KR20240004708A - 넥틴-4 (nectin-4)를 표적하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

넥틴-4 (nectin-4)를 표적하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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웨이 저우
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다타오 류
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장쑤 맵웰 헬스 파마수티컬 알앤디 컴퍼니, 리미티드
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Abstract

폴리오바이러스 수용체-유사 분자 4( poliovirus receptor-like molecule 4) ((넥틴-4 (Nectin-4)) 를 표적 하는 항체-약물 접합체. 이 항체-약물 접합체는 넥틴-4 관련된 질환을 치료하는 약물을 제조하는데 사용될 수 있다. 이 항체-약물 접합체는 넥틴-4에 대하여 강하게 표적하는 성질 및 표적을 통한 강한 세포내섭취 (endocytosis) 효과를 가지며, 및 아주 우수한 종양-살상 효과를 가지고 있다.

Description

넥틴-4 (nectin-4)를 표적하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 및 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate), 특히 폴리오바이러스 수용체-유사 분자 4 (넥틴-4) (poliovirus receptor-like molecule 4) (Nectin-4) 를 표적하는 항체-약물 접합체 및 이를 제조하는 방법 및 이의 용도에 관련 된다.
본 출원과 관련된 교차-참고 문헌
본 특허 출원은 2021년 4월 30일에 출원된 중국 특허 출원 번호 CN202110481199.4의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로 본 문서에 포함된다.
넥틴 (Nectin) ((폴리오바이러스 수용체-유사 분자 (poliovirus receptor-like molecules)) 은 새로운 부류의 세포 부착 단백질이며, 이는 카드헤린 (cadherins)과 협동적으로 또는 독립적으로 세포-세포 부착을 조절한다. 넥틴은, 넥틴-1, -2, -3, 및 -4의 4 멤버 부류를 포함한다. 모든 넥틴은 세 개의 Ig-유사 루프 (Ig-like loops), 하나의 막통과 절편(transmembrane segment) 및 하나의 세포질 내 꼬리(cytoplasmic tail)가 있는 하나의 세포외 부위((extracellular region)를 가진다. 이 멤버들 중에, 넥틴-4 (Nectin-4) 는 배아 및 태반은 물론 종양 세포에서 특이적으로 발현되며, 일부 연구에서 다양한 종양 세포의 생성 및 발달과 상당히 연관되는 것으로 발견되었다. 예를 들어, 2394명의 종양 환자로부터 유래된 병리학적 절편의 분석에서 넥틴-4는 방광암, 유방암 및 췌장암으로 고통을 받고 있는 환자 집단에서 널리 발현 되고 있는 것으로 나타났다. 그러므로, 넥틴-4는 많은 종양 또는 암의 진단 및 치료에 중요한 표적이 되었다.
항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate, ADC) 기술은 항체가 종양 세포의 표면에 있는 특정 항원을 특이적으로 인식하는 항체의 능력을 이용하여 항 종양 약물 (예를 들어, 세포독성 제제, 세포증식억제 제제, 소-분자 화학요법 치료제, 등)을 표적 암 세포에 정확하게 전달하고, 항 종양 약물을 축적하고 세포 내로 방출시켜, 이로써 종양을 정확하게 죽이는 기술이다. 항체-약물 접합체는 일반적으로 세 부분, 즉 항체 또는 항체-유사 리간드, 소 분자 약물 및 이 두 개를 함께 연결하는 링커로 구성된다. 항체-약물 접합체는 적절한 분자량, 높은 안정성, 강력한 표적화 특성, 및 적은 독성 및 부작용 때문에 가장 유망한 항 종양성 약물 중 하나로서 간주되어 왔다.
그러나 성공적인 항체-약물 접합체 (ADC) 개발을 위하여 고려되어야 하고 및 설명되어야 할 많은 문제점들이 있다. 예를 들어, 항체는 질환 부위를 특이적으로 인식하도록 하여야 하고, 낮은 알러르기 항원성 (allergenicity)을 갖고, 및 식균작용(endocytosis)에 의해 효과적이고 및 빠르게 내부화 될 수 있으며; 항체 및 약물을 연결하는 링커는 혈액에서 높은 안정성을 가져야하고 및 표적 세포에서 소 분자 약물을 특이적으로 활성화시키고 효과적으로 방출시킬 필요가 있으며, 그렇지 않으면 정상세포에서 허용할 수 없는 수준의 독성을 가질 수 있으며, 결합되는 소 분자 약물은 강한 세포 살상 활성 및 이와 유사한 활성을 가질 필요가 있다. 현재 임상 시험에 있는 항체-약물 접합체에서, 높은-활성의 세포독성 소 분자 약물은 전형적으로 최적 약물-대비-항체 비율 (drug-to-antibody ratio, DAR) 2-4로 링커를 통해 항체 표면의 라이신 잔기(lysine residues) 또는 힌지 부위 (hinge region)의 시스테인 잔기(cysteine residues) 에 결합된다. 그러나, 항체 표면에 있는 많은 수의 라이신 잔기 (80 개 이상) 및 접합반응의 비-선택성으로 인해 확실하지 않은 수의 결합된 약물의 수가 불확실하고 접합 부위가 불확실하여 이는 결국 비-균일적인 항체-약물 접합체의 생산을 초래한다. 예를 들어, 표적 약물 트라스투쮸맵 (Trastuzumab) (항-HER2 항체) 및 미세소관(microtubule) 억제제 DM1 ((메이탄신 (maytansine)) 로부터 만들어진 항체-약물 접합체 T-DM1은 DAR 분포 0-8 (평균 DAR 3.5) 을 가진다. 마찬가지로, 항체의 힌지 부위에 단지 4 개의 체인간 이황화 결합 (iterchain disulfide bonds) 이 있지만, 최적의 평균 DAR (2-4) 를 달성하기 위하여 체인간 이황화 결합의 부분적인 환원이 요구된다. 그러나, 현재 구할 수 있는 환원제 (DTT, TCEP, 등)는 체인간 이황화 결합을 선택적으로 환원시킬 수 없기 때문에, 얻어진 접합체는 균일하지 않고 복수의 구성성분으로 구성된다. 구성성분중에, 주요 성분은 0, 2, 4, 6, 또는8의 DAR을 가지며 하나의 해당 특정 DAR을 가진 구성성분은 다른 접합부위로 인해 형성된 동족체 (isomer)에서 일어난다. ADC 생산물의 이질성은 구성성분 간의 약동력학 특성, 효능, 및 독성의 이질성을 초래할 수 있다. 예를 들어, 더 높은 DAR을 가진 구성성분은 생체 내에서 좀 더 빠르게 제거되어 독성이 더 높아진다.
아스텔라스(Astellas)와 협력하고 있는, 시애틀 지네틱스 (Seattle Genetics)사가 무작위 접합을 통해 이들의 고유한 링커 mc-vc-MMAE 및 항-넥틴-4 항체 엔포튜맵을 사용하여 엔포투맵 베도틴 (Enfortumab Vedotin) ((파드세브 (Padcev))으로 불리는 항-넥틴-4 항체-약물 접합체(anti-Nectin-4 antibody-drug conjugate)를 제공하였다. 한 임상 시험 결과에서 화학요법 및 PD-1/PD-L1 억제제 용법을 받는 환자에서, 엔포투맵 베도틴을 투여받은 환자는 생존기간이 12.9개월의 평균 전반적인 생존기간을 보였으며, 이는 대조군에서 항암요법을 받은 환자보다 3.9 개월 더 긴 생존율은 보였으며, 이로써 엔포투맵 베도틴에 의한 종양 치료에서 좋은 효율을 보였다. 그러나, 임상 연구에서는 또한 엔포투맵 베도틴 치료는 자주 발열, 피부 가려움증, 말초 신경증, 안구 건조증, 호중구감소증, 등을 수반한다는 것이 발견되었다. 이 부작용 반응은 소 분자와 항체의 과도한 커플링 및 불안전한 커플링 방법과 직접적으로 관련된다.
그러므로, 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 연구 및 개발을 위한 효율적이고, 간단하고, 및 실질적인 화학적 접합 방법이 여전히 시급한 상황이다.
발명의 요약
본 발명에 의해 해결되어야 할 기술적인 문제는 하이브리도마 스크리닝 (hybridoma screening) 및 인간화 (humanization) 기술을 사용하여 인간 넥틴-4(Nectin-4) 에 높은 친화력을 가지고 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 제공하는 것으로, 이에 의해 항체는 인간화 디자인을 통해 가장 적은 수의 쥐 아미노산 서열을 가지며 및 이로써 더 좋은 생체 내 안전성 및 적용 관점을 가지며; 이 항체에 기반을 두어, 좀 더 강한 내부화 효과 (internalization effect) 를 가진 항체를 추가로 스크리닝하고, 이 항체는 소-분자 화학적 약물과 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 로 제조된다. 이 항체-약물 접합체는 항체가 넥틴-4 발현하는 세포를 표적하는 것과 표적 넥틴-4를 통한 강한 내부화 효과를 조합하여, 소-분자 화학적 약물의 작용으로, 아주 우수한 종양 살상 효과를 달성할 것이다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 넥틴-4에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 제공하는 것이다. 본 발명의 맥락에서, 항체의 단편은 항체의 다양한 기능적 단편, 예를 들어, Fab, F(ab')2, 또는 scFv 단편과 같은 이의 항원-결합 부분을 포함한다. 본 발명의 또 다른 목적는 상기 항체 또는 이의 단편을 이용하여 제조된 넥틴-4 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체를 제공하는 것이다.
본 발명은 하기의 기술적 해결방안을 제공한다.
한 관점에서, 본 발명은 약물에 공유결합으로 결합된 항-넥틴-4 항체(anti-Nectin-4 antibody) 또는 이의 단편을 포함하는, 넥틴-4(Nectin-4) 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 각각 하기와 같이 중쇄 상보성 결정 부위 (heavy chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3) 및 경쇄 상보성 결정 부위 (light chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
(i) 서열 번호 11, 서열 번호 12 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3;
(ii) 서열 번호 11, 서열 번호 17 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 18, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3;
(iii) 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3.
바람직하게, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기와 같은 식을 가진다: Ab-[L-CTD]m으로, 여기서 Ab는 항-넥틴-4 항체(anti-Nectin-4 antibody) 또는 이의 단편을 나타내고, L은 링커를 나타내고, CTD는 약물을 나타내며, m은 하나의 항체 분자 당 결합된 약물의 평균 수를 나타낸다.
바람직하게, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, CTD는 세포독성 약물이고; 바람직하게, CTD는 미세소관(microtubule) 억제제 MMAE, DM1, DM4, 튜브라이신 (Tublysin), 아마니틴 (amanitin), 칼리체아마이신(calicheamicin), 에리블린 (Eribulin) 및 이의 유도체; 토포이소머라제 억제제 (topoisomerase inhibitors) SN38, 엑사테칸 (Exatecan) 및 이의 유도체; 및 DNA 결합제제 PBD, 독소루비신 (doxorubicin) 및 이의 유도체 로:구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다.
m은 1.0 내지 5.0 이고, 바람직하게 3.0 내지 4.2, 보다 바람직하게 3.5 내지 4.5이고, 더욱 바람직하게 3.8 내지 4.2이고, 더욱 바람직하게 3.9내지 4.1이고, 특히 바람직하게 4.0이다.
바람직하게, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에서 포함된 중쇄 및 경쇄는 중쇄 가변 부위 (heavy chain variable region, VH) 및 경쇄 가변 부위 (light chain variable region, VL)를 각각 포함하며, 여기서 중쇄 가변 부위 (VH) 는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 및 경쇄 가변 부위 (VL)는 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호6, 또는 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
좀 더 바람직하게, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 가변 부위 (VH) 및 경쇄 가변 부위 (VL)는 각각 하기를 포함한다:
(i)서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체 (varient); 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체;
(ii) 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체;
(iii) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는
(iv) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체.
본 발명의 맥락에서, 아미노산 서열의 "변이체 (varient)" 는 적어도 75% 서열 동일성 (75% 보다 더 크거나 75%와 동등한 퍼센트, 예를 들어, 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 좀 더 바람직하게 적어도90%, 더욱 바람직하게 적어도91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 심지어 99% 까지 동일성이 있는 등) 을 갖는 아미노산 서열을 의미한다.
특히, 본 발명에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은, 적어도 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 포함하며, 이 둘은 상기와 같은 CDR 및 산재된 프레임워크 부위 (Framework Regions, FRs) 포함하고, 이 도메인들은 다음과 같이 배열되어 있다: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. 그러므로, 본 발명에 의해 제공된 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위에 관련하여, “적어도 75% 서열 동일성”으로 인한 최대 25%까지의 차이는 중쇄 가변 부위 또는 경쇄 가변 부위의 어느 프레임워크 부위에 존재할 수 있다. 또는 전반적으로 본 발명에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에 관련하여, 최대 25%의 차이는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위 이외의 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편에 있는 어느 도메인 또는 서열에 존재할 수 있다. 이러한 차이는 어느 위치에서의 아미노산 결실, 첨가 또는 치환으로 인해 발생할 수 있으며 치환은 보존적 치환 (conservative substitution) 또는 비-보존적 (non-conservative substitution) 일 수 있다.
