CN116217715B - 基于识别不同抗原决定簇的马铃薯y病毒单克隆抗体的组合及其应用 - Google Patents

基于识别不同抗原决定簇的马铃薯y病毒单克隆抗体的组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于识别不同抗原决定簇的马铃薯Y病毒单克隆抗体的组合及其应用，属于生物技术领域。本发明获得的单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1具有特异的CDR区，与现有报道的单克隆抗体存在显著差异；这5个单克隆抗体及其组合能够识别所有或绝大多数已报道的PVY分离物，降低了漏检的可能性；且这5个单克隆抗体不与同属的其它病毒以及不同属的病毒反应，降低了错检的可能性。因此，本发明的单克隆抗体及其组合可实现PVY的精准检测。

Description

基于识别不同抗原决定簇的马铃薯Y病毒单克隆抗体的组合 及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于识别不同抗原决定簇的马铃薯Y病毒单克隆抗体的组合及其应用。
背景技术
马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的代表种，主要侵染马铃薯、烟草、辣椒等茄科作物，严重影响作物产量和品质。PVY在马铃薯上引起花叶、叶脉坏死、植株矮化、薯块坏死环斑等症状，在烟草上引起斑驳、花叶和叶脉坏死等症状，发生严重时可导致作物减产80％。PVY可由蚜虫以非持久性方式传播，也可通过汁液摩擦传播，在马铃薯上还可通过种薯传播。及时准确地鉴定PVY，有助于了解PVY发生情况，为PVY的监测预警和综合防控提供理论依据。
漏检或错检可导致检测结果错误，不利于PVY的有效防控，严重危害作物的安全生产。PVY商业化单克隆抗体Mab1128、Mab1129和Mab1130可识别衣壳蛋白(coat protein，CP)的抗原决定簇25NLNKEK30、16RPEQGSIQSNP26和5IDAGGS10。但是，有许多PVY分离物中不包含这3个抗原决定簇，因此，利用这3个单抗进行检测会产生漏检现象。PVY多克隆抗体与马铃薯Y病毒属中其它的病毒有交叉反应，因此，利用多克隆抗体进行检测会发生错检现象。
筛选能识别新的抗原决定簇的PVY单克隆抗体，明确抗原决定簇的保守性和特异性，进而将其组合实现的病毒的精准检测，防止错检、漏检现象的发生，是保障马铃薯、辣椒等重要作物安全生产的关键。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种能够检测所有或绝大多数马铃薯Y病毒分离物的单克隆抗体组合及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一批检测马铃薯Y病毒的单克隆抗体，所述单克隆抗体为单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1中的至少一种；
所述单克隆抗体N1，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:1-3所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:4-6所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
所述单克隆抗体M1，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:7-9所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10-12所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
所述单克隆抗体M2，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:13-15所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:16-18所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
所述单克隆抗体M3，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:19-21所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:22-24所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；
所述单克隆抗体C1，其包含氨基酸序列如SEQ ID NO:25-27所示的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，和氨基酸序列如SEQ ID NO:28-30所示的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
