CN111518213A - 抗her2的双特异性抗体及其应用 - Google Patents
抗her2的双特异性抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗HER2的双特异性抗体，其包括分别用于识别HER2的胞外结构域II和胞外结构域IV的第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包括第一重链和轻链，所述第二蛋白功能区包括第二重链和轻链，具体的第一重链、第二重链和轻链的序列见本文。本发明还公开了包括所述双特异性抗体的药物组合物和它们的用途。本发明的双特异性抗体和含其的药物组合物可用于癌症的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗HER2的双特异性抗体及其应用。
背景技术
HER2是一种185kDa的细胞表面受体酪氨酸激酶(cell surface receptortyrosine kinase)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族的成员，所述EGFR家族包括四种不同的受体：EGFR/ErbB-1、HER2/ErbB-2、HER3/ErbB-3、和HER4/ErbB-4。所述EGFR家族的四种成员形成同二聚体和异二聚体，其中HER2是优选的且是其它ErbB受体的最强的二聚配偶体(Graus-Porta等人，Embo J 1997；16:1647-1655；Tao等人，J Cell Sci2008；121:3207-3217)。HER2可以通过过表达或通过与其它可以由配体结合而激活的ErbB的异二聚化而激活(Riese和Stern，Bioessays1998；20:41-48)。对于HER2，还没有鉴定出配体。HER2活化导致受体磷酸化，其通过多种信号途径，如MAPK、磷酸肌醇3-激酶/AKT、JAK/STAT、和PKC，而触发下游的信号级联放大，其最终导致多种细胞功能的调节，如生长、存活、和分化(Huang等人，Expert Opin Biol THER2009；9:97-110)。
对HER2在肿瘤方面的关注集中于其在乳腺癌(breast cancer)中的作用，其中HER2过表达在大约20％的病例中报道，且其与不良的预后有关联(Reese等人，StemCells1997；15:1-8；Andrechek等人，Proc Natl Acad Sci U SA2000；97:3444-3449；和Slamon等人，Science1987；235:177-182)。除了乳腺癌以外，HER2表达还与其它人癌瘤种类关联，包括前列腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、结肠癌、食管癌、和头和颈的鳞状细胞癌(Garcia de Palazzo等人，Int J Biol Markers1993；8:233-239；Ross等人，Oncologist2003；8:307-325；Osman等人，J Urol2005；174:2174-2177；Kapitanovic等人，Gastroenterology1997；112:1103-1113；Turken等人，Neoplasma2003；50:257-261；和Oshima等人，Int J Biol Markers2001；16:250-254)。下表显示了HER2在各种不同来源肿瘤细胞中的表达情况。
表1.肿瘤细胞及HER2表达情况
曲妥珠单抗(Trastuzumab)是一种重组的、人源化单克隆抗体，其针对HER2蛋白质的域IV，由此在高HER2过表达的细胞内阻断配体非依赖性HER2同二聚化，并在较小的程度上还阻断HER2与其它家族成员的异二聚化(Cho等人，Nature2003；421:756-760和Wehrman等人，Proc Natl Acad Sci 2006；103:19063-19068)。在具有中等HER2表达水平的细胞中，发现了曲妥珠单抗抑制HER2/EGFR异二聚体的形成(Wehrman等人，Proc Natl Acad Sci2006；103:19063-19068；Schmitz等人，Exp Cell Res2009；315:659-670)。曲妥珠单抗介导抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)并阻止胞外域脱落(ectodomain shedding)，否则其会导致在HER2过表达细胞中形成截短的组成型活性蛋白质。而且，还对于曲妥珠单抗报道了对高水平表达HER2的肿瘤细胞的体外和体内的增殖(在Nahta和Esteva，Oncogene 2007；26:3637-3643中综述)的抑制。曲妥珠单抗已被NMPA和FDA批准用于HER2过表达转移性乳腺癌的一线治疗和辅佐治疗，无论是与化学疗法组合还是在一种或多种化学疗法之后的单剂。其被发现仅在20-50％的HER2过表达乳腺癌患者中有效，且许多初始反应者(responder)在几个月后显示了复发(Dinh等人，Clin AdvHematol Oncol 2007；5:707-717)。美国国立综合癌症机构(National ComprehensiveCancer Network,NCCN)在2019版乳腺癌临床治疗指南中，将帕妥珠单抗和曲妥珠单抗联合多西他赛(一类推荐)或紫杉醇作为HER2阳性晚期(转移性)乳腺癌和新辅助治疗(即手术前)的一线用药方案，预期增加乳腺癌手术成功率和降低复发率，改善生存期和生存质量。
帕妥珠单抗(Pertuzumab)(OmnitargTM)是另一种人源化单克隆抗体。其针对HER2蛋白质的域II，导致对配体诱导的异二聚化的抑制(即HER2与已结合配体的ErbB家族的另一个成员的二聚化)；其据报道为不严格需要高HER2表达水平的机制(Franklin等人，Cancer Cell2004；5:317-328)。虽然帕妥珠单抗也介导ADCC，帕妥珠单抗的主要作用机制依赖其对二聚化的阻断(Hughes等人，Mol Cancer THER2009；8:1885-1892)。此外，发现帕妥珠单抗通过抑制EGFR/HER2异二聚体的形成而增强EGFR内化(internalization)和下调，否则所述异二聚体在质膜表面将EGFR拘束(Hughes等人，Mol Cancer THER2009；8:1885-1892)。这一点与所观察到的EGFR同二聚体比EGFR/HER2二聚体的内化更有效相关联(Pedersen等人，Mol Cancer Res2009；7:275-284)。根据最新的CLEOPATRA，NeoSphere，VELVET和PERUSE临床研究结果，靶向HER2不同表位的帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的联合应用，可显著提高HER2阳性乳腺癌患者的无疾病进展生存期和中位生存期。
另一种提出的基于HER2的治疗方法是将针对不同HER2表位的HER2抗体组合，在体外和体内肿瘤模型中都已经报道了其在降低肿瘤生长方面比单独的HER2抗体更有效(Emde等人，Oncogene2011；30:1631-1642；Spiridon等人，Clin Cancer res2002；8:1720-1730)。例如，据报道，当在患者中将两者组合时，帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的互补性机制导致增强的抗肿瘤作用和功效，所述患者是之前的曲妥珠单抗疗法期间有进展的患者(Baselga等人，J Clin Oncol2010；28:1138-1144)。在III期临床试验(CLEOPATRA)中，已经在患者中显示了帕妥珠单抗加曲妥珠单抗的抗体组合与多烯他赛一起导致了与曲妥珠单抗与多西他赛一起相比延长的无进展生存(prolonged progression-free survival)，所述患者患有之前未治疗过的HER2阳性转移性乳腺癌。
