TW202417040A - 涉及用於治療癌症的上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑之組合 - Google Patents

涉及用於治療癌症的上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑之組合 Download PDF

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法蘭克 爾灣 康摩爾
保羅 大衛 史密斯
尼古拉斯 弗洛克
義塔莉亞 葛瑞佳
萊恩 詹姆斯 哈特邁爾
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瑞典商阿斯特捷利康公司
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Abstract

本揭露關於用於在治療癌症（例如，非小細胞肺癌[NSCLC]）中組合使用的上皮生長因子受體（EGFR）酪胺酸激酶抑制劑（TKI）和抗EGFR/cMET抗體分子。

Description

涉及用於治療癌症的上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑之組合
本說明書關於用於在治療癌症（例如非小細胞肺癌[NSCLC]）中使用的上皮生長因子受體（EGFR）酪胺酸激酶抑制劑（TKI），其中該EGFR TKI與抗EGFR/cMET抗體分子組合投與。
有多種已獲批准或處於臨床開發中的針對上皮生長因子受體（EGFR）的藥物。例如，目前有兩種第一代（厄洛替尼和吉非替尼）、兩種第二代（阿法替尼和達克替尼）和一種第三代（奧希替尼）酪胺酸激酶抑制劑（TKI）可用於管理EGFR突變陽性非小細胞肺癌（NSCLC）。所有該等TKI在NSCLC患者中均有效，該等患者的腫瘤攜帶EGFR的外顯子19中的框內缺失和外顯子21中的L858R點突變。這兩種突變占所有EGFR突變的大約90%。在大約50%的患者中，對第一代和第二代TKI的抗性係由獲得「看門人（gatekeeper）」突變T790M而介導的。目前，奧希替尼係唯一對外顯子19缺失和L858R突變具有活性（無論是否存在T790M突變）的註冊EGFR TKI。然而，即使用奧希替尼治療的患者最終也會進展，這主要是由於其他抗性機制導致後天性抗性的發展。因此，仍然需要開發用於治療癌症的新療法，尤其是對於在用第三代EGFR TKI治療後已出現疾病進展的患者。
cMET（原癌基因MET的基因產物）係主要在上皮細胞表面表現的受體酪胺酸激酶。已經報導了多種人類癌症的cMET途徑的異常表現和失調，該等癌症包括非小細胞肺癌、大腸直腸癌、胃腸癌、頭頸癌、胰臟癌、腎癌和肝細胞癌等（Organ, 2011；Birchmeier, 2003；Mo, 2017；Sierra, 2011）。有大量且越來越多的文獻表明，EGFR和cMET傳訊通路之間存在交互作用和直接相互作用，並且這種交互作用在功能上轉化為臨床上對EGFR和cMET靶向療法的抗性（McDermott, 2010；Moores, 2016；Suda, 2010）。
已經研究抗體藥物軛合物（ADC）作為克服與治療表現cMET和EGFR的癌症相關的限制的手段。一種EGFR指導的ADC（迪妥昔珠單抗莫福汀（depatuxizumab mafodotin，ABT-414））處於由艾伯維公司（AbbVie）進行的神經膠質母細胞瘤的III期臨床開發中（Phillips, 2016）。ABT-414之前在II期試驗中針對多種其他實性瘤適應症進行了測試（ClinicalTrials.gov: NCT01741727）。ADC在該等適應症中在耐受劑量下顯示出功效有限，並且在所治療的患者中經常觀察到令人擔憂的眼部毒性（Tolcher, 2014）。第二代EGFR ADC（ABBV-221）處於臨床開發中，但由於安全性問題而中斷（Phillips, 2018；Calvo, 2017）。有一種cMET靶向ADC（特立妥珠單抗瑞他汀（Telisotuzumab Vedotin，ABBV-399）），其作為單一療法和與EGFR抑制劑厄洛替尼組合，進入腫瘤表現高水平cMET的非小細胞肺癌（NSCLC）患者的II期臨床開發（Angevin, 2017；Wang, 2017）。在I期試驗中，cMET ADC + EGFR TKI組合在該所選患者群體中顯示出臨床活性，周邊神經病變和皮疹係最常見的治療相關不良事件（Angevin, 2017；Calvo, 2017）。
靶向EGFR和cMET的雙特異性抗體也已被開發出來，並正在臨床研究作為單一療法和與第三代EGFR TKI組合治療晚期NSCLC患者（ClinicalTrials.gov：NCT02609776）。
雙特異性抗體的性質允許微調每個靶標之間的相互作用以影響分子的總體性質，這可以產生具有可接受的治療範圍的ADC（Comer, 2018）。這一概念已經在體外針對EGFR和cMET進行了測試，但研究人員尚未展示與上述EGFR和cMET ADC相比安全性或有效性有所提高的體內概念驗證（Sellmann, 2016）。
因此，需要顯示出功效以及可接受的安全性特徵的用於靶向表現EGFR和cMET的癌症的新治療策略。
諸位發明人認識到，開發一種開發中的以低親和力與EGFR結合（例如，與人EGFR結合，其中解離常數（Kd）等於或高於10 nM）的抗EGFR/cMET抗體分子，可以與已知的EGFR TKI組合使用，作為癌症（例如NSCLC）的有效治療。
如本文所證明的，與包含以較高親和力結合人EGFR的EGFR抗原結合結構域的軛合物相比，包含與藥物軛合的這樣的低親和力EGFR結合結構域的抗EGFR/cMET抗體分子（抗體藥物軛合物（「ADC」））在正常組織中顯示出降低的靶點關聯毒性（on-target toxicity），如皮膚毒性，並且因此證明展現出改善的安全性特徵。
此外，包含這種低親和力EGFR結合結構域的ADC與第三代TKI奧希替尼組合使用被證明可有效治療一系列EGFR突變型癌症模型，包括已經對奧希替尼產生抗性的癌症模型。因此，據信，本文揭露的抗體分子和EGFR TKI的組合可以提供針對EGFR相關癌症的安全和有效的療法，例如在對EGFR TKI產生抗性的患者中。
在一個方面，本文提供了用於在治療人患者的癌症中使用的EGFR TKI，其中將該EGFR TKI與抗EGFR/cMET抗體分子組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.  包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.  具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.  包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.  具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在另一方面，本文提供了用於在治療人患者的癌症中使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中將該抗EGFR/cMET抗體分子與EGFR TKI組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.  包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.  具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.  包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.  具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在另一方面，本文提供了治療人患者的癌症之方法，該方法包括抗EGFR/cMET抗體分子與EGFR TKI組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.  包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.  具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.  包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.  具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在另一方面，本文提供了EGFR/cMET抗體分子和EGFR TKI的藥物組合，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.  包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.  具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.  包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.  具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，分別、順序或同時投與EGFR TKI和抗EGFR/cMET抗體分子。
描述了用於在所要求的組合治療中使用的合適的EGFR TKI的實例。在一些實例中，EGFR TKI係奧希替尼或其藥學上可接受的鹽。
在一些實例中，抗EGFR結合結構域包含具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3。在一些實例中，抗EGFR結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VH區；以及含有與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
在一些實例中，抗cMET結合結構域包含： a.  包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.  具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.  包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.  具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1 ii. 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2 iii.      具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，抗cMET結合結構域包含具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1、具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2、具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3、具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1、具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2、以及具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的LCDR3。在一些實例中，抗cMET結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VH區；以及含有與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
在一些實例中，抗體分子與藥物軛合。藥物可以包括細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴激素、趨化介素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光活性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或它們的組合。在一些實例中，藥物係拓樸異構酶I抑制劑，如本文進一步描述的。
在一些實例中，癌症係非小細胞肺癌（NSCLC）。在一些實例中，非小細胞肺癌係EGFR突變陽性NSCLC。EGFR突變陽性NSCLC包括那些包含活化突變（例如在EGFR基因中的L858R突變和/或外顯子19中之一或多個缺失），以及與EGFR TKI抗性相關的突變（例如在EGFR基因中的外顯子20中的插入）的NSCLC。如本文所證明的，EGFR-cMET軛合物與奧希替尼的組合在一系列EGFR突變型癌症（包括被歸類為奧希替尼抗性的那些）中顯示出功效。
相關申請的交叉引用
本申請根據35 U.S.C. §119(e) 要求於2022年6月27日提交的美國臨時專利申請案號63/367,068的權益，出於所有目的將其藉由援引以其全文併入本文。 對以電子方式提交的序列表的參考
本申請藉由援引併入以文字檔案與本申請一起提交的電腦可讀形式（CRF）的序列表，該序列表名稱為「EGFCM-400-WO-PCT」，創建於2023年6月05日，並且大小為75,711位元組。
現在將參考附圖來討論本揭露之各方面和實例。對於熟悉該項技術者而言，其他方面和揭露內容將是顯而易見的。該文本中提及的所有文件均藉由援引併入本文。 靶標 EGFR
人EGFR（也稱為原癌基因c-ErbB-1、受體酪胺酸-蛋白激酶erbB-1和EC 2.7.10.1）係由UniProt P00533鑒定的蛋白質。由人 EGFR基因（也稱為 ERBB 、 ERBB1和 HER1）編碼的mRNA的選擇性剪接產生四種同種型：同種型1（UniProt：P00533-1，v2（上一次序列更新：1997年11月1日））；同種型2（UniProt：P00533-2，v1），其包含相對於同種型1的取代F404L和L405S，並且其缺乏對應於同種型1的位置406至1210的胺基酸序列；同種型3（UniProt：P00533-3，v1），其包含同種型1的位置628至705處的取代，並且其缺乏對應於同種型1的位置706至1210的胺基酸序列；以及同種型4（UniProt：P00533-4），其包含相對於同種型1的取代C628S，並且其缺乏對應於同種型1的位置629至1210的胺基酸序列。
EGFR的結構和功能在例如Ferguson, Annu Rev Biophys. [生物物理學年度評論] (2008) 37: 353-373中進行了綜述。EGFR係一種跨膜蛋白，係上皮生長因子家族（EGF家族）成員的受體。該受體包含大的胞外區、單跨跨膜結構域、胞內近膜結構域、酪胺酸激酶結構域和C端調節區。EGFR與配體的結合誘導EGFR的C端調節區中的幾個酪胺酸殘基（Y992、Y1045、Y1068、Y1148和Y1173）發生受體二聚化和自磷酸化。
異常的EGFR表現/活性與許多疾病有關，包括神經系統障礙和許多癌症。
在本說明書中，「EGFR」係指來自任何物種的EGFR並且包括來自任何物種的EGFR同種型、片段、變體或同源物。 cMET
人cMET（也稱為c-Met、肝細胞生長因子受體（HGFR）或酪胺酸-蛋白激酶Met）係由UniProt P08581鑒定的蛋白質。由人 MET基因編碼的mRNA的選擇性剪接產生三種同種型：同種型1（UniProt：P08581-1，v4（上一次序列更新：2009年7月7日））；同種型2（UniProt：P08581-2），其中胺基酸序列「STWWKEPLNIVSFLFCFAS」插入在同種型1的位置755處；以及同種型3（UniProt：P08581-3）也稱為可溶性met變體4，其中對應於同種型1的位置755至764的胺基酸序列被「RHVNIALIQR」取代，並且其進一步缺乏對應於同種型1的位置765至1390的胺基酸序列。
cMET的結構在例如Gherardi, 2003中進行了綜述，該文獻藉由援引以其全文併入本文。cMET係由二硫鍵連接的α鏈（50 kDa）和β鏈（145 kDa）組成的異二聚物。cMET包含介導結合肝細胞生長因子（HGF）的N端Sema結構域和胞內激酶結構域。在細胞表面處的配體結合誘導cMET在其胞內結構域上的自磷酸化，該胞內結構域為下游訊息分子提供停泊位點並活化若干訊息級聯。
cMET在上皮細胞表面的正常組織中表現。在許多人類腫瘤和癌症中觀察到cMET過表現，這通常與轉移表現型和不良預後相關。已觀察到高水平cMET表現的癌症的實例包括非小細胞肺癌（NSCLC）、胰臟癌、大腸直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、乳癌和食道-胃癌。在該等癌症中，經常觀察到EGFR和cMET的共表現。 抗體分子
本揭露提供了抗體分子。根據本揭露之抗體分子可以以分離的形式提供，在沒有污染物的意義上，諸如能夠結合其他多肽和/或血清組分的抗體。
術語「抗體分子」描述了無論是天然的或部分或全部合成產生的免疫球蛋白。抗體分子可為人的或人源化的。抗體分子可為單株抗體分子。抗體的實例係免疫球蛋白同種型，例如免疫球蛋白G（IgG），和它們的同種型亞類，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及其片段。
如本文所用，術語「抗體分子」因此包括抗體片段，只要它們顯示與相關靶分子的結合。抗體片段的實例包括Fv、scFv、Fab、scFab、F(ab') 2、Fab 2、雙抗體、三抗體、scFv-Fc、微型抗體和單結構域抗體（例如VhH）等）。除非上下文另有要求，否則如本文所用，術語「抗體分子」因此等同於「抗體分子或其片段」。
抗體分子及其構建和使用方法係本領域熟知的，並且在例如Holliger & Hudson, Nature Biotechnology [自然生物技術] 23(9):1126-1136 (2005)中描述。可以採用單株和其他抗體分子並使用重組DNA技術來產生保留原始抗體的特異性的其他抗體或嵌合分子。此類技術可以涉及將一種抗體分子的CDR或可變區引入不同的抗體分子中（EP-A-184187、GB 2188638 A和EP-A-239400）。
鑒於當今與單株抗體技術相關的技術，可以製備針對大多數抗原的抗體分子。抗原結合結構域可為抗體的一部分（例如Fab片段）或合成的抗體片段（例如單鏈Fv片段（ScFv））。針對所選抗原的合適的單株抗體可以藉由已知技術製備，例如「Monoclonal Antibodies: A manual of techniques」[單株抗體：技術手冊], H Zola (CRC Press [CRC出版社], 1988) 中和「Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications」[單株融合瘤抗體：技術與應用], J G R Hurrell (CRC Press [CRC出版社], 1982) 中揭露的那些。Neuberger, 1988討論了嵌合抗體。
根據本揭露之抗體分子包含抗原結合結構域（本文也稱為「結合結構域」）。「抗原結合結構域」或「結合結構域」描述了結合靶抗原的全部或部分的分子的部分。當抗原較大時，抗體可以僅結合至抗原的特定部分，該部分稱為表位。抗體抗原結合位點可以由一或多個抗體可變結構域提供。抗體抗原結合位點視需要包含可變輕鏈（VL）區和可變重鏈（VH）區。抗原結合結構域的VH區和VL區一起構成Fv區。
抗原結合結構域通常包含六個互補決定區（CDR）；三個在VH區：HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及三個在VL區：LCDR1、LCDR2和LCDR3。這六個CDR一起定義了抗原結合結構域的互補位，該互補位係結合靶抗原的抗原結合結構域的一部分。
VH區和VL區包含每個CDR任一側的框架區（FR），其為CDR提供支架。從N末端到C末端，VH區包含以下結構：N末端-[HFR1]-[HCDR1]-[HFR2]-[HCDR2]-[HFR3]-[HCDR3]-[HFR4]-C末端；VL區包含以下結構：N末端-[LFR1]-[LCDR1]-[LFR2]-[LCDR2]-[LFR3]-[LCDR3]-[LFR4]-C末端。
有幾種不同的慣例用於定義抗體CDR和FR，諸如Kabat, 1991、Chothia, 1987中描述的那些；如LeFranc, 2015中描述的IMGT編號；以及如Retter, 2005中描述的VBASE2。本文描述的抗體分子的VH區和VL區的CDR和FR根據Kabat（Kabat, 1991）定義。
包含至少兩個抗原結合結構域（其中每個抗原結合結構域能夠結合不同的靶標）的抗體分子可被稱為「雙特異性抗體分子」。相比之下，僅結合單個靶標（例如EGFR或cMET）的抗體分子被稱為「單特異性抗體分子」。本揭露關於包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域的雙特異性抗體分子。 抗 EGFR 結合結構域
結合EGFR（抗EGFR結合結構域）的結合結構域通常包含能夠結合EGFR的抗體分子的CDR。在一些實例中，結合EGFR的結合結構域另外包含能夠結合EGFR的抗體分子的FR。也就是說，在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含能夠結合EGFR的抗體分子的VH區和VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含係或源自本文所述之EGFR結合抗體殖株（即抗EGFR抗體殖株RAA22或QD6）的VH/VL區的VH區和VL區。在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含係或源自RAA22的VH/VL區的VH區和VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含抗EGFR抗體殖株RAA22或QD6、視需要RAA22的三個HCDR或三個LCDR，視需要三個VH CDR和三個VL CDR。本文描述了抗體RAA22和QD6的VH和VL結構域序列，因此可以從所述序列確定所述抗體的三個VH和三個VL結構域CDR。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (1) 或 (2) 的VH區： (1) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代，或 (2) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 具有SEQ ID NO: 7的胺基酸序列的HCDR2 具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (1) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (1) 或 (2) 的VH區，其中該VH區另外包含根據下文 (3) 的FR： (3) 具有SEQ ID NO: 8的胺基酸序列的HFR1 具有SEQ ID NO: 9的胺基酸序列的HFR2 具有SEQ ID NO: 10的胺基酸序列的HFR3 具有SEQ ID NO: 11的胺基酸序列的HFR4， 或其變體，其中HFR1、HFR2、HFR3或HFR4中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含VH區，該VH區包含根據上文 (1) 或 (2) 的CDR和根據上文 (3) 的FR。 在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (4) 或 (5) 的VH區： (4) 包含根據 (1) 的CDR和根據 (3) 的FR的VH區， (5) 包含根據 (2) 的CDR和根據 (3) 的FR的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (4) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (6) 或 (7) 的VH區： (6) 包含與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH區。 (7) 包含與SEQ ID NO: 18的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (6) 的VH區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (8) 或 (9) 的VL區： (8) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。 (9) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 具有SEQ ID NO: 66的胺基酸序列的LCDR2 具有SEQ ID NO: 67的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (8) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (8) 或 (9) 的VL區，其中該VL區另外包含根據下文 (10) 的FR： (10) 具有SEQ ID NO: 12的胺基酸序列的LFR1 具有SEQ ID NO: 13的胺基酸序列的LFR2 具有SEQ ID NO: 14的胺基酸序列的LFR3 具有SEQ ID NO: 15的胺基酸序列的LFR4， 或其變體，其中LFR1、LFR2、LFR3或LFR4中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含VL區，該VH區包含根據上文 (8) 或 (9) 的CDR和根據上文 (10) 的FR。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (11) 或 (12) 的VL區： (11) 包含根據 (8) 的CDR和根據 (10) 的FR的VL區。 (12) 包含根據 (9) 的CDR和根據 (10) 的FR的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (11) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據下文 (13) 或 (14) 的VL區： (13) 包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL區。 (14) 包含與SEQ ID NO: 22的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (13) 的VL區。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域包含根據上文 (1) 至 (7) 中任一項的VH區和根據上文 (8) 至 (14) 中任一項的VL區。在一些實例中，結合結構域包含根據 (1)、(4) 和 (6) 中任一項的VH區和根據 (8)、(11) 和 (13) 中任一項的VL區。在其他實例中，結合結構域包含根據 (2)、(5) 和 (7) 中任一項的VH區和根據 (9)、(12) 和 (14) 中任一項的VL區。 抗 cMET 結合結構域
結合cMET（抗cMET結合結構域）的結合結構域通常包含能夠結合cMET的抗體分子的CDR。在一些實例中，結合cMET的結合結構域另外包含能夠結合cMET的抗體分子的FR。也就是說，在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含能夠結合cMET的抗體分子的VH區和VL區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含係或源自本文所述之cMET結合抗體殖株（即抗cMET抗體殖株B09-GL）的VH/VL區的VH區和VL區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含cMET結合抗體殖株B09-GL的三個HCDR或三個LCDR，視需要三個VH CDR和三個VL CDR。本文描述了抗體B09-GL的VH和VL結構域序列，因此可以從所述序列確定所述抗體的三個VH和三個VL結構域CDR。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (15) 的VH區： (15) 包含以下CDR的VH區： 具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1 具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2 具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據上文 (15) 的VH區，其中該VH區另外包含根據下文 (16) 的FR： (16) 具有SEQ ID NO: 30的胺基酸序列的HFR1 具有SEQ ID NO: 31的胺基酸序列的HFR2 具有SEQ ID NO: 32的胺基酸序列的HFR3 具有SEQ ID NO: 33的胺基酸序列的HFR4， 或其變體，其中HFR1、HFR2、HFR3或HFR4中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (17) 的VH區： (17) 包含根據 (15) 的CDR和根據 (16) 的FR的VH區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (18) 的VH區： (18) 包含與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VH區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (19) 的VL區： (19) 包含以下CDR的VL區： 具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1 具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2 具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據上文 (19) 的VL區，其中該VL區另外包含根據下文 (20) 的FR： (20) 具有SEQ ID NO: 34的胺基酸序列的LFR1 具有SEQ ID NO: 35的胺基酸序列的LFR2 具有SEQ ID NO: 36的胺基酸序列的LFR3 具有SEQ ID NO: 37的胺基酸序列的LFR4， 或其變體，其中LFR1、LFR2、LFR3或LFR4中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (21) 的VL區： (21) 包含根據 (19) 的CDR和根據 (20) 的FR的VL區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據下文 (22) 的VL區： (22) 包含與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域包含根據上文 (15) 至 (18) 中任一項的VH區和根據上文 (19) 至 (22) 中任一項的VL區。 CDR 取代
在根據本揭露之實例中，一或多種胺基酸（例如一種、兩種或三種）被另一種胺基酸取代。
基於共同的側鏈特性可以將天然存在的殘基分類： 1) 非極性，脂族：甘胺酸（G）、甲硫胺酸（M）、丙胺酸（A）、纈胺酸（V）、白胺酸（L）、異白胺酸（I）； 2) 極性，不帶電荷：半胱胺酸（C）、絲胺酸（S）、蘇胺酸（T）、天冬醯胺（N）、麩醯胺（Q）、脯胺酸（P）； 3) 酸性（帶負電）：天冬胺酸（D）、麩胺酸（E）； 4) 鹼性（正電荷）：組胺酸（H）、離胺酸（K）、精胺酸（R）； 5) 芳香族：色胺酸（W）、酪胺酸（Y）、苯丙胺酸（F）。
胺基酸取代可為保守胺基酸取代。保守胺基酸取代可以涉及該等類別之一的一個成員與同一類別的另一成員的交換。例如，保守胺基酸取代可為酸性胺基酸麩胺酸（E）取代酸性胺基酸天冬胺酸（D）。
在一些實例中，一或多個取代可為功能上保守的。也就是說，在一些實例中，與等效的未取代的抗原結合結構域相比，取代可以不影響（或可以基本上不影響）包含取代的抗原結合結構域的一或多種功能性質（例如結合親和力）。 恒定區