进一步的，所述单克隆抗体N1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示；所述单克隆抗体M1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示；所述单克隆抗体M2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:36所示；所述单克隆抗体M3的重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO:37所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示；所述单克隆抗体C1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示。
进一步的，所述单克隆抗体N1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示；所述单克隆抗体M1的重链的氨基酸序列如SEQ IDNO:43所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示；所述单克隆抗体M2的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示；所述单克隆抗体M3的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示；所述单克隆抗体C1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。
优选的，所述单克隆抗体为如下(1)-(3)任一单克隆抗体组合：
(1)单克隆抗体M1和单克隆抗体M2的组合；
(2)单克隆抗体M1和单克隆抗体C1的组合；
(3)单克隆抗体M2和单克隆抗体C1的组合。
本发明的第二方面，提供单克隆抗体的编码基因，包括：
SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52所示的分别编码单克隆抗体N1重链和轻链的核苷酸序列；
SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的分别编码单克隆抗体M1重链和轻链的核苷酸序列；
SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56所示的分别编码单克隆抗体M2重链和轻链的核苷酸序列；
SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58所示的分别编码单克隆抗体M3重链和轻链的核苷酸序列；
SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60所示的分别编码单克隆抗体C1重链和轻链的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供上述单克隆抗体在如下(1)或(2)中的应用：
(1)检测马铃薯Y病毒；
(2)制备检测马铃薯Y病毒的产品。
优选的，所述检测马铃薯Y病毒的产品包括但不限于：ELISA检测试剂盒、WesternBlot检测试剂盒、胶体金检测试剂盒和化学发光免疫分析试剂盒等。
本发明的第四方面，提供一种检测马铃薯Y病毒的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒中含有上述单克隆抗体。
本发明的有益效果：
本发明获得的单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1及其组合能够识别所有或绝大多数已报道的PVY分离物，降低了漏检的可能性；且这5个单克隆抗体不与同属的其它病毒以及不同属的病毒反应，降低了错检的可能性。因此，本发明的单克隆抗体及其组合可实现PVY的精准检测。
附图说明
图1：dot-ELISA筛选识别CP不同区域的单克隆抗体(A)及鉴定单克隆抗体的抗原决定簇(B)。
图2：dot-ELISA分析单克隆抗体对不同PVY分离物的识别。
图3：比对单克隆抗体识别的抗原决定簇序列与不同马铃薯Y病毒CP氨基酸中对应的序列。
图4：分析单克隆抗体对不同病毒的特异性。
图5：比对单克隆抗体识别的抗原决定簇序列与不同马铃薯Y病毒属病毒CP氨基酸中对应的序列。
图6：dot-ELISA分析单克隆抗体的抗原灵敏度。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，PVY的漏检或错检可导致检测结果错误，不利于PVY的有效防控，严重危害作物的安全生产。对于PVY的检测而言，PVY多克隆抗体能够检测到马铃薯Y病毒属病毒中其它的病毒，因此，利用多抗进行检测会发生错检现象；PVY商业化单克隆抗体Mab1128、Mab1129和Mab1130可识别衣壳蛋白(coat protein，CP)的抗原决定簇25NLNKEK30、16RPEQGSIQSNP26和5IDAGGS10。但是，有许多PVY分离物中不包含这3个抗原决定簇，因此，利用这3个单抗进行检测会产生漏检现象。
基于此，为了防止漏检或错检现象的发生，筛选能识别新的抗原决定簇的PVY单克隆抗体，明确抗原决定簇的保守性和特异性，进而将其组合实现的病毒的精准检测，防止错检、漏检现象的发生。
