CN113817065A

CN113817065A - 一种抗her2的多肽及其用途

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Publication number: CN113817065A
Application number: CN202111039939.5A
Authority: CN
Inventors: 苏彦景; 李光磊; 封纯芳; 张培发
Original assignee: Shenzhen Letu Biomedical Co Ltd
Current assignee: Shanghai Letu Life Technology Co ltd; Shenzhen Le Earth Life Science And Technology Investment Co ltd; Shenzhen Letu Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113817065B

Abstract

一种抗HER2的多肽及其用途，所述多肽还包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第一HER2抗体结合位点，所述第二抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第二HER2抗体结合位点，所述第一HER2抗体结合位点不同于所述第二HER2抗体结合位点。HER2双抗可以同时靶向HER2抗原的DomainⅡ和DomainⅣ，突破Trastuzumab和Pertuzumab单抗单独治疗的局限性，HER2双抗的功能更强。

Description

一种抗HER2的多肽及其用途

技术领域

本发明涉及抗体领域，具体涉及一种抗HER2的多肽及其用途。

背景技术

曲妥珠单抗与HER2的DomainⅣ结合，从而抑制HER2同源二聚体的形成，干扰HER2分子自身磷酸化，抑制下游信号通路激活。但曲妥珠单抗无法阻止HER2/HER3或HER2/HER1异源二聚体的形成，易导致肿瘤逃逸。帕妥珠单抗通过结合HER2胞外结构域Ⅱ，阻滞了HER2与其它HER受体形成异源二聚化复合物，抑制HER2信号转导通路，显著抑制乳腺癌细胞增殖。曲妥珠和帕妥珠二者以互补的方式阻断HER2介导，二者联合可以防止或减弱曲妥珠出现耐药性，有效抑制肿瘤细胞的增殖。

现有技术中，抗HER2双表位抗体易形成同源二聚体，通过双细胞系表达和体外组装完成构建，费时、费力、生产成本高。

发明内容

根据第一方面，在一实施例中，提供一种多肽，所述多肽包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第一HER2抗体结合位点，所述第二抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第二HER2抗体结合位点，所述第一HER2抗体结合位点不同于所述第二HER2抗体结合位点。

根据第二方面，在一实施例中，提供分离的多核苷酸，其包含编码第一方面所述多肽的核苷酸序列。

根据第三方面，在一实施例中，提供一种构建体，所述构建体包含第二方面所述多核苷酸。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第三方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第二方面所述多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达如第一方面所述多肽。

根据第五方面，在一实施例中，提供一种偶联物，其包含第一方面所述多肽以及偶联部分，所述偶联部分为可检测的标记。

根据第六方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，其包含第一方面所述多肽，或第六方面所述偶联物。

根据第七方面，在一实施例中，提供一种组合物，其包含第一方面所述多肽，和/或第二方面所述多核苷酸，和/或第六方面所述偶联物。

根据第八方面，在一实施例中，提供第一方面所述多肽，或第二方面所述多核苷酸，或第三方面所述构建体，或第四方面所述表达系统，或第五方面所述偶联物在制备治疗和/或预防和/或诊断肿瘤的药物中的用途。

根据第九方面，在一实施例中，提供第一方面所述多肽，或第二方面所述多核苷酸，或第三方面所述构建体，或第四方面所述表达系统，或第五方面所述偶联物在制备抑制或阻断HER2的同源二聚体形成和/或HER2的异源二聚体形成的药物中的用途。

依据上述实施例的抗HER2的多肽及其用途，HER2双抗可以同时靶向HER2抗原的DomainⅡ和DomainⅣ，突破Trastuzumab和Pertuzumab单抗单独治疗的局限性，HER2双抗的功能更强。

附图说明

图1为实施例1的抗体结构示意图；

图2为实施例3的SDS-PAGE检测结果图；

图3为实施例4的HER2双功能抗体双表位鉴定上样图；

图4为实施例4的HER2双功能抗体双表位鉴定结果图；

图5、图6为实施例5的HER2双表位双功能抗体体外增殖活性检测结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本申请所说“连接”、“联接”，如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。

本文中，术语“人IgG Fc区域”具有该术语在免疫学领域中通常给定的含义。特别地，该术语是指通过从抗体移除两个抗原结合区(Fab片段)而获得的人IgG抗体片段。具体而言，Fc区包括抗体的CH2和CH3恒定区结构域，并且也可包括一部分或所有的铰链区。