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含免疫球蛋白重鏈恒定（CH）區。在一些實例中，CH係或源自IgG（例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgA（例如IgA1、IgA2）、IgD、IgE或IgM的重鏈恒定區序列。
在一些實例中，CH區係人免疫球蛋白G1恒定區（IGHG1；UniProt：P01857-1，v1；SEQ ID NO: 42）或其片段。
在一些實例中，CH區包含與SEQ ID NO: 42、43、44、45、46、63或64的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。在一些實例中，CH區包含與SEQ ID NO: 63或64的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實例中，抗體分子包含重鏈，該重鏈包含如本文所述之VH區和如本文所述之CH區或由它們組成。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含免疫球蛋白輕鏈恒定（CL）區或其片段。在一些實例中，CL區係或源自SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48中列出的κ CL區。在一些實例中，CL區係或源自SEQ ID NO: 49或SEQ ID NO: 65中列出的λ CL區。在一些實例中，抗體分子包含：係或源自SEQ ID NO: 47或48中列出的κ CL區的第一CL區；以及係或源自SEQ ID NO: 49或65中列出的λ CL區的第二CL區。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含： 第一重鏈，其中該第一重鏈包含該抗EGFR結合結構域的該VH區，以及第一重鏈恒定（CH）區或其片段； 第一輕鏈，其中該第一輕鏈包含該抗EGFR結合結構域的該VL區，以及第一輕鏈恒定（CL）區或其片段； 第二重鏈，其中該第二重鏈包含該抗cMET結合結構域的該VH區，以及第二重鏈恒定（CH）區或其片段；以及 第二輕鏈，其中該第二輕鏈包含該抗cMET結合結構域的該VL區，以及第二輕鏈恒定（CL）區或其片段。
第一CH區和第二CH區可以相同或不同。換句話說，第一CH區和第二CH區可以形成同二聚物或異二聚物。例如，不對稱雙特異性抗體分子具有不同的第一CH區和第二CH區，如下文更詳細地描述的。第一CL區和第二CL區可以相同或不同。在一些實例中，第一CL區係或源自SEQ ID NO: 47或48中列出的κ CL區；以及係或源自SEQ ID NO: 49或65中列出的λ CL區的第二CL區。
應當理解，當抗體分子包含第一VH區和第一CH區時，該等區一起形成抗體分子的第一重鏈，即第一VH區和第一CH區彼此連接。類似地，第二VH區和第二CH區形成抗體分子的第二重鏈；第一VL區和第一CL區形成抗體分子的第一輕鏈；並且第二VL區和第二CL區形成抗體分子的第二輕鏈。
在一些實例中，抗體分子包含具有與SEQ ID NO: 50中列出的B-09-GL重鏈、SEQ ID NO: 53中列出的QD6重鏈、SEQ ID NO: 56中列出的RAA22重鏈、SEQ ID NO: 59中列出的重鏈或SEQ ID NO: 60中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的重鏈。
在一些實例中，抗體分子包含第一重鏈和第二重鏈，其中 (i) 第一重鏈包含與SEQ ID NO: 56中列出的B-09-GL重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；以及 (ii)       第二重鏈包含與SEQ ID NO: 50中列出的RAA22重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實例中，抗體分子包含第一重鏈和第二重鏈，其中 (i) 第一重鏈包含與SEQ ID NO: 59中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；以及 (ii)       第二重鏈包含與SEQ ID NO: 60中列出的重鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含輕鏈，該輕鏈包含如本文所述之VL區和如本文所述之CL區或由它們組成。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含具有與SEQ ID NO: 52中列出的B-09-GL輕鏈、SEQ ID NO: 55中列出的QD6輕鏈、SEQ ID NO: 58中列出的RAA22輕鏈、SEQ ID NO: 61中列出的輕鏈或SEQ ID NO: 62中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列的輕鏈。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含第一輕鏈和第二輕鏈，其中 (i) 第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 58中列出的RAA22輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；以及 (ii)       第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 52中列出的B-09-GL輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
在一些實例中，本文所述之抗體分子包含第一輕鏈和第二輕鏈，其中 (i) 第一輕鏈包含與SEQ ID NO: 61中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；以及 (ii)       第二輕鏈包含與SEQ ID NO: 62中列出的輕鏈的胺基酸序列具有至少70%序列同一性，例如至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
本文所述之抗體分子的CH、CL、重鏈和/或輕鏈可包含一或多個修飾，例如消除或降低Fc效應子功能，促進異二聚物抗體分子的形成，增加同源重鏈和輕鏈配對的功效，和/或協助軛合物形成，如下文更詳細地描述的。已經修飾的CH、CL、重鏈和輕鏈可分別稱為經修飾的CH、CL、重鏈和輕鏈。
抗體分子可在重鏈的CH區中包含突變以減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體諸如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII和/或與補體的結合。這種突變消除或降低Fc效應子功能。用於減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體和補體的結合的突變係已知的，並且包括例如Organesyan, 2008中描述的L234F/L235E/P331S的「三重突變」或「TM」。已知調節抗體效應子功能的其他突變在例如Wang, 2018中進行了描述。
因此，在一些實例中，第一重鏈和/或第二重鏈包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號根據EU索引。例如，第一重鏈和第二重鏈中之一條或兩條都可包含具有與SEQ ID NO: 42中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%序列同一性的胺基酸序列的CH區，並且包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號按照EU索引。如實例（例如實例12）中所證明的，重鏈中包含TM被證明改善了示例性抗體分子和ADC的藥物動力學性質。
包含三重突變的CH區的實例係SEQ ID NO: 63和64。因此，在一些實例中，第一重鏈和第二重鏈中之一條包含具有與SEQ ID NO: 63中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列的CH區，而另一條重鏈包含具有與SEQ ID NO: 64中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列的CH區，其中CH區中之一或兩個（較佳的是兩個）包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中編號按照EU索引。
包含含有三重突變的CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 59和60。因此，在一些實例中，第一重鏈和第二重鏈中之一條具有與SEQ ID NO: 59中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列，而另一條重鏈具有與SEQ ID NO: 60中列出的序列具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%序列同一性的胺基酸序列，其中重鏈中之一條或兩條包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中編號按照EU索引。
抗體分子的VL區和CL區以及VH區和CH1區一起構成Fab區。抗體分子的其餘部分構成Fc區。
除非另有說明，否則恒定結構域中的胺基酸殘基位置（包括如本文所述之胺基酸序列、取代、缺失和插入的位置）根據EU編號（Edelman, 2007）進行編號。 雙特異性形式
雙特異性抗體分子可以任何合適的形式提供。本文所述之雙特異性抗體分子的合適形式及其產生方法在Kontermann, MAbs 2012, 4(2):182-197以及Kontermann和Brinkmann 2015, 20(7): 838-847中進行了描述，這兩篇文獻均藉由援引以其全文併入本文。具體參見Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19的圖2。
也可以藉由化學軛合由現有抗體產生雙特異性抗體分子。例如，可以使用同源或異源雙功能偶合試劑偶合（例如，如Graziano和Guptill, Methods Mol Biol. [分子生物學方法] 2004; 283:71-85中所述）偶合兩個IgG分子或兩個Fab'片段。
在一些實例中，雙特異性抗體分子可為免疫球蛋白G樣（IgG樣）雙特異性抗體分子。IgG樣雙特異性抗體分子可包含對一種抗原特異的Fv區、Fab區或sVD，對另一種抗原特異的Fv/Fab/sVD，以及Fc區。IgG樣雙特異性抗體分子可為對稱的或不對稱的。在一個實例中，雙特異性抗體分子係不對稱的。
對稱IgG樣雙特異性抗體分子通常含有與IgG分子的重鏈或輕鏈的N端或C端融合的例如以scFv片段或可變單結構域的形式的抗原結合結構域。該等對稱IgG樣雙特異性抗體分子的特有性質係它們含有兩條相同的重鏈。此外，對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個表位通常是二價的。如本文所用的價係指抗體分子中能夠結合單個表位的抗原結合區的數量。單株單特異性IgG抗體分子對於單個表位係二價的—其含有兩個抗原結合結構域，每個結構域能夠結合單個靶分子上的表位。對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個表位係二價的—其通常含有四個抗原結合結構域，其中兩個能夠結合靶分子上的第一表位，並且其中兩個能夠結合靶分子上的第二表位。
對稱IgG樣雙特異性抗體分子的實例包括DVD-IgG、IgG-scFv、scFv-IgG、scFv 4-Ig、IgG-scFab、scFab-IgG、IgG-sVD、sVD-IgG、2合1-IgG、mAb 2、tandemab共同LC。該等可以藉由本領域已知的方法形成，例如化學交聯、體細胞雜交或氧化還原方法。
相比之下，不對稱IgG樣雙特異性抗體分子對於每個靶標通常是一價的。如例如Klein 2012中所述，一價雙特異性IgG的概念被認為具有獨特的治療優勢，因為它們 (i) 不會引起受體同二聚化，(ii) 由於對每種抗原的親合力喪失而潛在地具有對非靶組織降低的毒性，並且 (iii) 當兩種抗原都被選擇性地限制或在靶細胞上大量表現時具有更好的選擇性。因此，在一些實例中，抗體分子係不對稱IgG樣雙特異性抗體分子。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子涉及兩條不同重鏈的異二聚化和同源輕鏈與重鏈的正確配對。重鏈的異二聚化可以藉由幾種技術來解決，諸如杵臼結構（knobs-into-holes）、CH3的靜電轉向、CH3鏈交換的工程化結構域和白胺酸拉鍊。可以藉由使用該等重鏈異二聚化技術中之一種連同使用共同的輕鏈、CH1與CL之間的結構域交叉、重鏈和輕鏈與連接子的偶合、來自兩個單獨的單株的重鏈-輕鏈二聚物的體外組裝、整個Fab結構域的介面工程化或CH1/CL介面的二硫化物工程化來確保輕鏈與重鏈的正確配對。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子的實例包括DuetMab、kih IgG、kih IgG共同LC、CrossMab、kih IgG-scFab、mAb-Fv、電荷對和SEED體。
在一些實例中，抗體分子在CH1、CH2和CH3結構域中之一者或多者中包含一或多個促進異二聚物抗體分子的形成的修飾。例如，上述DuetMab抗體分子可另外包含一或多個CH1、CH2和CH3結構域中之一或多個修飾，其促進異二聚物抗體分子的形成。這可能涉及Ridgway 1996中描述的基於CH3結構域中促進重鏈異二聚化的單個胺基酸取代的杵臼結構（KiH）策略。杵變體重鏈CH3的小胺基酸已被較大胺基酸替換，而臼變體的大胺基酸已被較小胺基酸替換。也可引入另外的修飾以穩定重鏈之間的締合。
增強異二聚化的CH3修飾包括例如一條重鏈上的Y407V/T366S/L368A和另一條重鏈上的T366W；以及一條重鏈上的S354C/T366W和另一條重鏈上的Y349C/Y407V/T366S/L368A，其中恒定區的編號按照EU索引。
增強異二聚化的CH3修飾的其他實例在例如Brinkmann和Kontermann, 2017 MABS 9(2), 182-212的表1中進行了描述，該文獻藉由援引具體併入本文。
在一些實例中，抗體分子包含形成異二聚物的第一重鏈和第二重鏈，其中第一重鏈和第二重鏈中之一條包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基，並且另一條重鏈包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A），其中恒定區的編號按照EU索引。例如，第一重鏈和第二重鏈中之一條可具有SEQ ID NO: 42中列出的序列，並且進一步包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基，並且另一條重鏈具有SEQ ID NO: 42中列出的序列，並且進一步包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A），其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，抗體分子包含： (i) 包含第一經修飾的CH3區的第一重鏈，其中該第一經修飾的CH3區包含位置354處的半胱胺酸（C）殘基和位置366處的色胺酸（W）殘基；以及 (ii)       包含第二經修飾的CH3區的第二重鏈，其中該第二經修飾的CH3區包含位置349處的半胱胺酸（C）殘基、位置407處的纈胺酸（V）殘基、位置366處的絲胺酸（S）和位置368處的丙胺酸（A）， 其中恒定區的編號按照EU索引。
不對稱IgG樣雙特異性抗體分子的具體例示形式稱為「DuetMab」。DuetMab抗體分子使用KIH技術用於2個不同重鏈的異二聚化，並藉由用工程化的二硫鍵替換CH1-CL介面之一中的天然二硫鍵來增加同源重鏈和輕鏈配對的效力。與DuetMab相關的揭露內容可以在例如美國專利案號9,527,927和Mazor 2015中找到，這兩篇參考文獻藉由援引以其全文併入本文。
在一些實例中，抗體分子包含： (a) 經修飾的CH區，其中經修飾的重鏈包含天然非半胱胺酸胺基酸到半胱胺酸胺基酸的取代；以及 (b) 經修飾的相應CL區，其中該經修飾的CL包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代， 其中： (i) 該第一重鏈包含該經修飾的CH區並且該第一輕鏈包含該經修飾的相應CL區；或 (ii)       該第二重鏈包含該經修飾的CH區並且該第二輕鏈包含該經修飾的相應CL區。
在一些實例中，由天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代產生的經修飾的CH區的取代的半胱胺酸和由天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代產生的經修飾的相應CL區的取代的半胱胺酸可以形成二硫鍵。
在一些實例中，經修飾的CH區包含位置126處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代；並且經修飾的相應CL區包含位置121處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸的取代，其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，經修飾的CH區包含位置126處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代和位置219處的天然半胱胺酸胺基酸至非半胱胺酸胺基酸（例如至纈胺酸）的取代；並且經修飾的相應CL區包含位置121處的天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸的取代和位置214處的天然半胱胺酸胺基酸至非半胱胺酸胺基酸（例如至纈胺酸）的取代，其中恒定區的編號按照EU索引。
在一些實例中，抗體分子包含第二CH區和第二相應輕鏈，其中第二CH區和第二相應CL不包含天然非半胱胺酸胺基酸至半胱胺酸胺基酸的取代並且不包含天然半胱胺酸至非半胱胺酸胺基酸的取代。 軛合物
抗體分子可以與藥物軛合。在這種情況下，抗體分子可稱為「軛合物」或「抗體藥物軛合物」。這樣的軛合物可用於治療和/或診斷如本文所述之疾病。如本文所用，藥物可稱為「有效載荷」或「彈頭」。
在一些實例中，藥物包括細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴激素、趨化介素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光活性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或它們的組合。
細胞毒素係一種能夠誘導被靶向的細胞死亡的化合物。通常，在抗體藥物軛合物的情況下，細胞毒素被遞送至抗體分子所靶向的細胞，在那裡它被釋放到細胞中並誘導細胞死亡。細胞毒素在抗體藥物軛合物中之用途在例如Chalouni和Doll 2018 J Exp Clin Cancer Res. [實驗與臨床癌症研究雜誌] 37(1):20中進行了描述。在一些實例中，細胞毒素係微管溶素、澳瑞他汀、美登木素生物鹼、拓樸異構酶抑制劑或吡咯并苯并二氮呯（PBD）。
在特定實例中，細胞毒素係或包含微管溶素。微管溶素係一類抑制細胞生長的四肽，其含有異白胺酸和三種其他複雜的非天然胺基酸Mep（R-N-mepipecolicacid）、Tuv（tubuvaline）和Tut（tubulyrosine）或Tup（tubuphenylalanine）。微管溶素係極其有效的細胞毒性分子，並且有效對抗多重耐藥細胞系（Domling, 2005）。該等化合物以低皮莫耳範圍內的IC50值顯示出針對一組癌細胞系測試的高細胞毒性；因此，它們作為抗癌治療劑係有意義的。參見例如WO 2012019123。微管溶素軛合物揭露於例如美國專利案號7,776,814中。在一些實例中，微管溶素係具有以下化學結構的微管溶素A：
在一些實例中，微管溶素係微管溶素1508，也稱為「AZ1508」並且在WO 2015157594中進行了更詳細的描述。微管溶素1508具有以下化學結構：
在一些實例中，細胞毒素係或包含拓樸異構酶抑制劑。如本文所用的術語「拓樸異構酶抑制劑」係指抑制一或多種拓樸異構酶（拓樸異構酶I和II）的活性的細胞毒性劑，該等酶係藉由調節DNA超螺旋在DNA複製和轉錄中發揮重要作用的酶。因此，預期包含拓樸異構酶抑制劑作為細胞毒素的抗體藥物軛合物干擾涉及DNA的正常過程，因此導致細胞死亡。已經證明含有拓樸異構酶抑制劑的軛合物在臨床試驗中對多種含有腫瘤的細胞系有效以及具有抗癌活性。參見例如Ogitani, 2016a；Ogitani, 2016b；Cardillo, 2015；和Bardia, 2017。
在一些實例中，抗體分子與拓樸異構酶I抑制劑軛合。拓樸異構酶I抑制劑的代表性實例包括但不限於喜樹鹼及其類似物拓樸替康、伊立替康、貝洛替康、依沙替康、勒托替康和西諾替康。拓樸異構酶II抑制劑的代表性實例包括但不限於安吖啶、道諾黴素、多柔比星、表鬼臼毒素、玫瑰樹鹼、表柔比星、依托泊苷、雷佐生和替尼泊苷。
喜樹鹼化學結構的實例如下： 。
合適的拓樸異構酶I抑制劑的一般實例由以下化合物表示： 所述化合物表示為A*。
在一些實例中，化合物（例如A*）具有用於連接至本文所述之抗體分子（其可稱為「配體單元」或替代地「細胞結合劑」（CBA））的連接子。合適地，連接子以可切割的方式連接（例如軛合）至胺基殘基，例如本文所述之抗體分子的胺基酸。
用於軛合物的連接子的設計和選擇係本領域已知的，並且在例如Beck, 2017中進行了描述。本文使用的連接子可為 Beck, 2017中描述的任何連接子。
更特別地，合適的拓樸異構酶I抑制劑的實例由具有式「I」的以下化合物： 及其鹽和溶劑合物表示，其中R L係用於連接至本文所述之抗體分子的連接子，其中所述連接子視需要地選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X係： ， 其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）並且至少c1或c2 = 0（即c1和c2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如配體單元或細胞結合劑）的連接子；或 (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；並且 e係0或1。
在式 中，上標 C(=O)和 NH表示原子所結合的基團。例如，NH基團顯示與羰基（其不是所示部分的一部分）結合，並且羰基顯示與NH基團（其不是所示部分的一部分）結合。
熟悉該項技術者將理解，多於一種所述藥劑（例如拓樸異構酶I抑制劑）可以軛合至抗體分子。
例如，本揭露之軛合物（例如抗體-藥物軛合物）可以具有通式IV： L - (D L) p (IV)或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中L係本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA），D L係具有連接子的藥物（例如藥物連接子單元），並且p係1至20的整數。
在一些實例中，D L係具有式III的連接子的拓樸異構酶I抑制劑： 。
R LL係連接至本文所述之抗體分子（例如配體單元）的連接子，其中該連接子視需要地選自 (ia')： ， 其中Q和X如以上所定義並且G LL係連接至本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）的連接子；並且 (ib')： ， 其中R L1和R L2如以上所定義。
載藥量由p表示，即每個抗體分子（例如配體單元）的拓樸異構酶I抑制劑（例如藥物單元）的數量。載藥量可以在1至20個藥物單元（D）/配體單元的範圍內。對於組成物，p表示組成物中軛合物的平均載藥量，並且p的範圍為1至20。在一些實例中，當藥物係拓樸異構酶抑制劑時，p範圍選自2至8，視需要4至8，例如5至7，或5.5至6.5。如實例中所述，產生平均DAR為 6 +/- 6%的包含拓樸異構酶I抑制劑SG3932的ADC。
因此，本揭露包括這樣的軛合物，該軛合物包含與至少一種拓樸異構酶I抑制劑（例如藥物單元，諸如上文所示的A*）共價連接的本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）。所述抑制劑視需要藉由連接子（例如連接子單元）例如上文描述為R L和/或R LL的連接子連接至抗體分子。換句話說，本揭露包括本文所述之抗體分子（例如配體單元或CBA）與一或多種拓樸異構酶I抑制劑連接，視需要經由連接子（例如藥物-連接子單元）。上文更全面描述的抗體分子（代表配體單元或CBA）係結合靶部分的靶向劑。更具體地，該抗體分子可以例如特異性結合靶細胞上的EGFR和cMET，從而將藥物單元遞送至靶細胞。因此，本揭露還提供了用ADC治療例如各種癌症和其他障礙（例如與表現EGFR和cMET的細胞、例如癌細胞的存在相關的癌症/障礙）的方法。下文更詳細地描述該等方法。 Q X
在一個實例中，Q係胺基酸殘基。胺基酸可為天然胺基酸或非天然胺基酸。例如，Q可以選自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg、和Trp，其中Cit係瓜胺酸。
在一個實例中，Q包含二肽殘基。二肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，二肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，二肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，二肽係組織蛋白酶的識別位點。
在一個實例中，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O、 NH-Phe-Cit- C=O、 NH-Leu-Cit- C=O、 NH-Ile-Cit- C=O、 NH-Phe-Arg- C=O、 NH-Trp-Cit- C=O、和 NH-Gly-Val- C=O； 其中Cit係瓜胺酸。
在一個實例中，Q選自： NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Ala- C=O、 NH-Val-Lys- C=O、 NH-Ala-Lys- C=O、和 NH-Val-Cit- C=O。
在一個實例中，Q選自 NH-Phe-Lys- C=O、 NH-Val-Cit- C=O或 NH-Val-Ala- C=O。
其他合適的二肽組合包括： NH-Gly-Gly- C=O、 NH-Gly-Val- C=O NH-Pro-Pro- C=O、和 NH-Val-Glu- C=O。
可以使用其他二肽組合，包括由Dubowchik等人, Bioconjugate Chemistry[生物軛合化學], 2002, 13,855-869描述的那些，將其藉由援引併入本文。
在一些實例中，Q係三肽殘基。三肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，三肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，三肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，三肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的三肽連接子係： NH-Glu-Val-Ala- C=O NH-Glu-Val-Cit- C=O NH-αGlu-Val-Ala- C=O NH-αGlu-Val-Cit- C=O
在一些實例中，Q係四肽殘基。四肽中的胺基酸可為天然胺基酸和非天然胺基酸的任何組合。在一些實例中，四肽包含天然胺基酸。當連接子係組織蛋白酶不穩定連接子時，四肽係組織蛋白酶介導的切割的作用位點。然後，四肽係組織蛋白酶的識別位點。特別感興趣的四肽連接子係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O；以及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。
在一些實例中，四肽係： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O。
在上述肽殘基的表示中， NH-表示殘基的N末端，並且- C=O表示殘基的C末端。C末端結合至A*的NH。
Glu表示麩胺酸的殘基，即： αGlu表示當經由α鏈結合時的麩胺酸的殘基，即：
在一個實例中，在適當的情況下，胺基酸側鏈被化學保護。側鏈保護基團可為如上所討論的基團。被保護的胺基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc側鏈保護的Lys殘基的二肽序列可被組織蛋白酶切割。
胺基酸側鏈的保護基團係本領域熟知的，並且描述於Novabiochem公司目錄中，並且如上所述。 G L G L可以選自：
(G L1-1) (G L6)
(G L1-2) (G L7)
(G L2) (G L8)
(G L3-1) 其中NO 2基團係視需要的 (G L9)
(G L3-2) 其中NO 2基團係視需要的 (G L10)
(G L3-3) 其中NO 2基團係視需要的 (G L11)
(G L3-4) 其中NO 2基團係視需要的 (G L12)
(G L4) 其中Hal = I、Br、Cl (G L13)
(G L5) (G L14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X'表示C 1-4烷基。
在一些實例中，G L選自G L1-1和G L1-2。在該等實例中之一些中，G L係G L1-1。 G LL G LL可以選自：
(G LL1-1) (G LL8-1)
(G LL1-2) (G LL8-2)
(G LL2) (G LL9-1)
(G LL3-1) (G LL9-2)
(G LL3-2) (G LL10)
(G LL-4) (G LL11)
(G LL5) (G LL12)
(G LL6) (G LL13)
(G LL7) (G LL14)
其中Ar表示C 5-6伸芳基基團，例如伸苯基，並且X'表示C 1-4烷基。CBA表示細胞結合劑或配體單元。
在一些實例中，G LL選自G LL1-1和G LL1-2。在該等實例中之一些中，G LL係G LL1-1。 X
X視需要地是： ，
其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0並且至少c1或c2 = 0。
a可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，a係0至3。在該等實例中之一些中，a係0或1。在其他實例中，a係0。
b1可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b1係0至12。在該等實例中之一些中，b1係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
b2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b2係0至12。在該等實例中之一些中，b2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。在一些實例中，b1和b2中只有一個可以不是0。
c1可為0或1。c2可為0或1。在一些實例中，c1和c2中只有一個可以不是0。
d可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，d係0至3。在該等實例中之一些中，d係1或2。在其他實例中，d係2。在其他實例中，d係5。
