KR20180083425A - 항-5t4 항체 및 항체-약물 접합체 - Google Patents

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더 리 미란다 마리아 코르넬리아 반
게라르두스 요셉 안드레아스 아리아안스
잔 스코우텐
마리온 브로멘로어
패트릭 게르하르트 그루튀스
루디 게라르두스 엘리자베스 쿠만스
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신톤 바이오파머슈티칼즈 비.브이.
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Abstract

본 발명은 인간 5T4 종양태아성 항원에 대한 항체 및 임상 시험에서의 시험에 적합한 상응하는 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 상기 항체는 인간과 사이노몰구스 원숭이에 대해 교차 반응성이며 이의 사이노몰구스 원숭이 5T4 항원에 대한 친화성과 동일한 크기 정도인 인간 5T4 항원에 대한 친화성을 나타낸다. 본 발명은 추가로 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에서 항체 및 상응하는 ADC를 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

항-5T4 항체 및 항체-약물 접합체
본 발명은 5T4(종양태아성(oncofoetal)) 항원에 대한 항체 및 상응하는 항체-약물 접합체(ADC; antibody-drug conjugate)에 관한 것이다.
5T4 종양태아성 항원은 인간 태반 함포영양막 미세융모 멤브레인으로부터 밀 배아 응집소 단리된 당단백질에 대항하여 발생하는 단일클론 항체에 의해 정의된 72 kDa 당단백질이다. 상기 단일클론 항체(mAb)는 WO89/07947에서 5T4로 명명되었다. 5T4 항원은 정상 조직에서 제한된 발현을 갖는 반면, 이는 다양한 종류의 암 세포에 의해서는 (과)발현된다. 이것은 5T4 항원이 특이적 암 표적이자 잠재적이고 유망한 치료용 표적이 되게 한다. 그러나, 상기 표적이 80년대 후반에 발견되었음에도 불구하고, 승인된 치료용 항체는 여전히 이용 불가능하다.
WO2006/031653에서는 원래의 mAb 5T4, 즉, H8 및 이의 인간화 버전이 개시되어 있으며, 그 둘 모두는 생체 내 전임상 (독성) 연구에 통상적으로 사용되는 다양한 비-인간 동물 종에 교차 반응성이지 않다. 이러한 전임상 연구는 인간에서의 후속 투여량 증량 계획을 위한 초기 안전 투여량을 확인하는 것; 가역적 또는 비가역적 독성 효과의 잠재적 표적인 건강한 조직 또는 장기를 확인하는 것; 및 임상 모니터링을 위한 안전 파라미터를 확인하는 것을 목적으로 한다. 생물약학물질, 예컨대 단일클론 항체에 대하여, 조절 가이드라인은 적어도 하나의 관련된 종에서의 시험을 필요로 한다(예: ICH S6 조절 가이드라인). 상기 종은, 단일클론 항체가 그 종에 대해 교차 반응성이지 않고 그러므로 상기 종에서 효능이 불충분한 경우 유의하지 않다. 이러한 경우 대안적인 동물 모델, 예를 들어 유전자 조작 종이 이용될 수 있다. 그러나, 이는 모델을 개발하는 것뿐만 아니라, 또한 규제 기관에 용인되는 과학적 타당성을 제공할 수 있기 위해 광범위한 노력을 필요로 할 것이다.
WO2007/106744에서는 항-5T4 항체 A1, A2 및 A3이 개시되어 있으나, 상기 세종류의 항체가 비-인간 동물 종, 예를 들어 사이노몰구스 원숭이에 대해 얼마간의 교차 반응성을 나타내지만, 인간 5T4에 대한 상기 항체들의 친화성은 인간 5T4에 대한 H8의 친화성보다 훨씬 낮다.
4-(4'-아세틸페녹시)-부탄산을 통해 칼리키아미신에 연결된 항-5T4 항체 H8, A1, A2 및 A3은 WO2007/106744의 73 페이지에 개시되어 있다. WO2012/131527에서는 말레이미도카프론-모노메틸아우리스타틴 F에 연결된 A1(A1-mc-MMAF)이 개시되어 있다.
몇 되지 않는 5T4 항원을 표적으로 하는 치료법이 임상 시험 단계에 도달하였다. 5T4 항원을 암호화하는 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA; modified vaccinia virus Ankara) 벡터의 백신은 5T4 항원에 대한 내생성 항체 반응을 유발하지만, 이의 전이 신암에 대한 III 상 연구는 이의 생존 증가의 1차 평가지표를 충족시키지 못했다. 또 다른 예시는 나프투모맙 에스타페나톡스(naptumomab estafenatox)이며, 이는 변형 포도구균 장독소 E(modified Staphylococcal enterotoxin E)에 접합된 mAb 5T4의 Fab 단편이다. 상기 접합체는 종양의 근처에서 T 세포 반응을 활성화시킨다고 여겨진다. 그러나, 진행성 신장세포 암종(advanced renal cell carcinoma)에서의 나프투모맙 에스타페나톡스 + IFN-α 대 IFN-α의 무작위화된 II/III 상 연구는 이의 생존 연장의 1차 평가지표를 충족시키지 못 했다. 최근에는 또한, A1-mc-MMAF ADC를 평가하는 임상 개발이 중단되었다. 현재는, US 및 EU 임상 시험 등록에 기재된 유효한 임상 시험은 없다.
WO 2015/155345에서는 신규한 항-5T4 항체 및 항-5T4 항체가 피롤로벤조디아제핀(PDB) 이합체에 또는 튜뷸리신에 (부위 특이적으로) 연결된 상응하는 ADC가 개시되어 있다. 그러나, 임상 데이터는 아직 이용 불가능하다.
상기의 내용은, 임상 시험된 5T4 표적 치료법, 즉 항체, 항체-약물 접합체 및 백신이 암 치료법의 요건을 달성하지 못한다는 결론은 도출한다. 따라서, 암 치료를 위한 5T4 항원에 대한 신규한 항원 및 상응하는 항체-약물 접합체에 대한 요구가 존재한다. 전임상 세팅에서 이러한 항체 및 상응하는 ADC의 적합성을 측정하기 위해, 이러한 항체는 약물 후보의 전임상 개발과 관련된 비-인간 동물 종의 5T4 항원에 대해 교차 반응성이어야 한다.
본 발명은 임상 시험에서의 시험에 적합한 인간 5T4 종양태아성 항원에 대한 항체 및 상응하는 ADC에 관한 것이다. 전임상 세팅에서의 적합한 항체 및 상응하는 ADC는 약물 후보의 전임상 개발과 관련된 비-인간 동물 종의 5T4 항원에 대해 교차 반응성이어야 한다.
바람직하게는, 상기 항체는 인간과 사이노몰구스 원숭이에 대해 교차 반응성이며 이의 사이노몰구스 원숭이 5T4 항원(사이노 5T4; cyno 5T4)에 대한 친화성과 동일한 크기 정도인 인간 5T4 항원(인간 5T4; hu 5T4)에 대한 친화성을 나타낸다.
본 발명은 추가로 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에서의 항체 및 상응하는 ADC의 용도에 관한 것이다.
도 1a 내지 도 1c는 인간 5T4-발현 CHO 세포(CHOZN)에 대한 키메라 mAb, HC-41C 돌연변이를 갖는 인간화 mAb 및 상응하는 항-5T4 ADC의 결합 대 H8 및 A1의 결합을 나타낸다(도 1a 클론 789, 도 1b 클론 833, 도 1c 클론 825).
도 2a 내지 도 2c는 사이노 5T4-발현 CHO 세포(CHOZN)에 대한 키메라 mAb, HC-41C 돌연변이를 갖는 인간화 mAb 및 상응하는 항-5T4 ADC의 결합 대 H8 및 A1의 결합을 나타낸다(도 2a 클론 789, 도 2b 클론 833, 도 2c 클론 825).
도 3은 면역결핍 마우스의 5T4-양성 BT474 세포주 이종이식에서 항-5T4 ADC 833a-, 833b-, 833c-, 833d-, 825a-, 825c-vc-seco-DUBA 대 H8-vc-seco-DUBA 및 비결합 대조군 리툭시맙-vc-seco-DUBA의 생체 내 효능을 나타낸다.
5T4 종양태아성 항원은 정상 조직에서 제한된 발현을 갖는 반면, 다양한 암 세포에 의해서는 (과)발현되며, 따라서 5T4 항원을 특이적 암 표적이자 잠재적이고 유망한 치료용 표적이 되게 한다. 그러나, 상기 표적이 80년대 후반에 발견되었음에도 불구하고, 현재 상기 표적을 향한 승인된 치료법이 없다.
