一次(Q3W)、至少每4週一次(Q4W)、至少每5週一次(Q5W)、至少每6週一次(Q6W)、至少每7週一次(Q7W)、至少每8週一次(Q8W)、至少每9週一次(Q9W)、至少每10週一次(Q10W)、至少每11週一次(Q11W)或至少每12週一次(Q12W)。在所選實施例中，DLL3 ADC將以下列頻率來投與：至少每3週(Q3W)、至少每4週一次(Q4W)、至少每5週一次(Q5W)或至少每6週一次(Q6W)。在其他所選實施例中，DLL3 ADC將以下列劑量來投與：約0.01mg/kg、0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.075mg/kg、0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg或1.0mg/kg。所選實施例將包含藉由單次投與DLL3 ADC來治療患者。某些其他實施例將包含以指定間隔(即Q2W、Q3W、Q4W、Q5W、Q6W等)持續下列週期來治療患者：兩個週期(×2)、三個週期(×3)、四個週期(×4)、五個週期(×5)、六個週期(×6)、七個週期(×7)、八個週期(×8)、九個週期(×9)或十個週期(×10)。在其他實施例中，可完成初始DLL3 ADC治療(x個週期)且不再進行DLL3 ADC治療直至癌症顯示惡化跡象(有惡化時治療)。在其他實施例中，可完成初始DLL3 ADC治療(x個週期)，且然後使患者進行維持療法(例如，0.1mg/kg DLL3 ADC Q6W，無限期地)。在該等維持環境中，DLL3 ADC可以相對較低之量經由蠕動幫浦以連續或週期性(例如，每小時)輸注形式來投與。在其他實施例中，患者將接受初始DLL3 ADC治療(x個週期)，且然後不再治療(使用所揭示ADC或使用另一藥劑)同一或相關癌症直至惡化(即，有惡化時治療)。在該等情形下，直至第一治療週期結束後4 週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週或16週或更多個週後才實現第二治療週期(例如，使用DLL3 ADC)。
在一個實施例中，本發明包含減少腫瘤細胞群體中之腫瘤起始細胞之方法，其中該方法包含使腫瘤起始細胞群體與如本文所述之ADC接觸(例如活體外或活體內)，藉此減小腫瘤起始細胞之頻率。
在一態樣中，本發明包含將細胞毒素遞送至細胞之方法，其包含使細胞與上述ADC中之任一者接觸。
在另一態樣中，本發明包含檢測、診斷或監測個體癌症(例如，肺癌、前列腺癌或黑色素瘤)之方法，該方法包含以下步驟：使腫瘤細胞與DLL3檢測劑接觸(例如活體外或活體內)，及檢測與腫瘤細胞締合之DLL3檢測劑。在所選實施例中，檢測劑應包含與DLL3基因型決定子締合之抗DLL3抗體或核酸探針。在相關實施例中，診斷方法將包含免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)。
為此，應瞭解，本發明之某些態樣包含將DLL3抗體用於免疫組織化學。更具體而言，可使用DLL3 IHC作為診斷工具來幫助診斷各種增生性病症及監測對治療(包括DLL3抗體療法)之潛在反應。就此而言且如下文實例中所顯示，可使用免疫組織化學技術來衍生如業內已知之H-評分。該等H-評分(即，300點量表上90及以上之彼等)可用於指示哪些患者可適於用本發明組合物治療以及用於指導治療決策及確定投藥方案及時間。在其他實施例中，可使用腫瘤中陽性染色之DLL3細胞之百分比來指示哪些患者可對用所揭示DLL3 ADC治療敏感。
類似地，本發明亦提供可用於診斷、監測或治療DLL3相關病症(例如癌症)之套組或器件及相關方法。為此，本發明較佳提供可用於檢測、診斷或治療DLL3相關病症之製品，其包含含有DLL3 ADC之貯 器及使用該DLL3 ADC來治療、監測或診斷DLL3相關病症之說明書。在所選實施例中，該等器件及相關方法將包含接觸至少一個循環腫瘤細胞之步驟。在其他實施例中，所揭示套組將包含指示使用該套組或器件來診斷、監測或治療DLL3相關癌症之說明書、標記、插頁、讀取器或諸如此類。
前述內容為發明內容且因此必須含有細節之簡化、概述及省略；因此，熟習此項技術者應瞭解，發明內容僅為說明性且不欲以任何方式進行限制。在本文所述之教示中將明瞭本文所述方法、組合物及/或器件及/或其他標的物之其他態樣、特徵及優點。提供該發明內容以按簡化形式引入下文在實施方式中進一步闡述之概念精選。
圖1A及1B以表形式提供與如本文實例中所述分離、選殖及改造之所揭示DLL3 ADC相容之多個鼠類及人類化實例性DLL3抗體之輕鏈及重鏈可變區的鄰接胺基酸序列(SEQ ID NO：21-407，奇數)；圖2以示意圖形式繪示如本文實例中所述分離、選殖及改造之實例性DLL3抗體之結構域層級映射分析之結果；圖3A及3B提供免疫組織化學數據，其顯示DLL3表現並不與標準護理療法之臨床結果相關聯(圖3A)及DLL3表現在未經處理及化療難治性SCLC患者二者中升高(圖3B)；圖4A-4F提供關於I期研究之各種數據，其中圖4A匯總研究設計及結果，圖4B繪示DLL3 ADC之臨床藥物動力學，圖4C顯示DLL3 ADC所提供反應之持續時間，圖4D及4E顯示所有經治療患者及DLL3+陽性患者之反應，且圖4F提供所報告不良事件之匯總表；圖5A-5C以表形式提供數據，其展示所揭示DLL3 ADC之凍乾實施例在三種不同溫度下穩定；且圖6A及6B圖解說明當組合投與時，DLL3 ADC及抗PD-1抗體起 抑制免疫活性小鼠中之腫瘤生長之作用。
本發明可以許多不同形式來體現。本文揭示本發明之例示其原理之非限制性、說明性實施例。本文所用之任何部分標題僅出於組織目的，而不能理解為限制所述標的物。出於本發明之目的，除非另外註明，否則所有鑑別序列登錄號可參見NCBI參照序列(RefSeq)數據庫及/或NCBI GenBank®檔案序列數據庫。
已驚人地發現，DLL3表現與多個腫瘤類型相關聯，且可作為決定子用於治療該等腫瘤。亦已意外地發現，DLL3表現與致瘤細胞相關，且因此可有效地用於抑制或消除該等細胞。已知下文將更詳細闡述之致瘤細胞展現對許多習用治療之抗性。與先前技術之教示不同，所揭示之化合物及方法可有效地克服此固有抗性。
本發明提供抗DLL3抗體(包括抗體藥物結合物)及其於預後、診斷、診療、治療及/或預防眾多種DLL3相關癌症中之用途，而與任何具體作用機制或特異性靶向之細胞或分子組份無關。驚人的是，已發現某些所揭示DLL3 ADC具有相對較長之活體內半衰期，此允許提供意外穩健治療指數之新穎投藥方案。此外，患有表現某些量之DLL3之腫瘤之患者尤其接受用本發明抗體及ADC治療，如藉由隨附臨床試驗數據所證實。其他實施例包含所揭示DLL3 ADC與某些免疫治療化合物(包括在抑制腫瘤生長方面似乎驚人地有效之針對PD-1之抗體)之組合的用途。在其他實施例中已發現，呈凍乾形式之所揭示ADC展現不尋常穩定性。應瞭解，與標準護理療法所提供者相比，該等先進性通常提供所揭示組合物之更有效投與及最終更佳患者結果。
I. DLL3生理學
已發現，DLL3表型決定子在臨床上與多種增生性病症(包括展現神經內分泌特徵之贅瘤形成)相關，且DLL3蛋白及其變體或同種型提 供可用於治療相關疾病之有用腫瘤標記物。就此而言，本發明提供包含抗DLL3抗體靶向劑及承載體(例如，包含PBD彈頭之承載體)之多種抗體藥物結合物。如下文更詳細論述及隨附實例中所述，所揭示抗DLL3 ADC可尤其有效地消除致瘤細胞，且因此可用於治療及預防某些增生性病症或其惡化或復發。另外，當與包含相同組份之習用ADC組合物相比時，某些所揭示ADC組合物(例如，位點特異性構築體)可展現相對較高之DAR=2百分比及意外的穩定性，此可提供經改良之治療指數。另外，所揭示ADC可展現延長的末端半衰期，此允許使用可進一步增加治療指數之新穎投藥方案。
此外，已發現，DLL3標記物或決定子(例如細胞表面DLL3蛋白)在治療上與癌症幹細胞(亦稱為腫瘤永存細胞)相關且可有效地用於消除或沉默該等細胞。經由使用如本文所揭示之抗DLL3結合物選擇性減少或消除癌症幹細胞之能力驚人之處在於，已知該等細胞通常對許多習用治療有抗性。亦即，傳統以及最新靶向治療方法之有效性通常受限於即使在該等不同治療方法下仍能夠使腫瘤生長永存之抗性癌症幹細胞之存在及/或出現。此外，與癌症幹細胞相關之決定子通常因低或不一致表現、無法保持與致瘤細胞締合或無法存在於細胞表面而使治療靶較差。與先前技術之教示明顯不同，本發明所揭示之ADC及方法可有效地克服此固有抗性，且特異性消除、消耗、沉默或促進該等癌症幹細胞之分化，由此抵消其持續或再誘導潛在腫瘤生長之能力。此外，如本文所指示，所揭示ADC所提供之意外穩定性及相對均質之DAR製劑允許可能尤其有效之新穎投藥方案。
因此，DLL3結合物(例如本文所揭示之彼等)可有利地用於治療及/或預防所選增生性(例如，贅瘤性)病症或其惡化或復發。應瞭解，儘管下文將尤其在具體結構域、區域或表位方面或在癌症幹細胞或腫瘤(包含神經內分泌特徵及其與所揭示抗體藥物結合物之相互作用)之 背景下廣泛論述本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者應瞭解該等實例性實施例並不限制本發明之範疇。而是，本發明之最寬泛實施例及隨附申請專利範圍廣泛且明確地係關於所揭示抗DLL3結合物及其在治療及/或預防眾多種DLL3相關或介導之病症(包括贅瘤性或細胞增生性病症)中的用途，而與任何具體作用機制或特異性靶向之腫瘤、細胞或分子組份無關。
在果蠅(Drosophila)中，Notch信號傳導主要係由一個Notch受體基因及兩個配體基因(稱為Serrate及Delta)來調介(Wharton等人，1985；Rebay等人，1991)。在人類中，存在四種已知Notch受體及五種DSL(Delta-Serrate LAG2)配體-Serrate之兩種同系物(稱為Jagged1及Jagged 2)，及Delta之三種同系物(稱為δ樣配體或DLL1、DLL3及DLL4)。一般而言，信號接受細胞表面上之Notch受體係藉由與在相對信號傳送細胞表面上表現之配體相互作用(稱為反式相互作用)來活化。該等反式相互作用產生一系列蛋白酶介導之Notch受體裂解。因此，Notch受體細胞內結構域自膜自由易位至核，在核中該Notch受體細胞內結構域係CSL轉錄因子家族(在人類中為RBPJ)之伴侶且將該等轉錄因子自轉錄抑制子轉化成Notch反應性基因之活化劑。
在人類Notch配體中，DLL3不同之處在於，其看上去無法經由反式相互作用來活化Notch受體(Ladi等人，2005)。Notch配體亦可與Notch受體順式(在相同細胞上)相互作用來抑制Notch信號，但順式抑制之確切機制仍不清楚且可端視配體而變化(例如，參見Klein等人，1997；Ladi等人，2005；Glittenberg等人，2006)。兩種假設抑制模式包括藉由防止反式相互作用，或藉由擾亂受體之處理或藉由以物理方式使受體滯留於內質網或高爾基體(Golgi)中以減少細胞表面上Notch受體之量，來調節細胞表面處之Notch信號傳導(Sakamoto等人，2002；Dunwoodie,2009)。然而，顯然，相鄰細胞上Notch受體及配體 之表現之隨機差別可經由轉錄及非轉錄過程二者放大，且順式及反式相互作用之微妙平衡可產生相鄰組織中Notch介導之相異細胞命運描繪之微調(Sprinzak等人，2010)。
DLL3係δ樣Notch DSL配體家族之成員。代表性DLL3蛋白直向同源物包括(但不限於)人類(登錄號NP_058637及NP_982353)、黑猩猩(登錄號XP_003316395)、小鼠(登錄號NP_031892)及大鼠(登錄號NP_446118)。在人類中，DLL3基因係由位於染色體19q13上跨越9.5kBp之8個外顯子組成。最後一個外顯子內之選擇性剪接產生兩個經處理之轉錄本，一個具有2389個鹼基(登錄號NM_016941)且一個具有2052個鹼基(登錄號NM_203486)。前者轉錄本編碼618胺基酸蛋白質(登錄號NP_058637；SEQ ID NO：1)，而後者編碼587胺基酸蛋白質(登錄號NP_982353；SEQ ID NO：2)。DLL3之該兩種蛋白質同種型跨越其細胞外結構域及其跨膜結構域共享總共100%一致性，差別僅在於較長同種型含有在蛋白質之羧基末端含有32個額外殘基之延長的細胞質尾。並不清楚同種型之生物相關性，但可在腫瘤細胞中檢測到兩種同種型。
DLL3蛋白之細胞外區域包含6個EGF樣結構域、單一DSL結構域及N末端結構域。通常，EGF結構域識別為在hDLL3(SEQ ID NO：1及2)之約胺基酸殘基216-249(結構域1)、274-310(結構域2)、312-351(結構域3)、353-389(結構域4)、391-427(結構域5)及429-465(結構域6)處出現，且DSL結構域在約胺基酸殘基176-215處出現，且N末端結構域在約胺基酸殘基27-175處出現。如本文更詳細論述及下文實例中所顯示，EGF樣結構域中之每一者、DSL結構域及N末端結構域包含DLL3蛋白之如藉由不同胺基酸序列界定之部分。應注意，出於本發明之目的，各別EGF樣結構域可稱為EGF1至EGF6，其中EGF1最靠近該蛋白質之N末端部分。關於該蛋白質之結構組成，本發明之一個重 要態樣在於，所揭示之DLL3調節劑可經生成、製造、改造或選擇以與所選結構域、基序或表位反應。在某些情形下，該等抗體或ADC可提供增強的反應性及/或效能，此端視其主要作用模式而定。在尤佳實施例中，抗DLL3 ADC將結合至DSL結構域，且在甚至更佳實施例中將結合至DSL結構域內包含G203、R205、P206之表位(SEQ ID NO：4)。
II. 癌症幹細胞
根據當前模型，腫瘤包含非致瘤細胞及致瘤細胞。即使在以過量細胞數移植至免疫受損小鼠中時，非致瘤細胞仍不具自我更新能力且無法可再生地形成腫瘤。構成腫瘤細胞群體之0.1%-40%(更通常0.1%-10%或0.01%-1.0%)之致瘤細胞(在本文中亦稱為「腫瘤起始細胞」(TIC))具有形成腫瘤之能力。致瘤細胞涵蓋兩種腫瘤永存細胞(TPC)，可互換地稱為癌症幹細胞(CSC)及腫瘤祖細胞(TProg)。
與支持正常組織中之細胞分級之正常幹細胞一樣，CSC能夠無限地自我複製，同時維持多向分化之能力。就此而言，CSC能夠生成致瘤子代及非致瘤子代二者且能夠完全重演親代腫瘤之異質細胞組成，如藉由連續分離並將少數經分離CSC移植至免疫受損小鼠中所展示。有證據指示，除非消除該等「種子細胞」，否則腫瘤更可能轉移或復發，從而導致疾病再發及最終惡化。
TProg與CSC一樣具有推動一次移植中之腫瘤生長之能力。然而，與CSC不同，其無法重演親代腫瘤之細胞異質性且在重起始後續移植中之致瘤方面不夠有效，此乃因TProg通常僅能夠使有限數量之細胞分裂，如藉由將少數經高度純化之TProg連續移植至免疫受損小鼠中所展示。TProg可進一步分成早期TProg及晚期TProg，其可藉由表型(例如，細胞表面標記物)及其不同的重演腫瘤細胞架構之能力來區分。儘管二者重演腫瘤之程度皆不與CSC相同，但早期TProg具有 強於晚期TProg重演親代腫瘤特徵之能力。儘管具有前述不同，但已顯示，一些TProg群體可在個別情況下獲得通常歸因於CSC之自我更新能力且其本身可變成CSC。
CSC與下列各項相比展現更高之致瘤性且相對更靜止：(i)TProg(早期及晚期TProg二者)；及(ii)可衍生自CSC且通常構成腫瘤本體之非致瘤細胞，例如腫瘤浸潤細胞，例如纖維母細胞/間質、內皮及造血細胞。鑒於習用療法及方案在很大程度上已經設計以減積腫瘤並攻擊快速增殖之細胞，CSC對習用療法及方案比更快速增殖之TProg及其他本體腫瘤細胞群體(例如非致瘤細胞)更具抗性。可使CSC對習用療法具有相對化學抗性之其他特徵為增加的多重抗藥性運輸體表現、增強的DNA修復機制及抗細胞凋亡基因表現。該等CSC性質與標準腫瘤治療方案無法提供患有晚期贅瘤之患者中之持久反應相關，此乃因標準化學療法並不有效地靶向實際上推動持續腫瘤生長及復發之CSC。藉由抑制或消除該等種子細胞使腫瘤生長繁殖及擴散之能力，所揭示化合物及組合物
已驚人地發現，DLL3表現以使多個致瘤細胞亞群對如本文所述之治療敏感之方式與該多個致瘤細胞亞群相關。本發明提供抗DLL3抗體，其尤其可用於靶向致瘤細胞且可用於沉默、敏化、中和、減小頻率、阻斷、消除、干擾、減少、阻礙、限制、控制、消耗、緩和、調介、減小、再程式化、消除、殺死或以其他方式抑制(統稱為「抑制」)致瘤細胞，由此幫助治療、管控及/或預防增生性病症(例如癌症)。有利地，本發明之新穎抗DLL3抗體可經選擇，以使其在投與個體後較佳減小致瘤細胞之頻率或致瘤性而與DLL3決定子之形式(例如表型或基因型)無關。致瘤細胞頻率之減小可因以下各項所致：(i)致瘤細胞之抑制或消滅；(ii)控制致瘤細胞之生長、擴增或復發；(iii)中斷致瘤細胞之起始、繁殖、維持或增殖；或(iv)藉由其他方式阻礙 致瘤細胞之存活、再生及/或轉移。在一些實施例中，致瘤細胞之抑制可因一或多個生理路徑改變所致。無論藉由抑制致瘤細胞、改變其潛能(例如，藉由誘導分化或生態位破壞)抑或以其他方式干擾致瘤細胞影響腫瘤環境或其他細胞之能力造成的路徑改變允許藉由抑制致瘤、腫瘤維持及/或轉移及復發來更有效地治療DLL3相關病症。應進一步瞭解，所揭示抗體之相同特徵使其可尤其有效地治療已證實對標準治療方案具有抗性或難治性之復發性腫瘤。
可用於評價致瘤細胞頻率之減小之方法包括(但不限於)細胞術或免疫組織化學分析，較佳藉助活體外或活體內限制性稀釋分析(Dylla等人，2008,PMID：PMC2413402及Hoey等人，2009,PMID：19664991)。
活體外限制性稀釋分析可藉由以下方式來實施：在養育群落形成之固體培養基上培養分級或未分級腫瘤細胞(例如分別來自經治療及未經治療之腫瘤)，及計數並表徵生長之群落。或者，可將腫瘤細胞連續稀釋至含有液體培養基之孔之板上，且可在接種後之任一時間但較佳在接種後10天以上將每一孔評分為對群落形成呈陽性或陰性。
活體內限制性稀釋係藉由以下方式來實施：將來自未經治療之對照或暴露於所選治療劑下之腫瘤之腫瘤細胞以連續稀釋物移植至免疫受損小鼠中，且隨後將每一小鼠評分為對腫瘤形成呈陽性或陰性。評分可在可檢測到植入腫瘤後之任一時間進行，但較佳在移植後60天或以上進行。較佳利用帕松分佈(Poisson distribution)統計學或評價預定明確事件(例如是否生成活體內腫瘤之能力)之頻率來分析限制性稀釋實驗之結果以確定致瘤細胞之頻率(Fazekas等人，1982,PMID：7040548)。
亦可使用流式細胞術及免疫組織化學來確定致瘤細胞頻率。兩種技術採用一或多種結合已知富集致瘤細胞之業內公認細胞表面蛋白 質或標記物之抗體或試劑(參見WO 2012/031280)。如業內已知，亦可使用流式細胞術(例如螢光活化細胞分選(FACS))來表徵、分離、純化、富集或分選包括致瘤細胞之各種細胞群體。流式細胞術藉由使其中懸浮有混合細胞群體之流體流通過能夠每秒量測高達數千個粒子之物理及/或化學特徵的電子檢測裝置來量測致瘤細胞含量。免疫組織化學所提供之其他資訊在於，其使得能夠藉由用結合至致瘤細胞標記物之經標記抗體或試劑對組織樣本染色使致瘤細胞在原位(例如在組織切片中)可視化。
因此，本發明抗體可用於經由諸如流式細胞術、磁性活化細胞分選(MACS)、雷射介導之切片或FACS等方法來鑑別、表徵、監測、分離、切片或富集致瘤細胞之群體或亞群。FACS係用於以基於特異性細胞表面標記物大於99.5%之純度分離細胞亞群之可靠方法。用於表徵及操縱致瘤細胞(包括CSC)之其他相容技術可參見例如U.S.P.N.12/686,359、12/669,136及12/757,649。
下文列示已與CSC群體締合且已用於分離或表徵CSC之標記物：ABCA1、ABCA3、ABCG2、ADAM9、ADCY9、ADORA2A、AFP、AXIN1、B7H3、BCL9、Bmi-1、BMP-4、C20orf52、C4.4A、羧肽酶M、CAV1、CAV2、CD105、CD133、CD14、CD16、CD166、CD16a、CD16b、CD2、CD20、CD24、CD29、CD3、CD31、CD324、CD325、CD34、CD38、CD44、CD45、CD46、CD49b、CD49f、CD56、CD64、CD74、CD9、CD90、CEACAM6、CELSR1、CPD、CRIM1、CX3CL1、CXCR4、DAF、核心蛋白聚醣、easyh1、easyh2、EDG3、eed、EGFR、ENPP1、EPCAM、EPHA1、EPHA2、FLJ10052、FLVCR、FZD1、FZD10、FZD2、FZD3、FZD4、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、GD2、GJA1、GLI1、GLI2、GPNMB、GPR54、GPRC5B、IL1R1、IL1RAP、JAM3、Lgr5、Lgr6、LRP3、 LY6E、MCP、mf2、mllt3、MPZL1、MUC1、MUC16、MYC、N33、Nanog、NB84、巢蛋白、NID2、NMA、NPC1、製瘤素M、OCT4、OPN3、PCDH7、PCDHA10、PCDHB2、PPAP2C、PTPN3、PATIENTS、RARRES1、SEMA4B、SLC19A2、SLC1A1、SLC39A1、SLC4A11、SLC6A14、SLC7A8、smarcA3、smarcD3、smarcE1、smarcA5、Sox1、STAT3、STEAP、TCF4、TEM8、TGFBR3、TMEPAI、TMPRSS4、運鐵蛋白受體、TrkA、WNT10B、WNT16、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT5A、YY1及β-連環蛋白。例如，參見Schulenburg等人，2010,PMID：20185329、U.S.P.N.7,632,678及U.S.P.N.2007/0292414、2008/0175870、2010/0275280、2010/0162416及2011/0020221。
類似地，與某些腫瘤類型之CSC締合之細胞表面表型之非限制性實例包括CD44高CD24低、ALDH+、CD133+、CD123+、CD34+CD38-、CD44+CD24-、CD46高CD324+CD66c-、CD133+CD34+CD10-CD19-、CD138-CD34-CD19+、CD133+RC2+、CD44+α2β1 高CD133+、CD44+CD24+ESA+、CD271+、ABCB5+以及業內已知之其他CSC表面表型。例如，參見Schulenburg等人，2010，上文文獻；Visvader等人，2008,PMID：18784658及U.S.P.N.2008/0138313。本發明尤其關注包含CD46高CD324+表型之CSC製劑。
「陽性」、「低」及「陰性」表現量在其應用於標記物或標記物表型時係如下定義。具有陰性表現(即「-」)之細胞在本文中定義為表現小於或等於在螢光通道中在標記其他螢光發射通道中之其他所關注蛋白質之完全抗體染色混合劑存在下利用同型對照抗體所觀察到表現之95%的彼等細胞。熟習此項技術者應瞭解，用於定義陰性事件之此程序稱為「螢光減一」或「FMO」染色。表現大於使用上述FMO染色程序利用同型對照抗體所觀察到表現之95%的細胞在本文中定義 為「陽性」(即「+」)。如本文所定義，多個細胞群體在廣義上定義為「陽性」。若抗原之所觀察到之平均表現大於如上文所述使用FMO染色利用同型對照抗體測定的95%，則細胞定義為陽性。若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且在95%之一個標準偏差內，則陽性細胞可稱為具有低表現(即「lo」)之細胞。或者，若所觀察到之平均表現大於藉由FMO染色測定之95%且大於95%以上之一個標準偏差，則陽性細胞可稱為具有高表現(即「hi」)之細胞。在其他實施例中，較佳可使用99%作為陰性與陽性FMO染色之間之區別點，且在一些實施例中，百分位可大於99%。
CD46高CD324+標記物表型及上文剛剛例示之彼等可與標準流式細胞術分析及細胞分選技術結合使用來表徵、分離、純化或富集TIC及/或TPC細胞或細胞群體以供進一步分析。
因此，可使用上述技術及標記物來測定本發明抗體減小致瘤細胞頻率之能力。在一些情況下，抗DLL3抗體可使致瘤細胞之頻率減小10%、15%、20%、25%、30%或甚至35%。在其他實施例中，致瘤細胞頻率之減小可為40%、45%、50%、55%、60%或65%。在某些實施例中，所揭示化合物可使致瘤細胞之頻率減小70%、75%、80%、85%、90%或甚至95%。應瞭解，致瘤細胞頻率之任何減小皆可能引起贅瘤之致瘤性、持久性、復發及攻擊性的相應減小。
III. 抗體 A. 抗體結構
抗體及其變體及衍生物(包括業內公認術語及編號系統)已廣泛闡述於例如以下文獻中：Abbas等人(2010),Cellular and Molecular Immunology(第6版)，W.B.Saunders Company；或Murphey等人(2011),Janeway’s Immunobiology(第8版)，Garland Science。
「抗體」或「完整抗體」通常係指包含藉由共價二硫鍵及非共 價相互作用保持在一起之兩個重多肽鏈(H)及兩個輕多肽鏈(L)之Y形四聚體蛋白質。每一輕鏈係由一個可變結構域(VL)及一個恆定結構域(CL)構成。每一重鏈包含一個可變結構域(VH)及恆定區，在IgG、IgA及IgD抗體之情形下其包含三個結構域，稱為CH1、CH2及CH3(IgM及IgE具有第四個結構域CH4)。在IgG、IgA及IgD類別中，CH1與CH2結構域藉由撓性鉸鏈區分開，該撓性鉸鏈區係可變長度(在不同IgG子類中為約10個至約60個胺基酸)之富含脯胺酸及半胱胺酸之區段。輕鏈及重鏈二者中之可變結構域藉由約12個或更多個胺基酸之「J」區連結至恆定結構域，且重鏈亦具有約10個額外胺基酸之「D」區。每一類抗體進一步包含由成對半胱胺酸殘基形成之鏈間及鏈內二硫鍵。
如本文所用之術語「抗體」包括多株抗體(polyclonal antibodies)、多株抗體(multiclonal antibodies)、單株抗體、嵌合抗體、人類化及靈長化抗體、CDR移植抗體、人類抗體(包括重組產生之人類抗體)、重組產生之抗體、胞內抗體、多特異性抗體、雙特異性抗體、單價抗體、多價抗體、抗個體基因型抗體、合成抗體(包括突變蛋白及其變體)、免疫特異性抗體片段(例如Fd、Fab、F(ab')2、F(ab')片段)、單鏈片段(例如ScFv及ScFvFc)；及其衍生物，包括Fc融合物及其他修飾，及任何其他免疫反應性分子，只要其展現與決定子優先締合或結合即可。此外，除非上下文約束另外指示，否則該術語進一步包含所有類別之抗體(即IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)及所有子類(即，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)。對應於不同抗體類別之重鏈恆定結構域通常分別由相應的小寫希臘字母α、δ、ε、γ及μ表示。基於來自任何脊椎動物物種之抗體之恆定結構域之胺基酸序列，可將該等抗體之輕鏈指配為兩種完全不同的類型(稱為卡帕型(κ)及拉姆達型(λ))中之一者。
抗體之可變結構域顯示抗體之間胺基酸組成之相當變化，且主要負責抗原識別及結合。每一輕鏈/重鏈對之可變區形成抗體結合位點，使得完整IgG抗體具有兩個結合位點(即其為二價)。VH及VL結構域包含三個極端可變區，其稱為超變區，或更通常稱為互補決定區(CDR)，其藉由四個較不可變區(稱為框架區(FR))構架並分開。VH區與VL區之間之非共價締合形成含有抗體之兩個抗原結合位點中之一者之Fv片段(對於「可變片段」)。可藉由遺傳改造獲得之scFv片段(對於單鏈可變片段)在單一多肽鏈中締合抗體之藉由肽連接體分開之VH區與VL區。
如本文所用，除非另外註明，否則將胺基酸指配至每一結構域、框架區及CDR可根據以下文獻所提供方案中之一者來進行：Kabat等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(第5版)，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號；Chothia等人，1987,PMID：3681981；Chothia等人，1989,PMID：2687698；MacCallum等人，1996,PMID：8876650；或Dubel編輯(2007)Handbook of Therapeutic Antibodies，第3版，Wily-VCH Verlag GmbH and Co或AbM(Oxford Molecular/MSI Pharmacopia)。如業內所熟知，可變區殘基編號通常係如Chothia或Kabat中所述。如自Abysis網站數據庫(參見下文)所獲得，包含如由Kabat、Chothia、MacCallum(亦稱為接觸)及AbM定義之CDR之胺基酸殘基闡釋於下表1中。應注意，MacCallum使用Chothia編號系統。
抗體序列中之可變區及CDR可根據業內已研發出之一般規則(如上文所闡釋，例如Kabat命名系統)或藉由比對該等序列與已知可變區之數據庫來鑑別。用於鑑別該等區域之方法闡述於以下文獻中：Kontermann及Dubel編輯，Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001及Dinarello等人，Current Protocols in Immunology,John Wiley and Sons Inc.,Hoboken,NJ,2000。抗體序列之實例性數據庫闡述於以下網站中且可經由其存取：「Abysis」網站www.bioinf.org.uk/abs(由Department of Biochemistry & Molecular Biology University College London,London,England之A.C.Martin維護)及VBASE2網站www.vbase2.org，如Retter等人，Nucl.Acids Res.,33(數據庫期號)：D671-D674(2005)中所述。較佳使用Abysis數據庫來分析序列，該Abysis數據庫將來自Kabat、IMGT及蛋白質數據庫(PDB)之序列數據與來自PDB之結構數據整合在一起。參見Dr.Andrew C.R.Martin's book chapter Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains.Antibody Engineering Lab Manual(編輯：Duebel,S.及Kontermann,R.,Springer-Verlag,Heidelberg,ISBN-13：978-3540413547，亦可在網站bioinforg.uk/abs上獲得)。Abysis數據庫網站進一步包括已經研發用於鑑別可根據本文教示使用之CDR之一般規則。除非另外指示，否則本文所述之所有CDR皆係根據Kabat等人根據Abysis數據庫網站衍生而來。
對於本發明中所論述之重鏈恆定區胺基酸位置，根據首次闡述於Edelman等人，1969,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63(1)：78-85中之Eu指數來編號，該文獻闡述經報導為第一個經測序之人類IgG1之骨髓瘤 蛋白Eu之胺基酸序列。Edelman之Eu指數亦闡述於Kabat等人，1991(上文文獻)中。因此，術語「如Kabat中所述之Eu指數」或「Kabat之Eu指數」或「Eu指數」或「Eu編號」在重鏈背景下係指基於Edelman等人之人類IgG1 Eu抗體之殘基編號系統，如Kabat等人，1991(上文文獻)中所述。用於輕鏈恆定區胺基酸序列之編號系統以類似方式闡述於Kabat等人，(上文文獻)中。與本發明相容之實例性κ輕鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： (SEQ ID NO：5)。
類似地，與本發明相容之實例性IgG1重鏈恆定區胺基酸序列緊接闡述於下文中： (SEQ ID NO：6)。
所揭示之恆定區序列或其業內已知之變化形式或衍生物可利用標準分子生物學技術可操作地與所揭示之重鏈及輕鏈可變區締合，以提供可原樣使用或納入本發明抗DLL3 ADC中的全長抗體。就此而言且出於說明之目的，實例性抗體hSC16.56之全長重鏈(SEQ ID NO：7)及輕鏈(SEQ ID NO：8)胺基酸序列緊接闡述於下文中。
(SEQ ID NO：7)。
(SEQ ID NO：8)。
應瞭解，本發明之抗體或免疫球蛋白(及ADC)可自特異性識別或締合任何DLL3決定子之抗體生成。如本文所用之「決定子」或「靶」意指可鑑別與具體細胞、細胞群體或組織締合或特定發現於具體細胞、細胞群體或組織中或其上之任何可檢測性狀、性質、標記物或因子。決定子或靶之性質可為形態的、功能的或生物化學的且較佳係表型的。在一些實施例中，決定子係由特定細胞類型或由某些條件下之細胞(例如，在細胞週期之特定點期間或具體生態位之細胞)差異表現(過表現或過少表現)之蛋白質。出於本發明之目的，決定子較佳在異常癌細胞上差異表現，且可包含DLL3蛋白質，或其剪接變體、同種型、同系物或家族成員中之任一者，或其特定結構域、區域或表位。「抗原」、「免疫原性決定子」、「抗原性決定子」或「免疫 原」意指在引入免疫活性動物中時可刺激免疫反應且由自該免疫反應產生之抗體識別的任何蛋白質或其任何片段、區域或結構域。可利用本文所涵蓋DLL3決定子之存在或不存在來鑑別細胞、細胞亞群或組織(例如，腫瘤、致瘤細胞或CSC)。
在免疫球蛋白分子中存在兩種類型之二硫橋或二硫鍵：鏈間及鏈內二硫鍵。如業內所熟知，鏈間二硫鍵之位置及編號根據免疫球蛋白類別及物種而變化。儘管本發明並不限於抗體之任何具體類別或子類，但出於說明之目的在本發明通篇中應使用IgG1免疫球蛋白。在野生型IgG1分子中存在12個鏈內二硫鍵(4個在每一重鏈上且2個在每一輕鏈上)及4個鏈間二硫鍵。鏈內二硫鍵通常受一定保護且相對不如鏈間鍵對還原敏感。相反，鏈間二硫鍵位於免疫球蛋白之表面上，為溶劑可及且通常相對較容易還原。在重鏈之間及每一重鏈中之一者與其各別輕鏈之間存在兩個鏈間二硫鍵。已展示，鏈間二硫鍵並非鏈締合所必需。IgG1鉸鏈區含有在重鏈中形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸，其提供結構支撐以及促進Fab移動之撓性。重鏈/重鏈IgG1鏈間二硫鍵位於殘基C226及C229(Eu編號)處，而IgG1之輕鏈與重鏈之間(重鏈/輕鏈)的IgG1鏈間二硫鍵係在κ或λ輕鏈之C214與重鏈上游鉸鏈區之C220之間形成。
B. 抗體生成及產生
本發明抗體可使用業內已知之眾多種方法來產生。
1. 宿主動物中多株抗體之生成
在多種宿主動物中產生多株抗體為業內所熟知(例如，參見Harlow及Lane(編輯)(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,CSH Press；及Harlow等人(1989)Antibodies,NY,Cold Spring Harbor Press)。為生成多株抗體，用抗原蛋白或包含抗原蛋白之細胞或製劑免疫免疫活性動物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、非人類靈長類動物 等)。一段時間後，藉由采血或殺死動物獲得含有多株抗體之血清。血清可以自動物獲得之形式使用或抗體可經部分或完全純化以提供免疫球蛋白部分或經分離之抗體製劑。
可使用任何形式之抗原或含有該抗原之細胞或製劑來生成特異性針對決定子之抗體。術語「抗原」係以廣義使用且可包含所選靶之任何免疫原性片段或決定子，包括單一表位、多表位、單一或多結構域或整個細胞外結構域(ECD)。抗原可係經分離之全長蛋白質、細胞表面蛋白質(例如，用在其表面上表現抗原之至少一部分之細胞免疫)或可溶性蛋白質(例如，僅用該蛋白質之ECD部分免疫)。抗原可在經遺傳修飾之細胞中產生。上文所提及抗原中之任一者可單獨使用或與一或多種業內已知之免疫原性增強佐劑組合使用。編碼抗原之DNA可為基因組DNA或非基因組DNA(例如cDNA)，且可編碼足以誘發免疫原性反應之ECD之至少一部分。可採用任何載體來轉變其中表現抗原之細胞，包括(但不限於)腺病毒載體、慢病毒載體、質體及非病毒載體(例如陽離子脂質)。
2. 單株抗體
在所選實施例中，本發明涵蓋單株抗體之用途。如業內已知之術語「單株抗體」或「mAb」係指自實質上均質之抗體群體獲得之抗體，即，除可能存在極少量可能突變(例如天然突變)外，構成該群體之個別抗體皆相同。
單株抗體可使用業內已知之眾多種技術來製備，包括雜交瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、轉基因動物(例如XenoMouse®)或其一些組合。舉例而言，單株抗體可使用例如以下文獻中更詳細闡述之雜交瘤以及生物化學及遺傳改造技術來產生：An,Zhigiang(編輯)Therapeutic Monoclonal Antibodies：From Bench to Clinic,John Wiley and Sons，第1版，2009；Shire等人(編輯)Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing,Springer Science+Business Media LLC，第1版，2010；Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，第2版，1988；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier,N.Y.,1981)。在產生多種特異性結合至決定子之單株抗體後，可基於例如對決定子之親和力或內化速率經由多個篩選過程選擇尤其有效之抗體。如本文所述產生之抗體可用作「來源」抗體且進一步經修飾以例如改良對靶之親和力，改良其在細胞培養物中之產生，降低活體內免疫原性，產生多特異性構築體等。單株抗體產生及篩選之更詳細描述闡釋於下文及隨附實例中。
3. 人類抗體
在另一實施例中，抗體可包含全人類抗體。術語「人類抗體」係指具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用製造下文所述人類抗體之任一技術製造之抗體。
人類抗體可使用業內已知之多種技術來產生。在一個實施例中，可藉由篩選使用噬菌體展示製備之重組組合抗體文庫來分離重組人類抗體。在一個實施例中，文庫係使用自B細胞分離之mRNA製備之人類VL及VH cDNA生成的scFv噬菌體或酵母展示文庫。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供候選序列之相對較容易的操縱(例如藉由親和力成熟或重組改組)。
人類抗體亦可藉由將人類免疫球蛋白基因座引入其中內源免疫球蛋白基因已部分或完全不活化且已引入人類免疫球蛋白基因之轉基因動物(例如小鼠)中來製造。在激發時，觀察到人類抗體產生，其在所有方面非常類似於在人類中可見之情形，包括基因重排、組裝及全人類抗體譜。此方法闡述於例如U.S.P.N.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016以及關於XenoMouse®技 術之U.S.P.N.6,075,181及6,150,584；及Lonberg及Huszar,1995,PMID：7494109中。或者，可經由使產生針對靶抗原之抗體之人類B淋巴球(該等B淋巴球可自患有贅瘤性病症之個體回收或可已在活體外經免疫)永生來製備人類抗體。例如，參見Cole等人，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss，第77頁(1985)；Boerner等人，1991,PMID：2051030；及U.S.P.N.5,750,373。如同其他單株抗體，該等人類抗體可用作來源抗體。
此外，該等抗體可在已使用編碼期望人類重鏈及輕鏈之遺傳材料(來自任何來源，包括上文剛剛闡述之彼等)轉變或轉染所選宿主細胞後以重組方式產生。該等以重組方式製造之非天然全人類抗體組合物明確在本發明之範疇內且可用於提供所揭示抗DLL3 ADC。
4. 衍生抗體：
在如上文所述生成、選擇及分離來源抗體後，其可立即經進一步改變以提供具有經改良之醫藥特徵之抗DLL3抗體。較佳地，使用已知分子改造技術來修飾或改變來源抗體以提供具有期望治療性質之衍生抗體。
4.1. 嵌合及人類化抗體
