ES2889398T3 - Anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo-fármaco - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable (VR) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) seleccionadas del grupo que consiste en: a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2; b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12; en las que las CDR están subrayadas en las SEQ ID NOs y en el que el anticuerpo comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionado de las posiciones 40, 41 y 89 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones 40 y 41 de la región marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-5T4 y conjugados de anticuerpo-fármaco
Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos contra el antígeno 5T4 (oncofetal) y los correspondientes conjugados anticuerpo-fármaco (ADC).
Antecedentes de la presente invención
El antígeno oncofetal 5T4 es una glicoproteína de 72 kDa definida por un anticuerpo monoclonal generado contra glicoproteínas aisladas de aglutinina de germen de trigo de la membrana microvellosa de sincitiotrofoblasto placentario humano. Este anticuerpo monoclonal (mAb) se denominó 5T4 en el documento WO89/07947. Aunque que el antígeno 5T4 tiene una expresión limitada en el tejido normal, es (sobre)expresado por varios tipos de células cancerosas. Esto convierte al antígeno 5T4 en un objetivo específico del cáncer y en un objetivo terapéutico potencial y prometedor. Sin embargo, aunque el objetivo se descubrió a finales de los años ochenta, los anticuerpos terapéuticos aprobados todavía no están disponibles.
El documento WO2006/031653 divulga el mAb 5T4 original, es decir, H8 y su versión humanizada, los cuales no presentan reactividad cruzada con diversas especies animales no humanas típicamente utilizadas en estudios preclínicos (de toxicidad) in vivo. Estos estudios preclínicos tienen como objetivo identificar una dosis inicial segura para los esquemas posteriores de escalamiento de dosis en humanos; identificar tejidos u órganos sanos que sean posibles objetivos de efectos tóxicos reversibles o irreversibles; e identificar parámetros de seguridad para el seguimiento clínico. Para los compuestos biofarmacéuticos, tales como los anticuerpos monoclonales, las pautas regulatorias requieren pruebas en al menos una especie relevante (por ejemplo, la pauta reguladora ICH S6). La especie no es relevante en caso de que el anticuerpo monoclonal no presente reactividad cruzada para la especie y, por lo tanto, sea insuficientemente potente en dicha especie. En tales casos, puede usarse un modelo animal alternativo, por ejemplo, una especie genéticamente modificada. Sin embargo, esto requerirá un gran esfuerzo no solo para desarrollar el modelo, sino también para poder proporcionar una justificación científica aceptable a las autoridades reguladoras.
El documento WO2007/106744 divulga los anticuerpos anti-5T4 A1, A2 y A3, pero aunque estos tres anticuerpos exhiben alguna reactividad cruzada hacia especies animales no humanas, por ejemplo, mono cynomolgus, sus afinidades por el 5T4 humano son mucho menores que la afinidad del H8 por el 5T4 humano.
Los anticuerpos anti-5T4 H8, A1, A2 y A3 unidos mediante ácido 4-(4'-acetilfenoxi)-butanoico a caliqueamicina se divulgaron en el documento WO2007/106744 en la página 73. El documento WO2012/131527 divulga A1 unido a monometilauristatina F maleimidocaprónica (A1-mc-MMAF).
Sólo unas pocas terapias dirigidas al antígeno 5T4 han alcanzado la etapa de ensayo clínico. La vacuna del vector Ankara del virus vacuna modificado (MVA) que codifica el antígeno 5T4 induce una respuesta de anticuerpos endógenos contra el antígeno 5T4, pero su estudio de fase III sobre cáncer renal metastásico no logró alcanzar su criterio de valoración principal de aumento de la supervivencia. Otro ejemplo es naptumomab estafenatox, que es el fragmento Fab de mAb 5T4 conjugado con una enterotoxina E estafilocócica modificada. Se cree que este conjugado activa una respuesta de células T en la proximidad del tumor. Sin embargo, un estudio aleatorizado de fase II/III de naptumomab estafenatox más IFN-a versus IFN-a en el carcinoma de células renales avanzado no cumplió con su criterio de valoración principal de supervivencia prolongada. También recientemente, se interrumpió el desarrollo clínico que evaluaba el ADC AI-mc-MMAF. Actualmente, no se incluye ningún ensayo clínico activo en los registros de ensayos clínicos de los Estados Unidos y la Unión Europea.
El documento WO 2015/155345 divulga nuevos anticuerpos anti-5T4 y los ADC correspondientes en los que un anticuerpo anti-5T4 está unido (específicamente al sitio) a un dímero de pirrolobenzodiazepina (PDB) o a una tubulisina. Sin embargo, aún no se dispone de datos clínicos.
Lo anterior lleva a la conclusión de que las terapias dirigidas a 5T4 clínicamente probadas, es decir, anticuerpos, conjugados anticuerpo-fármaco y vacunas, no están a la altura de los requisitos de una terapia contra el cáncer. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos anticuerpos contra el antígeno 5T4 y de los correspondientes conjugados anticuerpo-fármaco para la terapia contra el cáncer. Para determinar la idoneidad de estos anticuerpos y los ADC correspondientes en un entorno preclínico, dichos anticuerpos deben tener reactividad cruzada para el antígeno 5T4 de especies animales no humanas relevantes para el desarrollo preclínico de un candidato a fármaco.
Breve descripción de la presente invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende una regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable (VR) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) seleccionadas del grupo que consiste en: (a) secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la Cd R1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2; (b) secuencias de aminoácidos de la Cd R1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y (c) secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de las SEQ ID NO: 12; en el que las CDR están subrayadas en las SEQ ID NO y en el que el anticuerpo comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionado de las posiciones 40, 41 y 89 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones de la región marco de la cadena ligera 40 y 41 de acuerdo con la numeración de Kabat.
Los anticuerpos contra el antígeno oncofetal 5T4 humano y los ADC correspondientes son adecuados para probarlos en ensayos clínicos. Los anticuerpos adecuados y los ADC correspondientes en un entorno preclínico deben tener reactividad cruzada para el antígeno 5T4 de especies animales no humanas relevantes para el desarrollo preclínico de un candidato a fármaco.
Preferiblemente, los anticuerpos tienen reactividad cruzada para humanos y monos cynomolgus y exhiben una afinidad por el antígeno 5T4 humano (5T4 hu) que es del mismo orden de magnitud que su afinidad por el antígeno 5T4 de mono cynomolgus (5T4 cyno).
La invención se refiere además al uso de los anticuerpos y los ADC correspondientes en el tratamiento de tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la unión de los mAb quiméricos, los mAb humanizados con mutación HC-41C y los correspondientes ADC anti-5T4 a las células CHO que expresan 5T4 hu (CHOZN) frente a aquellas de H8 y A1 (Figura 1A, clon 789, Figura 1B, clon 833, Figura 1C clon 825).
La Figura 2 muestra la unión de los mAb quiméricos, los mAb humanizados con mutación HC-41C y los correspondientes ADC anti-5T4 a células CHO que expresan 5T4 cyno (CHOZN) frente a aquellas de H8 y A1 (Figura 2A, clon 789, Figura 2B, clon 833, Figura 2C clon 825).
La Figura 3 muestra la eficacia in vivo de los ADC anti-5T4833a-vc-seco-DUBA, 833b-vc-seco-DUBA, 833c-vc-seco-DUBA, 833d-vc-seco-DUBA, 825a-vc-seco-DUBA, 825c-vc-seco-DUBA frente a H8-vc-seco-DUBA y el control sin unión a rituximab-vc-seco-DUBA en el xenoinjerto de la línea celular BT474 positiva para 5T4 en ratones inmunodeficientes.
Descripción detallada de la presente invención
Mientras que el antígeno oncofetal 5T4 tiene una expresión limitada en tejidos normales, es (sobre)expresado por diversas células cancerosas, convirtiendo así al antígeno 5T4 en un objetivo específico del cáncer y un objetivo terapéutico potencial y prometedor. Sin embargo, aunque el objetivo se descubrió a finales de los años ochenta, actualmente no hay terapias aprobadas dirigidas a este objetivo.
La presente invención se refiere a anticuerpos contra el antígeno 5T4 y los correspondientes conjugados anticuerpofármaco (ADC), que presentan reactividad cruzada para 5T4 cyno y también exhiben una excelente afinidad por el antígeno 5T4 hu. Los anticuerpos anti-5T4 y los ADC de acuerdo con la invención muestran una afinidad por el antígeno 5T4 cyno en el mismo orden de magnitud que su afinidad por 5T4 hu. El término "mismo orden de magnitud" significa que las afinidades por el antígeno 5T4 hu y cyno difieren entre sí en menos de un factor diez. Los anticuerpos anti-5T4 de la invención tienen una afinidad mejorada por el antígeno 5T4 hu en comparación con los anticuerpos anti-5T4 A1 y A3 de la técnica anterior, y una afinidad mejorada por el antígeno 5T4 cyno en comparación con el anticuerpo anti-5T4 H8 de la técnica anterior. La afinidad se mide preferiblemente como CE50 en pg/ml en un ensayo basado en células usando células que expresan el antígeno hu o 5T4 cyno. Los presentes inventores midieron la CE50 en varias células, tales como células m DA-MB-468, PA-1 y de ovario de hámster chino (CHO) modificadas para expresar 5T4 hu o 5T4 cyno. Los anticuerpos de la invención exhiben típicamente una CE50 inferior a 0,8 pg/ml medida usando células que expresan antígeno 5T4 hu o 5T4 cyno después de la incubación de las células con los anticuerpos durante 30 minutos a 4 °C.
