TW201643195A - 對細胞內致癌基因產物的單株抗原結合蛋白 - Google Patents

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陶 達歐
成 劉
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Abstract

本案揭示了對HLA-A2限制性Ras胜肽有專一性的抗原結合蛋白。該抗原結合蛋白涵蓋呈種種形式的抗體,包含全長抗體、實質上完整的抗體、Fab片段、F(ab')2片段、與單鏈Fv片段。本案所揭示的內容亦思量融合蛋白質(諸如與免疫球蛋白或T細胞受體功能域融合的scFv)與併入針對各胜肽的抗原結合區域之專一性的雙專一性抗體。此外,本案所揭示的內容亦涵蓋免疫結合物,其可包含抗體以及與之連接的放射性同位素、螢光或其他可偵測的標記、細胞毒素、或其他分子。在其他事物外,免疫結合物可用於遞送藥劑以誘發治療性功效或以促進免疫效應功能。

Description

對細胞內致癌基因產物的單株抗原結合蛋白 相關申請案的交互參照
本申請案主張於2015年3月20日提申的U.S.臨時申請案第62/136,117號的利益,其特此以其整體以引用方式納入。
序列表
本申請案含有序列表,其係於2015年3月18日創建;該檔案為ASCII格式,被命名為3314061AWO_ST25.txt且大小係77.8千位元組。該檔案特此以其整體以引用方式納入本申請案中。
本文所揭示的內容大體上係關於涉及免疫功能的抗原結合蛋白分子。更具體言之,本文所揭示的內容係關於對Ras蛋白質有結合專一性的重組抗體、嵌合性抗原受體與其片段或部分。
抗體越來越常被用作為對抗癌症、自體免疫疾病與感染的治療劑。咸已基於治療性抗體之包含以下者的多種作用機制而利用其等:1) 藉透過ADCC或CDC指引的裸抗體之腫瘤細胞滅殺(例如曲妥珠單抗(trastuzumab))、2)封阻或刺激細胞膜分子以誘發細胞死亡(例如西妥昔單抗(cetuximab))、3)中和被分泌的部分(例如貝伐珠單抗(bevacizumab))、4)透過所接附的部分(諸如藥物、毒素、放射性同位素)滅殺與5)透過T細胞效應功能調節免疫系統。
在幾乎所有的例子中,為了產生治療性益處,抗體必須擁有某種特性,包含對其等所瞄準的抗原的高親和性、最小的急性與長期副作用、與在特定的應用中對人類Fc受體的高親和性(4)。此外,所瞄準的抗原必須在腫瘤中表現但不在正常組織上表現(專一性或選擇性),在患者中間與在患者裡面的特定腫瘤中被一貫地表現(低異質性),且應對癌症細胞之存活而言是必要的或不太可能被下調。
Ras係人類癌症中最重要的致癌基因,而此係因為其在一些最致命的癌症(包含肺症、胰臟癌、結腸與直腸癌、以及許多其他者)中突變且涉及該等癌症。Ras蛋白質係小型的GTP酶,其在轉導調節細胞生長、分化與存活的訊號中扮演中心角色。所有哺乳類動物細胞皆表現3種密切相關的Ras蛋白質(K-Ras、N-Ras與H-Ras),而其等當密碼子12、13或61發生突變時會促進腫瘤形成。K-Ras突變以遠較高的頻率在癌症中被觀察到且與>30%的所有人類癌症(在胰臟癌中高達90%)聯結且係在人類癌症中找到的首先被鑑認的且最常見的致癌基因之一。因為Ras在所有正常細胞中被表現,所以安全且有效的藥物必須只對經突變的Ras蛋白質形式有選擇性。然而,因為與癌症聯結的突變體Ras與所有人類細胞中找到的正常Ras蛋白質極為類似(突變體的差異僅在單個胺基酸)且因為Ras 之致癌功能並非在傳統觀念上可被小型分子瞄準的經突變酵素,所以迄今在製作對Ras蛋白質有選擇性的藥物方面有困難。FDA尚未核准任何針對Ras的藥物用於人類。因此,對於可醫療成千上萬患有Ras聯結性癌症與白血病的患者的藥物仍有重要且未滿足的需求。
治療性單株抗體(mAb)係高度專一性且有效力的藥物,其等能夠起使對腫瘤細胞的免疫攻擊。mAb之免疫效應功能包含抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)、抗體依賴性細胞性吞噬作用(ADCP)與目標細胞之直接滅殺。此外,mAb係高度多功能的治療劑。其等可與放射活性同位素、毒素、或藥物、或如此藥物之載劑結合(直接結合或藉由多步驟靶定之方法結合)以將更有效力的治療專一性地遞送至癌症細胞。此外,mAb亦可被設計成嵌合性抗原受體(CAR)或雙專一性T細胞接合形式(bispecific T cell engager form,T-BiTE),其帶有對抗被mAb瞄準的癌症細胞的強大T細胞細胞毒性。可接附細胞介素或其他促發炎性藥劑。目前在USA市面上販售的所有治療性mAb皆瞄準細胞外或細胞表面分子,然而許多重要的致癌基因與疾病目標係在細胞內。
然而,不像跨越細胞膜的小分子藥物,mAb無法跨越細胞膜以接近細胞內蛋白質(例如Ras)且因此靶向細胞表面抗原的傳統基於抗體的策略是無法利用的。作為替代,瞄準Ras的免疫治療方法已聚焦於產生對抗由第I型與第II型MHC兩者呈現在腫瘤細胞上的衍生自Ras的胜肽抗原決定基的T細胞反應。雖然初步的結果暗示衍生自Ras突變的抗原決定基可為用於對抗廣大範圍的人類癌症的T細胞免疫治療的癌症專一性目標,衍生自Ras突變的胜肽疫苗已在患有胰臟癌與其他癌症的患者中於臨 床試驗中評估,但並未觀察到臨床效力。
據此,對有效地瞄準細胞內致癌蛋白質的免疫治療劑(包含抗體)仍有需求。
本文所揭示的內容係基於Ras專一結合性蛋白質分子之鑑認,該分子之胺基酸序列可被用於產生種種抗原結合蛋白,例如對Ras或對具有單一胺基酸取代的Ras突變體胜肽變體有專一性的抗體。
本文所揭示的內容鑑認能夠瞄準細胞溶質性/細胞內蛋白質(例如Ras致癌蛋白質)的抗原結合蛋白(諸如抗體)並界定其特徵。所揭示的抗體瞄準胜肽/MHC複合體,因為其典型會在Ras蛋白質之抗原加工與由細胞呈現後出現在該細胞之表面上。在該方面,該抗體模擬T細胞受體,而此係因為該抗體具有以MHC限制性方式(即,當一胜肽與MHC抗原結合時)專一性辨識一胜肽並與之結合的能力。胜肽/MHC複合體重現該抗原,因為其典型會在Ras蛋白質之抗原加工與呈現給T細胞後出現在該細胞之表面上。
本文所揭示的抗體專一性地辨識Ras胜肽/HLA-A2複合體(特別是Ras/HLA-A0201複合體)並與之結合。被本文所揭示的內容之抗原結合蛋白辨識成一HLA-胜肽複合體之一部份的胜肽之實例包含(但不限於)該等於表11中顯示者,例如)具有胺基酸序列KLVVVGAVGV的胜肽(Ras10-G12V;SEQ ID NO:111)。
因此,在一個方面,本文所揭示的內容係關於一種經分離的 抗體或其抗原結合片段/部分,其在具有胺基酸序列KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)的胜肽與MHC抗原(諸如HLA-A2)結合時與該胜肽結合。
因此,在另一個方面,本文所揭示的內容係關於一種重組抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,包含以下者之一:(A)抗原結合區域,其具有SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、或88之一者的胺基酸序列;(B)抗原結合區域,其包含分別具有選自SEQ ID NO:7與9;17與19;27與29;37與39;47與49;57與59;67與69;與77與79的胺基酸序列的VH與VL;或(C)抗原結合區域,其包含:(i)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、與SEQ ID NO:6的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:3的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(ii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、與SEQ ID NO:16的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、與SEQ ID NO:13的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(iii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、與SEQ ID NO:26的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、與SEQ ID NO:23的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3; (iv)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、與SEQ ID NO:36的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、與SEQ ID NO:33的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(v)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、與SEQ ID NO:46的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、與SEQ ID NO:43的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vi)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、與SEQ ID NO:56的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、與SEQ ID NO:53的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、與SEQ ID NO:66的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、與SEQ ID NO:63的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;或(viii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、與SEQ ID NO:76的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、與SEQ ID NO:73的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3。