本發明之所選實施例包含以免疫特異性方式結合至DLL3且可視為「來源」抗體之鼠類單株抗體。在某些實施例中，本發明抗體可經由來源抗體之恆定區及/或表位結合胺基酸序列之可選修飾自該等「來源」抗體衍生而來。在各個實施例中，若來源抗體中之所選胺基酸係經由缺失、突變、取代、整合或組合來改變，則抗體「衍生」自該來源抗體。在另一實施例中，「衍生」抗體係其中將來源抗體之片段(例如，一或多個CDR或整個重鏈及輕鏈可變區)組合或納入受體抗體序列中以提供衍生性抗體(例如嵌合或人類化抗體)者。該等「衍生」抗體可使用如下文所述之標準分子生物學技術來生成，例如以改 良對決定子之親和力；改良抗體穩定性；改良細胞培養物中之產生及產量；降低活體內免疫原性；減小毒性；促進活性部分之結合；或產生多特異性抗體。該等抗體亦可藉由化學方式或轉譯後修飾來修飾成熟分子(例如醣基化模式或聚乙二醇化)自來源抗體衍生而來。
在一個實施例中，本發明抗體包含衍生自已共價連結之至少兩個不同物種或類別之抗體之蛋白質區段的嵌合抗體。術語「嵌合」抗體係指如下構築體：其中重鏈及/或輕鏈之一部分與來自具體物種或屬具體抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來自另一物種或屬另一抗體類別或子類之抗體以及該等抗體之片段的相應序列一致或同源(U.S.P.N.4,816,567；Morrison等人，1984,PMID：6436822)。在一些實施例中，本發明之嵌合抗體可包含可操作地連接至人類輕鏈及重鏈恆定區之所選鼠類重鏈及輕鏈可變區的全部或大部分。在其他所選實施例中，嵌合抗DLL3抗體可「衍生」自本文所揭示之小鼠抗體。
在其他實施例中，本發明之嵌合抗體係「CDR移植」抗體，其中CDR(如使用Kabat、Chothia、McCallum等所定義)衍生自具體物種或屬具體抗體類別或子類，而該抗體之其餘部分主要衍生自來自另一物種或屬另一抗體類別或子類之抗體。對於在人類中之應用，可將一或多個所選齧齒類動物CDR(例如小鼠CDR)移植至人類受體抗體中，替代人類抗體之一或多個天然CDR。該等構築體通常具有提供最大強度人類抗體功能(例如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC))、同時減少個體對抗體之不期望免疫反應之優點。在一個實施例中，CDR移植抗體將包含一或多個自小鼠獲得之納入人類框架序列中之CDR。
「人類化」抗體與CDR移植抗體類似。如本文所用之「人類化」抗體係包含一或多個衍生自一或多個非人類抗體(供體或來源抗體)之 胺基酸序列(例如CDR序列)之人類抗體(受體抗體)。在某些實施例中，可將「回復突變」引入人類化抗體中，其中接受者人類抗體之可變區之一或多個框架結構域(FR)中之殘基經來自非人類物種供體抗體之相應殘基替代。該等回復突變可幫助維持移植CDR之適當三維構形且由此改良親和力及抗體穩定性。可使用來自多個供體物種之抗體，包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物。此外，人類化抗體可包含未在接受者抗體或供體抗體中發現之新殘基，以例如進一步細化抗體性能。如下文實例中所述提供與本發明相容之包含來源抗體之鼠類組份及受體抗體之人類組份的CDR移植及人類化抗體。
可利用多種業內公認技術來確定使用哪些人類序列作為受體抗體來提供本發明之人類化構築體。確定其適宜作為受體序列之相容性人類種系序列及方法之編譯揭示於例如Dubel及Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Tomlinson,I.A.等人(1992)J.Mol.Biol.227：776-798；Cook,G.P.等人(1995)Immunol.Today 16：237-242；Chothia,D.等人(1992)J.Mol.Biol.227：799-817；及Tomlinson等人(1995)EMBO J 14：4628-4638)。V-BASE目錄(VBASE2-Retter等人，Nucleic Acid Res.33；671-674,2005)提供人類免疫球蛋白可變區序列之全面目錄(經Tomlinson,I.A.等人，MRC Centre for Protein Engineering,Cambridge,UK編譯)，亦可使用該目錄來鑑別相容性受體序列。另外，例如U.S.P.N.6,300,064中所述之共有人類框架序列亦可證實為相容性受體序列且可根據本發明教示使用。一般而言，基於與鼠類來源框架序列之同源性以及來源及受體抗體之CDR經典結構之分析來選擇人類框架受體序列。然後可使用業內公認技術合成衍生抗體之重鏈及輕鏈可變區之衍生序列。
舉例而言，CDR移植及人類化抗體以及相關方法闡述於U.S.P.N. 6,180,370及5,693,762中。關於其他細節參見例如Jones等人，1986(PMID：3713831)；及U.S.P.N.6,982,321及7,087,409。
CDR移植或人類化抗體可變區與人類受體可變區之序列一致性或同源性可如本文所論述來測定，且在如此量測時將較佳共享至少60%或65%序列一致性，更佳至少70%、75%、80%、85%或90%序列一致性，甚至更佳至少93%、95%、98%或99%序列一致性。較佳地，不一致之殘基位置因保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈(R基團)之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同之情形下，可向上調整序列一致性%或相似度以校正取代之保守性質。
應瞭解，如附圖1A及1B中所提供之經註解CDR及框架序列係根據Kabat等人使用專有Abysis數據庫來定義。然而，如本文所論述，熟習此項技術者可容易地根據Chothia等人、ABM或MacCallum等人以及Kabat等人所提供之定義來鑑別CDR。因此，包含一或多個根據上文所提及系統中之任一者衍生而來之CDR之抗DLL3人類化抗體明確保持在本發明之範疇內。
4.2. 位點特異性抗體
本發明抗體可經改造以有助於結合至細胞毒素或其他抗癌劑(如下文更詳細論述)。根據細胞毒素在抗體上之位置及藥物對抗體比率(DAR)，抗體藥物結合物製劑有利地包含ADC分子之同源群體。基於本發明，熟習此項技術者可容易地製造如本文所述之位點特異性經改造構築體。如本文所用之「位點特異性抗體」或「位點特異性構築體」意指抗體或其免疫反應性片段，其中重鏈或輕鏈中之至少一個胺基酸缺失、改變或經取代(較佳經另一胺基酸)以提供至少一個游離半 胱胺酸。類似地，「位點特異性結合物」應意指包含位點特異性抗體及至少一種結合至未配對或游離半胱胺酸之細胞毒素或其他化合物之ADC。在某些實施例中，未配對半胱胺酸殘基將包含未配對鏈內殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸殘基將包含未配對鏈間半胱胺酸殘基。在其他實施例中，游離半胱胺酸可改造成抗體之胺基酸序列(例如，在CH3結構域中)。在任一情形下，位點特異性抗體可具有多種同型，例如IgG、IgE、IgA或IgD；且在彼等類別內，抗體可具有多種子類，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。對於IgG構築體，抗體之輕鏈可包含各自納入C214之κ或λ同型，在所選實施例中，該同型可因在IgG1重鏈中缺少C220殘基而未配對。
因此，除非上下文另外指明，否則如本文所用之術語「游離半胱胺酸」或「未配對半胱胺酸」可互換使用且應意指抗體之任何半胱胺酸(或含有硫醇)成份，無論係天然存在抑或使用分子改造技術特異性納入所選殘基位置中。在某些所選實施例中，游離半胱胺酸可包含天然半胱胺酸，其原初鏈間或鏈內二硫橋伴侶已經取代、消除或以其他方式改變以破壞生理條件下之天然二硫橋，由此使未配對半胱胺酸適於位點特異性結合。在其他較佳實施例中，游離或未配對半胱胺酸將包含選擇性位於抗體重鏈或輕鏈胺基酸序列內之預定位點處之半胱胺酸殘基。應瞭解，在結合之前，游離或未配對半胱胺酸可以硫醇(還原半胱胺酸)、封端半胱胺酸(經氧化)或與同一抗體上之另一游離半胱胺酸之非天然分子內二硫鍵(經氧化)形式存在，此端視系統之氧化態而定。如下文更詳細論述，此抗體構築體之輕度還原將提供可用於位點特異性結合之硫醇。在尤佳實施例中，游離或未配對半胱胺酸(無論係天然抑或納入)將經受選擇性還原及後續結合以提供均質DAR組合物。
應瞭解，所揭示經改造結合物製劑所展現之有利性質係至少部 分地基於特異性定向結合且極大地限制所製造結合物之結合位置及組合物之絕對DAR的能力來預測。與大多數習用ADC製劑不同，本發明無需完全依賴抗體之部分或完全還原來提供隨機結合位點及DAR種類之相對不受控生成。相反，在某些態樣中，本發明較佳藉由改造靶向抗體以破壞一或多個天然(即，「原初」)鏈間或鏈內二硫橋或在任一位置引入半胱胺酸殘基來提供一或多個預定未配對(或游離)半胱胺酸位點。為此，應瞭解，在所選實施例中，可使用標準分子改造技術將半胱胺酸殘基沿抗體(或其免疫反應性片段)重鏈或輕鏈納入任一處或附加至其。在其他較佳實施例中，可破壞原初二硫鍵，同時納入非天然半胱胺酸(其隨後將包含游離半胱胺酸)，其隨後可用作結合位點。
在一個實施例中，經改造抗體包含鏈內或鏈間半胱胺酸殘基之至少一個胺基酸缺失或取代。如本文所用之「鏈間半胱胺酸殘基」意指參與抗體之輕鏈與重鏈之間或抗體之兩個重鏈之間的原初二硫鍵之半胱胺酸殘基，而「鏈內半胱胺酸殘基」係與同一重鏈或輕鏈中之另一半胱胺酸天然配對者。在一個實施例中，缺失或經取代之鏈間半胱胺酸殘基參與形成輕鏈與重鏈之間之二硫鍵。在另一實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基參與兩個重鏈之間之二硫鍵。在典型實施例中，因抗體之互補結構(其中輕鏈與重鏈之VH及CH1結構域配對，且其中一個重鏈之CH2及CH3結構域與互補重鏈之CH2及CH3結構域配對)所致，輕鏈或重鏈中單一半胱胺酸之突變或缺失將在經改造抗體中產生兩個未配對半胱胺酸殘基。
在一些實施例中，鏈間半胱胺酸殘基係缺失的。在其他實施例中，鏈間半胱胺酸經另一胺基酸(例如，天然胺基酸)取代。舉例而言，胺基酸取代可使得鏈間半胱胺酸經中性(例如絲胺酸、蘇胺酸或甘胺酸)或親水性(例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸或異白胺酸)殘基替代。在一個實施例中，鏈間半胱胺酸經絲胺酸替代。
在本發明所涵蓋之一些實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基處於輕鏈(κ或λ)上，由此使游離半胱胺酸留在重鏈上。在其他實施例中，缺失或經取代之半胱胺酸殘基處於重鏈上，從而使游離半胱胺酸留在輕鏈恆定區上。綜上所述應瞭解，缺失或取代完整抗體之輕鏈或重鏈中之單一半胱胺酸會產生具有兩個未配對半胱胺酸殘基之位點特異性抗體。
在一個實施例中，IgG輕鏈(κ或λ)之位置214(C214)處之半胱胺酸缺失或經取代。在另一實施例中，IgG重鏈上之位置220(C220)處之半胱胺酸缺失或經取代。在其他實施例中，重鏈上之位置226或位置229處之半胱胺酸缺失或經取代。在一個實施例中，重鏈上之C220經絲胺酸取代(C220S)以在輕鏈中提供期望游離半胱胺酸。在另一實施例中，輕鏈中之C214經絲胺酸取代(C214S)以在重鏈中提供期望游離半胱胺酸。該等位點特異性構築體提供於實例15中。該等構築體之匯總緊接顯示於下表2中，其中編號通常係根據如Kabat中所述之Eu指數，且WT代表無變化之「野生型」或原初恆定區序列，且德爾塔(△)指示胺基酸殘基之缺失(例如，C214△指示位置214處之半胱胺酸已缺失)。
就此而言且出於說明之目的，實例性抗體hSC16.56ss1之全長重鏈(SEQ ID NO：9)及輕鏈(SEQ ID NO：8)胺基酸序列緊接闡述於下文中。應注意，κ輕鏈與在hSC16.56抗體中所發現之輕鏈一致，而hSC16.56ss1重鏈(SEQ ID NO：9)與hSC16.56抗體中之重鏈(SEQ ID NO：7)之不同之處在於其含有C220S突變，該突變在下文序列中加下劃線且加粗。
(SEQ ID NO：9)。
(SEQ ID NO：8)。
關於引入或添加一或多個半胱胺酸來提供游離半胱胺酸(與破壞原初二硫鍵不同)，熟習此項技術者可容易地辨別出抗體或抗體片段上之相容性位置。因此，在所選實施例中，可將半胱胺酸引入CH1結構域、CH2結構域或CH3結構域或其任一組合中，此端視期望DAR、 抗體構築體、所選承載體及抗體靶而定。在其他較佳實施例中，可將半胱胺酸引入κ或λ CL結構域中，且在尤佳實施例中，可將半胱胺酸引入CL結構域之c末端區域中。在每一情形下，可改變、移除或取代毗鄰半胱胺酸插入位點之其他胺基酸殘基以促進分子穩定性、結合效率或在承載體附接後為承載體提供保護性環境。在具體實施例中，經取代殘基出現在抗體之任何可及位點處。藉由用半胱胺酸取代該等表面殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之容易可及位點處且可經選擇性還原，如本文進一步闡述。在具體實施例中，經取代殘基出現在抗體之可及位點處。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於選擇性結合該抗體。在某些實施例中，下列殘基中之任一者或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(Eu編號)及重鏈Fc區之S400(Eu編號)。製造相容性位點特異性抗體之其他取代位置及方法闡述於U.S.P.N.7,521,541中，其全文併入本文中。
用於生成如本文所揭示具有所定義位點及化學計量之載藥量的抗體-藥物結合物之策略廣泛適用於所有抗DLL3抗體，此乃因其主要涉及抗體之保守恆定結構域之改造。由於抗體之每一類別及子類之胺基酸序列及原初二硫橋在許多文件中有記載，故熟習此項技術者無需過多實驗即可容易地製造各種DLL3抗體之經改造構築體，且因此該等構築體明確涵蓋於本發明之範疇內。如本發明中所述之包含重鏈及輕鏈可變區胺基酸序列之位點特異性構築體尤其如此。
4.3. 恆定區修飾及改變的醣基化
本發明之所選實施例亦可包含恆定區(即Fc區)之取代或修飾，包括(但不限於)胺基酸殘基取代、突變及/或修飾，此產生具有包括(但不限於)以下特徵之化合物：改變的藥物動力學、增加的血清半衰期、增加結合親和力、降低的免疫原性、增加的產生、改變的Fc配體 與Fc受體(FcR)之結合、增強或降低的ADCC或CDC、改變的醣基化及/或二硫鍵及改良的結合特異性。
具有經改良之Fc效應物功能之化合物可例如經由改變參與Fc結構域與Fc受體(例如，FcγRI、FcγRIIA及B、FcγRIII及FcRn)之間之相互作用的胺基酸殘基來生成，該改變可產生增加的細胞毒性及/或改變的藥物動力學，例如增加的血清半衰期(例如，參見Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。
在所選實施例中，具有增加的活體內半衰期之抗體可藉由修飾(例如，取代、缺失或添加)經鑑別參與Fc結構域與FcRn受體之間之相互作用的胺基酸殘基來生成(例如，參見國際公開案第WO 97/34631號；第WO 04/029207號；U.S.P.N.6,737,056及U.S.P.N.2003/0190311)。關於該等實施例，Fc變體可提供在哺乳動物、較佳人類中超過5天、超過10天、超過15天、較佳超過20天、超過25天、超過30天、超過35天、超過40天、超過45天、超過2個月、超過3個月、超過4個月或超過5個月之半衰期。增加的半衰期產生較高的血清效價，由此減小投與抗體之頻率及/或降低欲投與抗體之濃度。可例如在表現人類FcRn之轉基因小鼠或經轉染人類細胞系中或在投與具有變體Fc區之多肽之靈長類動物中分析活體內與人類FcRn之結合及人類FcRn高親和力結合多肽之血清半衰期。WO 2000/42072闡述具有經改良或減少的與FcRn之結合之抗體變體。例如，亦參見Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。驚人的是，除用於提供可選位點特異性結合物之ADC外，無任何抗體恆定區修飾之某些本發明ADC展現延長的末端半衰期(例如，兩週)。
在其他實施例中，Fc變化可產生增強或降低的ADCC或CDC活 性。如業內已知，CDC係指在補體存在下溶解靶細胞，且ADCC係指細胞毒性之形式，其中結合至存在於某些細胞毒性細胞(例如，天然殺手細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上之FcR上之分泌性Ig使得該等細胞毒性效應細胞能夠特異性結合至帶有抗原之靶細胞，且隨後殺死含有細胞毒素之靶細胞。在本發明背景下，提供具有「改變的」FcR結合親和力之抗體變體，該改變的FcR結合親和力與親代或未經修飾之抗體或與包含原初序列FcR之抗體相比係增強或降低的結合。展示降低的結合之該等變體可具有極小或無顯著結合，例如與原初序列相比0-20%之與FcR之結合，例如如藉由業內所熟知之技術所測定。在其他實施例中，變體將展現與原初免疫球蛋白Fc結構域相比增強的結合。應瞭解，該等類型之Fc變體可有利地用於增強所揭示抗體之有效抗贅瘤性質。在其他實施例中，該等變化產生增加的結合親和力、降低的免疫原性、增加的產生、改變的醣基化及/或二硫鍵(例如，對於結合位點)、改良的結合特異性、增加的吞噬作用；及/或下調細胞表面受體(例如B細胞受體；BCR)等。
其他實施例包含一或多個經改造糖型，例如共價附接至蛋白質(例如，在Fc結構域中)之包含改變的醣基化模式或改變的碳水化合物組成之位點特異性抗體。例如，參見Shields,R.L.等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740。經改造糖型可用於眾多個目的，包括(但不限於)增強或降低效應物功能、增加抗體對靶之親和力或促進抗體之產生。在某些實施例中，倘若期望降低的效應物功能，則分子可經改造以表現非醣基化形式。可消除一或多個可變區框架醣基化位點、由此消除該位點處之醣基化之取代為業內所熟知(例如，參見U.S.P.N.5,714,350及6,350,861)。相反，可藉由改造一或多個其他醣基化位點來賦予含有Fc之分子增強的效應物功能或經改良之結合。
其他實施例包括具有改變的醣基化組成之Fc變體，例如具有減 少的岩藻糖基殘基量之低岩藻醣基化抗體或具有增加的平分型GlcNAc結構之抗體。已展示，該等改變的醣基化模式增加抗體之ADCC能力。經改造之糖型可藉由熟習此項技術者已知之任一方法來生成，例如藉由使用經改造或變體表現菌株、藉由與一或多種酶(例如N-乙醯葡糖胺基轉移酶III(GnTIII))共表現、藉由在各種生物體或來自各種生物體之細胞系中表現包含Fc區之分子或藉由在已表現包含Fc區之分子後修飾碳水化合物(例如，參見WO 2012/117002)。
4.4. 片段
根據本文之教示，無論選擇哪種形式之抗體(例如嵌合、人類化等)來實踐本發明，應瞭解，可使用其免疫反應性片段自身或用作抗體藥物結合物之一部分。「抗體片段」包含完整抗體之至少一部分。如本文所用之術語抗體分子之「片段」包括抗體之抗原結合片段，且術語「抗原結合片段」係指免疫球蛋白或抗體之與所選抗原或其免疫原性決定子以免疫特異性方式結合或反應或與衍生出片段用於特異性抗原結合之完整抗體競爭的多肽片段。
實例性位點特異性片段包括：可變輕鏈片段(VL)、可變重鏈片段(VH)、scFv、F(ab')2片段、Fab片段、Fd片段、Fv片段、單一結構域抗體片段、雙價抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及自抗體片段形成之多特異性抗體。另外，活性位點特異性片段包含抗體之保留其與抗原/受質或受體之相互作用且以與完整抗體類似之方式對其進行改質(但可能具有稍低之效率)的部分。該等抗體片段可進一步經改造以包含一或多個如本文所述之游離半胱胺酸。
在其他實施例中，抗體片段係當存在於完整抗體中時包含Fc區且保留至少一種通常與Fc區相關之生物功能(例如FcRn結合、抗體半衰期調節、ADCC功能及補體結合)者。在一個實施例中，抗體片段係活體內半衰期實質上與完整抗體類似之單價抗體。舉例而言，該抗體 片段可包含連接至能夠賦予片段活體內穩定性之包含至少一個游離半胱胺酸之Fc序列的抗原結合臂。
如熟習此項技術者將公認，片段可藉由分子改造或經由化學或酶處理(例如木瓜酶或胃蛋白酶)完整或完全抗體或抗體鏈或藉由重組方式來獲得。關於抗體片段之更詳細描述，參見例如Fundamental Immunology,W.E.Paul編輯，Raven Press,N.Y.(1999)。
4.5. 多價構築體
在其他實施例中，本發明之抗體及結合物可為單價或多價(例如，二價、三價等)。如本文所用之術語「化合價」係指與抗體締合之潛在靶結合位點之數量。每一靶結合位點特異性結合一個靶分子或靶分子上之特定位置或基因座。當抗體為單價時，分子之每一結合位點將特異性結合至單一抗原位置或表位。當抗體包含一個以上之靶結合位點(多價)時，每一靶結合位點可特異性結合相同或不同的分子(例如，可結合至不同配體或不同抗原，或相同抗原上之不同表位或位置)。例如，參見U.S.P.N.2009/0130105。
在一個實施例中，抗體係其中雙鏈具有不同特異性之雙特異性抗體，如Millstein等人，1983,Nature,305：537-539中所述。其他實施例包括具有額外特異性之抗體，例如三特異性抗體。其他更複雜的相容性多特異性構築體及其製造方法闡述於U.S.P.N.2009/0155255以及WO 94/04690；Suresh等人，1986,Methods in Enzymology,121：210；及WO96/27011中。
多價抗體可以免疫特異性方式結合至期望靶分子之不同表位或可以免疫特異性方式結合至靶分子以及異源表位(例如異源多肽或固體支撐材料)二者。儘管所選實施例僅可結合兩種抗原(即雙特異性抗體)，但具有額外特異性之抗體(例如三特異性抗體)亦涵蓋於本發明中。雙特異性抗體亦包括交聯或「異源結合」抗體。舉例而言，異源 結合物中抗體中之一者可偶合至抗生物素蛋白，另一者偶合至生物素。業內已提出該等抗體例如使免疫系統細胞靶向不期望細胞(U.S.P.N.4,676,980)，且用於治療HIV感染(WO 91/00360、WO 92/200373及EP 03089)。異源結合抗體可使用任一便利交聯方法來製造。適宜交聯劑為業內所熟知，且與多種交聯技術一起揭示於U.S.P.N.4,676,980中。
5. 抗體之重組產生
抗體及其片段可使用自抗體產生細胞及重組技術獲得之遺傳材料來產生或修飾(例如，參見Dubel及Reichert(編輯)(2014)Handbook of Therapeutic Antibodies，第2版，Wiley-Blackwell GmbH；Sambrook及Russell(編輯)(2000)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版)，NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等人(2002)Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.；及U.S.P.N.7,709,611)。
本發明之另一態樣係關於編碼本發明抗體之核酸分子。該等核酸可存在於完整細胞中，存在於細胞溶解物中，或以部分純化或實質上純之形式存在。核酸係當藉由標準技術(包括鹼/SDS處理、CsCl分級、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳及業內所熟知之其他技術)與其他細胞組份或其他污染物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離時「經分離的」或使其實質上純的。本發明核酸可為例如DNA(例如基因組DNA、cDNA)、RNA及其人工變體(例如肽核酸)，而無論係單鏈抑或雙鏈DNA、RNA，且可含或可不含內含子。在所選實施例中，核酸係cDNA分子。
本發明核酸可使用標準分子生物學技術來獲得。對於由雜交瘤(例如，如下文實例中所述製備之雜交瘤)表現之抗體，可藉由標準 PCR擴增或cDNA選殖技術獲得編碼抗體之輕鏈及重鏈之cDNA。對於自免疫球蛋白基因文庫(例如使用噬菌體展示技術)獲得之抗體，可自該文庫回收編碼抗體之核酸。
可藉由標準重組DNA技術進一步操縱編碼VH及VL區段之DNA片段，例如以將可變區基因轉化成全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在該等操縱中，編碼VL或VH之DNA片段操作地連接至編碼另一蛋白質或蛋白質片段(例如抗體恆定區或撓性連接體)之另一DNA片段。如此上下文中所用之術語「可操作地連接」意指連結兩個DNA片段使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保留在框架中。
可藉由將編碼VH之DNA操作地連接至編碼重鏈恆定區(在IgG1之情形下為CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子，將編碼VH區之經分離DNA轉化成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人(1991)(上文文獻))，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG4恆定區。實例性IgG1恆定區闡述於SEQ ID NO：2中。對於Fab片段重鏈基因，編碼VH之DNA可操作地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。
可藉由將編碼VL之DNA操作地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子，將編碼VL區之經分離DNA轉化成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列為業內已知(例如，參見Kabat等人，(1991)(上文文獻))，且涵蓋該等區域之DNA片段可藉由標準PCR擴增來獲得。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區，但最佳為κ恆定區。實例性相容性κ輕鏈恆定區闡述於SEQ ID NO：5中。
本文涵蓋展現與本發明多肽之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之某些多肽(例如抗原或抗體)。舉例而言，衍 生之人類化抗體VH或VL結構域可展現與來源(例如，鼠類)或受體(例如，人類)VH或VL結構域之序列相似性。「同源」多肽可展現65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性。在其他實施例中，「同源」多肽可展現93%、95%或98%序列一致性。如本文所用，兩個胺基酸序列之間之同源性%等效於兩個序列之間之一致性%。兩個序列之間之一致性%隨該等序列所共享之一致位置數而變化(即，同源性%=一致位置數/總位置數×100)，其中考慮到為達成兩個序列之最佳比對而需要引入之空位數及每一空位之長度。兩個序列之間之序列比較及一致性%測定可使用數學演算法來完成，如下文非限制性實例中所述。
兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入ALIGN程式(2.0版)中之E.Meyers及W.Miller之演算法(Comput.Appl.Biosci.,4：11-17(1988))、使用PAM120權重殘基表、空位長度罰分12及空位罰分4來測定。另外，兩個胺基酸序列之間之一致性%可使用已納入GCG軟體包(在www.gcg.com上獲得)中之GAP程式中之Needleman及Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))演算法、使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣及空位權重16、14、12、10、8、6或4以及長度權重1、2、3、4、5或6來測定。
另外或或者，本發明之蛋白質序列可進一步用作「詢問序列」來實施針對公共數據庫之檢索，以例如鑑別相關序列。該等檢索可使用Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-10之XBLAST程式(2.0版)來實施。BLAST蛋白質檢索可使用XBLAST程式、評分=50、字長=3來實施以獲得與本發明之抗體分子同源之胺基酸序列。為獲得空位比對用於比較之目的，可如Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中所述使用空位BLAST。當使用BLAST及空位BLAST程式時，可使用各別程式(例如XBLAST及NBLAST)之預設參 數。
不一致之殘基位置可因保守胺基酸取代或不保守胺基酸取代而不同。「保守胺基酸取代」係其中胺基酸殘基經具有相似化學性質(例如電荷或疏水性)之側鏈之另一胺基酸殘基取代者。一般而言，保守胺基酸取代實質上不會改變蛋白質之功能性質。在兩個或更多個胺基酸序列因保守取代而彼此不同之情形下，可向上調整序列一致性%或相似度以校正取代之保守性質。在用不保守胺基酸取代之情形下，在實施例中，展現序列一致性之多肽將保留本發明多肽(例如抗體)之期望功能或活性。
本文亦涵蓋展現與本發明核酸之「序列一致性」、「序列相似性」或「序列同源性」之核酸。「同源序列」意指展現至少約65%、70%、75%、80%、85%或90%序列一致性之核酸分子序列。在其他實施例中，核酸之「同源序列」可展現與參照核酸93%、95%或98%序列一致性。
本發明亦提供載體，其包含可操作地連接至啟動子之該等上述核酸(例如，參見WO 86/05807；WO 89/01036；及U.S.P.N.5,122,464)；及真核分泌路徑之其他轉錄調控及處理控制元件。本發明亦提供具有彼等載體及宿主表現系統之宿主細胞。
如本文所用之術語「宿主表現系統」包括可經改造以生成本發明之核酸或多肽及抗體的任一類型之細胞系統。該等宿主表現系統包括(但不限於)微生物(例如，大腸桿菌(E.coli)或枯草桿菌(B.subtilis))，其經重組噬菌體DNA或質體DNA轉變或轉染；酵母(例如，酵母菌屬(Saccharomyces))，其經重組酵母表現載體轉染；或哺乳動物細胞(例如，COS、CHO-S、HEK293T、3T3細胞)，其具有含有衍生自哺乳動物細胞或病毒基因組之啟動子(例如，腺病毒晚期啟動子)之重組表現構築體。宿主細胞可經兩個表現載體共轉染，例 如，第一載體編碼重鏈衍生之多肽且第二載體編碼輕鏈衍生之多肽。在本發明之尤佳態樣中，所揭示抗體將使用經改造CHO細胞來產生。
轉變哺乳動物細胞之方法為業內所熟知。例如，參見U.S.P.N.4,399,216、4,912,040、4,740,461及4,959,455。宿主細胞亦可經改造以允許產生具有多種特徵之抗原結合分子(例如具有GnTIII活性之經修飾糖型或蛋白質)。
對於重組蛋白之長期、高產率生產而言，穩定表現為較佳。因此，穩定表現所選抗體之細胞系可使用標準業內公認技術來改造且形成本發明之一部分。宿主細胞可使用受適當表現控制元件(例如，啟動子或增強子序列、轉錄終止子、多腺苷酸化位點等)控制之DNA及可選擇標記物轉變，而非使用含有病毒複製起點之表現載體。可使用業內所熟知之任一選擇系統，包括麩醯胺酸合成酶基因表現系統(GS系統)，其提供用於增強所選條件下之表現之有效方式。GS系統以整體或部分結合EP 0 216 846、EP 0 256 055、EP 0 323 997及EP 0 338 841及U.S.P.N.5,591,639及5,879,936進行論述。用於研發穩定細胞系之另一相容性表現系統係FreedomTM CHO-S套組(Life Technologies)。
藉由重組表現或任何其他所揭示技術產生本發明抗體後，可立即藉由業內已知之方法將其純化或分離，使得自其天然環境將其鑑別及分離及/或回收且與將干擾抗體或相關ADC之診斷或治療用途之污染物分離。經分離抗體包括重組細胞內之原位抗體。
該等經分離之製劑可使用多種業內公認技術來純化，該等技術係例如離子交換及粒徑篩析層析、透析、滲濾及親和層析、尤其蛋白質A或蛋白質G親和層析。相容性方法更全面論述於下文實例中。
6. 產生後選擇
無論如何獲得，皆可針對期望特徵來選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤、酵母群落等)，該等期望特徵包括例如穩 健生長、高抗體產生及期望抗體特徵(例如對所關注抗原之高親和力)。雜交瘤可在細胞培養物中進行活體外擴增或在同基因免疫受損動物中進行活體內擴增。選擇、選殖及擴增雜交瘤及/或群落之方法為熟習此項技術者所熟知。鑑別出期望抗體後，可立即使用常用業內公認分子生物學及生物化學技術來分離、操縱及表現相關遺傳材料。
由原始文庫(天然或合成)產生之抗體可具有中等親和力(Ka為約106M-1至107M-1)。為增強親和力，可藉由構築抗體文庫(例如，藉由使用易錯聚合酶在活體外引入隨機突變)及自彼等二級文庫重新選擇對抗原具有高親和力之抗體(例如藉由使用噬菌體或酵母展示)在活體外模擬親和力成熟。WO 9607754闡述在免疫球蛋白輕鏈CDR中誘導誘變以產生輕鏈基因文庫之方法。
可使用多種技術來選擇抗體，包括(但不限於)噬菌體或酵母展示，其中在噬菌體或酵母上合成人類組合抗體或scFv片段之文庫，用所關注抗原或其抗體結合部分篩選該文庫，並自可獲得抗體或免疫反應性片段者分離結合該抗原之噬菌體或酵母(Vaughan等人，1996,PMID：9630891；Sheets等人，1998,PMID：9600934；Boder等人，1997,PMID：9181578；Pepper等人，2008,PMID：18336206)。用於生成噬菌體或酵母展示文庫之套組在市面上有售。業內亦存在可用於生成及篩選抗體展示文庫之其他方法及試劑(參見U.S.P.N.5,223,409；WO 92/18619、WO 91/17271、WO 92/20791、WO 92/15679、WO 93/01288、WO 92/01047、WO 92/09690；及Barbas等人，1991,PMID：1896445)。該等技術有利地允許篩選大量候選抗體且提供序列之相對較容易的操縱(例如藉由重組改組)。
IV. 抗體之特徵
在某些實施例中，可針對有利性質來選擇、選殖並進一步篩選抗體產生細胞(例如雜交瘤或酵母群落)，該等有利性質包括例如穩健 生長、高抗體產生及如下文更詳細論述之期望位點特異性抗體特徵。在其他情形下，可藉由選擇用於接種動物之具體抗原(例如特異性DLL3同種型)或靶抗原之免疫反應性片段來賦予抗體之特徵。在其他實施例中，所選抗體可如上文所述經改造以增強或細化諸如親和力或藥物動力學等免疫化學特徵。
A. 中和抗體
在某些實施例中，結合物將包含「中和」抗體或其衍生物或片段。亦即，本發明可包含結合特定結構域、基序或表位且能夠阻斷、降低或抑制DLL3之生物活性之抗體分子。更通常而言，術語「中和抗體」係指結合至靶分子或配體或與其相互作用且防止靶分子與結合伴侶(例如受體或受質)結合或締合、由此中斷原本將自分子之相互作用產生之生物反應的抗體。
應瞭解，可使用業內已知之競爭性結合分析來評價抗體或其免疫功能片段或衍生物之結合及特異性。關於本發明，如例如藉由Notch受體活性或在活體外競爭性結合分析中所量測，當過量抗體使結合至DLL3之結合伴侶之量減少至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更大時，抗體或片段將保持抑制或減少DLL3與結合伴侶或受質之結合。在針對DLL3之抗體之情形下，例如，中和抗體或拮抗劑較佳將使Notch受體活性改變至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%或更大。應瞭解，此改變的活性可直接使用業內公認技術來量測或可藉由改變的活性對下游所具有之影響(例如，腫瘤形成、細胞存活率或Notch反應性基因之活化或抑制)來量測。較佳地，抗體中和DLL3活性之能力係藉由DLL3與Notch受體結合之抑制或藉由評價其減輕DLL3介導之Notch信號傳導抑制的能力來評價。
B. 內化抗體
在某些實施例中，抗體可包含內化抗體，使得該抗體將結合至決定子且將內化(與任何所結合之醫藥活性部分一起)至所選靶細胞(包括致瘤細胞)中。內化抗體分子之數量可足以殺死抗原表現細胞、尤其抗原表現致瘤細胞。端視抗體或在一些情況下抗體藥物結合物之功效，將單一抗體分子攝取至細胞中可足以殺死抗體所結合之靶細胞。本發明已證實，所表現DLL3蛋白之實質性部分保持與致瘤細胞表面締合，由此允許所揭示抗體或ADC之定位及內化。在所選實施例中，該等抗體將締合或結合至一或多種在內化後殺死細胞之藥物。在一些實施例中，本發明ADC將包含內化位點特異性ADC。
如本文所用之「內化」抗體係在結合至相關決定子後(與任何所結合細胞毒素一起)被靶細胞吸收者。該等內化ADC之數量較佳將足以殺死決定子表現細胞、尤其決定子表現癌症幹細胞。端視細胞毒素或在一些情況下ADC整體之功效，將少數抗體分子攝取至細胞中足以殺死抗體所結合之靶細胞。舉例而言，某些藥物(例如PBD或卡奇黴素)係如此強效以致於內化結合至抗體之少數毒素分子足以殺死靶細胞。抗體在結合至哺乳動物細胞後是否內化可藉由多種業內公認分析(例如肥皂草毒素分析，例如Mab-Zap及Fab-Zap；Advanced Targeting Systems)來確定。檢測抗體是否內化至細胞中之方法亦闡述於U.S.P.N.7,619,068中。
C. 消耗抗體
在其他實施例中，本發明抗體係消耗抗體。術語「消耗」抗體係指較佳結合至細胞表面上或附近之抗原且誘導、促進或引起細胞死亡(例如，藉由CDC、ADCC或引入細胞毒性劑)之抗體。在實施例中，所選消耗抗體將結合至細胞毒素。
較佳地，消耗抗體將能夠殺死所定義細胞群體中之至少20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或99%之DLL3表現細胞。在一些實施例中，細胞群體可包含經富集、製成切片(sectioned)、純化或分離之致瘤細胞，包括癌症幹細胞。在其他實施例中，細胞群體可包含完整腫瘤樣本或包含癌症幹細胞之異質腫瘤提取物。根據本文之教示，可使用標準生物化學技術來監測及量化致瘤細胞之消耗。
D. 結合親和力
本文揭示對特定決定子(例如DLL3)具有高結合親和力之抗體。術語「KD」係指具體抗體-抗原相互作用之解離常數或表觀親和力。當解離常數KD(k解離/k締合)為10-7M時，本發明抗體可以免疫特異性方式結合其靶抗原。該抗體當KD為5×10-9M時以高親和力特異性結合抗原，且當KD為5×10-10M時以極高親和力特異性結合抗原。在本發明之一個實施例中，抗體之KD為10-9M且解離速率為約1×10-4/sec。在本發明之一個實施例中，解離速率為<1×10-5/sec。在本發明之其他實施例中，抗體將以介於約10-7M與10-10M之間之KD結合至決定子，且在另一實施例中其將以KD 2×10-10M結合。本發明之其他所選實施例包含具有以下KD(k解離/k締合)之抗體：小於10-6M、小於5×10-6M、小於10-7M、小於5×10-7M、小於10-8M、小於5×10-8M、小於10-9M、小於5×10-9M、小於10-10M、小於5×10-10M、小於10-11M、小於5×10-11M、小於10-12M、小於5×10-12M、小於10-13M、小於5×10-13M、小於10-14M、小於5×10-14M、小於10-15M或小於5×10-15M。
在某些實施例中，以免疫特異性方式結合至決定子(例如DLL3)之本發明抗體可具有以下締合速率常數或k 締合 (或k a )速率(抗體+抗原(Ag)k 締合←抗體-Ag)：至少105M-1s-1、至少2×105M-1s-1、至少5×105M-1s-1、至少106M-1s-1、至少5×106M-1s-1、至少107M-1s-1、至少5×107 M-1s-1或至少108M-1s-1。
在另一實施例中，以免疫特異性方式結合至決定子(例如DLL3)之本發明抗體可具有以下解離速率常數或k 解離 (或k d )速率(抗體+抗原(Ag)k 解離←抗體-Ag)：小於10-1s-1、小於5×10-1s-1、小於10-2s-1、小於5×10-2s-1、小於10-3s-1、小於5×10-3s-1、小於10-4s-1、小於5×104s-1、小於10-5s-1、小於5×10-5s-1、小於10-6s-1、小於5×10-6s-1、小於10-7s-1、小於5×10-7s-1、小於10-8s-1、小於5×10-8s-1、小於10-9s-1、小於5×10-9s-1或小於10-10s-1。
結合親和力可使用業內已知之多種技術來測定，例如表面電漿共振、生物層干涉術、雙極化干涉術、靜態光散射、動態光散射、等溫滴定量熱、ELISA、分析超速離心及流式細胞術。