免疫球蛋白(Ig)中存在四种IgG子类(G1、G2、G3和G4)，其各自具有不同的结构和被称为效应物功能的生物学功能。这些效应物功能一般通过与Fc受体(FcγR)相互作用或者通过结合补体因子Clq来介导。结合至FcγR可导致抗体依赖性的细胞介导的细胞裂解，而结合至补体因子可导致补体介导的细胞裂解。IgG子类的Fc区的结构和性质是本领域中已知的。本发明的融合蛋白可含有来自任何IgG子类的Fc区，尽管Gl和G3比G2和G4抗体具有更高的受体结合和效应物功能活性，因此是优选的。

本文中，HER2、Her2和ErbB2可以互相使用，均表示天然序列的人HER2蛋白(Genebank登录号：X03363，参见例如Semba等人，1985，PNAS，82:6497-6501；和Yamamoto等人，1986，Nature,319:230-234)及其功能衍生物，例如氨基酸序列变体。

本文中，术语“曲妥珠单抗”(英文名Trastuzumab，亦称赫赛汀)是抗Her 2的单克隆抗体，它通过将自己附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，赫赛汀还可以刺激身体自身的免疫细胞去摧毁癌细胞。临床上目前主要用于Her-2过度表达的转移性乳腺癌。单药治疗可用于已接受过一个或多个化疗方案的转移性乳腺癌；可与紫杉醇联合治疗未接受过化疗的转移性乳腺癌。

本文中，术语“帕妥珠单抗”(Pertuzumab，也被称作2C4，商品名Perjeta)是一种单克隆抗体。它是第一个被称作“HER二聚化抑制剂”的单克隆抗体。通过结合HER2，阻滞了HER2与其它HER受体的杂二聚，从而减缓了肿瘤的生长。

本文中，术语“HER2”是指人表皮生长因子受体-2。

本文中，术语“Her2同源二聚体”是两个Her2分子形成二聚体。

本文中，术语“Her2异源二聚体”是Her2与Her1(EGFR)、Her3或Her4之间形成二聚体。

本文中，术语“EC50”是指半最大效应浓度(concentration for 50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效应的浓度。

本文中，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。抗体轻链可分类为κ和λ轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。VH和VL区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各VH和VL由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

术语抗体的“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，Fundamental Immunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，RavenPress,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。

术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P 4,816,567)。

如本文中所使用的，术语“分离的”或“被分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”或“被分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

如本文中所使用的，术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。

如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

如本文中使用的，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5M，例如小于大约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”和“单抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多克隆抗体”和“多抗”具有相同的含义且可互换使用；术语“多肽”和“蛋白质”具有相同的含义且可互换使用。并且在本发明中，氨基酸通常用本领域公知的单字母和三字母缩写来表示。例如，丙氨酸可用A或Ala表示。

本文中使用的术语“药学上可接受的载体”或“生理学上可接受的载体”包括液体或固体填充剂，还可以包括但不限于溶剂和包封材料中的至少一种；并且是指药学或生理学上可接受的材料、组合物、物质或介质。

在一实施例中，所述第一HER2抗体结合位点位于HER2的结构域II，所述第二HER2抗体结合位点位于HER2抗原的结构域IV。

在一实施例中，所述第一HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的抗体结合位点相同。

在一实施例中，所述第二HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点相同。

在一实施例中，所述第一抗原结合结构域包含第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域。

在一实施例中，所述第一重链可变结构域包含曲妥珠单抗的重链可变结构域(TraVH)。

在一实施例中，所述第一重链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.5)。

在一实施例中，所述第一轻链可变结构域包含曲妥珠单抗的轻链可变定结构域(TraVL)。

在一实施例中，所述第一轻链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.6)。

在一实施例中，所述第二抗原结合结构域包含第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域。

在一实施例中，所述第二重链可变结构域包含帕妥珠单抗的重链可变结构域(PerVH)。

在一实施例中，所述第二重链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

在一实施例中，所述第二轻链可变结构域包含帕妥珠单抗的轻链可变定结构域(PerLV)。

在一实施例中，所述第二轻链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

在一实施例中，所述帕妥珠单抗的重链可变结构域的C端键联至所述IgG抗体的轻链恒定结构域的N端。

在一实施例中，所述多肽还包含第一重链恒定结构域、第二重链恒定结构域，所述第一重链恒定结构域包含人IgG抗体Fc区knob突变体，所述第二重链恒定结构域包含人IgG抗体Fc区hole突变体。

在一实施例中，所述IgG抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型或其突变体中的至少一种。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的至少一种：S354、T366、K409。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的至少一种：S354C、T366W、K409E。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的全部：S354C、T366W、K409E。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区knob突变体包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.9)。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的至少一种：Y349、T366、L368、Y407、F405。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的至少一种：Y349C、T366S、L368A、Y407V、F405K。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的全部：Y349C、T366S、L368A、Y407V、F405K。