본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 어느 형태, 예를 들어, 넥틴-4에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 체인 항체 (single chain antibody), 디아바디 (diabody), 단일 도메인 항체 (single domain antibody), 나노바디 (nanobody), 전적으로 또는 부분적으로 인간화된 항체 (fully or partially humanized antibody) 또는 키메릭 항체 (chimeric antibody ) 및 이와 유사한 형태이다; 다른 한편으로, 항체 또는 이의 단편은 넥틴-4에 대한 반쪽-항체 (half-antibldy) 또는 반쪽-항체의 항원-결합 단편, 예를 들어, 단일-체인 가변 단편 (single-chain variable fragment, scFv), 2가 단일-체인 가변 단편 (bivalent single-chain variable fragment, BsFv), 이황화-안정화된 가변 단편 (disulfide-stabilized variable fragment, dsFv), (이황화-안정화된 가변 단편)2 ((disulfide-stabilized variable fragment)2 ,(dsFv)2), 항원-결합 단편 (antigen-binding fragment, Fab), Fab' 단편 (Fab'), F(ab')2 단편(F(ab')2), 또는 가변 단편(variable fragment, Fv) 이다. 본 발명에서 제공된 단편에 관하여, 바람직하게, 이 단편은 포유류 넥틴-4, 바람직하게 영장류 넥틴-4, 좀 더 바람직하게 인간 넥틴-4에 결합할 수 있는 항체의 어느 단편이다.
바람직하게, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 추가로 고정 부위(constant region)를 포함할 수 있다. 바람직하게, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 추가로 인간 또는 쥐 중쇄 고정 부위 (CH) 및/또는 경쇄 고정 부위 (CL)를 포함하고, 좀 더 바람직하게, IgG, IgA, IgM, IgD 및IgE의 고정 부위로 구성된 그룹으로부터 선택된 중쇄 고정 부위 및/또는 카파(kappa) 또는 람다 (lambda) 타입 경쇄 고정 부위를 포함한다.
바람직하게, 항체는 단일클론 항체, 바람직하게 쥐, 키메릭, 또는 인간화된 단일클론 항체이다; 좀 더 바람직하게, 단일 클론 항체의 중쇄 고정 부위는 IgG1 또는IgG4 서브타입이고 단일 클론 항체의 경쇄 고정 부위는 카파 타입이다. 다른 한편으로, 예를 들어, 항체는 면역글로블린, 특히 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM, 이다, 예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 또는IgM의 인간 서브타입, 좀 더 바람직하게 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입이다.
본 발명의 한 특정 실시 예에 따라, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 고정 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 다른 한편으로, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 고정 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 상기 정의된 대로, 아미노산 서열의 “변이체 (varient)”는 아미노산 서열과 적어도 75% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 의미한다.
추가로, 본 발명에 의해 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기의 화학식 Ia 및/또는 Ib 로 나타내는 구조를 가진다:
Ia
및/또는
Ib
여기서:
Ab는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편이고;
Ar'은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌 (C6-C10 arylene) 및 치환된 또는 비치환된 5-12 원 헤테로아릴렌 (heteroarylene)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나이고, 여기서 치환은 그룹에 있는 수소 원자가 할로겐 (halogen) (F, Cl, Br 또는I), 할로겐화 된 알킬 (halogenated alkyl) ((예를 들어, 할로겐화 된C1-C6 (halogenated C1-C6 alkyl), 바람직하게는 할로겐화 된C1-C4 알킬 (halogenated C1-C4 alkyl), 예를 들어, 트리플루오로메틸 (trifluoromethyl)) 및 알콕시 (alkoxy) ((예를 들어, C1-C6 알콕시, 바람직하게 C1-C4 알콕시, 예를 들어, 메톡시(methoxy) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다;
L1 은 Ar'에 연결된 -O(CH2CH2O)n- 이고, 여기서 n은 1내지 24의 범위에 있는 어느 정수, 바람직하게 1 내지 10, 좀 더 바람직하게 3 내지 5의 범위의 정수이다;
L2는 효소 절단 가능한 단편, 예를 들어 디펩티드 (dipeptide) 또는 트리펩티드(tripeptide) 또는 테트라펩티드 (tetrapeptide) 또는 절단 가능한 자체-소멸되는 링커와 이들의 조합(즉, 2-4개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 단편, 또는 절단 가능한 자체-소멸되는 링커와 폴리펩티드 단편의 조합) 으로, Val-Ala, Val-Ala-PAB, Val-Cit, Val-Cit-PAB, Phe-Lys-PAB, Ala-Ala-Ala, Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG), MAC 글루크로나이드페놀 (MAC glucuronide phenol) 과 같은 것이다.
바람직하게, L2-CTD 는 VcMMAE, GGFG-Dxd 또는VC-seco-DUBA 이다.
바람직하게, Ar'이 치환된 또는 비-치환된 5-12 원 헤테로아릴렌인 경우에, 헤테로원자는 N이다.
바람직하게, Ar'은 치환된 또는 비치환된 C6 아릴렌 (arylene) 또는 치환된 또는 비치환된 6 원 헤테로아릴렌 (heteroarylene) 이다.
본 발명의 특정한 실시 예에 따라, 본 발명에서 제공되는 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기의 구조를 가진다:
접합체 ADC-1:
접합체 ADC-2:
접합체 ADC-3:
접합체 ADC-4:
접합체 ADC-5:
접합체 ADC-6:
접합체 ADC-7:
다른 관점에서, 본 발명은 넥틴-4 또는 이의 염을 표적으로하는 항체-약물 접합체를 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기의 Ia 및/또는 Ib의 화학식으로 표시되는 구조를 가진다:
Ia
및/또는
Ib
그 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(1) 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편을 버퍼에서 환원제와 반응시켜, 환원된 항체 및 이의 단편을 얻는다;
(2) 단계 (1) 에서 얻은 환원된 항체 또는 이의 단편에 약물-링커 (링커-약물 접합체) 를 버퍼 및 유기 용매의 혼합물에서 접합시켜, 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체 또는 이의 염을 얻는다.
본 발명에서 제공된 제조 방법에서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 상기 정의된 대로이고; 약물-링커는 하기의 화학식 Ic로 표시된 구조를 갖는다:
Ic
여기서:
R 은 X 또는R'S 이고, 여기서 X는 할로겐 (F, Cl, Br 또는I), 바람직하게 Br 또는 I이고; R'은 치환된 또는 비-치환된 C6-C10 아릴 (aryl) 또는 치환된 또는 비-치환된 5-12원 헤테로아릴 (heteroaryl) 이고, 여기서 치환은 그룹에 있는 수조 원자가, 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬, 바람직하게 C1-C4 알킬), 알콕시((예를 들어, C1-C6 알콕시,바람직하게 C1-C4 알콕시, 좀 더 바람직하게 메톡시 (methoxy)), 할로겐 (F, Cl, Br 또는I), 에스터(ester), 아마이드(amide) 및 시아노(cyano) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다;
바람직하게, R 은 R'S이고, 여기서 R' 는 페닐 (phenyl) 또는 치환된 페닐 (substituted phenyl) 이고, 치환된 페닐에 있는 치환기는 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬, 바람직하게 C1-C4 알킬), 알콕시((예를 들어, C1-C6 알콕시, 바람직하게 C1-C4 알콕시, 좀 더 바람직하게 메톡시 (methoxy)), 할로겐 (F, Cl, Br 또는I), 에스터(ester), 아마이드(amide) 및 시아노(cyano) 로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게 R'은 페닐, 4-메틸포름아미도-치환된 페닐(4-methylformamido- substituted phenyl) (), 또는 4-포밀모르포린-치환된 페닐 (4-formylmorpholine-substituted phenyl) ( ) 이고; 및
Ar', L1, L2 및CTD는 상기 정의된 대로이다.
본 발명의 문맥에서, “약물-링커 (drug-linker)” , "[L-D]" , "약물-함유하는 링커 (drug-containing linker)", "링커-약물-접합체 (linker-drug conjugate)" 및 이와 유사한 것은 상호교환적으로 사용된다. 본 출원의 특정 실시 예에 따라, 약물-링커는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나이다:
A-1
A-2
A-3
A-4
A-5
A-6
A-7
B-1
B-2
B-3
B-4
B-5
B-6
B-7
C-1
C-2
C-3
C-4
C-5
C-6
C-7
바람직하게, 본 발명에서 제공되는 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a. 항체 환원: 항체 5-30 mg/ml의 농도를 함유하는 인산염 버퍼에 환원제를 ≥ 5.5: 1 (환원제: 항체)의 등가 몰비로 첨가하고, 및 환원제 및 항체를 반응시키는 단 환원제가TCEP, DTT, 2-MEA, 및DTBA로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상인 항체를 1.5 ~2시간 동안 반응시킨다;
b. 항체 접합: 단계 a 에서 얻어진 환원된 항체를 pH 6.5-7.8의 인산염 버퍼에 치환하여 넣고, 이로써 항체를 3.5-15 mg/mL의 농도로 인산염 버퍼에서 희석시켜 희석된 항체 용액을 얻는다; 유기 공유-용매 (organic co-solvent)에 용해되어 있는 약물-함유하는 링커(약물-함유하는 링커: 항체)를 4.5-6.5:1의 등가 몰비로 희석된 항체 용액에 첨가하고, 및 그 후 반응 시스템을 15-35 °C에서 교반시키면서 ≥ 0.5 시간 동안 반응시킨다, 여기서 유기 공유-용매는 DMA, DMSO, DMF, 및 CAN로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이다;
c. 소수성 크로마토그래피 (Hydrophobic chromatography): 얻어진 항체 접합체 산물을 소수성 필러(hydrophobic filler)를 사용하여 소수성 크로마토그래피를 통해 정제한다.
추가로 바람직하게, 제조 방법은 추가로 단계 b 이후에 또는 단계 C 이후에 하기의 단계를 포함한다:
d. 가수분해: 항체-접합체 생산물을 pH 7.4-9.0의 인산염 버퍼에 대체하여 넣고 이 버퍼를 35±10 °C에서 2-24 시간 동안 가열시켜, 가수분해 생산물을 얻는다.
바람직하게, 단계 a, b, 및 d에서 대체 (displacement) 는 분자체 (molecular sieves), 초원심분리 튜브 또는 한외여과 막을 사용하여 수행된다. 바람직하게, 단계 c에서 사용된 소수성 필러는 부틸 세파로즈 HP (Butyl Sepharose HP), 캡토 페닐 임프레스(Capto Phenyl Impres), 또는 부틸 세파로즈 FF (Butyl Sepharose FF) 일 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편을 제공한다. 상기와 같은 넥틴-4 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체에 포함된 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편에 관한 서술 및 정의는 이러한 관점에서 항-넥틴4-항체 또는 이의 단편에 적용된다. 세부적으로 서열에 관하여, 본 발명에서 제공되는 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편은 각각 하기와 같이 중쇄 상보성 결정 부위 (heavy chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄 상보성 결정 부위 (light chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3) 을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산을 가진 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3.
바람직하게, 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 및 경쇄는 중쇄 가변 부위 (heavy chain variable region, VH) 및 경쇄 가변 부위 (light chain variable region, VL)를 각각 포함하며, 여기서 중쇄 가변 부위 (VH)는 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 경쇄 가변 부위 (VL)는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함한다.
좀 더 바람직하게, 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 가변 부위 (VH) 및 경쇄 가변 부위 (VL) 는 다음을 포함한다:
A) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체 ; 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는(B) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체.
이 관점에서 추가로, 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편은 항체-약물 접합체의 항체 부분에 대하여 여기 상기에서 정의된 대로의 해당하는 특성을 또한 가질 수 있다.
