JP2019141066A - 二重特異性her2抗体及び使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一抗原結合部位及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二抗原結合部位を含む、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体に関し、ここで、前記二重特異性抗体は、HER2の細胞外ドメインII及びIVの両方に対して一価である。一実施態様において、二重特異性抗体は、補体依存性細胞傷害(CDC)をペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高度に誘導する。このような一実施態様において、二重特異性抗体の補体依存性細胞傷害は、LDHアッセイ又は補体アッセイによって決定され、同じアッセイによって決定される場合、ペルツズマブとトラスツズマブの組み合わせの補体依存性細胞傷害に対して比較される。一実施態様において、補体依存性細胞傷害は、インビトロで、がん細胞において、好ましくは乳がん細胞において決定される。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合可能な第一Fab分子、
及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合可能な第二Fab分子を含み、ここで、第一Fab分子の可変軽鎖の配列は、第二Fab分子の可変軽鎖の配列と同一である。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、(a)配列番号55、配列番号58及び配列番号14からなる群から選択される重鎖CDR1;配列番号77、配列番号15及び配列番号60からなる群から選択される重鎖CDR2及び配列番号56、配列番号59及び配列番号16からなる群から選択される重鎖CDR3を含む第一重鎖、及び(b)配列番号20の重鎖CDR1、配列番号29の重鎖CDR2及び配列番号30及び配列番号79からなる群から選択される重鎖CDR3を含む第二重鎖;及び(c)第一及び第二軽鎖を含み、ここで、第一及び第二軽鎖の可変軽鎖は、配列番号89、配列番号90及び配列番号19を含む。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号54のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号64、配列番号70及び配列番号68からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、並びに配列番号92及び配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖を含む。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合可能な第一Fab分子、
及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合可能な第二Fab分子を含み、ここで、少なくとも一のFab断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号14の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2及び配列番号16の重鎖CDR3;並びに配列番号11の軽鎖CDR1、配列番号12の軽鎖CDR2及び配列番号13の軽鎖CDR3を含む第一Fab分子、及び配列番号20の重鎖CDR1、配列番号108の重鎖CDR2及び配列番号79の重鎖CDR3;並びに配列番号107の軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む第二Fab分子を含む。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号14の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2及び配列番号16の重鎖CDR3;並びに配列番号11の軽鎖CDR1、配列番号12の軽鎖CDR2及び配列番号13の軽鎖CDR3を含む第一Fab分子、及び配列番号20の重鎖CDR1、配列番号29の重鎖CDR2及び配列番号79、配列番号78、配列番号80、配列番号87、配列番号88からなる群から選択される重鎖CDR3;並びに配列番号104、配列番号103及び配列番号158からなる群から選択される軽鎖CDR1、配列番号18の軽鎖CDR2及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む第二Fab分子を含む。一態様において、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、配列番号22のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号24のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む第一Fab分子、及び配列番号105のアミノ酸配列及び配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む第二Fab分子を含む。
I.定義
開示全体を通して、用語「ErbB2」、「ErbB2受容体」、「c−Erb−B2」及び「HER2」は互換的に使用され、別途指示がない限り、天然配列のErbB2ヒトポリペプチド、又はその機能的誘導体を指す。「ber2」、「erbB2」及び「c−erbB2」は、対応するヒト遺伝子を指す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは、A及びBのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと一致しない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用される全ての%アミノ酸配列同一性値は、直前のパラグラフに記載したように、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。
一態様において、本発明は、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体に基づいています。本発明の抗体は、例えば、がんの治療のために有用である。
本発明の一態様では、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体が提供され、抗体は、HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合する第一の結合部分及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合する第二の結合部分を含む。本発明の発明者らは、驚くべきことに、一価の二重特異性抗体を生成し、ここで両方の結合部分が、腫瘍細胞増殖の阻害の観点で親の単一特異性抗体の有効性を保持し、かつHER2の細胞外ドメインIIに対する増加した親和性を有する共通の軽鎖を共有する。親抗体の両方の結合特性を保持する共通の軽鎖を有する二重特異性分子の生成は、ハイブリッド軽鎖の共通のCDRが、HER2の細胞外ドメインII及びIVの両方に対して結合特異性を保持する必要があるので容易ではない。このいわゆる「共通の軽鎖」原理、即ち、1つの軽鎖を共有するが、依然として別々の特異性を持つ二つのバインダーを組み合わせることの使用により、軽鎖誤対合を防止し、この特定のケースでは親抗体のエピトープ特異性を保持する。その結果、製造時により少ない副生成物を生じ、高収率でHER2二重特異性抗原結合分子の均一な調製を容易にする。ペルツズマブの重鎖は更に最適化され、HER2の細胞外ドメインIIへの親和性の観点からより強力な分子をもたらした。加えて、トラスツズマブ重鎖は、CDR中に特定の変異を導入することによって安定化されている。得られる分子は、親のペルツズマブ及びトラスツズマブである単一特異性抗体よりも優れている。一価共通軽鎖フォーマットの二重特異性HER2抗体は、親抗体の組み合わせと比較して、ペルツズマブエピトープに対する増加した親和性を有し、細胞増殖における優れた阻害効果を示す。
(a)配列番号55の重鎖CDR1;
(b)配列番号77の重鎖CDR2;
(c)配列番号56の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号30の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号14の重鎖CDR1;
(b)配列番号60の重鎖CDR2;
(c)配列番号16の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号30の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号58の重鎖CDR1;
(b)配列番号15の重鎖CDR2;
(c)配列番号59の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号30の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号55の重鎖CDR1;
(b)配列番号77の重鎖CDR2;
(c)配列番号56の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号79の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号14の重鎖CDR1;
(b)配列番号60の重鎖CDR2;
(c)配列番号16の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号79の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号58の重鎖CDR1;
(b)配列番号15の重鎖CDR2;
(c)配列番号59の重鎖CDR3
を含む第一重鎖、
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号79の重鎖CDR3
を含む第二重鎖、及び
(a)配列番号89の軽鎖CDR1;
(b)配列番号90の軽鎖CDR2;
(c)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む第一及び第二軽鎖
を含むHER2の細胞外ドメインII及びIVに特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
本発明の一実施態様では、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体が提供され、抗体は、HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合する第一の結合部分及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合する第二の結合部分を含む。本発明の発明者らは、結合部分の1つが、クロスオーバーFab断片である、第二の一価二重特異性抗体フォーマットを生成した。本発明の一態様では、一価の二重特異性抗体が生成され、ここで、IgG分子のFab断片の一つは、クロスオーバーFab断片により置換される。クロスオーバーFab断片は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換されるFab断片である。クロスオーバーFab断片を含む二重特異性抗体フォーマットは、例えば、WO2009080252、WO2009080253、WO2009080251、WO2009080254、WO2010/136172、WO2010/145792及びWO2013/026831に記載される。天然型トラスツズマブ配列は、安定性及び親和性を向上させるために、可変重鎖及び可変軽鎖の両方のCDRに改変を導入することによって最適化されており、得られた配列は二重特異的分子中の軽鎖の誤対合を回避するためにフレームワークが移植され、二重特異性抗体は糖鎖を操作され、高収率で生産することができるHER2を標的とする非常に強力な二重特異性抗体とほんの低い割合の副生成物が得られる。加えて、各親抗体の組み合わせと比較して、腫瘍細胞増殖の優れた阻害を示す。
(a)配列番号14の重鎖CDR1;
(b)配列番号15の重鎖CDR2;
(c)配列番号16の重鎖CDR3;
(d)配列番号11の軽鎖CDR1;
(e)配列番号12の軽鎖CDR2;
(f)配列番号13の軽鎖CDR3
を含む、HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一の抗原結合部位、及び
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号108の重鎖CDR2;
(c)配列番号79の重鎖CDR3;
(d)配列番号107の軽鎖CDR1;
(e)配列番号18の軽鎖CDR2;
(f)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二の抗原結合部位
を含むHER2に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号14の重鎖CDR1;
(b)配列番号15の重鎖CDR2;
(c)配列番号16の重鎖CDR3;
(d)配列番号11の軽鎖CDR1;
(e)配列番号12の軽鎖CDR2;
(f)配列番号13の軽鎖CDR3;
を含む、HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一の抗原結合部位、及び
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号79の重鎖CDR3;
(d)配列番号104の軽鎖CDR1;
(e)配列番号18の軽鎖CDR2;
(f)配列番号19の軽鎖CDR3;
を含む、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二の抗原結合部位
を含むHER2に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
(a)配列番号14の重鎖CDR1;
(b)配列番号15の重鎖CDR2;
(c)配列番号16の重鎖CDR3;
(d)配列番号11の軽鎖CDR1;
(e)配列番号12の軽鎖CDR2;
(f)配列番号13の軽鎖CDR3
を含む、HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一の抗原結合部位、及び
(a)配列番号20の重鎖CDR1;
(b)配列番号29の重鎖CDR2;
(c)配列番号79、配列番号78、配列番号80、配列番号87、配列番号88からなる群から選択される重鎖CDR3;
(d)配列番号104、配列番号103及び配列番号158からなる群から選択される軽鎖CDR1;
(e)配列番号18の軽鎖CDR2;
(f)配列番号19の軽鎖CDR3
を含む、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二の抗原結合部位
を含むHER2に特異的に結合する二重特異性抗体を提供する。
Fcドメイン、
HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一の抗原結合部位を含む1つのFab断片、
HER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二の抗原結合部位を含む1つのFab断片を含み、
ここで、少なくとも一のFab断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される。
Fcドメイン、
重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、HER2の細胞外ドメインIIに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片、及び
HER2の細胞外ドメインIVに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片
を含む。
Fcドメイン、
HER2の細胞外ドメインIIに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片、及び 重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片
を含む。
Fcドメイン、
HER2の細胞外ドメインIIに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片、及び
Fab断片の重鎖及び軽鎖の可変領域が交換される、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片
を含む。
Fcドメイン、
HER2の細胞外ドメインIIに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片、及び
重鎖及び軽鎖の定常領域が交換される、HER2の細胞外ドメインIVに特異的な抗原結合部位を含む1つのFab断片
を含む。
本発明の二重特異性HER2抗体は、Fcドメインの2つのサブユニットの一方又は他方に融合した異なる抗原結合部分を含み、よってFcドメインの2つのサブユニットは典型的には2つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組換え共発現及び続く二量体化は、2つのポリペプチドの複数の可能な組合せをもたらす。組換え発現において本発明の二重特異性抗体の収率と純度を向上させるために、本発明の二重特異性抗体のFcドメインにおいて所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することは有利であろう。
本発明は更に、本明細書に記載されるHER2に特異的に結合する二重特異性抗体又はその断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドは、二重特異性抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性二重特異性抗体を形成する。例えば、Fab断片の軽鎖部分は、Fab断片の重鎖部分、抗原結合部分、Fcドメインサブユニット及び任意で別のFab断片(の部分)を含んでなる二重特異性抗体の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、重鎖ポリペプチドが軽鎖ポリペプチドと会合し、Fab断片を形成する。別の実施例では、2つのFcドメインサブユニットの一方、及び場合によっては一以上のFab断片(の一部)を含む本明細書に提供される二重特異性抗体の部分は、2つのFcドメインサブユニットの他方、及び場合によってはFab断片(の一部)を含む本明細書に提供される二重特異性抗体の部分に由来する別々のポリヌクレオチドによりコードされ得る。共発現されると、Fcドメインのサブユニットが会合しFcドメインを形成する。
一態様において、上記実施形態の何れかに記載のHER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、Fc部分が修飾されている免疫グロブリンG(IgG)分子を含む。修飾されたFc部分は、野生型Fc部分と比較してFcγ受容体に対する低下した結合親和性を有する。
ある実施態様において、上述されるものに加えて、本明細書で提供される二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体が意図される。例えば、二重特異性抗体の結合親和性及び/又は他の生物学的特性を改善することが望まれ得る。二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体は、二重特異性抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成によって調製することができる。このような改変は、例えば、抗体のアミノ酸配列内における、残基の欠失、及び/又は挿入及び/又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせが、最終コンストラクトに到達させるために作成され得る。
ある実施態様において、一以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換型変異誘発の対象となる部位は、HVR及びFRを含む。保存的置換は、表Bの「保存的置換」の見出しの下に示されている。より実質的な変更が、表Bの「例示的置換」の見出しの下に与えられ、アミノ酸側鎖のクラスを参照して以下に更に説明される。アミノ酸置換は、目的の抗体に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持/改善、免疫原性の減少、又はADCC又はCDCの改善についてスクリーニングされる。
アミノ酸は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性の親水性Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響する残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe.