在X的一些實例中，a係0，b1係0，c1係1，c2係0並且d係2，並且b2可為0至8。在該等實例中之一些中，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，a係1，b2係0，c1係0，c2係0並且d係0，並且b1可為0至8。在該等實例中之一些中，b1係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，a係0，b1係0，c1係0，c2係0並且d係1，並且b2可為0至8。在該等實例中之一些中，b2係0、2、3、4、5或8。在X的一些實例中，b1係0，b2係0，c1係0，c2係0並且a和d中之一個係0。a和d中的另一個係1至5。在該等實例中之一些中，a和d中的另一個係1。在該等實例中的其他實例中，a和d中的另一個係5。在X的一些實例中，a係1，b2係0，c1係0，c2係1，d係2，並且b1可為0至8。在該等實例中之一些中，b2係0、2、3、4、5或8。
在一些實例中，R L具有式Ib。在一些實例中，R LL具有式Ib'。
R L1和R L2可以獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團。
在一些實例中，R L1和R L2均是H。在一些實例中，R L1係H並且R L2係甲基。在一些實例中，R L1和R L2均是甲基。
在一些實例中，R L1和R L2與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯基團。在一些實例中，R L1和R L2與它們所鍵合的碳原子一起形成環丁烯基。
在基團Ib中，在一些實例中，e係0。在其他實例中，e係1並且硝基基團可以在環的任何可用位置。在該等實例中之一些中，它處於鄰位。在該等實例的其他實例中，它處於對位。
在其中以單一鏡像異構物或以鏡像異構物增濃的形式提供本文所述之化合物的一些實例中，鏡像異構物增濃形式具有大於60 : 40、70 : 30、80 : 20或90 : 10的鏡像異構物比率。在其他實例中，鏡像異構物比率大於95 : 5、97 : 3或99 : 1。
在一些實例中，R L選自：
(i)
(ii)
(iii)
(iv)
(v)
(vi)
(vii)
(viii)
(ix)
在一些實例中，R LL係衍生自上述R L基團的基團。
在一些實例中，式 I化合物具有式 I P ： ； 及其鹽和溶劑合物，其中R LP係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段的連接子，其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q P係： ，其中Q XP使得Q P為胺基酸殘基、二肽殘基或三肽殘基； X P係： ， 其中aP = 0至5，bP = 0至16，cP = 0或1，dP = 0至5； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子； (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；並且 e係0或1。
aP可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，aP係0至3。在該等實例中之一些中，aP係0或1。在其他實例中，aP係0。
bP可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b係0至12。在該等實例中之一些中，bP係0至8，並且可為0、2、4或8。
cP可為0或1。
dP可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，dP係0至3。在該等實例中之一些中，dP係1或2。在其他實例中，dP係2。
在X P的一些實例中，aP係0，cP係1並且dP係2，並且bP可為0至8。在該等實例中之一些中，bP係0、4或8。
上述對於具有式 I的化合物的Q X的實例可以適用於Q XP（例如，在適當的情況下）。
上述對於具有式 I的化合物的G L、R L1、R L2和e的實例可以適用於具有式 I P 的化合物。
在一些實例中，式 IV的軛合物具有式 IV P ： L - (D LP) p( IV P ) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中L係本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元），D LP係拓樸異構酶I抑制劑（例如，藥物連接子單元）並且具有式III P： ； R LLP係連接至該抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子，其中所述連接子選自 (ia')： ， 其中Q P和X P如以上所定義，並且G LL係連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子；並且 (ib')： ， 其中R L1和R L2如以上所定義；並且 p係1至20的整數。
在一些實例中，式 I化合物具有式 I P2 ： ； 及其鹽和溶劑合物，其中R LP2係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段的連接子，其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X P2係： ， 其中aP2 = 0至5，b1P2 = 0至16，b2P2 = 0至16，cP2 = 0或1，dP2 = 0至5，其中至少b1P2或b2P2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接至本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子； (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所鍵合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；並且 e係0或1。
aP2可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，aP2係0至3。在該等實例中之一些中，aP2係0或1。在其他實例中，aP2係0。
b1P2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b1P2係0至12。在該等實例中之一些中，b1P2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
b2P2可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實例中，b2P2係0至12。在該等實例中之一些中，b2P2係0至8，並且可為0、2、3、4、5或8。
在一些實例中，b1P2和b2P2中只有一個可以不是0。
cP2可為0或1。
dP2可為0、1、2、3、4或5。在一些實例中，dP2係0至3。在該等實例中之一些中，dP2係1或2。在其他實例中，dP2係2。在其他實例中，dP2係5。
在X P2的一些實例中，aP2係0，b1P2係0，cP2係1並且dP2係2，並且b2P2可為0至8。在該等實例中之一些中，b2P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，aP2係1，b2P2係0，cP2係0並且dP2係0，並且b1P2可為0至8。在該等實例中之一些中，b1P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，aP2係0，b1P2係0，cP2係0並且dP2係1，並且b2P2可為0至8。在該等實例中之一些中，b2P2係0、2、3、4、5或8。在X P2的一些實例中，b1P2係0，b2P2係0，cP2係0並且aP2和dP2中之一個係0。aP2和d中的另一個係1至5。在該等實例中之一些中，aP2和d中的另一個係1。在該等實例中的其他實例中，aP2和dP2中的另一個係5。
上述對於具有式 I的化合物的Q X的實例可以適用於式Ia P2中的Q X（例如，在適當的情況下）。
上述對於具有式 I的化合物的G L、R L1、R L2和e的實例可以適用於具有式 I P2 的化合物。
在一些實例中，式 IV的軛合物具有式 IV P2 ： L - (D LP2) p( IV P2 ) 或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物，其中L係本文所述之抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元），D LP2係拓樸異構酶I抑制劑（例如，藥物連接子單元）並且具有式III P2： ； R LLP2係連接至該抗體或其抗原結合片段（例如，配體單元）的連接子，其中所述連接子選自 (ia')： ， 其中Q和X P2如以上所定義，並且G LL係連接至該抗體或其抗原結合片段的連接子；並且 (ib')： ， 其中R L1和R L2如以上所定義；並且 p係1至20的整數。
特別合適的拓樸異構酶I抑制劑包括具有以下式的那些： （SG3932）； （SG4010）； （SG4057）； （SG4052）；和/或 。
在一些實例中，本文所述之抗體分子軛合至具有下式的拓樸異構酶I抑制劑（例如SG3932）： （SG3932）。
為了避免疑問，數字「8」指定，方括號內的結構重複八次。因此，SG3932的另一種表示係： 。
SG4010的另一種表示係： 。
SG4057的另一種表示係： 。
SG4052的另一種表示係： 。
本文所述之任何抗體或其抗原結合片段可以軛合至所述拓樸異構酶I抑制劑中之一或多種。 拓樸異構酶 I 抑制劑的合成
為了完成，現在將描述用於製備一或多種示例性拓樸異構酶I抑制劑的某些通用合成路線。
具有式I的化合物（其中R L具有式Ia）可以從具有式2的化合物： ； （其中R L*係-QH）藉由連接具有式3的化合物： ， 或其活化版本來合成。
這樣的反應可以在醯胺偶合條件下進行。
具有式2的化合物可以藉由具有式4的化合物： ； （其中R L*prot係-Q-Prot N，其中Prot N係胺保護基團）的去保護合成。
具有式4的化合物可以藉由具有式5的化合物： ； 與化合物A3的偶合，使用弗裡德蘭德反應（Friedlander reaction）合成。
具有式5的化合物可以從具有式6的化合物： ； 藉由除去三氟乙醯胺保護基團來合成。
具有式6的化合物可以藉由以下偶合合成：R L*prot-OH至化合物I7。
具有式I的化合物（其中R L具有式Ia或Ib）可以從化合物I11藉由化合物R L-OH或其活化形式的偶合來合成。
胺保護基團： 胺保護基團係熟悉該項技術者熟知的。特別參考以下文獻中的合適的保護基團的揭露：Greene's Protecting Groups in Organic Synthesis [有機合成中的格林氏保護基團], 第四版, John Wiley & Sons [約翰威利父子公司], 2007 (ISBN 978-0-471-69754-1), 第696-871頁。
載藥量（p）係每個抗體分子的藥物（例如微管溶素或拓樸異構酶抑制劑）的平均數量。在本揭露之組成物中，載藥量的範圍為每個抗體分子1至20種藥物（D）。例如，載藥量的範圍可以為每個抗體分子1至10種藥物（D），即其中1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種藥物共價連接至抗體分子。軛合物的組成包括與1至10種藥物軛合的抗體分子的集合。在本揭露之化合物結合至離胺酸的情況下，載藥量的範圍可以為每個抗體分子1至80種藥物（D），但是上限可能較佳的是40、20、10或8。軛合物的組成包括與1至80、1至40、1至20、1至10或1至8種藥物軛合的抗體分子的集合。
來自軛合反應的軛合物製劑中每個抗體的藥物的平均數量可以藉由常規方法諸如UV、逆相HPLC、HIC、質譜、ELISA分析和電泳表徵。還可以確定軛合物在p方面的定量分佈。藉由ELISA，可以確定特定軛合物製劑中p的平均值（Hamblett, 2004；Sanderson, 2005）。然而，藉由ELISA的抗體-抗原結合和檢測限制不能辨別p（藥物）值的分佈。另外，用於檢測軛合物的ELISA分析不能確定藥物部分附接至抗體分子的位置，諸如重鏈或輕鏈片段，或特定胺基酸殘基。在一些實例中，均質軛合物（其中p係來自具有其他載藥量的軛合物的確定值）的分離、純化和表徵可以藉由例如逆相HPLC或電泳來實現。此類技術也適用於其他類型的軛合物。
對於一些軛合物，p可能受到抗體分子上附接位點數量的限制。例如，抗體分子可以僅具有一個或幾個半胱胺酸硫醇基團，或者可以僅具有一個或幾個足夠反應性的硫醇基團，可以藉由該基團附接連接子。
通常，在軛合反應期間，與抗體分子軛合的藥物少於理論最大值。抗體分子可以含有例如許多不與連接子（L）反應的離胺酸殘基。僅最具反應性的離胺酸基團可與胺反應性連接子試劑反應。而且，僅最具反應性的半胱胺酸硫醇基團可以與硫醇反應性連接子試劑反應。通常，抗體分子不含有許多（如果有的話）可與藥物部分連接的游離和反應性半胱胺酸硫醇基團。軛合物的抗體分子中的大多數半胱胺酸硫醇殘基以雙硫鍵形式存在，必須在部分或全部還原條件下用還原劑（如二硫蘇糖醇（DTT）或TCEP）還原。軛合物的負載（藥物/抗體比）可以藉由幾種不同的方式進行控制，包括：(i) 限制相對於抗體的莫耳過量的藥物連接子，(ii) 限制軛合反應時間或溫度，以及 (iii) 半胱胺酸硫醇修飾的部分或限制性還原條件。
某些抗體分子具有可還原的鏈間雙硫鍵，即半胱胺酸橋。藉由用還原劑例如DTT（二硫蘇糖醇）處理，可使抗體分子具有響應性以與連接子試劑進行軛合。因此，每個半胱胺酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核體。該過程也被稱為「經典軛合」，並且差異於諸如在已被工程化到抗體分子中的特定位點的半胱胺酸處發生軛合的方法。藉由離胺酸與2-亞胺基硫烷（尤特奇試劑（Traut's reagent））反應，可以將另外的親核基團引入抗體，從而導致胺轉化為硫醇。
藉由經典軛合，藉由部分還原抗體，然後用所希望的連接子-藥物反應來製備具有隨機軛合至天然半胱胺酸殘基的藥物的ADC。例如，可以藉由在pH 8.0添加約3莫耳當量的DTT，隨後在約37°C下孵育約2小時，將濃度為5 mg/mL的抗體部分還原。然後可以將還原反應在冰中冷卻，並例如藉由滲濾除去過量的DTT。然後可以以約1 : 10的連接子-藥物/硫醇莫耳比添加連接子-藥物。軛合反應可以在約10% v/v DMSO的存在下進行。軛合後，可以添加過量游離的半胱胺酸（超過連接子-藥物約2倍莫耳比）以淬滅未反應的連接子-藥物以產生半胱胺酸-連接子-藥物加合物。然後可以將反應混合物進行純化（例如，藉由疏水相互作用層析法），並將緩衝液更換為PBS。可以使用標準方法（諸如疏水相互作用層析法和還原逆相層析法）確定載藥量分佈，如別處所述。
使用藉由涉及 N-烷基順丁烯二醯亞胺的抗體分子鏈間雙硫鍵的還原產生的溶劑可及硫醇的直接軛合來製備軛合物的方法係已知的。其他方法使用 N-羥基琥珀醯亞胺酯在離胺酸的一級胺處軛合藥物。這樣的方法在例如Gébleux和Casi, Pharmacol Ther (2016) 167: 48-59中進行了綜述，其藉由援引以其全文併入本文。
單獨地或除了上述經典軛合方法之外，還可以使用位點特異性軛合，即其中載藥量和軛合位點受到控制的方法。這可以藉由例如在特定殘基處工程化半胱胺酸、用生物正交反應性或酶連接方法用非天然胺基酸替換殘基來實現。位點特異性軛合的一種方法在Dimasi, 2017中進行了描述，該文獻藉由援引以其全文併入本文，並且涉及將半胱胺酸插入抗體分子的特定位置。
半胱胺酸胺基酸可在抗體分子中的反應性位點處被工程化，並且不形成鏈內或分子間二硫鍵（Junutula, 2008；Dornan, 2009；US 7521541；US 7723485；WO 2009/052249）。工程化半胱胺酸硫醇可以與具有硫醇反應性親電基團諸如順丁烯二醯亞胺或α-鹵代醯胺的本文所述之連接子或藥物-連接子反應以與半胱胺酸工程化抗體分子和藥物形成軛合物。因此可以設計、控制和知道藥物的位置。由於工程化半胱胺酸硫醇基團通常以高產率與硫醇反應性連接子試劑或藥物連接子試劑反應，因此可以控制載藥量。藉由在重鏈或輕鏈上的單個位點進行取代，對IgG抗體進行工程化以引入半胱胺酸胺基酸，在對稱抗體上給出兩個新的半胱胺酸。如果需要，可以達到接近2的載藥量，其中軛合產物接近均質性。
在一些實例中，本揭露之軛合物的抗體分子包含CH區並且藥物在插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸處化學軛合，其中恒定區的編號按照EU索引。因此，抗體分子與藥物之間的連接可以藉由該插入的半胱胺酸胺基酸和連接子上的末端順丁烯二醯亞胺基團。
包含插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸的CH區的實例係SEQ ID NO: 43和SEQ ID NO: 45。包含CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 50、53和56，該CH區包含插入在CH區的位置239與240之間的半胱胺酸胺基酸。
在其他實例中，軛合物的抗體分子不包含插入到CH區中之任何胺基酸殘基。在特定實例中，軛合物的抗體分子不包含插入到CH區中的半胱胺酸胺基酸（例如在位置239與240之間，其中恒定區的編號按照EU索引）。如實例（例如實例12）中所證明的，在使用經典軛合將藥物-連接子軛合至天然半胱胺酸的情況下，插入的半胱胺酸不是必需的。
不包含插入到CH區中之任何胺基酸殘基的CH區的實例係SEQ ID NO: 44、46、63和64。包含不包含插入到CH區中之任何胺基酸殘基的CH區的重鏈的實例係SEQ ID NO: 51、54、57、59和60。
當抗體分子的一個以上親核或親電基團與藥物-連接子中間體或連接子試劑反應，然後與藥物試劑反應時，則所得產物係軛合化合物的混合物，其中附接在抗體上的藥物分佈為例如1、2、3等。液相層析法（如聚合逆相（PLRP）和疏水相互作用（HIC））可以藉由藥物負載值來分離混合物中的化合物。可以分離具有單個藥物負載值（p）的軛合物的製劑，但是，該等單個負載值軛合物仍可能是異質混合物，因為藥物可以經由連接子附接到抗體分子上的不同位點。
因此，本揭露之軛合物組成物包括抗體-藥物軛合物化合物的混合物，其中抗體具有一或多個藥物部分（例如微管溶素或拓樸異構酶抑制劑）並且其中藥物部分可以在各種胺基酸殘基處連接至抗體分子。
在一些實例中，每個抗體分子的微管溶素藥物部分的平均數量在1至8的範圍內。在一些實例中，範圍選自1至6、1至4、1至3，視需要地1至2、1.5至2、1.8至2，例如1.9至2。
如上文已經描述，在一些實例中，ADC的抗體分子可以在重鏈的CH區中包含一或多個突變以減少或消除抗體分子與一或多種Fcγ受體的結合。因此，本文所述之ADC的第一重鏈和/或第二重鏈可以包含位置234處的苯丙胺酸（F）、位置235處的麩胺酸（E）和位置331處的絲胺酸（S），其中編號按照EU索引。 抗體分子和軛合物的功能性質
本文所述之抗體分子和軛合物可以藉由參考某些功能性質來表徵。 結合親和力
本文所述之抗體分子和軛合物的特徵可以在於結合對EGFR具有特定親和力的EGFR的抗原結合結構域和/或結合對c-Met具有特定親和力的c-Met的抗原結合結構域。抗體分子與同源抗原（例如人、小鼠或石蟹獼猴EGFR或c-Met）的結合親和力可以藉由表面電漿共振（SPR），例如使用Biacore來確定。可以使用抗體分子確定結合親和力，例如作為包含結合EGFR的第一抗原結合結構域和結合c-Met的第二抗原結合結構域的雙特異性抗體分子的一部分。替代性地，可以使用對EGFR或c-Met具有單特異性的抗體分子確定結合親和力。在一些實例中，使用如實例2.1中所述之BIACore確定結合親和力。
結合親和力通常藉由Kd（抗原結合結構域與其抗原之間的平衡解離常數）測量。眾所周知，Kd值越低，抗原結合結構域的結合親和力越高。例如，以10 nM的Kd結合靶標的抗原結合結構域將被認為以高於以100 nM的Kd結合相同靶標的抗原結合結構域的親和力結合所述靶標。
提及人EGFR可以指包含EGFR胞外結構域的多肽，諸如具有SEQ ID NO: 68中列出的胺基酸序列的多肽。提及小鼠EGFR可以指由可從義翹神州（SinoBiological）獲得的目錄號51091-M08H的分子產生的多肽。提及石蟹獼猴EGFR可以指SEQ ID NO: 69中列出的胺基酸序列。提及人c-Met可以指具有SEQ ID NO: 70中列出的胺基酸序列的多肽。提及小鼠c-Met可以指具有SEQ ID NO: 90中列出的胺基酸序列的多肽或指由可從義翹神州獲得的目錄號50622-M08H的分子產生的多肽。提及石蟹獼猴c-Met可以指SEQ ID NO: 71中列出的胺基酸序列。 EGFR 親和力
本文所述之抗體分子和軛合物可以包含以低親和力結合EGFR的結合結構域。已知EGFR在正常組織例如皮膚中以低水平表現。預期以低親和力結合EGFR的抗體分子和軛合物有利地在正常組織中顯示出降低的靶點關聯毒性，同時仍能夠靶向表現高水平EGFR的腫瘤，從而改善了安全性特徵。此外，如本文所證明的，與包含較高親和力EGFR結合結構域的軛合物相比，包含該低親和力EGFR結合結構域的軛合物在治療癌症方面更有效。
結合EGFR的結合結構域可以以具有等於或高於10 nM、15 nM、20 nM、25 nM、30 nM、35 nM或40 nM的Kd的親和力結合人EGFR。替代性地，結合EGFR的結合結構域可以以在10與100 nM之間、在20與100 nM之間、在30與100 nM之間、在40與100 nM之間、在10與80 nM之間、在20與80 nM之間、在30與80 nM之間、在40與80 nM之間、在10與70 nM之間、在20與70 nM之間、在30與70 nM之間、在40與70 nM之間、在10與60 nM之間、在20與60 nM之間、在30與60 nM之間、在40與60 nM之間、在10與50 nM之間、在20與50 nM之間、在30與50 nM之間、或40與50 nM之間的Kd結合人EGFR。
結合EGFR的結合結構域可以結合人EGFR，其親和力低於包含在SEQ ID NO: 53和55中分別列出的抗體分子QD6的重鏈序列和輕鏈序列的結合結構域的親和力。
例如，結合EGFR的結合結構域可以結合人EGFR，其親和力的Kd比包含在SEQ ID NO: 53和55中分別列出的抗體分子QD6的重鏈序列和輕鏈序列的結合結構域結合人EGFR的Kd至少高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍或7倍。替代性地，結合EGFR的結合結構域可以結合人EGFR，其親和力的Kd比包含在SEQ ID NO: 53和55中分別列出的抗體QD6的重鏈序列和輕鏈序列的結合結構域結合人EGFR的Kd高2與10倍之間、高3與10倍之間、高4與10倍之間、高5與10倍之間、高6與10倍之間、高7與10倍之間、高2與9倍之間、高3與9倍之間、高4與9倍之間、高5與9倍之間、高6與9倍之間、高7與9倍之間、高2與8倍之間、高3與8倍之間、高4與8倍之間、高5與8倍之間、高6與8倍之間、高7與8倍之間。
結合EGFR的結合結構域可以結合人EGFR，其親和力類似於包含在SEQ ID NO: 16和20中分別列出的抗體分子RAA22的可變重區序列和可變輕區序列的結合結構域結合人EGFR的親和力。例如，結合EGFR的結合結構域可以結合人EGFR，其親和力的Kd比包含在SEQ ID NO: 16和20中分別列出的抗體分子RAA22的可變重區序列和可變輕區序列的結合結構域結合人EGFR的Kd差異小於5倍、差異小於4倍、差異小於3倍、差異小於2倍、差異小於1倍或差異小於0.5倍。
結合EGFR的結合結構域也可以結合石蟹獼猴EGFR。例如，結合EGFR的結合結構域可以以具有小於700 nM、小於600 nM、小於500 nM、小於400 nM、小於300 nM、或小於250 nM的Kd的親和力結合石蟹獼猴EGFR。替代性地，結合EGFR的抗原結合結構域可以以Kd在100和700 nM之間、在100和600 nM之間、在100和500 nM之間、在100和400 nM之間、在100和300 nM之間、在150和250 nM之間、在100和200 nM之間的親和力結合石蟹獼猴EGFR。結合EGFR的抗原結合結構域可以結合石蟹獼猴EGFR，其Kd比結合結構域結合人EGFR的Kd小於或等於10、9、8、7、6、5、4、3倍高。
結合EGFR的結合結構域也可以結合小鼠EGFR。例如，結合EGFR的結合結構域可以以具有小於1 µM、小於900 nM、小於800 nM、小於700 nM、小於600 nM、或小於650 nM的Kd的親和力結合小鼠EGFR。替代性地，結合EGFR的結合結構域可以以在100 nM與1 µM之間、在200與900 nM之間、在300與800 nM之間、在400與700 nM之間、在400與600 nM之間、或在450與550 nM之間的Kd結合小鼠EGFR。
在一些實例中，結合EGFR的結合結構域能夠結合人EGFR和石蟹獼猴EGFR。這種交叉反應性係有利的，因為它允許在臨床前開發期間在石蟹獼猴中進行抗體分子和軛合物的劑量和安全性測試。在一些實例中，結合EGFR的結合結構域能夠結合人EGFR、石蟹獼猴EGFR和小鼠EGFR。例如，結合EGFR的結合結構域可以能夠以上文所述之Kd值（例如人EGFR的Kd在10與100 nM之間，石蟹獼猴EGFR的Kd在100與700 nM之間以及小鼠EGFR的Kd在100 nM與1 µM之間）結合人EGFR、石蟹獼猴EGFR和小鼠EGFR。 cMET 親和力
結合cMET的結合結構域可以以具有低於20 nM、15 nM、12 nM、11 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM或2.5 nM的Kd的親和力結合人cMET。替代性地，結合cMET的抗原結合結構域可以以具有在1與20 nM之間、在1與15 nM之間、在1與10 nM之間、在1與9 nM之間、在1與8 nM之間、在1與7 nM之間、在1與6 nM之間、在1與5 nM之間、在1與4 nM之間、在1與3 nM之間、在1與2.5 nM、或2與2.5 nM之間的Kd的親和力結合人c-Met。
結合cMET的結合結構域可以結合石蟹獼猴cMET。例如，結合cMET的結合結構域可以以具有低於30 nM、25 nM、20 nM、15 nM、10 nM、9 nM、8 nM、7 nM、6 nM、5 nM、4 nM、3 nM、或2.5 nM的Kd的親和力結合石蟹獼猴cMET。替代性地，結合cMET的結合結構域可以以具有在1與20 nM之間、在1與15 nM之間、在1與10 nM之間、在1與9 nM之間、在1與8 nM之間、在1與7 nM之間、在1與6 nM之間、在1與5 nM之間、在1與4 nM之間、在1與3 nM之間、在1與2.5 nM、或2與2.5 nM之間的Kd的親和力結合石蟹獼猴cMET。結合cMET的結合結構域可以結合石蟹獼猴cMET，其親和力的Kd比抗原結合結構域結合人c-Met的Kd小於或等於10、9、8、7、6、5、4、3、2、1倍高。
在一些實例中，結合cMET的結合結構域能夠結合人cMET和石蟹獼猴cMET。這種交叉反應性係有利的，因為它允許在臨床前開發期間在石蟹獼猴中進行抗體分子的劑量和安全性測試。例如，結合cMET的結合結構域可以能夠以上文所述之Kd值（例如人cMET的Kd在1與20 nM之間以及石蟹獼猴cMET的Kd在1與20 nM之間）結合人cMET和石蟹獼猴cMET。 特異性結合
本文所述之結合結構域可以特異性結合其各自靶標（即，EGFR和cMET）。術語「特異性」可指抗原結合結構域將不會表現出與其特異性結合配偶體（此處為EGFR或cMET）以外的分子的任何顯著結合的情況。此類分子被稱為「非靶分子」。術語「特異性」也適用於抗體分子對特定表位具有特異性的情況，該等特定表位諸如由許多抗原攜帶的在EGFR或cMET上的表位，在這種情況下抗體分子將能夠結合攜帶該表位的各種抗原。
在一些實例中，如果與非靶分子的結合程度小於結合分子與靶標的結合的約10%，如例如藉由ELISA、SPR、生物膜干涉技術（BLI）、微量熱泳法（MST）或藉由放射性免疫分析法法（RIA）所測量，則認為抗體分子未表現出與非靶分子的任何顯著結合。替代性地，結合特異性可根據結合親和力反映，其中本文所述之抗體分子以比對另一種非靶分子的親和力大至少0.1個數量級的親和力結合EGFR和/或c-Met。在一些實例中，本揭露之抗體分子以比對另一種非靶分子的親和力大至少0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、或2.0個數量級的親和力結合EGFR和/或cMET。
EGFR係受體的ErbB家族的成員，該ErbB家族係四種密切相關的受體酪胺酸激酶的亞家族：EGFR、HER2、HER3和HER4。RAA22抗原結合結構域不顯示與HER2、HER3和HER4結合，表明該抗原結合結構域特異性結合EGFR。因此，在特定的實例中，結合EGFR的抗原結合結構域不與HER2、HER3或HER4結合，或者沒有顯示出對HER2、HER3或HER4的任何顯著的結合。
cMET係受體酪胺酸激酶亞家族的成員，包括Ron和Sema 4a。B09-GL抗原結合結構域不與Ron和Sema 4a結合，表明該抗原結合結構域特異性結合cMET。因此，在特定的實例中，結合cMET的結合結構域不與Ron、Sema 4a結合，或者沒有顯示出對Ron、Sema 4a的任何顯著的結合。 同時接合
本文所述之抗體分子和軛合物的特徵在於兩個結合結構域能夠同時接合其各自的EGFR和cMET靶標。具有同時接合EGFR和cMET的抗體分子和軛合物預期是有利的，因為已知許多腫瘤同時表現EGFR和c-Met兩者，並且因此可以被本揭露之抗體分子靶向。因此，在一些實例中，抗體分子能夠同時接合EGFR和cMET。
例如，可以藉由體外細胞毒性測定來確定同時接合，該測定使用表現大致等量的EGFR和cMET的細胞系以及包含具有EGFR和cMET抗原結合結構域的抗體分子的軛合物。如果軛合物中的單個抗原結合結構域獨立地起遞送藥物的作用，則預期阻斷該細胞系中之任一靶標將僅適度地降低軛合物的活性，使IC50移動2倍或更少，因為靶標以相似的水平存在。在該測定中可以藉由使用例如單特異性抗體分子阻斷EGFR和cMET靶標，該單特異性抗體分子在EGFR或cMET上結合同一區域，但缺乏能夠誘導細胞毒性的藥物。例如，單特異性抗體分子可以含有與測試的軛合物相同的結合EGFR的抗原結合結構域，或相同的結合c-Met的抗原結合結構域。另一方面，如果軛合物需要同時接合以有效地將軛合物遞送到細胞中，則阻斷任一靶標將可能對軛合物的活性具有更大的影響。也就是說，如果在使用該測定時阻斷任一靶標後IC50移動至少2倍、至少5倍或至少10倍，則認為抗體分子能夠同時接合兩個靶標。
確定同時接合的另外的方法係在體外細胞毒性測定中比較雙特異性EGFR-cMET軛合物與一價單特異性對照軛合物的活性。對照軛合物包含一個針對EGFR或c-Met的抗原結合結構域和一個非結合同種型抗體對照抗原結合結構域。如果雙特異性軛合物中之每個抗原結合結構域獨立地起作用，則預期結果將是每個單特異性對照軛合物將僅適度地比雙特異性軛合物效力低，並且差異將是相加的。替代性地，如果雙特異性軛合物的兩個抗原結合結構域藉由同時結合而協同作用，則預期雙特異性軛合物的活性與單特異性對照抗體相比有較大差異。也就是說，如果雙特異性軛合物導致IC50的變化大於使用單特異性對照軛合物觀察到的IC50變化的總和，則認為抗體分子能夠同時接合兩個靶標。
該等測量同時接合的方法的更多詳細資訊可以在實例中找到。 抗體內化
本文所述之抗體分子和軛合物可藉由它們介導有效內化的能力來表徵。這對於軛合物特別有用，因為它確保軛合物內化到細胞中並遞送到溶酶體，在溶酶體中抗體分子隨後被降解並且藥物釋放到細胞中，在細胞中它發揮其細胞作用，例如細胞毒性。
可以藉由將活細胞與抗體分子接觸且在足夠用於內化的時間段後檢測抗體分子來分析抗體分子的內化。內化可以藉由檢測抗體分子的定位來確定。如果抗體分子留在細胞表面（例如在細胞表面檢測到，和/或未在細胞內檢測到），則確定抗體分子未被內化。如果在細胞內檢測到抗體分子（例如定位於細胞質或細胞器中），則確定抗體分子已被內化。
顯現抗體分子是否能夠介導有效內化的示例性方法涉及用pH敏感性染料標記抗體分子，該等染料在酸性pH下表現出螢光，並將該等標記的抗體分子添加到細胞中。可藉由監測螢光來檢測細胞內化。如果在一定時間段（例如48小時）內，觀察到的螢光大於標記的非結合對照抗體分子的螢光，則認為抗體分子能夠介導內化並遞送到溶酶體。這種顯現抗體內化的方法的更多詳細資訊可以在實例中找到。
與EGFR或cMET單特異性對照相比，本文所述之抗體分子的特徵在於它們能夠介導更有效的內化。預期表現出這種性質的抗體分子和軛合物係有利的，因為預期它們對共表現兩種靶標的腫瘤細胞表現出更大的選擇性，並且可以使抗體分子在不表現出顯著水平的共表現的正常組織中的影響最小化。 體外活性