본 발명은, 사이노 5T4에 대해 교차 반응성이면서 또한 인간 5T4 항원에 아주 우수한 친화성을 나타내는, 5T4 항원에 대한 항체 및 상응하는 항체-약물 접합체(ADC)에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-5T4 항체 및 ADC는 이의 인간 5T4에 대한 친화성과 동일한 크기 정도로 사이노 5T4 항원에 대한 친화성을 나타낸다. 용어 "동일한 크기 정도"는 인간 및 사이노 5T4 항원에 대한 친화성의 차이가 서로 10배 미만인 것을 의미한다. 본 발명의 항-5T4 항체는 종래 기술 항-5T4 항체 A1 및 A3에 비해 인간 5T4 항원에 대해 향상된 친화성과, 종래 기술 항-5T4 항체 H8에 비해 사이노 5T4 항원에 대해 향상된 친화성을 가진다. 친화성은 바람직하게는 인간 또는 사이노 5T4 항원을 발현하는 세포를 이용하는 세포 기반 검정에서 μg/ml 단위의 EC50으로서 측정하였다. 본 발명의 발명자들은 인간 5T4 또는 사이노 5T4를 발현하도록 조작된 다양한 세포, 예컨대 MDA-MB-468, PA-1 및 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 상에서 EC50을 측정하였다. 본 발명의 항체는 통상적으로, 4℃에서 30 분 동안 항체와 함께 세포의 인큐베이션 후 인간 5T4 또는 사이노 5T4 항원을 발현하는 세포를 이용하여 측정된 0.8 μg/ml보다 낮은 EC50을 나타내었다.
종래 기술 항-5T4 항체 A1은 US8044178, 서열번호 2, 위치 20 - 138 유래 마우스 A1 아미노산 서열의 중쇄(HC) 가변 영역(VR) 및 US8044178, 서열번호 4, 위치 21 - 127 유래 마우스 A1 아미노산 서열의 경쇄(LC) VR에 의해 특징된다. 종래 기술 항-5T4 항체 A3은 US8044178, 서열번호 10, 위치 20 - 141 유래 마우스 A3 아미노산 서열의 HCVR 및 US8044178, 서열번호 12, 위치 21 - 127 유래 마우스 A3 아미노산 서열의 LCVR에 의해 특징된다. 종래 기술 항-5T4 항체 H8은 서열번호 52의 HCVR 및 서열번호 53의 LCVR에 의해 특징된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 Fab, Fab' 또는 F(ab')2 단편을 포함하는 단일클론 항체(mAb), 단일 사슬(sc) 항체, scFv, 단일 도메인(sd) 항체, 디아바디, 또는 미니바디를 지칭한다. 항체는 임의의 동종형, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM 항체의 것일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 IgG 항체이고, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 항체이다. 항체는 키메라, 인간화 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 인간화된 것이다. 보다 더욱 바람직하게는, 항체는 인간화 또는 인간 IgG 항체이고, 가장 바람직하게는 인간화 또는 인간 IgG1 mAb이다. 항체는 κ(카파) 또는 λ(람다) 경쇄, 바람직하게는 κ(카파) 경쇄를 가질 수 있고, 즉, 인간화 또는 인간 IgG1-κ 항체일 수 있다.
인간화 항체에서, HC 및 LC의 가변 영역에서 항원-결합 상보성 결정 영역(CDR)은 비-인간 종, 통상적으로 마우스, 래트 또는 래빗 유래 항체로부터 유래한다. 이러한 비-인간 CDR은 HC 및 LC의 가변 영역의 인간 프레임워크(FR1, FR2, FR3 및 FR4) 내에 위치할 수 있다. 인간 FR 중 선택된 아미노산은, 낮은 면역원성을 유지하면서, 결합 친화성을 향상시키도록 상응하는 원래의 비-인간 종 아미노산과 교환될 수 있다. 대안적으로, 원래의 비-인간 종 FR의 선택된 아미노산은, 항체의 결합 친화성을 유지하면서, 면역원성을 감소시키도록 이의 상응하는 인간 아미노산으로 교환된다. 이로써 인간화된 가변 영역이 인간 불변 영역과 조합된다.
본 발명은 특히 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함하는 항-5T4 항체에 관한 것이다:
a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
b. 서열번호 3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
c. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
d. 서열번호 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
e. 서열번호 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
f. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
g. 서열번호 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
h. 서열번호 15의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 16의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
i. 서열번호 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 18의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
j. 서열번호 19의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
k. 서열번호 21의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
l. 서열번호 23의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
m. 서열번호 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 26의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
n. 서열번호 27의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
o. 서열번호 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 30의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
p. 서열번호 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 32의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
q. 서열번호 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 34의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열.
명확성을 위해, 상기 a 내지 q 하에 열거된 항체의 HCVR의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열 및 LCVR의 CDR1, CDR2 및 CDR3 서열은 본 명세서의 마지막 부분에 제공되는 서열 목록에 밑줄이 그어져 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 항체는
a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
b. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
c. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
d. 서열번호 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
e. 서열번호 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 18의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
f. 서열번호 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 26의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 항체는
a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
b. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
c. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함한다.
한 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 항체는
a. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
b. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
a. 서열번호 35의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열;
b. 서열번호 36의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열;
c. 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 44의 LCVR 아미노산 서열;
d. 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 46의 LCVR 아미노산 서열;
e. 서열번호 40의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
f. 서열번호 41의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
g. 서열번호 42의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LCVR 아미노산 서열;
h. 서열번호 43의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LCVR 아미노산 서열;
i. 서열번호 38의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열;
j. 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열; 및
k. 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항-5T4 항체에 관한 것이다.
본 발명의 제1 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 35의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제2 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 36의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제3 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 44의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제4 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 46의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제5 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 40의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제6 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 41의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제7 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 42의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제8 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 43의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제9 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 38의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제10 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 제11 바람직한 실시양태에서, 인간화 항-5T4 항체는 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로, 링커 약물이 본 발명에 따른 항-5T4 항체에 접합된 것인 ADC에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 링커 약물이 본 발명에 따른 항-5T4 항체에 쇄간 이황화 결합의 환원을 통해 자유화된 고유 시스테인을 통해 무작위로 접합된 것인 ADC에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 링커 약물이 본 발명에 따른 항-5T4 항체에 조작된 시스테인을 통해 부위 특이적으로 접합된 것인 ADC(부위 특이적 ADC)에 관한 것이다.
HC 또는 LC에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하는 항-5T4 항체는 몇 가지 장점을 가진다. 조작된 시스테인을 포함하는 항체는 부위 특이적 ADC를 제조하는 기회를 제공하며, 링커 약물과 우수한 반응성을 나타내는 접합 위치를 제공할 수 있고, 동시에 항체들 사이에 추가 이황화 결합을 형성하는 것(응집 야기) 또는 항체 구조를 교란하는 것의 위험을 감소시킨다. HC 또는 LC의 특정 위치에 시스테일을 갖는 것의 추가 장점은 결과로 얻는 ADC의 감소된 소수성의 효과이다.
링커 약물 부착을 위한 복수의 적합한 접합 위치는 모든 항체 구조에 존재하는 공동(cavity)에 및 공동에 가까운 근처에 확인되었으며, 즉, WO2015/177360에 개시되고 특허 청구된 바와 같이 이러한 위치에서 조작된 시스테인의 우수한 접근성을 가진다.
링커 약물이 본원에 특허청구된 바와 같이 항-5T4 항체의 특정 위치에서 접합된 경우, 상기 링커 약물은 항체의 불변 중쇄 1(CH1), 가변 중쇄(VH), 가변 경쇄 (VL) 및 불변 경쇄(CL) 영역에 의해 형성된 Fab 공동에 맞아들어간다. 그 결과, 링커 약물(대부분의 독소/링커 약물은 소수성임)은 항체 및 ADC를 둘러싼 수성 환경으로부터 차폐되고, 따라서 링커 약물이 항체의 고유 쇄간 이황화 결합 시스테인을 통해 접합된 ADC에 비해 덜 소수성이며, 링커 약물이 항체의 바깥으로, 즉 친수성 수성 환경에 더 노출되게 힘을 받는 상이한 위치에 링커 약물이 부위 특이적으로 접합된 ADC에 비해 훨씬 덜 소수성이다.
본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항-5T4 항체는 HC 가변 영역 FR 또는 LC 가변 영역 FR에의 위치에서 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함한다. 본 명세서 전체에서 사용된 바와 같은 용어 "조작된 시스테인"은 시스테인에 의해 항체의 HC 또는 LC에서 비-시스테인 아미노산을 교체함을 의미한다. 당업자에 의해 공지된 바와 같이, 이는 아미노산 수준에서 또는 DNA 수준에서, 예를 들어 부위 특이적 돌연변이 유발을 이용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 조작된 시스테인은 특이적 점 돌연변이에 의해 도입되며, 원래의/모 항체의 기존 아미노산을 교체한다.
바람직하게는, 적어도 하나의 조작된 시스테인이 HC 40, 41 및 89(카바트 넘버링에 따름); 및 LC 40 및 41(카바트 넘버링에 따름)로부터 선택된 본 발명에 따른 항-5T4 항체의 하나 이상의 위치에 존재한다. 표현 "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]의 항체의 모음집(compilation)의 HC 가변 영역 또는 LC 가변 영역에 대해 통상적으로 사용되는 넘버링 시스템을 의미한다. 상기 넘버링 시스템을 이용하여, 실제의 선형 아미노산 서열은 가변 영역의 FR 또는 CDR의 단축(shortening) 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 더 적은 또는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 넘버링은 "표준" 카바트 넘버링된 서열을 갖는 항체의 서열의 상동성의 영역에서 정렬에 의해 주어진 항체에 대해 결정된다.