在一個相關的方面,本文所揭示的內容係關於一種重組抗原結合蛋白或其抗原結合片段,其中該抗原結合蛋白係抗體或嵌合性抗原受 體(CAR),其與和HLA2結合的Ras胜肽專一性結合。該重組抗體係全長抗體(其係完整的或實質上完整的抗體)、Fab片段、F(ab)2片段或單鏈可變片段(scFv)、或包含此等元件。
在該重組抗原結合蛋白中(不管是抗體或CAR),其抗原結合區域與HLA-2/Ras胜肽複合體之抗原決定基專一性結合。
本文所揭示的內容之抗原結合蛋白與含有被預測是HLA-A2之最小抗原決定基的普遍ras密碼子12突變的一組十聚體與九聚體胜肽結合。該十聚體係基於ras野生型之胺基酸5-14,KLVVVGAGGV(SEQ ID NO:110),而該九聚體對應於ras野生型之胺基酸6-14,LVVVGAGGV(SEQ ID NO:115)。
被本文所揭示的內容之抗原結合蛋白辨識為HLA-Ras胜肽複合體之一部份的胜肽包含(但不限於)具有胺基酸序列LVVVGAGGV的9個胺基酸的胜肽(Ras9-WT,SEQ ID NO:115);與其單胺基酸取代物:LVVVGAVGV(Ras9-G12V,SEQ ID NO:116);與LVVVGACGV(Ras9-G12C,SEQ ID NO:117);與LVVVGADGV(Ras9-G12D,SEQ ID NO:118)以及具有胺基酸序列KLVVVGAGGV的10個胺基酸的胜肽(Ras10-WT,SEQ ID NO:110);與其單胺基酸取代物:KLVVVGAVGV(Ras10-G12V,SEQ ID NO:111);KLVVVGACGV(Ras10-G12C,SEQ ID NO:112);與KLVVVGADGV(Ras10-G12D,SEQ ID NO:113)與KLVVVGASGV(R10-G12S,SEQ ID NO:114)。在一些具體態樣中,該胜肽係與為HLA-A2的HLA抗原聯結而被辨識。
在又另一個方面,本文所揭示的內容之重組抗原結合蛋白係 包含選自由SEQ ID NOS:81、82、83、84、85、86、87與88所組成的群組的胺基酸序列的scFv。
在一些具體態樣中,該抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分與具有SEQ ID NO:111之胺基酸序列的胜肽以範圍在8.0至10nM(在一些具體態樣中範圍在8.5至9.5nM且在一些具體態樣中範圍在9.76至9.25nM)的親和性結合。
在一個相關的方面,該重組抗原結合蛋白係包含如表1-8之任一者中揭示的抗原結合區域或雙專一性抗體(例如如表10中顯示者)的融合蛋白質。
在其他方面,本文所揭示的內容係關於包含為如本文所揭示的抗原結合蛋白或其抗原結合片段的第一組份的免疫結合物。該免疫結合物包含為細胞毒素、可偵測的標籤、放射性同位素、治療劑、具有第二胺基酸序列的結合性蛋白質或分子的第二組份。在該第二組份為結合性蛋白質或第二抗體的情況下,該結合性蛋白質或第二抗體對與該HLA-胜肽複合體不同的目標具有結合專一性。
在一個相關的方面,本文所揭示的內容係關於雙專一性抗體,其包含含有如本文描述的抗原結合蛋白或其功能性片段的雙專一性T細胞接合性抗體。
在另一個相關的方面,本文所揭示的內容係關於一種與放射性核素結合的抗原結合蛋白,其用於放射性免疫治療(RIT)以將細胞毒性輻射遞送至目標細胞。
在一個相關的方面,本文所揭示的內容係關於編碼本文所揭 示的內容之抗原結合蛋白的核酸、包含編碼該抗原結合蛋白(包含CAR構築體)的核酸載體/遺傳構築體與細胞與包含如本文描述被導入T細胞中的抗原結合蛋白或功能性片段的CAR T細胞抗體。
在又其他的方面,本文所揭示的內容係關於一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分之用途,該蛋白質或其片段/部分與在野生型Ras胜肽,KLVVVGAGGV(SEQ ID NO:110,胺基酸5-14)或LVVVGAGGV(SEQ ID NO:115,胺基酸6-14)之變體內的抗原決定基專一性結合,該變體於位置12具有單胺基酸取代,其係用於鑑認及/或滅殺帶有與MHC抗原(諸如HLA-A2)結合被展現在細胞表面上的RAS突變體胜肽的細胞。
圖1A-D顯示藉由RAS G12衍生性胜肽的HLA-A2分子之穩定化。將T2細胞(TAP-,HLA-A0201+)在以10μg/ml人類β 2m(b2M,Sigma,聖路易,MO,USA)補充的無FCS RPMI培養基中以1 x 106個細胞/ml於37℃培養過夜,該培養係在以下者之存在或不存在下:RAS10-WT(上面的圖)、RAS10-G12V(中間的圖)、RAS10-G12C(下面的圖)胜肽(圖1A),RAS10-G12D(上面的圖)、或的衍生自B型肝炎病毒(HBV)的對照組胜肽(下面的圖)(圖1B)。該等胜肽與HLA-A2分子間的結合係藉由以與FITC結合的小鼠抗HLA-A2 mAb染色T2細胞來測量。紅色的線顯示對單獨T2細胞的BB7染色。藍色、綠色與橘色的線顯示對分別以50、10與2μg/ml的胜肽脈衝的T2細胞的BB7染色。淺藍色、紫色與淺棕色的線顯示對分別以50、10與2μg/ml的胜肽脈衝的T2細胞的同型對照組(小鼠 IgG2b)染色。深棕色的線顯示對單獨T2細胞的同型染色。類似地,胜肽與HLA-A2間的結合係藉由對以以下者脈衝的T2細胞的BB7染色來測量:RAS9-WT(上面的圖)、RAS9-G12V(中間的圖)、RAS9-G12C(下面的圖)(圖1C)、RAS9-G12D(上面的圖)或對照組HBV(下面的圖)(圖1D)。紅色的線:單獨T2細胞。藍色、綠色與橘色的線:分別為50、10與2μg/ml的胜肽。同型對照組未顯示任何與T2細胞的結合且因此未於圖中顯示。
圖2A2B顯示RAS-G12突變體胜肽誘發性T細胞反應。將來自健康HLA-A0201陽性捐贈者的T細胞以RAS10胜肽WT、G12V、G12C或G12D(在X軸上顯示)刺激5回合(A)。類似地,將T細胞以RAS9胜肽G12V、G12C或G12D刺激3回合(B圖上圖)或5回合(B圖下圖)。當以右邊的圖例所顯示的個別胜肽或對照組挑戰時,胜肽專一性T細胞反應係藉由IFN-g ELISPOT分析測量。
圖3A-G顯示mAb與RAS10-G12V胜肽/HLA A2複合體間的結合。將50μg/ml的RAS 10-WT、RAS10-G12V、G12-C或G12D胜肽脈衝輸送至T2細胞上(參見以上圖1)。mAb與胜肽/HLA-A2複合體間的結合係藉由以與APC結合的mAb直接染色來測量或藉由以mAb接著以次級山羊抗人類IgG1/FITC mAb間接染色來測量。mAb之結合係在FACScalibur(Becton Dickenson)上藉由流動式細胞測量術測量並使用FlowJo 9.6.3軟體分析。同時,將細胞以抗HLA-A2 mAb(BB7.2)染色以測量該胜肽穩定化在細胞表面上的HLA-A2分子的能力。(A)藉由間接染色的mAb #2、4或7及同型對照組與以所指出的胜肽脈衝的T2細胞間的結合。(B)使用與APC結合的mAb的直接染色,包含BB7與同型對照組抗體。(C)mAb #2、4或 7與以於所指出的各種位置經丙胺酸取代的胜肽脈衝的T2細胞間的結合。在此例子中,於所指出的位置(該胜肽之位置#9-13)以丙胺酸取代WT胺基酸以探測抗體結合之位置。(D)藉由間接染色的mAb #2與10或1μg/ml的RAS10-G12S或RAS10-A11G胜肽間的結合,包含BB7與同型對照組抗體。(E)於間接染色中mAb#2與各種RAS10-G12衍生性突變體胜肽及CT和MTH胜肽間的結合。在此例子中,於所指出的位置(胜肽位置#8-13)以丙胺酸取代WT胺基酸以探測抗體結合之位置。(F)測量藉由以上胜肽的抗體與T2細胞。在此例子中,於所指出的胜肽之位置#8-13以丙胺酸取代WT胺基酸以確認與HLA分子的結合。(G)透過Ras 10胜肽的T2穩定化係藉由以BB7 mAb染色T2細胞同時測量。在此例子中,於所指出的位置(胜肽之位置#8-13)以丙胺酸取代WT胺基酸以確認與HLA分子的結合。同型對照組並未顯示任何結合且因此未於圖中顯示。