El anticuerpo A1 anti-5T4 de la técnica anterior se caracteriza por una región variable (VR) de la cadena pesada (HC) de la secuencia de aminoácidos de A1 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 2, posiciones 20-138 y una VR de la cadena ligera (LC) de la secuencia de aminoácidos de A1 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 4, posiciones 21-127. El anticuerpo de A3 anti-5T4 de la técnica anterior se caracteriza por una HCVR de la secuencia de aminoácidos de A3 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 10, posiciones 20-141 y una LCVR de la secuencia de aminoácidos de A3 de ratón del documento US8044178, Se Q ID NO: 12, posiciones 21-127. El anticuerpo H8 anti-5T4 de la técnica anterior se caracteriza por la HCVR de la SEQ ID NO: 52 y la LCVR de la SEQ ID NO: 53.
El término "anticuerpo", como se usa en toda la presente memoria descriptiva, se refiere a un anticuerpo monoclonal (mAb) que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras o un fragmento de unión a antígeno del mismo, por ejemplo, un fragmento Fab, Fab' o F(ab')2, un anticuerpo de cadena sencilla (sc), un scFv, un anticuerpo de dominio sencillo (sd), un diacuerpo o un minicuerpo. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo, tal como los anticuerpos IgG, IgA o IgM. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG, más preferiblemente un anticuerpo IgG1 o IgG2. Los anticuerpos pueden ser quiméricos, humanizados o humanos. Preferiblemente, los anticuerpos de la invención están humanizados. Incluso más preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo IgG humanizado o humano, lo más preferiblemente un mAb IgG1 humanizado o humano. El anticuerpo puede tener cadenas ligeras k (kappa) o A (lambda), preferiblemente cadenas ligeras k (kappa), es decir, un anticuerpo IgG1-K humanizado o humano.
En los anticuerpos humanizados, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de unión a antígeno en las regiones variables de la HC y LC se derivan de anticuerpos de una especie no humana, comúnmente ratón, rata o conejo. Estas CDR no humanas se pueden colocar dentro de un marco humano (FR1, FR2, FR3 y FR4) de las regiones variables de la HC y LC. Los aminoácidos seleccionados en las FR humanos pueden intercambiarse por los correspondientes aminoácidos originales de especies no humanas para mejorar la afinidad de unión, mientras se conserva una baja inmunogenicidad. Alternativamente, los aminoácidos seleccionados de las FR originales de especies no humanas se intercambian por sus correspondientes aminoácidos humanos para reducir la inmunogenicidad, mientras se retiene la afinidad de unión del anticuerpo. Las regiones variables así humanizadas se combinan con regiones constantes humanas.
La presente divulgación se refiere particularmente a un anticuerpo anti-5T4 que comprende CDR de la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, , CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, , CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 3 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 4;
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6;
d. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, , CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 7 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 8;
e. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, , CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 9 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 10;
f. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12;
g. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 13 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 14;
h. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 15 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 16;
i. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 17 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 18;
j. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 19 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 20;
k. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 21 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 22;
l. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 23 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 24;
m. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 25 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 26;
n. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 27 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 28;
o. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 29 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 30;
p. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 31 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 32; y
q. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 33 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 34.
Para mayor claridad, las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la HCVR y las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la LCVR de los anticuerpos enumerados desde a hasta q anteriormente están subrayados en los listados de secuencias presentados al final de la presente descripción.
En una realización, el anticuerpo anti-5T4 de la divulgación comprende las CDR de la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6;
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12;
d. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 13 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 14;
e. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 17 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 18; y
f. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 25 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 26.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable (VR) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12;
en la que las CDR están subrayadas en las SEQ ID NO y en las que el anticuerpo comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionadas de las posiciones 40, 41 y 89 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones 40 y 41 de la región del marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
En una realización preferida, el anticuerpo anti-5T4 de la invención comprende CDR de la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12.
En otra realización, la invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende una HCVR y una LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 35 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45;
b. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 36 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45;
c. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 44;
d. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 46;
e. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 40 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
f. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 41 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
g. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 42 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 49;
h. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 43 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 50;
i. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 38 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47;
j. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47; y
k. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 48.
En una primera realización de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 35 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45.
En una segunda realización de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 36 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45.
En una tercera realización de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 44.
En una cuarta realización de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 46.
En una quinta realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 40 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51. En una sexta realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 41 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51. En una séptima realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 42 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 49. En una octava realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 43 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 50. En una novena realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 38 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47. En una décima realización de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47. En una undécima realización preferida de la invención, el anticuerpo anti-5T4 humanizado comprende la secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y la secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 48. La presente invención se refiere además a un ADC, en el que un fármaco enlazador se conjuga con un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la invención.
La presente divulgación divulga un ADC en el que un fármaco enlazador se conjuga aleatoriamente con un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la invención a través de una cisteína nativa liberada mediante la reducción de los enlaces disulfuro entre cadenas.
En una realización, la presente invención se refiere a un ADC en el que un fármaco enlazador se conjuga de manera específica del sitio con un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la invención a través de una cisteína modificada (ADC específico del sitio).
Los anticuerpos anti-5T4 que comprenden al menos una cisteína modificada en la HC o LC tienen varias ventajas. Los anticuerpos que comprenden cisteínas modificadas brindan la oportunidad de preparar ADC específicos del sitio, pueden proporcionar posiciones de conjugación que muestran una buena reactividad con el fármaco enlazador y, al mismo tiempo, tienen un riesgo reducido de formar enlaces disulfuro adicionales entre los anticuerpos (que conducen a la agregación) o perturbar la estructura del anticuerpo. Una ventaja adicional de tener cisteínas en posiciones específicas en la HC o LC es el efecto de la hidrofobicidad disminuida de los ADC resultantes.
Se han identificado múltiples posiciones de conjugación adecuadas para la unión del fármaco enlazador en y muy cerca de las cavidades que están presentes en todas las estructuras de anticuerpos, es decir, con buena accesibilidad de cisteínas modificadas en estas ubicaciones como se divulga y reivindica en el documento WO2015/177360. Cuando los fármacos enlazadores se conjugan en las posiciones específicas de los anticuerpos anti-5T4 como se reivindica en el presente documento, dicho fármaco enlazador encaja en la cavidad de Fab que está formada por las regiones del anticuerpo de la cadena pesada constante 1 (CH1), la cadena pesada variable (VH), la cadena ligera variable (VL) y la cadena ligera constante (CL). Como resultado, el fármaco enlazador (la mayoría de las toxinas/fármacos enlazadores son hidrófobos) está protegido del entorno acuoso que rodea al anticuerpo y el ADC como tal es menos hidrófobo en comparación con los ADC en los que el fármaco enlazador se conjuga a través de cisteínas nativas de enlace disulfuro entre cadenas del anticuerpo y es mucho menos hidrófobo en comparación con los ADC en los que el fármaco enlazador se conjuga específicamente en el sitio en diferentes posiciones en las que el fármaco enlazador se fuerza al exterior del anticuerpo, es decir, más expuesto al entorno acuoso hidrófilo.
El anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la invención comprende al menos una cisteína modificada en una posición en una FR de la región variable de HC o una FR de la región variable de LC. El término "cisteína modificada" como se usa en toda la presente memoria descriptiva significa reemplazar un aminoácido que no es cisteína en la HC o LC de un anticuerpo por una cisteína. Como es conocido por la persona experta en la técnica, esto se puede hacer a nivel de aminoácidos o a nivel de ADN, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio. Preferiblemente, dicha cisteína modificada se introduce mediante mutaciones puntuales específicas, reemplazando un aminoácido existente en el anticuerpo original/parental.
Al menos una cisteína modificada está presente en una o más posiciones de los anticuerpos anti-5T4 de acuerdo con la invención seleccionados entre HC 40, 41 y 89 (de acuerdo con la numeración de Kabat); y LC 40 y 41 (de acuerdo con la numeración de Kabat). La expresión "numeración de Kabat" se refiere al sistema de numeración comúnmente utilizado para regiones variables de HC o regiones variables de LC de la compilación de anticuerpos en Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. (1991). Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o más, correspondientes a un acortamiento o inserción en una FR o una CDR de la región variable. La numeración de residuos de Kabat se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada de Kabat.
Con respecto a los anticuerpos anti-5T4 que comprenden las CDR de la HCVR y LCVR y los anticuerpos humanizados que comprenden HCVR y LCVR como se divulgó anteriormente, la presente invención se refiere a dichos anticuerpos que comprenden en la HC y/o LC al menos una cisteína modificada en una posición seleccionada entre HC 40, 41 y 89, y LC 40 y 41.
El anticuerpo anti-5T4 de la invención comprende al menos una cisteína modificada en una posición seleccionada entre HC 40, 41 y 89, y LC 40 y 41 y comprende las CDR de la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12.
En una realización preferida, la invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende al menos una cisteína modificada en una posición seleccionada entre HC 40, 41 y 89, y LC 40 y 41 y que comprende la HCVR y LCVR seleccionados del grupo que consiste en:
a. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 40 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 51;
b. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 41 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 51;
c. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 42 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 49;
d. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 43 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 50;
e. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 38 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 47; y
f. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 48.
