CN117126289A - 一种抗trop-2/cd3双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体药物技术领域，具体地，涉及一种抗TROP‑2/CD3双特异性抗体。本发明的抗TROP‑2/CD3双特异性抗体包含第一抗原结合结构域D1和第二抗原结合结构域D2，其中D1为抗TROP‑2抗体或其抗原结合片段，D2为抗CD3抗体或其抗原结合片段。本发明的抗TROP‑2/CD3双特异性抗体可用于实现T细胞介导的免疫反应，特别是有效促进针对表达TROP‑2的肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤，从而有效地抑制肿瘤。

Description

一种抗TROP-2/CD3双特异性抗体
技术领域
本发明涉及抗体药物技术领域，具体地，涉及一种抗TROP-2/CD3双特异性抗体。
背景技术
人滋养层细胞表面抗原2(human trophoblast cell surface antigen 2,TROP-2)是由TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白。TROP-2为单次跨膜的I型膜蛋白，由323个氨基酸构成，其中信号肽26个氨基酸，胞外区248个氨基酸，跨膜区23个氨基酸，胞内区26个氨基酸。截至目前，TROP-2的配体蛋白还没有鉴定到，因此对其生理生化功能还不是十分明确。但是大量的临床研究和文献报道，TROP-2蛋白在各种人类上皮癌中高表达并且与患者的预后不良和癌细胞转移密切相关，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和宫颈癌等。美国FDA已经批准TROP-2抗体偶联药物赛妥珠单抗-格卫替康(sacituzumabgovitecan)用于转移性三阴性乳腺癌的治疗。
分化簇3(cluster of differentiation 3,CD3)是T细胞表面重要的分化抗原，CD3分子与T细胞受体(T cell recptor,TCR)形成TCR-CD3复合体，TCRαβ亚基识别胞外信号并将胞外信号传递给CD3，CD3分子依靠自身免疫酪氨酸信号模体(immunoreceptortyrosine-based activation motif,ITAM)将信号向胞内传递。抗CD3抗体可激发或阻断T细胞活化信号，清除效应T细胞或诱导调节T细胞产生。
双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)也称为双功能抗体，是同时靶向两种不同抗原或相同抗原不同表位的特异性药物。BsAb可将免疫细胞和病毒分子等作用于肿瘤细胞，增强对靶细胞的杀伤作用，也可以同时结合肿瘤细胞的不同抗原，增强其结合特异性并降低脱靶效应。双特异性抗体拓宽了抗体药物的应用领域，为肿瘤免疫提供了新的研究思路。
然而，目前本领域尚缺乏令人满意的针对TROP-2和CD3的双特异性抗体。因此，本领域亟待开发一种新的抗TROP-2和CD3的双特异性抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的抗TROP-2和CD3的双特异性抗体，该双特异性抗体能同时与TROP-2及CD3特异结合，从而激活T细胞靶向性杀伤TROP-2阳性表达的肿瘤细胞。本发明的目的还在于提供编码所述双特异性抗体的多核苷酸分子；提供包含所述分子的表达载体；提供包含所述表达载体的宿主细胞；提供所述双特异性抗体的制备方法；提供包含所述双特异性抗体的药物组合物；提供包含所述双特异性抗体的免疫偶联物；提供所述双特异性抗体或所述药物组合物在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的应用；提供所述融合蛋白、所述药物组合物或所述免疫偶联物治疗癌症或肿瘤的方法。
为了达到上述目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明的第一个方面提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含第一抗原结合结构域D1和第二抗原结合结构域D2，所述D1为抗TROP-2抗体或其抗原结合片段，所述D2为抗CD3抗体或其抗原结合片段。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含单体或单体形成的二聚体，所述二聚体可以是同源的或异源的，所述单体从N端到C端包含选自以下组的结构：
其中，
VLA代表抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHA代表抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
VLB代表抗CD3抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHB代表抗CD3抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
CH代表重链恒定区；
CL代表轻链恒定区；
L1、L2和L3各自独立地为键或接头；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含选自以下组的结构：
a)结构I的单体形成的同源二聚体；
b)结构II的单体形成的同源二聚体。
在另一优选例中，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ ID NO.9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述互补决定区包含至少一个氨基酸突变。
在另一优选例中，所述突变用于提高双特异性抗体的表达水平。
在另一优选例中，所述突变用于降低双特异性抗体对人CD3的亲和力。
在另一优选例中，所述互补决定区包含：
a)抗CD3抗体或其抗原结合片段的HCDR1：X1X2AMN，和/或，
b)抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的HCDR1：X3YWLG，
所述氨基酸突变选自X1不为T、X2不为Y、和X3不为I的组。
在另一优选例中，所述氨基酸突变选自X1为G、X2为S、和X3为D或E的组。
在另一优选例中，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQID NO.11、SEQ ID NO.12所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
在另一优选例中，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在另一优选例中，所述可变区包含至少一个氨基酸突变。
在另一优选例中，所述可变区包含选自以下组的氨基酸突变：
a)所述SEQ ID NO.16具有第31位的氨基酸突变；
b)所述SEQ ID NO.18具有第31位的氨基酸突变；
c)所述SEQ ID NO.18具有第32位的氨基酸突变。
在另一优选例中，所述可变区包含选自以下组的氨基酸突变：
a)所述SEQ ID NO.16具有I31D；
b)所述SEQ ID NO.16具有I31E；
c)所述SEQ ID NO.18具有T31G；
d)所述SEQ ID NO.18具有Y32S。
在另一优选例中，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
在另一优选例中，所述抗TROP-2或抗CD3抗原结合片段选自Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)；所述抗TROP-2或抗CD3抗体为IgG抗体。
在另一优选例中，所述抗TROP-2或抗CD3抗体选自嵌合抗体、鼠源抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述抗TROP-2抗体是低内吞抗体，更有利于持续发挥作用。
在另一优选例中，所述IgG抗体包含重链恒定区和轻链恒定区；更优选地，所述重链恒定区选自人IgG1、人IgG2、人IgG3或人IgG4，所述轻链恒定区选自人κ(Kappa)或人λ(Lambda)。
在另一优选例中，所述IgG抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.39所示的IgG1重链恒定区。
在另一优选例中，所述IgG抗体包含氨基酸序列如SEQ ID NO.40所示的人κ(Kappa)轻链恒定区。
在另一优选例中，所述IgG抗体的恒定区包含至少一个氨基酸突变。
在另一优选例中，所述氨基酸突变是可促进两条重链异源二聚化的杵臼结构(knob-in-hole,KIH)突变；更优选地，所述突变位于恒定区CH3区。
在另一优选例中，所述D1为IgG抗体，所述D2为scFv；更优选地，所述D2连接至D1的N末端或C末端，或连接至D1的CH1和CH2之间；进一步更优选地，所述D2连接至D1的重链。
在另一优选例中，所述D2包含一个、两个、三个或多个抗CD3的scFv。
在另一优选例中，所述scFv从N端到C端包含VH-L1-VL结构或VL-L1-VH结构。
在另一优选例中，所述抗TROP-2抗体选自抗TROP-2-VH-I31D单抗和抗TROP-2-VH-I31E单抗。
在另一优选例中，所述抗CD3抗原结合片段选自CD3-scFv和CD3-scFv-VH-T31G-Y32S。
上述连接是指通过接头或通过肽键直接相连。
在另一优选例中，所述接头L1、L2、L3的氨基酸序列独立地为(G4S)n或4G，n选自1、2、3、4、5、6。
在另一优选例中，所述接头L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示。
在另一优选例中，所述接头L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示。