在一实施例中，所述人IgG抗体Fc区hole突变体包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

在一实施例中，所述第一重链恒定结构域还包含IgG抗体的重链第一恒定结构域(CH1)。

在一实施例中，所述IgG抗体的重链第一恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO.11)。

在一实施例中，所述第二重链恒定结构域还包含IgG抗体的轻链恒定结构域(IgG-CL)。

在一实施例中，所述IgG抗体的轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.12)。

在一实施例中，所述多肽还包含第一轻链恒定结构域，所述第一轻链恒定结构域包含IgG抗体的轻链恒定结构域(IgG-CL)。

在一实施例中，所述第一轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.13)。

在一实施例中，所述多肽还包含第二轻链恒定结构域，所述第二轻链恒定结构域包含IgG抗体的重链第一恒定结构域(CH1)。

在一实施例中，所述第二轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO.14)。

在一实施例中，所述IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型或其突变体中的至少一种。

所述构建体通常可以通过将所述分离的多核苷酸插入合适的载体中构建获得，本领域技术人员可选择合适的载体，所述载体可以是噬菌体、质粒、病毒载体或人工染色体，诸如细菌或酵母人工染色体。换言之，本发明的实施方案的载体包含能够在宿主细胞或其分离的级分中表达的感兴趣的多核苷酸。载体通常还适合作为克隆载体，即在微生物系统中可复制；克隆载体可以被设计用于在一种宿主中复制，而构建体被设计用于在不同的宿主中表达。包含本发明的实施方案的多肽和蛋白的载体还可以包含用于在宿主细胞中繁殖或选择的选择标记。载体可以通过常规转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。

根据第四方面，在一实施例中，提供一种表达系统，所述表达系统含有如第三方面所述构建体或基因组中整合有外源的如第二方面所述多核苷酸。所述表达系统可以是宿主细胞，所述宿主细胞可以表达如第一方面所述多肽。在本发明另一具体实施例中，所述宿主细胞可以是真核细胞和/或原核细胞，更具体可以是小鼠细胞、人细胞等。

在一实施例中，所述偶联部分包括但不限于放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶中的至少一种。

在一实施例中，所述试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别所述多肽。

在一实施例中，所述第二抗体还包含可检测的标记。

在一实施例中，所述可检测的标记包括但不限于放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶中的至少一种。

在一实施例中，所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

在一实施例中，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、前列腺癌中的至少一种。

在一实施例中，所述前列腺癌为晚期前列腺癌。

在一实施例中，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。

根据第十方面，在一实施例中，提供一种多肽的制备方法，包括：

曲妥珠重链突变体的构建步骤，包括将编码曲妥珠单抗的重链可变结构域的核苷酸和编码IgG抗体的Fc区knob突变体的核苷酸融合，得到编码所述曲妥珠重链突变体的核苷酸；

帕妥珠重链突变体的构建步骤，包括将编码帕妥珠单抗的重链可变结构域的核苷酸和编码所述IgG抗体的Fc区hole突变体的核苷酸、编码IgG抗体的轻链恒定结构域(IgG1-CL)的核苷酸融合，得到编码所述帕妥珠重链突变体的核苷酸；

曲妥珠轻链的构建步骤，包括将编码曲妥珠单抗的轻链可变结构域的核苷酸和编码IgG抗体的轻链恒定结构域的核苷酸融合，得到编码所述曲妥珠轻链的核苷酸；

帕妥珠轻链突变体的构建步骤，包括将编码帕妥珠单抗的轻链可变结构域的核苷酸和编码IgG抗体的重链第一恒定结构域(CH1)的核苷酸融合，得到编码所述帕妥珠轻链突变体的核苷酸；

表达步骤，包括将编码所述曲妥珠重链突变体的核苷酸与编码所述曲妥珠轻链的核苷酸串联，得到曲妥珠融合核苷酸，克隆到第一载体中，得到克隆有曲妥珠融合核苷酸的载体；将编码所述帕妥珠重链突变体的核苷酸与编码所述帕妥珠轻链突变体的核苷酸串联，得到帕妥珠融合核苷酸，克隆到第二载体中，得到克隆有帕妥珠融合核苷酸的载体，将所述克隆有曲妥珠融合核苷酸的载体、克隆有帕妥珠融合核苷酸的载体共转染至宿主细胞，表达得到所述多肽，即为双表位双功能抗体，该抗体可以同时靶向HER2抗原的DomainⅡ和DomainⅣ，突破Trastuzumab和Pertuzumab单抗单独治疗的局限性，HER2双抗的功能更强。