本文所述之抗體分子的特徵可以在於它們的細胞毒性活性，即，它們能夠殺傷細胞。細胞毒性活性可以使用體外細胞活力測定諸如CellTiter-Glo ®（Promega）測定來測量。在一些實例中，細胞係表現EGFR和cMET兩者的細胞。
抗體分子的效力可以表示為IC50值。IC50係抗體分子的半數抑制濃度。在功能測定中，IC50係將生物響應降低其最大值的50%的濃度。IC50可以藉由本領域已知的任何數目的手段來計算。
在一些實例中，本文所述之具有細胞毒性活性的抗體分子當使用體外細胞活力測定測量時具有小於4000 pM、小於3500 pM、小於3000 pM、小於2500 pM、小於2000 pM、小於1500 pM、小於1000 pM、小於500 pM、小於400 pM、小於300 pM、小於250 pM、小於200 pM、小於150 pM、或小於100 pM的IC50。在一些實例中，本文所述之抗體分子可以具有在60與500 pM之間的IC50。
在一些實例中，與表現低水平的EGFR和cMET中之一個或另一個的細胞相比，本文所述之抗體分子能夠增加表現顯著量的EGFR和cMET兩者的細胞（例如腫瘤細胞）的殺傷。表現顯著量的EGFR和cMET兩者的細胞可以藉由測量在細胞表面上的相對受體密度來確定。例如，在細胞表面以大於15,000的相對受體密度可以表現EGFR和cMET的細胞可以被認為是表現顯著量的EGFR和cMET兩者的細胞，以及在細胞表面以15,000或更低的低相對受體密度表現EGFR和c-Met之一的細胞。可以例如使用Quantum MESF定量FACS測定套組（kit）測量相對EGFR和cMET密度，如實例中所述。
表現顯著量的EGFR和cMET兩者的細胞的實例可以包括NCI H596、HCC 827 GR Pool、A549、NCI H1792、NCI H1975、NCI H292和NCI H358 細胞系。以低相對受體密度表現EGFR和cMET之一的細胞的實例可以包括A427、NCI H23和NCI H661（Ag陰性）細胞系。該等細胞系可藉由ATCC獲得。 EGFR 酪胺酸激酶抑制劑
EGFR TKI可以表徵為第一代、第二代或第三代EGFR TKI，如下所述。
第一代EGFR TKI係帶有活化突變的EGFR的可逆抑制劑，其不會顯著抑制帶有T790M突變的EGFR。第一代TKI的實例包括吉非替尼和厄洛替尼。
第二代EGFR TKI係帶有活化突變的EGFR的不可逆抑制劑，其不會顯著抑制帶有T790M突變的EGFR。第二代TKI的實例包括阿法替尼和達克替尼。
第三代EGFR TKI係帶有活化突變的EGFR的抑制劑，其也顯著抑制帶有T790M突變的EGFR，而不顯著抑制野生型EGFR。第三代TKI的實例包括具有式 (V) 的化合物、奧希替尼、AZD3759（佐利替尼（zorifertinib））、拉澤替尼（lazertinib）、納紮替尼（nazartinib）（EGF816）、CO1686（羅西替尼（rociletinib））、HM61713、ASP8273（那屈替尼（naquotinib））、PF-06747775（馬韋爾替尼（mavelertinib））、阿維替尼（avitinib）（艾維替尼（abivertinib））、艾氟替尼（alflutinib）（AST2818）和CX-101（奧拉夫替尼（olafertinib）；RX-518）、阿美替尼（almonertinib）（HS-10296；阿美替尼（aumolertinib））和BPI-7711（瑞芙利替尼（rezivertinib））。
在一方面，EGFR TKI係第一代EGFR TKI。在另外的實例中，第一代EGFR TKI選自由以下組成之群組：吉非替尼或其藥學上可接受的鹽、埃克替尼或其藥學上可接受的鹽、和厄洛替尼或其藥學上可接受的鹽。
在一方面，EGFR TKI係第二代EGFR TKI。在另外的方面，第二代EGFR TKI選自達克替尼或其藥學上可接受的鹽和阿法替尼或其藥學上可接受的鹽。
在一方面，EGFR TKI係第三代EGFR TKI。在另外的方面，第三代EGFR TKI係如下定義的具有式 (V) 的化合物。在另外的方面，第三代EGFR TKI選自由以下組成之群組：奧希替尼或其藥學上可接受的鹽、AZD3759或其藥學上可接受的鹽、拉澤替尼或其藥學上可接受的鹽、艾維替尼或其藥學上可接受的鹽、艾氟替尼或其藥學上可接受的鹽、CX-101或其藥學上可接受的鹽、HS-10296或其藥學上可接受的鹽和BPI-7711或其藥學上可接受的鹽。在另外的方面，第三代EGFR TKI係奧希替尼或其藥學上可接受的鹽。 具有式 (V) 的化合物
在一方面，EGFR TKI係具有式 (V)的化合物： (V)其中： G選自4,5,6,7-四氫吡唑并[1,5- a]吡啶-3-基、吲哚-3-基、吲唑-1-基、3,4-二氫-1H-[1,4]㗁𠯤并[4,3-a]吲哚-10-基、6,7,8,9-四氫吡啶并[1,2-a]吲哚-10-基、5,6-二氫-4H-吡咯并[3,2,1-ij]喹啉-1-基、吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基和吡唑并[1,5- a]吡啶-3-基； R 1 選自氫、氟、氯、甲基和氰基； R 2 選自甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基和甲基； R 3 選自(3 R)-3-(二甲基胺基)吡咯啶-1-基、(3 S)-3-(二甲基-胺基)吡咯啶-1-基、3-(二甲基胺基)四氫吖唉-1-基、[2-(二甲基胺基)乙基]-(甲基)胺基、[2-(甲基胺基)乙基](甲基)胺基、2-(二甲基胺基)乙氧基、2-(甲基胺基)乙氧基、5-甲基-2,5-二氮雜螺[3.4]辛-2-基、(3a R,6a R)-5-甲基六氫-吡咯并[3,4- b]吡咯-1(2 H)-基、1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基、4-甲基哌𠯤-1-基、4-[2-(二甲基胺基)-2-側氧基乙基]哌𠯤-1-基、甲基[2-(4-甲基哌𠯤-1-基)乙基]胺基、甲基[2-(𠰌啉-4-基)乙基]胺基、1-胺基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基和4-[(2 S)-2-胺基丙醯基]哌𠯤-1-基； R 4 選自氫、1-哌啶基甲基和N,N-二甲基胺基甲基； R 5 獨立地選自甲基、乙基、丙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟、氯和環丙基； X 係CH或N；並且 n係0、1或2； 或其藥學上可接受的鹽。
在另外的方面，提供了如以上定義的具有式 (V)的化合物，其中 G選自吲哚-3-基和吲唑-1-基； R 1 選自氫、氟、氯、甲基和氰基； R 2 選自甲氧基和2,2,2-三氟乙氧基； R 3 選自[2-(二甲基胺基)乙基]-(甲基)胺基、[2-(甲基胺基)乙基](甲基)胺基、2-(二甲基胺基)乙氧基和2-(甲基胺基)乙氧基； R 4 係氫； R 5 選自甲基、2,2,2-三氟乙基和環丙基； X 係CH或N；並且 n係0或1；或其藥學上可接受的鹽。
具有式 (V) 的化合物的實例包括描述於WO 2013/014448、WO 2015/175632、WO 2016/054987、WO 2016/015453、WO 2016/094821、WO 2016/070816和WO 2016/173438中的那些。 奧希替尼及其藥物組成物
奧希替尼具有以下化學結構：
已知奧希替尼的游離鹼的化學名為： N-(2-{2-二甲基胺基乙基-甲基胺基}-4-甲氧基-5-{[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)丙-2-烯醯胺。奧希替尼描述於WO 2013/014448中。奧希替尼也被稱為AZD9291。
奧希替尼可以以如下甲磺酸鹽的形式存在： N-(2-{2-二甲基胺基乙基-甲基胺基}-4-甲氧基-5-{[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)丙-2-烯醯胺甲磺酸鹽。甲磺酸奧希替尼也被稱為TAGRISSO TM。
甲磺酸奧希替尼目前被批准為每日一次口服片劑配製物，劑量為80 mg（以游離鹼表示，相當於95.4 mg甲磺酸奧希替尼），用於治療轉移性EGFR T790M突變陽性NSCLC患者。如果需要修改劑量，則可用40 mg每日一次口服片劑配製物（以游離鹼表示，相當於47.7 mg甲磺酸奧希替尼）。片芯包含藥物稀釋劑（如甘露醇和微晶纖維素）、崩散劑（如低取代的羥丙織維素）和潤滑劑（如硬脂醯反丁烯二酸鈉）。片劑配製物描述於WO 2015/101791中。
因此，在一方面，奧希替尼或其藥學上可接受的鹽呈甲磺酸鹽的形式，即 N-(2-{2-二甲基胺基乙基-甲基胺基}-4-甲氧基-5-{[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}苯基)丙-2-烯醯胺甲磺酸鹽。
在一方面，奧希替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的方面，甲磺酸奧希替尼每日一次投與。
在一方面，奧希替尼的總日劑量為約80 mg。在另外的方面，甲磺酸奧希替尼的總日劑量為約95.4 mg。
在一方面，奧希替尼的總日劑量為約40 mg。在另外的方面，甲磺酸奧希替尼的總日劑量為約47.7 mg。
在一方面，奧希替尼或其藥學上可接受的鹽呈片劑形式。
在一方面，以包含一或多種藥學上可接受的賦形劑（例如稀釋劑或載劑）的藥物組成物的形式投與奧希替尼或其藥學上可接受的鹽。在另外的方面，該組成物包含一或多種藥物稀釋劑（如甘露醇和微晶纖維素）、一或多種藥物崩散劑（如低取代的羥丙織維素）或一或多種藥物潤滑劑（如硬脂醯反丁烯二酸鈉）。
在一方面，該組成物呈片劑的形式，其中片芯包含：(a) 從2至70份的奧希替尼或其藥學上可接受的鹽；(b) 從5至96份的兩種或更多種藥物稀釋劑；(c) 從2至15份的一或多種藥物崩散劑；以及 (d) 從0.5至3份的一或多種藥物潤滑劑；並且其中所有份數均是按重量計，並且份數之和 (a)+(b)+(c)+(d) = 100。
在一方面，該組成物呈片劑的形式，其中片芯包含：(a) 從7至25份的奧希替尼或其藥學上可接受的鹽；(b) 從55至85份的兩種或更多種藥物稀釋劑，其中該等藥物稀釋劑包含微晶纖維素和甘露醇；(c) 從2至8份的藥物崩散劑，其中該藥物崩散劑包含低取代的羥丙織維素；(d) 從1.5至2.5份的藥物潤滑劑，其中該藥物潤滑劑包含硬脂醯反丁烯二酸鈉；並且其中所有份數均是按重量計，並且份數之和 (a)+(b)+(c)+(d) = 100。
在一方面，該組成物呈片劑的形式，其中片芯包含：(a) 約19份的甲磺酸奧希替尼；(b) 約59份的甘露醇；(c) 約15份的微晶纖維素；(d) 約5份的低取代的羥丙織維素；以及 (e) 約2份的硬脂醯反丁烯二酸鈉；並且其中所有份數均是按重量計，並且份數之和 (a)+(b)+(c)+(d)+(e) = 100。 AZD3759 （佐利替尼）
AZD3759具有以下化學結構：
已知AZD3759的游離鹼的化學名為：4-[(3-氯-2-氟苯基)胺基]-7-甲氧基-6-喹唑啉基(2 R)-2,4-二甲基-1-哌𠯤甲酸酯。AZD3759描述於WO 2014/135876中。
在一方面，AZD3759或其藥學上可接受的鹽每日兩次投與。在另外的方面，AZD3759每日兩次投與。
在一方面，AZD3759的總日劑量為約400 mg。在另外的方面，約200 mg的AZD3759每日兩次投與。 拉澤替尼
拉澤替尼具有以下化學結構：
已知拉澤替尼的游離鹼的化學名為 N-{5-[(4-{4-[(二甲基胺基)甲基]-3-苯基-1H-吡唑-1-基}-2-嘧啶基)胺基]-4-甲氧基-2-(4-𠰌啉基)苯基}丙烯醯胺。拉澤替尼描述於WO 2016/060443中。拉澤替尼也被稱為YH25448和GNS-1480。
在一方面，拉澤替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的方面，拉澤替尼每日一次投與。
在一方面，拉澤替尼的總日劑量為約20至320 mg。
在一方面，拉澤替尼的總日劑量為約240 mg。 阿維替尼
阿維替尼具有以下化學結構：
已知阿維替尼的游離鹼的化學名為：N-(3-((2-((3-氟-4-(4-甲基哌𠯤-1-基)苯基)胺基)-7H-吡咯并(2,3-d)嘧啶-4-基)氧基)苯基)丙-2-烯醯胺。阿維替尼揭露於US 2014038940中。阿維替尼也被稱為艾維替尼。
在一方面，阿維替尼或其藥學上可接受的鹽每日兩次投與。在另外的方面，順丁烯二酸阿維替尼每日兩次投與。
在一方面，順丁烯二酸阿維替尼的總日劑量為約600 mg。 艾氟替尼
艾氟替尼具有以下化學結構：
已知艾氟替尼的游離鹼的化學名為：N-{2-{[2-(二甲基胺基)乙基](甲基)胺基}-6-(2,2,2-三氟乙氧基)-5-{[4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基}吡啶-3-基}丙烯醯胺。艾氟替尼揭露於WO 2016/15453中。艾氟替尼也被稱為AST2818。
在一方面，艾氟替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的方面，甲磺酸艾氟替尼每日一次投與。
在一方面，甲磺酸艾氟替尼的總日劑量為約80 mg。
在一方面，甲磺酸艾氟替尼的總日劑量為約40 mg。 阿法替尼
阿法替尼具有以下化學結構：
已知阿法替尼的游離鹼的化學名為： N-[4-(3-氯-4-氟苯胺基)-7-[(3 S)-氧戊環-3-基]氧基喹唑啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺。阿法替尼揭露於WO 02/50043中。阿法替尼也被稱為吉泰瑞（Gilotrif）。
在一方面，阿法替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的方面，二順丁烯二酸阿法替尼每日一次投與。
在一方面，二順丁烯二酸阿法替尼的總日劑量為約40 mg。
在一方面，二順丁烯二酸阿法替尼的總日劑量為約30 mg。 CX-101 （奧拉夫替尼； RX-518 ）
CX-101具有以下化學結構：
已知CX-101的游離鹼的化學名為：N-(3-(2-((2,3-二氟-4-(4-(2-羥乙基)哌𠯤-1-基)苯基)胺基)喹唑啉-8-基)苯基)丙烯醯胺。CX-101揭露於WO 2015/027222中。CX-101也被稱為RX-518。 HS-10296 （阿美替尼（ almonertinib 、 aumolertinib ））
HS-10296（阿美替尼（almonertinib、aumolertinib））具有以下化學結構：
已知HS-10296的游離鹼的化學名為：N-[5-[[4-(1-環丙基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]-2-[2-(二甲基胺基)乙基-甲基-胺基]-4-甲氧基-苯基]丙-2-烯醯胺。HS-10296揭露於WO 2016/054987中。
在一方面，HS-10296的總日劑量為約110 mg。 BPI-7711 （瑞芙利替尼）
BPI-7711具有以下化學結構：
已知BPI-7711的游離鹼的化學名為：N-[2-[2-(二甲基胺基)乙氧基]-4-甲氧基-5-[[4-(1-甲基吲哚-3-基)嘧啶-2-基]胺基]苯基]丙-2-烯醯胺。BPI-7711揭露於WO 2016/94821中。
在一方面，BPI-7711的總日劑量為約180 mg。 達克替尼
達克替尼具有以下化學結構：
已知達克替尼的游離形式的化學名為：(2 E)- N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-甲氧基喹唑啉-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁-2-烯醯胺。達克替尼描述於WO 2005/107758中。達克替尼也被稱為PF-00299804。
達克替尼能以如下達克替尼一水合物的形式存在，即(2E)-N-{4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-甲氧基喹唑啉-6-基}-4-(哌啶-1-基)丁-2-烯醯胺一水合物。
在一方面，達克替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的方面，達克替尼一水合物每日一次投與。
在一方面，達克替尼一水合物的總日劑量為約45 mg。
在一方面，達克替尼或其藥學上可接受的鹽呈片劑形式。
在一方面，以包含一或多種藥學上可接受的賦形劑的藥物組成物的形式投與達克替尼或其藥學上可接受的鹽。在另外的方面，一或多種藥學上可接受的賦形劑包含乳糖一水合物、微晶纖維素、羥乙酸澱粉鈉和硬脂酸鎂。 埃克替尼
埃克替尼具有以下化學結構： 。
已知埃克替尼的游離鹼的化學名為： N-(3-乙炔基苯基)-2,5,8,11-四氧雜-15,17-二氮雜三環[10.8.0.0 14,19]二十碳-1(12),13,15,17,19-五烯-18-胺。埃克替尼揭露於WO 2013064128中。埃克替尼也被稱為凱美納（Conmana）。
在實例中，埃克替尼或其藥學上可接受的鹽每日三次投與。在另外的實例中，鹽酸埃克替尼每日三次投與。
在實例中，鹽酸埃克替尼的總日劑量為約375 mg。 吉非替尼
吉非替尼具有以下化學結構： 。
已知吉非替尼的游離鹼的化學名為：N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-𠰌啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺。吉非替尼揭露於WO 1996/033980中。吉非替尼也被稱為IRESSA TM。
在實例中，吉非替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的實例中，吉非替尼每日一次投與。
在實例中，吉非替尼的總日劑量為約250 mg。 厄洛替尼
厄洛替尼具有以下化學結構： 。
已知厄洛替尼的游離鹼的化學名為：N-(3-乙炔基苯基)-6,7-雙(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺。厄洛替尼揭露於WO 1996/030347中。厄洛替尼也被稱為TARCEVA TM。
在實例中，厄洛替尼或其藥學上可接受的鹽每日一次投與。在另外的實例中，厄洛替尼每日一次投與。
在實例中，厄洛替尼的總日劑量為約150 mg。
在實例中，厄洛替尼的總日劑量為約100 mg。 組合治療
如以上所解釋，EGFR和cMET的共表現與許多癌症類型相關，並且靶向兩種分子的抗體分子、以及尤其包含這樣的抗體分子的軛合物為多種適應症的廣泛臨床益處提供了機會。因此，如本文所述之EGFR TKI和抗體分子的組合預期可用於治療應用，特別是在癌症治療中。
如本文所述之EGFR TKI和/或抗體分子可用於治療人或動物體的方法。本揭露之相關方面提供了： (i) 本文所述之用於在治療癌症之方法中使用的EGFR TKI，其中在該方法中，將該EGFR TKI與本文所述之抗體分子組合投與， (ii) 本文所述之用於在治療癌症之方法中使用的抗體分子，其中在該方法中，將該抗體分子與本文所述之EGFR TKI組合投與， (iii) 本文所述之EGFR TKI在製造用於治療癌症的藥物中之用途，其中在該治療中，將該EGFR TKI與本文所述之抗體分子組合投與； (iv) 本文所述之抗體分子在製造用於治療癌症的藥物中之用途，其中在該治療中，將該抗體分子與本文所述之EGFR TKI組合投與； (v) 治療個體的癌症之方法，其中該方法包括向該個體投與治療有效量的如本文所述之抗體分子與治療有效量的如本文所述之EGFR TKI的組合； (vi) 治療個體的癌症之方法，其中該方法包括向該個體投與第一量的EGFR TKI、和第二量的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一量和該第二量一起構成治療有效量。
本文還提供了本文所述之EGFR/cMET抗體分子和本文所述之EGFR TKI的藥物組合。藥物組合係指包含治療有效量的本文所述之EGFR/cMET抗體分子和治療有效量的本文所述之EGFR TKI以及一或多種藥學上可接受的載劑的組成物，其中每種活性成分旨在組合給予患者。
如本文所用，「組合治療」係指向個體投與i) 本文所述之抗體分子（如本文所述，其可以與藥物軛合）；以及ii) 本文所述之EGFR TKI兩者。
個體可為患者。在一些實例中，患者係人患者。
治療可為其中實現一些期望的治療效果的任何治療或療法，例如，抑制或延遲病症的進展，並且包括降低進展的速率、停止進展的速率、改善病症、治癒或緩解病症（無論是部分的還是全部的）、預防、改善、延遲、減輕或阻止病症的一或多種症狀和/或體征，或延長個體或患者的存活超過在沒有治療的情況下所預期的。 投與
抗體分子、軛合物和EGFR TKI將以藥物組成物的形式投與，該藥物組成物除活性劑之外還可包含至少一種組分。
藥物組成物除抗體分子、軛合物或EGFR TKI之外還可包含藥學上可接受的賦形劑、載劑、緩衝液、穩定劑或熟悉該項技術者熟知的其他材料。如本文所用，術語「藥學上可接受的」涉及化合物、材料、組成物和/或劑型，其在合理的醫學判斷範圍內適用於與受試者（例如，人）的組織接觸而沒有過度毒性、刺激、過敏性因應或其他問題或併發症，與合理的益處/風險比相稱。每種載劑、賦形劑等在與配製物的其他成分相容的意義上也必須是「可接受的」。載劑或其他材料的確切性質將取決於投與途徑，其可以藉由輸注、注射或任何其他合適的途徑，如下所述。
投與可為「治療有效量」，這足以對個體顯示益處。投與的實際量以及投與的速率和時程將取決於所治療的物質的性質和嚴重程度、所治療的特定個體、個體的臨床狀況、障礙的原因、組成物的遞送部位、抗體分子的類型、投與的方法、投與的時間表和醫療從業者已知的其他因素。治療的處方，例如對劑量的決定等，在普通醫生和其他醫生的責任範圍內，並且可以取決於所治療的疾病的症狀嚴重程度和/或進展。適當劑量的EGFR TKI係本領域已知的，其示例性劑量在上文關於EGFR TKI的章節中描述。抗體分子的適當劑量係本領域熟知的（Ledermann, 1991；以及Bagshawe, 1991）。可以使用本文或Physician's Desk Reference [醫師案頭參考] (2003) 中指出的適合於所投與的抗體分子的具體劑量。抗體分子的治療有效量或合適劑量可以藉由比較動物模型中的體外活性和體內活性來確定。將小鼠和其他試驗動物中的有效劑量外推至人的方法係已知的。精確劑量將取決於許多因素，包括待治療區域的大小和位置，以及抗體分子的精確性質。抗體分子可以例如每天、每週一次、每兩週一次或每月一次投與。在一些實例中，EGFR TKI作為第一量投與，並且抗EGFR/cMET抗體分子作為第二量投與，其中第一量和第二量一起構成治療有效量。
EGFR TKI可以與抗體分子的投與同時、順序或分別投與於個體。如果EGFR TKI與抗體分子同時投與，則抗體分子和EGFR TKI可以作為組合製劑投與於個體。
組合治療（即，抗體分子和EGFR TKI）可以與第三治療組合投與，所述第三治療與組合治療同時、順序或分別投與於個體。第三治療可以包含化療、放射療法、另一種（不同的）抗體分子或另一種（不同的）EGFR TKI。 癌症
使用如本文所述之組合治療的待治療的癌症可以選自由以下組成之群組：肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、乳癌、大腸直腸癌、腎癌、胃癌、頭頸癌、卵巢癌或神經膠質母細胞瘤。
癌症可為表現EGFR和cMET兩者的癌症。癌症細胞可以在細胞表面表現EGFR和cMET。在一個實例中，可以已經確定腫瘤共表現EGFR和cMET。用於確定靶標表現的方法係本領域已知的並且包括例如免疫組織化學。
在一些實例中，使用本文所述之組合治療的待治療的癌症選自由以下組成之群組：肺癌（諸如非小細胞肺癌（NSCLC））、胰臟癌、大腸癌、大腸直腸癌和頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN或SQHN）。在一個實例中，待治療的癌症係非小細胞肺癌（NSCLC）。在一個實例中，癌症係頭頸部鱗狀細胞癌（SCCHN）。
在一些實例中，癌症係野生型EGFR癌症、EGFR突變型癌症、野生型cMET癌症、或cMET突變型癌症。檢測EGFR和cMET突變型癌症之方法係熟知的。
在一些實例中，待治療的癌症係EGFR突變型癌症（也稱為「EGFR突變陽性」），例如EGFR突變型NSCLC。可能與癌症相關的示例性EGFR突變（如活化EGFR的突變）包括導致EGFR的至少一種生物活性（如升高的酪胺酸激酶活性、受體同二聚物和異二聚物的形成、增強的配體結合等）的增加的點突變、缺失突變、插入突變、倒置或基因擴增。突變可以位於EGFR基因的任何部分或與EGFR基因相關的調節區，並且包括外顯子18、19、20或21中的突變。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的L858R突變、外顯子19中之一或多個缺失、或外顯子20中之一或多個插入、T790M突變或其組合的癌症。
在NSCLC中，在EGFR基因中的特定突變與EGFR TKI的高響應率有關。外顯子21中的單點突變白胺酸-858到精胺酸（L858R）以及外顯子19中之至少三個胺基酸殘基的可變缺失通常一起被稱為「經典」活化 EGFR的突變，並且占NSCLC中所有觀察到的 EGFR激酶結構域突變的絕大多數（85%-90%）（Vyse和Huang, 2019）。已報導的EGFR外顯子19缺失的實例包括delE746-A750、delE746-T751、delL747-E749、delL747-P753和delL747-T751。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的L858R突變和/或外顯子19中之一或多個缺失的癌症（例如EGFR突變陽性NSCLC）。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的外顯子19中之一或多個缺失和/或L858R突變的癌症（例如EGFR突變陽性NSCLC）。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的L858R突變和外顯子19中之一或多個缺失的癌症（例如EGFR突變陽性NSCLC）。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的外顯子19中之一或多個缺失的癌症（例如EGFR突變陽性NSCLC）。在一些實例中，EGFR突變型癌症係具有在EGFR基因中的L858R突變的癌症（例如EGFR突變陽性NSCLC）。
儘管大多數具有EGFR突變的NSCLC患者最初對EGFR TKI療法有響應，但幾乎所有用第一代EGFR TKI治療的患者在大約10個月的無進展期後都會獲得抗性。在胺基酸位置790（T790M）處用甲硫胺酸取代蘇胺酸的繼發點突變係產生靶向激酶的耐藥性變體的分子機制。T790M突變存在於大約一半的對第一代和第二代EGFR TKI具有後天性抗性的肺癌患者中，並且據報導藉由增加受體對三磷酸腺苷的親和力（相對於其對TKI的親和力）來起作用（Suda, 2009）。
並非所有活化的EGFR突變本質上對EGFR抑制劑敏感。外顯子20中的框內鹼基對插入也導致EGFR的組成型活化，但與經典活化的EGFR突變不同，EGFR外顯子20插入與對目前臨床可用的EGFR抑制劑的原發性耐藥（de novo resistance）相關。已經報導了在EGFR外顯子20插入突變NSCLC患者中，厄洛替尼、吉非替尼和第二代EGFR抑制劑阿法替尼在3%-8%之間的低響應率，並且因此，有效的治療選擇係有限的（Vyse和Huang, 2019）。已報導的EGFR外顯子20插入的實例包括D761-E762 insX、A764-Y764 insX、Y764-V765 insX、V765-M766 insX、A767-S768 insX、S768-V769 insX、V769-D770 insX、D770-N771 insX、N771-P772 insX、P772-H773 insX、H773-V774 insX、V774-C775 insX，其中insX指示在1-7胺基酸之間的框內插入。
如本文所證明的，涉及本文所述之抗EGFR/cMET軛合物和奧希替尼（第三代EGFR TKI）的組合治療在一系列不同的突變型EGFR癌症模型（包括含有L858R突變，外顯子20插入和具有T790M突變的外顯子19缺失的那些）中顯示出有效的腫瘤抑制。因此，預期本文所述之組合治療將有效治療人類中一系列不同的EGFR突變型癌症。
在一些實例中，所治療的患者以前已經用先前抗癌症療法（例如先前EGFR TKI）治療。在一些實例中，人患者在先前EGFR TKI治療期間或之後已出現疾病進展，即，患者已經對先前EGFR TKI治療的治療具有後天性抗性或有抗性。在一些實例中，所治療的患者對用厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼、凡德他尼、阿法替尼、奧希替尼、泊齊替尼、克唑替尼、卡博替尼、卡奈替尼、阿西替尼、樂伐替尼、尼達尼布、瑞戈菲尼、帕唑帕尼、索拉非尼和/或舒尼替尼的治療有抗性或具有後天性抗性。在一些實例中，人患者在先前用不同的EGFR TKI治療期間或之後已出現疾病進展，例如所治療的癌症被歸類為奧希替尼抗性癌症。如上所述，與EGFR TKI抗性相關的突變包括T790M突變和外顯子20中的插入。在其他實例中，所治療的患者係EGFR TKI初治人患者（即，他們以前沒有用EGFR TKI治療）。 治療作用
在癌症的情況下，治療可以包括抑制癌症生長，包括完全癌症緩解，和/或抑制癌症轉移，以及抑制癌症復發。癌症生長通常係指指示癌症內的變化為更發展的形式的多個指標中之任一個。因此，用於測量癌症生長抑制的指標包括癌細胞存活的減少、腫瘤體積或形態的減少（例如，如使用電腦斷層掃描（CT）、超音波掃描或其他成像方法所確定的）、延遲的腫瘤生長、腫瘤脈管系統的破壞、遲發型超敏皮膚測試中改善的性能、抗癌免疫細胞或其他抗癌免疫響應的活性的增加，以及腫瘤特異性抗原水平的降低。活化或增強個體對癌性腫瘤的免疫響應可以提高個體抵抗癌症生長（特別是受試者已經存在的癌症的生長）的能力和/或降低個體癌症生長的傾向。
在一些實例中，本文所述之組合治療能夠抑制癌症的發展或進展。
可以例如使用體內模型分析給定組合治療抑制癌症發展或進展的能力。例如，體內模型可涉及測量患者來源的異種移植物（PDX）模型中的腫瘤生長。該示例性方法的更多詳細資訊在實例中進行了描述。
癌症發展的抑制可以藉由在投與抗體分子後觀察腫瘤生長較慢或腫瘤大小減小（例如藉由測量腫瘤生長抑制（%TGI））來推斷。對於那些投與抗體分子的受試者，%TGI可以藉由比較在第0天測量的腫瘤大小與研究時間結束時測量的腫瘤大小來測量，並將其與投與對照抗體分子的受試者在同一時間段內的腫瘤生長進行比較。這樣，根據下式，%TGI可以定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = （1 -（TX 最終-TX 初始）/（C 最終-C 初始））x 100。
在一些實例中，本文所述之組合治療具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的%TGI。
癌症發展的抑制可以藉由觀察響應於抗體分子治療的癌症症狀的延遲或預防發作和/或嚴重程度降低來推斷。癌症進展的抑制可以藉由觀察響應於抗體分子治療的延遲、預防和/或減少的侵襲和/或轉移來推斷。
本文所述之組合治療可以能夠將癌症的發展或進展抑制至小於100%，例如99%或以下、95%或以下、90%或以下、85%或以下、75%或以下、70%或以下、65%或以下、60%或以下、55%或以下、50%或以下、45%或以下、40%或以下、35%或以下、30%或以下、25%或以下、20%或以下、15%或以下、10%或以下、5%或以下、或1%或以下之一的在沒有治療（或用適當的對照治療）的情況下癌症的發展/進展。在一些實例中，本文所述之組合治療能夠將癌症的發展或進展抑制至在沒有治療（或用適當的對照治療）的情況下癌症的發展/進展水平的小於1倍，例如≤ 0.99倍、≤ 0.95倍、≤ 0.9倍、≤ 0.85倍、≤ 0.8倍、≤ 0.85倍、≤ 0.75倍、≤ 0.7倍、≤ 0.65倍、≤ 0.6倍、≤ 0.55倍、≤ 0.5倍、≤ 0.45倍、≤ 0.4倍、≤ 0.35倍、≤ 0.3倍、≤ 0.25倍、≤ 0.2倍、≤ 0.15倍、≤ 0.1倍之一。