在另一优选例中，所述接头L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体或异源二聚体。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体，包含抗TROP-2的IgG抗体和两个抗CD3的scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过接头L1连接，每个抗CD3的scFv通过接头L2和L3，连接到抗TROP-2的免疫球蛋白抗体IgG的CH1和CH2之间。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为同源二聚体，包含抗TROP-2的IgG抗体和两个抗CD3的scFv，其中每个scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过接头L1连接，每个抗TROP-2的scFv通过接头L2和抗TROP-2的免疫球蛋白抗体IgG重链的N端串联。
在另一优选例中，所述双特异性抗体为异源二聚体，包含抗TROP-2的IgG抗体和一个抗CD3的scFv，其中scFv包含可变区VH和可变区VL，VH与VL通过接头L1连接，抗CD3的scFv通过接头L2与任一抗TROP-2的免疫球蛋白抗体IgG重链的N端串联。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链的氨基酸序列选自下组：
a)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
b)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
c)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
或，
d)将a)、b)或c)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗TROP-2活性和抗CD3活性的由a)、b)或c)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述双特异性抗体包括所述双特异性抗体的活性片段和/或衍生物，其中，所述活性片段和/或所述衍生物保留了所述双特异性抗体的70-100％(如70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％)的抗TROP-2活性和70-100％的抗CD3活性。
在另一优选例中，所述双特异性抗体的衍生物是所述双特异性抗体经过一个或几个氨基酸突变(氨基酸缺失、插入和/或取代后)并保持至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性的多肽。
在另一优选例中，所述氨基酸突变为保守性氨基酸取代。
在另一优选例中，所述氨基酸突变位于框架区或恒定区。
本发明的第二个方面提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的双特异性抗体。
在另一优选例中，所述多核苷酸分子包含编码所述双特异性抗体重链的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.35、SEQ ID NO.36或SEQ ID NO.37所示；和，编码所述双特异性抗体的轻链的多核苷酸分子，核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示。
本发明的第三个方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有所述的多核苷酸分子。
在另一优选例中，所述表达载体为病毒或质粒，较佳地为噬菌体或者噬菌粒。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：pcDNA3.4、pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR、pTT5、pDHFF、pGM-CSF或pCHO 1.0，较佳地为pcDNA3.4。
本发明的第四个方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的表达载体。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：COS、CHO、293F、293E、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，较佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。
本发明的第五个方面提供了上述双特异性抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养所述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体；
b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。
本发明的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的上述的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂等。
在另一优选例中，所述药物组合物包含上述的双特异性抗体、醋酸盐、海藻糖、盐酸精氨酸或吐温等。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括胃肠给药剂型或胃肠外给药剂型。
在另一优选例中，所述的胃肠外给药剂型包括玻璃体注射、静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射、颅内注射或腔内注射等。
本发明的第七个方面提供了上述的双特异性抗体或药物组合物在制备癌症或肿瘤的药物中的用途。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤为TROP-2阳性癌症或肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症或肿瘤选自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、肛门区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其组合。
本发明的第八个方面提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包含：
a)上述的双特异性抗体；和
b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶等。
在另一优选例中，所述偶联物部分选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、磁共振成像或电子计算机X射线断层扫描技术的造影剂，或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素或细胞因子等。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物包括抗体-药物偶联物。
在另一优选例中，所述的免疫偶联物用于制备治疗肿瘤或癌症的药物组合物。
在本发明的第九个方面提供了一种治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的第一方面所述的双特异性抗体、本发明的第六方面所述的药物组合物、或本发明的第八方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述方法还包括和其他的抗肿瘤药联合给药。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
本发明的抗TROP-2/CD3双特异性抗体的积极进步效果在于：(1)可以通过结合T细胞调节T细胞免疫活性，并特异性结合表达TROP-2的肿瘤细胞，从而诱导免疫细胞靶向杀伤TROP-2阳性的肿瘤细胞。特别地，其肿瘤细胞杀伤效果及激发免疫细胞释放IL-2细胞因子的能力均优于对照抗CD3单抗；(2)特异性高、安全性好；(3)表达量高；(4)结构稳定。
附图说明
图1A显示了抗TROP-2/CD3双抗a和b的结构示意图。
图1B显示了抗TROP-2/CD3双抗c的结构示意图。
图2A显示了抗TROP-2/CD3双抗a的UPLC检测图谱。
图2B显示了抗TROP-2/CD3双抗b的UPLC检测图谱。
图2C显示了抗TROP-2/CD3双抗c的UPLC检测图谱。
图3A显示了ELISA检测抗TROP-2/CD3双抗a和c与TROP-2的结合。
图3B显示了ELISA检测抗TROP-2/CD3双抗a、b和c与CD3的结合。
图4A显示了在抗TROP-2/CD3双抗b作用下，hPBMC对Colo205细胞的杀伤作用。
图4B显示了在抗TROP-2/CD3双抗b作用下，hPBMC对MDA-MB-231细胞的杀伤作用。
图4C显示了在抗TROP-2/CD3双抗b作用下，hPBMC对A549细胞的杀伤作用。
图5A显示了在抗TROP-2/CD3双抗b作用下，hPBMC杀伤Colo205细胞过程中释放的IL-2含量。
图5B显示了在抗TROP-2/CD3双抗b作用下，hPBMC杀伤MDA-MB-231细胞过程中释放的IL-2含量。
图6A显示了抗TROP-2/CD3双抗b在NCI-H292移植瘤模型上的抗肿瘤作用。
图6B显示了抗TROP-2/CD3双抗b在NCI-H292移植瘤模型上对小鼠的毒副作用。
图7A显示了抗TROP-2/CD3双抗a在25℃条件下处理28天的HPLC检测图谱。
图7B显示了抗TROP-2/CD3双抗a在37℃条件下处理28天的HPLC检测图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，获得一种新的靶向肿瘤细胞表面分子TROP-2和CD3的双特异性抗体，其能够保持两端抗体的活性，能同时结合TROP-2和CD3抗原。本发明的双特异性抗体可用于实现T细胞介导的免疫反应，特别是有效促进针对表达TROP-2的肿瘤细胞的T细胞介导的杀伤，从而有效地抑制肿瘤。意料不到的是，其肿瘤细胞杀伤效果及激发免疫细胞释放IL-2细胞因子的能力均优于对照抗CD3单抗，且安全性好。因此，本发明的双特异性抗体可以被开发为一种疗效优越的抗肿瘤药物。在此基础上完成了本发明。
术语
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。