帕妥珠单抗和曲妥珠单抗联合比单用效果更明显，帕妥珠单抗单药反应率仅3.4％，但和曲妥珠单抗联合使用反应率可达21.4％。尽管如此，曲妥珠单抗和帕托珠单抗均仅适用于HER2强阳性(IHC检测结果为3+)的乳腺癌治疗，针对HER2弱阳性的乳腺癌，曲妥珠单抗及帕托珠单抗的治疗效果均不理想。近年来，细胞治疗在血液肿瘤治疗方面取得了非凡的成就，因此有科学家基于曲妥珠单抗开发了用于HER2阳性乳腺癌的治疗。结果病人在CAR-T细胞输入后的第5天因为严重的副作用去世(Morgan等人，The American Societyof Gene&Cell Therapy 2010；4:843-851)。抗HER2不同表位的双特异性抗体是用于识别HER2表面两种不同抗原表位的单克隆抗体药物，其包含有两条不同抗体的重链可变区和两条相同的轻链可变区(CN105829347A；CN105820251A；CN105980409A)，能够特异性结合HER2表面的第二、第四结构域，目的为提供一种即具有曲妥珠单抗活性又具有帕妥珠单抗活性的双特异性抗体，替代目前临床上曲妥珠单抗加帕妥珠单抗两种抗体联合治疗的方法。然而，现有技术(CN105829347A；CN105820251A；CN105980409A)抗体存在与抗原结合活性差，或者稳定性不佳易形成沉淀的特征，而稳定性是抗体成药性的必要条件。
发明内容
鉴于现有技术存在上述亲和力低、稳定性不佳易形成沉淀的技术缺陷，本发明的目的在于提供一种抗HER2不同表位的双特异性抗体及其应用。本申请的发明人发现，分别采用帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的重链，优化天然曲妥珠单抗轻链作为共同的轻链，能够获得对HER2靶点第二、第四结构域的亲和力分别与野生型的帕妥珠单抗和曲妥珠单抗相当的双特异性单抗。由于双特异性及高亲和力的特征，本发明的抗体对于HER2弱阳性的乳腺癌很可能也有效。同时，意外的发现，本发明的抗体对于多种HER2表达肿瘤细胞均具有增强的增殖抑制效果。
为解决上述技术问题，本发明第一方面的技术方案为：提供一种抗HER2的双特异性抗体，所述双特异性抗体包括分别用于识别HER2的胞外结构域IV和胞外结构域II的第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包括第一重链和轻链，所述第二蛋白功能区包括第二重链和轻链，其中，所述第一重链包括如SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其突变所示的重链可变区，所述第二重链包括如SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其突变所示的重链可变区，且所述轻链包括轻链可变区，所述轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下位点的一个或多个氨基酸的置换：R24、N30、T31、A32、F53、L54、S56、R66、H91、T93、T94和P96。在此，所述双特异性抗体可为scFv、F(ab)2或类IgG的结构。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体的轻链可变区中，所述氨基酸置换是将原氨基酸残基置换为选自以下的氨基酸残基：Asp(D)、Glu(E)、Ser(S)、Thr(T)、Asn(N)、Gln(Q)、Gly(G)、Ala(A)、Val(V)、Ile(I)、Leu(L)、Lys(K)、Met(M)、Phe(F)、Tyr(Y)、Trp(W)和Arg(R)。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体的轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生一个或多个以下氨基酸残基的置换：R24K、N30S、T31I、A32G、F53Y、L54R、S56T、R66G、H91Y、T93I、T94Y和P96Y。优选氨基酸残基的置换发生在一个或多个以下位点：N30S、F53Y、L54R、S56T和P96Y。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体的轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体还包括轻链恒定区，所述轻链恒定区优选人轻链恒定区λ链或κ链。较佳地，所述轻链在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体的第一重链和第二重链还包括重链恒定区，所述重链恒定区优选人重链恒定区。较佳地，所述双特异性抗体的第一重链和第二重链间形成异二聚体，所述第一重链和第二重链优选由Knob-in-Hole结构连接。更佳地，所述第二重链的重链可变区在如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列上发生D102E突变。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体的第一重链的重链可变区包含以下CDR序列：如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NOs:6-13所示的HCDR2，如SEQ ID NOs:14-19所示的HCDR3；
优选地，所述第一重链的重链可变区包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ IDNO:6所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:16所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:8所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:9所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ IDNO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:13所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:18所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3。
在一较佳的具体实施例中，所述双特异性抗体降低了岩藻糖修饰；优选地，所述抗体是无岩藻糖修饰的。
为解决上述技术问题，本发明第二方面的技术方案为：提供一种编码含如上所述的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。
为解决上述技术问题，本发明第三方面的技术方案为：提供一种表达载体，其包含上述第二方面的核酸序列。
为解决上述技术问题，本发明第四方面的技术方案为：提供一种原核或真核细胞，其包含上述第三方面的表达载体。
为解决上述技术问题，本发明第五方面的技术方案为：提供一种轻链，所述轻链包括轻链可变区，所述轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。优选地，所述轻链还包括轻链恒定区，所述轻链恒定区优选人轻链恒定区λ链或κ链。更优选地，所述轻链在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
为解决上述技术问题，本发明第六方面的技术方案为：提供上述第五方面的轻链在制备抗体中的应用；优选地，所述抗体为scFv、Fab’、F(ab)2或全长抗体，或单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
为解决上述技术问题，本发明第七方面的技术方案为：提供一种抗HER2的双特异性抗体的药物偶联物，其由如上所述的双特异性抗体与细胞毒性药物共价偶联。优选地，所述细胞毒性药物为微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA小沟抑制剂。更优选地，所述微管蛋白抑制剂为美登素类化合物，或奥瑞斯他汀衍生物，或微管素；所述拓扑异构酶抑制剂为DXd或其衍生物，或SN-38，或阿霉素及其衍生物；所述DNA小沟抑制剂为卡奇霉素(Calicheamicin)，倍癌霉素(Duocarmycin)及其衍生物，吡咯苯二氮平类化合物(pyrrolobenzodiazepines)或吲哚苯二氮平类化合物(indolinobenzodiazepines)。