ある実施態様において、本明細書で提供される二重特異性抗体は、抗体がグリコシル化される程度が増加又は減少するように改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は削除は、1つ又は複数のグリコシル化部位が作り出される又は取り除かれるようにアミノ酸配列を変化させることにより都合よく実現しうる。
ある実施態様において、二重特異性抗体の1つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作二重特異性抗体、例えば、「thioMAbs」を作成することが望まれ得る。特定の実施態様において、置換された残基は、二重特異性抗体のアクセス可能な部位で存在する。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基はそれにより抗体の接触可能部位に置かれ、この基を使用して抗体を、薬物部分又はリンカー薬物部分などの他の部分にコンジュゲートさせて、イムノコンジュゲートを作り出しうる。ある実施態様において、一以上の以下の残基がシステインで置換され得る:軽鎖のV205(Kabatの番号付け);重鎖のA118(EU番号付け);及び重鎖Fc領域のS400(EU番号付け)。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第7521541号に記載のように生成され得る。
本発明の二重特異性抗体は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固相合成)又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、二重特異性抗体(又は断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明の一以上のポリヌクレオチドを含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに、二重特異性抗体(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えDNA技術、合成技術及びインビボでの組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989);及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片であっても良い発現ベクターは、二重特異性抗体(断片)をコードするポリヌクレオチド(即ちコーディング領域)がプロモーター及び/又は他の転写又は翻訳調節要素と作動可能に結合してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合には、コード領域の一部と考えられ得るが、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の二重特異性抗体(断片)、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合され又は融合されない異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、例えばポリペプチドなど遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下に遺伝子産物の発現を配置するように、一以上の制御配列と結合するときである。(ポリペプチドコーディング領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、及び二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターに加えて、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動的に結合することができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン−Aと連結した最初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及び(例えばラウス肉腫ウイルスなど)レトロウイルスを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギα−グロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を調節することができる他の配列に由来するものを含む。更なる好適な転写調節領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、様々な転写制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素(特に、配列内リボソーム進入部位、又はCITE配列とも呼ばれるIRES)を含む。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び/又はレトロウイルスの長い末端反復配列(LTR)又はアデノ随伴ウイルス(AAV)の末端逆位配列(ITR)など染色体組み込み要素など他の特徴を含んでいてもよい。
本明細書で提供されるHER2に特異的に結合する二重特異性抗体は、当技術分野で公知の様々なアッセイによって、同定され、その物理的/化学的性質及び/又は生物学的活性についてスクリーニングされ、又は特徴づけることができる。
HER2に特異的に結合する二重特異性抗体の親和性は、実施例に記載の方法に従って、表面プラズモン共鳴(SPR)によって、BIAcore装置(GEヘルスケア)のような標準的な器具類を使用して決定することができ、そしてそのような受容体又は標的タンパク質は、組換え発現によって得ることができる。代替的に、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体の結合を、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えば、フローサイトメトリー(FACS)により評価することができる。結合親和性を測定するための具体的な実例であり、例示的な実施態様は、以下及び下記実施例に記載されている。
一態様において、本発明の二重特異性抗体は、例えばELISA、ウエスタンブロット法など公知の方法により、その抗原結合活性について試験される。
一態様において、アッセイは、生物学的活性を有するそのHER2に結合する二重特異性抗体を同定するために提供される。生物学的活性は、例えば、DNAの断片化、アポトーシスの誘導及び標的細胞の溶解を含み得る。インビボ及び/又はインビトロでこのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。一実施態様において、前記活性は、補体依存性細胞傷害(CDC)の誘導である。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、ペルツズマブ及びトラスツズマブ単独よりも高度にCDCを誘導する。一実施態様において、前記二重特異性抗体は、ペルツズマブ及びトラスツズマブ単独よりも少なくとも約10倍高度に、少なくとも約20倍高度に、少なくとも約30倍高度にCDCを誘導する。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、CDCをペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高度に誘導する。別の実施態様において、前記二重特異性抗体は、CDCをペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも約30%、40%、50%若しくは60%、又は少なくとも30%から70%、又は少なくとも40%から60%高度に誘導する。補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイを、非加熱処理血清又は市販の補体画分を用いて行うことができる(例えば、Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006)を参照)。標的細胞の死滅は、アラマーブルーなどの幾つかの細胞の生存試薬によって評価することができる(Lazar, G. A. et al. Engineered antibody Fc variants with enhanced effector function. Proc. Natl Acad. Sci. USA 103, 4005-4010 (2006), Idusogie, E. E. et al. Engineered antibodies with increased activity to recruit complement. J. Immunol. 166, 2571-2575 (2001))、CellTiter−Glo(例えば、Zhao, X. et al. Targeting C-type lectin-like molecule-1 for antibody-mediated immunotherapy in acute myeloid leukemia. Haematologica 95, 71-78 (2009)を参照)、LDH放出(例えば、Konishi, E., Kitai, Y. & Kondo, T. Utilization of complement-dependent cytotoxicity to measure low levels of antibodies: application to nonstructural protein 1 in a model of Japanese encephalitis virus. Clin. Vaccine Immunol. 15, 88-94(2008) 及びここに開示される実施例)又はカルセインAM放出。幾つかの実施態様において、前記程度のCDCの誘導は、LDH放出アッセイ又は細胞性抗原に結合した本発明の抗体への補体タンパク質C1qの結合を測定する補体アッセイにより決定される。二重特異性抗体のCDC誘導はその後、ペルツズマブ又はトラスツズマブの何れか単独、又はペルツズマブ及びトラスツズマブの組み合わせのCDCの誘導と比較され、ここでCDC誘導についての全ての値は同じ細胞株と同じ各抗体濃度を用いた同じアッセイでアッセイされる。マイクロタイタープレートで実行した場合、二重特異性抗体及び対照(ペルツズマブ又はトラスツズマブ単独、又はペルツズマブ及びトラスツズマブとの組み合わせの何れか)のCDCを誘導する能力は、好ましくは、同じアッセイを使用して、同じマイクロタイタープレートで測定される。例示的なアッセイが、例えば、実施例18又は19に開示される。一実施態様において、CDCの前記誘導は、がん細胞において、例えば乳がん細胞において測定される。
本明細書に記載のHER2に特異的に結合する二重特異性抗体の薬学的製剤は、所望の程度の純度を有するかかる二重特異性抗体と任意の薬学的に許容可能な一以上の担体(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.: Williams and Wilkins PA, USA(1980))とを、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で混合することによって調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量及び濃度でレシピエントに毒性でなく、そしてこれには、限定しないが、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のような緩衝液;アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン;マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール;塩形成対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。本明細書における典型的な薬学的に許容される担体は、水溶性の中性アクティブヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)などの介在性薬物分散剤、例えば、rHuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)などのヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質を更に含む。特定の例示的sHASEGP及び使用方法は、rHuPH20を含めて、米国特許公開第2005/0260186号及び第2006/0104968号に記載されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの一以上の付加的なグルコサミノグリカナーゼと組み合わされる。
本明細書で提供される任意の二重特異性抗体の何れかを治療方法に使用することができる。