在一实施例中，所述多肽为第一方面所述多肽。

在一实施例中，本发明提供一种抗HER2的双表位双功能抗体的构建方法，包括：

第一阶段：HER2双抗表达载体的构建：

(1)采用overlap PCR构建knob和hole突变体；

(2)采用crossmab技术构建将Pertuzumab的重链CH1与轻链CL互换；

(3)利用连接肽，将构建好的基因片段克隆到含有两个启动子的pLVX-AcGFP1-N1载体上。

第二阶段：HER2双抗体外瞬时表达和纯化：

(1)HER2双质粒或单质粒在CHO细胞中的高效表达；

(2)HER2双抗经Protein A亲和纯化进行纯化。

第三阶段：HER2双抗体外抗肿瘤功能研究：

(1)HER2双抗双表位鉴定；

(2)体外增殖抑制检测。

在一实施例中，本发明的HER2双抗可以同时靶向HER2抗原的DomainⅡ和DomainⅣ，突破Trastuzumab和Pertuzumab单抗单独治疗的局限性，HER2双抗的功能更强。

在一实施例中，对于重链恒定区CH3，在knob in hole技术的基础上，进一步采用了静电转位(亦称静电转向，electrostatic steering)技术，使得双抗的重链更容易形成异源二聚体；重链和轻链间配对采用的是cross mabCH1-CL技术，解决了同源轻重链正确配对的问题，进一步提高了目标HER2双抗的正确配对的成功率。

在一实施例中，本发明将轻重链构建在一个载体上，更有利于异源二聚体形成。

在一实施例中，HER2双抗序列都经过人源化，降低了免疫原性。

在一实施例中，HER2双抗序列同时克隆到一个表达载体上转染CHO细胞或分别克隆到两个表达载体上，双质粒共转染CHO细胞，提高了HER2双抗的表达、纯化效率。

实施例1：HER2双表位双功能抗体表达载体的构建及验证

合成曲妥珠和帕妥珠抗体的重链和轻链，并在Fc端引入突变点：S354C、T366W、K409E(Knob)和Y349C、T366S、L368A、Y407V、F405K(hole)。

曲妥珠重链突变体的构建：以获得的曲妥珠重链可变区和Fc区knob突变体为模板，采用overlap PCR的方法将曲妥珠重链可变区与Fc区knob突变体进行融合，构建曲妥珠重链knob突变体TraVH-CH1-Hing e-CH2-CH3。“Tra”为“Trastuzumab”的简写，表示此为曲妥珠可变区序列。

帕妥珠重链突变体的构建：

以获得的帕妥珠重链可变区和Fc区hole突变体及IgG-CL为模板，采用overlapPCR的方法将帕妥珠重链可变区与Fc区hole进行片段融合，构建PerVH-CL-Hinge-CH2-CH3重链hole突变体。“Per”为“Pertuz umab”的简写，表示此为帕妥珠可变区序列。

曲妥珠轻链的构建：以获得的曲妥珠轻链可变区和本实验室原有的抗体的IgG1的CL为模板，采用over lap PCR的方法将曲妥珠的VL和CL进行融合，构建完整的曲妥珠轻链TraVL-CL。

帕妥珠轻链突变体的构建；以获得的帕妥珠轻链可变区和本实验室原有的抗体的IgG1的CH1为模板，采用overlap PCR的方法将帕妥珠的VL与CH1进行片段融合，然后装入表达载体，具体为pLVX-AcGFP1-N1载体(丰晖生物，货号：BR020)，构建PerVL-CH1。

HER2双抗完整载体的构建：将构建好的曲妥珠两条融合片段用连接肽(Furin-T2A)串联形成TraVH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Furin-T2A-TraVL-CL片段；将帕妥珠两条融合片段用连接肽(Furin-F2A)串联在一起，形成PerVH-CL-Hinge-CH2-CH3-Furin-F2A-PerVL-CH1片段；得到构建好的基因片段。

图1为本实施例构建的抗体结构示意图。

TraVH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Furin-T2A-TraVL-CL的核苷酸序列如下：