为解决上述技术问题，本发明第八方面的技术方案为：提供一种包括如上所述的双特异性抗体的药物组合物。优选地，所述药物组合物还包括透明质酸酶。更优选地，所述透明质酸酶为rHuPH20或经修饰的rHuPH20。最优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
为解决上述技术问题，本发明第九方面的技术方案为：提供一种制备如上所述的双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：
(1)将包含编码所述重链的核苷酸序列和包含编码所述轻链的核苷酸序列构建在同一载体或不同的载体中；
(2)将上述步骤构建的载体在不同宿主细胞或同一宿主细胞中表达。
为解决上述技术问题，本发明第十方面的技术方案为：提供一种如上所述的抗HER2的双特异性抗体、抗HER2的双特异性抗体的药物偶联物和包括双特异性抗体的药物组合物在制备治疗HER2表达肿瘤药物中的应用。优选地，所述阳性肿瘤包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、食管癌、和头颈癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌、皮肤癌；更优选为乳腺癌、胃癌和肺癌。
此外，为解决上述技术问题，本发明第十一方面的技术方案为：提供一种药盒组合，其包括药盒A和药盒B；所述药盒A包含一种如上所述的抗HER2的双特异性抗体、抗HER2的双特异性抗体的药物偶联物和包括双特异性抗体的药物组合物；所述药盒B包含靶向HER2或其它靶点的其它抗体、双特异性抗体、基因修饰的细胞或药物组合物。所述药盒A和药盒B的使用不分先后顺序，或先使用药盒A再使用药盒B，或先使用药盒B再使用药盒A。
本发明所述的抗HER2的双特异性抗体、所述的免疫偶联物和所述的药物组合物或所述的药盒组合可施用于病人，用于治疗相关肿瘤。
在本发明中，本发明的HER2识别抗体或其抗原结合部分或其混合物或含其抗原结合部分的治疗性免疫细胞还可与化疗药物和/或其它抗体联用，因此本发明的组合物中还可含有化疗药物和/或其它抗体。
在本发明中，所述化疗药物包括但不限于：阿霉素(Adriamycin)、环磷酰胺和紫杉烷类[紫杉醇(Taxol)和多西他赛(Taxotere)]、卡培他滨(Xeloda)、吉西他滨(Gemzar)、长春瑞滨(Navelbine)、他莫昔芬、芳香酶抑制剂(瑞宁得、弗隆、阿诺新)、5-FU加亚叶酸、伊立替康(camptosar)、奥沙利铂、顺铂、卡铂、雌莫司汀、米托蒽醌(Novantrone)、泼尼松、长春新碱(Oncovin)等，或它们的组合。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果为：通过对曲妥珠轻链可变区、帕妥珠的重链可变区、曲妥珠重链可变区的指定氨基酸突变，得到一种亲和力高、稳定性好、肿瘤细胞杀伤活性强、ADCC活性高的双特异性单抗。
附图说明
图1显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对MDA-MB-175细胞的增殖抑制活性结果；A为KJ015w与帕妥珠对比；B为曲妥珠与帕妥珠对比。
图2显示双特异性单抗蛋白电泳图。
图3显示抗人HER2不同表位双特异抗体细胞结合活性。
图4显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对NCI-N87(A)和MCF-7(B)细胞的内吞结果。
图5显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对MDA-MB-175细胞增殖抑制活性结果；其中，A为KJ015-A的结果；B为KJ015-B的结果；C为KJ015-C的结果；D为KJ015-D的结果。
图6显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对BT474细胞增殖抑制活性结果；其中，A为KJ015-A的结果；B为KJ015-B和KJ015-C的结果；C为KJ015-D的结果。
图7显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对SK-BR-3细胞增殖抑制活性结果；其中，A为KJ015-A的结果；B为KJ015-B和KJ015-C的结果；C为KJ015-D的结果。
图8显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对NCI-N87细胞增殖抑制活性结果；其中，A为KJ015-A和KJ015-B的结果；B为KJ015-C和KJ015-D的结果。
图9显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对Calu-3细胞增殖抑制活性结果；其中，A为KJ015-A和KJ015-C的结果；B为KJ015-B的结果；C为KJ015-D的结果。
图10显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对JIMT-1细胞的ADCC活性结果；其中，A为KJ015-A和KJ015-B的结果；B为KJ015-C和KJ015-D的结果。
图11显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对SK-BR-3细胞ADCC活性结果；其中，A为KJ015-A和KJ015-B的结果；B为KJ015-C和KJ015-D的结果。
图12显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对NCI-N87细胞ADCC活性结果；其中，A为KJ015-A和KJ015-B的结果；B为KJ015-C和KJ015-D的结果；C为KJ015-E的结果。
图13显示抗人HER2不同表位双特异抗体针对MDA-MB-175细胞ADCC活性结果；其中，A为KJ015-A～KJ015-C的结果；B为KJ015-D和KJ015-E的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施了仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例1：抗人HER2不同表位双特异抗体构建表达
全基因合成编码曲妥珠单抗重链(含knob结构)、帕妥珠单抗重链(含hole结构)和曲妥珠单抗轻链(SEQ ID NO:2)DNA片段，分别克隆至本室构建的表达载体，表达载体由下述原件构成：
1)谷氨酰胺合成酶基因，作为筛选标记；或新霉素抗性基因，作为重链筛选标记，
2)复制起点：ori，
3)来自载体pUC18的复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，
4)β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
5)来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
6)人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和
如上所述，通过基因合成来制备包含重链或轻链的免疫球蛋白基因，并克隆入pUC57(Amp)质粒中。使用Hind III和EcoRI酶切含重链基因的pUC57(Amp)质粒、含轻链基因基因的pUC57(Amp)质粒及对应的表达质粒，并分别将重链及轻链定向克隆至对应质粒。酶切和连接的操作按商业提供的试剂盒说明书进行。
将上述构建好的曲妥珠单抗重链、帕妥珠单抗重链和轻链表达载体分别转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)，按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含重链和轻链编码序列的质粒DNA以1:1:2～1:1:4的比例共转染入CHO-K1(中国仓鼠卵巢细胞，购自ATCC)，操作方法按照生产商说明书进行。
转染后24-48小时将细胞培养基更换为含筛选药物的筛选培养基，每3-4天更换一次筛选培养基，直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高且生长状态良好的细胞进行扩增培养。
上述ELISA检测方法为将曲妥珠单抗特异性抗原
帕妥珠特异性抗原