本発明の別の態様において、上述した障害の治療、予防、及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器とラベル又は容器上にある又は容器に付属する添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、IV輸液バッグ等を含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な物質から形成されうる。容器は、疾患の治療、予防、及び/又は診断に有効である、それ自体か、又はその他の組成物と併用される化合物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針による穴あきストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の二重特異性抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が特定の症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)本発明の二重特異性抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器と(b)更なる細胞障害剤又は別の治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、又は加えて、製造品は、薬学的に許容される緩衝液、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器を更に含んでもよい。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザーの立場から望まれる他の物質を更に含んでもよい。
本発明はまた、化学療法剤又は薬物、成長抑制剤、毒素(例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片)、又は放射性同位元素など、一以上の細胞傷害性薬物にコンジュゲートした本明細書のHER2に特異的に結合する二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
以下は本発明の方法及び組成物の例である。種々の他の実施態様は、上記に示す一般的な説明を前提として実施することができることが理解される。
特に明記しない限り、以下の一般的な方法が適用されている:
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がDNAを操作するために使用された。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については、Kabat, E., A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242に与えられる。抗体鎖のアミノ酸はEU番号付けに従って番号付けされる(Edelman, G.M., et al., PNAS 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242)。GCG(Genetics Computer Group,Madison,Wisconsin)ソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomax’s Vector NTI Advance suiteのバージョン8.0が配列の作成、マッピング、解析、注解及び図解のために使用された。
DNA配列は、SequiServe(Vaterstetten,Germany)とGeneart AG(Regensburg,Germany)で行った二本鎖配列決定により決定した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から、Geneart AG(Regensburg,Germany)により調製された。特異な制限酵素切断部位に隣接する遺伝子セグメントがpGA18(ampR)プラスミドにクローニングされた。プラスミドDNAを形質転換した細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。
以下の発現ベクターを、全ての重鎖及び軽鎖をコードする発現プラスミドの構築のために使用した。ベクターは、以下の要素からなる:
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
− エプスタイン−バーウイルス(EBV)の複製起点、oriP、
− 大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点
− 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト免疫グロブリン1ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
組換え免疫グロブリン変異体は、製造業者(Invitrogen,USA)の指示に従ってFreeStyleTM293発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。小規模試験発現のため、0.5×106のHEK293F細胞/mlの30mlをトランスフェクションの一日前に播種した。翌日、プラスミドDNA(培養体積のml当たり1μgのDNA)が、1.2mlのOpti−MEM(登録商標)I低血清培地(Reduced Serum Medium)(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)と混合され、続いて、40μlの293FectinTMトランスフェクション試薬(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)が添加された。混合物を室温で15分間インキュベートし、細胞に滴下した。トランスフェクションの一日後、各フラスコに、300μlのL−グルタミン(200mM,Sigma−Aldrich,Steinheim,Germany)及びfeed7(L−アスパラギン、アミノ酸、微量元素、HyPep1510、クエン酸鉄(III)アンモニウム、エタノールアミン、微量元素、D−グルコース、RPMIを含まないフリースタイル培地を含む)の600μlが供給された。トランスフェクションの三日後、細胞濃度、培地中の細胞濃度、生存能力及びグルコース濃度を、自動化された細胞生存率分析器(Vi−CELLTM XR,Beckman Coulter,Fullerton,CA,USA)及びグルコースメーター(Accu−CHEK(登録商標)Sensor comfort,Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)を用いて測定した。加えて、各フラスコに、L−グルタミンを300μl、供給した非必須アミノ酸溶液(PANTM Biotech,Aidenbach,Germany)を300μl、ピルビン酸ナトリウムを300μl(100mM、Gibco,Invitrogen)、feed7を1.2ml及びグルコース(D−(+)−グルコース溶液45%、シグマ)を5g/L、供給した。最後に、トランスフェクションの6日後、抗体は、周囲温度で15分間、X3R Multifuge(Heraeus,Buckinghamshire,England)で3500rpmで遠心分離により回収し、上清を滅菌Steriflipフィルターユニット(0.22mm Millipore Express PLUS PESメンブラン,Millipore,Bedford,MA)を通して濾過し、更に使用するまで−20℃で保存した。5Lまでの大規模なトランスフェクションは、直線的にスケーリングされた。
二重特異性抗体は、プロテインA−セファロースTM(GE Healthcare,Sweden)を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス200サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、PBS緩衝液(10mMのNa2HPO4,1mMのKH2PO4,137mMのNaCl及び2.7mMのKCl,pH7.4)で平衡化したHiTrapプロテインAHP(5ml)カラムに適用した。非結合タンパク質は、平衡緩衝液を用いて洗浄した。抗体及び抗体変異体は、0.1Mクエン酸緩衝液、pH2.8で溶出し、タンパク質を含む画分は、0.1mlの1Mトリス、pH8.5で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分をプールし、アミコンウルトラ遠心濾過装置(MWCO:30K,Millipore)で3mlの体積まで濃縮し、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化した、スーパーデックス200HiLoad 120ml 16/60又は26/60ゲル濾過カラムにロードした。5%未満の高分子量凝集体を含有する精製二重特異性抗体及び対照抗体を含む画分がプールされ、−80℃で1.0mg/mlの一定分量として保存した。
タンパク質は、プレパックされたポロス(登録商標)AプロテインAカラム(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を装着し、自動化されたUltimate 3000システム(Dionex,Idstein,Germany)を使用して、アフィニティークロマトグラフィーにより定量した。全ての試料は緩衝液A(0.2MのNa2HPO4・[2H2O]、pH7.4)にロードされ、緩衝液B(0.1Mのクエン酸、0.2MのNaCl、pH2.5)で溶出した。タンパク質濃度を決定するために、吸光係数1.62を全ての試料に使用した。
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度及び分子量は、還元剤(5mMの1,4−ジチオトレイトール)の存在下及び非存在下でのSDS−PAGE、及びクーマシーブリリアントブルーによる染色により分析された。NuPAGE(登録商標)Pre−Castゲルシステム(Invitrogen,USA)を、製造業者の取扱説明書に従って使用した(4−20%のトリスグリシン・ゲル)。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、25℃で200mMのKH2PO4、250mMのKCl、pH7.0の泳動用緩衝液中で、Superdex200分析的サイズ排除カラムを使用して高性能SECにより分析された。25μgのタンパク質が流速0.5ml/分でカラムに注入され、50分間にわたり均一濃度で溶出された。還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド−N−グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)による酵素処理によるN−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーQ−TOF質量分析法により検証された。
抗体は、TSK−GEL G3000SWゲル濾過カラム(7.5mm IDx30cm,TosoHaas Corp.,Montgomeryville,PA,USA)を装着したAgilent1100 HPLC(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)を用いて分析した。18μlの溶出したタンパク質を緩衝液A(300mMのNaCl、pH7.5中の0.05MのK2HPO4/KH2PO4)中でカラムにロードし、サイズに基づいて分離した。
溶出したタンパク質の7μlを2×試料緩衝液(NuPAGE(登録商標)LDS試料緩衝液、Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)と混合し、別の7μlは10%の還元剤(NuPAGE(登録商標)試料還元剤,Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)を含む2×試料緩衝液と混合した。試料は10分間、70℃まで加熱し、プレキャストNuPAGE(登録商標)4−12%BisTrisゲル(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)上でロードした。ゲルは、200Vで125mAで45分間流した。その後、ゲルは、ミリポア水で3回洗浄し、SimplyBlueTM SafeStainで染色した(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。ゲルを、ミリポア水で一晩脱色した。
図1のa)からd)は、2+2 IgG−scFvフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の異なる変異体を模式的に示す。全ての二重特異性抗体は、それぞれの抗原結合部位に対して二価であり、ErbB2/HER2受容体の異なる2つのパラトープに結合する(抗原1=トラスツズマブ特異性;抗原2=ペルツズマブ特異性)。本明細書中に記載の2+2 IgG−scFvフォーマットの全ての二重特異性抗体は、非フレームワーク移植、非CDR最適化、非糖鎖操作型であり、Fc部分に任意の変異を有しない。
図2から4は、2+2 IgG−scFvフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の変異体の例示的サイズ排除精製グラフ、SDS−PAGE分析及び分析用HPLCを示す。TvAB17、TvAB13及びハーセプチン−scFv_AからEのデータは示されず;2+2 IgG−scFvフォーマットのトラスツズマブ及びペルツズマブ二重特異性抗体の全ての変異体は同じ品質で生成された。
細胞株