在一些實例中，本文所述之組合治療能夠比使用單獨投與單藥劑（即，抗體分子或EGFR TKI）更大程度地抑制癌症的發展或進展。本文所述之組合治療可以能夠將癌症的發展或進展抑制至小於100%，例如99%或以下、95%或以下、90%或以下、85%或以下、75%或以下、70%或以下、65%或以下、60%或以下、55%或以下、50%或以下、45%或以下、40%或以下、35%或以下、30%或以下、25%或以下、20%或以下、15%或以下、10%或以下、5%或以下、或1%或以下之一的用單獨的抗體分子、軛合物或EGFR TKI治療的癌症的發展/進展。在一些實例中，本文所述之組合治療能夠將癌症的發展或進展抑制至用單獨的抗體分子、軛合物或EGFR TKI治療的癌症的發展/進展水平的小於1倍，例如≤ 0.99倍、≤ 0.95倍、≤ 0.9倍、≤ 0.85倍、≤ 0.8倍、≤ 0.85倍、≤ 0.75倍、≤ 0.7倍、≤ 0.65倍、≤ 0.6倍、≤ 0.55倍、≤ 0.5倍、≤ 0.45倍、≤ 0.4倍、≤ 0.35倍、≤ 0.3倍、≤ 0.25倍、≤ 0.2倍、≤ 0.15倍、≤ 0.1倍之一。在一些實例中，本文所述之組合治療對抑制癌症的發展或進展發揮協同作用。 * * *
以其特定形式或根據用於執行所揭露的功能的方式、或者用於獲得所揭露的結果的方法或過程來表現的在前面的說明書或在以下申請專利範圍或在附圖中揭露的特徵，視情況可以單獨地，或者以此類特徵的任何組合的方式用於以其各種形式來實現本揭露。
雖然已經結合上述示例性實例描述了本揭露，但是當給出本揭露時，許多等同的修改和變化對於熟悉該項技術者將是顯而易見的。因此，上述揭露的示例性實例被認為是說明性的而非限制性的。在不脫離本揭露之精神和範圍的情況下，可以對所描述的實例進行各種改變。
為了避免任何疑問，提供本文提供的任何理論解釋係為了提高讀者的理解。諸位發明人不希望受到任何該等理論解釋的束縛。
本文使用的任何章節標題只是出於組織的目的，而不應被解釋為限制所描述的主題。
除非上下文另有要求，否則在本說明書（包括後面的申請專利範圍）全篇，詞語「包含」和「包括」及變型應當被理解為暗指包括所陳述的整數或步驟或者多個整數或步驟的組，但不排除任何其他整數或步驟或者多個整數或步驟的組。
必須指出的是，如本說明書和所附申請專利範圍中所用，除非上下文另外明確指出，否則單數形式「一」、「一種（個）」和「該」包括複數指示物。本文可以將範圍表述為「約」一個特定值，和/或至「約」另一個特定值。在表述此類範圍時，另一個實例包括從該一個特定值開始和/或到另一個特定值。類似地，藉由使用先行詞「約」將值表述為近似值時，應該理解該特定值形成了另一個實例。相對於數值的術語「約」係視需要的並且意指例如+/-10%。 實例 實例 1 - RAA22/B09 DuetMab 設計和構建
該實例描述了產生能夠結合EGFR和cMET兩者的雙特異性抗體分子。 1.1 抗 cMET 抗體 0021U3-B09 的分離和鑒定
基本上如（Vaughan, 1996）所述，在重組哺乳動物表現的生物素化單體人cMET（英商梅迪繆思有限公司（MedImmune））上的一系列重複淘選選擇循環中從大型天然人scFv噬菌體顯示文庫中分離cMET特異性scFv抗體。來自第2輪選擇輸出的ScFv在細菌周質中表現並篩選它們在HGF:cMET HTRF®（均相時間解析螢光）配體受體抑制結合測定中抑制人cMET受體與HGF配體結合的能力。選擇表現出強抑制作用的最佳命中（hit）並進行DNA定序。基本上如（Persic; 1997）所述，然後將獨特的基因轉化為人免疫球蛋白G2（IgG2）抗體，並在哺乳動物細胞中產生。然後基於它們在HGF:cMET HTRF®結合測定中的抑制作用對純化的抗體進行排序。選擇最有效的抗體0021U3-B09用於進一步表徵。 1.2 抗 cMET 抗體 0021U3-B09 的優化。
為了最小化潛在的免疫原性，特異性靶向並改變0021U3-B09的可變框架區中的非Vernier框架殘基（Foote和Winter 1992）以匹配最接近的人種系序列。在VH區，七個胺基酸殘基發生突變以匹配參考人種系序列IGHV1-8*01。在VL區，三個殘基發生突變以匹配參考人種系序列IGKV1-5*03。VH和VL區中的所有殘基均成功地改變為種系殘基而不喪失活性。基本上如（Kunkel 1985）所述，使用基於雜交的誘變方法對0021U3-B09進行親和力優化。使用標準分子生物學技術，藉由VH互補決定區3（CDR3）的寡核苷酸定向誘變，創建了來源於0021U3-B09序列的大型scFv文庫。對文庫進行基於親和力的溶液相選擇，以選擇對人和石蟹獼猴cMET抗原具有更高親和力的變體。篩選來自CDR靶向選擇輸出的粗製scFv周質提取物以提高HGF:cMET HTRF®結合測定中的抑制活性。對與親本0021U3-B09相比表現出顯著改善的抑制作用的變體進行DNA定序，並將獨特的基因轉化為人IgG2。然後根據它們的抑制作用對純化的抗體進行排序。選擇最有效的抗體B09-57用於進一步表徵。 1.3 抗 EGFR 抗體 Tdev-0004 的分離和鑒定。
基本上如（Vaughan, 1996）所述，在重組哺乳動物表現的生物素化單體人EGFR（英商梅迪繆思有限公司）上的一系列重複淘選選擇循環中從大型天然人scFv噬菌體顯示文庫中分離EGFR特異性scFv抗體。在ELISA中篩選來自第3輪選擇輸出的ScFv展示噬菌體與人和石蟹獼猴EGFR的結合。選擇顯示交叉反應性的最佳命中並進行DNA定序。基本上如（Persic, 1997）所述，然後將獨特的基因轉化為人免疫球蛋白G1（IgG1）抗體，並在哺乳動物細胞中產生。然後藉由流動式細胞分析術基於純化的抗體與表現EGFR的細胞系A431的結合對純化的抗體進行排序。選擇表現出特異性細胞結合的抗體Tdev-0004用於進一步表徵。 1.4 抗 EGFR 抗體 Tdev-0004 的優化。
藉由優化抗EGFR Tdev-0004 mAb衍生變體RAA22和QD6。Tdev-0004的VL框架與參考人種系序列IGLV2-11*01/IGLJ2具有100%匹配（參見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/Idlink.cgi?seqname=IGLV2-11*01&taxid=9606&dbname=IG_DB%2Fimgt.Homo_sapiens.V.f.orf.p） ，然而，VH框架與最接近的人種系IGHV1-69*01/JH4具有79%同源性（參見https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/igblast/Idlink.cgi?seqname=IGHV1-69*01&taxid=9606&dbname=IG_DB%2Fimgt.Homo_sapiens.V.f.orf.p）。為了最小化潛在的免疫原性，最初藉由突變所有13個非種系框架殘基使VH區完全種系化。在種系化後，完全種系化變體與石蟹獼猴EGFR的結合顯著受損。為了恢復與石蟹獼猴EGFR的結合，選擇性回復突變了四種非種系殘基：K68、I73、R76和T78。胺基酸殘基藉由Kabat編號系統編號（Kabat和Wu 1991）。所得的部分種系變體（命名為H4）被用作親和力優化的模板序列。根據製造商的說明書，使用QuikChange Lightning多位點定向誘變套組（安捷倫公司（Agilent）），藉由對所有六個CDR的簡約誘變對變體H4進行親和力優化。單個胺基酸誘變的VH和VL文庫在細菌中表現為Fab片段，並在ELISA中篩選與人和石蟹獼猴EGFR的改善的結合。對與親本H4相比表現出提高的結合的變體進行DNA定序，並將獨特的基因轉化為人IgG1。鑒定了在CDRH3中具有單個突變的變體RAA22。為了進一步提高親和力，將單個陽性突變組合以創建組合文庫，篩選與人和石蟹獼猴EGFR結合增強的變體。鑒定了在CDRL2、CDRL3和CDRH3中具有四個組合突變的變體QD6。 1.5 一價雙特異性抗 EGFR/cMET DuetMab 抗體的產生。
抗cMET mAb B09-57和抗EGFR mAb RAA22和QD6的可變結構域用於在DuetMab平臺的骨架上構建一價雙特異性抗EGFR/cMET抗體（Mazor, 2015）。具體地，將抗cMET B09-57的VH基因插入到攜帶「杵」突變（T366W）和替代的鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）的人γ-1恒定重鏈中。將B09-57的VL基因在框內插入到被設計成與「杵」重鏈配對的攜帶相應的替代鏈間半胱胺酸突變（S121C和C214V）的人κ恒定結構域。類似地，將抗EGFR RAA22和親和力優化的QD6的VH基因插入到攜帶「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）的人γ-1恒定重鏈中，而將RAA22和B09-57的VL基因在框內插入到被設計成與「臼」重鏈配對的人λ恒定結構域中。此外，「杵」和「臼」重鏈的CH3結構域中的兩個殘基突變為半胱胺酸（「杵」中的S354C和「臼」中的Y349C）以形成穩定的雙硫鍵。Fc結構域被進一步工程化以在絲胺酸239（C239i/「Maia」）後攜帶半胱胺酸插入，其被設計成使得能夠進行攜帶順丁烯二醯亞胺的細胞毒性藥物的位點特異性軛合（Dimasi, 2017）。胺基酸殘基藉由Kabat編號系統編號（Kabat和Wu 1991）。組裝的一價雙特異性抗EGFR/cMET DuetMab抗體被命名為RAA22/B09-57和QD6/B09-57（ 圖 1）。從哺乳動物細胞產生DuetMab抗體，如前所述（Mazor, 2017）。
根據本實例產生的DuetMab的重鏈和輕鏈的胺基酸序列提供於下表中：
   RAA22/B09-57 QD6/B09-57
EGFR重鏈 56 53
cMET重鏈 50 50
EGFR輕鏈 58 55
c-Met輕鏈 52 52
實例 2 - 生物化學和生物物理特性
本實例測試了RAA22、QD6和B09-57單株抗體和RAA22/B09-57和QD6/B09-57雙特異性抗體分子的各種生物化學和生物物理學性質，包括它們分別對EGFR和c-Met的結合親和力以及它們同時結合兩種抗原的能力。 2.1 DuetMab 和親本 mAb 對 EGFR 和 cMET 的結合親和力。
使用BIAcore T200儀器（賓夕凡尼亞州匹茲堡的通用電氣醫療集團（GE Healthcare, Pittsburgh, PA））上的抗體捕獲測定，在25°C下藉由SPR確定重組人、石蟹獼猴和鼠EGFR和cMET抗原的EGFR-cMET DuetMAb的動力學速率常數（kon和koff）和平衡解離常數（K D）。將小鼠抗人IgG固定在CM4感測器晶片上，最終表面密度為約2000共振單位（RU）。還使用相同的固定化方案在該感測器晶片上製備了參照流動細胞表面。測試製品抗體和對照製品抗體在儀器緩衝液（HBS-EP緩衝液；0.01 M HEPES、pH 7.4、0.15 M NaCl、3 mM EDTA和0.005% P-20）中、以及在儀器緩衝液中的3倍連續稀釋純化的EGFR（0.27 - 200 nM人，0.4 - 900 nM人，4-1000 nM鼠）或cMET蛋白（0.27至66 nM人和0.27 - 22 nM人）以5-20 nM製備。使用順序方法用於動力學測量。首先將抗體以10µL/分鐘的流速注射到捕獲表面上。在捕獲的抗體的結合穩定後，將單一濃度的分析物以75µL/分鐘的流速注射到捕獲表面和參照表面上。得到的結合響應曲線產生締合相數據。在注射分析物之後，然後將流切換回儀器緩衝液15分鐘以允許收集解離相數據，接著係10 mM甘胺酸，pH 1.5的1分鐘脈衝，以在晶片上再生抗體捕獲表面。從各濃度分析物的雙份注射中記錄針對測試製品抗體和對照製品抗體的結合響應。此外，在整個注射系列過程中，穿插若干緩衝液注射。選擇緩衝液注射與參照細胞響應一起使用以校正原始數據組的注射偽影和/或非特異性結合相互作用，通常稱為「雙重參照」。將校正的結合數據全域擬合至1 : 1結合模型（Biacore T200評估軟體2.0，賓夕凡尼亞州匹茲堡的通用電氣醫療集團）。計算的動力學參數（k on和k off）和以k off/k on確定的K D示於 表 1中。 [ 表 1] DuetMab 和親本 IgG 對 EGFR 和 cMET 抗原的動力學
抗體 抗原 K on （ M -1s -1 ） K off （ s -1 ） K D （ nM ）
RAA22 IgG 人EGFR 4.41 x 10 4 2.06 x 10 -3 46.6
石蟹獼猴EGFR 3.54 x 10 4 6.01 x 10 -3 169.8
小鼠EGFR 4.03 x 10 4 1.90 x 10 -2 488.0
人cMET 在200n M下未檢測到結合
石蟹獼猴cMET
小鼠cMET
QD6 IgG 人EGFR 1.48 x 10 5 2.92 x 10 -4 2.0
石蟹獼猴EGFR 1.14 x 10 5 2.88 x 10 -4 2.5
小鼠EGFR 1.67 x 10 5 7.35 x 10 -4 4.4
人cMET ND
石蟹獼猴cMET
小鼠cMET
B09-57 IgG 人EGFR 在200 nM下未檢測到結合
石蟹獼猴EGFR
小鼠EGFR
人cMET 5.63 x 10 5 8.82 x 10 -4 1.6
石蟹獼猴cMET 1.04 x 10 6 1.94 x 10 -3 1.9
小鼠cMET 在200 nM下未檢測到結合   
RAA22/B09-57 DuetMab 人EGFR 4.47 x 10 4 2.01 x 10 -3 45.0
石蟹獼猴EGFR 2.78 x 10 4 5.48 x 10 -3 197.0
小鼠EGFR 3.54 x 10 4 2.06 x 10 -2 575.4
人cMET 4.43 x 10 5 9.86 x 10 -4 2.2
石蟹獼猴cMET 9.74 x 10 5 2.12 x 10 -3 2.2
小鼠cMET ND   
QD6/B09-57 DuetMab 人EGFR 6.35 x 10 4 3.74 x 10 -4 5.9
石蟹獼猴EGFR 2.10 x 10 5 5.85 x 10 -4 2.8
小鼠EGFR 1.26 x 10 5 7.80 x 10 -4 6.2
人cMET 4.25 x 10 5 6.96 x 10 -4 1.6
石蟹獼猴cMET 9.58 x 10 5 2.06 x 10 -3 2.2
小鼠cMET ND
aND：未確定。使用BIACore儀器進行EGFR和cMET的可溶性單體形式的動力學測量。K D由數據的非線性擬合計算為k off/k on的比率。
從以上數據可以看出，與QD6/B09-57相比，雙特異性抗體分子QD6/B09-57以高親和力（約2 nM kD）結合人c-Met並且以高親和力（約6 nM kD）結合人EGFR，而雙特異性抗體分子RAA22/B09-57以類似高親和力（約2 nM kD）結合人c-Met，但以降低的親和力（約45 nM kD）結合人EGFR。 2.2 DuetMab 與 EGFR 和 cMET 的同時結合。
基本上如（Mazor, 2015）所述，在Octet384儀器上藉由生物層干涉測量法測量對重組人EGFR和cMET蛋白的同時結合研究。易言之，最初在NI-NTA生物感測器上捕獲在測定緩衝液[PBS pH7.2，3 mg/mL牛血清白蛋白（BSA），0.05%（v/v）Tween 20]中的5 µg/mL的His-標記的cMET抗原。在洗滌步驟除去任何未結合的蛋白質後，分別負載的生物感測器進行連續的締合和解離相互作用，首先與66 nM的抗體相互作用，然後與500 nM的EGFR抗原相互作用。使用Octet384軟體v.9.0對數據進行非線性擬合，由此計算締合和解離曲線。如 圖 2所示，DuetMab表現出與兩種抗原同時結合，而親本抗cMET IgG僅表現出與cMET的特異性結合，並且兩種抗EGFR IgG不表現出與負載cMET的感測器的結合。 2.3 EGFR 和 c-Met 特異性
藉由ELISA確定EGFR和cMET物種同種同源物和密切相關的家族成員的特異性。易言之，在PBS中以1 µg/mL製備抗原溶液並將50微升包被在半面積ELISA分析板上。洗滌板，並在室溫下用含有0.005% Tween-20的1% BSA的PBS（PBS-T）封閉一小時。將孔在PBS-T中洗滌4次。如 圖 3所示，使用一抗，其中：R374（非結合IgG1同種型對照抗體）、B09（抗cMET抗體）、QD6（抗EGFR抗體）、RAA22（抗EGFR抗體）、QD6/B09（雙特異性EGFR/c-MET DuetMAb）、RAA22/B09（雙特異性EGFR/c-MET DuetMAb）、PaniX（抗EGFR抗體）、MetMab（抗cMET抗體）和Mab11311（抗HER4抗體）。除了HER4結合mAb對照MAB1131（該系列以1 µg/mL開始）之外，將孔與以1 : 3稀釋系列稀釋於PBS-T中的50微升所示一抗一起孵育，以10 µg/mL開始並以0.002 µg/mL結束。將孔在PBS-T中洗滌4次，然後將50 µl在PBS-T中以1 : 5000稀釋的山羊抗人Fab HRP-標記的二抗添加到各孔中並在室溫下孵育一小時。向所有孔中添加50微升TMB底物溶液並在室溫下孵育5-30分鐘，直到在陽性對照孔中觀察到強訊息。向所有孔中添加50微升TMB終止溶液，在SpectraMax M5酶標儀上在450 nm處讀取吸光度。在SoftMax Pro 5軟體中分析數據並使用GraphPad Prism 7繪圖軟體繪圖。
為了確定物種交叉反應性，如上所述進行ELISA分析。如 圖 3A所示，高親和力EGFR IgG QD6以及一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb QD6/B09與人、石蟹獼猴和小鼠EGFR結合並在ELISA分析中給出強訊息。相比之下，與QD6相比，降低親和力的EGFR IgG RAA22與人、石蟹獼猴和小鼠EGFR結合較弱。與小鼠EGFR的結合較弱，但可檢測。相應的一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb RAA22/B09顯示出相對於二價親本IgG RAA22與人和石蟹獼猴EGFR的結合仍然較弱，並且顯示出與小鼠EGFR的標稱結合。cMET IgG B09以及所有雙特異性變體顯示出與人和石蟹獼猴cMET相當的結合。沒有檢測到任何抗體與小鼠cMET的結合。該等結果與在BIAcore儀器上藉由表面電漿共振測定的結合動力學一致（上表1）。
如 圖 3B所示，親本IgG或衍生的雙特異性抗體都沒有表現出與任何EGFR HER家族蛋白、HER2、HER3或HER4的可測量的結合。類似地，沒有抗體顯示與cMET家族成員Ron（CD136）或Semaphorin 3a的顯著結合。
該等結果證明，親本IgG和得到的雙特異性抗體與它們的同源靶標特異性結合，而與密切相關的家族物種沒有可檢測的結合。 2.4 雙特異性抗體的內化
AlexaFluor647（AF647）主要標記的DuetMab的內化動力學：使用EGFR和c-MET表現細胞系H1975在體外評估RAA22/B09和QD6/B09抗體。將每種抗體預結合到細胞上，然後使用活細胞共聚焦螢光顯微鏡監測抗體從細胞表面到細胞質的易位。兩種抗體在（T = 0）經歷內化條件之前主要都定位在細胞表面上，並在1小時後易位到細胞質區域（未顯示數據）。在內化的時間過程中每5分鐘拍攝一次動力學圖像，並使用定量演算法進行處理以確定內化動力學常數和半衰期。QD6/B09和RAA22/B09的內化動力學相當，半衰期分別為37.5 ± 10.6 min和43.2 ± 15.5。
為了評估抗體內化的模式並研究每個組對DuetMab的整體內化的貢獻，我們評估了在表現EGFR和c-MET的H1975細胞中針對duet QD6/B09的單組特異性對照抗體分子QD6/IgG和B09/IgG以及針對duet RAA22/B09的RAA22/IgG和B09/IgG的內化。由於只有一個組對靶受體係特異性的，因此對照抗體只能藉由一個受體內化，從而消除了作為內化模式的雙重受體靶向和交聯。
QD6/B09（ 圖 4A）和RAA22/B09（ 圖 4B）的內化曲線呈現了非常相似的膜mAb-Fl647訊息的一致減少模式，其中細胞質中mAb-AF647訊息分別增加，這係內化的典型特徵。然而，它們的單組構建體顯示出非常不同的內化曲線。單組QD6/IgG與QD6/B09 DuetMab具有幾乎相同的內化時間過程（ 圖 4A，左和中），表明QD6/B09 duet的內化主要由分子的EGFR-組驅動，B09-組的貢獻最小。實際上，B09/IgG構建體顯示出非常小的內化水平（ 圖 4B，右）。膜訊息的快速和廣泛減少對應於細胞質訊息的非常適度的增加，可能是由於預先結合的B09/IgG從細胞表面上的c-MET受體廣泛解離。抗體的解離隨後導致B09/IgG的適度內化。該等結果表明，QD6/B09 duet的內化主要由分子的EGFR-組驅動，B09-組的貢獻最小。
相比之下，當與其單組對照抗體相比時，RAA22/B09 DuetMab顯示出非常不同的內化曲線。如 圖 4B所示，RAA22/B09 DuetMab的細胞質強度值比RAA22-IgG和B09-IgG的細胞質強度值分別高10.98倍和4.70倍。雖然B09/IgG的低效內化可能歸因於其明顯的解離，但RAA22/IgG確實經歷了快速內化。然而，由於EGFR-組的親和力較低，因此RAA22/IgG分子的數目（基於螢光強度）比RAA22-B09 DuetMab少10.98倍。與單組構建體相反，進入細胞質的duet RAA22/B09 mAb的顯著增加量表明，兩個抗體組必須與靶受體接合以驅動內化。該發現表明，QD6/B09和RAA22/B09 DuetMab具有不同的內化機制，其中QD6/B09主要由EGFR組驅動，但RAA22/B09需要EGFR和c-MET組兩者用於接合。
由於EGFR和c-MET組與靶受體的結合促進了RAA22/B09受體在H1975細胞中的內化，我們檢測了EGFR和c-Met受體數量的增加是否會影響內化性質。在H1975細胞中藉由西方墨點法確定的相應受體水平對於EGFR為約33,000並且對於c-MET為約50,000，並且在HCC827細胞中對於EGFR為約790,000並且對於c-MET為約523,000。RAA22/B09在H1975（培養基受體）和HCC827（高受體）細胞中的內化曲線顯示HCC827細胞的內化顯著增加（ 圖 5）。
正如預期的那樣，對應於EGFR和c-MET RAA22/B09的總體水平分別增加23.9倍和10.4倍，與HCC827細胞的結合平均比H1975高8.9倍（T = 0，3.1 × 10 7MFI對3.5 × 10 6MFI）。在HCC827細胞中內化水平（藉由峰值細胞質強度判斷）高21.7倍，表明在表現高水平靶受體的細胞中，進入細胞質的抗體濃度顯著較高。重要的是，除了顯著不同的強度之外，HCC827與H1975細胞之間的內化曲線（隨時間變化的膜和細胞質訊息）也顯著不同。在高表現HCC827細胞中，RAA22/B09-AF647膜訊息的降低對應於RAA22-B09細胞質訊息的相互增加，其中總RAA22/B09訊息在時間過程中維持，表明與兩種受體的強雙組抗體相互作用和隨後的內化。在H1975細胞中，總強度和膜強度同時降低，表明部分預結合抗體可能已從細胞表面解離並且無法在細胞內進行內化。在HCC827細胞中觀察到RAA22/IgG和B09/IgG的內化指示解離的類似特徵，其中單組接合不能提供有效結合並且容易解離（ 圖 6A和 6B）。該數據表明，當RAA22/B09在H1975細胞中進行內化時，存在受體相互作用的混合模式（單組和雙組接合）。總之，該等數據表明靶細胞受體表現水平係RAA22/B09內化的程度和效率的重要決定因素。 實例 3 - ADC 的體外效力
在該實例中，在一組癌細胞系中測量EGFR/cMET雙特異性ADC的體外效力。 3.1 位點特異性軛合
微管溶素藥物與RAA22/B09抗體分子的軛合基本上如先前在Thompson, 2016和US 20150291657 A1中所述進行。 3.2 確定 ADC 細胞毒性活性的方法
如下在多種細胞系中測試了ADC細胞毒性活性。將細胞以96孔板的每孔10,000個細胞的密度以100 μL的體積鋪板在其推薦的補充有10%胎牛血清的培養基中。藉由在培養基中連續稀釋抗體原液來製備3X濃度的待測試抗體的每個劑量。將五十微升每種測試製品一式三份添加到細胞中，使得最終抗體濃度範圍為60 nM至0.0009 nM。將經處理的細胞在37°C下在潮濕培養箱中培養72小時。根據製造商的說明書，使用來自普洛麥格公司的CellTiter-Glo發光活力測定來測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大活力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性迴歸分析來確定IC 50值。 3.3 結果 - 細胞系的體外 ADC 活性
使用CellTiter-Glo發光活力測定在一組癌細胞系中測量EGFR/cMET雙特異性ADC的體外效力。如 表 3所示，較高親和力QD6/B09-AZ1508和較低親和力RAA22/B09-AZ1508在具有一系列靶標表現水平的細胞系中都表現出廣泛的活性。 [ 表 3] - EGFR-cMET DuetMAb ADC 的體外活性
細胞系 相對EGFR密度 相對cMET密度 高親和力ADC QD6/B09-AZ1508 降低的EGFR親和力ADC RAA22/B09-AZ1508
IC50 (pM) 最大值 抑制% IC50 (pM) 最大值 抑制%
HCC 827親本 1, 513, 899 236, 933 96 79% 132 55%
NCI H596 938,023 28,353 274 54% 3,237 67%
HCC 827 GR池 760, 040 523, 298 33 66% 168 59%
A549 88, 385 16, 483 118 45% 667 36%
NCI H1792 63,820 20,658 81 80% 200 81%
NCI H1975 33, 086 50, 339 178 65% 255 65%
NCI H292 96,538 16,497 91 79% 271 62%
A427 20,236 9,734 6,959 12% 40,220 58%
NCI H358 15,065 16,429 168 29% 3,017 30%
NCI H23 9,843 21,669 ＞60,000 約5% 8,096 46%
NCI H661（Ag陰性） ND - 9,906 ND - 8, 114 ＞60,000 0 ＞66,667 10%
總體上，對EGFR具有較低的親和力的ADC在共表現顯著量的EGFR和cMET兩者的廣泛範圍的細胞系中表現出相當的（稍微降低）效力。通常，當一種或另一種靶標在細胞表面具有約15,000或更低的低相對受體密度時，兩種ADC均顯示降低的效力。這種作用在親和力較低的變體中更顯著，該親和力較低的變體似乎對較低水平的cMET更敏感。 實例 4 - ADC 的雙特異性接合
為了進一步測試降低親和力的EGFR-cMET抗體的雙特異性接合對於最佳ADC遞送係必需的假設，我們進行了體外實驗以確定各個抗體組對雙特異性ADC活性的相對貢獻。在第一個實驗中，我們使用過量的未設組親本抗體來阻斷EGFR或cMET，然後在體外細胞毒性測定中測量雙特異性EGFR-cMET ADC的活性。對於該實驗，我們使用了以大致相等的量表現中等水平的EGFR和cMET的細胞系。如果雙特異性ADC的各個組獨立地起遞送ADC的作用，則預期阻斷該細胞系中之任一靶標將僅適度地降低ADC的活性，使IC 50移動兩倍或更少，因為靶標以相似的水平存在。另一方面，如果ADC需要雙重靶標接合以有效地將ADC遞送到細胞中，則阻斷任一靶標將可能對雙特異性ADC的活性具有更大的影響。在一項相關實驗中，我們比較了雙特異性EGFR-cMET ADC與由一個EGFR或cMET結合組和一個非結合同種型抗體對照組組成的一價、單特異性對照抗體的活性。類似地，如果每個組獨立地起作用，則預期結果將是每個單特異性對照ADC將僅適度地比雙特異性ADC效力低，並且差異將是相加的。替代性地，如果雙特異性的兩個組協同作用，則預期雙特異性ADC的活性與單特異性對照抗體相比有較大差異。 4.1 方法
如下在NCI-H1975細胞系中測試了ADC的細胞毒性活性。將細胞以96孔板的每孔10,000個細胞的密度鋪板在其推薦的補充有10%胎牛血清的培養基中，對於阻斷實驗，體積為50 μL，而對於一價ADC實驗，體積為100 μL。對於未設組mAb阻斷實驗，將50 μL的300 μg/mL的EGFR IgG（RAA22）或cMET IgG（B09）溶液添加到孔中並在37°C下在加濕培養箱中預孵育一小時。藉由在培養基中4X連續稀釋抗體原液來製備3X濃度的待測試抗體的每個劑量。將五十微升單獨的培養基、同種型對照IgG ADC（R347-AZ1508）或EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）一式三份添加到細胞中，使得最終抗體濃度範圍從67 nM降至0.0009 nM。對於一價ADC實驗，將50 μL同種型對照ADC（R347-AZ1508）、一價EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）、一價抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）、一價ADC的等莫耳組合或EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）的3X儲備液一式三份以開始於60 nM並且結束於0.009 nM的4X稀釋系列添加。將經處理的細胞在37°C下在潮濕培養箱中培養72小時。根據製造商的說明書，使用來自普洛麥格公司的CellTiter-Glo發光活力測定來測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大活力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性迴歸分析來確定IC 50值。 4.2 結果和結論 - 雙重靶向概念的體外驗證（ mAb 阻斷實驗和一價 ADC ）
我們進行了體外實驗以檢查各個抗體組對雙特異性ADC的細胞毒性活性的相對貢獻，如上文所述。如圖7中的代表性實驗所示，用cMET IgG RAA22對NCI H1975細胞進行預處理導致EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）的IC 50從大約60 pM轉變為3,480 pM，相差約60倍。用抗cMET IgG B09處理導致IC 50轉變為680 pM，相差大於11倍。類似地，當NCI H1975細胞用一價單特異性EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）處理時，IC 50為約20,500 pM，與雙特異性EGFR-cMET ADC的316 pM相比相差約65倍（ 圖 8）。一價單特異性抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）的IC 50為2,772 pM，與雙特異性抗體相比相差約13倍。
總之，該等數據表明，EGFR-cMET ADC有效靶向共表現兩種靶標的腫瘤細胞主要由ADC的雙特異性接合來驅動。此外，該等結果表明，EGFR親和力降低的結合組不足以在不存在cMET結合的情況下促進有效的ADC遞送，如當cMET組被未設組抗體阻斷時效力的顯著降低和一價EGFR對照ADC、RAA22/R347-AZ1508的弱細胞毒性所證明的。總之，該等結果與以下假設一致：雙特異性ADC（RAA22/B09-AZ1508）的EGFR結合組的降低的親和力將促進ADC遞送至EGFR和cMET共表現腫瘤，同時表現出對主要僅表現一種靶標的細胞的降低的細胞毒性。當僅EGFR可用於接合時，這種作用最為顯著，這對於減輕表現顯著水平的EGFR但相對較少的cMET的正常器官諸如皮膚中的EGFR驅動的毒性有影響。 實例 5 - 患者來源的異種移植（ PDX ）模型中的 ADC 體內藥理學
人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型已成為基於腫瘤細胞系的腫瘤異種移植物的成熟替代物。PDX模型係根據患者的原發性腫瘤組織直接植入免疫缺乏小鼠體內以在小鼠體內產生增殖的腫瘤而建立的。由此產生的腫瘤隨後在另外的小鼠中繁殖，無需體外培養，以建立可用於植入研究小鼠的低傳代PDX腫瘤組織庫。PDX模型的一個關鍵特徵係它們在很大程度上保持組織學和基因組異質性並保留相應的原始患者腫瘤的基因表現譜。與使用已適應體外生長的腫瘤細胞選殖群體的基於腫瘤細胞系的異種移植物模型相比，PDX模型的特徵旨在更準確地複製真實人類腫瘤的特徵，從而提高臨床前小鼠模型的預測價值。實際上，許多研究已經顯示PDX模型對標準護理治療的響應和抗性特徵與具有給定腫瘤特徵的人類受試者的臨床數據密切相關。