圖4A4B顯示Mab與RAS 9聚體胜肽/HLA A2複合體間的結合。將50μg/ml的RAS9WT或G12V胜肽脈衝輸送至T2細胞上。mAb與該胜肽/HLA-A2複合體間的結合係藉由間接(A)或以與APC結合的mAb間接染色(B)來測量。同時,將細胞以抗HLA-A2 mAb(BB7.2)染色以測量該胜肽與HLA-A2分子間的相對結合。
圖5A-C顯示衍生自RAS mAb的BiTE與胜肽/HLA-A2複合體及T細胞間的結合。將T2細胞以RAS10-WT或RAS10-G12V胜肽脈衝,並將其以所指出的濃度的BiTE接著以次級小鼠抗myc mAb/FITC染色(A)。MFI:上面的圖為RAS-G12V而下面的圖為RAS10-WT。(BC)同時,將使用泛T細胞分離套組(Miltenyi Biotec)藉由負性免疫磁性細胞分離自健 康的捐贈者純化的CD3 T細胞以所指出的濃度的BiTE #2、上面的圖#4下面的圖(B)或#7(C)並接著以次級小鼠抗myc mAb/FITC染色。
圖6顯示在RAS mAb之存在下由新鮮PBMC介導的ADCC。將以胜肽脈衝(50μg/ml,2hr)的T2細胞以50:1的E:T比率在mAb #2、7或同型對照組之存在或不存在下以人類PBMC培養4-5hr。滅殺係藉由標準51Cr釋放分析測量。各數據點係三重複培養之平均。
圖7顯示透過T細胞的T-BiTE介導性滅殺。將以胜肽脈衝(50μg/ml,2hr)的T2細胞以30:1的E:T比率在T-BiTE #2、7或同型對照組之存在或不存在下以經純化人類休眠T細胞培養4-5hr。T細胞滅殺係藉由51Cr釋放分析測量。各數據點係三重複培養之平均。
圖8顯示胜肽/HLA-A0201複合體之洗提曲線。將未經純化的樣本裝載並以1管柱體積洗提。第一個峰(其由錯誤折疊的聚集體組成)在裝載後於約110.63mL洗提出。對應於正確折疊的MHC複合體的峰於216.18mL觀察到。最後,由自由B2M組成的峰係在275.12mL觀察到。
圖9顯示Ras噬菌體抗體殖系FACS結合分析之結果。殖系#2與K-Ras10 G12V(T2-014A2mut,淺綠色的線)及K-Ras9 G12V/HLAA0201(T2-014A1mut,藍色的線)專一性結合,但不會辨識空的T2細胞(T2-B2M,深綠色的線)或K-Ras WT胜肽/HLA A0201複合體(T2-0142WT,橘色的線與T2-0141WT,紅色的線)。
所有本文引用的專利案、公開案、申請案與其他文獻特此以 其等之整體併入本申請案中。
在實施本文所揭示的內容時,使用許多分子生物學、微生物學、細胞生物學、生物化學、與免疫學中的習用技術,而其等係落入技術領域之技藝中。此等技術係於(例如)以下者更詳細描述:Molecular Cloning:a Laboratory Manual第3版,J.F.Sambrook與D.W.Russell,ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001;Recombinant Antibodies for Immunotherapy,Melvyn Little,ed.Cambridge University Press 2009;"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait,ed.,1984);"Animal Cell Culture"(R.I.Freshney,ed.,1987);"Methods in Enzymology"(Academic Press,Inc.);"Current Protocols in Molecular Biology"(F.M.Ausubel等人,eds.,1987,與定期更新);"PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis等人,ed.,1994);"A Practical Guide to Molecular Cloning"(Perbal Bernard V.,1988);"Phage Display:A Laboratory Manual"(Barbas等人,2001)。此等文獻與其他文獻(包含廣為所屬技術領域中具有通常知識者已知且為其等依賴的標準方案)(包含製造商之指南)之內容特此以引用方式納入作為本文所揭示的內容之一部份。
於以下的描述中,關於術語學之用法會依照某些慣例。大體而言,本文所使用的術語係意欲被理解成與該等術語被所屬技術領域中具有通常知識者所知者一致的意義。
「抗原結合蛋白」係一種蛋白質或多肽,其包含抗原結合區域或抗原結合部分,且對其與之結合的另一個分子具有強親和性。抗原結合蛋白涵蓋抗體、抗原受體與其融合蛋白質。本文所揭示的內容之抗原結合蛋白可使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的方法重組製造。
如技術領域中已知的,術語「抗體」意指於免疫系統的背景中形成的抗原結合蛋白。用於本文,術語「抗體」包含完整的全長抗體與其中「抗原結合部分」或「抗原結合區域」被保留的任何其片段或其單鏈。天然存在的「抗體」係醣蛋白,其包含由雙硫鍵相互連結的至少二個重(H)鏈與二個輕(L)鏈。各重鏈係由重鏈可變區域(本文縮寫為VH)與重鏈恆定區域構成。重鏈恆定區域係由三個功能域(CH1、CH2與CH3)構成。各輕鏈係由輕鏈可變區域(本文縮寫為VL)與輕鏈恆定區域構成。輕鏈恆定區域係由一個功能域(CL)構成。VH與VL區域可被進一步細分成稱為互補決定區域(CDR)的高度變異性之區域,其間點綴著稱為骨架區域(FR)的較被保留的區域。各VH與VL係由從胺基端向羧基端以以下順序排列的三個CDR與四個FR構成:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈與輕鏈之可變區域含有與抗原交互作用的結合功能域。抗體之恆定區域可介導免疫球蛋白與目標組織或因子(包含免疫系統之各種細胞(例如,效應細胞)與經典補體系統之第一組份(C1q))間的結合。
用於本文,術語抗體之「抗原結合部分」或「抗原結合區域」(或單單「抗原部分」)意指抗體之賦予抗原專一性的區域或部分;抗原結合蛋白(例如抗體)之片段因此包含保留與抗原(例如,HLA-胜肽複合體)專一性結合的能力的抗體之一或多個片段。咸已顯示抗體之抗原結合性功能可由全長抗體之片段執行。術語抗體之「抗體片段」內涵蓋的抗原結合片段之實例包含Fab片段,其為由VL、VH、CL與CH1功能域組成的單價片段;F(ab)2片段,其為包含於樞紐區域由二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段;Fd片段,其由VH與CH1功能域組成;Fv片段,其由抗體之單臂之 VL與VH功能域組成;dAb片段(Ward等人,1989 Nature 341:544-546),其由VH功能域組成;與重組互補決定區域(CDR)。
此外,雖然Fv片段之兩個功能域(VL與VH)係由分開的基因編碼,其等可藉由合成性連接子使用重組方法連結,該連接子允許其等被以其中VL與VH區域配對以形成單價分子的單一蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv))的形式製造;參見(例如)Bird等人,1988 Science 242:423-426;與Huston等人,1988 Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883。如此單鏈抗體亦意欲被涵蓋在術語抗體之「抗原結合部分」內。此等抗體片段係使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的習用技術獲得,且此等片段被篩選以用於以與完整的抗體相同的方式利用。
「重組抗體」或「重組抗原結合蛋白」或「合成性抗體」一般係使用所屬技術領域中具有通常知識者已知的重組技術或胜肽合成技術生產。
正常的Ras與突變形式產生為細胞內的且因此無法被習用單株抗體(mAb)治療接近的蛋白質。因此,瞄準Ras的免疫治療方法已被聚焦於產生對抗由第I型與第II型MHC兩者展示在腫瘤細胞上的衍生自Ras的胜肽抗原決定基的T細胞反應。在HLA-A0201或其他HLA單倍數基因型之背景,各種橫跨Ras突變G12V、G12D、G12R與G12C的具有9、10、13、17或21個胺基酸(aa)的胜肽已被顯示會誘發CD4與CD8 T細胞反應兩者(ref)。一9個aa Ras-G12V胜肽,LVVVGAVGV(SEQ ID NO:117)已被顯示能夠產生細胞毒性CD8 T細胞殖系,其滅殺經IFN γ預處理的結腸癌症細胞系SW480(HLA-A0201+K-Ras-G12V突變+)。類似地,在HLA-A0201 之背景中,Ras G12VT突變衍生性胜肽KLVVVGAVGV-(10個aa,p5-14,SEQ ID NO:113)與LVVVGAVGV-(9個aa,p6-14,SEQ ID NO:117)胜肽會自患有胰臟癌的患者誘發CD8 T細胞反應以滅殺胰臟癌細胞系PaTu(Ras-G12V)以及結腸癌症細胞系SW480(Ras-G12VT)。此等結果暗示衍生自Ras突變的抗原決定基可為用於對抗廣泛的的人類癌症的T細胞免疫治療的癌症專一性目標。據此,咸已於患有胰臟癌與其他癌症患者中於臨床試驗中評估衍生自Ras突變的胜肽疫苗,但並未觀察到臨床效力。
模擬TCR之專一性(類TCR)的單株抗體可結合對表現細胞內蛋白質的細胞有專一性的細胞表面複合體,但保留使mAb成為強大治療劑的合適藥動學與效應功能。類TCR抗體在腫瘤學是特別令人感興趣的,而此係因為許多最重要的腫瘤聯結性與致癌性蛋白質係細胞核性或細胞質性。