MDA−MB175 VII細胞は、10%ウシ胎児血清及び2mLのL−グルタミンを補充したDMEM/F12培地(Gibco)中で維持された。細胞株の増殖は、標準的な細胞培養プロトコルに従った。
重鎖の位置98でのアスパラギン酸異性化部位及び軽鎖の位置30でのアスパラギンの脱アミド部位はトラスツズマブの安定性ホットスポットである。これら二つの位置は、抗体の抗原結合能力の安定性及び完全性に影響を与える。この問題は、コハク酸ナトリウム又はヒスチジン緩衝液の何れかを使用して凍結乾燥製剤を導入することによって克服された。安定性及び貯蔵半減期を増加させるために、我々は、それらの不安定性の既知の原因をアミノ酸又はより高度の固有の安定性を有するべきであるアミノ酸ストレッチにより置き換えることを意図した。私たちは、重鎖におけるAsp98のGluによる置換、及び軽鎖におけるAsn30のSer並びにThr31のValによる置換を試験した。これらの変異は、D98E、N30S、及びT31Vと略記される。T31VはN30の脱アミド化に直接影響を与えないが、アスパラギンのC末端側に隣接する残基がポリペプチド鎖の安定性に影響を与えるだろうと仮定された。
全ての変異体は、親トラスツズマブ分子として組換えHER2抗原に対して同じ親和性を示す。40℃でpH5又はpH6に曝露後、トラスツズマブは、、オフ速度が高められ、オン速度を変えずに維持することによって主に駆動され、〜5倍親和性を失った。変異体602は、pHストレス前後にほとんど区別がつかないの親和性を示した。変異体N30Sは、親トラスツズマブと比較して最初からより高い親和性を有し、ストレス状態の間ほぼ一定であった。N30S、N30T、又はV(VL)の何れかと一緒に変異体D98E(VH)が更なる実験に使用された。結果は図5及び図6並びに以下の表に示される。
結合
KPL−4細胞を回収し、FACS緩衝液に再懸濁した。0.2Mio細胞を、96ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを400×gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体40μlに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために4℃で30分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、FACS緩衝液で2回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトFc特異的FITC標識二次抗体12μl中に再懸濁し(Jackson ImmunoResearch#109−096−098)、4℃で30分間再びインキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液200μlに再懸濁し、蛍光をBD CantoIIを用いて測定した。
標的細胞を回収し、洗浄し、カルセイン(Invitrogen)で染色し、AIMV(登録商標)培地(Life Technologies)中に再懸濁させ、3×104細胞/ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞(末梢血単核エフェクター細胞[PBMC])の添加前に10分間インキュベートした。エフェクター(E)及び標的(T)細胞は、次いで、指示されたE:T比で37℃で指示された時間インキュベートされた(全試料について三通り)。インキュベーション後、細胞をPBSで1回洗浄し、次いでホウ酸緩衝液で溶解した。カルセイン保持率はWallac Victor3 1420 Multilabel Counterで測定された。ADCCは、以下の式を用いて計算された。
結果を図7から9に示す。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から、Geneart AG(Regensburg,Germany)により調製された。scFv抗体断片のC末端付着を有する重鎖又は軽鎖、S354C及びT366W変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」抗体重鎖及び未修飾VHドメインと組み合わせて、CH3ドメインにおけるY349C、T366S、L368A及びY407V変異を有する「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖、交差Cカッパドメイン又はscFab抗体断片並びに未修飾抗体軽鎖又はCH1ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位(BamHI−XbaI、BamHI−XmnI又はBamHI−KpnI)により隣接され、pGA18(ampR)プラスミドにクローニングされた。プラスミドDNAを形質転換した細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’末端DNA配列を含んでいた。
全ての「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖並びに抗体軽鎖をコードする発現プラスミドの構築のために使用された発現ベクターは以下の要素を含む:
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
− エプスタイン−バーウイルス(EBV)の複製起点、oriP、
− 大腸菌でこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製起点
− 大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト免疫グロブリン1ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
− 固有のBamHI及びXbaI制限部位。
組換え二重特異性抗体は、製造業者(Invitrogen,USA)の指示に従ってFreeStyleTM293発現システムを使用して、ヒト胎児腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションによって発現させた。簡単に説明すると、懸濁液FreeStyleTM293−F細胞を37℃/8%CO2でFreeStyle(登録商標)293発現培地中で培養し、トランスフェクションの1日前に細胞を1×106生細胞/mlの密度で新鮮な培地に播種した。トランスフェクションのために、DNAを、293−FreeTMトランスフェクション試薬(Merck,USA)162.5μl、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖1及び2を1:1のプラスミド比でscFabをコードするDNAのN末端付着を有する重鎖125μg、及び250mlの最終トランスフェクション体積中1:1:1のモル比の軽鎖プラスミドDNAを使用して10mlのダルベッコPBS(PAA,Austria)中で調製した。Cross Mabsのトランスフェクションのために、「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖1:未修飾軽鎖:Cカッパドメイン交換「ノブ・イントゥー・ホール」重鎖2:CH1ドメイン交換軽鎖のプラスミド比1:1:1:1、1:1:1:2、1:1:1:4、1:1:1:8が調製された。CH1−VL軽鎖プラスミド比は、CE−SDS及びQ−TOF分光法の組み合わせを用いて鎖対の最適化を評価するために、1倍、2倍、4倍及び8倍のモル比で使用した。抗体を含有する細胞培養上清は、トランスフェクション後7日目に30分間14000×gでの遠心分離により回収し、無菌フィルター(0.22μm)を通して濾過した。上清を精製まで−20℃で保存した。得られた抗体の配列を以下の表8に示す。
二重特異性<Her2GlyMab>抗体の糖鎖操作誘導体は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して哺乳動物抗体の重鎖及び軽鎖の発現ベクターを用いて、HEK293−EBNA細胞をコトランスフェクトすることによって産生された。指数関数的に増殖しているHEK293−EBNA細胞は、リン酸カルシウム法によりトランスフェクトされた。糖操作抗体の産生のために、細胞を融合GnTIIIポリペプチド発現のためのプラスミド及びマンノシダーゼII発現のための第二のプラスミドそれぞれでコトランスフェクトした。上記の材料と方法のセクションに記載したように、二重特異性抗体のプラスミド比が添加された。細胞を、10%のFCSを補填したDMEM培養培地を使用してTフラスコ中で付着単層培養として増殖させ、それらが50及び80%集密になるときに形質移入した。T75フラスコのトランスフェクションでは、FCS(最終10%v/vで)(最終的には250/mlのネオマイシン)を補填した約14mlのDMEM培養培地に形質移入の24時間前に7.5(から8)00万細胞を播種し、細胞を5%CO2大気のインキュベーター中に37℃で一晩置く。トランスフェクトされる各T75フラスコに対して、DNA、CaCl2及び水の溶液は、47μgの総プラスミドベクターDNA、235μlの1MのCaCl2溶液を混合し、469μlの最終容積まで水を加えることにより調製された。この溶液に、469μlの50mMのHEPES、280mMのNaCl、1.5mMのNa2HPO4溶液(pH7.05)を加え、直ぐに10秒間混合し、室温で20秒間静置した。懸濁液を、2%のFCSを補填した約12mlのDMEMで希釈し、既存の培地の代わりにT75フラスコに加えた。細胞を約17から20時間、37℃、5%CO2でインキュベートし、ついで培地を約12mlのDMEM、10%FCSに置換した。馴化培地は、トランスフェクション後5から7日目に回収され、210〜300*gで5分間遠心分離し、0.22μmの滅菌フィルターでろ過し(1200rpmで5分間遠心分離、続いて4000rpmで10分間の2回目の遠心分離)し、4℃で保存した。
糖操作抗体は精製され、非糖操作抗体について上述したように処方した。フコースの量を決定するために、下記のように、抗体のFc領域に付着したオリゴ糖を分析した。
原理:トラスツズマブ及びペルツズマブの同様のフレームワークは、軽鎖の誤対合を可能とする:トラスツズマブ及びペルツズマブの両方がVHIII VLkIフレームワークを有し、従って、両方の重鎖に対する軽鎖界面親和性は同じである。
二重特異性抗体は、MabSelectSure−セファロースTM(GE Healthcare,Sweden)を使用する親和性クロマトグラフィー及びスーパーデックス200サイズ排除クロマトグラフィー(GE Healthcare,Sweden)により細胞培養上清から精製された。簡潔には、無菌ろ過した細胞培養上清を、PBS緩衝液(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したMabSelect SuRe樹脂に捕獲し、平衡化緩衝液で洗浄し、pH3.0で25mMのクエン酸ナトリウムにより溶出した。溶出したタンパク質画分をプールし、2Mトリス、pH9.0を用いて中和し、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化したスーパーデックス200 26/60 GL(GE Healthcare,Sweden)カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィーにより更に精製した。サイズ排除クロマトグラフィー画分をCE−SDS(Caliper Life Science,USA)で分析し、二重特異性抗体を含有する画分をプールし、−80℃で保存した。
精製されたタンパク質試料のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、280nmでの光学密度(OD)を測定することによって決定した。二重特異性及び対照抗体の純度、完全性及び分子量は、マイクロ流体Labchip技術(Caliper Life Science,USA)を用いて、CE−SDSにより分析した。5μlのタンパク質溶液をHT Protein Express Reagentキットを使用して製造元の指示に従ってCE−SDS分析のために調製され、HT Protein Express Chipを使用して、LabchipGXIIシステム上で分析した。データは、LabChip GXソフトウェアバージョン3.0.618.0を使用して分析した。二重特異性及び対照抗体試料の凝集体含量は、25℃で200mMのKH2PO4、250mMのKCl、pH7.0の泳動用緩衝液中で、Superdex200分析的サイズ排除カラムを使用して高性能SECにより分析された。25μgのタンパク質が流速0.5ml/分でカラムに注入され、50分間にわたり均一濃度で溶出された。
還元された二重特異性抗体軽鎖と重鎖のアミノ酸主鎖の完全性は、ペプチド−N−グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)による酵素処理によるN−グリカンの除去後にナノエレクトロスプレーQ−TOF質量分析法により検証された。重鎖及び軽鎖の誤対合の量も定量した。
機器:ビアコアT100(GE Healthcare)
ソフトウエア:ビアコア T100コントロール、バージョン2.02/2.03
ビアコア T100評価バージョン2.02/2.03
ビアコア B3000(Biacore)