本发明共获得5个单克隆抗体，即N1、M1、M2、M3和C1，其抗原决定簇分别为4TIDAGGSTK12、37GTSGTHTVP45、89QFDTWYE95、154PTLRQIM160和261LLGVKN266。截止2022年4月12日，NCBI上共有1885个完整的PVY分离物CP氨基酸序列。根据抗原决定簇分析表明，N1至少识别694个分离物，M1至少识别1853个分离物，M2至少识别1843个分离物，M3至少识别1848个分离物，C1至少识别1851个分离物；M1和M2组合可识别所有的1885个分离物，M1和C1组合可识别1883个分离物，M2和C1组合可识别1876个分离物。且这5个单克隆抗体不与同属的其它病毒以及不同属的病毒反应。因此本发明获得的单克隆抗体及其进行组合可实现PVY的精准检测。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明中所使用的PVY分离物在NCBI中登录号为X977895。PVY单克隆抗体Mab1128、Mab1129和Mab1130记载在文献Analysis of Potato virus Y Coat ProteinEpitopes Recognized by Three Commercial Monoclonal Antibodies(PLoS ONE,2014,9(12):e115766)中。
实施例1：识别不同表位的PVY单克隆抗体的制备
1.PVY粒子提取
将200g PVY侵染的马铃薯叶片、400mL 0.1M磷酸盐缓冲液(包括0.15％β-巯基乙醇，0.01M EDTA，pH＝7.2)分别加入到组织捣碎机中，搅拌10min。将匀浆液用纱布进行过滤，去除不溶的植物组织。将获得的溶液4℃8000rpm离心30min，取上清液，加入1％Triton-100，4℃搅拌3h；加入6％PEG6000和1％NaCl，4℃搅拌3h。将溶液4℃8000rpm离心30min，去除上清，沉淀用40mL 0.1M磷酸盐缓冲液(含1％ Triton-100，pH＝7.2)溶解，4℃搅拌过夜。4℃8000rpm离心10min，去除沉淀。将上清液加到含30％蔗糖垫的离心管中，4℃100000g超速离心2h。所得沉淀用2mL 0.05M磷酸盐缓冲液溶解，提取得到PVY粒子。
2.小鼠免疫
将提纯的PVY粒子注射6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次间隔三周，每次注射100μL PVY粒子(25μg)。初次免疫免疫原用等体积弗氏完全佐剂乳化，第二次免疫免疫原用等体积弗氏不完全佐剂乳化，第三次免疫免疫原用等体积生理盐水混合。
3.杂交瘤细胞株制备
将BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞按10:1比例进行混合。混合细胞中加入50％PEG 4000，融合3分钟。融合的细胞用培养液洗涤一次，加入HAT细胞培养液，分装于96孔细胞培养板。7天后，利用间接法ELISA筛选阳性细胞孔。将阳性的细胞在24孔板中扩大培养。采用有限稀释法获得单克隆细胞株。
4.单克隆抗体大量制备
取6周龄BALB/c雌性小鼠，在其腹腔注射0.5mL液体石蜡，一周后，在小鼠腹腔注射106个杂交瘤细胞。注射完杂交瘤细胞一周后，根据小鼠腹腔膨大情况及时收集腹水。利用Protein G亲和层析柱纯化单克隆抗体。
5、筛选识别不同抗原决定簇的单克隆抗体
为了获得识别不同抗原决定簇的PVY单克隆抗体，我们首先构建CP的原核表达载体pEHISTEV-PVY CP(表达产物为PVY CP)。随后在pEHISTEV-PVY CP进行缺失突变，分别删除编码2-15、2-30、16-45、31-60、46-75、61-90、61-255、226-255、241-267、256-267位氨基酸的密码子序列，获得可表达缺失突变体CPΔ2-15、CPΔ2-30、CPΔ16-45、CPΔ31-60、CPΔ46-75、CPΔ61-90、CPΔ61-255、CPΔ226-255、CPΔ241-267、CPΔ256-267的质粒。pEHISTEV-GFP为阴性对照，可表达GFP。
将纯化得到的单克隆抗体分别与PVY CP及其突变体进行dot-ELISA。dot-ELISA的方法如下：
PVY侵染的马铃薯样品用PBS缓冲液按照1：40(重量比)进行稀释，取2μL稀释后的蛋白样品滴于硝酸纤维素膜(NC膜)上，于室温下晾干。将NC膜放入10mL封闭缓冲液中，室温摇床封闭2h或4℃封闭过夜。冲掉NC膜的封闭缓冲液，放入10mL含有纯化得到的单克隆抗体(一抗)的由TBST配制的脱脂奶粉中，室温摇床孵育1h或4℃冰箱孵育一夜，10mL TBST洗膜10min，重复3次。将NC膜放入10mL含有辣根过氧化物标记的山羊抗小鼠IgG(Sigma-Aldrich)二抗的TBST配制的缓冲液中，室温摇床孵育1h；10mL TBST洗膜10min，重复2次，第3次用TBS洗膜10min。显色液加入到NC膜，放置于化学发光仪上显色、拍照。
根据单克隆抗体识别的突变体，筛选出识别不同区域的5个单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1。其中，N1不与CPΔ2-15和CPΔ2-30反应；M1不与CPΔ16-45和CPΔ31-60反应；M2不与CPΔ61-90和CPΔ61-255反应、M3不与CPΔ61-255反应；C1不与CPΔ241-267和CPΔ256-267反应(图1A)。
6、5个PVY单克隆抗体抗原决定簇鉴定
根据不能反应的结果鉴定关键氨基酸，进而推出抗体识别的最小决定簇。dot-ELISA结果表明，N1识别2-15位的氨基酸，M1识别31-45位的氨基酸，M2识别61-90位的氨基酸，M3识别90-226位的氨基酸，C1识别256-267位的氨基酸。为了缩小M2和M3抗原决定簇所在区域的范围，我们进一步通过缺失突变分析，将M2抗原决定簇锁定在85-98位氨基酸，M3抗原决定簇锁定在151-165位氨基酸。