E. 分倉及表位映射
本文所揭示之抗體可根據其所締合之離散表位來表徵。「表位」係決定子之抗體或免疫反應性片段所特異性結合之部分。免疫特異性結合可基於如上文所述之結合親和力或藉由抗體對蛋白質及/或大分子之複合混合物中之其靶抗原之優先識別(例如在競爭分析中)來確認及定義。「線性表位」係由抗原中允許免疫特異性結合抗體之鄰接胺基酸形成。優先結合線性表位之能力通常即使在抗原變性時仍得以維持。相反，「構象表位」通常包含抗原胺基酸序列中之非鄰接胺基酸，但在抗原之二級、三級或四級結構背景下足夠靠近以同時被單一抗體結合。當具有構象表位之抗原變性時，抗體通常將不再識別該抗原。表位(鄰接或非鄰接)通常包括至少3個、且更通常至少5個或8-10個或12-20個呈獨特空間構象之胺基酸。
亦可根據本發明抗體所屬之群或「倉」來表徵該等抗體。「分倉」係指利用競爭性抗體結合分析鑑別出無法同時結合免疫原性決定子之抗體對，由此鑑別出「競爭」結合之抗體。競爭性抗體可藉由其 中所測試之抗體或免疫功能片段防止或抑制參照抗體與共用抗原之特異性結合的分析來測定。通常，該分析涉及使用結合至固體表面或細胞之經純化抗原(例如，DLL3或其結構域或片段)、未經標記之測試抗體及經標記之參照抗體。藉由測定在測試抗體存在下結合至固體表面或細胞之標記之量來量測競爭性抑制。關於測定競爭性結合之方法之其他細節提供於本文實例中。通常，當存在過量競爭性抗體時，其將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的參照抗體與共同抗原之特異性結合。在一些情況下，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更大之結合。相反，當結合參照抗體時，其較佳將抑制至少30%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的後續添加之測試抗體(即，DLL3抗體)之結合。在一些情況下，抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更大的測試抗體之結合。
通常，分倉或競爭性結合可使用多種業內公認技術來測定，例如免疫分析，例如西方墨點(western blot)、放射性免疫分析、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、「夾心」免疫分析、免疫沈澱分析、沈澱素反應、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散分析、凝集分析、補體固定分析、免疫放射量測定分析、螢光免疫分析及蛋白質A免疫分析。該等免疫分析係常規的且為業內所熟知(參見Ausubel等人編輯(1994)Current Protocols in Molecular Biology，第1卷，John Wiley & Sons,Inc.,New York)。另外，可使用交叉阻斷分析(例如，參見WO 2003/48731；及Harlow等人(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Harlow及David Lane編輯)。
用於測定競爭性抑制(且因此「倉」)之其他技術包括：表面電漿共振，其使用例如BIAcoreTM 2000系統(GE Healthcare)；生物層干涉術，其使用例如ForteBio® Octet RED(ForteBio)；或流式細胞術珠粒 陣列，其使用例如FACSCanto II(BD Biosciences)或多倍體LUMINEXTM檢測分析(Luminex)。
Luminex係使得能夠進行大規模多倍體抗體配對之基於珠粒之免疫分析平臺。該分析比較抗體對與靶抗原之同時結合模式。該對中之一種抗體(捕獲mAb)結合至Luminex珠粒，其中每一捕獲mAb結合至不同顏色之珠粒。另一抗體(檢測mAb)結合至螢光信號(例如藻紅素(PE))。該分析分析抗體與抗原之同時結合(配對)且將具有相似配對特徵之抗體分組在一起。檢測mAb與捕獲mAb之相似特徵指示該兩種抗體結合至相同或密切相關之表位。在一個實施例中，配對特徵可使用皮爾森相關係數(Pearson's correlation coefficient)來確定以鑑別出與所測試抗體板上之任何具體抗體最密切相關之抗體。在實施例中，若抗體對之皮爾森相關係數為至少0.9，則測試/檢測mAb經測定與參照/捕獲mAb在同一倉中。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.8、0.85、0.87或0.89。在其他實施例中，皮爾森相關係數為至少0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99或1。分析自Luminex分析獲得之數據之其他方法闡述於U.S.P.N.8,568,992中。Luminex分析100種不同類型之珠粒(或更多)之能力同時提供幾乎無限的抗原及/或抗體表面，從而在抗體表位剖析中產生與生物感測器分析相比經改良之通量及解析度(Miller等人，2011,PMID：21223970)。
類似地，包含表面電漿共振之分倉技術與本發明相容。如本文所用之「表面電漿共振」係指允許藉由檢測生物感測器基質內蛋白質濃度之變化來分析實時特異性相互作用之光學現象。使用市售設備(例如BIAcoreTM 2000系統)，可容易地確定所選抗體是否彼此競爭結合至所定義抗原。
在其他實施例中，可用於確定測試抗體是否與參照抗體「競爭」結合之技術係「生物層干涉術」，其係一種分析自以下兩個表面 反射之白光之干涉圖案的光學分析技術：生物感測器尖端上之固定化蛋白質層及內部參照層。結合至生物感測器尖端之分子數之任何變化使可實時量測之干涉圖案發生移位。該等生物層干涉分析可使用ForteBio® Octet RED機器如下實施。將參照抗體(Ab1)捕獲至抗小鼠捕獲晶片上，然後使用高濃度之非結合抗體封阻晶片且收集基線。然後藉由特異性抗體(Ab1)捕獲單體重組靶蛋白，且將尖端浸至含有與對照相同之抗體(Ab1)之孔中或浸至含有不同測試抗體(Ab2)之孔中。若如藉由比較與對照Ab1之結合量所測定未發生進一步結合，則Ab1及Ab2經測定為「競爭性」抗體。若利用Ab2觀察到額外結合，則Ab1及Ab2經測定不彼此競爭。可擴大此過程以使用96孔板中代表獨特倉之一整列抗體來篩選獨特抗體之大文庫。在實施例中，若參照抗體抑制至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%的測試抗體與共用抗原之特異性結合，則測試抗體將與參照抗體競爭。在其他實施例中，將抑制至少80%、85%、90%、95%或97%或更大之結合。
在定義涵蓋一組競爭性抗體之倉後，可立即實施進一步表徵以確定抗原上該組抗體所結合之特異性結構域或表位。可使用Cochran等人，2004,PMID：15099763所述方案之修改來實施結構域層級表位映射。精細表位定位係確定抗原上包含抗體所結合之決定子表位之特定胺基酸的過程。
在某些實施例中，精細表位映射可使用噬菌體或酵母展示來實施。其他相容性表位映射技術包括丙胺酸掃描突變體、肽墨點(Reineke,2004,PMID：14970513)或肽裂解分析。另外，可採用諸如表位切除、表位提取及抗原之化學修飾等方法(Tomer,2000,PMID：10752610)，其使用酶，例如蛋白水解酶(例如，胰蛋白酶、胞內蛋白酶Glu-C、胞內蛋白酶Asp-N、胰凝乳蛋白酶等)；化學劑，例如琥珀醯亞胺基酯及其衍生物、含有一級胺之化合物、肼及卡巴肼、游離胺 基酸等。在另一實施例中，可根據每一抗體與經化學或酶修飾之抗原表面的結合特徵之相似性使用修飾輔助剖析(亦稱為基於抗原結構之抗體剖析(ASAP))來分類針對同一抗原之大量單株抗體(U.S.P.N.2004/0101920)。
在確定抗原上之期望表位後，可立即例如藉由使用本文所述之技術用包含所選表位之肽免疫來生成針對該表位之其他抗體。
V. 抗體結合物
在一些實施例中，本發明抗體可與醫藥活性或診斷部分結合以形成「抗體藥物結合物」(ADC)或「抗體結合物」。術語「結合物」係在廣義上使用且意指任何醫藥活性或診斷部分與本發明抗體之共價或非共價締合，而與締合方法無關。在某些實施例中，締合係經由抗體之離胺酸或半胱胺酸殘基來實現。在一些實施例中，醫藥活性或診斷部分可經由一或多個位點特異性游離半胱胺酸結合至抗體。所揭示之ADC可用於治療及診斷目的。
本發明ADC可用於將細胞毒素或其他承載體遞送至靶位置(例如，致瘤細胞及/或表現DLL3之細胞)。如本文所用之術語「藥物」或「彈頭」可互換使用且將意指生物活性或可檢測分子或藥物，包括抗癌劑及細胞毒素，如下文所述。「承載體」可包含藥物或「彈頭」與可選連接體化合物之組合。結合物上之「彈頭」可包含代謝成活體內活性劑之肽、蛋白質或前藥、聚合物、核酸分子、小分子、結合劑、模擬劑、合成藥物、無機分子、有機分子及放射性同位素。在有利實施例中，所揭示ADC將所結合承載體導向呈相對無反應性、無毒狀態之靶位點，然後釋放並活化彈頭。彈頭之此靶向釋放較佳係經由承載體之穩定結合(例如，經由抗體上之一或多個半胱胺酸)及最小化過量結合之毒性ADC種類之相對均質之ADC製劑組合物來達成。在彈頭已遞送至腫瘤位點後即與經設計以大量釋放彈頭之藥物連接體偶合，本 發明之結合物實質上可減小不期望非特異性毒性。此有利地提供腫瘤位點處相對較高之活性細胞毒素量，同時最小化非靶向細胞及組織之暴露，由此提供增強的治療指數。
應瞭解，儘管本發明之一些實施例包含納入治療部分之承載體(例如，細胞毒素)，但納入診斷劑及生物相容性改質劑之其他承載體可受益於所揭示結合物所提供之靶向釋放。因此，除非上下文另外指明，否則關於治療性承載體實例之任何揭示內容亦適用於包含如本文所論述之診斷劑或生物相容性改質劑之承載體。所選承載體可共價或非共價連接至抗體且展現不同的化學計量莫耳比，此至少部分地端視用於實現結合之方法而定。本發明結合物通常可由下式表示：Ab-[L-D]n或其醫藥上可接受之鹽，其中：a)Ab包含抗DLL3抗體；b)L包含可選連接體；c)D包含藥物；且d)n係約1至約20之整數。
熟習此項技術者應瞭解，上文所提及式之結合物可使用多種不同的連接體及藥物來製造且結合方法將端視組份之選擇而變化。因此，與所揭示抗體之反應性殘基(例如，半胱胺酸或離胺酸)締合之任何藥物或藥物連接體化合物皆與本文之教示相容。類似地，允許所選藥物與抗體結合(包括位點特異性結合)之任何反應條件皆在本發明之範疇內。儘管具有前述內容，本發明之一些實施例包含使用穩定劑與輕度還原劑之組合使藥物或藥物連接體選擇性結合至游離半胱胺酸，如本文所述。該等反應條件往往提供更均質之製劑及較少非特異性結合及污染物以及相應地較小毒性。
A. 承載體及彈頭 1. 治療劑
本發明抗體可結合、連接或融合至醫藥活性部分或以其他方式與醫藥活性部分締合，該醫藥活性部分係治療部分或藥物，例如抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑(或細胞毒素)、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射性治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改質劑、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。
實例性抗癌劑或細胞毒素(包括同系物及其衍生物)包含1-去氫睪固酮、安麯黴素(anthramycin)、放線菌素(actinomycin)D、博來黴素(bleomycin)、卡奇黴素(包括n-乙醯基卡奇黴素)、秋水仙鹼(colchicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、細胞鬆弛素(cytochalasin)B、放線菌素(dactinomycin)(之前稱為放線菌素(actinomycin))、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、多卡米星、吐根素(emetine)、泛艾黴素(epirubicin)、溴乙錠(ethidium bromide)、依託泊苷(etoposide)、糖皮質激素、短桿菌素(gramicidin)D、利多卡因(lidocaine)、類美登素(例如DM-1及DM-4(Immunogen))、光輝黴素(mithramycin)、絲裂黴素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、普魯卡因(procaine)、普萘洛爾(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、替尼泊苷(tenoposide)、四卡因(tetracaine)及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
其他相容性細胞毒素包含多拉斯他汀(dolastatin)及奧裡斯他汀，包括單甲基奧裡斯他汀E(MMAE)及單甲基奧裡斯他汀F(MMAF)(Seattle Genetics)；瓢菌素(amanitin)，例如α-瓢菌素、β-瓢菌素、γ-瓢菌素或ε-瓢菌素(Heidelberg Pharma)；DNA小溝結合劑，例如多卡米星衍生物(Syntarga)；烷基化劑，例如經修飾或二聚體吡咯并苯并二氮呯(PBD)、甲基二氯乙基胺、噻替派(thiotepa)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、美法侖(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)、 洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、環磷醯胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂黴素C及順式二氯二胺鉑(II)(DDP、順鉑)；剪接抑制劑，例如米亞黴素(meayamycin)類似物或衍生物(例如，如U.S.P.N.7,825,267中所述之FR901464)；管狀結合劑，例如埃博黴素(epothilone)類似物及微管溶素(tubulysin)、太平洋紫杉醇及DNA損傷劑(例如卡奇黴素及埃斯培拉黴素(esperamicin))；抗代謝物，例如胺甲喋呤(methotrexate)、6-巰嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)及5-氟尿嘧啶達卡巴嗪(decarbazine)；抗有絲分裂劑，例如長春鹼(vinblastine)及長春新鹼(vincristine)及蒽環(例如道諾黴素(daunorubicin)(之前稱為柔紅黴素(daunomycin))及多柔比星(doxorubicin))及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
在所選實施例中，本發明抗體可與抗CD3結合分子締合以招募細胞毒性T細胞且使其靶向致瘤細胞(BiTE technology；例如，參見Fuhrmann等人(2010)Annual Meeting of AACR摘要編號5625)。
在其他實施例中，本發明ADC可包含使用適宜連接體結合之包含治療性放射性同位素之細胞毒素。可與該等實施例相容之實例性放射性同位素包括(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、銅(62Cu、64Cu、67Cu)、硫(35S)、鐳(223R)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)、鉍(212Bi、213Bi)、鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、117Sn、225Ac、76Br及211At。亦可使用其他放射性核種作為診斷及治療劑，尤其60keV至4,000keV能量範圍中之彼等。
在其他所選實施例中，本發明ADC將結合至細胞毒性苯并二氮呯衍生物彈頭。可結合至所揭示抗體之相容性苯并二氮呯衍生物(及可選連接體)闡述於例如U.S.P.N.8,426,402及PCT文件WO2012/128868及WO2014/031566中。與下文所述之PBD一樣，人們認為相容性苯并二氮呯衍生物在DNA之小溝中結合且抑制核酸合成。該等化合物經報導具有強效抗腫瘤性質，且因此尤其適用於本發明ADC中。
在某些實施例中，本發明ADC可包含PBD及其醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物作為彈頭。PBD係藉由共價結合至小溝中之DNA且抑制核酸合成來發揮抗腫瘤活性之烷基化劑。已顯示PBD具有強效抗腫瘤性質，同時展現最低骨髓細胞減少。與本發明相容之PBD可使用若干類型之連接體(例如，包含具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至抗體，且在某些實施例中其呈二聚體形式(即，PBD二聚體)。可結合至所揭示抗體之相容性PBD(及可選連接體)闡述於例如U.S.P.N.6,362,331、7,049,311、7,189,710、7,429,658、7,407,951、7,741,319、7,557,099、8,034,808、8,163,736、2011/0256157及PCT文件WO2011/130613、WO2011/128650、WO2011/130616、WO2014/057073及WO2014/057074中。與本發明相容之PBD化合物之實例顯示於下文中。
就此而言，已顯示PBD具有強效抗腫瘤性質，同時展現最低骨髓細胞減少。與本發明相容之PBD可使用若干類型之連接體中之任一者(例如，包含具有游離硫氫基之馬來醯亞胺基部分之肽基連接體)連接至DLL3調節劑，且在某些實施例中其呈二聚體形式(即，PBD二聚體)。PBD具有一般結構：
其取代基之數量、類型及位置、其芳香族A環及吡咯并C環二者及C環之飽和度不同。在B環中，在負責烷基化DNA之親電子中心N10-C11位置處存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲醚(NH-CH(OMe))。所有已知天然產物在手性C11a位置處具有(S)-構形，此當自C環向A環觀察時為該等天然產物提供右撚。此給予該等天然產物適當的三維形狀用於與B型DNA小溝之等螺旋性，從而在結合位點處緊密吻合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York，第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。其在小溝中形成加成物之能力使得其能夠干擾DNA處理，因此其用作細胞毒性劑。如上文所提及，為增加其功效，PBD通常係以可結合至如本文所述之抗DLL3抗體之二聚體形式來使用。
在尤佳實施例中，可結合至所揭示調節劑之相容性PBD闡述於U.S.P.N.2011/0256157中。在此揭示內容中，PBD二聚體(即包含兩個PBD部分之彼等)可能較佳。因此，本發明之較佳結合物係具有式(AB)或(AC)之彼等：
其中：虛線指示C1與C2之間或C2與C3之間之雙鍵的可選存在；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基；其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn及鹵基；R10係聯結至DLL3抗體或其片段或衍生物之連接體，如本文所述；Q獨立地選自O、S及NH；R11係H或R，或倘若Q係O，則R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子；X選自O、S或N(H)且在所選實施例中包含O；R"係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如，O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代； R及R’各自獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基，且視情況對於NRR’，R及R’與其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環；且其中R2"、R6"、R7"、R9"、X"、Q"及R11"(若存在)分別係如根據R2、R6、R7、R9、X、Q及R11所定義，且RC係封端基團。
包含上文所提及結構之所選實施例緊接更詳細闡述於下文中。
雙鍵
在一個實施例中，在C1與C2之間及在C2與C3之間不存在雙鍵。
在一個實施例中，虛線指示C2與C3之間之雙鍵之可選存在，如下文所顯示：
在一個實施例中，當R2係C5-20芳基或C1-12烷基時，在C2與C3之間存在雙鍵。
在一個實施例中，虛線指示C1與C2之間之雙鍵之可選存在，如下文所顯示：
在一個實施例中，當R2係C5-20芳基或C1-12烷基時，在C1與C2之間存在雙鍵。
R 2
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR。
在一個實施例中，R2獨立地選自H、=O、=CH2、R、=CH-RD及=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地係H。
在一個實施例中，R2獨立地係R，其中R包含CH3。
在一個實施例中，R2獨立地係=O。
在一個實施例中，R2獨立地係=CH2。
在一個實施例中，R2獨立地係=CH-RD。在PBD化合物內，基團=CH-RD可具有下文所顯示之任一構形：
在一個實施例中，構形係構形(I)。
在一個實施例中，R2獨立地係=C(RD)2。
在一個實施例中，R2獨立地係=CF2。
在一個實施例中，R2獨立地係R。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之C5-7芳基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之C8-10芳基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之苯基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之萘基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之吡啶基。
在一個實施例中，R2獨立地係視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。
在一個實施例中，R2帶有1至3個取代基，且1個及2個更佳，且單取代基團最佳。取代基可處於任何位置。
倘若R2係C5-7芳基，則單一取代基較佳處於不毗鄰至化合物之其餘部分之鍵的環原子上，即較佳至化合物之其餘部分之鍵的β或γ位。因此，倘若C5-7芳基係苯基，則取代基較佳處於間位或對位，且更佳處於對位。
在一個實施例中，R2選自：
其中星號指示附接點。
倘若R2係C8-10芳基(例如喹啉基或異喹啉基)，則其可在喹啉環或異喹啉環之任何位置帶有任何數量之取代基。在一些實施例中，其帶有1個、2個或3個取代基，且該等取代基可處於近端及遠端環或二者(若存在一個以上之取代基)上。
在一個實施例中，倘若R2視情況經取代，則取代基選自下文取代基部分中所給出之彼等取代基。
倘若R視情況經取代，則取代基較佳選自：鹵基、羥基、醚、甲醯基、醯基、羧基、酯、醯氧基、胺基、醯胺基、醯基醯胺基、胺基羰基氧基、脲基、硝基、氰基及硫醚。
在一個實施例中，倘若R或R2視情況經取代，則取代基選自由以下組成之群：R、OR、SR、NRR’、NO2、鹵基、CO2R、COR、CONH2、CONHR及CONRR’。
倘若R2係C1-12烷基，則可選取代基可另外包括C3-20雜環基及C5-20芳基。
倘若R2係C3-20雜環基，則可選取代基可另外包括C1-12烷基及C5-20芳基。
倘若R2係C5-20芳基，則可選取代基可另外包括C3-20雜環基及C1-12烷基。
應理解，術語「烷基」涵蓋子類烯基及炔基以及環烷基。因此，倘若R2係視情況經取代之C1-12烷基，則應理解，烷基視情況含有一或多個碳-碳雙鍵或三鍵，其可形成共軛系統之一部分。在一個實施例中，視情況經取代之C1-12烷基含有至少一個碳-碳雙鍵或三鍵，且此鍵與存在於C1與C2之間或C2與C3之間之雙鍵共軛。在一個實施例中，C1-12烷基係選自飽和C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基及C3-12環烷基之基團。
若R2上之取代基係鹵基，則其較佳係F或Cl、更佳Cl。
若R2上之取代基係醚，則在一些實施例中其可為烷氧基，例如C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)，或在一些實施例中其可為C5-7芳基氧基(例如苯氧基、吡啶基氧基、呋喃基氧基)。
若R2上之取代基係C1-7烷基，則其較佳可為C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R2上之取代基係C3-7雜環基，則在一些實施例中其可為C6含氮雜環基，例如嗎啉基、硫嗎啉基、六氫吡啶基、六氫吡嗪基。該等基團可經由氮原子結合至PBD部分之其餘部分。該等基團可進一步經取代，例如經C1-4烷基取代。
若R2上之取代基係雙-氧基-C1-3伸烷基，則此較佳係雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸乙基。
R2之尤佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-六氫吡嗪基、嗎啉基及甲基-噻吩基。
尤佳經取代之R2基團包括(但不限於)4-甲氧基-苯基、3-甲氧基 苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧基亞甲基-苯基、4-甲基噻吩基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。
在一個實施例中，R2係鹵基或二鹵基。在一個實施例中，R2係-F或-F2，該等取代基在下文中分別圖解說明為(III)及(IV)：
R D
在一個實施例中，RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基。
在一個實施例中，RD獨立地係R。
在一個實施例中，RD獨立地係鹵基。
R 6
在一個實施例中，R6獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H、OH、OR、SH、NH2、NO2及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地選自H及鹵基。
在一個實施例中，R6獨立地係H。
在一個實施例中，R6及R7一起形成基團-O-(CH2)p-O-，其中p係1或2。
R 7
R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、 NO2、Me3Sn及鹵基。
在一個實施例中，R7獨立地係OR。
在一個實施例中，R7獨立地係OR7A，其中R7A獨立地係視情況經取代之C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地係視情況經取代之飽和C1-6烷基。
在一個實施例中，R7A獨立地係CH3。
在一個實施例中，R7A獨立地係視情況經取代之C2-4烯基。
在一個實施例中，R7A獨立地係Me。
在一個實施例中，R7A獨立地係CH2Ph。
在一個實施例中，R7A獨立地係烯丙基。
在一個實施例中，化合物係二聚體，其中每一單體之R7基團一起形成連接單體之具有式X-R"-X之二聚體橋。
R 9
在一個實施例中，R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、NO2、Me3Sn-及鹵基。
在一個實施例中，R9獨立地係H。
在一個實施例中，R9獨立地係R或OR。
R 10
較佳地，相容性連接體(例如本文所述之彼等)經由R10位置(即，N10)處之共價鍵使DLL3抗體附接至PBD藥物部分。
Q
在某些實施例中，Q獨立地選自O、S及NH。
在一個實施例中，Q獨立地係O。
在一個實施例中，Q獨立地係S。
在一個實施例中，Q獨立地係NH。
R 11
在所選實施例中，R11係H或R，或倘若Q係O，則R11可為SO3M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，R11係H。
在某些實施例中，R11係R。
在某些實施例中，倘若Q係O，則R11係SO3M，其中M係金屬陽離子。陽離子可為Na+。
在某些實施例中，倘若Q係O，則R11係H。
在某些實施例中，倘若Q係O，則R11係R。
X
在一個實施例中，X選自O、S或N(H)。
較佳地，X係O。
R"
R"係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，R"係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。
在一個實施例中，伸烷基視情況雜有一或多個選自O、S、及NMe之雜原子及/或芳香族環，該等環視情況經取代。
在一個實施例中，芳香族環係C5-20伸芳基，其中伸芳基係指藉由自芳香族化合物之兩個芳香族環原子移除兩個氫原子獲得之二價部分，該部分具有5至20個環原子。
在一個實施例中，R"係C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子(例如O、S、N(H)、NMe)及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經NH2取代。
在一個實施例中，R"係C3-12伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3、C5、C7、C9及C11伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3、C5及C7伸烷基。
在一個實施例中，R"選自C3及C5伸烷基。
在一個實施例中，R"係C3伸烷基。
在一個實施例中，R"係C5伸烷基。
上文所列示之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)，該等環視情況經取代。
上文所列示之伸烷基可視情況雜有一或多個雜原子及/或芳香族環(例如苯或吡啶)。
上文所列示之伸烷基可為未經取代之直鏈脂肪族伸烷基。
R及R’
在一個實施例中，R獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環基及C5-20芳基。該等基團各自於下文取代基部分中進行定義。
在一個實施例中，R獨立地係視情況經取代之C1-12烷基。
在一個實施例中，R獨立地係視情況經取代之C3-20雜環基。
在一個實施例中，R獨立地係視情況經取代之C5-20芳基。
在一個實施例中，R獨立地係視情況經取代之C1-12烷基。
對於R2，上文闡述關於較佳烷基及芳基之多個實施例及可選取代基之一致性及數量。當R2適用於R時對R2闡釋之較佳者適用於(若適宜)所有其他基團R，例如在R6、R7、R8或R9係R時。
R之較佳者亦適用於R’。
在本發明之一些實施例中，提供具有取代基-NRR’之化合物。在一個實施例中，R及R’與其所附接之氮原子一起形成視情況經取代之4員、5員、6員或7員雜環。該環可含有另一雜原子，例如N、O或S。
在一個實施例中，雜環自身經基團R取代。倘若存在另一N雜原子，則取代基可處於N雜原子上。
除上文所提及之PBD外，已顯示某些二聚體PBD尤其具活性且可 與本發明結合使用。為此，本發明之抗體藥物結合物(即，如本文所揭示之ADC 1-6)可包含如下文緊接闡述為PBD 1-5之PBD化合物。作為藥物-連接體化合物之組份之PBD 1-5中每一者之合成更詳細呈現於WO 2014/130879中，其關於該合成之內容以引用方式併入本文中。根據WO 2014/130879，如本文所述可容易地產生並採用可包含本發明ADC之所選彈頭之細胞毒性化合物。因此，可在連接體裂解後自所揭示ADC釋放之所選PBD化合物緊接闡述於下文中：
及
應瞭解，上文所提及二聚體PBD彈頭中之每一者較佳將在由靶細胞內化且連接體破壞後釋放。如下文更詳細闡述，較佳連接體將包含納入自我犧牲部分以允許釋放活性PBD彈頭而不保留連接體之任何部分的可裂解連接體。在釋放後，PBD彈頭隨後將與靶細胞DNA結合並交聯。該結合表觀上阻斷靶癌細胞之分裂且不破壞其DNA螺旋，因此 可能避免突發抗藥性之常見現象。
根據本發明，該等化合物在腫瘤位點處之遞送及釋放可證實在臨床上可有效地治療或管控增生性病症。關於該等化合物應瞭解，所揭示PBD中之每一者在每一C環中皆具有兩個sp2中心，與在每一C環中僅具有一個sp2中心之化合物相比，此可允許DNA小溝中之較強結合(且因此較大毒性)。因此，當用於如本文所述之DLL3 ADC中時，所揭示PBD可證實可尤其有效地治療增生性病症。
根據本文之教示，前述內容提供與本發明相容之實例性PBD化合物，且決不欲限制可成功地納入抗DLL3結合物中之其他PBD。相反，可結合至如本文所述及下文實例中所述之抗體之任何PBD與所揭示之結合物相容且明確在本發明之公認範圍內。
除上文所提及之藥劑外，本發明抗體亦可結合至生物反應改質劑。舉例而言，在一些實施例中，藥物部分可為具有期望生物活性之多肽。該等蛋白質可包括例如毒素，例如相思子素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)A、抗腫瘤核糖核酸酶(或另一細胞毒性RNase)、假單胞菌屬(pseudomonas)外毒素、霍亂毒素、白喉毒素；細胞凋亡劑，例如腫瘤壞死因子(例如TNF-α或TNF-β)、α-干擾素、β-干擾素、神經生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖維蛋白溶酶原活化劑、AIM I(WO 97/33899)、AIM II(WO 97/34911)、Fas配體(Takahashi等人，1994、PMID：7826947)及VEGI(WO 99/23105)；血栓劑；抗血管生成劑，例如血管抑素或內皮抑素；淋巴介質，例如介白素-1(IL-1)、介白素-2(IL-2)、介白素-6(IL-6)、顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及顆粒球群落刺激因子(G-CSF)；或生長因子，例如生長激素(GH)。
2. 診斷或檢測劑
在其他實施例中，本發明抗體或其片段或衍生物結合至診斷或可檢測劑、標記物或報導基因，其可為例如生物分子(例如，肽或核 苷酸)、小分子、螢光團或放射性同位素。經標記抗體可用於監測過度增生性病症之發生或惡化或作為臨床測試程序之一部分來測定具體療法(包括所揭示抗體(即治療診斷劑))之效能或確定將來療程。該等標記物或報導基因亦可用於純化所選抗體、用於抗體分析(例如，表位結合或抗體分倉)、分離(separating)或分離(isolating)致瘤細胞或用於臨床前程序或毒物學研究中。
該診斷、分析及/或檢測可藉由將抗體偶合至可檢測物質來完成，該等可檢測物質包括(但不限於)各種酶，包含例如辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；輔基，例如(但不限於)鏈黴抗生物素蛋白生物素及抗生物素蛋白/生物素；螢光材料，例如(但不限於)傘形酮、螢光黃、異硫氰酸螢光黃、玫瑰紅、二氯三嗪基胺螢光黃、丹磺醯氯或藻紅素；發光材料，例如(但不限於)發光胺；生物發光材料，例如(但不限於)螢光素酶、螢光素及水母素；放射性材料，例如(但不限於)碘(131I、125I、123I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、銦(115In、113In、112In、111In)及鍀(99Tc)、鉈(201Ti)、鎵(68Ga、67Ga)、鈀(103Pd)、鉬(99Mo)、氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149Pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142Pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32P、89Zr、153Gd、169Yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn及117錫；使用各種正電子發射斷層攝影術之正電子發射金屬、非放射性順磁性金屬離子及經放射標記或結合至特定放射性同位素之分子。在該等實施例中，適宜檢測方法為業內所熟知且可容易地自多種商業來源購得。
在其他實施例中，抗體或其片段可融合或結合至標記物序列或化合物(例如肽或螢光團)以有助於純化或診斷或分析程序，例如免疫組織化學、生物層干涉術、表面電漿共振、流式細胞術、競爭性ELISA、FAC等。在一些實施例中，標記物尤其包含例如由pQE載體 (Qiagen)提供之組胺酸標籤，該載體中之許多在市面上有售。可用於純化之其他肽標籤包括(但不限於)血球凝集素「HA」標籤，其對應於衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白之表位(Wilson等人，1984,Cell 37：767)；及「flag」標籤(U.S.P.N.4,703,004)。
3. 生物相容性改質劑
在所選實施例中，本發明抗體可與可用於視需要調節、改變、改良或緩和抗體特徵之生物相容性改質劑結合。舉例而言，可藉由附接相對較高分子量之聚合物分子(例如市售聚乙二醇(PEG)或類似生物相容性聚合物)來生成具有增加的活體內半衰期之抗體或融合構築體。熟習此項技術者應瞭解，PEG可以可經選擇以賦予抗體特異性性質(例如可調整半衰期)之許多不同分子量及分子構形獲得。PEG可使用或不使用多功能連接體經由使PEG結合至抗體或抗體片段之N末端或C末端或經由存在於離胺酸殘基上之ε-胺基附接至該等抗體或抗體片段或衍生物。可使用產生最小生物活性損失之直鏈或具支鏈聚合物衍生。可藉由SDS-PAGE及質譜來嚴密監測結合程度以確保PEG分子與抗體分子之最佳結合。可藉由例如粒徑篩析或離子交換層析自抗體-PEG結合物分離未反應之PEG。以類似方式，所揭示抗體可結合至白蛋白以使抗體或抗體片段在活體內更穩定或具有更長的活體內半衰期。該等技術為業內所熟知，參見例如WO 93/15199、WO 93/15200及WO 01/77137；及EP 0 413,622。其他生物相容性結合物為熟習此項技術者所明瞭且可容易地根據本文之教示來鑑別。
B. 連接體化合物
可使用多種連接體化合物將本發明抗體結合至相關彈頭。連接體僅需要與抗體上之反應性殘基(較佳半胱胺酸或離胺酸)及所選藥物化合物共價結合。因此，本發明之與所選抗體殘基反應且可用於提供相對穩定之結合物(位點特異性或以其他方式)之任何連接體與本文之 教示相容。
相容性連接體可有利地結合至親核性還原半胱胺酸及離胺酸。涉及還原半胱胺酸及離胺酸之結合反應包括(但不限於)硫醇-馬來醯亞胺、硫醇-鹵代基(醯鹵)、硫醇-烯、硫醇-炔、硫醇-乙烯基碸、硫醇-二碸、硫醇-硫代磺酸鹽、硫醇-吡啶基二硫化物及硫醇-對氟反應。如本文進一步論述，硫醇-馬來醯亞胺生物結合因其快速反應速率及溫和結合條件而成為最廣泛使用之方法之一。使用此方法之一個問題在於，逆向麥可反應(retro-Michael reaction)之可能性及馬來醯亞胺基連接之承載體損失或自抗體轉移至血漿中之其他蛋白質(例如人類血清白蛋白)。然而，在一些實施例中，使用選擇性還原及如本文所述之位點特異性抗體可用於穩定結合且減少此不期望轉移。硫醇-醯鹵反應提供可不經歷逆向麥可反應、且因此更穩定之生物結合物。然而，硫醇-鹵化物反應通常具有與基於馬來醯亞胺之結合相比較緩慢之反應速率，且因此無法有效地提供不期望藥物對抗體比率。硫醇-吡啶基二硫化物反應係另一流行的生物結合途徑。吡啶基二硫化物經歷與游離硫醇之快速交換，此產生混合二硫化物並釋放吡啶-2-硫酮。混合二硫化物可在還原性細胞環境中裂解以釋放承載體。在生物結合方面獲得更多關注之其他方法係硫醇-乙烯基碸及硫醇-二碸反應，其各自與本文之教示相容且明確包括在本發明之範疇內。
