CN112062853A - 双特异性her2抗体及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及双特异性HER2抗体及使用方法。本发明涉及双特异性HER2结构域II和结构域IV抗体，新颖的HER2抗体变体，用于生成它们的方法，含有所述抗体的药物组合物，和它们的用途。

Description

双特异性HER2抗体及使用方法
本申请是申请日为2014年12月18日、中国申请号为201480067305.2、发明名称为“双特异性HER2抗体及使用方法”的发明申请的分案申请。
发明领域
本发明涉及双特异性HER2抗体，新颖的HER2抗体变体，用于生成它们的方法，含有所述抗体的药物组合物，和它们的用途。
发明背景
对肿瘤相关抗原特异性的抗体是癌症疗法中一种有价值的办法，因为它们介导对肿瘤细胞的选择性破坏，同时留下健康细胞和组织不受损害。
受体酪氨酸激酶的ErbB家族的成员是细胞生长，分化和存活的重要介导物。该受体家族包括四个独特成员，包括表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1)，HER2(ErbB2或p185″e″)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)。HER2是一种跨膜的表面结合的受体酪氨酸激酶，而且正常情况下牵涉导致细胞生长和分化的信号转导途径。HER2是乳腺癌治疗的一种有希望的靶物，因为发现它在约四分之一的乳腺癌患者中过表达(Bange等，2001，NatureMedicine 7：548)。
鼠单克隆抗体4D5特异性靶向过表达HER2的癌细胞中的HER2，而对表达生理水平HER2的细胞没有影响。人源化(4D5)单克隆抗体(hu4D5)在商业上称作药物
Figure BDA0002619651350000011
(曲妥珠单抗(Trastuzumab)，rhuMAb HER2，美国专利No 5,821,337)，它在1998年晚期获得FDA销售批准。
Herceptin是第一种为治疗HER2阳性乳腺癌开发的单克隆抗体，而且延长患者的存活时间，所以它们现在与具有HER2阴性乳腺癌的患者一样。在Herceptin治疗之前，与具有HER2阴性疾病的患者相比，诊断有HER2阳性乳腺癌的患者预期具有更短的存活结局。在CLEOPATRA研究中，PERJETA与Herceptin和化疗组合显示出延长具有这种攻击性疾病的患者的存活时间，甚至超过Herceptin。
帕妥珠单抗(Pertuzumab)(PERJETATM，rhuMab 2C4，美国专利No.7,862,817)是一种人源化单克隆抗体，其特异性设计成阻止HER2受体与细胞表面上的其它HER受体(EGFR/HER1，HER3和HER4)配对(二聚化)，认为该过程在肿瘤生长和存活中发挥作用。认为PERJETA，Herceptin和化疗的组合提供对HER信号传导途径的更加全面阻断。PERJETA批准在具有HER2阳性转移性或局部复发性不可切除乳腺癌的成年患者中与Herceptin(曲妥珠单抗)和多西他赛组合，而且在2013年9月获得FDA批准用于新辅助乳腺癌治疗。帕妥珠单抗结合对于二聚化至关重要的HER2结构域II，而曲妥珠单抗结合HER2胞外域IV。
Li等(Cancer Research.2013)描述克服曲妥珠单抗抗性的针对ErbB2的双特异性，二价抗体。其中描述的双特异性，二价抗体基于天然曲妥珠单抗和帕妥珠单抗序列。
令人惊讶的是，本申请的发明人发现，优化天然曲妥珠单抗和帕妥珠单抗序列及在两种不同改良双特异性，单价抗体型式中组合这些优化变体导致特性与单特异性抗体rhuMab 2C4和hu 4D5的组合相比有改善。而且，该抗体优于Li等人披露的二价抗体型式，因为它们是单价的且具有与两种单特异性抗体帕妥珠单抗和曲妥珠单抗相同的分子量。因此，新的双特异性型式组合本领域已知的双特异性HER2抗体的卓越特征与经典的单特异性抗体的优点：本发明的新颖的双特异性HER2抗体对于两种不同HER2表位是单价的，导致与二价亲本抗体相同的亲合效应。相反，四价抗体在它们对细胞上的HER2的亲合力方面可能有所不同。新颖的双特异性HER2抗体的亲合效应可导致对具有低HER2表达的细胞类型(诸如在可能不想要抑制HER2和/或ADCC的心脏组织或正常组织中)卓越的安全性窗口。
而且，由于它们与亲本150KD IgG1抗体的扩散常数匹配的天然IgG构造，本文中描述的双特异性抗体具有与二价亲本抗体相同的扩散常数。由于天然IgG构造，而且可以预期免疫原性和抗药物抗体形成的风险降低。最后但并非最不重要的是，与四价双特异性抗体相比，与脱落HER2胞外域形成免疫复合物的风险因单价而降低且与亲本抗体相当。免疫复合物可导致抗原呈递细胞摄取的复合物的免疫原性增强，而且如果免疫复合物在肾中沉积的话，最终可诱导肾毒性。
在本发明的一个方面，提供一种单价双特异性抗体，其中IgG分子的Fab片段之一用交叉Fab片段替换。交叉Fab片段是如下的Fab片段，其中重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。包含交叉Fab片段的双特异性抗体型式已有记载，例如WO2009080252，WO2009080253，WO2009080251，WO2009080254，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2013/026831。天然曲妥珠单抗序列已经在它们的CDR中进行优化以改进抗体CDR针对自发化学修饰的稳定性，框架嫁接所得序列以避免错配，并将双特异性抗体糖工程化，导致高度有力的特异性结合HER2的双特异性抗体，其具有增强的FcgRIII结合，导致免疫效应细胞诸如NK细胞或单核细胞/巨噬细胞募集增强；最后，它们能以与常规亲本Her2抗体相当的高产量且只有低百分比的副产物生成。在HER2双特异性CrossMAb的情况中，源自帕妥珠单抗和曲妥珠单抗二者均基于相当框架区这一事实的轻链的抗体链错配已经通过将CDR嫁接到完全新颖的抗体框架上而克服。
在本发明的另一个方面，提供特异性结合HER2胞外域IV和II的单价双特异性抗体，其中两个结合模块包含相同的基于亲本曲妥珠单抗和帕妥珠单抗轻链的共有的轻链，而且对应的帕妥珠单抗重链已经重塑。这种所谓的“共同轻链”原理(即组合分享一种轻链但仍具有不同特异性的两种结合者)的使用防止轻链错配，而且在这种特定情况中保留亲本抗体的表位特异性。后果是，生产期间副产物较少，便于以高产量同质制备HER2双特异性抗原结合分子。令人惊讶的是，本发明的发明人发现，单价共同轻链型式的双特异性HER2抗体具有升高的对帕妥珠单抗表位的亲和力，而且显示与亲本抗体的组合相比卓越的对细胞增殖的抑制效果和细胞依赖性细胞毒性(CDC)诱导。补体依赖性细胞毒性(CDC)对于最佳治疗性单克隆抗体(单抗)功能是非常重要的，而且甚至在化疗治疗后仍然是完全保留的。然而，一些但并非所有抗体产生这种活性。
发明概述
本发明涉及特异性结合HER2的双特异性抗体，其包含对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其中该双特异性抗体对HER2胞外域II和IV二者均是单价的。在一个实施方案中，该双特异性抗体以比帕妥珠单抗或曲妥珠单抗的组合要高的程度诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一个此类实施方案中，通过LDH测定法或补体测定法测定该双特异性抗体的补体依赖性细胞毒性，并与通过相同测定法测定的帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合的补体依赖性细胞毒性比较。在一个实施方案中，补体依赖性细胞毒性是在体外在癌细胞上，优选在乳腺癌细胞上测定的。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含能够特异性结合HER2胞外域II的第一Fab分子和能够特异性结合HER2胞外域IV的第二Fab分子，其中该第一Fab分子可变轻链的序列与该第二Fab分子可变轻链的序列相同。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含：(a)包含选自SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：58和SEQ ID NO：14的重链CDR1，选自SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：60的重链CDR2，和选自SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：59和SEQID NO：16的重链CDR3的第一重链；和(b)包含SEQ ID NO：20的重链CDR1，SEQ ID NO：29的重链CDR2，和选自SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：79的重链CDR3的第二重链；和(c)第一和第二轻链，其中第一和第二轻链的可变轻链包含SEQ ID NO：89，SEQ ID NO：90和SEQ ID NO：19的CDR。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含：两条包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列的可变轻链；包含如下可变重链的第一重链，该可变重链包含选自SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：68的氨基酸序列；和包含如下可变重链的第二重链，该可变重链包含选自SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：117的氨基酸序列。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含能够特异性结合HER2胞外域II的第一Fab分子和能够特异性结合HER2胞外域IV的第二Fab分子，其中至少一个Fab片段的重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含：包含SEQ ID NO：14的重链CDR1，SEQ ID NO：15的重链CDR2和SEQ ID NO：16的重链CDR3，和SEQ ID NO：11的轻链CDR1，SEQID NO：12的轻链CDR2和SEQ ID NO：13的轻链CDR3的第一Fab分子；和包含SEQ ID NO：20的重链CDR1，SEQ ID NO：108的重链CDR2和SEQ ID NO：79的重链CDR3，和SEQ ID NO：107的轻链CDR1，SEQ ID NO：18的轻链CDR2和SEQ ID NO：19的轻链CDR3的第二Fab分子。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含：包含SEQ ID NO：14的重链CDR1，SEQ ID NO：15的重链CDR2和SEQ ID NO：16的重链CDR3，和SEQ ID NO：11的轻链CDR1，SEQ ID NO：12的轻链CDR2和SEQ ID NO：13的轻链CDR3的第一Fab分子；和包含SEQ ID NO：20的重链CDR1，SEQID NO：29的重链CDR2和选自SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88的重链CDR3，和选自SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：158的轻链CDR1，SEQ ID NO：18的轻链CDR2和SEQ ID NO：19的轻链CDR3的第二Fab分子。在一个方面，该特异性结合HER2的双特异性抗体包含第一Fab分子，其包含包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的可变轻链；和第二Fab分子，其包含包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的轻链可变区。
在第二个目标中，本发明涉及一种药物组合物，其包含本发明的双特异性抗体。
在第三个目标中，本发明涉及本发明的双特异性抗体，其用于治疗癌症。在另一个实施方案中，提供双特异性抗体作为药物的用途。优选地，所述用途为用于治疗癌症。
在又一些目标中，本发明涉及包含编码本发明的双特异性抗体的重链的序列的核酸序列，包含编码本发明的双特异性抗体的轻链的序列的核酸序列，包含本发明的核酸序列的表达载体，和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。
附图简述
图1a)-1d)：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的示意图。该抗体对于每种抗原结合位点均是二价的且能够结合ErbB2/HER2受体中的两种不同互补位(抗原1＝曲妥珠单抗特异性，即HER2胞外域IV；抗原2＝帕妥珠单抗特异性，即HER2胞外域II)。1a)：以VH-VL的次序，单链Fv(scFv)融合至重链的C端(TvAB12，SEQ ID NO 123和124)。1b)：以VL-VH的次序，单链Fv(scFv)融合至轻链的N端(TvAB13，SEQ ID NO 125和126)。1c)以VL-VH的次序，单链Fv(scFv)融合至轻链的C端(TvAB16，SEQ ID NO 127和128；TvAB20，SEQ ID NO 131和132)。1d)：以VL-VH的次序，单链Fv(scFv)融合至重链的C端(TvAB17，SEQ ID NO 129和130)。
图2a)-2b)：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的纯化。2a)：TvAb12(SEQ ID NO 123和124)在26/60Superdex 200柱上的大小排阻纯化。2b)：源自大小排阻层析的主峰级分的SDS-PAGE分析(NR＝非还原性，R＝还原性条件)。
图3a)-3b)：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的纯化。3a)：TvAb16(SEQ ID NO 127和128)在26/60Superdex 200柱上的大小排阻纯化。3b)：源自大小排阻层析的主峰级分的SDS-PAGE分析(NR＝非还原性，R＝还原性条件)。
图4a)-4b)：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的纯化。4a)：TvAb20(SEQ ID NO 131和132)在26/60Superdex 200柱上的大小排阻纯化。主产物峰标有“1”。4b)：源自大小排阻层析的主峰级分的SDS-PAGE分析(NR＝非还原性，R＝还原性条件)。
图5a)-5b)：将样品于40℃在缓冲液pH 5.0的40mM组氨酸，150mM NaCl中温育1，2，或3个月后通过SPR方法(ProteOn仪器)测定的曲妥珠单抗变体的解离速率。变体的解离速率在所调查的时间段上没有变化。“602”：重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变。
图6a)-6c)：将样品于40℃在不同pH的40mM组氨酸，150mM NaCl中温育1，2，或3个月后通过SPR方法(ProteOn仪器)测定的曲妥珠单抗变体的解离速率。N30S变体的解离速率很慢，因此含有高度的不确定性。“602”：重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变，“N30T”：重链中的D98E突变和轻链中的N30T突变，“N30S”：重链中的D98E突变和轻链中的N30S突变。6a)：pH 5.0，6b)：pH 6.0，6c)：pH 7.4。
图7a)-7b)：曲妥珠单抗和曲妥珠单抗稳定化变体在应力后对KPL-4细胞的结合。将曲妥珠单抗和3种不同稳定化曲妥珠单抗变体在具有不同pH值的缓冲液中于40℃温育1，2和3个月。通过流式细胞术对经受过应力的抗体测试对KPL-4细胞的结合，与时间点零的抗体比较。“602”：重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变，“N30T”：重链中的D98E突变和轻链中的N30T突变，“N30S”：重链中的D98E突变和轻链中的N30S突变。
图8：曲妥珠单抗和曲妥珠单抗稳定化变体在应力后对KPL-4细胞的结合。将曲妥珠单抗和2种稳定化变体GA602(重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变)和GA603(重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变和FcRN突变T307Q和N434A)于40℃在缓冲液1(40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 5.0)或缓冲液2(40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.0)中温育1，2和3个月。通过流式细胞术对经受过应力的抗体测试对KPL-4细胞的结合，与时间点零的抗体比较。
图9：曲妥珠单抗，GA602和GA603在应力后对KPL-4细胞的ADCC诱导。将曲妥珠单抗和2种稳定化变体GA602(重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变)和GA603(重链中的D98E突变和轻链中的T31V突变和FcRN突变T307Q和N434A)于40℃在缓冲液1(40mM组氨酸，150mMNaCl，pH 5.0)或缓冲液2(40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.0)中温育1，2和3个月。4小时后对经受过应力的抗体测试对KPL-4细胞的ADCC诱导，与时间点零的抗体比较。
图10a)-10b)：1+1型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的示意图。10a)：基于单链Fab(scFab)的分子，10b)：基于交叉Fab(xFab)的分子。
图11a)-11b)：CrossMab-XPer(SEQ ID NO 109，110，96，86)的纯化。11a)：经过纯化的抗体分子在还原和非还原条件下的SDS-PAGE。11b)：经过纯化的CrossMab-XPer的HP-SEC分析。
图12：CrossMab-XTra(顶部，SEQ ID NO 119，120，121，122)和CrossMab-CDRG(底部，SEQ ID NO 109，110，111，112)的谱的Q-TOF质谱术比较，评估抗体分子的完整性和纯度。
图13a)-13b)：非糖工程化HER2 CrossMab(SEQ ID NO 119，120，121，122)在温育5天后的增殖抑制，在
Figure BDA0002619651350000071
测定法中测量。13a)BT474细胞，13b)N87细胞。
图14a)-14c)：由不同HER2特异性抗体诱导的ADCC，使用14a)KPL-4，14b)T47D和14c)Calu-3作为靶细胞(E∶T＝25∶1，效应人PBMC，温育时间4小时)。“HER2 crossmab wt”：SEQ ID NO 119，120，121，122，非糖工程化的；“HER2 crossmab g2”：SEQ ID NO 119，120，121，122，糖工程化的。
图15a)-15c)：不同抗Her2抗体在Calu3非小细胞肺癌异种移植物中的抗肿瘤活性(实验：Bispec.Her2_PZ_Calu3_001)。以所示剂量i.p.一周一次处理具有Calu3异种移植物肿瘤的SCID米色小鼠达7周。使用Xolair(一种靶向人IgE的人源化IgG1抗体)作为对照。基于终点(第85天)时的中值的统计分析揭示，与Xolair相比，双特异性HER2抗体将肿瘤生长阻抑87.5％(s.)；OmniE(SEQ ID NO 145，146)阻抑43.7％(n.s.)；Crossmab_003(SEQ IDNO 119，120，121，122，非糖工程化的)阻抑92.1％(s.)；TvAb12(SEQ ID NO 123和124)阻抑59.8％(n.s.)；而TvAb20(SEQ ID NO 131和132)阻抑12.6％(n.s.)。以均值+/-SEM(每组中n＝8)描绘肿瘤生长曲线。
图16a)-16c)：不同抗Her2抗体在KPL-4乳腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性(实验：Bispec.Her2_PZ_KPL-4_002)。以所示剂量i.p.一周一次处理具有KPL-4异种移植物肿瘤的SCID米色小鼠达5周。使用Xolair(一种靶向人IgE的人源化IgG1抗体)作为对照。基于终点(第59天)时的中值的统计分析揭示，与Xolair相比，双特异性HER2抗体将肿瘤生长阻抑120.8％(s.)；Crossmab_003(SEQ ID NO 119，120，121，122，非糖工程化的)阻抑120.6％(s.)；TvAb12(SEQ ID NO 123和124)阻抑70.1％(s.)；TvAb20(SEQ ID NO 131和132)阻抑83.4％(s.)。OmniE(SEQ ID NO 145，146)对肿瘤生长没有显著影响。以均值+/-SEM(每组中n＝9)描绘肿瘤生长曲线。
图17a)-17c)：抗Her2_005 crossmab抗体(SEQ ID NO 119，120，121，122，非糖工程化的)在KPL-4乳腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性(实验：Bispec.Her2_PZ_KPL-4_003)。以范围为1至20mg/kg的逐渐放大剂量的crossmab i.p.一周一次处理具有KPL-4异种移植物肿瘤的SCID米色小鼠达5周。使用Xolair(一种靶向人IgE的人源化IgG1抗体)作为对照。基于终点(第70天)时的中值的统计分析揭示，与Xolair相比，双特异性HER2抗体将肿瘤生长阻抑121.8％(s.)。Her2 crossmab_005在1mg/kg的剂量将肿瘤生长阻抑25.1％(n.s.)；在5mg/kg阻抑112.3％(s.)；在10mg/kg阻抑109.5％(s.)；而在20mg/kg阻抑121.8％(s.)。以均值+/-SEM(每组中n＝10)描绘肿瘤生长曲线。
图18a)-18c)：不同抗Her2抗体在KPL-4乳腺癌异种移植物中的抗肿瘤活性(实验：Bispec.Her2_PZ_KPL-4_009)。用不同化合物i.p.一周一次处理具有KPL-4异种移植物肿瘤的SCID米色小鼠达4周。使用Xolair(一种靶向人IgE的人源化IgG1抗体)作为对照。基于终点(第70天)时的中值的统计分析揭示，与Xolair相比，双特异性HER2抗体(均以5mg/kg给药)将肿瘤生长阻抑83.2％(s.)，而二者均以10mg/kg的剂量给予时阻抑109.5％(s.)。以两种不同剂量(5mg/kg和10mg/kg)给予的TvAb16(SEQ ID NO 127和128)不具有显著的抗肿瘤效果。TvAb20(SEQ ID NO 131和132)在5mg/kg的剂量将肿瘤生长阻抑75.3％(s.)，而在10mg/kg的剂量阻抑59.8％(n.s.)。以均值+/-SEM(每组中n＝10)描绘肿瘤生长曲线。
图19：初始帕妥珠单抗/曲妥珠单抗杂合轻链的SPR分析。帕妥珠单抗，曲妥珠单抗，和包含曲妥珠单抗LCDR3区的氨基酸残基的初始帕妥珠单抗杂合LC的序列组合的基于SPR的动力学分析。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。帕妥珠单抗TrasL3：SEQ ID No：26，帕妥珠单抗Tras Y91H：SEQ ID No：28。
图20：帕妥珠单抗和曲妥珠单抗HC与新鉴定的共同轻链帕妥珠单抗(Tras.L3)(QM)，SEQ ID No：54组合的SPR分析。所显示的是在不同浓度两种抗体对Her2的结合。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图21：通过噬菌体展示鉴定的亲和力成熟的帕妥珠单抗克隆的表征。所鉴定的亲和力成熟克隆的SPR分析。所显示的是在不同浓度细菌Fab对Her2的结合。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。B2：SEQ ID No：66，D1：SEQ ID No：62，E1：SEQ ID No：68，C8：SEQ ID No：72，G2：SEQ ID No：70，A1：SEQ ID No：74。
图22：具有共同轻链的双特异性HER2抗体的示意图。
图23a)-23c)：具有共同轻链的双特异性HER2抗体的纯化和分析性表征。纯化方法牵涉一个亲和步骤(蛋白A)，接着是大小排阻层析(Superdex 200，GE Healthcare)。通过分析性大小排阻层析(Superdex 200柱)来分析和表征终产物。23a)：包含D1der(SEQ ID NO：64)，23b)：包含G2(SEQ ID NO：70)，23c)：包含E1(SEQ ID NO：68)。
图24：Her2敲除变体的SPR分析。所显示的是曲妥珠单抗和帕妥珠单抗结合两种敲除变体的传感图。平滑线代表数据对1∶1相互作用模型的全局拟合。
图25：具有共同轻链克隆变体的双特异性HER2抗体对KPL-4细胞的结合。用渐增浓度的所示抗体对KPL-4细胞染色。用FITC标记的抗人二抗检测抗体，并通过流式细胞术测定荧光。“Herceptarg CLC D1-der”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC G2/2”：SEQ IDNO 70，54，92，“HerceptargCLC E1/1”：SEQ ID NO 68，54，92；“GA 604”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图26a)-26c)：具有共同轻链克隆变体的双特异性HER2抗体对BT474，N87，和SkBr3细胞的增殖抑制。用3种不同Herceptarg变体处理BT474(图26a))，N87(图26b))，和SkBr3(图26c))细胞。包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合作为对照。5天后，用CellTiterGlo测定增殖抑制。“Herceptarg CLC D1-der”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLCG2/2”：SEQ ID NO 70，54，92，“Herceptarg CLC E1/1”：SEQ ID NO 68，54，92；“GA 604”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图27a)-27b)：具有共同轻链变体的双特异性HER2抗体对KPL-4细胞和MDA-MB 231的杀伤。27a)通过测量4小时后的LDH释放来测定PBMC对KPL-4细胞的抗体依赖性杀伤(E∶T25∶1)。27b)通过测量24小时后的LDH释放来测定PBMC对MDA-MB 231细胞的抗体依赖性杀伤(E∶T 5∶1)。“Herceptarg CLC D1-der”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC G2/2”：SEQ ID NO 70，54，92，“Herceptarg CLC E1/1”：SEQ ID NO 68，54，92；“GA 604”：SEQ IDNO 109，110，111，112。
图28：具有共同轻链克隆变体的双特异性HER2抗体对BT474细胞的增殖抑制。用不同Herceptarg变体处理BT474细胞。包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合作为对照。6天后，用CellTiter Glo测定增殖抑制。“Herceptarg CLC D1-der wt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“HerceptargCrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图29：Her2抗体在BT-474细胞上的C1q结合。将BT474细胞与3种Herceptarg变体一起温育。包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合作为对照。“Herceptarg CLC D1-derwt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“Herceptarg CrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图30：BT-474细胞的CDC激活(LDH释放)。将BT474细胞与3种Herceptarg变体一起温育。包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合作为对照。“Herceptarg CLC D1-derwt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“Herceptarg CrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图31a)-31b)：BT-474细胞的CDC介导的杀伤(ACEA)。将BT474细胞与3种Herceptarg变体一起温育。包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合作为对照。“Herceptarg CLC D1-der wt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“Herceptarg CrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
图32：双特异性抗体的体内活性。将用不同Her2双特异性分子(10mg/kg)处理后小鼠异种移植物模型中的肿瘤体积与曲妥珠单抗，帕妥珠单抗和二者的组合的处理比较。“Herceptarg”：SEQ ID NO 64，54，92。“对照”：Xolair，一种非Her2结合抗体。
发明详述
I.定义
贯穿本公开文本，术语“ErbB2”、“ErbB2受体”、“c-Erb-B2”、和“HER2”可互换使用，而且，除非另外指明，指天然序列ErbB2人多肽或其功能性衍生物。“ber2”、“erbB2”和“c-erb-B2”指相应的人基因。
出于本文中的目的，“受体人框架”指包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。自人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少、或2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列在序列上相同。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
“亲和力成熟的”抗体指在一个或多个高变区(HVR)中具有一处或多处改变的抗体，与不拥有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力改善。
术语“双特异性HER2抗体”和“特异性结合HER2的双特异性抗体”可互换使用，指如下的双特异性抗体，其能够以足够亲和力分别在胞外域II和IV二者上结合HER2，使得该抗体可用作靶向表达HER2的细胞的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，在胞外域II和IV二者上特异性结合HER2的双特异性抗体结合无关非HER2蛋白质的程度小于该抗体对HER2的结合的约10％，如例如通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)、基于表面等离振子共振(SPR)的测定法(例如Biacore)或流式细胞术(FACS)测量的。在某些实施方案中，特异性结合HER2的双特异性抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM、或≤0.001nM(例如10-8M或更少，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)的解离常数(Kd)。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、和抗体片段，只要它们展现出期望的抗原结合活性。
“抗体片段”指与完整抗体不同的分子，其包含完整抗体中的如下部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双抗体；cross-Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，scFv抗体记载于Huston，J.S.，Methods in Enzymol.203(1991)46-96。另外，抗体片段包含具有VH域或VL域的特征(即能够与VL域或VH域一起装配成功能性抗原结合位点，并且由此提供全长抗体的抗原结合特性)的单链多肽。
如本文中使用的，“Fab片段”指包含轻链片段(其包含VL域和轻链恒定域(CL))及VH域和重链第一恒定域(CH1)的抗体片段。在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含至少一个Fab片段，其中重和轻链的可变区或恒定区任一是交换的。由于可变区或恒定区任一的交换，所述Fab片段也称作“cross-Fab”片段或“xFab”片段或“交换Fab”片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中：一方面，Fab重和轻链的可变区是交换的，即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链及由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(VLVH)。另一方面，当Fab重和轻链的恒定区交换时，交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的一条肽链及由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的一条肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab(CLCH1)。
“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH)、抗体重链恒定域1(CH1)、抗体轻链可变域(VL)、抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸、优选介于32和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL经CL域和CH1域之间的天然二硫键稳定化。另外，通过经插入半胱氨酸残基(例如可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100，依照Kabat编号方式)生成链间二硫键可以进一步稳定化这些单链Fab分子。术语“N端”表示N端最后一个氨基酸，术语“C端”表示C端最后一个氨基酸。
“融合”或“连接”表示各成分(例如Fab分子和Fc域亚基)是通过肽键相连接的，或是直接的或是经由一个或多个肽接头。
如本文中使用的，术语“接头”指肽接头且优选是具有长度为至少5个氨基酸，优选长度为5-100个，更优选10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3、4、5或6且m＝0、1、2或3)或(x＝4且n＝2、3、4或5且m＝0、1、2或3)，优选x＝4且n＝2或3，更优选x＝4且n＝2。在一个实施方案中，所述肽接头是(G4S)2。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然发生抗体的结构的蛋白质。例如，IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端，每条重链具有可变区(VH)，也称作可变重域或重链可变域，接着是3个恒定域(CH1、CH2和CH3)，也称作重链恒定区。类似地，从N端至C端，每条轻链具有可变区(VL)，也称作可变轻域或轻链可变域，接着是恒定轻(CL)域，也称作轻链恒定区。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)的五种类之一，其中一些可以进一步分成亚类，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两种型之一。免疫球蛋白基本上由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和一个Fc域组成。
与参照抗体“结合相同表位的抗体”指在竞争测定法中将参照抗体对其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，且相反，参照抗体在竞争测定法中将该抗体对其抗原的结合阻断50％或更多。本文中提供了一种例示性的竞争测定法。
术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中，抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地，抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
术语“嵌合”抗体指其中重和/或轻链的一部分自特定的来源或物种衍生，而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生的抗体，其通常通过重组DNA技术来制备。包含家兔可变区和人恒定区的嵌合抗体是优选的。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是那些其中恒定区已经自初始抗体的恒定区修饰或改变以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。此类嵌合抗体也称作“类转换抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于生成嵌合抗体的方法牵涉常规的重组DNA和基因转染技术，其是本领域中公知的。参见例如Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专利No.5,202,238和5,204,244。
如本文中使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂或化疗药物(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂)；生长抑制剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体；及下文公开的各种抗肿瘤剂或抗癌剂。
“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)下调和B细胞活化。
如本文中使用的，术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化样式或各氨基酸侧链基团的修饰，以及这些办法的组合。
如本文中使用的，术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代、删除、插入和修饰。可以进行替代、删除、插入和修饰的任意组合来实现最终构建体，只要最终构建体拥有期望的特征，例如降低的对Fc受体的结合，或升高的与另一种肽的联合。氨基酸序列删除和插入包括氨基和/或羧基端氨基酸删除和插入。具体的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如Fc区的结合特征，特别优选非保守性的氨基酸替代，即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、鸟氨酸、高丝氨酸、5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变、PCR、基因合成、等等。通过与遗传工程不同的方法，诸如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能是有用的。本文中可使用各种名称来指示同一氨基酸突变。例如，Fc域第329位从脯氨酸到甘氨酸的替代可指示为329G、G329、G329、P329G或Pro329Gly。
药剂(例如药物配制剂)的“有效量”指在必需的剂量和时段上有效实现期望的治疗或预防结果的量。
本文中术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中至少含有恒定区的一部分的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，可以存在或不存在Fc区的C端赖氨酸(Lys447)。除非本文中另外指定，Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号系统，也称作EU索引，如记载于Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest，第5版Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD，1991的。如本文中使用的，Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两条多肽之一，即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如，IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的Fc域亚基的肽主链操作或翻译后修饰。如本文中使用的，具体地，促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰，其中所述修饰彼此互补，从而促进两个Fc域亚基的联合。例如，促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷，从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此，(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生，其在融合至每个亚基的别的成分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中，促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中，促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变，具体为氨基酸替代。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。一般地，可变域的FR由4个FR域组成：FR1、FR2、FR3、和FR4。因而，HVR和FR序列在VH(或VL)中一般以如下的顺序出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”、和“全抗体”在本文中可互换使用，指与天然抗体结构具有实质性相似的结构或者具有含有如本文中定义的Fc区的重链的抗体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”、和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且指已经导入有外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括原代的经转化的细胞及自其衍生的后代而不考虑传代的次数。后代在核酸内容物上可以与亲本细胞不完全相同，而是可以含有突变。本文中包括具有与在初始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物学活性的突变体后代。
“人抗体”指拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的此定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。正如关于依照本发明的嵌合和人源化抗体也提及的，如本文中使用的，术语“人抗体”也包含恒定区中经过修饰以生成依照本发明的特性的此类抗体，尤其在C1q结合和/或FcR结合方面，例如通过“类转换”即Fc部分的改变或突变(例如自IgG1至IgG4和/或IgG1/IgG4突变)。
如本文中使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NS0或CHO细胞或者自对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体或使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但可以不天然存在于体内的人抗体种系全集内的序列。
“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常存在的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变域序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIHPublication 91-3242，Bethesda MD(1991)，第1-3卷中的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等，见上文中的亚组III。
“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体会包含至少一个，通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些，且所有或基本上所有FR对应于人抗体的那些。任选地，人源化抗体可以至少包含自人抗体衍生的抗体恒定区的一部分。抗体(例如非人抗体)的“人源化形式”指已经经历人源化的抗体。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是那些其中的恒定区已经另外自初始抗体的恒定区进行过修饰或改变以生成依照本发明的特性(尤其是关于C1q结合/或Fc受体(FcR)结合)的。