为了鉴定单克隆抗体N1所识别PVY CP抗原决定簇的具体氨基酸位点，我们进一步在pEHISTEV-PVY CP第2-14位氨基酸进行删除突变，获得可表达缺失突变体CPΔ2、CPΔ2-3、CPΔ2-4、CPΔ2-5、CPΔ2-6、CPΔ2-7、CPΔ9-14、CPΔ10-14、CPΔ11-14、CPΔ12-14、CPΔ13-14、CPΔ14的质粒。
将N1对上述突变体进行dot-ELISA，结果发现N1与CPΔ2-3、CPΔ13-14有反应，与CPΔ2-4、CPΔ2-5、CPΔ11-14和CPΔ12-14有微弱反应，不与CPΔ2-6、CPΔ2-7、CPΔ9-14、CPΔ10-14反应(图1B)，表明N1识别的抗原决定簇为PVY CP第4-12位氨基酸TIDAGGSTK。
根据其余4个抗体识别的氨基酸范围，分别构建类似删除突变质粒。dot-ELISA结果发现，单克隆抗体M1与CPΔ31-36有反应，与CPΔ44-45、CPΔ45有微弱反应，与CPΔ31-37、CPΔ31-38、CPΔ38-45、CPΔ39-45、CPΔ40-45、CPΔ41-45、CPΔ42-45、CPΔ43-45无反应(图1B)，表明M1识别的抗原决定簇为PVY CP第37-45位氨基酸GTSGTHTVP。
单克隆抗体M2与CPΔ85-88、CPΔ96-98有反应，CPΔ85-89有微弱反应，与CPΔ85-90、CPΔ85-91、CPΔ85-92、CPΔ85-93、CPΔ93-98、CPΔ94-98、CPΔ95-98无反应(图1B)，表明M2所识别的抗原决定簇为PVY CP第89-95位氨基酸QFDTWYE。
单克隆抗体M3与CPΔ151-153、CPΔ161-165有反应，与CPΔ151-154、CPΔ151-155、CPΔ160-165有微弱反应，与CPΔ151-156、CPΔ151-157、CPΔ151-158、CPΔ158-165、CPΔ159-165无反应(图1B)，表明M3所识别的抗原决定簇为PVY CP第154-160位氨基酸PTLRQIM。
单克隆抗体C1与CPΔ256-260、CPΔ267有反应，与CPΔ266-267反应强度下降，而与CPΔ256-261、CPΔ256-262、CPΔ256-263、CPΔ263-267、CPΔ264-267、CPΔ265-267无反应(图1B)，表明C1所识别的抗原决定簇为PVY CP第261-266位氨基酸LLGVKN。
7、5个PVY单克隆抗体亚型及效价鉴定：
MAb N1、M1、M2、M3和C1这五种单克隆抗体的亚型和亚类分别鉴定为IgG1、IgG1、IgG1、IgG1和IgG2b，轻链均为kappa(表1)。5种单克隆抗体经间接ELISA检测效价均可达1:243000(表1)。
表1：单克隆抗体亚型及效价
实施例2：MAbs N1、M1、M2、M3和C1检测MAb1128、MAb1129和MAb1130不能识别的PVY分离物CP
我们合成了10个PVY分离物CP序列，它们均不含有MAb1128、MAb1129和MAb1130识别的抗原决定簇。10个PVY分离物在NCBI中的编号分别为CAA66472、CAA48304、ABY78978、CAA48306、CAA94183、AAL35616、ABQ53158、CAE51190、CAA32356、CAA48302、CAA94184。
dot-ELISA结果表明，N1不能识别分离物PVY1、PVY2、PVY5、PVY6，M1、M2和M3均可以识别这10个分离物，C1不能识别分离物PVY8(图2)。
进一步序列分析发现，10个PVY分离物CP序列均不含有N1识别的抗原决定簇序列，均含有M1和M2识别的抗原决定簇序列，除PVY5以外的9个分离物CP序列均含有M3识别的抗原决定簇序列，除PVY8以外的9个分离物CP序列均含有C1识别的抗原决定簇序列(图3)。这些结果表明M1、M2、M3和C1可识别全部或大多数MAb1128、MAb1129和MAb1130不能识别的分离物。
实施例3：PVY单克隆抗体的特异性分析
对实施例1筛选得到的5个单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1进行特异性分析。
具体如下：
我们将这5个单抗分别利用点杂交检测芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus，TuMV；genus Potyvirus),烟草脉带花叶病毒(tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV；genus Potyvirus),马铃薯X病毒(potato virus X，PVX；genus Potexvirus),烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV；genus Tobamovirus)，番茄花叶病毒(tomatomosaic virus，ToMV；genus Tobamovirus),番茄斑驳花叶病毒(tomato mottle mosaicvirus，ToMMV；genus Tobamovirus)和番茄褐色皱果病毒(tomato brown rugose fruitvirus，ToBRFV；genus Tobamovirus)，以及辣椒环斑病毒(chilli ringspot virus，ChiRSV；genus Potyvirus)，辣椒斑驳病毒(pepper mottle virus，PepMoV；genusPotyvirus)，马铃薯A病毒(potato virus A，PVA；genus Potyvirus),辣椒脉斑驳病毒(pepper veinal mottle virus，PVMV；genus Potyvirus)、烟草脉斑驳病毒(tobacco veinmottling virus，TVMV；genus Potyvirus)，马铃薯M病毒(potato virus M，PVM；genusCarlavirus)和马铃薯S病毒(potato virus S，PVS；genus Carlavirus)原核表达CP。