分别用包被液(pH9.6CBS)稀释到一定浓度(2μg/ml)后包被于96孔板上，100μl/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入300μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液PBS(pH7.0)稀释标准品曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，100ng/mL起始二倍比稀释7个点。表达上清根据情况适当稀释，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体(HRP-抗人IgGγ轻链特异性抗体，Thermo)至一定浓度(1:2000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育20min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，根据标准曲线计算样品的含量。
最终得到野生型KJ015w抗体表达细胞株。各细胞株采用CD2基础培养基
扩增至100ml体积，进行补料批培养，从第3天开始，每天补加2％Feed4
悬浮培养12天后，分别收集培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，纯化得到双特异性单抗蛋白样品。
实施例2：抗人HER2不同表位双特异抗体与HER2亲和力测定
采用Biacore T200测定单靶点的HER2抗体曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、HER2双特异抗体KJ015w与三种形式的HER2抗原的亲和力。
首先将Anti-Human Fc(AHC)抗体偶联到CM5芯片上，然后用AHC捕获待测试的抗体IgG(2μg/ml)，再将不同浓度的三种抗原分子流过捕获了IgG的芯片表面，检测HER2抗体与各不同浓度抗原的结合活性，得到的数据根据Biacore T200分析软件进行拟合，得到确切的动力学常数，其对比结果见表2所示。
表2：抗体KJ015w与三种形式的HER2抗原的亲和力测试结果
曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和双特异抗HER2抗体KJ015w均能结合至HER2膜外区全长抗原，双特异抗HER2抗体KJ015w既能识别帕妥珠单抗特异性HER2抗原
也能识别曲妥珠单抗特异性HER2抗原
但其与帕妥珠单抗特异性HER2抗原的亲和力比帕妥珠单抗低了2个数量级。
实施例3：抗人HER2不同表位双特异抗体细胞增殖抑制活性检测
MDA-MB-175细胞培养瓶放置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色及细胞汇合度，记录细胞倍增时间。每隔2-4天对细胞进行传代培养。细胞约80％满层时，进行消化种板。弃培养基，用PBS洗一次，添加0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化。吹打细胞收集至离心管中，500g离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液进行计数。用含2％FBS的培养基将细胞密度调整至1×105个/mL，100μL每孔铺至96孔板中。
用含2％FBS的培养基稀释待测药物，先将待测药物稀释至150μg/mL，再4倍梯度稀释8次，获得9个浓度梯度的药物，最后一个点为阴性对照点。不同细胞，抗体起始浓度不同，详细见结果图中起始浓度点。取稀释好的药物100μL加入已铺好细胞的96孔板对应孔中，每个点双复孔。将96孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育反应96～120小时。
孵育结束，96孔板中加入CCK8试剂
20μL/孔，微孔板震荡仪震荡混匀。染色0.5-6小时后，用酶标仪读取OD 450nm吸光度数值。采用GraphPad软件对原始数据进行曲线拟合分析。
抗体增殖抑制活性的结果(图1A)显示KJ015w针对MDA-MB-175细胞具有增殖抑制活性。
实施例4：抗人HER2不同表位双特异抗体构建表达
全基因合成编码三种轻链变体的DNA片段[在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上分别发生选自以下组的氨基酸残基的置换：F53Y(M1)，F53Y、L54R和S56T(M2)，P96Y(M3)]，分别克隆至本室构建的抗体重轻链表达载体。
将上述构建好的曲妥珠单抗重链、帕妥珠单抗重链和轻链表达载体分别转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆接种于500ml LB培养基中扩增。利用Qiagen公司超纯质粒纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)，按照生产商说明书抽提纯化DNA。采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒将上述含重链和轻链编码序列的质粒DNA以一定比例(1:1:2)共转染入CHO-K1，操作方法按照生产商说明书进行。
转染后24-48小时将细胞培养基更换为含筛选药物的筛选培养基，每3-4天更换一次筛选培养基，直至细胞克隆形成。待细胞克隆直径达1-2mm时用克隆环从平板上挑取单克隆转接入24孔板中。单细胞克隆在24孔板中长至50-70％满层时，取各克隆的培养上清进行ELISA检测，选取表达量高且生长状态良好的细胞进行扩增培养。
上述ELISA检测方法为将曲妥珠单抗特异性抗原
帕妥珠特异性抗原
分别用包被液(pH9.6CBS)稀释到一定浓度(2μg/ml)后包被于96孔板上，100μl/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入300μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液PBS(pH7.0)稀释标准品曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，100ng/mL起始二倍比稀释7个点。表达上清根据情况适当稀释，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体(HRP-抗人IgGγ轻链特异性抗体，Thermo)至一定浓度(1:2000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育20min。加入终止液50μl/孔，终止反应。在490nm处读取吸收值OD，根据标准曲线计算样品的含量。
最终得到野生型突变体KJ015m1、KJ015m2和KJ015m3抗体表达细胞株。各细胞株采用CD2基础培养基
扩增至100ml体积，进行补料批培养，从第3天开始，每天补加2％Feed4
悬浮培养12天后，分别收集培养上清液，通过ProteinA亲和层析法，初步纯化得到3个共同轻链双特异性单抗蛋白样品(图2)。图2说明3个双特异性单抗蛋白纯度均较高。
实施例5：抗人HER2不同表位双特异抗体与HER2亲和力检测
将曲妥珠单抗特异性抗原
帕妥珠特异性抗原
HER2全长抗原
分别用包被液(pH9.6CBS)稀释到一定浓度(2μg/ml)后包被于96孔板上，100μl/孔，于2～8℃放置过夜。弃去孔中液体，用PBST洗3次，甩干后加入300μl/孔的封闭液(1％BSA PBST)，室温2hr，再用PBST洗3次，甩干。用稀释液PBS(pH7.0)稀释标准品曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，2000ng/mL起始三倍比稀释10个梯度，以100μl/孔复孔加样至96孔板中，37℃孵育1hr，弃液，洗板3次，甩干。用稀释液稀释酶联抗体(HRP-抗人IgGγ轻链特异性抗体，Thermo)至一定浓度(1:2000)，以100μl/孔加至96孔板中，37℃下反应1hr，弃液，洗板3-6次，甩干。配制底物混合液，以100μl/孔加入到96孔板中，37℃孵育20min。加入终止液50μl/孔，终止反应。
表3.各HER2抗体与HER2不同表位抗原ELISA亲和力检测结果
注：**和KJ015w相比，P＜0.01；***和KJ015w相比，P＜0.001。
