KR20230051214A - 항체 약물 접합체 - Google Patents

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티안시 첸
웨이웨이 펭
빙 좡
샤오치 탕
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샤오진 왕
후아스 셍
젱핑 좡
후아 왕
용 가오
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Abstract

본 발명은 구체적으로 연결된 치료용 항체 모이어티, 중간 링커 모이어티 및 세포독성 약물 모이어티를 포함하는 항체 약물 결합체를 제공한다. 치료용 항체 모이어티는 HER2 표적에 대한 항체이다. 세포독성 약물 모이어티는 캄프토테신 토포이소머라제 I 억제제이다. 세포독성 약물 모이어티 또는 링커-세포독성 약물 모이어티는 중수소 치환에 의해 변형된다. 항체 약물 접합체는 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.

Description

항체 약물 접합체
본 발명은 연결된 치료용 항체 모이어티, 중간 링커 모이어티 및 세포독성 약물 모이어티를 포함하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암을 예방하고 치료하기 위한 의약품을 제조하는 데 있어서 항체-약물 접합체의 사용에 관한 것이다.
항체-약물 접합체(ADC)는 치료용 항체의 높은 특이성과 세포독성 약물의 높은 살상 활성을 결합한 약물 종류로, 치료용 항체 모이어티가 중간 링커 모이어티를 통해 세포독성 약물 모이어티에 연결된다. 현재 전 세계적으로 최소 8개의 ADC 약물이 시판되고 있으며, 그 중 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 폴라투주맙 베도틴(polatuzumab vedotin) 및 엔포르투맙 베도틴(enfortumab vedotin)의 항체 부분은 각각 CD30, CD79b, 넥틴-4를 대상으로 하고; 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine) 및 트라스투주맙 데룩스테칸(trastuzumab deruxtecan)의 항체 모이어티는 표적 HER2를 대상으로 하고; 젬투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin) 및 이노투주맙 오조가마이신(inotuzumab ozogamicin)의 항체 모이어티는 각각 표적 CD33 및 CD22를 대상으로 하고; 사시투주맙 고비테칸(sacituzumab govitecan)의 항체 모이어티은 표적 TROP2를 대상으로 한다. 세포독성 약물 모이어티의 경우, 브렌툭시맙 베도틴, 폴라투주맙 베도틴 및 엔포르투맙 베도틴은 미세소관에 작용하는 오리스타틴 독소 분자를 채택하고, 트라스투주맙 엠탄신은 미세소관에 작용하는 메이탄시노이드 독소 분자를 채택하고, 젬투주맙 오조가마이신 및 이노투주맙 오조가마이신은 DNA에 작용하는 칼리케아미신 독소 분자를 채택하고, 가장 최근에 시판된 트라스투주맙 데룩스테칸 및 사시투주맙 고비테칸은 캄프토테신 유사 독소 분자를 채택한다. 중간 링커 부분의 경우, 트라스투주맙 엠탄신은 절단 불가능한 링커를 채택하고, 상기 ADC 약물 중 나머지 7개는 절단 가능한 링커를 채택한다.
캄푸토테신(CPT) 유사체 및 유도체는 광범위한 종양 유형에 대해 유의한 활성을 보이는 토포이소머레이스 I에 결합하여 항종양 활성을 나타낸다. CPT의 낮은 수용성을 극복하기 위해 연구자들은 다양한 CPT 유도체를 합성했으며, 그 중 이리노테칸 염산염(CPT-11)은 전이성 대장암 치료용으로 승인된 수용성 전구약물이다. 그러나 CPT-11은 활성 형태인 SN-38(화학식 I)로 전환되기 전에 생체 내에서 카르복실에스테라제에 의해 촉매되어야 하는데, 이 전환은 매우 비효율적이며 SN38 자체는 용해도가 낮아 약물로 제조하기 어렵다. 또 다른 수용성 CPT 유도체인 엑사테칸(화학식 II)은 항종양제로서 개발이 시도되었으나 2004년까지 개발이 중단되었으며, 엑사테칸은 효소에 의해 활성화될 필요가 없다. 또한, 이리노테칸의 약력학적 온톨로지인 SN-38에 비해 엑사테칸은 토포이소머레이스 I의 활성에 더 강한 억제 효과를 갖는다.
Figure pct00001
Figure pct00002
ADC 약물은 세포독성 소분자의 높은 효능과 특정 종양 세포에 대한 항체의 높은 선택성의 두 가지 이점을 결합하지만 더 많은 적응증을 표적으로 할 수 있는 매우 강력하고 독성이 낮은 ADC 약물의 개발이 여전히 필요한 실정이다.
일 양상에서, 본 발명은 중수소화 변형, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 함유하는 항체-약물 접합체를 제공하고, 구체적으로 링커 또는 세포독성 약물 모이어티의 중수소화 변형에 관한 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 Ab는 항체 모이어티를 나타내고, L은 링커 모이어티를 나타내고, U는 세포독성 모이어티를 나타내고, 상기 n은 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수 또는 소수이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물를 제공하며, 상기 Ab(항체 모이어티)는 종양 항원(종양 특이적 항원 및 종양 관련 항원 포함)에 특이적으로 결합할 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 임의의 종양 예방 또는 치료 표적으로부터 선택될 수 있으며, 예를 들어 HER2, EGFR, CD20, CD30, CD33, CD47, CD79b, VEGF, VEGFR, MET, RET, PD-1, PD-L1 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시예에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 Ab(항체 부분)는 변형 가능할 수 있으며, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산의 변화, 첨가 또는 감산을 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 부분 Ab는 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체이다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 항체 모이어티 Ab는 하기 표 1에 나타낸 서열을 갖는 트라스주맙이다.
트라스주맙 서열
중쇄 가변 영역 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFNIK DTYIHWVRQA PGKGLEWVAR IYPTNGYTRY ADSVKGRFTI SADTSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCSRWG GDGFYAMDYW GQGTLVTVSS (서열번호 40)
중쇄 CDR1 GFNIKDTYIH (서열번호 44)
중쇄 CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열번호 28)
중쇄 CDR3 WGGDGFYAMDYW (서열번호 29)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDVN TAVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASFLYSGVPS RFSGSRSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ HYTTPPTFGQ GTKVEIK (서열번호 39)
경쇄 CDR1 CRASQDVNTAVAW (서열번호 30)
경쇄 CDR2 SASFLYS (서열번호 33)
경쇄 CDR3 QQHYTTPPT (서열번호 32)
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 항체 모이어티 Ab는 하기 표 2에 나타낸 서열을 갖는 퍼투주맙이다.
퍼투주맙 서열
중쇄 가변 영역 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFT DYTMDWVRQA PGKGLEWVAD VNPNSGGSIY NQRFKGRFTL SVDRSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNL GPSFYFDYWG QGTLVTVSS (서열번호 37)
중쇄 CDR1 GFTFTDYTMD (서열번호 45)
중쇄 CDR2 DVNPNSGGSIYNQRFKG (서열번호 46)
중쇄 CDR3 NLGPSFYFDY (서열번호 47)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDVS IGVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRYTGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YYIYPYTFGQ GTKVEIK (서열번호 38)
경쇄CDR1 KASQDVSIGVA (서열번호 48)
경쇄 CDR2 SASYRYT (서열번호 49)
경쇄 CDR3 QQYYIYPYT (서열번호 50)
일부 실시예에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 그 용매화물을 제공하며, 상기 항체 부분 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하고, 제1 항원-결합 단편은 VH 및 VL을 포함하는 scFv이고, VH는 K30 돌연변이 및/또는 VL은 F53 돌연변이를 갖는다. 일부 실시예에서, VH 서열의 30번 위치의 아미노산은 K로부터 산성 아미노산, 예를 들어, E로 돌연변이된다. 일부 실시예에서, VL의 서열에서 53번 위치의 아미노산은 F로부터 중성 또는 염기성 아미노산, 예를 들어 Y, A 또는 R로 돌연변이된다. 예를 들어, 상기 scFv는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에서 K30 돌연변이 및/또는 F53 돌연변이를 갖는 서열일 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 27, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 34 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하며; 상기 서열번호 27에 제시된 서열은 GFNIX2DTYIH이고, 여기서 X2는 K 또는 E이고; 서열번호 34에 제시된 서열은 SASX1LYS이고, 여기서 X1은 F 또는 Y이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3은 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, 다음을 포함하는 군에서 선택된다.
i. 각각 서열번호 41 및 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편; 및
ii. 서열번호 41 및 42에 각각 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편.
상기 서열번호 41에 개시된 서열은 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIX2DTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS이고, 상기 X2는 K 또는 E이고;
상기 서열번호 42에 개시된 서열은 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASX1LYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK, 여기서 X1은 F 또는 Y이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, 각각 서열번호 35 및 36에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며, 상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, VH 및 VL이 다음과 같은 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열된다:VH-링커-VL.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하고, 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하고, 상기 제2 항원-결합 단편은 Fab이며, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3은 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3은 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 단편을 추가로 포함하고, 상기 제2 항원-결합 단편은 scFv이고, 각각 서열번호 37 및 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 항체 모이어티 Ab는 하기 표 3에 개시되어 있다.
예시적인 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 항체 모이어티
명칭 설명 제1 항원-결합 단편
(Kabat 번호 선정 시스템에 따름)		 제2 항원-결합 단편
/ Epitope-containing domain ECD4 ECD2
Form scFV Fab
Original sequence Trastuzumab Pertuzumab
1 Sequence substitution VL: F53Y /
2 Sequence substitution VH: K30E /
3 Sequence substitution VL: F53Y
VH: K30E		 /
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 또는 CH3 중 하나 이상, 또는 ii. Fc이다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 또는 CH3 중 하나 이상, 또는 ii. Fc이고, 상기 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc는 각각 인간 IgG의 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc에서 유래된다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 또는 CH3 중 하나 이상, 또는 ii. Fc이고, 상기 CL, CH1, CH2, CH3 또는 Fc는 변형을 갖거나 갖지 않는 것이며, 바람직하게는 CH3 또는 Fc는 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 435 및/또는 위치 436에서 아미노산 치환인 변형을 갖는다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 또는 CH3 중 하나 이상, 또는 ii. Fc이고, 상기 Fc는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이량체 Fc이고, 제1 항원 결합 단편은 제1 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 결합 단편은 제2 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결된다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 불변 영역을 포함하고, 여기서 불변 영역은 면역글로불린의 천연 서열 불변 영역 또는 돌연변이된 불변 영역이다. 예를 들어 천연 또는 돌연변이된 CL, CH1, CH2 및/또는 CH3 기능성 도메인 중 하나 이상일 수 있고; 일부 예에서, 이러한 기능성 도메인은 당업계의 통상적인 방식으로 작동 가능하게 연결되며, 불변 영역은 인간 면역글로불린의 불변 영역, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래될 수 있고, 일부 예에서, 불변 영역은 이펙터 기능을 매개하는 능력을 개선하기 위해 수정될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 면역글로불린 기능적 도메인 또는 골격, 예를 들어 Fc를 포함하고, 제1 항원 결합 단편 및/또는 제2 항원 결합 단편에 작동 가능하게 연결된다; Fc라는 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함하고, Fc는 인간 Fc일 수 있으며, 예를 들어, 이것은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래되고 Fc는 이펙터를 매개하는 능력이 향상되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 상기 골격은 노브-인투-홀(knob into hole), H435R, Y436F 및 탈푸코실화(defucosylation) 등과 같은 변형을 갖는다; 일부 실시예에서, 상기 골격에서 놉 인투 홀의 돌연변이 부위는 예를 들어 Y349C, T366S, L368A, Y407V, S354C 및 T366W 등을 포함한다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 골격 및/또는 제2 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명에 기재된 골격은 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는 이량체 Fc이다. 일 실시예에서, 본 발명에 기재된 이합체 Fc는 변형을 갖는다. 일부 실시예에서, 이합체 Fc는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬 중 하나 또는 둘 모두에서 발생할 수 있는 H435R 변형 및/또는 Y436F 변형을 갖는다. 일 실시예에서, 이합체 Fc는 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬 중 하나 또는 둘 모두에서 발생할 수 있는 H435R 변형 및/또는 Y436F 변형을 갖는다. 구체적으로, 이량체 Fc는 H435R 변형 및/또는 Y436F 변형을 가지며, 이는 다른 Fc 폴리펩티드가 아닌 하나의 Fc 폴리펩티드에서만 발생한다. 일 실시예에서, 이량체 Fc는 Y349C, T366S, L368A, Y407V, S354C, T366W 등과 같은 놉 인투 홀 돌연변이 부위를 갖는다. 일 실시예에서, 이합체 Fc의 한 사슬은 T366W 또는/및 S354C를 갖고, 다른 사슬은 Y407V, Y349C, T366S 또는/및 L368A를 갖는다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 서열번호 11에 기재된 중쇄, 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 15에 기재된 경쇄를 포함하는 2가 이중특이적 항체이다.
일부 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 항체 모이어티 Ab는 하기 표 4에 개시되어 있다.
명칭 설명 아미노산 서열
Expi Her2-2/
23C-HER2-2		 제1 항원-결합 단편 (scFV) 중쇄 CDR1 GFNIEDTYIH (서열목록 43)
중쇄CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열목록 28)
중쇄CDR3 WGGDGFYAMDYW (서열목록 29)
중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (서열목록 35)
경쇄n CDR1 CRASQDVNTAVAW (서열목록 30)
경쇄 CDR2 SASYLYS (서열목록 31)
경쇄 CDR3 QQHYTTPPT (서열목록 32)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열목록 36)
항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
(서열목록 11)
제2 항원-결합 단편 (Fab) 중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열목록 37)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열목록 38)
항-Her2-domain2-HC-
Fc		 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (서열목록 13)
항-Her2-domain2-LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열목록 15)
Expi Her2-3/
23C-HER2-3		 제1 항원-결합 단편 (scFV) 중쇄 CDR1 GFNIEDTYIH (서열목록 43)
중쇄 CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열목록 28)
중쇄 CDR3 WGGDGFYAMDYW (서열목록 29)
중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (서열목록 35)
경쇄CDR1 CRASQDVNTAVAW (서열목록 30)
경쇄 CDR2 SASFLYS (서열목록 33)
경쇄 CDR3 QQHYTTPPT (서열목록 32)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열목록 39)
제2 항원-결합 단편 (Fab) 중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열목록 37)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열목록 38)
Expi Her2-4/
23C-HER2-4		 제1 항원-결합 단편 (scFV) 중쇄 CDR1 GFNIKDTYIH (서열목록 44)
중쇄 CDR2 RIYPTNGYTRYADSVKG (서열목록 28)
중쇄 CDR3 WGGDGFYAMDYW (서열목록 29)
중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (서열목록 40)
경쇄 CDR1 CRASQDVNTAVAW (서열목록 30)
경쇄 CDR2 SASYLYS (서열목록 31)
경쇄 CDR3 QQHYTTPPT (서열목록 32)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK (서열목록 36)
제2 항원-결합 단편
(Fab)		 중쇄 가변 영역 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSS (서열목록 37)
경쇄 가변 영역 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIK (서열목록 38)