如本文中使用的，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的和/或形成结构上限定的环(“高变环”)的每个区。一般地，天然的4链抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(CDR)的氨基酸残基，后一种是最高序列变异性的和/或牵涉抗原识别。例示性高变环存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)、和96-101(H3)(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。例示性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35B(H1)、50-65(H2)、和95-102(H3)(Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991))。高变区(HVR)也称作互补决定区(CDR)，而且这些术语在述及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可互换使用。此特定区域已由Kabat等，U.S.Dept.of Health andHuman Services，Sequences of Proteins of Immunological Interest(1983)及由Chothia等，J Mol Biol 196：901-917(1987)描述，其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义来指抗体或其变体的CDR意图在如本文中定义和使用的术语的范围内。涵盖如由上文引用的每篇参考文献定义的CDR的适宜的氨基酸残基在下表A中列出作为比较。涵盖特定CDR的确切残基编号会随着CDR的序列和大小而变化。给予抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员能常规确定哪些残基构成特定CDR。
表A：CDR定义1
CDR Kabat Chothia AbM<sup>2</sup>
V<sub>H</sub> CDR1 31-35 26-32 26-35
V<sub>H</sub> CDR2 50-65 52-58 50-58
V<sub>H</sub> CDR3 95-102 95-102 95-102
V<sub>L</sub> CDR1 24-34 26-32 24-34
V<sub>L</sub> CDR2 50-56 50-52 50-56
V<sub>L</sub> CDR3 89-97 91-96 89-97
1表A中所有CDR定义的编号方式依照由Kabat等(见下文)提出的编号规则。
2如表A中使用的具有小写字母“b”的“AbM”指由Oxford Molecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还定义用于可变区序列的编号系统，其可应用于任何抗体。本领域的普通技术人员能明确地将此“Kabat编号”系统用于任何可变区序列，不依赖于序列本身外的任何实验数据。如本文中使用的，“Kabat编号方式”指由Kabat等，U.S.Dept.of Health andHuman Services，“Sequence of Proteins of Immunological Interest”(1983)提出的编号系统。除非另外说明，提及抗体可变区中特定氨基酸残基位置的编号方式依照Kabat编号系统。
除了VH中的CDR1外，CDR一般包含形成高变环的氨基酸残基。CDR还包含“特异性决定残基”，或“SDR”，其是接触抗原的残基。SDR包含在称作缩短的-CDR，或a-CDR的CDR区内。例示性的a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2、和a-CDR-H3)存在于氨基酸残基31-34(L1)、50-55(L2)、89-96(L3)、31-35B(H1)、50-58(H2)、和95-102(H3)(参见Almagro和Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另有指示，HVR残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等，见上文编号。
“免疫缀合物”指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒剂)缀合的抗体。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬、和马)、灵长类(例如人和非人灵长类诸如猴)、家兔、和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的一种成分分开的抗体。在一些实施方案中，抗体纯化至大于95％或99％的纯度，如通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如Flatman等，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
“分离的”核酸指已经与其天然环境的一种成分分开的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中含有的核酸分子，但是核酸分子在染色体外或在与其天然染色体位置不同的染色体位置处存在。
“编码特异性结合HER2的双特异性抗体的分离的核酸”指编码抗体重和轻链(或其片段)的一种或多种核酸分子，包括单一载体或分开的载体中的此类核酸分子，和存在于宿主细胞中的一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文中使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的抗体个体是相同的和/或结合相同表位，除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外，此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此，修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特性，而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如，可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
“裸抗体”指未与异源模块(例如细胞毒性模块)或放射性标记物缀合的抗体。裸抗体可以存在于药物配制剂中。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由成二硫键的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2、和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域或轻链可变域，接着是一个恒定轻域(CL)。根据其恒定域氨基酸序列，抗体轻链可归入两种型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。
术语“包装插页”用于指治疗产品的商业包装中通常包含的用法说明书，其含有关于涉及此类治疗产品应用的适应症、用法、剂量、施用、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。
“没有实质性交叉反应性”意指分子(例如抗体)不识别或特异性结合与该分子的实际靶抗原不同的抗原(例如与靶抗原密切相关的抗原)，特别是在与该靶抗原比较时。例如，抗体可以结合少于约10％至少于约5％的与实际靶抗原不同的抗原，或者可以以由少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、或0.1％组成的量结合所述与实际靶抗原不同的抗原，优选少于约2％、1％、或0.5％，且最优选少于约0.2％或0.1％与实际靶抗原不同的抗原。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.编写，并且源代码已经连同用户文档一起提交给美国版权局(US Copyright Office，Washington D.C.，20559)，在那里其以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech，Inc.，South San Francisco，Califomia可获得ALIGN-2程序，或者可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作系统，包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。应当领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中所使用的所有％氨基酸序列同一性值都是如上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
术语“药物配制剂”指处于如下的制剂，其形式使得允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的，且不含对会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的成分。
“药学可接受载剂”指药物配制剂中除活性组分以外的，且对受试者无毒的组分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂、或防腐剂。
如本文中使用的，“治疗/处理”(及其语法变型)指试图改变所治疗个体的天然过程的临床干预，并且可以为了预防或者在临床病理学的过程期间实施。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或再发生、减轻症状、减轻/减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态、和消退或改善的预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延迟疾病的形成或减缓疾病的进展。
如本文中使用的，术语“癌症”指增殖性疾病，诸如淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、支气管肺泡细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门区癌、胃癌(stomach cancer，gastric cancer)、结肠癌、乳腺癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、阴门癌、何杰金(Hodgkin)氏病、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、间皮瘤、肝细胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)新生物、脊柱肿瘤、脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、施旺细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤因氏肉瘤，包括任何上述癌症的顽固性型式，或一种或多种上述癌症的组合。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，其中每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)(参见例如Kindt等，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman andCo.，第91页(2007))。单个VH或VL域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以分别使用来自结合抗原的抗体的VH或VL域筛选互补VL或VH域的文库来分离结合特定抗原的抗体。参见例如Portolano等，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352：624-628(1991)。
在本文中使用时，术语“抗体的抗原结合位点”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。抗体的抗原结合部分包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是可变域中那些除本文中定义的高变区残基以外的区。因此，抗体的轻和重链可变域自N至C端包含域FRI、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、和FR4。尤其，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大且限定抗体特性的区。CDR和FR区依照Kabat等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD(1991)的标准定义来确定和/或是那些来自“高变环”的残基。
抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文中使用的，术语“单特异性”抗体表示抗体具有一个或多个结合位点，每个结合相同抗原的相同表位。
依照本发明的“双特异性抗体”是具有两种不同抗原结合特异性的抗体。本发明的抗体是对HER2的两种不同表位特异性的，即HER2的胞外域II和IV。如本文中使用的，术语“双特异性”抗体表示抗体具有至少两个结合位点，每个结合相同抗原的不同表位。
双特异性抗体也可以用于将细胞毒剂定位于表达HER2的细胞。可以作为全长抗体或抗体片段制备双特异性抗体。
如本申请内使用的，术语“效价”或“价”表示抗体分子中存在指定数目的结合位点。如此，术语“二价”、“四价”、和“六价”分别表示抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。依照本发明的双特异性抗体至少是“二价”的，而且可以是“三价”的或“多价”的(例如“四价”或“六价”)。
本发明的抗体具有两个或更多个结合位点且是双特异性的。就是说，该抗体可以是双特异性的，即使在有超过两个结合位点的情况中(即该抗体是三价或多价的)。本发明的双特异性抗体包括例如多价单链抗体、双抗体和三抗体，以及如下的抗体，该抗体具有全长抗体的恒定域结构，对其经一个或多个肽接头连接别的抗原结合位点(例如单链Fv、VH域和/或VL域、Fab、或(Fab)2)。所述抗体可以是全长来自单一物种的，或者是嵌合化的或人源化的。
如本文中使用的，术语“载体”指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制型核酸结构的载体及整合入接受其导入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸的表达。此类载体在本文中称作“表达载体”。
如本申请内使用的，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基α-氨基酸的组，包括丙氨酸(三字母代码：ala，单字母代码：A)、精氨酸(arg，R)、天冬酰胺(asn，N)、天冬氨酸(asp，D)、半胱氨酸(cys，C)、谷氨酰胺(gln，Q)、谷氨酸(glu，E)、甘氨酸(gly，G)、组氨酸(his，H)、异亮氨酸(ile，I)、亮氨酸(leu，L)、赖氨酸(lys，K)、甲硫氨酸(met，M)、苯丙氨酸(phe，F)、脯氨酸(pro，P)、丝氨酸(ser，S)、苏氨酸(thr，T)、色氨酸(trp，W)、酪氨酸(tyr，Y)、和缬氨酸(val，V)。
如本文中使用的，表述“细胞”、“细胞系”、和“细胞培养物”可互换使用，并且所有此类名称包括后代。如此，词语“转化体”和“经转化的细胞”包括原代主题细胞和自其衍生的培养物，而不管传代的次数。还应当理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA内容上可能不是正好相同的。包括具有如在初始转化细胞中筛选的相同功能或生物学活性的变体后代。
“亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有指示，如本文中使用的，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)来表述。亲和力可以通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的方法。下文描述了用于测量结合亲和力的具体的说明性和例示性的实施方案。
如本文中使用的，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选在表面等离振子共振测定法(SPR，BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)中抗体对抗原的表位的结合。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)限定。结合或特异性结合意指10-8mol/l或更小，优选10-9M至10-13mol/l的结合亲和力(KD)。
抗体对死亡受体的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare Uppsala，Sweden)来调查。结合亲和力通过术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的结合速率常数)、kD(解离常数)、和KD(kD/ka)限定。
术语“表位”包括能够与抗体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面聚组，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基，并且在某些实施方案中可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的电荷特征。表位是抗原中受到抗体结合的区域。
如本文中使用的，认为术语“工程化”或“工程化改造”(特别是具有前缀“糖”的)及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程，包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外，糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中，糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中，工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
II.组合物和方法
一方面，本发明基于特异性结合HER2的双特异性抗体。本发明的抗体可用于例如治疗或诊断癌症。
A.例示性的具有共同轻链的特异性结合HER2的双特异性抗体
在本发明的一个方面，提供一种双特异性抗体特异性结合HER2，其中该抗体包含特异性结合HER2胞外域II的第一结合模块和特异性结合HER2胞外域IV的第二结合模块。本发明的发明人令人惊讶地生成了一种单价双特异性抗体，其中两个结合模块分享共同轻链，该共同轻链保留亲本单特异性抗体就抑制肿瘤细胞增殖而言的功效且具有升高的对HER2胞外域II的亲和力。具有保留两种亲本抗体的结合特性的共同轻链的双特异性分子的生成并非简单易行的，因为杂合轻链的共同CDR必须保留对HER2胞外域II和IV二者的结合特异性。这种所谓的“共同轻链”原理(即组合分享一条轻链但仍具有分开的特异性的两个结合物)的使用防止轻链错配，而且在这种特定情况中，保留亲本抗体的表位特异性。结果是，生产期间的副产物较少，推动以高产量同质制备HER2双特异性抗原结合分子。进一步优化了帕妥珠单抗的重链，产生就对HER2胞外域II的亲和力而言更加有力的分子。另外，通过在CDR中引入某些突变，稳定化了曲妥珠单抗重链。所得分子优于亲本帕妥珠单抗和曲妥珠单抗单特异性抗体。单价共同轻链型式的双特异性HER2抗体具有升高的对帕妥珠单抗表位的亲和力，而且显示与亲本抗体的组合相比卓越的在细胞增殖上的抑制效果。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含能够特异性结合HER2胞外域II的第一Fab分子和能够特异性结合HER2胞外域IV的第二Fab分子，其中第一Fab分子可变轻链的序列与第二Fab分子可变轻链的序列相同(即第一和第二Fab分子包含共同轻链)。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：55的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：77的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：56的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：30的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：14的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：60的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：16的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：30的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：58的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：15的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：59的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：30的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，任何上述实施方案的第二重链在氨基酸序列中携带至少一处赋予CDR以更高化学稳定性的修饰，导致在应力条件下保留对HER2的结合。在本文中有用的修饰是例如D98E，D98N，D98T，G99A或G99S。令人惊讶的是，发明人发现一些CDR修饰不仅改善分子的稳定性，而且改善对HER2的结合亲和力。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：55的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：77的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：56的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：79的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：14的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：60的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：16的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：79的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2胞外域II和IV的双特异性抗体，其包含
第一重链，其包含
(a)SEQ ID NO：58的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：15的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：59的重链CDR3；
和第二重链，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：79的重链CDR3；
和第一和第二轻链，其包含
(a)SEQ ID NO：89的轻链CDR1；
(b)SEQ ID NO：90的轻链CDR2；
(c)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO 54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO92的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO 54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO 92的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO 54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO：92的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，任何上述实施方案的第二重链在氨基酸序列中携带至少一处赋予CDR以稳定性和对靶物的结合的修饰，例如D98E，D98N，D98T，G99A或G99S。
因此，在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：64的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：70的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含两条可变轻链，其包含SEQ ID NO：54的氨基酸序列(即共同轻链)，第一重链，其包含包含SEQ ID NO：68的氨基酸序列的可变重链，和第二重链，其包含包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的可变重链。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一重链恒定区，其包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第二重链恒定区，其包含SEQ IDNO：115的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一轻链恒定区，其包含SEQID NO：113的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第二轻链恒定区，其包含SEQID NO：116的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQ ID NO：54，113，64，114，82，116，92和115。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQ ID NO：54，113，64，114，82，116，96和115。
在一个实施方案中，任何上述实施方案的双特异性抗体是糖工程化的，如下文F小节中概述的。在一个实施方案中，任何上述实施方案的双特异性抗体包含促进异二聚化的Fc域修饰，如下文D小节中概述的。
B.例示性的包含交叉Fab片段的HER2双特异性抗体
在本发明的一个实施方案中，提供一种特异性结合HER2的双特异性抗体，其中该抗体包含特异性结合HER2胞外域II的第一结合模块和特异性结合HER2胞外域IV的第二结合模块。本发明的发明人生成了第二种单价双特异性抗体型式，其中结合模块之一是交叉Fab片段。在本发明的一个方面，提供一种单价双特异性抗体，其中IgG分子的Fab片段之一用交叉Fab片段替换。交叉Fab片段是如下的Fab片段，其中重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。包含交叉Fab片段的双特异性抗体型式已有描述，例如WO2009080252，WO2009080253，WO2009080251，WO2009080254，WO2010/136172，WO2010/145792和WO2013/026831。已经优化了天然曲妥珠单抗序列，即在可变重链和可变轻链二者的CDR中引入修饰以改善稳定性和亲和力，框架嫁接所得序列以避免双特异性分子中的轻链错配，并将双特异性抗体糖工程化改造，产生高度有力的靶向HER2的双特异性抗体，能以高产量和仅仅低百分比的副产物生产。另外，它显示与各自亲本抗体的组合相比卓越的肿瘤细胞增殖抑制。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2的双特异性抗体，其包含
对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：14的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：15的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：16的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO：11的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：12的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：13的轻链CDR3，
和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：108的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：79的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO：107的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：18的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的可变轻链；和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO：105的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：106的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2的双特异性抗体，其包含
对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：14的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：15的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：16的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO：11的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：12的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：13的轻链CDR3，
和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：79的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO：104的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：18的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，该双特异性抗体包含对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点，其包含包含SEO ID NO：22的氨基酸序列的可变重链和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的可变轻链；和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其包含包含SEQ ID NO：117的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO：118的氨基酸序列的轻链可变区。
在一个实施方案中，本发明提供一种特异性结合HER2的双特异性抗体，其包含
对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：14的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：15的重链CDR2；
(c)SEQ ID NO：16的重链CDR3；
(d)SEQ ID NO：11的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：12的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：13的轻链CDR3，
和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其包含
(a)SEQ ID NO：20的重链CDR1；
(b)SEQ ID NO：29的重链CDR2；
(c)选自SEQ ID NO：79，SEQ ID NO：78，SEQ ID NO：80，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：88的重链CDR3；
(d)选自SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：158的轻链CDR1；
(e)SEQ ID NO：18的轻链CDR2；
(f)SEQ ID NO：19的轻链CDR3。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一重链恒定区，其包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一重链恒定区，其包含SEQ IDNO：114的氨基酸序列，其中C端赖氨酸已经去除。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第二重链恒定区，其包含SEQ IDNO：115的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第二重链恒定区，其包含SEQ IDNO：115的氨基酸序列，其中C端赖氨酸已经去除。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第一轻链恒定区，其包含SEQID NO：113的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的双特异性抗体包含第二轻链恒定区，其包含SEQID NO：116的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含SEQ ID NO：109，110，111和112。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点的Fab片段，和一个包含对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点的Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。
由于上述双特异性抗体是二价的，其中一个结合位点针对HER2胞外域II且一个结合位点针对HER2胞外域IV，因此这种型式也称作“1+1”型式。因此，这一节中描述的双特异性抗体对于HER2胞外域II是单价的且对于HER2胞外域IV是单价的。1+1型式的双特异性抗体的一种例示性结构描绘于图10a)-10b)。由于可变区或恒定区任一的交换，因此上文Fab片段也称作“cross-Fab片段”或“xFab片段”或“交叉Fab片段”。1+1型式的IgG分子也称作Crossmab型式(参见Schaefer等，Proc Natl Acad Sci USA 2011；108：11187-92)。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含
一个Fc域，一个包含对HER2胞外域II特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。
和一个包含对HER2胞外域IV特异性的抗原结合位点的Fab片段。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对HER2胞外域II特异性的抗原结合位点的Fab片段，
和一个包含对HER2胞外域IV特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对HER2胞外域II特异性的抗原结合位点的Fab片段，
和一个包含对HER2胞外域IV特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中该Fab片段的重和轻链可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含
一个Fc域，
一个包含对HER2胞外域II特异性的抗原结合位点的Fab片段，
和一个包含对HER2胞外域IV特异性的抗原结合位点的Fab片段，其中重和轻链恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的所述双特异性抗体包含一个Fc域，在该Fc域的N端融合两个Fab片段，其中至少一个Fab片段的重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。在一个实施方案中，经由免疫球蛋白铰链区，在该Fc域的N端融合两个Fab片段。在一个实施方案中，该免疫球蛋白铰链区是人IgG1铰链区。在一个实施方案中，包含对HER2胞外域II特异性的抗原结合位点的Fab片段，包含对HER2胞外域IV特异性的抗原结合位点的Fab片段和Fc域是免疫球蛋白分子的一部分。在一个特定实施方案中，该免疫球蛋白分子是IgG类免疫球蛋白。在一个甚至更加特定的实施方案中，该免疫球蛋白是IgG1亚类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，该免疫球蛋白是IgG4亚类免疫球蛋白。在又一个特定实施方案中，该免疫球蛋白是人免疫球蛋白。在其它实施方案中，该免疫球蛋白是嵌合免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含具有一个对HER2胞外域II特异性的结合位点和一个对HER2胞外域IV特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中该IgG分子的一条臂(Fab片段)的重和轻链可变区或恒定区任一是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含具有一个对HER2胞外域II特异性的结合位点和一个对HER2胞外域IV特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中该IgG分子的一条臂(Fab片段)的重和轻链可变区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab(VHVL)。
在一个实施方案中，该IgG分子的包含对HER2胞外域IV特异性的结合位点的一条臂(Fab片段)的重和轻链可变区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含具有一个对HER2胞外域II特异性的结合位点和一个对HER2胞外域IV特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中该IgG分子的一条臂(Fab片段)的重和轻链恒定区是交换的。这种抗体型式也称作CrossMab(CH1CL)。
在一个实施方案中，该IgG分子的包含对HER2胞外域IV特异性的结合位点的一条臂(Fab片段)的重和轻链恒定区是交换的。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含具有一个对HER2胞外域II特异性的结合位点和一个对HER2胞外域IV特异性的结合位点的免疫球蛋白G(IgG)分子，其中该IgG分子的一条臂(Fab片段)的整个VH-CH1和VL-CL域是交换的。这意味着至少一个Fab片段经轻链(VLCL)融合至该Fc域的N端。在一个实施方案中，另一Fab片段经重链(VHCH1)融合至该Fc域的N端。
这种抗体型式也称作CrossMabFab。在一个实施方案中，两个Fab片段经由免疫球蛋白铰链区融合至该Fc域的N端。
在一个实施方案中，任何上述实施方案的双特异性抗体是糖工程化的，如下文F小节中概述的。在一个实施方案中，任何上述实施方案的双特异性抗体包含促进异二聚化的Fc域修饰，如下文D小节中概述的。
C.促进异二聚化的Fc域修饰
本发明的双特异性HER2抗体包含不同的抗原结合模块，其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个，如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中本发明的双特异性抗体的产率和纯度，如此在本发明的双特异性抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此，在一个实施方案中，所述修饰在Fc域的CH3域中。
在一个特定的实施方案中，所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰，其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等，Prot Eng 9，617-621(1996)和Carter，J Immunol Meth 248，7-15(2001)。一般地，该方法牵涉在第一多肽的界面处引入隆起(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”)，使得隆起可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建隆起。在第二多肽的界面中创建具有与隆起相同或相似大小的互补性空腔，其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而，在一个具体的实施方案中，在本发明的双特异性抗体的Fc域的第一亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第一亚基的CH3域内生成隆起，其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中，而且在Fc域的第二亚基的CH3域中，一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换，由此在第二亚基的CH3域内生成空腔，其中可安置第一亚基的CH3域内的隆起。
可以通过改变编码多肽的核酸，例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成隆起和空腔。
在一个特定的实施方案中，在Fc域第一亚基的CH3域中，第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W)，而在Fc域第二亚基的CH3域中，第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中，在Fc域第二亚基中，另外，第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)。
在还有又一个实施方案中，在Fc域的第一亚基中，另外，第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)，而在Fc域的第二亚基中，另外，第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥，进一步稳定了二聚体(Carter，J Immunol Methods 248，7-15(2001))。
在一个备选的实施方案中，促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰，例如如记载于PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地，此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基，从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。
在一个实施方案中，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其包含对HER2的胞外域II特异性的第一抗原结合位点和对HER2的胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块，容许IgG分子的两条重链异二聚化。
在又一个优选的实施方案中，依照节入穴策略(参见Carter P.；Ridgway J.B.B.；Presta L.G.：Immunotechnology，Volume 2，Number 1，February 1996，pp.73-73(1))，第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。