在一些實施例中，相容性連接體將賦予ADC在細胞外環境中之穩定性、防止ADC分子聚集且保持ADC易溶於水性介質中並呈單體狀態。在運輸或遞送至細胞中之前，ADC較佳係穩定的且保持完整，即抗體保持與藥物部分連接。儘管連接體在靶細胞外係穩定的，但其經設計以在該細胞內以一定有效之速率裂解或降解。因此，有效的連接體將：(i)維持抗體之特異性結合性質；(ii)允許結合物或藥物部分之細胞內遞送；(iii)保持穩定及完整，即不會裂解或降解直至結合 物遞送或運輸至其靶向位點；及(iv)維持藥物部分之細胞毒性、細胞殺死效應或細胞生長抑制效應(在一些情形下包括任何旁觀者效應)。ADC之穩定性可藉由諸如以下等標準分析技術來量測：HPLC/UPLC、質譜術、HPLC及分離/分析技術LC/MS及LC/MS/MS。如上文所述，抗體及藥物部分之共價附接要求連接體具有兩個反應性官能基，即在反應意義上為二價。業內已知可用於附接兩個或更多個功能或生物活性部分(例如MMAE及抗體)之二價連接體試劑，且已闡述多種方法來提供其所得結合物。
與本發明相容之連接體可在廣義上分類為可裂解及不可裂解連接體。可裂解連接體可包括酸不穩定連接體(例如，肟及腙)、蛋白酶可裂解連接體及二硫化物連接體，其內化至靶細胞中且在細胞內在胞內體-溶酶體路徑中裂解。細胞毒素之釋放及活化依賴於促進酸不穩定化學連接(例如腙或肟)裂解之胞內體/溶酶體酸性隔室。若將溶酶體特異性蛋白酶裂解位點改造成連接體，則細胞毒素將靠近其細胞內靶釋放。或者，含有混合二硫化物之連接體提供以下方式，藉由該方式當細胞毒性承載體在細胞之還原環境中、但不在血流中之富氧環境中選擇性裂解時在細胞內釋放。相反，含有醯胺連接之聚乙二醇或烷基間隔體之相容性不可裂解連接體在靶細胞內在ADC之溶酶體降解期間釋放毒性承載體。在一些方面，連接體之選擇將端視結合物中所用之具體藥物、具體適應症及抗體靶而定。
因此，本發明之某些實施例包含可藉由存在於細胞內環境中(例如，在溶酶體或胞內體或胞膜窖內)之裂解劑裂解之連接體。連接體可為例如藉由細胞內肽酶或蛋白酶(包括(但不限於)溶酶體或胞內體蛋白酶)裂解之肽基連接體。在一些實施例中，肽基連接體之長度為至少兩個胺基酸長或至少三個胺基酸。裂解劑可包括細胞自溶酶B及D及胞漿素，已知其各自水解二肽藥物衍生物，從而在靶細胞內釋放活 性藥物。可藉由硫醇依賴性蛋白酶細胞自溶酶-B裂解之實例性肽基連接體係包含Phe-Leu之肽，此乃因已發現細胞自溶酶-B在癌性組織中具有高表現。該等連接體之其他實例闡述於例如U.S.P.N.6,214,345中。在特定實施例中，可藉由細胞內蛋白酶裂解之肽基連接體係Val-Cit連接體、Val-Ala連接體或Phe-Lys連接體。使用細胞內蛋白水解釋放治療劑之一個優點在於該藥劑在結合時通常會減弱且結合物之血清穩定性相對較高。
在其他實施例中，可裂解連接體具有pH敏感性。通常，pH敏感性連接體將在酸性條件下水解。舉例而言，可使用可在溶酶體中水解之酸不穩定連接體(例如，腙、肟、半卡腙、硫半卡腙、順式-烏頭醯胺、原酸酯、縮醛、縮酮或諸如此類)(例如，參見U.S.P.N.5,122,368；5,824,805；5,622,929)。該等連接體在中性pH條件(例如在血液中之彼等)下相對穩定，但在低於pH 5.5或5.0(為溶酶體之近似pH)下不穩定。
在其他實施例中，連接體可在還原條件下裂解(例如，二硫化物連接體)。業內已知眾多種二硫化物連接體，包括例如可使用以下化合物形成之彼等：SATA(S-乙醯基硫代乙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDP(3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺基酯)、SPDB(3-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-琥珀醯亞胺基酯)及SMPT(N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)。在其他特定實施例中，連接體係丙二酸酯連接體(Johnson等人，1995,Anticancer Res.15：1387-93)、馬來醯亞胺基苯甲醯基連接體(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1299-1304)或3'-N-醯胺類似物(Lau等人，1995,Bioorg-Med-Chem.3(10)：1305-12)。
在所選態樣中，所選連接體將包含下式化合物：
其中星號指示至藥物之附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗DLL3抗體，L1包含連接體及視情況可裂解連接體，A係聯結L1與抗體上之反應性殘基之聯結基團(視情況包含間隔體)，L2較佳係共價鍵，且可存在或可不存在之U可包含有助於連接體在腫瘤位點處與彈頭清晰分離之自消性單元之全部或一部分。
在一些實施例(例如U.S.P.N.2011/0256157中所述之彼等)中，相容性連接體可包含：
其中星號指示至藥物之附接點，CBA(即細胞結合劑)包含抗DLL3抗體，L1包含連接體及視情況可裂解連接體，A係聯結L1與抗體上之反應性殘基之聯結基團(視情況包含間隔體)，且L2係共價鍵或與-OC(=O)-一起形成自消性部分。
應瞭解，L1及L2(若存在)之性質可廣泛變化。該等基團係基於其裂解特徵來選擇，該等裂解特徵可取決於遞送有結合物之位點處之條件。藉由酶之作用裂解之彼等連接體較佳，但亦可使用可藉由改變pH(例如酸或鹼不穩定)、溫度或在照射後(例如光不穩定)裂解之連接體。可在還原或氧化條件下裂解之連接體亦可用於本發明中。
在某些實施例中，L1可包含鄰接胺基酸序列。該胺基酸序列可為酶裂解之靶受質，由此允許釋放藥物。
在一個實施例中，L1可藉由酶之作用裂解。在一個實施例中，酶係酯酶或肽酶。
在另一實施例中，L1呈細胞自溶酶不穩定連接體形式。
在一個實施例中，L1包含二肽。二肽可表示為-NH-X1-X2-CO-， 其中-NH-及-CO-分別表示胺基酸基團X1及X2之N末端及C末端。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸之任何組合。倘若連接體係細胞自溶酶不穩定連接體，則二肽可處於細胞自溶酶介導之裂解之作用位點處。
另外，對於分別具有羧基或胺基側鏈官能基之彼等胺基酸基團(例如Glu及Lys)，CO及NH可表示該側鏈官能基。
在一個實施例中，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-、-Val-Cit-、-Phe-Cit-、-Leu-Cit-、-Ile-Cit-、-Phe-Arg-及-Trp-Cit-，其中Cit係瓜胺酸。
較佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-選自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-及-Val-Cit-。
最佳地，二肽-NH-X1-X2-CO-中之基團-X1-X2-係-Phe-Lys-或-Val-Ala-或Val-Cit。在某些所選實施例中，二肽將包含-Val-Ala-。
在一個實施例中，存在L2且其與-C(=O)O-一起形成自消性連接體。在一個實施例中，L2係酶活性之受質，由此允許釋放彈頭。
在一個實施例中，倘若L1可藉由酶之作用裂解且存在L2，則該酶裂解L1與L2之間之鍵。
L1及L2(若存在)可藉由選自以下之鍵聯結：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
L1之聯結至L2之胺基可在胺基酸之N末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如離胺酸胺基酸側鏈)之胺基。
L1之聯結至L2之羧基可在胺基酸之C末端或可衍生自胺基酸側鏈(例如麩胺酸胺基酸側鏈)之羧基。
L1之聯結至L2之羥基可衍生自胺基酸側鏈(例如絲胺酸胺基酸側鏈)之羥基。
術語「胺基酸側鏈」包括於以下各項中發現之彼等基團：(i)天 然胺基酸，例如丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩醯胺酸、麩胺酸、甘胺酸、組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸；(ii)次要胺基酸，例如鳥胺酸及瓜胺酸；(iii)非天然胺基酸、β-胺基酸、天然胺基酸之合成類似物及衍生物；及(iv)其所有鏡像異構物、非鏡像異構物、異構富集形式、經同位素標記形式(例如2H、3H、14C、15N)、受保護形式及外消旋混合物。
在一個實施例中，-C(=O)O-及L2一起形成以下基團：
其中星號指示至藥物或細胞毒性劑位置之附接點，波形線指示至連接體L1之附接點，Y係-N(H)-、-O-、-C(=O)N(H)-或-C(=O)O-，且n係0至3。伸苯基環視情況經1個、2個或3個取代基取代。在一個實施例中，伸苯基視情況經鹵基、NO2、烷基或羥基烷基取代。
在一個實施例中，Y係NH。
在一個實施例中，n係0或1。較佳地，n係0。
倘若Y係NH且n係0，則自消性連接體可稱為對胺基苄基羰基連接體(PABC)。
在其他實施例中，連接體可包括自消性連接體且與二肽一起形成基團-NH-Val-Cit-CO-NH-PABC-。在其他所選實施例中，連接體可包含基團-NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-，其圖解說明於下文中：
其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點，且波形線指示至 可結合至抗體之連接體其餘部分(例如，間隔體-抗體結合區段)之附接點。在酶裂解二肽後，當遠端位點活化時，自消性連接體將允許清晰釋放受保護之化合物(即，細胞毒素)，沿下文所顯示之線進行：
其中星號指示至所選細胞毒性部分之附接點且其中L*係包含現有裂解肽基單元之連接體其餘部分的活化形式。清晰釋放彈頭確保其將維持期望毒性活性。
在一個實施例中，A係共價鍵。因此，L1及抗體係直接聯結。舉例而言，倘若L1包含鄰接胺基酸序列，則該序列之N末端可直接聯結至抗體殘基。
在另一實施例中，A係間隔基團。因此，L1及抗體係間接聯結。
在某些實施例中，L1及A可藉由選自以下之鍵聯結：-C(=O)NH-、-C(=O)O-、-NHC(=O)-、-OC(=O)-、-OC(=O)O-、-NHC(=O)O-、-OC(=O)NH-及-NHC(=O)NH-。
如下文將更詳細論述，本發明之藥物連接體較佳將連接至半胱胺酸(包括游離半胱胺酸)上之反應性硫醇親核劑。為此，可藉由用多種還原劑(例如DTT或TCEP或溫和還原劑)處理使抗體之半胱胺酸具有反應性用於與連接體試劑結合，如本文所述。在其他實施例中，本發明之藥物連接體較佳將連接至離胺酸。
較佳地，連接體含有親電子官能基以與抗體上之親核官能基反應。抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N末端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基團，例如半胱胺酸；及(iv)糖羥 基或胺基，其中抗體經醣基化。胺基、硫醇基團及羥基具有親核性且能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)馬來醯亞胺基，(ii)活性二硫化物，(iii)活性酯，例如NHS(N-羥基琥珀醯亞胺)酯、HOBt(N-羥基苯并三唑)酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(iv)烷基及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；及(v)醛基、酮基及羧基。
與本發明相容之實例性官能基緊接圖解說明於下文中：
在一些實施例中，半胱胺酸(包括位點特異性抗體之游離半胱胺酸)與藥物-連接體部分之間之聯結係經由硫醇殘基及存在於連接體上之末端馬來醯亞胺基。在該等實施例中，抗體與藥物-連接體之間之聯結可為：
其中星號指示至藥物-連接體其餘部分之附接點，且波形線指示至抗體其餘部分之附接點。在此實施例中，S原子較佳衍生自位點特異性游離半胱胺酸。
關於其他相容性連接體，結合部分可包含可與抗體上之活化殘基反應以提供期望結合物之末端碘乙醯胺。在任一情形下，根據本發明，熟習此項技術者可容易地結合所揭示藥物-連接體化合物中之每一者與相容性抗DLL3抗體(包括位點特異性抗體)。
根據本發明，本發明提供製造相容性抗體藥物結合物之方法，其包含結合抗DLL3抗體與選自由以下組成之群之藥物-連接體化合物：
出於本申請案之目的，DL將作為「藥物-連接體」之縮寫來使用且將包含如上文所述之藥物連接體1-6(即，DL1、DL2、DL3、DL4、DL5及DL6)。應注意，DL1及DL6包含相同彈頭及相同的二肽亞單位，但聯結基團間隔體不同。因此，在連接體裂解後，DL1及DL6二者將釋放PBD1。
應瞭解，可使用業內公認技術使連接體附加之末端馬來醯亞胺 基部分(DL1-DL4及DL6)或碘乙醯胺部分(DL5)結合至所選DLL3抗體上之游離硫氫基。上文所提及化合物之合成途徑闡述於WO2014/130879中，其以引用方式併入本文中，而結合該等PBD之特定方法闡述於下文實例中。
因此，在所選態樣中，本發明係關於DLL3抗體，其結合至所揭示吡咯并苯并二氮呯以提供實質上緊接闡述於下文ADC 1-6中之DLL3免疫結合物。因此，在某些態樣中，本發明係關於選自由以下組成之群之抗體藥物結合物
及
其中Ab包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段。應注意，出於本發明之目的，當ADC1包含hSC16.56抗體(SEQ ID NO：7及8)時，其亦可稱為SC16LD6.5或hSC16.56PBD1(其可包含DL1或DL6)或hSC16.56DL1或瑞伐匹珠單抗泰斯潤(rovalpituzumab tesirine)(Rova- T)。類似地，出於本發明之目的，當ADC6包含hSC16.56ss1抗體(SEQ ID NO：8及9)時，其可指hSC16.56ss1PBD1(其可包含DL1或DL6)或hSC16.56ss1DL6。
C. 結合
應瞭解，可使用多種熟知之不同反應將藥物部分及/或連接體附接至所選抗體。舉例而言，可採用利用半胱胺酸之硫氫基之多種反應來結合期望部分。一些實施例將包含包括一或多個游離半胱胺酸之抗體之結合，如下文詳細論述。在其他實施例中，本發明ADC可經由使藥物結合至存在於所選抗體中之離胺酸殘基之溶劑暴露之胺基來產生。其他實施例包含N末端蘇胺酸及絲胺酸殘基之活化，該等殘基隨後可用於將所揭示承載體附接至抗體。較佳將調整所選結合方法以最佳化附接至抗體之藥物數量並提供相對較高之治療指數。
將治療性化合物結合至半胱胺酸殘基之多種方法為業內已知且將為熟習此項技術者所明瞭。在鹼性條件下，半胱胺酸殘基將去質子化以產生可與諸如馬來醯亞胺及碘乙醯胺等弱親電子劑反應之硫醇鹽親核劑。通常，用於該等結合之試劑可直接與半胱胺酸硫醇反應以形成經結合蛋白質或與連接體-藥物反應以形成連接體-藥物中間體。在連接體之情形下，熟習此項技術者已知採用有機化學反應、條件及試劑之若干途徑，包括：(1)使本發明蛋白質之半胱胺酸基團與連接體試劑反應，以經由共價鍵形成蛋白質-連接體中間體，然後與活化化合物反應；及(2)使化合物之親核基團與連接體試劑反應，以經由共價鍵形成藥物-連接體中間體，然後與本發明蛋白質之半胱胺酸基團反應。如熟習此項技術者根據前述內容將明瞭，雙功能(或二價)連接體可用於本發明中。舉例而言，雙功能連接體可包含硫醇修飾基團(用於共價連接至半胱胺酸殘基)及至少一個附接部分(例如，第二硫醇修飾部分)(用於共價或非共價連接至化合物)。
在結合之前，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使抗體具有反應性用於與連接體試劑結合。在其他實施例中，可經由離胺酸與試劑(包括(但不限於)2-亞胺基四氫噻吩(喬特試劑(Traut’s reagent))、SATA、SATP或SAT(PEG)4)之反應使胺轉化成硫醇將其他親核基團引入抗體中。
關於該等結合，半胱胺酸硫醇或離胺酸胺基係親核的且能夠與連接體試劑或化合物-連接體中間體或藥物上之親電子基團反應形成共價鍵，該等親電子基團包括：(i)活性酯，例如NHS酯、HOBt酯、鹵代甲酸酯及醯鹵；(ii)烷基及苄基鹵化物，例如鹵代乙醯胺；(iii)醛基、酮基、羧基及馬來醯亞胺基團；及(iv)二硫化物，包括吡啶基二硫化物，經由硫化物交換。化合物或連接體上之親核基團包括(但不限於)能夠與連接體部分及連接體試劑上之親電子基團反應形成共價鍵之胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、縮胺基硫脲、肼甲酸酯及芳基醯肼基團。
結合試劑通常包括馬來醯亞胺、鹵代乙醯基、碘乙醯胺琥珀醯亞胺基酯、異硫氰酸酯、磺醯氯、2,6-二氯三嗪基、五氟苯基酯及亞磷醯胺，但亦可使用其他官能基。在某些實施例中，方法包括例如使用馬來醯亞胺、碘乙醯亞胺或鹵代乙醯基/烷基鹵化物、氮丙啶、丙烯醯基衍生物與半胱胺酸之硫醇反應以產生與化合物反應之硫醚。游離硫醇與活化吡啶基二硫化物之二硫化物交換亦可用於產生結合物(例如，使用5-硫基-2-硝基苯甲(TNB)酸)。較佳地，使用馬來醯亞胺。
如上文所指示，亦可使用離胺酸作為反應性殘基來實現結合，如本文所述。親核離胺酸殘基通常經由胺反應性琥珀醯亞胺基酯來靶向。為獲得最佳去質子化離胺酸殘基數，水溶液之pH必須低於離胺酸銨基之pKa(為約10.5)，因此反應之典型pH為約8及9。常用於偶合 反應之試劑係NHS-酯，其經由離胺酸醯化機制與親核離胺酸反應。經歷類似反應之其他相容性試劑包含異氰酸酯及異硫氰酸酯，其亦可結合本文之教示使用來提供ADC。在離胺酸活化後，可立即使用上文所提及連接基團中之許多將彈頭共價結合至抗體。
將化合物結合至蘇胺酸或絲胺酸殘基(較佳N末端殘基)之方法亦為業內已知。舉例而言，已闡述以下方法：其中自絲胺酸或蘇胺酸之1,2-胺基醇衍生出羰基前體，其可藉由過碘酸鹽氧化選擇性且快速轉化成醛形式。該醛與欲附接至本發明蛋白質之化合物中之半胱胺酸之1,2-胺基硫醇反應形成穩定的噻唑啶產物。此方法尤其可用於標記N末端絲胺酸或蘇胺酸殘基處之蛋白質。
在一些實施例中，可藉由引入1個、2個、3個、4個或更多個游離半胱胺酸殘基將反應性硫醇基引入所選抗體(或其片段)中(例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之抗體)。該等位點特異性抗體或經改造抗體允許結合物製劑展現增強的穩定性及實質均質性，此至少部分歸因於提供經改造之游離半胱胺酸位點及/或本文所述之新穎結合程序。與完全或部分還原鏈內或鏈間抗體二硫鍵中之每一者來提供結合位點(且完全與本發明相容)之習用結合方法不同，本發明另外提供某些所製備游離半胱胺酸位點之選擇性還原及將藥物-連接體導向該等位點。
就此而言，應瞭解，經改造位點及選擇性還原所促進之結合特異性允許在期望位置處高百分比之位點定向結合。顯著地，該等結合位點(例如存在於輕鏈恆定區之末端區域中之彼等)中之一些通常難以有效地結合，此乃因其往往與其他游離半胱胺酸交叉反應。然而，經由所得游離半胱胺酸之分子改造及選擇性還原，可獲得有效的結合率，此顯著減少不期望之高DAR污染物及非特異性毒性。更通常而言，經改造之構築體及包含選擇性還原之所揭示新穎結合方法提供具 有經改良之藥物動力學及/或藥效學及潛在地經改良之治療指數的ADC製劑。
在某些實施例中，位點特異性構築體呈現游離半胱胺酸，其當還原時包含親核且能夠與連接體部分上之親電子基團(例如上文所揭示之彼等)反應形成共價鍵之硫醇基團。如上文所論述，本發明抗體可具有可還原之未配對鏈間或鏈內半胱胺酸或經引入之非天然半胱胺酸，即提供該等親核基團之半胱胺酸。因此，在某些實施例中，還原游離半胱胺酸之游離硫氫基與所揭示藥物-連接體之末端馬來醯亞胺基或鹵代乙醯胺基團的反應將提供期望結合。在該等情形下，可藉由用還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT)或(參(2-羧基乙基)膦(TCEP))處理使抗體之游離半胱胺酸具有反應性用於與連接體試劑結合。因此，理論上，每一游離半胱胺酸將呈現反應性硫醇親核劑。儘管該等試劑係相容的，但應瞭解，可使用熟習此項技術者通常已知之多種反應、條件及試劑來實現位點特異性抗體之結合。
另外已發現，可選擇性還原經改造抗體之游離半胱胺酸以提供增強的位點定向結合且減少不期望潛在毒性污染物。更特定而言，已發現諸如精胺酸等「穩定劑」調節蛋白質中之分子內及分子間相互作用，且可與所選還原劑(較佳相對溫和)結合使用來選擇性還原游離半胱胺酸並促進位點特異性結合，如本文所述。如本文所用之術語「選擇性還原(selective reduction)」或「選擇性還原(selectively reducing)」可互換使用且應意指還原游離半胱胺酸且不實質上破壞存在於經改造抗體中之原初二硫鍵。在所選實施例中，此還原可僅藉由某些還原劑來實現。在其他實施例中，經改造構築體之選擇性還原將包含使用穩定劑與還原劑(包括溫和還原劑)之組合。應瞭解，術語「選擇性結合」應意指已經選擇性還原之經改造抗體與如本文所述之細胞毒素之結合。就此而言，使用該等穩定劑與所選還原劑之組合可 顯著改良位點特異性結合之效率，如藉由抗體重鏈及/或輕鏈上之所選位點處之結合度及製劑之DAR分佈所確定。相容性抗體構築體以及選擇性結合技術及試劑廣泛揭示於WO2015/031698中，其關於該等方法及構築體之內容係全文以引用方式併入本文中。
儘管不希望受限於任何具體理論，但該等穩定劑可用於調節靜電微環境及/或調節期望結合位點處之構象變化，由此允許相對溫和之還原劑(其實質上不還原完整原初二硫鍵)來促進期望游離半胱胺酸位點處之結合。已知該等藥劑(例如，某些胺基酸)形成鹽橋(經由氫鍵結及靜電相互作用)，且可以一定方式調節蛋白質-蛋白質相互作用以賦予可引起有利的構象變化及/或減少不利的蛋白質-蛋白質相互作用之穩定效應。此外，該等藥劑可用於抑制還原後不期望之分子內(及分子間)半胱胺酸-半胱胺酸鍵之形成，由此有助於其中經改造位點特異性半胱胺酸結合至藥物(較佳經由連接體)之期望結合反應。由於選擇性還原條件無法提供完整原初二硫鍵之顯著還原，故通常將後續結合反應驅動至游離半胱胺酸上相對較少之反應性硫醇(例如，較佳2個游離硫醇/抗體)。如先前所提及，該等技術可用於顯著減少根據本發明製造之結合物製劑中之非特異性結合量及相應雜質。因此，該等位點特異性ADC組合物可展現減小的毒性。
在所選實施例中，與本發明相容之穩定劑通常將包含具有至少一個具有鹼性pKa之部分之化合物。在某些實施例中，該部分將包含一級胺，而在其他實施例中，胺部分將包含二級胺。在其他實施例中，胺部分將包含三級胺或胍基。在其他所選實施例中，胺部分將包含胺基酸，而在其他相容性實施例中，胺部分將包含胺基酸側鏈。在其他實施例中，胺部分將包含蛋白胺基酸。在其他實施例中，胺部分包含非蛋白胺基酸。在一些實施例中，相容性穩定劑可包含精胺酸、離胺酸、脯胺酸及半胱胺酸。另外，相容性穩定劑可包括具有鹼性 pKa之胍及含氮雜環。
在某些實施例中，相容性穩定劑包含具有至少一個pKa大於約7.5之胺部分的化合物，在其他實施例中，標的胺部分將具有大於約8.0之pKa，在其他實施例中，胺部分將具有大於約8.5之pKa，且在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約9.0之胺部分。其他實施例將包含其中胺部分將具有大於約9.5之pKa之穩定劑，而某些其他實施例將包含展現至少一個pKa大於約10.0之胺部分之穩定劑。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約10.5之胺部分之化合物，在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約11.0之胺部分之化合物，而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約11.5之胺部分。在其他實施例中，穩定劑將包含具有pKa大於約12.0之胺部分之化合物，而在其他實施例中，穩定劑將包含pKa大於約12.5之胺部分。熟習此項技術者應理解，相關pKa可容易地使用標準技術來計算或測定且用於確定使用所選化合物作為穩定劑之適用性。
顯示所揭示穩定劑在與某些還原劑組合時可尤其有效地靶向與游離位點特異性半胱胺酸之結合。出於本發明之目的，相容性還原劑可包括產生還原游離位點特異性半胱胺酸用於結合而不顯著破壞經改造抗體之原初二硫鍵之任何化合物。在較佳由所選穩定劑及還原劑之組合所提供之該等條件下，活化藥物連接體極大地限於與期望游離位點特異性半胱胺酸位點之結合。相對溫和之還原劑或在相對較低之濃度下使用以提供溫和條件之還原劑尤佳。如本文所用之術語「溫和還原劑」或「溫和還原條件」應意指由在游離半胱胺酸位點處提供硫醇且不實質上破壞存在於經改造抗體中之原初二硫鍵之還原劑(視情況在穩定劑存在下)帶來的任何藥劑或狀態。亦即，溫和還原劑或條件(較佳與穩定劑組合)能夠有效地減少游離半胱胺酸(提供硫醇)且不顯著破壞蛋白質之原初二硫鍵。期望還原條件可由建立適用於選擇性結 合之環境之多種基於硫氫基之化合物來提供。在實施例中，溫和還原劑可包含具有一或多個游離硫醇之化合物，而在一些實施例中，溫和還原劑將包含具有單一游離硫醇之化合物。與本發明之選擇性還原技術相容之還原劑的非限制性實例包含麩胱甘肽、n-乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、2-胺基乙烷-1-硫醇及2-羥基乙烷-1-硫醇。
應瞭解，上文所述之選擇性還原過程可尤其有效地靶向與游離半胱胺酸之結合。就此而言，與位點特異性抗體中期望靶位點之結合度(在此處定義為「結合效率」)可藉由多種業內公認技術來測定。藥物與抗體之位點特異性結合之效率可藉由評價靶結合位點(例如每一輕鏈之c末端上之游離半胱胺酸)上相對於所有其他結合位點之結合百分比來確定。在某些實施例中，本文方法提供藥物與包含游離半胱胺酸之抗體之有效結合。在一些實施例中，結合效率為至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或更大，如藉由相對於所有其他結合位點之靶結合百分比所量測。
應進一步瞭解，能夠結合之經改造抗體可含有當產生或儲存抗體時被封阻或封端之包含硫氫基之游離半胱胺酸殘基。該等帽包括與硫氫基相互作用且防止或抑制結合物形成之小分子、蛋白質、肽、離子及其他材料。在一些情形下，未結合之經改造抗體可包含結合相同或不同抗體上之其他游離半胱胺酸之游離半胱胺酸。如本文所論述，該交叉反應性可在製造程序期間產生多種污染物。在一些實施例中，經改造抗體可需要在結合反應之前脫帽。在特定實施例中，本文抗體經脫帽且展示能夠結合之游離硫氫基。在其他特定實施例中，使本文抗體經受不擾亂或重排天然二硫鍵之脫帽反應。應瞭解，在大多數情形下，脫帽反應將發生在正常還原反應(還原或選擇性還原)期間。
D. DAR分佈及純化
在所選實施例中，與本發明相容之結合及純化方法有利地提供產生包含狹窄DAR分佈之相對均質之ADC製劑的能力。就此而言，根據藥物與經改造抗體之間之化學計量比及毒素位置，所揭示構築體(例如，位點特異性構築體)及/或選擇性結合提供樣本內ADC種類之均質性。如上文簡單論述，術語「藥物對抗體比率」或「DAR」係指藥物對抗體之莫耳比。在某些實施例中，結合物製劑之DAR分佈實質上可為均質，此意味著在ADC製劑內，關於負載位點(即，在游離半胱胺酸上)之具有具體DAR(例如，2或4之DAR)之位點特異性ADC之主要種類亦均一。在本發明之某些其他實施例中，可經由使用位點特異性抗體及/或選擇性還原及結合來達成期望均質性。在其他實施例中，期望均質性可經由使用位點特異性構築體與選擇性還原之組合來達成。在其他實施例中，可使用分析型或製備型層析技術進一步純化相容性製劑以提供期望均質性。在該等實施例中之每一者中，ADC樣本之均質性可使用多種業內已知之技術來分析，該等技術包括(但不限於)質譜、HPLC(例如粒徑篩析HPLC、RP-HPLC、HIC-HPLC等)或毛細管電泳。
關於ADC製劑之純化應瞭解，可採用標準醫藥製備方法來獲得期望純度。如本文所論述，液相層析方法(例如反相(RP)及疏水相互作用層析(HIC))可根據載藥值分離混合物中之化合物。在一些情形下，亦可使用離子交換(IEC)或混合模式層析(MMC)來分離具有特定載藥量之種類。
所揭示ADC及其製劑可包含各個化學計量莫耳比之藥物及抗體部分，此端視抗體之構形且至少部分地端視用於實現結合之方法而定。在某些實施例中，每個ADC之載藥量可包含1-20個彈頭(即，n係1-20)。其他所選實施例可包含載藥量為1至15個彈頭之ADC。在其他 實施例中，ADC可包含1-12個彈頭或更佳1-10個彈頭。在一些實施例中，ADC將包含1至8個彈頭。
儘管理論載藥量可能相對較高，但諸如游離半胱胺酸交叉反應性及彈頭疏水性等實際限制往往因聚集物及其他污染物所致而限制包含該DAR之均質製劑之產生。亦即，較高載藥量(例如>6或8)可引起某些抗體-藥物結合物之聚集、不溶性、毒性或細胞滲透性損失，此端視承載體而定。考慮到該等問題，本發明所提供之實際載藥量較佳介於1至8種藥物/結合物範圍內，即其中1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種或8種藥物共價附接至每一抗體(例如，對於IgG1，其他抗體可具有不同的負載能力，此端視二硫鍵之數量而定)。較佳地，本發明組合物之DAR將為約2、4或6，且在一些實施例中，DAR將包含約2。
儘管本發明提供相對較高程度之均質性，但所揭示組合物實際上包含含有一系列藥物化合物(例如，在IgG1情形下可能為1至8)之結合物之混合物。因此，所揭示之ADC組合物包括以下結合物之混合物：其中大部分組成抗體共價連接至一或多個藥物部分，及(儘管經改造構築體及選擇性還原提供相關結合物特異性)其中藥物部分可藉由多個硫醇基團附接至抗體。亦即，在結合後，本發明之ADC組合物將包含在不同濃度下具有不同載藥量(例如，1至8種藥物/IgG1抗體)之結合物(以及主要由游離半胱胺酸交叉反應性引起之某些反應污染物)之混合物。然而，使用選擇性還原及製造後純化，可將結合物組合物驅動至以下點：其中其主要含有單一主要期望ADC種類(例如，載藥量為2)及相對較低量之其他ADC種類(例如，載藥量為1、4、6等)。平均DAR值代表組合物整體(即，所有ADC種類一起)之載藥量之加權平均值。由於所用量化方法之不精確性及難以完全移除商業環境中之非主要ADC種類，故可接受之DAR值或規格通常呈現為平均值、範圍或 分佈(即，2 +/- 0.5之平均DAR)。較佳地，將在醫藥環境中使用包含經量測在該範圍(即，1.5至2.5)內之平均DAR之組合物。
因此，在一些實施例中，本發明將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.5之組合物。在其他實施例中，本發明將包含2、4、6或8 +/- 0.5之平均DAR。最後，在所選實施例中，本發明將包含2 +/- 0.5或4 +/- 0.5之平均DAR。應瞭解，在一些實施例中，該範圍或偏差可小於0.4。因此，在其他實施例中，組合物將包含1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.3之平均DAR，2、4、6或8 +/- 0.3之平均DAR，甚至更佳2或4 +/- 0.3之平均DAR，或甚至2 +/- 0.3之平均DAR。在其他實施例中，IgG1結合物組合物較佳將包含平均DAR為1、2、3、4、5、6、7或8各自+/- 0.4之組合物及相對較低量(即，小於30%)之非主要ADC種類。在其他實施例中，ADC組合物將包含2、4、6或8各自+/- 0.4之平均DAR及相對較低量(<30%)之非主要ADC種類。在一些實施例中，ADC組合物將包含2 +/- 0.4之平均DAR及相對較低量(<30%)之非主要ADC種類。在其他實施例中，當相對於其他DAR種類量測時，主要ADC種類(例如，DAR為2或DAR為4)將以下列濃度存在：大於65%之濃度、大於70%之濃度、大於75%之濃度、大於80%之濃度、大於85%之濃度、大於90%之濃度、大於93%之濃度、大於95%之濃度或甚至大於97%之濃度。
熟習此項技術者應瞭解，來自結合反應之ADC製劑中藥物/抗體之分佈可藉由諸如以下等習用方法來表徵：UV-Vis分光光度法、反相HPLC、HIC、質譜術、ELISA及電泳。舉例而言，根據藥物/抗體之ADC之定量分佈亦可使用HIC及RP層析之組合來測定。類似地，具體ADC製劑中藥物/抗體之平均值可使用ELISA來測定，但因抗體-抗原結合及檢測限制所致而無法容易地辨別出藥物/抗體值之分佈。而且，ELISA分析無法提供關於藥物部分附接在抗體上之何處之資訊。 然而，如上文所提及，該數據可容易地使用業內所熟知之多種層析及電泳技術來獲得。
VI. 診斷及篩選 A. 診斷
本發明提供用於檢測、診斷或監測增生性病症之活體外及活體內方法以及篩選來自患者之細胞以鑑別腫瘤細胞(包括致瘤細胞)之方法。該等方法包括鑑別患有癌症之個體用於治療或監測癌症之惡化，其包含使患者或自患者獲得之樣本與能夠特異性識別並締合DLL3決定子之檢測劑(例如，抗體或核酸探針)接觸(活體內或活體外)，及檢測樣本中檢測劑之存在或不存在或締合量。在所選實施例中，檢測劑將包含與如本文所述之可檢測標記或報導基因分子締合之抗體。在某些其他實施例中，將投與DLL3抗體且使用二級經標記抗體(例如，抗鼠類抗體)來檢測。在其他實施例(例如，原位雜交或ISH)中，將與基因組DLL3決定子反應之核酸探針用於檢測、診斷或監測增生性病症。
更通常而言，DLL3決定子之存在及/或含量可使用熟習此項技術者可獲得之多種技術中之任一者來量測用於蛋白質或核酸分析，該等技術係例如直接物理量測(例如質譜)、結合分析(例如免疫分析、凝集分析及免疫層析分析)、聚合酶鏈反應(PCR、RT-PCR；RT-qPCR)技術、分枝寡核苷酸技術、北方墨點(Northern blot)技術、寡核苷酸雜交技術及原位雜交技術。該方法亦可包含量測自化學反應產生之信號，例如吸光度之變化、螢光之變化、化學發光或電化學發光之生成、反射率、折射率或光散射之變化、可檢測標記自表面之累積或釋放、氧化或還原或氧化還原物質、電流或電位、磁場之變化等。適宜檢測技術可經由標記之光致發光(例如，經由量測螢光、時間解析螢光、衰減波螢光、上轉化磷光體、多光子螢光等)、化學發光、電化 學發光、光散射、吸光度、放射性、磁場、酶活性(例如，經由引起吸光度或螢光之變化或引起化學發光發射之酶反應來量測酶活性)量測該等標記以量測經標記結合試劑之參與來檢測結合事件。或者，可使用無需使用標記之檢測技術，例如基於量測質量(例如表面聲波量測)、折射率(例如表面電漿共振量測)或分析物之固有發光之技術。
在一些實施例中，檢測劑與樣本中之具體細胞或細胞組份之締合指示該樣本可含有致瘤細胞，由此表示可使用如本文所述之抗體或ADC有效地治療患有癌症之個體。
在某些較佳實施例中，分析可包含免疫組織化學(IHC)分析或其變化形式(例如，螢光ABC、發色ABC、標準ABC、標準LSAB等)、免疫細胞化學或其變化形式(例如，直接免疫細胞化學、間接免疫細胞化學、螢光免疫細胞化學、發色免疫細胞化學等)或原位雜交(ISH)或其變化形式(例如，發色原位雜交(CISH)或螢光原位雜交(DNA-FISH或RNA-FISH))。
就此而言，本發明之某些態樣包含使用經標記之DLL3抗體用於免疫組織化學(IHC)。在其他實施例中，DLL3抗體將使用二級經標記抗體來檢測。更具體而言，可使用DLL3 IHC作為診斷工具來幫助診斷多種增生性病症及監測對治療(包括DLL3抗體療法)之潛在反應。如本文所論述及下文實例中所顯示，可對已經化學固定(相容性技術包括(但不限於)：甲醛、戊二醛、四氧化鋨、重鉻酸鉀、乙酸、醇、鋅鹽、氯化汞、四氧化鉻及苦味酸)及包埋(相容性方法包括(但不限於)：乙二醇甲基丙烯酸酯、石蠟及樹脂)或經由冷凍保藏之組織實施相容性診斷分析。該等分析可用於指導治療決策及確定投藥方案及時間。
如下文實例中所顯示，可使用免疫組織化學技術來衍生如業內已知之H-評分。該等H-評分可用於指示哪些患者可適於用本發明組合 物治療。基於下文實例，在所選實施例中，可使用300點量表上約90、約100、約110、約120、約130、約140、約150、約160、約170、約180、約190或約200或以上之H-評分來指示哪些患者可有利地對本發明治療方法有反應。因此，在一個實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有300點量表上至少90(即，腫瘤為DLL3+)之H-評分。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少120之H-評分。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少180之H-評分。出於本發明之目的，在300點量表上展現90或以上之H-評分之任何腫瘤將視為DLL3+腫瘤且經受所揭示抗體或ADC之治療。
在其他實施例中，患者選擇可基於腫瘤樣本中之陽性染色DLL3細胞%之更簡單量測來進行。就此而言，當使用抗DLL3抗體探查時，展現IHC樣本中一定百分比之陽性染色細胞之患者將視為DLL3+且將經選擇以根據本文之教示來治療。在該等實施例中，展現大於10%、大於20%、大於30%、大於40%或大於50%陽性細胞染色之腫瘤樣本可分類為DLL3+。在其他實施例中，展現大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或大於95%陽性細胞染色之腫瘤樣本可分類為DLL3+。在某些較佳態樣中，DLL3+腫瘤將在50%之組成細胞中表現DLL3。在前述實施例中之每一者中，患有DLL3+陽性腫瘤之患者可使用如本文所述之所揭示組合物來治療。
本發明之其他尤其相容態樣涉及使用原位雜交來檢測或監測DLL3決定子。原位雜交技術或ISH為熟習此項技術者所熟知。簡言之，將細胞固定且將含有特定核苷酸序列之可檢測探針添加至經固定細胞中。若細胞含有互補核苷酸序列，則可檢測之探針將與其雜交。使用本文所述之序列資訊，探針可經設計以鑑別表現基因型DLL3決定子之細胞。探針較佳與對應於該等決定子之核苷酸序列雜交。雜交 條件可以常規方式最佳化以藉由不完全互補雜交最小化背景信號，但較佳地探針較佳與所選DLL3決定子完全互補。在所選實施例中，探針經附接至可容易地藉由標準螢光方法檢測之探針之螢光染料標記。
相容性活體內治療診斷劑或診斷分析可包含業內公認成像或監測技術，例如磁共振成像、電腦化斷層攝影術(例如CAT掃描)、正電子斷層攝影術(例如PET掃描)、放射線攝影術、超音波等，如將為熟習此項技術者已知。
在某些實施例中，本發明抗體可用於檢測及量化患者樣本(例如血漿或血液)中具體決定子(例如DLL3蛋白)之量，其進而可用於檢測、診斷或監測與相關決定子相關之增生性病症。在相關實施例中，本發明抗體可用於在活體內或活體外檢測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。
在本發明之某些實施例中，可在療法或方案之前使用所揭示之抗體評價或表徵個體或個體樣本中之致瘤細胞來建立基線。在其他實例中，可評價源自所治療個體之樣本之致瘤細胞。
在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症惡化及/或發病機制之方法。在另一實施例中，活體內癌症惡化及/或發病機制之分析包含測定腫瘤惡化之程度。在另一實施例中，分析包含鑑別腫瘤。在另一實施例中，對原發性腫瘤實施腫瘤惡化之分析。在另一實施例中，隨時間實施分析，此端視癌症之類型而定，如熟習此項技術者已知。在另一實施例中，在活體內實施源自原發性腫瘤之轉移細胞之繼發性腫瘤之進一步分析。在另一實施例中，分析繼發性腫瘤之大小及形狀。在一些實施例中，實施進一步離體分析。
在另一實施例中，本發明提供分析活體內癌症惡化及/或發病機制之方法，其包括測定細胞轉移或檢測並量化循環腫瘤細胞之量。在 另一實施例中，細胞轉移之分析包含測定自原發性腫瘤不連續之位點處細胞之進行性生長。在一些實施例中，可實施程序以監測經由血管系統、淋巴、在體腔內或其組合分散之腫瘤細胞。在另一實施例中，根據細胞遷移、傳播、外滲、增殖或其組合來實施細胞轉移分析。
在某些實例中，可在療法之前使用所揭示抗體評價或表徵個體或個體樣本中之致瘤細胞來建立基線。在其他實例中，樣本源自所治療之個體。在一些實例中，在個體開始或終止治療後至少約1個月、2個月、4個月、6個月、7個月、8個月、10個月、12個月、14個月、15個月、16個月、18個月、20個月、30個月、60個月、90天、6個月、9個月、12個月或>12個月自個體獲取樣本。在某些實例中，在一定劑量數後(例如，在療法之2個、5個、10個、20個、30個或更多個劑量後)評價或表徵致瘤細胞。在其他實例中，在接受一或多個療法後1週、2週、1個月、2個月、1年、2年、3年、4年或更長表徵或評價致瘤細胞。