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 세포독성 약물 모이어티 U는 링커 모이어티 L을 통해 항체 모이어티 Ab에 접합된다. 본 발명에 개시된 링커 모이어티 L은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 항체 모이어티에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 링커 모이어티는 설피드릴(sulfydryl) 그룹 및/또는 아미노 그룹을 통해 항체 모이어티에 연결된다. 일부 더 바람직한 실시예에서, 본 발명에 개시된 링커 모이어티는 설피드릴(sulfydryl) 그룹을 통해 항체 모이어티에 연결된다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 세포독성 약물 모이어티 U는 절단 가능한 링커 또는 절단 불가능한 링커일 수 있는 링커 모이어티 L을 통해 항체 모이어티 Ab에 접합되고; 일 실시예에서, 본 발명에 개시된 링커 모이어티는 예를 들어, 낮은 pH-의존성 분해 유형(히드라존 결합, 카보네이트 결합 등 포함), 단백질 분해 유형(펩티드-기반 결합 포함), 고글루타티온 농도 의존적 분해 유형(이황화 결합 포함) 등과 같은 절단가능한 링커이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명에 개시된 링커 모이어티는 절단 불가능한 링커이고, 예를 들어 말레이미도카프로일 등일 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 항체 모이어티 Ab는 예를 들어 알칼로이드, 항대사제, 항종양 항생제, 알킬화제, 백금계 약물 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 세포독성 약물 모이어티 U에 접합되고, 바람직하게는 세포독성 약물은 미세소관 억제제(메이탄시노이드, 오리스타틴 포함) 또는 DNA-작용 세포독성 약물(칼리케아미신, 듀오카르마이신, PBD(피롤로벤조디아제핀), 토포이소머라제 I 억제제 등 포함)이다.
일 특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 세포독성 약물 모이어티 U는 토포이소머라제 I 억제제이다.
일 특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 세포독성 약물 모이어티 U는 캄프토테신 유사체 토포이소머라제 I 억제제이다.
일 바람직한 특정 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 세포독성 약물 모이어티 U는 SN-38, SN-38 유도체, 엑사테칸 및 엑사테칸 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 Ab는 항체 모이어티를 나타내고, L은 링커 모이어티를 나타내고, U는 세포독성 약물 모이어티를 나타내고, n은 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수 또는 소수이며, U는 캄프토테신 토포아이소머라제 Ⅰ 억제제이고, L 모이어티 및/또는 U 모이어티는 중수소화 변형을 갖는다. 일 실시예에서, n은 2 내지 10, 예를 들어, 2 내지 9, 2 내지 8, 3 내지 9, 3 내지 8, 4 내지 9, 4 내지 8, 5 내지 9 및 5에서 8로 이루어진 그룹으로부터 선택된 정수 또는 소수이다.
일 실시예에서, 본 발명은 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며, 상기 Ab는 항체 모이어티를 나타내고, L은 링커 모이어티를 나타내고, U는 세포독성 약물 모이어티를 나타내고, n은 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수 또는 소수이며, U는 캄프토테신 토포아이소머라제 Ⅰ 억제제이고, L 모이어티 및/또는 U 모이어티는 중수소화 변형을 갖으며, 포독성 약물 모이어티 U는 SN-38, SN-38 유도체, 엑사테칸 및 엑사테칸 유도체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 하기 화학식 III의 구조를 포함한다:
[화학식 III]
Figure pct00003
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 하기 화학식 IV의 구조를 포함한다:
[화학식 IV]
Figure pct00004
상기 R1은 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 군에서 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 하기 화학식 IV-1 또는 IV-2의 구조를 포함한다:
[화학식 IV-1]
Figure pct00005
[화학식 IV-2]
Figure pct00006
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 하기 화학식 V의 구조를 포함한다:
[화학식 V]
Figure pct00007
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구조의 왼쪽 석신이미드 말단은 항체 모이어티에 연결되는 부위이고, 오른쪽 카보닐 말단은 세포독성 약물 모이어티에 연결되는 부위이다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 V-1, V-2, V-3 또는 V-4의 구조를 포함하고, 화학식 V-1 내지 V-4의 구조는 각각 좌측 석신이미드 말단에 의해 항체 모이어티에 연결되고 우측 카보닐 말단에 의해 세포독성 약물 모이어티에 연결된다:
[화학식 V-1]
Figure pct00008
[화학식 V-2]
Figure pct00009
[화학식 V-3]
Figure pct00010
[화학식 V-4]
Figure pct00011
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 VI의 구조를 포함한다:
[화학식 VI]
Figure pct00012
상기 R1 및 R2는 각각 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 VI-1, VI-2, VI-3 또는 VI-4의 구조를 갖는다:
[화학식 VI-1]
Figure pct00013
[화학식 VI-2]
Figure pct00014
[화학식 VI-3]
Figure pct00015
[화학식 VI-4]
Figure pct00016
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 VII의 구조를 갖는다:
[화학식 VII]
Figure pct00017
상기 Ab는 제1 항원-결합 단편 및 제2 항원-결합 단편을 포함하는 항체 모이어티를 나타내고, 제1 항원-결합 단편은 scFv이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 제2 항원-결합 단편은 Fab이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이고, R1 및 R2는 수소(H) 및 중수소(D)로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 VII-1, VII-2, VII-3 또는 VII-4의 구조를 갖는다:
[화학식 VII-1]
Figure pct00018
[화학식 VII-2]
Figure pct00019
[화학식 VII-3]
Figure pct00020
[화학식 VII-4]
Figure pct00021
상기 Ab는 제1 항원-결합 단편 및 제2 항원-결합 단편을 포함하는 항체 모이어티를 나타내고, 제1 항원-결합 단편은 scFv이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 제2 항원-결합 단편은 Fab이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이다.
일 실시예에서, 본 발명에 제공된 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 화학식 VII-1의 구조를 갖는다:
[화학식 VII-1]
Figure pct00022
상기 Ab는 제1 항원-결합 단편 및 제2 항원-결합 단편을 포함하는 항체 모이어티를 나타내고, 제1 항원-결합 단편은 scFv이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, 제2 항원-결합 단편은 Fab이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하며, n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이다.
일 실시예에서, 본 발명은 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며,
[화학식 VII]
Figure pct00023
상기 Ab는 트라스투주맙이고, n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이고, R1 및 R2는 수소(H) 및 중수소(D)로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택된다.
일 실시예에서, 본 발명은 하기 화학식 VII-1의 구조를 갖는 항체-약물 접합체, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물을 제공하며,
[화학식 VII-1]
Figure pct00024
상기 Ab는 트라스투주맙이고, n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용되는 담체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 암 예방 및 치료용 의약 제조에서의 용도를 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다.
일 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약
학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 또는 본 명세서에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물의 치료 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물은 HER2 양성 암, HER2 음성 암, 및 면역조직화학적 분석에 의해 검출된 IHC2+로서 HER2 발현을 나타내는 암의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 항체를 중간체 화합물에 연결하는 항체-약물 접합체를 얻는 데 사용하기 위한 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 링커-약물 중간체 화합물을 제공한다:
[화학식 VI]
Figure pct00025
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 그룹으로부터 선택됨.
일 양상에서, 본 발명은 항체를 중간체 화합물에 연결하는 항체-약물 접합체를 얻는 데 사용하기 위한 하기 화학식 VI-1, VI-2, VI-3 또는 VI-4의 구조를 갖는 링커-약물 중간체 화합물을 제공한다:
[화학식 VI-1]
Figure pct00026
[화학식 VI-2]
Figure pct00027
[화학식 VI-3]
Figure pct00028
[화학식 VI-4]
Figure pct00029
일 양상에서, 본 발명은 링커를 통해 약물을 항체에 연결하는 항체-약물 접합체를 얻는 데 사용하기 위한 하기 화학식 V의 구조를 갖는 링커 화합물을 제공한다:
[화학식 V]
Figure pct00030
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 구조의 왼쪽 석신이미드 말단은 항체 모이어티에 연결되는 부위이고, 오른쪽 카보닐 말단은 세포독성 약물 모이어티에 연결되는 부위이다.
일 양상에서, 본 발명은 링커를 통해 약물을 항체에 연결하는 항체-약물 접합체를 얻는 데 사용하기 위한 하기 화학식 V-1, V-2, V-3 또는 V-4의 구조를 갖는 링커 화합물을 제공하며, 화학식 V-1 내지 V-4의 구조는 각각 좌측 석신이미드 말단에 의해 항체 모이어티에 연결되고 우측 카보닐 말단에 의해 세포독성 약물 모이어티에 연결된다:
[화학식 V-1]
Figure pct00031
[화학식 V-2]
Figure pct00032
[화학식 V-3]
Figure pct00033
[화학식 V-4]
Figure pct00034
일 양상에서, 본 발명은 하기 화학식 IV(a)의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
[화학식 IV(a)]
Figure pct00035
상기 R1은 수소(H) 및 중수소(D)로 구성된 그룹에서 선택된다.
일 양상에서, 본 발명은 하기 화학식 IV(a)-1 또는 화학식 IV(a)-2의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
[화학식 IV(a)]
Figure pct00036
[화학식 IV(a)]
Figure pct00037
일 양상에서, 본 발명은 하기 화학식 III(a)의 구조를 갖는 화합물을 제공한다:
[화학식 III(a)]
Figure pct00038
본 발명은 개선된 약동학적 특성을 갖는 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물을 제공한다. 개선된 약동학적 특성에 의해 표적 화합물의 독성 감소, 안전성 및/또는 내약성의 증가, 효능의 증가 및 최종 치료 기간의 개선을 가져올 것이다.
달리 명시되지 않는 한, 여기에서 사용되는 다음 용어는 다음과 같은 의미를 갖는다. 특정 용어는 달리 구체적으로 정의되지 않는 한 불확실하거나 불분명한 것으로 간주되어서는 안 되며 해당 분야의 일반적인 의미에 따라 해석되어야 한다. 예를 들어, Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Inc., 미국 뉴욕(2012); Abbas 등, Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Science Health Science div (2009); He Wei et al., Medical Immunology, (2nd ed), People's Medical Publishing House, 2010. 상기 상품명을 언급할 때, 이는 해당 상업 제품 또는 활성 성분을 지칭하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 용어 "치환된"은 특정 원자의 원자가가 정상이고 생성된 화합물이 안정한 한 특정 원자 상의 임의의 하나 이상의 수소 원자가 치환기로 치환되는 것을 의미한다. 치환기가 옥소(즉, =O)일 때, 이는 2개의 수소 원자가 치환된 것을 의미하며 옥소는 방향족 그룹에서 이용가능하지 않다.
본 명세서에 기재된 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 이후에 설명된 사건 또는 상황이 반드시 발생하지는 않지만 발생할 수 있음을 의미하며, 설명에는 사건이나 상황이 발생하는 경우와 사건이나 상황이 발생하지 않는 경우가 포함됩니다. "임의로 치환된" 특정 그룹은 그룹이 치환되거나 비치환될 수 있음을 의미하며, 예를 들어, 에틸이 할로겐으로 "임의로" 치환된다는 것은 에틸이 비치환(CH2CH3), 모노치환(예: CH2CH2F), 폴리치환(예를 들어, CHFCH2F, CH2CHF2 등), 또는 완전히 치환(CF2CF3)됨을 의미한다. 하나 이상의 치환기를 포함하는 임의의 그룹에 대하여, 공간적으로 합성할 수 없거나 합성할 수 없는 임의의 치환 또는 치환 패턴이 도입되지 않는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기서 사용되는 Cm-n은 주어진 범위에서 정수개의 탄소 원자를 갖는 부분을 의미한다. 예를 들어, "C1-6"은 기가 1개의 탄소 원자, 2개의 탄소 원자, 3개의 탄소 원자, 4개의 탄소 원자, 5개의 탄소 원자 또는 6개의 탄소 원자를 가질 수 있음을 의미한다.
임의의 변수(예: R)가 화합물의 구성 또는 구조에서 두 번 이상 발생하는 경우 변수는 각 경우에 독립적으로 정의된다. 따라서, 예를 들어, 그룹이 2개의 R로 치환된 경우 각 R의 정의는 독립적이다.
예를 들어 -(CH2)0-와 같이 연결기가 0이면 연결기가 공유결합임을 의미한다.
변수가 단일 결합인 경우 두 그룹이 직접 연결되어 있음을 의미한다. 예를 들어, A-L-Z에서, L이 단일 결합을 나타내는 경우 구조가 실제로 A-Z임을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "할로-" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "하이드록시"는 -OH 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "시아노"는 -CN 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "설피드릴"는 -SH 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "아미노"는 -NH2 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "니트로"는 -NO2 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "알킬"은 CnH2n+1의 일반식을 갖는 하이드로카르빌을 의미한다. 알킬은 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들어, "C1-6 알킬"이라는 용어는 1~6개의 탄소 원자를 포함하는 알킬(예: 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, n- 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 네오펜틸, 헥실, 2-메틸펜틸 등)을 의미한다. 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 알킬술포닐 및 알킬티오의 알킬 잔기(즉, 알킬)는 상기와 유사하게 정의된다.
본 명세서에 기재된 용어 "알콕시"는 -O-알킬을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "알킬아미노"는 -NH-알킬을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "디알킬아미노"는 -N(알킬)2 그룹을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "알킬술포닐"는 -SO2-알킬을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "알킬티오"는 -S-알킬을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어“알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 갖는 탄소 원자 및 수소 원자로 이루어진 선형 또는 분지형 불포화 지방족 히드로카르빌을 의미한다. 알케닐의 비제한적 예는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 1-부테닐, 이소부테닐, 1,3-부타디에닐 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "알키닐"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 탄소 원자 및 수소 원자로 이루어진 선형 또는 분지형 불포화 지방족 히드로카르빌을 지칭한다. 알키닐의 비제한적 예는 에티닐(-C≡CH), 1-프로피닐(-C≡C-CH3), 2-프로피닐(-CH2-C≡CH), 1,3- 부타디이닐(-C≡C-C≡CH) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "사이클로알킬"은 완전히 포화되고 모노사이클릭, 가교된 사이클릭 또는 스피로 사이클릭 구조의 형태로 존재할 수 있는 탄소 고리를 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 탄소 고리는 일반적으로 3-10개의 고리이다. 사이클로알킬의 비제한적 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 노르보르닐(비시클로[2.2.1]헵틸), 비시클로[2.2.2]옥틸, 아다만틸 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "사이클로알케닐"은 완전히 포화되지 않은 비방향족 탄소 고리를 말하며 모노사이클릭, 브리지드 사이클릭 또는 스피로 사이클릭 구조의 형태로 존재할 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 탄소 고리는 일반적으로 5-8개의 고리입니다. 사이클로알케닐의 비제한적 예는 사이클로펜테닐, 사이클로펜타디에닐, 사이클로헥세닐, 사이클로헥사디에닐, 사이클로헵테닐, 사이클로헵타디에닐 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "헤테로사이클릴"은 모노사이클릭, 가교된 사이클릭 또는 스피로 사이클릭 구조의 형태로 존재할 수 있는 완전히 포화되거나 부분적으로 불포화된(그러나 완전히 불포화된 헤테로방향족 그룹은 아님) 비방향족 고리를 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 헤테로사이클릴은 일반적으로 황, 산소 및/또는 질소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 헤테로원자(바람직하게는 1 또는 2개의 헤테로원자)를 함유하는 3-7개의 고리이다. 헤테로사이클릴의 비제한적 예는 옥시라닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로푸라닐, 피롤리디닐, N-메틸피롤리디닐, 디히드로피롤릴, 피페리디닐, 피페라지닐, 피라졸리디닐, 4H-피라닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라히드로티에닐 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "헤테로사이클로알킬"은 모노사이클릭, 가교된 사이클릭 또는 스피로 사이클릭 구조의 형태로 존재할 수 있는 완전히 포화된 사이클릭 그룹을 의미한다. 달리 명시되지 않는 한, 헤테로사이클릴은 일반적으로 황, 산소 및/또는 질소로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된 1-3개의 헤테로원자(바람직하게는 1 또는 2개의 헤테로원자)를 함유하는 3-7개의 고리이다. 3개 고리 헤테로사이클로알킬의 예는 옥시라닐, 티라닐 및 아지라닐을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 4개 고리 헤테로사이클로알킬의 비제한적 예는 아제티디닐, 옥세타닐 및 티에타닐을 포함하지만 이에 제한되지 않으며; 5개 고리 헤테로시클로알킬의 예는 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 피롤리디닐, 이속사졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 티아졸리디닐, 이미다졸리디닐 및 테트라히드로피라졸릴을 포함하나 이에 제한되지 않으며; 6개 고리 헤테로사이클로알킬의 예는 피페리디닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 모르폴리닐, 피페라지닐, 1,4-티옥사닐, 1,4-디옥사닐, 티오모르폴리닐, 1,3-디티아닐 및 1,4-디티아닐을 포함하나, 이에 제한되지 않으며; 7개 고리 헤테로사이클로알킬의 예는 아자사이클로헵타닐, 옥사사이클로헵타닐 및 티오사이클로헵타닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 헤테로사이클로알킬은 5 또는 6개의 고리 원자를 갖는 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬이다.