衍生自Ras突變的抗原決定基代表了真正腫瘤專一性的抗原且其等在人類癌症細胞中的廣泛表現使其等成為吸引人的用於使用類TCR mAb的免疫治療的目標。吾人描述數種類對於Ras突變(對別是對於K-Ras G12突變)有專一性的TCR mAb。當在人類MHC HLA-A0201的背景中時,此等mAb中有許多僅辨識經突變的序列且不會辨識正常的序列。當該突變體抗原決定基(Ras G12V/MHC)係在細胞表面上但非當正常的Ras胜肽係表面上時,該等抗體之一些具體態樣能夠滅殺人類癌症細胞。
藉由噬菌體展現挑選的本文所揭示的內容之scFv最初被測試其等與呈現在HLA陽性細胞之表面上的胜肽結合的能力。於在胜肽之存在下培養T2細胞後,scFv可使用流動式細胞測量術選擇性辨識其等。
在一些具體態樣中,本文所揭示的內容之抗原結合蛋白包含具有scFv序列的抗體,該scFv序列與重鏈之第2與第3恆定功能域融合(CH2,3),形成人類免疫球蛋白之Fc區域之底下第三個以產生二價蛋白質與其片段,增加抗體之總體結合性與穩定性。此外,Fc部分允許其他分子(包含但不限於螢光染料、細胞毒素、放射性同位素、等等)與抗體直接結合,以(例如)用於抗原定量研究、固定抗體來用於使用表面電漿子共振(SPR)的親和性測量、用於靶定性遞送治療劑、用於使用CD16表現性免疫效應細胞的Fc介導性細胞毒性測試、與許多其他應用。
此處所呈現的結果突出了本文所揭示的內容之抗原結合蛋白在瞄準MHC-Ras致癌蛋白質複合體的專一性、敏感性與實用性。
因此,在一個具體態樣中,本文所揭示的內容係關於抗原結合蛋白與其部分(諸如重組抗體),其辨識衍生自一細胞內蛋白質(特別是Ras致癌蛋白質)的胜肽/蛋白質片段與第I型MHC分子之複合體,(例如)如同該複合體會出現在細胞表面上以被T細胞辨識的。
本文所揭示的內容之分子係基於使用噬菌體展現的單鏈可變片段(scFv)之鑑認與挑選,該scFv之胺基酸序列賦予該分子對於所關注的MHC限制性胜肽的專一性並形成本文所揭示的內容之抗原結合蛋白之基礎。因此,該scFv可用於設計各種各樣的「抗體」分子,包含(例如)全長抗體、其片段(諸如Fab與F(ab')2)、微抗體(minibody)、融合蛋白質(包含scFv-Fc融合物)、多價抗體(即對於相同的抗原或不同的抗原具有超過一種專一性的抗體,例如雙專一性T細胞接合性抗體(bispecific T cell engager antibody,BiTE或T-BiTE)、三體(tribody))、等等(參見Cuesta等 人,Multivalent antibodies:when design surpasses evolution.Trends in Biotechnology 28:355-362 2010)。scFv亦可被用於構築CAR,其藉由所屬技術領域中具有通常知識者所知的各種方法被導入至活T細胞中以製造細胞毒性CAR T細胞。
在一個其中抗原結合蛋白係全長抗體的具體態樣中,本文所揭示的內容之抗體之重鏈與輕鏈可為全長(例如,抗體可包含至少一個,且較佳為兩個,完整的重鏈,與至少一個,且較佳為兩個,完整的輕鏈)或可包含抗原結合部分(Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(「scFv」))。在其他的具體態樣中,抗體重鏈恆定區域係選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、與IgE。在一些具體態樣中,免疫球蛋白同型係選自IgG1、IgG2、IgG3、與IgG4,更具體言之係IgG1(例如,人類IgG1)。抗體類型之選擇會取決於該抗體經設計以誘發的免疫效應功能。
在構築重組免疫球蛋白中,對於各種免疫球蛋白同型之恆定區域的適當胺基酸序列與用於生產各種各樣的抗體的方法對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知的。
在一些具體態樣中,抗體之恆定區域被改變(例如被突變)以修飾抗體之特性(例如,以增加或減少以下之一或多個者:Fc受體結合、抗體碳水化合物(例如醣苷化或海藻糖基化)、半胱胺酸殘基之數目、效應細胞功能、或補體功能)。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:81之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:113)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態 樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表1的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質、全長人類IgG或其片段。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:82之胺基酸序列的並與LVVVGAVGV(SEQ ID NO:116)/HLA2或KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表2的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:83之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV (SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表3的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:84之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表4的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:85之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表5的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:86之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表6的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:87之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV (SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表7的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗原結合蛋白或其片段,其具有包含SEQ ID NO:88之胺基酸序列並與KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)/HLA2專一性結合的抗原結合區域。在其他的具體態樣中,抗RAS抗原結合蛋白係具有選自表8的VH與VL區域或CDR的scFv、或scFv-Fc融合蛋白質或全長人類IgG。
在一些具體態樣中,本文所揭示的內容之抗原結合蛋白包含抗原結合區域或部分,其具有與以上表1-8中揭示的胺基酸序列100%一致 的胺基酸序列。在其他具體態樣中,本文所揭示的內容之抗原結合蛋白包含抗原結合區域或部分,其具有與以上表1-8中揭示的胺基酸序列96-99.9%一致的胺基酸序列。在又其他的具體態樣中,本文所揭示的內容之抗原結合蛋白可包含抗原結合區域或部分,其具有與以上表1-8中揭示的胺基酸序列約70%、80%、90%、或95.9%一致的胺基酸序列。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS抗體,其具有如於表9中顯示的hIgG1恆定區域、人類輕鏈(κ)或人類輕鏈(λ)。
在一個具體態樣中,抗原結合蛋白係抗RAS雙專一性T細胞接合性抗體或BiTE,其具有Ras抗體輕鏈可變區域、第一連接子、與Ras抗體重鏈可變區域。在某種具體態樣中,該BiTE抗體進一步包含第二連接子與抗CD3 scFv-His標籤,其具有如於表10中顯示的序列。用於產生BiTE的連接子一般係富甘胺酸的且長度範圍係約4至25個胺基酸。
在一些具體態樣中,本文所揭示的內容之BiTE抗體具有與SEQ ID NO:103 70%、80%、90%、95%且在一些例子中99-100%一致的胺基酸序列。
實施例 實施例1:抗原決定基選擇與胜肽合成
為了本文所揭示的內容之目的,K-Ras胜肽係藉由相對於NCBI蛋白質資料庫之NCBI參考序列NP_203524.1的胺基酸位置來鑑認。據此,K-Ras胜肽,LVVVGAGGV與KLVVVGAGGV分別對應於參考序列之胺基酸6-14與5-14。
為了挑選具有強致免疫性的衍生自Ras密碼子12突變的HLA-A2限制性抗原決定基,首先使用三個線上可得的資料庫(BIMAS、RANKPEP與SYFPEITHI)篩選Ras突變序列之預測分數。(Ras突變序列係於Smith等人Oncogenic mutations in ras create HLA-A2.1 binding peptides but affect their extracellular antigen processing.International Immunology Vol.9(8),pp.1085-1093,1997中描述)。