本发明中，术语“抗体(Antibody，Ab)”和“免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)”是有相同结构特征的异四聚糖蛋白，其由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型(isotype)的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是恒定区，重链恒定区由三个结构域CH1、CH2、以及CH3构成。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区，轻链恒定区包括一个结构域CL；轻链的恒定区与重链恒定区的CH1结构域配对，轻链的可变区与重链的可变区配对。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)等。重链恒定区包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型；轻链恒定区包括κ(Kappa)或λ(Lambda)。抗体的重链和轻链通过重链的CH1结构域和轻链的CL结构域之间的二硫键共价连接在一起，抗体的两条重链通过铰链区之间形成的多肽间二硫键共价连接在一起。
本发明所述的“免疫球蛋白抗体IgG”约150kDa，由四条肽链构成，含有两条相同的约50kDa的γ重链，和两条相同的约25kDa的轻链，从而具有四聚体四级结构。两条重链通过二硫键相互连接，并各自与一条轻链连接。所成的四聚体具有相同的两半，二者形成叉型或者类似Y的形状，叉的每一端含有一个相同的抗原结合位点。IgG抗体可以基于重链的恒定区中氨基酸序列的微小差异而分为多个亚类(例如IgG1、2、3、4)。
本发明中，术语“双特异性抗体(或双抗)”是指能同时特异性结合两种抗原(靶点)或两种表位的抗体分子。根据对称性，双特异性抗体可以分为结构对称的和不对称的分子。根据结合位点的多少，双特异性抗体可以分为二价、三价、四价和多价分子。
本发明中，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同抗原决定簇的不同抗体的混合物)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们可以通过杂交瘤培养来合成，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
如本文所用，术语“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段或单一Fv片段等。抗原结合片段的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fv片段；或(iv)单链Fv(scFv)。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米体(例如单价纳米体和双价纳米体等)、小模块免疫药物和鲨鱼可变IgNAR域等。
本发明中，术语“Fab”和“Fc”是指木瓜蛋白酶可将抗体裂解为两个完全相同的Fab段和一个Fc段。Fab段由抗体的重链的VH和CH1以及轻链的VL和CL结构域组成。Fc段即可结晶片段(fragment crystallizable，Fc)，由抗体的CH2和CH3结构域组成。Fc段无抗原结合活性，是抗体与效应分子或细胞相互作用的部位。术语“F(ab')2”片段抗体是由胃蛋白酶消化整个IgG抗体，去除大部分Fc区同时完整保留一些铰链区后得到的，具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合F(ab')部分。
本发明中，术语“scFv”或“单链可变区片段scFv”为单链抗体(single chainantibody fragment，scFv)，是指包含免疫球蛋白重链VH和轻链VL可变区的融合蛋白，VH与VL通过含有15-25个氨基酸的接头(linker)相连，其中所述融合蛋白保留了完整免疫球蛋白相同的抗原特异性。
本发明中，术语“Fv片段”或“Fv抗体”含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv片段还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。
本发明中，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于重链可变区和轻链可变区中称为互补决定区(complementarity-determining region，CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为框架区(frame region，FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。
如本文所用，术语“框架区FR”指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。如本文所用，术语“人框架区”是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。
如本文所用，术语“接头”是指插入免疫球蛋白结构域中为轻链和重链的结构域提供足够的可动性以折叠成交换双重可变区免疫球蛋白的一个或多个氨基酸残基。在本发明中，优选的接头是指接头L1、L2和L3，其中L1连接单链抗体(scFv)的VH和VL，L2和L3将scFv连接到抗体重链的CH1和CH2之间，或直接通过L2连接到抗体的重链上(如抗体重链的N末端或C末端)。合适的接头实例包括单甘氨酸(Gly)或丝氨酸(Ser)残基，接头中氨基酸残基的标识和序列可随着接头中需要实现的次级结构要素的类型而变化。
本发明中，术语“抗”、“结合”、“特异性结合”是指两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。通常，抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的平衡解离常数(KD)结合该抗原。本发明中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。例如，使用表面等离子体共振术(surface plasmon resonance，SPR)在BIACORE仪中测定抗体与抗原的结合亲和力或使用ELISA测定抗体与抗原结合的相对亲和力。
本发明中，术语“表位”是指与抗体特异性结合的多肽决定簇或是抗原中被抗体结合的区域。
双特异性抗体
本发明的双特异性抗体为一种能与TROP-2和CD3特异结合的双特异性抗体，其包含抗CD3抗体部分和抗TROP-2抗体部分。
本发明的双特异性抗体可以为二聚体、三聚体或多聚体，优选为同源或异源二聚体。本发明的双特异性抗体中抗CD3或抗TROP-2的抗体部分可以包括一个或多个抗体或其抗原结合片段，较佳地，1、2、3、4、5或6个。
本发明的双特异性抗体还包括其保守性变异体，指与本发明的双特异性抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A.
本发明序列采用Kabat系统编号规则。
在构建本发明的双特异性抗体时，与该双特异性抗体的化学和物理稳定性相关的问题也得到了解决，诸如表达物理稳定的分子、增加热和盐依赖的稳定性、降低聚集、增加在高浓度下的溶解度以及维持分别针对两种抗原TROP-2和CD3的亲和力等。
编码核酸和表达载体
本发明另一方面提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码上述所述的双特异性抗体。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
本发明所述多核苷酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，较佳地包括以下制备方法：通过基因克隆技术例如PCR方法等，获得编码上述单克隆抗体的多核苷酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述单克隆抗体的多核苷酸分子。
本领域技术人员知晓，编码上述双特异性抗体的氨基酸序列的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对编码该双特异性抗体基因的一个或多个碱基在保持抗体活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
本发明另一方面提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述的多核苷酸分子。
这些载体可以用于转化到适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。其中所述表达载体为本领域常规的表达载体，是指包含适当的调控序列，例如启动子序列、终止子序列、多腺苷酰化序列、增强子序列、标记基因和/或序列以及其他适当的序列的表达载体。所述表达载体可以是病毒或质粒，如适当的噬菌体或者噬菌粒，更多技术细节请参见例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989，Sambrook等编著。许多用于核酸操作的已知技术和方案请参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology，第二版，Ausubel等编著。本发明所述表达载体较佳地为pDR1、pcDNA3.1(+)、pcDNA3.4、pcDNA3.1/ZEO(+)、pDHFR、pTT5、pDHFF、pGM-CSF或pCHO1.0，更佳地为pcDNA3.4。
本发明另外提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的表达载体。
本发明所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带所述的核苷酸可被有效表达即可。其中所述宿主细胞包括原核表达细胞和真核表达细胞，所述宿主细胞较佳地包括：COS、CHO(中国仓鼠卵巢，Chinese H amster Ovary)、NS0、sf9、sf21、DH5α、BL21(DE3)或TG1，更佳地为E.coli TG1、BL21(DE3)细胞(表达单链抗体或Fab抗体)或者CHO-K1细胞(表达全长IgG抗体)。将前述表达载体转化至宿主细胞中，即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