상기와 같이 본 발명에서 제공하는 항체에 따르면, 본 발명은 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터로 클론 될 수 있고 이는 이어서 숙주 세포에 형질 감염(transfect) 또는 형질 전환(transform)될 수 있다. 따라서, 또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 이 벡터는 진핵세포 발현 벡터, 원핵세포 발현 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터 및 이와 유사한 것이 될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 벡터 또는 핵산 분자는 숙주 세포를 형질 전환 또는 형질 감염시키는데 사용되거나 또는 숙주 세포에 어떤 방법으로 든 들어가 항체의 보존 또는 발현 등에 사용될 수 있다. 그러므로, 추가의 관점에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하거나, 또는 본 공개의 핵산 분자 및/또는 벡터로 형질 전환되거나 형질 감염된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는, 박테리아 또는 곤충, 곰팡이, 식물 또는 동물 세포와 같은, 어느 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편은 이 기술 분야에서 알려진 임의의 통상적인 기술 어느 것을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 가변 부위 및/또는 경쇄 가변 부위 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에서 제공되는 핵산 분자로부터 얻어질 수 있으며 및 그 후 이들은 항체를 얻기 위하여 항체의 선택적인 다른 도메인과 함께 조립될 수 있으며; 대안으로, 본 발명에서 제공된 숙주세포는 숙주세포가 항체의 중쇄 가변 부위 및/또는 경쇄 가변 부위 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하도록 하는 조건하에서 배양시키고 및 이들을 항체로 조립한다. 선택적으로, 이 방법은 추가로 생산된 항체를 회수하는 단계를 포함한다.
넥틴-4 또는 이의 염을 표적 하는 항체-약물 접합체, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 핵산 분자, 벡터, 또는 숙주 세포는 조성물, 보다 구체적으로는 약학적 제제에 함유되어 실제로 필요에 따라 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 그러므로, 아직 추가의 관점에서, 본 발명은 또한 본 발명의 넥틴-4 또는 이의 염, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 숙주 세포를 표적화하는 항체-약물 접합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직하게, 이 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부속 물질 또는 부형제를 선택적으로 포함하는 약제학적 조성물이다.
아직 다른 관점에서, 본 발명은 종양 치료용 의약품의 제조에 있어서, 넥틴-4 또는 이의 염, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물을 표적 하는 항체-약물 접합체의 용도를 제공한다.
다른 한편으로, 본 발명은 이를 필요로 하는 개체에게 넥틴-4 또는 이의 염, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물을 표적 하는 항체-약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는 조양 치료하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 포유류, 바람직하게 영장류, 추가로 바람직하게 인간이다.
바람직하게 , 종양은 높은 넥틴-4 발현과 연관된 종양 또는 암이고; 바람직하게, 종양 또는 암은: 방광 암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 난소 암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer), 비-호치킨스 림프종(non-hodgkin's lymphoma), 호치킨스 림프종(hodgkin's lymphoma), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 전립선 암(prostate cancer), 비-소 세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소-세포 폐암(small cell lung cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 편평상피암 (squamous cell carcinoma), 신경교아세포종(glioblastoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 위장관 종양(gastrointestinal tumors), 전립선 암 (prostate cancer), 결장 암 (colorectal cancer), 신경교종 (glioma), 및 중피종(mesothelioma) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나이다.
본 발명의 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 하기에 상세하게 서술되며, 여기서:
도 1은 ADC 3d 특성규명 결과를 보여준다. 패널 1A: 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) 프로파일; 1B: 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusive Chromatography, SEC) 프로파일; 1C: 비-환원 모세관 전기영동-소듐 도데실 설페이트 (Non-Reducing Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate, NR-CE-SDS) 프로파일; 1D: 액체 크로마토그래피 질량 스펙트로메트리 (Liquid Chromatography Mass Spectrometry, LCMS) 스펙트럼.
도 2는 다양한 항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate, ADC) 의 생체 내 효능의 결과를 보여준다.
도 3은 다양한 ADC의 생체 내 효능의 결과를 보여준다.
도 4는 다양한 ADC의 생체 내 효능의 결과를 보여준다.
도 5는 다양한 ADC의 생체 내 효능의 결과를 보여준다.
도 6는 다양한 ADC의 생체 내 효능의 결과를 보여준다.
바람직한 실시 예의 상세한 서술
본 발명은 특정 실시 예시를 참조하여 서술된다. 이 분야 기술에 통상 전문가는 이들 실시 예시들이 단지 본 발명을 보여주기 위한 것이며 및 본 발명의 범위를 어떤 방식으로든 제한하려는 것을 아니라는 것을 이해 할 것이다.
하기 실시 예시들의 실험적 공정은 달리 특별히 구체화하지 않는 한 모두 통상적인 것이다. 하기의 실시 예시에서 사용된 원료 및 시약은, 달리 특별히 구체화하지 않는 한, 상업적으로 구할 수 있는 것이다.
실시 예시 그룹 1 항-넥틴-4 항체의 스크리닝 및 제조
생쥐를 재조합 인간 넥틴-4 단백질 ((노보프로테인 과학 회사(Novoprotein Scientific Inc.)에서 구입, Catalog No.: CJ19 ))로 면역화시켰으며, B 세포가 면역화된 생쥐로부터 얻어졌으며 인간 넥틴-4 항원에 결합할 수 있는 양성 하이브리도마 세포를 스크리닝하기 위해 미리 제조된 SP20 골수종 세포와 융합시켰다. 단지 하나의 항체만 분비하는 각 양성 하이브리도마 세포주가 최종으로 얻어졌다.
항-넥틴-4 항체를 분비하는 하이브리도마 세포의 확장 배양 후에, 총 RNA가 세포로부터 추출한 후cDNA로 역전사되었다. 항체의 경쇄 가변 부위 IgVL (κ) 및 중쇄 가변 부위VH의 서열이 PCR로 증폭되었다. PCR 생산물은 정제되었으며 T 벡터에 라이게이트 (ligated) 되었다. 얻어진 벡터는 E. coli 세포에 형질전환시켰다. 세포의 확장 배양 후에, 플라스미드는 단일 클론 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 부위의 서열을 얻기 위하여 DNA 서열분석을 위하여 추출되었다.
각 생쥐 항-인간 넥틴-4 단일클론 항체의 중쇄 가변 부위 서열 및 공개된 인간 단일 클론 항체 IgG1 서브클래스 (서열 번호 9)의 중쇄 고정 부위 서열을 서로 스플라이싱(splice)하여 포유류 세포 발현 벡터에 구성시켰으며, 각 생쥐 항-인간 넥틴-4 단일클론 항체의 경쇄 가변 부위 서열 및 공개된 인간 단일 클론 항체 κ 서브클래스 (서열 번호 10)의 경쇄 고정 부위 서열을 서로 스플라이싱하고 포유류 세포 발현 벡터에 구성시켰다. 항-인간 넥틴-4 키메릭 항체 제조를 위하여 구성된 중쇄 및 경쇄 벡터는 짝으로 혼합시켰으며, HEK293 세포가 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine, PEI) 을 사용하여 이 벡터들로 형질 감염되었으며, 약 7일 후에 세포 상등액이 수집되었다. 항-인간 넥틴-4 키메릭 항체는 맵셀렉트 (Mabselect) 를 사용하여 얻었다.
항체 코딩 계획도 (antibody coding schemes)로 종합적인 분석에 따라, 6개의 상보성 결정 부위 (complementarity determining regions, CDRs) 의 아미노산 서열 및 각 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄의 보전적 3-차원적 형태를 지지하는 프레임워크 영역이 결정되었다. 이어서, 쥐 항체를 대부분 닮은 인간 항체의 중쇄 가변 부위 서열이 알려진 인간 항체 서열로부터 탐색되었으며, 예를 들어, IGHVl | IGHJ4*01가 선택되었다.
이것에 있는 플레임워크 부위 서열이 템플레이트 (template)로서 선택되었으며, 쥐 항체의 중쇄 CDR이 인간 항체의 프레임워크 부위와 조합되었으며, 인간화된 중쇄 가변 부위 서열이 궁극적으로 생산되었다. 같은 방식으로, 인간화된 경쇄 가변 부위 서열이 생산되었다. 결합 활성에서의 변화에 따라서, 플레임워크 부위에 있는 개별 아미노산은 복귀 돌연변이 (back mutation) 가 발생하여, 인간 아미노산에서 생주 아미노산으로 변으로 변경되고, 및/또는 만약 번역-후 수정이 일어났으면 각각의 아미노산은 수정되었다. 대안적인 인간화된 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위가 최종적으로 얻어졌다.
인간화된 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위는 쌍으로 조합되었으며, 인간화된 항체는 상기와 같은 키메릭 항체의 제조 과정을 참조하여 얻어졌다. 인간 넥틴-4 에 대한 시험관 내 세포-결합 에세이, 표적 암 세포에서 세포내섭취 (endocytosis) 에세이, 타겟 암 세포 증식 억제 에세이를 통해서 뿐만 아니라, 항체의 항원-결합 능력의 측정, 알려진 약물-함유하는 링커와 함께 ADCs로 제조될 때 내부화 활성 (internalization activity) 또는 약동력학 (pharmacodynamics), 및 이와 유사한 것의 측정을 통해, 다음과 같은 인간화 항체가 스크린 되었다 (밑줄 쳐진 CDRs과 함께):
42D20-hz63
VH (서열 번호 1; CDR은 코티아(CHOTHIA) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13,)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGGGKIYYNSVLKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKQGGLLFYAMDYWGQGTLVTVSS
VL (서열 번호 2; CDR은 코티아(CHOTHIA) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNTYSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSETDFTLTISSLQAEDLAVYFCQQHYNTPFTFGAGTKLELK
42D20-hz10:
VH (서열 번호 3; CDR은 코티아(CHOTHIA) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 11, 서열 번호 17, 서열 번호 13)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGDGKIYYNSVLKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKQGGLLFYAMDYWGQGTLVTVSS
VL (서열 번호 4; CDR은 코티아(CHOTHIA) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 18, 서열 번호 15, 서열 번호 16)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSYSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPFTFGAGTKLELK
hH2L1:
VH (서열 번호 5; CDR은 코티아(CHOTHIA) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 13, KABAT 숫자 메김 계획도에 따라)
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGGGKIYYNSVLKSRVTISKDNSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAKQGGLLFYAMDYWGQGTLVTVSS
VL (서열 번호 6; CDR순서에 따라: 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16, KABAT 숫자 메김 계획도에 따라)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNTYSQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPFTFGGGTKVEIK
hL2H1mut1:
VH (서열 번호 7; CDR은 카바트(KABAT) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 19, 서열 번호 20, 서열 번호 13)
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIDYGVSWIRQPPGKGLEWIGVIWGGGKIYYNSVLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKQGGLLFYAMDYWGQGTLVTVSS
VL (서열 번호 8; CDR은 카바트(KABAT) 넘버링 도식(CHOTHIA numbering scheme)에 따라 순차적으로 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 16)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNTYSQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYFASTRESGVPDRFSGSGSETDFTLTISSLQAEDLAVYFCQQHYNTPFTFGGGTKVEIK
실시 예시 그룹 2 항체-약물 접합체의 제조 및 물리화학적 특성규명
하기의 방법이 예시적인 실험에서 사용되었다:
2.1 약물-함유하는 링커 C-1, C-2, C-3, 및C-4의 제조
C-1
C-2
C-3
C-4
상기 화합물들은 WO2018/095422A1에 공개된 방법을 사용하여 합성되었으며 및 모든 생산물은 황색 고체이었다. LC-MS (ESI) M+1: 1927 (C-1), 1987 (C-2), 1963 (C-3) 및1995 (C-4), 각각.
약물-함유하는 링커 MC-VC-MMAE는 MCE (MedChemExpress)로부터 구입하였다.
2.2 부위-특이적으로 접합된 (site-specifically conjugated) 항체-약물 접합체의 제조
항체-약물 접합체의 제조 방법은 CN202011046911.X, 특허 출원에 서술되었으며 다음을 포함한다: 항체를 환원시켜 이황화 결합을 끊고, 환원된 항체를 약물-함유하는 링커와 접합시켜 항체-약물 접합체를 형성시키고; 항체-약물 접합체에 함유되어 있는 말레이미드 링 (maleimide ring) 을 가수분해를 통해 고리를 열고, 얻어진 생산물을 정제시켜 DAR 4를 가진 항체-약물 접합체를 제공한다 (CN202011046911.X 특허 출원의 내용 그 전문으로 여기 참고 문헌으로 포함된다).
사용된 예시적인 방법은 상세하게 하기와 같다:
샘플 환원 및 접합: 항체를 함유하는 샘플은 세파덱스 G-25 (Sephadex G-25)로 채워진 NAP-25 탈염 컬럼 (desalting column)을 사용하여, 50 mM 소듐 클로라이드 (sodium chloride) 및 50 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate) pH 7.4으로 구성된 버퍼에 대체되었으며, 여기서 항체 농도는10 mg/mL로 희석되었다. 희석된 항체 샘플 10mL (총 100mg)을 취하고, 여기에 10mg/ML 농도의 TCEP (Sigma-Aldrich) 수용액을 10:1 (환원제: 항체)의 등가 몰비로 첨가하였다. 2시간 배양 후에, 반응 용액은 세피덱스-G-25 탈염 컬럼(Sephadex G-25 desalting column)에서50 mM NaCl 및50 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트 (disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate) pH 7.0로 구성된 버퍼로 버퍼 교환되도록 하였다.
환원된 항체는 버퍼에 5 mg/mL로 희석시켰으며, 여기에 총 반응 부피의 7.4 %에 해당하는 1.33 mL 의 N,N-디메틸아세트아마이드 (N,N-Dimethylacetamide) ((DMA, 전-용매 (pre-sovent) 로서)) 5.5: 1 (약물: 항체)의 등가 몰비로 및 DMA 에 있는 약물-함유하는 링커 용액 (10 mg/mL)이 순서대로 첨가되었다. 반응은 실온에서 60분 동안 교반되었으며, 및 그 후 과량의 약물-함유하는 링커를 제거하기 위하여, 세파덱스G-25 (Sephadex G-25)로 채워진 NAP-25 탈염 컬럼 (desalting column)을 사용하여 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate), pH 8.0 으로 구성된 버퍼로 버퍼 교환되게 하였다. 얻어진 용액은 37 ℃ 수조 (water bath) 에서 3 시간 동안 가열시켰다. 수조에서 가열시키기 전 및 후에, 이 용액은 여기에 함유된 접합체 생산물의 구조를 질량 스펙트로메트리 (mass spectrometry)를 사용하여 분석하기 위하여 샘플되었다. 다양한 접합체 생산물의 분석 결과는 수조에서 가열시키기 전에, 접합체 생산물은 화학식 Ia로 나타내는 구조인 반면, 수조에서 가열 후에는 접합된 생성물에 대해 화학식 Ib로 나타내는 링이 완전히 개열된 구조, 즉 100% 가수분해된 구조가 얻어졌음을 보여주었다.
샘플 정제: 상기에 서술된 대로의 용액은 아미콘 (AMICOM) 한외여과 원심분리 (ultrafiltration centrifuge) 튜브를 사용하여 농축시켜, 약 15 mg/mL로 농축시켰다. 50 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate-sodium dihydrogen phosphate) 및 3M 암모늄 포스페이트 (ammonium phosphate )로 구성된 버퍼를 이 용액에 첨가시켜 전도율 (conductivity) 74 ms/cm가 달성되었다. 그 후 이는 부틸-세파로즈 4FF (Butyl-Sepharose 4 FF) (GE Healthcare 로부터 구입) 로 채워진 소수성 컬럼 (hydrophobic column) 에, 상 A (phase A): 50 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트 및0.45M 암모늄 설페이트 (ammonium sulfate)로 구성된 버퍼; 상 B (phasse B): 50mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트로 구성된 버퍼를 사용하여, 적용시켰다. 12 컬럼-부피의 상 B 로 0% 로부터 80%의 선상-구배 용출 (linear gradient elution) 및 100% 상 B의 등장 구배 용출이 수행되었으며, 주요 피크가 수집되었다.
얻어진 최종 샘플은 아미콘 (AMICOM) 한외여과 원심분리 튜브를 사용하여 50 mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트-소듐 디하이드로겐 포스페이트, pH 7.4로 구성된 버퍼로 버퍼 교환되게 하였으며, 이는 그 후 0.22 μm 필터(Sartorius stedim Ministart) 를 통해 여과시켰다.
만약 실제 반응 스케일이 1g 보다 크거나 또는 1g 과 같으면, 세파덱스G-25로 채워진 NAP-25 탈염 컬럼 및 아미콘 (AMICOM) 한외여과 원심분리 튜브는, 반응에 사용된 해당 비율은 변함이 없이, HYDRO-30kD (Sartorius) 한외여과 멤브레인 (ultrafiltration membrane) 으로 대체되었다. 다른 주요 매개변수들로 역시 변화되지 않았다.
2.3 부위-특이적 (site-specifically) 으로 접합된 항체-약물 접합체의 물리화학적 성질 규명
a. 약물-대-항체 비율 (UV-DAR 방법) 및 농도를 결정하기 위하여 사용되는 자외선 스펙트로포토메트리 (Ultraviolet spectrophotometry)
항체-약물 접합체의 농도가280 nm에서 UV 흡광도 및 소분자의 특징인 흡광 파장에서 측정하고 및 하기와 같이 계산하여 얻어질 수 있다.
a1. 무작위로 접합된 ADC의 약물-대-항체 비율 (drug-to-antibody ratio, DAR)의 결정
이는 문헌 [Clin Cancer Res. 2004 Oct 15;10(20):7063-70] 에서, DAR (약물-대-항체 비율) =라는 것이 알려졌으며, 여기서 는 280nm에서 항체의 몰 흡광 계수 (molar absorption coefficient) 이고, A280는 항체를 함유하는 항체-약물 접합체의 280 nm에서의 UV 흡광도이고, A248는 항체-약물 접합체에서 약물-함유하는 링커의 특징적인 흡광 파장인 248nm에서 항체-약물 접합체의 UV 흡광도이고, 는 약물-함유하는 링커의 특징적인 흡광 파장인 248nm에서 항체의 몰 흡광 계수이고, 는 248nm에서 약물-함유하는 링커의 몰 흡광 계수이고, 및
는 280nm에서 약물-함유하는 링커의 몰 흡광 계수이고, 및 여기서:
이다.
a2. 부위-특이적 (site-specifically) 으로 접합된 ADC의 약물-대-항체 비율 (DAR)의 결정
문헌 [Clin Cancer Res. 2004 Oct 15;10(20):7063-70] 에서, DAR (약물-대-항체) =
, 라는 것이 알려졌으며, 여기서 는 280nm에서 항체의 몰 흡광 계수 (molar absorption coefficient) 이고, A280는 항체를 함유하는 항체-약물 접합체의 280 nm에서의 UV 흡광도이고, A251은 항체-약물 접합체에서 약물-함유하는 링커의 특징적인 흡광 파장인 251nm에서 항체-약물 접합체의 UV 흡광도이고, 는 약물-함유하는 링커의 특징적인 흡광 파장인 251nm에서 항체의 몰 흡광 계수이고, 은 251nm에서 약물-함유하는 링커의 몰 흡광 계수이고, 및 는 280nm에서 약물-함유하는 링커의 몰 흡광 계수이고, 및 여기서:
이다.
참조: BL20E는 상기 C-3 화합물로부터 이탈기 R을 제거하고 및 말레이미드 링 (maleimide ring)을 열어서 얻어진 생산물이다.
a3. 항체-약물 접합체 (Antibody-drug conjugate, ADC) 농도의 결정
특정 파장에서 총 흡광도는 시스템에 존재하는 모든 흡수 화학 종 (absorbent chemical species)의 흡광도의 합과 동등하므로 (흡광도의 합산적 특성), 만약 ADC에 함유된 항체 및 약물-함유하는 링커의 몰 흡광 계수가 항체가 약물-함유하는 링커와 접합 전 및 후에 변하지 않는다면, 그러면 ADC의 농도는:
관계에 따른다.
그러므로, 항체-약물 접합체의 몰 농도 (mol/L) 는 이다.
그러므로, 항체-약물 접합체의 농도 (g/L)는
이고,
여기서 MWADC는 항체-약물 접합체의 분자량이고, MWab는 항체의 분자량이고, 및 MWD는 약물-함유하는 링커의 분자량이고; 및 단백질 농도는 DAR 값을 수식에 넣어 얻을 수 있다.
b-1. 부위-특이적으로 접합된 항체- 약물 접합체의 DAR 값을 결정하는데 사용된 소수성 크로마토그래피 (Hydrophobic chromatography, HIC-HPLC)
샘플 제조:샘플은 이동상 B를 사용하여 2.0 mg/mL로 희석되었으며,그 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었으며, 얻어진 상등액은 HPLC 분석을 위하여 취하였다.
크로마토그래피 컬럼:세팍스 프로테오믹스 HIC 부틸-NP5 (Sepax Proteomix HIC Butyl-NP5), 5 μm, 4.6 mm Х 35 mm;
이동상 A (Mobile phase A): 0.025 M 포스페이트(phosphate) + 1.2 M 암모늄 설페이트 (ammonium sulphate) (pH 7.0);
이동상 B (Mobile phase B): 0.025 M 포스페이트 (pH 7.0);
이동상 C (Mobile phase C): 100% IPA;
유속 (Flow rate): 0.8 mL/분;
검출 파장: 280 nm;
컬럼 온도: 30 ℃;
로딩 부피(Loading volume): 20 μL;
HIC 분석에 사용된 크로마토그래피 구배:
DAR 계산을 위한 공식:
DAR = Σ ((무게 피크 면적(weighted peak area)) / 100, 즉, DAR = ((D0 피크 면적 비율 (peak area ratio) Х 0 + D1 피크 면적 비율 Х 1 + D2 피크 면적 비율 Х 2 + D3 피크 면적 비율 Х 3 + D4 피크 면적 비율 Х 4 + D5 피크 면적 비율 Х 5 + D6 피크 면적 비율 Х 6 + D7 피크 면적 비율 Х 7 + D8 피크 면적 비율 Х 8)) / 100.
b-2. 무작위로 접합된 항체- 약물 접합체의 DAR 값을 결정하는데 사용된 소수성 크로마토 그래피 (Hydrophobic chromatography, HIC-HPLC)
샘플 제조:샘플은 이동상 B를 사용하여 2.0 mg/mL로 희석되었으며, 그 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었으며, 얻어진 상등액은 HPLC 분석을 위하여 취하였다.
크로마토그래피 컬럼: 토소 부틸 NPR (TOSOH Butyl NPR), 2.5 μm, 4.6 mm Х 100 mm;
이동상 A (Mobile phase A): 125 mM 포스페이트(phosphate) + 2.5 M 암모늄 설페이트 (ammonium sulphate) (pH 6.8);
이동상 B (Mobile phase B): 125 mM 포스페이트 (pH 6.8);
이동상 C (Mobile phase C): 100% IPA;
이동상 D (Mobie phase D): H2O;
유속 (Flow rate): 0.7 mL/분;
검출 파장: 280 nm;
컬럼 온도: 30 ℃;
로딩 부피(Loading volume): 10 μL;
HIC 분석에 사용된 크로마토그래피 구배:
DAR 계산을 위한 공식:DAR = Σ ((무게 피크 면적(weighted peak area)) / 100, 즉, DAR = ((D0 피크 면적 비율 (peak area ratio) Х 0 + D1 피크 면적 비율 Х 1 + D2 피크 면적 비율 Х 2 + D3 피크 면적 비율 Х 3 + D4 피크 면적 비율 Х 4 + D5 피크 면적 비율 Х 5 + D6 피크 면적 비율 Х 6 + D7 피크 면적 비율 Х 7 + D8 피크 면적 비율 Х 8)) / 100.
c. DAR 값을 결정하기 위하여 사용된 질량 스펙트로메트리 (Mass spectrometry) (LC-MS)
샘플 제조: 적절한 양의 샘플을 한외여과 튜브에 넣고, 50 mM NH4HCO3 (pH 7.1)로 구성된 버퍼로 버퍼 교환이 되게 하였다. 버퍼를 보충한 후에, 얻어진 샘플은 한외여과 원심분리 (13000 g Х 5분) 되게 하였다. 8 μL 의PNGase F 가 이 샘플에 첨가되었으며, 이는 이어서 당화를 없애기 위하여 37 ℃에서 5시간 동안 배양시켰다. 배양 후에, 샘플은 12000 rpm에서 5 분 동안 원심분리되었으며, 얻어진 상등액은 후에 검사를 위하여 테스트 샘플로서 샘플 바이알로 넣었다.
크로마토그래피 컬럼: PolyLC ® PolyHYDROXYETHYLA 컬럼, 300 , 5um, 2.1 mm Х 200 mm;
이동상: 0mM 암모늄 아세테이트 (mmonium acetate) pH 7.0;
운영 시간 (running time) 10분;
유속(Flow rate): 0.1 mL/분;
로딩 부피 (Loading volume): 2 μL;
컬럼 온도 : 25 ℃;
검출 파장: 280 nm;
이온화 모드 (Ionization mode): ESI 양성;
건조 가스 온도 (Drying gas temperature): 325 ℃;
건조 가스 유속 (Drying gas flow rate): 8 L/분;
분무기 압력(Atomizer pressure): 20 psig;
차단 가스 온도 (Sheath gas temperature): 325 ℃;
차단 가스 유속(Sheath gas flow rate): 12 L/분;
스캐닝 세팅 (Scanning setting): 900-8000 m/z.
d. 분자의 분자크기 이질성을 결정하기 위하여 사용된 크기 배제 크로마토그래피 (Size exclusion chromatography, SEC-HPLC)
샘플 제조:샘플은 이동상으로 1.0 mg/mL로 희석되었으며 그 후 12000 rpm에서 10분 동안 원심분리되었으며; 및 얻어진 상등액은 HPLC 분석을 위하여 채취하였다.
크로마토그래피 컬럼: 토소 (TOSOH), TSKgel G3000SWXL, 5 μm, 7.8 mm Х 300 mm;
이동상 (Mobile phase): 100 mM 포스페이트(phosphate) + 200 mM 아르기닌 하이드로클로라이드 (arginine hydrochloride), 5% 이소프로파놀 (isopropanol) (pH 6.8);
유속 (Flow rate): 0.6 mL/분;
컬럼 온도: 30 ℃;
로딩 부피(Loading volume): 20 μL;
용출 시간(Elution time): 25 분;
용출 구배 (Elution gradient): 등장 용출.
e. 순도를 결정하기 위한 비-환원성 모세관 전기영동-소듐 도데실 설페이트 (Non-Reducing Capillary Electrophoresis-Sodium Dodecyl Sulfate, NR-CE-SDS)
측정은 중국 약전 (Chinese Pharmacopoeia) 의 파트 IV의 일반적인 법칙 3127에 서술된 "단일 클론 항체의 분자 크기 변이체의 측정" 방법에 따라 수행되었다.
실시 예시 1: 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 제조 및 물리화학적 분석
항-넥틴-4 항체 Ref ((WHO 약물 정보 (WHO Drug Information) 에서 제공된 엔포투맵 (Enfortumab)의 서열을 참조하여 제조)), 42D20-hz63, 42D20-hz10, hH2L1, hH1L2mut1 및 관련없는 IgG1 (Bio-Rad Antibodies, Cat No.: MCA928) (각100 mg)를 약물-함유하는 링커 C-1 및 C-3각각으로, 실시 예시의 현재 그룹 2에2.2 부분 에서 서술된 대로 접합시켰으며, 부위-특이적으로 접합된 ADC 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f 및2a, 2b, 2c, 2d, 2e가 얻어졌다.
항-넥틴-4 항체 hH2L1를 약물-함유하는 링커 C-3와, 실시 예시의 현재 그룹 2에2.2 부분에서 서술된 대로, 특허 출원 CN202011046911.X에서 서술된 항체-약물 접합체 제조하는 방법을 사용하여, 큰 스케일로 접합시켰으며, ADC 3d가 얻어졌다.
항-넥틴-4 항체 42D20-hz63, 42D20-hz10, 및 IgG1 (각 100 mg)는 물론 Ref, hH2L1, 및 hH1L2mut1 (각 500 mg)이 약물-함유하는 링커 MC-VC-MMAE와, 특허 문서 US 2009/0010945 A1에 서술된 방법을 사용하여, 접합시켰으며, 무작위로 접합된 ADCs 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 및4f 가 얻어졌다.
얻어진 부위-특이적으로 접합된 ADC 및 무작위로 접합된 ADC의 물리화학적 특성이 실시 예시의 현재 그룹 2에 2.3 a, 2.3 b-1, 2.3 b-2, 2.3 d 는 물론 2.3 c, 및2.3 e 부분에서 서술된 대로 결정되었으며, 그 결과는 표 1 내지 3 및 도 1 에서 각각 제공된다.
넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 질적 성질 규명의 결과
ADC 항체 약물-함유하는
링커		 UV에 의한 DAR HIC 에 의한 DAR SEC (%)
1a Ref (Enfortumab) C-1 3.7 4.0 99.1