D.核酸序列，载体和方法
本发明进一步提供编码本文所述特异性结合HER2的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸。编码本发明的双特异性抗体的多核苷酸可以作为编码完整双特异性抗原结合分子的单条多核苷酸或作为多条(例如两条或更多条)共表达的多核苷酸来表达。由共表达的多核苷酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性双特异性抗体。例如，Fab片段的轻链部分可以与双特异性抗体中包含Fab片段的重链部分，Fc域亚基和任选(部分)另一个Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，重链多肽会与轻链多肽联合以形成Fab片段。又例如，本文中提供的双特异性抗体中包含两个Fc域亚基中的一个和任选(部分)一个或多个Fab片段的部分可以与本文中提供的双特异性抗体中包含两个Fc域亚基中的另一个和任选(部分)Fab片段的部分由分开的多核苷酸编码。当共表达时，Fc域亚基会联合以形成Fc域。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 63，67和69中所示的第一可变重链序列的序列。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 91和133中所示的第二可变重链序列的序列。
在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 53中所示的可变轻链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码如SEQ ID NO 83，85，91，93，95，97，99，101，63，67，69，53，21和23中所示的多肽序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 63，67和69中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的第一可变重链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 91和133中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的第二可变重链序列的序列。
在另一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的双特异性抗体或其片段的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含编码与SEQ ID NO 53中的氨基酸序列至少约80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％相同的可变轻链序列的序列。
在某些实施方案中，所述多核苷酸或核酸为DNA。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸为RNA，例如信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。
在又一些目标中，本发明涉及包含本发明的核酸序列的表达载体，和包含本发明的载体的原核或真核宿主细胞。另外，提供生成抗体的方法，其包括培养宿主细胞，使得抗体生成。
E.降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
一方面，依照任何上述实施方案的特异性结合HER2的双特异性抗体包含一个免疫球蛋白G(IgG)分子，其中Fc部分是经过修饰的。经过修饰的Fc部分具有与野生型Fc部分相比降低的对Fcγ受体的结合亲和力。
本发明的双特异性抗体的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体，其每个亚基包含CH2和CH3 IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。
在依照本发明的一个实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一个实施方案中，Fc域是IgG4 Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代，特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。在一个更加具体的实施方案中，Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G的IgG4 Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等，Drug Metabolism and Disposition 38，84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中，Fc域是人的。
Fc域赋予本发明的双特异性抗体以有利的药动学特性，包括长血清半衰期，其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而，同时它可能导致不想要的本发明的双特异性抗体对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。因而，在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％、优选少于20％、更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力，和/或与天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的本发明的双特异性抗体)相比少于50％、优选少于20％、更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中，Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcγRIIB。在一个实施方案中，效应器功能是CDC，ADCC，ADCP，和细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中，所述Fc域展现出与天然IgG1 Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出超过约70％、特别是超过约80％、更特别是超过约90％的天然IgG1 Fc域(或包含天然IgG1 Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力时，实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中，Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常，Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中，所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中，所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍、至少5倍、或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中，这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍、至少20倍、或甚至至少50倍。在一个实施方案中，包含工程化Fc域的本发明的双特异性抗体展现出与包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体相比少于20％、特别是少于10％、更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中，所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中，所述Fc受体是抑制性Fc受体。在一个具体的实施方案中，所述Fc受体是抑制性人Fcγ受体，更具体地是人FcgRIIB。在一些实施方案中，所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中，所述Fc受体是活化性人Fcγ受体，更特别是人FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特别是人FcγRIIIa。优选地，对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中，对补体成分的结合亲和力，特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中，对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的本发明的双特异性抗体)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时，实现基本相似的对FcRn的结合，即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的本发明的双特异性抗体可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项：降低的补体依赖性细胞毒性(CDC)，降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，降低的细胞因子分泌，降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取，降低的对NK细胞的结合，降低的对巨噬细胞的结合，降低的对单核细胞的结合，降低的对多形核细胞的结合，降低的诱导凋亡的直接信号传导，降低的树突细胞成熟，或降低的T细胞引发。在一个实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的CDC，降低的ADCC，降低的ADCP，和降低的细胞因子分泌中的一项或多项。在一个具体的实施方案中，所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中，所述降低的ADCC小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的本发明的双特异性抗体)诱导的ADCC。
在一个实施方案中，所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中，Fc域包含在E233，L234，L235，N297，P331和P329位置处的氨基酸替代。在一个更特定的实施方案中，Fc域包含在L234，L235和P329位置处的氨基酸替代。在一些实施方案中，Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中，氨基酸替代是P329A或P329G，特别是P329G。在一个实施方案中，Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代：E233，L234，L235，N297和P331。在一个更加特定的实施方案中，所述又一处氨基酸替代是E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S。在具体的实施方案中，所述Fc域包含在位置P329、L234和L235处的氨基酸替代。在更具体的实施方案中，所述Fc域包含氨基酸突变L234A、L235A和P329G(“P329G LALA”)。在一个此类实施方案中，Fc域是IgG1 Fc域，特别是人IgG1 Fc域。氨基酸替代组合“P329G LALA”几乎完全消除了人IgG1 Fc域的Fcγ受体结合，如记载于PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393，其通过提述完整并入本文。PCT/EP2012/055393还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此，在一些实施方案中，本发明的双特异性抗体的Fc域是IgG4Fc域，特别是人IgG4 Fc域。在一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能，在一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代L235E。在另一个实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代P329G。在一个具体的实施方案中，所述IgG4 Fc域包含在位置S228、L235和P329处的氨基酸替代，具体是氨基酸替代S228P、L235E和P329G。此类IgG4 Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393，其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中，展现出与天然IgG1 Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A、L235A和任选的P329G的人IgG1 Fc域，或包含氨基酸替代S228P、L235E和任选的P329G的人IgG4 Fc域。
在某些实施方案中，已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中，所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变，特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代。
在上文和PCT专利申请No.PCT/EP2012/055393中描述的Fc域以外，具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的替代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其具有残基265和297变成丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除、替代、插入或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变、PCR、基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合，例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行，并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。本文中描述了一种合适的此类结合测定法。或者，可使用已知表达特定Fc受体的细胞系(诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞)来估测Fc域或包含Fc域的细胞活化性双特异性抗原结合分子对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的本发明的双特异性抗体的效应器功能。本文中描述了用于测量ADCC的一种合适的测定法。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其它例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等，Proc Natl AcadSci USA 83，7059-7063(1986)和Hellstrom等，Proc Natl Acad Sci USA 82，1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等，J Exp Med 166，1351-1361(1987)。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology，Inc.Mountain View，CA)；和CytoTox
Figure BDA0002619651350000421
非放射性细胞毒性测定法(Promega，Madison，WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如披露于Clynes等，Proc Natl Acad Sci USA 95，652-656(1998)的。
在一些实施方案中，Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而，在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中，所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定本发明的双特异性抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等，J Immunol Methods 202，163(1996)；Cragg等，Blood 101，1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie，Blood 103，2738-2743(2004))。
下面的部分描述本发明的双特异性抗体的优选实施方案，其包含降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰。
F.抗体变体
在某些实施方案中，在上文描述的那些以外，还涵盖本文中提供的双特异性抗体的氨基酸序列变体。例如，可以期望改善双特异性抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。可以通过将合适的修饰引入编码双特异性抗体的核苷酸序列中，或者通过肽合成来制备双特异性抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如对抗体的氨基酸序列内的残基的删除、和/或插入和/或替代。可以进行删除、插入、和替代的任何组合以得到最终的构建体，只要最终的构建体拥有期望的特征，例如抗原结合。
1.替代、插入、和删除变体
在某些实施方案中，提供了具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和FR。保守替代在表B中在“优选的替代”的标题下显示。更多实质性变化在表B中在“例示性替代”的标题下提供，并且如下文参照氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸替代引入感兴趣的抗体中，并且对产物筛选期望的活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性、或改进的ADCC或CDC。
表B
初始残基 例示性替代 优选的替代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
依照共同的侧链特性，氨基酸可以如下分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Ile；
(2)中性、亲水性的：Cys，Ser，Thr，Asn，Gln；
(3)酸性的：Asp，Glu；
(4)碱性的：His，Lys，Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly，Pro；
(6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。一般地，为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗体会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力、降低的免疫原性)和/或会基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。一种例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之，将一个或多个HVR残基突变，并将变体抗体在噬菌体上展示，并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。
可以对HVR做出变化(例如替代)，例如以改善抗体亲和力。可以对HVR“热点”，即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基(参见例如Chowdhury，Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))，和/或SDR(a-CDR)做出此类变化，其中对所得的变体VH或VL测试结合亲和力。通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟已经记载于例如Hoogenboom等，于Methods in Molecular Biology178：1-37(O’Brien等编，HumanPress，Totowa，NJ，(2001))。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法(例如易错PCR、链改组、或寡核苷酸指导的诱变)任一将多样性引入为成熟选择的可变基因。然后，创建次级文库。然后，筛选文库以鉴定具有期望的亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法牵涉HVR指导的办法，其中将数个HVR残基(例如一次4-6个残基)随机化。可以例如使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性鉴定牵涉抗原结合的HVR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，可以在一个或多个HVR内发生替代、插入、或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对HVR做出保守变化(例如保守替代，如本文中提供的)，其不实质性降低结合亲和力。此类变化可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或者含有不超过1、2或3处氨基酸替代。
一种可用于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域的方法称作“丙氨酸扫描诱变”，如由Cunningham和Wells(1989)Science，244：1081-1085所描述的。在此方法中，鉴定一个残基或一组靶残基(例如带电荷的残基，诸如Arg、Asp、His、Lys、和Glu)，并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外，使用抗原-抗体复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选，可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有期望的特性。
氨基酸序列插入包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合，及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括抗体的N或C端与酶(例如对于ADEPT)或延长抗体的血清半衰期的多肽的融合物。
2.糖基化变体
在某些实施方案中，改变本文中提供的双特异性抗体以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列，使得创建或消除一个或多个糖基化位点来方便地实现对抗体的糖基化位点的添加或删除。
在双特异性抗体包含Fc区的情况中，可以改变其附着的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体通常包含分支的、双触角寡糖，其一般通过N连接附着于Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright等，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可以包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着于双触角寡糖结构“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明的双特异性抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善的特性的抗体变体。
在一个实施方案中，提供了双特异性抗体变体，其具有缺乏附着(直接或间接)于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构。例如，此类抗体中的岩藻糖量可以是1％至80％、1％至65％、5％至65％或20％至40％。通过相对于附着于Asn297的所有糖结构(例如复合的、杂合的和高甘露糖的结构)的总和，计算Asn297处糖链内岩藻糖的平均量来测定岩藻糖量，如通过MALDI-TOF质谱术测量的，例如如记载于WO 2008/077546的。Asn297指位于Fc区中的约第297位(Fc区残基的Eu编号方式)的天冬酰胺残基；然而，Asn297也可以由于抗体中的微小序列变异而位于第297位上游或下游约±3个氨基酸，即在第294位和第300位之间。此类岩藻糖基化变体可以具有改善的ADCC功能。参见例如美国专利公开文本No.US 2003/0157108(Presta，L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。涉及“脱岩藻糖基化的”或“岩藻糖缺乏的”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO2005/035586；WO 2005/035778；WO 2005/053742；WO 2002/031140；Okazaki等，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能够生成脱岩藻糖基化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖基化缺陷的Lec13CHO细胞(Ripka等，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美国专利申请No US 2003/0157108 A1，Presta，L；及WO 2004/056312 A1，Adams等，尤其在实施例11)，和敲除细胞系，诸如α-1，6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda，Y.等，Biotechnol.Bioeng.，94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
进一步提供了具有两分型寡糖的双特异性抗体变体，例如其中附着于双特异性抗体Fc区的双触角寡糖是通过GlcNAc两分的。此类双特异性抗体变体可以具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等)；美国专利No.6,602,684(Umana等)；及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可以具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等)；WO 1998/58964(Raju，S.)；及WO 1999/22764(Raju，S.)。
3.经半胱氨酸工程化改造的抗体变体
在某些实施方案中，可以期望创建经半胱氨酸工程化改造的双特异性抗体(例如“thioMAb”)，其中双特异性抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在具体的实施方案中，替代的残基存在于双特异性抗体的可接近位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，反应性硫醇基团由此定位于抗体的可接近位点，并且可以用于将抗体与其它模块(诸如药物模块或接头-药物模块)缀合，以创建免疫缀合物。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代下列残基之任一个或多个：轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541所述生成经半胱氨酸工程化改造的抗体。
G.重组方法和组合物
可以例如通过固态肽合成(例如Merrifield固相合成)或重组生成来获得本发明的双特异性抗体。对于重组生成，分离一种或多种编码所述双特异性抗体(或片段)的多核苷酸(例如如上文描述的)，并将其插入一种或多种载体中用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规规程容易地分离并测序此类多核苷酸。在一个实施方案中，提供包含一种或多种本发明的多核苷酸的载体(优选表达载体)。可以使用本领域技术人员公知的方法来构建含有双特异性抗体(片段)的编码序列以及适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如记载于Maniatis等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience，N.Y(1989)的技术。表达载体可以是质粒、病毒的一部分，或者可以是核酸片段。表达载体包含表达盒，其中在与启动子和/或其它转录或翻译控制元件的可操作联合中克隆编码双特异性抗体(片段)的多核苷酸(即编码区)。如本文中使用的，“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但是可以将其视为编码区的一部分(若存在的话)，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、5’和3’非翻译区等)不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或存在于分开的多核苷酸构建体中，例如在分开的(不同的)载体上。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如本发明的载体可以编码一种或多种多肽，其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译分开成最终蛋白质。另外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，其与编码本发明的双特异性抗体(片段)或其变体或衍生物的多核苷酸融合或未融合。异源编码区包括但不限于特殊化的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能域。当基因产物(例如多肽)的编码区与一种或多种调节序列以某种方式联合从而使得该基因产物的表达置于该调节序列的影响或控制下时，即为可操作联合。若诱导启动子功能导致编码期望的基因产物的mRNA的转录且若两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力，则两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)为“可操作联合的”。如此，如果启动子能够实现编码多肽的核酸的转录，那么该启动子区会是与该核酸可操作联合。启动子可以是细胞特异性启动子，其仅在预先确定的细胞中指导DNA的实质性转录。除启动子以外，其它转录控制元件(例如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号)能与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。在本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区，诸如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子区段(例如立即早期启动子，连同内含子-A)、猿病毒40(例如早期启动子)和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和家兔
Figure BDA0002619651350000481
-珠蛋白衍生的，以及能够控制真核细胞中基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子及自病毒系统衍生的元件(具体地，内部核糖体进入位点或IRES，也称作CITE序列)。表达盒还可以包含其它特征，诸如复制起点和/或染色体整合元件，诸如逆转录病毒长末端重复(LTR)或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的另外的编码区联合，所述分泌或信号肽指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。例如，如果期望分泌双特异性抗体，那么可以将编码信号序列的DNA置于编码本发明双特异性抗体或其片段的核酸上游。依照信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦启动将生长中的蛋白质链穿越粗面内质网输出，就将该信号肽或分泌前导序列从成熟蛋白质切去。本领域中普通技术人员知晓由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽N端的信号肽，其从所翻译的多肽切去以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可以将野生型前导序列用人组织纤溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
可以将编码能用于促进后期纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记双特异性抗体的短蛋白质序列的DNA纳入双特异性抗体(片段)编码多核苷酸内或其末端。
在一个别的实施方案中，提供包含本发明的一种或多种多核苷酸的宿主细胞。在某些实施方案中，提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体可以单独地或组合地掺入本文中分别关于多核苷酸和载体所描述的任何特征。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含载体(例如已用该载体转化或转染)，所述载体包含编码本发明双特异性抗体(的部分)的多核苷酸。如本文中使用的，术语“宿主细胞”指任何种类能工程化改造以生成本发明的双特异性抗体或其片段的细胞系统。适用于复制双特异性抗体及支持其表达的宿主细胞是本领域中公知的。在适当时，可用特定的表达载体转染或转导此类细胞，并且可以培养大量的含载体细胞以用于接种大规模发酵罐，从而获得充足数量的双特异性抗体用于临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物诸如大肠杆菌，或各种真核细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、昆虫细胞等。例如，可以在细菌中生成多肽，特别是在不需要糖基化时。在表达后，可以将多肽在可溶性级分中与细菌细胞糊分离并可以进一步纯化。除了原核生物外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是适合多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已被“人源化”，导致生成具有部分或完全人的糖基化样式的多肽的真菌和酵母菌株。参见Gerngross，Nat Biotech 22，1409-1414(2004)，和Li等，Nat Biotech 24，210-215(2006)。适用于表达(糖基化)多肽的宿主细胞还自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)衍生。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已鉴定出可与昆虫细胞一起使用的大量杆状病毒株，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。也可以将植物细胞培养物用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适应于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293T细胞，如例如记载于Graham等，J Gen Virol 36，59(1977))、幼仓鼠肾细胞(BHK)、小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如记载于Mather，Biol Reprod 23，243-251(1980)的)、猴肾细胞(CV1)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76)、人宫颈癌细胞(HELA)、犬肾细胞(MDCK)，牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A)、人肺细胞(W138)、人肝细胞(Hep G2)、小鼠乳房肿瘤细胞(MMT 060562)、TRI细胞(如例如记载于Mather等，Annals N.Y.Acad Sci 383，44-68(1982)的)、MRC 5细胞和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括dhfr-CHO细胞(Urlaub等，Proc Natl Acad Sci USA 77，4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO、NS0、P3X63和Sp2/0。对于某些适用于蛋白质生产的哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo编，Humana Press，Totowa，NJ)，pp.255-268(2003)。宿主细胞包括培养的细胞，例如培养的哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、细菌细胞和植物细胞等，但还包括在转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织中包含的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，优选哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。
本领域中已知在这些系统中表达外来基因的标准技术。可以将表达包含抗原结合域诸如抗体的重链或轻链的多肽的细胞工程化改造为使得还表达另一抗体链，从而使得表达的产物是具有重链和轻链两者的抗体。
在一个实施方案中，提供了生成依照本发明的双特异性抗体的方法，其中所述方法包括在适合于双特异性抗体表达的条件下培养包含编码双特异性抗体的多核苷酸的宿主细胞(如本文中提供的)，并从宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收双特异性抗体。
双特异性抗体的组分彼此遗传融合。双特异性抗体可设计为使其组分直接彼此融合或经由接头序列间接融合。可依照本领域中公知的方法确定接头的组成和长度，并可以测试功效。双特异性抗体不同组分之间的接头序列的例子见于本文中提供的序列。还可包含另外的序列以纳入切割位点来分开融合物的各个组分(若期望的话)，例如内肽酶识别序列。
在某些实施方案中，双特异性抗体的Fab片段形成部分至少包含能够结合抗原性决定簇的抗体可变区。可变区能形成天然或非天然存在的抗体及其片段的一部分及自其衍生。生成多克隆抗体和单克隆抗体的方法是本领域中公知的(参见例如Harlow和Lane，“Antibodies，a laboratory manual”，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然存在的抗体可以使用固相肽合成构建，可以重组生成(例如如记载于美国专利No.4,186,567的)或可通过例如筛选包含可变重链和可变轻链的组合库获得(参见例如McCafferty的美国专利No.5,969,108)。
可以将任何动物物种的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区用于本发明的双特异性抗体。可用于本发明的非限制性抗体、抗体片段、抗原结合域或可变区可以是鼠、灵长类或人起源的。如果双特异性抗体意图供人使用，那么可以使用嵌合形式的抗体，其中抗体的恒定区来自人。也可以依照本领域中公知的方法制备人源化或全人形式的抗体(参见例如Winter的美国专利No.5,565,332)。人源化可以通过各种方法实现，包括但不限于(a)将非人(例如供体抗体)CDR嫁接到人(例如受体抗体)框架和恒定区上，保留或不保留关键的框架残基(例如那些对于保留较好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)，(b)仅将非人特异性决定区(SDR或a-CDR；对于抗体-抗原相互作用关键的残基)嫁接到人框架和恒定区上，或(c)移植完整的非人可变域，但通过替换表面残基用人样部分来“掩饰(cloak)”它们。人源化的抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson，Front Biosci 13，1619-1633(2008)，并且还记载于例如Riechmann等，Nature 332，323-329(1988)；Queen等，ProcNatl Acad Sci USA 86，10029-10033(1989)；美国专利No.5,821,337，7,527,791，6,982,321和7,087,409；Jones等，Nature 321，522-525(1986)；Morrison等，Proc Natl Acad Sci81，6851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv Immunol 44，65-92(1988)；Verhoeyen等，Science 239，1534-1536(1988)；Padlan，Molec Immun 31(3)，169-217(1994)；Kashmiri等，Methods 36，25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)嫁接)；Padlan，Mol Immunol 28，489-498(1991)(描述“表面重建”)；Dall’Acqua等，Methods36，43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等，Methods 36，61-68(2005)以及Klimka等，BrJ Cancer 83，252-260(2000)(描述了FR改组的“引导选择”办法)。可以使用本领域中已知的各种技术来生成人抗体和人可变区。人抗体一般记载于van Dijk和van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5，368-74(2001)以及Lonberg，Curr Opin Immunol 20，450-459(2008)。人可变区能形成通过杂交瘤方法生成的人单克隆抗体的一部分及自其衍生(参见例如Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987))。还可以通过对转基因动物施用免疫原来制备人抗体和人可变区，所述转基因动物已经过修饰以应答抗原性攻击而生成完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg，NatBiotech 23，1117-1125(2005))。还可以通过分离自人衍生的噬菌体展示库选择的Fv克隆可变区序列来生成人抗体和人可变区(参见例如Hoogenboom等，于Methods in MolecularBiology 178，1-37(O’Brien等编，Human Press，Totowa，NJ，2001)；和McCafferty等，Nature 348，552-554；Clackson等，Nature 352，624-628(1991))。噬菌体通常展示抗体片段，作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段。
在某些实施方案中，将可用于本发明的Fab片段工程化改造为具有增强的结合亲和力，其依照例如美国专利申请公开文本No.2004/0132066中公开的方法进行，其完整内容通过提述据此并入。可以经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量本发明的双特异性抗体结合特定抗原性决定簇的能力，所述其它技术例如表面等离振子共振技术(在BIACORE T100系统上分析)(Liljeblad等，Glyco J17，323-329(2000))和传统的结合测定法(Heeley，Endocr Res 28，217-229(2002))。可以使用竞争测定法来鉴定与参照抗体竞争对特定抗原的结合的抗体、抗体片段、抗原结合域或可变域。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合由参照抗体结合的相同表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体结合的表位的详细的例示性方法在Morris(1996)“Epitope MappingProtocols，”于Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)中提供。在一种例示性竞争测定法中，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含结合该抗原的第一经标记抗体和测试其与第一抗体竞争对抗原的结合的第二未标记抗体。第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化的抗原在溶液中温育，所述溶液包含第一经标记抗体但没有第二未标记抗体。在允许第一抗体结合抗原的条件下温育后，除去过量的未结合的抗体，并测量与固定化抗原联合的标记物的量。如果与固定化抗原联合的标记物的量在测试样品中相对于对照样品实质性降低，那么这指示第二抗体与第一抗体竞争对抗原的结合。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。