상기 개시된 바와 같은 HCVR 및 LCVR CDR를 포함하는 항-5T4 항체 및 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항체 이외에도, 본 발명은 또한 HC 40, 41 및 89, 및 LC 40 및 41로부터 선택된 위치에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 HC 및/또는 LC에 포함하는 상기 항체에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항-5T4 항체는 HC 40, 41 및 89, 및 LC 40 및 41로부터 선택된 위치에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하고 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 HCVR CDR을 포함한다:
a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
b. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
c. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 HC 40, 41 및 89, 및 LC 40 및 41로부터 선택된 위치에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하고 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항-5T4 항체에 관한 것이다:
a. 서열번호 40의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LC 아미노산 서열;
b. 서열번호 41의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LC 아미노산 서열;
c. 서열번호 42의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LC 아미노산 서열;
d. 서열번호 43의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LC 아미노산 서열;
e. 서열번호 38의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LC 아미노산 서열; 및
f. 서열번호 39의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LC 아미노산 서열.
위치 HC 40, 41 및 89 및 LC 40 및 41은 항체의 Fab 부분뿐만 아니라 항체의 가변 영역 FR에도 위치한다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 링커 약물이 본 발명에 따른 항-5T4 항체에 HC 40, 41 및 89(카바트 넘버링에 따름) 및 LC 40 및 41(카바트 넘버링에 따름)로부터 선택된 상기 항-5T4 항체의 하나 이상의 위치에 조작된 시스테인을 통해 부위 특이적으로 접합된 ADC에 관한 것이다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 부위 특이적으로 접합된 ADC가, 링커 약물이 항-5T4 항체의 고유 쇄간 이황화 결합 시스테인을 통해 접합된 종래 ADC에 비해, 향상된 물리화학적, 약리학적 및/또는 약물동력학 특성을 나타낸다는 것을 밝혀내었다.
항체의 가변 부분의 변형은 항원 결합 친화성의 부분적인 또는 완전한 손실을 야기할 수 있기 때문에 일반적으로 회피된다. 그러나, 일반적인 예상과는 대조적으로, 항체의 HC 및 LC의 FR 중 특정 잔기는 접합에 적합하면서도 링커 약물의 접합 후 항원 결합의 (현저한) 감소를 야기하지 않음이 밝혀졌다. 한 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 상기 조작된 시스테인이 HC 40 및 41, 및 LC 40 및 41(상기 항체의 Fab 부분 중)로부터 선택된 상기 항-5T4 항체의 하나 이상의 위치에 있는 ADC에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 조작된 시스테인은 위치 HC 41 또는 LC 40 또는 41에 있고, 보다 바람직하게는 HC 41에 있다.
힌지 영역 하에서, 종양 미세환경 중의 종양-연관된 프로테아제가 Fc 불변 도메인을 부분적으로 절단할 수 있다는 것이 문헌으로부터 공지된 바와 같이, Fab 부분에서의 접합은 Fc 부분에서의 접합보다 바람직하다. Fc 불변 도메인의 절단은 Fc-접합된 링커 약물에서 손실을 야기할 수 있고, 이는 결과적으로 생체 내 ADC의 감소된 활성을 야기할 수 있다. (Fan et al. Breast Cancer Res. 2012; 14: R116 and Brezsky et al. PNAS 2009; 106: 17864-17869). 더 나아가, Fab 부분에서 이러한 위치로의 접합은 또한 본원에 개시된 항-5T4 항체의 항원 결합 단편의 사용을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 (부위 특이적) ADC는 본래의(naked) 항체와 비슷한 결합 친화성 및 아주 우수한 생체 외 효능을 갖고, 종래 기술로부터 공지된 5T4-표적 ADC에 비해 향상된 생체 내 프로필을 가진다. 본 발명에 따른 부위 특이적 ADC는 종래 기술의 5T4-표적 ADC와 비교하여 낮은 생체 내 비-특이적 독성을 나타낼 것이라고 예상된다. 본 발명의 항-5T4 ADC에서 링커 약물은 차폐되며(ADC가 세포외 프로테아제에 의한 절단에 덜 감수성이게 함) 이로써 약물이 너무 이르게 방출되는 가능성이 덜해진다.
본 발명에 따라, ADC 분야에서 공지된 임의의 링커 약물은, 이것이 고유 또는 조작된 시스테인의 티올 기, 통상적으로 말레이미드 또는 할로아세틸 기와 반응할 수 있는 화학 기를 갖는 경우, 본 발명에 따른 항체로의 (부위 특이적) 접합을 위해 사용될 수 있다. 적합한 링커 약물은 세포독성 약물로서 듀오카르마이신, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀(PBD) 이합체, 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴 유도체를 포함할 수 있다. 절단성 또는 비-절단성 링커가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 바람직하게는, 세포독성 약물은 듀오카르마이신, 메이탄시노이드 또는 아우리스타틴 유도체이다. 메이탄시노이드 약물의 적합한 예시는 DM1 및 DM4를 포함한다. 아우리스타틴 약물의 적합한 예시는 MMAE 및 MMAF를 포함한다.
이러한 약어는 당업자에게 주지되어 있다. 당업자에게 공지된 적합한 링커 약물의 예시는 mc-vc-PAB-MMAE(또한 mc-vc-MMAE 및 vc-MMAE로 약술됨), mc-MMAF, 및 mc-vc-MMAF를 포함한다. 바람직하게는, 사용되는 링커는 발린-시트룰린(vc) 또는 발린-알라닌(va)을 포함하는 절단성 링커이다.
본 발명에 따른 (부위 특이적) vc-MMAE ADC 및 mc-MMAF ADC의 포괄적인 분자 구조는 하기에 도시되어 있다.
Figure pct00001
mAb에 연결된 vc- MMAE의 분자 구조
Figure pct00002
mAb에 연결된 mc- MMAF의 분자 구조
한 실시양태에서, 본 발명은 링커 약물이 듀오카르마이신 유도체를 포함하는 것인 ADC에 관한 것이다.
스트렙토마이세스(Streptomyces) 종의 배양 브로스로부터 처음 단리된 것인 듀오카르마이신은, 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 SA, 및 CC-1065를 포함하는 항종양 항생제의 패밀리의 일원이다. 듀오카르마이신은 DNA의 작은 홈(minor groove)에 결합하고 후속적으로 DNA의 비가역적 알킬화를 야기한다. 이는 핵산 아키텍쳐를 붕괴시키며, 이는 결국 종양 세포 사멸을 유도한다.
WO2011/133039에서는 CC-1065의 듀오카르마이신 유도체를 포함하는 일련의 링커 약물이 개시되어 있다. 본 발명에 따라 사용될 적합한 링커-듀오카르마이신 유도체는 182-197 페이지에 개시되어 있다. 다수의 이러한 링커 약물의 화학 합성은 WO2011/133039의 실시예 1-12에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (I)의 ADC에 관한 것이다:
Figure pct00003
여기서,
"항-5T4 항체"는 본원에 개시된 바와 같이 HC 또는 LC에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 갖거나 갖지 않는 본 발명에 따른 항-5T4 항체이고,
n은 0-3, 바람직하게는 0-1이며,
m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4의 평균 DAR을 나타내며,
R1은
Figure pct00004
로부터 선택되며,
y은 1-16이며,
R2는
Figure pct00005
로부터 선택된다.
한 바람직한 실시양태에서, 화학식 (I)의 ADC는 HC 또는 LC에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하는 본 발명에 따른 항-5T4 항체를 포함하며, 여기서 링커 약물은 항-5T4 항체에 조작된 시스테인을 통해 부위 특이적으로 접합된다. 바람직하게는, 조작된 시스테인은 위치 HC 40, 41 또는 89 또는 LC 40 또는 41에, 보다 바람직하게는 HC 41 또는 LC 40 또는 41에, 가장 바람직하게는 HC 41에 있다.
본 명세서에 나타낸 구조 화학식에서, n은 0 내지 3의 정수를 나타내고, m은 1 내지 6의 평균 약물 대 항체 비율(DAR; drug-to-antibody ratio)을 나타낸다. 당업계에 주지된 바와 같이, DAR 및 약물 부하 분포는, 예를 들어 소수성 상호반응 크로마토그래피(HIC) 또는 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 이용하여, 측정될 수 있다. HIC는 평균 DAR을 측정하는 데 특히 적합하다.
본 발명에 따른 화학식 (I)의 ADC는 당업자에게 주지된 방법 및 절차에 따라 얻어질 수 있다.