B. 篩選
在某些實施例中，可使用本發明抗體來篩選樣本以鑑別藉由與決定子相互作用改變腫瘤細胞之功能或活性之化合物或藥劑(例如，抗體或ADC)。在一個實施例中，使腫瘤細胞與抗體或ADC接觸，且該抗體或ADC可用於篩選表現某一靶(例如DLL3)之腫瘤細胞，以鑑別該等細胞用於多個目的(包括(但不限於)診斷目的)、監測該等細胞以確定治療效能或針對該等靶表現細胞富集細胞群體。
在另一實施例中，方法包括使腫瘤細胞與測試劑或化合物直接或間接接觸，及確定該測試劑或化合物是否調節決定子締合之腫瘤細胞之活性或功能，例如細胞形態或活力之改變、標記物之表現、分化或去分化、細胞呼吸、粒腺體活性、膜完整性、成熟、增殖、活力、細胞凋亡或細胞死亡。直接相互作用之一個實例係物理相互作用，而 間接相互作用包括例如組合物對中間分子之作用，該中間分子進而作用於所引用實體(例如，細胞或細胞培養物)。
篩選方法包括高通量篩選，其可包括視情況位於或置於例如培養皿、管、燒瓶、滾瓶或板上之預定位置之細胞陣列(例如，微陣列)。高通量機器人或人工處置方法可探測化學相互作用並在短時間段中測定許多基因之表現量。業內已研發出例如藉助螢光團或微陣列(Mocellin及Rossi,2007,PMID：17265713)及以極快速之速率處理資訊之自動化分析(例如，參見Pinhasov等人，2004,PMID：15032660)利用分子信號之技術。可篩選之文庫包括例如小分子文庫、噬菌體展示文庫、全人類抗體酵母展示文庫(Adimab)、siRNA文庫及腺病毒轉染載體。
VII. 醫藥製劑及治療用途 A. 調配物及投與途徑
本發明之抗體或ADC可以多種方式使用業內公認技術來調配。在一些實施例中，本發明之治療組合物可單獨或與最少量其他組份一起投與，而其他可視情況經調配以含有適宜的醫藥上可接受之載劑。如本文所用之「醫藥上可接受之載劑」包含賦形劑、媒劑、佐劑及稀釋劑，其為業內所熟知且可購自商業來源用於醫藥製劑中(例如，參見Gennaro(2003)Remington：The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons：Drugfacts Plus，第20版，Mack Publishing；Ansel等人(2004)Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，第7版，Lippencott Williams and Wilkins；Kibbe等人(2000)Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press。)
適宜醫藥上可接受之載劑包含呈相對惰性且可幫助投與抗體或ADC或可幫助將活性化合物處理成經醫藥上最佳化以遞送至作用位點 之製劑的物質。
該等醫藥上可接受之載劑包括可改變調配物之形式、稠度、黏性、pH、張力、穩定性、滲透度、藥物動力學、蛋白質聚集或溶解度之藥劑，且包括緩衝劑、潤濕劑、乳化劑、稀釋劑、囊封劑及皮膚增滲劑。載劑之某些非限制性實例包括鹽水、緩衝鹽水、右旋糖、精胺酸、蔗糖、水、甘油、乙醇、山梨醇、聚葡萄糖、羧甲基纖維素鈉及其組合。用於全身投與之抗體可經調配用於腸內、非經腸或局部投與。在某些實施例中，所揭示組合物將經調配用於靜脈內投與且較佳將使用IV容器(例如IV滴袋)來輸注。實際上，可同時使用所有三種類型之調配物來達成活性成份之全身投與。用於非經腸及非注射用藥物遞送之賦形劑以及調配物闡述於Remington：The Science and Practice of Pharmacy(2000)第20版Mack Publishing中。
適於腸內投與之調配物包括硬或軟明膠膠囊、丸劑、錠劑(包括包衣錠劑)、酏劑、懸浮液、糖漿或其吸入及控制釋放形式。
適於非經腸投與(例如，藉由注射或輸注)之調配物包括水性或非水性、等滲、無熱原、無菌液體(例如，溶液、懸浮液)，其中活性成份係溶解、懸浮或以其他方式提供(例如，於脂質體或其他微粒中)。該等液體可另外含有使調配物與預期接受者之血液(或其他相關體液)等滲之其他醫藥上可接受之載劑，例如抗氧化劑、緩衝劑、防腐劑、穩定劑、抑菌劑、懸浮劑、增稠劑及溶質。賦形劑之實例包括(例如)水、醇、多元醇、甘油、植物油及諸如此類。適用於該等調配物中之醫藥上可接受之等滲載劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏溶液(Ringer's Solution)或乳酸化林格氏注射液。
在尤佳實施例中，可凍乾本發明之經調配組合物以提供抗體或ADC之粉末形式，其隨後可在投與之前經重構。用於製備可注射溶液之無菌粉末可藉由以下方式來生成：凍乾包含所揭示抗體或ADC之溶 液，以產生包含活性成份以及任何可選共溶生物相容性成份之粉末。通常，分散液或溶液係藉由將活性化合物納入含有基礎分散介質或溶劑(例如，稀釋劑)及視情況其他生物相容性成份之無菌媒劑中來製備。相容性稀釋劑係在醫藥上可接受(對於投與人類安全且無毒)且可用於製備液體調配物(例如在凍乾後重構之調配物)者。實例性稀釋劑包括無菌水、抑菌性注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。在替代實施例中，稀釋劑可包括鹽水溶液及/或緩衝液。
在某些較佳實施例中，抗DLL3抗體或ADC將與醫藥上可接受之糖組合凍乾。「醫藥上可接受之糖」係在與所關注蛋白質組合時顯著防止或降低該蛋白質在儲存後之化學及/或物理不穩定性之分子。該等糖在意欲將調配物凍乾且然後重構時尤其相容。如本文所用之醫藥上可接受之糖亦可稱為「凍乾保護劑(lyoprotectant)」。實例性糖及其相應糖醇包括：胺基酸，例如麩胺酸單鈉或組胺酸；甲胺，例如甜菜鹼；易溶鹽，例如硫酸鎂；多元醇，例如三元或更高分子量糖醇，例如甘油、聚葡萄糖、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；PLURONICS®；及其組合。其他實例性凍乾保護劑包括甘油及明膠，以及蜜二糖、蜜三糖、棉子糖、甘露三糖及水蘇糖。還原糖之實例包括葡萄糖、麥芽糖、乳糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖及乳酮糖。非還原糖之實例包括選自糖醇及其他直鏈多元醇之多羥基化合物之非還原醣苷。較佳糖醇系單醣苷，尤其彼等藉由還原諸如乳糖、麥芽糖、乳酮糖及麥芽酮糖等二糖獲得之化合物。醣苷側基可為葡萄糖苷或半乳糖苷。糖醇之其他實例係葡萄糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇及異麥芽酮糖。較佳醫藥上可接受之糖係非還原糖海藻糖或蔗糖。醫藥上可接受之糖係以「保護量」(例如預凍乾)添加至調配物中，此意味著該蛋白質在儲存期間(例如，在重構及儲 存後)基本上保持其物理及化學穩定性及完整性。
熟習此項技術者應瞭解，相容性凍乾保護劑可以介於以下範圍內之濃度添加至液體或凍乾調配物中：約1mM至約1000mM、約25mM至約750mM、約50mM至約500mM、約100mM至約300mM、約125mM至約250mM、約150mM至約200mM或約165mM至約185mM。在某些實施例中，可添加凍乾保護劑以提供下列濃度：約10mM、約25mM、約50mM、約75mM、約100mM、約125mM、約130mM、約140mM、約150mM、約160mM、約165mM、約170mM、約175mM、約180mM、約185mM、約190mM、約200mM、約225mM、約250mM、約300mM、約400mM、約500mM、約600mM、約700mM、約800mM、約900mM或約1000mM。在某些較佳實施例中，凍乾保護劑可包含醫藥上可接受之糖。在尤佳態樣中，醫藥上可接受之糖將包含海藻糖或蔗糖。
在其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包含某些化合物，包括胺基酸或其醫藥上可接受之鹽，以用作穩定劑或緩衝劑。該等化合物可以介於以下範圍內之濃度來添加：約1mM至約100mM、約5mM至約75mM、約5mM至約50mM、約10mM至約30mM或約15mM至約25mM。在某些實施例中，可添加緩衝劑以提供下列濃度：約1mM、約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM。在其他所選實施例中，可添加緩衝劑以提供下列濃度：約5mM、約10mM、約15mM、約20mM、約25mM、約30mM、約35mM、約40mM、約50mM、約60mM、約70mM、約80mM、約90mM或約100mM。在某些較佳實施例中，緩衝劑將包含組胺酸鹽酸鹽(例如，L-組胺酸HCL)。
在其他所選實施例中，本發明之液體及凍乾調配物可包含非離 子型表面活性劑，例如作為穩定劑之聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60或聚山梨醇酯80。該等化合物可以介於以下範圍內之濃度來添加：約0.1mg/ml至約2.0mg/ml、約0.1mg/ml至約1.0mg/ml、約0.2mg/ml至約0.8mg/ml、約0.2mg/ml至約0.6mg/ml或約0.3mg/ml至約0.5mg/ml。在某些實施例中，可添加表面活性劑以提供下列濃度：約0.1mg/ml、約0.2mg/ml、約0.3mg/ml、約0.4mg/ml、約0.5mg/ml、約0.6mg/ml、約0.7mg/ml、約0.8mg/ml、約0.9mg/ml或約1.0mg/ml。在其他所選實施例中，可添加表面活性劑以提供下列濃度：約1.1mg/ml、約1.2mg/ml、約1.3mg/ml、約1.4mg/ml、約1.5mg/ml、約1.6mg/ml、約1.7mg/ml、約1.8mg/ml、約1.9mg/ml或約2.0mg/ml。在某些較佳實施例中，表面活性劑將包含聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯40。在尤佳態樣中，表面活性劑將包含聚山梨醇酯20。
無論係自凍乾粉末抑或原初溶液重構，用於非經腸投與(例如，靜脈內注射)之所揭示抗體或ADC之相容性調配物可包含約10μg/mL至約100mg/mL之ADC或抗體濃度。在某些所選實施例中，抗體或ADC濃度將包含20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1mg/mL。在其他實施例中，ADC濃度將包含2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL或100mg/mL。
在某些較佳態樣中，本發明組合物將包含包括以下各項之液體調配物：10mg/ml DLL3 ADC(例如，hSC16.56DL1、hSC16.56ss1DL6等)、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL 聚山梨醇酯20，pH 6.0。在一個態樣中，本發明組合物包含10mg/ml hSC16.56DL1(即，Rova-T)、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL聚山梨醇酯20，pH 6.0。在另一態樣中，本發明組合物包含10mg/ml hSC16.56ss1DL6、20mM組胺酸鹽酸鹽、0.175M蔗糖、0.4mg/mL聚山梨醇酯20，pH 6.0。如本文所論述及下文實例中所顯示，該等液體調配物可經凍乾以提供可在使用之前用醫藥相容性(例如，酸性)載劑重構之粉末狀組合物。當在液體溶液中時，該等組合物較佳應儲存在-70℃下且避光。當凍乾時，DLL3 ADC粉末狀調配物較佳應儲存在2℃-8℃下且避光。上文所提及溶液或粉末中之每一者較佳含有於無菌玻璃瓶(例如，I型USP 10ml)中且可經構形以一致地提供設定體積(例如，3mL或5mL)之10mg/mL DLL3 ADC(於原初或重構溶液中)。
無論是否自凍乾粉末重構，液體DLL3 ADC調配物(例如，如上文剛剛闡述)可在投與之前進一步經稀釋(較佳於水性載劑中)。舉例而言，上文所提及之液體調配物可進一步稀釋至含有0.9%氯化鈉注射液之輸注袋、USP或等效物(經適當變通後)中，以達成用於投與之期望劑量值。在某些態樣中，經完全稀釋之DLL3 ADC溶液將使用IV裝置經由靜脈內輸注來投與。較佳地，所投與之DLL3 ADC藥物溶液(無論係藉由靜脈內(IV)輸注抑或注射)係澄清、無色且不含可見粒子。
更通常而言，本發明之化合物及組合物可藉由多種途徑在活體內投與有需要之個體，該等途徑包括(但不限於)經口、靜脈內、動脈內、皮下、非經腸、鼻內、肌內、心內、室內、氣管內、經頰、直腸、腹膜內、真皮內、局部、經皮及鞘內或藉由植入或吸入。可將標的組合物調配成呈固體、半固體、液體或氣態形式之製劑；包括(但不限於)錠劑、膠囊、粉末、顆粒、軟膏劑、溶液、栓劑、灌腸劑、注射液、吸入劑及氣溶膠。可根據預期應用及治療方案來選擇適宜調 配物及投與途徑。
B. 劑量及投藥方案
具體劑量方案(即劑量、時間及重複次數)將端視個別個體以及經驗考慮(例如藥物動力學，例如半衰期、清除率等)而定。熟習此項技術者(例如主治醫師)可基於考慮病況及所治療病況之嚴重程度、所治療個體之年齡及一般健康狀況及諸如此類來確定投與頻率。投與頻率可在療程內基於所選組合物及投藥方案之效能之評價進行調整。該評價可基於特定疾病、病症或病況之標記物或個體健康之評價(如使用生活品質評價、日常生活活動等所量測)來進行。在個體患有癌症之實施例中，該等評價包括經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤樣本之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測根據本文所述方法鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或抗原；增生性或致瘤細胞數量之減少、該等贅瘤性細胞減少之維持；贅瘤性細胞增殖之減少；或轉移發生之延遲。
本發明之DLL3 ADC可以多個範圍來投與。該等範圍包括約5μg/kg體重至約100mg/kg體重/劑量；約50μg/kg體重至約5mg/kg體重/劑量；約100μg/kg體重至約10mg/kg體重/劑量。其他範圍包括約100μg/kg體重至約20mg/kg體重/劑量及約0.5mg/kg體重至約20mg/kg體重/劑量。在某些實施例中，劑量係至少約100μg/kg體重、至少約250μg/kg體重、至少約750μg/kg體重、至少約3mg/kg體重、至少約5mg/kg體重、至少約10mg/kg體重。
在所選實施例中，DLL3抗體或ADC將以下列劑量來投與(較佳靜脈內)：約5μg/kg體重、10μg/kg體重、20μg/kg體重、30μg/kg體重、40μg/kg體重、50μg/kg體重、60μg/kg體重、70μg/kg體重、80μg/kg體重、90μg/kg體重或100μg/kg體重/劑量。其他實施例可包含 以下列劑量投與抗體或ADC：約200μg/kg體重、250μg/kg體重、300μg/kg體重、350μg/kg體重、400μg/kg體重、450μg/kg體重、500μg/kg體重、550μg/kg體重、600μg/kg體重、650μg/kg體重、700μg/kg體重、750μg/kg體重、800μg/kg體重、850μg/kg體重、900μg/kg體重、950μg/kg體重、1000μg/kg體重、1100μg/kg體重、1200μg/kg體重、1300μg/kg體重、1400μg/kg體重、1500μg/kg體重、1600μg/kg體重、1700μg/kg體重、1800μg/kg體重、1900μg/kg體重或2000μg/kg體重/劑量。在其他實施例中，所揭示結合物將以下列劑量來投與：2.5mg/kg、3mg/kg、3.5mg/kg、4mg/kg、4.5mg/kg、5mg/kg、5.5mg/kg、6mg/kg、6.5mg/kg、7mg/kg、7.5mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg。在其他實施例中，結合物可以下列劑量來投與：12mg/kg體重、14mg/kg體重、16mg/kg體重、18mg/kg體重或20mg/kg體重/劑量。在其他實施例中，結合物可以下列劑量來投與：25mg/kg體重、30mg/kg體重、35mg/kg體重、40mg/kg體重、45mg/kg體重、50mg/kg體重、55mg/kg體重、60mg/kg體重、65mg/kg體重、70mg/kg體重、75mg/kg體重、80mg/kg體重、90mg/kg體重或100mg/kg體重/劑量。利用本文之教示，基於臨床前動物研究、臨床觀察以及標準醫學及生物化學技術及量測，熟習此項技術者可容易地確定適用於各種DLL3抗體或ADC之劑量。
可根據U.S.P.N.7,744,877中所揭示之體表面積(BSA)計算來預測其他投藥方案。如業內所熟知，BSA係使用患者之身高及體重來計算且提供如藉由其身體之表面積表示之個體大小之量度。在某些實施例中，結合物可以下列劑量來投與：1mg/m2至800mg/m2、50mg/m2至500mg/m2及100mg/m2、150mg/m2、200mg/m2、250mg/m2、300mg/m2、350mg/m2、400mg/m2或450mg/m2。亦應瞭解，可使用業內公認及經驗技術來確定適宜劑量。
在其他實施例中，抗DLL3抗體或ADC可根據特定時間表來投與。通常，向個體投與一或多次有效劑量之DLL3結合物。更具體而言，每週一次、每2週一次、每3週一次、每月一次或小於每月一次向個體投與有效劑量之抗體或ADC。在某些實施例中，可投與多次有效劑量之DLL3抗體或ADC，包括持續至少1個月、至少6個月、至少1年、至少2年之時段或數年之時段。在其他實施例中，在所揭示抗體或ADC之投與之間可經過數天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、數週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或數月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)或甚至1年或數年。
在一些實施例中，涉及所結合抗體之療程將包含在數週或數月之時段內所選藥品之多個劑量(週期)。更特定而言，本發明之抗體或ADC可以下列頻率來投與：每天一次、每2天一次、每4天一次、每週一次、每10天一次、每2週一次、每3週一次、每4週一次、每5週一次、每6週一次、每8週一次、每10週一次或每12週一次。就此而言，應瞭解，基於患者反應及臨床實踐，可改變劑量或可調整間隔。本發明亦涵蓋不連續投與或將每日劑量分成若干次部分投與。本發明組合物及抗癌劑可交替數天或數週互換投與；或可給出抗體治療之序列，然後進行抗癌劑療法之一或多次治療。在任一情形下，如熟習此項技術者應理解，化學治療劑之適宜劑量通常將大致為臨床療法中已採用之彼等，其中化學治療劑係單獨投與或與其他化學治療劑組合投與。
在某些實施例中，本發明提供抗DLL3抗體藥物結合物用於治療癌症，其中該治療可包含以下列頻率投與有效量之抗DLL3抗體藥物結合物(DLL3 ADC)：至少每週一次(QW)、至少每2週一次(Q2W)、至少每3週一次(Q3W)、至少每4週一次(Q4W)、至少每5週一次(Q5W)、至少每6週一次(Q6W)、至少每7週一次(Q7W)、至少每8週一次 (Q8W)、至少每9週一次(Q9W)或至少每10週一次(Q10W)。在所選實施例中，DLL3 ADC將以下列頻率來投與：至少每3週(Q3W)、至少每4週一次(Q4W)、至少每5週一次(Q5W)或至少每6週一次(Q6W)。在某些其他實施例中，DLL3 ADC將以下列頻率來投與：至少每7週(Q7W)、至少每8週一次(Q8W)、至少每9週一次(Q9W)或至少每10週一次(Q10W)。在其他所選實施例中，DLL3 ADC將以下列劑量來投與：約0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg或0.8mg/kg。某些實施例將包含藉由單次投與DLL3 ADC來治療患者。其他實施例將包含以指定間隔(即Q2W、Q3W、Q4W、Q5W、Q6W等)持續下列週期來治療患者：兩個週期(×2)、三個週期(×3)、四個週期(×4)、五個週期(×5)、六個週期(×6)、七個週期(×7)、八個週期(×8)、九個週期(×9)或十個週期(×10)。本發明之其他態樣將包含投與DLL3 ADC無限個週期，此端視患者之反應及任何毒性而定。在其他實施例中，可完成初始DLL3 ADC治療(x個週期)且不再進行DLL3 ADC治療直至癌症顯示惡化跡象(有惡化時治療)。在其他實施例中，可完成初始DLL3 ADC治療(x個週期)，且然後使患者進行維持療法(例如，0.1mg/kg DLL3 ADC Q6W，無限期地)。
與本發明相容之實例性投藥方案闡釋於下表3中。應注意，如下文更詳細論述，所揭示實例性投藥方案與作為單一藥劑或與其他治療劑或癌症治療(例如，手術或束輻射)組合使用DLL3 ADC相容。
在本發明之一些態樣中，DLL3 ADC將包含PBD。在其他態樣中，DLL3將包含SC16LD6.5(例如，hSC16.56DL1或ADC1)。在其他態樣中，DLL3 ADC將包含位點特異性ADC，且在某些較佳態樣中將包含hSC16.56ss1PBD1(例如，hSC16.56ss1DL6或ADC6)。在其他態樣中，DLL3 ADC將以靜脈內投與。在某些其他態樣中，欲治療之癌症將包含神經內分泌腫瘤。在其他態樣中，欲治療之癌症將包含小細胞肺癌(SCLC)或大細胞神經內分泌癌(LCNEC)。某些實施例將包含使用所揭示之組合物來治療前線患者(即，尚未進行具體癌症治療之患者)。在所選實施例中，前線患者將展現擴散期SCLC或侷限期SCLC。在其他所選態樣中，欲治療之癌症患者將包含第二線患者(即，先前經治療之患者)。在其他實施例中，欲治療之癌症患者將包含第三線患者(即，先前已經治療兩次之患者)。在其他實施例中，癌症患者將包含第四線患者(即，先前已經治療三次之患者)。
本發明之某些較佳實施例將包含使用0.2mg/kg之DLL3 ADC每3週持續3個週期(0.2mg/kg Q3W×3)治療患者。在所選實施例中，欲以0.2mg/kg Q3W×3治療之患者係患有SCLC。在其他實施例中，欲以0.2mg/kg Q3W×3治療之患者係患有LCNEC。在一些態樣中，患者尚未進行癌症治療。在某些態樣中，患者將包含第二線患者。在其他實施例中，患者將包含第三線患者。在其他態樣中，患者將在0.2mg/kg Q3W×3治療週期後有惡化時進行治療。在其他態樣中，患者將在0.2mg/kg Q3W×3治療週期後轉移至DLL3 ADC維持療法。在其他實施例中，DLL3 ADC將包含SC16LD6.5(例如，ADC1)，而在其他實施例中，DLL3 ADC將包含h16.56ss1DL6。
在該等治療中(且如下文更詳細論述)，DLL3 ADC可與所選抗癌 劑組合來改良患者反應。對於某些個體，DLL3 ADC可在投與一或多種抗癌劑之前或之後每3週持續兩個或更多個週期(例如，0.2mg/kg Q3W×2或0.2mg/kg Q3W×3等)來投與。在所選實施例中，個體係患有SCLC且抗癌劑將為順鉑、卡鉑及/或依託泊苷。因此，一個實例性投藥方案可包含0.2mg/kg Q3W×2或0.2mg/kg Q3W×3之DLL3 ADC，然後投用順鉑(例如，80mg/m2)及依託泊苷(例如，100mg/m2)，其中其各自可以例如Q3W×4來投與。因此，在該等情況下，一個方案將包含0.2mg/kg Q3W×2或0.2mg/kg Q3W×3之DLL3 ADC；Q3W×4之CDDP及ETP，其中CDDP/ETP方案可在DLL3 ADC週期結束後1週、2週、3週、4週、5週、6週或更長時間開始。在其他相容性實施例中，CDDP/ETP可在用DLL3 ADC治療之前給予(即，Q3W×4之CDDP/ETP；0.2mg/kg Q3W×2或0.2mg/kg Q3W×3之DLL3 ADC，其中DLL3 ADC方案可在完成CDDP/ETP週期後1週、2週、3週、4週、5週、6週或更長時間開始)。在其他實施例中，可同時給予CDDP/ETP方案及DLL3 ADC方案(實質上如上文所述，但視情況使用0.1mg/kg之DLL3 ADC劑量)(即，其皆在第1週開始)。在某些實施例中，欲根據上文所提及方案治療之個體將為前線患者。在其他較佳實施例中，前線患者係患有SCLC或LCNEC。在其他實施例中，將以60mg/m2投與順鉑，而在其他實施例中，可每3週給予順鉑/依託泊苷組合(鉑D1、依託泊苷D1、2、3，每3週×4或×6)。在其他實施例中，可以與CDDP/E Q21d×4-6個週期相似之頻率投與卡鉑(5 AUC)/依託泊苷。在其他實施例中，DLL3 ADC可在任何化學治療劑(包括卡鉑、順鉑及/或依託泊苷)之前投與患者以用作敏化劑且加強治療組合之效應。
如上文所論述，本發明之所選實施例包含具有經改良之藥物動力學及藥效學性質之ADC，此提供增強的治療指數且允許最佳化投藥方案。就此而言，當如本文所述量測時，所揭示ADC將具有超過6天 之末端半衰期、超過7天之末端半衰期或超過8天之末端半衰期。本發明之其他態樣將包含具有超過9天之末端半衰期、超過10天之末端半衰期、超過11天之末端半衰期、超過12天之末端半衰期的ADC(各自係如在人類個體中所量測)。在其他實施例中，在人類個體中所揭示ADC將具有超過13天之末端半衰期、超過約14天之末端半衰期、超過15天之末端半衰期、超過約16天之末端半衰期、超過約17天之末端半衰期、超過18天之末端半衰期、超過約19天之末端半衰期、超過約20天之末端半衰期或超過3週之末端半衰期。在其他實施例中，本發明ADC將展現約6天之末端半衰期、約7天之末端半衰期、約8天之末端半衰期、約9天之末端半衰期、約10天之末端半衰期、約11天之末端半衰期、約12天之末端半衰期、約13天之末端半衰期、約14天之末端半衰期、約15天之末端半衰期、約16天之末端半衰期、約17天之末端半衰期、約18天之末端半衰期、約19天之末端半衰期、約20天之末端半衰期或約3週之末端半衰期。熟習此項技術者應瞭解，該等延長的半衰期將允許較不頻繁地投用所揭示ADC，由此提供期望效能，同時展現相似或減小的毒性。
因此，本發明之某些其他較佳實施例將包含使用0.3mg/kg之DLL3 ADC每6週治療患者一次，持續2個或更多個週期(例如，0.3mg/kg Q6W×2)。如下文實例中所顯示，該方案特別有效(展現有效的治療指數)之原因在於本發明DLL3 ADC之相對較長之半衰期。在所選實施例中，欲以0.3mg/kg Q6W×2治療之患者係患有SCLC。在其他實施例中，欲以0.3mg/kg Q6W×2治療之患者係患有LCNEC。其他實施例將包括以0.3mg/kg Q6W投與DLL3 ADC，持續三個週期(×3)、持續四個週期(×4)、持續五個週期(×5)、持續六個週期(×6)或更長時間。在該等實施例中，各週期可為連續(每6週)或間歇(跳過每第三個週期，然後重新開始)。在一些態樣中，患者尚未進行癌症治療(前線)。 在某些態樣中，患者將包含第二線患者。在其他實施例中，患者將包含第三線患者。在其他態樣中，患者將在0.3mg/kg Q6W×2治療週期後有惡化時進行治療。在其他態樣中，患者將在0.3mg/kg Q6W×2治療週期後轉移至DLL3 ADC維持療法。在某些實施例中，DLL3 ADC將包含SC16LD6.5(例如，ADC1)，而在其他較佳態樣中，DLL3 ADC將包含hSC16.56ss1DL6(例如，ADC6)。
如下文更詳細論述，DLL3 ADC可與所選抗癌劑組合來改良患者反應。對於某些個體，DLL3 ADC可在投與一或多種抗癌劑之前或之後每6週投與，持續兩個週期(例如，0.3mg/kg Q6W×2)。在所選實施例中，個體係患有SCLC且抗癌劑將為順鉑、卡鉑及/或依託泊苷。因此，一個實例性投藥方案可包含0.3mg/kg Q6W×2之DLL3 ADC，然後投用順鉑(例如，80mg/m2)及依託泊苷(例如，100mg/m2)，其中其各自係以例如Q3W×4來投與。因此，在該等情況下，一個週期將包含0.3mg/kg Q6W×2之DLL3 ADC；Q3W×4之CDDP及ETP，其中CDDP/ETP方案可在DLL3 ADC週期結束後1週、2週、3週、4週、5週、6週或更長時間開始。在其他相容性實施例中，CDDP/ETP可在用DLL3 ADC治療之前給予(即，Q3W×4之CDDP/ETP；0.3mg/kg Q6W×2之DLL3 ADC，其中DLL3 ADC方案可在完成CDDP/ETP週期後1週、2週、3週、4週、5週、6週或更長時間開始)。在其他實施例中，可同時給予CDDP/ETP方案及DLL3 ADC方案(實質上如上文所述，但視情況使用0.1mg/kg之DLL3 ADC劑量)(即，其皆在第1週開始)。在某些實施例中，欲根據上文所提及方案治療之個體將為前線患者。在其他較佳實施例中，前線患者係患有SCLC或LCNEC。在其他實施例中，將以60mg/m2投與順鉑，而在其他實施例中，可每3週給予順鉑/依託泊苷組合(鉑D1、依託泊苷D1、2、3，每3週×4或×6)。在其他實施例中，可以與CDDP/E Q21d×4-6個週期相似之頻率 投與卡鉑(5 AUC)/依託泊苷。在其他實施例中，DLL3 ADC可在任何化學治療劑(包括卡鉑、順鉑及/或依託泊苷)之前投與患者以用作敏化劑且加強治療組合之效應。
在其他實施例中，本發明之DLL3 ADC可以不同劑量在任一週期中投與。舉例而言，該藥物可以相對較高之劑量(例如，0.5mg/kg)投與(即，負載或載藥)，然後在4週後(Q4W)投與較低劑量之DLL3 ADC(例如，0.2mg/kg)作為同一週期之一部分。而且，該等週期可重複(2×、3×等)或延遲直至惡化(有惡化時治療)或隨後進行DLL3 ADC維持(例如，無限0.1mg/kg Q4W或無限0.1mg/kg Q6W)。就此而言，本發明之DLL3抗體或ADC可用於維持療法環境中以減少或消除初始呈現疾病後之腫瘤復發機會。無論第一治療係使用DLL3 ADC抑或另一抗瘤劑或治療(例如，輻射、手術、化學療法等)，皆可使用該維持療法。較佳地，病症已經治療且初始腫瘤團塊已消除、減小或以其他方式改善，因此患者無症狀或處於緩解中。此時，即使使用標準診斷程序存在極少或無疾病指示，仍可向個體投與一或多次醫藥有效量之所揭示ADC。在較佳實施例中，DLL3 ADC將包含PBD，且在所選實施例中將包含SC16LD6.5或SC16.56ss1DL6。
在某些實施例中，維持療法將包含在化學治療性治療(包括標準護理(SOC)化學治療性治療)後投與DLL3 ADC。在所選態樣中，此維持療法將包含最初用SOC化學治療劑(例如順鉑/依託泊苷)治療、然後進行DLL3 ADC維持方案之前線患者。舉例而言，可使用一或多個週期之前線化學療法(例如，四個週期之基於鉑之化學療法)、然後投與一或多個週期之DLL3 ADC來治療患者。在某些實施例中，DLL3 ADC可以0.3mg/kg Q6W省略每第三個週期來投與。應瞭解，該等維持方案可持續至患者有反應且不展現疾病惡化或不良事件。
在另一較佳實施例中，本發明之抗體或ADC可以預防方式或作 為輔助療法用於預防減積程序後之腫瘤轉移或減小其可能性。如本發明中所用之「減積程序」意指減小腫瘤團塊或改善腫瘤負荷或腫瘤增殖之任何程序、技術或方法。實例性減積程序包括(但不限於)手術、輻射治療(即，束輻射)、化學療法、免疫療法或消融。可在由熟習此項技術者根據本發明容易確定之適宜時間下，如臨床、診斷或治療診斷程序所建議投與所揭示之ADC來減少腫瘤轉移及腫瘤復發之可能性。
本發明之其他實施例包含向無症狀但具有罹患癌症之風險之個體投與所揭示抗體或ADC。亦即，本發明之抗體或ADC可在真正預防意義下使用並給予已經檢查或測試且具有一或多個所述風險因子(例如基因組適應症、家族病史、活體內或活體外測試結果等)但尚未罹患贅瘤之患者。
亦可憑經驗確定已給予一或多次投與之個體中所揭示治療組合物之劑量及方案。舉例而言，可給予個體遞增劑量之如本文所述產生之治療組合物。在所選實施例中，可分別基於經驗確定或所觀察到之副作用或毒性來逐漸增加或減小或減弱劑量。為評價所選組合物之效能，可如先前所述遵循特定疾病、病症或病況之標記物。對於癌症，該等評價包括經由觸診或目測觀察直接量測腫瘤大小；藉由x射線或其他成像技術間接量測腫瘤大小；如藉由腫瘤樣本之直接腫瘤生檢及顯微鏡檢查評價之改良；量測根據本文所述方法鑑別之間接腫瘤標記物(例如用於前列腺癌之PSA)或致瘤抗原；疼痛或麻痺之減輕；經改良之與腫瘤相關之語言、視覺、呼吸或其他失能；增加的食欲；或如藉由公認測試所量測之生活品質之提高或存活期之延長。熟習此項技術者應明瞭，劑量將端視個體、贅瘤性病況之類型、贅瘤性病況之時期、贅瘤性病況是否已開始轉移至個體之其他位置及所使用之過去及同時治療而定。
C. 組合療法
如上文所提及，組合療法尤其可用於減少或抑制不期望贅瘤性細胞增殖、減少癌症之發生、減少或預防癌症之復發或減少或預防癌症之擴散或轉移。在該等情形下，本發明之抗體或ADC可作為敏化劑或化學敏化劑藉由移除原本將支撐腫瘤團塊並使其永存之CSC來起作用，且由此允許更有效地使用當前標準護理減積劑或抗癌劑。亦即，在某些實施例中，所揭示抗體或ADC可提供增強的效應(例如，在性質上加和或協同)來加強另一所投與治療劑之作用模式。在本發明背景下，「組合療法」應在廣義上理解且僅係指投與抗DLL3抗體或ADC及一或多種抗癌劑，包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射性療法及放射治療劑、靶向抗癌劑(包括單株抗體及小分子實體二者)、BRM、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、輻射療法及抗轉移劑及免疫治療劑，包括特異性及非特異性方法二者。
組合結果無需係在單獨實施每一治療(例如，DLL3 ADC及抗癌劑)時所觀察到之效應之加和。儘管通常期望至少加和效應，但大於單一療法中之一者之任何增加的抗腫瘤效應皆係有益的。此外，本發明無需組合治療來展現協同效應。然而，熟習此項技術者應瞭解，利用某些包含較佳實施例之所選組合可觀察到協同作用。
因此，在某些態樣中，在癌症治療中，與以下各項相比組合療法具有治療協同作用或改良可量測之治療效應：(i)單獨使用抗DLL3抗體或ADC，或(ii)單獨使用治療部分，或(iii)使用治療部分與未添加抗DLL3抗體或ADC之另一治療部分之組合。如本文所用之術語「治療協同作用」意指抗DLL3抗體或ADC及一或多個治療部分之組合具有大於抗DLL3抗體或ADC及一或多個治療部分之組合之加和效應的治療效應。
藉由與對照或基線量測比較來量化所揭示組合之期望結果。如本文所用之諸如「改良」、「增加」或「減小」等相對術語指示相對於對照(例如在同一個體中在起始本文所述治療前之量測，或在對照個體(或多個對照個體)中在本文所述之抗DLL3抗體或ADC不存在下但在其他治療部分(例如標準護理治療)存在下之量測)的值。代表性對照個體係患有與所治療個體相同形式之癌症之個體，其與所治療個體之年齡大致相同(以確保所治療個體與對照個體之疾病時期相當)。
對療法之反應之變化或改良(無論係加和抑或協同的)可證實在統計學上顯著。如本文所用之術語「顯著性」或「顯著」係指兩個或更多個所量測反應之間存在非隨機相關之機率之統計學分析。為確定關係是否「顯著」或具有「顯著性」，可計算「p值」。低於使用者定義之截止點之p值視為顯著。出於本發明之目的，小於或等於0.1、小於0.05、小於0.01、小於0.005、小於0.001之p值可視為顯著。
協同治療效應可係比由單一治療部分或抗DLL3抗體或ADC誘發之治療效應，或由給定組合之抗DLL3抗體或ADC或單一治療部分誘發之治療效應之和高至少約2倍、或高至少約5倍、或高至少約10倍、或高至少約20倍、或高至少約50倍、或高至少約100倍之效應。協同治療效應亦可觀察為與由單一治療部分或抗DLL3抗體或ADC誘發之治療效應或由給定組合之抗DLL3抗體或ADC或單一治療部分誘發之治療效應之和相比，治療效應增加至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或更大。協同效應亦係在治療劑組合使用時容許減少治療劑投藥之效應。
在實踐組合療法中，抗DLL3抗體或ADC及治療部分可以單一組合物或以兩種或更多種不同組合物使用相同或不同投與途徑同時投與個體。或者，使用抗DLL3抗體或ADC之治療可在治療部分治療之前 或之後以例如在介於數分鐘至數週範圍內之間隔進行。在一個實施例中，彼此在約5分鐘至約兩週內投與治療部分及抗體或ADC二者。在其他實施例中，在投與抗體與治療部分之間可經過數天(2天、3天、4天、5天、6天或7天)、數週(1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週或8週)或數月(1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月或8個月)。
組合療法可經投與直至病況按照不同時間表(例如每天一次、兩次或三次、每2天一次、每3天一次、每週一次、每2週一次、每月一次、每2個月一次、每3個月一次、每6個月一次)被治療、減輕或治癒，或可連續投與。抗體及治療部分可交替數天或數週投與；或可給出抗DLL3抗體或ADC治療之序列，然後使用其他治療部分治療一或多次。在一個實施例中，抗DLL3抗體或ADC係與一或多個治療部分組合投與用於短治療週期。在其他實施例中，投與組合治療用於長治療週期或用於維持療法型環境中。
在所選實施例中，本發明之化合物及組合物可與檢查點抑制劑(例如PD-1抑制劑或PD-L1抑制劑)結合使用。PD-1以及其配體PD-L1係抗腫瘤T淋巴球反應之負調節劑。在一個實施例中，組合療法可包含一起投與抗DLL3抗體或ADC及抗PD-1抗體(例如派姆單抗(pembrolizumab)、尼沃魯單抗(nivolumab)、匹利珠單抗(pidilizumab))及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法可包含一起投與抗DLL3抗體或ADC及抗PD-L1抗體(例如阿維魯單抗(avelumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab))及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法可包含一起投與抗DLL3抗體或ADC及抗PD-1抗體或抗PD-L1，其投與在使用檢查點抑制劑及/或靶向BRAF組合療法(例如威羅菲尼(vemurafenib)或達拉非尼(dabrafinib))治療後持續惡化之患者。如本文所論述及下文 實例中所述，該等治療組合可證實在抑制腫瘤生長及繁殖方面驚人地有效。
儘管不希望受限於任何具體理論，本文所述之結果表明，DLL3ADC可以活化免疫活性細胞(包括T淋巴球)及/或將其吸引至腫瘤位點之方式結合並殺死DLL3表現腫瘤細胞。此外，經由投與DLL3 ADC消除或破壞DLL3+癌症幹細胞(例如，藉由細胞破壞)可釋放使個體之免疫反應集中在腫瘤之生殖「種子細胞」上之CSC特異性抗原。應瞭解，此患者介導之集中在癌症幹細胞上之免疫攻擊可提供增強致瘤細胞之消除及相應地抑制腫瘤生長或維持之機制。PD-1抗體之存在則可用於防止新活化T淋巴球經由其表面上之PD-1受體接受抑制信號(例如，藉由接合PD-L1或PD-L2配體)及維持或增強所集中的免疫反應。因此，使用DLL3 ADC治療可藉由生成或吸引新活化T細胞以消除腫瘤位點處之癌症幹細胞來增強所投與PD-1抗體之抗致瘤效應，同時，在同一時間或隨後，PD-1抗體可增強CSC活化T淋巴球之抗腫瘤效應，由此消除多於在檢查點抑制劑不存在下原本將可能消除之腫瘤細胞。
應瞭解，該等DLL3 ADC/檢查點抑制劑(例如，抗PD-1抗體)組合允許減弱劑量及相應投藥方案以提供尤其有益之治療特徵。更特定而言，當與藥物作為單一藥劑使用相比時，該等組合可允許以任一或兩種藥物之較低(或較不頻繁)劑量有效地抑制或消除致瘤細胞。因此，在本發明之某些態樣中，可使用相對較低劑量(與作為單一藥劑使用相比)之所揭示DLL3 ADC及抗PD-1抗體且仍提供具有較小毒性之治療反應。舉例而言，使用較低的DLL3 ADC劑量(例如，0.1mg/kg、0.05mg/kg等)與PD-1抗體之組合，而非使用如上文所論述0.2mg/kg Q3W×3或0.3mg/kg Q6W×2之所揭示DLL3 ADC投藥方案可獲得等效治療結果。類似地，使用DLL3 ADC/抗PD-1組合與降低的或 減弱的方案(例如減少DLL3 ADC週期(例如，0.2mg/kg Q3W×2)或延長DLL3 ADC投藥之間的時間(例如，0.2mg/kg Q4W×2))可獲得有效治療結果。在每一該情形(即，較低劑量或延長的投藥)下應瞭解，由所揭示之治療組合提供之意外益處允許有效地治療患者且具有相對較小之毒性。此進而提供能夠較佳耐受必需治療之較健康患者及/或延長治療方案以增加陽性反應之機會。