表3结果说明，本发明的双特异性抗体KJ015m1、KJ015m2和、KJ015m3与帕妥珠抗体特异性抗原结合的亲和力均比野生型(即KJ015w)的高(P＜0.001)。本发明的双特异性抗体与曲妥珠抗体特异性抗原的结合与野生型相当，其中KJ015m1的亲和力略优于野生型(P＜0.01)。在与HER2全长抗原的结合实验中，KJ015m1、KJ015m2表现与野生型相当，KJ015m3的亲和力明显优于野生型(P＜0.001)。
实施例6：抗人HER2不同表位双特异抗体热稳定性检测
将待测抗体用PBS稀释至1mg/ml，将SYPRO orange dye染料(Life technologies)用去离子水稀释至40×。取稀释后样品12.5μL，加入40×染料2.5μl、去离子水5μL；按照每孔20μl上样复孔。封膜后上机，以25℃运行2分钟、95℃运行2分钟的PCR反应程序进行反应。将原始读数导出，将结果导入Graphpad Prism进行曲线拟合分析。检测得到各样品Tm值见表4，结果表明M1～M3轻链变体的热稳定性均较好。
表4.抗人HER2不同表位双特异抗体热稳定性数据
实施例7：抗人HER2不同表位双特异抗体重链改造
选择轻链变体M1～3作为轻链，进行帕妥珠单抗重链突变改造。使用M1、M2、M3混合轻链，利用kunkel技术对单一重链模板的目标区域进行高通量突变，构建文库两个：文库一的突变区域在HCDR1、HCDR2和HCDR3；文库二的突变区域在HCDR2。分别电转超级感受态细胞，扩大培养；分别收获噬菌体文库一和文库二。
使用抗原重组蛋白HER2 ECD
作为baits，基于maxi-sorp 96孔板的固相法筛选，采用滴度检测验证噬菌体是否富集。使用文库一和文库二分别筛选。对每个文库分别富集的噬菌体，挑选48个单克隆进行培养。收集培养得到的噬菌体，进行ELISA鉴定。挑选出比野生抗体亲和力高的阳性单克隆，并进行DNA测序，得到抗体序列。
实施例8：候选序列亲和常数检测
基于实施例1的质粒，重链和轻链编码序列的质粒DNA以一定比例(1:1)共转染入ExpiCHO-S细胞株(Gibco)，操作方法按照
转染试剂盒说明书进行。转染后培养7-10天，收取培养上清，用Protein A亲合层析的方法纯化后用于亲和常数检测。
采用Biacore T200测定单靶点的HER2抗体与HER2 ECD抗原
的亲和力。首先将Anti-Human Fc(AHC)抗体偶联到CM5芯片上，然后用AHC捕获待测试的抗体IgG(2μg/ml)，再将不同浓度的三种抗原分子流过捕获了IgG的芯片表面，检测HER2抗体与各不同浓度抗原的结合活性，得到的数据根据Biacore T200分析软件进行拟合，得到确切的动力学常数。详细的亲和力常数结果见表5。根据亲和常数数据，经亲和力改造的帕妥珠重链的亲和力常数相对于野生型帕妥珠重链均提高了两个数量级。D102E曲妥珠重链相对于野生型曲妥珠重链，亲和力提高了约3倍。
表5.候选序列亲和力常数
注：表5的候选重链中，相对帕妥珠重链的可变区序列，仅发生了HCDR2和HCDR3区域的突变。另，HCDR1的序列均为SEQ ID NO:5。
实施例9：抗人HER2不同表位双特异抗体制备
基于实施例1的质粒，按照表7进行抗体重链的基因合成，并进行质粒抽提得到对应重链质粒。按照相同方法构建N30S M1轻链、N30S M2轻链、D102E曲妥珠重链。采用
的瞬时转染试剂盒将上述含重链和轻链编码序列的质粒DNA以一定比例(1:1:2)共转染入ExpiCHO-S细胞株(Gibco)，操作方法按照
转染试剂盒说明书进行。转染后培养7-10天，收取培养上清，用protein A亲合层析的方法纯化后用于功能评价。纯化后样品采用0.22μm膜除菌过滤，2～8℃保存。得到样品信息见表6。样品保存过程中发现，仅KJ015-E样品出现了沉淀现象，其他样品均澄清，说明KJ015-E样品不稳定。
表6.HER2双特异性抗体序列组合
| 名称 | 共同轻链 | 第二重链 | 第一重链 |
| KJ015-A | M1 | 曲妥珠重链 | 表5重链序号1 |
| KJ015-B | M1 | 曲妥珠重链 | 表5重链序号2 |
| KJ015-C | N30S M1 | D102E曲妥珠重链 | 表5重链序号1 |
| KJ015-D | N30S M1 | D102E曲妥珠重链 | 表5重链序号2 |
| KJ015-E# | SEQ ID NO:54 | SEQ ID NO:92 | SEQ ID NO:64 |
#：序号为来自专利US20170029529的SEQ ID NO。
实施例10：抗人HER2不同表位双特异抗体纯度检测
参照分子排阻色谱法(中国药典2010版三部附录III B)进行KJ015抗体纯度检测。以亲水改性硅胶为填充剂(TSKgel SuperSW mAb HR，300×7.8mm)，以磷酸氢二钠和异丙醇的混合溶液(取磷酸氢二钠28.4g，加纯化水溶解并稀释至800ml，用磷酸调节pH值至7.0，加异丙醇10ml，用纯化水定容至1L)为流动相；流速为每分钟0.7ml；检测波长为280nm。取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪进行检测。按峰面积归一化法计算抗体单体峰面积。参考USPMedicines Compendium Bevacizumab以及Beckman Coulter官方文档、采用PA800 plus仪器进行KJ015样品的CE-SDS检测。检测得到各样品的纯度值见表7。由此可见，各抗体纯度均较高，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗相近，可用于后续的活性评价工作。
表7.各待测抗体样品纯度
实施例11：抗人HER2不同表位双特异抗体热稳定性检测
将待测抗体用PBS稀释至1mg/mL，将SYPRO orange dye染料(Life technologies)用去离子水稀释至40×。取稀释后样品12.5μL，加入40×染料2.5μl、去离子水5μL；按照每孔20μl上样复孔。封膜后上机，以25℃运行2分钟、95℃运行2分钟的PCR反应程序进行反应。将原始读数导出，将结果导入Graphpad Prism进行曲线拟合分析。检测得到各样品Tm值见表8。由此可见，各抗体Tm值差异不大，与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗相近。
表8.各样品Tm值
实施例12：抗人HER2不同表位双特异抗体细胞结合活性
细胞培养瓶放置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色及细胞汇合度，记录细胞倍增时间。每隔2-4天对细胞进行传代培养。细胞约80％满层时，进行消化种板。弃培养基，用PBS洗一次，添加0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化。吹打细胞收集至离心管中，500g离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液进行计数。用PBS(含1％BSA)重悬细胞，调整细胞密度至3×106个/mL。
用含2％FBS的培养基稀释待测药物，先将待测药物稀释至固定浓度，再3倍梯度稀释5次，获得6个浓度梯度的药物。不同细胞，抗体起始浓度不同，详细见结果图中起始浓度点。取100μL重悬后细胞，加入终浓度为300nM～1nM的待检测抗体，以同型IgG
作为阴性对照，4℃孵育1小时。孵育结束后，预冷PBS洗3次，用50μL PBS(含1％BSA)重悬细胞，加入抗人荧光二抗，4℃孵育半小时。孵育结束后，预冷PBS洗3次，上机检测。
检测结果显示(图3)，KJ015A-D样品均具有结合活性，且高于曲妥珠单抗，和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗混合样品结果相当。
实施例13：抗人HER2不同表位双特异抗体内吞活性
细胞培养瓶放置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色及细胞汇合度，记录细胞倍增时间。每隔2-4天对细胞进行传代培养。细胞约80％满层时，进行消化种板。弃培养基，用PBS洗一次，添加0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化。吹打细胞收集至离心管中，500g离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液进行计数。用PBS(含1％BSA)重悬细胞，调整细胞密度至3×106个/mL。