ソフトウエア:ビアコア B3000 コントロール、バージョン4.1.2
BIAEvaluation、バージョン4.1.1
<Her2GlyMab>−分子の動力学定数及び得られた親和性は、「トラスツズマブ」−及び「ペルツズマブ」−機能性のそれぞれ両方について測定された。これら二つの機能は、アミン結合された親MAb「トラスツズマブ」(FC1/2)又は「ペルツズマブ」(FC3/4)の何れかとのHer2の事前複合体形成を経由して区別された。親MAbとHer2の複合体形成は、Her2 ECDの注入後に開始した。
製造業者の説明書に従ったフローセル1から4の標準的なアミンカップリング:CM5チップ、T=25℃、泳動用緩衝液:HBS−N緩衝液:EDC/NHSの混合物による活性化、800RUを目標;親Abs「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」は、カップリング緩衝液酢酸ナトリウム、pH4.5、c=2−3μg/mLで希釈された;最後に、残りの活性化カルボキシル基は1Mエタノールアミンの注入によりブロックされた。
(アミン結合された親のmAb「トラスツズマブ」又は「ペルツズマブ」の何れかを用いた)フローセル1及び3のチップ表面は、可能な緩衝液作用又は非特異的結合を補正するための基準対照表面として用いられた。
泳動用緩衝液:PBS
全ての試料は泳動用緩衝液+1mg/mlのBSAで希釈した。
フローセル2と4におけるHER2 ECDの捕獲:c=100nM、流速5μL/分、時間120秒。
分析物試料:5つの濃度(c=300、100、33.33、11.11及び3,7nM)で分析される<Her2GlyMab>−分子の古典的な濃度系列は、50μl/分の流速で注入された。各濃度に対してシングルス、重複として1回;結合時間:180秒、解離時間:900秒。
最終的な再生は、アミン結合Mab「トラスツズマブ」に対して10mMのグリシンpH2.5、アミン結合Mab「ペルツズマブ」に対して25mMのNaOH、接触時間は各60秒、流速30μl/分を用いて各サイクル後に行った。
動力学的パラメータは、二重基準(対照基準:Mabトラスツズマブ及びペルツズマブのそれぞれに対する分析物の結合;フローセル:1それぞれ3)を用いて算出し、濃度「0」は、ブランクとして使用した。計算は、「ラングミュア結合1:1」モデル、RI(屈折率)=0を用いて行った。
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価<Her2GlyMab>抗体分子OAscFab1、OAscFab2、OAscFabPer1、OAscFabPer2、CrossMab−XPer、CrossMab−XTra及びCrossMab−CDRGが発現され精製される。各分子において、VH及びVLの一部は、可変軽鎖における変異T31V又はN30T及び重鎖における変異D98Eを有する最適化されたトラスツズマブ配列及びペルツズマブの親配列それぞれに基づいている。抗体の模式構造を図10に示す。配列を上記表8に示す。
CrossMab−XTra
上記の材料及び方法に記載される手順に従って、二重特異性、二価<Her2GlyMab>抗体分子CrossMab−XTraは、1:1:1:1、1:1:1:2、1:1:1:4及び1:1:1:8のモルプラスミド比を用いて発現させ精製された。CrossMab−XTraの発現をウェスタンブロットで確認した。細胞培養上清のプロテインA精製後、コンストラクトは、1:1:1:1等モルプラスミド比で、Q−TOF MSによって検出される場合、二重特異性抗体の約73%が約148kDaの推定分子量を有し;11%がペルツズマブ及びXトラスツズマブ重鎖と対をなす2×ペルツズマブ軽鎖を含み;9%が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する(重鎖と軽鎖の両方がXトラスツズマブに由来する)インタクトなXトラスツズマブ抗体であり;4%がペルツズマブ軽鎖のみと組み合わされたXトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合であり;3%が1xXトラスツズマブ軽鎖及び1xペルツズマブ軽鎖とのXトラスツズマブ重鎖ホール−ホール会合であることを示した。
細胞培養上清のプロテインA精製後、コンストラクトは、1:1:1:1等モルプラスミド比で、Q−TOF MSによって検出される場合、二重特異性抗体の約85%が約148kDaの推定分子量を有し;2%がXペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対をなす2×Xペルツズマブ軽鎖を含み;1%が重鎖ホール−ホール会合の形成を有する(重鎖と軽鎖の両方がトラスツズマブに由来する)インタクトなトラスツズマブ抗体であり;12%がXペルツズマブ及びトラスツズマブ重鎖と対合した2xトラスツズマブ軽鎖であることを示した。更なる種は検出されなかった。
細胞培養上清のプロテインA精製後、コンストラクトは、1:1:1等モルプラスミド比では、Q−TOF MSによって検出される場合、二重特異性抗体の約95%が約148kDaの推定分子量を有し;5%がXPertuzumab及びトラスツズマブ(HerCDRG)重鎖と対をなす2×XPertuzumabの軽鎖を含むことを示した。
更なる種は検出されず、従って、プラスミド比の更なる最適化は行われなかった。副生成物のプロフィールを比較するために、抗体CrossMab−XHer及びCrossMab−CDRGに関して行われたMSスペクトルを図12に見ることができる。
上記のように二重特異性抗体の結合を、BIAcoreにより分析した。
別々のアッセイフォーマットでは、試料(CrossMabXPer並びにOAscFab1及びOAscFab2について)は、トラスツズマブの機能並びにペルツズマブ特異性であることが証明された。CrossMabXPerは、陽性対照と同程度に動力学的定数及び得られた親和性を示した。トラスツズマブ媒介型結合についてのわずかに減少したka−速度定数を除き、OAscFab1及びOAscFab2は、陽性対照、即ち親Mabと同程度に、動力学的定数及び得られた親和性を示した。
陽性対照の一部の二価の結合は−CM5チップ上のリガンド密度に応じてこの例に示された二つの実験における解離速度定数の変化を引き起こす可能性がある。
増殖阻害アッセイ
AlamarBlue(登録商標)(Invitrogen)を、HER2 CrossMab(CrossMab−XTra Her2GlyMab、配列番号119、120、121、122)、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ/ペルツズマブの組み合わせの存在下で5日間のインキュベーション後、(A)BT474及び(B)N87細胞の代謝活性と増殖を測定するために使用した。染料の生物学的還元は、酸化型(青)の量を低減し、同時に蛍光中間体(赤)を増加させる。
標的細胞を、回収し、洗浄し、RPMI 1640(Gibco)+10%FCS+1%GlutaMAXTM(Gibco)中に再懸濁し、1×104細胞/ウェルの濃度で播種した。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で3時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で5日間インキュベートした。
25μl/ウェルのAlamar Blueをプレートに添加し、インキュベーター中で7時間インキュベートした。
吸光度をWallac Victor3 1420マルチラベルカウンターで584nm及び612nmでモニターした。
増殖阻害の割合を計算するために、非処理対照試料がアッセイに含められ、100%増殖として定義された。三通りの各実験の平均割合及び増殖阻害が計算された。
結果を図13に示す。
HER2 CrossMab(CrossMab−XTra Her2GlyMab、配列番号119、120、121、122)、トラスツズマブ、ペルツズマブ又はトラスツズマブ/ペルツズマブの組み合わせにより媒介されるADCCは、KPL−4(A)、T47D(B)及びCalu−3(C)において評価された。
標的細胞を回収し、洗浄し、AIMV(登録商標)培地(Life Technologies)中に再懸濁させ、3×104細胞/ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞(末梢血単核エフェクター細胞[PBMC])の添加前に10分間インキュベートした。エフェクター(E)及び標的(T)細胞は、次いで、25:1のE:T比で37℃で4時間インキュベートされた(全試料について三通り)。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出は、LDH細胞傷害性検出キット(Roche Applied Science)を用いて測定した。ADCCは、以下の式を用いて計算された。
インビトロ培養細胞−Calu3
このヒト肺腺癌細胞株は、肺がんを有するヒト白人男性から樹立されている。細胞は、Chugai Pharmaceuticals Co.,Ltd.から入手し、ワーキング・セル・バンクのために社内で継代された。腫瘍細胞は、5%CO2で水飽和大気中、37℃で10%ウシ胎児血清グルタミン(PAN Biotech,Germany)を補充したRPMI培地(PAN Biotech,Germany)中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン/EDTA 1×(PAN)を用いて行い、2回/週、分割する。細胞継代P6がインビトロ研究に使用される。
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、J.Kurebayashi教授によって提供された(Kawasaki Medical School,Kurashiki,Japan)。腫瘍細胞は、5%CO2で水飽和大気中、37℃で10%ウシ胎児血清グルタミン(PAN Biotech,Germany)及び2mMのL−グルタミン(PAN Biotech,Germany)を補充したDMEM培地(PAN Biotech,Germany)中で常套的に培養される。培養継代は、トリプシン/EDTA 1×(PAN)を用いて行い、2回/週、分割する。細胞継代P6がインビトロ研究に使用される。
雌SCIDベージュ(C.B.−17)マウス;年齢10−12週;体重18〜20g(Charles River Germany,Sulzfeld)又は雌BALB/C nu/nuマウス;年齢8−10週;体重>20g(Bomholtgard,Denmark)は、国際ガイドライン(GV−Solas;Felasa;TierschG)に従って12時間明/12時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、1週間動物施設の検疫部で収容される。継続的な健康管理が定期的に実施される。ダイエット食品(Altromin)及び水(pH2.5−3に酸性化)が自由に与えられる。実験的研究は地方政府によってレビューされ承認された;登録番号55.2−1−54−2531.2−3−08 SCIDベージュ同所性げっ歯類の乳癌モデル及び211−2531.2−16/00。1.2.2皮下腫瘍モデル。
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ(Greiner TriFlask)から回収され(トリプシン−EDTA)、び50mlの培地に移され、1回洗浄され、PBSに再懸濁される。PBSによる更なる洗浄工程及びろ過(セルストレイナー;Falconφ100μm)の後に、最終の細胞力価を1.5x108/mlに調整される。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合される。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー(プレクシグラス)、個々のマウスの鼻マスク(シリコン)及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン(Pharmacia−Upjohn,Germany)を用いて小動物用のStephens吸入器を使用して閉鎖循環系で実行される。注入の2日前に、SCIDベージュマウスの外被は剃毛される。Calu3細胞の皮下注射のために、麻酔をかけた動物の皮膚は慎重に解剖学的鉗子で持ち上げられ、100μlの細胞懸濁液(=5.0×10e6細胞)が動物の右脇腹に皮下注射される。細胞懸濁液は、幅広の注射針(0.45×25mm)を使用して、1.0mlのツベルクリン注射器(Braun,Melsungen)に充填される。KPL−4細胞(3×10e6細胞)は、各麻酔マウスの右の最後から2番目の鼠径部乳腺脂肪体に20μlの容量で同所注入される。同所性移植のため、細胞懸濁液は、ハミルトンマイクロシリンジ及び30Gx1/2”針を用いて乳頭下の皮膚を介して注入される。
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理される。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週2回記録し、週2回腫瘍体積をキャリパーで測定する。腫瘍体積は、NCIプロトコルに従って算出された(腫瘍重量=1/2ab2、「a」及び「b」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である)。終了基準はクリティカルな腫瘍塊(上限1.7g又は>1.5cm)、ベースラインから20%以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Tierversuchsanzeige」で承認される。