在其他實施例中，抗DLL3抗體或ADC可與多種經批准第一線癌症治療組合使用。在所選實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及諸如以下等細胞毒性劑：異環磷醯胺、絲裂黴素(mytomycin)C、長春地辛(vindesine)、長春鹼、依託泊苷、伊立替康(irinotecan)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉烷(taxane)、長春瑞濱(vinorelbine)、胺甲喋呤及培美曲塞(pemetrexed)及視情況一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及基於鉑之藥物(例如卡鉑或順鉑)及視情況一或多個其他治療部分(例如長春瑞濱；吉西他濱；紫杉烷，例如多西他賽(docetaxel)或太平洋紫杉醇；伊立替康；或培美曲塞)。
在某些實施例中，例如在BR-ERPR、BR-ER或BR-PR癌症之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及一或多個闡述為「激素療法」之治療部分。如本文所用之「激素療法」係指例如他莫昔芬(tamoxifen)；促性腺激素或促黃體激素釋放激素(GnRH或LHRH)；依維莫司(everolimus)及依西美坦(exemestane)；托瑞米芬(toremifene)；或芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦或氟維司群(fulvestrant))。
在另一實施例中，例如在BR-HER2之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及曲妥珠單抗(trastuzumab)或阿多-曲妥珠單抗 艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)(Kadcyla®)及視情況一或多個其他治療部分(例如帕妥珠單抗(pertuzumab)及/或多西他賽)。
在一些實施例中，例如在轉移性乳癌之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及紫杉烷(例如多西他賽或太平洋紫杉醇)及視情況另一治療部分，例如蒽環(例如多柔比星或泛艾黴素)及/或埃雷布林(eribulin)。
在另一實施例中，例如在轉移性或復發性乳癌或BRCA突變體乳癌之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及甲地孕酮(megestrol)及視情況另一治療部分。
在其他實施例中，例如在BR-TNBC之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制劑(例如BMN-673、奧拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕尼(rucaparib)及維利帕尼(veliparib))及視情況另一治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及PARP抑制劑及視情況一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，例如在乳癌之治療中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及環磷醯胺及視情況另一治療部分(例如多柔比星、紫杉烷、泛艾黴素、5-FU及/或胺甲喋呤)。
在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及阿法替尼(afatinib)及視情況一或多個其他治療部分(例如厄洛替尼(erlotinib)及/或貝伐珠單抗(bevacizumab))。
在另一實施例中，用於治療EGFR陽性NSCLC之組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及厄洛替尼及視情況一或多個其他治療部分(例如貝伐珠單抗)。
在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及色瑞替尼(ceritinib)(Zykadia)及視情況一或多 個其他治療部分。
在另一實施例中，用於治療ALK陽性NSCLC之組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及克唑替尼(crizotinib)(Xalcori)及視情況一或多個其他治療部分。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況一或多個其他治療部分(例如吉西他濱或紫杉烷，例如多西他賽或太平洋紫杉醇；及/或鉑類似物)。
在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及貝伐珠單抗及視情況環磷醯胺。
在具體實施例中，用於治療鉑抗性腫瘤之組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及多柔比星及/或依託泊苷及/或吉西他濱及/或長春瑞濱及/或異環磷醯胺及/或甲醯四氫葉酸(leucovorin)調節之5-氟尿嘧啶及/或貝伐珠單抗及/或他莫昔芬；及視情況一或多個其他治療部分。
在所選實施例中，所揭示抗體及ADC可與某些類固醇組合使用以潛在地使療程更有效且減少諸如發炎、噁心及過敏等副作用。可與本發明ADC組合使用之實例性類固醇包括(但不限於)氫化可體松(hydrocortisone)、地塞米松(dexamethasone)、普賴松(prednisone)、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)及普賴蘇濃。在尤佳態樣中，類固醇將包含地塞米松。在其他較佳態樣中，類固醇將包含普賴松。
組合療法亦可包含抗DLL3抗體或ADC及可有效地針對包含突變或異常表現之基因或蛋白質(例如BRAF V600E)之腫瘤(例如黑色素瘤)之化學治療部分。
T淋巴球(例如，細胞毒性淋巴球(CTL))在針對惡性腫瘤之宿主防禦中起重要作用。CTL係藉由在抗原呈遞細胞上呈遞腫瘤相關抗原來活化。活性特異性免疫療法係可用於藉由使用衍生自已知癌症相關抗 原之肽對患者進行疫苗接種來強化針對癌症之T淋巴球反應之方法。在一個實施例中，組合療法可包含抗DLL3抗體或ADC及針對癌症相關抗原(例如黑色素細胞譜系特異性抗原酪胺酸酶、gp100、Melan-A/MART-1或gp75)之疫苗。在其他實施例中，組合療法可包含一起投與抗DLL3抗體或ADC及自體CTL或天然殺手細胞之活體外擴增、活化及授受性再引入。CTL活化亦可藉由增強抗原呈遞細胞之腫瘤抗原呈遞之策略來促進。顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)有助於樹突細胞之招募及樹突細胞交叉啟動之活化。在一個實施例中，組合療法可包含分離抗原呈遞細胞，使用刺激性細胞介素(例如GM-CSF)活化該等細胞，使用腫瘤相關抗原啟動，且然後將抗原呈遞細胞授受性再引入患者中，與使用抗DLL3抗體或ADC及視情況一或多個不同治療部分組合。
在一些實施例中，抗DLL3抗體或ADC可與多種第一線黑色素瘤治療組合使用。在一個實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及達卡巴嗪及視情況一或多個其他治療部分。在其他實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及替莫唑胺(temozolamide)及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及基於鉑之治療部分(例如卡鉑或順鉑)及視情況一或多個其他治療部分。在一些實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及長春花生物鹼(vinca alkaloid)治療部分(例如長春鹼、長春瑞濱、長春新鹼或長春地辛)及視情況一或多個其他治療部分。在一個實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及介白素-2及視情況一或多個其他治療部分。在另一實施例中，組合療法包含使用抗DLL3抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療部分。
在其他實施例中，抗DLL3抗體或ADC可與輔助黑色素瘤治療及/或手術程序(例如腫瘤切除術)組合使用。在一個實施例中，組合療法 包含使用抗DLL3抗體或ADC及干擾素-α及視情況一或多個其他治療部分。
本發明亦提供抗DLL3抗體或ADC與放射性療法之組合。如本文所用之術語「放射性療法」意指用於誘導腫瘤細胞內之局部DNA損傷之任何機制，例如γ-照射、X射線、UV-照射、微波、電子發射及諸如此類。亦涵蓋使用將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之組合療法，且可以組合使用或以本文所揭示抗DLL3抗體之結合物使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個連續劑量投與。
在其他實施例中，抗DLL3抗體或ADC可與下文所述之一或多種抗癌劑組合使用。
D. 抗癌劑
如本文所用之術語「抗癌劑」係「治療部分」之一個子集，該「治療部分」進而係闡述為「醫藥活性部分」之藥劑的子集。更具體而言，「抗癌劑」意指可用於治療細胞增生性病症(例如癌症)之任何藥劑(或其醫藥上可接受之鹽)，且包括(但不限於)細胞毒性劑、細胞生長抑制劑、抗血管生成劑、減積劑、化學治療劑、放射治療劑、靶向抗癌劑、生物反應改質劑、治療性抗體、癌症疫苗、細胞介素、激素療法、抗轉移劑及免疫治療劑。應注意，抗癌劑之前述分類彼此並不排斥且所選藥劑可歸於一或多個類別中。舉例而言，相容性抗癌劑可分類為細胞毒性劑及化學治療劑。因此，應根據本發明且然後根據其在醫學業內之應用理解前述術語中之每一者。
在較佳實施例中，抗癌劑可包括抑制或消除或經設計抑制或消除癌細胞或可能變成癌性或生成致瘤子代之細胞(例如，致瘤細胞)的任何化學藥劑(例如，化學治療劑)。就此而言，所選化學藥劑(細胞週期依賴性藥劑)通常針對為細胞生長或分裂所需之細胞內過程，且因 此可尤其有效地針對通常快速生長及分裂之癌細胞。舉例而言，長春新鹼使微管解聚合，且因此抑制快速分裂之腫瘤細胞進入有絲分裂。在其他情形下，所選化學藥劑係干擾細胞在其生命週期之任一點之存活且可在定向治療中有效之非細胞週期依賴性藥劑(例如，ADC)。舉例而言，某些吡咯并苯并二氮呯結合至細胞DNA之小溝且在遞送至核後抑制轉錄。關於組合療法或ADC組份之選擇應瞭解，熟習此項技術者可根據本發明容易地鑑別出相容性細胞週期依賴性藥劑及非細胞週期依賴性藥劑。
在任一情形下且如上文所提及，應瞭解，所選抗癌劑可與除本文所揭示之抗DLL3抗體及ADC外之每一其他療法(例如，CHOP療法)組合投與。此外，應進一步瞭解，在某些實施例中，該等抗癌劑可包含結合物且可在投與之前與抗體締合。在一些態樣中，所揭示抗癌劑將連接至抗DLL3抗體以提供如本文所揭示之ADC。
如本文所用之術語「細胞毒性劑」(或細胞毒素)通常意指對細胞之毒性在於其降低或抑制細胞功能及/或引起腫瘤細胞破壞之物質。在某些實施例中，該物質係衍生自活生物體之天然分子或其類似物(自天然來源純化或以合成方式製備)。細胞毒性劑之實例包括(但不限於)細菌之小分子毒素或酶活性毒素(例如，卡奇黴素、白喉毒素、假單胞菌屬內毒素及外毒素、葡萄球菌腸毒素A)、真菌之小分子毒素或酶活性毒素(例如，α-帚麴菌素(α-sarcin)、侷限麴菌素(restrictocin))、植物之小分子毒素或酶活性毒素(例如，相思子素、蓖麻毒蛋白、莫迪素(modeccin)、槲寄生素、商陸抗病毒蛋白、肥皂草毒素、白樹素、苦瓜毒素、天花粉蛋白、大麥毒素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(Phytolacca mericana)蛋白[PAPI、PAPII及PAP-S]、苦瓜(Momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、肥皂草(saponaria officinalis)抑制劑、米特格林(mitegellin)、侷限麴菌 素、酚黴素、新黴素及新月毒素)或動物之小分子毒素或酶活性毒素(例如細胞毒性RNase，例如細胞外胰臟RNase；DNase I，包括其片段及/或變體)。本文闡述其他相容性細胞毒性劑，包括某些放射性同位素、類美登素、奧裡斯他汀、多拉斯他汀、多卡米星、瓢菌素及吡咯并苯并二氮呯。
更通常而言，可與本發明抗體組合(或結合)使用之細胞毒性劑或抗癌劑之實例包括(但不限於)烷基化劑、磺酸烷基酯、阿那曲唑、瓢菌素、氮丙啶、乙烯亞胺及甲基蜜胺、多聚乙醯、喜樹鹼(camptothecin)、BEZ-235、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚蟲素(bryostatin)、海綿他汀(callystatin)、CC-1065、色瑞替尼、克唑替尼、念珠藻素(cryptophycin)、多拉斯他汀、多卡米星、艾榴塞洛素(eleutherobin)、埃羅替尼、水鬼蕉鹼(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海綿抑制素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔達內黴素(enediyne dynemicin)、雙磷酸鹽、埃斯培拉黴素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸、博來黴素、放線菌素C、坎磷醯胺(canfosfamide)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycinis)、環磷醯胺、放線菌素D、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、多柔比星、泛艾黴素、依索比星(esorubicin)、依西美坦、氟尿嘧啶、氟維司群、吉非替尼(gefitinib)、艾達黴素(idarubicin)、拉帕替尼(lapatinib)、來曲唑、洛那法尼(lonafarnib)、麻西羅黴素(marcellomycin)、乙酸甲地孕酮、絲裂黴素、黴酚酸、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、帕唑帕尼(pazopanib)、派來黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、雷 帕黴素(rapamycin)、羅多比星(rodorubicin)、索拉菲尼(sorafenib)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、他莫昔芬、檸檬酸他莫昔芬、替莫唑胺(temozolomide)、噻替派(tepadina)、替比法尼(tipifarnib)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凡德他尼(vandetanib)、氟氯唑(vorozole)、XL-147、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝劑、葉酸類似物、嘌呤類似物、雄激素、抗腎上腺藥、葉酸補充劑(例如亞葉酸)、醋葡醛內酯(aceglatone)、醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)、胺基乙醯丙酸、乙炔脲嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、貝司特布斯(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依達曲沙(edatraxate)、地磷醯胺(defofamine)、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鳥胺酸(elfornithine)、伊利醋銨(elliptinium acetate)、埃博黴素、乙環氧啶(etoglucid)、硝酸鎵、羥基脲、香菇多醣、氯尼達明(lonidainine)、類美登素、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、莫哌達醇(mopidanmol)、二胺硝吖啶(nitraerine)、噴斯他丁(pentostatin)、蛋胺氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸、2-乙基醯肼、苯卡巴肼(procarbazine)、多醣複合物、雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；SF-1126、西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(T-2毒素、黏液黴素(verracurin)A、桿孢菌素(roridin)A及蛇形菌素(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛；達卡巴嗪；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)；環磷醯胺；噻替派；類紫杉醇(taxoid)、苯丁酸氮芥(chloranbucil)；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲喋呤；鉑類似物、長春鹼；鉑；依託泊苷；異環磷醯胺；米托蒽醌；長春新鹼； 長春瑞濱；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素；胺基喋呤(aminopterin)；截瘤達(xeloda)；依班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康、拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸；類視色素；卡培他濱(capecitabine)；考布他汀(combretastatin)；甲硫四氫葉酸；奧沙利鉑；XL518、減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR及VEGF-A抑制劑及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。此定義亦包括用於調控或抑制激素對腫瘤之作用之抗激素劑，例如抗雌激素劑及選擇性雌激素受體抗體、抑制芳香酶、調控腎上腺中之雌激素產生之芳香酶抑制劑、及抗雄激素劑；以及曲沙他濱(troxacitabine，1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸、核酶(例如VEGF表現抑制劑及HER2表現抑制劑)；疫苗、PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯培拉黴素及上述任一者之醫藥上可接受之鹽或溶劑合物、酸或衍生物。
相容性細胞毒性劑或抗癌劑亦可包含商業上或臨床上可獲得之化合物，例如埃羅替尼(TARCEVA®,Genentech/OSI Pharm.)、多西他賽(TAXOTERE®,Sanofi-Aventis)、5-FU(氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶，CAS編號51-21-8)、吉西他濱(GEMZAR®,Lilly)、PD-0325901(CAS編號391210-10-9,Pfizer)、順鉑(順式-二胺、二氯鉑(II)，CAS編號15663-27-1)、卡鉑(CAS編號41575-94-4)、太平洋紫杉醇(TAXOL®,Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)、曲妥珠單抗(HERCEPTIN®,Genentech)、替莫唑胺(4-甲基-5-側氧基-2,3,4,6,8-五氮雜雙環[4.3.0]九-2,7,9-三烯-9-甲醯胺，CAS編號85622-93-1、TEMODAR®、TEMODAL®,Schering Plough)、他莫昔芬((Z)-2-[4-(1,2-二苯基丁-1-烯基)苯氧基]-N,N-二甲基乙胺、NOLVADEX®、ISTUBAL®、VALODEX®)及多柔比星(ADRIAMYCIN®)。其他商業 上或臨床上可獲得之抗癌劑包含奧沙利鉑(ELOXATIN®,Sanofi)、硼替佐米(VELCADE®,Millennium Pharm.)、舒癌特(sutent)(SUNITINIB®、SU11248,Pfizer)、來曲唑(FEMARA®,Novartis)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)(GLEEVEC®,Novartis)、XL-518(Mek抑制劑，Exelixis,WO 2007/044515)、ARRY-886(Mek抑制劑，AZD6244,Array BioPharma,Astra Zeneca)、SF-1126(PI3K抑制劑，Semafore Pharmaceuticals)、BEZ-235(PI3K抑制劑，Novartis)、XL-147(PI3K抑制劑，Exelixis)、PTK787/ZK 222584(Novartis)、氟維司群(FASLODEX®,AstraZeneca)、甲醯四氫葉酸(亞葉酸)、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®,Wyeth)、拉帕替尼(TYKERB®、GSK572016,Glaxo Smith Kline)、洛那法尼(SARASARTM、SCH 66336,Schering Plough)、索拉菲尼(NEXAVAR®、BAY43-9006,Bayer Labs)、吉非替尼(IRESSA®,AstraZeneca)、伊立替康(CAMPTOSAR®、CPT-11,Pfizer)、替吡法尼(tipifarnib)(ZARNESTRATM,Johnson & Johnson)、ABRAXANETM(不含Cremophor)、太平洋紫杉醇之白蛋白改造之奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Il)、凡德他尼(rINN、ZD6474、ZACTIMA®,AstraZeneca)、苯丁酸氮芥、AG1478、AG1571(SU 5271；Sugen)、替西羅莫司(temsirolimus)(TORISEL®,Wyeth)、帕唑帕尼(GlaxoSmithKline)、坎磷醯胺(TELCYTA®,Telik)、噻替派及環磷醯胺(CYTOXAN®,NEOSAR®)；長春瑞濱(NAVELBINE®)；卡培他濱(XELODA®,Roche)、他莫昔芬(包括NOLVADEX®；檸檬酸他莫昔芬、FARESTON®(檸檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))、MEGASE®(乙酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦；Pfizer)、福美司坦(formestanie)、法曲唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏氯唑(vorozole))、FEMARA®(來曲唑；Novartis)及 ARIMIDEX®(阿那曲唑；AstraZeneca)。
術語「醫藥上可接受之鹽」或「鹽」意指分子或大分子之有機或無機鹽。酸加成鹽可利用胺基形成。實例性鹽包括(但不限於)硫酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、異菸鹼酸鹽、乳酸鹽、柳酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、油酸鹽、鞣酸鹽、泛酸鹽、酒石酸氫鹽、抗壞血酸鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、龍膽酸鹽、富馬酸鹽、葡萄糖酸鹽、葡糖醛酸鹽、糖二酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、麩胺酸鹽、甲烷磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即1,1'亞甲基雙-(2-羥基3-萘酸鹽))。醫藥上可接受之鹽可涉及納入另一分子，例如乙酸根離子、琥珀酸根離子或其他相對離子。相對離子可為穩定母體化合物上之電荷之任一有機或無機部分。此外，醫藥上可接受之鹽可在其結構中具有不止一個帶電原子。倘若多個帶電原子為醫藥上可接受之鹽之一部分，則該鹽可具有多個相對離子。因此，醫藥上可接受之鹽可具有一或多個帶電原子及/或一或多個相對離子。
類似地，「醫藥上可接受之溶劑合物」或「溶劑合物」係指一或多種溶劑分子與一種分子或大分子之締合。形成醫藥上可接受之溶劑合物之溶劑之實例包括(但不限於)水、異丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、乙酸及乙醇胺。
在其他實施例中，本發明之抗體或ADC可與目前臨床試驗或市售之多種抗體(或免疫治療劑)中之任一者組合使用。所揭示抗體可與選自由以下組成之群之抗體組合使用：阿巴伏單抗(abagovomab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿福圖珠單抗(afutuzumab)、阿倫單抗(alemtuzumab)、阿托珠單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿替珠單抗、阿維魯單抗、巴維昔單抗 (bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝伐珠單抗、比伐單抗(bivatuzumab)、布利莫單抗(blinatumomab)、貝倫妥單抗(brentuximab)、坎妥珠單抗(cantuzumab)、卡妥索單抗(catumaxomab)、西妥昔單抗(cetuximab)、西他珠單抗(citatuzumab)、西妥木單抗(cixutumumab)、克立瓦妥珠單抗(clivatuzumab)、可那木單抗(conatumumab)、達西珠單抗(dacetuzumab)、達洛珠單抗(dalotuzumab)、達雷木單抗(daratumumab)、地莫單抗(detumomab)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、德瓦魯單抗、杜昔妥單抗(dusigitumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、恩司昔單抗(ensituximab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、埃達珠單抗(etaracizumab)、法勒珠單抗(farletuzumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗蘭托單抗(flanvotumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、蓋尼塔單抗(ganitumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格萊木單抗(glembatumumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、伊戈伏單抗(igovomab)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英達妥昔單抗(indatuximab)、伊珠單抗(inotuzumab)、英妥木單抗(intetumumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊妥木單抗(iratumumab)、拉貝珠單抗(labetuzumab)、蘭布魯珠單抗(lambrolizumab)、來沙木單抗(lexatumumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、洛伏珠單抗(lorvotuzumab)、魯卡木單抗(lucatumumab)、馬帕木單抗(mapatumumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗(minretumomab)、米妥莫單抗(mitumomab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)、納那妥單抗(narnatumab)、那莫單抗(naptumomab)、奈昔木單抗(necitumumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼沃魯單 抗、若莫單抗(nofetumomabn)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、奧卡妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧拉帕尼、昂妥珠單抗(onartuzumab)、莫奧珠單抗(oportuzumab)、奧戈伏單抗(oregovomab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕圖珠單抗(parsatuzumab)、帕圖單抗(patritumab)、派姆單抗、帕圖莫單抗(pemtumomab)、帕妥珠單抗、匹利珠單抗、平妥單抗(pintumomab)、普托木單抗(pritumumab)、拉妥木單抗(racotumomab)、拉圖單抗(radretumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗(rituximab)、羅妥木單抗(robatumumab)、沙妥莫單抗(satumomab)、司美替尼(selumetinib)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、司妥昔單抗(siltuximab)、司妥佐單抗(simtuzumab)、索利圖單抗(solitomab)、他妥珠單抗(tacatuzumab)、他妥莫單抗(taplitumomab)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替普莫單抗(teprotumumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、托西莫單抗(tositumomab)、曲妥珠單抗、托卡珠單抗(tucotuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、沃妥珠單抗(vorsetuzumab)、沃圖莫單抗(votumumab)、紮魯木單抗(zalutumumab)、CC49、3F8、MEDI0680、MDX-1105及其組合。
其他實施例包含使用經批准用於癌症療法之抗體，包括(但不限於)利妥昔單抗、吉妥珠單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamcin)、阿倫單抗、替伊莫單抗、托西莫單抗、貝伐珠單抗、西妥昔單抗、帕替木單抗(patitumumab)、奧法木單抗、伊匹單抗及貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)。熟習此項技術者將能夠容易地鑑別出與本文之教示相容之其他抗癌劑。
E. 放射性療法
如上文簡單論述，本發明亦提供抗體或ADC與放射性療法(即， 用於誘導腫瘤細胞內之局部DNA損傷之任何機制，例如γ-照射、X射線、UV-照射、微波、電子發射及諸如此類)之組合。亦涵蓋使用將放射性同位素定向遞送至腫瘤細胞之組合療法，且所揭示抗體或ADC可與靶向抗癌劑或其他靶向方式結合使用。通常，輻射療法係經約1週至約2週之時間段脈衝式投與。可向患有頭頸癌之個體投與輻射療法達約6至7週。視情況，輻射療法可以單一劑量或以多個連續劑量投與。
VIII. 適應症
本發明提供使用本發明抗體及ADC來診斷、診療、治療及/或預防多種病症，包括增生性病症、贅瘤性、發炎性、血管生成性及免疫病症及由病原體引起之病症。在某些實施例中，欲治療之疾病包含贅瘤性病況，且在某些其他態樣中包含實體腫瘤。在其他實施例中，欲治療之疾病包含血液惡性病。在其他實施例中，本發明之抗體或ADC將用於治療表現DLL3決定子之腫瘤或致瘤細胞。較佳地，欲治療之「個體」或「患者」將為人類，但如本文所用之該等術語明確包含任何哺乳動物物種。
應瞭解，本發明之化合物及組合物可用於治療處在不同疾病時期及處在其治療週期之不同點之個體。因此，在某些實施例中，本發明之抗體及ADC將用作前線療法且投與先前尚未進行癌性病況治療之個體。在其他實施例中，本發明之抗體及ADC將用於治療第二及第三線患者(即，先前已分別治療同一病況一或兩次之彼等個體)。其他實施例將包含治療已使用所揭示之DLL3 ADC或使用不同治療劑治療同一或相關病況三次或更多次之第四線或更高患者(例如，SCLC患者)。在其他實施例中，本發明之化合物及組合物將用於治療先前已經治療(使用本發明之抗體或ADC或使用其他抗癌劑)且再發或經測定對先前治療具有難治性之個體。在所選實施例中，本發明之化合物及 組合物可用於治療患有復發性腫瘤之個體。
如上文所論述及隨附實例中所顯示，本發明之化合物及組合物可用於治療患有較佳使用如本文所述衍生之IHC及/或H-評分測定之DLL3+腫瘤(例如，DLL3 H-評分為90或以上之腫瘤及/或腫瘤在20%之細胞中表現DLL3)之任何個體。就此而言，本發明之一個實施例包含使用所揭示之DLL3 ADC治療H-評分為至少90之患者。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少120之DLL3 H-評分。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少150之DLL3 H-評分，且更佳將具有至少180之DLL3 H-評分。其他實施例將包含其中腫瘤在至少20%、30% 40%或至少50%之組成細胞中表現DLL3之DLL3+腫瘤，如藉由染色所測定。在某些較佳實施例中，經染色細胞之H-評分或百分比將使用自SCLC腫瘤獲得之樣本來量測。在其他實施例中，經染色細胞之H-評分或百分比將使用自大細胞神經內分泌癌、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤或甲狀腺髓樣腫瘤獲得之樣本來量測。在其他實施例中，經染色細胞之H-評分或百分比將使用自展現神經內分泌特徵之腫瘤獲得之樣本來量測。
在某些態樣中，增生性病症將包含實體腫瘤，包括(但不限於)腎上腺腫瘤、肝腫瘤、腎腫瘤、膀胱腫瘤、乳房腫瘤、胃腫瘤、卵巢腫瘤、子宮頸腫瘤、子宮腫瘤、食道腫瘤、結腸直腸腫瘤、前列腺腫瘤(例如，前列腺腺癌)、胰臟腫瘤、肺腫瘤(小細胞腫瘤及非小細胞腫瘤二者)、甲狀腺腫瘤、癌瘤、肉瘤、神經膠母細胞瘤及各種頭頸腫瘤。在其他較佳實施例中且如下文實例中所顯示，所揭示ADC可尤其有效地治療小細胞肺癌(SCLC)及非小細胞肺癌(NSCLC)(例如，鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)。在某些實施例中，肺癌對基於鉑之藥劑(例如，卡鉑、順鉑、奧沙利鉑、托泊替康(topotecan))及/或紫杉烷(例如，多西他賽、太平洋紫杉醇、拉洛他賽 (larotaxel)或卡巴他賽(cabazitaxel))具有難治性、再發性或抗性。在另一實施例中，欲治療之個體患有大細胞神經內分泌癌(LCNEC)。在本發明之其他態樣中，所揭示抗體及ADC可用於治療甲狀腺髓樣癌、神經膠母細胞瘤、神經內分泌前列腺癌(NEPC)、高級胃腸胰臟癌(GEP)及惡性黑色素瘤。
更通常而言，根據本發明經受治療之實例性贅瘤性病況可為良性或惡性；實體腫瘤或血液惡性病；且可選自包括(但不限於)以下之群：腎上腺腫瘤、AIDS相關癌症、腺泡狀軟組織肉瘤、星形細胞瘤、自主神經節瘤、膀胱癌(鱗狀細胞癌及移行細胞癌)、囊胚腔病症、骨癌(牙釉質瘤、動脈瘤樣骨囊腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦及脊髓癌、轉移性腦瘤、乳癌、頸動脈體瘤、子宮頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、嫌色性腎細胞癌、透明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、良性皮膚纖維組織細胞瘤、結締組織增生性小圓細胞腫瘤、室管膜瘤、上皮病症、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、骨外黏液樣軟骨肉瘤、骨纖維生成不良、骨纖維發育不良、膽囊及膽管癌、胃癌、胃腸疾病、妊娠滋養細胞疾病、生殖細胞瘤、腺病、頭頸癌、下視丘癌、腸癌、胰島細胞瘤、卡波西氏肉瘤(Kaposi's Sarcoma)、腎癌(腎胚細胞瘤、乳頭狀腎細胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤性腫瘤、脂肪肉瘤/惡性脂肪瘤性腫瘤、肝癌(肝母細胞瘤、肝細胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細胞癌、腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌等)、巨噬細胞病症、神經管胚細胞瘤、黑色素瘤、腦脊髓膜瘤、甲狀腺髓樣癌、多發性內分泌贅瘤、多發性骨髓瘤、骨髓發育不良症候群、神經胚細胞瘤、神經內分泌腫瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺瘤、兒科癌症、外周神經鞘膜瘤、嗜鉻細胞瘤、腦下垂體瘤、前列腺癌、後代眼色素層黑色素瘤、罕見血液病、腎轉移癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細胞癌症、胃癌、間質病症、滑膜肉瘤、睪丸 癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉移癌及子宮癌(子宮頸癌、子宮內膜癌及平滑肌瘤)。
在其他較佳實施例中，化合物或組合物將投與患有黑色素瘤之個體。更通常而言，本文所揭示之組合物及方法可用於診斷、監測、治療或預防黑色素瘤。如本文所用之術語「黑色素瘤」包括所有類型之黑色素瘤，包括(但不限於)原發性黑色素瘤、惡性黑色素瘤、皮膚黑色素瘤、皮膚外黑色素瘤、表淺擴散性黑色素瘤、息肉樣黑色素瘤、黑色素細胞癌、黑色素上皮癌、黑色素肉瘤、黑色素原位瘤、結節性惡性黑色素瘤、黑色素小痣性黑色素瘤、小痣性黑色素瘤、小痣性惡性黑色素瘤、黏膜小痣性黑色素瘤、黏膜黑色素瘤、肢端小痣性黑色素瘤、軟組織黑色素瘤、眼黑色素瘤、侵襲性黑色素瘤、家族性非典型痣與黑色素瘤(FAM-M)症候群、促結締組織增生性惡性黑色素瘤或葡萄膜黑色素瘤。
轉移性黑色素瘤可衍生自黑色素細胞、黑紗細胞痣或發育不良痣且可經由不同的腫瘤惡化期(例如水平生長期或垂直生長期)演化。黑色素瘤可由染色體異常、變性生長及/或發育障礙、有絲分裂劑、紫外輻射、病毒感染、致癌劑、各種遺傳突變或基因之異常表現引起。