듀오카르마이신 링커 약물의 비특이성 (무작위) 접합, 즉 고유 시스테인으로의 접합을 위한 적합한 방법은 WO2011/133039의 실시예 15에 개시되어 있으며, 한편 문헌[Doronina et al. Bioconjugate Chem. 17 (2006): 114-124]에서는 mc-MMAF와의 비특이적 접합이 기재되어 있다.
링커 약물을 부위 특이적으로 접합하는 데 적합한 방법은, 예를 들어 링커 약물 vc-MMAE와의 항체의 (부분적인) 부하에 대한 완전한 감소 전략이 기재된 WO2005/084390의 실시예 7 및 8에서, 그리고 메이탄시노이드(DM1) 포함 링커 약물의 부위 특이적 접합이 기재된 WO2006/034488의 실시예 11 및 12에서 찾을 수 있다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 화학식 (I)의 ADC에 관한 것이며, 여기서 n은 0-1이고, m은 1 내지 6, 바람직하게는 1 내지 4, 보다 바람직하게는 1 내지 2, 보다 더욱 바람직하게는 1.5 내지 2, 가장 바람직하게는 1.8 내지 2의 평균 DAR을 나타내며,
R1은
Figure pct00006
로부터 선택되고,
y는 1-16, 바람직하게는 1-4이고,
R2는
Figure pct00007
로부터 선택된다.
한 구체적인 실시양태에서, 본 발명은 상기 개시된 바와 같은 구조 화학식 (I)의 ADC에 관한 것이며, 여기서 n은 0-1이고, m은 1.5 내지 2, 바람직하게는 1.8 내지 2의 평균 DAR을 나타내며, R1은
Figure pct00008
이고,
y는 1-4이며, R2는
Figure pct00009
로부터 선택된다.
한 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식 (II)의 ADC에 관한 것이며,
Figure pct00010
여기서 "항-5T4 항체"는 본원에 개시된 바와 같이 HC 또는 LC에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 갖거나 갖지 않는 본 발명에 따른 항-5T4 항체이고, m은 1.5 내지 2, 바람직하게는 1.8 내지 2의 평균 DAR을 나타낸다.
한 바람직한 실시양태에서, 화학식 (II)의 ADC는 HC 또는 LC에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하는 본 발명에 따른 항-5T4 항체를 포함하며, 여기서 링커 약물은 조작된 시스테인을 통해 항체에 부위 특이적으로 접합된다. 바람직하게는, 상기 조작된 시스테인은 위치 HC 40, 41 또는 89 또는 LC 40 또는 41에, 보다 바람직하게는 HC 41 또는 LC 40 또는 41에, 가장 바람직하게는 HC 41에 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함하는 항-5T4 항체를 포함하는 화학식 (II)의 ADC에 관한 것이다:
a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
b. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
c. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열.
한 보다 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항-5T4 항체를 포함하는 화학식 (II)의 ADC에 관한 것이다:
a. 서열번호 40의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LC 아미노산 서열;
b. 서열번호 41의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LC 아미노산 서열;
c. 서열번호 42의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LC 아미노산 서열;
d. 서열번호 43의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LC 아미노산 서열;
e. 서열번호 38의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LC 아미노산 서열; 및
f. 서열번호 39의 HC 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LC 아미노산 서열.
한 보다 더욱 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 HC 40 및 41, 및 LC 40 및 41로부터 선택된 하나 이상의 위치에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하는 본 발명에 따른 항-5T4 항체를 포함하는 화학식 (II)의 ADC에 관한 것이며, 여기서 링커 약물은 항-5T4 항체에 조작된 시스테인을 통해 부위 특이적으로 접합된다. 바람직하게는, 조작된 시스테인은 위치 HC 41 또는 LC 40 또는 41에 있고, 가장 바람직하게는 HC 41에 있다.
한 가장 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항-5T4 항체를 포함하는 화학식 (II)의 ADC에 관한 것이다:
a. 서열번호 61의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
b. 서열번호 62의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
c. 서열번호 63의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LCVR 아미노산 서열;
d. 서열번호 64의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LCVR 아미노산 서열;
e. 서열번호 59의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열; 및
f. 서열번호 60의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열;
여기서 링커 약물은 위치 HC 41에서 조작된 시스테인을 통해 항-5T4 항체에 부위 특이적으로 접합된다.
본 발명은 추가로 항-5T4 항체 또는 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 ADC 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. mAb 및 (단일클론) ADC와 같은 치료용 단백질의 통상의 약학적 포뮬레이션은 정맥내 주입 전에 (수)용해(즉 재구성)을 필요로 하는 동결건조된 케이크(동결건조 분말), 또는 사용 전에 해동을 필요로 하는 냉동 (수)용액의 형태를 취한다.
통상적으로, 약학 조성물은 동결건조된 케이크의 형태로 제공된다. 본 발명에 따른 (냉동 건조 전) 약학 조성물 내로의 포함에 대해 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 완충 용액(예: 수중 시트레이트, 히스티딘 또는 숙시네이트 함유 염), 동결건조보호제(lyoprotectant)(예: 수크로오스, 트레할로오스), 장성 변형제(예: 염화나트륨), 계면활성제(예: 폴리소르베이트), 및 증량제(예: 만니톨, 글리신)를 포함한다. 냉동 건조된 단백질 포뮬레이션에 사용되는 부형제는 저장 중뿐만 아니라 냉동 건조 공정 중에 단백질 변성을 방지하는 이의 능력에 관하여 선택된다. 예시로서, 캐싸일라™(Roche)의 멸균 동결건조 분말 1회용 포뮬레이션은 - 주입용 정균수 또는 멸균수(BWFI 또는 SWFI)로 재구성시 - 20 mg/mL 아도-트라스투주맙 엠탄신, 0.02% w/v 폴리소르베이트 20, 10 mM 숙신산나트륨, 및 6% w/v 수크로오스를 포함하며 pH는 5.0이다.
본 발명은 추가로 약제로서 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 항체, ADC 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 인간 고형 종양 및 혈액 악성 종양, 바람직하게는 인간 고형 종양의 치료에서 사용하기 위한 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 항체, ADC 또는 약학 조성물에 관한 것이다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명은, 유방암, 위암, 대장암, 난소암, 폐암(특히 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC)), 및 (악성 흉막) 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 고형 종양의 치료에서 사용하기 위한, 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 항체, ADC 또는 약학 조성물, 구체적으로 듀오카르마이신 유도체 링커 약물을 포함하는 ADC에 관한 것이다.
한 추가 실시양태에서, 본 발명은, 인간 혈액 악성 종양, 구체적으로 급성 림프구성 및 골수성 백혈병(각각 ALL 및 AML)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 백혈병의 치료에서 사용하기 위한, 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 항체, ADC 또는 약학 조성물, 구체적으로 듀오카르마이신 유도체 링커 약물을 포함하는 ADC에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 상기 기재된 바와 같은 항-5T4 항체, 항-5T4 ADC 또는 약학 조성물의, 상기 기재된 바와 같은 인간 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료를 위한 5T4 항원 이외의 암 관련 표적에 대한 치료용 항체, 화학요법제 및/또는 ADC과의 순차적 또는 동시 투여되는 조합물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 구체적으로 듀오카르마이신 유도체 링커 약물을 포함하는 항-5T4 ADC의 경우, 치료용 항체는 베바시주맙, 세툭시맙, 니볼루맙, 또는 라무시루맙이고 화학요법제는 알킬화제, 구체적으로 시클로포스파미드, 이포스파미드 또는 트리아진, 구체적으로 테모졸로마이드, 또는 백금 약물, 보다 구체적으로 시스플라틴 또는 카보플라틴, 대사길항제, 구체적으로 젬시타빈 또는 페메트렉시드, 토포이소머라제 II 억제제, 구체적으로 에토포시드, 유사분열 억제제, 구체적으로 탁산, 보다 구체적으로 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 빈카 알칼로이드, 보다 구체적으로 빈블라스틴 또는 비노렐빈, 또는 신호 전달 캐스케이드 억제제, 구체적으로 티로신 키나제 억제제, 보다 구체적으로 이마티닙, 엘로티닙, 세리티닙, 크리조티닙 또는 아파티닙이다.
본 발명의 한 추가 실시양태에서, 구체적으로 듀오카르마이신 유도체 링커 약물을 포함하는 항-5T4 ADC의 경우, 치료용 항체는 베바시주맙이고 화학요법제는 알킬화제, 구체적으로 질소 머스타드, 구체적으로 이포스파미드 또는 시클로포스파미드, 백금 약물, 구체적으로 시스플라틴 또는 카보플라틴, 또는 트리아진, 구체적으로 테모졸로마이드, 항-종양 항생제, 구체적으로 독소루비신, 대사길항제, 구체적으로 젬시타빈, 토포이소머라제 I 또는 II 억제제, 구체적으로 토포테칸, 이리노테칸 또는 에토포시드, 또는 유사분열 억제제, 구체적으로 탁산, 보다 구체적으로 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 빈카 알칼로이드, 보다 구체적으로 빈크리스틴 또는 비노렐빈이다.