制备方法
本发明所述的宿主细胞的培养方法、所述抗体的分离和纯化方法为本领域常规方法，具体操作方法请参考相应的细胞培养技术手册以及抗体分离纯化技术手册。本发明中公开的抗TROP-2/CD3双特异性抗体的制备方法包括：在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达能与TROP-2和CD3特异结合的双特异性抗体；及分离和纯化所述的抗TROP-2/CD3双特异性抗体。利用上述方法，可以将重组蛋白纯化为基本均一的物质。
可以利用亲和层析的方法对本发明公开的抗TROP-2/CD3双特异性抗体进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的抗TROP-2/CD3双特异性抗体。本发明的发明人对所得抗TROP-2/CD3双特异性抗体进行了检测实验，实验结果表明该抗TROP-2/CD3双特异性抗体能很好地与靶细胞和抗原结合，具有较高的亲和力。
药物组合物
本发明的另一方面提供了一种组合物，优选地，所述的组合物是药物组合物。
本发明中，术语“药物组合物”是指本发明的双特异性抗体可以和药学上可以接受的载体一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的双特异性抗体的氨基酸核心序列的构象完整性，同时还保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5.0-8.0，较佳地pH约为6.0-8.0，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：静脉注射、静脉滴注、皮下注射、局部注射、肌肉注射、瘤内注射、腹腔内注射(如腹膜内)、颅内注射或腔内注射。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2-8℃条件下至少一年保持稳定；对于冻干制剂，通常可以在30℃条件下至少六个月保持稳定。所述双特异性抗体制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的双特异性抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-50毫克/千克体重。此外，本发明的双特异性抗体还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的双特异性抗体或其免疫偶联物施用于哺乳动物。其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
应用
本发明另一方面提供了上述能与TROP-2和CD3特异结合的双特异性抗体、或上述药物组合物在制备药物中的应用，所述药物用于治疗癌症或肿瘤。
本发明所称的用于治疗癌症或肿瘤的药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，进一步还包括已存在的肿瘤伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还包括减少或防止肿瘤的转移等。
本发明所述的药物针对的肿瘤较佳地包括但不限于：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、肛门区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性或急性白血病和所述癌的组合。
本发明的双特异性抗体及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药剂量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1-1800mg/天。
本发明的双特异性抗体及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药以达到更加有效治疗肿瘤的目的，这些抗肿瘤药包括但不限于：1、细胞毒类药物：1)作用于核酸化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝脲类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂(Cisplatin)、卡铂(Carboplatin)和草酸铂(Oxaliplatin)等；抗生素类如阿霉素(Adriamycin/Doxorubicin)、放线菌素D(Dactinomycin D)、柔红霉素(Daunorubicin)、表阿霉素(Epirubicin)、光辉霉素(Mithramycin)等；2)影响核酸代谢的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(Methotrexate)和培美曲塞(Pemetrexed)等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5-氟尿嘧啶、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(Hydroxycarbamide)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Cytosinearabinoside)和吉西他滨(Gemcitabine)等；3)作用于微管蛋白的药物：多西他赛(Docetaxel)、长春花碱(Vincristine)、长春瑞滨(Vinorelbine)、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱等；2、激素类药物：抗雌激素如他莫昔芬(Tamoxifen)、屈洛昔芬(Droloxifene)、依西美坦(Exemestane)等；芳香化酶抑制剂如氨鲁米特(Aminoglutethimide)、福美司坦(Formestane)、来曲唑(Letrozle)、阿那曲唑(Anastrozole)等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂类药物：此类药物主要通过调节机体免疫功能以到抗肿瘤的效果，如干扰素类(Interferon)、白细胞介素-2(Interleukin-2)、胸腺肽类(Thymosins)等；4、单克隆抗体类药物：曲妥昔单抗(Trastuzumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、西妥昔单抗(Cetuximab)、贝伐单抗(Bevacizumab)等。本发明公开的双特异性抗体及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
以下实施例中使用的实验材料和来源以及实验试剂的配制方法具体说明如下。
实验材料：
感受态细胞：品牌生工，货号B528412。
293F细胞：品牌GIBCO，货号R79007。
Colo205细胞：中科院细胞库，目录号TCHu102。
MDA-MB-231细胞：中科院细胞库，目录号TCHu227。
A549细胞：购自ATCC。
人肺癌细胞NCI-H292：中科院细胞库，目录号SCSP-582。
hPBMC：购自澳赛尔斯，货号FPB004F-C-MLR。
0.45μm的过滤器：品牌密理博，货号SLHV013SL。
实验试剂：
无内毒素质粒大提试剂盒：品牌天根，货号DP117。
DNA纯化回收试剂盒：品牌天根，货号DP214。
ClonExpressTM II One Step Cloning Kit：品牌诺唯赞，货号C112。
HS DNA Polymerase：品牌takara，货号R010B。
包被液：碳酸钠1.59克，碳酸氢钠2.93克，加入双蒸水定容至1L。
PBST：PBS+0.05％Tween 20。
Tween 20：品牌阿拉丁，货号T104863。
ELISA封闭液：PBST+1％BSA。
BSA：品牌生工，货号A60332。
TROP-2-HIS蛋白：品牌恺佧，货号TRP-HM121。
CD3-FC蛋白：品牌恺佧，货号CD3-HM205。
HRP标记的山羊抗人FC抗体：品牌博奥龙，货号BF03031。
HRP标记的山羊抗人Fab抗体：品牌赛默飞，货号A0293。
TMB：品牌BD Biosciences，货号555214。
终止液：2M硫酸溶液。
0.25％胰酶-EDTA：品牌GIBCO，货号25200-072。
1640完全培养基：RPMI1640培养基+10％FBS+1％Pen Strep+1％丙酮酸钠。
RPMI1640培养基：品牌GIBCO，货号22400089。
FBS：品牌GIBCO，货号10099-141。
Pen Strep：品牌GIBCO，货号1514022。
丙酮酸钠：品牌GIBCO，货号11360-070。
DMEM完全培养基：DMEM高糖培养基+10％FBS+1％Pen Strep+1％GLUMAX。
DMEM高糖培养基：品牌GIBCO，货号11965-092。
GlutaMAX：品牌GIBCO，货号35050-061。
Luminescent Cell Viability Assay：购自Promega，货号G7572。
Purified Mouse Anti-Human IL-2：购自BD Pharmingen，货号55051。
Biotin Mouse Anti-Human IL-2：购自BD Pharmingen，货号555040。
Recombinant Human IL-2：购自BD Pharmingen，货号554603。
Streptavidin HRP：购自BD Biosciences，货号554066。
实验仪器：
Mastercycler nexus PCR仪：购自Eppendorf公司。
Hitrap Mabselect Sure柱：购自Cytiva公司。
HiLoad 26/600Superdex 200pg柱：购自Cytiva公司。
SpectraMax i3x酶标仪：购自Molecular Devices公司。
SpectraMaxM5酶标仪：购自Molecular Devices公司。
本申请的序列如下表所示：
表B.