1b 42D20-hz10 C-1 4.2 4.0 98.7
1c 42D20-hz63 C-1 4.1 4.0 97.9
1d hH2L1 C-1 4.3 4.0 99.7
1e hH1L2mut1 C-1 4.4 4.0 99.3
1f IgG1 C-1 4.3 4.0 98.7
2a Ref (Enfortumab) C-3 3.9 4.0 99.3
2b 42D20-hz10 C-3 3.9 4.0 99.1
2c 42D20-hz63 C-3 4.0 4.0 98.5
2d hH2L1 C-3 4.0 4.0 99.4
2e hH1L2mut1 C-3 3.9 4.0 98.8
2f IgG1 C-3 3.7 4.0 97.9
3d hH2L1 C-3 4.0 4.0 98.7
넥틴-4를 표적하는 대조군 항체-약물 접합체의 질적 성질 규명의 결과
ADC 항체 약물-함유하는
링커 		UV에 의한 DAR HIC 에 의한 DAR SEC (%)
4a Ref (Enfortumab) MC-VC-MMAE 4.2 4.0 98.2
4b 42D20-hz10 MC-VC-MMAE 4.0 3.7 96.9
4c 42D20-hz63 MC-VC-MMAE 4.2 3.8 94.1
4d hH2L1 MC-VC-MMAE 4.1 4.2 98.5
4e hH1L2mut1 MC-VC-MMAE 4.1 4.3 99.3
4f IgG1 MC-VC-MMAE 4.2 4.2 99.5
가수분해 전후의 질량 스펙트로메트리(spectrometric)적인 성질 규명 결과
ADC 측정된 분자량 시스템에 있는 화합물
3d, 가수분해 전 155015 시스템에 있는 화학식Ia 및 화학식Ib의 혼합 화합물
3d, 가수분해 후 155034 시스템에 있는 화학식 Ib 화합물
질량 스펙트로메트리에 의한 분자량 측정은 가수분해 전의 샘플은 화학식 Ia 및Ib로 표시되는 구조를 가진 화합물의 혼합물을 함유하고 있는 반면, 가수 분해 후의 샘플은, 말레이미드 링 (maleimide ring)을 완전히 개열하여 얻어지는 , 화학식 Ib로 표시된 구조를 가진 화합물만 함유하는 것을 보였다.
실시 예시의 그룹 3 항체-약물 접합체의 시험관 내 살상 효과 및 생체 내 효능 연구
하기의 방법들이 예시적 실험에 사용되었다:
3.1 시험관 내 살상 효과 연구 방법
BT474 세포, 즉 인간 유방 관 암 세포 (breast ductal carcinoma cells) (ATCC로부터 구입) 가 이 실험에서 사용되었다. BT474 세포의 밀도는 완전 배지 (45 mL의 RPMI 1640 배지 및 5 mL 의 FBS 를 혼합하여 제조)에서 1.5Х104/mL로 조정되었다. 세포는 100 μL/웰로 세포 배양 플레이트에 첨가되었으며 및 하룻밤 동안 배양되었다. 다음날, ADC 샘플은 상기와 같은 완전 배지로 50 μg/mL로 희석되었으며, 이어서 4-배 구배로 희석하여 총 9개 구배 플러스 0 농도를 얻었다. 모든 샘플은 세 복제 웰로 (3 replicate wells) 제조되었다. 음성 대조군 (세포 + 배양 배지) 및 블랭크 대조군 (세포 없음, 배양 배지만)을 설정하였다. 희석된 ADC 샘플은 하룻밤-배양된 세포 배양 플레이트에, 100 μL/웰로 첨가되었다. 그 후 세포 플레이트는 세포 배양기에서 96시간 동안 배양되었다. 세포 배양 플레이트를 꺼내고 및 MTS가 플레이트에 40 μL/웰로 첨가되었으며, 이는 그 후 37℃ 배양기에서 2-4시간 동안 배양시켰다. 세포 플레이트는 꺼내고 및490 nm에서 OD값을 읽었다.
3.2 생체 내 효능 연구 방법
마우스 모델을 확립하기 위하여, BT474 세포, 즉 인간 유방 관 암세포 (breast ductal carcinoma cells) (ATCC로부터 구입) 및 MDA-MB-468 세포, 즉 인간 유방 암세포 (breast carcinoma cells) (ATCC로부터 구입) 가 누드 마우스 (Nude mice) (BALB/cJGpt-Foxn 1nu/Gpt, 4-5 주령)에 접종하기 위하여 각각 사용되었다. 종양이 100-200 mm3 로 자랐을 때, 생쥐는10 mL/kg 부피로 각각 정맥주사(IV)되었으며; 및 매개체 그룹 (vehicle group) 의 생쥐는 같은 부피의 매개체 (생리식염수)로 정맥주사되었다. 용법 및 투여 계획도는 상세하게 하기에 제시된다. 종양 부피는 주 당 2번 측정 되었으며 및 생쥐의 중량을 재고 및 데이터가 기록되었다.
실험이 끝났을 때, 실험의 종료점에 도달되었거나, 또는 만약 종양 부피가 1500 mm3에 도달되었을 때, 동물은 CO2 마취 하에서 희생시켰으며 종양을 해부하여 사진을 찍었다.
3.3 생체 내 효능 평가를 위한 방법
이 실험은 ADC 의 종양 성장에 대한 영향을 조사하기 위한 것이며, 특정한 지수 T/C (%) 또는 종양 성장 억제 ((Tumor Growth Inhibition , TGI (%))가 사용되었다.
종양 직경은 버니어 캘리퍼 (vernier caliper)를 이용하여 주당 2회 측정되었으며 종양 부피 (V)는 다음과 같이 계산되었다: V = 1/2 Х a Х b2, 여기서 a 및b는 각각 길이 및 너비이다.
T/C (%)= (T - T0) / (C - C0) Х 100, 여기서 T 및 C는 실험 종료시의 종양 부피이고; T0 및C0 는 실험 시작 일 때 종양 부피이다.
종양 성장 억제 (Tumor Growth Inhibition, TGI) (%) = 100 - T/C (%).
종양 감퇴가 일어났을 때, 종양 성장 억제 (TGI) (%) =100 - (T - T0) / T0 Х 100.
종양이 이의 초기 부피보다 줄어들면, 즉, T < T0 또는 C < C0인 경우, 부분 종양 감퇴 (Partial tumor regression, PR) 가 기록되며; 종양이 완전히 없어지면, 완전한 종양 감퇴 (complete tumor regression, CR)가 기록된다.
실시 예시 1 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 시험관 내 살상 효과 연구
다양한 약물-함유하는 링커를 다양한 항-넥틴-4 항체와 접합하여 생산된 ADC가 실시 예시 현재 그룹 3 에서의 3.1 부분에서 서술된 대로 그룹화되고 연구되었다. 다음과 같은 것이 발견되었다.
다른 항체들이 MC-VC-MMAE와 접합되어 ADC를 형성하였을 때, 항체 hH2L1이 접합된 ADC는 대조군 항체 Ref (엔포투맵)가 접합된 ADC에 비슷할 만한 수준의 시험관 내 살상 효과를 보인 반면, 항체 42D20-hz10, 42D20-hz63 및hH1L2mut1으로 접합된 ADC의 살상 효과보다 약간 더 좋은 살상 효과를 보였다. 더 나아가, ADC 2a, 1a, 및2e 사이의 비교에서는, 화합물 C-3 및 C-1은 비슷한 생체 내 활성을 가진 것으로 보였다. 이 결과는 표 4에 보여준다.
다양한 항체 및 약물-함유하는 링커의 시험관 내 살상 효과 연구
플레이트 # ADC 항체 약물-함유하는 링커 EC50 (ng/ml) 최대 세포 살상 퍼센트 (%)
플레이트 1 4b 42D20-hz10 MC-VC-MMAE 16.34 55
4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 10.89 62.4
4d hH2L1 MC-VC-MMAE 11.24 55
플레이트 2 4e hH1L2mut1 MC-VC-MMAE 132.5 30.7
4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 17.2 60.7
4d hH2L1 MC-VC-MMAE 13.79 55.7
플레이트 3 4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 11.74 47.6
4e hH1L2mut1 MC-VC-MMAE 138.1 27.2
4b 42D20-hz10 MC-VC-MMAE 12.060 41.0
플레이트 4 4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 14.13 58.5
4b 42D20-hz10 MC-VC-MMAE 14.04 49.6
4c 42D20-hz63 MC-VC-MMAE 11.34 45.8
플레이트 5 2a Ref (엔포투맵) C-3 12.42 39.9
1a Ref (엔포투맵) C-1 8.345 37.8
2e hH1L2mut1 C-3 N/A N/A
실시 예시 2 넥틴-4를 표적으로하는 항체-약물 접합체의 생체 내 효능 연구(1)
BT474 세포를 사용한 생쥐 모델이 확립되었으며 다양한 약물-함유하는 링커와 다양한 항-넥틴-4 항체의 접합으로 생산된 ADC가, 실시 예시의 현재 그룹 3에서의 3.2 및 3.3 부분에서 서술된 대로, 그룹화되고 연구되었다.
다양한 ADC의 그룹핑 및 투여 계획도
투여 그룹 항체 약물-함유하는 링커 용량
(mg/kg)		 투여 경로 투여 시점 투여 부피 (mL/kg)
매개체(Vehicle) 없음 없음 없음 IV D0 10
4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
4c 42D20-hz63 MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
2c 42D20-hz63 C-3 5 IV D0 10
4b 42D20-hz10 MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
2b 42D20-hz10 C-3 5 IV D0 10
4f IgG1 MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
2f hH1L2mut1 MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
결과는 도 2 및 표 6에 보여준다.
그룹 평균 종양 부피 volume (mm3) 평균 종양 부피 (mm3) T/C (%) TGI (%) P 값 실험 초기 그룹 당 동물의 수 실험 종료 시 그룹 당 동물의 수
D0 SEM D26 SEM D26 D26 D26
매개체
(Vehicle)		 118.1 ± 2.7 2005.1 ± 253.9 - - - 10 10
4a, 5mg/kg 115.6 ± 4.0 169.7 ± 50 3 97 0.000 6 6
4c, 5mg/kg 112.0 ± 3.6 421.3 ± 156.7 16 84 0.001 6 6
2c, 5mg/kg 113.0 ± 3.5 220.9 ± 59.3 6 94 0.000 6 6
4b, 5mg/kg 114.8 ± 4.3 289.3 ± 47.3 9 91 0.000 6 6
2b, 5mg/kg 115,1 ± 3.6 160.5 ± 28.6 2 98 0.000 6 6
4f, 5mg/kg 114.3 ± 3.6 1879.0 ± 347.4 94 6 0.777 6 6
2f, 5mg/kg 114.8 ± 4.1 1230.1 ± 219.4 59 41 0.058 6 6
참고: 표에서 P 값은 매개체 (vehicle) 그룹과 비교하여 결정된다.
실시 예시 3 넥틴-4 를 표적으로 하는 항체-약물 접합체의 생체 내 효능 연구(2)
MDA-MB-468 세포를 사용한 생쥐 모델이 확립되었으며 다양한 약물-함유하는 링커와 다양한 항-넥틴-4 항체의 접합으로 생산된 ADC가, 실시 예시의 현재 그룹 3에서의 3.2 및 3.3 부분에서 서술된 대로, 그룹화되고 연구되었다.
다양한 ADC의 그룹핑 및 투여 계획도
투여 그룹 항체 약물-함유하는 링커 용량
(mg/kg)		 투여 경로 투여 시점 투여 부피 (mL/kg)
매개체(Vehicle) 없음 없음 없음 IV D0 10
4d hH2L1 MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
2d hH2L1 C-3 5 IV D0 10
4a Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 5 IV D0 10
결과는 도 3 및 표 8에서 보여준다.
다양한 ADC의 생체 내 효능 결과
그룹 TV(D0) SEM TV(D24) SEM T/C(%)
(D24)		 TGI%
(D24)		 P 값 PR
(D24)		 동물의 수 (D0) 동물의 수 (D24)
매개체
(Vehicle)		 112.9±2.5 589.6±68.3 - - - 0 10 10
4d, 5 mg/kg 116.1±3.0 333.0±35.0 46 54 0.015 0 6 6
2d, 5 mg/kg 112.0±3.9 110.6±10.8 -1 101 0.000 4 6 6
4a, 5 mg/kg 115.7±2.7 248.7±26.5 28 72 0.002 0 6 6
참고: 표에서 P 값은 매개체 그룹과 비교하여 결정된다. TV:종양 부피, mm3.
실시 예시의 그룹 4 다양한 종양 모델에서 약물 후보로서 항체-약물 접합체3d의 효능의 평가
하기의 방법이 예시적인 실험에 사용되었다:
4.1 그룹핑 및 실험 디자인
MDA-MB-468 세포, 즉 인간 유방 암세포 (breast carcinoma cells) (ATCC로부터 구입), NCI-H322 세포, 즉 폐 암세포 (ATCC로부터 구입), 및 T24/넥틴-4, 즉 방광암 세포 ((중국 과학 아카데미 (Chinese Academy of Science) 의 세포 은행으로부터 구할 수 있음)) 가 생쥐 모델을 확립하기 위하여 각각 누드 마우스 (BALB/cJGpt-Foxn1nu/Gpt, 4-5 주령)에 접종하는데 사용되었다.
항체-약물 접합체 3d 및 대조군 약물 PADCVE (에포투맵 베도틴, Seattle Gentics 로부터 구입)이 그룹화되어 연구되었다 (하기 표 9 참조). 생쥐는 각각 10 mL/kg의 부피로 정맥 주사 (IV) 되었으며, 매개체 그룹 생쥐는 같은 부피의 매개체 (생리 식염수)로 정맥 주사되었다. 용량 및 투여 계획도는 상세하게 표 9에 제시된다. 종양 부피는 주당 2회 측정 되었으며, 생쥐의 중량을 재고 및 데이터가 기록되었다.
실험이 끝났을 때, 실험의 종료점에 도달되었거나, 또는 만약 종양 부피가 1500 mm3에 도달되었을 때, 동물은 CO2 마취 하에서 희생시켰으며 및 종양을 해부하여 사진을 찍었다.
다양한 ADC의 그룹핑 및 투여 계획도
투여 그룹 항체 약물-함유하는 링커 용량
(mg/kg)		 투여 경로 투여 시점 투여 부피 (mL/kg)
매개체(Vehicle) 없음 없음 없음 IV D0 10
3d hH2L1 C-3 1 IV D0 10
3d hH2L1 C-3 3 IV D0 10
3d hH2L1 C-3 10 IV D0 10
PADCVE Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 3 IV D0 10
PADCVE Ref (엔포투맵) MC-VC-MMAE 10 IV D0 10
4.2 생체 내 효능을 평가하는 방법
생체 내 효능을 평가하는 방법은 실시 예시의 그룹 3 의 3.3 부분에서 서술된 것과 같다.
실시 예시 1 유방암 동물 모델에서 넥틴-4를 표적 하는 항체-약물 접합체의 생체 내 효능 연구
MDA-MB-468세포를 사용하여 생쥐 모델이 확립되었으며 ADC 3d 및PADCVE가, 실시 예시의 현재 그룹 4에서 4.1 및 4.2 부분에서 서술된 대로, 그룹화되고 연구 되었다. 그 결과는 도 4 및 표 10에서 보여준다.
다양한 ADC의 생체 내 효능 결과
그룹 TV(D0) SEM TV(D21) SEM T/C (%)
(D21)		 TGI (%)
(D21)		 P 값 PR
(D21)		 동물의 수 (D0) 동물의 수 (D21)
매개체
(Vehicle)		 132.4 ± 3.6 739.1 ± 20.7 - - - 0 10 10
3d, 1 mg/kg 133.7 ± 3.1 628.1 ± 60.8 82 18 0.721 0 8 8
3d, 3 mg/kg 134.6 ± 4.6 355.5 ± 59.7 36 64 0.000 0 8 8
3d, 10 mg/kg 133.9 ± 3.4 119.5 ± 31.2 -11 111 0.000 7 8 8
PADCEV®, 3 mg/kg 133.1 ± 3.4 516.4 ± 33.7 63 37 0.000 0 8 8
PADCEV®,
10 mg/kg		 139.5 ± 3.3 309.5 ± 49.7 28 72 0.000 0 8 8
참조: 표에서P 값은 매개체 그룹과 비교하여 결정된다. TV:종양 부피, mm3. PR:부분적인 종양 감퇴.
실시 예시 2 폐암 동물 모델에서 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 생체 내 효능 연구
NCI-H322세포를 사용하여 생쥐 모델이 확립되었으며 ADC 3d 및PADCVE가, 실시 예시의 현재 그룹 4에서 4.1 및 4.2 부분에서 서술된 대로, 그룹화되었고 연구되었다. 그 결과는 도 5 및 표 11에서 보여준다.
다양한 ADC의 생체 내 효능 결과
그룹 TV(D0) TV(D21) T/C (%)