点杂交结果显示，这5个单抗只能识别PVY，不与其他14个病毒或CP发生交叉反应，具有较高特异性(图4A)。Western blot和ELISA也进一步证明了这5个单抗的特异性(图4B和4C)。序列分析这8个马铃薯Y病毒属病毒的CP序列发现，5个单抗抗原决定簇序列与其它7个病毒对应的序列不存在100％的一致率(图5)。这些结果表明，这5个单抗特异性识别PVYCP上抗原决定簇序列。
实施例4：PVY单克隆抗体的灵敏度分析
对实施例1筛选得到的5个单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1，分别采用dot-ELISA进行灵敏度分析。
我们首先稀释了PVY侵染的病汁液。随后进行dot-ELISA，方法同实施例1。结果显示：N1可以检测到稀释10240倍的病汁液；M1可以检测到稀释5120倍的病汁液；M2可以检测到稀释640倍的病汁液；M3可以检测到稀释5120倍的病汁液；C1可以检测到稀释5120倍的病汁液(图6)。
实施例5：PVY单克隆抗体对不同PVY分离物的覆盖率分析
截止2022年4月12日，NCBI上共有1885个完整的PVY分离物CP氨基酸序列。。通过序列分析发现含有N1识别的抗原决定簇序列TIDAGGSTK的分离物有694个，含有M1识别的抗原决定簇序列GTSGTHTVP的分离物有1853个，含有M2识别的抗原决定簇序列QFDTWYE的分离物有1843个，含有M3识别的抗原决定簇序列PTLRQIM的分离物有1848个，含有C1识别的抗原决定簇序列LLGVKN的分离物有1851个。单克隆抗体M1、M2、M3和C1可以检测的PVY分离物比MAb1130能检测的分离物分别多11.35％、10.82％、11.09％和11.25％(表2)。
表2单克隆抗体对不同PVY分离物的覆盖情况
单克隆抗体M3识别的抗原决定簇(PTLRQIM)在PVY5分离物CP中对应的序列为PSLRQIM，在TVMV和PVA CP中对应的序列也是PSLRQIM。虽然在实施例2和实施例3的分析中，M3能识别PVY5，而不能识别TVMV和PVA。但我们认为M3不是最优的抗体，在优选PVY单克隆抗体组合时不予考虑。另外单克隆N1识别的分离物较少，也不予考虑。我们将1885个PVY分离物按1-1885进行编号，通过其抗原决定簇分析发现，单克隆抗体M1、M2和C1不能识别的PVY分离物分别有32个、42个和34个，具体分离物编号见(表3)。通过分析不含MAb M1、M2或C1所识别抗原决定簇的PVY分离物编号发现，单克隆抗体M1和M2组合可识别所有的1885个PVY分离物，单克隆抗体M1和C1组合可识别除1107(NCBI中登录号AMW64585.1)和1344(AYA57928.1)号之外的1883个PVY分离物，而单克隆抗体M2和C1组合可识别除380(AEF59038.1)、381(AEF59039.1)、788(AGX27987.1)、789(AGX27988.1)、790(AGX27989.1)、991(AIL50122.1)、992(AIL50123.1)、993(AIL50124.1)和994(AIL50125.1)号的1876个PVY分离物(表3)。
表3：单克隆抗体M1、M2和C1不能识别的分离物编号
注：表中加粗斜体的编号是单克隆抗体M1和C1组合不能识别的PVY分离物编号。仅加粗的是M2和C1组合不能识别的PVY分离物编号。
实施例6：PVY单克隆抗体的序列和结构分析
对实施例1筛选得到的5个单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1作进一步的序列和结构分析，其中：
上述单克隆抗体均包括：重链(Heavy Chain)和轻链(Light Chain)，具体如下：
单克隆抗体N1重链氨基酸序列：
注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
单克隆抗体N1轻链氨基酸序列：
注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
编码单克隆抗体N1重链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为重链可变区的编码序列。
编码单克隆抗体N1轻链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。
单克隆抗体M1重链氨基酸序列：
注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
单克隆抗体M1轻链氨基酸序列：
注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
编码单克隆抗体M1重链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为重链可变区的编码序列。