マウスは、腫瘍体積において、KPL−4については平均が70mm3、Calu3については平均が100mm3で無作為化された。マウスは、腹腔内に10ml/kgの量で週一回処置された。併用治療のために、トラスツズマブが最初に与えられ、その24時間後にペルツズマブが与えられた。
結果は、表14から17及び図15から18に示される。
遺伝子合成
必要な場合、所望の遺伝子を、適切な鋳型を使用してPCRによって生成するか、又は自動化遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物からGeneart AG(Regensburg,Germany)で合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、オリゴヌクレオチドプライマーを最も近いホモログからの配列に基づいて設計し、遺伝子を適切な組織に由来するRNAからRT−PCRによって単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを標準のクローニング/シークエンシングベクターにクローン化した。プラスミドDNAを形質転換した細菌から精製し、UV分光法により濃度を決定した。サブクローニング遺伝子断片のDNA配列を、DNA配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中にサブクローニングできるように適切な制限部位を伴って設計された。全てのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする5’末端DNA配列を含んでいた。配列番号155、156、及び157は例示的リーダーペプチドを与える。
成熟チロシンキナーゼ型細胞表面受容体HER2(Her2、UNIPROT:P04626)のアミノ酸1から629をコードするDNA断片は、N末端リーダー配列を含有する哺乳動物レシピエントベクター中にフレームにクローニングされた。更に、コンストラクトは、Bir Aビオチンリガーゼとの同時発現中に特定のビオチン化を可能にするC末端aviタグ、及び固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)による精製に使用されるHisタグが含まれる(配列番号1及び2)。
抗原及び抗体の両方は、EBV由来のタンパク質EBNAを安定的に発現するHEK293細胞に一過性にトランスフェクトされた。同時にコトランスフェクトしたビオチンリガーゼBir Aをコードするプラスミドは、インビボでのaviタグ特異的ビオチン化を可能とした。タンパク質は、次いで、プロテインA、続いてゲルろ過をカラムを用いて精製された。
トラスツズマブ及びペルツズマブのための共通の軽鎖(CLC)の生成のために、個々の軽鎖(LC)を分析し、比較した。配列分析は、両方の可変ドメインが、同じ生殖系列配列に由来することを明らかにした。トラスツズマブの一般にLCDR3が、具体的には残基H91がHer2の上トラスツズマブ特異的エピトープと特異的に相互作用することを考慮すると、トラスツズマブ/ペルツズマブのCLCを作成する最初の試みは以下のようになされる:トラスツズマブの完全なCDR3領域又は残基H91のみの何れかがペルツズマブのLCの対応する位置を置換した。その結果、ペルツズマブ由来LCDR1及び2をコードするがトラスツズマブ由来LCDR3のアミノ酸残基を保有するハイブリッドLCコンストラクトが作成された。得られたCLCは、「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」(配列番号25として記載されている可変ドメインのDNA配列)又は「ペルツズマブ(Tras.Y91H)LC」(配列番号27)の何れかに命名され、トラスツズマブ又はペルツズマブHCの何れかと同時発現された。得られた4つの抗体(配列番号22及び26、「ペルツズマブHC」x「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」;配列番号92及び26,「トラスツズマブHC」x「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」;配列番号22及び28、「ペルツズマブHC」x「ペルツズマブ(Trast.Y91H)LC」;配列番号92及び28、「トラスツズマブHC」x「ペルツズマブ(Tras.Y91H)LC」)として記載されている可変ドメインのタンパク質配列は、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製され、Her2に対する結合は、それぞれの親抗体(配列番号22及び24、「ペルツズマブHC」x「ペルツズマブLC」;配列番号92及び82、「トラスツズマブHC」x「トラスツズマブLC」)を用いてSPRにより測定され、比較された。
新規抗体鎖の組合せの親和性(KD)は、25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて表面プラズモン共鳴により測定した。最初の工程で、huIgG(Fc特異的)を認識する抗ヒトIgG(Sigma I2136、ポリクローナルヤギ抗体)の6500RUがアミンカップリングによってGLMチップの全6チャンネル上に固定化された(酢酸ナトリウムpH4、30μl/分、300秒)(垂直方向)。
付加的トラスツズマブ特異的LCDR残基のペルツズマブ(Tras.L3)LCへの導入及び特性評価
以前のSPR測定の結果に基づいて、ペルツズマブHCと組み合わせて設計されたCLC「ペルツズマブ(Trast.L3)LC」の結合は、減少したが依然として十分に検出可能な結合をもたらした。対照的に、トラスツズマブHCとのCLCの共発現は、マイクロモル範囲で非常に弱い親和性をもたらし、親トラスツズマブ抗体と比較して有意に減少した。
更にCLCの生成を更に進化させ、トラスツズマブHCとの組み合わせで結合を改善するために、LCDR1、2及び3並びにトラスツズマブに特異的であるフレームワーク3領域の付加的トラスツズマブ特異的アミノ酸が、以前に設計された「ペルツズマブ(Trast.L3)LC」の配列に個別に導入された(配列番号31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、及び51として列挙された可変ドメインのDNA配列)。得られたコンストラクト(配列番号32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、及び52として列挙された可変ドメインのタンパク質配列)は、トラスツズマブHC(配列番号92)又はペルツズマブHC(配列番号22)とともに共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。HER2に対する結合が測定され、それぞれの親抗体と比較された。
新規抗体鎖の組合せの親和性(KD)は、ProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて表面プラズモン共鳴により測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図19に与えられる。
興味深いことに、ペルツズマブと組み合わせた場合「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」における付加的単一変異のいずれも有意には親和性に影響を与えず、その親和性は「ペルツズマブHC」x「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」に匹敵した。しかし、トラスツズマブHCとの「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」変異体の組み合わせは、有意な差を生じた。一方、LCDR3領域におけるペルツズマブ配列への復帰変異(P94Y及びT96Y)(配列番号50及び52として記載される可変ドメインのタンパク質配列)は完全にHer2への結合を破壊し、ペルツズマブ特異的変異の導入(配列番号32、34、36、38、40、42、44、46、及び48)は、「トラスツズマブHC」×「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」の最初の組み合わせと比較して同等又は改善された親和性を生じた。特に、変異I31T、G32A、Y53F、及びG66Rの導入は、結合に最も有意な改善につながった。
上述の結合測定に基づいて、「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」への4つの最適なトラスツズマブ特異的変異の導入を組み合わせた。何れかの個々の変異を含む可変ドメインのタンパク質配列は配列番号36、40、42、及び48として記載される。「四重変異」を含む鎖は、「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」(配列番号54)と命名した。
新規「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」を特性評価し、ペルツズマブHC又はトラスツズマブHCの何れかと組み合わせた結合の親和性を決定するために、更にSPR実験を行った。新規抗体鎖の組合せの親和性(KD)は、ProteOn XPR36装置(Biorad)を用いて測定され、前述のように実施された。動力学的及び熱力学的測定の概要が図20及び表20に与えられる。
前に導入され特性評価された個々の変異と同様に、ペルツズマブHC及び「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」を含む抗体の親和性は、「ペルツズマブHC」x「ペルツズマブ(Tras.L3)LC」の最初の鎖の組み合わせに比べて有意には低下しなかった。両方の鎖の組み合わせに対して、親和性は26−34nMの範囲であった。興味深いことに、「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」との「トラスツズマブのHC」の組み合わせは、Her2に対する親和性の非常に強い改善につながる。更に、200pMのその親和性は、親抗体のトラスツズマブ(2.2 nM)の測定された親和性よりも更に優れている。
トラスツズマブHCとの「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」の組み合わせはHer2への結合を完全に復元する(あるいは超える)ことを考慮し、及びペルツズマブHCとの組み合わせはHer2への結合を減少させるが抑制しないことを考慮すると、両方のHer2特異性のためのCLCとして「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」を使用し、ペルツズマブHCの親和性成熟によってペルツズマブ特異的エピトープへの結合を復元することは明らかである。
ペルツズマブベースのH1/H3及びH2親和性成熟ライブラリーの作成
親和性成熟ペルツズマブ由来の重鎖の生成は、標準的なプロトコルを使用して、ファージディスプレイにより行った(Silacci et al, 2005)。
「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」と一緒に発現され、改善された親和性を有するペルツズマブ由来のHCの生成のために、CDR1及び3又はCDR2において無作為化された成熟ライブラリーが作成された。ペルツズマブHC(配列番号22)及び「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」(配列番号54)の配列がファージミドにクローン化され、無作為化のための鋳型として使用した。CDR1及び3で無作為化されたペルツズマブHC親和性成熟ライブラリーの生成のために、3つの断片は、「オーバーラップ・エクステンションによるスプライシング」(SOE)PCRによって組み立てられ、ファージベクターにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された:断片1(LMB3(配列番号147)及びAM_omni_H1_TN−ba(配列番号148)、断片2(RJH108(omni_3’H1_fo)(配列番号149)及びRJH109(omni_5’H3_re)(配列番号150)、及び断片3(AM_omni_H3_TN_fo(配列番号151)及びRJH99(配列番号152)。完全長の無作為断片の十分な量を組み立てた後、それを同様に処理されたアクセプターファージミドベクターと一緒にMunI/NheIで消化した。Fabライブラリーインサートの6ugが、ファージミドベクターの24ugと連結された。精製されたライゲーションは60の形質転換のために使用され、6×10exp9の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、選択のために使用されるためにPEG/NaCl精製によって精製された。