(D21)		 TGI (%)
(D21)		 P 값 PR
(D21)		 동물의 수 (D0) 동물의 수 (D21)
매개체
(Vehicle)		 121.0 ± 1.6 676.2 ± 41.3 - - - 0 12 12
3d, 1 mg/kg 122.3 ± 1.9 325.8 ± 36.6 37 63 <0.001 0 8 8
3d, 3 mg/kg 124.4 ± 2.1 216.7 ± 31.1 17 83 <0.001 1 8 8
3d, 10 mg/kg 123.1 ± 2.0 81.1 ± 2.5 -34 134 <0.001 8 8 8
PADCEV®, 3 mg/kg 125.1 ± 1.9 325.9 ± 33.3 36 64 <0.001 0 8 8
PADCEV®, 10 mg/kg 124.1 ± 2.6 95.9 ± 5.2 -23 123 <0.001 7 8 8
참조:표에서P 값은 매개체 그룹과 비교하여 결정된다. TV:종양 부피, mm3. PR:부분적인 종양 감퇴.
실시 예시 3 방광암 동물 모델에서 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 생체 내 효능 연구
T24/nectin-4 세포를 사용하여 생쥐 모델이 확립되었으며 ADCs 3d 및PADCVE가, 실시 예시의 현재 그룹 4에서 4.1 및 4.2 부분에서 서술된 대로, 그룹화되었고 연구되었다. 그 결과는 도6 및 표 12에서 보여준다.
다양한 ADC의 생체 내 효능 결과
그룹 평균 체중 (g) 생쥐의 수 평균 종양 중량 (g)
(D22)		 SD TGI (%) (D22) P 값
초기 종료 시 초기 종료 시
매개체
(Vehicle)		 22.1 19.5 10 10 2.46 ± 0.25 _
3d, 1 mg/kg 22.0 18.8 8 8 1.98 ± 0.35 19.3 0.004
3d, 3 mg/kg 22.0 22.2 8 8 0.58 ± 0.88 76.2 0.000
3d, 10 mg/kg 22.2 23.5 8 8 0.08 ± 0.03 96.9 0.000
PADCEV®,3 mg/kg 22.0 23.0 8 8 0.23 ± 0.15 90.7 0.000
PADCEV®,10 mg/kg 22.0 23.3 8 8 0.09 ± 0.02 96.3 0.000
참조 : 표에서 P 값은 매개체 그룹과 비교하여 결정된다.
실시 예시 그룹 5 항체-약물 접합체의 기능 평가
실시 예시 1 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 Fab 부위의 친화력 분석
비아코어 에세이 (BIAcore assay)를 사용하여 항원, 즉 인간 넥틴-4 단백질의 재조합 세포외 도메인에 대한 항체-약물 접합체 3d 및 Padcev의 친화력을 결정하였다.
인간 넥틴-4 단백질 (Novoprotein Scientific Inc. 로부터 구입) 은 탈염 컬럼 (desalting column) 으로 운영 시약 1 (running reagents 1) ((10 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진 -N-2 설폰산 ((N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-2 sulfonic acid)), 150 mM소듐 클로라이드 (sodium chloride), 3 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트 산(ethylene diamine tetraacetic acid), 0.005% Tween-20 , pH 7.4로 조정)) 을 사용하여 버퍼 교환되게 하였다. 검출될 샘플은 운영시약 1을 사용하여 5 μg/mL되게 희석시켰으며, His 캡쳐 칩 (His capture chips) 으로 약 400RU동안 10 μg/분의 유속으로 실험 채널에으로 순차적으로 주입되게 하였다. 리간의 캡처가 참조 채널에서는 필요로 하지 않는다. 인간 넥틴-4 단백질은 운영 시약 (running reagent)을 사용하여 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.781, 0.391, 및0 nM로 희석된 후, 희석된 인간 넥틴-4 는 실험 채널 및 참조 채널에 유속 30 μL/분으로 주사되었다. 결합 및 해리 시간은 각각 120초 및 300초이었다. 각 항체의 KD값을 계산하기 위하여 비아코아 8K (Biocore 8K) 분석 소프트웨어가 사용되었다. 참조 채널은 배경 차감을 위해 사용되었다.
인간 넥틴-4 에 대한 hH2L1, 3d 및 Padcev의 친화도의 검출 결과가 표 13에 보여준다. 결과는 인간 넥틴-4 에 대한 hH2L1, 3d 및 Padcev의 친화도 (KD)는 모두 나노몰 스케일이고, 배치 대 배치 균질성이 우수하다는 것을 보였으며; hH2L1의 친화도는 ADC3의 친화도와 기본적으로 일치하며, 이는 ADC를 제조하는 접합 공정이 넥틴-4 에 대한 항체의 결합에 의미있게 영향을 주지는 않음을 제시하고; Padcev는 결합 속도 상수 (association rate constant, ka) 및 해리 속도 상수(dissociation rate constant, kd) 둘 다 ADC 3d 보다 높은 것으로 나타나, ADC 3d 는 전반적으로 Padcev보다 약 2배 더 높고, 더 우수한 친화도를 보인다.
항원에 대한 친화도 검출 결과
그룹 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (nM)
hH2L1 5.62E+05 1.45E-03 2.58
3d 5.89E+05 1.42E-03 2.41
PADCEV 1.05E+06 5.12E-03 4.87
실시 예시 2 ?뗬?-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 Fc 부위의 분석
비아코어 에세이 (BIAcore assay)를 사용하여 항체 hH2L, 항체-약물 접합체 3d 및 Padcev의 Fc 수용체: FcRn, 인간 FcγR I (CD64), 인간FcγR IIa (인간 CD32a (H167)), 인간 FcγR IIb (인간CD32b), 및 인간FcγR IIIa (인간CD16a (V176)) 에 대한 친화력을 결정하였다.
인간 FcγR I (CD64), FcγR IIa (CD32a (H167)), FcγR IIb (CD32b), 및 FcγR IIIa (CD16a (V176)) 단백질은 운영 시약 1 (running reagent 1) ((10 mM N-(2-하이드록시에틸)피페라진 -N-2 설폰산 ((N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N-2 sulfonic acid)), 150 mM소듐 클로라이드 (sodium chloride), 3 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트 산(ethylene diamine tetraacetic acid), 0.005% Tween-20 , pH 7.4로 조정))으로 0.25 μg/mL 로 희석시켰으며, FcRn 단백질은 운영시약 2 ((2 mM 소듐 디하이드로겐 포스페이트 (sodium dihydrogen phosphate), 10mM 디소듐 하이드로겐 포스페이트 (disodium hydrogen phosphate), 137mM 소듐 클로라이드, 2.7mM 포타슘 클로라이드, 0.05% 트윈-20 (tween-20), pH6.0으로 조정)) 를 사용하여 0.25 μg/mL 로 희석시켰으며 모든 희석된 단백질들은 약 40 RU 동안 10 μg/분의 유속으로 His 캡처 칩(FC2)을 사용하여 실험 채널에 순차적으로 주입되었다. 참조 채널 (FC1)에서 리간드의 캡쳐는 요구되지 않았다. 검출할 샘플들은 해당하는 운영 시약으로 희석한 후 실험 채널 및 참조 채널에 유속 30 μL/분으로 주사되었다. 결합 및 해리가 특정 시간 기간 동안 모니터되었다. 각 항체의 KD값을 계산하기 위하여 비아코아 8K (Biocore 8K) 분석 소프트웨어가 사용되었다. 참조 채널 (reference channel) (FCI)은 배경 차감을 위해 사용되었다.
Fc 수용체에 대한 hH2L1, 3d 및 Padcev의 친화도의 검출 결과가 표 14에 나타내었다. 그 결과 Fc 수용체에 대한 hH2L1 및 3d 의 4개 배치의 친화력은 배치-대-배치간에 의미있는 차이는 보이지 않았음을 보여주며; Fcγ IIIa에 대한 ADC 3d 및 Padcevdml 한 배치의 친화력은 hH2L1의 친화력 보다 약간 열등하였으며; 다른 수용체에 각각에 대한 세가지의 친화력에서 분명한 차이는 없었다.
Fc 수용체에 대한 친화력 검출 결과
그룹 친화력(Affinity) (KD)
FcRn (μM) FcγRI (nM) FcγRIIa (μM) FcγRIIb (μM) FcγRIIIa (μM)
hH2L1 0.549 13.9 4.00 35.8 0.178
3d 0.557 9.81 3.51 13.8 0.300
PADCEV 0.513 12.3 2.77 16.3 0.252
실시 예시 3 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체의 내면화 활성 연구
hH2L1, 3d 및Padcev의 내면화 활성을 검출하기 위하여 넥틴-4를 고도로 발현하는 안정적으로 형질감염된 세포 주 PC-3-Nectin4(2-4) (자체 제작) 가 표적 세포주로서 사용되었다.
실험 방법은 아래와 같다: 성장의 로그 단계 (ogarithmic stage)에 있는 표적 세포를 원심분리로 수확하고, 완전 배지(10% FBS 및250 μg/ml G418를 함유하는 F-12K 배지)로 밀도 5 X 105 세포/mL로 조정하였다. 얻은 세포 현탁액1mL, 즉 각 5X105 세포를, EP 튜브에 파이펫하여 넣은 후 원심분리시켰다. 상등액은 버리고 세포는 PBS 로 2회 세척시켰다. 각hH2L1, 3d 및 Padcev 샘플을 200 μL씩 세포에 첨가시켰으며, 그 후 4 ℃ (대조군 그룹으로서) 및 37 ℃(실험군 그룹으로서) 에 각각 놓아 두었다. 2시간 배양 후에, 형광표지된 2차 항체인, 염소 항 인간 IgG Fc-FITC (Sigma로부터 구입)가 첨가되었으며 4 ℃에서 1 시간 동안 배양되었다. 배양 후에, 형광 강도는 유동 세포 분석기 (flow cytometer) 로 측정되었으며, 및 각 샘플의 내면화 효율 (internalization efficiency) 은 다음과 같은 공식으로 계산되었다: 시점 tx에서 내면화 퍼센트= (1-37 ℃에서 샘플의 형광 강도/4℃에서 샘플의 형광 강도) x 100% (tx는 세포가 있는 샘플의 배양 시간 기간 x 이다).
그 결과 관심있는 모든 ADC가 PC-3-Nectin4(2-4) 세포의 표면에서 상대적으로 높은 수준의 표적 단백질 넥틴-4가 발현되는 것으로 나타났으며 여기에 모든 관심 있는 ADC, 원형 그대로의 항체 및 Padcev 가 상관 없는 항체에 비교하여 넥틴-4에 다소 강한 결합을 나타냄을 보였다. 얻은 결과로부터, ADC 3d 및 ADC 저장 용액 3 개 배치의 내면화 활성 (internalization activities) 과 Padcev의 내면화 활성 사이에는 의미있는 차이는 없었다.
이 결과는 표 15에 보여준다
hH2L1, 3d 및 Padcev의 내면화 활성 검출 결과
그룹 평균(Average) 중간 값(Median)
4 ℃ 37 ℃ 내면화 효율
(Internalization efficiency)		 4 ℃ 37 ℃ 내면화 효율 (Internalization efficiency)
Blank 229 N/A N/A 216 N/A N/A
hH2L1 83591 29646 64.53% 78157 19948 74.48%
3d 90122 42886 52.41% 85562 30891 63.90%
PADCEV 83966 33129 60.54% 78925 25038 62.28%
본 공개의 실시 예들의 상기 서술은 본 공개를 제한하려는 의도는 아니며, 이 분야 기술에 전문가는 본 발명의 정신으로부터 이탈됨이 없이 다양한 변경이나 수정을 할 수 있으며, 이는 수반되는 청구항의 범위 내에 있을 것이다.
Sequence Listing <110> JIANGSU MABWELL HEALTH PHARMACEUTICAL R&D CO., LTD. MABWELL (SHANGHAI) BIOSCIENCE CO., LTD. <120> ANTIBODY-DRUG CONJUGATE TARGETING NECTIN-4 AND PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF <130> LC22210007P <150> CN202110481199.4 <151> 2021-04-30 <160> 20 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 42D20-hz63,VH <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 42D20-hz63, VL <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 42D20-hz10, VH <400> 3 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> 42D20-hz10, VL <400> 4 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 5 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> hH2L1, VH <400> 5 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> hH2L1, VL <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> hL2H1mut1, VH <400> 7 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Gly Gly Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys Gln Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> hL2H1mut1, VL <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr 20 25 30 Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 9 <211> 330 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CH <400> 9 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CL <400> 10 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 11 Gly Phe Ser Leu Ile Asp Tyr 1 5 <210> 12 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 12 Trp Gly Gly Gly Lys 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H3 <400> 13 Gln Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 14 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L2 <400> 15 Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L3 <400> 16 Gln Gln His Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 1 5 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 17 Trp Gly Asp Gly Lys 1 5 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-L1 <400> 18 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Tyr Ser Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H1 <400> 19 Asp Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> CDR-H2 <400> 20 Val Ile Trp Gly Gly Gly Lys Ile Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser 1 5 10 15