Las posiciones HC 40, 41 y 89 y LC 40 y 41 están ubicadas en las FR de la región variable del anticuerpo así como en la parte Fab del anticuerpo.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un ADC en el que un fármaco enlazador se conjuga de manera específica del sitio con un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la invención a través de una cisteína modificada en una o más posiciones de dicho anticuerpo anti-5T4 seleccionado de HC 40, 41 y 89 (de acuerdo con la numeración de Kabat) y LC 40 y 41 (de acuerdo con la numeración de Kabat).
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los ADC conjugados de manera específica del sitio de la presente invención muestran propiedades fisicoquímicas, farmacológicas y/o farmacocinéticas mejoradas, en comparación con los ADC convencionales en los que el fármaco enlazador se conjuga a través de cisteínas de enlace disulfuro entre cadenas nativas del anticuerpo anti-5T4.
Generalmente se evita la modificación de la parte variable de un anticuerpo ya que puede conducir a una pérdida parcial o completa de las afinidades de unión al antígeno. Sin embargo, contrariamente a las expectativas generales, se encontró que los residuos específicos en las FR de la HC y LC del anticuerpo son adecuados para la conjugación y no conducen a una reducción (significativa) de la unión del antígeno después de la conjugación del fármaco enlazador. En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un ADC en el que dicha cisteína modificada está en una o más posiciones de dicho anticuerpo anti-5T4 seleccionado entre HC 40 y 41, y LC 40 y 41 (en la parte Fab de dicho anticuerpo). Preferiblemente, dicha cisteína modificada está en la posición HC 41 o LC 40 o 41, más preferiblemente en HC 41.
Como se sabe por la bibliografía que las proteasas asociadas a tumores en el microambiente tumoral pueden escindir parcialmente los dominios constantes de Fc, bajo la región bisagra, se prefiere la conjugación en la parte Fab a la conjugación en la parte Fc. La escisión de los dominios constantes de Fc daría como resultado la pérdida de fármacos enlazadores conjugados con Fc, lo que a su vez podría conducir a una disminución de la actividad del ADC in vivo (Fan et al., Breast Cancer Res. 2012; 14: R116 y Brezsky et al., PNAS 2009; 106: 17864-17869). Además, la conjugación a estas posiciones en la parte Fab también permite el uso de fragmentos de unión a antígeno de los anticuerpos anti-5T4 divulgados en el presente documento.
Los ADC (específicos del sitio) de acuerdo con la presente invención tienen afinidades de unión similares a los anticuerpos desnudos y una excelente potencia in vitro, y tienen un perfil in vivo mejorado con respecto a los ADC dirigidos a 5T4 conocidos en la técnica anterior. Se espera que los ADC específicos del sitio de acuerdo con la presente invención presenten una baja toxicidad no específica in vivo en comparación con los ADC dirigidos a 5T4 de la técnica anterior. En los ADC anti-5T4 de la invención, el fármaco enlazador está protegido (haciendo que los ADC sean menos susceptibles a la escisión por proteasas extracelulares) y, por lo tanto, es menos probable que el fármaco se libere de forma prematura.
De acuerdo con la presente invención, cualquier fármaco enlazador conocido en la técnica de los ADC se puede usar para la conjugación (específica del sitio) con los anticuerpos de acuerdo con la presente invención, siempre que tenga un grupo químico que pueda reaccionar con el grupo tiol de una cisteína nativa o modificada, típicamente un grupo maleimida o haloacetilo. Los fármacos enlazadores adecuados pueden comprender un derivado de duocarmicina, caliqueamicina, pirrolobenzodiazepina (PBD), maitansinoide o auristatina como fármaco citotóxico. Puede usarse un enlazador escindible o no escindible de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, el fármaco citotóxico es un derivado de una duocarmicina, un maitansinoide o una auristatina. Los ejemplos adecuados de fármacos maitansinoides incluyen DM1 y DM4. Los ejemplos adecuados de fármacos de auristatina incluyen MMAE y MMAF.
Estas abreviaturas son bien conocidas por el experto en la materia. Los ejemplos de fármacos enlazadores adecuados conocidos por el experto en la técnica incluyen mc-vc-PAB-MMAE (también abreviado como mc-vc-MMAE y vc-MMAE), mc-MMAF y mc-vc-MMAF. Preferiblemente, el enlazador usado es un enlazador escindible que comprende valina-citrulina (vc) o valina-alanina (va).
Las estructuras moleculares genéricas de un ADC vc-MMAE (específico de sitio) y ADC mc-MMAF de acuerdo con la presente invención se representan a continuación.
Figure imgf000008_0001
Estructura molecular de vc-MMAE enlazada a un mAb
Figure imgf000008_0002
Estructura molecular de mc-MMAF enlazada a un mAb
En una realización, la presente invención se refiere a un ADC en el que el fármaco enlazador comprende un derivado de duocarmicina.
Las duocarmicinas, aisladas por primera vez de un caldo de cultivo de la especie Streptomyces, son miembros de una familia de antibióticos antitumorales que incluyen duocarmicina A, duocarmicina SA y CC-1065. Las duocarmicinas se unen al surco menor del ADN y posteriormente causan una alquilación irreversible del ADN. Esto altera la arquitectura del ácido nucleico, lo que eventualmente conduce a la muerte de las células tumorales.
El documento WO2011/133039 divulga una serie de fármacos enlazadores que comprenden un derivado de duocarmicina de CC-1065. Derivados adecuados enlazadores de duocarmicina para usar de acuerdo con la presente invención se describen en las páginas 182-197. La síntesis química de varios de estos fármacos enlazadores se describen en los Ejemplos 1-12 del documento WO2011/133039.
En una realización, la resente invención se refiere a un ADC de Fórmula I
Figure imgf000009_0001
en la que
"Anticuerpo anti-5T4" es un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la presente invención sin o con al menos una cisteína modificada en la HC o LC como se divulga en el presente documento.
n es 0-3, preferiblemente 0-1,
m representa una DAR promedio de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4,
R1 se selecciona de
Figure imgf000009_0002
y es 1-16, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000009_0003
En una realización preferida, el ADC de Fórmula (I) comprende un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la presente invención que comprende al menos una cisteína modificada en la HC o LC, en la que el fármaco enlazador se conjuga de manera específica del sitio con el anticuerpo anti-5T4 a través de la cisteína modificada. Preferiblemente, la cisteína modificada está en la posición HC 40, 41 u 89 o LC 40 o 41, más preferiblemente en HC 41 o LC 40 o 41, lo más preferiblemente en HC 41.
En las fórmulas estructurales que se muestran en la presente memoria descriptiva, n representa un número entero de 0 a 3, mientras que m representa una relación promedio de fármaco a anticuerpo (DAR) de 1 a 6. Como es bien conocido en la técnica , la DAR y la distribución de la carga de fármaco se pueden determinar, por ejemplo, utilizando cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) o cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC). HIC es particularmente adecuada para determinar la DAR promedio.
Los ADC de Fórmula (I) de acuerdo con la presente invención pueden obtenerse de acuerdo con métodos y procedimientos que son bien conocidos por un experto en la técnica.
Un método adecuado para la conjugación inespecífica (aleatoria) de fármacos enlazadores de duocarmicina, es decir, la conjugación con una cisteína nativa, se divulga en el Ejemplo 15 del documento WO2011/133039, mientras que Doronina et al., Bioconjugate Chem. 17 (2006): 114-124 describe una conjugación inespecífica con mc-MMAF. Los métodos adecuados para conjugación específica del sitio de fármacos enlazadores se pueden encontrar, por ejemplo, en los Ejemplos 7 y 8 del documento WO2005/084390, que describen estrategias de reducción completas para la carga (parcial) de anticuerpos con el fármaco enlazador vc-MMAE, y en los Ejemplos 11 y 12 del documento WO2006/034488, que describen la conjugación específica de sitio de un fármaco enlazador que comprende maitansinoide (DM1).
En una realización particular, la presente invención se refiere a un ADC de Fórmula (I) como se divulgó anteriormente, en la que n es 0-1, m representa una DAR promedio de 1 a 6, preferiblemente de 1 a 4, más preferiblemente de 1 a 2, incluso más preferiblemente de 1,5 a 2, lo más preferiblemente de 1,8 a 2,
R1 se selecciona de
Figure imgf000010_0001
y es 1-16, preferiblemente 1-4, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000010_0002
En una realización específica, la presente invención se refiere a un ADC de fórmula estructural (I) como se divulgó anteriormente, en la que n es 0-1, m representa una DAR promedio de 1,5 a 2, preferiblemente de 1,8 a 2, R1 es *K -° );h
y es 1-4, y R2 se selecciona de
Figure imgf000010_0003
En una realización particularmente preferida, la presente invención se refiere a un ADC de Fórmula (II)
Figure imgf000010_0004
en la que "anticuerpo anti-5T4" es un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la presente invención sin o con al menos una cisteína modificada en la HC o LC como se divulga en este documento y m representa una DAR promedio de 1,5 a 2, preferiblemente de 1,8 a 2.
El ADC de Fórmula (II) comprende un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la presente invención que comprende al menos una cisteína modificada en la HC o LC, en la que el fármaco enlazador se conjuga de forma específica del sitio con el anticuerpo a través de la cisteína modificada. Dicha cisteína modificada está en la posición HC 40, 41 u 89 o LC 40 o 41, más preferiblemente en HC 41 o LC 40 o 41, lo más preferiblemente en HC 41.