可以通过本领域已知的技术来纯化如本文中描述的那样制备的双特异性抗体，所述技术诸如高效液相层析、离子交换层析、凝胶电泳、亲和层析、大小排阻层析等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷、疏水性、亲水性等因素，而且对于本领域中的技术人员会是明显的。对于亲和层析纯化，可以使用双特异性抗体结合的抗体、配体、受体或抗原。例如，对于本发明的双特异性抗体的亲和层析纯化，可以使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以连续使用蛋白A或G亲和层析和大小排阻层析来分离双特异性抗体，基本如实施例中描述的。可以通过多种公知的分析方法中的任一种来测定双特异性抗体的纯度，包括凝胶电泳、高压液相层析等。
H.测定法
可以通过本领域中已知的多种测定法对本文中提供的特异性结合HER2的双特异性抗体鉴定、筛选、或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。
1.亲和力测定法
可以依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(SPR)使用标准仪器如BIAcore仪(GE Healthcare)和诸如可以通过重组表达获得的受体或靶蛋白来测定特异性结合HER2的双特异性抗体的亲和力。或者，可以例如通过流式细胞术(FACS)，使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估本文中提供的双特异性抗体对HER2的结合。下面和下文实施例描述了一个用于测量结合亲和力的特定的说明性和例示性实施方案。
依照一个实施方案，使用
Figure BDA0002619651350000531
T100机器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振于25℃测量KD。
为了分析Fc部分与Fc受体之间的相互作用，通过固定化于CM5芯片上的抗五His抗体(Qiagen)来捕捉带His标签的重组Fc受体并将双特异性构建体用作分析物。简言之，将羧甲基化的右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，GEHealthcare)依照供应商说明书用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。将抗五His抗体用10mM乙酸钠pH 5.0稀释至40μg/ml，之后以5μl/min的流速注射以实现大约6500个响应单位(RU)的偶联蛋白质。在注射配体后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。随后，以4或10nM捕捉Fc受体60秒。对于动力学测量，将双特异性构建体在HBS-EP(GE Healthcare，10mMHEPES，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05％表面活性剂P20，pH 7.4)中的4倍连续稀释液(范围介于约500nM和4000nM之间)于25℃以30μl/min的流速注射120秒。
为了测定对靶抗原的亲和力，通过固定化于活化的CM5传感器芯片表面上的抗人Fab特异性抗体(GE Healthcare)来捕捉双特异性构建体，如对于抗五-His抗体所描述的。偶联蛋白质的最终量为大约12000RU。双特异性构建体以300nM捕捉90秒。使靶抗原在从250至1000nM的浓度范围以30μl/min的流速通过流动池达180秒。监测解离达180秒。
通过减去在参照流动池上获得的响应来校正批量折射率(bulk refractiveindex)差异。使用稳态响应通过Langmuir结合等温线的非线性曲线拟合来推导解离常数KD。使用简单的一对一Langmuir结合模型(
Figure BDA0002619651350000541
T100评估软件版本1.1.1)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(kon)和解离速率(kon)。以比率koff/kon计算平衡解离常数(KD)。参见例如Chen等，J Mol Biol 293，865-881(1999)。
2.结合测定法和其它测定法
一方面，对本发明的双特异性抗体测试其抗原结合活性，例如通过已知的方法诸如ELISA、Western印迹、等来进行。
另一方面，可使用竞争测定法来鉴定与特定抗HER2抗体竞争对HER2的结合的抗体。在某些实施方案中，此类竞争性抗体结合与特定抗HER2抗体所结合表位相同的表位(例如线性或构象表位)。用于定位抗体所结合表位的详细例示性方法参见Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”，Methods in Molecular Biology vol.66(Humana Press，Totowa，NJ)。实施例部分描述了别的方法。
3.活性测定法
一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的结合HER2的双特异性抗体的测定法。生物学活性可包括例如DNA片段化、诱导凋亡和靶细胞裂解。还提供了在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗体。在一个实施方案中，所述活性是诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)。在一个实施方案中，所述双特异性抗体以比单独的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗要高的程度诱导CDC。在一个实施方案中，所述双特异性抗体诱导CDC至比单独的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗要高至少约10倍的程度，要高约20倍的程度或要高约30倍的程度。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体以比帕妥珠单抗或曲妥珠单抗的组合要高的程度诱导CDC。在另一个实施方案中，所述双特异性抗体诱导CDC至比帕妥珠单抗或曲妥珠单抗的组合要高约30％，40％，50％或60％，或至少30％至70％，或至少40％至60％的程度。可以用非热处理的血清或商品化补体级分实施补体依赖性细胞毒性(CDC)测定法(参见例如Lazar，G.A.等，Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function.Proc.NatlAcad.Sci.USA 103，4005-4010(2006))。可以通过数种细胞存活力试剂诸如Alamar Blue(Lazar，G.A.等，Engineered antibody Fc variants with enhanced effectorfunction.Proc.Natl Acad.Sci.USA 103，4005-4010(2006)；Idusogie，E.E.等，Engineered antibodies with increased activity to recruitcomplement.J.Immunol.166，2571-2575(2001))，CellTiter-Glo(参见例如Zhao，X.等，Targeting C-type lectin-like molecule-1 for antibody-mediated immunotherapyin acute myeloid leukemia.Haematologica 95，71-78(2009))，LDH释放(参见例如Konishi，E.，Kitai，Y.&Kondo，T.Utilization of complement-dependent cytotoxicityto measure low levels of antibodies：application to nonstructural protein 1ina model ofJapanese encephalitis virus.Clin.Vaccine Immunol.15，88-94(2008)及本文中披露的实施例)或钙黄绿素-AM释放来评估靶细胞杀伤。在一些实施方案中，所述CDC诱导程度是通过LDH释放测定法或补体测定法(其测量补体蛋白C1q对结合至细胞抗原的本发明抗体的结合)测定的。然后，将双特异性抗体的CDC诱导与单独的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗任一，或帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合的CDC诱导比较，其中CDC诱导的所有值是在相同测定法中，用相同细胞系和相同相应抗体浓度测定的。如果在微量滴定板中实施的话，优选使用相同测定法在相同微量滴定板中测量双特异性抗体和对照(单独的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗任一，或帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的组合)诱导CDC的能力。例示性测定法披露于例如实施例18或19。在一个实施方案中，所述CDC诱导是用癌细胞，例如乳腺癌细胞测定的。
在某些实施方案中，对本发明的双特异性抗体测试此类生物学活性。用于检测细胞裂解(例如通过测量LDH释放)或凋亡(例如使用TUNEL测定法)的测定法是本领域公知的。用于测量ADCC或CDC的测定法还记载于WO 2004/065540(参见其中的实施例1)，通过述及将其完整内容收入本文。
I.药物配制剂
如本文中所描述的特异性结合HER2的双特异性抗体的药物配制剂通过混合具有期望纯度的此类双特异性抗体与一种或多种任选的药学可接受载剂(Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980))以冻干配制剂或水溶液形式制备。一般地，药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括但不限于缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性的药学可接受载剂进一步包含间质药物分散剂诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，诸如rHuPH20(
Figure BDA0002619651350000561
BaxterInternational，Inc.)。某些例示性的sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)记载于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一方面，将sHASEGP与一种或多种别的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性的冻干抗体配制剂记载于美国专利No.6,267,958。含水抗体配制剂包括那些记载于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的，后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲液。
本文中的配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性组分，优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。此类活性组分适于以有效用于所需目的的量而组合存在。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，在胶状药物投递系统中(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)，或在粗滴乳状液中。此类技术披露于例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适的例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形物品形式，例如膜，或微胶囊。
要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现，例如通过穿过无菌滤膜过滤。
J.治疗性方法和组合物
可以在治疗性方法中使用本文中提供的任何结合HER2的双特异性抗体。
在一个方面，提供了作为药物使用的特异性结合HER2的双特异性抗体。在又一些方面，提供了在治疗癌症中使用的特异性结合HER2的双特异性抗体。在某些实施方案中，提供了在治疗方法中使用的特异性结合HER2的双特异性抗体。在某些实施方案中，本发明提供了在治疗具有癌症的个体的方法中使用的特异性结合HER2的双特异性抗体，所述方法包括对个体施用有效量的特异性结合HER2的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”优选是人。
在又一方面，本发明提供了特异性结合HER2的双特异性抗体在制造或制备药物中的用途。在一个实施方案中，药物用于治疗癌症。在又一个实施方案中，药物用于治疗癌症的方法，所述方法包括对具有癌症的个体施用有效量的药物。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了治疗癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括对具有癌症的个体施用有效量的结合HER2的双特异性抗体。在一个此类实施方案中，所述方法进一步包括对个体施用有效量的至少一种别的治疗剂，如下文所描述的。依照任何上述实施方案的“个体”可以是人。
在又一方面，本发明提供了药物配制剂，其包含本文中提供的任何结合HER2的双特异性抗体，例如在任何上述治疗性方法中使用。在一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合HER2的双特异性抗体和药学可接受载剂。在另一个实施方案中，药物配制剂包含本文中提供的任何结合HER2的双特异性抗体和至少一种别的治疗剂，例如如下文所描述的。
可以通过任何合适的手段(包括胃肠外、肺内、和鼻内，及若期望用于局部治疗的话，损伤内施用)来施用本发明的双特异性抗体。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、或皮下施用。部分根据施用是短暂的还是长期的，剂量给药可以通过任何合适的路径(例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射)来进行。本文中涵盖各种剂量给药日程表，包括但不限于单次施用或在多个时间点里的多次施用、推注施用、和脉冲输注。
本发明的双特异性抗体会以一种符合优秀的医学实践的方式配制、定剂量和施用。在此背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症、所治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、药剂投递部位、施用方法、施用日程表及医学从业人员知道的其它因素。双特异性抗体无需但任选与一种或多种目前用于预防或治疗所讨论病症的药剂一起配制。此类其它药物的有效量取决于配制剂中存在的抗体的量、病症或治疗的类型、及上文所述其它因素。这些通常以本文所述相同的剂量和施用途径使用，或以约1-99％的本文所述剂量使用，或以凭经验/临床上确定为适宜的任何剂量和任何途径使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的双特异性抗体的适宜剂量会取决于要治疗的疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重性和病程、施用双特异性抗体是预防还是治疗目的、之前的疗法、患者的临床史和对双特异性抗体的响应、及主治医师的斟酌。双特异性抗体适合于在一次或一系列的治疗中施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)的双特异性抗体可以作为初始候选剂量施用于患者，无论是例如通过一次或多次分开的施用或者是通过连续输注。根据上文所述因素，一种典型的日剂量可以在约1μg/kg至100mg/kg或更多的范围中。对于几天或更长时间上的重复施用，根据状况，治疗通常会持续直至疾病症状发生期望的阻抑。双特异性抗体的一种例示性剂量会在约0.05mg/kg至约10mg/kg的范围中。如此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg的一剂或多剂。此类剂量可间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受约2至约20剂，或例如约6剂双特异性抗体)。可以施用较高的初始加载剂，接着是较低的一或多剂。然而，其它剂量方案可能是有用的。此疗法的进展易于通过常规技术和测定来监测。
应当理解，可以使用本发明的免疫缀合物代替或补充本发明的特异性结合HER2的双特异性抗体来实施任何上述配制剂或治疗性方法。
K.制品
在本发明的另一方面，提供了一种制品，其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物，并且可以具有无菌存取口(例如，容器可以是具有由皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的双特异性抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外，制品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中组合物包含本发明的双特异性抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中组合物包含别的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页，其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外，制品可以进一步包含第二(或第三)容器，其包含药学可接受缓冲液，诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解，任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充本发明的特异性结合HER2的双特异性抗体。
L.免疫缀合物
本发明还提供免疫缀合物，其包含本文中特异性结合HER2的双特异性抗体，该双特异性抗体与一种或多种细胞毒剂诸如化疗剂或化疗药物、生长抑制剂、毒素(例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素，或其片段)、或放射性同位素缀合。
在一个实施方案中，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与一种或多种药物缀合，包括但不限于美登木生物碱(maytansinoid)(参见美国专利No.5,208,020、No.5,416,064和欧洲专利EP 0 425 235 B1)；奥瑞司他汀(auristatin)诸如单甲基奥瑞司他汀药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(参见美国专利No.5,635,483和No.5,780,588，及No.7,498,298)；多拉司他汀(dolastatin)；加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(参见美国专利No.5,712,374；No.5,714,586；No.5,739,116；No.5,767,285；No.5,770,701；No.5,770,710；No.5,773,001；和No.5,877,296；Hinman等，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(参见Kratz等，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等，Bioorganic&Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等，Bioorg.&Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美国专利No.6,630,579)；甲氨蝶呤；长春地辛(vindesine)；紫杉烷，诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他赛(paclitaxel)、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel；单端孢菌素(trichothecene)；和CC1065。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与酶活性毒素或其片段缀合，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。
在另一个实施方案中，免疫缀合物包含本文所述抗体，该抗体与放射性原子缀合以形成放射缀合物。多种放射性同位素可用于生成放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将放射缀合物用于检测时，它可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如tc99m或1123，或自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称作磁共振成像，mri)，诸如再次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚胺基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核素与抗体缀合的一个例示性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等，Cancer Res.52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的此类缀合物，包括但不限于：商品化(例如购自Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL，U.S.A)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上文提供的一般描述，可以实施各种其它实施方案。
尽管为了理解清楚的目的，上述发明已经通过举例说明较为详细地描述，然而描述和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提述明确完整收录本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容。
实施例1：材料和方法
除非另有说明，应用下面的通用方法：
重组DNA技术
如Sambrook，J.等，Molecular cloning：A laboratory manual；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989中所述，使用标准方法来操作DNA。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。
DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理
关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息参见：Kabat，E.，A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH PublicationNo 91-3242。抗体链的氨基酸依照EU编号方式(Edelman，G.M.等，PNAS 63(1969)78-85；Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIHPublication No 91-3242)来编号。使用GCG(Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin)的软件包10.2版和Infomax的Vector NTI高级套装8.0版来进行序列创建，作图，分析，注释和说明。
DNA测序
通过在SequiServe(Vaterstetten，Germany)和Geneart AG(Regensburg，Germany)实施的双链测序来测定DNA序列。
实施例2：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的生成
基因合成
由Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入pGA18(ampR)质粒中。自经转化细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆的基因片段的DNA序列。
表达质粒的构建
使用下面的表达载体来构建所有编码重和轻链的表达质粒。载体由下述元件构成：
-潮霉素抗性基因，作为选择标记，
-复制起点，oriP，Epstein-Barr病毒(EBV)的，
-来自载体pUC18的复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polyA”)信号序列，和
如上所述，通过基因合成来制备包含重或轻链的免疫球蛋白基因，并克隆入pGA18(ampR)质粒中。使用独特限制性位点通过定向克隆来构建可变重链构建物。作为包含VL和CL的基因合成来定制可变轻链构建物，并使用独特限制性位点通过定向克隆来构建。将最终的表达载体转化入大肠杆菌细胞中，分离(微量制备)表达质粒DNA，并进行限制酶分析和DNA测序。在150ml LB-Amp培养基中培养正确克隆，再次分离(大量制备)质粒DNA，并通过DNA测序来确认序列完整性。
免疫球蛋白变体在HEK293细胞中的瞬时表达
使用FreeStyleTM 293表达系统依照制造商的说明书(Invitrogen，USA)通过瞬时转染人胚肾293-F细胞来表达重组免疫球蛋白变体。对于小规模测试表达，在转染前一天接种30ml 0.5x 106个HEK293F细胞/ml。次日，混合质粒DNA(1μg DNA/ml培养物体积)与1.2ml
Figure BDA0002619651350000631
I减量血清培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，接着添加40μl293FectinTM转染试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。将混合物于室温温育15分钟，并逐滴添加至细胞。转染后一天，给每个烧瓶补加300μl L-谷氨酰胺(200mM，Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)和600μl含有L-天冬酰胺，氨基酸，痕量元素，柠檬酸铵-Fe(III)，乙醇胺，痕量元素，D-葡萄糖，无RPMI的FreeStyle培养基的补料7。转染后三天，使用自动化细胞存活力分析仪(Vi-CellTM XR，Beckman Coulter，Fullerton，CA，USA)和葡萄糖计(Accu-
Figure BDA0002619651350000632
Sensor comfort，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)测定培养基中的细胞浓度，存活力和葡萄糖浓度。另外，给每个烧瓶补加300μl L-谷氨酰胺，300μl非必需氨基酸溶液(PANTM Biotech，Aidenbach，Germany)，300μl丙酮酸钠(100mM，Gibco，Invitrogen)，1.2ml补料7和补加5g/L葡萄糖(D-(+)-葡萄糖溶液45％，Sigma)。最后，转染后六天，通过于环境温度在X3R Multifuge(Heraeus，Buckinghamshire，England)中以3500rpm离心15分钟来收获抗体，使上清液无菌过滤通过Steriflip过滤单元(0.22mmMillipore Express PLUS PES膜，Millipore，Bedford，MA)，并保存于-20℃直至进一步使用。线性扩大高至5L的大规模转染。
双特异性和对照抗体的纯化
通过使用蛋白A-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)的亲和层析和Superdex200大小排阻层析自细胞培养物上清液纯化双特异性抗体。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液应用于用平衡PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡的HiTrap蛋白A HP(5ml)柱。用平衡缓冲液清洗掉未结合的蛋白质。用0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH 2.8洗脱抗体和抗体变体，并用0.1ml 1M Tris，pH 8.5中和含蛋白质级分。合并洗脱的蛋白质级分，用Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml的体积，并加载到用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex 200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，Sweden)上。合并高分子量聚集体少于5％的含有经过纯化的双特异性和对照抗体的级分，并以1.0mg/ml等分试样保存于-80℃。
蛋白质量化
使用具有预装填
Figure BDA0002619651350000641
A蛋白A柱(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)的自动化Ultimate 3000系统(Dionex，Idstein，Germany)通过亲和层析量化蛋白质。在缓冲液A(0.2M Na2HPO4·[2H2O]，pH 7.4)中加载所有样品，并在缓冲液B(0.1M柠檬酸，0.2MNaCl，pH 2.5)中洗脱。为了测定蛋白质浓度，对所有样品使用消光系数1.62。
对经过纯化的蛋白质的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过测量280nm处的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。通过在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)存在和缺失下的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色来分析双特异性和对照抗体的纯度和分子量。依照制造商的说明书使用
Figure BDA0002619651350000643
预制凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。于25℃在200mM KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液中使用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)通过高效SEC来分析双特异性和对照抗体样品的聚集体含量。以0.5ml/min的流速将25μg蛋白质注射到柱上，并在50分钟里等度洗脱。通过肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)酶处理去除N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱术来验证还原的双特异性抗体轻和重链的氨基酸主链完整性。
分析性HPLC
使用具有TSK-GEL G3000SW凝胶过滤柱(7.5mm ID x 30em，TosoHaas Corp.，Montgomeryville，PA，USA)的Agilent HPLC 1100(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)分析抗体。在缓冲液A(含0.05M K2HPO4/KH2PO4的300mM NaCl，pH 7.5)中将18μl洗脱的蛋白质加载到柱上，并基于大小分开。
还原性和非还原性SDS-PAGE
混合7μl洗脱的蛋白质与2x样品缓冲液(
Figure BDA0002619651350000642
LDS样品缓冲液，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并混合另7μl与含有10％还原剂(
Figure BDA0002619651350000644
样品还原剂，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的2x样品缓冲液。将样品加热至70℃达10分钟，并加载到预制
Figure BDA0002619651350000651
4-12％BisTris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上。将凝胶以200V和125mA运行45分钟。之后用Millipore水清洗凝胶三次，并用SimplyBlueTM SafeStain(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色。将凝胶在Millipore水中脱色过夜。
图1a)至1d)示意性描绘2+2 IgG-scFv型式的不同曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体变体。所有双特异性抗体对于每种抗原结合位点都是二价的，而且结合ErbB2/HER2受体中的两种不同互补位(抗原1＝曲妥珠单抗特异性；抗原2＝帕妥珠单抗特异性)。本文所述2+2 IgG-scFv型式的所有双特异性抗体都是非框架嫁接的，非CDR优化的，非糖工程化的且不携带Fc部分中的任何突变。
图2a)至4b)显示2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体变体的例示性大小排阻纯化图，SDS-PAGE分析和分析性HPLC。没有显示TvAB17，TvAB13和变体Herceptin-scFv_A至E的数据；2+2 IgG-scFv型式的所有曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体变体是以相同质量生成的。
表1a：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的序列
Figure BDA0002619651350000661
Figure BDA0002619651350000671
Figure BDA0002619651350000681
表1b)：在scFv部分中具有稳定性二硫键以降低聚集水平的TvAB12_2431_曲妥珠单抗HCscFvOmnitarg(HC_LC)变体
分子的名称 二硫化物位置(VH-VL)
曲妥珠单抗_scFv_WT WT
曲妥珠单抗_scFv_A 44-100
曲妥珠单抗_scFv_B 45-98
曲妥珠单抗_scFv_C 101-46
曲妥珠单抗_scFv_D 103-44
曲妥珠单抗_scFv_E 105-43
实施例3：2+2 IgG-scFv型式的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗双特异性抗体的增殖抑制测定法
细胞系
在补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基(Gibco)中维持MDA-MB 175 VII细胞。细胞系的扩充遵循标准细胞培养方案。
在细胞系MDA-MB-175 VII中评估双特异性抗体抑制增殖的能力。在补充有10％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基(Gibco)中培养MDA-MB-175 VII。解离对数生长期的细胞，计数，并在96孔细胞培养板中在每孔100μL培养基中接种2x104个细胞。在温箱中维持细胞过夜，并在次日以稀释系列的形式将100μL在培养基中稀释的相应抗体添加至细胞。总共6天的温育时间后，在Alamar Blue(Invitrogen)测定法中评估细胞生长。如制造商推荐的那样实施测定法。
表2显示选定的双特异性抗体在增殖测定法中的效力。
抗体 SEQ ID NO： EC50[nM]
Herceptarg WT 1.84
Herceptarg A 1.89
Herceptarg B 2.66
Herceptarg C 2.56
Herceptarg D 1.63
Herceptarg E 1.75
TvAb12 123/124 4.90
CrossMab 119/120/121/122 4.75
帕妥珠单抗 2.11
帕妥珠单抗+Herceptin 1.70
Herceptin 2.92
实施例4：Herceptarg稳定化
重链第98位处的天冬氨酸异构化位点和轻链第30位处的天冬酰胺脱酰胺位点是曲妥珠单抗的稳定性热点。那两个位置影响抗体的抗原结合能力的稳定性和完整性。通过引入使用琥珀酸钠或组氨酸缓冲剂任一的冻干配制剂克服了这个问题。为了提高稳定性和贮存半衰期，我们意图用应当具有更高内在稳定性的氨基酸或氨基酸串替换不稳定性的那些已知来源。我们由此测试了在重链中用Glu替换Asp98及在轻链中用Ser替换Asn30以及用Val替换Thr31。那些突变缩写为D98E，N30S，和T31V。T31V不直接影响N30的脱酰胺，但是猜想邻近天冬酰胺C端侧的残基会影响多肽链的稳定性特性。
将抗体样品于40℃在三种缓冲液(40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 5.0；40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 6.0；或40mM组氨酸，150mM NaCl，pH 7.4)之一中温育1，2，或3个月任一时段。这个时段期间的蛋白质浓度始终是1mg/ml。所示时间点后，采集样品并在液氮中闪冻，然后保存于-80℃直至进一步分析。此分析在ProteOn XPR36仪器(BioRad)上进行。使用胺偶联在GLM芯片的2个通道上分别固定化大约700RU Her2(垂直取向)。通过以水平取向以100μl/min注射于6个不同分析物浓度(100，50，25，12.5，6.25，0nM)一式两份测量曲妥珠单抗变体。记录结合速率180s和解离速率600s。通过10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH以150μl/min达60s的两次脉冲(水平取向)来实施再生。测量了总共四种不同曲妥珠单抗变体。在第一项实验(表3和4)中，只测试了未修饰的曲妥珠单抗和变体602(重链D98E和轻链T31V)。在第二项实验中，测试了未修饰的曲妥珠单抗，变体602(重链D98E和轻链T31V)和变体VH：D98E/VL：N30S VH：D98E/VL：N30T(表5，6，7)。
结果：
所有变体显示与亲本曲妥珠单抗分子相同的针对重组Her2抗原的亲和力。于40℃暴露于pH 5或pH 6后，曲妥珠单抗以约5的因数丧失亲和力，主要是由解离速率升高且结合速率保持不变造成的。变体602在pH应力之前和之后显示几乎无法区分的亲和力。变体N30S自开始起具有与亲本曲妥珠单抗相比更高的亲和力，在应力条件期间保持大致恒定。在进一步的实验中与N30S，N30T，或T31V(VL)任一一起使用变体D98E(VH)。结果显示于图5a)至6c)和下面的表。
Figure BDA0002619651350000711
Figure BDA0002619651350000721
Figure BDA0002619651350000731
Figure BDA0002619651350000741
Figure BDA0002619651350000751
实施例5：曲妥珠单抗和曲妥珠单抗稳定化变体在应力后对KPL-4细胞的结合
结合
收获KPL-4细胞，并在FACS缓冲液中重悬浮。在96孔圆底板中接种0.2Mio个细胞。将板以400g离心3分钟以使细胞形成团粒。去除上清液，并在40μl稀释的抗体中重悬浮细胞。将板于4℃温育30分钟以容许抗体结合。为了去除未结合的抗体，再次将细胞离心，并用FACS缓冲液清洗两次。为了检测抗体，在12μl稀释的山羊抗人Fc特异性FITC标记的二抗(Jackson ImmunoResearch#109-096-098)中重悬浮细胞，并再次于4℃温育30分钟。之后，用FACS缓冲液清洗细胞两次，在200μl FACS缓冲液中重悬浮，并用BDCantoII测量荧光。
ADCC
收获靶细胞，清洗，用钙黄绿素(Invitrogen)染色，在AIM
Figure BDA0002619651350000762
培养基(LifeTechnologies)中重悬浮，并以3x 104个细胞/孔的浓度在板中分配。将相应抗体稀释液一式三份添加至细胞，并温育10分钟，之后添加效应细胞(外周血单个核效应细胞[PBMC])。然后将效应细胞(E)和靶细胞(T)以所述E∶T比于37℃温育所述时间(所有样品一式三份)。温育后，用PBS清洗细胞一次，然后用硼酸盐缓冲液裂解。在Wallac Victor3 1420多重标记物计数器中测量钙黄绿素保留。使用下面的公式计算ADCC：
Figure BDA0002619651350000761
将自发释放(对应于在没有抗体的情况下与效应细胞一起温育的靶细胞)定义为0％细胞毒性，并将最大释放(用1％Triton X-100裂解的靶细胞)定义为100％细胞毒性。计算每项实验的一式三份的ADCC平均百分比和标准偏差。
结果显示于图7a)至9。
实施例6：Herceptarg CrossMab的生成和新颖的基于LC06的框架上的框架嫁接以实现更少的错配
基因合成
由Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸和PCR产物制备期望的基因区段。编码C端附着有scFv抗体片段的重或轻链，在CH3域中携带S354C和T366W突变的“节入穴”抗体重链和在CH3域中携带Y349C，T366S，L368A和Y407V突变的“节入穴”重链，与未修饰的VH域，交叉的Cκ域或scFab抗体片段组合以及未修饰的抗体轻链或CH1域交换的轻链的基因区段侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点(BamHI-XbaI，BamHI-XmnI或BamHI-KpnI)，并克隆入pGA18(ampR)质粒中。自经转化细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序来确认亚克隆的基因片段的DNA序列。所有构建物设计成具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’-端DNA序列，前导肽将蛋白质靶向真核细胞中的分泌。
表达质粒的构建
用于构建所有“节入穴”重链的表达载体以及编码抗体轻链的表达质粒包含下述元件：
-潮霉素抗性基因，作为选择标记，
-复制起点，oriP，Epstein-Barr病毒(EBV)的，
-来自载体pUC18的复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，
-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“polyA”)信号序列，和
-独特BamHI和XbaI限制性位点。
如描述的那样，通过基因合成来制备包含C端附着有scFv抗体片段的重或轻链，具有未修饰的VH域，交叉的Cκ域或scFab片段的“节入穴”重链以及未修饰的轻链或CH1域交换的轻链的免疫球蛋白基因，并克隆入pGA18(ampR)质粒中。用BamHI和XbaI，BamHI和XmnI或BamHI和KpnI限制酶(Roche Molecular Biochemicals)消化携带合成的DNA区段的pGA18(ampR)质粒和表达载体，并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将经过纯化的C端附着有scFv抗体片段的重或轻链，“节入穴”重链和未修饰的或域交换的轻链的编码DNA区段连接入分离的表达载体BamHI/XbaI，BamHI/XmnI或BamHI/KpnI片段，产生最终的表达载体。将最终的表达载体转化入大肠杆菌细胞中，分离(Miniprep)表达质粒DNA，并进行限制酶分析和DNA测序。在150ml LB-Amp培养基中培养正确克隆，再次分离(Maxiprep)质粒DNA，并通过DNA测序来确认序列完整性。
双特异性抗体在HEK293细胞中的瞬时表达
使用FreeStyleTM 293表达系统依照制造商的说明书(Invitrogen，USA)通过瞬时转染人胚肾293-F细胞来表达重组双特异性抗体。简言之，在FreeStVleTM 293表达培养基中于37℃/8％CO2培养悬浮FreeStyleTM 293-F细胞，并在转染前一天在新鲜培养基中以1x106个可存活细胞/ml的密度接种细胞。为了转染，在10ml Dulbecco氏PBS(PAA，Austria)中使用162.5μl 293-FreeTM转染试剂(Merck，USA)和125μgN端附着有scFab的重链编码DNA以质粒比1∶1与“节入穴”重链1和2和轻链质粒DNA以1∶1∶1摩尔比准备DNA，最终转染体积250ml。为了CrossMab的转染，准备质粒比1∶1∶1∶1，1∶1∶1∶2，1∶1∶1∶4，1∶1∶1∶8的“节入穴”重链1∶未修饰的轻链∶Cκ域交换的“节入穴”重链2：CH1域交换的轻链。使用CE-SDS和Q-TOF光谱术的组合，以1x，2x，4x和8x摩尔比使用CH1-VL轻链质粒比来评估链配对的优化。转染后7天通过以14000g离心30分钟来收获含有抗体的细胞培养物上清液，并过滤通过无菌滤器(0.22μm)。于-20℃保存上清液直至纯化。所得抗体的序列显示于下文表8。