Claims (21)

  1. 약물에 공유결합된 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편을 포함하는 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체 또는 이의 염으로서;
    여기서, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 각각 하기와 같은 중쇄 상보성 결정 부위 (heavy chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3) 및 경쇄 상보성 결정 부위 (light chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)를 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
    (i) 서열 번호 11, 서열 번호 12 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3;
    (ii) 서열 번호 11, 서열 번호 17 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 18, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3;
    (iii) 서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진, CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3; 및 서열 번호 14 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산 서열을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3.
  2. 제1항에 있어서,
    여기서 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기와 같은 식을 갖는다: Ab-[L-CTD]m으로, 여기서 Ab는 항 넥틴-4 항체(anti-Nectin-4 antibody) 또는 이의 단편을 나타내고, L은 링커를 나타내고, CTD는 약물을 나타내고, m은 하나의 항체 분자 당 결합된 약물의 평균 수 이고;
    바람직하게, CTD는 세포독성 약물이고; 바람직하게, CTD는 미세소관(microtubule) 억제제 MMAE, DM1, DM4, 튜브라이신 (Tublysin), 아마니틴 (amanitin), 칼리체아마이신(calicheamicin), 에리블린 (Eribulin) 및 이의 유도체; 토포이소머라제 억제제 (topoisomerase inhibitors) SN38, 엑사테칸 (Exatecan) 및 이의 유도체; 및 DNA 결합제제 PBD, 독소루비신 (doxorubicin) 및 이의 유도체로: 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이고;
    바람직하게 m은1.0 내지 5.0 이고, 바람직하게 3.0 내지 4.2, 보다 바람직하게 3.5 내지 4.5이고, 더욱 바람직하게 3.8 내지 4.2 이고, 더욱 바람직하게 3.9 내지 4.1 이고, 특히 바람직하게 4.0인, 항체-약물 접합체 또는 이의 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    여기서 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에서 포함된 중쇄 및 경쇄는 중쇄 가변 부위 (heavy chain variable region, VH) 및 경쇄 가변 부위 (light chain variable region, VL)를 각각 포함하며, 여기서 중쇄 가변 부위 (VH) 는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 또는 서열 번호 7 에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 경쇄 가변 부위 (VL)는 서열 번호2, 서열 번호4, 서열 번호6, 또는 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;
    바람직하게, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에서 포함된 중쇄 가변 부위 (VH) 및 경쇄 가변 부위 (VL)는 각각:
    (i)서열 번호 1 에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체 (varient); 및 서열 번호 2에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체;
    (ii) 서열 번호 3에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 4에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체;
    (iii) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는
    (iv) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체인, 항체-약물 접합체 또는 이의 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 어느 형태, 예를 들어, 넥틴-4 에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody), 단일 체인 항체 (single chain antibody), 디아바디 (diabody), 단일 도메인 항체 (single domain antibody), 나노바디 (nanobody), 전적으로 또는 부분적으로 인간화된 항체 (fully or partially humanized antibody) 또는 키메릭 항체 (chimeric antibody) 및 이와 유사한 형태이고; 다른 한편으로, 항체 또는 이의 단편은 넥틴-4에 대한 반쪽-항체 (half-antibody) 또는 반쪽-항체의 항원-결합 단편, 예를 들어 단일-체인 가변 단편 (single-chain variable fragment, scFv), 2가 단일-체인 가변 단편 (bivalent single-chain variable fragment, BsFv), 이황화-안정화된 가변 단편 (disulfide-stabilized variable fragment, dsFv), (이황화-안정화된 가변 단편)2 ((disulfide-stabilized variable fragment)2 ,(dsFv)2), 항원-결합 단편 (antigen-binding fragment, Fab), Fab', F(ab')2, 또는 가변 단편(variable fragment, Fv);
    바람직하게, 넥틴-4는 포유류 넥틴-4, 바람직하게 영장류 넥틴-4, 좀 더 바람직하게 인간 넥틴-4인, 항체-약물 접합체 또는 이의 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 상기 항체는 단일클론 항체, 바람직하게 쥐, 키메릭, 또는 인간화된 단일클론 항체이고; 좀 더 바람직하게, 단일 클론 항체의 중쇄 고정 부위는 IgG1 또는IgG4 서브타입이고 단일 클론 항체의 경쇄 고정 부위는 카파 타입이고; 다른 한편으로, 항체는 면역글로블린, 특히 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM, 이고, 예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 또는IgM의 인간 서브타입, 좀 더 바람직하게 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 서브타입이고;
    바람직하게, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 9에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 고정 부위 또는 이의 변이체를 포함하고; 다른 한편으로, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편은 서열 번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 고정 부위 또는 이의 변이체에를 포함하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 염.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기와 같은 화학식Ia 및/또는 Ib로 표시되는 구조를 가지고,

