KR20190023084A - 이중 특이성 항체를 이용한 항체 약물 복합체 플랫폼 - Google Patents

이중 특이성 항체를 이용한 항체 약물 복합체 플랫폼 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중 특이성 항체를 이용한 항체 약물 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체 약물 복합체는 2가 코티닌-펩타이드 및 약물의 접합체와 항-코티닌 단일쇄 가변 절편의 결합을 통해 다단계 합성 절차가 필요 없이 항체와 약물의 복합체를 용이하게 형성할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 약물 복합체는 항체가 특이적으로 결합하는 표적에 약물을 효과적으로 전달할 수 있으며, 체내 약물의 반감기를 증진시켜 치료 효과를 향상시킬 수 있다.

Description

이중 특이성 항체를 이용한 항체 약물 복합체 플랫폼
본 발명은 이중 특이성 항체를 이용한 항체 약물 복합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 출원은 2016년 6월 21일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/352,804호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
항체 약물 복합체(ADC)는 항암제의 새로운 부류로 항원-발현 종양 세포에 세포 독성 제제를 선택적으로 전달하기 위해 개발되었다. 종래의 ADC는 높은 적용성 및 부위 특이적 결합 방법을 사용하는 많은 장점이 있다. 그러나, 항체에 세포 독성 제제를 연결하기 위해 다단계 결합법이 필요하며, 개개의 항체를 최적화하는 과정이 필요하여, ADC의 사용에 어려움이 있다.
표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 ErbB 계열에 속하는 수용체 티로신 키나아제이다. EGFR의 과발현은 두경부암, 결장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 난소암, 뇌암 또는 방광암 등 다양한 인간 암에서 빈번하게 관찰된다. 암 치료 목적으로 EGFR 신호를 차단하기 위해 하기 두가지 약리학적 접근법이 사용되었다: 단일클론항체인 세툭시맙(cetuximab) (Erbitux) 및 파니투무맙(panitumimab) (Vectibix)과 소분자 티로신 카나아제 억제제인 게피티닙(gefitinib) (Iressa) 및 엘로티닙(erlotinib) (Tarceva). 그러나 EGFR 및 이의 다운스트림 시그널링 분자에 몇몇 돌연변이는 EGFR 표적 치료에서 임상적 반응이 낮아, 치료에 어려움을 초래했다. 예를 들어, KRAS 돌연변이는 EGFR 양성암 중 EGFR 표적 치료에서 1차 저항성에 중요한 역할을 수행한다. KRAS 돌연변이는 비소세포 폐암(NSCLC)의 25% 및 결장암의 39%에서 발견된다. KRAS가 인간 암에서 가장 흔하게 발병하는 암 유전자 이상의 하나임이 잘 알려져 있지만, KRAS 돌연변이를 갖는 EGFR 양성암을 효과적으로 진단 및 치료하는 방법의 개발은 미흡한 실정이다.
한편, ADC는 KRAS 변이를 갖는 EGFR 양성 암에도 효과적일 수 있다. ADC는 링커에 의해 단일클론 항체에 세포 독성 제제를 가교 결합시킴으로써 제조될 수 있다. ADC는 종래의 항체 또는 비특이적 세포 독성 제제가 갖는 치료 한계를 극복할 수 있다. 예를 들어, 두가지 ADC인 브렌투시맙 베도틴(brentuximab vedotin) (Adcetris) 및 트라스투주맙 엠탄신(trastuzumab emtansine) (Kadcyla)은 식품 의약청(FDA)에서 림프종 및 인간 표두 성장 인자 수용체-2(Her2) 양성 전이성 유방암 치료제로 각각 승인받았다.
소분자와 항체의 통상적인 결합은 리신 잔기의 ε-아미노산 사슬 또는 시스테인 잔기상의 산소가 제거된 사슬 간 디설파이드 결합을 사용한다. 비특이적인 결합은 가변 약물 대 항체의 비율(DAR) 및 접합 부위의 위치를 갖는 ADC의 이종 혼합을 생성한다. 이러한 이질성은 ADC의 용해도, 안정성, 약물 동태 및 배치 변화에 영향을 미친다.