본 발명의 또 하나의 추가 실시양태에서, 구체적으로 듀오카르마이신 유도체 링커 약물을 포함하는 항-5T4 ADC의 경우, 치료용 항체는 아마툭시맙이고 화학요법제는 알킬화제, 구체적으로 백금 약물, 보다 구체적으로 시스플라틴 또는 카보플라틴, 대사길항제, 구체적으로 젬시타빈 또는 페메트렉시드, 또는 유사분열 억제제, 구체적으로 빈카 알칼로이드, 보다 구체적으로 비노렐빈이다.
본 발명에 따른 항-5T4 항체 또는 ADC의 치료적 유효량은 체중 1 kg당 약 0.01 mg 내지 약 15 mg의 범위 내, 구체적으로 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 10 mg의 범위 내, 보다 구체적으로 체중 1 kg당 약 0.3 mg 내지 약 10 mg의 범위 내이다. 상기 마지막 범위는 20 mg 내지 800 mg의 항체 또는 ADC 범위의 동일량(flat dose)에 대략적으로 상응한다. 본 발명의 화합물은 1주 간격, 2주 간격, 3주 간격, 1달 간격 또는 6주 간격으로 투여될 수 있다. 적합한 치료 요법은 질병의 중증도, 환자의 연령, 투여되는 화합물 및 치료하는 의사가 고려할 수 있는 이러한 다른 인자들에 따른다.
[ 실시예 ]
면역화 프로토콜 및 선택
래빗을 인간 5T4/사이노 5T4 단백질의 혼합물(2 마리 래빗) 및 MDA-MB-468 세포(2 마리 래빗)로 반복 면역화시켰다. 약 20 ml 혈액을 상이한 시점에 수집하였다. 단일 B 세포를 미량정량판(microtiter plate)의 단일 웰에 침착시켰다. 상기 B 세포를 조정 배지 및 피더 세포의 존재 하에 수일간 배양하였다. 이 시간 동안 상기 B 세포는 단일클론 항체를 생성하여 배양 배지(B 세포 상청액) 내로 방출하였다. 상기 단일 B 세포의 상청액을 IgG 생성에 대해 분석하고, 후속하여 인간 및 사이노 5T4 항원의 특이적 결합 및 5T4 발현 MDA-MB-468 세포로의 결합을 측정하였다. 이러한 항체가 MDA-MB-468 세포뿐만 아니라 인간 및 사이노 5T4 항원 양쪽에 결합함에 따라, 160개의 B 세포 상청액을 선택하고 서열분석하였다. 항체 중쇄 및 경쇄의 131개의 고유한 가변 영역을 얻고, 유전자 합성하여 IgG1 서브클래스의 인간 면역글로불린 불변 부분 상에 클로닝하였다. HEK 293 세포를, Tecan Freedom Evo 플랫폼 상에서 자동화된 절차를 이용하여 면역글로불린 서열 포함 플라스미드로 일과성 형질주입하였다. 면역글로불린을 플레이트 오토샘플러가 구비된 Dionex Ultimate 3000 HPLC 시스템 상에서 친화성 정제(단백질 A)를 사용하여 세포 상청액으로부터 정제하였다. 매우 낮은 생산성을 갖는 4개의 샘플을 제외시키고, 재시험을 위한 총 127개의 항체를 얻었다. 항체를 이의 인간 및 사이노 5T4 항원의 특이적 결합과 인간 5T4 발현 MDA-MB-468 세포에의 결합을 기준으로 선택하였다.
인간 및 사이노 5T4 항원으로의 결합을 하기 절차로 측정하였다. 인간 또는 사이노 5T4 항원을 384-포맷 미량정량판 상에 코팅하였다. 참조 항체, B 세포 상청액 또는 재조합으로 생성된 항체를 첨가하고 항-래빗 또는 인간-POD 항체를 통해 결합을 검출하였다.
MDA-MB-468 세포로의 결합을 위해, 세포를 블랙 세포 배양 미량정량판(Corning) 상에 시딩하였다. B 세포 상청액으로부터 유래한 특정 항체 또는 참조 항체를 세포와 상호작용하도록 하였다. 결합은 Alexa Fluor 488-라벨링된 항체를 이용하여 검출하였다. 형광은 CellInsight(Thermo Fischer사제) 디바이스를 이용하여 판독하였다.
17개의 항체를 선택하고, 5T4 항원으로의 친화성을 MDA-MB-468 세포, PA-1 세포 및 인간 또는 사이노 5T4 항원 발현 중국 햄스터 난소 (CHO) 포유동물 세포를 이용하여 측정하였다(표 2). 본 명세서에서, 이용된 CHO 세포는 상기 인간 또는 사이노 5T4 항원 발현 CHO 세포가 Sigma-Aldrich사의 CHOZN® 플랫폼을 이용하여 얻어지기 때문에 CHOZN으로 지칭된다. CHOZN 세포(SAFC)를, Amaxa 뉴클레오펙터 디바이스(Lonza)를 제조사의 지시서에 따라 이용하여 일과성 형질주입시켰다. 표준의 시판되는 포유동물 발현 벡터(SAFC, Life Technologies)를 이용하였고, 이는 인간 CMV 프로모터가 선행하는 전장 인간 및 사이노 5T4 항원 암호화 서열(각각 수납 번호 NP_006661.1 및 Q4R8Y9에 따름)을 포함한다. 일과성 형질주입된 CHOZN 세포를, 항체 결합 연구에서 이용하기 전에 제조사의 지시서에 따라 배양하였다. 17개의 선택된 항체를 하기 표에 따른 아미노산 서열에 의해 특징화하였다(표 1).
키메라 항-5T4 단일클론 항체
항체 HCVR LCVR
789 서열번호 1 서열번호 2
811 서열번호 3 서열번호 4
825 서열번호 5 서열번호 6
828 서열번호 7 서열번호 8
829 서열번호 9 서열번호 10
833 서열번호 11 서열번호 12
834 서열번호 13 서열번호 14
835 서열번호 15 서열번호 16
841 서열번호 17 서열번호 18
843 서열번호 19 서열번호 20
845 서열번호 21 서열번호 22
847 서열번호 23 서열번호 24
848 서열번호 25 서열번호 26
849 서열번호 27 서열번호 28
868 서열번호 29 서열번호 30
899 서열번호 31 서열번호 32
908 서열번호 33 서열번호 34
생체 외 친화성 프로토콜
인간 또는 사이노 5T4 항원을 발현하는 MDA-MB-468 세포, PA-1 세포 또는 CHOZN 세포(96-웰 플레이트 중 100,000 세포/웰)를 빙냉(ice-cold) FACS 완충제(0.2% v/w BSA(Sigma-Aldrich, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 함유 1x PBS(Lonza)) 및 0.02% v/w NaN3(Sigma-Aldrich)로 3회 세척하고, 이어서 빙냉 FACS 완충제로 희석된 각각의 1차 mAb(50 μl/웰)의 농도 범위를 추가하였다. 4℃에서 30분의 인큐베이션 후, 세포를 빙냉 FACS 완충제로 3회 세척하고 50 μl/웰 2차 mAb(AffiniPure F(ab')2 단편 Goat-항-인간 IgG-APC, 1:6,000 희석, Jackson Immuno Research)를 첨가하였다. 4℃에서 30분 후, 세포를 2회 세척하고 150 μl FACS 완충제에 재현탁시켰다. 형광 강도를 유세포 분석기(BD FACSVerse, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)로 측정하고 중간 형광 강도(MFI; median fluorescence intensity)로서 나타내었다. 곡선은 GraphPad Prism (윈도우즈용 버전 5.01/6.01, GraphPad, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)에서 가변 경사를 갖는 S자형 투여-반응 방정식(4개 파라미터)을 사용하여 비선형 회귀로 적합시켰다. EC50 값은, 4 파라미터 로지스틱 핏(4 parameter logistic fit)을 이용할 때, 곡선의 바닥부와 정상부 사이에 반응 중간 지점을 제공하는 μg/ml 단위의 농도로서 계산된다.
인간 5T4 항원(인간 5T4)-발현 MDA-MB-468 세포 상에 측정된 키메라 항체의 친화성은, 0.19 μg/ml인 H8의 EC50 값과 견줄만하게, EC50이 0.040 μg/ml 내지 0.730 μg/ml 범위였다. 그러나, A1 항체는 MDA-MB-468 세포 상에서 측정된 바와 같이 보다 낮은 친화성을 갖는 인간 5T4로의 결합을 나타냈다(EC50 값은 4.72 μg/ml임). 인간 5T4에 대한 키메라 항체의 친화성을 또한 PA-1 세포 및 인간 5T4를 발현하는 CHOZN 세포 상에서 측정하였다. 키메라 항체의 EC50 값은 다시 H8의 EC50 값과 동일한 범위 내였으며, 반면 A1은 인간 5T4에 대해 적어도 3 배 더 낮은 결합 친화성을 나타냈다(표 2). 인간 5T4를 발현하는 세 세포 종류 상의 A3의 EC50 값은 상응하는 세포 종류 상의 키메라 항체의 EC50 값보다 낮았다.