基於從三個資料庫之每一者預測的結合分數,選擇以下胜肽以用於測試以確定該等胜肽是否能夠在HLA-A2陽性健康捐贈者中誘發抗原決定基專一性T細胞反應。
所有的胜肽皆係向Genemed Synthesis,Inc.(聖安東尼奥,TX)購買並由其合成。將胜肽以70%至90%之純度消毒。將胜肽溶解在DMSO中並以5mg/mL在食鹽水中稀釋並儲存在-80℃。
使用由Eureka Therapeutics構築的人類scFv抗體噬菌體展現文庫(10 x 1010個殖系)以挑選對K-Ras G12V/HLA-A0201有專一性的人類mAb。為了減少由將蛋白質複合體固定在塑膠表面上而導入的MHC1複合體之構形性改變,使用溶液淘選與細胞淘選取代習用平板淘選。於溶液淘選中,在以PBS緩衝液長時間洗滌後首先將經生物素化的抗原與人類scFv噬菌體文庫混合,並接著將抗原-scFv抗體噬菌體複合體通過通過磁性網架藉由與鏈黴抗生物素蛋白結合的Dyna珠粒M-280拉下。接著洗提被結合的殖系並將其用於感染大腸桿菌XL1-Blue。於細胞淘選中,首先將裝載有Ras 10-G12V或Ras 9-G12V胜肽的T2細胞與人類scFv噬菌體文庫混合。T2細胞係一TAP缺陷性HLA-A0201+淋巴母細胞細胞系。為裝載胜肽,將T2細胞以在無血清RPMI 1640培養基中的胜肽(50μg/ml)脈衝,在20μg/ml β 2微球蛋白之存在下過夜。在以PBS長時間洗滌後,離心下具有scFv抗體噬菌體結合於其上的裝載了胜肽的T2細胞。接著洗提經結合的殖系並將其用於感染大腸桿菌XL1-Blue。接著純化在細菌中表現的噬菌體殖系。以溶液淘選、細胞淘選或溶液與細胞淘選之組合進行淘選3-4回合以富集與Ras10-G12V及/或Ras9-G12V/HLA-0201專一性結合的scFv噬菌體殖系。
表12係針對K-Ras G12V/HLA-A0201的噬菌體淘選之概要。進行了八個獨立的淘選。透過FACS分析,在436個所篩選的殖系中鑑認出122個陽性殖系。在80個經定序的陽性殖系中,找到8個獨特的殖系。
實施例2:T2穩定化分析
第I型MHC限制性胜肽之致免疫性需要與在活細胞表面上的第I型MHC分子結合並穩定之的能力。此外,電腦預測僅具有至多70%的正確性;因此下一步係直接測量在胜肽與HLA-A0201分子間的交互作用之力度,其利用使用抗原運輸缺陷性(TAP2陰性)HLA-A0201人類T2細胞的習用結合與穩定化分析。T2細胞缺乏TAP功能且因此在適當地裝載具有於細胞溶質中產生的抗原性胜肽的第I型分子方面有缺陷。將外加胜肽與不耐熱的空HLA-A0201分子聯結會穩定化其等並造成可被專一性抗HLA-A0201 mAb(諸如BB7.2)辨識的表面HLA-A0201之水平增加。
T2結合分析顯示當以50μg/ml使用時,Ras 10聚體胜肽野生型(WT)、G12V、G12C、G12D在T2細胞上增加了HLA-A2表現(圖1AB)且可穩定化HLA-A2表現的最佳胜肽係RasG12V,其次係RasG12D,且較低程度係RasG12-C與野生型。Ras 9聚體胜肽在所有所使用的濃度皆顯示較佳的HLA-A2穩定化,但在胜肽之間並未顯示明顯的差異(圖1C與D)。
實施例3:突變體Ras胜肽誘發的T細胞反應
在接到經紀念Sloan-Kettering癌症中心機構審查委員會批准的方案被同意的通知後,藉由Ficoll密度離心獲得來自經定型其HLA的健康捐贈者的周邊血液單核細胞(PBMC)。按照之前描述的方案刺激T細胞(Dao T.等人Identification of a human cyclin D1-derived peptide that induces human cytotoxic CD4 cells.Plos One Vol.4(9)e6730,2009)。藉由IFN-g ELISPOT分析測量胜肽專一性T細胞反應(Dao,T,Science Tr Med 2013)。
為擴增胜肽專一性T細胞前軀細胞,進行三到五次試管內刺激並藉由IFN-g生產(當以個別的胜肽挑戰時)測量專一性T細胞反應。Ras-G12V胜肽刺激誘發對抗Ras10-G12V的強烈T細胞反應但未顯示對胜肽Ras10-WT、G12C與G12D的交叉反應性(Fig.2A)。類似地,Ras 9-G12V亦誘發對其本身(但非其他胜肽)的強烈T細胞反應。刺激T細胞五次提高反應且顯示更多的IFN-g點。有意思地,Ras 9-G12D胜肽在5回合的刺激後亦誘發對其本身的胜肽專一性反應(圖2B)。
基於T細胞數據,產生了在HLA-A0201分子的背景中對Ras10-G12V與WT胜肽有專一性的類TCR mAb。
實施例4:經生物素化的胜肽/HLA-A0201複合體
根據標準方案製備經生物素化的胜肽/HLA-A0201複合體單體(John D.Altman與Mark M.Davis Current Protocols in Immunology(2003)17.3.1-17.3.33)。簡言之,全長人類β 2m之DNA係由Genewiz合成並被選 殖入載體pET-27b中。將BirA受質胜肽(BSP)加至HLA A0201細胞外功能域(ECD)之C端。HLA-A0201 ECD-BSP之DNA係由Genewiz合成並選殖入載體pET-27b中。分開地將表現人類β 2m與HLA-A0201 ECD-BSP的載體轉形入大腸桿菌BL21中,並自細菌培養物以包涵體形式分離之。使胜肽配位體Ras10-G12V與Ras10-WT和人類β 2m與HLA A0201 ECD-BSP一起再折疊以形成Ras-G12V/HLA A0201與Ras10-WT/HLA A0201複合體單體。藉由超過濾濃縮經折疊的胜肽/HLA A0201單體並透過粒徑排阻層析法進一步純化之(圖8)。以Hyclone Dulbecco氏磷酸鹽緩衝食鹽水溶液(Thermo Scientific,目錄編號SH3002802)平衡HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR共1.5管柱體積。裝載未經純化的樣本並洗提共1管柱體積。第一個峰(其由錯誤折疊的聚集體組成)係於裝載後於約110.63mL洗提出。對應於適當折疊的MHC複合體的峰係於216.18mL觀察到。最後,由自由B2M組成的峰係於275.12mL觀察到。
透過SDS-PAGE顯像經純化的胜肽/HLA A0201單體(圖E-2)。簡言之,將4μg的蛋白質與2.5μL的NuPAGE LDS樣本緩衝液(Life Technologies,NP0008)混合並以去離子水充至10μL。將樣本於70℃加熱10分鐘,並接著將其裝載至凝膠上。以180V進行凝膠電泳1個小時。在凝膠上觀察到兩個主要的條帶。30KD的條帶係HLA A0201,而10KD的條帶係B2M。
透過BirA介導性酵素反應將胜肽/HLA A0201單體生物素化並接著藉由高解析度陰離子交換層析法純化之。將經生物素化的胜肽/HLA A0201單體儲存在-80℃下。
實施例5:篩選對K-Ras G12V/HLA-A0201複合體有專一性的噬菌體ScFv
使用與活T2細胞結合的Ras G12V藉由流動式細胞測量術確定陽性噬菌體殖系。簡言之,將細胞首先以經純化的scFv噬菌體殖系染色,並接著以小鼠抗M13 mAb染色,且最後以得自Vector Labs的與R-PE結合的馬抗小鼠IgG染色。染色之每個步驟皆在冰上進行30-60分鐘並在染色之每個步驟間洗滌細胞兩次。圖8係與裝載有胜肽的T2細胞結合的K-Ras G12V/HLA A0201專一性噬菌體殖系之實例。殖系#2與K-Ras10 G12V(T2-014A2mut,淺綠色的線)以及K-Ras9 G12V/HLA A0201(T2-014A1mut,藍色的線)專一性結合,但不辨識空的T2細胞(T2-B2M,深綠色的線)或K-Ras WT胜肽/HLA A0201複合體(T2-0142WT,橘色的線與T2-0141WT,紅色的線)。
實施例6:使用所挑選的scFv片段設計全長mAb
於HEK293與中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中製造所挑擇的噬菌體殖系之全長人類IgG1,如所描述的(Tomimatsu K、Matsumoto S、Yamashita M、Teruya K、Katakura Y、Kabayama S & Shirahat S.Production of human monoclonal antibodies against FceRIa by a method combining in vitro immunization with phage display.Biosci Biotechnol Biochem 2009;73(7)1465-1469.)。簡言之,將抗體可變區域與符合的人類λ或κ輕鏈恆定區域以及人類IgG1恆定區域序列次殖系入哺乳類動物表現載體中。藉由電泳在還原條件與非還原條件下測量經純化的全長IgG抗體之分子量。電泳(SDS-PAGE)之實例係於 圖E-4顯示。第1道,殖系#2,還原還原條件,第2道,殖系#4,還原條件,第3道,殖系#7,還原條件,第6-7道,非還原條件,殖系#2、#4與#7,分別地。
實施例7:設計雙專一性T細胞接合子(bispecific T cell engager,T-BiTE)