双特异性<Her2GlyMab>抗体的糖工程化衍生物的制备
通过使用磷酸钙转染法用哺乳动物抗体重和轻链表达载体共转染HEK293-EBNA细胞来生成双特异性<Her2GlyMab>抗体的糖工程化衍生物。通过磷酸钙法转染指数式生长的HEK293-EBNA细胞。为了生成糖工程化抗体，用用于融合GnTIII多肽表达的质粒和用于甘露糖苷酶II表达的第二质粒共转染细胞。如上文材料和方法部分所述添加多种质粒比的双特异性抗体。使用补充有10％FCS的DMEM培养基在T烧瓶中作为贴壁单层培养物培养细胞，并在它们处于50-80％汇合时转染。为了转染T75烧瓶，在转染前24小时在接近14ml补充有FCS(最终10％V/V)(最终250μg/ml新霉素)的DMEM培养基中接种7.5(至8)x 106个细胞，并将细胞于37℃在具有5％CO2气氛的温箱中放置过夜。对于每个要转染的T75烧瓶，通过混合47μg总质粒载体DNA，235μl 1M CaCl2溶液，并添加水至终体积469μl来制备DNA，CaCl2和水的溶液。对此溶液，添加469μl处于pH 7.05的50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4溶液，立即混合10秒，并于室温静置20秒。用接近12ml补充有2％FCS的DMEM稀释悬浮液，并添加至T75代替现有的培养基。将细胞于37℃，5％CO2温育约17-20小时，然后用接近12ml DMEM，10％FCS替换培养基。转染后5-7天收获条件化培养基，即以210-300*g离心5分钟，无菌过滤通过0.22μm滤器(或者以1200rpm离心5分钟，接着再次以4000rpm离心10分钟)，并保存于4℃。
如上文关于非糖工程化抗体所述纯化并配制糖工程化抗体。如下文所述分析附着于抗体Fc区的寡糖以测定岩藻糖的量。
框架嫁接
原理：曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的相似框架容许轻链的错配：曲妥珠单抗和帕妥珠单抗二者均具有VHIII VLkI框架，因此对二者重链的轻链界面亲和力是相同的。
为了避免crossMab Herceptarg双特异性抗体中的轻链错配，将“CrossMabXPerHer2GlyMab”的曲妥珠单抗框架与无关抗体LC06的框架交换。曲妥珠单抗与种系hVH3_66和hVK1D_39相关，而抗体LC06对应于种系hVbase_VH1_1种系和hVL_3。帕妥珠单抗与hVH3_23和hVK1D_13(它们显示与曲妥珠单抗相比非常相似的框架系统)相关。
LC06的两种种系受体框架均与曲妥珠单抗框架不同，尤其是LC06λ轻链，与曲妥珠单抗κ轻链相比。叠加曲妥珠单抗的抗体Fab晶体结构，并在结构上评价框架的相容性。将曲妥珠单抗轻链的CDRI，II和III嫁接到新的LC06的λ框架上。所包括的突变是D98E和N30S，由于对Her2胞外域的亲和力随N30S修饰而升高，因此N30S的使用有利于T31V。认为由CDR嫁接引起的任何Kd降低可以通过使用N30S突变来补偿。需要受体框架的一些适应，使得CDR处于它们的生物学活性构象；例如，将轻链Kabat位置71处的A(LC06λ)回复突变成F(曲妥珠单抗κ)。维持帕妥珠单抗的初始VHIII-VLkI(κI家族)框架。所得双特异性抗体描绘为“CrossMab-CDRG Her2GlyMab”，序列显示于下文表8。
表8：Herceptarg CrossMab双特异性抗体的序列
Figure BDA0002619651350000801
Figure BDA0002619651350000811
Figure BDA0002619651350000821
Figure BDA0002619651350000831
Figure BDA0002619651350000841
双特异性抗体的纯化
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，Sweden)的亲和层析和Superdex 200大小排阻(GE Healthcare，Sweden)层析自细胞培养物上清液纯化双特异性抗体。简言之，在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH7.4)平衡的MabSelect SuRe树脂上捕捉无菌过滤的细胞培养物上清液，用平衡缓冲液清洗，并用25mM柠檬酸钠pH 3.0洗脱。合并洗脱的蛋白质级分，用2M Tris pH 9.0中和，并使用用20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex 20026/60GL (GE Healthcare，Sweden)柱通过大小排阻层析进一步纯化。通过CE-SDS(Caliper Life Science，USA)分析大小排阻层析级分，合并含有双特异性抗体的级分，并保存于-80℃。
对经过纯化的蛋白质的分析
使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm处的光密度(OD)来测定经过纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。使用microfluidic Labchip技术(Caliper LifeScience，USA)通过CE-SDS分析双特异性和对照抗体的纯度，抗体完整性和分子量。使用HT蛋白质表达试剂盒依照制造商的说明书制备5μl用于CE-SDS分析的蛋白质溶液，并使用HT蛋白质表达芯片在LabChip GXII系统上分析。使用LabChip GX软件3.0.618.0版分析数据。于25℃在200mM KH2PO4，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液中使用Superdex 200分析性大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)通过高效SEC分析双特异性和对照抗体样品的聚集体含量。以0.5ml/min的流速将25μg蛋白质注射到柱上，并在50分钟里等度洗脱。
质谱术
通过用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals)的酶处理去除N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱术验证还原的双特异性抗体轻和重链的氨基酸主链的完整性。还量化重和轻链错配的量。
表面等离振子共振
仪器：BIAacore T100(GE Healthcare)
软件：Biacore T100 Control，2.02/2.03版
Biacore T100 Evaluation，2.02/2.03版
Biacore B3000(Biacore)
软件：Biacore B3000 Control，4.1.2版
BIAEvaluation，4.1.1版
测定法型式芯片：CM5芯片
分别对“曲妥珠单抗”功能性和“帕妥珠单抗”功能性二者测量<Her2GlyMab>分子的动力学常数和所得亲和力。这两种功能性经由Her2与胺偶联的亲本单抗“曲妥珠单抗”(FC1/2)或“帕妥珠单抗”(FC3/4)任一的预络合来区分。注射Her2 ECD后开始亲本单抗和Her2复合物形成。
作为亲本单抗“曲妥珠单抗”/Her2预络合的后果，所有“曲妥珠单抗”结合位点被饱和，但是所有“帕妥珠单抗”结合位点是可用的，反之亦然。最终，经由每个循环使用递增浓度的注射，测量要分析的“<Her2GlyMab>”分子的结合。使用Langmuir 1∶1结合模型计算观察到的结合和解离。为了将测量期间Her2的解离降至最低，于T＝25℃测量动力学常数。
捕捉分子的胺偶联
流动室1至4上的标准胺偶联依照制造商的说明书：CM5芯片，T＝25℃，运行缓冲液：HBS-N缓冲液，用EDC/NHS混合物活化，目标是800RU；在偶联缓冲液乙酸钠，pH 4.5中稀释亲本抗体“曲妥珠单抗”或“帕妥珠单抗”，c＝2-3μg/mL；最终，通过注射1M乙醇胺来封闭剩余的活化的羧基基团。
使用流动室1和3(具有胺偶联的亲本单抗“曲妥珠单抗”或“帕妥珠单抗”任一)上的芯片表面作为参照对照表面，用于修正可能的缓冲剂影响或非特异性结合。
<Her2GlyMab>分子于25℃的动力学表征
运行缓冲液：PBS
用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释所有样品。
流动室2和4上HER2 ECD的捕捉：c＝100nM，流速5μl/min，时间120sec。
分析物样品：以五个浓度(c＝300，100，33.33，11.11和3.7nM)分析一个经典浓度系列的<Her2GlyMab>分子，以流速50μl/min注射。每个浓度单份，有一个两份；结合时间：180sec，解离时间：900sec。
每个循环后使用10mM甘氨酸pH 2.5(用于胺偶联的单抗“曲妥珠单抗”)和25mMNaOH(用于胺偶联的单抗“帕妥珠单抗”)实施最终的再生，接触时间每次60sec，流速30μl/min。
使用双重参照计算动力学参数(对照参照：分析物分别对单抗曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的结合；分别为流动室1和3)，使用浓度“0”作为空白。用模型Langmuir结合1∶1实施计算，RI(折射率)＝0。
结果：双特异性，二价<Her2GlyMab>抗体分子的表达和纯化
依照上文材料和方法中描述的规程，表达并纯化双特异性，二价<Her2GlyMab>抗体分子OAscFab1，OAscFab2，OAscFabPerl，OAscFabPer2，CrossMab-XPer，CrossMab-XTra和CrossMab-CDRG。在每种分子中，VH和VL部分分别基于具有可变轻链中的突变T31V或N30T和重链中的突变D98E的经过优化的曲妥珠单抗序列和帕妥珠单抗亲本序列。抗体的示意性结构显示于图10a)-10b)。序列显示于上文表8。
通过Western印迹和HP-SEC确认<Her2GlyMab>抗体分子OAscFab1 Her2 GlyMab，OAscFab2 Her2 GlyMab，OAscFabPerl Her2 GlyMab，OAscFabPer2 Her2 GlyMab(都是糖工程化的，节入穴，曲妥珠单抗携带D98E和T31V突变)，CrossMab-XPer Her2 GlyMab，CrossMab-XTra Her2 GlyMab(都是糖工程化的，节入穴，曲妥珠单抗cross-Fab携带D98E和T31V突变)，和CrossMab-CDRG Her2 GlyMab(是糖工程化的，节入穴，CDR嫁接的，曲妥珠单抗cross-Fab携带D98E和N30S突变)的表达(图11a)-11b))。OAscFab1，OAscFab2，0AscFabPer1，OAscFabPer2，CrossMab-XPer，CrossMab XTra和CrossMab-CDRG的纯化导致表9中所示产量。所有OAscFab构建物在纯化后显示少于90％的单体，这些分子降低的纯度不能通过在表达中优化质粒比来提高(数据未显示)。然而，证明了表达中质粒链比的优化提高CrossMab抗体纯化后存在的单体分数，如下文描述的。
Figure BDA0002619651350000871
Figure BDA0002619651350000881
表9-Her2GlyMab纯化-蛋白A和SEC纯化后使用HP-SEC的百分比聚集分析和相应蛋白质产量，通过糖工程化构建物的UV光谱术A280计算。
实施例7：双特异性，二价<Her2GlyMab>抗体分子的表达和纯化，表达中使用的质粒比的优化
CrossMab-XTra
依照上文材料和方法中描述的规程，以1∶1∶1∶1，1∶1∶1∶2，1∶1∶1∶4和1∶1∶1∶8的摩尔质粒比表达双特异性，二价<Her2GlyMab>抗体分子CrossMab-XTra，并纯化。通过Westem印迹确认CrossMab-XTra的表达。细胞培养物上清液的蛋白A纯化后，构建物在1∶1∶1∶1等摩尔质粒比显示大约73％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；11％含有与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x帕妥珠单抗轻链；9％具有重链穴-穴联合形成的完整X曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自X曲妥珠单抗)；4％只与帕妥珠单抗轻链组合的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合；和3％具有1x X曲妥珠单抗轻链和1x帕妥珠单抗轻链的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合。
1∶1∶1∶2质粒比(其中交叉的曲妥珠单抗轻链(XHerLC)的摩尔比2倍表达)显示大约81％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；1％含有与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x帕妥珠单抗轻链；16％具有重链穴-穴联合形成的完整X曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自X曲妥珠单抗)；未检测到只与帕妥珠单抗轻链组合的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合；和1％具有1x X曲妥珠单抗轻链和1x帕妥珠单抗轻链的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合。
1∶1∶1∶4质粒比(其中交叉的曲妥珠单抗轻链的摩尔比4倍表达)显示大约64％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；未检测到与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x帕妥珠单抗轻链；然而，在此比首次检测到12％与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x X曲妥珠单抗轻链；24％具有重链穴-穴联合形成的完整X曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自X曲妥珠单抗)；未检测到只与帕妥珠单抗轻链组合的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合；未检测到具有1x X曲妥珠单抗轻链和1x帕妥珠单抗轻链的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合。
1∶1∶1∶8质粒比(其中交叉的曲妥珠单抗轻链的摩尔比8倍表达)显示大约45％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；未检测到与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x帕妥珠单抗轻链；然而，在此比首次检测到28％与帕妥珠单抗和X曲妥珠单抗重链配对的2x X曲妥珠单抗轻链；27％具有重链穴-穴联合形成的完整X曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自X曲妥珠单抗)；未检测到只与帕妥珠单抗轻链组合的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合；未检测到具有1x X曲妥珠单抗轻链和1x帕妥珠单抗轻链的X曲妥珠单抗重链穴-穴联合。
Figure BDA0002619651350000891
Figure BDA0002619651350000892
表10-CrossMab-XTra Her2GlyMab-Her2GlyMab抗体构建物的副产物概况的Q-TOF分析和量化，比较交叉的曲妥珠单抗轻链(XHer LC)的优化质粒滴定。N.D.-未检测到。
CrossMab-XPer
细胞培养物上清液的蛋白A纯化后，构建物在1∶1∶1∶1等摩尔质粒比显示大约85％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；2％含有与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x X帕妥珠单抗轻链；1％具有重链穴-穴联合形成的完整曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自曲妥珠单抗)；12％与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x曲妥珠单抗轻链。未检测到别的种类。
1∶1∶1∶2质粒比(其中交叉的帕妥珠单抗轻链(XPerLC)的摩尔比2倍表达)显示大约89％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；7％含有与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x X帕妥珠单抗轻链；未检测到具有重链穴-穴联合形成的完整曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自曲妥珠单抗)；4％与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x曲妥珠单抗轻链。
1∶1∶1∶4质粒比(其中交叉的帕妥珠单抗轻链(XPerLC)的摩尔比4倍表达)显示大约74％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；25％含有与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x X帕妥珠单抗轻链；未检测到具有重链穴-穴联合形成的完整曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自曲妥珠单抗)；1％与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x曲妥珠单抗轻链。
1∶1∶1∶8质粒比(其中交叉的帕妥珠单抗轻链(XPerLC)的摩尔比8倍表达)显示大约52％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体；48％含有与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x X帕妥珠单抗轻链；未检测到具有重链穴-穴联合形成的完整曲妥珠单抗抗体(重和轻链均源自曲妥珠单抗)；未检测到与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗重链配对的2x曲妥珠单抗轻链。
CrossMab-CDRG
细胞培养物上清液的蛋白A纯化后，构建物在1∶1∶1∶1等摩尔质粒比显示大约95％的如通过Q-TOF MS检测的具有预期分子量大约148kDa的双特异性抗体，和5％含有与X帕妥珠单抗和曲妥珠单抗(HerCDRG)重链配对的2x X帕妥珠单抗轻链。
未检测到别的种类，因此，未实施质粒比的进一步优化。为了比较副产物概况而对抗体CrossMab-XHer和CrossMab-CDRG实施的MS谱可以见图12。
Figure BDA0002619651350000901
Figure BDA0002619651350000911
表11-CrossMab-XPer Her2GlyMab-Her2GlyMab抗体构建物的副产物概况的Q-TOF分析和量化，比较交叉的曲妥珠单抗轻链(XPer LC)的优化质粒滴定。N.D.-未检测到。
Figure BDA0002619651350000912
表12-CrossMab-CDRG Her2GlyMab-Her2GlyMab抗体构建物的副产物概况的Q-TOF分析和量化，检测错配抗体重和轻链的存在。N.D.-未检测到。
实施例8：双特异性抗体对两种抗原的同时结合
如上所述经由BIAcore分析双特异性抗体的结合。
在分开的测定法型式中证明样品(CrossMabXPer以及OAscFab1和OAscFab2)对于曲妥珠单抗以及帕妥珠单抗特异性是功能性的。CrossMabXPer显示与阳性对照相同数量级的动力学常数和所得亲和力。除了曲妥珠单抗介导的结合略微降低的ka速率常数以外，OAscFab1和OAscFab2显示与阳性对照(即亲本单抗)相同数量级的动力学常数和所得亲和力。
阳性对照的部分二价结合(依赖于CM5芯片上的配体密度)可引起这个实施例中描绘的两项实验中解离速率常数的变化。
Figure BDA0002619651350000913
Figure BDA0002619651350000921
表13-Her2GlyMab亲和力的SPR分析-于25℃使用BIAcoreT100及CM5芯片测量抗体的结合和解离速率。
实施例9：1+1 Herceptarg CrossMAb和糖工程化Herceptarg Crossmab的体外评估
增殖抑制测定法
使用
Figure BDA0002619651350000922
(Invitrogen)来测量在HER2 CrossMab(CrossMab-XTraHer2GlyMab，SEQ ID NO 119，120，121，122)，曲妥珠单抗，帕妥珠单抗或曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组合存在下温育5天后(A)BT474细胞和(B)N87细胞的代谢活性和增殖。染料的生物还原降低氧化形式(蓝色)的量且伴随提高发荧光的中间体(红色)。
收获靶细胞，清洗，在RPMI 1640(Gibco)+10％FCS+1％GlutaMAXTM(Gibco)中重悬浮，并以1x 104个细胞/孔的浓度在板中分配。将细胞在细胞温箱中温育3小时，之后添加相应抗体稀释液。将板温和摇动，并在细胞温箱中温育5天。
将25μl/孔Alamar Blue添加至板，并在温箱中温育7小时。
在Wallac Victor3 1420多标记物计数器中于584nm和612nm监测吸光度。
为了计算增殖抑制的百分比，测定法中包括无处理对照样品，定义为100％增殖。计算每项实验的一式三份的增殖抑制的平均百分比。
结果显示于图13a)-13b)。
ADCC测定法
在KPL-4(A)，T47D(B)和Calu-3(C)细胞上评估由HER2 CrossMab(CrossMab-XTraHer2GlyMab，SEQ ID NO 119，120，121，122)，曲妥珠单抗，帕妥珠单抗或曲妥珠单抗/帕妥珠单抗组合介导的ADCC。
收获靶细胞，清洗，在AIM
Figure BDA0002619651350000923
培养基(Life Technologies)中重悬浮，并以3x 104个细胞/孔的浓度在板中分配。将相应抗体稀释液一式三份添加至细胞，并温育10分钟，之后添加效应细胞(外周血单个核效应细胞[PBMC])。然后将效应细胞(E)和靶细胞(T)以E∶T比25∶1于37℃温育4小时(所有样品一式三份)。使用LDH细胞毒性检测试剂盒(RocheApplied Science)测量乳酸脱氢酶(LDH)释放。使用下面的公式计算ADCC：
Figure BDA0002619651350000931
将自发释放(对应于在没有抗体的情况下与效应细胞一起温育的靶细胞)定义为0％细胞毒性，并将最大释放(用1％Triton X-100裂解的靶细胞)定义为100％细胞毒性。计算每项实验的一式三份的ADCC平均百分比和标准偏差。结果显示于图14a)-14c)。
实施例10：HER2 CrossMab的体内表征：在Calu3肺癌和KPL4乳腺癌异种移植物中靶向HER2的双特异性抗体对肿瘤生长的影响
体外培养的细胞-Calu3
这种人肺腺癌癌细胞系是自具有肺癌的高加索人男性的建立的。自ChugaiPharmaceuticals Co.，Ltd.获得细胞，并在内部传代，用作工作细胞库。于37℃在5％CO2的水饱和气氛中在补充有10％胎牛血清谷氨酰胺(PANBiotech，Germany)的RPMI培养基(PANBiotech，Germany)中例行培养肿瘤细胞。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)实施培养物传代，一周拆分两次。使用细胞传代P6进行体内研究。
体外培养的细胞-KPL-4
这种人乳腺癌细胞系是自具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液建立的。细胞是由J.Kurebayashi教授(Kawasaki Medical School，Kurashiki，Japan)提供。于37℃在5％CO2的水饱和气氛中在补充有10％胎牛血清(PAN Biotech，Germany)和2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech，Germany)的DMEM培养基(PAN Biotech，Germany)中例行培养肿瘤细胞。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)实施培养物传代，一周拆分两次。使用细胞传代P6进行体内研究。
动物
依照国际指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在无特定病原体的条件下维持雌性SCID米色(C.B.-17)小鼠；年龄10-12周；体重18-20g(Charles River Germany，Sulzfeld)或雌性BALB/C nu/nu小鼠；年龄8-10周；体重＞20g(Bomholtgard，Denmark)，日周期12小时光亮/12小时黑暗。到达后，将动物在动物房的检疫部分中收容1周以适应新环境及进行观察。规则地进行连续健康监测。随意提供食物(Alltromin)和水(酸化pH 2.5-3)。实验研究得到了当地政府审查和批准；登记号55.2-1-54-2531.2-3-08Scid-米色同位啮齿动物乳腺癌模型和211-2531.2-16/00.1.2.2皮下肿瘤模型。
肿瘤细胞注射
在注射那天，自培养瓶(Greiner TriFlask)收获(胰蛋白酶-EDTA)肿瘤细胞，并转移入50ml培养基中，在PBS中清洗一次并重悬浮。再次用PBS清洗并过滤(细胞滤网；Falcon
Figure BDA0002619651350000941
)后，将最终的细胞滴度调节至1.5x 108/ml。用移液器小心混合肿瘤细胞悬浮液以避免细胞聚集。在封闭循环系统中用预培养室(树脂玻璃)，单独小鼠鼻罩(硅)和非易燃或易爆麻醉化合物异氟烷(Pharmacia-Upjohn，Germany)使用用于小型动物的Stephens吸入单元实施麻醉。注射前2天，对SCID米色小鼠除毛。对于皮下注射Calu3细胞，用解剖钳小心夹起麻醉动物的皮肤，并在动物的右体侧中皮下注射100μl细胞悬浮液(＝5.0x 106个细胞)。使用粗注射针(0.45x 25mm)将细胞悬浮液吸入1.0ml结核菌素注射器(Braun，Melsungen)。以20μl体积同位注射KPL-4细胞(3x 106个细胞)入每只麻醉小鼠的倒数第二个右侧腹股沟乳房脂肪垫中。对于同位植入，使用Hamilton微升注射器和30Gx1/2″针经由乳头下的皮肤注射细胞悬浮液。
监测
每天管理动物，检测不良作用的临床症状。对于贯穿实验的监测，一周两次记录动物的体重，并一周两次用测径器测量肿瘤体积。依照NCI方案(肿瘤体积＝1/2ab2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径)计算肿瘤体积。终止标准是关键肿瘤块(高至1.7g或
Figure BDA0002619651350000942
)，体重自基线损失超过20％，肿瘤溃疡或较差的动物整体状况。动物的研究排除标准在对应的“Tierversuchsanzeige”中描述并得到批准。
动物处理
将小鼠针对肿瘤体积随机化，KPL-4均值80mm3，Calu3均值100mm3。一周一次以10ml/kg体积腹膜内处理小鼠。对于组合治疗，先给予曲妥珠单抗，24小时后给予帕妥珠单抗。
结果显示于表14至17及图15a)至18c)。
Figure BDA0002619651350000951
表14：BispecHer2_Pz_Calu3_001(图15a)-15c))：CrossMAb_003non-ge：非糖工程化CrossMab-XTra Her2GlyMab(SEQ ID NO 119，120，121，122)，阴性对照：抗IgE抗体(Omalizumab)，Herceptarg 2+2 OmniE：曲妥珠单抗scFV添加至重链C端的帕妥珠单抗抗体。曲妥珠单抗scFv含有VH 105-VL 43之间的稳定性二硫键(SEQ ID NO：145，146)，TvAb12和TvAb20：scFv 2+2 HER2双特异性抗体，见实施例2。
Figure BDA0002619651350000952
表15：BispecHER2_PZ_KPL-4_002(图16a)-16c))：CrossMAb_003 non-ge：非糖工程化CrossMab-XTra Her2GlyMab(SEQ ID NO 119，120，121，122)，阴性对照：抗IgE抗体(Omalizumab)，Herceptarg 2+2 OmniE：曲妥珠单抗scFV添加至重链C端的帕妥珠单抗抗体。曲妥珠单抗scFv含有VH 105-VL 43之间的稳定性二硫键(SEQ ID NO：145，146)，TvAb12和TvAb20：scFv 2+2 HER2双特异性抗体，见实施例2。
Figure BDA0002619651350000953
表16：Bispec.HER2_PZ_KPL-4_003(图17a)-17c))：CrossMAb_005非糖工程化CrossMab-XTra Her2GlyMab(SEQ ID NO 119，120，121，122)，阴性对照：抗IgE抗体(Omalizumab)。
Figure BDA0002619651350000961
表17：Exploratory_PZ_KPL-4_009(图18a)-18c))：阴性对照：抗IgE抗体(Omalizumab)，TvAb16和TvAb20：scFv 2+2 HER2双特异性抗体，见实施例2。
实施例11：曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的共同轻链的生成
基因合成
根据需要，使用适宜模板通过PCR生成期望基因区段，或者在Geneart AG(Regensburg，Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸和PCR产物合成期望基因区段。在精确基因序列不可得的情况中，基于来自最接近同源物的序列设计寡核苷酸引物，并自源自适宜组织的RNA通过RT-PCR分离基因。将侧翼为单一限制性内切核酸酶切割位点的基因区段克隆入标准克隆/测序载体中。自经转化细菌纯化质粒DNA，并通过UV光谱术测定浓度。通过DNA测序确认亚克隆的基因片段的DNA序列。基因区段设计成具有合适的限制性位点以容许亚克隆入相应表达载体中。所有构建物设计成具有编码前导肽的5’-端DNA序列，前导肽将蛋白质靶向真核细胞中的分泌。SEQ ID NO：155，156，和157给出例示性前导肽。
抗原表达载体的克隆
将编码成熟酪氨酸激酶型细胞表面受体HER2(Her2，Uniprot：P04626)氨基酸1至629的DNA片段同框克隆入含有N端前导序列的哺乳动物接受者载体中。另外，构建物含有C端avi标签(其在与Bir A生物素连接酶共表达期间容许特异性生物素化)和His标签(其用于通过固定化金属亲和层析(IMAC)的纯化)(SEQ ID NO 1和2)。
抗原表达一般由MPSV启动子驱动，而且转录由位于CDS下游的合成polyA信号序列终止。在表达盒以外，每种载体还含有EBV oriP序列，用于EBV-EBNA表达性细胞系中的自主复制。
抗原和抗体的生成和纯化
将抗原和抗体二者瞬时转染入稳定表达EBV衍生蛋白质EBNA的HEK293细胞中。同时共转染编码生物素连接酶Bir A的质粒容许体内avi标签特异性生物素化。然后使用蛋白A柱，接着是凝胶过滤来纯化蛋白质。
曲妥珠单抗/帕妥珠单抗共同轻链的设计
为了生成曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的共同轻链(CLC)，分析并比较各种轻链(LC)。序列分析揭示两种可变域均源自相同种系序列。鉴于总体上的曲妥珠单抗LCDR3和特别的残基H91与Her2上的曲妥珠单抗特异性表位特异性相互作用，如下进行创建曲妥珠单抗/帕妥珠单抗CLC的第一项尝试：用曲妥珠单抗的整个LCDR3区或仅残基H91任一替代帕妥珠单抗LC中的对应位置。结果是，创建了编码帕妥珠单抗衍生LCDR1和2但包含曲妥珠单抗衍生LCDR3氨基酸残基的杂合LC构建物。将称作“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”(可变域的DNA序列列于SEQ ID NO：25)或“帕妥珠单抗(曲.Y91H)LC”(SEQ ID NO：27)的所得CLC与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗HC任一共表达。自哺乳动物衍生细胞培养物上清液纯化所得四种抗体(可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：22和26，“帕妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”；SEQ IDNO：92和26，“曲妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”；SEQ ID NO：22和28，“帕妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.Y91H)LC”；SEQ ID NO：92和28，“曲妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.Y91H)LC”)，通过SPR测量对Her2的结合，并与相应亲本抗体(SEQ ID NO：22和24，“帕妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗LC”；SEQ ID NO：92和82，“曲妥珠单抗HC”x“曲妥珠单抗LC”)比较。
使用BioRad的ProteOn XPR36生物传感器通过SPR的亲和力测定
于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振测量新的抗体链组合的亲和力(KD)。在第一步中，通过按偶联(乙酸钠pH 4，30μl/min，300s)在GLM芯片的所有6个通道上固定化6500RU识别hu IgG(Fc-特异性)的抗人IgG(Sigma I2136，多克隆山羊抗体)(垂直取向)。
用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH 7.4，0.005％Tween 20)稀释每种抗体至2μg/ml，然后在垂直取向上以30μl/min注射60s以实现约400个响应单位(RU)的固定化水平。注射Her2：对于一击动力学测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5以100μl/min同时注射经过纯化的Her2的三倍稀释系列(范围介于300和3.7nM之间的不同浓度)，结合时间180s，解离时间600s。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作为参照。通过10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH以100μl/min达30s的两次脉冲(水平取向)来实施再生。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单一对一Langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。以比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。
如预期的，两种对照抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗均以它们低纳摩尔或亚纳摩尔范围中的已知亲和力识别Her2。然而，虽然帕妥珠单抗HC与新设计的“帕妥珠单抗(曲.Y91H)LC”的组合的亲和力略微降低，但是相同轻链与曲妥珠单抗HC的组合没有产生任何可检测的结合。这指示帕妥珠单抗LC中的单一曲妥珠单抗衍生点突变(Y91H)在这种链组合中没有充分翻译成对Her2的结合。这与第二CLC变体“帕妥珠单抗LC(曲.L3)”构成对比，第二CLC变体“帕妥珠单抗LC(曲.L3)”在与曲妥珠单抗HC组合时导致弱结合，但是在与帕妥珠单抗HC共表达时结合降低但清楚可见的。图19和表18给出动力学和热力学测量结果的汇总。基于此发现，进一步修饰CLC“帕妥珠单抗LC(曲.L3)”以恢复与曲妥珠单抗HC组合的Her2结合同时尽可能小地影响与帕妥珠单抗HC共表达时的亲和力。
表18：曲妥珠单抗，帕妥珠单抗，及其杂合分子的动力学和热力学参数
Figure BDA0002619651350000981
实施例12：共同轻链的亲和力改善
帕妥珠单抗(曲.L3)LC中另外的曲妥殊单抗特异性LCDR残基的引入和表征
基于先前SPR测量的结果，所设计CLC“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”与帕妥珠单抗HC组合的结合导致降低但仍然较好的可检测结合。与之对比，该CLC与曲妥珠单抗HC的共表达导致很弱的微摩尔范围中的亲和力，而且与亲本曲妥珠单抗抗体相比显著降低。
为了进一步发展CLC生成及改进与曲妥珠单抗HC组合的结合，将LCDR1，2，和3以及框架3区中对于曲妥珠单抗而言特异性的另外的曲妥珠单抗特异性氨基酸个别引入先前设计的“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”的序列(可变域的DNA序列列于SEQ ID NO：31，33，35，37，39，41，43，45，47，49，和51)。共表达所得构建物(可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：32，34，36，38，40，42，44，46，48，50，和52)与曲妥珠单抗HC(SEQ ID NO：92)或帕妥珠单抗HC(SEQID NO：22)，并自哺乳动物衍生的细胞培养物上清液纯化。测量对Her2的结合，并与相应亲本抗体比较。
“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”变体通过SPR的亲和力测定
使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过表面等离振子共振测量新抗体链组合的亲和力(KD)，如之前所述实施。表19给出动力学和热力学测量结果的汇总。
有趣的是，“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”变体中另外的单突变在与帕妥珠单抗组合时无一显著影响亲和力，而且亲和力与“帕妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”相当。然而，“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”变体与曲妥珠单抗HC的组合导致显著差异。虽然LCDR3区中变成帕妥珠单抗序列的回复突变(P94Y和T96Y)(可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：50和52)完全消除对Her2的结合，但是引入帕妥珠单抗特异性突变(SEQ ID NO：32，34，36，38，40，42，44，46，和48)产生与初始组合“曲妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”相比相等或改善的亲和力。特别地，引入突变I31T，G32A，Y53F，和G66R导致最显著的结合改善。
在“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”中同时引入最显著的曲妥珠单抗特异性残基
基于上文所述结合测量结果，在“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”中组合引入4种最相关的曲妥珠单抗特异性突变。含有任一个别突变的可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：36，40，42，和48。含有“四重突变”的链称作“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”(SEQ ID NO：54)。
“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”通过SPR的亲和力测定
为了表征新“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”及测定在与帕妥珠单抗HC或曲妥珠单抗HC任一组合时的结合亲和力，实施了又一项SPR实验。使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)测量新抗体链组合的亲和力(KD)，如之前所述实施。图20和表20给出动力学和热力学测量结果的汇总。
与之前引入并表征的个别突变相似，包含帕妥珠单抗HC和“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”的抗体的亲和力与初始链组合“帕妥珠单抗HC”x“帕妥珠单抗(曲.L3)LC”相比没有显著降低。对于两种链组合，亲和力均在26至34nM的范围中。有趣的是，“曲妥珠单抗HC”与“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”的组合导致对Her2的亲和力有很强的改善。而且，它200pM的亲和力甚至好于亲本抗体曲妥珠单抗的测量亲和力(2.2nM)。
鉴于“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”与曲妥珠单抗HC的组合完全恢复(或甚至超越)对Her2的结合及考虑到与帕妥珠单抗HC的组合降低但未消除对Her2的结合，使用“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”作为两种Her2特异性的CLC及通过帕妥珠单抗HC的亲和力成熟恢复对帕妥珠单抗特异性表位的结合是显然的。
表19：包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗HC任一与另外的CLC杂合分子组合的抗体的动力学和热力学参数
Figure BDA0002619651350001001
Figure BDA0002619651350001011
表20：包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗HC任一和最终CLC的抗体的动力学和热力学参数
Figure BDA0002619651350001012
实施例13：帕妥珠单抗重链的亲和力成熟
基于帕妥珠单抗的H1/H3和H2亲和力成熟文库的生成
亲和力成熟的Pertutzumab衍生重链的生成是使用标准方案(Silacci等，2005)通过噬菌体展示进行的。
为了生成在与“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”联合表达时具有改善的亲和力的帕妥珠单抗衍生HC，生成了在CDR1和3中或在CDR2中随机化的成熟文库。将帕妥珠单抗HC(SEQID NO：22)和“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”(SEQ ID NO：54)的序列克隆入噬菌粒中，并用作随机化的模板。为了生成在CDR1和3中随机化的帕妥珠单抗HC亲和力成熟文库，通过“交叠延伸剪接”(SOE)PCR来组装三种片段，并克隆入噬菌体载体中。使用下述引物组合来生成文库片段：片段1，LMB3(SEQ ID NO：147)和AM_omni_H1_TN-ba(SEQ ID NO：148)，片段2，RJH108(omni_3’H1_fo)(SEQ ID NO：149)和RJH109(omni_5’H3_re)(SEQ ID NO：150)，和片段3，AM_omni_H3_TN_fo(SEQ ID NO：151)和RJH99(SEQ ID NO：152)。组装足够量的全长随机化片段后，与相同处理的接受者噬菌粒载体一起，用MunI/NheI消化它。连接6ug Fab文库插入物与24ug噬菌粒载体。使用经过纯化的连接体系进行60次转化，产生6x 109个转化体。挽救展示帕妥珠单抗亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaCl纯化来纯化，要用于选择。
CDR2随机化的帕妥珠单抗HC亲和力成熟文库的生成是类似进行的，但是仅两种片段生成，组装并使用与之前相同的限制酶克隆入噬菌粒中。使用下述引物组合来生成文库片段：片段1，LMB3(SEQ ID NO：147)和RJH110(omni_5’H2_ba)(SEQ ID NO：153)和片段2，AM_omni_h2_TN_fo(SEQ ID NO：154)和RJH99(SEQ ID NO：152)。使用经过纯化的连接体系进行60次转化，产生4x 109个转化体。挽救展示帕妥珠单抗亲和力成熟文库的噬菌粒颗粒，并通过PEG/NaC1纯化来纯化，要用于选择。
表21a)：用于生成CDR1和3随机化的帕妥珠单抗亲和力成熟文库的引物组合
Figure BDA0002619651350001021
表21b)：用于生成CDR1和3随机化的帕妥珠单抗亲和力成熟文库的引物序列
Figure BDA0002619651350001022
Figure BDA0002619651350001031
表22a)：用于生成CDR2随机化的帕妥珠单抗亲和力成熟文库的引物组合
Figure BDA0002619651350001032
表22b)：用于生成CDR2随机化的帕妥珠单抗亲和力成熟文库的引物组合
Figure BDA0002619651350001033