El ADC de Fórmula (II) comprende un anticuerpo anti-5T4 que comprende las CDR de la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12.
En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un ADC de Fórmula (II) que comprende un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 40 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 51;
b. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 41 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 51;
c. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 42 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 49;
d. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 43 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 50;
e. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 38 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 47; y
f. Secuencia de aminoácidos de la HC de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LC de la SEQ ID NO: 48.
En una realización aún más preferida, la presente invención se refiere a un ADC de Fórmula (II) que comprende un anticuerpo anti-5T4 de acuerdo con la presente invención que comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones seleccionadas de HC 40 y 41 y LC 40 y 41, en las que el fármaco enlazador se conjuga de forma específica del sitio con el anticuerpo anti-5T4 a través de la cisteína modificada. Preferiblemente, dicha cisteína modificada está en la posición HC 41 o LC 40 o 41, lo más preferiblemente en HC 41.
En una realización más preferida, la presente invención se refiere a un ADC de Fórmula (II) que comprende un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende la HCVR y LCVR seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 61 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
b. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 62 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
c. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 63 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 49;
d. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 64 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 50;
e. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 59 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47; y
f. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 60 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 48;
en la que el fármaco enlazador se conjuga de forma específica del sitio con el anticuerpo anti-5T4 a través de la cisteína modificada en la posición HC 41.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-5T4 o un ADC anti-5T4 como se describió anteriormente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Las formulaciones farmacéuticas típicas de proteínas terapéuticas tales como los mAb y los ADC (monoclonales) toman la forma de tortas liofilizadas (polvos liofilizados), que requieren disolución (acuosa) (es decir, reconstitución) antes de la infusión intravenosa, o soluciones congeladas (acuosas), que requieren descongelación antes de su uso.
Normalmente, la composición farmacéutica se proporciona en forma de torta liofilizada. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados para su inclusión en la composición farmacéutica (antes de la liofilización) de acuerdo con la presente invención incluyen soluciones tampón (por ejemplo, sales en agua que contienen citrato, histidina o succinato), lioprotectores (por ejemplo, sacarosa, trehalosa), modificadores de la tonicidad (por ejemplo, cloruro de sodio), tensioactivos (por ejemplo, polisorbato) y agentes de carga (por ejemplo, manitol, glicina). Los excipientes utilizados para las formulaciones de proteínas liofilizadas se seleccionan por su capacidad para prevenir la desnaturalización de las proteínas durante el proceso de liofilización y durante el almacenamiento. A modo de ejemplo, la formulación en polvo estéril y liofilizado de un solo uso de KadcylaMR (Roche) contiene, tras la reconstitución con agua bacteriostática o estéril para preparaciones inyectables (BWFI o SWFI), 20 mg/ml de ado-trastuzumab emtansina, polisorbato 20 al 0,02% p/v, succinato de sodio 10 mM y sacarosa al 6% p/v con un pH de 5,0.
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4, ADC o composición farmacéutica como se describió anteriormente para su uso como medicamento.
En una realización, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4, ADC o composición farmacéutica como se describió anteriormente para su uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos y neoplasias malignas hematológicas, preferiblemente tumores sólidos humanos.
En una realización preferida, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4, un ADC o una composición farmacéutica como se describió anteriormente, particularmente un ADC que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, para uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos seleccionados del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC)) y mesotelioma (pleural maligno).
En una realización adicional, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-5T4, ADC o composición farmacéutica como se describió anteriormente, particularmente un ADC que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, para uso en el tratamiento de neoplasias hematológicas humanas, particularmente leucemia, seleccionados del grupo que consiste en leucemia linfoblástica y mieloide aguda (ALL y AML, respectivamente).
En un aspecto adicional, la presente invención se refiere al uso de una combinación administrada secuencial o simultáneamente de un anticuerpo anti-5T4, un ADC anti-5T4 o una composición farmacéutica como se describió anteriormente con un anticuerpo terapéutico, un agente quimioterapéutico, y/o un ADC contra un objetivo relacionado con el cáncer distinto del antígeno 5T4 para el tratamiento de tumores sólidos humanos y neoplasias malignas hematológicas como se describió anteriormente.
En una realización de la presente invención, particularmente en el caso de un ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es bevacizumab, cetuximab, nivolumab o ramucirumab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente ciclofosfamida, ifosfamida o una triazina, particularmente temozolomida, o un fármaco de platino, más particularmente cisplatino o carboplatino, un antimetabolito, particularmente gemcitabina o pemetrexed, un inhibidor de la topoisomerasa II, particularmente etopósido, un inhibidor mitótico, particularmente un taxano, más particularmente paclitaxel o docetaxel, o un alcaloide de la vinca, más particularmente vinblastina o vinorelbina, o un inhibidor de la cascada de señalización, particularmente un inhibidor de tirosina quinasa, más particularmente imatinib, erlotinib, ceritinib, crizotinib o afatinib.
En una realización adicional de la presente invención, particularmente en el caso de un ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es bevacizumab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente una mostaza nitrogenada, particularmente ifosfamida o ciclofosfamida, un fármaco de platino, particularmente cisplatino o carboplatino, o una triazina, particularmente temozolomida, un antibiótico antitumoral, particularmente doxorrubicina, un antimetabolito, particularmente gemcitabina, un inhibidor de la topoisomerasa I o II, particularmente topotecano, irinotecano o etopósido, o un inhibidor mitótico, particularmente un taxano, más particularmente paclitaxel o docetaxel, o un alcaloide de la vinca, más particularmente vincristina o vinorelbina.
En otra realización más de la presente invención, particularmente en el caso de un ADC anti-5T4 que comprende un fármaco enlazador derivado de duocarmicina, el anticuerpo terapéutico es amatuximab y el agente quimioterapéutico es un agente alquilante, particularmente una subclase de platino. Se transfectaron transitoriamente células HEK 293 con los plásmidos que contienen la secuencia de inmunoglobulina usando un procedimiento automatizado en una plataforma Tecan Freedom Evo. Las inmunoglobulinas se purificaron del sobrenadante celular usando purificación por afinidad (Proteína A) en un sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 con un automuestreador de placas. Se excluyeron 4 muestras con muy baja productividad, lo que resultó en un total de 127 anticuerpos para repetir la prueba. Los anticuerpos se seleccionaron basándose en su unión específica del antígeno 5T4 humano y cyno y por la unión a células MdA-MB-468 que expresan 5T4 hu.
La unión al antígeno 5T4 hu y cyno se determinó mediante el siguiente procedimiento. Se recubrió una placa de microtitulación de 384 pozos con antígeno 5T4 hu o de cyno. Se añadió un anticuerpo de referencia, sobrenadantes de células B o un anticuerpo producido de forma recombinante y se detectó la unión mediante un anticuerpo anti­ conejo o POD humano.
Para la unión a células MDA-MB-468, las células se sembraron en placas de microtitulación de cultivo celular negras (Corning). Se permitió que los anticuerpos específicos procedentes de sobrenadantes de células B o los anticuerpos de referencia interactuaran con las células. La unión se detectó usando un anticuerpo marcado con Alexa Fluor 488. La fluorescencia se leyó usando un dispositivo CellInsight (Thermo Fischer).
Se seleccionaron 17 anticuerpos y se midió la afinidad por el antígeno 5T4 usando células MDA-MB-468, células PA-1 y células de mamífero de ovario de hámster chino (CHO) que expresan antígeno 5T4 hu o de cyno (Tabla 2). En la aplicación actual, las células CHO utilizadas se denominan CHOZN ya que estas células CHO que expresan el antígeno 5T4 hu o de cyno se obtuvieron usando la plataforma CHOZN® de Sigma-Aldrich. Se transfectaron transitoriamente células CHOZN (SAFC), utilizando un dispositivo Nucleofector Amaxa (Lonza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizaron vectores de expresión de mamíferos estándar disponibles comercialmente (SAFC, Life Technologies), que contenían la secuencia codificante del antígeno 5T4 hu y cyno de longitud completa (de acuerdo con el número de acceso NP_006661.1 y Q4R8Y9 respectivamente), precedidos por un promotor de CMV humano. Las células CHOZN transfectadas transitoriamente se cultivaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, antes de usarse en estudios de unión de anticuerpos. Los 17 anticuerpos seleccionados se caracterizan por las secuencias de aminoácidos de acuerdo con la siguiente tabla (Tabla 1).
Tabla 1. Anticuer os monoclonales^ uiméricos anti-5T4
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Protocolo de afinidad in vitro
Las células MDA-MB-468, las células PA-1 o las células CHOZN que expresan el antígeno 5T4 hu o de cyno (100.000 células/pocillo en una placa de 96 pocillos) se lavaron tres veces con tampón FACS helado (1x PBS (Lonza ) que contenía BSA al 0,2% v/p (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) y NaN3 al 0,02% v/p (Sigma-Aldrich), seguido de la adición de un intervalo de concentración de cada mAb primario (50 pl/pocillo) diluido en tampón FACS helado. Después de una incubación de 30 minutos a 4 °C, las células se lavaron tres veces con tampón FACS helado y se añadieron 50 pl/pocillo de mAb secundario (IgG-APC anti-humano de cabra del fragmento F(ab')2, AffiniPure, dilución 1: 6.000, Jackson Immuno Research). Después de 30 minutos a 4°C, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en 150 pl de tampón FACS. Las intensidades de fluorescencia se determinaron mediante citometría de flujo (BD FACSVerse, Fanklin Lakes, NJ) y se indicaron como la intensidad de fluorescencia media (MFI). Las curvas se ajustaron mediante regresión no lineal utilizando la ecuación sigmoidea de respuesta a la dosis con pendiente variable (cuatro parámetros) en CE-50GraphPad Prism (versión 5.01/6.01 para Windows, GraphPad, San Diego, CA). Los valores de CE50 se calcularon como la concentración en pg/ml que produce una respuesta a mitad de camino entre la parte inferior y superior de la curva, cuando se usa un ajuste logístico de 4 parámetros.