如上文所提及，所揭示抗體及ADC可尤其有效地治療肺癌，包括以下亞型：小細胞肺癌及非小細胞肺癌(例如鱗狀細胞非小細胞肺癌或鱗狀細胞小細胞肺癌)及大細胞神經內分泌癌。在所選實施例中，抗體及ADC可投與展現侷限期疾病或擴散期疾病之患者。在其他實施例中，將向以下患者投與所揭示之所結合抗體：難治性患者(即，在初始療程期間或在完成初始療程後不久疾病復發之彼等)；敏感患者(即，在一級療法後長於2-3個月再發之彼等)；或對基於鉑之藥劑(例如卡鉑、順鉑、奧沙利鉑)及/或紫杉烷(例如多西他賽、太平洋 紫杉醇、拉洛他賽或卡巴他賽)展現抗性之患者。在某些較佳實施例中，本發明之DLL3 ADC可投與前線患者(即，尚未進行肺癌治療之彼等)。在其他實施例中，本發明之DLL3 ADC可投與第二線肺癌患者。在其他實施例中，本發明之DLL3 ADC可投與第三或第四線肺癌患者。
在尤佳實施例中，所揭示ADC可用於治療小細胞肺癌。關於該等實施例，所結合抗體可投與展現侷限期疾病之患者。在其他實施例中，所揭示ADC將投與展現擴散期疾病之患者。在其他較佳實施例中，所揭示ADC將投與難治性患者(即，在初始療程期間或在完成初始療程後不久復發之彼等)或復發性小細胞肺癌患者。其他實施例包含將所揭示ADC投與敏感患者(即，在SCLC之一級療法後長於2-3個月再發之彼等)。在每一情形下應瞭解，相容性ADC可與其他抗癌劑(例如，基於鉑之藥劑或紫杉烷或針對PD-1或PD-L1之抗體)組合使用，此端視所選投藥方案及臨床診斷而定。
如本文所述，所揭示ADC可進一步用於預防、治療或診斷具有神經內分泌特徵或表型之腫瘤，包括神經內分泌腫瘤。源自分散內分泌系統之真正或經典神經內分泌腫瘤(NET)相對較為罕見，且發病率為每100,000個人2-5個，但具有高度攻擊性。神經內分泌腫瘤發生於腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(甲狀腺髓樣癌)及肺(小細胞肺癌及大細胞神經內分泌癌)。該等腫瘤可分泌可引起使人虛弱之症狀(稱為類癌症候群)之若干種激素，包括血清素及/或染色顆粒素A。該等腫瘤可藉由陽性免疫組織化學標記物(例如神經元特異性烯醇酶(NSE，亦稱為γ烯醇酶，基因符號=ENO2)、CD56(或NCAM1)、染色顆粒素A(CHGA)及突觸素(SYP))或藉由已知展現升高的表現之基因(例如ASCL1)來表示。不幸的是，傳統化學療法尚無法尤其有效地治療NET且肝轉移係常見 結果。
儘管所揭示ADC可有利地用於治療神經內分泌腫瘤，但其亦可用於治療、預防或診斷基因型或表型模擬經典神經內分泌腫瘤、與其類似或展現其常見性狀之假神經內分泌腫瘤(pNET)。假神經內分泌腫瘤或展現神經內分泌特徵之腫瘤係源自瀰漫性神經內分泌系統之細胞或源自其中神經內分泌分化級聯在致癌過程期間已異常再活化之細胞的腫瘤。該等pNET通常與傳統上定義之神經內分泌腫瘤(即，其展現神經內分泌特徵)分享某些表型或生物化學特徵，包括產生生物活性胺、神經傳遞質及肽激素之子集之能力。在組織學上，該等腫瘤(NET及pNET)共享通常顯示含有少量溫和細胞病理學細胞質及圓形至卵圓形點狀核之緻密聯結小細胞的常見外觀。出於本發明之目的，可用於定義神經內分泌及假神經內分泌腫瘤之通常表現之組織學標記物或遺傳標記物包括(但不限於)染色顆粒素A、CD56、突觸素、PGP9.5、ASCL1及神經元特異性烯醇酶(NSE)。
因此，本發明ADC可有益地用於治療假神經內分泌腫瘤及經典神經內分泌腫瘤二者。就此而言，ADC可如本文所述用於治療在以下器官中出現之神經內分泌腫瘤(NET及pNET二者)：腎、泌尿生殖道(膀胱、前列腺、卵巢、子宮頸及子宮內膜)、胃腸道(結腸、胃)、甲狀腺(甲狀腺髓樣癌)及肺(小細胞肺癌及大細胞神經內分泌癌)。此外，本發明ADC可用於治療表現一或多個選自由以下組成之群之標記物之腫瘤：NSE、CD56、突觸素、染色顆粒素A、ASCL1及PGP9.5(UCHL1)。亦即，本發明可用於治療患有為NSE+或CD56+或PGP9.5+或ASCL1+或SYP+或CHGA+或其一些組合之腫瘤之個體。
如先前所提及，本發明之DLL3 ADC可用於治療在一或兩次治療後患有進行性疾病之SCLC患者(即，第二或第三線SCLC患者)，尤其在其展現上文所提及之標記物時。
關於血液惡性病應進一步瞭解，本發明之化合物及方法可尤其有效地治療眾多種B細胞淋巴瘤，包括低級/NHL濾泡細胞淋巴瘤(FCC)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、瀰漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、小淋巴球性(SL)NHL、中間級/濾泡性NHL、中間級瀰漫性NHL、高級免疫母細胞性NHL、高級淋巴母細胞性NHL、高級小非裂解細胞NHL、大包塊疾病NHL、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)、淋巴漿細胞樣淋巴瘤(LPL)、外套細胞淋巴瘤(MCL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、瀰漫性大細胞淋巴瘤(DLCL)、柏基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma，BL)、AIDS相關淋巴瘤、單核球B細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞性淋巴腺病；小淋巴球性、濾泡性、瀰漫性大細胞、瀰漫性小裂解細胞、大細胞免疫母細胞性淋巴母細胞瘤；小非裂解、柏基特氏及非柏基特氏、濾泡性、主要大細胞淋巴瘤；濾泡性、主要小裂解細胞淋巴瘤；及濾泡性、混合小裂解及大細胞淋巴瘤。參見Gaidono等人，「Lymphomas」,CANCER：PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY，第2卷：2131-2145(DeVita等人編輯，第5版增刊1997)。熟習此項技術者應明瞭，該等淋巴瘤因改變分類系統所致而通常將具有不同的名稱，且患有分類於不同名稱下之淋巴瘤之患者亦可受益於本發明之組合治療方案。
IX. 製品
本發明包括包含一或多個容器或貯器之醫藥包裝及套組，其中容器可包含一或多個劑量之本發明抗體或ADC。該等套組或包裝可具有診斷或治療性。在某些實施例中，包裝或套組含有單位劑量，此意指預定量之包含例如本發明抗體或ADC、含或不含一或多種其他藥劑及視情況一或多種抗癌劑之組合物。在某些其他實施例中，包裝或套組含有可檢測量之抗DLL3抗體或ADC、含或不含相關報導基因分子及視情況一或多種用於癌細胞之檢測、量化、染色及/或可視化之其 他藥劑。
在任一情形下，本發明之套組通常將包含適宜容器或貯器中之本發明抗體或ADC(包含醫藥上可接受之調配物)及視情況相同或不同容器中之一或多種抗癌劑。該套組亦可含有其他醫藥上可接受之調配物或器件用於診斷或組合療法。診斷器件或儀器之實例包括可用於檢測、探查、監測、量化或剖析與增生性病症相關之細胞或標記物(關於該等實例性標記物之列表參見上文)之彼等。在一些實施例中，該等器件可用於在活體內或活體外檢測、監測及/或量化循環腫瘤細胞(例如，參見WO 2012/0128801)。在其他實施例中，循環腫瘤細胞可包含致瘤細胞。本發明所涵蓋之套組亦可含有適宜試劑以組合本發明之抗體或ADC與抗癌劑或診斷劑。
當於一或多種液體溶液中提供該套組之組份時，液體溶液可為非水性溶液，但通常水溶液較佳，且無菌水溶液尤佳。套組中之調配物亦可以可在添加適宜液體後重構之乾燥粉末或凍乾形式提供。用於重構之液體可含於單獨容器中。該等液體可包含醫藥上可接受之無菌緩衝劑或其他稀釋劑，例如抑菌性注射用水、無菌注射用水、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液或右旋糖溶液。倘若該套組包含本發明之抗體或ADC與其他治療劑或藥劑之組合，則溶液可以等莫耳濃度組合或以一種組份超過另一種組份之方式預混合。或者，可在投與患者之前將本發明之抗體或ADC及任何可選抗癌劑或其他藥劑單獨維持於不同容器內。
在某些較佳實施例中，本發明之套組將包含含有凍乾DLL3 ADC之小瓶或瓶。較佳地，凍乾ADC將包含選自由以下組成之群之DLL3 ADC：ADC1、ADC2、ADC3、ADC4、ADC5及ADC6，且更佳地凍乾DLL3 ADC將包含hSC16.56DL1或hSC16.56ss1DL6。在某些實施例中，凍乾DLL3 ADC將進一步包含凍乾保護劑。在其他態樣中，該等 套組可視情況包含包括可用於重構凍乾DLL3 ADC之水溶液之容器。在其他實施例中，該等套組可包含指示凍乾DLL3在2℃-8℃(例如，4℃)下保持穩定達3個月、6個月、1年、18個月、2年、30個月或3年之插頁或說明書。在所選較佳實施例中，插頁或說明書將指示凍乾ADC在2℃-8℃(例如，4℃)下將保持穩定達2年。在某些較佳實施例中，上文所提及包含凍乾DLL3 ADC之套組將包含標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀取器，此指示該等套組內容物可用於治療、預防及/或診斷癌症。在尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀取器指示該等套組內容物可用於治療、預防及/或診斷小細胞肺癌。在其他尤佳態樣中，標記、標記物、包裝插頁、條碼及/或讀取器指示該等套組內容物可用於治療、預防及/或診斷大細胞神經內分泌癌、黑色素瘤、甲狀腺癌或神經膠母細胞瘤。
更通常而言，該套組可包含一或多個容器或貯器及容器中、容器上或與容器締合之標記或包裝插頁，此指示所封閉之組合物用於診斷或治療所選疾病病況(例如癌症)。適宜容器包括例如瓶、小瓶、注射器、輸注袋(IV袋)等。該等容器可自眾多種材料(例如玻璃或醫藥上相容之塑膠)形成。在某些實施例中，該(等)容器可包含無菌輸液埠(例如靜脈內溶液袋)或具有皮下注射針可刺入之塞子之小瓶。
在一些實施例中，該套組可含有向患者投與抗體及任何可選組份之構件，例如一或多個針或注射器(預填充或空的)、滴管、吸管或可將調配物注射或引入個體中或施加至身體之患病區域之其他此類裝置。本發明之套組通常亦將包括在商業規模用封閉限制中含有小瓶或諸如此類及其他組份之構件，例如其中放置且保留期望小瓶及其他裝置之吹模塑膠容器。
X. 雜項
除非本文另有定義，否則結合本發明使用之科學及技術術語應 具有熟習此項技術者通常所理解之含義。此外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數形式且複數術語應包括單數形式。另外，本說明書及隨附申請專利範圍中所提供之範圍包括兩個終點及該等終點之間之所有點。因此，2.0至3.0之範圍包括2.0、3.0及2.0與3.0之間之所有點。
通常，本文所述細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及化學之技術係業內所熟知且常用之彼等。本文結合該等技術使用之術語亦為業內所常用。除非另外指示，否則本發明之方法及技術通常係根據業內所熟知且如本說明書通篇所引用之多個參考文獻中所述之習用方法來實施。
XI. 參考文獻
無論片語「以引用方式併入」是否用於具體參考文獻中，本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方式獲得之材料的完整揭示內容(包括例如GenBank及RefSeq中之例如核苷酸序列提交，及例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中之胺基酸序列提交，及GenBank及RefSeq中之註解編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。前述詳細描述及隨附實例係僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所顯示及闡述之確切細節。熟習此項技術者所明瞭之變化形式包括在由申請專利範圍定義之本發明中。本文所用之任何部分標題僅出於組織目的，而不能理解為限制所述標的物。
XII. 序列
隨附本申請案者係圖式及包含多個核酸及胺基酸序列之序列表。下表4提供所包括序列之匯總。
表4
如下文實例2中所論述，上表4可進一步用於指示圖1A及1B中所描繪之實例性Kabat CDR之SEQ ID NO。更具體而言，圖1A及1B表示每一重鏈(CDRH)及輕鏈(CDRL)可變區序列之三個Kabat CDR，且上 表4提供可應用於輕鏈之每一CDRL1、CDRL2及CDRL3及重鏈之每一CDRH1、CDRH2及CDRH3的SEQ ID名稱之指配。使用此方法，可為圖1A及1B中所述之每一獨特CDR指配連續SEQ ID NO且可用於提供本發明之衍生抗體。
XIII. 腫瘤列表
PDX腫瘤細胞類型係由縮寫加其後指示具體腫瘤細胞系之數字表示。所測試樣本之傳代次數指示為隨附樣本名稱之p0-p#，其中p0指示直接自患者腫瘤獲得之未傳代樣本，且p#指示在測試之前腫瘤經由小鼠傳代之次數。如本文所用腫瘤類型及亞型之縮寫顯示於下表5中：
實例
藉由參照下列實例將更容易地理解上文由此通常闡述之本發明，該等實例係以說明方式提供且不欲對本發明加以限制。該等實例不欲表示下文實驗係所實施之所有實驗或唯一實驗。除非另外指示，否則份數係重量份數，分子量係重量平均分子量，溫度係以℃表示，且壓力為大氣壓力或接近大氣壓力。
實例1 鼠類抗DLL3抗體之生成
如下產生抗DLL3鼠類抗體。在第一次免疫運動中，使用經等體積之TiterMax®或明礬佐劑乳化之人類DLL3-fc蛋白(hDLL3-Fc)接種三隻小鼠(以下品系中之每一者各有一隻：Balb/c、CD-1、FVB)。hDLL3-Fc融合構築體係購自Adipogen International(目錄號AG-40A-0113)。使用10μg hDLL3-Fc/小鼠於TiterMax中之乳液實施初始免疫。然後使用明礬佐劑中之5μg hDLL3-Fc/小鼠每兩週對小鼠實施加 強免疫。使用PBS中之5μg hDLL3-Fc/小鼠進行融合前之最終注射。
在第二次免疫運動中，使用經等體積之TiterMax®或明礬佐劑乳化之人類DLL3-His蛋白(hDLL3-His)接種六隻小鼠(以下品系各有兩隻：Balb/c、CD-1、FVB)。自經改造以過表現hDLL3-His之CHO-S細胞之上清液純化重組hDLL3-His蛋白。使用10μg hDLL3-His/小鼠於TiterMax中之乳液進行初始免疫。然後使用明礬佐劑中之5μg hDLL3-His/小鼠每兩週對小鼠實施加強免疫。使用經改造以過表現hDLL3之2×105個HEK-293T細胞進行最終注射。
使用固相ELISA分析來篩選小鼠血清之特異性針對人類DLL3之小鼠IgG抗體。大於背景之陽性信號指示特異性針對DLL3之抗體。簡言之，用ELISA包覆緩衝液中之0.5μg/ml重組DLL3-His將96孔板(VWR International，目錄號610744)包覆過夜。用含有0.02%(v/v)Tween 20之PBS洗滌後，在室溫(RT)下用200μL/孔於PBS中之3%(w/v)BSA將孔封阻1小時。對小鼠血清進行滴定(1：100、1：200、1：400及1：800)且以50μL/孔添加至DLL3包覆之板中並在室溫下培育1小時。洗滌各板，且然後在室溫下與50μL/孔以1：10,000稀釋於3% BSA-PBS或PBS中之2% FCS中之HRP標記之山羊抗小鼠IgG一起培育1小時。再洗滌各板，且在室溫下經15分鐘添加40μL/孔之TMB受質溶液(Thermo Scientific 34028)。顯影後，添加等體積之2N H2SO4以終止受質顯影且藉由分光光度計在OD 450下分析各板。
將血清陽性免疫小鼠殺死且解剖引流淋巴結(膕、鼠蹊及髂骨肌)並將其用作抗體產生細胞之來源。藉由電細胞融合使用模型BTX Hybrimmune系統(BTX Harvard Apparatus)，使B細胞之細胞懸浮液(來自hDLL3-Fc免疫小鼠之約229×106個細胞，及來自hDLL3-His免疫小鼠之510×106個細胞)與非分泌性P3x63Ag8.653骨髓瘤細胞以1：1之比率融合。將細胞重懸浮於由補充有偶氮絲胺酸、15%胎兒純系I血清、 10% BM Condimed(Roche Applied Sciences)、1mM非必需胺基酸、1mM HEPES、100IU青黴素(penicillin)-鏈黴素(streptomycin)及50μM 2-巰基乙醇之DMEM培養基組成之雜交瘤選擇培養基中，且於四個T225燒瓶中於100mL選擇培養基/燒瓶中培養。將燒瓶於含有5% CO2及95%空氣之37℃加濕培育器中放置6至7天。
在融合後第6天或第7天，自燒瓶收集雜交瘤文庫細胞，且以200μL經補充雜交瘤選擇培養基(如上文所述)中之一個細胞/孔(使用FACSAria I細胞分選儀)平鋪於64個Falcon 96孔板及48個96孔板中用於hDLL3-His免疫運動。將文庫之其餘部分儲存在液氮中。
將雜交瘤培養10天且使用如下實施之流式細胞術針對特異性針對hDLL3之抗體來篩選上清液。將1×105個/孔之經改造以過表現人類DLL3、小鼠DLL3(經染料預染色)或食蟹猴DLL3(經Dylight800預染色)之HEK-293T細胞與25μL雜交瘤上清液一起培育30分鐘。用PBS/2% FCS洗滌細胞，且然後與每樣本25μL以1：300稀釋於PBS/2%FCS中之DyeLight 649標記之山羊-抗小鼠IgG Fc片段特異性二級抗體一起培育。培育15分鐘後，用PBS/2%FCS將細胞洗滌兩次且重懸浮於含有DAPI之PBS/2%FCS中並藉由流式細胞術分析超出經同型對照抗體染色之細胞之螢光的螢光。將剩餘未使用之雜交瘤文庫細胞冷凍於液氮中用於將來文庫測試及篩選。
hDLL3-His免疫運動產生約50種鼠類抗hDLL3抗體且hDLL3-Fc免疫運動產生約90種鼠類抗hDLL3抗體。
實例2 抗DLL3抗體之測序
基於前述內容，選擇以表觀高親和力結合所固定人類DLL3或h293-hDLL3細胞之多種不同的實例性單株抗體進行測序及進一步分析。實例1中所生成之所選單株抗體之輕鏈可變區及重鏈可變區之序 列分析確認，許多抗體具有新穎的互補決定區且通常展示新穎VDJ排列。
首先，使表現期望抗體之所選雜交瘤細胞溶解於Trizol®試劑(Trizol® Plus RNA純化系統，Life Technologies)以製備編碼該等抗體之RNA。將104至105個細胞重懸浮於1mL Trizol中，且添加200μL氯仿，然後劇烈振盪。然後將樣本在4℃下離心10分鐘且將水相轉移至新離心管中並添加等體積之70%乙醇。將樣本裝載於RNeasy Mini旋轉管柱上，置於2mL收集管中且根據製造商之說明書進行處理。藉由直接溶析至旋轉管柱膜用100μL不含RNase之水提取總RNA。藉由分級分離1%瓊脂醣凝膠中之3μL來測定RNA製劑之品質，然後儲存在-80℃下直至使用。
使用包含32個經設計以靶向完整小鼠VH譜之小鼠特異性前導序列引子之5’引子混合物與特異性針對所有小鼠Ig同型之3'小鼠Cγ引子的組合來擴增每一雜交瘤之Ig重鏈之可變區。類似地，使用含有32個經設計以擴增Vκ小鼠家族中之每一者之5' Vκ前導序列之引子混合物與特異性針對小鼠κ恆定區之單一反向引子的組合來擴增κ輕鏈並對其進行測序。對於含有λ輕鏈之抗體，使用三個5’ VL前導序列與一個特異性針對小鼠λ恆定區之反向引子的組合來實施擴增。自100ng總RNA使用Qiagen一步RT-PCR套組如下擴增VH及VL轉錄本。對每一雜交瘤運行總共8次RT-PCR反應，對Vκ輕鏈運行4次且對Vγ重鏈運行4次。PCR反應混合物包括3μL RNA、0.5μL 100μM重鏈或κ輕鏈引子(由Integrated Data Technologies定製合成)、5μL 5×RT-PCR緩衝液、1μL dNTP、1μL含有反轉錄酶及DNA聚合酶之酶混合物及0.4μL核糖核酸酶抑制劑RNasin(1個單位)。熱週期計程式為RT步驟，50℃保持30分鐘，95℃保持15分鐘，然後30個(95℃保持30秒，48℃保持30秒，72℃保持1分鐘)週期。然後在72℃下最後培育10分鐘。
使用與上文針對可變區擴增所述相同之特異性可變區引子對所提取之PCR產物進行測序。為製備PCR產物用於直接DNA程序，根據製造商之方案使用QIAquickTM PCR純化套組(Qiagen)對其進行純化。使用50μL無菌水自旋轉管柱溶析DNA且然後直接自兩個鏈測序(MCLAB)。
使用IMGT序列分析工具(http：//www.imgt.org/IMGTmedical/sequence_analysis.html)來分析所選核苷酸序列以鑑別出具有最高序列同源性之種系V、D及J基因成員。使用專有抗體序列數據庫藉由比對VH及VL基因與小鼠種系數據庫來比較該等衍生序列與Ig V區及J區之已知種系DNA序列。
圖1A繪示來自抗DLL3抗體的多種新穎鼠類輕鏈可變區及衍生自代表性鼠類抗DLL3抗體之可變輕鏈的實例性人類化輕鏈可變區之鄰接胺基酸序列(根據下文實例3)。圖1B繪示來自相同抗DLL3抗體的新穎鼠類重鏈可變區及衍生自提供人類化輕鏈之相同鼠類抗體的人類化重鏈可變區之鄰接胺基酸序列(根據下文實例3)。鼠類輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：21-387奇數中，而人類化輕鏈及重鏈可變區胺基酸序列提供於SEQ ID NO：389-407奇數中。
因此，圖1A及1B一起提供以下各項之經註解序列：多個鼠類抗DLL3結合或靶向結構域，稱為SC16.3、SC16.4、SC16.5、SC16.7、SC16.8、SC16.10、SC16.11、SC16.13、SC16.15、SC16.18、SC16.19、SC16.20、SC16.21、SC16.22、SC16.23、SC16.25、SC16.26、SC16.29、SC16.30、SC16.31、SC16.34、SC16.35、SC16.36、SC16.38、SC16.41、SC16.42、SC16.45、SC16.47、SC16.49、SC16.50、SC16.52、SC16.55、SC16.56、SC16.57、SC16.58、SC16.61、SC16.62、SC16.63、SC16.65、SC16.67、SC16.68、SC16.72、SC16.73、SC16.78、SC16.79、SC16.80、 SC16.81、SC16.84、SC16.88、SC16.101、SC16.103、SC16.104、SC16.105、SC16.106、SC16.107、SC16.108、SC16.109、SC16.110、SC16.111、SC16.113、SC16.114、SC16.115、SC16.116、SC16.117、SC16.118、SC16.120、SC16.121、SC16.122、SC16.123、SC16.124、SC16.125、SC16.126、SC16.129、SC16.130、SC16.131、SC16.132、SC16.133、SC16.134、SC16.135、SC16.136、SC16.137、SC16.138、SC16.139、SC16.140、SC16.141、SC16.142、SC16.143、SC16.144、SC16.147、SC16.148、SC16.149及SC16.150；及人類化抗體，稱為hSC16.13、hSC16.15、hSC16.25、hSC16.34及hSC16.56。
在本發明之具體態樣中，ADC結合結構域特異性結合至hDLL3且包含以下各項或與包含以下各項之抗體競爭結合：SEQ ID NO：21之輕鏈可變區(VL)及SEQ ID NO：23之重鏈可變區(VH)；或SEQ ID NO：25之VL及SEQ ID NO：27之VH；或SEQ ID NO：29之VL及SEQ ID NO：31之VH；或SEQ ID NO：33之VL及SEQ ID NO：35之VH；或SEQ ID NO：37之VL及SEQ ID NO：39之VH；或SEQ ID NO：41之VL及SEQ ID NO：43之VH；或SEQ ID NO：45之VL及SEQ ID NO：47之VH；或SEQ ID NO：49之VL及SEQ ID NO：51之VH；或SEQ ID NO：53之VL及SEQ ID NO：55之VH；或SEQ ID NO：57之VL及SEQ ID NO：59之VH；或SEQ ID NO：61之VL及SEQ ID NO：63之VH；或SEQ ID NO：65之VL及SEQ ID NO：67之VH；或SEQ ID NO：69之VL及SEQ ID NO：71之VH；或SEQ ID NO：73之VL及SEQ ID NO：75之VH；或SEQ ID NO：77之VL及SEQ ID NO：79之VH；或SEQ ID NO：81之VL及SEQ ID NO：83之VH；或SEQ ID NO：85之VL及SEQ ID NO：87之VH；或SEQ ID NO：89之VL及SEQ ID NO：91之VH；或SEQ ID NO：93之VL及SEQ ID NO：95之VH；或SEQ ID NO：97之VL及SEQ ID NO：99之VH；或SEQ ID NO：101之VL及SEQ ID NO：103之VH；或SEQ ID NO：105之VL及 SEQ ID NO：107之VH；或SEQ ID NO：109之VL及SEQ ID NO：111之VH；或SEQ ID NO：113之VL及SEQ ID NO：115之VH；或SEQ ID NO：117之VL及SEQ ID NO：119之VH；或SEQ ID NO：121之VL及SEQ ID NO：123之VH；或SEQ ID NO：125之VL及SEQ ID NO：127之VH；或SEQ ID NO：129之VL及SEQ ID NO：131之VH；或SEQ ID NO：133之VL及SEQ ID NO：135之VH；或SEQ ID NO：137之VL及SEQ ID NO：139之VH；或SEQ ID NO：141之VL及SEQ ID NO：143之VH；或SEQ ID NO：145之VL及SEQ ID NO：147之VH；或SEQ ID NO：149之VL及SEQ ID NO：151之VH；或SEQ ID NO：153之VL及SEQ ID NO：155之VH；或SEQ ID NO：157之VL及SEQ ID NO：159之VH；或SEQ ID NO：161之VL及SEQ ID NO：163之VH；或SEQ ID NO：165之VL及SEQ ID NO：167之VH；或SEQ ID NO：169之VL及SEQ ID NO：171之VH；或SEQ ID NO：173之VL及SEQ ID NO：175之VH；或SEQ ID NO：177之VL及SEQ ID NO：179之VH；或SEQ ID NO：181之VL及SEQ ID NO：183之VH；或SEQ ID NO：185之VL及SEQ ID NO：187之VH；或SEQ ID NO：189之VL及SEQ ID NO：191之VH；或SEQ ID NO：193之VL及SEQ ID NO：195之VH；或SEQ ID NO：197之VL及SEQ ID NO：199之VH；或SEQ ID NO：201之VL及SEQ ID NO：203之VH；或SEQ ID NO：205之VL及SEQ ID NO：207之VH；或SEQ ID NO：209之VL及SEQ ID NO：211之VH；或SEQ ID NO：213之VL及SEQ ID NO：215之VH；或SEQ ID NO：217之VL及SEQ ID NO：219之VH；或SEQ ID NO：221之VL及SEQ ID NO：223之VH；或SEQ ID NO：225之VL及SEQ ID NO：227之VH；或SEQ ID NO：229之VL及SEQ ID NO：231之VH；或SEQ ID NO：233之VL及SEQ ID NO：235之VH；或SEQ ID NO：237之VL及SEQ ID NO：239之VH；或SEQ ID NO：241之VL及SEQ ID NO：243之VH；或SEQ ID NO：245之VL及SEQ ID NO：247之VH；或SEQ ID NO： 249之VL及SEQ ID NO：251之VH；或SEQ ID NO：253之VL及SEQ ID NO：255之VH；或SEQ ID NO：257之VL及SEQ ID NO：259之VH；或SEQ ID NO：261之VL及SEQ ID NO：263之VH；或SEQ ID NO：265之VL及SEQ ID NO：267之VH；或SEQ ID NO：269之VL及SEQ ID NO：271之VH；或SEQ ID NO：273之VL及SEQ ID NO：275之VH；或SEQ ID NO：277之VL及SEQ ID NO：279之VH；或SEQ ID NO：281之VL及SEQ ID NO：283之VH；或SEQ ID NO：285之VL及SEQ ID NO：287之VH；或SEQ ID NO：289之VL及SEQ ID NO：291之VH；或SEQ ID NO：293之VL及SEQ ID NO：295之VH；或SEQ ID NO：297之VL及SEQ ID NO：299之VH；或SEQ ID NO：301之VL及SEQ ID NO：303之VH；或SEQ ID NO：305之VL及SEQ ID NO：307之VH；或SEQ ID NO：309之VL及SEQ ID NO：311之VH；或SEQ ID NO：313之VL及SEQ ID NO：315之VH；或SEQ ID NO：317之VL及SEQ ID NO：319之VH；或SEQ ID NO：321之VL及SEQ ID NO：323之VH；或SEQ ID NO：325之VL及SEQ ID NO：327之VH；或SEQ ID NO：329之VL及SEQ ID NO：331之VH；或SEQ ID NO：333之VL及SEQ ID NO：335之VH；或SEQ ID NO：337之VL及SEQ ID NO：339之VH；或SEQ ID NO：341之VL及SEQ ID NO：343之VH；或SEQ ID NO：345之VL及SEQ ID NO：347之VH；或SEQ ID NO：349之VL及SEQ ID NO：351之VH；或SEQ ID NO：353之VL及SEQ ID NO：355之VH；或SEQ ID NO：357之VL及SEQ ID NO：359之VH；或SEQ ID NO：361之VL及SEQ ID NO：363之VH；或SEQ ID NO：365之VL及SEQ ID NO：367之VH；或SEQ ID NO：369之VL及SEQ ID NO：371之VH；或SEQ ID NO：373之VL及SEQ ID NO：375之VH；或SEQ ID NO：377之VL及SEQ ID NO：379之VH；或SEQ ID NO：381之VL及SEQ ID NO：383之VH；或SEQ ID NO：385之VL及SEQ ID NO：387之VH；或SEQ ID NO：389之VL及SEQ ID NO：391之VH；或 SEQ ID NO：393之VL及SEQ ID NO：395之VH；或SEQ ID NO：397之VL及SEQ ID NO：399之VH；或SEQ ID NO：401之VL及SEQ ID NO：403之VH；或SEQ ID NO：405之VL及SEQ ID NO：407之VH。
出於本申請案之目的，每一具體抗體之SEQ ID NO係連續奇數。因此，單株抗DLL3抗體SC16.3包含分別針對輕鏈及重鏈可變區之胺基酸SEQ ID NO：21及23；SC16.4包含SEQ ID NO：25及27；SC16.5包含SEQ ID NO：29及31等。每一抗體胺基酸序列之相應核酸序列包括在隨附序列表中且其SEQ ID NO緊接在相應胺基酸SEQ ID NO之前。因此，例如，SC16.3抗體之VL及VH之SEQ ID NO分別為21及23，且編碼SC16.3抗體之VL及VH之核酸序列之SEQ ID NO分別為SEQ ID NO：20及22。圖1A及1B中之CDR係根據Kabat等人(上文文獻)使用Abysis數據庫之專有版本來定義。
實例3 嵌合及人類化抗DLL3抗體之生成
為提供與本發明相容之人類化結合結構域之基準，使用業內公認技術如下生成嵌合抗DLL3抗體。自雜交瘤提取總RNA且如實例1中所述進行擴增。自所衍生核酸序列獲得關於鼠類抗體之VH及VL鏈之V、D及J基因區段之數據。使用以下限制性位點設計特異性針對抗體VH及VL鏈之前導序列之引子集合：AgeI及XhoI用於VH片段，且XmaI及DraIII用於VL片段。使用QIAquick PCR純化套組(Qiagen)純化PCR產物，然後用針對VH片段之限制酶AgeI及XhoI及針對VL片段之XmaI及DraIII消化。將VL及VH經消化之PCR產物純化且分別連接至κ CL(SEQ ID NO：5)人類輕鏈恆定區表現載體或IgG1(SEQ ID NO：6)人類重鏈恆定區表現載體中。
在含有200U T4-DNA連接酶(New England Biolabs)、7.5μL經消化且純化之基因特異性PCR產物及25ng線性化載體DNA之10μL總體 積中實施連接反應。經由在42℃下用3μL連接產物熱震來轉變勝任大腸桿菌DH10B細菌(Life Technologies)，且以100μg/mL之濃度平鋪於胺苄青黴素(ampicillin)板上。純化並消化所擴增連接產物後，將VH片段選殖至pEE6.4HuIgG1表現載體(Lonza)之AgeI-XhoI限制性位點中，且將VL片段選殖至pEE12.4Hu-κ表現載體(Lonza Ltd.)之XmaI-DraIII限制性位點中。
藉由用pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ表現載體共轉染HEK-293T細胞來表現嵌合抗體。在轉染之前，將HEK-293T細胞培養於150mm板中之標準條件下之補充有10%熱不活化FCS、100μg/mL鏈黴素及100U/mL青黴素G的達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)中。為進行瞬時轉染，使細胞生長至80%鋪滿。將12.5μg pEE6.4HuIgG1及pEE12.4Hu-κ載體DNA各自添加至1.5mL Opti-MEM中之50μL HEK-293T轉染試劑中。在室溫下將混合物培育30分鐘且平鋪。在轉染後3至6天收穫上清液。藉由在800×g下離心10分鐘自細胞碎片澄清含有重組嵌合抗體之培養物上清液且儲存在4℃下。使用蛋白質A親和層析純化重組嵌合抗體。
亦使用相同的鼠類抗DLL3抗體(例如SC16.13、SC16.15、SC16.25、SC16.34及SC16.56)來衍生CDR移植或人類化結合結構域。使用專有電腦輔助CDR移植方法(Abysis數據庫，UCL Business)及標準分子改造技術如下人類化鼠類抗體。基於框架序列與人類種系抗體序列之CDR經典結構之間以及框架序列與相關小鼠抗體之CDR之間的最高同源性設計可變區之人類框架區。出於分析之目的，根據Kabat等人將胺基酸指配至每一CDR結構域。在選擇可變區後，其立即自合成基因區段生成(Integrated DNA Technologies)。使用上文針對嵌合抗體闡述之分子方法來選殖及表現人類化抗體。
對於每一人類化抗體，所選人類受體可變區之遺傳組成緊接顯 示於下表6中。表6中所繪示之序列對應於以下各項中所述之鄰接可變區序列：SEQ ID NO：389及391(hSC16.13)、SEQ ID NO：393及395(hSC16.15)、SEQ ID NO：397及399(hSC16.25)、SEQ ID NO：401及403(hSC16.34)以及SEQ ID NO：405及407(hSC16.56)。表6顯示無需框架變化或回復突變來維持所選抗體之有利結合性質。
儘管在框架區中無殘基發生改變，但將一個人類化純系(hSC16.13)突變引入重鏈CDR2中以解決穩定性問題。檢查具有經修飾CDR之抗體之結合親和力以確保其等效於相應的嵌合或鼠類抗體。
在人類化後，分析所得VL及VH鏈胺基酸序列以確定其與鼠類供體及人類受體輕鏈及重鏈可變區之同源性。緊接顯示於下表7中之結果揭露，人類化構築體一致地展現與人類受體序列之同源性高於與鼠類供體序列之同源性。鼠類重鏈及輕鏈可變區顯示與人類化抗體及供體雜交瘤蛋白質序列之同源性(74%-83%)相比，相似的與人類種系基因最接近匹配之總體同源性百分比(85%-93%)。
表7
對於嵌合抗體，將人類化VL及VH經消化之PCR產物純化且分別連接至κ CL(SEQ ID NO：5)人類輕鏈恆定區表現載體或IgG1(SEQ ID NO：6)人類重鏈恆定區表現載體中。在表現後，使用表面電漿共振分析每一所衍生人類化構築體，以確定CDR移植過程是否已顯著改變其對DLL3蛋白之表觀親和力。比較人類化構築體與包含鼠類親代(或供體)重鏈及輕鏈可變結構域及實質上等效於人類化構築體中所用之人類恆定區的嵌合抗體。人類化抗DLL3抗體展現與嵌合親代抗體所顯示之結合特徵大致相當之結合特徵(數據未顯示)。
實例4 位點特異性抗體之生成
構築包含原初輕鏈(LC)恆定區及重鏈(HC)恆定區之經改造人類IgG1/κ抗DLL3位點特異性抗體，其中HC之上游鉸鏈區中與LC中之半胱胺酸214(C214)形成鏈間二硫鍵之半胱胺酸220(C220)經絲胺酸取代(C220S)。在組裝時，HC及LC形成包含適於結合至治療劑之兩個游離半胱胺酸之抗體。除非另外註明，否則恆定區殘基之所有編號皆係 根據如Kabat等人中所述之EU編號方案來進行。
如下生成經改造抗體。使用編碼全長人類化抗DLL3抗體hSC16.56之表現載體作為模板用於PCR擴增及定點誘變。定點誘變係使用Quick-change®系統(Agilent Technologies)根據製造商之說明書來實施。
在CHO-S細胞中使用原初全長κ輕鏈共轉染編碼hSC16.56之突變體C220S重鏈之載體且使用哺乳動物瞬時表現系統來表現。含有C220S突變體之經改造抗DLL3位點特異性抗體稱為hSC16.56ss1(SEQ ID NO：8及9)。在表現後，立即藉由SDS-PAGE來表徵經改造抗DLL3抗體以確認已生成正確的突變體。在諸如DTT(二硫蘇糖醇)等還原劑存在及不存在下在來自life technologies之預澆注10% Tris-甘胺酸微型凝膠上實施SDS-PAGE。在電泳後，使用膠質考馬斯(Coomassie)溶液對凝膠進行染色。在還原條件下，觀察到對應於游離LC及游離HC之兩個條帶(數據未顯示)。此圖案係還原條件下之典型IgG分子。在非還原條件下，條帶圖案不同於天然IgG分子，此指示在HC與LC之間不存在二硫鍵。觀察到對應於HC-HC二聚體之約98kD之條帶。另外，觀察到對應於游離LC之模糊條帶及對應於LC-LC二聚體之約48kD之主要條帶。預期一定量之LC-LC種類之形成歸因於每一LC C末端之游離半胱胺酸。
實例5 抗DLL3抗體之結構域及表位映射
為表徵及定位所揭示抗DLL3抗體所結合之表位，使用Cochran等人，2004(上文文獻)所述方案之修改來實施結構域層級表位映射。在酵母之表面上表現DLL3之包含特定胺基酸序列之個別結構域，且經由流式細胞術測定每一抗DLL3抗體之結合。
產生酵母展示質體構築體用於表現以下構築體：DLL3細胞外結 構域(胺基酸27-466)；DLL1-DLL3嵌合體，其係由融合至DLL3之EGF樣結構域1至6(胺基酸220-466)之DLL1之N末端區域及DSL結構域(胺基酸22-225)組成；DLL3-DLL1嵌合體，其係由融合至DLL1之EGF樣結構域1至8(胺基酸222-518)之DLL3之N末端區域及DSL結構域(胺基酸27-214)組成；EGF1(胺基酸215-249)；EGF2(胺基酸274-310)；EGF1及EGF2(胺基酸215-310)；EGF3(胺基酸312-351)；EGF4(胺基酸353-389)；EGF5(胺基酸391-427)；及EGF6(胺基酸429-465)。關於結構域資訊通常參見UniProtKB/Swiss-Prot數據庫進入Q9NYJ7。應注意，胺基酸編號參照含有納入SEQ ID NO.1中所述之序列中之前導序列的未經處理之DLL3蛋白。對於N末端區域或EGF結構域整體之分析，使用含有家族成員DLL1之嵌合體(DLL1-DLL3及DLL3-DLL1)而非片段以最小化蛋白質摺疊之潛在問題。先前已顯示，結構域定位之抗體不與DLL1交叉反應，此指示與該等構築體之任何結合係經由與構築體之DLL3部分締合來進行。將該等質體轉變至酵母中，然後該等質體如Cochran等人中所述生長及誘導。