BiTE抗體係單鏈雙專一性抗體,其於N末端包含呈scFv形式的K-Ras G12V/HLA A0201專一性抗體並於C末端包含抗人類CD3 ε scFv小鼠單株抗體(Brischwein,K.等人MT110:A novel bispecific single-chain antibody construct with high efficacy in eradicating established tumors.Molecular Immunology 43,1129-1143(2006))。由Genewiz合成編碼Ras scFv抗體與抗人類CD3 ε scFv抗體的DNA片段並使用標準DNA技術將之次選殖至Eureka氏哺乳類動物表現載體pGSN-Hyg中。將六組織胺標籤插入Ras BiTE抗體之C末端之下游以用於抗體純化與偵測。以該等Ras BiTE表現載體轉染中國倉鼠卵巢(CHO)細胞並藉由使用甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX)的標準藥物選擇(一種基於麩醯胺酸合成酶(GS)的方法)達成穩定表現(參考文獻2)。收集含有被分泌的Ras BiTE分子的CHO細胞上清液。藉由FPLC AKTA系統使用HisTrap HP管柱(GE醫療(GE healthcare))純化Ras BiTE。簡言之,澄清化CHO細胞培養物並以低咪唑濃度(20mM)將其裝載至管柱,並接著使用等度高咪唑濃度洗提緩衝液(500mM)以洗提被結合的Ras BiTE蛋白質。藉由電泳在非還原條件下測量經純化的Ras BiTE抗體之分子量(圖E-5)。第1-4道,還原條件,殖系#2、#4、901對照組hIgG1抗體與#7,分別地。
實施例8:界定對Ras 10-G12V/HLA-A0201複合體有專一性的全長人類IgG1之特徵
為確定mAb殖系#2、4與7是否與在活細胞上的細胞表面胜肽/HLA-A0201複合體結合,使用流動式細胞測量術以研究裝載有胜肽的HLA-A0201陽性TAP缺陷性T2細胞。於無血清培養基中以胜肽(50μg/ml)與10μg/ml的β 2微球蛋白(β 2M)培養T2細胞過夜,並收穫細胞並洗滌之。將細胞以mAb或同型對照組人類IgG1染色30分鐘並洗滌,接著以與FITC結合的次級山羊(Fab)2抗人類IgG1 mAb染色。mAb亦與別藻藍蛋白(APC)螢光團結合以進行直接染色。
圖3A顯示mAb#2與經Ras10-G12V胜肽脈衝的T2細胞專一性結合,且亦以較低的程度與經Ras-G12C胜肽脈衝的T2細胞專一性結合,但不與經Ras WT、Ras10-G12D或單獨T2、或對照組HLA-A0201結合性胜肽EW脈衝的T2細胞專一性結合(Dao,T.等人Identification of a human cyclin D1-derived peptide that induces human cytotoxic CD4 cells.Plos One vol.4(9)e6730,2009)。MAb #4與7未顯示與以該等Ras10胜肽脈衝的T2的明顯結合。
在直接染色中測量與APC結合的mAb之結合來確認該等結果。由於APC結合會大大地擴大結合訊號,#7 mAb被看到會與以Ras10-G12V胜肽脈衝的T2細胞結合以及以較低的程度與以Ras10-WT胜肽脈衝的T2細胞結合。然而,mAb滴定顯示mAb#2對Ras10-G12V/HLA-A0201複合體具有最強的親和性。在此實驗中,亦測試mAb與潛在交叉反應性正常胜肽CT (非來自Ras)間的結合。僅mAb#7與其結合以及與Ras WT結合,顯示mAb#7相較於#2或#4係較雜亂的mAb(圖3B上圖)。結合專一性並非導因於與HLA-A2分子結合的胜肽之差異,而此係因為藉由胜肽CT的HLA-A2表現水平與在相同情況下使用的其他胜肽類似(下面的圖)。
Ras人類IgG1 mAb之結合親和性
使用ForteBio Octet QK測定Ras hIgG1 mAb對裝載有胜肽的MHC複合體的結合親和性。數據係於表13中顯示。將5μg/mL的經生物素化Ras胜肽/HLA-A0201複合體裝載至鏈黴抗生物素蛋白生物感應器上。首先洗滌掉過多的抗原。接著以10μg/mL個別地測試Ras mAb聯結與解離步驟。使用1:1結合位置模式、部分符合計算結合參數。在HLA-A0201分子的背景中,Ras抗體#2與#4專一性辨識Ras G12V突變體胜肽/HLA-A0201複合體,而Ras抗體#7辨識突變體與野生型Ras胜肽兩者。
實施例9:胜肽抗原決定基作圖
為了更精確地研究用於mAb辨識的抗原決定基,於Ras蛋白質位置8、9、10、12、與13以丙胺酸取代Ras10-G12V胜肽並將其脈衝輸送至T2細胞上並對其測試mAb結合。於位置12的丙胺酸取代完全地廢除了#2 mAb之結合。於位置9、10與13的丙胺酸取代亦減低了#2 mAb之結合。MAb #4與7顯示類似於#2 mAb的結合減低,然而,#7 mAb與於位置12含有丙胺酸取代的胜肽間的結合仍係可偵測的(圖3C)。由於Ras10-G12V胜肽之Ras蛋白質位置11已經是丙胺酸,接著以甘胺酸取代此位置(Ras10-A11G)。亦測試#2 mAb與Ras10-G12S胜肽間的結合。Mab#2顯示弱的但陽性的與以Ras10-G12S脈衝的T2間的結合以及減低的與Ras10-A11G胜肽間的結合。結合之喪失並非導因於對HLA-A2分子的胜肽結合親和性減低,因為Ras10-A11G在T2穩定化分析中顯示最強的結合(圖3D)。此等結果顯示位於Ras10-G12V胜肽之Ras蛋白質位置12的纈胺酸對於Ras mAb辨識係重要的且mAb#2對Ras10-G12V突變具有高專一性。進一 步確認使用經丙胺酸取代的胜肽與可能的交叉反應性非Ras胜肽CT與MTH的mAb#2結合專一性。並未觀察到對照組CT或MTH胜肽有結合(圖3E)。流動式細胞測量術數據顯示mAb #2對各種胜肽與HLA-A2的結合(圖3F)。於Ras位置8的丙胺酸取代顯露對T2細胞的毒性,如由HLA-A2表現減少(圖3G)且無可靠的數據產生所顯示的。
除了10聚體胜肽外,亦測試mAb與Ras 9聚體G12V突變衍生性胜肽間的結合。mAb #2與Ras 9聚體G12V結合。mAb #4與7不與野生型或G12V突變體胜肽結合,如間接染色(圖4A)與直接染色(圖4B)兩者以及胜肽結合之T2確認(圖4B下面的圖)所顯示的。
實施例10:界定T-BiTE構築體之特徵
mAb滅殺功能可以多種方式提高。作為一個將T細胞細胞毒性帶到目標的策略,亦產生mAb之雙專一性T細胞接合子(T-BiTE)構築體並在T2細胞上測試與目標Ras胜肽的結合且藉由T-BiTE然後是次級mAb(與FITC結合的小鼠抗myc,因為BiTE構築體係經加上myc標籤的)測試與休眠的經純化T細胞(效應細胞)的結合。
BiTE保留其等之結合專一性與親和性,#2與Ras10-G12V胜肽的結合最佳,接著是#7與#4 mAb。mAb#7亦顯示與WT胜肽的結合(圖5A)。mAb #4顯示最強的與CD3 T細胞的結合,接著是同型對照組BITE、mAb #2與#7(圖5B與C)。
實施例11:ADCC介導性滅殺
咸認為ADCC係人類中治療性mAb之主要功效或機制之一。因此,吾人接著於標準51Cr釋放分析中使用來自健康捐贈者的新鮮經分離人類PBMC測試mAb是否能夠介導ADCC。(圖6)mAb #2與7兩者皆能以所指出的濃度以類似的程度夠滅殺以Ras10-G12V胜肽脈衝的T2細胞。未觀察到對未經脈衝的T2細胞的滅殺。mAb #7亦滅殺以Ras10-WT胜肽脈衝的T2,但未觀察到透過#2 mAb的滅殺。此等結果與結合數據一致且進一步證實#2 mAb對於突變體Ras10-G12V胜肽/HLA-A2複合體有專一性。
實施例12:透過T-BITE的滅殺
接著,測試Ras mAb之T-BiTE是否能夠介導對目標的T細胞滅殺。純化CD3 T細胞並在T-BiTE #2、#7與同型衍生性對照組BiTE之存在或不存在下藉由標準51Cr釋放分析測量細胞毒性。對照組未經脈衝的T2細胞或以對照組胜肽EW脈衝的細胞未觀察到滅殺。#2與#7 BiTE兩者於所指出的濃度的BiTE皆能夠介導對以Ras10-G12V胜肽脈衝的T2細胞的T細胞滅殺(圖7)。BiTE#2不滅殺以Ras WT脈衝的細胞,顯示對表面上具有Ras突變體的細胞的滅殺之專一性。BiTE#7未顯示對以Ras10-WT脈衝的T2細胞的滅殺,其可能係因為相較於對Ras10-G12V/HLA-A2複合體對WT/HLA-A2複合體結合親和性較低。
相等物
以上書面說明書被認為足以使所屬技術領域中具有通常知識者去實現本文所揭示的內容。以上的描述與實施例詳細敘述了本文所揭 示的內容之某些具體態樣並描述了本案之發明人所思量的最佳模式。然而,應認知到無論以上內容敘述地多麼詳細,本文所揭示的內容可以許多方式實現且本文所揭示的內容應根據所附申請專利範圍與任何其等之相等物來理解。
參考文獻
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 95
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成的
<400> 96
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<212> PRT
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<400> 97