取100μL重悬后细胞，加入终浓度为10μg/mL(NCI-N87)、50μg/mL(MCF-7)的待检测抗体，以同型IgG
作为阴性对照，4℃孵育1小时。用预冷PBS洗3次，用100μL完全培养基重悬细胞，放置在37℃细胞培养箱中孵育1小时。孵育结束后，预冷PBS洗3次，用50μLPBS(含1％BSA)重悬细胞，加入抗人荧光二抗，4℃孵育半小时。孵育结束后，预冷PBS洗3次，上机检测。内吞(％)＝1-(MFI某时间点供试品处理组-MFI该时间点对照hIgG)/(MFI0小时供试品处理组-MFI0小时对照hIgG)×100％计算出各待检抗体在各时间点的内吞率后作图。
内吞结果如图4所示，在NCI-N87细胞上，所有4个样品的内吞效率均介于曲妥珠单抗和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗之间；针对MCF-7细胞，KJ015-A样品活性略低于曲妥珠单抗和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗，KJ015-B样品活性与这两个抗体相当，KJ015-C、KJ015-D样品的活性则高于曲妥珠单抗和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用。
实施例14：抗人HER2不同表位双特异抗体增殖抑制活性
采用细胞增殖抑制的方法评价不同变体的抗HER2抗体抑制HER2阳性肿瘤细胞的表达，所用细胞系如表9所示。
细胞培养瓶放置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色及细胞汇合度，记录细胞倍增时间。每隔2-4天对细胞进行传代培养。细胞约80％满层时，进行消化种板。弃培养基，用PBS洗一次，添加0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化。吹打细胞收集至离心管中，500g离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液进行计数。用含2％FBS的培养基将细胞密度调整至1×105个/mL，100μL每孔铺至96孔板中。
用含2％FBS的培养基稀释待测药物，先将待测药物稀释至20-6000μg/mL，再2.2～3倍梯度稀释8-10次，获得9-11个浓度梯度的药物，最后一个点为阴性对照点。不同细胞，抗体起始浓度不同，详细见结果图中起始浓度点。取稀释好的药物100μL加入已铺好细胞的96孔板对应孔中，每个点双复孔。将96孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育反应96～120小时。
孵育结束，96孔板中加入CCK8试剂
20μL/孔，微孔板震荡仪震荡混匀。染色0.5-6小时后，用酶标仪读取OD 450nm吸光度数值。采用GraphPad软件对原始数据进行曲线拟合分析。
表9.细胞增殖抑制率
MDA-MB-175细胞增殖抑制活性的结果(图5)显示，A～D样品均能够抑制MDA-MB-175细胞的生长，均呈剂量依赖性，增殖抑制活性显著高于曲妥珠单抗。其中KJ015-A、B样品和曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用活性相当；KJ015-C、D样品的最高抑制率为曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用的1.1倍；KJ015-D样品的EC50值为1.5μg/ml，低于曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合样品的2.3μg/ml。
BT474细胞增殖抑制活性的结果结果(图6)显示，KJ015-A～D能够抑制BT474细胞的生长，均呈剂量依赖性。其样品的增殖抑制活性显著优于曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用，最大抑制率均约为曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用的1.2倍。
SK-BR-3细胞增殖抑制活性的结果(图7)显示，KJ015-A～D能够抑制SK-BR-3细胞的生长，均呈剂量依赖性。其样品的增殖抑制活性显著优于曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用，最大抑制率均约为曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用的2.2倍。
NCI-N87细胞增殖抑制活性的结果(图8)显示4个候选抗体对NCI-N87细胞的杀伤活性基本相当；对NCI-N87细胞的最大杀伤率均高于曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用，最大抑制率均约为曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用的1.6～1.7倍。
Calu-3细胞增殖抑制活性的结果结果(图9)显示，KJ015-A～D能够抑制Calu-3细胞的生长，均呈剂量依赖性。其样品的增殖抑制活性显著高于曲妥珠单抗，是曲妥珠单抗+帕妥珠单抗联合使用的平均约1.2倍。
实施例15：抗人HER2不同表位双特异抗体ADCC活性
细胞培养瓶放置于37℃、5％二氧化碳恒温培养箱中静置培养，每天观察培养基颜色及细胞汇合度，记录细胞倍增时间。每隔2-4天对细胞进行传代培养。细胞约80％满层时，进行消化种板。弃培养基，用PBS洗一次，添加0.25％胰蛋白酶(Gibco)进行消化。吹打细胞收集至离心管中，500g离心3min。弃上清，加入完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液进行计数。用含2％FBS的培养基将细胞密度调整至2.5～7.5×105个/mL，100μL每孔铺至96孔板中。
96孔板过夜培养后，进行加样。用含1％FBS的培养基稀释待测药物，先将待测药物稀释至75～300μg/mL(起始浓度可根据不同细胞进行调整)，再4～5倍梯度稀释8次，获得9个浓度梯度的药物，最后一个点为阴性对照点。不同细胞，抗体起始浓度不同，详细见结果图中起始浓度点。取稀释好的药物25μL加入已铺好细胞的96孔板对应孔中，每个点双复孔。用1640+1％FBS将效应细胞Jurkat-NFAT/CD16a稀释至1～3×106/mL，每孔加入25uL。(效应细胞数可根据不同细胞进行调整)在96孔板边缘添加足量灭菌水，后将96孔板放置于二氧化碳培养箱中孵育反应4-6小时。
孵育结束，将待测细胞从培养箱中取出，放置于室温(22℃-25℃)至少平衡15min，然后向96孔板中加入室温孵育后的荧光素酶试剂
75μL/孔，微孔板震荡仪震荡混匀，室温放置3-5min，用酶标仪读取荧光值。采用GraphPad软件对原始数据进行曲线拟合分析。
JIMT-1细胞ADCC活性的结果(图10)显示，KJ015-A-D样品均具有ADCC活性并且呈剂量依赖性，A样品最大信号值分别为曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的1.2倍；B样品分别为1.3倍和1.2倍；C样品分别为1.5倍和1.3倍；D样品分别为1.5倍和1.3倍；说明KJ015-A-D样品的ADCC活性均高于曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用。
SK-BR-3细胞ADCC活性的结果(图11)显示，KJ015-A-D样品均具有ADCC活性并且呈剂量依赖性，A～D样品最大信号值分别为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的1.8倍、1.7倍、1.7倍、1.6倍；说明KJ015-A-D样品的ADCC活性均高于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用。