La afinidad de los anticuerpos quiméricos medidos en células MDA-MB-468 que expresan el antígeno 5T4 humano (5T4 hu) varía desde una CE50 de 0,040 pg/ml a 0,730 pg/ml, comparable al valor de CE50 de H8, que es de 0,19 pg/ml. Sin embargo, el anticuerpo A1 exhibe unión a 5T4 hu con una menor afinidad (el valor de CE50 es 4,72 pg/ml) como se midió en células MDA-MB-468. La afinidad de los anticuerpos quiméricos por 5T4 hu también se midió en células PA-1 y en células CHOZN que expresan 5T4 hu. Los valores de CE50 de los anticuerpos quiméricos estaban de nuevo en el mismo intervalo que los valores de CE50 de H8, mientras que A1 mostró al menos una afinidad de unión 3 veces menor por 5T4 hu (Tabla 2). Los valores de CE50 de A3 en los tres tipos de células que expresan 5T4 hu fueron más bajos que los valores de CE50 de los anticuerpos quiméricos en los tipos de células correspondientes.
Los anticuerpos anti-5T4 quiméricos tienen una afinidad similar por 5T4 hu y 5T4 cyno cuando se miden usando células CHOZN que expresa 5T4 hu o células CHOZN que expresan 5T4 cyno como se muestra en la Tabla 2. En comparación con la unión de H8 a 5T4 cyno, la unión muestra una mejora de 32 veces para la mayoría de los anticuerpos quiméricos, excepto para 846 (10 veces) y 828 (7 veces).
Tabla 2. Afinidad de mAb uiméricos medida en células ue ex resan 5T4 hu 5T4 c no
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Humanización
Se prepararon anticuerpos humanizados mediante injerto de CDR como se describe a continuación.
Las CDR de los clones 789, 825 y 833 se identificaron utilizando las definiciones de CDR del sistema de numeración IMGT (LEFRANC, MP, The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains. The Immunologist, 7 (1999), páginas 132-136) y Kabat.
Se realizaron búsquedas en bases de datos públicas en línea de secuencias de IgG humanas usando el dominio VH de conejo usando algoritmos de búsqueda b La ST, y se seleccionaron dominios variables humanos candidatos de los 200 resultados principales de BLAST. Se seleccionaron cinco candidatos basándose en criterios tales como la homología del marco, el mantenimiento de los residuos clave del marco, la estructura de bucle canónico y la inmunogenicidad. Se repitió el mismo procedimiento para el dominio VL del anticuerpo. Todas las variantes de VH humanizadas se combinaron con todas las variantes de VL humanizadas dando como resultado 25 variantes humanizadas para cada anticuerpo.
Las variantes humanizadas que comprenden una mutación de HC-41C se sintetizaron de acuerdo con el procedimiento siguiente y se midió su afinidad por 5T4 humano y de cyno usando células CHOZN que expresan 5T4 humano o de cyno. Se seleccionaron 11 variantes para una evaluación adicional.
Expresión transitoria de anticuerpos
a) Preparación de constructos de ADNc y vectores de expresión
La HCVR de la secuencia de aminoácidos de A1 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 2, posiciones 20­ 138, la HCVR de la secuencia de aminoácidos de A3 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 10, posiciones 20-141, y la HCVR de la secuencia de aminoácidos de la variante 1 humanizada de H8 de la SEQ ID NO: 52 se unieron cada una en el extremo terminal N a una secuencia líder de HAVT20 (SEQ ID NO: 54), y en el extremo terminal C al dominio constante de una HC de IgG1 humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 55. Las secuencias de aminoácidos quiméricos resultantes se tradujeron de nuevo en una secuencia de ADNc de codón optimizado para expresión en células humanas (Homo sapiens).
De manera similar, la secuencia de ADNc quimérico para la LC del constructo se obtuvo uniendo las secuencias de una señal de secreción adecuada (también la secuencia líder de HAVT20), la LCVR de la secuencia de aminoácidos de A1 de ratón del documento US8044178, SEQ ID NO: 4, posiciones 21-127, la LCVR de la secuencia de aminoácidos de A3 de ratón del documento US8044178, SEQ ID n O: 12, posiciones 21-127, o la LCVR de la secuencia de aminoácidos de la variante 1 humanizada de H8, SEQ ID NO: 53, y una región constante de cadena ligera k de IgG humana (SEQ ID NO: 56), y traduciendo de nuevo las secuencias de aminoácidos obtenidas en una secuencia de ADNc de codón optimizado para expresión en células humanas (Homo sapiens).
Las secuencias de ADNc para la LC y HC de las variantes humanizadas con la mutación HC-41C se obtuvieron utilizando un procedimiento similar, sin embargo, en este caso las secuencias de HC y LC se unieron en el extremo terminal N a secuencias líder de conejo (SEQ ID NO: 57 y 58, respectivamente), y en el extremo terminal C del dominio constante de la HC de IgG1 humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 55. Se utilizaron las secuencias de acuerdo con la siguiente tabla, que tienen una cisteína en la posición 41 de la HCVR de acuerdo con la numeración de Kabat (T abla 3).
Tabla 3. HCVR LCVR de variantes humanizadas de HC-41C
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b) Estrategia de construcción y clonación de vectores
Para la expresión de las cadenas de anticuerpos se utilizó un derivado del vector de expresión de mamíferos pcDNA3.3 disponible comercialmente (Thermo Fisher), que contiene un casete de expresión CMV:BGHpA. Este vector se adaptó ligeramente cambiando el sitio de clonación múltiple secuencia abajo del promotor de CMV para contener sitios de restricción AscI y NheI, dando lugar al vector de expresión 0080pcDNA3.3-SYN.
Los ADNc para la HC y la LC del constructo se ligaron directamente en el vector 0080pcDNA3.3-SYN, usando sitios de restricción AscI y NheI. Los vectores finales que contienen el casete de expresión de HC o LC (CMV:HC:BGHpA y CMV:LC-BGHpA, respectivamente) se transfirieron y expandieron en células NEB 5-alfa de E. coli. La producción a gran escala de los vectores de expresión finales para la transfección se realizó usando kits Maxiprep o Megaprep (Qiagen).
c) Expresión transitoria en células de mamífero
Se transfectaron células Expi293F disponibles comercialmente (Thermo Fisher) con los vectores de expresión usando el agente de transfección ExpiFectamine de acuerdo con las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: se sembraron 75x107 células en 300 ml de medio FortiCHO, se combinaron 300 |jg del vector de expresión con 800 j l de agente de transfección ExpiFectamine y se añadió a las células. Un día después de la transfección, se añadieron al cultivo 1,5 ml de Potenciador 1 y 15 ml de Potenciador 2. Seis días después de la transfección, se recogió el sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación a 4.000 g durante 15 minutos y se filtró el recogido clarificado sobre filtros de botella PES/filtros MF 75 (Nalgene).
Mediciones de afinidad utilizando un ensayo basado en células
Los anticuerpos anti-5T4 humanizados tienen una afinidad similar por 5T4 hu y 5T4 cyno medida en células CHOZN que expresan 5T4 hu o 5T4 cyno, excepto para los anticuerpos anti-5T4 humanizados 825a, 825b y 825c, que muestran 2 a 3 veces menor unión a 5T4 cyno en comparación con 5T4 hu (Tabla 4). En comparación con la unión de H8 a 5T4 cyno, la unión es de 4 a 17 veces mejor para los anticuerpos anti-5T4 humanizados. En comparación con A1, la unión se mejora de manera similar. La afinidad de los anticuerpos anti-5T4 humanizados por las células CHOZN que expresan 5T4 hu es comparable a la de H8.
Tabla 4. La afinidad de los mAb humanizados con la mutación HC-41C y un mAb quimérico con mutación HC-41C medida en células CHOZN ue ex resan 5T4 hu 5T4 c no
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continuación
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Protocolo general de conjugación específica del sitio
A una solución de anticuerpo anti-5T4 modificado con cisteína (5-10 mg/ml en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6) se le añadió EDTA (25 mM en agua, 4% v/v). El pH se ajustó a ~ 7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió TCEP (10 mM en agua, 20 equivalentes) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1-3 horas. El exceso de TCEP se eliminó mediante una columna de desalación PD-10 o un concentrador centrífugo Vivaspin (corte de 30 kDa, PES) usando histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6. El pH de la solución de anticuerpo resultante se elevó hasta ~ 7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió ácido deshidroascórbico (10 mM en agua, 20 equivalentes) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1-2 horas. Se añadió DMA seguido de una solución de fármaco enlazador (10 mM en DMA). La concentración final de DMA fue del 5 al 10%. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 1-16 h. Con el fin eliminar el exceso de fármaco enlazador, se añadió carbón activado y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El carbón se eliminó usando un filtro PES de 0,2 pm y el ADC resultante se formuló en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6 usando un concentrador centrífugo Vivaspin (corte de 30 kDa, PES). Finalmente, la solución de ADC se filtró en forma estéril usando un filtro de PES de 0,22 pm.