상기와 같은 ADC의 이질성을 피하기 위해, 시스테인 또는 비천연 아미노산 잔기를 의도적으로 도입하거나 또는 효소 접합 방법을 사용하여 부위 특이적인 결합 방법이 연구되었다. 또한, ADC의 결합 활성, 안전성 및 결합 효율은 결합 부위에 의해 영향을 받는다. 따라서, 상기 ADC의 특성을 최대화하기 위해서는, 적절한 결합 잔기를 찾고 이를 각 항체에 최적화시키는 절차가 필요하다. 보통 ADC는 다단계 복합체 결합 절차, 또는 최종 생산물의 검증을 위한 정교한 분석을 요구한다. 그 결과, 부위 특이적 결합을 이용하는 종래의 ADC를 개발하는 것에 많은 어려움이 있었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래의 항체 약물 복합체가 갖는 단점이 해소된 새로운 항체 약물 복합체 플랫폼을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 상기 항체 약물 복합체 플랫폼을 포함하는 약학적 조성물 및 이를 이용한 질병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv)를 포함하는 이중 특이성 항체; 및 펩타이드와 가교 결합된 2가 코티닌 및 약물의 접합체를 포함하는 항체 약물 복합체 플랫폼을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 종래의 항체 약물 복합체(ADC)가 다단계 결합 절차 및 항체의 최적화를 필요로 하는 단점을 해결하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 인간 EGFR 및 합텐(hapten)이 결합된 세포 독성 제제 모두에 동시에 결합하는 4가 이중 특이성 항체를 사용하는 새로운 항체 약물 복합체 플랫폼을 개발하였다.
먼저, 본 발명자들은 종래에 보고된 4가 이중 특이적 항체 포맷을 선택하고, 인간 EGFR 및 코티닌(cotinine)에 반응하는 이중 특이성 항체를 개발하였다. 본 발명의 이중 특이적 항체는 코티닌과의 복합체 형성을 위해 항-코티닌 단일 사슬 가변 절편(scFv)을 사용하였다. 코티닌은 니코틴의 주요 대사산물이며, 이는 외인성, 생리학적 불활성 및 비독성 때문에 임상 접근법에 있어서 이상적인 합텐으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 이중 특이성 항체(ERC6)는 인간 EGFR 결합 항체인 세툭시맙(cetuximab)을 포함하여 형성된다. 그 다음, 듀오카마이신(duocarmycin)이 가교 결합된 2가 코티닌 결합 펩타이드(코티닌-듀오카마이신)를 제조하고, 상기 이중 특이성 항체와 혼합을 통해 항체 약물 복합체를 형성하였다. 결과적으로, 본 발명의 발명자들은 이중 특이적 세툭시맙 × 항-코티닌 항체를 포함하는 4가 복합체 및 듀오카마이신으로 가교 결합된 2가 코티닌 결합 펩타이드(코티닌-듀오카마이신)로 이루어진 항체 약물 복합체 플랫폼을 개발하였다(도 1a). 상기 본 발명의 항체 약물 복합체 플랫폼은 인비트로(in vitro) 및 인비보(in vivo) 모델 모두에서 KRAS 돌연변이를 갖는 EGFR-양성 세툭시맙(cetuximab) 난치성 폐선암종(lung adenocarcinoma)에 대한 현저한 항 종양 활성을 나타내었다. 이러한 실험 결과는 이중 특이성 항체를 사용하는 본 발명의 ADC 플랫폼이 암과 같은 질병의 치료에 유용한 전달 도구가 될 수 있음을 가리킨다.