NCI-N87细胞ADCC活性的结果(图12)显示，KJ015-A-D样品均具有ADCC活性并且呈剂量依赖性，A～C样品最大信号值均约为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的1.2倍；说明KJ015-A-C样品的ADCC活性均高于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用。KJ015-D样品的ADCC活性与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用相当。KJ015-E样品的活性最大信号值为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的0.9倍，EC50值为46.07ng/ml，与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的10.17ng/ml差异显著。
MDA-MB-175细胞ADCC活性的结果(图13)显示，KJ015-A-D样品均具有ADCC活性并且呈剂量依赖性，A～D样品最大信号值均约为曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用的1.2、1.4、1.3、1.2倍；说明KJ015-A-D样品的ADCC活性均高于曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用。KJ015-E样品的ADCC活性与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗联合使用相当。
本发明主要涉及的序列如下表10所示。
表10本发明抗体序列
本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州康聚生物科技有限公司
<120> 抗HER2的双特异性抗体及其应用
<130> P180116923C
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<223> 曲妥珠轻链可变区WT
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<223> 曲妥珠轻链WT
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
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<212> PRT
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<220>
<223> 第二重链可变区（曲妥珠）WT
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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<223> 第一重链可变区（帕妥珠）WT
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
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Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
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65 70 75 80
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85 90 95
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<223> 帕妥珠HCDR1
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Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp
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<220>
<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）WT
<400> 6
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体1
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体2
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Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Leu Asn Val Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体3
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体4
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Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Phe Asn His Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体5
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Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Ile Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体6
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Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR2（帕妥珠）变体7
<400> 13
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Thr Asn Gln Arg Phe Lys
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Gly
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）WT
<400> 14
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）变体1
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Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）变体2
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Ala Arg Asn Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）变体3
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Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）变体4
<400> 18
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Leu Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
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<211> 12
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<213> Artificial Sequence
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<223> 第一重链HCDR3（帕妥珠）变体5
<400> 19