Figure BDA0002619651350001041
亲和力成熟的帕妥珠单抗HC衍生克隆的选择
针对人Her2胞外域(ECD)的选择是使用HEK293表达的蛋白质进行的。通过共表达生物素连接酶Bir A经N端avi标签酶促生物素化抗原。依照下面的样式在溶液中实施多轮淘选：1.以1ml总体积将约1012个噬菌粒颗粒结合至10nM生物素化Her2 ECD达0.5小时，2.通过添加5.4x 107个链霉亲合素包被的磁珠达10分钟来捕捉生物素化Her2 ECD和特异性结合的噬菌体颗粒，3.使用5x 1ml PBS/Tween20和5x 1ml PBS清洗珠，4.通过添加1ml 100mMTEA达10分钟来洗脱噬菌体颗粒，并通过添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4来中和，5.再感染指数式生长中的大肠杆菌TG1细菌，并6.用辅助噬菌体VCSM13感染，随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒，要用于随后多轮选择。使用递减(自20x 10-9M至1x 10-9M)抗原浓度在3轮里进行选择。在第2和3轮中，抗原：噬菌体复合物捕捉是使用中性亲合素板代替链霉亲合素珠实施的。另外，将中性亲合素板在2L PBS中清洗3小时。如下通过ELISA鉴定特异性结合者：在中性亲合素板上包被每孔100μl 30nM生物素化Her2 ECD。添加含Fab细菌上清液，并通过使用抗Flag/HRP二抗经它们的Flag标签来检测结合性Fab。以96孔格式作为可溶性Fab片段用细菌表达ELISA阳性克隆，并使用ProteonXPR36通过SPR分析对上清液进行动力学筛选实验。
亲和力成熟的帕妥珠单抗HC变体通过SPR的亲和力测定
通过表面等离振子共振测量新帕妥珠单抗HC变体的亲和力(KD)。在第一步中，通过胺偶联(乙酸钠，pH 4.5，30μl/min，300s)在GLM芯片的所有6个通道上固定化7000RU多克隆抗人Fab抗体(垂直取向)。
过滤每份含抗体细菌上清液，并用PBS 3倍稀释，然后在垂直取向上以30μl/min注射180s以实现100至400个响应单位(RU)的固定化水平。注射Her2：对于一击动力学测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5以100μl/min同时注射经过纯化的Her2的两倍稀释系列(范围介于100和6.25nM之间的不同浓度)，结合时间180s，解离时间1000s。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作为参照。通过10mM甘氨酸pH 1.5和50mMNaOH以100μl/min达30s的两次脉冲(水平取向)来实施再生。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单一对一Langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。以比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。鉴定表达具有最高亲和常数的Fab的克隆，并对对应噬菌粒的重链测序。最亲和的帕妥珠单抗HC变体(可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：62，66，68，70，72，和74)的热力学测量结果汇总于表23和图21。
表23：选定的亲和力成熟的帕妥珠单抗克隆变体与共同轻链(CLC)组合的亲和力
帕妥珠单抗重链 亲和力(nM)
帕妥珠单抗 34
亲和力成熟克隆D1 1
亲和力成熟克隆B2 1
亲和力成熟克隆E1 0.5
亲和力成熟克隆G2 1
亲和力成熟克隆C8 3
亲和力成熟克隆A1 1
实施例14：曲妥珠单抗/帕妥珠单抗双特异性抗体的表征
具有CLC的曲妥珠单抗/帕妥珠单抗双特异性抗Her抗体的生成
在下面的步骤中，以双特异性抗体型式与称作“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)LC”的CLC组合表达亲和力成熟的帕妥珠单抗HC以及曲妥珠单抗HC。为了生成此类具有CLC的双特异性抗体，通过应用节入穴技术实现了2种不同HC的异二聚化。将帕妥珠单抗亲和力成熟克隆E1和G2的可变域(可变域的蛋白质序列列于SEQ ID NO：68和70)以及克隆“D1衍生的”(D1-der)序列(SEQ ID NO：64)克隆入在域CH3中含有“穴”突变的人IgG1 HC中。具有CLC的双特异性抗体的示意性概览显示于图22。亲和力成熟克隆“D1-der”组合克隆D1(SEQ ID NO：62)的CDR1和3突变与在其它选定克隆中找到的别的CDR2突变。将曲妥珠单抗HC的可变域(SEQID NO：92)克隆入在域CH3中携带“节”突变的人IgG1 HC中。共表达所得构建物(称作“Herceptarg”构建物)，并自哺乳动物衍生细胞培养物上清液纯化。所有三种双特异性抗体的分析数据的汇总显示于图23a)-23c)和表24。
表24：具有共同轻链的HER2抗体的生成
抗体 产量/升(mg/l) ％单体
Herceptarg CLC G2 41.3 100
Herceptarg CLC E1 72.1 96
Herceptarg CLC D1-der 20.1 100
Her2敲除抗原变体的生成
为了分析和表征Herceptarg双特异性抗体对Her2上两种表位中每一项的结合，设计了Her2敲除变体。在这些变体中，通过突变与相应抗体链相互作用的氨基酸，删除两种特异性表位中任一项。
为了表达和纯化，将相应DNA片段同框融合至N端前导序列和C端人IgG1 Fc编码片段(其充当溶解性和纯化标签)。位于Fc片段C末端的avi标签容许体内生物素化。为了以单体形式表达抗原，这些Fc链含有“节”突变(SEQ ID NO：5和6，Her2 ECD-Fc(节)；SEQ ID NO：7和8，Her2 ECD(帕妥珠单抗KO)-Fc(节)；SEQ ID NO：9和10，Her2 ECD(曲妥珠单抗KO)-Fc(节))，并与“Fc-穴”对应物(SEQ ID NO：3和4)组合共表达。
Herceptarg双特异性抗体通过SPR的亲和力测定
于25℃使用ProteOn XPR36仪器(Biorad)通过SPR测量新双特异性抗体对her2中它们表位中每一项的亲和力(KD)。在第一步中，通过胺偶联(乙酸钠，pH 4，30μl/min，300s)在GLM芯片的所有6个通道上固定化11000RU识别人IgG(Fc特异性的)的多克隆山羊抗人IgG(Sigma I2136)(垂直取向)。
用PBST(10mM磷酸盐，150mM氯化钠pH 7.4，0.005％Tween 20)稀释每种抗体至2μg/ml，然后在垂直取向上以30μl/min注射60s以实现约400个响应单位(RU)的固定化水平。注射Her2：对于一击动力学测量，将注射方向变成水平取向，沿着分开的通道1-5以100μl/min同时注射经过纯化的单价Her2-Fc蛋白质构建物的两倍稀释系列(范围介于100和6.25nM之间的不同浓度)，结合时间180s，解离时间600s。沿着第六通道注射缓冲液(PBST)以提供“在线”空白作为参照。通过10mM甘氨酸pH 1.5和50mM NaOH以100μl/min达30s的两次脉冲(水平取向)来实施再生。在ProteOn Manager v3.1软件中使用简单一对一Langmuir结合模型通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。以比koff/kon计算平衡解离常数(KD)。
对所有抗体(包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗以及三种包含亲和力成熟的帕妥珠单抗HC，曲妥珠单抗HC，和CLC“帕妥珠单抗(曲.L3)(QM)”的双特异性Herceptarg构建物)测试了对两种Her2敲除变体的结合。如预期的，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗均以预期亲和力结合它们的相应Her2表位。对它们的对应敲除变体的结合得到消除(图24)。这些结果证明了Her2敲除表位变体的使用容许剖析双特异性抗体的结合及分析两种特异性的个别亲和力。
每种Herceptarg克隆变体的个别KD值的测定揭示了恒定的对曲妥珠单抗表位的结合亲和力，在0.6至1.8nM的预期范围中。与之对比，对帕妥珠单抗表位的结合依赖于亲和力成熟的帕妥珠单抗HC。在三种Herceptarg克隆变体中，发现克隆“D1-der”具有最高的亲和力(0.16nM)。热力学数据的汇总显示于表25。总而言之，此实验确认了我们有能力生成具有CLC且对曲妥珠单抗和帕妥珠单抗表位特异性的双特异性抗体。
Herceptarg克隆变体对KPL-4细胞的结合分析
收获KPL-4细胞，并在FACS缓冲液中重悬浮。在96孔圆底板中接种0.2Mio细胞。将板以400g离心3分钟以使细胞成团粒。去除上清液，并在40μl稀释的抗体中重悬浮细胞。将板于4℃温育30分钟以容许抗体结合。为了去除未结合的抗体，再次离心细胞，并用FACS缓冲液清洗两次。为了检测抗体，在12μl稀释的山羊抗人Fc特异性FITC标记的二抗(JacksonImmunoResearch#109-096-098)中重悬浮细胞，并再次于4℃温育30分钟。此后，用FACS缓冲液清洗细胞两次，在200μl FACS缓冲液中重悬浮，并用BD CantoII测量荧光。结果显示于图25。
表25：亲和力成熟帕妥珠单抗克隆变体与CLC组合的选定双特异性抗体的亲和力
Figure BDA0002619651350001071
Figure BDA0002619651350001081
表26：多种细胞类型的增殖抑制(IC50值及置信区间)
Figure BDA0002619651350001082
由Herceptarg结合变体介导的增殖抑制
收获靶细胞，清洗，在RPMI 1640(Gibco)+10％FCS+1％GlutaMAXTM(Gibco)中重悬浮，并以5x 103个细胞/孔的浓度在板中分配。将细胞在细胞温箱中温育4小时，之后添加相应抗体稀释液。在细胞温箱中将板温和摇动并温育5天。将板平衡至室温，并将100μl/孔新鲜制备的CellTiter Glo(Promega)底物添加至每个孔。在Wallac Victor3 1420多重标记物计数器中测量发光。结果显示于表26和图26a)-26c)。
Herceptarg克隆介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
收获靶细胞，清洗，在AIM
Figure BDA0002619651350001084
培养基(Life Technologies)中重悬浮，并以3x 104个细胞/孔的浓度在板中分配。将相应抗体稀释液一式三份添加至细胞，并温育10分钟，之后添加至效应细胞(外周血单个核效应细胞[PBMC])。然后将效应细胞(E)和靶细胞(T)以所述E∶T比于37℃温育所述时间(所有样品一式三份)。使用LDH细胞毒性检测试剂盒(RocheApplied Science)测量乳酸脱氢酶(LDH)释放。使用下面的公式计算ADCC：
Figure BDA0002619651350001083
将自发释放(对应于在没有抗体的情况下与效应细胞一起温育的靶细胞)定义为0％细胞毒性，并将最大释放(用1％Triton X-100裂解的靶细胞)定义为100％细胞毒性。计算每项实验的一式三份的ADCC平均百分比和标准偏差。结果显示于图27a)-27b)。
表27：前导肽
SEQ ID 蛋白质序列
155 MDWTWRILFLVAAATGAHS
156 MDMRVPAQLLGLLLLWFPGARC
157 MGWSCIILFLVATATGVHS
实施例15：增殖测定法
在96孔平底板中在RPMI/10％FCS中培养1x 104个BT-474细胞/孔。24小时后，去除生长培养基，并添加滴定量的所述抗体(在培养基中预混合)至终体积100μl。
为了测定培养物中可存活细胞的数目，通过量化存在的ATP水平(作为有代谢活性的细胞的指标)来实施CellTiter-Glo发光细胞存活力测定法。如此，在培养6天后，将100μlCellTiter-Glo试剂混合物(Promega，产品目录号#G7571)添加至细胞，摇动2分钟，之后将75μl裂解物转移至另一96孔平底滴定板(Costar，产品目录号#3917)。再次混合后，使用Tecan Infinite Reader依照制造商的说明书评估发光。
结果显示于表28和图28。
在增殖测定法中显示了双特异性Her2抗体比单独的或组合的帕妥珠单抗或曲妥珠单抗更加有力地抑制BT-474细胞增殖。测试了下述双特异性Her2抗体：“Herceptarg CLCD1-der wt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“Herceptarg CrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
表28：IC50 BT474增殖测定法
Figure BDA0002619651350001091
实施例16：C1q FACS结合测定法
将3x 105个BT-474细胞与10μg/ml所述抗体一起在冰上温育。测试了下述双特异性Her2抗体：“Herceptarg CLC D1-der wt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“Herceptarg CrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
30分钟后，添加10μg/ml C1q(Sigma，C1740)，并再温育20分钟。清洗后，用商品化PE标记的抗C1q抗体(Cedarlane，CL7611PE-SP)对细胞复染色。再温育(30分钟，冰)后，清洗细胞两次，并在FACS Canto II上分析。
结果显示于图29和表29。此C1q测定法说明重组补体因子C1q对BT-474细胞上不同Her抗体的结合。显示了用曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合处理导致最高的C1q结合，接着是两种CLC双特异性Her2抗体。用Crossmab处理导致略微升高的C1q结合。
表29：C1q结合测定法
抗体/抗体 PE信号(几何均值)
曲妥珠单抗 282
帕妥珠单抗 344
曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合 2157
双特异性抗HER2抗体，共同轻链 1439
双特异性抗HER2抗体，共同轻链，糖工程化 1036
双特异性抗HER2抗体，CrossMab型式 489
实施例17：使用幼家兔补体(BRC)的LDH测定法
在96孔平底细胞培养板(NUNC，100μL/孔)上以10,000个细胞/孔接种CHO-K1Nxre19细胞(经IL15R转染的CHO-K1)，并培养过夜。添加IL15-Fc融合多肽(25μL/孔，5倍终浓度)，并温育1小时。此后，用1mL Aqua bidest重建一管幼家兔补体(Cedarlane，产品目录号CL3441)。用培养基稀释补体溶液，并将25μL添加至孔。4小时后，将板以200g离心，并将100μL/孔转移至另一96孔平底板。此后，添加100μL LDH反应混合物(细胞毒性检测试剂盒，Roche Diagnostic GmbH，Mannheim，Germany)。于37℃温育20分钟后，在Tecan SunriseReader上于492/690nm测量光密度(OD)。
表30：使用BRC的LDH测定法
Figure BDA0002619651350001101
Figure BDA0002619651350001111
可见，BRC具有低背景毒性且显示剂量依赖性补体毒性。
实施例18：BT-474细胞上的CDC(补体依赖性细胞毒性)激活(LDH释放)
将1x 104个细胞/孔与10μg/ml所述抗体一起在150μl中于37℃温育30分钟。测试了下述双特异性Her2抗体：“Herceptarg CLC D1-der wt”：SEQ ID NO64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“HerceptargCrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
然后添加50μl幼家兔补体(Cedarlane，产品目录号CL3441，批号6312)，并再温育2小时。然后，转移上清液(s/n)，并与50μl LDH反应混合物(Roche)混合，并在再温育15分钟后在Tecan Sunrise Reader上分析490/620nm处的消光(Ex.)。如下计算对BT-474细胞的特异性抗体依赖性毒性(n＝4的均值+/-SD)：
Figure BDA0002619651350001112
结果显示于图30。
此CDC测定法显示LDH释放，作为在幼家兔补体存在下用不同抗Her2抗体(型式，组合)处理后正在死去的/死的细胞的标志物。
在这里，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合导致CDC的显著诱导，而单独的亲本抗体不然。令人惊讶的是，两种CLC Herceptarg变体均激起甚至卓越的CDC效应，而HerceptargCrossmab处理导致不如亲本抗体的组合有效的CDC反应。
实施例19：CDC(补体依赖性细胞毒性)介导的BT-474细胞杀伤(ACEA)
在96孔E板(ACEA Biosciences Inc.)上接种1x 104个BT-474细胞/孔，并在Xcelligence装置中生长过夜。去除生长培养基，并用无血清AIM-V培养基(Gibco)清洗细胞一次。添加50μl/孔AIM-V培养基和50μl AIM-V中的抗体(3倍终浓度)，并温育20分钟。添加50μl幼家兔补体(Cedarlane)，并每5分钟测量细胞指数(CI；代表细胞的存活力)(见曲线)。测试了下述双特异性Her2抗体：“Herceptarg CLC D1-der wt”：SEQ ID NO 64，54，92，“Herceptarg CLC D1-der G2”：SEQ ID NO 64，54，92(糖工程化变体)，“HerceptargCrossMab”：SEQ ID NO 109，110，111，112。
依照下面的公式计算特异性CDC，其中CI是标准化的细胞指数：
Figure BDA0002619651350001121
在两个代表性时间点(起始反应后1小时和2小时)，计算特异性裂解(＝CDC诱导的细胞死亡)，并显示于图表中(n＝4的均值+/-SEM)。
结果显示于图31a)-31b)和表31。此CDC测定法说明细胞指数的变化，作为在幼家兔补体存在下用不同抗Her2抗体(型式，组合)处理后正在死去的/死的细胞的标志物：在这里，曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合导致CDC的显著诱导，而单独的亲本抗体不然。令人惊讶的是，两种CLC Herceptarg变体均激起甚至卓越的CDC效应，而Herceptarg Crossmab处理导致不如亲本抗体的组合有效的CDC反应。
Herceptarg CLC D1-der的卓越性的一个可能原因可能是略微更高的对曲妥珠单抗表位的亲和力以及显著更高的对帕妥珠单抗表位的亲和力(还见表25)。
表31：CDC(补体依赖性细胞毒性)介导的BT-474细胞杀伤(ACEA)
Figure BDA0002619651350001122
实施例20：小鼠异种移植物研究
细胞系KPL4
这种人乳腺癌细胞系是自具有炎性皮肤转移的乳腺癌患者的恶性胸腔积液建立的。细胞是由J.Kurebayashi教授(Kawasaki Medical School，Kurashiki，Japan)提供的。在补充有10％胎牛血清(PAN Biotech，Germany)和2mM L-谷氨酰胺(PAN Biotech，Germany)的DMEM培养基(PAN Biotech，Germany)中于37℃在5％CO2的水饱和气氛中例行培养肿瘤细胞。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)实施培养传代，一周拆分两次。使用细胞传代P6进行体内研究。
小鼠
依照国际指导方针(GV-Solas；Felasa；TierschG)，在无特定病原体的条件下维持雌性SCID米色(C.B.-17)小鼠；年龄10-12周；体重18-20g(Charles River Germany，Sulzfeld)；体重＞20g，日周期12小时光亮/12小时黑暗。到达后，将动物在动物房的检疫部分中收容1周以适应新环境及进行观察。规则地进行连续健康监测。随意提供食物(Alltromin)和水。实验研究得到了当地政府审查和批准。
肿瘤细胞注射
在注射那天，自培养瓶(Greiner TriFlask)收获(胰蛋白酶-EDTA)肿瘤细胞，并转移入50ml培养基中，在PBS中清洗一次并重悬浮。再次用PBS清洗并过滤(细胞滤网；Falcon
Figure BDA0002619651350001132
)后，将最终的细胞滴度调节至1.5x 108/ml。用移液器小心混合肿瘤细胞悬浮液以避免细胞聚集。在封闭循环系统中用预培养室(树脂玻璃)，单独小鼠鼻罩(硅)和非易燃或易爆麻醉化合物异氟烷(Pharmacia-Upjohn，Germany)使用用于小型动物的Stephens吸入单元实施麻醉。注射前2天，对SCID米色小鼠除毛，并以20μl体积(使用Hamilton微升注射器和30Gx1/2″针)同位注射KPL-4细胞(3x 106个细胞)入每只麻醉小鼠的倒数第二个右侧腹股沟乳房脂肪垫中。经由乳头下的皮肤注射细胞悬浮液。
监测
每天管理动物，检测不良作用的临床症状。对于贯穿实验的监测，一周两次记录动物的体重，并一周两次用测径器测量肿瘤体积。依照NCI方案(肿瘤体积＝1/2ab2，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长和短直径)计算肿瘤体积。终止标准是关键肿瘤块(高至1.7g或
Figure BDA0002619651350001131
)，体重自基线损失超过20％，肿瘤溃疡或较差的动物整体状况。动物的研究排除标准在对应的“Tierversuchsanzeige”中描述并得到批准。
处理
将小鼠针对80mm3肿瘤体积随机化，随后一周一次以10ml/kg体积腹膜内处理。对于组合治疗，先给予Herceptin，24小时后给予Perjeta。
测试下述双特异性Her2抗体：Herceptarg CLC-D1-der：SEQ ID NO 64，54，92。结果显示于图32。
Figure BDA0002619651350001141
表32：帕妥珠单抗和曲妥珠单抗的亲本序列
Figure BDA0002619651350001142
Figure BDA0002619651350001151
表33：具有共同轻链的抗体的序列
Figure BDA0002619651350001161
Figure BDA0002619651350001171
Figure BDA0002619651350001181
Figure BDA0002619651350001191
Figure BDA0002619651350001201
Figure BDA0002619651350001211
Figure BDA0002619651350001221
Figure BDA0002619651350001231
Figure BDA0002619651350001241
表34：抗原
Figure BDA0002619651350001242
Figure BDA0002619651350001251
Figure BDA0002619651350001261
Figure BDA0002619651350001271
Figure BDA0002619651350001281
Figure BDA0002619651350001291
Figure BDA0002619651350001301
表35：共同轻链抗体“D1 der”的全长抗体序列
Figure BDA0002619651350001302
Figure BDA0002619651350001311
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann - La Roche AG）
<120> 双特异性HER2抗体及使用方法
<130> 31865 WO
<160> 164
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2 ECD DNA
<400> 1
acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60
ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120
acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180
tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240
cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300
ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360
cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420
taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480
ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540
cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600
ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660
ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720
atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780
cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840
tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900
acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960
tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020
gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080
ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140
ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200
agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260
ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320
agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380
gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440
gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500
ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560
gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620
tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680
cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740
ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800
tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860
cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacgaac agttatattt tcagggcggc 1920
tcaggcctga acgacatctt cgaggcccag aagatcgagt ggcacgaggc tcgagctcac 1980
caccatcacc atcac 1995
<210> 2
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HER2 ECD
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu
20 25 30
Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln
35 40 45
Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr
50 55 60
Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr
65 70 75 80
Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu
85 90 95
Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala
100 105 110
Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly
115 120 125
Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu
130 135 140
Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu
165 170 175
Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys
180 185 190
Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp
195 200 205
Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys
210 215 220
Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly
225 230 235 240
Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn
245 250 255
His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn
260 265 270
Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe
275 280 285
Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp
290 295 300
Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr
305 310 315 320
Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala
325 330 335
Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala
340 345 350
Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe
355 360 365
Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser
370 375 380
Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu
385 390 395 400
Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu
405 410 415
Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile
420 425 430
Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser
435 440 445
Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu
450 455 460
Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp
465 470 475 480
Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg
485 490 495
Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys
500 505 510
Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys
515 520 525
Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu
530 535 540
Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys
545 550 555 560
His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu
565 570 575
Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe
580 585 590
Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met
595 600 605
Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro
610 615 620
Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro
625 630 635 640
Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Glu Gln Leu Tyr Phe
645 650 655
Gln Gly Gly Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu
660 665 670
Trp His Glu Ala Arg Ala His His His His His His
675 680
<210> 3
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(穴)DNA
<400> 3
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctctcgtg cgcagtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt gagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accgcttcac gcagaagagc 660
ctctccctgt ctccgggtaa a 681
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc(穴)
<400> 4
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 5
<211> 2670
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 ECD-Fc(节)DNA
<400> 5
acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60
ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120
acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180
tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240
cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300
ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360
cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420
taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480
ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540
cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600
ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660
ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720
atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgtt tgagtccatg 780
cccaatcccg agggccggta tacattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840
tacctttcta cggacgtggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctgcacaa ccaagaggtg 900
acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960
tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020
gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080
ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140
ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200
agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260
ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320
agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380
gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440
gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500
ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560
gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620
tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680
cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740
ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800
tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860
cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacggtg gtagtccgac acctccgaca 1920
cccgggggtg gttctgcaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1980
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2040
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2100
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2160
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2220
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2280
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 2340
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 2400
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2460
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag 2520
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2580
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc 2640
ttcgaggccc agaagattga atggcacgag 2670
<210> 6
<211> 890
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 ECD-Fc(节)
<400> 6
Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys Leu Arg Leu Pro Ala Ser
1 5 10 15
Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His Leu Tyr Gln Gly Cys Gln
20 25 30
Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr Leu Pro Thr Asn Ala Ser
35 40 45
Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val Gln Gly Tyr Val Leu Ile
50 55 60
Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu Gln Arg Leu Arg Ile Val
65 70 75 80
Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr Ala Leu Ala Val Leu Asp
85 90 95
Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro Val Thr Gly Ala Ser Pro
100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln Leu Cys Tyr Gln Asp Thr
130 135 140
Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn Asn Gln Leu Ala Leu Thr
145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser Ser Glu Asp Cys Gln Ser
180 185 190
Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys Ala Arg Cys Lys Gly Pro
195 200 205
Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly
210 215 220
Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu His Phe Asn His Ser Gly
225 230 235 240
Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
245 250 255
Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ser
260 265 270
Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu Ser Thr Asp Val Gly Ser
275 280 285
Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln Glu Val Thr Ala Glu Asp
290 295 300
Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys Pro Cys Ala Arg Val Cys
305 310 315 320
Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu Val Arg Ala Val Thr Ser
325 330 335
Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys Lys Ile Phe Gly Ser Leu
340 345 350
Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp Pro Ala Ser Asn Thr Ala
355 360 365
Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe Glu Thr Leu Glu Glu Ile
370 375 380
Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro Asp Ser Leu Pro Asp Leu
385 390 395 400
Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg Gly Arg Ile Leu His Asn
405 410 415
Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu Gly Ile Ser Trp Leu Gly
420 425 430
Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly Leu Ala Leu Ile His His
435 440 445
Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val Pro Trp Asp Gln Leu Phe
450 455 460
Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr Ala Asn Arg Pro Glu Asp
465 470 475 480
Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His Gln Leu Cys Ala Arg Gly
485 490 495
His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys Val Asn Cys Ser Gln Phe
500 505 510
Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys Arg Val Leu Gln Gly Leu
515 520 525
Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys Leu Pro Cys His Pro Glu
530 535 540
Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys Phe Gly Leu Glu Ala Asp
545 550 555 560
Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp Pro Pro Phe Cys Val Ala
565 570 575
Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu Ser Tyr Met Pro Ile Trp
580 585 590
Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln Pro Cys Pro Ile Asn Cys
595 600 605
Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys Gly Cys Pro Ala Glu Gln
610 615 620
Arg Ala Ser Pro Leu Thr Val Asp Gly Gly Ser Pro Thr Pro Pro Thr
625 630 635 640
Pro Gly Gly Gly Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
645 650 655
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
660 665 670
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
675 680 685
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
690 695 700
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
705 710 715 720
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
725 730 735
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
740 745 750
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
755 760 765
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu
770 775 780
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
785 790 795 800
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
805 810 815
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
820 825 830
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
835 840 845
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
850 855 860
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Ser Gly Gly Leu Asn Asp Ile
865 870 875 880
Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu
885 890
<210> 7
<211> 2670
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 ECD(帕妥珠单抗KO)-Fc(节)DNA
<400> 7
acccaagtgt gcaccggcac agacatgaag ctgcggctcc ctgccagtcc cgagacccac 60
ctggacatgc tccgccacct ctaccagggc tgccaggtgg tgcagggaaa cctggaactc 120
acctacctgc ccaccaatgc cagcctgtcc ttcctgcagg atatccagga ggtgcagggc 180
tacgtgctca tcgctcacaa ccaagtgagg caggtcccac tgcagaggct gcggattgtg 240
cgaggcaccc agctctttga ggacaactat gccctggccg tgctagacaa tggagacccg 300
ctgaacaata ccacccctgt cacaggggcc tccccaggag gcctgcggga gctgcagctt 360
cgaagcctca cagagatctt gaaaggaggg gtcttgatcc agcggaaccc ccagctctgc 420
taccaggaca cgattttgtg gaaggacatc ttccacaaga acaaccagct ggctctcaca 480
ctgatagaca ccaaccgctc tcgggcctgc cacccctgtt ctccgatgtg taagggctcc 540
cgctgctggg gagagagttc tgaggattgt cagagcctga cgcgcactgt ctgtgccggt 600
ggctgtgccc gctgcaaggg gccactgccc actgactgct gccatgagca gtgtgctgcc 660
ggctgcacgg gccccaagca ctctgactgc ctggcctgcc tccacttcaa ccacagtggc 720
atctgtgagc tgcactgccc agccctggtc acctacaaca cagacacgcg ggagtccatg 780
cccaatcccg agggccggta tagattcggc gccagctgtg tgactgcctg tccctacaac 840
tacctttcta cggaccgggg atcctgcacc ctcgtctgcc ccctggccaa ccaagaggtg 900
acagcagagg atggaacaca gcggtgtgag aagtgcagca agccctgtgc ccgagtgtgc 960
tatggtctgg gcatggagca cttgcgagag gtgagggcag ttaccagtgc caatatccag 1020
gagtttgctg gctgcaagaa gatctttggg agcctggcat ttctgccgga gagctttgat 1080
ggggacccag cctccaacac tgccccgctc cagccagagc agctccaagt gtttgagact 1140
ctggaagaga tcacaggtta cctatacatc tcagcatggc cggacagcct gcctgacctc 1200
agcgtcttcc agaacctgca agtaatccgg ggacgaattc tgcacaatgg cgcctactcg 1260
ctgaccctgc aagggctggg catcagctgg ctggggctgc gctcactgag ggaactgggc 1320
agtggactgg ccctcatcca ccataacacc cacctctgct tcgtgcacac ggtgccctgg 1380
gaccagctct ttcggaaccc gcaccaagct ctgctccaca ctgccaaccg gccagaggac 1440
gagtgtgtgg gcgagggcct ggcctgccac cagctgtgcg cccgagggca ctgctggggt 1500
ccagggccca cccagtgtgt caactgcagc cagttccttc ggggccagga gtgcgtggag 1560
gaatgccgag tactgcaggg gctccccagg gagtatgtga atgccaggca ctgtttgccg 1620
tgccaccctg agtgtcagcc ccagaatggc tcagtgacct gttttggact ggaggctgac 1680
cagtgtgtgg cctgtgccca ctataaggac cctcccttct gcgtggcccg ctgccccagc 1740
ggtgtgaaac ctgacctctc ctacatgccc atctggaagt ttccagatga ggagggcgca 1800
tgccagcctt gccccatcaa ctgcacccac tcctgtgtgg acctggatga caagggctgc 1860
cccgccgagc agagagccag ccctctgacg gtcgacggtg gtagtccgac acctccgaca 1920
cccgggggtg gttctgcaga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1980
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 2040
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 2100
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 2160
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 2220
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 2280
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc 2340
cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc 2400
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agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2580
cactacacgc agaagagcct ctccctgtct ccgggtaaat ccggaggcct gaacgacatc 2640
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<210> 8
<211> 890
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 ECD(帕妥珠单抗KO)-Fc(节)
<400> 8
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser Leu Thr Glu Ile Leu Lys
115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys His Pro Cys Ser Pro Met
165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val Thr Tyr Asn Thr Asp Thr
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> Her2 ECD(曲妥珠单抗KO)-Fc(节)DNA
<400> 9
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gtgaaacctg acctctccta catgcccatc tggaagtttc cagatgagga gggcgcatgc 1800
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atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatgccgg 2340
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg tggtgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 2400
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gaggcccaga agattgaatg gcacgag 2667
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Her2 ECD(曲妥珠单抗KO)-Fc(节)
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<220>
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ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 24
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗wt VL(10290)
<400> 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3)(10403)DNA
<400> 25
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3)(10403)
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.H91)(10404)DNA
<400> 27
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacacagg cgtgcccagc 180
cggttcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacatct acccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.H91)(10404)
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗wt VH CDR2
<400> 29
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗wt VH CDR3
<400> 30
Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 31
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) K24R(10949)DNA
<400> 31
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgcc gggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) K24R(10949)
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL(曲.L3) S30N (10950)DNA
<400> 33
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgaac atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL(曲.L3) S30N (10950)
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) I31T (10951)DNA
<400> 35
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc accggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) I31T (10951)
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) I31V (10952)DNA
<400> 37
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc gtcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) I31V
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Val Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) G32A(10953)DNA
<400> 39
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcgccgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL (曲.L3) G32A(10953)
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL(曲.L3) Y53F(10954)DNA
<400> 41
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VL(曲.L3) Y53F(10954)
<400> 42
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 43
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) R54L(10955)DNA
<400> 43
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc tgtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) R54L(10955)
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) T56S(10956)DNA
<400> 45
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacagcgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) T56S(10956)
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) G66R(10957)DNA
<400> 47
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagccgctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) G66R(10957)
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 320
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) T94Y(10958)DNA
<400> 49
acatccagat gacccagagc cccagcagcc tgagcgccag cgtgggcgac agagtgacca 60
tcacatgcaa ggccagccag gacgtgtcca tcggcgtggc ctggtatcag cagaagcccg 120
gcaaggcccc caagctgctg atctacagcg ccagctaccg gtacaccggc gtgcccagca 180
gattcagcgg cagcggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc ctgcagcccg 240
aggacttcgc cacctactac tgccagcagc actacaccta cccccccacc ttcggccagg 300
gcaccaaggt ggaaatcaag 320
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) T94Y(10958)
<400> 50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Tyr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 51
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) P96Y(10959)DNA
<400> 51
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc atcggcgtgg cctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccctacac cttcggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) P96Y(10959)
<400> 52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) (QM) (11055)DNA
<400> 53
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc acagccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac atttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa g 321
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) (QM) (11055)
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1衍生的VH CDR1
<400> 55
Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr Thr Met Asp
1 5 10
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1衍生的VH CDR3
<400> 56
Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆B2- VH CDR3
<400> 57
Asn Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆E1- VH CDR1
<400> 58
Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr Thr Met Asp
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆E1- VH CDR3
<400> 59
Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆G2- VH CDR2
<400> 60
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Tyr Ile Val Asn Arg Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1 DNA
<400> 61
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180
aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300
ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 62
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1
<400> 62
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 63
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1衍生的DNA
<400> 63
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcattgtt 180
aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300
ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 64
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1衍生的
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 65
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆B2 DNA
<400> 65
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattggtt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180
aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300
ggtccgaact tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 66
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆B2
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Asn Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆E1 DNA
<400> 67
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttgca gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcatttat 180
aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300
ggtccgtggt tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 68
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆E1
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 69
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆G2 DNA
<400> 69
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttacattgtt 180
aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300
ggtccgagct tctattttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 70
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆G2
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Tyr Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 71
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆C8 DNA
<400> 71
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttctattatg 180
aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300
ggtccgagct tctattttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 72
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆C8
<400> 72
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 73
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆A1 DNA
<400> 73
gaggtgcaat tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttacc gattacacaa tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga actctggtgg ttctattgtt 180
aaccagcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaatctg 300
ggtccgtggt tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagc 357
<210> 74
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆A1
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Trp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆C8- VH CDR2
<400> 75
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Met Asn Arg Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆A1- VH CDR2
<400> 76
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Gln Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗亲和力成熟克隆D1衍生的VH CDR2
<400> 77
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98N)(6636)CDR3
<400> 78
Trp Gly Gly Asn Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 79
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98E)(6637)CDR3
<400> 79
Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 80
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98T)(6638)CDR3
<400> 80
Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL(4245)DNA
<400> 81
gacatccaga tgacccagag cccaagctct ctgtctgcct ctgtgggcga cagagtgacc 60
atcacctgca gagccagcca ggacgtgaac acagccgtgg cctggtatca gcagaagcca 120
ggcaaggccc caaagctgct gatctacagc gccagcttcc tgtacagcgg cgtgccaagc 180
agattcagcg gcagcagaag cggcacagac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagcca 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccaccaac cttcggacag 300
ggcaccaagg tggagatcaa g 321
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL(4245)
<400> 82
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31A (6641)DNA
<400> 83
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacgtgaac gccgctgtag cgtggtacca gcagaaacca 120
ggtaaggcac cgaagctatt aatttatagt gcgagcttcc tgtacagtgg ggtcccgtcg 180
cgttttagcg gctctcgatc cggcacggat tttaccctga ccattagcag cctgcagcct 240
gaagactttg cgacatatta ttgccaacag cactacacaa ctcctcccac ctttggccag 300
ggtacgaaag ttgaaattaa a 321
<210> 84
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31A (6641)
<400> 84
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Ala Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31V (6642)DNA
<400> 85
gatatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcaagtca ggacgtgaac gtggctgtag cgtggtacca gcagaaacca 120
ggtaaggcac cgaagctatt aatttatagt gcgagcttcc tgtacagtgg ggtcccgtcg 180
cgttttagcg gctctcgatc cggcacggat tttaccctga ccattagcag cctgcagcct 240
gaagactttg cgacatatta ttgccaacag cactacacaa ctcctcccac ctttggccag 300
ggtacgaaag ttgaaattaa ag 322
<210> 86
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31V (6642)
<400> 86
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99A)(6639)CDR3
<400> 87
Trp Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 88
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99S)(6640)CDR3
<400> 88
Trp Gly Gly Asp Ser Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) (QM)-CDR1
<400> 89
Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗(曲.L3) (QM)-CDR2
<400> 90
Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr
1 5
<210> 91
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (11345)DNA
<400> 91
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggagacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
<210> 92
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (11345)
<400> 92
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 93
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98N)(6636)DNA
<400> 93
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggaaacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
<210> 94
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98N)(6636)
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asn Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98E)(6637)DNA
<400> 95
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggagaggggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98E)(6637)
<400> 96
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98T)(6638)DNA
<400> 97
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggaaccgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98T)(6638)
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Thr Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
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<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99A)(6639)DNA
<400> 99
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggagacgcct tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
<210> 100
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99A)(6639)
<400> 100
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 101
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99S)(6640)DNA
<400> 101
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggagacagct tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
<210> 102
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (G99S)(6640)
<400> 102
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Ser Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 103
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31A (6641)CDR1
<400> 103
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Ala Ala Val Ala
1 5 10
<210> 104
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL T31V (6642)CDR1
<400> 104
Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala Val Ala
1 5 10
<210> 105
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG VH (D98ECDRG)
<400> 105
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG VL (N30TCDRG)
<400> 106
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg
100 105
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG VL CDR1
<400> 107
Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG VH CDR2
<400> 108
Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 109
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X帕妥珠单抗重链(VHCL)
<400> 109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 110
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链(VLCH1)
<400> 110
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys
210
<210> 111
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG 重链(VHCH1)