第一条单直线下划线标示的序列为编码重链信号肽的核苷酸序列。

双直下划线标示的序列为TraVH区(曲妥珠重链可变区)。

粗下划线标示的序列为CH1区。

点式下划线标示的序列为Hinge区。

虚下划线标示的序列为CH2区。

点-短线下划线标示的序列为CH3(Knob)区。

点-点-短线下划线标示的序列为Furin区。

单波浪线标示的序列为T2A区。

双波浪线标示的序列为编码轻链信号肽的核苷酸序列。

加粗的序列为TraVL区(曲妥珠轻链可变区)。

第二条单直下划线标示的序列为CL区(曲妥珠轻链恒定区)。

TraVH-CH1-Hinge-CH2-CH3-Furin-T2A-TraVL-CL的氨基酸序列如下：

第一条单直下划线标示的序列为重链信号肽。

双直下划线标示的序列为TraVH区(曲妥珠重链可变区)。

粗下划线标示的序列为CH1区。

点式下划线标示的序列为Hinge区。

虚下划线标示的序列为CH2区。

点-短线下划线标示的序列为CH3(Knob)区。

点-点-短线下划线标示的序列为Furin区。

单波浪线标示的序列为T2A区。

双波浪线标示的序列为编码轻链信号肽的核苷酸序列。

加粗的序列为TraVL区(曲妥珠轻链可变区)。

第二条单直下划线标示的序列为CL区(曲妥珠轻链恒定区)。

PerVH-CL-Hinge-CH2-CH3-Furin-T2A-PerVL-CH1的核苷酸序列如下：

双直下划线标示的序列为PerVH区(帕妥珠重链可变区)。

粗下划线标示的序列为CL区。

点式下划线标示的序列为Hinge区。

虚下划线标示的序列为CH2区。

点-短线下划线标示的序列为CH3(Hole)区。

点-点-短线下划线标示的序列为Furin区。

单波浪线标示的序列为T2A区。

双波浪线标示的序列为编码轻链信号肽的核苷酸序列。

加粗的序列为PerVL区(帕妥珠轻链可变区)。

第二条单直下划线标示的序列为CH1区(帕妥珠轻链恒定区)。

PerVH-CL-Hinge-CH2-CH3-Furin-T2A-PerVL-CH1的氨基酸序列如下：

第一条单直线下划线标示的序列为重链信号肽。

双直下划线标示的序列为PerVH区(帕妥珠重链可变区)。

粗下划线标示的序列为CL区。

点式下划线标示的序列为Hinge区。

虚下划线标示的序列为CH2区。

点-短线下划线标示的序列为CH3(Hole)区。

点-点-短线下划线标示的序列为Furin区。

单波浪线标示的序列为T2A区。

双波浪线标示的序列为轻链信号肽。

加粗的序列为PerVL区(帕妥珠轻链可变区)。

第二条单直下划线标示的序列为CH1区(帕妥珠轻链恒定区)。

实施例2：HER2双质粒瞬时共转染CHO细胞

按照Thermo转染试剂(ExpiCHO^TM Expression System Kit，货号A29133)说明书，将双质粒共转染至CHO细胞，进行表达。具体地，提前一天培养CHO细胞至所需数量，分别将自提双质粒和转染试剂在OptiPRO ^TMSFM中稀释混匀，静置3min将转染试剂加入稀释好的质粒DNA中混合，将混合物转移至CHO细胞培养物中在进行转染，37℃、8％CO₂高湿度环境培养。转染后的第二天(18-22h)和第五天补加Feed，32℃、5％CO₂高湿度环境培养至第12天，3000rpm，离心5min，收获细胞，弃去细胞碎片；-80℃保存备用。

实施例3：转染表达产物纯化

将收集的上清液，用Protein A进行纯化。纯化前将收集的细胞上清液，用0.45μm的滤膜进行过滤，0.25mL/min流速上样，20mM柠檬酸钠pH6.0顶样3mL，洗涤5个柱体积；0.1M柠檬酸钠pH3.0洗脱5个柱体积；CIP 3个柱体积后20％乙醇保存色谱柱和层析系统，SDS-PAGE检测纯化产物。

图2所示为SDS-PAGE检测结果图，其中，条带1为Marker，条带2为空白对照，条带3为纯化后的双抗，条带4为3.3μg帕妥珠单抗(罗氏)，条带5为3.3μg曲妥珠单抗(罗氏)。

实施例4：HER2双功能抗体双表位鉴定

使用大分子相互作用仪ForteBio Octet 96e，采用Ni—NTA传感器，进行双表位鉴定。Ni-NTA固化含有His标签的Her2抗原，抗原浓度10μg/mL左右，室温放置1个小时。按图3顺序上样：第2列为200μg/mL高浓度样品，第4列为2.5μg/mL样品。

图3所示为上样图，其中，各符号的含义如下：

Ab：待检纯化样品；Ab1：曲妥珠单抗；Ab2：帕妥珠单抗；Ab3：利妥昔单抗注射液(罗氏)。

A、E行(sensor A12、E12)先用过量的HER2双抗封闭传感器上HER2抗原，再加入曲妥珠或帕妥珠；

B、F行(sensor B12、F12)先用过量的曲妥珠或帕妥珠封闭传感器上HER2抗原，再加入HER2双抗；

C行(sensor C12)先用过量的帕妥珠封闭传感器上HER2抗原，再加入曲妥珠；

D行(sensor D12)为空白行排除非特异性结合；

G行(sensor G12)为无关蛋白对照。

图4所示为HER2双功能抗体双表位鉴定结果图，横坐标为Time(second)，代表反应时间，纵坐标为Bi nding(nm)，代表结合位移。可见：如先加入了过量的HER2双抗(sensorA12、E12)，传感器上HER2抗原被饱和后，再加入曲妥珠或者帕妥珠均没有结合信号，说明HER2抗原结构域Ⅳ和结构域Ⅱ均被HER2双抗结合；如先加入过量的曲妥珠或帕妥珠(sensor B12、F12)，再加入HER2双抗，仍然出现结合信号，说明HER2双抗能结合帕妥珠和曲妥珠的表位；阳性对照为sensor C12，阴性对照为sensor D12和sensor G12。