儘管PDX模型提供了改進，但標準體內藥理學研究設計存在限制，即使當應用於PDX模型時。對於每個腫瘤模型，一項典型的研究測試了多種劑量水平的藥物治療以及一或多種陽性或陰性對照化合物，每個治療組有足夠的小鼠來支持模型內統計。用於此類研究設計的小鼠數量相對較多，而PDX模型的成本較高，這可能會限制可以實際測試給定化合物的腫瘤模型的數量。傳統研究設計的替代/補充方法係小鼠PDX試驗，這係一種根據人類臨床試驗設計之後進行的基於群體的方法。在該方法中，對於每種化合物，通常以從先前的劑量範圍發現研究建立的單一劑量水平治療單個小鼠，對於每種模型具有視需要的治療對照組。由於每個模型所需的小鼠數量較少，因此可以測試許多PDX模型，每個代表獨特的人類腫瘤。不是依賴於模型內統計，而是在整個測試的腫瘤模型群體中評估響應。該方法可以提供對不同範圍的靶標表現、分子表現型、腫瘤亞型或其他感興趣的臨床相關特徵的響應率的更準確估計。此外，可以在PDX試驗中測試的大量獨特模型可以使更有意義的探索性基因組學、轉錄組學或表現譜研究能夠開始早期搜索響應或抗性的相關性。對於本文概述的示例性研究，我們採用了「全員」方法，在START Discovery測試了所有可用的NSCLC模型，而不管靶標表現水平或分子表現型如何。 5.1 方法
在德克薩斯州聖安東尼奧的南德克薩斯加速研究治療公司（START, San Antonio, TX）進行小鼠PDX試驗。START獲得了AAALAC International（國際實驗室動物護理評估和認證協會（Association for the Assessment and Accreditation of Labortory Animal Care International））的認可，並符合阿斯利康動物護理和福利全球標準（ AstraZeneca Global Standard on Animal Care and Welfare）。所有模型都是在START開發的。患者來源的異種移植物（START-PDX）模型由活的人類腫瘤組織或體液建立，並且已經在動物體內連續傳代有限次數以維持腫瘤異質性。將無胸腺裸鼠(Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) / CB-17 Scid (CB17/Icr-Prkdcscid/IcrIcoCrl)單側植入從宿主動物採集的腫瘤片段，每個移植來自特定的傳代批次。在其估計開始日期之前約一週開始記錄研究前腫瘤體積。當腫瘤達到合適的腫瘤體積起始（TVI）範圍（125-250 mm 3）時，將動物隨機分成治療組和對照組，並開始靜脈內（IV）給藥（第0天）；在整個研究過程中單獨跟蹤動物。在第0天開始初始給藥；所有組中的動物均按重量靜脈內給藥（0.01 ml/g；10 ml/kg）。每7天對藥物治療的動物給藥，總共4次給藥。從第0天開始，藉由數位卡尺測量腫瘤尺寸，並記錄每隻治療動物和對照動物的估計腫瘤體積；使用以下公式計算腫瘤體積：TV = 寬度 2× 長度 × 0.52。腫瘤生長觀察在最後一次給藥後持續一週。每隻動物在達到腫瘤體積（TV）終點（腫瘤體積≥ 1cm 3）或28天的研究時間終點時處死，以先到者為準。對於一些腫瘤生長緩慢的PDX模型，觀察期有所延長。根據下式，腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 - （TX 最終- TX 初始）/（C 最終- C 初始）。腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始劑量日）的腫瘤減小百分比：%消退 = （TX 最終平均- TX 初始平均）/（TX 初始平均）x 100。 5.2 結果和結論
如 圖 9所示，高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508和具有對EGFR親和力降低的變體RAA22/B09-AZ1508兩者在眾多測試的PDX模型中都誘導腫瘤生長抑制或消退。令人驚訝的是，與較高親和力的ADC相比，較低親和力的ADC顯示出觀察到的響應的數量和深度增加的總體趨勢。對於對降低的親和力ADC反應最小的PDX模型，這種活性趨勢略微反轉，這與較低的cMET表現有些相關。該等觀察提高了較低的親和力EGFR-cMET ADC的活性部分地由cMET表現水平驅動的可能性。兩種雙特異性抗體的EGFR結合組來源於相同的小鼠EGFR交叉反應性抗體（參見 實例 1）。QD6/B09抗體對小鼠EGFR的固有結合親和力為約6 nM，而RAA22/B09雙特異性抗體的親和力為約575 nM。較低的EGFR親和力的活性的出乎意料的改善可以歸因於來自正常組織（諸如皮膚）中的EGFR吸收的降低的影響，從而導致ADC的更高的總體循環暴露。無論如何，該等數據表明，降低EGFR-cMET雙特異性抗體對EGFR的親和力不會損害所得ADC的體內功效，但與較高親和力ADC相比出乎意料地提高了活性。 5.3 不同劑量的 PDX 研究
進行了進一步的實驗以在PDX模型中測試不同劑量的ADC。該實驗如實例5.1所述進行，不同之處在於將個體小鼠的腫瘤體積為≥ 2 cm 3從研究中除去，並將最終測量值包括在組平均值中，直到平均值達到體積終點或研究達到63天的時間終點。對於示例性研究，在1和2 mg/kg的劑量水平下測試高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508，並且在1、2和3 mg/kg下測試對EGFR具有較低的親和力的變體RAA22/B09-AZ1508。
如 圖 10所示，高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508和具有對EGFR親和力降低的變體RAA22/B09-AZ1508兩者在測試的劑量下在PDX模型中都誘導腫瘤生長抑制活性。根據實例5.2中描述的結果和 圖 9所示的結果，較低親和力ADC通常比高親和力ADC更有效。在所有四種測試的模型中，較低親和力的ADC在2或3 mg/kg劑量水平下誘導消退，表明較低親和力的ADC在適度劑量下係有效的。該等數據提供了進一步的證據，即降低EGFR-cMET雙特異性抗體對EGFR的親和力並沒有降低所得ADC的體內功效，而是與較高親和力ADC相比提高了體內功效。 實例 6 - 原位胰臟 PDX 模型的 ADC 功效
皮下體內腫瘤模型係檢驗抗癌劑功效的主要手段。然而，當解釋體內結果時，該腫瘤植入部位伴隨有許多需要考慮的限制。該等缺陷包括腫瘤血管形成和腫瘤生長和響應中缺乏組織特異性基質。為了應對該等挑戰，我們比較了高親和力和低親和力EGFR-cMET雙特異性抗體-藥物軛合物在胰臟PDX模型MEDI-PANC-08的皮下和原位模型中的體內功效。為了原位跟蹤這種腫瘤的生長，我們開發了一種表現螢光素酶的PDX變體（MEDI-PANC-08 LUC），其生長可以使用成像進行追蹤。 6.1 方法
所有實驗均在AAALAC（實驗動物護理評估和認可協會）認可的機構中進行，根據英商梅迪繆思有限公司的IACUC（機構動物護理和使用委員會）對實驗動物進行人道治療和護理的指導方針。每天監測動物的發病率和死亡率。 皮下PDX模型
本研究中使用的MEDI-PANC-08胰臟PDX模型來自Internal MedImmune PDX庫。PDX腫瘤最初在接種NSG（NOD.Cg-Prkdc scidIl2rg tm1Wjl/SzJ）小鼠中繁殖，以產生足夠的腫瘤材料接種效力研究。一旦腫瘤達到800-1200 mm 3，藉由CO 2窒息人道地處死小鼠。在無菌條件下分離腫瘤，切成約2 mm 3的塊，並使用11號套管針皮下植入個體NSG小鼠的右脅腹。在達到約150-250 mm3的尺寸時，將小鼠隨機（基於腫瘤體積）分成治療組，並用ADC（Q1Wx4）治療。以1、2和3 mg/kg QD6/B09（高親和力）和RAA2/B09（低親和力）檢查了兩種EGFR-cMET雙特異性ADC。還在3 mg/kg下測試了同種型對照ADC（R347-AZ1508）。在即將使用之前，將所有抗體-藥物軛合物在緩衝液（25mM組胺酸、7%蔗糖、0.02% PS80、pH 6.0）中稀釋，並藉由尾靜脈進行靜脈內投與。每週兩次收集腫瘤和體重測量值，並使用等式(LxW2)/2計算腫瘤體積，其中L和W分別指長度和寬度尺寸。 原位PDX模型
表現螢光素酶的PDX模型（MEDI-PANC-08 LUC）在NSG種子小鼠中皮下生長，體積為800-1200mm 3，收穫腫瘤並切成約2mm 3的碎片。隨後將腫瘤碎片縫合到NSG小鼠的胰臟（第零天）。使用IVIS光譜體內成像系統每週測定螢光素酶訊息。易言之，在成像前10分鐘，腹膜內（i.p.）注射200ul溶解在DPBS（15 mg/ml）中的螢光素。將小鼠在3%異氟醚下麻醉，右側臥並測量發光。腫瘤植入後十四天，當清楚地檢測到發光訊息時，基於發光將小鼠隨機分組到各自的組中。小鼠用同種型對照（R347-AZ1508，3 mg/kg - Q1Wx4），吉西他濱（75 mg/kg，Q2Dx5）和RAA2/B09 ADC（2和3 mg/kg - Q1Wx4）處理。每週測量發光。研究終點包括體重減輕、身體狀況惡化和嗜睡。使用Living Image軟體（珀金埃爾默公司（Perkin Elmer））分析數據，並以平均輻射率[p/s/cm2/sr]對時間作圖。 6.2 結果和討論
為了輔助為EGFR-cMET雙特異性ADC選擇適當的EGFR親和力組合，使用MEDI-PANC-08胰臟PDX模型在體內功效研究中比較了高親和力和低親和力EGFR-cMET雙特異性ADC。如 圖 11的小圖A和小圖B所示，在2個分子之間觀察到不同的差異。高親和力QD6/B09 ADC在所測試的3個劑量水平中之任一個下都沒有顯示出功效。相比之下，低親和力RAA2/B09 ADC在第65天時使腫瘤完全消退，隨後在3 mg/kg劑量水平下腫瘤重新生長並且在2 mg/kg下腫瘤生長受到抑制。
雖然皮下腫瘤模型已成為體內功效研究的工作要點，但主要缺陷在於腫瘤不是在原發部位生長，因此任何藥物響應可能無法真正反映患者的響應。為了解決這一問題，使用經轉基因修飾以穩定表現螢光素酶的MEDI-PANC-08腫瘤開發了胰臟癌的原位模型。在胰臟上手術植入後，允許腫瘤建立，隨後基於發光訊息隨機化。然後用低親和力RAA2/B09 EGFR-cMET ADC、同種型對照或吉西他濱（一種化療藥物）治療小鼠。治療後，每週測量發光。如 圖 11的小圖C所示，由於身體狀況不佳和大的、可觸及的腹部腫瘤，未處理的對照組和同種型對照組的發光隨著時間的推移而增加。吉西他濱顯示發光訊息初始減少，在第21天左右達到最低點，此後訊息隨著時間的推移而增加，並在第49天將該組從研究中移除。在原位模型中，2 mg/kg和3 mg/kg劑量水平的RAA2/B09 ADC均引起發光訊息降低，在第60天達到接近背景水平。與皮下研究相比，2 mg/kg劑量水平表現出更好的產生腫瘤消退的活性。在研究結束時屍體剖檢顯示發光訊息接近背景的腫瘤的動物不再顯示可見的腫瘤，因此支持發光訊息與腫瘤體積之間的相關性。
總之，在皮下PDX胰臟PDX模型中，與高親和力QD6/B09 ADC相比，低親和力EGFR-cMET RAA2/B09 ADC顯示出改善的功效，在3mg/kg下觀察到腫瘤消退。在使用經工程化以穩定表現螢光素酶的相同PDX腫瘤（MEDI-PANC-08）的原位模型中也觀察到這種功效。使用發光作為腫瘤體積的替代物，在2和3 mg/kg下RAA2/B09 ADC顯示出優於皮下模型的療效，產生腫瘤消退。 實例 7 - 安全性和藥物動力學
進行藥物動力學（PK）分析以比較低親和力和高親和力EGFR-cMET ADC的血漿PK參數，包括小鼠和石蟹獼猴中的峰值和總暴露量、清除率和半衰期。關鍵目標係確定降低對EGFR的親和力是否會影響EGFR-cMET雙特異性ADC的循環暴露。在小鼠和石蟹獼猴中收集QD6/B09-57-AZ1508和RAA/B09-57-AZ1508的不同劑量水平的PK樣本。進行非隔間分析以基於物種和劑量水平的總ADC濃度估計QD6/B09-57-AZ1508和RAA22/B09-57-AZ1508的PK參數。
總之，在小鼠和石蟹獼猴中，與QD6/B09-57-AZ1508相比，RAA22/B09-57-AZ1508顯示出更高的暴露量和延長的t½，這表明在較低親和力的RAA22/B09-57-AZ1508中PK得到改善。 7.1 臨床前 PK 測定的生物分析
目標化合物（QD6/B09-57-AZ1508和RAA22/B09-57-AZ1508）濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。易言之，將多株抗人抗體與磁珠軛合。然後將25 µL血漿樣本在PBS中稀釋並與磁珠一起孵育。捕獲後，磁珠經過多次洗滌，然後在內標存在下用胰蛋白酶消化。藉由添加酸來淬滅該消化。然後將液體內容物轉移至注射板。
使用逆相層析（RPLC）分離人抗體Fc區和裂解彈頭上的特徵性胰蛋白酶肽，然後使用多重反應監測（MRM）進行檢測。Fc區上的特徵性肽用於計算總Ab，而消化釋放的彈頭用於計算ADC。本實驗中使用的內標係同位素標記的肽或蛋白質（SiluMAb，西格瑪奧德里奇公司（Sigma-Aldrich））或同位素標記的彈頭。分析物與內標的峰面積比用於計算標準曲線。
藉由將不同水平的目標化合物摻加到與樣本相同的基質中來製作標準曲線和QC。定量範圍覆蓋100 ng/mL-15,000 ng/mL，稀釋QC覆蓋高達525,000 ng/mL。用最簡單的可能模型擬合標準曲線。除定量下限（LLOQ）為25%外，所有水平的測定準確度和精密度均在20%以內。 7.2 小鼠中的 QD6/B09-57-AZ1508 PK
包括在NCA分析中的小鼠研究總結在 表 4中。 [ 表 4] RAA22/B09-57-AZ1508 和 QD6/B09-57-AZ1508 的小鼠研究列表
研究 研究標題 研究設計
03-EGFR cMET-ADC-PK -15-003- A cMET-EGFR-AZ1508在裸鼠體內的藥物動力學研究 （QD6/B09-57-AZ1508） 單次IV劑量為1、3、5和10 mg/kg；在0.5、4、24、48、72、144和240小時收集血漿；ADC和總Ab的LC-MS/MS分析
RAA22/B09-AZ1508小鼠PK研究 - 2016年10月 cMET-EGFR DuetMAb RAA22/B09-AZ1508在裸鼠體內的藥物動力學研究 單次IV劑量為0.5、1、3、5和10 mg/kg；在0.5小時、4小時、1天、2天、3天、6天、10天和14天收集血漿；ADC和總Ab的LC-MS/MS分析
RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在小鼠中的平均PK濃度-時間曲線在 圖 12中顯示。
在測試的劑量水平下，RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在小鼠中都表現出線性PK，在0.5 mg/kg至10 mg/kg的RAA22/B09-57-AZ1508和1 mg/kg至10 mg/kg的QD6/B09-57-AZ1508中分別觀察到與劑量成比例的暴露（C max和AUC），可比較的CL和t 1/2。
RAA22/B09-57-AZ1508與QD6/B09-57-AZ1508之間的PK比較在針對兩種化合物測試的1、3、5、10 mg/kg劑量水平下評估，並且基於NCA的平均PK參數總結於 表 5中。結果表明，RAA22/B09-57-AZ1508的CL較慢、暴露較高並且t 1/2延長，其中RAA22/B09-57-AZ1508的平均AUC與QD6/B09-57-AZ1508相比顯示出2至2.91倍的增加；RAA22/B09-57-AZ1508的平均t 1/2為4.24至6.38天，QD6/B09-57-AZ1508為2.57至3.33天，表示RAA22/B09-57-AZ1508的t 1/2增加1.27至2.32倍。 [ 表 5] 小鼠中 RAA22/B09-57-AZ1508 與 QD6/B09-57-AZ1508 之間劑量水平的平均 NCA PK 參數
劑量（ mg/kg ） 1 mg/kg 3 mg/kg 5 mg/kg 10 mg/kg
分子 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508
C 最大 （ mg/mL ） 12.8 11.3 51.1 31.0 90.7 44.8 198 134
AUC （ mg* 天 /mL ） 41.0 20.5 136 57.5 230 87.9 494 170
t½ （天） 5.97 2.57 4.24 3.33 6.38 3.28 5.31 2.95
CL （ mL/kg/ 天） 20.8 45.7 20.0 46.9 18.5 50.8 17.3 53.8
7.3 石蟹獼猴中的 QD6/B09-57-AZ1508 PK
NCA分析中包括的石蟹獼猴研究總結在 表 6中。 [ 表 6] RAA22/B09-57-AZ1508 和 QD6/B09-57-AZ1508 的石蟹獼猴研究列表
研究 研究標題 研究設計
20102256 RAA22/B09-Maia-AZ1508：評價石蟹獼猴安全性和藥物動力學的靜脈重複劑量毒性研究 IV推注Q3 Wk x 2
20067678 石蟹獼猴靜脈推注EGFR cMET的8週劑量範圍發現研究 IV推注Q3 Wk x 3
20067312 在石蟹獼猴中藉由靜脈途徑的8週單次遞增劑量的 EGFRcMet-ADC（EGFRcMet-1508） 單次遞增IV給藥
RAA22/B09-57-AZ1508和QD6/B09-57-AZ1508在石蟹獼猴中的平均PK濃度-時間曲線在 圖 13中顯示。
RAA22/B09-57-AZ1508在石蟹獼猴中在2 mg/kg至5 mg/kg下表現出線性PK，其中觀察到與劑量成比例的暴露（C max和AUC），可比較的CL和t 1/2。
QD6/B09-57-AZ1508在石蟹獼猴中表現出0.67 mg/kg至3 mg/kg的非線性PK，顯示出超過劑量比例的暴露（C max和AUC），並且在較低劑量水平下觀察到較快的CL和較短的t 1/2。
石蟹獼猴中RAA22/B09-57-AZ1508與QD6/B09-57-AZ1508之間的PK比較在針對兩種化合物測試的2和3 mg/kg劑量水平下評估，並且基於NCA的平均PK參數總結於 表 7中。結果表明，RAA22/B09-57-AZ1508的CL較慢、暴露較高並且t 1/2延長，其中RAA22/B09-57-AZ1508的平均AUC與QD6/B09-57-AZ1508相比顯示出1.90至2.43倍的增加；RAA22/B09-57-AZ1508的平均t 1/2為4.30至5.90天，QD6/B09-57-AZ1508為0.969至1.07天，表示RAA22/B09-57-AZ1508的t 1/2增加4.44至5.51倍。 [ 表 7] 猴中 RAA22/B09-57-AZ1508 與 QD6/B09-57-AZ1508 之間劑量水平的平均 NCA PK 參數
劑量（ mg/kg ） 2 mg/kg 3 mg/kg
分子 RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508 * RAA22/B09-57-AZ1508 QD6/B09-57-AZ1508
C 最大 （ mg/mL ） 59.1 47.5 86.6 73.3
AUC （ mg* 天 /mL ） 116 47.6 179 94.4
t½ （天） 5.90 1.07 4.30 0.969
CL （ mL/kg/ 天） 16.7 42.2 16.5 31.6
總之，該等數據表明，在小鼠和石蟹獼猴中，與高親和力QD6/B09-57-AZ1508相比，低親和力RAA22/B09-57-AZ1508顯示出更高的暴露和更長的循環半衰期。該等數據與以下假設一致，即降低對EGFR的親和力會降低與正常組織中存在的EGFR的結合，從而減輕正常組織吸收的影響並改善血漿PK參數。 實例 8 - 用拓樸異構酶 I 抑制劑作為有效載荷的 ADC
設計了一項實驗來測試與不同有效載荷（拓樸異構酶I抑制劑而不是先前實例中使用的微管溶素）軛合的RAA22/B09-57雙特異性分子的功效和安全性。
將根據實例1產生的DuetMab RAA22/B09（在絲胺酸239後具有「Maia」半胱胺酸插入）雙特異性抗體藉由與雙特異性抗體中的天然半胱胺酸「經典」軛合而與拓樸異構酶抑制劑SG3932軛合。
使用PDX試驗研究了EGFR/cMET拓樸異構酶I抑制劑ADC的功效。PDX試驗基本上如以上實例5所述使用從胰臟癌，大腸癌，NSCLC和鱗狀頭頸癌（SQHN）腫瘤中獲得的各種不同PDX模型進行。給動物注射10 mg/kg的單劑量EGFR-cMET Maia Topo ADC。使用EGFR-cMET Maia Topo ADC的PDX試驗結果報告在 圖 14中。
如 圖 14所示，EGFR-cMET Maia Topo ADC在許多測試的PDX模型中誘導腫瘤生長抑制或消退。因此，該等結果證明含有拓樸異構酶I抑制劑的RAA22/B09-57ADC在代表多種腫瘤類型的PDX模型中係有效的。 實例 9 - 改善 ADC 的 PK 的突變
在實例8中產生和測試的具有拓樸異構酶I抑制劑的ADC使用含有絲胺酸239後的「Maia」半胱胺酸插入的RAA22/B09雙特異性抗體。然而，鑒於SG3932與天然半胱胺酸軛合，Maia半胱胺酸插入不是必需的。因此，我們試圖修飾在實例8中產生的RAA22/B09 Maia Topo ADC，以除去這種半胱胺酸插入。
還認識到，如果Fc主鏈的效應子功能降低或除去，則可能減輕免疫毒性並改善藥物動力學。因此，我們還引入了L234F/L235E/P331S（EU編號）的「三重突變體（TM）」，其先前已被證明可以降低抗體分子中的Fc效應子功能（Organesyan, 2008；Hay, 2016）。
新產生的「EGFR-cMET TM」分子，包含來自RAA22和B09的可變區，除去了239i突變並引入了TM，具有下表中所示的胺基酸序列：
   EGFR-cMET TM
EGFR重鏈 59
c-Met重鏈 60
EGFR輕鏈 61
c-Met輕鏈 62
為了與SG3932軛合，將50 mM三(2-羧乙基)膦（TCEP）的磷酸鹽緩衝液pH 7.4（PBS）溶液（12.5莫耳當量/抗體）添加到EGFR-cMET TM雙特異性抗體的含有PBS和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的還原緩衝液溶液中，並且最終抗體濃度為約3 mg/mL。使還原混合物在37°C下在溫和（60 rpm）振盪的定軌振盪器中孵育2小時。使反應混合物冷卻至室溫45分鐘。然後將SG3932作為DMSO溶液（12.5莫耳當量/抗體）添加，最終DMSO濃度為10%（ v/v）。將溶液在室溫下孵育2小時，然後藉由添加 N-乙醯基半胱胺酸（5微莫耳/SG3932）淬滅，並在室溫下孵育15分鐘。反應混合物使用0.2 uM無菌過濾器過濾，然後在2°C-8°C下儲存過夜。藉由切向流過濾單元（TFF），使用表面積為375 cm 2的mPES、MidiKros® 30 kDa纖維過濾器去除到含有30 mm組胺酸、30 mM精胺酸、pH 6.8的緩衝液中。使用純軛合物藉由UHPLC-RP監測游離藥物去除的程度。在完全除去游離藥物後，對ADC進行緩衝液更換。在無菌氣氛下使用0.22 µm過濾器過濾ADC，然後添加聚山梨醇酯-80至0.02%（w/v）的最終濃度。
在Shimadzu Recience系統上使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm × 2.1 mm柱在214 nm和330 nm（SG3932特異性）下用水和乙腈對ADC還原樣本進行梯度洗脫的UHPLC分析揭示了每抗體6.0個SG3932分子的藥物/抗體比率（DAR）。
使用PDX試驗研究了EGFR cMET TM ADC的功效。PDX試驗基本上如以上實例5所述使用從胰臟癌，大腸癌，NSCLC和SQHN腫瘤中獲得的一系列不同PDX模型進行。給動物注射5 mg/kg的單劑量EGFR-cMET TM ADC。使用EGFR-cMET TM ADC的PDX試驗結果報告在 圖 15中。該實驗的結果證明，EGFR-cMET TM ADC能夠在許多測試的PDX模型中誘導腫瘤生長抑制或消退。
將EGFR-cMET TM ADC（「TM ADC」）與PDX模型SQHN-02和PANC-08中實例8中產生的EGFR-cMET Maia Topo ADC（「Maia ADC」）的功效進行了比較。給動物投與2.5 mg/kg、5 mg/kg或10 mg/kg的每種ADC並監測腫瘤生長。該實驗還包括未處理的對照（「未處理的」）和用未軛合的EGFR-cMET TM（TM mAb）給藥的動物。結果顯示在 圖 16中。
結果證明，EGFR-cMET TM ADC和EGFR-cMET Maia Topo ADC在所測試的劑量範圍下在減少腫瘤生長/誘導腫瘤消退方面同樣有效（「等效」）。這表明使用三重突變體去除S239i突變和消除Fc效應子功能不會負面影響該等腫瘤模型中的功效。
EGFR-cMET TM ADC還顯示可有效減少表現野生型或突變型EGFR的NSCLC腫瘤的生長。結果表明，EGFR-cMET TM ADC在野生型和突變型EGFR PDX模型中均具有活性，如 圖 17所示。這係有利的，因為這表明ADC將能夠在多種治療環境中和在一系列不同EGFR基因型中提供益處。
此外，在NOD-SCID小鼠中進行藥物動力學（PK）研究，以比較實例8中產生的EGFR-cMET TM ADC（「TM ADC」）和EGFR-cMET Maia Topo ADC（「Maia ADC」）。實驗基本上如實例7所述進行。
該等PK研究的代表性結果在 圖 18中提供。如該圖所報告，當與EGFR-cMET Maia Topo ADC（t ½= 3.0 天；CL = 39.7 ml/天/kg）相比時，EGFR-cMET TM ADC展現出較長的半衰期（t ½= 5.0 天）以及降低的藥物清除率（CL = 14.8 ml/天/kg）。因此，結果表示，與實例7中產生的EGFR-cMET Maia Topo ADC相比，此處描述的EGFR-cMET TM ADC顯示出改善的PK。當比較未軛合的EGFR-cMET TM抗體（「TM mAb」）和未軛合的EGFR-cMET Maia（「Maia ADC」）時，也觀察到PK的類似改善。 實例 10 - ADC 與奧希替尼組合的功效
該實例使用PDX試驗比較了ADC與第三代酪胺酸激酶抑制劑TKI奧希替尼（「Osi」）在各種EGFR突變型腫瘤模型中的功效。 5.1 方法
在Champions Oncology（無胸腺Foxn1nu裸鼠）和Genendesign（Balb/C裸鼠）對免疫功能受損的小鼠或攜帶患者來源的異種移植物（PDX）進行了臨床前功效研究。所有研究均符合阿斯利康動物護理和福利全球標準。模型係從活的人類腫瘤組織或流體中建立的，並且已經在動物中連續傳代了有限的次數以維持腫瘤異質性。將從宿主動物收穫腫瘤片段單側植入小鼠的側腹，每個片段都從特定的傳代批次植入。在其估計開始日期之前約一週開始記錄研究前腫瘤體積。當腫瘤達到適當的初始腫瘤體積（TVI）範圍（150-300 mm 3）時，將動物隨機分為治療組和對照組。
治療 - 接受實例9中所述之EGFR-cMET Top1i抗體藥物軛合物（ADC）或對照EGFR-cMET mAb的動物在第0天以指示的劑量水平投與單次靜脈內（IV）劑量；按重量計IV給藥動物（以5 ml/kg的劑量體積）。從第0天開始，奧希替尼治療組中的動物在媒介物（0.5% w/v HPMC（羥丙基甲基纖維素）在去離子水中）中以2.5 mg/ml接受在口服給藥溶液中配製的藥物；以10 mL/kg的給藥體積按重量計口服給藥動物，以達到25 mg/kg的最終劑量水平。奧希替尼治療的動物在研究的前21天每天給藥。組合治療組中的動物接受EGFR-cMET ADC和奧希替尼兩者，每種治療根據以上所述之單一療法給藥時間表投與。在整個研究過程中對所有動物進行單獨隨訪。
腫瘤生長抑制 - 從第0天開始，藉由數位卡尺每週測量兩次腫瘤尺寸，並記錄每組的包括個體和平均估計腫瘤體積（平均TV ± SEM）的數據；使用公式 (1) 計算腫瘤體積：TV = 寬度 2× 長度 × 0.52。在研究結束時，使用式 (2) 的初始（i）和最終（f）腫瘤測量值計算並報告每個治療組（T）與對照組（C）的腫瘤生長抑制百分比（%TGI）值：%TGI = 1 - （Tf-Ti）/（Cf-Ci）。報告兩次連續測量的腫瘤體積小於或等於第0天測量值的30%的個體小鼠被認為是部分緩解者（PR）。缺乏可觸及的腫瘤的個體小鼠（兩次連續測量值為0.00 mm³）被分類為完全緩解者（CR）；持續到研究完成的CR被認為是無腫瘤倖存者（TFS）。使用式DT = （Df - Di）* log2 /（logTVf - logTVi）確定媒介物治療組的腫瘤倍增時間（DT），其中D = 天以及TV = 腫瘤體積。在未處理的對照組中進行腫瘤生長觀察，直到該組（未經刪失）的平均腫瘤體積達到1500 mm 3的人道終點，或直到第60天，以先到者為準。進行治療組的腫瘤生長觀察直到第60天；如果治療組中個體小鼠的腫瘤達到1500 mm 3的人道終點，則對動物實施安樂死，並繼續觀察其他治療動物。對一些表現出持續響應的動物的觀察超過60天。 結果
結果在 圖 19-21中提供。
圖 19A 和 19C示出了含有代表一線EGFRm非小細胞肺癌（NSCLC）的EGFR L858R突變的EGFR突變型模型「LUN487」和「LUN439」的結果。EGFR-cMET TM ADC以2、4和8 MPK（mg/kg）給藥。一組還以8 mPK的僅mAb對照（EGFR-cMET mAb）或以25 MPK的僅奧希替尼給藥。結果顯示EGFR-cMET TM ADC單一療法表現出劑量依賴性響應。PDX模型對奧希替尼有響應。對於僅mAb的對照組未觀察到治療響應。
圖 19B 和 19D示出了EGFR突變型模型「LUN487」和「LUN439」的結果，其中EGFR-cMET TM ADC以2或4 MPK單獨給藥或與奧希替尼（25 MPK）組合給藥。EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼的組合與單獨投與的任一種藥物（EGFR-cMET TM ADC或奧希替尼）相比，顯示出改善的腫瘤生長抑制。
圖 20A示出了含有代表對奧希替尼的原發性抗性的外顯子20插入EGFR突變型模型「CTG-2992」的結果。EGFR-cMET TM ADC以2、4和8 MPK（mg/kg）給藥。一組還以8 mPK的僅mAb對照（EGFR-cMET mAb）或以25 MPK的僅奧希替尼給藥。結果顯示EGFR-cMET TM ADC單一療法表現出劑量依賴性響應。PDX模型對奧希替尼有響應。
圖 20B示出了EGFR突變型模型「CTG-2992」的結果，其中將EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼組合投與。EGFR-cMET TM ADC以2或4 MPK給藥。EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼的組合與單獨投與的任一種藥物（EGFR-cMET TM ADC或奧希替尼）相比，顯示出改善的腫瘤生長抑制。
圖 21A示出了代表對奧希替尼的後天性抗性的EGFR突變型模型「CTG-2803」的結果。EGFR-cMET TM ADC以2、4和8 MPK（mg/kg）給藥。一組還以8 mPK的僅mAb對照（EGFR-cMET mAb）或以25 MPK的僅奧希替尼給藥。結果顯示EGFR-cMET TM ADC單一療法表現出劑量依賴性響應。PDX模型對奧希替尼或僅mAb單一療法沒有響應。
圖 21B示出了EGFR突變型模型「CTG-2803」的結果，其中將EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼組合投與。EGFR-cMET TM ADC以2或4 MPK給藥。EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼的組合與單獨投與的任一種藥物（EGFR-cMET TM ADC或奧希替尼）相比，顯示出改善的腫瘤生長抑制。
總之，該等結果表明，EGFR-cMET TM ADC和奧希替尼的組合在一系列EGFR突變型癌症（包括被歸類為奧希替尼抗性的那些）中顯示出功效。 實例 11 - EGFRmut NSCLC PDX 對 ADC 與奧希替尼組合的響應
該實例旨在進一步評估奧希替尼和EGFR-cMET TM ADC在具有突變型EGFR的NSCLC PDX模型中的組合功效。招募了另外的涵蓋各種EGFR突變的23個NSCLC PDX模型。研究主要按照實例10的章節5.1中所述之進行。
將每個PDX的小鼠通常分為三組，每天接受奧希替尼25 mg/kg、EGFR-cMET TM ADC 2 mg/kg或每天奧希替尼25 mg/kg和EGFR-cMET TM ADC 2 mg/kg，持續21天。用劑量為8 mg/kg的同種型ADC R347對照和/或劑量為8 mg/kg的裸EGFR-cMET TM mAb對照進行實驗。