Protocolo general de conjugación (aleatoria) para conjugación a través de cisteínas de enlace disulfuro entre cadenas nativas parcialmente reducidas (conjugación de tipo silvestre o wt)
A una solución de anticuerpo anti-5T4 (5-10 mg/ml en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6), se le añadió EDTA (25 mM en agua, 4% v/v). El pH se ajustó a ~7,4 usando TRIS (1 M en agua, pH 8), después de lo cual se añadió TCEP (10 mM en agua, 1-3 equivalentes dependiendo del anticuerpo y de la DAR deseada) y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Se añadió DMA seguido de una solución de fármaco enlazador (10 mM en DMA). La concentración final de DMA fue del 5 al 10%. La mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente en ausencia de luz durante 1-16 h. Con el fin de eliminar el exceso de fármaco enlazador, se añadió carbón activado y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. El carbón se eliminó usando un filtro PES de 0,2 pm y el ADC resultante se formuló en histidina 4,2 mM, trehalosa 50 mM, pH 6 usando un concentrador centrífugo Vivaspin (corte de 30 kDa, PES). Finalmente, la solución de ADC se filtró en forma estéril usando un filtro de PES de 0,22 pm.
Utilizando los procedimientos generales anteriores, se sintetizaron y caracterizaron los ADC modificados con cisteína y de tipo silvestre con base en vc-seco-DUBA (SYD980; es decir, compuesto 18b, n = 1 en el Ejemplo 10 en la página 209 del documento WO2011/133039), utilizando cromatografía analítica de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), cromatografía de fase hidrófoba protegida (SHPC), RP-HPLC y pruebas de endotoxinas LAL.
Para la HIC analítica, se inyectaron 5-10 pl de muestra (1 mg/ml) en una columna TSKgel Butyl-NPR (4,6 mm de diámetro interno x 3,5 cm de longitud, Tosoh Bioscience, Cat. No. 14947). El método de elución consistió en un gradiente lineal desde tampón A al 100% (fosfato de sodio 25 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 6,95) hasta 100% de tampón B (fosfato de sodio 25 mM, pH 6,95, isopropanol al 20%) a razón de 0,4 ml/min durante 20 minutos. Se utilizó un sistema UPLC Clase H Acquity de Waters equipado con detector de PDA y el software Empower. Se midió la absorbancia a 214 nm y se determinó el tiempo de retención de los ADC.
Como se hizo evidente mediante HIC analítica, hubo diferencias en los tiempos de retención (RT) para la especie DAR2 de los diferentes ADC modificados con cisteína. Además, el RT de la especie DAR2 de la mayoría de los ADC modificados fue más bajo que el RT del conjugado de H8 wt (Tabla 5) y el aumento en el tiempo de retención (RTdar2-RTdarü) tras la conjugación de dos fármacos enlazadores es menor para los ADC humanizados con HC-41C modificado en comparación con el aumento para el H8-vc-seco-DUBA wt. Todos los ADC humanizados modificados tienen un valor RTdar2-RTdar0 de entre 2,1-3,1, que es más bajo que el valor RTdar2-RTdar0 de H8-vc-seco-DUBA wt de 3,5, lo que indica que los ADC humanizados modificados presentan una menor hidrofobicidad.
Tabla 5. La hidrofobicidad de los ADC vc-seco-DUBA mediante HIC analítica
Figure imgf000017_0002
Citotoxicidad in vitro
Las afinidades de unión al antígeno de los ADC anti-5T4 (específicos del sitio) no se vieron afectadas por el fármaco enlazador unido derivado de duocarmicina, medido en células CHOZN que expresan 5T4 hu o 5T4 cyno (Figuras 1 y 2). Como se esperaba, el ADC de control sin unión (rituximab-vc-seco-DUBA) tuvo un efecto sobre el crecimiento de las células tumorales que expresan 5T4 solo a altas concentraciones. Todos los ADC anti-5T4 humanizados estaban inactivos (CI50 > 10 nM) en SK-MEL-30, una línea de células tumorales humanas negativas para 5T4 (aproximadamente 400 sitios de unión al antígeno 5T4 por célula).
Las potencias de los ADC anti-5T4 humanizados modificados fueron comparables a la potencia del ADC H8-wt conjugado convencionalmente en células MDA-MB-468 que expresan 5T4 humano y células PA-1 (Tabla 6). Sin embargo, la serie ADC 833 no pudo disminuir completamente la viabilidad de las células PA-1 (eficacia del 65 al 72%). Además, los ADC anti-5T4 humanizados modificados fueron 2,5 veces más potentes que el A3-vc-seco-DUBA y más de 14 veces más potentes que el A1-vc-seco-DUBA.
Tabla 6. Citotoxicidad in vitro de los ADC vc-seco-DUBA en células tumorales humanas ue ex resan 5T4
Figure imgf000017_0001
continuación
Figure imgf000018_0001
Estudio de eficacia in vivo
La eficacia in vivo de los ADC anti-5T4 se evaluó en un modelo de xenoinjerto de línea celular BT474 (carcinoma ductal de mama invasivo de una paciente caucásica de 60 años) en ratones B6; D2-Ces1ce Foxn1nu/J. La tinción inmunohistoquímica confirmó la presencia de 5T4 hu en la membrana celular de la línea celular BT474.
Se indujeron tumores por vía subcutánea inyectando 2x107 células BT-474 en 200 pl de medio RPMI 1640 que contenía Matrigel (50:50, v:v) en el flanco derecho de 110 ratones desnudos Ces1ce hembra, 24 a 72 horas después de una irradiación de todo el cuerpo con una fuente y (2 Gy, 60Co, BioMep, Dijon, Francia). Cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de 200-300 mm3, se dosificó a los ratones con una única inyección de 3 mg/kg de ADC H8-vc-seco-DUBA, 833a-vc-seco-DUBA, 833b-vc-seco-DUBA, 833c-vc-seco-DUBA, 833d-vc-seco-DUBA, 825a-vcseco-DUBA o 825c-vc-seco-DUBA. Se utilizaron vehículo y ADC de rituximab-vc-seco-DUBA no enlazante como controles. Se excluyeron del análisis los ratones que tenían actividad Ceslc en plasma.
Todos los ADC anti-5T4 conjugados de forma específica del sitio redujeron el volumen tumoral más que e1H8-vcseco-DUBA de la técnica anterior (Figura 3), lo que indica una eficacia in vivo mejorada.
Farmacocinética in vivo
Se realizó un estudio farmacocinético con ADC anti-5T4 en la cepa de ratón B6(Cg)-Ces1ctm11Loc/J. Estos ratones carecen del exón 5 del gen Ceslc, lo que conduce a la eliminación de la función de la enzima. Se dosificó a los ratones con los ADC anti-5T4 (3 mg/kg, iv en la vena de la cola) y se recogió plasma a las 0,25, 1, 6, 24, 48, 96, 168, 336 y 504 horas después de la dosificación. Se utilizaron ensayos basados en ELISA para cuantificar el anticuerpo total y el anticuerpo conjugado. El ensayo de anticuerpo conjugado captura especies de ADC que contienen al menos un fármaco enlazador. Los resultados presentados en la Tabla 7 muestran que los ADC específicos del sitio son muy estables, se eliminan más lentamente y tienen una vida media más larga que el ADC H8-vc-seco-DUBA de la técnica anterior.