본 명세서에 기재된 용어 "아릴"은 결합된 pi-전자 시스템을 갖는 탄소 원자의 방향족 모노사이클릭 또는 융합된 폴리사이클릭 그룹을 의미한다. 예를 들어, 아릴은 6-20개의 탄소 원자, 6-14개의 탄소 원자 또는 6-12개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 아릴의 비제한적 예는 페닐, 나프틸, 안트릴, 1,2,3,4-테트라히드로나프탈렌 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 용어 "헤테로아릴"은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 고리 원자를 포함하고 나머지 고리 원자는 C이고 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 모노시클릭 또는 융합된 폴리시클릭 시스템을 지칭한다. 바람직하게는, 헤테로아릴은 단일 4-8개의 고리, 특히 5-8개의 고리를 갖거나, 6-14개의 고리, 특히 6-10개의 고리를 포함하는 복수의 융합된 고리이다. 헤테로아릴의 비제한적 예는 피롤릴, 푸라닐, 티에닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 피라졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 테트라졸릴, 트리아졸릴, 트리아졸릴, 벤조티에닐, 아이소졸릴 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "유도체": 모화합물의 분자 내의 원자 또는 원자기가 다른 원자 또는 원자기로 치환되어 형성된 화합물을 모화합물의 유도체라고 한다.
본 명세서에 표시되고 합성된 화합물의 원자는 특별히 지정되지 않는 한 원자의 안정한 동위원소를 나타낼 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 구조 내의 위치가 H, 즉 수소(H-1)로 정의될 때, 이 위치는 자연적으로 발생하는 동위원소만을 포함한다. 마찬가지로, 달리 명시되지 않은 한, 구조물의 위치가 D, 즉 중수소(H-2)로 정의될 때, 이 위치는 구조물의 하나 이상의 위치일 때 자연적으로 발생하는 동위원소의 양(0.015%)보다 최소 3340배 많은 양(즉, 50.1% 이상의 중수소 동위원소)을 포함하고, 표지 합성 화합물은 D, 즉 중수소(H-2)로 정의되며, 구조로 표시되는 화합물의 함량은 52.5% 이상, 60% 이상, 67.5% 이상, 75% 이상, 82.5% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 98.5% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상일 수 있다. 본 명세서에 표시되고 합성된 화합물의 중수소화 비율은 표지 합성 동위원소의 양에 대한 자연발생 동위원소의 양의 비율을 의미한다. 본 명세서에 표시되어 합성된 화합물의 지정된 중수소 원자당 중수소 비율은 3500배 이상(52.5%), 4000배 이상(60%), 4500배 이상(67.5%), 5000배 이상(75%)일 수 있고, 최소 5500배(82.5%), 최소 6000배(90%), 최소 6333.3배(95%), 최소 6466.7배(97%), 최소 6566.7배(98.5%), 최소 6600배(99%), 최소 6633.3배(99.5%)일 수 있다. 본 명세서에서 동위원소는 화학 구조의 관점에서 동위원소 조성만 다른 화합물을 의미한다. 따라서 본 명세서에서 표지 합성된 특정 위치의 중수소 함유 화합물도 이 위치에 수소 동위원소를 거의 포함하지 않으며, 본 명세서에서 표지 합성된 화합물의 특정 위치에서의 수소 동위원소의 양은 중수소화제의 중수소 동위원소 순도(D2O, D2, NaBD4, LiAlD4 등) 및 중수소 동위원소 합성 방법 도입의 효율성을 포함하여 많은 요인에 따라 달라진다. 그러나 앞서 언급한 바와 같이 특정 위치에서 이러한 수소 동위원소의 총량은 49.9% 미만일 것이다. 본 명세서에 표시되어 합성된 화합물 내의 특정 위치에서의 수소 동위원소의 총량은 47.5%, 40%, 32.5%, 25%, 17.5%, 10%, 5%, 3%, 1% 또는 0.5% 미만일 것이다.
본 발명에서, 중수소로 지정되지 않은 모든 개별 원자는 자연 동위원소 함량으로 존재한다.
본 명세서에 기재된 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 다음을 포함하여 질병 또는 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 예방, 개선 또는 제거하기 위해 본 명세서에 설명된 화합물 또는 제제를 투여하는 것을 의미한다:(i) 포유동물에서 질병 또는 질병 상태의 발생을 예방하는 것, 특히 그러한 포유동물이 질병 상태에 걸리기 쉬운 경향이 있지만 아직 진단되지 않은 경우; (ii) 질병 또는 질병 상태를 억제하는 것, 즉 발병을 저지하는 것; (iii) 질병 또는 질병 상태의 완화, 즉 퇴행 유발하는 것.
본 명세서에 기재된 용어 "치료적 유효량"이란 (i) 특정 질병, 상태 또는 장애를 치료 또는 예방하거나 (ii) 특정 질병, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 완화, 개선 또는 제거하거나, (iii) 특정 질병, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 개시를 예방하거나 지연시키기 위한 본 발명에 기재된 화합물의 양을 의미한다. "치료적 유효량"을 구성하는 본 출원의 화합물의 양은 화합물, 질병 상태 및 이의 중증도, 투여 경로 및 치료할 포유동물의 연령에 따라 다르지만, 통상적으로 당업자의 지식 및 본 명세서에 개시된 내용에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 재료, 조성물 및/또는 투약 형태에 사용되며, 합리적인 유익성/위해성 비율로 측정한다.
약학적으로 허용되는 염으로는 예를 들어 금속염, 암모늄염, 유기염, 무기산으로 형성된 염, 유기산으로 형성된 염, 염기성 또는 산성 아미노산으로 형성된 염 등을 들 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "용매화물"은 화합물과 용매 분자가 결합하여 형성된 물질을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "약제학적 조성물"은 본원에 개시된 하나 이상의 화합물 또는 이의 염 및 약학적으로 허용되는 부형제로 구성된 혼합물을 의미한다. 약제학적 조성물은 유기물에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재된 용어 "약학적으로 허용 가능한 첨가제"라 함은 유기적인 개체에 대하여 현저한 자극 효과가 없고, 활성 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 손상시키지 않는 것을 말한다. 적합한 첨가제는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 물이 팽윤되는 고분자, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등이다.
본 명세서에 개시된 화합물 및 중간체는 또한 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 모든 형태는 본 출원의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 기재된 용어 "호변이성질체" 또는 "호변이성질체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호전환될 수 있는 상이한 에너지의 구조 이성질체를 지칭한다. 예를 들어, 양성자 호변이성질체(프로토트로픽 호변이성질체라고도 함)는 케토-에놀 이성질체 및 이민-에나민 이성질체와 같은 양성자 이동을 통한 상호전환을 포함합니다. 양성자 호변이성질체의 특정한 예는 양성자가 2개의 고리 질소 사이에서 이동할 수 있는 이미다졸 모이어티이다. 원자가 호변이성체는 일부 결합 전자의 재결합을 통한 상호전환을 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되며, 특히 원하는 생물학적 활성을 갖는 한, 온전한 단일 클론 항체, 폴리클로널 항체, 적어도 2개의 온전한 항체, 다기능 항체 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이 항체(예: 이중 특이 항체)를 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "인간화 항체"는 비인간 항체로부터 유래된 CDR을 포함하는 항체를 지칭하고, 항체 분자의 나머지는 하나 이상의 인간 항체로부터 유래된다.
본 명세서에 기재된 용어 "돌연변이체"는 다음과 같은 펩티드의 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 지칭하기 위해 사용된다: 하나 또는 둘 이상의 아미노산이 원래 펩티드와 다른 아미노산으로 치환, 하나의 결실 또는 2개 이상의 야생형 아미노산, 야생형에 존재하지 않는 하나 또는 둘 이상의 아미노산의 삽입, 및/또는 야생형에 존재하지 않는 아미노산의 아미노 말단(N- 말단) 및/또는 야생형의 카르복시 말단(C-말단)(이하 총칭하여 "돌연변이"라 함). 본 명세서에서 "삽입"은 "추가"에 포함될 수도 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "초가변 영역"으로도 알려진 "CDR"(상보성 결정 영역)은 서열이 매우 가변적이고 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 의미하며, 천연 4쇄 항체는 일반적으로 중쇄 가변 영역에 3개, 경쇄 가변 영역에 3개, 총 6개의 CDR을 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "가변 영역": 항체 구조 단위는 두 쌍의 폴리펩타이드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 중쇄와 하나의 경쇄를 가지며 각 사슬의 N-말단 도메인은 약 100~110개 이상의 영역을 정의한다. 주로 항원 인식을 담당하는 아미노산은 가변 영역이다.
본 명세서에 기재된 용어 "Fab"는 불변 도메인(CL)과 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 각각 경쇄와 중쇄의 가변 도메인(VL) 및 VH(중쇄 가변 영역)과 함께 구성하는 것을 말한다. 가변 도메인은 항원 결합에 관여하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재한다. 일 실시예에서, scFv는 항원-결합에 필요한 구조를 형성할 수 있도록 VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "ECD"는 세포외 도메인을 의미한다. HER 수용체는 인간 표피 성장 인자 수용체(HER) 패밀리에 속하는 수용체 단백질 티로신 키나아제이며 EGFR, HER2, HER3 및 HER4 수용체를 포함하며, 상기 HER2 수용체는 일반적으로 HER 리간드에 결합할 수 있는 세포외 도메인, 친유성 막횡단 도메인, 보존된 세포내 티로신 키나아제 도메인, 인산화될 수 있는 여러 티로신 잔기를 갖는 카르복시-말단 신호전달 도메인을 포함하며, HER2의 세포외 도메인은 각각 ECD1, ECD2, ECD3 및 ECD4인 4개의 도메인을 포함한다.
본 명세서에 기재된 용어 "항체 모이어티"는 특정 실시예에서 특정 작용기를 통해 중간 링커 모이어티에 연결되고 항체 모이어티가 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체-약물 접합체 내의 항체 모이어티를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 용어 "링커 모이어티"는 항체 모이어티를 세포독성 약물 모이어티와 연결하고 절단 가능하거나 절단 불가능한 항체-약물 접합체의 일부를 의미하며, 상기 절단 가능 링커는 표적 세포에서 절단되어 세포독성 약물을 방출할 수 있는 부분을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "세포독성 약물 모이어티"는 항체-약물 접합체 내의 세포독성 약물 모이어티를 지칭하고, 특정 실시예에서, 세포독성 약물 모이어티는 작용기를 통해 중간 링커 모이어티에 연결되어 종양 세포 내에서 세포독성 약물 분자가 해방되어 항종양 효과를 발휘할 수 있다.
본 명세서에 기재된 용어 "트라스투주맙"은 인간 표피 성장 인자 수용체-4(HER4)의 세포외 부위에 선택적으로 작용하고 HER2 양성 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 재조합 인간화 단일클론 항체를 말하며, 그 예는 HERCEPTIN®이라는 상품명으로 시판되는 치료용 단일클론 항체 제품이다.
본 명세서에 기재된 용어 "페르투주맙"은 인간 표피 성장 인자 수용체-2(HER2)의 세포외 부위에 선택적으로 작용하고 HER2 양성 암을 치료하는 데 사용될 수 있는 재조합 인간화 단일클론 항체를 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "HER2"는 티로신 키나제 활성을 갖는 EGFR 계열의 두 번째 구성원으로, 상기 HER2의 발현 수준은 면역 조직 화학 분석에 의해 검출될 수 있으며, HER2 양성은 IHC3+, HER2 음성은 IHC1+/0을 의미하며, IHC2+의 경우 추가 설명을 위해 ISH 분석을 수행해야 한다.
본 명세서에 기재된 용어 "암"은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "삼중 음성 유방암"은 에스트로겐 수용체, 프로게스테론 수용체 및 인간 표피 성장 인자 수용체-2의 발현에 대해 음성인 유방암이다.
여기에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 "포함하다", "구성하다" 및 "포함하는" 또는 이와 동등한 용어(포함하다, 포함하다, 포함하다, 포함하다, 포함하다, 포함하다)는 제한이 없는 진술이며, 명시된 것 외에 명시되지 않은 요소, 구성 요소 및 단계가 포함될 수 있다.
여기에서 사용된 바와 같이, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 성분, 측정 또는 반응 조건의 양을 나타내는 모든 숫자는 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 기재된 용어 "약"은 백분율과 연결될 때 예를 들어 ±0.1%, 바람직하게는 ±0.05%, 보다 바람직하게는 ±0.01%를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 달리 명시하지 않는 한, 단수 용어는 복수 지시 대상을 포함하며 그 역도 마찬가지이다. 유사하게, 본 명세서에서 달리 명시되지 않는 한, 단어 "또는"은 "및"을 포함하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 시퀀스 간의 백분율 동일성(호몰로지의 정도)은 월드 와이드 웹(예: www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 일반적으로 이러한 목적을 위해 사용되는 자유롭게 사용 가능한 컴퓨터 프로그램(예: BLASTP 또는 BLASTn)을 사용하여 두 시퀀스를 비교함으로써 결정될 수 있다.
도 1은 항-HER2 이중특이적 항체(Expi HER2-1, Expi HER2-2, 23C2 HER2-1 및 23C2 HER2-2) 및 BT474 종양 세포에 대한 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합의 사멸률을 나타낸다.
도 2는 NCI-N87 종양 세포에 대한 항-HER2 이중특이적 항체, 트라스투주맙, T-DM1 및 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합의 사멸률을 나타낸다.
도 3은 JIMT-1 종양 세포에 대한 항-HER2 이중특이적 항체, 트라스투주맙, T-DM1 및 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합의 사멸률을 나타낸다.
도 4는 BT474 종양 세포의 증식에 대한 항-HER2 이중항체인 트라스투주맙 및 트라스투주맙 + 페르투주맙 조합의 억제 결과를 나타낸다.
도 5는 위암 N87 마우스 이종이식 종양 모델에서 마우스 종양 부피 변화에 대한 항-HER2 이중특이적 항체, PBS 비히클 대조군 및 트라스투주맙 + 페르투주맙 조합(Per + Tra)의 효과를 보여준다.
도 6은 위암 N87 마우스 이종이식편 종양 효능에서 마우스 체중 변화에 대한 항-HER2 이중특이적 항체, PBS 비히클 대조군 및 트라스투주맙 + 페르투주맙의 조합의 효과를 나타낸다.
도 7은 일부 예시적인 항-HER2 이중특이적 항체의 구조를 나타내며, 여기서 이합체 Fc는 검은색으로 표시된 하나의 사슬(제1 Fc 폴리펩티드) 및 회색으로 표시된 또 다른 사슬(제2 Fc 폴리펩티드)로 묘사되며, 하나의 항원 결합 도메인(제1 항원 결합 단편)은 빗금으로 표시되고 다른 항원 결합 도메인(제2 항원 결합 단편)은 흰색으로 표시되며; 여기서 제1 항원 결합 단편은 scFv이고 제1 Fc 폴리펩타이드와 융합되고, 제2 항원 결합 단편은 Fab이고 제2 Fc 폴리펩타이드와 융합된다.
도 8은 NCI-N87 종양 세포에서 상이한 항체(단일클론 항체-DDDXD 및 이중특이적 항체-DDDXD)의 약물 접합체의 세포내이입 활성을 나타낸다.
도 9는 SK-BR-3 종양 세포에서 상이한 항체(단일클론 항체-DDDXD 및 이중특이적 항체-DDDXD)의 약물 접합체의 세포내이입 활성을 나타낸다.
명확하게 하기 위해, 본 출원은 하기 실시예와 함께 추가로 기술되지만, 본 출원의 범위를 제한하려는 의도는 아니다. 여기에서 사용된 시약은 시중에서 구입할 수 있으며 추가 정제 없이 사용할 수 있다.
본 출원의 실시예에서 사용된 트라스투주맙 및 페르투주맙은 항체에 대한 통상적인 방법에 따라 제조되었으며, 여기서는 먼저 벡터를 구축하고, 진핵 세포를 형질감염시킨 후 발현을 위해 정제하고, 트라스투주맙의 서열은 WHO DRUG INFORMATION INN RL78을 참조하였고, 페르투주맙의 서열은 WO0100245의 예를 참조하였다.
DS-8201은 다이이치 산쿄(주)로부터 시판되는 제제인 엔허투의 유효성분으로서, 본 출원에서 제조된 트라스투즈맵-DXD와 동일한 구조를 갖는다(구조는 실시예 15 참조).
실시예 1. 항-Her2 scFv-Fc 및 이의 변이체의 구성, 발현 및 정제
항-Her2 scFv-Fc를 제작함에 있어서, 인간 IgG1을 Fc 부분으로 사용하였고, 항-Her2 arm의 가변 영역 서열은 단일클론 항체 Herceptin®에 기초한 서열이었다. 단일클론 항체 Herceptin®의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 설계된 링커 1(즉, (GGGGS)3)에 의해 직렬로 연결되어 항-Her2 scFv-Fc(서열번호 1)를 형성하였으며, 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
또한, 항-Her2 scFv-Fc 서열에서 점 돌연변이를 구성하여 하기 변이체를 구성하였다:
항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc(서열번호 3): 야생형 항-Her2 scFv-Fc에서 유래되었으며, VL 영역에서 F53Y 돌연변이를 가지고 있으며, 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc(서열번호 5): 야생형 항-Her2 scFv-Fc에서 유래되었으며, VL 영역에서 F53A 돌연변이를 가지고 있으며, 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASALYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc(서열번호 7): 야생형 항-Her2 scFv-Fc에서 유래되었으며, VL 영역에서 F53R 돌연변이를 가지고 있으며, 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASRLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc(서열번호 9): 야생형 항-Her2 scFv-Fc에서 유래되었으며, VH 영역에서 K30E 돌연변이를 가지고 있으며, 아미노산 서열은 다음과 같다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
항-Her2 scFv-Fc 및 그의 변이체의 DNA 서열(서열번호 2, 4, 6, 8 및 10)을 합성하고 각각 pcDNA3.1 발현 벡터에 클로닝하였다. ExpiCHOTM 발현 키트(Thermo Fisher, Cat. No. A29133)를 사용하여 항-Her2 scFv-Fc 또는 그의 변이체의 발현 벡터를 ExpiCHO 세포(CHO-S, Thermo)에 형질감염시켰다. 세포는 8% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 가습 환경의 ExpiCHO 발현 배지에서 배양하였다 130 rpm으로 회전하는 오비탈 진탕기 상에서 8% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 가습 분위기의 ExpiCHO 발현 배지에서 배양하였다. 배양 상등액을 회수하고 단백질 A 자성 비드(Genscript, Cat. No. L00273)를 이용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단백질 농도는 UV-Vis 분광광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 측정했다.
항-Her2 scFv-Fc 및 이의 변이체에 대한 서열 정보
명칭 아미노산 서열
(서열번호)		 암호화 DNA 서열
(서열번호)		 가변 영역의 돌연변이 부분
항-Her2 scFv-Fc 1 2 None
항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 3 4 F53Y
항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc 5 6 F53A
항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc 7 8 F53R
항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc 9 10 K30E
실시예 2. 항-Her2 scFv-Fc 및 이의 변이체의 인간 Her2 항원-결합 검정 및 집계 확인
발현 및 정제된 항-Her2 scFv-Fc 및 이의 변이체에 대해, 인간 Her2 단백질에 대한 시험 분자의 친화도를 Biacore T200(GE)에 의해 다음과 같이 결정하였다:
일정량의 항-Her2 scFv-Fc 또는 이의 변이체를 항-hIgG에 접합된 칩에 포획한 다음 항원 인간 HER2 단백질(Sino Biological, Cat. No. 10004-H08H)을 칩 표면 위로 흐르게 했다. 반응 신호는 Biacore T200을 사용하여 실시간으로 감지되었으며 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험에 사용된 완충액은 Biacore 범용 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4·12H2O, 1.8mM KH2PO4, 0.05% 계면활성제 P20(GE, Cat. No. BR-1000-54), pH 7.4)이었다. 항-hIgG(인간 항체 포획 키트에 의해 포획됨, GE, Cat. No. 29-2346-00)는 최대 약 9000 RU의 반응 값으로 CM5 칩 표면에 접합되었고, 항-Her2 scFv-Fc 또는 이의 변이 후 반응 값 약 200RU였다. 그런 다음 인간 HER2 단백질의 다양한 농도(100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM, 3.125nM)와 항-Her2 scFv-Fc 또는 그의 변이체의 상호작용의 신호 값을 측정하였다. 유동 셀의 유속은 50μL/min, 결합은 240초, 해리는 1400초, 재생은 3M MgCl2(GE)를 사용하여 60초 동안 수행되었으며, 베이스라인은 안정적이었다. 결과는 biacore 평가 소프트웨어에서 친화도 및 동역학 1:1 결합 모드에 따라 계산하여 얻었다. 항-Her2 scFv-Fc 또는 항원 인간 Her2 단백질에 대한 변이체의 친화도를 표 6에 나타내었다. 항-Her2 scFv-Fc(KD = 0.77nM)와 비교하여, F53A 돌연변이는 인간 Her2 단백질 항원에 대한 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc(KD = 1.26nM)의 결합 친화도에 더 큰 영향을 미쳤다. 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc(KD = 0.8nM) 및 항-Her2 scFv-Fc(KD = 0.77nM)는 항원 인간 Her2 단백질에 대해 유사한 결합 친화도를 나타내었다. 변이체 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc는 항원 인간 Her2 단백질에 대해 0.54nM의 결합 KD를 갖았다. 돌연변이 F53Y 및 K30E의 도입은 항원 인간 Her2 단백질에 대한 결합 친화성을 감소시키지 않는 것으로 알려져 있다. 항-Her2 scFv-Fc 또는 이의 변이체의 성분을 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고, 성분을 분자량에 따라 내림차순으로 용출하였다. 사용된 겔 크로마토그래피 컬럼은 ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 컬럼 200Å, 1.7μm, 4.6 × 300mm이고 컬럼 온도는 25℃이다(인산이수소나트륨 2수화물 2.33g, 인산수소이나트륨 12수화물 12.53g 및 염화나트륨 11.69g을 약 800mL의 초순수에 넣고 교반하여 완전히 용해시켰다; 부피가 1000mL에 도달할 때까지 초순수를 첨가하고; 혼합물을 잘 혼합한 다음 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과했다). 시료를 이동상으로 희석하여 10mg/mL의 검액을 얻었고, 그 중 2μL를 정밀하게 측정하여 액체크로마토그래프(시료 농도가 10mg/mL 미만이면 단백질 20μg이 주입되도록 주입량 조절)에 주입하여 280nm에서 검출하였다. 유속은 0.30mL/분이었고, 등용매 용출은 15분 동안 수행되었다. 데이터를 가공하고 그 결과를 Area Normalization 방법을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 응집체, 면역글로불린 단량체 및 저분자량 불순물에 대한 피크 면적 백분율을 계산하였다. 응집체 피크는 면역글로불린 단량체를 나타내는 메인 피크 이전에 나타났고, 저분자량 불순물 피크는 메인 피크 이후에 나타났다. 항-Her2 scFv-Fc 또는 이의 변이체에서 주요 피크 및 응집체 함량 백분율은 표 6에 제시하였다. 변이체 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 및 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc는 상당히 감소된 응집체를 가지며, 상기 응집체 함량은 6.31%(항-Her2 scFv-Fc에서)에서 4.94%와 3.39%로 각각 감소되었다.
항원 Her2에 대한 항-Her2 scFv-Fc 및 이의 변이체의 총 함량 및 결합 친화도
명칭 항-Her2 scFv-Fc 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 항-Her2-scFv-VL-F53A-Fc 항-Her2-scFv-VL-F53R-Fc 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc
응집체 6.31% 4.94% 6.96% 7.83% 3.39%
단위체 93.43% 94.83% 92.80% 91.90% 96.32%
저분자량 조각 0.25% 0.24% 0.23% 0.26% 0.28%
항원 Her2 (KD) 0.77 nM 0.8 nM 1.26 nM 측정되지 않음 0.54 nM
실시예 3. 항-Her2 이중특이적 항체의 구축, 발현 및 정제
항-Her2 이중특이적 항체는 노브-인투-홀(Ridgway, et al., 1996) Fc 공학에 의해 인간 IgG1로서 생성되었다. H435R 및 Y436F 돌연변이(Jendeberg et al., 1997)는 단백질 A에 대한 Fc의 친화성을 감소시키기 위해 하나의 중쇄의 Fc 영역 서열에서 설계되었으며, 이는 단백질 A 친화성 정제(특허 US5945311A)에서 이중특이적 항체의 조립 중에 형성된 동종이량체를 제거하는 데 유리했다. 실시예 2로부터 항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc 돌연변이 및 항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc 돌연변이가 Her2 항원에 대한 친화력은 변하지 않은 채 항Her2-scFv 응집체를 유의하게 감소시킬 수 있음을 알 수 있다. 본 실시예에서 항-Her2 이중특이적 항체의 하나의 항-Her2 암의 항원-결합 도메인은 scFv(VH-링커-VL 구조) 형태이고, 가변 영역 서열은 돌연변이 K30E(b-항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc, 서열번호 21), 돌연변이 F53Y(b-항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc, 서열번호 23), 또는 두 점 돌연변이(항-Her2 -scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc, 서열번호 11)를 포함하였다. 본 실시예에서 항-Her2 이중특이적 항체의 또 다른 항-Her2 암의 항원-결합 도메인은 항-Her2-도메인2-HC-Fc(서열번호 13) 및 항-Her2-도메인2-LC(서열번호 15)를 포함하는 Fab 형태였다. 또한 돌연변이가 없는 항-Her2 이중항체를 scFv 형태(VH-링커-VL 구조 또는 VL-링커-VH 구조)로 대조군으로 제작하였다.
항-Her2 이중특이적 항체에 대한 서열 정보
명칭 성분 아미노산 서열
(서열번호)		 뉴클레오티드 서열
(서열번호)
Expi Her2-1 항-Her2-scFv-VL-VH-Fc DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSAAEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLICLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENRYMTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 17) 18
항-Her2-domain2-HC-Fc-2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPG (서열번호 19) 20
항-Her2-domain2-LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열번호 15)		 16
Expi Her2-2 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 11) 12
항-Her2-domain2-HC-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYTMDWVRQAPGKGLEWVADVNPNSGGSIYNQRFKGRFTLSVDRSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNLGPSFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK (서열번호 13) 14
항-Her2-domain2-LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSIGVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYIYPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
(서열번호 15)		 16
Expi Her2-3 b-항-Her2-scFv-VH-K30E-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIEDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 21) 22
항-Her2-domain2-HC-Fc 서열번호 13 14
항-Her2-domain2-LC 서열번호 15 16
Expi Her2-4 b-항-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 23) 24
항-Her2-domain2-HC-Fc 서열번호 13 14
항-Her2-domain2-LC 서열번호 15 16
Expi Her2-5 항-Her2-scFv-VH-VL-Fc EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열번호 25) 26
항-Her2-domain2-HC-Fc 서열번호 13 14
항-Her2-domain2-LC 서열번호 15 16
항-Her2 이중특이적 항체의 DNA 서열(서열번호 12, 14 및 16)을 합성하고 각각 pcDNA3.1 발현 벡터에 클로닝하였다. 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc(서열번호 11), 항-Her2-domain2-HC-Fc(서열번호 13) 및 항-Her2-domain2-Fc의 발현 벡터 LC(SEQ ID NO: 15)는 CHOgro® 고수율 발현 시스템(Cat. No. MIR 6270)을 사용하여 1:1:1.5의 형질감염 비율로 ExpiCHO 세포에 동시 형질감염되었다. 형질감염 밀도는 6 × 106개 cells/mL이었다. 배지는 CHOgro® 발현 배지(Cat. No. MIR 6200, 제조사: Mirus)였다. 형질감염 후 10일째까지 배양을 계속하였고, 세포 배양 상등액을 원심분리하여 수집하였다.
단백질 A 자성 비드(Genscript, Cat. No. L00273)를 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단백질 농도는 UV-Vis 분광광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 측정했다. 이 샘플은 Expi Her2-2로 지정되었다. 이 방법을 참조하여 다른 이중특이적 항체인 Expi Her2-1, Expi Her2-3, Expi Her2-4 및 Expi Her2-5를 발현 및 정제를 통해 얻었다.
실시예 4. 푸코스 녹아웃 이중특이적 항체의 제조 및 검증
FcgRIIIa와 IgG1의 상호작용은 푸코스 발현 관련 유전자 FUT8을 녹아웃시킴으로써 개선될 수 있으며, 이에 따라 항체의 ADCC가 향상된다(Shields et al., 2002; Yamane-Ohnuki et al., 2004). 이 실시예에서, 푸코스 녹아웃 항-Her2 이중특이적적 항체는 FUT8-녹아웃 CHO-S 세포(CHO FUT8-/- 세포로 지정됨)를 사용하여 제조되었다. 항-Her2 이중특이적 항체의 DNA 서열(서열번호 12, 14 및 16)을 합성하고 각각 pcDNA3.1 발현 벡터에 각각 클로닝하였다. 항-Her2-scFv-VH-K30E-VL-F53Y-Fc, 항-Her2-domain2-HC-Fc 및 항-Her2-domain2-LC의 발현 벡터를 CHOgro® 고수율 발현 시스템(Cat. No. MIR 6270)을 사용하여 1:1:1.5 비율로 FUT8-녹아웃 CHO-S 세포에 공동 형질감염시켰다. 형질감염 밀도는 6 × 106개 cells/mL이었다. 배지는 CHOgro® 발현 배지(Cat. No. MIR 6200, 제조사: Mirus)였다. 형질감염 후 10일째까지 배양을 계속하고, 세포 배양 상층액을 원심분리하여 모았다. 단백질 A 자성 비드(Genscript, Cat. No. L00273)를 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단백질 농도는 UV-Vis 분광광도계(NanoDrop lite, Thermo Scientific)를 사용하여 측정했다. 이 샘플은 23C2 Her2-2로 지정되었다. 이 방법을 참조하여 Expi Her2-1, Expi Her2-3, Expi Her2-4 및 Expi Her2-5의 서열을 CHO FUT8-/- 세포에서 발현시켜 상응하는 푸코스 녹아웃 항-Her2-1, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 및 23C2 Her2-5를 얻었다. CHO FUT8-/- 세포 및 CHO-S 세포에 의해 발현된 항-Her2 이중특이적 항체 샘플을 GlycoWorks RapiFluor-MS N-Glycan 키트(Waters, Milford, MA, USA)를 사용하여 처리하였다. N-글리칸은 단백질에서 방출되어 표지되었다. 칼럼 크로마토그래피 분리 후 FLR 검출기(Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하여 N-글리칸의 구조 및 함량을 얻을 수 있었다. 글리칸 함량 백분율은 표 8에 나와 있다. 정상적인 항-Her2 이중특이적 항체 Expi HER2-2에서, 탈푸코실화된 글리칸의 백분율은 21.85%였고, FUT8-녹아웃 CHO-S 세포에 의해 발현된 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 HER2-2에서 탈푸코실화된 글리칸의 백분율은 99.40%였다.
항Her2 이중특이항체의 글리칸 함량 분석
성분 명칭 함량 (%)
Expi HER2-2 23C2 HER2-2
A1(M3B) 1.81 9.84
A1G(4)1 0.16 0.17
A2 1.14 70.33
A2[3]G(4)1 / 2.34
A2[6]G(4)1 / 4.19
A2[3]BG(4)1 / 0.11
A2G(4)2 / 0.55
A2G(4)2S(3)1 / 0.21
A2G(4)2S(3,3)2 / 0.46
F(6)A1G(4)1 / /
F(6)A1[3]G(4)1S(3)1 / /
F(6)A1 12.77 /
F(6)A2 60.69 0.60
F(6)A2[3]G(4)1 1.20 /
F(6)A2[6]G(4)1 0.70 /
F(6)A2G(4)2 / /
F(6)A2G(4)2S(3)1 / /
M3 / 0.26
M4 / 0.07
M4A1G(4)1 / 0.36
M4 D1 / 0.08
M5 12.31 5.67
M5A1G(4)1 / 0.05
M6 D1 2.11 0.75
M6 D3 0.73 0.18
M7 D1 0.80 0.44
M8 0.20 0.15
De-fucosylated glycans 21.85 99.40
Di-sialylated glycans / 0.46
High mannose glycans 20.07 7.24
Mono-sialylated glycans 0.18 0.21
Non-sialylated glycans 99.82 99.33
실시예 5. 이중특이항체의 집계 확인
이 실시예는 항-her2 이중특이적 항체 23C2 Her2-1, 23C2 Her2-2, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 및 23C2 Her2-5의 응집체 검증에 관한 것이다. 항-Her2 이중항체를 겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 응집체 함량을 확인하였으며, 각 성분은 분자량이 큰 순으로 용출하였다. 사용된 겔 크로마토그래피 컬럼은 ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 컬럼 200Å, 1.7μm, 4.6 × 300mm이고 컬럼 온도는 25℃였다. 이동상은 pH 7.0에서 50mmol/L 인산완충식염수-200mmol/L 염화나트륨이었다(인산이수소나트륨 2수화물 2.33g, 인산수소이나트륨 12수화물 12.53g 및 염화나트륨 11.69g을 약 800mL의 초순수에 넣고 교반하여 완전히 용해시킨 후, 초순수를 1000mL가 될 때까지 가하고, 혼합물을 잘 혼합한 후 0.22μm 필터 멤브레인을 통해 여과했다). 시료를 이동상으로 희석하여 10mg/mL의 검액을 얻었고, 그 중 2μL를 정밀하게 측정하여 액체크로마토그래프(시료 농도가 10mg/mL 미만일 경우 20μg의 단백질이 주입되도록 주입량 조절)에 주입하여 280nm에서 검출하였다. 유속은 0.30mL/분이었고, 등용매 용출은 15분 동안 수행되었다. 데이터를 가공하고 그 결과를 Area Normalization 방법을 이용하여 정량적으로 분석하였다. 응집체, 면역글로불린 단량체 및 저분자량 불순물에 대한 피크 면적 백분율을 계산하였다. 응집체 피크는 면역글로불린 모노머를 나타내는 주피크 이전에 나타났고, 저분자량 불순물 피크는 주피크 이후에 나타났다.
항-Her2 이중특이적 항체의 총 함량
샘플 명칭 응집체 단위체 저분자량 조각
23C2 Her2-2 8.51% 91.02% 0.47%
23C2 Her2-1 19.55% 80.05% 0.40%
결과는 scFV가 이중특이적 항체로 조립된 후 조립된 이중특이적 항체가 여전히 많은 양의 응집체를 생성했음을 보여주었다; 그러나 이중특이적 항체의 응집체 함량은 돌연변이를 도입함으로써 감소될 수 있었고, 23C2 Her2-2의 응집체 함량은 돌연변이를 포함하지 않는 23C2 Her2-1의 것과 비교하여 8.51% 감소될 수 있었다(표 9).
실시예 6. 항-Her2 이중특이적 항체의 항원-결합 검정
발현 및 정제된 항-Her2 이중특이적 항체에 대해, HER2 단백질에 대한 시험 분자의 친화도를 Biacore T200(GE)에 의해 다음과 같이 결정하였다:
항-Her2 이중특이적 항체의 양을 항-hIgG에 결합된 칩에 의해 포획한 다음, 인간 Her2(Sino Biological, Cat. No. 10004-H08H)를 칩 표면 위로 흐르게 하였다. 응답 신호는 Biacore T200을 사용하여 실시간으로 감지되었으며 결합 및 해리 곡선을 얻었다. 실험에 사용된 완충액은 Biacore 범용 완충액(137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4·12H2O, 1.8mM KH2PO4, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4)이었다. 항-hIgG(인간 항체 포획 키트에 의해 포획됨, GE, Cat. No. 29-2346-00)는 최대 약 9000RU의 반응 값으로 CM5 칩 표면에 접합되었고, 포획된 항-Her2 이중특이적 항체의 반응 값은 약 200RU였다. 그 다음, 상이한 농도의 Her2 단백질(100nM, 50nM, 25nM, 12.5nM, 6.25nM 및 3.125nM)과 항-Her2 이중특이적 항체의 상호작용의 신호 값을 측정하였다. 유동 셀의 유속은 50μL/min, 결합은 240초, 해리는 1400초, 재생은 3M MgCl2(GE)를 사용하여 60초 동안 수행되었으며, 베이스라인은 안정적이었다. 결과는 biacore 평가 소프트웨어에 따라 계산하여 얻었다. 항원 Her2에 대한 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 Her2-2 뿐만 아니라 대조군 트라스투주맙 및 페르투주맙의 결합 친화도를 표 10에 나타내었다.
인간 Her2 항원에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 친화도
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
23C2 Her2-2 1.79E+05 1.09E-04 6.11E-10
트라스투주맙 대조군 샘플 1.73E+05 2.12E-04 1.22E-09
페르투주맙 대조군 샘플 1.15E+05 2.69E-04 2.35E-09
실시예 7. 항-Her2 이중특이적 항체의 항원-결합 검정
실시예 6의 절차를 참조하여, HER2 단백질에 대한 발현 및 정제된 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 Her2-1, 23C2 Her2-2, 23C2 Her2-3, 23C2 Her2-4 및 23C2 Her2-5의 친화력은 Biacore T200(GE)에 의해 측정되었다. 항원 인간 Her2 단백질에 대한 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 Her2-1의 친화도 측정 결과를 표 11에 나타내었다. 표 10 및 표 11의 결과로부터 항원 인간 Her2 단백질에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 결합 친화력이 F53Y 및 K30E 돌연변이를 도입함으로써 향상될 수 있음을 알 수 있다.
인간 Her2 항원에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 친화도
샘플 명칭 23C2 Her2-1
항원 Her2 KD 4.02nM
실시예 8. 항-Her2 이중특이적 항체에 의한 Her2 양성 표적 세포 BT474의 사멸
표적 세포(BT474 Her2+++, 출처: the Cell Bank of Type Culture Collection Committee of the Chinese Academy of Sciences)에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸 효과는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)에서 제공하는 NK 세포를 사용하여 연구되었다. 항-Her2 이중특이적 항체의 시험관내 활성을 EC50 값으로 평가하였다.
구체적인 절차는 다음과 같다: BT474 세포를 2% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 1640 배지를 사용하여 3 x 105cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 96-웰세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat. No. 0030730199)에 50μL/ml로 시딩했다. 다양한 농도의 항-Her2 이중특이적 항체(1000ng/mL, 333ng/mL, 111ng/mL, 37ng/mL, 12.3ng/mL, 4.11ng/mL, 1.37ng/mL, 0.46ng/mL, 0.15ng/mL 및 0.05ng/mL)를 1640 배지를 사용하여 제조하고 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 50μL씩 첨가하였다. 인간 PBMC를 1640 배지를 사용하여 1.5 x 106cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 웰당 100μL로 첨가했다. 투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체), 표적 세포군(BT474 세포), 이펙터 세포군(인간 PBMC), 표적 세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지) 및 용해액 대조군과 표적 세포 최대 방출군(표적 세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터 대 표적 세포 비율은 10:1로 하였다. 분석 45분 전, 20μL/well의 용해 용액(Promega, Cat. No. G182A)을 표적 세포 최대 방출 그룹 및 용해 용액 대조군에 첨가하였다. 45분 후 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석(Promega, G1780)을 사용하여 세포 용해 속도를 측정했다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD표적 세포+이펙터 세포군)/(OD표적 세포 최대 방출군 - OD표적 세포군) × 100%