实施例5：HER2双表位双功能抗体体外增殖活性检测

准备足够数量的BT474细胞(上海赛百慷，货号：icell-h028)，提前一天在96孔板中铺板，37℃、5％CO₂的培养箱中培养过夜。第二天，用培养基将HER2双抗和对照品进行3倍梯度稀释，将不同浓度的样品加至96孔细胞培养板上。

将培养板在37℃、5％CO₂培养箱中培养孵育72h，向每孔加入10μL CCK8溶液，将培养板在37℃培养箱内孵育3h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，通过四参数拟合计算EC50。

图5、图6中，横坐标表示样品浓度取10为底的对数，纵坐标为对应孔中细胞液的吸光值。

图5所示为空白对照组、曲妥珠单抗组、帕妥珠单抗组、HER2双抗组的吸光值结果图，可见，HER2双抗对BT474细胞的增殖抑制效果优于曲妥珠单抗、帕妥珠单抗。

图6所示为HER2双抗组与帕/曲妥珠单抗混合物组的吸光值结果图，可见，HER2双抗增殖抑制效果优于曲妥珠和帕妥珠单抗的混合物。

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市乐土生物医药有限公司

<120> 一种抗HER2的多肽及其用途

<130> 21I31658

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2190

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagctgg gcctgagctg gatcttcctg ctggccatcc tgaagggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gagactgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcaa catcaaggac acctacatcc actgggtgag acaggccccc 180

ggcaagggcc tggagtgggt ggccagaatc taccccacca acggctacac cagatacgcc 240

gacagcgtga agggcagatt caccatcagc gccgacacca gcaagaacac cgcctacctg 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcagcag atggggcggc 360

gacggcttct acgccatgga ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcc 420

agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 480

accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 540

aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 600

ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 660

atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 720

agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgagctgct gggcggcccc 780

agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag aacccccgag 840

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 900

gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gagaggagca gtacaacagc 960

acctacagag tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1020

tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1080

gccaagggcc agcccagaga gccccaggtg tacaccctgc ccccctgcag agacgagctg 1140

accaagaacc aggtgagcct gtggtgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1200

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1260

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc gaactgaccg tggacaagag cagatggcag 1320

cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380

aagagcctga gcctgagccc cggcaagaga agaaagagag gcagcggcga gggcagaggc 1440

agcctgctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggcc ccatggacat gagagtgccc 1500

gcccagctgc tgggcctgct gctgctgtgg ctgagcggcg ccagatgcga catccagatg 1560

acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc gtgggcgaca gagtgaccat cacctgcaga 1620

gccagccagg acgtgaacac cgccgtggcc tggtaccagc agaagcccgg caaggccccc 1680

aagctgctga tctacagcgc cagcttcctg tacagcggcg tgcccagcag attcagcggc 1740

agcagaagcg gcaccgactt caccctgacc atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc 1800

acctactact gccagcagca ctacaccacc ccccccacct tcggccaggg caccaagctg 1860

gagatcaaga gaaccgtggc cgcccccagc gtgttcatct tcccccccag cgacgagcag 1920

ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc ctgctgaaca acttctaccc cagagaggcc 1980

aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctg cagagcggca acagccagga gagcgtgacc 2040

gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaggcc 2100

gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagcagcccc 2160

gtgaccaaga gcttcaacag aggcgagtgc 2190

<210> 2

<211> 730

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

145 150 155 160

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

225 230 235 240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

305 310 315 320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

370 375 380

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

385 390 395 400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

405 410 415

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Glu Leu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys Arg Arg Lys Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly

465 470 475 480

Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp

485 490 495

Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser

500 505 510

Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

515 520 525

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp

530 535 540

Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

545 550 555 560

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser

565 570 575

Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

580 585 590

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

595 600 605

Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

610 615 620

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

625 630 635 640

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

645 650 655

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

660 665 670

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

675 680 685

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

690 695 700

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

705 710 715 720

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

725 730

<210> 3

<211> 2187

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggagctgg gcctgagctg gatcttcctg ctggccatcc tgaagggcgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gagactgagc 120

tgcgccgcca gcggcttcac cttcaccgac tacaccatgg actgggtgag acaggccccc 180

ggcaagggcc tggagtgggt ggccgacgtg aaccccaaca gcggcggcag catctacaac 240

cagagattca agggcagatt caccctgagc gtggacagaa gcaagaacac cctgtacctg 300

cagatgaaca gcctgagagc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aaacctgggc 360

cccagcttct acttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcagaacc 420

gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc 480

gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc taccccagag aggccaaggt gcagtggaag 540

gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag 600

gacagcacct acagcctgag cagcaccctg accctgagca aggccgacta cgagaagcac 660

aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag ggcctgagca gccccgtgac caagagcttc 720

aacagaggcg agtgcgagcc caagagctgc gacaagaccc acacctgccc cccctgcccc 780

gcccccgagc tgctgggcgg ccccagcgtg ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc 840

ctgatgatca gcagaacccc cgaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaggac 900

cccgaggtga agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag 960

cccagagagg agcagtacaa cagcacctac agagtggtga gcgtgctgac cgtgctgcac 1020

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcccgcc 1080

cccatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccca gagagcccca ggtgtgcacc 1140

ctgcccccca gcagagacga gctgaccaag aaccaggtga gcctgagctg cgccgtgaag 1200

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca acggccagcc cgagaacaac 1260

tacaagacca ccccccccgt gctggacagc gacggcagct tcaagctggt gagcaagctg 1320

accgtggaca agagcagatg gcagcagggc aacgtgttca gctgcagcgt gatgcacgag 1380

gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctga gccccggcaa gagaagaaag 1440

agaggcagcg gcgagggcag aggcagcctg ctgacctgcg gcgacgtgga ggagaacccc 1500

ggccccatgg acatgagagt gcccgcccag ctgctgggcc tgctgctgct gtggctgagc 1560

ggcgccagat gcgacatcca gatgacccag agccccagca gcctgagcgc cagcgtgggc 1620

gacagagtga ccatcacctg caaggccagc caggacgtga gcatcggcgt ggcctggtac 1680

cagcagaagc ccggcaaggc ccccaagctg ctgatctaca gcgccagcta cagatacacc 1740

ggcgtgccca gcagattcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 1800

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accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aaggccagca ccaagggccc cagcgtgttc 1920

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accgtgccca gcagcagcct gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa ccacaagccc 2160

agcaacacca aggtggacaa gaaggtg 2187

<210> 4

<211> 729

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn

65 70 75 80

Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn

85 90 95

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Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

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Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro

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145 150 155 160

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

165 170 175

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

180 185 190

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

195 200 205

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

210 215 220

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

225 230 235 240

Asn Arg Gly Glu Cys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

260 265 270

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

275 280 285

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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

305 310 315 320

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

325 330 335

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

340 345 350

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

355 360 365

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser

370 375 380

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

385 390 395 400

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

405 410 415

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

420 425 430

Ser Phe Lys Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

435 440 445

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

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His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Arg Arg Lys

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu

500 505 510

Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Ser Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met

515 520 525

Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

530 535 540

Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr

545 550 555 560

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser

565 570 575

Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

580 585 590

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

595 600 605

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln

610 615 620

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

645 650 655

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

660 665 670

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

675 680 685

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

690 695 700

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

705 710 715 720

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

725

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第一HER2抗体结合位点，所述第二抗原结合结构域可结合至HER2抗原的第二HER2抗体结合位点，所述第一HER2抗体结合位点不同于所述第二HER2抗体结合位点。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一HER2抗体结合位点位于HER2的结构域II，所述第二HER2抗体结合位点位于HER2抗原的结构域IV；

和/或，所述第一HER2抗体结合位点与曲妥珠单抗的抗体结合位点相同；

和/或，所述第二HER2抗体结合位点与帕妥珠单抗的抗体结合位点相同；

和/或，所述第一抗原结合结构域包含第一重链可变结构域和第一轻链可变结构域；

和/或，所述第一重链可变结构域包含曲妥珠单抗的重链可变结构域(TraVH)；

和/或，所述第一重链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO.5)；

和/或，所述第一轻链可变结构域包含曲妥珠单抗的轻链可变定结构域(TraVL)；

和/或，所述第一轻链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO.6)；

和/或，所述第二抗原结合结构域包含第二重链可变结构域和第二轻链可变结构域；

和/或，所述第二重链可变结构域包含帕妥珠单抗的重链可变结构域(PerVH)；

和/或，所述第二重链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

和/或，所述第二轻链可变结构域包含帕妥珠单抗的轻链可变定结构域(PerLV)；

和/或，所述第二轻链可变结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO.8)；

和/或，所述帕妥珠单抗的重链可变结构域的C端键联至IgG抗体的轻链恒定结构域的N端。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽还包含第一重链恒定结构域、第二重链恒定结构域，所述第一重链恒定结构域包含人IgG抗体Fc区knob突变体，所述第二重链恒定结构域包含人IgG抗体Fc区hole突变体；