实施例1.抗TROP-2/CD3双抗分子的构建
本发明采用了抗TROP-2的单抗IgG和抗CD3单抗scFv串联的方式，构建了抗TROP-2/CD3双特异性抗体a、b和c，a和b结构如图1A所示，c结构如图1B所示。
其中，抗TROP-2/CD3双特异性抗体中的抗TROP-2单抗序列来源于US20120237518A1专利中公开的KM4097HV3aLV0人源化单克隆抗体，KM4097HV3aLV0人源化单克隆抗体作为抗TROP-2单抗阳性对照。抗TROP-2/CD3双特异性抗体中的抗CD3单抗的CDR序列来源于US8236308B2中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4，并对其进行了人源化改造。本发明使用改造后的人源化SP34作为抗CD3单抗阳性对照。
人源化SP34具体构建方法如下：
(1)鼠源抗人CD3单克隆抗体鼠源SP34(mSP34)的CDR区序列的获取
鼠源抗人CD3单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别来自于US8236308B2中的SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4。
mSP34重链可变区氨基酸序列：
EVKLLESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA
mSP34轻链可变区氨基酸序列：
QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
对mSP34的重链和轻链可变区氨基酸序列进行分析，依据Kabat规则分别确定mSP34重链和轻链的互补决定区CDR和框架区FR。mSP34重链CDR的氨基酸序列为HCDR1：TYAMN(SEQ ID NO.7)、HCDR2：RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO.8)和HCDR3：HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO.9)，轻链CDR的氨基酸序列为LCDR1：RSSTGAVTTSNYAN(SEQ IDNO.10)、LCDR2：GTNKRAP(SEQ ID NO.11)和LCDR3：ALWYSNLWV(SEQ ID NO.12)。
(2)SP34单克隆抗体的人源化构建过程
在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/，将mSP34的重链可变区与人IgG胚系序列进行同源性比较，选择IGHV3-23*04为重链CDR移植模板，将mSP34的重链CDR移植入IGHV3-23*04骨架区，并在HCDR3之后加入WGQGTLVTVSS作为第四个框架区，获得CDR移植重链可变区序列。同样地，将mSP34的轻链可变区与人IgG胚系序列同源性比较，选择IGLV7-46*01为轻链CDR移植模板，将SP34的轻链CDR移植入IGLV7-46*01的骨架区，并在LCDR3之后加入FGQGTKVEIK作为第四个框架区，获得CDR移植轻链可变区序列。在CDR移植可变区的基础上，对一些氨基酸位点进行突变。在进行突变时，将氨基酸序列进行Kabat编码，位点的位置由Kabat码指示。
优选的，对于CDR移植重链可变区，将第49位的S突变为A，将第73位的N突变为D，将第93位的A突变为V，将第94位的K突变为R。对于CDR移植轻链可变区，将第36位的F突变为V，第46位的T突变为G，第49位的Y突变为G，第57位的W突变为G，第58位的T突变为V。上述带有回复突变位点的重链和轻链可变区分别定义为SP34人源化重链和轻链可变区(SEQ IDNO.18和SEQ ID NO.19)。
(3)全长人源化SP34单克隆抗体的构建过程：
将合成的人源化重链可变区与人IgG1重链恒定区(SEQ ID NO.39)的编码基因相连，获得全长的人源化重链基因；将人源化轻链可变区与人Kappa链恒定区(SEQ ID NO.40)的编码基因相连，获得全长的人源化轻链基因。
阳性对照单克隆抗体参照实施例2中的表达纯化方法获得。
对抗TROP-2重链可变区VH(SEQ ID NO.16)的氨基酸I31D位点突变,获得抗TROP-2重链可变区VH-I31D(SEQ ID NO.20)，从而获得抗TROP-2重链HC-I31D(SEQ ID NO.28)，抗TROP-2单抗的轻链(SEQ ID NO.27)保持不变，获得抗TROP-2-VH-I31D单抗；对抗TROP-2重链可变区VH(SEQ ID NO.16)的氨基酸I31E位点突变，获得抗TROP-2重链可变区VH-I31E(SEQ ID NO.21)，从而获得抗TROP-2重链HC-I31E(SEQ ID NO.29)，抗TROP-2单抗的轻链(SEQ ID NO.27)保持不变，获得抗TROP-2-VH-I31E单抗；对抗CD3重链可变区VH(SEQ IDNO.18)的氨基酸T31G和Y32S位点突变，获得抗CD3重链可变区VH-T31G-Y32S(SEQ IDNO.22)。
抗TROP-2/CD3双特异性抗体a、c的scFv是通过L1(SEQ ID NO.23)连接抗CD3重链可变区VH(SEQ ID NO.18)和抗CD3轻链可变区VL(SEQ ID NO.19)，得到VH-L1-VL，即CD3-scFv(SEQ ID NO.30)。抗TROP-2/CD3双特异性抗体b的scFv是通过L1(SEQ ID NO.23)连接抗CD3重链可变区VH-T31G-Y32S(SEQ ID NO.22)和抗CD3轻链可变区VL(SEQ ID NO.19)，得到VH-T31G-Y32S-L1-VL，即CD3-scFv-VH-T31G-Y32S(SEQ ID NO.31)。
抗TROP-2/CD3双特异性抗体a和b的CD3-scFv通过L2(SEQ ID NO.24)和L3(SEQ IDNO.25)连接到抗TROP-2重链HC-I31D(SEQ ID NO.28)CH1和CH2之间，获得抗TROP-2/CD3双抗a的重链(SEQ ID NO.32)和抗TROP-2/CD3双抗b的重链(SEQ ID NO.33)，抗TROP-2单抗的轻链(SEQ ID NO.27)保持不变。
抗TROP-2/CD3双特异性抗体c的CD3-scFv通过L2(SEQ ID NO.24)连接到抗TROP-2重链HC-I31D(SEQ ID NO.28)的N末端，获得抗TROP-2/CD3双抗c的重链(SEQ ID NO.34)，抗TROP-2单抗的轻链(SEQ ID NO.27)保持不变。
为了提高抗体分子在CHO细胞中的表达效率，对抗TROP-2/CD3双特异性抗体分子的核酸序列进行密码子优化，主要考虑密码子的偏好性、GC含量、mRNA的二级结构、重复序列等因素，委托生工生物工程有限公司合成抗体的核酸序列。氨基酸和核酸序列参见序列表。
实施例2.抗TROP-2/CD3双抗的表达与纯化
将抗TROP-2/CD3双特异性抗体的重链和轻链的DNA片段分别亚克隆到载体pcDNA3.4中，提取重组质粒并共转染293F细胞和/或CHO细胞。细胞培养5-7天后，将培养液通过高速离心、0.22μm滤膜过滤后上样至Hitrap Mabselect Sure亲和层析柱中，用100mM柠檬酸，pH3.5的洗脱液一步洗脱蛋白，回收目的样品并透析换液至pH7.4的PBS中，将纯化后的蛋白用UPLC-SEC检测。
在纯化产物蛋白表达量测定的过程中发现，阳性对照抗TROP-2单抗的表达量较低，约为10-20mg/l，在不影响抗TROP-2单抗与TROP-2抗原正常结合的情况下，对抗TROP-2单抗的重链可变区VH进行氨基酸突变，发现I31E位突变后抗TROP-2单抗蛋白表达量提高至30mg/l以上，I31D位突变后抗TROP-2单抗蛋白表达量提高至70mg/l以上，所以将I31E或I31D位突变运用于抗TROP-2/CD3双抗中，以提高双抗的表达量。
抗TROP-2/CD3双抗a、b、c分子的检测结果如图2A、图2B和图2C所示，其中抗体分子状态均一，单体纯度达到95％以上。
实施例3.酶联免疫吸附法(ELISA)测定双抗对抗原的亲和力
3.1检测抗TROP-2/CD3双特异性抗体对TROP-2的亲和力
包被液稀释重组Human-TROP-2-HIS蛋白至200ng/ml，以100μl/孔加入到酶标板中，常温放置2小时或者4摄氏度过夜放置。去掉包被液(用吸水纸去掉残留液滴)，以200μl/孔加入封闭液至酶标板中，常温放置1-2小时。去掉封闭液(用吸水纸去掉残留液滴)，再用封闭液稀释TROP-2/CD3双特异性抗体和抗TROP-2单抗至10μg/ml，四倍稀释形成12个浓度梯度(最高浓度10μg/ml，最低浓度0.002ng/ml)，以100μl/孔依次加入到封闭过的酶标板中，常温放置1小时。用PBST洗板3次(用吸水纸去掉残留液滴)，用封闭液按1:3000稀释含HRP标记的山羊抗人FC抗体，以100μl/孔加入到酶标板中，常温放置30分钟。用PBST洗板3次(用吸水纸去掉残留液滴)，以100μl/孔加入TMB，室温避光放置5分钟，以80μl/孔加入终止液，终止底物显色反应，用酶标仪读取450nm处的OD值，用GraphPad对数据进行分析，作图并计算EC50。
试验结果如图3A所示，抗TROP-2/CD3双特异性抗体分子a、c和阳性对照抗TROP-2单抗与TROP-2-HIS结合的EC50(单位：nM)分别为0.01649、0.01875和0.02606，表明CD3-scFv的嵌入，无论是连接在抗TROP-2单抗重链的N末端，还是插入到抗TROP-2单抗重链的CH1和CH2之间，都不影响双特异性抗体对TROP-2抗原的结合能力。
3.2检测抗TROP-2/CD3双特异性抗体对CD3的亲和力
包被液稀释重组Human-CD3-FC蛋白至200ng/ml，以100μl/孔加入到酶标板中，常温放置2小时或者4摄氏度过夜放置。去掉包被液(用吸水纸去掉残留液滴)，以200μl/孔加入封闭液至酶标板中，常温放置1-2小时。去掉封闭液(用吸水纸去掉残留液滴)，再用封闭液稀释抗TROP-2/CD3双特异性抗体和抗CD3单抗至10μg/ml，四倍稀释形成12个浓度梯度(最高浓度10μg/ml，最低浓度0.002ng/ml)，以100μl/孔依次加入到封闭过的酶标板中，常温放置1小时。用PBST洗板3次(用吸水纸去掉残留液滴)，用封闭液按1:3000稀释含HRP标记的山羊抗人Fab抗体，以100μl/孔加入到酶标板中，常温放置30分钟。用PBST洗板3次(用吸水纸去掉残留液滴)，以100μl/孔加入TMB，室温避光放置5分钟，以80μl/孔加入终止液，终止底物显色反应，用酶标仪读取450nm处的OD值，用GraphPad对数据进行分析，作图并计算EC50。
试验结果如图3B所示，抗TROP-2/CD3双特异性抗体分子a、b、c和阳性对照CD3单抗与CD3-FC结合的EC50(单位：nM)分别为0.07924、0.6071、0.04141和0.06182。表明CD3-scFv插入到抗TROP-2单抗重链的CH1和CH2之间，使双特异性抗体对CD3抗原的结合能力略有提高，对抗CD3重链可变区VH的氨基酸进行突变后，降低了双特异性抗体对CD3抗原的结合能力。
实施例4.双抗作用下hPBMC对肿瘤细胞杀伤实验
取对数期生长的Colo205细胞(人结肠癌细胞)、MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞)和A549细胞(人肺腺癌细胞)，用完全培养基稀释细胞至1×104个/ml，以100μl每孔加入到白色透明96孔板中，96孔板边缘孔不加细胞，只加完全培养基进行封边处理，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养过夜。
取新鲜的人外周血单个核细胞(Human peripheral blood mononuclear cell，hPBMC)，用完全培养基稀释细胞至1.2×106个/ml，以50μl每孔加入到白色透明96孔板中，同时设置只加hPBMC细胞无肿瘤细胞的对照孔。
不同肿瘤细胞加入抗体的浓度和稀释倍数不同：用完全培养基稀释抗CD3单抗和抗TROP-2/CD3双抗b至1μg/ml，6倍梯度稀释形成10个浓度梯度(最高浓度1μg/ml，最低浓度9.92×10-8μg/ml)，以50μl每孔加入到含有Colo205细胞和hPBMC细胞的白色透明96孔板中，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养48小时；用完全培养基稀释抗CD3单抗和抗TROP-2/CD3双抗b至20μg/ml，4倍梯度稀释形成10个浓度梯度(最高浓度20μg/ml，最低浓度7.63×10-5μg/ml)，以50μl每孔加入到含有MDA-MB-231细胞和hPBMC细胞、含有A549细胞和hPBMC细胞的白色透明96孔板中，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养48小时。检测前，白色透明96孔板底需用白色卡纸密封好，确保板底不透光，每孔吸出上清100μl，剩余含有细胞的培养基100μl，加入TheLuminescent Cell Viability Assay中的每孔100μl，避光反应10分钟后，用SoftMax 6.3软件上机读数检测。