도 1은 BT474 Her2+++ 종양 세포에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸률을 나타낸다. ADCC-강화 항-Her2 이중특이적 항체(도 1에서 23C2 HER2-1 및 23C2 HER2-2로 표시)는 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합보다 BT474 종양 세포에 대해 더 나은 사멸 효과를 가지고 CHO-S 세포에 의해 발현되는 항Her2 이중특이항체(Expi HER2-1 및 Expi HER2-2-2)보다 우수하였다; 상기 트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합물(1:1)의 EC50은 8.627ng/mL이고, Expi HER2-1의 EC50은 38.05ng/mL이고, Expi HER2-2의 EC50은 35.17ng/mL이므로, Expi HER2-2는 Expi HER2-1보다 우수함을 알 수 있었다. ADCC 강화 23C2 HER2-1의 EC50은 4.728ng/mL, ADCC 강화 23C2 HER2-2의 EC50은 3.658ng/mL로 ADCC 강화 23C2 HER2-2가 23C2 HER2-1보다 우수함을 알 수 있었다.
실시예 9. 항-Her2 이중특이적 항체에 의한 Her2 양성 표적 세포 NCI-N87의 사멸
표적 세포(NCI-N87 Her2++, 출처: the Cell Bank of Type Culture Collection Committee of the Chinese Academy of Sciences)에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸 효과는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)가 제공하는 NK 세포를 사용하여 연구되었다. 항-Her2 이중특이적 항체의 시험관내 활성을 EC50 값으로 평가하였다.
구체적인 절차는 다음과 같다: NCI-N87 세포는 2% FBS(fetal bovine serum)가 포함된 1640 배지를 사용하여 3 x 105cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 50℃에서 96-웰 세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat. No. 0030730199)에 웰당 50μL로 시딩했다. 다양한 농도의 항-Her2 이중특이적 항체 또는 대조군 약물(8.1nM, 2.7nM, 0.9nM, 0.3nM, 0.1nM, 0.03nM, 0.01nM, 0.003nM, 0.001nM 및 0.0004nM)을 실험용 배지를 사용하여 제조하였고, 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 50μL으로 첨가했다. 인간 PBMC는 실험용 배지를 사용하여 1.5 × 106cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 웰당 100μL로 첨가하였다. 투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체 또는 대조군 약물), 표적 세포군(NCI-N87 세포), 이펙터 세포군(인간 PBMC), 표적 세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지), 용해액 대조군, 표적 세포 최대 방출군(표적 세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터 대 표적 세포 비율은 10:1로 하였다. 트라스투주맙, T-DM1(트라스투주맙-엠탄신 접합체, 상표명 Kadcyla®), 트라스투주맙 및 페르투주맙(1:1) 및 Expi HER2-1이 대조군 약물로 사용되었다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD표적 세포+이펙터 세포군)/(OD표적 세포 최대 방출군 - OD표적 세포군) × 100%
도 2는 NCI-N87 종양 세포에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸률을 나타낸다. ADCC-강화 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 HER2-2는 트라스투주맙과 페르투주맙, 트라스투주맙, T-DM1 및 Expi HER2-1의 조합보다 NCI-N87 종양 세포에 더 나은 사멸 효과를 가졌다; 상기 ADCC-강화된 23C2 HER2-2의 EC50은 0.02447nM이고, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합물의 EC50은 0.08267nM이고, Expi HER2-1의 EC50은 0.1048nM이고, T-DM1의 EC50은 0.07392nM이고, 트라스투주맙의 EC50은 0.07468nM 이었다.
실시예 10. 항-Her2 이중특이적 항체에 의한 트라스투주맙-내성 세포 JIMT-1의 사멸
표적 세포(JIMT-1, 출처: AddexBio, Cat. No. C0006005)에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸 효과는 인간 PBMC(말초 혈액 단핵 세포)에 의해 제공된 NK 세포를 사용하여 연구되었고, 항-Her2 이중특이적 항체를 EC50 값으로 평가하였다.
구체적인 절차는 다음과 같다: JIMT-1 세포를 2% FBS(fetal bovine serum)를 포함하는 1640 배지를 사용하여 3 x 105cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 96-웰 세포 배양 플레이트(eppendorf, Cat 0030730199)에 웰당 50μL으로 시딩했다. 다양한 농도의 항-Her2 이중특이적 항체 또는 대조군 약물(8.1nM, 2.7nM, 0.9nM, 0.3nM, 0.1nM, 0.03nM, 0.01nM, 0.003nM, 0.001nM 및 0.0004nM)을 실험용 배지를 사용하여 제조하였고, 상기 96-웰 세포 배양 플레이트에 웰당 50μL씩 첨가하였다. 인간 PBMC는 실험용 배지를 사용하여 1.5 × 106cells/mL의 세포 밀도로 조정하고 웰당 100μL로 첨가하였다.
투여군(표적 세포 + 이펙터 세포 + 항체 또는 대조군 약물), 표적 세포군(BT474 세포), 이펙터 세포군(인간 PBMC), 표적 세포 + 이펙터 세포군, 블랭크 대조군(배지) 및 분석 용해액 대조군, 표적 세포 최대 방출군(표적 세포 + 용해액)을 설정하였으며, 이펙터 대 표적 세포 비율은 20:1로 하였다. 분석 45분 전, 20μL/well의 용해 용액(Promega, Cat. No. G182A)을 표적 세포 최대 방출 그룹 및 용해 용액 대조군에 첨가하였다. 45분 후 CytoTox96® 비방사성 세포독성 분석(Promega, G1780)을 사용하여 세포 용해 속도를 측정했다. 트라스투주맙, T-DM1, 트라스투주맙과 페르투주맙(1:1)의 조합, 그리고 Expi HER2-1이 대조군 약물로 사용되었다.
용해율(%) = (OD투여군 - OD표적 세포+이펙터 세포군)/(OD표적 세포 최대 방출군 - OD표적 세포군) × 100%
도 3은 JIMT-1 종양 세포에 대한 항-Her2 이중특이적 항체의 사멸률을 나타낸다. ADCC-강화 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 HER2-2는 트라스투주맙과 페르투주맙, 트라스투주맙, T-DM1 및 Expi HER2-1의 조합보다 JIMT-1 종양 세포에 더 나은 사멸 효과를 나타냈다; 상기 ADCC-강화 23C2 HER2-2의 EC50은 0.01006nM이고, 트라스투주맙과 페르투주맙의 조합물의 EC50은 0.06727nM이고, Expi HER2-1의 EC50은 0.08066nM이고, T-DM1의 EC50은 0.08357nM이고, 트라스투주맙의 EC50은 0.07443nM이고; 또한, 항-Her2 이중특이적 항체 23C2 HER2-2는 더 높은 세포 용해율을 나타내었다.
실시예 11. 항-Her2 이중항체에 의한 BT474 Her2+++ 종양세포의 증식 억제
23C2 Her2-2, 트라스투주맙 및 페르투주맙을 2% FBS(fetal bovine serum, 제조사: GIBCO, Cat. No. 10099-141)를 함유하는 DMEM/F12 배지(GIBCO, Cat. No. 11330-032)로 최종 농도가 3.2μg/mL가 되도록 희석한 다음 1:1의 비율로 9가지 농도(1.6μg/mL, 0.8μg/mL, 0.4μg/mL, 0.2μg/mL, 0.1μg/mL, 0.05μg/mL, 0.025μg/mL, 0.0125μg/mL 및 0.00625μg/mL)가 될 때까지 연속적으로 희석하였다. 대수 성장기 세포인 BT474 Her2+++ 수집하였고, 1 × 105cells/mL의 밀도로 조정하고 웰당 100μL로 플레이팅하고 세포가 없는 블랭크 웰을 대조군으로 설정하였다. 상기 연속 희석 샘플을 웰당 50μL로 첨가하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 5일 동안 배양하였다. 배양 배지를 버리고 CCK-8(Dojindo, Japan, Cat. No. CK04) 작업용액을 웰당 100μL씩 첨가하였다. 플레이트 발색을 위해 4~5시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 판독기(제조업체: Thermo, 모델: VarioskanFlash)에 넣었다. 450nm의 파장에서 흡광도 값을 읽고 630nm의 기준 파장을 사용하여 기록했다. 종양 세포에 대한 증식 억제율을 계산하였다.
그 결과를 도 4에 나타내었다. ADCC로 강화된 항Her2 이중항체 23C2 Her2-2의 BT474 종양세포에 대한 증식억제율은 78.38%로 트라스투주맙(54.12%), 트라스투주맙과 페르투주맙 병합요법(53.7%)보다 우수하였다.
실시예 12. 항-Her2 이중항체에 의한 NCI-N87 Her2++ 위암 누드 마우스 이종이식 종양의 억제
항-Her2 이중특이적 항체의 생체내 효능을 NCI-N87 Her2++ 위암 세포(중국 과학 아카데미 유형 배양 수집 위원회의 세포 은행)를 사용하는 마우스 이종이식 모델에서 평가하였다. NCI-N87 Her2++ 위암 세포를 5 × 107cells/mL의 농도로 준비하고 누드 마우스(Changzhou Cavens Laboratory Animal Ltd., 14-17 g, 수컷, SPF 환경에 수용됨)에 우측 겨드랑이에 0.1mL/mouse로 접종하였다. 누드 마우스 이종이식 종양의 직경은 버니어 캘리퍼스를 사용하여 측정되었으며, 종양이 100-250mm3로 성장했을 때 동물을 무작위로 5개 그룹으로 나누었다:
그룹 1: 대조군
그룹 2: Expi Her2-1, 10mg/kg
그룹 3: 23C2 Her2-2, 5mg/kg
그룹 4: 23C2 Her2-2, 10mg/kg
그룹 5: Per + Tra(트라스투주맙 및 페르투주맙의 조합), 5mg/kg + 5mg/kg
각 투여군은 해당 용량의 약물을 주 2회 약 연속 3주(6회 주사) 동안 정맥 주사했다. 그룹 5(병용 그룹)의 두 약물이 각각 5mL/kg으로 투여된 것을 제외하고 각 그룹은 10mL/kg으로 투여되었다.
그룹 1은 PBS(Hyclone; Cat. No. sh30256.01)를 10mL/kg으로 동시에 i.v.투여되었다. 병용군에서는 pertuzumab 투여 후 최소 30분 후에 trastuzumab을 투여하였다.
시험 약물의 항종양 효과는 종양 부피를 측정하여 동적으로 모니터링되었다. 종양 부피는 일주일에 2-3회 측정되었고 그 동안 마우스의 무게를 재고; 데이터를 기록하였다. 마우스의 일반적인 행동을 매일 관찰했다.
탐지 색인:
다음과 같이 계산된 종양 부피(TV): TV = 1/2 × a × b2, 여기서 a와 b는 각각 종양의 길이와 너비를 나타낸다.
이 실험에서, 투여는 d0에 시작하여 6회 수행하였다(d0, d3, d7, d10, d14 및 d17). 실험 d21까지 죽은 동물은 없었다. 각 그룹에서 마우스의 평균 체중은 상승 추세를 보였다(도 6). 이 약물은 현저한 독성 효과가 없었다.
d21까지, NCI-N87 위암 누드 마우스 이종이식 종양의 부피에 대한 그룹 2(10mg/kg), 그룹 3(5mg/kg), 그룹 4(10mg/kg) 및 Per + Tra 조합 그룹(5mg/kg + 5mg/kg)을 표 12 및 도 5에 나타내었다. 23C2 Her2-2군(10mg/kg)은 Expi Her2-1(10mg/kg) 및 Per + Tra 병용군(5mg/kg + 5mg/kg)보다 NCI-N87 위암 누드
마우스 이종이식 종양에 대해 더 나은 억제 효과를 나타냈다.
NCI-N87 위암 누드 마우스 이종이식 종양 부피에 대한 항-HER2 이중특이적 항체의 효과(평균 ± SD)
그룹 용량 (mg/kg) 투여경로 동물의 수(mice) TV (mm3)
d0 d21 d0 d3 d6 d9 d12 d15 d18 d21
대조군 - i.v. 6 6 204±40 284±58 363±78 481±109 586±161 724±261 808±241 863±251
Expi Her2-1 10 i.v. 6 6 204±23 235±46 207±35 179±30 195±24 204±44 195±50 178±35
23C2 Her2-2 5 i.v. 6 6 204±31 246±37 250±47 277±67 318±79 348±86 353±84 358±101
23C2 Her2-2 10 i.v. 6 6 204±44 201±39 154±39 136±33 151±35 173±46 165±35 144±29
Per+Tra 5+5 i.v. 6 6 204±34 224±48 199±59 202±65 205±45 231±93 218±94 218±91
실시예 13. MC-GGFG-DXD의 합성
Figure pct00039
단계 1 A5(({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노) 메틸 아세테이트)의 합성
SM5(N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실글라이신) 20g을 1L 3구 플라스크에 넣고 테트라하이드로푸란 300mL와 톨루엔 100mL를 가한 후 균일하게 교반하였다. 그런 다음 납 테트라아세테이트 30g 및 피리딘 5.4g을 첨가하였다. 혼합물을 65℃로 가열하고 4시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 실온으로 냉각시키고 고체를 여과하였다. 유기상을 40℃에서 농축 건조시켰다. 300mL의 에틸 아세테이트 및 300mL의 물을 농축된 건조 유기상에 첨가하였다. 유기상을 20분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 상을 분리하였다. 에틸 아세테이트 상에 포화 염화나트륨 용액 100 mL를 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 상을 분리하고 농축 건조시켰다. 농축액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(석유에테르:에틸아세테이트=1:1)하여 A5 13g을 얻었다. 수율은 63%였다. ESI-MS:m/z=391.1 [M+Na]+
단계 2 B5([({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]벤질 아세테이트)의 합성
A5 1.0g을 250mL 단일 목 플라스크에 넣고, DME(에틸렌 글리콜 디메틸 에테르) 15mL를 첨가하고, 벤질 글리콜레이트 0.897g을 첨가하고, 혼합물을 빙수조에서 0℃로 냉각시켰다. 0.27mL의 물과 0.108g의 NaOH이 포함된 용액을 준비했다. 준비된 NaOH 용액을 반응 용액에 첨가하였다. 0℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응액에 빙초산 0.078g을 첨가하였다. 물 100mL 및 에틸 아세테이트 100mL를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하고, 유기상을 분리하고 농축 건조시켰다. 반응액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(석유에테르:에틸아세테이트=1:1)하여 B5 0.68g을 얻었다. 수율은 53%였다. ESI-33MS:m/z=497.1 [M+Na]+
단계 3 C5([({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세트산)의 합성
0.68g의 B5를 250mL 수소화 플라스크에 넣고, 20mL의 에탄올 및 10mL의 에틸 아세테이트를 첨가하고, 0.34g의 습윤 탄소 상의 팔라듐(팔라듐 함량 10%)을 첨가하였다. 반응 용액을 수소 벌룬을 통해 수소로 퍼징하였다. 반응계를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 탄소 상의 팔라듐을 셀라이트로 여과하였다. 여액을 40℃에서 농축 건조시켜 C5 425mg을 얻었다. 수율은 77%였다. ESI-MS:m/z=407.1 [M+Na]+.
단계 4 D5([({N-[(9H-플루오렌-9-일메톡시)카르보닐]글리실}아미노)메톡시]아세틸-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9- 하이드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6'7']인돌리지노[1 ,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}-2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드)의 합성
SM4(엑사테칸 메실레이트) 50mg 및 C5 50mg을 100mL 1구 플라스크에 넣고 DMF(N,N-디메틸포름아미드) 2mL를 첨가한 후 반응계 0℃로 냉각하고 HATU(2-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 54mg 및 DIEA(N,N-디이소프로필에틸아민) 30mg을 첨가하였다. 반응계를 실온으로 가온하였다. 반응계를 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. 100mL의 디클로로메탄과 100mL의 물을 첨가하였다. 유기상을 20분 동안 교반하였다. 유기상을 분리하고 농축 건조시켰다. 반응액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올=10:1)하여 D5 88mg을 얻었다. 수율은 84%였다. ESI-MS:m/z=802.4 [M+H]+.
단계 5 E5({[(글리실)아미노]메톡시}아세틸-N-[(2-{[(1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2, 3,9,10,13,15-헥사하이드로-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':6'7']인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일]아미노}- 2-옥소에톡시)메틸]글리신아미드)의 합성
D5 78mg을 100mL 1구 플라스크에 넣고, 테트라히드로푸란 4mL를 첨가하고, 반응계를 0℃로 냉각하고, 에틸렌디아민 78mg을 첨가했다. 반응계를 실온으로 가온하였다. 반응계를 5시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 40℃에서 농축 건조시켰다. E5 55mg을 얻었다. 수율은 98%였다. ESI-MS:m/z=580.3 [M+H]+.
단계 6 MC-GGFG-DXD의 합성
E5 55mg을 100mg 1구 플라스크에 넣고, N,N-디메틸포름아미드 2mL를 첨가하고, MC-GGF-OH(말레이미도카프로일-글리실-글리실-페닐알라닌) 48mg을 첨가하고, 반응계를 0℃로 식혔다. 54mg의 HATU가 첨가되었고 30mg의 DIEA가 첨가되었다. 반응계를 실온으로 가온하였다. 반응 시스템을 1시간 동안 반응시켰다. 에틸아세테이트 100mL와 물 100mL를 넣고 20분간 교반하였다. 유기상을 분리하였다. 유기상을 40℃에서 농축 건조시켰다. 반응액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(에틸아세테이트:메탄올=10:1)하여 MC-GGFG-DXD 26mg을 얻었다. 수율은 27%였다. ESI-MS: m/z=1034.51([M+H]+). 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 8.62 (1H, t, J=6.5Hz), 8.50 (1H, d, J=9.0Hz), 8.29 (1H, t, J=6.0Hz), 8.12 (1H, d, J=8.0Hz), 8.06 (1H, t, J=6.0Hz), 8.00 (1H, t, J=6.0Hz), 7.76(1H, d, J=11Hz), 7.30(1H, s), 7.25~7.15 (5H, m), 6.90 (2H,s), 6.52 (1H,brs), 5.61~5.57 (1H, m), 5.42~5.40 (2H, m), 5.19~5.16 (2H, m), 4.64 (2H, d, J=7.0Hz), 4.49~4.44 (1H, m), 4.05~4.01 (2H, m), 3.76~3.51 (6H, m), 3.37~3.32(2H, m), 3.21~3.11 (2H, m), 3.02 (1H,dd,J=4.5,14.0), 2.77 (1H,dd,J=9.5,13.5), 2.37 (3H, s), 2.21~2.15(2H, m), 2.09 (2H, t, J=7.5Hz), 1.91~1.81 (2H, m), 1.49~1.42 (4H, m), 1.20~1.14 (2H, m), 0.87 (3H, t, J=6.5Hz).
실시예 14 중수소화 MC-GGFG-DXD(MC-GGFG-DDDXD), 중수소화 DXD(DDDXD) 및 DXD의 합성
Figure pct00040
단계 1 중간체 A의 합성
에틸 디아조아세테이트 80g을 질소 분위기 하에서 3L 1구 플라스크에 넣고 디클로로메탄 800mL와 1% 중수소화 초산 용액 800mL(중수소수 800mL에 용해된 중수소화 초산 8g)을 추가했다. 반응 용액을 차광 조건 하에 실온에서 75시간 동안 교반하였다. 유기상을 분리 및 수집하고, 수성상을 디클로로메탄(200 mL × 2)으로 2회 추출하고, 유기상을 합하였다. 유기상을 중수 200mL로 세정하고, 얻어진 유기상을 무수황산나트륨 위에서 건조시킨 황산나트륨을 여과로 제거하고, 여과액을 20℃에서 감압 농축 건조시켜 49.25g의 중간체 A를 얻었다. 수율은 66%였다. 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 4.27 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 1.31 (t, J = 7.1 Hz, 2H).
단계 2 중간체 B의 합성
N-플루오레닐메톡시카르보닐-글리실-글리신 50g을 2L 둥근 바닥 플라스크에 넣고 테트라히드로푸란 750mL와 빙초산 150mL를 첨가한 다음 혼합물을 40℃에서 20분 동안 교반하고, 납 테트라아세테이트 100g을 첨가하고 반응계를 80℃로 가온한 후 3시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 실온으로 냉각시키고 진공 여과한 후, 필터 케이크를 250mL의 에틸 아세테이트로 세척하였다. 여과액을 농축 건조시켰다. 여과액은 디클로로메탄 330mL와 에틸아세테이트 670mL를 첨가에 의해 용해되고 유기상을 얻었다. 유기상을 30% 수성 중탄산칼륨(500mL × 3)으로 3회 세척하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 감압 농축 건조시키고 디클로로메탄 100mL를 첨가하여 용해하였다; 여기에 n-헥산 100mL를 더 첨가하고 실온에서 고체가 침전될 때까지 교반한 후 n-헥산과 디클로로메탄의 혼합 용액(n-헥산:디클로로메탄 = 1:1) 300 mL를 첨가하여 밤새 교반하였다. 반응 용액을 여과하고, 필터 케이크를 40℃의 진공 오븐에서 4시간 동안 건조시켜 37.3g의 중간체 B를 얻었다. 수률은 72%였다. LCMS(ESI) m/z : 391.09 [M+Na]+.
단계 3 중간체 C의 합성