키메라 항-5T4 항체는 표 2에 나타난 바와 같이 인간 5T4 발현 CHOZN 또는 사이노 5T4 발현 CHOZN 세포를 사용하여 측정시 인간 5T4 및 사이노 5T4에 대해 유사한 친화성을 가졌다. H8의 사이노 5T4로의 결합에 비해, 결합은 846(10 배) 및 828(7 배)를 제외하고 대부분의 키메라 항체에 대해 32 배 향상을 나타냈다.
키메라 mAb의 친화성을 인간 5T4- 및 사이노 5T4 발현 세포 상에서 측정하였다.
친화성 (인간 5T4) 친화성 ( 사이노 5T4)
mAb MDA -MB-468
EC 50 ( μg /ml) 		PA-1
EC 50 ( μg /ml) 		CHOZN
EC 50 ( μg /ml) 		CHOZN
EC 50 ( μg /ml)
833 0.04 0.02 0.14 0.08
825 0.07 0.03 0.13 0.14
843 0.08 0.04 0.21 0.21
835 0.09 0.08 0.17 0.18
828 0.10 0.10 0.19 0.82
789 0.10 0.03 0.27 0.15
848 0.09 0.05 0.17 0.12
868 0.14 0.04 0.22 0.17
899 0.09 0.05 0.17 0.18
841 0.10 0.02 0.24 0.14
845 0.11 0.05 0.20 0.17
834 0.13 0.05 0.19 0.13
829 0.17 0.07 0.24 0.22
847 0.20 0.22 0.22 0.20
908 0.21 0.04 0.23 0.24
846 0.42 0.33 0.57 1.11
811 0.73 0.40 0.34 0.25
참조 mAb
H8 0.19 0.07 0.21 8.11
A1 4.72 1.34 3.00 3.23
A3 0.99 0.62 0.82 0.57
인간화
인간화 항체를 하기 기술된 바와 같이 CDR 그래프팅으로 제조하였다.
클론 789, 825 및 833의 CDR을 넘버링 시스템 IMGT(LEFRANC, MP, The IMGT unique numbering for immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains. The Immunologist, 7 (1999), pp. 132-136)로부터의 CDR-정의 및 카바트를 이용하여 확인하였다.
인간 IgG 서열의 온라인 공개 데이터베이스를 BLAST 검색 알고리즘을 사용하여 래빗 VH 도메인으로 검색하고, 후보 인간 가변 도메인을 상위 200 BLAST 결과로부터 선택하였다. 5개의 후보를 프레임워크 상동성, 주요 프레임워크 잔기 유지, 정준 루프(canonical loop) 구조 및 면역원성과 같은 준거를 기준으로 하여 선택하였다. 동일한 절차를 항체의 VL 도메인에 대해 반복하였다. 모든 인간화 VH 변이체를 모든 인간화 VL 변이체와 조합하여 각 항체에 대해 25가지의 인간화 변이체를 얻었다.
HC-41C 돌연변이를 포함하는 인간화 변이체를 하기 절차에 따라 합성하고 이들의 인간 및 사이노 5T4에 대한 친화성을 인간 또는 사이노 5T4를 발현하는 CHOZN 세포를 이용하여 측정하였다. 11개의 변이체를 추가 평가를 위해 선택하였다.
항체의 일과성 발현
a) cDNA 작제물 및 발현 벡터의 제조
US8044178, 서열번호 2, 위치 20 - 138 유래 마우스 A1 아미노산 서열의 HCVR, US8044178, 서열번호 10, 위치 20 - 141 유래 마우스 A3 아미노산 서열의 HCVR, 및 서열번호 52 유래 H8 인간화 변이체 1 아미노산 서열의 HCVR을 각각 at the N-말단에서 HAVT20 선도 서열(서열번호 54)로, 및 C-말단에서 서열번호 55에 따른 인간 IgG1 HC의 불변 도메인으로 연결시켰다. 결과로 얻어진 키메라 아미노산 서열을, 인간 세포(호모 사피엔스)에서의 발현에 최적화된 cDNA 서열 코돈으로 역번역하였다.
마찬가지로, 작제물의 LC에 대한 키메라 cDNA 서열을, 적합한 분비 신호의 서열(또한 HAVT20 선도 서열), US8044178, 서열번호 4, 위치 21 - 127 유래 마우스 A1 아미노산 서열의 LCVR, US8044178, 서열번호 12, 위치 21 - 127 유래 마우스 A3 아미노산 서열의 LCVR, 또는 H8 인간화 변이체 1 아미노산 서열 서열번호 53의 LCVR, 및 인간 IgG 경쇄 불변 영역(서열번호 56)을 연결하고, 얻어진 아미노산 서열을 인간 세포(호모 사피엔스)에서의 발현에 최적화된 cDNA 서열 코돈으로 역번역하여 얻었다.
HC-41C 돌연변이를 갖는 인간화 변이체의 LC 및 HC에 대한 cDNA 서열을 유사한 절차를 이용하여 얻었지만, 이 경우 HC 및 LC 서열을 N 말단에서 래빗 선도 서열(각각 서열번호 57 및 58)로, 및 C-말단에서 서열번호 55에 따른 인간 IgG1 HC의 불변 도메인으로 연결하였다. 카바트 넘버링에 따라 HCVR의 위치 41에 시스테인을 갖는, 하기 표에 따른 서열을 이용하였다(표 3).
HC-41C 인간화 변이체의 HCVR 및 LCVR
인간화 변이체 HCVR LCVR
789a 서열번호 35 서열번호 45
789b 서열번호 36 서열번호 45
789c 서열번호 37 서열번호 44
789d 서열번호 37 서열번호 46
833a 서열번호 61 서열번호 51
833b 서열번호 62 서열번호 51
833c 서열번호 63 서열번호 49
833d 서열번호 64 서열번호 50
825a 서열번호 59 서열번호 47
825b 서열번호 60 서열번호 47
825c 서열번호 60 서열번호 48
b) 벡터 작제물 및 클로닝 전략
항체 사슬의 발현을 위해, 시판되는 (Thermo Fisher) 포유동물 발현 벡터 pcDNA3.3의 유도체를 사용하였으며, 이는 CMV:BGHpA 발현 카세트를 포함하였다. 상기 벡터는 AscI 및 NheI 제한 부위를 포함하기 위해 CMV 프로모터의 다운스트림인 다중 클로닝 부위를 변화시킴으로써 약간 조정되어, 발현 벡터 0080pcDNA3.3-SYN을 발생시켰다.
작제물의 HC 및 LC를 위한 cDNA를, AscI 및 NheI 제한 부위를 이용하여 0080pcDNA3.3-SYN 벡터 내로 직접 결찰시켰다. HC 또는 LC 발현 카세트를 포함하는 최종 벡터(각각 CMV:HC:BGHpA 및 CMV:LC-BGHpA)를 이. 콜라이(E. coli) NEB 5-알파 세포에 전달 및 확장시켰다. 형질주입을 위한 최종 발현 벡터의 대규모 제조는 Maxi- 또는 Megaprep kits(Qiagen사제)를 이용하여 수행하였다.
c) 포유동물 세포에서의 일과성 발현
시판되는 Expi293F 세포(Thermo Fisher사제)를 하기와 같이 제조사의 지시서에 따라 ExpiFectamine 형질주입 제제를 사용하여 발현 벡터로 형질주입하였다: 75x107 세포를 300 mL FortiCHO 배지에 시딩하고, 300 μg의 발현 벡터를 800 μl의 ExpiFectamine 형질주입 제제와 조합한 후 세포에 첨가하였다. 형질주입 1일 후, 1.5 ml 증폭자(Enhancer) 1 및 15 ml 증폭자 2를 배양에 첨가하였다. 형질주입 6일 후, 세포 배양 상청액을 15 분 동안 4,000 g에서 원심분리하고 정화된 수집물을 PES 보틀 필터/ MF 75 필터(Nalgene) 위로 여과하여 수집하였다.
세포 기반 검정을 이용한 친화성 측정
인간화 항-5T4 항체는, 인간 5T4에 비해 사이노 5T4에 2 배 내지 3 배 더 낮은 결합을 나타내는 825a, 825b 및 825c 인간화 항-5T4 항체를 제외하면, 인간 5T4 또는 사이노 5T4를 발현하는 CHOZN 세포 상에서 측정한 바와 같이 인간 5T4 및 사이노 5T4에 대해 유사한 친화성을 가진다(표 4). H8의 사이노 5T4로의 결합에 비해, 결합은 인간화 항-5T4 항체에 대해 4 배 내지 17 배 향상되었다. A1에 비해, 결합은 유사하게 향상된다. 인간 5T4 발현 CHOZN 세포에 대한 인간화 항-5T4 항체의 친화성은 H8과 비견할만하다.