Tabla 7. Farmacocinética de los ADC anti-5T4 en ratones con inactivación de Ceslc
Figure imgf000018_0002
Listados de secuencia con secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 subrayadas en las secuencias de aminoácidos de la HCVR y LCVR
SEQ ID NO: 1 (HCVR del clon/pocillo 789 - conejo)
Figure imgf000019_0001
SEQ ID NO: 2 (LCVR del clon/pocillo 789 - conejo)
Figure imgf000019_0002
SEQ ID NO: 3 (HCVR del clon/pocillo 811 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTSLTLT CTASGFSLST YAMIWVRQAP GKGLEWIGII
51 NSSGYTYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGNAGIS 101 YDVSFNLWGQ GTLVTVSS
SEQ ID NO: 4 (LCVR del clon/pocillo 811 - conejo)
1 AYDMTQTPAS VEAGVGGTVT INCQASESIS SWLAWYQQKP GQPPNLLIYE
51 ASKLASGVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYCQQ GWTSSNIDNA 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 5 (HCVR del clon/pocillo 825 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YGMGWVRQAP GKGLEYIGII
51 SRNSVTYYAT WAKGRFTISK TSTTVDLKMT SPTTEDTATY FCARRATYSG 101 ALGYFDIWGP GTLVTVSF
SEQ ID NO: 6 (LCVR del clon/pocillo 825 - conejo)
1 GYDMTQTPAS VSAAVGGTVT INCQASENIY STLAWYQQKP GQPPKVLIYD
51 AFDLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISGVQS DDAATYYCQQ GYSGTNVDNA 104 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 7 (HCVR del clon/pocillo 828 - conejo)
Figure imgf000020_0001
SEQ ID NO: 8 (LCVR del clon/pocillo 828 - conejo)
1 DIVMTQTPSS VSAAVGGTVT INCQASQNIY SNLAWYQQKP GQRPKLLIYG 51 ASNLESGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLES DDAATYYCQS IDYGNNYLGS 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 9 (HCVR del clon/pocillo 829 - conejo)
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YDMSWVRQAP GKGLEYIGWI
51 NSDDGAYYAN WAKGRFTISR TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARDAGSTY 101 LYGLDPWGPG TLVTVSS
SEQ ID NO: 10 (LCVR del clon/pocillo 829 - conejo)
1 DVVMTQTPSS VSAGVGGTVT IKCQASQSIS SYLAWYQQKP GQRPKLLIYA
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTE YTLTINDLES ADAATYYCQC TYYGGTYNTF 101 GGGTEVVVK
SEQ ID NO: 11 (HCVR del clon/pocillo 833 - conejo)
1 QSLEESGGGL VTPGGSLTLT CTGSGIDLSH YVVGWVRQAP GKGLEWIGII
51 YGSGRTYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLRIA RPTAEDTATY FCARDASVSV 101 YYWGYFDLWG QGTLVTVSS
SEQ ID NO: 12 (LCVR del clon/pocillo 833 - conejo)
1 AYDMTQTPVS VEVAVGGTVT IKCQASQSIG SELAWYQQKP GQPPKLLIYR
51 ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTLTISGVES ADAATYYCQQ GYTYSEIDNA 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 13 (HCVR del clon/pocillo 834 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLST YSMSWVRQAP GKGLEWIGVI
51 SRGGSAYYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKVT SPTTEDTATY FCARGAISSG 101 YYVYDGMDLW GPGTLVTVSS
SEQ ID NO: 14 (LCVR del clon/pocillo 834 - conejo)
1 DIVMTQTPGS VEAAVGGTVT IKCQASESIS SYLAWYQQKP GQPPKFLIYS
51 ASTLASGVPS RFKGSGSGTE FTLTISDLES ADAATYYCQC TDYGSDYMGA 101 FGGGTGVVVK
SEQ ID NO: 15 (HCVR del clon/pocillo 835 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS GAMGWVRQAP GKGLEWIGLI
51 SSSPITYYAN WARGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTADTATY FCARGYDDYG 101 EIWFNIWGPG TLVTVSL
SEQ ID NO: 16 (LCVR del clon/pocillo 835 - conejo)
Figure imgf000021_0001
SEQ ID NO: 17 (HCVR del clon/pocillo 841 - conejo)
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CKASGFSLS TYWMSWVRQA PGKGLEWIGI_
51 MLSYGNTVYA NWAKGRFTIS KTSSTTVDLK ITSPTTEDTA TYFCARGLYG 101 GYPNYGVYDL WGQGTLVTVS S
SEQ ID NO: 18 (LCVR del clon/pocillo 841 - conejo)
1 DVVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIS SYLSWYQQKP GQPPKLLIYA
51 ASNLASGVSS RFKGSRSGTE YTLTISDLES ADAATYYCQC TDYGSNYVGA 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 19 (HCVR del clon/pocillo 843 - conejo)
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLNN AYMNWVRQAP GKGLEWIGII
51 NTYGSTYFAT WAKGRFTFSK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARAYAPFS 101 TYSHYYGMDL WGPGTLVTVS S
SEQ ID NO: 20 (LCVR del clon/pocillo 843 - conejo)
1 DVVMTQTPSS VSAAVGGTVT IKCQASESIG SWLSWYQQKP GQPPKLLIYE
51 ASKLTSGVPS RFKGSGSGTE YTLTISDLES ADAATYYCQY TDYGSNYLGT 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 21 (HCVR del clon/pocillo 845 - conejo)
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGIDLSS YTMNWVRQAP GKGLEWIGVI
51 TSHNTYYASW AKGRFTISKT STTVDLKITS PTTEDTATYF CARSNYGSTI 101 YYMGGMDPWG PGTLVTVSS
SEQ ID NO: 22 (LCVR del clon/pocillo 845 - conejo)
1 DVVMTQTPAS VSAAVGGTVT INCQASQSIG SYLAWYQHQP GQPPKLLIYS
51 ASTLESGVSS RFEGSRSGTE YTLTISDLDS ADAATYYCQC TDYGASYLGA 101 FGGGTEVVVK
SEQ ID NO: 23 (HCVR del clon/pocillo 847 - conejo)
Figure imgf000022_0001
SEQ ID NO: 24 (LCVR del clon/pocillo 847 - conejo)
1 DVVMTQTPAS VSEPVGGTVT INCQASQSIY SYLAWYQQKP GQRPKLLIYA
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES ADAATYYCQC TYYGGTFNTF 101 GGGTEVVVK
SEQ ID NO: 25 (HCVR del clon/pocillo 848 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSS YTMSWVRQAP GKGLEWIGII
51 SSIGSIWYAS WAKGRFTISK TSTTVDLKMT SLTTEDTATY FCARDGTGSK 101 YYTWDRLDLW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 26 (LCVR del clon/pocillo 848 - conejo)
1 NIVMTQTPSP VSGAVGGTVT INCQASQSIY NELSWYQQKP GQPPKLLIYY
51 TSTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTISGVES VDAATYYCQQ GYSSSDVDNVF 101 GGGTEVVVK
SEQ ID NO: 27 (HCVR del clon/pocillo 849 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSR YDMSWVRQAP GKGLEYIGYI
51 NRDGSAYYAN WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTDDTATY FCARHAGSTY 101 LYGMDPWGPG TLVTVSS
SEQ ID NO: 28 (LCVR del clon/pocillo 849 - conejo)
1 DVVMTQTPSS VSAAVGGTVT IKCQASQSIS NYLAWYQQKP GQPPKLLIYA
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTE FTLTISDLES ADAATYYCQC TYFGDTYNVF 101 GGGTEVVVK
SEQ ID NO: 29 (HCVR del clon/pocillo 868 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSD YTMGWVRQAP GKGLEWIGII
51 NGYGSTYYAN WAKGRFAISK TSTTVDLKIT SPATEDTATY FCARGDTGRT 101 YDMHFNLWGQ GTLVTVSS
SEQ ID NO: 30 (LCVR del clon/pocillo 868 - conejo)
1 AYDMTQTPAS VSAAVGGTVT IKCQASESIR SWLAWYQQKP GQPPKLLIYS
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTIGDLES ADAATYYCQQ GYTSSNLDNA 101 FGGGTEVLVK
SEQ ID NO: 31 (HCVR del clon/pocillo 899 - conejo)
1 AYDMTQTPAS VSAAVGGTVT IKCQASESIR SWLAWYQQKP GQPPKLLIYS_
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTIGDLES ADAATYYCQQ GYTSSNLDNA 101 FGGGTEVLVK
SEQ ID NO: 32 (LCVR del clon/pocillo 899 - conejo)
1 AYDMTQTPAS VSAAVGGTVT IKCQASESIR SWLAWYQQKP GQPPKLLIYS
51 ASTLASGVSS RFKGSGSGTQ FTLTIGDLES ADAATYYCQQ GYTSSNLDNA 101 FGGGTEVLVK
SEQ ID NO: 33 (HCVR del clon/pocillo 908 - conejo)
1 QSVEESGGRL VTPGTPLTLT CTVSGFSLSN FAMSWVRQAP GKGLEWIGII
51 NGYGSIYYAT WAKGRFTISK TSTTVDLKIT SPTTEDTATY FCARGDAGRT
101 YNHYFNIWGP GTLVTVSL
SEQ ID NO: 34 (LCVR del clon/pocillo 908 - conejo)
1 DVVMTQTPAS VEAAVGGTVT IKCQASQSIS SWLSWYQQKP GQRPKLLIYA
51 ASNLASGVPS RFKGSGSGTQ FTLTISDLES DDAATYYCQQ GYTSYNVDNA
101 FGGGTEVVVK
Secuencias de aminoácidos de la HCVR humanizada con posiciones preferidas para la mutación de cisteína 40, 41 y 89 subrayadas
SEQ ID NO: 35 (HCVR 789 humanizada versión 1)
1 EVKVEESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS SYWMSWVRQA PGKGLEWVSI
51 IAGRGSTYYA SWAKGRFTIS KDNSEGMVYL QMNSLRAEDT AVYYCARVSS
101 IYYTFNLWGQ GTTVTVSS
SEQ ID NO: 36 (HCVR 789 humanizada versión 2)
1 EVQLLESGGS LVLPGGSLRL SCAASGFSLS SYWMSWVRQA PGKGLEWVSI
51 IAGRGSTYYA SWAKGRFTIS RDNSKNTLYM QMNSLRAEDT ALYFCARVSS
101 IYYTFNLWGQ GTLVTVSS
SEQ ID NO: 37 (HCVR 789 humanizada versión 3)
1 QSVEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGFSLSS YWMSWVRQAP GKGLEWIGII
51 AGRGSTYYAS WAKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARVSSI
101 YYTFNLWGQG TLVTVSS
SEQ ID NO: 38 (HCVR 825 humanizada versión 1)
1 EVQLVESGGD LAQPGGSLRL SCAVSGIDLS SYGMGWVRQA PGKGLEWVSI
51 ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTVYL QMTSLRAEDT ALYFCARRAT
101 YSGALGYFDI WGQGTLVTVS S
SEQ ID NO: 39 (HCVR 825 humanizada versión 2)
1 EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS SYGMGWVRQA PGKGLEWVSI
51 ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARRAT
101 YSGALGYFDI WGRGTLVTVS S
SEQ ID NO: 40 (HCVR 833 humanizada versión 1)
1 EVQLVESGGG LIQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS KDNSKNTLYV RMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101 VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO: 41 (HCVR 833 humanizada versión 2)
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLFL RMNSLRVEDT AVYFCARDAS
101 VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO: 42 (HCVR 833 humanizada versión 3)
1 EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA PGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDAS
101 VSVYYWGYFD LWGRGTLVTV SS
SEQ ID NO: 43 (HCVR 833 humanizada versión 4)
1 QSLEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGIDLSH YVVGWVRQAP GKGLEWIGII
51 YGSGRTYYAN WAKGRFTISR HNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDASV
101 SVYYWGYFDL WGQGTLVTV SS
Secuencias de aminoácidos de la LCVR humanizada con posiciones preferidas para la mutación de cisteína 40 y 41 subrayadas.