CDR2−無作為化ペルツズマブHC親和性成熟ライブラリーの生成は同様に行われたが、わずか2つの断片が生成され、組み立てられ、前と同様に同じ制限酵素を用いてファージミドにクローニングされた。以下のプライマーの組み合わせがライブラリー断片を生成するために使用された:断片1(LMB3(配列番号147)及びRJH110(omni_5’H2_ba)(配列番号153)、及び断片2(AM_omni_h2_TN_fo(配列番号154)及びRJH99(配列番号152)。精製されたライゲーションは60の形質転換のために使用され、4×10exp9の形質転換体が得られた。ペルツズマブ親和性成熟ライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、選択のために使用されるためにPEG/NaCl精製によって精製された。
ヒトHer2の細胞外ドメイン(ECD)に対する選択は、HEK293で発現されたタンパク質を用いて行われた。抗原は、N末端のaviタグを介してビオチンリガーゼBir Aの共発現により酵素的にビオチン化された。パニングラウンドは、以下のパターンに従って溶液中で行われた:1. 1mlの全容量で0.5時間10nMのビオチン化Her2 ECDへ〜1012ファージミド粒子の結合、2. 10分間、5.4×107ストレプトアビジン被覆磁気ビーズの添加によるビオチン化Her2 ECD及び特異的に結合したファージ粒子の捕獲、3. 5×1mlのPBS/Tween20及び5×1mlのPBSを用いたビーズの洗浄、4. 10分間、1mlの100mMのTEAを添加することによるファージ粒子の溶出及び500μlの1Mトリス/HCl、pH7.4を添加することによる中和、5. 指数関数的に増殖する大腸菌TG1細菌の再感染、6. ヘルパーファージVCSM13による感染及び続いてその後の選択ラウンドに使用されるファージミド粒子のPEG/NaCl沈殿。選択は減少する濃度(20x10−9Mから1x10−9M))を用いて3ラウンドにわたって実施された。ラウンド2及び3において、抗原:ファージ複合体の捕獲はストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラビジンプレートを用いて行った。また、ニュートラビジンプレートは2lのPBS中で3時間洗浄した。特異的結合剤は、ELISAによって以下のように同定された:ウェルあたり30nMのビオチン化Her2 ECD100μlがニュートラビジンプレート上にコーティングされた。Fabを含む細菌の上清が添加され、結合するFabが抗Flag/HRP二次抗体を使用して、Flag・タグを介して検出された。ELISA陽性クローンを、96ウェルフォーマットで、可溶性Fab断片として細菌に発現させ、上清はProteon XPR36を用いてSPR分析による動力学的スクリーニング実験に供された。
新規ペルツズマブHC変異体の親和性(KD)は、表面プラズモン共鳴によって測定された。第一工程において、ポリクローナル抗ヒトFab抗体の7000RUは、アミンカップリングによるGLMチップの全6チャンネル上に固定化された(酢酸ナトリウムpH4.5、30μL/分、300秒)(垂直方向)。
CLCを有するトラスツズマブ/ペルツズマブ二重特異性抗Her抗体の生成
次の工程では、親和性成熟ペルツズマブHC並びにトラスツズマブHCは「ペルツズマブ(Tras.L3)(QM)LC」と命名されるCLCと組み合わせて二重特異性抗体のフォーマットで発現された。CLCを有するこのような二重特異性抗体の生成のために、2つの異なるHCのヘテロ二量体化がノブ・イントゥ・ホール技術の適用によって達成された。ペルツズマブの親和性成熟クローンE1及びG2の可変ドメイン(配列番号68及び70として記載される可変ドメインのタンパク質配列)並びにクローン「D1由来」(D1−der)配列(配列番号64)が、ドメインCH3に「ホール」変異を含むヒトIgG1 HCにクローニングされた。CLCを有する二重特異性抗体の概略が図22に示される。親和性成熟クローン「D1−der」は、クローンD1(配列番号62)のCDR1及び3変異を他の選択されたクローンに見いだされた付加的CDR2変異と組み合わせる。トラスツズマブHCの可変ドメイン(配列番号92)はドメインCH3に「ノブ」変異を保有するヒトIgG1 HCにクローニングされた。「ハーセプチン」コンストラクトと呼ばれる、得られたコンストラクトは共発現され、哺乳動物由来の細胞培養上清から精製された。3つ全ての二重特異性抗体の分析データの概要が図23と表24中のクローンに示される。
Her2上の両方のエピトープのそれぞれに対する、Herceptarg二重特異性抗体の結合を分析し特性評価するために、Her2のノックアウト変異体が設計された。これらの変異体では、2つの特異的エピトープの何れかは、それぞれの抗体鎖と相互作用するアミノ酸の変異によって除去された。
her2におけるそれらのエピトープの各々に対する新規二重特異性抗体の親和性(KD)は、25℃でProteOn XPR36装置(Biorad)を用いてSPRにより測定した。最初の工程で、ヒトIgG(Fc特異的)を認識するポリクローナルヤギ抗ヒトIgG(Sigma I2136)の11000RUがアミンカップリングによってGLMチップの全6チャンネル上に固定化された(酢酸ナトリウムpH4、30μl/分、300秒)(垂直方向)。
トラスツズマブ、ペルツズマブ並びに親和性成熟ペルツズマブHC、トラスツズマブHC、及びCLC「ペルツズマブ(Trast.L3)(QM)」を含む3つの二重特異的Herceptargコンストラクトを含む全ての抗体が両方のHer2ノックアウト変異体への結合について試験された。予想されたように、トラスツズマブ及びペルツズマブの両方とも、それぞれのHer2のエピトープに予想される親和性で結合する。それらに対応するノックアウト変異体への結合は消失された(図24)。これらの結果は、Her2のノックアウトエピトープ変異体の使用は、二重特異性抗体の結合を切断させ、両特異性の個々の親和性を分析することを可能とすることを示している。
各ハーセプチンクローン変異体の個々のKD値の決定は、0.6から1.8nMの予想される範囲内のトラスツズマブのエピトープに対する一定の結合親和性を明らかにした。これとは対照的に、ペルツズマブのエピトープへの結合は、親和性成熟ペルツズマブHCに依存する。3つのHerceptargクローン変異体のうち、クローン「D1−Der」は最も高い親和性(0.16nM)を有することが見出された。熱力学的データの概要を表25に示す。要約すると、本実験では、我々が、CLCを有し、トラスツズマブ及びペルツズマブのエピトープに特異的な二重特異性抗体を生成することができたことを確認する。
KPL−4細胞を回収し、FACS緩衝液に再懸濁した。0.2Mio細胞を、96ウェル丸底プレートに播種した。細胞をペレットにするために、プレートを400×gで3分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を希釈した抗体40μlに再懸濁した。プレートは、抗体の結合を可能にするために4℃で30分間インキュベートした。未結合抗体を除去するために、細胞を再び遠心分離し、FACS緩衝液で2回洗浄した。抗体を検出するために、細胞を、希釈した二次ヤギ抗ヒトFc特異的FITC標識二次抗体12μl中に再懸濁し(Jackson ImmunoResearch#109−096−098)、4℃で30分間再びインキュベートした。その後、細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、FACS緩衝液200μlに再懸濁し、蛍光をBD CantoIIを用いて測定した。結果を図25に示す。
標的細胞を、回収し、洗浄し、RPMI 1640(Gibco)+10%FCS+1%GlutaMAXTM(Gibco)中に再懸濁し、5×103細胞/ウェルの濃度で播種した。それぞれの抗体希釈液を添加する前に、細胞を細胞インキュベーター中で4時間インキュベートした。プレートを穏やかに振盪し、細胞インキュベーター中で5日間インキュベートした。プレートを室温に平衡化され、新たに調製したCellTiter Glo(Promega)基質100μl/ウェルが各ウェルに添加された。発光はWallac Victor3 1420 Multilabel Counterで測定された。結果は、表26及び図26に示される。
標的細胞を回収し、洗浄し、AIMV(登録商標)培地(Life Technologies)中に再懸濁させ、3×104細胞/ウェルの濃度で播種した。各抗体希釈液を細胞に三通りで添加し、エフェクター細胞(末梢血単核エフェクター細胞[PBMC])の添加前に10分間インキュベートした。エフェクター(E)及び標的(T)細胞は、次いで、指示されたE:T比で37℃で指示された時間インキュベートされた(全試料について三通り)。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出は、LDH細胞傷害性検出キット(Roche Applied Science)を用いて測定した。ADCCは、以下の式を用いて計算された。
抗体無しでエフェクター細胞と共にインキュベートした標的細胞に対応する自発的放出は、0%細胞毒性として定義され、最大放出(1%トリトンX−100で溶解した標的細胞)は、100%細胞毒性として定義された。三通りの各実験のADCCの平均割合及び標準偏差が計算された。結果を図27に示す。
1x104BT−474細胞/ウェルが、96ウェル平底プレート中のRPMI/10%FCS中で培養された。24時間後、増殖培地を除去し、指示された抗体の滴定量が100μlの最終容量に添加された(培地中で予備混合された)。
培養物中の生存細胞の数を決定するために、CellTiter−Glo Luminescent Cell Viability Assayが、代謝活性細胞の指標として現在のATPレベルを定量することによって行われた。このように、培養の6日後に、100μlのCellTiter−Glo Reaction Mix(Promega、カタログ番号#G7571)を細胞に添加し、2分間振り、溶解物の75μlが、別の96ウェル平底タイタープレートに移された(Costar、カタログ番号#3917)。更に混合した後、発光はTecan Infinite Readerを使用して、製造者の指示に従って評価された。
結果は、表28及び図28に示される。
増殖アッセイでは、二重特異性Her2抗体は、ペルツズマブ若しくはトラスツズマブ単独又は組み合わせにおいてBT−474細胞の増殖をより強力に阻害することが示された。以下の二重特異性Her2抗体が試験された:Herceptarg CLC D1−der wt”:配列番号64、54、92、Herceptarg CLC D1−der G2”:配列番号64、54、92(糖鎖操作変異体)「Herceptarg CrossMab」:配列番号109、110、111、112。
3x105のBT−474細胞を氷上で指示抗体10μg/mlと共にインキュベートした。以下の二重特異性Her2抗体が試験された:Herceptarg CLC D1−der wt”:配列番号64、54、92、Herceptarg CLC D1−der G2”:配列番号64、54、92(糖鎖操作変異体)「Herceptarg CrossMab」:配列番号109、110、111、112。
30分後、10μg/mlのC1q(Sigma,C1740)を添加し、更に20分間インキュベートした。洗浄後、細胞を、市販のPE標識抗C1q抗体(Cedarlane,CL7611PE−SP)を用いて対比染色した。更にインキュベーション(30分間、氷)した後、細胞を2回洗浄し、FACSCanto IIで分析した。
CHO−K1 Nxre19細胞(IL15RでトランスフェクトされたCHO−K1)が、96ウェル平底細胞培養プレート(NUNC,100μL/ウェル)上に10,000細胞/ウェルで播種され、一晩培養された。IL15−Fc融合ポリペプチドがを添加され(5倍最終濃度の25μL/ウェル)、1時間インキュベートされた。その後、仔ウサギ補体(Cedarlane、カタログ番号CL3441)の1バイアルをAqua bidestの1mLで再構成した。補体溶液は培地で希釈され、25μLがウェルに添加された。4時間後、プレートを200gで遠心分離し、100μL/ウェルが別の96ウェル平底プレートに移された。その後、LDH反応混合物の100μL(細胞傷害性検出キット、Roche Diagnostic GmbH,Mannheim,Germany)を添加した。37℃で20分のインキュベーション時間後、光学密度(OD)がTecan Sunriseリーダーで492/690nmで測定された。
BRCは、低バックグラウンド毒性を有し、用量依存性補体毒性を示すことが分かる。
1x104細胞/ウェルが、150μl中、37℃で30分間、指示された抗体の10μg/mlと共にインキュベートされた。以下の二重特異性Her2抗体が試験された:Herceptarg CLC D1−der wt”:配列番号64、54、92、Herceptarg CLC D1−der G2”:配列番号64、54、92(糖鎖操作変異体)「Herceptarg CrossMab」:配列番号109、110、111、112。
その後、50μlの仔ウサギ補体(Cedarlane、カタログ番号CL3441、バッチ番号6312)が添加され、更に2時間インキュベートされた。次いで、s/nは移され、50μlのLDHの反応ミックス(Roche)と混合され、15分間の更なるインキュベーション後、吸光度(Ex)はTecan Sunriseリーダーで490/620nmで分析された。BT−474細胞に対する特異的抗体依存性毒性(n=4の平均+/−SD)は以下のように計算された:
(Ex.試料−Ex.自発的溶解/Ex.最大溶解−自発的溶解)×100.