圖22A、22B和22C示出了三個治療組中之每一個的模型中之每一個的響應。
結果顯示，組合組的14/23（61%）模型觀察到響應，而奧希替尼和EGFR-cMET TM ADC單一療法組在8/23（34.8%）和7/23（30.4%）模型中分別顯示出響應率。響應定義為腫瘤體積較基線消退30%。從給藥後一週開始分析消退。報告的值係在研究期間觀察到的最佳響應。
下表提供了更詳細的響應數據以及關於EGFR突變狀態的資訊。 [表9]顯示了每個模型的每個研究組的最佳總體響應（R表示響應，NR表示沒有響應）。%變化表示與基線相比腫瘤體積的變化。
模型 奧希替尼 響應 ADC 響應 組合 響應 EGFRmut
CTG-0743 52% NR 140% NR -1% NR A1158V
CTG-1212 18% NR 57% NR 14% NR Ex19del，T790M
CTG-1342 92% NR 68% NR 23% NR R521K
CTG-1612 3% NR -3% NR 2% NR R521K
CTG-2405 -31% R -16% NR -38% R L858R，A289V
CTG-2531 -77% R 35% NR -80% R Ex19del
CTG-2534 -45% R 7% NR -58% R G719C，S768I
CTG-2535 -15% NR 34% NR -56% R Ex19del
CTG-2537 -95% R -35% R -85% R L858R，T790M
CTG-2548 -93% R -62% R -86% R L858R，多種不常見的
CTG-2790 -93% R -79% R -91% R Ex19del
CTG-2839 -20% NR -13% NR -48% R Ex19del
CTG-3160 -74% R 3% NR -73% R Ex19del
CTG-3192 9% NR -100% R 19% NR Ex19del
CTG-3196 -24% NR 43% NR -10% NR L858R
CTG-3213 118% NR 140% NR 12% NR R1068L
CTG-3271 -72% R -65% R -60% R Ex19del，T790M
CTG-3320 102% NR -66% R -74% R Ex19del
CTG-3414 186% NR -22% NR -65% R Ex19del，T790M
CTG-3470 -16% NR 37% NR -7% NR Ex19del
CTG-3475 72% NR -33% R -32% R L858R
CTG-3477 64% NR 184% NR 15% NR Ex19del，T790M
CTG-3543 56% NR 51% NR -81% R Ex19del
參考文獻
上文引用了許多出版物以便更全面地描述和揭露本揭露以及本揭露所屬領域的技術水平。下面提供了該等參考文獻的完整引用。將該等參考文獻中之每一篇參考文獻的全文併入本文。
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序列 低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的 CDR 序列 HCDR1 - DNDFS（SEQ ID NO: 1） HCDR2 - AIVAVFRTETYAQKFQD（SEQ ID NO: 2） HCDR3 - RLMSAISGPGAPLLM（SEQ ID NO: 3） LCDR1 - TGTSSDVGGYNYVS（SEQ ID NO: 4） LCDR2 - DVSKRPS（SEQ ID NO: 5） LCDR3 - SSYTSSDTLEI（SEQ ID NO: 6） 高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的 CDR 序列 HCDR1 - DNDFS（SEQ ID NO: 1） HCDR2 - AIVAVVRTETYAQKFQD（SEQ ID NO: 7） HCDR3 - RLMSAISGPGAPLLM（SEQ ID NO: 3） LCDR1 - TGTSSDVGGYNYVS（SEQ ID NO: 4） LCDR2 - DVSERPS（SEQ ID NO: 66） LCDR3 - FSYTSSDTLEI（SEQ ID NO: 67） 抗 EGFR 結合組 RAA22 和 QD6 的 FR 序列 HFR1 - QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFS（SEQ ID NO: 8） HFR2 - WVRQAPGQGLEWMG（SEQ ID NO: 9） HFR3 - RVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCAR（SEQ ID NO: 10） HFR4 - WGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 11） LFR1 - QSALTQPRSVSGSPGQSVTISC（SEQ ID NO: 12） LFR2 - WYQQHPGKAPKLMIY（SEQ ID NO: 13） LFR3 - GVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYC（SEQ ID NO: 14） LFR4 - FGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 15） 低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的可變重（ VH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 16 ） QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSS 低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 17 ）： CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGACAACGACTTTAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGCCATCGTGGCCGTGTTCCGGACAGAGACATACGCCCAGAAATTCCAGGACAGAGTGAAAATCACCGCCGACATCAGCACCAGAACCACCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGCTGATGTCTGCCATCTCTGGACCTGGCGCTCCTCTGCTCATGTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCCAGC 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 18 ）： QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSS 抗 EGFR 抗體殖株 QD6 的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 19 ）： CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCCGAAGTGAAGAAACCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGTAAAGCCAGCGGCGGCACCTTCAGCGACAACGACTTTAGCTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAGGGCCTGGAATGGATGGGAGCCATCGTGGCCGTGGTCCGGACAGAGACATACGCCCAGAAATTCCAGGACAGAGTGAAAATCACCGCCGACATCAGCACCAGAACCACCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGACGGCTGATGTCTGCCATCTCTGGACCTGGCGCTCCTCTGCTCATGTGGGGACAGGGAACACTGGTCACCGTGTCCAGC 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的可變輕鏈（ VL ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 20 ）： QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVL 抗 EGFR 抗體殖株 RAA22 的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 21 ）： CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCAGTTCATATACAAGCAGCGACACTCTCGAAATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的 VL 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 22 ）： QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTSSDTLEIFGGGTKLTVL 高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 23 ）： CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTCGCTCAGTGTCCGGGTCTCCTGGACAGTCAGTCACCATCTCCTGCACTGGAACCAGCAGTGATGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCAAAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTGAACGGCCCTCAGGGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCTTCTCATATACAAGCAGCGACACTCTCGAAATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA 抗 cMet 結合組 B09-GL 的 CDR 序列 HCDR1 - DYYIH（SEQ ID NO: 24） HCDR2 - WMNPNSGNTGYAQKFQG（SEQ ID NO: 25） HCDR3 - GQGYTHS（SEQ ID NO: 26） LCDR1 - RASEGIYHWLA（SEQ ID NO: 27） LCDR2 - KASSLAS（SEQ ID NO: 28） LCDR3 - QQYSNYPPT（SEQ ID NO: 29） 抗 cMet 結合組 B09-GL 的 FR 序列 HFR1 - QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT（SEQ ID NO: 30） HFR2 - WVRQATGQGLEWMG（SEQ ID NO: 31） HFR3 - RVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR（SEQ ID NO: 32） HFR4 - WGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 33） LFR1 - DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITC（SEQ ID NO: 34） LFR2 - WYQQKPGKAPKLLIY（SEQ ID NO: 35） LFR3 - GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYC（SEQ ID NO: 36） LFR4 - FGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 37） 抗 cMet 結合組 B09-GL 的可變重（ VH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 38 ）： QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSS 抗 cMet 結合組 B09-GL 的 VH 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 39 ）： CAAGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCAGCGTGAAGGTCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGACTACTACATCCACTGGGTCCGCCAGGCCACAGGCCAGGGACTGGAATGGA TGGGCTGGATGAACCCCAACAGCGGCAACACCGGCTACGCCCAGAAATTCCAGGGCAGAGTGACCATGACCCGGGACACCAGCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGAGGCCAGGGCTACACCCACAGCTGGGGCCAGGGCACCATGGTCACAGTGTCCAGC 抗 cMet 結合組 B09-GL 的可變輕（ VL ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 40 ）： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIK 抗 cMet 結合組 B09-GL 的 VL 區的核酸序列（ SEQ ID NO: 41 ）： GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCACCCTGAGCGCCAGCGTCGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCGAGGGCATCTACCACTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACAAGGCCAGCAGCCTGGCCAGCGGAGTCCCTAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGAGTTC ACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAGCAACTACCCCCCCACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG 人免疫球蛋白 G1 重鏈恒定（ CH ）區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 42 ）： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「杵」突變、鏈間半胱胺酸突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵並且具有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 43 ）： 以下取代標有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS VDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CREEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 經修飾以包括「杵」突變、鏈間半胱胺酸突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵並且沒有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 44 ）： 以下取代標有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；以及穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV CPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS VDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CREEMTKNQVSL WCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵並且具有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 45 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵並且沒有半胱胺酸插入的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 46 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 野生型人免疫球蛋白 κ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 47 ）： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 經修飾以包括 S121C 和 C214V 取代的人免疫球蛋白 κ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 48 ）： 以下取代標有底線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 RTVAAPSVFIFPP C DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE V 人免疫球蛋白 λ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 49 ）： GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLT PEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 具有半胱胺酸插入的抗 cMet 結合組 B09-GL 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 50 ）： 以下取代標有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 不具有半胱胺酸插入的抗 cMet 結合組 B09-GL 的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 51 ）： 以下取代標有底線： 「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；以及穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTM TRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 抗 cMet 結合組 B09-GL 的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 52 ）： 以下取代標有底線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP C DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGE V 具有半胱胺酸插入的高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 53 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITA DISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVS L S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 不具有半胱胺酸插入的高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 54 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVVRTETYAQKFQDRVKITA DISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK 高親和力抗 EGFR 結合組（ QD6 ）的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 55 ）： QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSERPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCFSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 具有半胱胺酸插入的低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 56 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；穩定化半胱胺酸突變（Y349C）；以及半胱胺酸插入（C239i），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK 不具有半胱胺酸插入的低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 57 ）： 以下取代標有底線： 「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS C VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK 低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 58 ）： QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS 具有三重突變（ TM ）的低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 59 ）： 以下取代標有底線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDNDFSWVRQAPGQGLEWMGAIVAVFRTETYAQKFQDRVKITADISTRTTYMELSSLRSEDTAVYYCARRLMSAISGPGAPLLMWGQGTLVTVSSASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKS V DKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 具有三重突變（ TM ）的抗 cMet 結合組的重鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 60 ）： 以下取代標有底線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTM TRDTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGQGYTHSWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGK 在「 EGFR-cMET TM 」抗體中的低親和力抗 EGFR 結合組（ RAA22 ）的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 61 ）： 以下取代標有底線： S121C和C214V，其中編號根據EU索引 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSDTLEIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPP C SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTV AWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE V S 在「 EGFR-cMET TM 」抗體中的抗 cMet 結合組的輕鏈的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 62 ）： DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASEGIYHWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYSNYPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 經修飾以包括「杵」突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵、沒有半胱胺酸插入並且具有 TM 的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 63 ）： 以下取代標有底線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「杵」突變（T366W）；鏈間半胱胺酸突變（F126C和C219V）；穩定化半胱胺酸突變（S354C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSV C PLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKS V DKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQVYTLPP C REEMTKNQVSL W CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括「臼」突變、半胱胺酸以形成穩定化雙硫鍵、沒有半胱胺酸插入並且具有 TM 的人免疫球蛋白 G1 CH 區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 64 ）： 以下取代標有底線： 三重突變（TM；L234F、L235E和P331S）；「臼」突變（T366S、L368A和Y407V）；以及穩定化半胱胺酸突變（Y349C），其中殘基的編號根據EU索引。 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPE FE GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA S IEKTISKAKGQPREPQV C TLPPSREEMTKNQVSL S C A VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL V SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 經修飾以包括 S121C 和 C214V 取代的人免疫球蛋白 λ 恒定區的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 65 ）： GQPKAAPSVTLFPP C SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTE V S 人 EGFR 細胞外結構域的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 68 ）： LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSDFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDC LVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEE DGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKT VKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHP NCTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPS 石蟹獼猴 EGFR 細胞外結構域的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 69 ）： LEEKKVCQGTSNKLTQLGTFEDHFLSLQRMFNNCEVVLGNLEITYVQRNYDLSFLKTIQEVAGYVLIALNTVERIPLENLQIIRGNMYYENSYALAVLSNYDANKTGLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPALCNVESIQWRDIVSSEFLSNMSMDFQNHLGSCQKCDPSCPNGSCWGAGEENCQKLTKIICAQQCSGRCRGKSPSDCCHNQCAAGCTGPRESDC LVCRKFRDEATCKDTCPPLMLYNPTTYQMDVNPEGKYSFGATCVKKCPRNYVVTDHGSCVRACGADSYEMEE DGVRKCKKCEGPCRKVCNGIGIGEFKDTLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQELDILKT VKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSSQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCQNVSRGRECVDKCNILEGEPREFVENSECIQCHPECLPQVMNITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPN CTYGCTGPGLEGCARNGPKIPS 人 cMET 細胞外結構域的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 70 ）： ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNF LLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNF TVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT 石蟹獼猴 cMET 細胞外結構域的胺基酸序列（ SEQ ID NO: 71 ）： ECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETAIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPNQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPHHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYIH AFESNNFIYFLTVQRETLNAQTFHTRIIRFCSLNSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRAEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFVKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHPLNQNGYTLVVTGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECPSGTWTQQICLPAIYKVFPTSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPIITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLHSVSVPRMVINVHEAGRNFT VACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGN DIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFT
無
現在將參考附圖來討論說明本揭露原理的實例和實驗，其中：
[ 圖 1A]. RAA22/B09-57 DuetMab的圖形描述。所示的是抗EGFR RAA22的Fab、抗cMET B09-57的Fab以及臼（Hole）和杵（Knob）重鏈。結構繪製係單個結構域結構的合成。
[ 圖 1B]. QD6/B09-57 DuetMab的圖形描述。所示的是抗EGFR QD6的Fab、抗cMET B09-57的Fab以及臼（Hole）和杵（Knob）重鏈。結構繪製係單個結構域結構的合成。
[ 圖 2].藉由Octet分析進行使用抗原捕獲形式的同時結合研究。負載有人cMET抗原的感測器首先與抗體然後與人EGFR抗原進行連續的締合和解離相互作用。Ass=締合；Diss=解離；NI-NTA=鎳-氮基三乙酸。
[ 圖 3A]. ELISA結果顯示EGFR和cMet物種交叉反應性。與人、石蟹獼猴和小鼠EGFR結合的高親和力單特異性EGFR IgG QD6以及一價雙特異性EGFR/cMET DuetMAb QD6/B09。親和力降低的單特異性EGFR IgG RAA22與QD6和相應的一價雙特異性EGFR/c-Met DuetMAb RAA22/B09相比與人、石蟹獼猴和小鼠EGFR的結合更弱，顯示出相對於二價親本IgG RAA22與人和石蟹獼猴EGFR的結合仍然較弱，並且顯示出與小鼠EGFR的標稱結合。單特異性c-Met IgG B09以及所有雙特異性變體顯示與人和石蟹獼猴c-Met相當的結合，但與小鼠c-Met沒有可檢測的結合。
[ 圖 3B] ELISA結果顯示EGFR和cMet家族特異性。所測試的抗體均未顯示出與任何EGFR HER家族蛋白（HER2、HER3或HER4）或任何c-Met家族成員（Ron（CD136）或Semaphorin 3a）的任何可感知的結合。
[ 圖 4A] .QD6/B09 DuetMab及其各自的單組對照抗體的內化曲線。藉由每個構建體各自的膜和細胞質訊息的時間進程顯示內化曲線。QD6/B09組係使用Opera共聚焦螢光顯微鏡獲得的。
[ 圖 4B]. RAA22/B09 DuetMab及其各自的單組對照抗體的內化曲線。藉由每個構建體各自的膜和細胞質訊息的時間進程顯示內化曲線。使用Zeiss旋轉盤共聚焦螢光顯微鏡獲得該組。
QD6/B09和QD6/IgG的相同曲線圖表明QD6/B09 DuetMab的EGFR-組驅動的內化模式，而RAA22/B09 DuetMab需要EGFR和c-MET組的接合以有效內化。
[ 圖 5A]. RAA22/B09-AZD1508 ADC在表現中等和高靶標c-MET和EGFR細胞表面受體的細胞中的內化曲線。所示的是H1975細胞中RAA22/B09-AF647 ADC的膜、細胞質和總訊息。示出了2的一個代表性實驗。H1975細胞顯示總強度和細胞膜強度的同時下降，表明抗體從細胞表面解離。
[ 圖 5B]等同於圖8A，但在HCC827細胞中。HCC827細胞在整個實驗時間過程中具有穩定的總訊息。膜訊息的降低係衍生的抗體內化。
[ 圖 6A]. RAA22/B09-AZD1508 ADC單臂對照抗體在HCC827細胞中的內化。由於藉由單組結合與EGFR的結合較弱，RAA22/IgG單組的強度曲線比RAA22/B09低約10倍。
[ 圖 6B] B09/IgG單組與細胞膜解離，表現為總訊息和膜訊息隨時間同時下降。
[ 圖 7]. 分析各個抗體組對雙特異性ADC的細胞毒性活性的相對貢獻。NCI H1975細胞用過量的未設組親本抗體預處理以阻斷EGFR或cMET。接著，將EGFR-cMET ADC（RAA22/B09-AZ1508）以4X系列稀釋系列添加到細胞中，最終濃度為67 nM至0.0009 nM。將經處理的細胞在加濕培養箱中在37°C和5% CO 2下培養72小時。使用CellTiter-Glo發光活力測定（普洛麥格公司）測定代謝活性。將數據繪製為相對於未處理對照的代謝活性百分比。使用GraphPad Prism軟體，使用最大活力（未處理的細胞）與最大響應（峰抑制）之間的邏輯非線性迴歸分析來確定IC50值。
[ 圖 8]. 進一步評估各個抗體組對雙特異性ADC的活性。藉由將每個結合組與非結合同種型對照組（R347）配對以產生EGFR ADC（RAA22/R347-AZ1508）和抗cMET ADC（B09/R347-AZ1508）來構建單特異性一價ADC。將ADC以4X系列稀釋系列添加到NCI H1975細胞中，最終濃度為67 nM至0.0009 nM。如圖7所述確定代謝活性百分比。
[ 圖 9A]. 進行小鼠PDX試驗以確定高親和力（QD6/B09-AZ1508）和低親和力（RAA22/B09-AZ1508）EGFR-cMET ADC在免疫缺乏小鼠中的大量人類癌症患者來源的異種移植物（PDX）模型中的功效。對於代表不同人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以3 mg/kg的單劑量水平測試每種化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C），並計算顯示與初始腫瘤體積相比尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比。(A) 示出了每個模型中的高親和力和低親和力ADC的直接比較，並且
[ 圖 9B]示出了高親和力ADC的以功效等級排序的瀑布圖。
[ 圖 9C]示出了低親和力ADC的以功效等級排序的瀑布圖。
[ 圖 10]. PDX模型中的劑量範圍發現體內功效研究在單側植入從宿主動物採集的腫瘤片段的無胸腺裸鼠中進行。如圖中所示，在1和2 mg/kg的劑量水平下測試高親和力EGFR-cMET ADC、QD6/B09-AZ1508，並且在1、2和3 mg/kg下測試對EGFR具有較低的親和力的變體RAA22/B09-AZ1508。在開始給藥後每週兩次進行腫瘤體積測量，並繪製為腫瘤體積隨時間變化的線圖。誤差槓代表平均值的標準誤差（SEM），插圖示出了每個模型的EGFR和cMET的免疫組織化學染色，其來自取自該模型早期傳代的腫瘤組織。
[ 圖 11A] EGFR-cMET雙特異性ADC在皮下和原位胰臟PDX模型中的體內功效。 A)高親和力QD6/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型、l-未處理、n-R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4）、p - QD6/B09-1508（1 mg/kg - Q1Wx4）、q - QD6/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - QD6/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）中的體內功效。治療天數由x軸上的刻度表示，每週兩次測量腫瘤體積。
[ 圖 11B]低親和力RAA2/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型中的體內功效。l - 未處理，n - R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4），p - RAA2/B09-1508（1 mg/kg - Q1Wx4），q - RAA2/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - RAA2/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）。治療天數由x軸上的刻度表示，每週兩次測量腫瘤體積。
[ 圖 11C]原位MEDI-PANC-08 LUC（螢光素酶表現）PDX模型的螢光素酶成像。使用IVIS光譜體內成像系統每週對小鼠成像。使用設置在最大訊息（第21天對照Gp）與背景之間的輻射率標度（平均輻射率[p/s/cm2/sr]）對所有組和時間點的圖像進行歸一化。
[ 圖 11D]低親和力RAA2/B09 ADC在皮下MEDI-PANC-08 PDX模型中的體內功效。l - 未處理，n - 吉西他濱（75 mg/kg - Q3/4Dx5），p R347-AZ1508（3 mg/kg - Q1Wx4），q - RAA2/B09-1508（2 mg/kg - Q1Wx4）和Â - RAA2/B09-1508（3 mg/kg - Q1Wx4）。治療天數用箭頭表示，每週兩次測量腫瘤體積。在圖11 A和11 B中顯示的數據係組平均腫瘤體積（mm 3）± SEM，在圖11 D中係組平均輻射率[p/s/cm 2/sr]± SEM。
[ 圖 12A]小鼠中RAA22/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。目標化合物濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。
[ 圖 12B]小鼠中QD6/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。目標化合物濃度和總抗體濃度用一種免疫捕獲LC-MS/MS測定法測量。
[ 圖 13A]猴中RAA22/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。
[ 圖 13B]猴中QD6/B09-57-AZ1508的平均濃度-時間曲線和平均NCA PK參數。
20067312中3 mg/kg QD6/B09-57-AZ1508的PK曲線和NCA PK參數基於第二次給藥後的PK數據。
[ 圖 13C]係總結分子的PK參數的表
[ 圖 14]作為PDX試驗，在代表免疫缺乏小鼠中多種類型的人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型中評估了EGFR-cMET Maia Topoi ADC。對於代表獨特的人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以10 mg/kg的劑量水平測試化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C）（根據下式，將腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 - （TX最終 - TX初始）/ （C最終 - C初始））。並且計算顯示與初始腫瘤體積相比顯示尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比（根據下式，將腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始劑量日）的腫瘤減小百分比：%消退 = (TX最終平均值 - TX初始平均值)/(TX初始平均值) × 100）。
[ 圖 15]作為PDX試驗，在代表免疫缺乏小鼠中多種類型的人類癌症的患者來源的異種移植物（PDX）模型中評估了EGFR-cMET Topoi TM ADC。對於代表獨特的人類腫瘤的每個PDX模型，在單個小鼠中以5 mg/kg的劑量水平測試化合物。計算生長大於初始體積的腫瘤相對於未治療的對照腫瘤的腫瘤生長百分比（%T/C）（根據下式，將腫瘤生長抑制（%TGI）定義為治療（TX）組與對照（C）組之間相對於第0天的腫瘤生長百分比：%TGI = 1 - （TX最終 - TX初始）/（C最終 - C初始））。並且計算顯示與初始腫瘤體積相比顯示尺寸減小的腫瘤的腫瘤消退百分比（根據下式，將腫瘤消退百分比定義為在研究終點根據下式計算的經治療動物中的腫瘤相對於第0天腫瘤體積（初始劑量日）的腫瘤減小百分比：%消退 = (TX最終平均值 - TX初始平均值)/(TX初始平均值) × 100）。
[ 圖 16A]在PDX模型SQHN-02中評估了具有不同IgG Fc形式（Maia和TM）的兩種不同EGFR-cMET ADC的可比性。在3個劑量水平下測試了ADC：2.5、5和10 mg/kg，並將腫瘤生長與未治療的對照動物進行了比較。每個治療組和對照組共治療了10隻動物。
[ 圖 16B]在PDX模型Panc-08中評估了具有不同IgG Fc形式（Maia和TM）的兩種不同EGFR-cMET ADC的可比性。在3個劑量水平下測試了ADC：2.5、5和10 mg/kg，並將腫瘤生長與未治療的對照動物進行了比較。每個治療組和對照組共治療了10隻動物。
[ 圖 17]描述了來自上述圖14的非小細胞肺癌NSCLC PDX模型的結果，突出了已知的EGFR突變狀態和組織學。
[ 圖 18]將EGFR-cMET雙特異性抗體INT-009（RAA22/B09-Maia裸mAb）和INT-009-SG3932 DAR8 ADC（「MAIA ADC」）與B09/RAA2-IgG1-TM鏡像mAb（INT-017）和TM-鏡像-SG3932 DAR6 ADC（「TM ADC」）在NOD-SCID小鼠中以5 mg/kg的治療劑量的藥物動力學曲線進行比較。
[ 圖 19A] 描述了ADC在含有L858R EGFR突變的EGFR突變型PDX模型「LUN487」中的功效的結果。
[ 圖 19B] 描述了ADC與第三代TKI奧希替尼（「Osi」）組合在含有L858R EGFR突變的EGFR突變型PDX模型「LUN487」中的功效的結果。
[ 圖 19C] 描述了ADC在含有L858R EGFR突變的EGFR突變型PDX模型「LUN439」中的功效的結果。
[ 圖 19D] 描述了ADC與第三代TKI奧希替尼（「Osi」）組合在含有L858R EGFR突變的EGFR突變型PDX模型「LUN439」中的功效的結果。
[ 圖 20A]描述了ADC在含有EGFR外顯子20插入的EGFR突變型PDX模型「CTG-2992」（原發性奧希替尼抗性）中的功效的結果。
[ 圖 20B]描述了ADC與第三代TKI奧希替尼組合在含有EGFR外顯子20插入的EGFR突變型PDX模型「CTG-2992」（原發性奧希替尼抗性）中的功效的結果。
[ 圖 21A]描述了ADC在EGFR突變型PDX模型「CTG-2803」（後天性奧希替尼抗性）中的功效的結果。
[ 圖 21B]描述了ADC與第三代TKI奧希替尼組合在EGFR突變型PDX模型「CTG-2803」（後天性奧希替尼抗性）中的功效的結果。
[ 圖 22A]示出了多個EGFRmut NSCLC患者來源的異種移植模型對用25 mg/kg奧希替尼治療的響應的瀑布圖。x軸描述了在研究期間從基線的最佳響應。Y軸截距線顯示了從基線的30%消退，這定義了響應。
[ 圖 22B]示出了多個EGFRmut NSCLC患者來源的異種移植模型對用2 mg/kg EGFR-cMET TM ADC治療的響應的瀑布圖。x軸描述了在研究期間從基線的最佳響應。Y軸截距線顯示了從基線的30%消退，這定義了響應。
[ 圖 22C]示出了多個EGFRmut NSCLC患者來源的異種移植模型對用25 mg/kg奧希替尼和2 mg/kg EGFR-cMET TM ADC的組合治療的響應的瀑布圖。x軸描述了在研究期間從基線的最佳響應。Y軸截距線顯示了從基線的30%消退，這定義了響應。
無
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Claims (36)

  1. 一種用於在治療人患者的癌症中使用的EGFR TKI，其中將該EGFR TKI與抗EGFR/cMET抗體分子組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  2. 一種用於在治療人患者的癌症中使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中將該抗EGFR/cMET抗體分子與EGFR TKI組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  3. 如請求項1所述使用的EGFR TKI、或如請求項2所述使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中分別、順序或同時投與該EGFR TKI和該抗EGFR/cMET抗體分子。
  4. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR TKI係具有式 (V)的化合物： (V)其中： G選自4,5,6,7-四氫吡唑并[1,5- a]吡啶-3-基、吲哚-3-基、吲唑-1-基、3,4-二氫-1H-[1,4]㗁𠯤并[4,3-a]吲哚-10-基、6,7,8,9-四氫吡啶并[1,2-a]吲哚-10-基、5,6-二氫-4H-吡咯并[3,2,1-ij]喹啉-1-基、吡咯并[3,2-b]吡啶-3-基和吡唑并[1,5- a]吡啶-3-基； R 1 選自氫、氟、氯、甲基和氰基； R 2 選自甲氧基、三氟甲氧基、乙氧基、2,2,2-三氟乙氧基和甲基； R 3 選自(3 R)-3-(二甲基胺基)吡咯啶-1-基、(3 S)-3-(二甲基-胺基)吡咯啶-1-基、3-(二甲基胺基)四氫吖唉-1-基、[2-(二甲基胺基)乙基]-(甲基)胺基、[2-(甲基胺基)乙基](甲基)胺基、2-(二甲基胺基)乙氧基、2-(甲基胺基)乙氧基、5-甲基-2,5-二氮雜螺[3.4]辛-2-基、(3a R,6a R)-5-甲基六氫-吡咯并[3,4- b]吡咯-1(2 H)-基、1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基、4-甲基哌𠯤-1-基、4-[2-(二甲基胺基)-2-側氧基乙基]哌𠯤-1-基、甲基[2-(4-甲基哌𠯤-1-基)乙基]胺基、甲基[2-(𠰌啉-4-基)乙基]胺基、1-胺基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-基和4-[(2 S)-2-胺基丙醯基]哌𠯤-1-基； R 4 選自氫、1-哌啶基甲基和N,N-二甲基胺基甲基； R 5 獨立地選自甲基、乙基、丙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟、氯和環丙基； X 係CH或N；並且 n係0、1或2； 或其藥學上可接受的鹽。
  5. 如請求項4所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中 G選自吲哚-3-基和吲唑-1-基； R 1 選自氫、氟、氯、甲基和氰基； R 2 選自甲氧基和2,2,2-三氟乙氧基； R 3 選自[2-(二甲基胺基)乙基]-(甲基)胺基、[2-(甲基胺基)乙基](甲基)胺基、2-(二甲基胺基)乙氧基和2-(甲基胺基)乙氧基； R 4 係氫； R 5 選自甲基、2,2,2-三氟乙基和環丙基； X 係CH或N；並且 n係0或1；或其藥學上可接受的鹽。
  6. 如請求項5所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR TKI係奧希替尼或其藥學上可接受的鹽。
  7. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR TKI選自由以下組成之群組：奧希替尼或其藥學上可接受的鹽、AZD3759或其藥學上可接受的鹽、拉澤替尼或其藥學上可接受的鹽、艾維替尼或其藥學上可接受的鹽、艾氟替尼或其藥學上可接受的鹽、阿法替尼或其藥學上可接受的鹽、CX-101或其藥學上可接受的鹽、HS-10296或其藥學上可接受的鹽、BPI-7711或其藥學上可接受的鹽、達克替尼或其藥學上可接受的鹽、埃克替尼或其藥學上可接受的鹽、吉非替尼或其藥學上可接受的鹽、和厄洛替尼或其藥學上可接受的鹽。
  8. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR TKI選自由以下組成之群組：奧希替尼或其藥學上可接受的鹽、AZD3759或其藥學上可接受的鹽、艾氟替尼或其藥學上可接受的鹽、HS-10296或其藥學上可接受的鹽、和拉澤替尼或其藥學上可接受的鹽。
  9. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3。
  10. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗EGFR結合結構域包含含有與SEQ ID NO: 16的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VH區；以及含有與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
  11. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗cMET結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  12. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗cMET結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 24的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 26的胺基酸序列的HCDR3；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 27的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 28的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 29的胺基酸序列的LCDR3。
  13. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該cMET結合結構域包含：含有與SEQ ID NO: 38的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VH區；以及含有與SEQ ID NO: 40的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%序列同一性的胺基酸序列的VL區。
  14. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗體分子包含： a.     第一重鏈，其中該第一重鏈包含該抗EGFR結合結構域的該VH區，以及第一重鏈恒定（CH）區或其片段； b.     第一輕鏈，其中該第一輕鏈包含該抗EGFR結合結構域的該VL區，以及第一輕鏈恒定（CL）區或其片段； c.     第二重鏈，其中該第二重鏈包含該抗cMET結合結構域的該VH區，以及第二重鏈恒定（CH）區或其片段；以及 d.     第二輕鏈，其中該第二輕鏈包含該抗cMET結合結構域的該VL區，以及第二輕鏈恒定（CL）區或其片段。
  15. 如請求項14所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一CH區和該第二CH區包含與SEQ ID NO: 42的胺基酸序列具有至少70%、至少80%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列。
  16. 如請求項14或請求項15所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一CH區和/或該第二CH區包含突變以減少或消除該抗體分子與一或多種Fcγ受體的結合。
  17. 如請求項16所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一CH區和/或該第二CH區包含位置234處的苯丙胺酸、位置235處的麩胺酸和位置331處的絲胺酸，其中該恒定區的編號按照EU索引。
  18. 如請求項14-17中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一CH區包含與SEQ ID NO: 63中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CH區包含與SEQ ID NO: 64中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列，並且其中該第一CL區包含與SEQ ID NO: 65中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列；並且該第二CL區包含與SEQ ID NO: 47中列出的序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的胺基酸序列。
  19. 如請求項14-18中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一重鏈包含具有SEQ ID NO: 59中列出的序列的胺基酸序列；該第二重鏈包含具有SEQ ID NO: 60中列出的序列的胺基酸序列；該第一輕鏈包含具有SEQ ID NO: 61中列出的序列的胺基酸序列；並且該第二輕鏈包含具有SEQ ID NO: 62中列出的序列的胺基酸序列。
  20. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中 該抗EGFR結合結構域以具有等於或高於10 nM、等於或高於30 nM、等於或高於40 nM的Kd的親和力結合人EGFR；和/或 該抗EGFR結合結構域以具有在10與100 nM之間、在20與80 nM之間、在30與75 nM之間、或在35與50 nM之間的Kd的親和力結合人EGFR。
  21. 如前述請求項中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗體分子與藥物軛合。
  22. 如請求項21所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該藥物包括細胞毒素、放射性同位素、免疫調節劑、細胞介素、淋巴激素、趨化介素、生長因子、腫瘤壞死因子、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、DNA、RNA、siRNA、RNAi、微RNA、光活性治療劑、抗血管生成劑、促細胞凋亡劑、肽、脂質、碳水化合物、螯合劑或它們的組合。
  23. 如請求項22所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該藥物係具有式A*的拓樸異構酶I抑制劑 。
  24. 如請求項23所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該拓樸異構酶I抑制劑具有式 ： 或其鹽或溶劑合物，其中R L係用於連接該抗體分子的連接子，視需要地其中所述連接子選自： (ia)： ， 其中 Q係： ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X係： 其中a = 0至5，b1 = 0至16，b2 = 0至16，c1 = 0或1，c2 = 0或1，d = 0至5，其中至少b1或b2 = 0（即b1和b2中只有一個可以不是0）並且至少c1或c2 = 0（即c1和c2中只有一個可以不是0）； G L係用於連接該抗體分子的連接子；或者 (ib)： ， 其中R L1和R L2獨立地選自H和甲基，或與它們所結合的碳原子一起形成環丙烯或環丁烯基團；並且 e係0或1。
  25. 如請求項21所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該抗體與具有下式的拓樸異構酶I抑制劑軛合： 。
  26. 如任一項前述請求項中所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該癌症係非小細胞肺癌。
  27. 如請求項26所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該非小細胞肺癌係EGFR突變陽性非小細胞肺癌。
  28. 如請求項27所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR突變陽性非小細胞肺癌包含在EGFR基因中的外顯子19中之一或多個缺失和/或L858R突變。
  29. 如請求項27或28所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR突變陽性非小細胞肺癌包含在EGFR基因中的T790M突變、外顯子20中的突變、或兩者。
  30. 如任一項前述請求項中所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該人患者係EGFR TKI初治人患者。
  31. 如請求項1-31中任一項所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該人患者在先前EGFR TKI治療期間或之後已出現疾病進展。
  32. 如請求項33所述使用的EGFR TKI或使用的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該EGFR TKI係奧希替尼或其藥學上可接受的鹽，並且該人患者在先前用不同的EGFR TKI治療期間或之後已出現疾病進展。
  33. EGFR TKI在製造用於治療人患者的癌症的藥物中之用途，其中將該EGFR TKI與抗EGFR/cMET抗體分子組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  34. 一種治療需要這樣的治療的人患者的癌症之方法，該方法包括向該人患者投與治療有效量的EGFR TKI，其中將該EGFR TKI與治療有效量的抗EGFR/cMET抗體分子組合投與，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  35. 一種治療需要這樣的治療的人患者的癌症之方法，該方法包括向該人患者投與第一量的EGFR TKI、以及第二量的抗EGFR/cMET抗體分子，其中該第一量和該第二量一起構成治療有效量，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
  36. 一種EGFR/cMET抗體分子和EGFR TKI的藥物組合，其中該抗EGFR/cMET抗體分子包含EGFR結合結構域和cMET結合結構域，其中該EGFR結合結構域包含： a.     包含以下互補決定區（CDR）的重鏈可變（VH）區： i.     具有SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的HCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 2的胺基酸序列的HCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列的HCDR3， 或其變體，其中HCDR1、HCDR2或HCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代；以及 b.     包含以下CDR的輕鏈可變（VL）區： i.     具有SEQ ID NO: 4的胺基酸序列的LCDR1 ii.   具有SEQ ID NO: 5的胺基酸序列的LCDR2 iii.  具有SEQ ID NO: 6的胺基酸序列的LCDR3， 或其變體，其中LCDR1、LCDR2或LCDR3中之一或多個中之一或兩個或三個胺基酸被另一個胺基酸取代。
TW112123734A 2022-06-27 2023-06-26 涉及用於治療癌症的上皮生長因子受體酪胺酸激酶抑制劑之組合 TW202417040A (zh)

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