為測試與具體構築體之結合，於PBS+1mg/mL BSA(PBSA)中將200,000個經誘導表現期望構築體之酵母細胞洗滌兩次，且在50μL PBSA中與0.1μg/mL生物素化抗HA純系3F10(Roche Diagnostics)及50nM經純化抗體或所培養雜交瘤之未經純化上清液之1：2稀釋物一起培育7天。在冰上將細胞培育90分鐘，然後於PBSA中洗滌兩次。然後在50μL PBSA中將細胞與適宜二級抗體一起培育：對於鼠類抗體，各自以1μg/mL添加Alexa 488結合之鏈黴抗生物素蛋白及Alexa 647結合之山羊抗小鼠抗體(Life Technologies)；且對於人類化或嵌合抗體，各自以1μg/mL添加Alexa 647結合之鏈黴抗生物素蛋白(Life Technologies)及R-藻紅素結合之山羊抗人類抗體(Jackson Immunoresearch)。在冰上培育20分鐘後，用PBSA將細胞洗滌兩次且 在FACS Canto II上分析。結合至DLL3-DLL1嵌合體之抗體指示為與N末端區域+DSL結合。特異性結合至存在於具體EGF樣結構域上之表位之抗體指示為與其各別結構域結合(圖2)。
為將表位分類為構象表位(例如，不連續)或線性表位，在80℃下將展示DLL3 ECD之酵母熱處理30分鐘以使DLL3 ECD變性，且然後在冰冷PBSA中洗滌兩次。藉由FACS使用與上文所述相同之染色方案來測試抗DLL3抗體結合變性酵母之能力。結合至變性及天然酵母二者之抗體分類為與線性表位結合，而結合天然酵母但不結合變性酵母之抗體分類為構象特異性表位。
所測試抗體之結構域層級表位映射數據之示意性匯總呈現於圖2中，其中結合線性表位之抗體加下劃線，倘若確定則相應倉以括號註明。圖2之綜述顯示大部分抗DLL3抗體往往映射至在DLL3或EGF2之N末端/DSL區中發現之表位。圖2以表形式呈現關於多種抗DLL3抗體之倉測定及結構域映射之類似數據。
使用兩種方法中之一者對所選抗體進一步實施精細表位映射。第一種方法採用根據製造商之說明書使用之Ph.D.-12噬菌體展示肽文庫套組(New England Biolabs)。將用於表位映射之抗體以3mL 0.1M碳酸氫鈉溶液(pH 8)中之50μg/mL包覆至Nunc MaxiSorp管中(Nunc)過夜。用碳酸氫鈉溶液中之3% BSA溶液封阻管。然後，允許PBS+0.1% Tween-20中之1011個輸入噬菌體結合，然後用0.1% Tween-20連續洗滌10次以洗掉非結合噬菌體。在室溫下在溫和攪動下用1mL 0.2M甘胺酸將剩餘噬菌體溶析10分鐘，然後用150μL 1M Tris-HCl(pH 9)中和。將所溶析噬菌體擴增且再用1011個輸入噬菌體在洗滌步驟期間使用0.5% Tween-20淘選以增加選擇嚴格性。使用Qiaprep M13 Spin套組(Qiagen)分離第二輪所溶析噬菌體之24個溶菌斑之DNA並測序。使用ELISA分析確認純系噬菌體之結合，其中將所映射抗體或對照抗 體塗覆於ELISA板上、封阻且暴露於每一噬菌體純系下。使用辣根過氧化物酶結合之抗M13抗體(GE Healthcare)及1步Turbo TMB ELISA溶液(Pierce)來檢測噬菌體結合。使用載體NTI(Life Technologies)針對抗原ECD肽序列比對特異性結合噬菌體之噬菌體肽序列以確定結合表位。
或者，使用酵母展示方法(Chao等人，2007,PMID：17406305)來映射所選抗體之表位。利用易錯PCR使用核苷酸類似物8-側氧基-2’去氧鳥苷-5’-三磷酸及2’-去氧-對-核苷-5’三磷酸(TriLink Bio)針對一個胺基酸突變/純系之靶誘變速率來生成DLL3 ECD突變體文庫。將該等文庫轉變至酵母展示格式中。使用上文針對結構域層級映射闡述之技術，在50nM下針對HA及抗體結合對文庫進行染色。使用FACS Aria(BD)，分選與野生型DLL3 ECD相比展現結合損失之純系。使該等純系再生長並經受另一輪針對與靶抗體之結合損失之FACS分選。使用Zymoprep酵母質體Miniprep套組(Zymo Research)，分離個別ECD純系並測序。若需要，使用Quikchange定點誘變套組(Agilent)將突變重新格式化為單一突變體ECD純系。
隨後篩選個別ECD純系以確定結合損失是否歸因於表位突變或引起錯誤摺疊之突變。因錯誤摺疊突變之可能性較大，自動丟棄涉及半胱胺酸、脯胺酸及終止密碼子之突變。然後針對與非競爭性構象特異性抗體之結合篩選剩餘ECD純系。推斷出失去與至非競爭性構象特異性抗體之結合之ECD純系含有錯誤摺疊突變，而推斷出保留與野生型DLL3 ECD之等效結合之ECD純系正確摺疊。推斷出後一組ECD純系中之突變處於表位中。
其衍生表位包含參與抗體結合之胺基酸殘基之所選抗體的匯總列示於下表8中。抗體SC16.34及SC16.56與常見胺基酸殘基相互作用，此與圖2中所顯示之分倉資訊及結構域映射結果一致。此外，發 現SC16.23與不同的鄰接表位相互作用且發現不與SC16.34或SC16.56分倉。應注意，出於隨附序列表之目的，SEQ ID NO：4包含位置204處之佔位胺基酸。
實例6 抗DLL3抗體與吡咯并苯并二氮呯(PBD)之結合
使人類化抗DLL3抗體(hSC16.56)及人類化位點特異性抗DLL3抗體(hSC16.56ss1)經由具有游離硫氫基之末端馬來醯亞胺基部分結合至吡咯并苯并二氮呯藥物連接體(分別為DL1及DL6，各自包含PBD1)以產生ADC，稱為hSC16.56DL1及hSC16.56ss1DL6。在如其欲用於臨床試驗中之GMP條件下製造hSC16.56PDL1(即，SC16LD6.5)及hSC16.56ss1DL6。
以兩個不同階段：還原步驟及結合步驟製備人類化DLL3(hSC16.56)抗體藥物結合物(ADC)，以使PBD1(DL1)結合至hSC16.56。然後經由陽離子交換(CEX)層析、隨後藉由滲濾及調配步驟來處理ADC以產生原料藥。該製程詳細闡述於下文中。
藉由添加200mM Tris鹼、32mM EDTA(pH 8.5)將抗體調節至pH 7.5。然後在20℃下，藉由預定莫耳濃度添加mol參(2-羧基乙基)-膦(TCEP)/mol抗體將pH經調節之DLL3抗體之半胱胺酸鍵部分還原90min.。然後在20℃下經最短30分鐘，使所得部分還原製劑經由馬來醯亞胺連接體結合至PBD1(如上文所述)。然後藉由添加與使用於水中製備之10mM原液之連接體-藥物相比過量之N-乙醯基半胱胺酸(NAC) 來驟冷反應物。在20分鐘之最短驟冷時間後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至5.5。然後經由陽離子交換(CEX)層析以結合及溶析模式利用階段溶析(step elution)來處理ADC製劑，以移除在結合步驟期間形成之聚集物。然後藉由滲濾使用30kDa膜將CEX純化之ADC緩衝液交換至滲濾緩衝液中。然後用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾之抗DLL3 ADC調配至靶最終濃度以產生原料藥。
使用經修改之部分還原製程使位點特異性人類化抗DLL3(hSC16.56ss1)ADC結合至DL6。就此而言，期望產物係在每一LC恆定區上之未配對半胱胺酸(C214)上最大結合且最小化藥物對抗體比率(DAR)大於2(DAR>2)之ADC、同時最大化DAR為2(DAR=2)之ADC的ADC。為進一步改良結合之特異性，在與連接體-藥物結合之前使用包含穩定劑(例如L-精胺酸)及溫和還原劑(例如麩胱甘肽)之製程選擇性還原抗體。然後經由製備型疏水相互作用層析(HIC)、隨後藉由滲濾及調配來處理步驟ADC以產生原料藥。該製程詳細闡述於下文中。
在室溫下，在含有1M L-精胺酸/5mM EDTA及預定濃度之還原麩胱甘肽(GSH)之緩衝液(pH 8.0)中，將位點特異性抗體構築體部分還原最少2小時。然後使用30kDa膜將所有製劑緩衝液交換至20mM Tris/3.2mM EDTA pH 7.0緩衝液中以移除還原緩衝液。然後在20℃下經最短30min.，使所得部分還原製劑經由馬來醯亞胺連接體結合至PBD1(如上文所述之DL6)。然後藉由添加與使用於水中製備之10mM原液之連接體-藥物相比過量之NAC來驟冷反應物。在20分鐘之最短驟冷時間後，藉由添加0.5M乙酸將pH調節至6.0。然後經由製備型疏水相互作用層析(HIC)(Butyl Sepharose FF)以結合及溶析模式利用階段溶析來處理pH經調節之ADC以進一步純化DAR 2種類。然後藉由滲濾使用30kDa膜將經純化ADC緩衝液交換至滲濾緩衝液中。然後用蔗糖及聚山梨醇酯-20將經滲濾之抗DLL3 ADC調配至靶最終濃度以產生 位點特異性原料藥。
實例7 免疫組織化學
對原代人類腫瘤組織切片實施免疫組織化學(IHC)以評價DLL3在腫瘤細胞中之表現及位置。
為鑑別IHC相容性抗DLL3抗體，使用多種本發明抗DLL3抗體對HEK293T親代細胞糰粒或表現DLL3之HEK293T細胞糰粒實施IHC。若干鼠類抗DLL3抗體(包括SC16.65)能夠比所測試之其他本發明抗DLL3抗體更有效地特異性檢測過表現DLL3之HEK293T細胞糰粒(數據未顯示)。該等抗體特異性檢測DLL3之能力係藉由競爭實驗來確認，其中將相關抗DLL3抗體與5×莫耳比過量之hDLL3-His蛋白混合，且然後與表現DLL3之HEK293T福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)切片一起培育。陽性染色之不存在展示hDLL3-His蛋白干擾抗DLL3抗體與過表現DLL3之HEK293T細胞之結合(數據未顯示)。
如下文所述對福馬林固定及石蠟包埋(FFPE)組織實施IHC，如同業內標準。將組織之平面切片切割且安裝於玻璃顯微鏡載玻片上。在二甲苯去石蠟化後，在99℃下用抗原修復溶液(Dako)將5μm切片預處理20min.，冷卻至75℃，且然後用PBS中之0.3%過氧化氫、隨後用抗生物素蛋白/生物素封阻溶液(Vector Laboratories)處理。然後用PBS緩衝液中之3% BSA中之10%馬血清封阻FFPE載玻片，且在室溫下與於3% BSA/PBS中稀釋至10μg/ml之本發明一級抗DLL3抗體一起培育30min.。然後在室溫下將FFPE載玻片與於3% BSA/PBS中稀釋至2.5μg/ml之生物素結合之馬抗小鼠抗體(Vector Laboratories)一起培育30min.，隨後在鏈黴抗生物素蛋白-HRP(ABC Elite套組；Vector Laboratories)中培育。然後遵循製造商之說明書根據TSA擴增套組(TSA擴增套組；Perkin Elmer)，將原代人類腫瘤之FFPE載玻片在生 物素基酪胺中培育，隨後在鏈黴抗生物素蛋白-HRP中培育。在室溫下用3,3’-二胺基聯苯胺(Thermo Scientific)研發出5min.發色檢測且用邁爾氏蘇木素(Meyer’s hematoxylin，IHC World)複染組織，用醇洗滌且浸沒於二甲苯中。PDX腫瘤不接受TSA擴增。然後藉由亮視野顯微術來觀察切片且藉由H-評分註明腫瘤上皮上之DLL3膜表現。H-評分係藉由下式來獲得：3×強染色膜表面百分比+2×中等染色膜表面百分比+弱染色膜表面百分比，給出0至300之範圍。研究結果顯示於圖3A及3B中。
圖3A及3B以圖表形式繪示侷限期對擴散期SCLC腫瘤中(圖3A)或未經處理及化療難治性SCLC腫瘤中之DLL3蛋白之表現對總存活率(OS)。圖3A之檢查顯示，DLL3表現並不指示總存活率(在經先前技術標準護理藥劑治療之患者中)且侷限期SCLC腫瘤及擴散期SCLC腫瘤二者表現不同量之DLL3。與黑色素瘤不同，倘若DLL3表現與患者存活率負相關，則展現神經內分泌特徵之腫瘤中之DLL3表現似乎並不指示與標準護理療法相關之死亡率。類似地，圖3B展示DLL3表現量在未經處理及經標準護理治療之腫瘤二者中大致相同。圖3B進一步顯示300點量表上憑經驗衍生之DLL3 H-評分為約90(虛線)及180(實線)。亦衍生出介於90與180之間之其他DLL3 H-評分(例如，120)(未顯示)。該等H-評分係根據實例8中所述之I期試驗來檢查且發現指示可對本發明DLL3 ADC之治療具有有利反應之患者。因此，在一個實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少90之DLL3 H-評分。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少120之DLL3 H-評分。在其他實施例中，欲使用本發明DLL3 ADC治療之患者將具有至少150之DLL3 H-評分且更佳將具有至少180之DLL3 H-評分。出於本發明之目的，展現90或更大之DLL3 H-評分之任何腫瘤(或如上文所論述，其中10%之組成細胞表現DLL3)應視 為DLL3+且可潛在地使用所揭示化合物及組合物來治療。
應注意，在其他研究中，亦研發出使用200點量表之H-評分。在該等200 H-評分量表中，120之H-評分大致等效於300 H-評分量表上180之H-評分。在兩種情形(例如，120/200或180/300)下，該等H-評分可分類為生物標記物陽性(BM+)或DLL3+(即，其皆大於300點量表上90之H-評分及/或10%之組成細胞表現DLL3)且暗示可對本發明治療方法具有有利反應之患者。
實例8 SC16.56PBD1(SC16LD6.5)研究概述及結果
實施I期臨床研究以探究使用所揭示之DLL3靶向ADC來治療患有復發性小細胞肺癌(SCLC)及大細胞神經內分泌癌(LCNEC)之患者之可能性。臨床試驗之匯總提供於圖4A中。
背景：瑞伐匹珠單抗泰斯潤(即本文所述之Rova-T、SC16LD6.5、hSC16.56PBD1或hSC16.56DL1)係δ樣蛋白質3(DLL3)靶向抗體-藥物結合物(ADC)，其包含人類化單株抗體、二肽連接體及吡咯并苯并二氮呯(PBD)二聚體毒素且藥物對抗體比率為2。SC16LD6.5實質上可如實例6中所述在GMP條件下製備。DLL3在人類神經內分泌腫瘤及其腫瘤起始細胞(包括約2/3之SCLC及LCNEC腫瘤)中高表現。DLL3蛋白在正常組織中不以可檢測量表現。在表現DLL3之SCLC及LCNEC患者源性異種移植物(PDX)腫瘤模型中，瑞伐匹珠單抗泰斯潤在誘導腫瘤消退及延後惡化時間方面顯著優於順鉑/依託泊苷。基於此有希望的活性，在患有復發性SCLC之患者中開始首次用於人類之I期試驗(NCT01901653)且初步結果報告於下文中。
方法：在1-3個患者隊列中，使在1次或2次先前多線療法後患有進行性疾病之SCLC患者(即，第二或第三線患者)每3週一次(Q3W)接受遞增劑量之瑞伐匹珠單抗泰斯潤作為單一藥劑直至觀察到劑量限制 性毒性(DLT)。劑量為0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg及0.8mg/kg Q3W。在中途經由應計數，藥物動力學數據(圖4B及如下文實例9中更詳細論述)揭露長於約11天之預期ADC半衰期，此促進Q6W時間表之評估。如先前實例中所述，研發出DLL3抗體且用於評價歸檔腫瘤樣本中之抗原表現。出於此研究之目的，生物標記物陽性(BM+)腫瘤係藉由IHC膜相關H-評分120(在200 H-評分量表上)來定義。
結果：治療79個患者：34個Q3W及45個Q6W；33F/46M；中值年齡為61歲(44-81)。分別在0.8mg/kg及0.4mg/kg Q3W下觀察到血小板減少症及漿膜腔積液(根據包含多個專家之數據監測委員會，在I期試驗中由研究者錯誤註解為毛細血管滲漏症候群「CLS」)之急性及慢性DLT。在擴展隊列中進一步評估0.2mg/kg Q3W×3個週期及0.3mg/kg Q6W×2個週期之最大耐受劑量(MTD)。在所有患者中最常見(20%)之治療中出現之任一級AE係疲勞(47%)、呼吸困難(24%)、噁心(24%)及食欲下降(22%)。最常見相關治療中出現之SAE係分別在11(14%)及3(4%)患者中報告之漿膜腔積液及血小板減少症(圖4F)。
在接受自入選患者之49個歸檔腫瘤樣本中，34個(69%)為DLL3 BM+。在27個確認以MTD治療之DLL3 BM+患者中，11個患者(41%)具有部分反應(PR)且12個患者(44%)達成穩定疾病(SD)，組合臨床受益率(CBR)為85%(圖4E)。在以MTD治療而不考慮DLL3生物標記物狀況之所有可評估患者(n=59)中，ORR為20%(n=12 PR)且SD 59%(n=35)，CBR為80%(圖4D)。應注意，以MTD治療之具有PR之所有患者及具有最耐久臨床益處(高達569天OS)之彼等為BM+。在對第一線療法具有敏感性及難治性之患者中及當前不存在標準護理之第三線環境中觀察到相似反應速率。
有趣的是，儘管於ADC下之總暴露相似，但當與0.2mg/kg Q3W×3隊列相比時，0.3mg/kg Q6W×2顯示優異的反應持續時間(圖4C)，分別為平均>175天對88天。圖4C進一步顯示相同的0.3mg/kg Q6W×2隊列具有優於0.2mg/kg Q3W×3隊列之平均OS。
結論：在患有復發性DLL3 BM+ SCLC之第二線及第三線患者中作為單一藥劑，首創DLL3靶向ADC瑞伐匹珠單抗泰斯潤(Rova-T)具有可管控毒性且展示顯著抗腫瘤活性(41% ORR及80% CBR)。
實例9 SC16.56PBD1(SC16LD6.5)藥物動力學
如先前實例中所提及，在上文所述之1a/1b期臨床試驗中評價SC16LD6.5之藥物動力學(PK)。在向患有SCLC或LCNEC之患者投與預定劑量之SC16LD6.5後評價人類血清中SC16LD6.5之濃度。在進入研究中之所有個體即將第一次投用SC16LD6.5之前及第1天之多個時間點(第1天為輸注日)，自該等個體收集血液樣本用於血清含量。在第1週期之第2天、第3天、第5天、第8天及第15天各自再抽取一次血液用於血清量測。在第2及第3週期，在第1天即將輸注前(谷)及輸注後(峰)不久採集血液。在所估計穩態(週期4)或其附近，在第1天、第8天及第15天再收集樣本。在收集血液後，將樣本處理成血清且冷凍。
在mesoscale發現(MSD)平臺上在酶聯免疫吸附分析(ELISA)中利用化學發光檢測來量測SC16LD6.5之血清濃度。此分析採用特異性捕獲並檢測含有一或多種結合毒素之SC16LD6.5之一對抗特發性抗體。此分析無法區分SC16LD6.5上之毒素結合物數量。基於該等所量測濃度生成濃度-時間曲線(圖4B)。
基於SC16LD6.5之血清濃度，藉由非分室分析使用軟體包Phoenix WinNonlin來估計SC16LD6.5之PK。PK與暴露劑量按比例增加成線性關係。藉由濃度-時間曲線末期之對數線性迴歸來估計末端半衰期以確定末端速率係數(λ)。計算2之天然對數與λ之商以估計末 端半衰期。在每3週投與0.2mg/kg SC16LD6.5後，SC16LD6.5之末端半衰期經估計為約10.1天，且在每6週投與0.3mg/kg SC16LD6.5後為約12.1天。此估計的半衰期超過其他抗體-藥物結合物(例如貝倫妥單抗維多汀及阿多-曲妥珠單抗艾坦辛)之半衰期。該意外長之半衰期允許使用新穎投藥方案(例如，0.2mg/kg Q3W×3及0.3mg/kg Q6W×2)達成穩健的治療指數。
實例10 抗DLL3 ADC凍乾
為提供長期儲存及後續商業活動之選擇，將本發明之實例性DLL3-ADC凍乾。然後使用儲存在醫藥相容性小瓶中之凍乾樣本來實施穩定性研究以測定該技術對包含PBD之ADC之適用性。由於PBD藥物連接體結合物較大且相對疏水，故提供展現長期穩定性之該等凍乾組合物之能力尚不清楚。
對於此研究，以10mg/mL SC16LD6.5、175mM蔗糖、20mM L-組胺酸鹽酸鹽(pH 6.0)及0.4mg/mL聚山梨醇酯20調配SC16LD6.5抗體-藥物結合物製劑(實質上如上文實例6中所述製備)。選擇此實例性調配物之原因在於，其適於在<-70℃之預期條件下以凍乾液體形式長期儲存用於I/II期臨床試驗且在適宜條件下以凍乾形式潛在地穩定。使用相同調配物研發出意欲儲存在冷藏條件(2℃-8℃)下之凍乾劑型(30mg/小瓶，約3mL於10mL玻璃小瓶中)用於後期臨床試驗及潛在商業應用。
凍乾製程及條件係使用研發規模凍乾機衍生而來。該製程包括以下步驟：冷凍斜坡、冷凍保持、初級乾燥及二級乾燥。使用此製程，在意欲製造臨床材料之設備中製造一批凍乾小瓶。在凍乾後，將含有粉末狀DLL3-ADC之加塞小瓶於不同溫度(5℃、25℃及40℃)下儲存延長時段。在預定時間下，將所選小瓶重構且分析所得調配物與起 始調配物之任何材料偏差。關於高達6個月之時間點之分析之結果顯示於圖5A-5C中。
數據之綜述展示，凍乾ADC在任一所選溫度下顯示極少降解。因此，展示以研發規模製造之凍乾小瓶在實時、應力及加速儲存條件下穩定。
實例11 抗DLL3 ADC及抗PD-1抗體之組合抑制活體內小細胞肺癌腫瘤生長
如上文所論述，本發明之DLL3 ADC可與抗PD-1抗體組合來有效地治療各種DLL3表現腫瘤。為證實本發明之治療能力，在小細胞肺癌(SCLC)之同基因活體內模型中測試hSC16.56DL1(Rova-T)與抑制PD-1與其配體PDL1之相互作用之抗PD-1抗體的組合。
Rova-T係如本申請案中所展示已在臨床環境中顯示針對SCLC之活性之DLL3特異性抗體-藥物結合物。阻斷主要在活化T細胞上表現之PD-1與其配體PD-L1及PD-L2之間之相互作用的針對PD-1之抗體已顯示在多種癌症適應症中之臨床效用。當前，抗PD-1抗體藥物Opdivo®(尼沃魯單抗)及Keytruda®(派姆單抗)經批准用於某些患有黑色素瘤、非小細胞肺癌(NSCLC)、頭頸部鱗狀細胞癌及霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)之患者，但亦已在患有SCLC之患者之子集中展示一定活性。為確定Rova-T及抗PD-1抗體在組合使用時是否具有抑制、中性、加和或協同效應，在SCLC動物模型中測試其作為單一藥劑及呈組合形式之活性。
由於抗PD-1抗體之作用機制需要免疫活性宿主，故表現DLL3之小鼠細胞系KP1係與免疫相容性同基因小鼠結合使用。KP1細胞系衍生自在缺少RB1及TP53基因之小鼠之肺中發現之自發小細胞肺癌腫瘤(PMID：21983857)。由於Rova-T能夠以針對DLL3表現細胞之相當親和力及活體外細胞毒性活性結合人類及鼠類DLL3蛋白，故該藥物可 用於小鼠模型中。但尼沃魯單抗及派姆單抗皆不足以與鼠類PD-1相互作用，故選擇抗小鼠PD-1替代性抗體純系。就此而言，已顯示，來自BioLegend(San Diego,USA)之抗小鼠PD-1抗體純系EH12.2H7抑制PD-1與PD-L1之間之相互作用，其類似於臨床環境中所用之抗人類抗體，且模擬其T細胞增強及抗癌活性。
KP1細胞係以皮下腫瘤形式生長於B6129SF1/J小鼠(The Jackson Laboratory編號101043,USA)之側腹中。使用卡尺每週兩次量測腫瘤體積。當平均腫瘤體積為約200mm3時，將小鼠隨機化至各自5隻小鼠之隊列中。藉由腹膜內注射，使用SC16LD6.5(「Rova-T」，0.1mg/kg，僅在第1天治療)或HuIgG1.DL1(「HuIgG1.PBD」，0.5mg/kg，僅在第1天治療)來治療小鼠，且亦使用抗小鼠PD-1抗體(「抗PD-1」，200μg/小鼠，在第1天、第3天、第7天治療；BioLegend,USA)或大鼠IgG2a抗體(「大鼠IgG2a」，200μg/小鼠，在第1天、第3天、第7天治療；BioLegend,USA)來治療相同小鼠。繼續每週兩次量測腫瘤體積，且當腫瘤體積超過1500mm3時對小鼠實施安樂死。研究結果顯示於附圖6A及6B中。
如圖6A中所顯示，抗PD-1抗體及HuIgG1.PBD對照之組合並不顯著抑制KP1腫瘤生長。類似地，大鼠IgG2a(用於抗PD-1之同型對照)與HuIgG1.PBD對照或Rova-T之組合實質上無法經顯著時間抑制活體內KP1腫瘤之生長(圖6A)。儘管延遲並不廣泛但應瞭解，在該等劑量下，基本上作為單一藥劑起作用之Rova-T表觀上顯示腫瘤生長之一定抑制。
同樣，如圖6B中所顯示，對照治療HuIgG1.PBD+大鼠IgG2a及HuIgG1.PBD+抗PD-1之組合實質上並不延長KP1腫瘤體積生長超過300mm3前之時間。此外，在圖6B所顯示之劑量下，與使用HuIgG1.PBD治療相比，Rova-T+同型對照(大鼠IgG2a)組合並不顯著 抑制KP1腫瘤生長。儘管基本上作為唯一活性劑起作用之Rova-T(hSC16.56DL1)在0.5mg/kg之劑量下完全消除KP1腫瘤(數據未顯示)，但0.1mg/kg之相對較低劑量顯示針對此腫瘤細胞系之極小效應。
與對照組合明顯不同，與單獨使用兩種活性劑之治療相比，使用Rova-T及抗PD-1抗體組合之治療產生活體內KP1腫瘤生長之顯著抑制(圖6A及6B)。如圖6A及圖6B二者中所顯示，嚴重延遲平均腫瘤生長。儘管來自組合對照治療組之所有小鼠在17天後具有大於300mm3之腫瘤，但僅2/5(40%)之組合組小鼠具有大於300mm3之腫瘤(圖6B)。類似地，圖6A顯示，經Rova-T及抗PD-1抗體治療之小鼠之平均腫瘤體積保持在1000mm3以下，維持時間長達經Rova-T+同型對照治療之小鼠的兩倍。此外，與「HuIgG1.PBD+大鼠IgG2a」之0%、「HuIgG1.PBD+抗PD-1」之0%及「Rova-T+大鼠IgG2a」治療組之0%相比，經Rova-T+抗PD-1治療之組的中值腫瘤生長抑制%(所量測最小治療後腫瘤體積比起始腫瘤體積小之%)為69%。此腫瘤生長抑制數據明顯表明DLL3 ADC及抗PD-1抗體之組合可具有協同性。
在任一情形下，此實例中所述之數據清楚地顯示，DLL3 ADC與抗PD-1抗體之組合藉由減小腫瘤體積及促進帶有腫瘤之小鼠之長效存活來展示針對SCLC之至少加和(若非協同)效應。所觀察到之效應具有特異性且依賴Rova-T對DLL3之識別，此乃因使用同型PBD ADC與PD-1抗體之組合治療未顯示相對於媒劑對照經改良之效能。所量測效應亦至少部分地歸因於PD-1結合及抑制，此乃因同型對照Ab與Rova-T之組合並未顯示相同結果。
總之，所呈現之數據顯示，Rova-T對DLL3表現癌症之靶向細胞殺死可進一步增強免疫療法(包括包含使用PD-1及/或PD-L1抗體之免疫療法)之效應。
本文所引用之所有專利、專利申請案及公開案以及可以電子方 式獲得之材料的完整揭示內容(包括例如GenBank及RefSeq中之例如核苷酸序列提交，及例如SwissProt、PIR、PRF、PBD中之胺基酸序列提交，及GenBank及RefSeq中之註解編碼區之轉譯)皆以引用方式併入本文中。前述詳細描述及實例係僅出於清楚理解之目的給出。自此應理解無不必要限制。本發明並不限於所顯示及闡述之確切細節，此乃因熟習此項技術者所明瞭之變化形式將包括在由申請專利範圍定義之本發明中。
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<221> CDS
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<211> 354
<212> DNA
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<220>
<223> 人類化抗體序列
<220>
<221> misc_feature
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<221> CDS
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<213> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.13 CDRH2
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.13 CDRH3
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<210> 426
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.15 CDRH1
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.15 CDRH2
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.15 CDRH3
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.25 CDRH1
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.25 CDRH2
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<210> 431
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.25 CDRH3
<400> 431
<210> 432
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.34 CDRH1
<400> 432
<210> 433
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.34 CDRH2
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.34 CDRH3
<400> 434
<210> 435
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.56 CDRH1
<400> 435
<210> 436
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.56 CDRH2
<400> 436
<210> 437
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HSC16.56 CDRH3
<400> 437

Claims (78)

  1. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，該腫瘤在300點量表上展現至少90之DLL3 H-評分及/或10%陽性染色之DLL3細胞，該方法包含投與DLL3 ADC之步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中該DLL3 ADC包含選自由以下組成之群之細胞毒素：PBD、卡奇黴素(calicheamicin)、奧裡斯他汀(auristatin)、類美登素(maytansinoid)及多卡米星(duocarmycin)。
  3. 如請求項2之方法，其中該細胞毒素包含PBD。
  4. 如請求項3之方法，其中所述PBD包含PBD1。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其包含結合至表現DLL3之腫瘤起始細胞之DLL3 ADC。
  6. 如請求項1至5中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含呈嵌合、CDR移植、人類或人類化抗體之抗體或其片段。
  7. 如請求項6之方法，其中該抗體係內化抗體。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該腫瘤在300點量表上展現至少120之DLL3 H-評分。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該腫瘤在300點量表上展現至少180之DLL3 H-評分。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該腫瘤包含神經內分泌腫瘤。
  11. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該腫瘤包含小細胞肺癌(SCLC)腫瘤。
  12. 如請求項1至10中任一項之方法，其中該腫瘤包含大細胞神經內分泌癌(LCNEC)腫瘤。
  13. 如請求項1至12中任一項之方法，其中該腫瘤包含甲狀腺髓樣癌 腫瘤。
  14. 如請求項1至13中任一項之方法，其中使用包含0.2mg/kg Q3W×3投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  15. 如請求項1至13中任一項之方法，其中使用包含0.3mg/kg Q6W×2投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  16. 如請求項14或15之方法，其中該個體係在該DLL3 ADC方案後有惡化時進行治療。
  17. 如請求項14或15之方法，其中該個體在該DLL3 ADC方案後轉移成DLL3 ADC維持療法。
  18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該個體係前線患者。
  19. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該個體係第二線患者。
  20. 如請求項1至17中任一項之方法，其中該個體係第三線患者。
  21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD.5。
  22. 如請求項1至20中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  23. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含以下步驟：獲得該腫瘤之樣本；探查該腫瘤樣本以計算DLL3 H-評分及/或測定陽性染色之DLL3細胞之百分比當該所計算DLL3 H-評分在300點量表上為至少90及/或該等陽性染色之DLL3細胞佔該等腫瘤細胞之10%時，則使用DLL3 ADC治療患者。
  24. 如請求項23之方法，其中該探查步驟包含免疫組織化學。
  25. 一種凍乾組合物，其包含式Ab-[L-D]n之抗體藥物結合物(ADC)或其醫藥上可接受之鹽，其中： Ab包含抗DLL3抗體；L包含可選連接體；D包含藥物；且n係1至20之整數。
  26. 如請求項25之凍乾組合物，其中D包含PBD。
  27. 如請求項25之凍乾組合物，其進一步包含醫藥上可接受之糖。
  28. 如請求項26之凍乾組合物，其中該ADC包含SC16LD6.5。
  29. 如請求項26之凍乾組合物，其中該ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  30. 一種可用於診斷或治療DLL3相關病症之製品，其包含如請求項25之組合物。
  31. 一種用於治療癌症之方法，其包含以下步驟：重構如請求項25之凍乾組合物，以提供液體醫藥組合物；及向有需要之個體投與該液體醫藥組合物。
  32. 如請求項31之方法，其中該癌症包含展現神經內分泌特徵之腫瘤。
  33. 如請求項32之方法，其中該癌症包含神經內分泌腫瘤。
  34. 如請求項30之方法，其中該癌症包含小細胞肺癌。
  35. 如請求項30之方法，其中該癌症包含大細胞神經內分泌癌。
  36. 一種可用於診斷或治療DLL3相關病症之製品，其包含包括凍乾DLL3 ADC之貯器及指示使用該製品來治療或診斷該DLL3相關病症之說明書。
  37. 如請求項36之製品，其中該DLL3 ADC包含PBD。
  38. 一種治療患有腫瘤之個體之方法，其包含投與具有超過約6天之末端半衰期之DLL3 ADC之步驟。
  39. 如請求項38之方法，其中該DLL3 ADC具有超過約7天之末端半衰期。
  40. 如請求項38之方法，其中該DLL3 ADC具有超過約8天之末端半衰期。
  41. 如請求項38之方法，其中該DLL3 ADC具有超過約9天之末端半衰期。
  42. 如請求項38之方法，其中該DLL3 ADC具有超過約10天之末端半衰期。
  43. 如請求項38至42中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含選自由以下組成之群之細胞毒素：PBD、卡奇黴素、奧裡斯他汀、類美登素及多卡米星。
  44. 如請求項43之方法，其中該細胞毒素包含PBD。
  45. 如請求項44之方法，其中該PBD包含PBD1。
  46. 如請求項38至45中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含呈嵌合、CDR移植、人類或人類化抗體之抗體或其片段。
  47. 如請求項46之方法，其中該抗體係內化抗體。
  48. 如請求項38至45中任一項之方法，其中該腫瘤包含展現神經內分泌特徵之腫瘤。
  49. 如請求項46之方法，其中該腫瘤包含神經內分泌腫瘤。
  50. 如請求項38至47中任一項之方法，其中該腫瘤包含小細胞肺癌(SCLC)腫瘤。
  51. 如請求項38至47中任一項之方法，其中該腫瘤包含大細胞神經內分泌癌(LCNEC)腫瘤。
  52. 如請求項38至51中任一項之方法，其中使用包含0.2mg/kg Q3W投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  53. 如請求項52之方法，其中使用包含0.2mg/kg Q3W×3投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  54. 如請求項38至51中任一項之方法，其中使用包含0.3mg/kg Q6W 投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  55. 如請求項54之方法，其中使用包含0.3mg/kg Q6W×2投藥方案之DLL3 ADC方案來治療該個體。
  56. 如請求項52至55之方法，其中該個體係在該DLL3 ADC方案後有惡化時進行治療。
  57. 如請求項52至55之方法，其中該個體在該DLL3 ADC方案後轉移成DLL3 ADC維持療法。
  58. 如請求項38至57中任一項之方法，其中該個體係前線患者。
  59. 如請求項38至57中任一項之方法，其中該個體係第二線患者。
  60. 如請求項38至57中任一項之方法，其中該個體係第三線患者。
  61. 如請求項38至60中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD.5。
  62. 如請求項38至60中任一項之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  63. 一種為有需要之個體降低癌症幹細胞之頻率之方法，其包含投與具有超過約6天之末端半衰期之DLL3 ADC的步驟。
  64. 一種DLL3 ADC，其包含下式： 其中Ab包含抗DLL3抗體或其免疫反應性片段。
  65. 如請求項64之DLL3 ADC，其中該抗DLL3抗體包含位點特異性 抗體。
  66. 如請求項64之DLL3 ADC，其中該抗DLL3抗體係hSC16.56ss1。
  67. 一種為有需要之個體降低癌症幹細胞之頻率之方法，其包含投與DLL3 ADC及抗PD-1抗體之步驟。
  68. 如請求項67之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD5。
  69. 如請求項67之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  70. 一種為有需要之個體降低癌症幹細胞之頻率之方法，其包含投與DLL3 ADC及抗PD-L1抗體之步驟。
  71. 如請求項70之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD5。
  72. 如請求項70之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  73. 一種為有需要之個體治療癌症之方法，其包含投與DLL3 ADC及抗PD-1抗體之步驟。
  74. 如請求項73之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD5。
  75. 如請求項73之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
  76. 一種為有需要之個體治療癌症之方法，其包含投與DLL3 ADC及抗PD-L1抗體之步驟。
  77. 如請求項76之方法，其中該DLL3 ADC包含SC16LD5。
  78. 如請求項76之方法，其中該DLL3 ADC包含hSC16.56ss1DL6。
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