为了研究抗TROP-2/CD3双抗中两个靶点的协同作用，选择TROP-2蛋白表达量不同的肿瘤细胞，其中Colo205细胞和MDA-MB-231细胞都可以表达TROP-2蛋白，且Colo205细胞的TROP-2表达量高于MDA-MB-231细胞，A549细胞几乎不表达TROP-2蛋白。试验结果如图4A、图4B和图4C所示，抗TROP-2/CD3双抗b对Colo205细胞的杀伤作用最明显，对MDA-MB-231细胞的杀伤也有一定的作用，对不表达TROP-2蛋白的A549细胞无杀伤作用，可以指示人体正常组织不会被抗TROP-2/CD3双抗诱导的T细胞杀伤作用所杀伤，且抗TROP-2/CD3双抗b对Colo205细胞和MDA-MB-231细胞的杀伤作用明显高于抗CD3单抗。
实施例5.双抗作用下IL-2细胞因子释放实验
取对数期生长的Colo205细胞和MDA-MB-231细胞，用完全培养基稀释细胞至1×104个/ml，以100μl每孔加入到白色透明96孔板中，96孔板边缘孔不加细胞，只加完全培养基进行封边处理，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养过夜。
取新鲜的hPBMC细胞,用完全培养基稀释细胞至1.2×106个/ml，以50μl每孔加入到白色透明96孔板中，同时设置只加hPBMC细胞无肿瘤细胞的对照孔。
不同肿瘤细胞加入抗体的浓度和稀释倍数不同：用完全培养基稀释抗CD3单抗和抗TROP-2/CD3双抗b至1μg/ml，6倍梯度稀释形成10个浓度梯度(最高浓度1μg/ml，最低浓度9.92×10-8μg/ml)，以50μl每孔加入到含有Colo205细胞和hPBMC细胞的白色透明96孔板中，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养48小时；用完全培养基稀释抗CD3单抗和抗TROP-2/CD3双抗b至20μg/ml，4倍梯度稀释形成10个浓度梯度(最高浓度20μg/ml，最低浓度7.63×10-5μg/ml)，以50μl每孔加入到含有MDA-MB-231细胞和hPBMC细胞的白色透明96孔板中，放置于37℃并5％CO2孵箱中培养48小时。
收集上清液，用ELISA检测上清液中IL-2的含量。用包被液稀释Purified MouseAnti-Human IL-2至2.5μg/ml，以50μl/孔加入到96孔酶标板中，于4℃冰箱过夜孵育。去掉包被液，用吸水纸去除残留液滴，以200μl/孔加入封闭液(含1％BSA的PBST)，室温放置2小时。去掉封闭液，用吸水纸去除残留液滴，用封闭液稀释Recombinant Human IL-2至100ng/ml，4倍梯度稀释，形成12个浓度梯度，用于制作标准曲线，同时用封闭液5倍稀释上清液，以100μl/孔加入到96孔酶标板中，室温放置1h。用PBST清洗酶标板3次，用封闭液按照1:1000的比例稀释Biotin Mouse Anti-Human IL-2，以100μl/孔加入到96孔酶标板中，室温放置1h。用PBST清洗酶标板3次，用封闭液按照1:1000的比例稀释Streptavidin HRP，以100μl/孔加入到96孔酶标板中，室温放置1h。用PBST清洗酶标板3次，以100μl/孔加入TMB，室温避光放置5分钟，以70μl/孔加入终止液，终止底物显色反应后，立即用酶标仪在450nm波长处读取各孔的OD值，并使用SoftMax 6.4软件绘制标准曲线，换算各孔IL-2细胞因子的浓度，用GraphPad Prism6作图分析数据。
实验结果如图5A和图5B所示，在hPBMC对肿瘤细胞的杀伤过程中，抗TROP-2/CD3双抗b与抗CD3单抗相比，可激发免疫细胞释放更多的IL-2细胞因子。同时比较图4A、图4B、图5A、图5B发现，抗TROP-2/CD3双抗b诱导IL-2细胞因子释放的浓度比引起肿瘤细胞杀伤的浓度要高的多，为双抗在肿瘤治疗中提供了用药窗口。
实施例6.抗TROP-2/CD3双抗b在NCI-H292移植瘤模型上的抗肿瘤作用
利用人外周血单核细胞hPBMC在NOG小鼠体内重建人源免疫系统，并在此小鼠上建立人肺癌NCI-H292皮下移植瘤模型。具体实施步骤如下：
收集体外培养的NCI-H292细胞(人非小细胞肺癌)，将细胞悬液浓度调整为1×108个/ml，与基质胶以1：1等比例混合。体外复苏hPBMC并用PBS重悬hPBMC细胞，将hPBMC悬液浓度调整为1×107个/ml。将混合好的肿瘤细胞悬液和hPBMC悬液1：1混合。在无菌条件下，接种200μl细胞混合悬液于NOG小鼠右侧上背部皮下。待皮下瘤生长至150mm3时，按照肿瘤体积将小鼠随机分为3组，每组8只小鼠，包括：空白对照组，仅注射PBS作为对照；抗TROP-2/CD3双特异性抗体b的1mg/kg和5mg/kg两个剂量组，腹腔注射给药，每周给药三次，连续处理四周。整个实验过程中，每周2次测量移植瘤直径，同时称量小鼠体重，绘制的各组肿瘤随时间的生长曲线和小鼠体重曲线。
实验结果如图6A和6B所示，在NCI-H292细胞混合hPBMC移植瘤模型上，抗TROP-2/CD3双抗b对肿瘤的抑制作用明显高于对照组，且1mg/kg和5mg/kg两个剂量组间无明显差异，说明1mg/kg的剂量就可以发挥较好的抑制作用；小鼠的体重随着连续给药数周后也没有明显下降，说明TROP-2/CD3双抗b对小鼠的毒副作用较小。结果表明，在此移植瘤模型上，抗TROP-2/CD3双抗b能够显著抑制肿瘤生长，且对小鼠无明显的毒副作用。
实施例7.抗TROP-2/CD3双抗a的稳定性研究
本实验可用于评估在辅料加入情况下蛋白质的稳定性，从而揭示研发最优制剂所需的重要信息。
抗TROP-2/CD3双抗a保存在20mM醋酸盐+6％海藻糖+1％盐酸精氨酸+0.1％吐温80并且pH为5.0的buffer中，分别放置于25℃和37℃的培养箱中28天，HPLC-SEC结果见图7A和图7B。
结果表明，抗TROP-2/CD3双抗a的结构比较稳定，在37℃高温条件下放置长达28天后，其纯度仍然可以保持在95％以上。
讨论
由上述实验可知，本发明提供的双特异抗体可以同时结合TROP-2和CD3，通过结合CD3调节T细胞的免疫活性功能，并特异性杀伤表达TROP-2蛋白的肿瘤细胞。图3B结果显示，双特异抗体与其单抗相比结合CD3的能力有所下调，但图4A和图4B结果显示，双特异抗体与其单抗相比杀伤肿瘤细胞的作用明显上升，且肿瘤细胞上TROP-2表达量越高，双特异抗体对肿瘤细胞的杀伤作用越强，且如图5A和图5B所示，双特异抗体b有较大的用药窗口。而且也通过NCI-H292移植瘤模型，从体内细胞免疫试验的角度再一次证明了抗TROP-2/CD3双抗b对肿瘤的杀伤作用和安全性。说明双特异抗体对CD3的亲和力下降，更有助于T细胞发挥免疫作用，且同时含有靶向TROP-2蛋白的功能，可以特异性结合并杀伤表达TROP-2的肿瘤细胞。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 三生国健药业（上海）股份有限公司
<120> 一种抗TROP-2/CD3双特异性抗体
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ile Tyr Trp Leu Gly
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr
1 5
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Gln Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ser Asp His Ile Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
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1 5
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<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
<210> 9
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val
1 5
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Tyr Trp Leu Gly
1 5
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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1 5
<210> 16
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 17
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Gln Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ser
85 90 95
Asp His Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 18
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
<210> 20
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Ser
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 25
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Gly Gly Gly
1
<210> 26
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ile Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Gln Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Ser
85 90 95
Asp His Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 28
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 29
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250 255
<210> 31
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Ser
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly
145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
180 185 190
Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg
195 200 205
Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly
210 215 220
Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser
225 230 235 240
Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
245 250 255
<210> 32
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
355 360 365
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
370 375 380
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
385 390 395 400
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
405 410 415
Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr
420 425 430
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
435 440 445
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
450 455 460
Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly
465 470 475 480
Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr
485 490 495
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
500 505 510
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
610 615 620
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
625 630 635 640
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