SEQ ID NO: 44 (LCVR 789 humanizada versión 1)
1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGQPPKLLI
51 YYASTLASGV PDRFSGSGSG TDFTLTISSL QAEDVAVYYC QGSYYSGSGW
101 YYAFGGGTKL EIK
SEQ ID NO: 45 (LCVR 789 humanizada versión 2)
Figure imgf000026_0001
SEQ ID NO: 46 (LCVR 789 humanizada versión 3)
1 AQVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCQSSQSVY SNNELSWYQQ KPGKAPKLLI
51 YYASTLASGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QGSYYSGSGW 101 YYAFGGGTKV EIK
SEQ ID NO: 47 (LCVR 825 humanizada versión 1)
1 EIVMTQSPSS LSASVGDRVT ITCQASENIY STLAWYQQKP GKAPKLLIYD
51 AFDLASGVPS RFSGSGSGTD YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYSGTNVDNA 101 FGQGTKLEIK
SEQ ID NO: 48 (LCVR 825 humanizada versión 2)
1 GYDMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQASENIY STLAWYQQKP GKAPKLLIYD
51 AFDLASGVPS RFKGSGSGTE YTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYSGTNVDNA
101 FGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 49 (LCVR 833 humanizada versión 1)
1 DIQMTQSPST LSASVGDRVT ITCQASQSIG SELAWYQQKP GKAPKLLIYR
51 ASTLESGVPS RFSGSGSGTE FTLTISSLQP DDFATYYCQQ GYTYSEIDNA 101 FGQGTKVEIK
SEQ ID NO: 50 (LCVR 833 humanizada versión 2)
Figure imgf000026_0002
SEQ ID NO: 51 (LCVR 833 humanizada versión 3)
1 AYDMTQSPSS VSASVGDRVT ITCQASQSIG SELAWYQQKP GKAPKLLIYR
51 ASTLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GYTYSEIDNA 101 FGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 52 (HC de H8)
1 QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYSFT GYYMHWVKQS PGQGLEWIGR
51 INPNNGVTLY NQKFKDRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARST
101 MITNYVMDYW GQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 53 (LC de H8)
1 DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCKASQSVS NDVAWYQQKP GQSPKLLISY
51 TSSRYAGVPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQA EDVAVYFCQQ DYNSPPTFGG
101 GTKLEIK
SEQ ID NO: 54 (Secuencia líder de HA VT20)
1 MACPGFLWAL VISTCLEFSM A
SEQ ID NO: 55 (región constante HC del anticuerpo IgG1 humano)
1 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV
51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP
101 KSCDKTHTCP PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS
151 HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK
201 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC
251 LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
301 QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
SEQ ID NO: 56 (región constante k LC del anticuerpo IgG humano)
1 RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG
51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK
101 SFNRGEC
SEQ ID NO: 57 (Secuencia líder de conejo HC)
1 MGWTLVFLFL LSVTAGVHS
SEQ ID NO: 58 (Secuencia líder de LC de conejo)
1 MVSSAQFLGL LLLCFQGTRC
Secuencias de aminoácidos de la HCVR humanizada con mutación de cisteína en la posición 41 de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
SEQ ID NO: 59 (HCVR 825 humanizada versión 141C)
1 EVQLVESGGD LAQPGGSLRL SCAVSGIDLS SYGMGWVRQA CGKGLEWVSI
51 ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTVYL QMTSLRAEDT ALYFCARRAT 101 YSGALGYFDI WGQGTLVTVS S
SEQ ID NO: 60 (HCVR 825 humanizada versión 241C)
1 EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS SYGMGWVRQA CGKGLEWVSI
51 ISRNSVTYYA TWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARRAT 101 YSGALGYFDI WGRGTLVTVS S
SEQ ID NO: 61 (HCVR 833 humanizada versión 141C)
1 EVQLVESGGG LIQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS KDNSKNTLYV RMNSLRAEDT AVYYCARDAS 101 VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO: 62 (HCVR 833 humanizada versión 241C)
1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLFL RMNSLRVEDT AVYFCARDAS 101 VSVYYWGYFD LWGQGTLVTV SS
SEQ ID NO: 63 (HCVR 833 humanizada versión 341C)
1 EVQLEESGGG LVKPGGSLRL SCAASGIDLS HYVVGWVRQA CGKGLEWVSI
51 IYGSGRTYYA NWAKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARDAS 101 VSVYYWGYFD LWGRGTLVTV SS
SEQ ID NO: 64 (HCVR 833 humanizada versión 441C)
1 QSLEESGGGL VQPGGSLRLS CAASGIDLSH YVVGWVRQAC GKGLEWIGII
51 YGSGRTYYAN WAKGRFTISR HNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCARDASV 101 SVYYWGYFDL WGQGTLVTV SS

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-5T4 humanizado que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la región variable (VR) de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 1 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 2;
b. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 5 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 6; y
c. Secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 11 y secuencias de aminoácidos de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID NO: 12;
en las que las CDR están subrayadas en las SEQ ID NOs y
en el que el anticuerpo comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionado de las posiciones 40, 41 y 89 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones 40 y 41 de la región marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
2. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende
a. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 35 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45;
b. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 36 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 45;
c. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 44;
c. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 37 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 46;
e. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 40 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
f. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 41 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
g. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 42 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 49;
h. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 43 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 50;
I. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 38 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47;
j. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47; y
k. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 39 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 48;
en el que la secuencia de aminoácidos de la HCVR comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones seleccionadas entre las posiciones 40, 41 y 89 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y/o la secuencia de aminoácidos de la LCVR comprende al menos una cisteína modificada en una o más posiciones seleccionadas de las posiciones 40 y 41 de la región del marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat.
3. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la al menos una cisteína modificada está presente en una o más posiciones de dicho anticuerpo seleccionadas entre las posiciones 40 y 41 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones 40 y 41 de la región marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat, preferiblemente seleccionadas de la posición 41 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat y las posiciones 40 y 41 de la región marco de la cadena ligera de acuerdo con la numeración de Kabat, más preferiblemente al menos una cisteína modificada está presente en la posición 41 de región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat.
4. Un conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que un fármaco enlazador se conjuga de forma específica del sitio con el anticuerpo a través de al menos una cisteína modificada.
5. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 4 de Fórmula (I)
Figure imgf000030_0001
en la que
n es 0-3,
m representa una DAR promedio de 1 a 6,
R1 se selecciona de
Figure imgf000030_0002
y es 1 - 16 y
R2 se selecciona de
Figure imgf000030_0003
6. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con la reivindicación 5, en el que
n es 0-1,
m representa una DAR promedio de 1,5 a 2,
R1 es
Figure imgf000030_0004
y es 1-4, y
R2 se selecciona de
Figure imgf000030_0005
7. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 de Fórmula (II)
Figure imgf000031_0001
8. El conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el anticuerpo comprende la HCVR y la lCv R seleccionadas del grupo que consiste en:
a. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 61 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
b. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 62 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 51;
c. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 63 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 49;
d. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 64 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 50;
e. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 59 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 47; y
f. Secuencia de aminoácidos de la HCVR de la SEQ ID NO: 60 y secuencia de aminoácidos de la LCVR de la SEQ ID NO: 48;
en el que el fármaco enlazador está conjugado específicamente en el sitio con el anticuerpo a través de la cisteína modificada en la posición 41 de la región marco de la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat.
9. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o el conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, preferiblemente en forma de un polvo liofilizado.
10. El anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 para uso como un medicamento.
11. El anticuerpo, el conjugado de anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 10 para uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos y neoplasias malignas hematológicas.
12. El anticuerpo, el conjugado de anticuerpo-fármaco o la composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que los tumores sólidos humanos se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y mesotelioma.
13. Una combinación del anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el conjugado de anticuerpo-fármaco de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 con un anticuerpo terapéutico, un agente quimioterapéutico y/o un conjugado de anticuerpo-fármaco contra un objetivo relacionado con el cáncer diferente del antígeno 5T4 para uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos y neoplasias malignas hematológicas.
14. La combinación para uso de acuerdo con la reivindicación 13, en la que los tumores sólidos humanos se seleccionan del grupo que consiste en cáncer de mama, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer de pulmón y mesotelioma.
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