和/或，所述IgG抗体包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型或其突变体中的至少一种；

和/或，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的至少一种：S354、T366、K409；

和/或，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的至少一种：S354C、T366W、K409E；

和/或，所述人IgG抗体Fc区knob突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的全部：S354C、T366W、K409E；

和/或，所述人IgG抗体Fc区knob突变体包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

GQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO.9)；

和/或，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的至少一种：Y349、T366、L368、Y407、F405；

和/或，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下氨基酸突变中的至少一种：Y349C、T366S、L368A、Y407V、F405K；

和/或，所述人IgG抗体Fc区hole突变体相对于人IgG抗体Fc区包含如下位置突变中的全部：Y349C、T366S、L368A、Y407V、F405K；

和/或，所述人IgG抗体Fc区hole突变体包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

和/或，所述第一重链恒定结构域还包含IgG抗体的重链第一恒定结构域(CH1)；

和/或，所述IgG抗体的重链第一恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO.11)；

和/或，所述第二重链恒定结构域还包含IgG抗体的轻链恒定结构域(IgG-CL)；

和/或，所述IgG抗体的轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.12)。

和/或，所述多肽还包含第一轻链恒定结构域；

和/或，所述第一轻链恒定结构域包含IgG抗体的轻链恒定结构域(IgG-CL)；

和/或，所述第一轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO.13)；

和/或，所述多肽还包含第二轻链恒定结构域；

和/或，所述第二轻链恒定结构域包含IgG抗体的重链第一恒定结构域(CH1)；

和/或，所述第二轻链恒定结构域包含如下氨基酸序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列中的至少一种：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV(SEQ ID NO.14)；

和/或，所述IgG包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4亚型或其突变体中的至少一种。

4.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1～3任意一项所述多肽的核苷酸序列。

5.一种构建体，其特征在于，所述构建体包含权利要求4所述多核苷酸。

6.一种表达系统，其特征在于，所述表达系统含有权利要求5所述构建体或基因组中整合有外源的如权利要求4所述多核苷酸。

7.一种偶联物，其特征在于，所述偶联物包含权利要求1～3任意一项所述多肽以及偶联部分，所述偶联部分为可检测的标记；

和/或，所述偶联部分为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质、酶中的至少一种。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～3任意一项所述多肽，或权利要求7所述偶联物；

和/或，试剂盒还包含第二抗体，其特异性识别所述多肽；

和/或，所述第二抗体还包含可检测的标记；

和/或，所述可检测的标记为放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶中的至少一种。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1～3任意一项所述多肽，和/或权利要求4所述多核苷酸，和/或权利要求7所述偶联物；

和/或，所述组合物还包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂、佐剂中的至少一种。

10.权利要求1～3任意一项所述多肽，或权利要求4所述多核苷酸，或权利要求5所述构建体，或权利要求6所述表达系统，或权利要求7所述偶联物在制备治疗和/或预防和/或诊断肿瘤的药物中的用途；

和/或，所述肿瘤为乳腺癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、子宫内膜癌、膀胱癌、肺癌、结肠癌、头颈癌、前列腺癌中的至少一种；

和/或，所述前列腺癌为晚期前列腺癌；

和/或，所述乳腺癌为转移性乳腺癌。

11.权利要求1～3任意一项所述多肽，或权利要求4所述多核苷酸，或权利要求5所述构建体，或权利要求6所述表达系统，或权利要求7所述偶联物在制备抑制或阻断HER2的同源二聚体形成和/或HER2的异源二聚体形成的药物中的用途。

12.一种多肽的制备方法，其特征在于，包括：

表达步骤，包括将编码所述曲妥珠重链突变体的核苷酸与编码所述曲妥珠轻链的核苷酸串联，得到曲妥珠融合核苷酸，克隆到第一载体中，得到克隆有曲妥珠融合核苷酸的载体；将编码所述帕妥珠重链突变体的核苷酸与编码所述帕妥珠轻链突变体的核苷酸串联，得到帕妥珠融合核苷酸，克隆到第二载体中，得到克隆有帕妥珠融合核苷酸的载体，将所述克隆有曲妥珠融合核苷酸的载体、克隆有帕妥珠融合核苷酸的载体共转染至宿主细胞，表达得到所述多肽。

13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述多肽为权利要求1～3任意一项所述多肽。