인간 5T4- 및 사이노 5T4-발현 CHOZN 세포 상에서 측정된 HC-41C 돌연변이를 갖는 인간화 mAb 및 HC-41C 돌연변이를 갖는 하나의 키메라 mAb의 친화성
mAb CHOZN - 인간 5T4 CHOZN - 사이노 5T4
평균 EC 50
(mg/ml) 		95% CI 1
(mg/ml) 		평균 EC 50
(mg/ml) 		95% CI 1
(mg/ml)
789a 0.20 0.14 내지 0.28 0.33 0.24 내지 0.48
789b 0.15 0.10 내지 0.20 0.24 0.16 내지 0.30
789c 0.20 0.11 내지 0.29 0.21 0.16 내지 0.26
789d 0.12 0.08 내지 0.18 0.15 0.08 내지 0.27
833a 0.22 0.11 내지 0.30 0.12 0.084 내지 0.17
833b 0.15 0.08 내지 0.24 0.18 0.12 내지 0.26
833c 0.18 0.11 내지 0.26 0.17 0.12 내지 0.20
833d 0.18 0.11 내지 0.25 0.16 0.11 내지 0.23
825a 0.15 0.09 내지 0.21 0.53 0.33 내지 0.80
825b 0.16 0.11 내지 0.23 0.46 0.30 내지 0.58
825c 0.21 0.13 내지 0.31 0.42 0.34 내지 0.49
키메라 899 0.14 0.08 내지 0.26 0.18 0.11 내지 0.27
참조 mAb
H8 0.22 0.15 내지 0.32 1.99 1.19 내지 2.52
A1 4.42 0.53 내지 19.19 1.58 1.09 내지 2.27
1 95% CI은 95% 신뢰 구간임
일반적인 부위 특이적 접합 프로토콜
시스테인 조작된 항-5T4 항체의 용액에(4.2 mM 히스티딘 중 5-10 mg/ml, 50 mM 트레할로오스, pH 6), EDTA(수중 25 mM, 4% v/v)를 첨가하였다. pH는 TRIS(수중 1 M, pH 8)를 이용하여 ~7.4로 조정하고 그 후 TCEP(수중 10 mM, 20 당량)을 첨가하고 결과로 얻어진 혼합물을 실온에서 1-3시간 동안 인큐베이트하였다. 과량의 TCEP를 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로오스, pH 6를 이용하는 Vivaspin 원심 농축기(30 kDa 컷오프, PES) 또는 PD-10 탈염 컬럼에 의해 제거하였다. 결과로 얻어진 항체 용액의 pH는 TRIS(수중 1 M, pH 8)를 이용하여 ~7.4로 상승시키고 그 후 데히드로아스코르브산(수중 10 mM, 20 당량)을 첨가하고 결과로 얻어진 혼합물을 실온에서 1-2 시간 동안 인큐베이트하였다. DMA와 이어서 링커 약물의 용액(DMA 중 10 mM)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 5-10%이었다. 결과로 얻어진 혼합물을 1-16 시간 동안 빛의 부재 하에 실온에서 인큐베이트하였다. 과량의 링커 약물을 제거하기 위해, 활성탄을 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 인큐베이트하였다. 활성탄을 0.2 μm PES 필터를 이용하여 제거하고 결과로 얻어진 ADC를 Vivaspin 원심 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 이용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로오스, pH 6으로 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.22 μm PES 필터를 이용하여 멸균 여과하였다.
부분적으로 감소된 고유 쇄간 이황화 결합 시스테인을 통한 접합을 위한 일반적인 (무작위) 접합 프로토콜(야생형 또는 wt 접합)
항-5T4 항체의 용액에(4.2 mM 히스티딘 중 5-10 mg/ml, 50 mM 트레할로오스, pH 6) EDTA(수중 25 mM, 4% v/v)를 첨가하였다. pH는 TRIS(수중 1 M, pH 8)를 이용하여 ~7.4로 조정하고 그 후 TCEP(수중 10 mM, 항체 및 바람직한 DAR에 따라 1-3 당량)을 첨가하고 결과로 얻어진 혼합물을 실온에서 1-3시간 동안 인큐베이트하였다. DMA와 이어서 링커 약물의 용액(DMA 중 10 mM)을 첨가하였다. DMA의 최종 농도는 5-10%이었다. 결과로 얻어진 혼합물을 1-16 시간 동안 빛의 부재 하에 실온에서 인큐베이트하였다. 과량의 링커 약물을 제거하기 위해, 활성탄을 첨가하고 혼합물을 1 시간 동안 실온에서 인큐베이트하였다. 활성탄을 0.2 μm PES 필터를 이용하여 제거하고 결과로 얻어진 ADC를 Vivaspin 원심 농축기(30 kDa 컷오프, PES)를 이용하여 4.2 mM 히스티딘, 50 mM 트레할로오스, pH 6으로 포뮬레이팅하였다. 마지막으로, ADC 용액을 0.22 μm PES 필터를 이용하여 멸균 여과하였다.
상기의 일반적인 절차를 이용하여, vc-seco-DUBA (SYD980; 즉, WO2011/133039의 209 페이지의 실시예 10의 화합물 18b, n=1)에 기초한 시스테인 조작된 및 야생형 ADC를 합성하고 분석용 소수성 상호반응 크로마토그래피(HIC), 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 차폐 소수성 상 크로마토그래피(SHPC; Shielded Hydrophobic Phase Chromatography), RP-HPLC 및 LAL 내독소시험으로 특징화하였다.
분석용 HIC를 위해, 샘플 5-10 μL(1 mg/ml)를 TSKgel 부틸-NPR 컬럼(4.6 mm ID x 3.5 cm L, Tosoh Bioscience, cat. nr. 14947) 상에 주입하였다. 용리법은 20분에 걸친 0.4 ml/분의 100% 완충제 A(25 mM 인산나트륨, 1.5 M 황산 암모니아, pH 6.95)로부터 100% of 완충제 B(25 mM 인산나트륨, pH 6.95, 20% 이소프로판올)로의 선형 구배로 이루어졌다. PDA-검출기 및 Empower 소프트웨어가 구비된 Waters Acquity H-Class UPLC 시스템을 이용하였다. 흡광도를 214 nm에서 측정하고 ADC의 체류 시간을 결정하였다.
분석용 HIC에 의해 명확해진 바와 같이, 상이한 시스테인 조작된 ADC들의 DAR2 종에 대한 체류 시간(RT)에는 차이가 있었다. 또한, 대부분의 조작된 ADC의 DAR2 종의 RT는 wt H8 접합체의 RT보다 낮았고(표 5) 두 링커 약물의 접합시 체류 시간에서의 증가(RTDAR2-RTDAR0)는 wt H8-vc-seco-DUBA의 증가에 비해 HC-41C 조작된 인간화 ADC에 대해 더 낮았다. 모든 조작된 인간화 ADC는 2.1-3.1의 RTDAR2-RTDAR0 값을 가지며, 이는 3.5인 wt H8-vc-seco-DUBA의 RTDAR2-RTDAR0 값보다 낮아, 조작된 인간화 ADC가 감소된 소수성을 나타냄을 시사한다.
분석용 HIC에 의한 vc-seco-DUBA ADC의 소수성
ADC DAR RT DAR2 RT DAR0 RT DAR2 - RT DAR0
H8-wt1 2.0 9.0 6.4 3.5
789a 1.8 9.4 6.3 3.1
789b 1.7 9.1 6.4 2.7
789c 1.7 9.1 6.3 2.8
789d 1.7 9.2 6.4 2.8
833a 1.7 9.4 6.9 2.5
833b 1.7 9.5 6.9 2.6
833c 1.7 9.0 6.9 2.1
833d 1.5 9. 7.1 2.8
825a 1.7 8.5 6.4 2.1
825b 1.7 8.6 6.4 2.2
825c 1.7 8.2 6.0 2.2
899 키메라 0.9 10.3 6.5 3.8
1 무작위 (비-부위 특이적) 부착
생체 외 세포독성
(부위 특이적) 항-5T4 ADC의 항원 결합 친화성은 인간 5T4 또는 사이노 5T4(도 1 및 도 2) 발현 CHOZN 세포 상에서 측정된 것과 같이 부착된 듀오카르마이신 유도체 링커 약물에 의해 영향을 받지 않았다. 예상된 바와 같이, 비-결합 대조군 ADC(리툭시맙-vc-seco-DUBA)는 고농도에서만 5T4-발현 종양 세포의 생장에 영향을 주었다. 모든 인간화 항-5T4 ADC는 SK-MEL-30, 5T4-음성 인간 종양 세포주(세포당 약 400 5T4 항원 결합 부위) 상에서 비활성 (IC50 > 10 nM)이었다.
조작된 인간화 항-5T4 ADC의 효능은 인간 5T4-발현 MDA-MB-468 세포 및 PA-1 세포 상의 종래적으로 접합된 H8-wt ADC의 효능에 비견할만 했다(표 6). 그러나, 833-ADC 시리즈는 PA1 세포 생존능을 완전히 감소시킬 수 없었다(효능 65%에서 72%). 더 나아가, 조작된 인간화 항-5T4 ADC는 A3-vc-seco-DUBA보다 2.5배 넘게 강력하고 A1-vc-seco-DUBA보다 14배 넘게 더 강력하였다.