645 650 655
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
660 665 670
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
675 680 685
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
690 695 700
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
705 710 715 720
<210> 33
<211> 720
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
225 230 235 240
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
245 250 255
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Ser Ala Met Asn Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys
275 280 285
Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe
290 295 300
Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
305 310 315 320
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly
325 330 335
Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
340 345 350
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr
370 375 380
Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr
385 390 395 400
Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp
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420 425 430
Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu
435 440 445
Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu
450 455 460
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465 470 475 480
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
515 520 525
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530 535 540
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
545 550 555 560
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565 570 575
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
580 585 590
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
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645 650 655
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660 665 670
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<210> 34
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
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1 5 10 15
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20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
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85 90 95
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145 150 155 160
Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr
165 170 175
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180 185 190
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Asn Leu Trp Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val
260 265 270
Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val
275 280 285
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Trp Leu
290 295 300
Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Asn
305 310 315 320
Ile Phe Pro Gly Ser Ala Tyr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly
325 330 335
Lys Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
340 345 350
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg
355 360 365
Glu Gly Ser Asn Ser Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
370 375 380
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
385 390 395 400
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
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565 570 575
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675 680 685
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
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<210> 35
<211> 2160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
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aacgagaagt tcaagggcaa ggtgaccatc accgccgaca ccagcacctc caccgcctac 240
atggagctgt cctccctgag atctgaggat accgctgtgt atttttgtgc tagagaagga 300
tctaatagcg gatattgggg ccaggggaca ctggtgaccg tgagttctgc gagcaccaag 360
ggaccttccg tgtttcccct cgcccccagc tccaaaagca ccagcggcgg aacagctgct 420
ctcggctgtc tcgtcaagga ttacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcgga 480
gccctgacaa gcggcgtcca caccttccct gctgtcctac agtcctccgg actgtacagc 540
ctgagcagcg tggtgacagt ccctagcagc tccctgggca cccagacata tatttgcaac 600
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ttcaccttca acacctacgc catgaactgg gtgagacagg ctcccggcaa gggcctggag 840
tgggtggccc ggatcagatc taaatataac aattatgcta catattatgc tgattctgtg 900
aaggataggt ttacaattag cagagatgat tctaagaata cactgtatct gcagatgaac 960
agtctgcgtg ctgaggatac tgcagtgtat tattgtgtga gacatggaaa tttcggtaat 1020
tcttatgtga gctggtttgc ttactggggc cagggaactc tggtgacagt gtcctctggc 1080
ggcggaggct ctggcggagg gggcagtggc ggcggtggct ctggaggcgg cggctctcag 1140
gctgtggtga cacaggaacc ttctctgaca gtgtctccag gaggaacagt gactctgaca 1200
tgtagaagtt ctactggagc tgtgacaacc tctaattatg ctaactgggt gcagcagaaa 1260
cctggccagg ctcctagagg tttgatcgga ggtacaaata agagagcacc tggagtgcct 1320
gctagatttt ctggctctct gctgggcgga aaagctgctc tgacactgtc tggagctcag 1380
cctgaggatg aagctgagta ttattgtgct ctgtggtact ctaatctgtg ggtgttcgga 1440
cagggcacaa aggtggaaat taagagaggt ggcggtggag acaagaccca cacatgtccc 1500
ccctgtcccg ctcctgaact gctgggaggc ccttccgtgt tcctgttccc ccctaagccc 1560
aaggacaccc tgatgatttc caggacaccc gaggtgacct gtgtggtggt ggacgtcagc 1620
cacgaggacc ccgaggtgaa attcaactgg tacgtcgatg gcgtggaggt gcacaacgct 1680
aagaccaagc ccagggagga gcagtacaat tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc 1740
gtcctccatc aggactggct gaacggcaaa gagtataagt gcaaggtgag caacaaggcc 1800
ctccctgctc ccatcgagaa gaccatcagc aaagccaagg gccagcccag ggaacctcaa 1860
gtctataccc tgcctcccag cagggaggag atgaccaaga accaagtgag cctcacatgc 1920
ctcgtcaagg gcttctatcc ttccgatatt gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc 1980
gagaacaact acaagacaac accccccgtg ctcgattccg atggcagctt cttcctgtac 2040
tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg caacaaggca acgtcttcag ttgcagcgtc 2100
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<210> 36
<211> 2160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