본 발명의 이중 특이성 항체의 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv)은 약물이 접합된 2가 코티닌-펩타이드의 2가 코티닌과 특이적으로 결합하여 항체 약물 복합체를 이룰 수 있다. 상기 항-코티닌 단일쇄 가변 절편의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 중쇄 및 서열번호 2의 경쇄로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 항-코티닌 단일쇄 가변 절편의 아미노산 서열은 서열번호 3의 중쇄 및 서열번호 4의 경쇄로 이루어질 수 있다. 또한 상기 항-코티닌 단일쇄 가변 절편의 중쇄 및 경쇄 서열의 사이에 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (n은 1~5의 정수), 바람직하게 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)4이 삽입될 수 있다. 이를 통해, 발현된 항-코티닌 단일쇄 가변 절편이 항원-항체 반응을 적절히 수행할 수 있도록 도울 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 이중 특이성 항체는 글리신 및 세린이 풍부한 펩타이드 링커 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (n은 1~5의 정수), 바람직하게 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3을 CH3 도메인 및 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv) 사이에 삽입할 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 이중 특이성 항체는 유연성이 향상될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2가 코티닌은 2개의 코티닌이 6~18 mer 펩타이드의 N 말단 및 C 말단에 각각 가교 결합된 것일 수 있다. 바람직하게, 상기 코티닌 및 펩타이드의 결합 시 코티닌은 카르복시코티닌(트랜스-4-코티닌 카르복실산)일 수 있으며, 이의 카르복실기를 통해 상기 펩타이드와의 가교 결합이 효과적으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2개의 코티닌과 가교 결합하는 펩타이드는 6~18 mer 길이의 펩타이드가 사용될 수 있다. 상기 펩타이드는 글리신(G), 세린(S) 및 리신(K) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상으로 이루어질 수 있다. 바람직하게, 상기 펩타이드는 GSKGSK, GGGGSKGGGGSK, GSKGSKGSKGSKK, 또는 GGGSGGGSKGGGSGGGSK 등이 사용될 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 펩타이드는 GSKGSKGSKGSKK가 사용될 수 있으며, 이는 본 발명의 약물, 예를 들어 듀오카마이신과 안정적으로 접합될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 2가 코티닌 및 약물의 접합은 2가 코티닌과 가교 결합된 6~18 mer 펩타이드에서 리신 잔기의 엡실론 아미노기와 약물의 접합을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 항체 약물 복합체에 사용될 수 있는 약물은 세포 독성 제제인 듀오카마이신(Duocarmycin), 아우리스타틴(Auristatin), 콜히친(Colchicine), 안트라사이클린(Anthracycline), 칼리키아마이신(Calicheamicin), 메이탄시노이드(Maytansinoid), 피롤로벤조다이아제핀(Pyrrolobenzodiazepine), 돌라스타틴(Dolastatin), 툴불리신(Tubulysin),　메이탄시노이드(Maytansinoid), 독소루비신(Doxorubicin), 크립토피신(Cryptophycin), 에포틸론(Epothilone), 사프라닌(Safranin), 디아세틸콜히친(Deacetyl colchicine), 메이탄신올(Maytansinol), 베도틴(Vedotin), 마포도틴(Mafodotin), 엠탄신(Emtansine), 머탄신(Mertansine), 라브탄신(Ravtansine), 소라브탄신(Soravtansine), 탈리린(Talirine), 테시린(Tesirine), 인돌리노벤조디아제핀(Indolinobenzodiazepines), 이리노테칸 전구약물(Irinotecan prodrug), 엑사테칸 유도체(Exatecan derivative) 및 튜불린 억제자(Tubulin inhibitor) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체 약물 복합체는 듀오카마이신 또는 엠탄신을 포함할 수 있다. 상기 듀오카마이신은 강력한 DNA 알킬화 활성으로 인해 암 세포를 사멸시키는데 효과적인 세포 독성 약물로 사용될 수 있다. 예를 들어, 듀오카마이신이 펩타이드와 결합하여 약물 접합체를 이룰 때, 4개의 발린(valine)-시트룰린(citrullin) PAB 연결된 디메틸 아미노에틸 듀오카마이신의 형태로 사용될 있다. 또한, 예를 들어, 엠탄신이 펩타이드와 결합하여 약물 접합체를 이룰 때, MCC(maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate) 링커를 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 실험예에서는 듀오카마이신(도 3e) 또는 엠탄신(도 6b)이 포함된 항체-약물 복합체의 암 세포에 대한 세포 독성을 실험하였으며, 두가지 경우 모두 A549 세포에 대한 현저한 억제 활성을 나타냈다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 항체 약물 복합체 플랫폼은 상기와 같은 다양한 약물들과 결합될 수 있는 다용성(versatility)을 가짐을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 항체 약물 복합체에 사용될 수 있는 약물은 암을 발생시키는 유전자의 발현을 억제하는 siRNA일 수 있다. 예를 들어, 상기 siRNA는 Mcl-1, Wnt-1, Hec1, Survivin, Livin, Bcl-2, XIAP, Mdm2, EGF, EGFR, VEGF, VEGFR, GASC1, IGF1R, Akt1, Grp78, STAT3, STAT5a, β-catenin, WISP1, c-myc, RRM2, KSP, PKN3, PLK1, KRAS, MYC 및 EPHA2 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 siRNA로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, siRNA는 리보핵산 매개 간섭현상(RNA-mediated interference, RNAi)에 의해 암세포에서 발현되는 특정 유전자의 발현을 억제하여 암세포를 사멸시키므로, 이를 포함하는 항체 약물 복합체는 우수한 항암제로 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서, siRNA 및 코티닌-펩타이드의 접합은 링커를 통해 이루어질 수 있다. 이를 통해, 본 발명의 항체-약물 복합체는 다양한 종류의 siRNA를 복합체에 결합시킬 수 있는 다용성을 가진다. 예를 들어, 상기 링커는 SMCC(succinimidyl　trans-4-(maleimidylmethyl)cyclohexane-1-carboxylate) 링커 또는 발린-시트룰린-PAB 링커일 수 있다. 구체적으로, siRNA가 SMCC 링커를 통해 코티닌-펩타이드에 결합되는 경우, siRNA의 5' 또는 3' 말단을 변형시켜 SMCC 링커에 가교 결합시키고, 이를 코티닌-GSCGSCGSCGSCK-코티닌에 접합시킬 수 있다(C=시스테인). 또는, siRNA가 발린-시트룰린-PAB 링커를 통해 코티닌-펩타이드에 결합되는 경우, siRNA를 상기 링커를 통해 코티닌-GSKGSKGSKGSKK-코티닌에 접합시킬 수 있다.