5T4 발현 인간 종양 세포 중 vc-seco-DUBA ADC의 생체 외 세포독성
ADC MDA -MB-468 PA-1
HC-41C Avg IC 50 (nM) 효능 ( % ) 95% CI 1 (nM) 평균 IC 50 (nM) 효능 ( % ) 95% CI 1 (nM)
789a 0.16 99 0.18 내지 0.22 0.13 96 0.09 내지 0.16
789 b 0.14 99 0.15 내지 0.19 0.11 97 0.07 내지 0.14
789 c 0.14 99 0.15 내지 0.20 0.11 91 0.07 내지 0.13
789d 0.10 99 0.10 내지 0.14 0.08 89 0.05 내지 0.10
833a 0.11 99 0.13 내지 0.17 0.13 67 0.07 내지 0.18
833b 0.10 99 0.12 내지 0.15 0.13 72 0.06 내지 0.20
833c 0.13 98 0.15 내지 0.21 0.13 66 0.07 내지 0.17
833d 0.12 99 0.11 내지 0.14 0.18 65 0.08 내지 0.26
825a 0.14 99 0.15 내지 0.19 0.11 95 0.08 내지 0.13
825b 0.14 99 0.15 내지 0.18 0.12 97 0.08 내지 0.13
825c 0.12 99 0.15 내지 0.18 0.09 97 0.06 내지 0.10
참조 ADC
H8-vc-seco -DUBA 0.11 99 0.10 내지 0.12 0.09 93 0.04 내지 0.09
A1-vc-seco-DUBA 2.25 95 1.95 내지 2.59 - - -
A3-vc-seco-DUBA 0.45 97 0.40 내지 0.51 - - -
리툭시맙-vc-seco-DUBA 32.92 91 26.86 내지 47.15 8.32 N/A N/A
듀오카르마이신 독소 0.05 99 0.04 내지 0.04 0.14 99 0.10 내지 0.16
1 95% CI은 95% 신뢰 구간임
2 N/A는 해당 없음임
생체 내 효능 연구
항-5T4 ADC의 생체 내 효능을, B6;D2-Ces1ce Foxn1nu/J 마우스에서 BT474(60세의 코카시안 여성 환자 유래의 침습성 유관 암종((invasive ductal breast carcinoma)) 세포주 이종이식 모델에서 평가하였다. 면역조직화학적 염색은 BT474 세포주의 세포막 상의 인간 5T4의 존재를 확인하였다.
γ-원(2 Gy, 60Co, BioMep, 프랑스 디종 소재)을 이용한 전신 조사 24시간 내지 72시간 후, 110 암컷 Ces1ce 누드 마우스의 우측 측복부 내에 200 μL 매트리젤 함유 RPMI 1640 배지(50:50, v:v) 중 2x107 BT-474 세포를 주입하여 피하에 종양을 유발하였다. 종양이 200-300 mm3의 평균 부피에 도달하면, 마우스에 3 mg/kg H8-, 833a-, 833b-, 833c-, 833d-, 825a- 또는 825c-vc-seco-DUBA ADC의 단일 주입으로 투약하였다. 운반체 및 비-결합 리툭시맙-vc-seco-DUBA ADC를 대조군으로 사용하였다. 혈장에 Ces1c 활성을 갖는 마우스를 분석으로부터 제외시켰다.
모든 부위 특이적으로 접합된 항-5T4 ADC는 종래 기술 H8-vc-seco-DUBA보다 더 종양 부피를 감소시켰으며, 향상된 생체 내 효능을 시사하였다.
생체 내 약물동력학
약물동력학 연구를 B6(Cg)-Ces1ctm1 . 1Loc/J 마우스 계통 중 항-5T4 ADC를 이용하여 수행하였다. 상기 마우스는 효소 기능의 폐지를 야기하는 Ces1c 유전자의 엑손 5가 결여된다. 마우스에 항-5T4 ADC(3 mg/kg, 꼬리 정맥으로 정맥 주사)로 투약하고 혈장을 투약 후 0.25, 1, 6, 24, 48, 96, 168, 336, 및 504 시간에 수집하였다. ELISA-기반 검정을 사용하여 전체 항체 및 결합된 항체를 정량하였다. 결합된 항체 검정은 적어도 하나의 링커 약물을 포함하는 ADC 종을 포획하였다. 표 7에 나타난 결과는 부위 특이적 ADC가 매우 안정하고, 확연히 더 느리며 종래 기술 H8-vc-seco-DUBA ADC보다 더 긴 반감기를 가진다는 것을 나타낸다.
Figure pct00011
nd는 측정되지 않음이다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024

Claims (16)

  1. 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 가변 영역(VR) 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항-5T4 항체:
    a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    b. 서열번호 3의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 4의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    c. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    d. 서열번호 7의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 8의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    e. 서열번호 9의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 10의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    f. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    g. 서열번호 13의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 14의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    h. 서열번호 15의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 16의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    i. 서열번호 17의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 18의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    j. 서열번호 19의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 20의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    k. 서열번호 21의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 22의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    l. 서열번호 23의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 24의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    m. 서열번호 25의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 26의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    n. 서열번호 27의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 28의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    o. 서열번호 29의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 30의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    p. 서열번호 31의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 32의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및
    q. 서열번호 33의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 34의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    b. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열;
    c. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR CDR을 포함하는 항체로서, 인간화된 것인 항체.
  3. 제2항에 있어서,
    a. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 35의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열;
    b. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 36의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 45의 LCVR 아미노산 서열;
    c. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 44의 LCVR 아미노산 서열;
    d. 서열번호 1의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 2의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 37의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 46의 LCVR 아미노산 서열;
    e. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 40의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
    f. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 41의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
    g. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 42의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LCVR 아미노산 서열;
    h. 서열번호 11의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 12의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 43의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LCVR 아미노산 서열;
    i. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 38의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열;
    j. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열; 및
    k. 서열번호 5의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열 및 서열번호 6의 CDR1, CDR2 및 CDR3 아미노산 서열; 및 서열번호 39의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열
    을 포함하는 인간화 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항체는 중쇄 프레임워크 영역 또는 경쇄 프레임워크 영역의 위치에 적어도 하나의 조작된 시스테인을 포함하는 것인 항체.
  5. 제4항에 있어서, 적어도 하나의 조작된 시스테인은
    중쇄 40, 41 및 89(카바트 넘버링에 따름); 및
    경쇄 40 및 41(카바트 넘버링에 따름)
    로부터 선택되는 상기 항체의 하나 이상의 위치에 존재하는 것인 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 항체-약물 접합체.
  7. 제6항에 있어서, 제4항 또는 제5항의 항체를 포함하는 항체-약물 접합체로서, 링커 약물이 적어도 하나의 조작된 시스테인을 통해 항체에 위치 특이적으로 접합된 것인 항체-약물 접합체.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 하기 화학식 (I)의 항체-약물 접합체:
    Figure pct00025

    여기서,
    n은 0-3이고,
    m은 1 내지 6의 평균 DAR을 나타내고,
    R1은
    Figure pct00026

    로부터 선택되며,
    y는 1-16이고,
    R2는
    Figure pct00027

    로부터 선택된다.
  9. 제8항에 있어서,
    n은 0-1이고,
    m은 1.5 내지 2의 평균 DAR을 나타내고,
    R1은
    Figure pct00028
    이고,
    y는 1-4이고,
    R2는
    Figure pct00029

    로부터 선택되는 것인 항체-약물 접합체.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하기 화학식 (II)의 항체-약물 접합체:
    Figure pct00030
    .
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-5T4 항체가 하기 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR 및 LCVR을 포함하는 인간화 항체이고, 링커 약물이 중쇄 위치 41에서 조작된 시스테인을 통해 항-5T4 항체에 부위 특이적으로 접합된 것인 항체-약물 접합체:
    a. 서열번호 61의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
    b. 서열번호 62의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 51의 LCVR 아미노산 서열;
    c. 서열번호 63의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 49의 LCVR 아미노산 서열;
    d. 서열번호 64의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 50의 LCVR 아미노산 서열;
    e. 서열번호 59의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 47의 LCVR 아미노산 서열; 및
    f. 서열번호 60의 HCVR 아미노산 서열 및 서열번호 48의 LCVR 아미노산 서열.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 바람직하게는 동결건조 분말의 형태인 약학 조성물.
  13. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 제12항의 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 인간 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에서 사용하기 위한 항체, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 인간 고형 종양은 유방암, 위암, 대장암, 난소암, 폐암, 및 중피종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 항체, 항체-약물 접합체 또는 약학 조성물.
  16. 인간 고형 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항의 항체-약물 접합체 또는 제12항의 약학 조성물의, 치료용 항체, 화학요법제 및/또는 5T4 항원 이외의 암 관련 표적에 대한 ADC와의 조합물.
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