結果を図30に示す。
このCDCアッセイは、仔ウサギ補体の存在下で、異なる抗Her2抗体(フォーマット、組み合わせ)の処置の際の瀕死/死細胞のマーカーとしてのLDHの放出を示す。
ここでは、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせは、CDCの有意な誘導をもたらしたが、親抗体単独ではもたらさなかった。驚くべきことに、両方のCLC Herceptarg変異体はより優れたCDC作用を誘発したが、一方Herceptarg Crossmab処置は親抗体の組み合わせよりも効果の弱いCDC反応をもたらしている。
1×1044のBT−474細胞/ウェルが96ウェルのE−プレート(ACEA Biosciences Inc.)に播種され、Xcelligence装置中で一晩増殖された。増殖培地は除去され、細胞は、無血清AIM−V培地(Gibco)で一回洗浄された。50μl/ウェルのAIM−V培地及びAIM−V中の50μlの抗体(3倍の最終濃度)が添加され、20分間インキュベートされた。50μlの仔ウサギ補体(Cedarlane)が添加され、CellIndex(CI;細胞の生存率についての代表として)が5分毎に測定された(曲線を参照)。以下の二重特異性Her2抗体が試験された:Herceptarg CLC D1−der wt”:配列番号64、54、92、Herceptarg CLC D1−der G2”:配列番号64、54、92(糖鎖操作変異体)「Herceptarg CrossMab」:配列番号109、110、111、112。
特異的CDCは下記式により算出され、ここで正規化された細胞指数である:
2つの代表時点において(反応開始後1時間及び2時間後)、特異的溶解(=CDC誘導細胞死)が算出され、図に示される(n=4の平均+/SEM)。
細胞株KPL4
このヒト乳がん細胞株は、炎症性皮膚転移を有する乳がん患者の悪性胸水から樹立されている。細胞は、J.Kurebayashi教授によって提供された(Kawasaki Medical School,Kurashiki,Japan)。腫瘍細胞は、5%CO2で水飽和大気中、37℃で10%ウシ胎児血清グルタミン(PAN Biotech,Germany)及び2mMのL−グルタミン(PAN Biotech,Germany)を補充したDMEM培地(PAN Biotech,Germany)中で常套的に培養された。培養継代は、トリプシン/EDTA 1×(PAN)を用いて行われ、2回/週、分割された。細胞継代P6がインビトロ研究に使用された。
雌SCIDベージュ(C.B.−17)マウス;年齢10−12週;体重18〜20g(Charles River Germany,Sulzfeld);体重>20gは、国際ガイドライン(GV−Solas;Felasa;TierschG)に従って12時間明/12時間暗黒の日々のサイクルによる特定病原体を含まない条件下で維持された。到着後、動物は、新しい環境に慣れるため、及び観察のために、1週間動物施設の検疫部で収容された。継続的な健康管理が定期的に実施された。ダイエット食品(Alltromin)及び水は自由に与えられた。実験的研究は、地方自治体によりレビューされ承認された。
注入の日に、腫瘍細胞は培養フラスコ(Greiner TriFlask)から回収され(トリプシン−EDTA)、び50mlの培地に移され、1回洗浄され、PBSに再懸濁された。PBSによる更なる洗浄工程及びろ過(セルストレイナー;Falconφ100μm)の後に、最終の細胞力価を1.5x108/mlに調整された。腫瘍細胞懸濁液は、細胞凝集を避けるため移送ピペットを用いて慎重に混合された。麻酔は、プレインキュベーションチャンバー(プレクシグラス)、個々のマウスの鼻マスク(シリコン)及び可燃性又は爆発性でない麻酔化合物イソフルラン(Pharmacia−Upjohn,Germany)を用いて小動物用のStephens吸入器を使用して閉鎖循環系で実行された。注入の2日前に、SCIDベージュマウスの外被は剃毛され、KPL−4細胞(3×10e6細胞)は、各麻酔マウスの右の最後から2番目の鼠径部乳腺脂肪体に20μlの容量で(Hamiltonマイクロシリンジ及び30Gx1/2”針を使用して)同所注入された。細胞懸濁液が、乳頭下の皮膚を介して注入された。
動物は、副作用の臨床症状の検出のために毎日管理された。モニタリングのため、実験を通して、動物の体重を毎週2回記録し、週2回腫瘍体積をキャリパーで測定した。腫瘍体積は、NCIプロトコルに従って算出された(腫瘍重量=1/2ab2、「a」及び「b」は、それぞれ腫瘍の長径、短径である)。終了基準はクリティカルな腫瘍塊(上限1.7g又は>1.5cm)、ベースラインから20%以上の体重減少、動物の腫瘍潰瘍又は悪い全身状態であった。動物に対する研究の除外基準が説明され、対応する「Tierversuchsanzeige」で承認される。
Claims (22)
- HER2の細胞外ドメインIIに特異的な第一抗原結合部位及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的な第二抗原結合部位を含む、HER2に特異的に結合する二重特異性抗体であって、該二重特異性抗体が、HER2の細胞外ドメインII及びIVの両方に対して一価である、二重特異性抗体。
- 前記抗体が、補体依存性細胞傷害をペルツズマブ又はトラスツズマブの組み合わせよりも高度に誘導する、請求項1に記載の二重特異性抗体。
- 二重特異性抗体の補体依存性細胞傷害が、LDHアッセイ又は補体アッセイによって決定され、同じアッセイによって決定される、ペルツズマブとトラスツズマブの組み合わせの補体依存性細胞傷害と比較される、請求項2に記載の二重特異性抗体。
- 補体依存性細胞傷害が、インビトロで、がん細胞において、好ましくは乳がん細胞において決定される、請求項2又は3に記載の二重特異性抗体。
- HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合可能な第一Fab分子、及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合可能な第二Fab分子を含み、ここで、第一Fab分子の可変軽鎖の配列が、第二Fab分子の可変軽鎖の配列と同一である、請求項1から4の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- (a)配列番号55、配列番号58、及び配列番号14からなる群から選択される重鎖CDR1;
配列番号77、配列番号15、及び配列番号60からなる群から選択される重鎖CDR2;配列番号56又は配列番号59及び配列番号16からなる群から選択される重鎖CDR3を含む第一重鎖、及び
(b)配列番号20の重鎖CDR1、配列番号29の重鎖CDR2、並びに配列番号30及び配列番号79からなる群から選択される重鎖CDR3を含む第二重鎖、
(c)第一及び第二軽鎖の可変軽鎖が配列番号89、配列番号90、及び配列番号19のCDRを含む、第一及び第二軽鎖を含む、請求項5に記載の二重特異性抗体。 - 配列番号54のアミノ酸配列を含む二つの可変軽鎖、配列番号64、配列番号70、及び配列番号68からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第一重鎖、並びに配列番号92及び配列番号117からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む可変重鎖を含む第二重鎖を含む、請求項5に記載の二重特異性抗体。
- HER2の細胞外ドメインIIに特異的に結合可能な第一Fab分子及びHER2の細胞外ドメインIVに特異的に結合可能な第二Fab分子を含み、ここで、少なくとも一のFab断片の重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域の何れかが交換される、請求項1から4の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 第一Fab分子が配列番号14の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号16の重鎖CDR3;並びに配列番号11の軽鎖CDR1;配列番号12の軽鎖CDR2、及び配列番号13の軽鎖CDR3を含み、且つ
第二Fab分子が配列番号20の重鎖CDR1;配列番号108の重鎖CDR2;配列番号79の重鎖CDR3;並びに配列番号107の軽鎖CDR1;配列番号18の軽鎖CDR2;及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。 - 第一Fab分子が配列番号14の重鎖CDR1、配列番号15の重鎖CDR2、及び配列番号16の重鎖CDR3;並びに配列番号11の軽鎖CDR1;配列番号12の軽鎖CDR2、及び配列番号13の軽鎖CDR3を含み、且つ
第二Fab分子が配列番号20の重鎖CDR1、配列番号29の重鎖CDR2、及び配列番号79、配列番号78、配列番号80、配列番号87、配列番号88からなる群から選択される重鎖CDR3;並びに配列番号104、配列番号103、及び配列番号158からなる群から選択される軽鎖CDR1;配列番号18の軽鎖CDR2、及び配列番号19の軽鎖CDR3を含む、請求項8に記載の二重特異性抗体。 - 第一Fab分子が配列番号22のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号24のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含み、且つ第二Fab分子が配列番号105のアミノ酸配列及び配列番号106のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項8又は9に記載の二重特異性抗体。
- 請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体を含む薬学的組成物。
- がんの治療のための請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 医薬としての使用のための請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体。
- 医薬の製造における請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体の使用。
- 医薬ががんの治療のためのものである、請求項15に記載の使用。
- 請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体の重鎖をコードする配列を含む核酸配列。
- 請求項1から11の何れか一項に記載の二重特異性抗体の軽鎖をコードする配列を含む核酸配列。
- 請求項17及び/又は請求項18に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項19に記載のベクターを含む原核又は真核宿主細胞。
- 抗体が産生されるように請求項20に記載の宿主細胞を培養することを含む抗体を産生する方法。
- 特に前述の実施例を参照して、本明細書に記載される本発明。
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