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<212> DNA
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<210> 103
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<210> 106
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
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<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
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<211> 249
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> DNA
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<223> 合成的
<400> 109
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
<210> 112
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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<212> PRT
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<223> 合成的
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成的
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<220>
<223> 合成的
<400> 117
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118

Claims (37)

  1. 一種抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其與在於位置12具有單一胺基酸取代的野生型Ras胜肽,KLVVVGAGGV(SEQ ID NO:110,胺基酸5-14)或LVVVGAGGV(SEQ ID NO:115,胺基酸6-14)之變體內的抗原決定基專一性結合。
  2. 根據申請專利範圍第1項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該於位置12具有單一胺基酸取代的變體Ras胜肽係選自由KLVVVGAVGV(SEQ ID NO:111)、KLVVVGASGV(SEQ ID NO:114)與LVVVGAVGV(SEQ ID NO:116)所組成的群組。
  3. 根據申請專利範圍第1項或第2項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其包含以下之至少一者:(A)抗原結合區域,其具有SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、或88之一的胺基酸序列;(B)抗原結合區域,其包含分別具有選自SEQ ID NO:(i)7與9;(ii)17與19;(iii)27與29;(iv)37與39;(v)47與49;(vi)57與59;(vii)67與69;或(viii)77與79的胺基酸序列的VH與VL;或(C)抗原結合區域,其包含:(i)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、與SEQ ID NO:6的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3,與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:3的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(ii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、與SEQ ID NO:16 的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、與SEQ ID NO:13的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(iii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、與SEQ ID NO:26的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、與SEQ ID NO:23的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(iv)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、與SEQ ID NO:36的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、與SEQ ID NO:33的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(v)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、與SEQ ID NO:46的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、與SEQ ID NO:43的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vi)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、與SEQ ID NO:56的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、與SEQ ID NO:53的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、與SEQ ID NO:66的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、與SEQ ID NO:63的重 鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(viii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、與SEQ ID NO:76的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與(b)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、與SEQ ID NO:73的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;或(D)抗原結合區域,其包含(A)、(B)、與(C)(i)至(C)(vii)之任一者中敘述的胺基酸序列之至少一者之片段或變體。
  4. 根據申請專利範圍第1、2或3項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗原結合蛋白係抗體。
  5. 根據申請專利範圍第4項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體包含人類可變區域骨架區域。
  6. 根據申請專利範圍第4項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體係完全人類的。
  7. 根據前述申請專利範圍中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分與結合至HLA-A2的Ras胜肽專一性結合。
  8. 根據申請專利範圍第7項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該HLA-A2係HLA-A0201。
  9. 根據申請專利範圍第7或8項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該胜肽包含SEQ ID NO:111之胺基酸序列。
  10. 根據申請專利範圍第7或8項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該胜肽包含SEQ ID NO:116之胺基酸序列。
  11. 根據申請專利範圍第7或8項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分以範圍在8.5至10nM的親和性與具有SEQ ID NO:111之胺基酸序列的胜肽結合。