중간체 B 78g을 3000mL 1구 플라스크에 넣고 디클로로메탄 800mL를 첨가한 후, 화합물 A 45g을 첨가하였다. 3000mL 1구 플라스크를 빙수조에 넣고, 반응계를 0℃로 냉각시켰다. 리튬 tert-부톡사이드 16g을 디클로로메탄 400mL에 녹여 리튬 tert-부톡사이드 용액을 제조하였다. 리튬 tert-부톡사이드 용액을 3000mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 반응계를 0℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 실온으로 데우고 물 800mL를 첨가하고 교반하였다. 유기상을 분리하고 수집하였다. 수성 상을 400mL의 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기상을 합하였다. 유기상을 800mL의 포화 염수로 1회 세척하고 무수 황산나트륨 위에서 건조하고 여과하였으며, 여과액은 감압 농축시켰다. 반응 용액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피(석유에테르:에틸아세테이트=3:1)하여 61g의 중간체 C를 얻었다. 수율은 70%였다. LCMS(ESI) m/z: 437.34 [M+Na]+.
단계 4 화합물 D의 합성
중수소화 메탄올 270mL와 중수 70mL에 화합물 C 31.2g을 넣고 빙수조에서 교반한 후 NaOH 5.5g을 넣고 실온으로 데워 밤새 교반하였다. 반응 용액에 에틸아세테이트 300mL와 물 300mL를 가하여 추출하고, 수용액층에 빙초산 20mL를 가하여 pH를 2-3으로 조절한 다음 고체를 침전시킨 후 진공 여과하여 20.3g의 화합물 D를 얻었다. 수율은 69.8%였다. LCMS(ESI) m/z: 409.08 [M + Na]+.
단계 5 화학물 E의 합성
엑사테칸 메실레이트 2수화물 2.0g 및 화합물 D 1.63g을 100mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. N,N-디메틸포름아미드 40mL를 넣고 교반하였다. 반응 용액을 0℃로 냉각시켰다. 2-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 2.0g 및 N,N-디이소프로필에틸아민 1.82g을 순차적으로 첨가하였다. 반응계를 0℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 얼음물 120mL에 부었다. 반응 용액을 1시간 동안 교반하고 여과하였다. 필터 케이크를 디클로로메탄으로 용해시켰다. 반응 용액을 컬럼크로마토그래피(100~200메쉬의 실리카겔 100g, 디클로로메탄:메탄올=30:1, 2L)하여 2.6g의 화합물 E 얻었다. 수율은 92%였다. LCMS(ESI) m/z: 804.84 [M+H]+.
단계 6 화합물 F의 제조
0.38g의 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔을 100mL 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 20 mL의 테트라히드로푸란을 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고 혼합물을 교반하였다. 반응 용액을 0℃로 냉각시켰다. 2.0g의 화합물 E를 칭량하고 20mL의 테트라히드로푸란에 용해시켰다. 준비된 화합물 E 용액을 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 천천히 넣었다. 반응계는 자연적으로 상온으로 가온하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응액을 질소 분위기에서 여과하여 1.45g의 화합물 F를 얻었다. 수율은 98%였다. LCMS(ESI) m/z: 582.39 [M+H]+.
단계 7 화합물 H의 제조
화합물 F 1.00g 및 화합물 G 0.97g을 100mL 원형 바닥 플라스크에 넣고, 여기에 N,N-디메틸포름아미드 10mL를 첨가하였다. 반응 용액을 -20℃로 냉각시키고, 0.34g의 1-히드록시벤조트리아졸 및 0.49g의 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염을 첨가하였다. 반응계를 -20℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 반응 용액에 20mL의 DCM과 20mL의 물을 첨가하고, 혼합물을 0.5시간 동안 교반한 후 분액을 위해 방치하고, 유기상을 수집하였다. 유기상을 무수 황산나트륨 위에서 건조시키고 여과하였다. 여과액을 감압 농축 건조시켰다. 반응액을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(디클로로메탄:메탄올 = 15:1)하여 400mg의 화합물 H 얻었다. 수율은 약 22%였다. MS m/s: 1037.08 [M+H]+. H-NMR(500MHz, DMSO-d6) 8.62 (1H, t, J=6.5), 8.49 (1H, d, J=8.5), 8.29 (1H, t, J=5.5), 8.12 (1H, d, J=8.0), 8.06 (1H, t, J=5.5), 8.00 (1H, t, J=5.5), 7.74 (1H, d, J=10.5), 7.30 (1H, s), 7.27~7.12 (5H, m), 6.98 (2H, s), 6.51 (1H, brs), 5.61~5.58(1H, m), 5.45~5.37 (2H, m), 5.22~5.13 (2H, m), 4.64 (2H, d, J=6.5),4.49~4.45 (1H, m), 3.76~3.57 (6H, m), 3.37~3.32 (2H, m), 3.24~3.09 (2H, m), 3.02 (1H, dd, J=4.5,14.0), 2.77 (1H, dd, J=9.5,13.5), 2.36 (3H,s), 2.23~2.14 (2H, m) 2.09 (2H, t, J=7.5), 1.91~1.79 (2H, m), 1.49~1.42 (4H, m), 1.20~1.14(2H, m), 0.87 (3H, t, J=7.5).
Figure pct00041
단계 1 중간체 I의 합성
화합물 A 0.85g을 중수소화 메탄올 9mL와 중수 1mL에 넣고 빙수조에서 교반한 후 수산화나트륨 0.32g을 넣고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 용액을 40℃에서 감압 농축하여 화합물 I을 얻었고, 이를 정제 없이 바로 다음 단계에 사용하였다.
단계 2 화합물 J(DDDXD) 합성
0.30g의 엑사테칸 메실레이트 2수화물 및 0.056g의 중간체 I를 3mL의 N,N-디메틸포름아미드에 첨가하였다. 혼합물을 빙수조에서 교반한 후, 1H-벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디닐 헥사플루오린포스페이트 0.32g 및 N,N-디이소프로필에틸아민 0.22g을 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응액을 액체 크로마토그래피하여 0.18g의 화합물 J를 얻었다. 수율은 64.3%였다. LC-MS (ESI) m/z: 496.37 [M+H]+. 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 8.39 (d, J = 8.9Hz, 1H), 7.70 (d, J = 10.9Hz, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58~5.54 (m, 1H), 5.47 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.17~5.02 (m, 2H), 3.24~3.03 (m, 2H), 2.34 (s, 3H), 2.25~2.09 (m, 2H), 1.92~1.80 (m, 2H), 0.87 (t, J = 7.3Hz, 3H).
또한, 특허 WO2014057687 명세서의 실시예 76에 개시된 방법을 참고하여 DXD를 제조하였다.
Figure pct00042
실시예 15 항체-약물 접합체의 제조
시약:
용액 A: pH 7.4의 PBS 버퍼
용액 B: 10mM 수성 TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염)
용액 C: DMSO(디메틸 설폭사이드)
용액 D: 히스티딘 완충액(0.89mg/mL L-히스티딘 및 4.04mg/mL L-히스티딘 염산염 1수화물 함유)
용액 E: 700mg/mL 수크로스 용액(용액 D로 제형화됨)
용액 F: 20mg/mL Tween 80(용액 D로 제형화됨)
항체: 트라스투주맙, 23C2 Her2-2
링커-페이로드(링커-세포독성 약물 모이어티): MC-GGFG-DXD 및 MC-GGFG-DDDXD
실험 조건 및 그룹:
항체 (N1): TCEP (N2) 항체 (N1): 화합물 (N3)
1:6/1:6.6 1:11.6/1:9.6
일련 번호 그룹
1 MC-GGFG-DXD에 대한 Trastuzumab의 포화 접합 (N1:N2 = 1:6, N1:N3 = 1:11.6)
2 MC-GGFG-DDDXD에 대한 Trastuzumab의 포화 접합(N1:N2 = 1:6, N1:N3 = 1:11.6)
3 MC-GGFG-DXD에 대한 23C2 Her2-2의 포화 접합 (N1:N2 = 1:6.6, N1:N3 = 1:9.6)
4 23C2 Her2-2의 MC-GGFG-DDDXD로의 포화 접합 (N1:N2 = 1:6.6, N1:N3 = 1:9.6)
절차:
1. 항체 교체
a. 용액 A를 사용하여 30KD의 초여과 원심분리기 튜브를 완전히 적셨다;
b. 항체가 용액 A로 교체되었다;
c. 항체 농도를 5mg/mL(23 C2 Her2-2), 7.5mg/mL(trastuzumab)로 조절하기 위해 용액 A를 적당량 투입하였다.
2. 항체 감소
a. 항체의 몰 중량을 계산하여 N1로 기록하였다;
b. 반응 시스템에서 TCEP의 몰 무게가 N2가 되도록 항체 용액에 적절한 양의 용액 B를 첨가했다;
c. 초여과 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 회전식 배양기 위에 올려놓고 저속(20rpm)으로 진탕한 후 암실에서 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.
3. 활용
a. 적절한 양의 링커-페이로드를 취하여 DMSO에 용해하여 최종 농도를 10mg/m로 조정하였다;
b. 항체 용액에 DMSO를 첨가하여 항체 농도가 5중량%가 되도록 한 후 적절한 양의 링커-페이로드 용액을 첨가하여 몰 농도가 N3가 되도록 하였다;
c. 초여과 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 회전식 배양기 위에 올려놓고 저속(20rpm)으로 진탕하고 암실에서 20℃에서 2시간 동안 반응시켰다.
4. 활용종료
a. 용액 D를 사용하여 초여과 원심분리기 튜브를 적셨다;
b. 용액 D에 항체를 치환하고 용액 E와 F를 적당량 첨가한 후 수크로스와 Tween 80의 농도를 각각 90mg/mL 및 0.3mg/mL로 조절하여 -80℃에서 냉동 보관하였다.
항체-약물 접합체의 DAR 값(항체 분자당 평균 약물 결합 수) 결정
DAR 값은 LC-MS 방법으로 결정되었다. 준비된 ADC 샘플 50μg에 글리코시다제 PNGaseF(RHINO BIO, China) 1 μL를 첨가하고 37℃에서 20시간 동안 배양했다. 실험에 사용된 질량분석기는 고해상도 Xevo G2-XS(Waters, USA)를 사용하였으며, 샘플의 농도는 5μM로 조정하였고, 다이렉트 샘플링 방식을 채택하여 양이온 모드에서 질량 스펙트럼 데이터를 수집하였다. 수집된 비변성 질량 스펙트럼 데이터는 소프트웨어 UNIFI 1.8.2.169(Waters, USA)를 사용하여 분석 및 처리되었다.
항체-약물 접합체의 단백질 농도 측정
단백질 농도는 로우리(lowry) 방법으로 검출하였다. 트라스투주맙과 23C2 Her2-2를 표준물질로 사용하였다. OD650 파장에서 표준물질과 준비된 ADC 시료의 흡광도 값을 마이크로플레이트 리더를 이용하여 검출하고, 표준곡선 wad를 장착한 후, 시료의 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 단백질 농도를 계산하였다.
상기 방법으로 다음과 같은 항체-약물 결합체를 제조하고 분석하였다:
Figure pct00043
트라스투주맙-DXD, 항체 농도: 4.25mg/mL, DAR: 7
Figure pct00044
트라스투주맙-DDDXD, 항체 농도: 4.29mg/mL, DAR: 7.7.
Figure pct00045
23C2 Her2-2-DXD, 항체 농도: 4.35mg/mL, DAR: 5.7.
Figure pct00046
23C2 Her2-2-DDDXD, 항체 농도: 4.16mg/mL, DAR: 5.8.
실시예 16 중수소화 DXD(DDDXD)의 시험관내 효소 활성
1. 시약 재료 준비
a. 1% 아가로스 전기영동겔이 만들었다;
b. 겔화 염료 침지 용액을 조제하고 암실에 저장했다;
c. 토포이소머라아제 I의 작업용액은 초순수와 완충액에 의해 제형화되었다.
2. 샘플 제형
a. 화합물(DDDXD)을 다시 용해하여 DMSO(초기 농도 200μM에서 5 농도까지 10배로 순차적으로 희석)에 희석하였다.
3. 반응계
a. 양성 대조군: 초순수 15μL + DNA Topoismasel 완충용액 2μL + BSA 0.1% + 1μL pBR322 DNA;
b. 음성 대조군: 초순수 14μL + 10× DNA Topoismasel 완충용액 2μL + BSA 0.1% 2μL + pBR322 DNA 1μL + Topoisomerase I 작업용액 1μL;
c. 시료군: 초순수 12μL + 10× DNA Topoismasel 완충용액 2μL + BSA 0.1% + pBR322 DNA 1μL + Topoisomerase I 작업용액 1μL + 화합물 2μL.
4. 절차
a. 상기 반응계를 37℃의 수조에 30분 동안 두었다;
b. 반응을 종료하기 위해 각 튜브 시스템에 2μL의 로딩 버퍼를 추가했다;
c. 아가로스 겔 전기영동은 2-2.5V/cm의 전압하에서 1.5시간 동안 수행되었다;
d. 전기영동 후 겔을 1.5시간 동안 겔화된 어두운 기포로 염색하고 겔 이미저로 촬영하였다.
실시예 17 항체-약물 접합체의 항원 결합 검정
실시예 6의 방법을 참조하여, HER2 단백질에 대한 트라스투주맙, 23C2 HER2-2, 트라스투주맙-DDDXD 및 23C2 HER2-2-DDDXD의 측정된 친화도를 하기 표 14에 나타내었다:
샘플 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
트라스투주맙 1.23E+05 1.12E-04 9.16E-10
23C2 HER2-2 1.73E+05 6.06E-05 3.49E-10
트라스투주맙-DDDXD 1.28E+05 1.19E-04 9.25E-10
23C2 HER2-2-DDDXD 1.28E+05 3.26E-05 2.55E-10
상기 결과는 항-Her2 이중특이적 항체가 트라스투주맙에 비해 항원 결합 활성이 더 강하고, 항-Her2 이중특이적 항체 ADC가 트라스투주맙 ADC에 비해 항원 결합 활성이 더 강함을 보여준다.
실시예 18 항체-약물 접합체의 세포내이입 분석
실험 방법: 대수 성장기 세포(NCI-N87 세포 및 SK-BR-3 세포) 1vial을 채취하고, 세포 밀도를 2.5 × 106cells/mL로 조정한 후 20μL/well로 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 또한 DS-8201, 대조군 IgG1(비 HER2 표적 특이적 IgG1; Sino Biological, Cat No. HG1K) 및 DDDXD 결합 IgG1-DDDXD를 대조군으로 사용했다. 구배로 희석되고 표지된 세포내이입 시약(sartorius, 90564)을 세포 플레이트에 20μL/웰로 첨가하고 37℃에서 15분 동안 배양했다. 96-웰 세포 배양 플레이트를 취하여 2개의 세포를 20μL/웰로 첨가한 후, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 96-웰 세포 배양 플레이트를 제거하고 유세포 분석기에 넣어 신호 강도를 측정했다.
NCI-N87 및 SK-BR-3 2개의 HER2 양성 세포에 대한 세포내이입 실험의 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다. 항-Her2 이중특이적 항체 ADC의 세포내이입이 트라스투주맙 ADC보다 더 강함을 보여준다.
실시예 19 중수소화 DXD와 항체-약물 결합체의 세포 활성
DXD 및 DDDXD는 배양 배지에서 140,000ng/mL로 미리 희석하고 S1로 표시한 다음 5배 연속 희석하여 해당 참조 샘플 S1-S9를 얻었다. 최종 약물 농도 범위는 35000ng/mL ~ 0.0896ng/mL였으며 총 9개 농도였다. 대수 성장기인 HER2 양성 종양 세포 NCI-N87을 채취하여 밀도를 1×105cells/mL로 조정하여 웰당 100μL로 도말하고 세포가 없는 빈 웰을 대조군으로 설정하였다. 상기 연속 희석된 2개의 샘플을 웰당 50μL로 첨가하였다. 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 5일 동안 5% CO2로 배양하였다. 배양 배지를 버리고 CCK-8(Dojindo, Japan, Cat. No. CK04) 작업용액을 웰당 100μL씩 첨가하였다. 플레이트를 발색을 위해 4~5시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 판독기(제조업체: Thermo, 모델: VarioskanFlash)에 넣었다. 450nm의 파장에서 흡광도 값은 630nm의 기준 파장을 이용하여 기록했다. 종양 세포에 대한 증식 억제를 계산하였다.
NCI-N87 세포 실험 결과는 하기 표 15과 같다:
샘플 IC50(nM)
DXD 4.45
DDDXD 4.01
DDDXD는 DXD보다 더 강한 종양 세포 증식 억제 활성을 보였다.
검출하고자 하는 항체와 실시예 15에서 제조된 항체-약물 접합체를 배양액을 사용하여 20μg/mL로 미리 희석하여 S1으로 표지한 후 5배 연속 희석하여 해당 샘플 S1-S9를 얻었다. 약물의 최종 농도 범위는 5000ng/mL에서 0.0128ng/mL까지 총 9가지 농도를 나타내었다. 대수 성장기의 HER2 양성 종양 세포(NCI-N87, BT474 및 SK-BR-3)를 수집하여 각각 2 × 104cells/mL의 밀도로 조정하고 웰당 100μL로 도말하고, 세포가 없는 빈 웰을 대조군으로 설정하였다. 순차적으로 희석된 샘플을 웰당 50μL로 첨가했습니다. 플레이트를 37℃의 인큐베이터에서 5일 동안 5% CO2로 배양하였다. 배양 배지를 버리고 CTG 검출 배지(Promega, Cat. No. G7572) 100μL를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 발색을 위해 10분 동안 배양한 후 마이크로플레이트 판독기(제조사 Thermo, 모델: VarioskanFlash)를 사용하여 화학 발광 값을 읽었다. 종양 세포에 대한 증식 억제율을 계산하였다.
NCI-N87 세포 실험 결과를 하기 표 16에 나타내었다:
샘플 증식 억제율 %
트라스투주맙 34.51
트라스투주맙-DDDXD 70.81
23C2 HER2-2 75.73
23C2 HER2-2-DDDXD 90.08
BT474 세포 실험 결과를 하기 표 17에 나타내었다:
샘플 증식 억제율 %
트라스투주맙 67.91
트라스투주맙-DDDXD 47.82
23C2 HER2-2 75.56
23C2 HER2-2-DDDXD 73.76
SK-BR-3 세포 실험 결과를 하기 표 18에 나타내었다:
샘플 증식 억제율 %
트라스투주맙 20.36
트라스투주맙-DDDXD 67.15
23C2 HER2-2 62.89
23C2 HER2-2-DDDXD 75.56
상기 결과로부터 항-Her2 이중특이적 항체 ADC의 세포 사멸 능력이 트라스투주맙 ADC보다 우수함을 알 수 있다.
실시예 20 간 미세소체에서의 시험관 내 안정성 분석
각 배양 시스템은 인산염 완충 식염수(PBS, pH 7.4), 간 마이크로좀 단백질, 기질(시험할 샘플의 아세토니트릴 용액) 및 NADPH를 포함하고, 37℃ 수조에서 배양을 수행하고, 0, 5, 15, 30 및 60분 후에 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 아세토니트릴을 첨가하여 반응을 종료하였다. 음성 대조군은 해당 종의 열 불활성화 간 마이크로솜과 함께 배양되었다. 원래 기판의 나머지 내용물은 LC/MS/MS 방법으로 검출하였다.
실시예 21 항체-약물 접합체의 생체내 약동학적 실험
본 출원의 항체-약물 결합체의 생체내 대사 경로 및 약물 동태 파라미터는 나가이 요코 등이 저자인 HER2 표적 항체-약물 결합체인 트라스투주맙 데룩스테칸(DS-8201a)의 포괄적 임상 전 약물 동태 평가, Cynomolgus Monkeys, 2019, 49(9), 1086-1096 에 설명된 방법을 참조하여 결정되었다,
실시예 22 JIMT-1 Her2 양성 유방암 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 항체-약물 접합체의 억제 효과
JIMT-1 유방암 세포를 2 × 107mL × 0.1mL/마우스의 농도로 준비하여 무균 상태에서 누드 마우스의 오른쪽 겨드랑이에 접종하였다. 종양 부피가 약 100-300mm3가 될 때까지 피하 이종이식 종양 접종 후 동물을 무작위로 3개 그룹으로 나누었다: 모델 그룹: 용매(L-히스티딘 0.89mg/mL, L-히스티딘 하이드로클로라이드 4.04mg/mL, 폴리소르베이트 800.3mg/mL, 수크로스 90mg/mL 포함), 6마리; 23C2 Her2-2-DXD 그룹: 1.68mg/kg, qw, i.v. 6마리; 23C2 Her2-2-DDDXD 그룹: 1.59mg/kg, qw, i.v. 6마리. 주당 2-3회 종양 부피를 측정하고 마우스의 무게를 측정하고 동물 성능을 매일 관찰하여 데이터를 기록했다.
상대 중량(RWt)은 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00047
상기 Wt0는 케이지 투여 시 동물 체중(즉, d0)이고 Wt는 각 측정 시 동물 체중이다.
종양 성장 억제(TGI)는 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00048
상기 TW는 투여군의 종양 중량이고 TW0는 모델군의 종양 중량이다.
체중은 하기 표 19에 나타내었다:
그룹 복용량
mg/kg		 투여빈도 투여경로 동물의 수 상대 체중 변화(%) 평균 ± SD
d0 d24 d6 d12 d18 d24
모델 그룹 - qw i.v. 6 6 5.8±3.1 9.1±3.9 9.6±3.8 15.8±5.4
23C2 Her2-2-DXD 1.68 qw i.v. 6 6 6.7±6.6 9.9±5.6 10.2±4.3 14.5±4.7
23C2 Her2-2-DDDXD 1.59 qw i.v. 6 6 8.8±3.5 11.5±5.0 12.4±2.9 15.0±5.4
약물 효과는 하기 표 20에 나타내었다:
그룹 복용량
mg/kg		 투여빈도 투여경로 동물의 수 종양 무게 평균±SD TGI (%)
d0 d24
모델 그룹 - qw i.v. 6 6 0.594±0.166 -
23C2 Her2-2-DXD 1.68 qw i.v. 6 6 0.189±0.072 68.2%
23C2 Her2-2-DDDXD 1.59 qw i.v. 6 6 0.145±0.056 75.6%
결과는 다음과 같다: 23C2 Her2-2-DXD 및 23C2 Her2-2-DDXD는 인간 유방암 세포의 JIMT-1 마우스 이종이식편 종양 모델에 유의미한 약물 효과를 보였고, 23C2 Her2-2-DDXD는 23C2 Her2-2-DXD에 비해 더 강한 종양 억제 효과를 보였다.