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gagaacaact acaagacaac accccccgtg ctcgattccg atggcagctt cttcctgtac 2040
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<210> 37
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60
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ggcggcggcg gaagcggcgg cggcggctcc caagtgcagc tggtgcagtc cggccccgag 840
gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg agctgcaagg cctccggcta caccttcacc 900
gactactggc tgggctgggt gaggcaggcc cccggccagg gcctggagtg gatgggcaac 960
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cctgaactgc tgggaggccc ttccgtgttc ctgttccccc ctaagcccaa ggacaccctg 1560
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agggaggagc agtacaattc cacctacagg gtggtgtccg tgctgaccgt cctccatcag 1740
gactggctga acggcaaaga gtataagtgc aaggtgagca acaaggccct ccctgctccc 1800
atcgagaaga ccatcagcaa agccaagggc cagcccaggg aacctcaagt ctataccctg 1860
cctcccagca gggaggagat gaccaagaac caagtgagcc tcacatgcct cgtcaagggc 1920
ttctatcctt ccgatattgc cgtcgagtgg gagtccaacg gacagcccga gaacaactac 1980
aagacaacac cccccgtgct cgattccgat ggcagcttct tcctgtactc caagctgacc 2040
gtggacaagt ccagatggca acaaggcaac gtcttcagtt gcagcgtcat gcatgaggcc 2100
ctccacaacc actacaccca gaagagcctc tccctgagcc ctggaaag 2148
<210> 38
<211> 657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gatattgtga tgacacagtc tcctgattct ctggccgtgt ctctgggaga aagagcaaca 60
atcaattgta aatcatctca gtctctgctg aactctggaa atcagcagaa ttatctggct 120
tggtaccagc agaagcctgg ccagccccct aagctgctga tctacggcgc ctccaccaga 180
gagtccggcg tgcccgacag gttctccggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 240
atctcctccc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagagcga ccacatctac 300
ccttacacct tcggccaggg caccaagctg gagatcaaga ggaccgtggc cgccccctcc 360
gtgttcattt ttccccctag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgctag cgtggtgtgc 420
ctgctgaaca acttctaccc cagggaggcc aaggtgcagt ggaaagtgga caacgccctg 480
cagagcggca actcccagga gtccgtgacc gagcaggaca gcaaggacag cacctactcc 540
ctgtcctcca ccctgaccct gtccaaggcc gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgt 600
gaggtgacac accagggcct gtcctccccc gtgacaaagt ccttcaacag gggcgag 657
<210> 39
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (19)

1.一种双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含：
第一抗原结合结构域D1和第二抗原结合结构域D2，
所述D1为抗TROP-2抗体或其抗原结合片段，
所述D2为抗CD3抗体或其抗原结合片段。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含单体或单体形成的二聚体，所述二聚体可以是同源的或异源的，所述单体从N端到C端包含选自以下组的结构：
其中，
VLA代表抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHA代表抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
VLB代表抗CD3抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
VHB代表抗CD3抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
CH代表重链恒定区；
CL代表轻链恒定区；
L1、L2和L3各自独立地为键或接头；
“～”代表二硫键或共价键；
“-”代表肽键；
优选地，所述双特异性抗体包含选自以下组的结构：
a)结构I的单体形成的同源二聚体；
b)结构II的单体形成的同源二聚体。
3.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；
优选地，所述互补决定区包含至少一个氨基酸突变。
4.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述互补决定区包含：
a)抗CD3抗体或其抗原结合片段的HCDR1：X1X2AMN，和/或，
b)抗TROP-2抗体或其抗原结合片段的HCDR1：X3YWLG，
所述氨基酸突变选自X1不为T、X2不为Y、和X3不为I的组，
优选地，所述氨基酸突变选自X1为G、X2为S、和X3为D或E的组。
5.如权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链互补决定区HCDR1-3和轻链互补决定区LCDR1-3，其中，HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；
优选地，所述可变区包含至少一个氨基酸突变。
7.如权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述可变区包含选自以下组的氨基酸突变：
a)所述SEQ ID NO.16具有第31位的氨基酸突变；优选地，突变方式选自I31D或I31E；
b)所述SEQ ID NO.18具有第31位的氨基酸突变；优选地，突变方式为T31G；
c)所述SEQ ID NO.18具有第32位的氨基酸突变；优选地，突变方式为Y32S。
8.如权利要求6所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗CD3抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；和/或，所述抗TROP-2抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.20或SEQ ID NO.21所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
9.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述抗TROP-2或抗CD3抗原结合片段选自Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv或单链Fv(scFv)；所述抗TROP-2或抗CD3抗体为IgG抗体。
10.如权利要求9所述的双特异性抗体，其特征在于，所述D1为IgG抗体，所述D2为scFv；优选地，所述D2连接至D1的N端或C端，或连接至D1的CH1和CH2之间；更优选地，所述D2连接至D1的重链。
11.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含重链和轻链，所述重链和轻链的氨基酸序列选自下组：
a)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.32所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
b)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.33所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
c)所述双特异性抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.34所示，和所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示；
或，
d)将a)、b)或c)中的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有同时抗TROP-2活性和抗CD3活性的由a)、b)或c)衍生的多肽。
12.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码如权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗体。
13.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有如权利要求12所述的多核苷酸分子。
14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求13所述的表达载体。
15.一种如权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
a)在表达条件下，培养如权利要求14所述的宿主细胞，从而表达双特异性抗体；
b)分离并纯化步骤a)所述的双特异性抗体。
16.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的如权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗体和一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
17.如权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗体或如权利要求16所述的药物组合物在制备癌症或肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述癌症或肿瘤为TROP-2阳性癌症或肿瘤。
18.如权利要求17所述的用途，其特征在于，所述癌症或肿瘤选自：肺癌、骨癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌、子宫癌、卵巢癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、阴道癌、外阴癌、直肠癌、结肠癌、肛门区癌、乳腺癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、睾丸癌、淋巴癌、移行细胞癌、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、软组织肉瘤、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、黑素瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、慢性、急性白血病或其组合。
19.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包含：
a)如权利要求1至11中任一项所述的双特异性抗体；和
b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素或酶。
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