  12. 根據申請專利範圍第4-6項中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體係全長抗體、完整抗體、Fab片段、F(ab')2片段、或單鏈可變片段(scFv)。
  13. 根據前述申請專利範圍中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗原結合蛋白係嵌合性抗原受體(CAR)。
  14. 根據前述申請專利範圍中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其與治療劑結合。
  15. 根據申請專利範圍第14項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該治療劑係藥物、毒素、放射性同位素、蛋白質、或胜肽。
  16. 一種核酸,其編碼根據前述申請專利範圍中任一項的抗原結合蛋白。
  17. 一種核酸,其包含:(A)第一與第二核苷酸序列,其等選自由SEQ ID NO:8與10;18與20;28與30;39與40;49與50;59與60;68與70;78與80、與其片段或變體所組成的群組;或(B)核苷酸序列,其選自由SEQ ID NO:91、92、93、94、95、96、97、98、與其片段或變體所組成的群組。
  18. 根據申請專利範圍第17項的核酸,其中該第一核苷酸序列編碼VH區域且該第二核苷酸序列編碼VL
  19. 根據申請專利範圍第17或18項的核酸,其中該核苷酸序列編碼scFv。
  20. 一種融合蛋白質,其包含根據申請專利範圍第1-15項中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分。
  21. 根據申請專利範圍第12項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體係單鏈可變片段(scFv),其包含選自由SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、88、或其片段或變體所組成的群組的抗原結合蛋白之胺基酸序列。
  22. 根據申請專利範圍第12或21項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體係scFv,其包含由胺基酸分隔子連接的VH與VL,其中該VH與VL分別包含選自由SEQ ID NO:(i)7與9;(ii)17與19;(iii)27與29;(iv)37與39;(v)47與49;(vi)57與59;(vii)67與69;(viii)77與79、或其片段或變體所組成的群組的胺基酸序列。
  23. 根據申請專利範圍第12或21項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分,其中該抗體係scFv,其包含:(i)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、與SEQ ID NO:6的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、與SEQ ID NO:3的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(ii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、與SEQ ID NO:16的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、與SEQ ID NO:13的重鏈 CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(iii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、與SEQ ID NO:26的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、與SEQ ID NO:23的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(iv)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、與SEQ ID NO:36的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、與SEQ ID NO:33的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(v)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、與SEQ ID NO:46的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、與SEQ ID NO:43的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vi)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、與SEQ ID NO:56的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、與SEQ ID NO:53的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(vii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、與SEQ ID NO:66的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、與SEQ ID NO:63的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;(viii)分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、與SEQ ID NO:76 的輕鏈互補決定區域(LC-CDR)LC-CDR1、LC-CDR2與LC-CDR3與分別具有胺基酸序列SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、與SEQ ID NO:73的重鏈CDR(HC-CDR)HC-CDR1、HC-CDR2與HC-CDR3;或(ix)包含(i)至(viii)之任一者中敘述的胺基酸序列之至少一組之片段或變體的LC-CDR1、LC-CDR2、LC-CDR3、HC-CDR1、HC-CDR2、與HC-CDR3。
  24. 一種免疫結合物,其包含為根據申請專利範圍第1-15與20-23項中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分的第一組份。
  25. 根據申請專利範圍第24項的免疫結合物,其包含具有第二胺基酸序列的第二組份。
  26. 根據申請專利範圍第24或25項的免疫結合物,其進一步包含細胞毒素或放射性核素。
  27. 根據申請專利範圍第25項的免疫結合物,其中該第二組份係結合性蛋白質或抗體,其對於與第一組份之結合專一性不同的目標具有結合專一性。
  28. 一種雙專一性抗體,其包含第一與第二抗原結合部分,其中該第一抗原結合部分係根據申請專利範圍第1-15與20-23項中任一項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分。
  29. 根據申請專利範圍第28項的雙專一性抗體,其中該雙專一性抗體包含第二抗原結合部分,其對於與第一抗原結合部分之結合專一性不同的目標具有結合專一性。
  30. 一種醫藥組成物,其包含根據申請專利範圍第1-15與20-23項的抗原結合蛋白或其抗原結合部分之任一者與醫藥上可接受的載劑。
  31. 一種選擇性滅殺在其表面上展現RasG12V/MHC抗原決定基的人類癌症細胞的方法,其包含使該細胞與包含以下者的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分接觸:(A)抗原結合區域,其具有SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87、88之一、其片段或變體、或其組合之胺基酸序列;或(B)抗原結合區域,其包含分別具有選自SEQ ID NO:(i)7與9;(ii)17與19;(iii)27與29;(iv)37與39;(v)47與49;(vi)57與59;vii)67與69;(viii)77與79;(ix)87與89、其片段或變體、或其組合的胺基酸序列的VH與VL
  32. 一種載體,其包含根據申請專利範圍第16-19項中任一項的核酸。
  33. 一種細胞,其包含根據申請專利範圍第16-19項中任一項的核酸。
  34. 一種醫藥組成物,其包含根據申請專利範圍第16-19項中任一項的核酸。
  35. 一種雙專一性抗體,其包含至少一個根據申請專利範圍第3項的抗原結合蛋白或其抗原結合片段/部分之胺基酸序列。
  36. 根據申請專利範圍第35項的雙專一性抗體,其中該雙專一性抗體具有SEQ ID NO:103之胺基酸序列。
  37. 一種醫藥組成物,其包含根據申請專利範圍第35或36項的雙專一性抗體。
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