    Ia
    및/또는

    Ib
    여기서, Ab는 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편이고;
    Ar'은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌 (C6-C10 arylene) 및 치환된 또는 비치환된 5-12 원 헤테로아릴렌 (heteroarylene)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나이고, 여기서 치환은 그룹에 있는 수소 원자가 할로겐 (halogen) (F, Cl, Br 또는I), 할로겐화 된 알킬 (halogenated alkyl) ((예를 들어, 할로겐화 된C1-C6 (halogenated C1-C6 alkyl), 바람직하게는 할로겐화 된C1-C4 알킬 (halogenated C1-C4 alkyl), 예를 들어, 트리플루오로메틸 (trifluoromethyl)) 및 알콕시 (alkoxy) ((예를 들어, C1-C6 알콕시, 바람직하게 C1-C4 알콕시, 예를 들어, 메톡시(methoxy) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환됨을 의미하고;
    L1 은 Ar'에 연결된 -O(CH2CH2O)n- 이고, 여기서 n은 1내지 24의 범위에 있는 어느 정수, 바람직하게 1 내지 10, 좀 더 바람직하게 3 내지 5의 범위의 정수이고;
    L2는 효소 절단 가능한 단편, 예를 들어 디펩티드 (dipeptide) 또는 트리펩티드(tripeptide) 또는 테트라펩티드 (tetrapeptide) 또는 절단 가능한 자체-소멸되는 링커와 이들의 조합(즉, 2-4개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드 단편, 또는 절단 가능한 자체-소멸되는 링커와 폴리펩티드 단편의 조합) 으로, Val-Ala, Val-Ala-PAB, Val-Cit, Val-Cit-PAB, Phe-Lys-PAB, Ala-Ala-Ala, Gly-Gly-Phe-Gly (GGFG), MAC 글루크로나이드페놀 (MAC glucuronide phenol) 과 같은 것인, 항체-약물 접합체 또는 이의 염.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    여기서 L2-CTD 는 VcMMAE, GGFG-Dxd 또는VC-seco-DUBA 이고;
    바람직하게, Ar'이 치환된 또는 비-치환된 5-12 원 헤테로아릴렌인 경우에, 헤테로원자는 N이고;
    바람직하게, Ar'은 치환된 또는 비-치환된C6 아릴렌 (arylene) 또는 치환된 또는 비-치환된 6 원 헤테로아릴렌 (heteroarylene) 이고;
    좀 더 바람직하게, 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기의 구조를 가지는 것을 특징으로하는, 항체-약물 접합체 또는 이의 염:
    접합체-ADC-1:

    접합체 -ADC-2:

    접합체 -ADC-3:

    접합체 -ADC-4:

    접합체 -ADC-5:

    접합체 -ADC-6:

    접합체 -ADC-7:


  8. 넥틴-4를 표적하는 항체-약물 접합체 또는 이의 염의 제조 방법으로서, 여기서, 항체-약물 접합체 또는 이의 염은 하기의 화학식 Ia 및/또는 Ib로 표시되는 구조를 가지고:

    Ia
    및/또는

    Ib

    (1) 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편을 버퍼에서 환원제와 반응시켜, 환원된 항체 또는 이의 단편을 얻는 단계;
    (2) 단계 (1) 에서 얻은 환원된 항체 또는 이의 단편에 약물-링커 (링커-약물 접합체) 를 버퍼 및 유기 용매의 혼합물에서 접합시켜, 넥틴-4 를 표적하는 항체-약물 접합체를 얻는 단계;를 포함하는, 제조 방법.

  9. 제8항에 있어서,
    상기 약물-링커는 하기의 화학식 Ic로 표시된 구조를 갖고:

    Ic
    여기서:
    R 은 X 또는R'S 이고, 여기서 X는 할로겐 (F, Cl, Br 또는 I), 바람직하게 Br 또는 I이고; R'은 치환된 또는 비-치환된 C6-C10 아릴 (aryl) 또는 치환된 또는 비-치환된 5-12 원 헤테로아릴 (heteroaryl) 이고, 여기서 치환은 그룹에 있는 수조 원자가, 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬, 바람직하게 C1-C4 알킬), 알콕시((예를 들어, C1-C6 알콕시, 바람직하게 C1-C4 알콕시, 좀 더 바람직하게 메톡시 (methoxy)), 할로겐 (F, Cl, Br 또는I), 에스터(ester), 아마이드(amide) 및 시아노(cyano) 로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 치환기로 치환됨을 의미하고;
    바람직하게, R 은 R'S이고, 여기서 R' 는 페닐 (phenyl) 또는 치환된 페닐 (substituted phenyl) 이고, 치환된 페닐에 있는 치환기는 알킬 (예를 들어, C1-C6 알킬, 바람직하게 C1-C4 알킬), 알콕시((예를 들어, C1-C6 알콕시, 바람직하게 C1-C4 알콕시, 좀 더 바람직하게 메톡시 (methoxy)), 할로겐 (F, Cl, Br 또는I), 에스터(ester), 아마이드(amide) 및 시아노(cyano) 로 구성된 그룹으로부터 선택되고; 바람직하게R'은 페닐, 4-메틸포름아미도-치환된 페닐(4-methylformamido- substituted phenyl) (), 또는 4-포밀모르포린-치환된 페닐 (4-formylmorpholine-substituted phenyl) ( ) 이고; 및

    Ar', L1, L2 및CTD는 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 대로인, 제조방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 약물-링커는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인, 제조 방법:

    A-1

    A-2

    A-3

    A-4

    A-5

    A-6

    A-7

    B-1

    B-2

    B-3

    B-4

    B-5

    B-6

    B-7

    C-1

    C-2

    C-3

    C-4

    C-5

    C-6

    C-7
  11. 제8항 내지 제10항에 있어서,
    제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:
    a. 항체 환원: 항체 5-30 mg/ml의 농도를 함유하는 인산염 버퍼에 환원제를 ≥ 5.5: 1 (환원제: 항체)의 등가 몰비로 첨가하고, 및 환원제 및 항체를 반응시키는 단 환원제가TCEP, DTT, 2-MEA, 및DTBA로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상인 항체를 1.5 ~2시간 동안 반응시키고;
    b. 항체 접합: 단계 a 에서 얻어진 환원된 항체를 pH 6.5-7.8의 인산염 버퍼에 치환하여 넣고, 이로써 항체를 3.5-15 mg/mL의 농도로 인산염 버퍼에서 희석시켜 희석된 항체 용액을 얻는다; 유기 공유-용매 (organic co-solvent)에 용해되어 있는 약물-함유하는 링커(약물-함유하는 링커: 항체)를 4.5-6.5:1의 등가 몰비로 희석된 항체 용액에 첨가하고, 및 그 후 반응 시스템을 15-35 °C에서 교반시키면서 ≥ 0.5 시간 동안 반응시킨다, 여기서 유기 공유-용매는 DMA, DMSO, DMF, 및 CAN로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 또는 그 이상이고;
    c. 소수성 크로마토그래피 (Hydrophobic chromatography): 얻어진 항체 접합체 산물을 소수성 필러(hydrophobic filler)를 사용하여 소수성 크로마토그래피를 통해 정제되도록 하고;.
    바람직하게는, 제조 방법은 추가로 단계 b 이후에 또는 단계 C 이후에 하기의 단계를 포함한다:
    d. 가수분해: 항체-접합체 생산물을 pH 7.4-9.0의 인산염 버퍼에 대체하여 넣고 이 버퍼를 35±10 °C에서 2-24 시간 동안 가열시켜 가수분해 생산물을 얻는, 단계를 포함하는, 제조 방법.
  12. 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편으로서, 여기서 중쇄 및 경쇄는 각각 하기와 같이 중쇄 상보성 결정 부위 (heavy chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-H1, CDR-H2 및CDR-H3) 및 경쇄 상보성 결정 부위 (light chain complementarity determining regions) 1 내지 3 (CDR-L1, CDR-L2 및CDR-L3) 을 포함한다:
    서열 번호 19, 서열 번호 20 및 서열 번호 13에서 각각 제시된 아미노산을 가진 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3; 및, 서열 번호 14, 서열 번호 15 및 서열 번호 16에서 각각 제시된 아미노산을 가진 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3을 포함하는, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편.
  13. 제12항에 있어서, 여기서 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 및 경쇄는 중쇄 가변 부위 (heavy chain variable region, VH) 및 경쇄 가변 부위 (light chain variable region, VL)를 각각 포함하고,
    여기서 중쇄 가변 부위 (VH)는 서열 번호 5 또는 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고, 경쇄 가변 부위 (VL)는 서열 번호 6 또는 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하고;
    바람직하게, 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편의 중쇄 가변 부위 (VH) 및 경쇄 가변 부위 (VL) 는:
    (A) 서열 번호 5에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체 ; 및 서열 번호 6에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는
    (B) 서열 번호 7에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 및 서열 번호 8에 제시된 아미노산 서열 또는 이의 변이체;를 포함하고
    더욱 바람직하게, 항-넥틴-4-항체 또는 이의 단편은 제4항 또는 제5항에서 정의된 것인, 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편.
  14. 제12항 또는 제 13항에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편에 포함된 중쇄 가변 부위, 경쇄 가변 부위, 중쇄 또는 경쇄를 암호화하는 염기서열을 포함하는 핵산분자.
  15. 제14항에 따른 핵산 분자를 포함하는, 벡터.
  16. 제14항에 따른 핵산 분자 및/또는 15항에 따른 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 넥틴-4 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체, 제12항 또는 제13항에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 제14항에 따른 핵산분자, 제15항에 따른 벡터, 및/또는 제16항에 따른 숙주 세포를 포함하는, 조성물.
  18. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 넥틴-4 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체, 제12항 또는 제13항에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 제14항에 따른 핵산분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 및/또는 제17항에 따른 조성물을 종양 치료용 약물 제조하는데 사용하는, 용도.
  19. 제18항에 있어서, 상기 종양은 높은 넥틴-4발현과 연관된 종양 또는 암이고;
    바람직하게, 종양 또는 암은: 방광 암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 난소 암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer), 비-호치킨스 림프종(non-hodgkin's lymphoma), 호치킨스 림프종(hodgkin's lymphoma), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 전립선 암(prostate cancer), 비-소 세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소-세포 폐암(small cell lung cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 편평상피암 (squamous cell carcinoma), 신경교아세포종(glioblastoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 위장관 종양(gastrointestinal tumors), 결장 암 (colorectal cancer), 신경교종 (glioma), 및 중피종(mesothelioma) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 용도.
  20. 종양을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 개체에게 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 넥틴-4 또는 이의 염을 표적하는 항체-약물 접합체, 제12항 또는 제13항에 따른 항-넥틴-4 항체 또는 이의 단편, 제14항에 따른 핵산분자, 제15항에 따른 벡터, 제16항에 따른 숙주 세포, 및/또는 제17항에 따른 조성물을, 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 개체는 포유류, 바람직하게 영장류, 좀 더 바람직하게 인간이고;
    바람직하게, 상기 종양은 높은 넥틴-4 발현과 연관된 종양 또는 암이고;
    바람직하게, 종양 또는 암은: 방광 암(bladder cancer), 유방암(breast cancer), 난소 암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 간세포암 (hepatocellular cancer), 위암(gastric cancer), 비-호치킨스 림프종(non-hodgkin's lymphoma), 호치킨스 림프종(hodgkin's lymphoma), 급성 림프성 백혈병(acute lymphocytic leukemia), 역형성 큰세포 림프종(anaplastic large cell lymphoma), 다발성 골수종 (multiple myeloma), 전립선 암(prostate cancer), 비-소 세포 폐암(non-small cell lung cancer), 소-세포 폐암(small cell lung cancer), 악성 흑색종(malignant melanoma), 편평상피암 (squamous cell carcinoma), 신경교아세포종(glioblastoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 위장관 종양(gastrointestinal tumors), 결장 암 (colorectal cancer), 신경교종 (glioma), 및 중피종(mesothelioma) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 어느 하나인 것인, 방법.




KR1020237041036A 2021-04-30 2022-04-29 넥틴-4 (nectin-4)를 표적하는 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugate) 및 이의 제조 방법 및 용도 KR20240004708A (ko)

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