编码单克隆抗体M1轻链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。
单克隆抗体M2重链氨基酸序列：
注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
单克隆抗体M2轻链氨基酸序列：
注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
编码单克隆抗体M2重链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为重链可变区的编码序列。
编码单克隆抗体M2轻链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。
单克隆抗体M3重链氨基酸序列：
注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
单克隆抗体M3轻链氨基酸序列：
注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
编码单克隆抗体M3重链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为重链可变区的编码序列。
编码单克隆抗体M3轻链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。
单克隆抗体C1重链氨基酸序列：
注：阴影区域为重链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3。
单克隆抗体C1轻链氨基酸序列：
注：阴影区域为轻链可变区；斜体加粗下划线区域为CDR(互补决定簇)区，按顺序分别为VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3。
编码单克隆抗体C1重链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为重链可变区的编码序列。
编码单克隆抗体C1轻链的核苷酸序列如下：
注：阴影区域为轻链可变区的编码序列。
本发明获得的单克隆抗体N1、M1、M2、M3和C1具有特异的CDR区，与现有报道的单克隆抗体存在显著差异；这5个单克隆抗体及其组合能够识别所有或绝大多数已报道的PVY分离物，降低了漏检的可能性；且这5个单克隆抗体不与同属的其它病毒以及不同属的病毒反应，降低了错检的可能性。因此，本发明的单克隆抗体及其组合可实现PVY的精准检测。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测马铃薯Y病毒的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为单克隆抗体M1；所述单克隆抗体M1的重链CDR分别如SEQ ID NO: 7-9所示；轻链CDR分别如SEQ ID NO:10-12所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体M1的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体M1的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示，轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示。
4.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体的编码基因。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括：SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:54所示的分别编码单克隆抗体M1重链和轻链的核苷酸序列。
6.一种检测马铃薯Y病毒的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体组合包括：权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体M1和单克隆抗体M2；
所述单克隆抗体M2的重链CDR分别如SEQ ID NO: 13-15所示；轻链CDR分别如SEQ IDNO:16-18所示。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体组合，其特征在于，所述单克隆抗体M2的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示。
8.权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体或者权利要求6或7所述的单克隆抗体组合在如下（1）或（2）中的应用：
（1）检测马铃薯Y病毒；
（2）制备检测马铃薯Y病毒的产品。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测马铃薯Y病毒的产品包括：ELISA检测试剂盒、Western Blot检测试剂盒、胶体金检测试剂盒和化学发光免疫分析试剂盒。
10.一种检测检测马铃薯Y病毒的ELISA试剂盒，其特征在于，所述ELISA试剂盒中含有权利要求6或7所述的单克隆抗体组合。
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