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tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc 420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct 480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag 540 ctgctgatct actccgcctc cttcctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc 600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca 660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag 720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca 780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg 840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag 900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga 960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat 1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc 1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc 1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt 1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag 1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg 1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag 1425 <210> 3 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 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ggtggctcgg atctatccta ccaatggcta cacaagatat 180 gccgactccg tgaagggccg gtttaccatc agcgccgata cctctaagaa cacagcttac 240 ctgcagatga attccctgag ggccgaggac acagccgtgt actattgcag cagatgggga 300 ggcgacggct tctacgctat ggattattgg ggccagggca ccctggtgac agtgtccagc 360 ggcggcggcg gctctggagg aggaggatcc ggaggaggag gaagcgatat ccagatgacc 420 cagtcccctt cttccctgtc tgcctccgtg ggcgacagag tgaccatcac atgtcgcgct 480 agccaggatg tgaacacagc cgtggcttgg taccagcaga agccaggcaa ggcccccaag 540 ctgctgatct actccgcctc ctacctgtat tccggagtgc caagcaggtt ttccggaagc 600 cggtctggaa ccgacttcac cctgacaatc agctctctgc agcctgagga ttttgccaca 660 tactattgcc agcagcacta taccacaccc cctaccttcg gccagggcac aaaggtggag 720 atcaagggcg agccaaagtc cagcgacaag acccatacat gcccaccatg tcctgctcca 780 gagctgctgg gcggcccttc cgtgttcctg tttcctccaa agccaaagga taccctgatg 840 atctctagaa cccctgaggt gacatgcgtg gtggtggacg tgtcccacga ggatccagag 900 gtgaagttta actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac caagccaaga 960 gaggagcagt acaattctac ctatcgcgtg gtgtccgtgc tgacagtgct gcaccaggat 1020 tggctgaacg gcaaggagta taagtgcaag gtgagcaata aggccctgcc cgctcccatc 1080 gagaagacca tctctaaggc taagggccag cccagagagc ctcaggtgta cacactgccc 1140 cctagccgcg aggagatgac caagaaccag gtgtctctga catgtctggt gaagggcttt 1200 tatccatctg acatcgccgt ggagtgggag tccaatggcc agcccgagaa caattacaag 1260 accacaccac ccgtgctgga ctctgatggc tccttctttc tgtattccaa gctgaccgtg 1320 gataagagcc gctggcagca gggcaacgtg ttctcctgca gcgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaatcatt acacacagaa gtctctgtcc ctgagccctg gcaag 1425 <210> 5 <211> 475 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of anti-Her2-scFv-VL-F53A-Fc <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 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ggaagagatg 1080 accaagaacc aggtgtccct gtcctgtgcc gtgaagggct tctacccttc cgatatcgcc 1140 gtggaatggg agagcaatgg ccagcctgag aacaactaca agacaacccc tcctgtgctg 1200 gactccgacg gctcattctt cctggtgtcc aagctgacag tggacaagtc cagatggcag 1260 cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacag gttcacccag 1320 aagtccctgt ctctgagccc cggcaaatga 1350 <210> 15 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of anti-Her2-domain2-LC <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe 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ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc 840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc 960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc 1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct 1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag 1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc 1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc 1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac 1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag 1440 tga 1443 <210> 23 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg 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Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245 250 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260 265 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275 280 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290 295 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305 310 315 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325 330 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340 345 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355 360 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370 375 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385 390 395 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405 410 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420 425 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435 440 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450 455 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 480 <210> 24 <211> 1443 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of b-anti-Her2-scFv-VL-F53Y-Fc <400> 24 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg 60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac 180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc 300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct 360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct 420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca 480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct 540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttcctacc tgtactccgg cgtgcccagc 600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct 660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag 720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct 780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc 840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc 960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc 1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct 1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag 1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc 1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc 1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac 1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag 1440 tga 1443 <210> 25 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of anti-Her2-scFv-VH-VL-Fc <400> 25 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met 130 135 140 Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr 145 150 155 160 Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr 165 170 175 Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser 180 185 190 Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala 210 215 220 Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln 225 230 235 240 Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr 245 250 255 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 260 265 270 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 275 280 285 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 290 295 300 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 305 310 315 320 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 325 330 335 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 340 345 350 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 355 360 365 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 370 375 380 Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys 385 390 395 400 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 405 410 415 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 420 425 430 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 435 440 445 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 450 455 460 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 480 <210> 26 <211> 1440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of anti-Her2-scFv-VH-VL-Fc <400> 26 gaggtgcaac tggtggaatc cggcggggga ctggtccaac ctggagggag cctgcggctg 60 tcttgcgccg cctctggctt caacatcaag gatacctaca tccactgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctggaatg ggtcgctaga atctacccta ccaacggcta caccagatac 180 gccgactctg taaagggcag attcaccatc tctgccgata catctaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgag agccgaggac accgccgtgt actactgctc ccggtggggc 300 ggtgacggct tttacgccat ggactactgg ggacaaggca cacttgttac ggtgtcctct 360 ggaggcggcg gctccggcgg cggcggctct ggcggaggcg gctctggcgg cggcggatct 420 gatatccaga tgacccagtc tcctagctcc ctctccgcct ccgtgggcga cagagtgaca 480 atcacctgca gagcttctca ggacgtgaac accgctgtgg cctggtacca gcagaagcct 540 ggcaaggccc ctaagctgct gatctactct gcttccttcc tgtactccgg cgtgcccagc 600 cggttctccg gctctcggtc cggcaccgac ttcactctga ccatctccag cctgcagcct 660 gaagatttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacca cccctcccac cttcggccag 720 ggcaccaaag tggagatcaa gggcgagccc aagtcctccg ataaaaccca cacctgtcct 780 ccttgccctg cccctgaact actgggcggc ccttctgtgt tcctgttccc tcctaagccc 840 aaggacaccc tgatgatctc tagaacccct gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900 cacgaggacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaagt gcataacgcc 960 aagaccaagc ctagagaaga gcagtacaac tccacctaca gagtggtctc cgtgctgacc 1020 gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggct 1080 ctgcctgctc ctatcgagaa gacaatctcc aaggccaaag gccagcctcg ggagcctcag 1140 gtgtacaccc tgcctccttg tagagaggaa atgaccaaga accaggtgtc tctgtggtgc 1200 ctggtgaagg gcttctaccc atccgacatc gccgtcgagt gggagtccaa cggacagccc 1260 gagaacaact acaagactac cccacctgtg ctggactccg atggctcctt cttcctgtac 1320 tccaagctga ccgtggacaa gtccagatgg cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg 1380 atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc cagaaatccc tgtctctgtc ccctggcaag 1440 1440 <210> 27 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is K or E <400> 27 Gly Phe Asn Ile Xaa Asp Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp 1 5 10 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Light chain CDR2 of Her2-2/23C-HER2-2 <400> 31 Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 32 Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210> 33 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is F or Y <400> 34 Ser Ala Ser Xaa Leu Tyr Ser 1 5 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Heavy chain variable region of Her2-3/23C-HER2-3 <400> 35 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Light chain variable region of Her2-4/23C-HER2-4 <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 37 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Second antigen-binding fragment's (Fab) Heavy chain variable region of Her2-2/23C-HER2-2 <400> 37 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of Second antigen-binding fragment's (Fab) Light chain variable region of Her2-2/23C-HER2-2 <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 39 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Light chain variable region of Her2-3/23C-HER2-3 <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 40 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Heavy chain variable region of Her2-4/23C-HER2-4 <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 41 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is K or E <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Xaa Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Xaa is F or Y <400> 42 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Xaa Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of First antigen-binding fragment(scFV)'s Heavy chain CDR1 of Her2-2/23C-HER2-2 <400> 43 Gly Phe Asn Ile Glu Asp Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His 1 5 10 <210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 45 Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Thr Met Asp 1 5 10 <210> 46 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 46 Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 47 Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 48 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly Val Ala 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 49 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 50 Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr Thr 1 5