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Tyr Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
Claims (17)
1.一种抗HER2的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包括分别用于识别HER2的胞外结构域II和胞外结构域IV的第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包括第一重链和轻链，所述第二蛋白功能区包括第二重链和轻链，其中，所述第一重链包括如SEQ ID NO:4的氨基酸序列或其突变所示的重链可变区，所述第二重链包括如SEQID NO:3的氨基酸序列或其突变所示的重链可变区，且所述轻链包括轻链可变区，所述轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下位点的一个或多个氨基酸的置换：R24、N30、T31、A32、F53、L54、S56、R66、H91、T93、T94和P96。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的轻链可变区中，所述氨基酸置换是将原氨基酸残基置换为选自以下的氨基酸残基：D、E、S、T、N、Q、G、A、V、I、L、K、M、F、Y、W和R。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生一个或多个以下氨基酸残基的置换：R24K、N30S、T31I、A32G、F53Y、L54R、S56T、R66G、H91Y、T93I、T94Y和P96Y；优选发生一个或多个以下氨基酸残基的置换：N30S、F53Y、L54R、S56T和P96Y。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体还包括轻链恒定区，所述轻链恒定区优选人轻链恒定区λ链或κ链；较佳地，所述轻链在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的第一重链和第二重链还包括重链恒定区，所述重链恒定区优选人重链恒定区；较佳地，所述双特异性抗体的第一重链和第二重链间形成异二聚体，所述第一重链和第二重链优选由Knob-in-Hole结构连接；更佳地，所述第二重链的重链可变区在如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列上发生D102E突变。
7.如权利要求1-6中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的第一重链的重链可变区包含以下CDR序列：如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQID NOs:6-13所示的HCDR2，如SEQ ID NOs:14-19所示的HCDR3；
优选地，所述第一重链的重链可变区包含如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:6所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ IDNO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:16所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQID NO:8所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:9所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:10所示的HCDR2，如SEQ ID NO:15所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:11所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:12所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQ IDNO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:13所示的HCDR2，如SEQ ID NO:17所示的HCDR3；或，如SEQID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:18所示的HCDR3；或，如SEQ ID NO:5所示的HCDR1，如SEQ ID NO:7所示的HCDR2，如SEQ ID NO:19所示的HCDR3。
8.如权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体降低了岩藻糖修饰；优选地，所述抗体是无岩藻糖修饰的。
9.一种编码含如权利要求1-7中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合部分的核酸序列。
10.一种表达载体，其包含如权利要求9所述的核酸序列。
11.一种原核或真核细胞，其包含如权利要求l0所述的表达载体。
12.一种轻链，其特征在于，所述轻链包括轻链可变区，所述轻链可变区在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y；优选地，所述轻链还包括轻链恒定区，所述轻链恒定区优选人轻链恒定区λ链或κ链；更优选地，所述轻链在SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列上发生选自以下组的氨基酸残基的置换：(1)F53Y，(2)F53Y、L54R和S56T，(3)P96Y，(4)N30S和F53Y，(5)N30S、F53Y、L54R和S56T，或(6)N30S、P96Y。
13.如权利要求12所述的轻链在制备抗体中的应用；优选地，所述抗体为scFv、Fab’、F(ab)2或全长抗体，或单克隆抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
14.一种抗HER2的双特异性抗体的药物偶联物，其特征在于，其由如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体与细胞毒性药物共价偶联；
优选地，所述细胞毒性药物为微管蛋白抑制剂、拓扑异构酶抑制剂或DNA小沟抑制剂；
更优选地，所述微管蛋白抑制剂为美登素类化合物、奥瑞斯他汀衍生物或微管素；所述拓扑异构酶抑制剂为DXd或其衍生物、SN-38或阿霉素及其衍生物；所述DNA小沟抑制剂为卡奇霉素、倍癌霉素及其衍生物、吡咯苯二氮平类化合物或吲哚苯二氮平类化合物。
15.一种包括如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体的药物组合物；优选地，所述药物组合物还包括透明质酸酶；更优选地，所述透明质酸酶为rHuPH20或经修饰的rHuPH20；最优选地，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
16.一种制备如权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)将包含编码所述重链的核苷酸序列和包含编码所述轻链的核苷酸序列构建在同一载体或不同的载体中；
(2)将上述步骤构建的载体在不同宿主细胞或同一宿主细胞中表达。
17.如权利要求1-8中任一项所述的抗HER2的双特异性抗体、权利要求12或13所述的轻链、权利要求14所述的抗HER2的双特异性抗体的药物偶联物和权利要求15所述的包括双特异性抗体的药物组合物在制备治疗HER2表达肿瘤药物中的应用；优选地，所述阳性肿瘤包括乳腺癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、食管癌、和头颈癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌、皮肤癌；更优选为乳腺癌、胃癌和肺癌。
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