<400> 111
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 112
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CDRG 轻链(VLCL)
<400> 112
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
35 40 45
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 113
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗wt CL
<400> 113
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 114
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗wt CH1
<400> 114
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val
<210> 115
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CH1
<400> 115
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
100 105
<210> 116
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗CL
<400> 116
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1 5 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35 40 45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 117
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VH (D98E)
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 118
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL (T31V)
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 119
<211> 453
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗重链
<400> 119
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val
130 135 140
Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp
145 150 155 160
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
165 170 175
Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr
180 185 190
Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val
195 200 205
Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly
210 215 220
Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210> 120
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链
<400> 120
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 121
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X曲妥珠单抗重链
<400> 121
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 122
<211> 212
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> X曲妥珠单抗轻链
<400> 122
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ala Ser Thr
100 105 110
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
130 135 140
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
145 150 155 160
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys
180 185 190
Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu
195 200 205
Pro Lys Ser Cys
210
<210> 123
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链(卡帕) [曲妥珠单抗1016]
<400> 123
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 124
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链[曲妥珠单抗+ scFv Omnitarg RB40]
<400> 124
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
465 470 475 480
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp
485 490 495
Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp
500 505 510
Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg
515 520 525
Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu
530 535 540
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
545 550 555 560
Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
565 570 575
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
595 600 605
Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr
610 615 620
Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr
625 630 635 640
Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser
645 650 655
Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
660 665 670
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
675 680 685
Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys
690 695 700
Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
705 710
<210> 125
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链[scFv 曲妥珠单抗+ Omnitarg RB34]
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr
165 170 175
Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile
180 185 190
Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu
195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp
210 215 220
Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
260 265 270
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile
275 280 285
Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
290 295 300
Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
305 310 315 320
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
325 330 335
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro
340 345 350
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
355 360 365
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
370 375 380
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
385 390 395 400
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
405 410 415
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
420 425 430
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
435 440 445
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
450 455 460
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
465 470
<210> 126
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链(Omnitarg RB33)
<400> 126
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 127
<211> 470
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链[曲妥珠单抗+ scFv Omnitarg RB35]
<400> 127
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
225 230 235 240
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln
245 250 255
Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
260 265 270
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro
275 280 285
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
290 295 300
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
305 310 315 320
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
325 330 335
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
340 345 350
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
355 360 365
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr
370 375 380
Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
385 390 395 400
Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys
405 410 415
Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
420 425 430
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
435 440 445
Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
450 455 460
Leu Val Thr Val Ser Ser
465 470
<210> 128
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链[曲妥珠单抗1036]
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 129
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链(卡帕) [曲妥珠单抗1016]
<400> 129
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 130
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链[曲妥珠单抗+ scFv Omnitarg RB43]
<400> 130
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
465 470 475 480
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile
485 490 495
Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly
565 570 575
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
580 585 590
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
595 600 605
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
610 615 620
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val
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Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
645 650 655
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
660 665 670
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
675 680 685
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
690 695 700
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
705 710
<210> 131
<211> 480
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链[曲妥珠单抗+ scFv Omnitarg RB61]
<400> 131
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
225 230 235 240
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
245 250 255
Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg
275 280 285
Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
290 295 300
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Cys Gly Thr
325 330 335
Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
340 345 350
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
355 360 365
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
370 375 380
Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp Trp Val Arg Gln
385 390 395 400
Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser
405 410 415
Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser
420 425 430
Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
435 440 445
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser
450 455 460
Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
465 470 475 480
<210> 132
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链[曲妥珠单抗1036]
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 133
<211> 696
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFab 曲妥珠单抗重链1
<400> 133
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Val Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
245 250 255
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
260 265 270
Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
275 280 285
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr
290 295 300
Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr
305 310 315 320
Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
325 330 335
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Glu Gly Phe Tyr Ala
340 345 350
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
355 360 365
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
370 375 380
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
385 390 395 400
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
405 410 415
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
420 425 430
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
435 440 445
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val
450 455 460
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
465 470 475 480
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
485 490 495
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
500 505 510
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
515 520 525
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
530 535 540
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
545 550 555 560
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
565 570 575
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
580 585 590
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr
595 600 605
Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
610 615 620
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
625 630 635 640
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
645 650 655
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
660 665 670
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
675 680 685
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695
<210> 134
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗重链2
<400> 134
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链1
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 136
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗重链1
<400> 136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
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290 295 300
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
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Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 137
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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65 70 75 80
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
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195 200 205
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
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340 345 350
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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660 665 670
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675 680 685
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
690 695
<210> 140
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗重链2
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Gly Lys
450
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗轻链2
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Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu
210
<210> 142
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗重链1
<400> 142
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 曲妥珠单抗轻链1
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<210> 144
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFab 帕妥珠单抗重链2
<400> 144
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
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225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
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305 310 315 320
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370 375 380
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385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
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Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
485 490 495
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile
500 505 510
Gly Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
515 520 525
Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
530 535 540
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
545 550 555 560
Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro
565 570 575
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
580 585 590
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
595 600 605
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
610 615 620
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
625 630 635 640
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
645 650 655
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
660 665 670
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
675 680 685
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
690 695
<210> 145
<211> 701
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv 曲妥珠单抗用二硫键稳定化的重链
<400> 145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
450 455 460
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
465 470 475 480
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val
485 490 495
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro
500 505 510
Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
515 520 525
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
530 535 540
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly
545 550 555 560
Glu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Cys Gly Thr Leu Val Thr
565 570 575
Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
580 585 590
Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
595 600 605
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn
610 615 620
Val Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Cys Pro Lys Leu
625 630 635 640
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
645 650 655
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
660 665 670
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr
675 680 685
Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
690 695 700
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗轻链
<400> 146
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 147
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LMB3
<400> 147
caggaaacag ctatgaccat gattac 26
<210> 148
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AM_omni_H1_TN-ba
<400> 148
ccggtgcctg acgaacccaa tccataaagg taaaaccgct tgctgcacag ctc 53
<210> 149
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RJH108 (omni_3H1_fo)
<400> 149
atggattggg ttcgtcaggc accgggtaaa gg 32
<210> 150
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RJH109 (omni_5H3_re)
<400> 150
attacgtgca caataataca ctgcggtatc ctc 33
<210> 151
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AM_omni_H3_TN_fo
<400> 151
taccgcagtg tattattgtg cacgtttctt tgattattgg ggtcagggca ccctggttac 60
<210> 152
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RJH99
<400> 152
ggctgagact cctcaagaga aggattag 28
<210> 153
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RJH110(omni_5H2_ba)
<400> 153
attaacatct gcaacccatt ccagaccttt ac 32
<210> 154
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AM_omni_h2_TN_fo
<400> 154
ggtctggaat gggttgcaga tgttaatggt attaaccgtt ttaaaggtcg ttttaccctg 60
ag 62
<210> 155
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导肽
<400> 155
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 156
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导肽
<400> 156
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys
20
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 前导肽
<400> 157
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 158
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VL N30S CDR1
<400> 158
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 159
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VHCH1- Fc 节
<400> 159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 160
<211> 1350
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 曲妥珠单抗VHCH1- Fc 节 DNA
<400> 160
gaagtgcaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cctccggatt taacataaag gacacataca tccactgggt gcgccaagca 120
cctgggaagg gtctcgagtg ggtggctcgg atttacccaa caaatggcta caccaggtat 180
gcggatagcg tgaaaggccg ttttaccatt tcagctgata cttcgaagaa caccgcctat 240
ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgctc gcgttgggga 300
ggagacgggt tctatgctat ggattactgg ggccaaggca ccctggtgac ggttagctca 360
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080
ctgaccaaga accaggtcag cctgtggtgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1350
<210> 161
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同轻链VLCL
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 162
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同轻链VLCL - DNA
<400> 162
gacatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc acagccgtgg cctggtatca gcagaagcct 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagcttcc ggtacaccgg cgtgcccagc 180
agattcagcg gcagcagatc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagctc cctgcagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca ccccccccac atttggccag 300
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gt 642
<210> 163
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VHCH1 Fc 穴
<400> 163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr
20 25 30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Val Asn Arg Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Phe Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser
355 360 365
Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 164
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 帕妥珠单抗VHCH1 Fc 穴 DNA
<400> 164
gaagttcagc tggttgaaag cggtggtggt ctggttcagc ctggtggtag cctgcgtctg 60
agctgtgcag caagcggttt tacctttaac gattatacca tggattgggt tcgtcaggca 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgcagat gttaatccga atagcggtgg tagcattgtt 180
aaccgtcgtt ttaaaggtcg ttttaccctg agcgttgatc gtagcaaaaa taccctgtat 240
ctgcaaatga atagtctgcg tgcagaggat accgcagtgt attattgtgc acgtaacctg 300
ggtccgttct tctactttga ttattggggt cagggcaccc tggttaccgt tagcagcgct 360
agcaccaagg gcccaagcgt gttccctctg gcccccagca gcaagagcac aagcggcgga 420
acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg agcccgtgac agtgtcctgg 480
aacagcggag ccctgaccag cggcgtgcac acctttccag ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtcacagtg cctagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgagctgct gggcggaccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatcagccg gacccccgaa 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caatgccaag accaagcccc gggaggaaca gtacaacagc 900
acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaagag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaggccctg cctgccccca tcgagaaaac catcagcaag 1020
gccaagggcc agcccagaga accccaggtg tgcaccctgc cccccagcag agatgagctg 1080
accaagaacc aggtgtccct gagctgtgcc gtcaagggct tctaccccag cgatatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctggtgtcc aaactgaccg tggacaagag ccggtggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagtccctga gcctgagccc cggcaag 1347

Claims (10)

1.一种特异性结合HER2的双特异性抗体，其包含对HER2胞外域II特异性的第一抗原结合位点和对HER2胞外域IV特异性的第二抗原结合位点，其中该双特异性抗体对HER2胞外域II和IV二者均是单价的。
2.一种药物组合物，其包含权利要求1的双特异性抗体。
3.权利要求1的双特异性抗体，其用于治疗癌症。
4.权利要求1的双特异性抗体，其用作药物。
5.权利要求1的双特异性抗体在制备药物中的用途。
6.一种核酸序列，其包含编码权利要求1的双特异性抗体的重链的序列。
7.一种核酸序列，其包含编码权利要求1的双特异性抗体的轻链的序列。
8.一种表达载体，其包含权利要求6和/或权利要求7的核酸序列。
9.一种原核或真核宿主细胞，其包含依照权利要求8的载体。
10.一种生成抗体的方法，其包括培养权利要求9的宿主细胞，使得该抗体生成。
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