Claims (25)

  1. 일반식 Ab-(L-U)n의 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물로서,
    상기 Ab는 항체 모이어티를 나타내고,
    상기 L은 링커 모이어티를 나타내고,
    상기 U는 세포독성 약물 모이어티를 나타내고,
    상기 n은 1 내지 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정수 또는 소수이며,
    상기 U는 캄프토테신 토포아이소머라제 Ⅰ 억제제이고, L 모이어티 및/또는 U 모이어티는 중수소화 변형을 갖음.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 U는 SN-38, SN-38 유도체, 엑사테칸 및 엑사테칸 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들의 용매화물.
  3. 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체-약물 접합체는 하기 화학식 III 또는 화학식 IV의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 III]
    Figure pct00049

    [화학식 IV]
    Figure pct00050

    상기 화학식 IV에서,
    R1은 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 군에서 선택됨.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체-약물 접합체는 하기 화학식 VI의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 VI]
    Figure pct00051

    상기 화학식 VI에서,
    R1 및 R2는 각각 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 화학식 VI는 하기의 화학식 VI-1, 화학식 VI-2, 화학식 VI-3 또는 화학식 VI-4의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 이들의 용매화물:
    [화학식 VI-1]
    Figure pct00052

    [화학식 VI-2]
    Figure pct00053

    [화학식 VI-3]
    Figure pct00054

    [화학식 VI-4]
    Figure pct00055
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Ab는 HER2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 Ab는 1가이고 HER2 발현 세포 상에서 HER2의 ECD4 에피토프에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 단편을 포함하며,
    상기 제1 항원-결합 단편은 scFv이고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 27, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 34 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3은 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제1 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 군에서 선택되는, 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물:
    i. 각각 서열번호 41 및 42에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편; 및
    ii. 각각 서열번호 41 및 42에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 제1 항원-결합 단편.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 35에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 36에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  11. 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 항원-결합 단편은 VH 및 VL이 다음과 같은 순서로 N-말단에서 C-말단으로 배열되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물: VH-링커-VL.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 모이어티 Ab는 1가이고 HER2-발현 세포 상의 HER2의 ECD2 에피토프에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 단편을 추가로 포함하고, 제2 항원 결합 단편은 Fab인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제2 항원-결합 단편은 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3은 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3은 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하는
    것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  14. 제12항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 항원-결합 단편은 각각 서열번호 37 및 38에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  15. 제6항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 모이어티 Ab는 제1 항원-결합 단편 및/또는 제2 항원-결합 단편에 작동가능하게 연결된 면역글로불린 기능적 도메인을 포함하고, 상기 면역글로불린 기능적 도메인은 i. CL, CH1, CH2 또는 CH3 중 하나 이상, 또는 ii. Fc인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 약학적으로 허용되는 염 또는 이의 용매화물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc는 각각 인간 IgG의 CL, CH1, CH2, CH3 및 Fc에서 유래된 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 CL, CH1, CH2, CH3 또는 Fc는 변형을 갖거나 갖지 않는 것이며, 바람직하게는 CH3 또는 Fc는 Kabat 넘버링 시스템에 따른 위치 435 및/또는 위치 436에서 아미노산 치환인 변형인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 용매화물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc는 제1 Fc 폴리펩타이드 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 이량체 Fc이고, 제1 항원 결합 단편은 제1 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되고, 제2 항원 결합 단편은 제2 Fc 폴리펩타이드에 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  19. 제6항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 모이어티 Ab는 서열번호 11에 기재된 중쇄, 서열번호 13에 기재된 중쇄 및 서열번호 15에 기재된 경쇄를 포함하는 2가 이중특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물.
  20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체-약물 접합체가 하기 화학식 VII의 구조를 갖는 것인 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 VII]
    Figure pct00056

    상기 화학식 VII에서,
    Ab는 제1 항원-결합 단편 및 제2 항원-결합 단편을 포함하는 항체 모이어티를 나타내고,
    제1 항원-결합 단편은 scFv이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3를 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 43, 28 및 29에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 30, 31 및 32에 기재된 아미노산 서열을 포함하며,
    제2 항원-결합 단편은 Fab이고 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2, 중쇄 CDR3, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3을 포함하고, 중쇄 CDR1, 중쇄 CDR2 및 중쇄 CDR3는 각각 서열번호 45, 46 및 47에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 경쇄 CDR1, 경쇄 CDR2 및 경쇄 CDR3는 각각 서열번호 48, 49 및 50에 기재된 아미노산 서열을 포함하며,
    n은 1~10으로 이루어진 군에서 선택되는 정수 또는 소수이고,
    R1 및 R2는 수소(H) 및 중수소(D)로 구성된 그룹에서 각각 독립적으로 선택됨.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 화학식 VII이 하기 화학식 VII-1, 화학식 VII-2, 화학식 VII-3 또는 화학식 VII-4의 구조를 갖는 것인 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물:
    [화학식 VII-1]
    Figure pct00057

    [화학식 VII-2]
    Figure pct00058

    [화학식 VII-3]
    Figure pct00059

    [화학식 VII-4]
    Figure pct00060
  22. 암 예방 및 치료용 의약 제조에 있어서의 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 용도로서, 상기 암은 바람직하게는 HER2 양성 암, HER2 음성 암, 및 면역조직화학적 분석에 의해 검출된 IHC2+로서 HER2 발현을 나타내는 암인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 또는 용매화물의 용도.
  23. 하기 화학식 VI의 구조를 갖는 링커-약물 중간체 화합물:
    [화학식 VI]
    Figure pct00061

    상기 화학식 VI에서,
    R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소(H) 및 중수소(D)로 이루어진 그룹으로부터 선택됨.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 화학식 VI이 하기 화학식 VI-1, 화학식 VI-2, 화학식 VI-3 또는 화학식 VI-4의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 링커-약물 중간체 화합물:
    [화학식 VI-1]
    Figure pct00062

    [화학식 VI-2]
    Figure pct00063

    [화학식 VI-3]
    Figure pct00064

    [화학식 VI-4]
    Figure pct00065
  25. 하기 화학식 IV(a) 또는 화학식 III(a)의 구조를 갖는 화합물:
    [화학식 IV(a)]
    Figure pct00066

    [화학식 III(a)]
    Figure pct00067

    상기 화학식 IV(a)에서,
    R1은 수소(H) 및 중수소(D)로 구성된 그룹에서 선택됨.










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