본 발명의 항체 약물 복합체에 포함되는 이중 특이성 항체는 세툭시맙(Cetuximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 오레고보맙(Oregovomab), 에드레콜로맙(Edrecolomab),　알렘투주맙(Alemtuzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab　), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 이필리무맙(Ipilimumab), 겜투주맙(Gemtuzumab), 브렌투시맙(Brentuximab), 베다스툭시맙(Vadastuximab), 글렙바투무맙(Glembatumumab), 데파투시주맙(Depatuxizumab), 폴라투주맙(Polatuzumab), 데닌투주맙(Denintuzumab), 엔포투맙(Enfortumab), 텔리소투주맙(Telisotuzumab), 티소투맙(Tisotumab), 피나투주맙(Pinatuzumab), 리파스투주맙(Lifastuzumab), 인두사투맙(Indusatumab), 밴돌투주맙(Vandortuzumab), 소피투주맙(Sofituzumab), 볼세투주맙(Vorsetuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 밀베투시맙(Mirvetuximab), 콜툭시맙(Coltuximab), 나라투시맙(Naratuximab), 인다투시맙(Indatuximab), 아네투맙(Anetumab), 롤보투주맙(Lorvotuzumab), 칸투주맙(Cantuzumab), 라프리투시맙(Laprituximab), 비바투주맙(Bivatuzumab), 바다스투시맙(Vadastuximab), 로발피투주맙(Rovalpituzumab), 이노투주맙(Inotuzumab), 사시투주맙(Sacituzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 밀라투주맙(Milatuzumab), 루팔투맙(Lupartumab) 및 아프루투맙(Aprutumab) 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 항체 약물 복합체는 인간 EGFR 결합 항체인 세툭시맙을 포함할 수 있다. 세툭시맙은 비소세포 폐암, 전이성 결장암 또는 두경부 편평세포암종(HNSCC)의 치료를 위해 FDA에 의해 임상적으로 승인된 단일클론 항체이다. 세툭시맙의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 5의 중쇄 서열 및 서열번호 서열번호 6의 경쇄 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 세툭시맙의 아미노산 서열은 서열번호 7의 중쇄 서열 및 서열번호 8의 경쇄 서열로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체 약물 복합체가 치료 효과를 나타내는 암은 두경부암, 결장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 난소암, 뇌암 또는 방광암 등으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 이중 특이적 세툭시맙 × 항-코티닌 항체를 포함하는 4가 복합체 및 듀오카마이신으로 가교 결합된 2가 코티닌 결합 펩타이드(코티닌-듀오카마이신)로 이루어진 항체 약물 복합체는 세툭시맙의 EGFR 표적 치료에 대한 1차 저항성을 갖는 KRAS 돌연변이 폐선암종(lung adenocarcinoma)에 현저한 치료 효과를 나타낸다. 바람직하게, 상기 이중 특이적 세툭시맙 × 항-코티닌 항체를 포함하는 4가 복합체 및 코티닌-듀오카마이신으로 이루어진 항체 약물 복합체의 전체 아미노산 서열은 서열번호 9의 경쇄 서열 및 서열번호 10의 중쇄 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로 또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 수 있으며, 정맥내, 근육내, 복막내 또는 피하 투여, 또는 표적 부위에 근접하게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 약물 복합체는 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명은 (s1) 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv)를 포함하는 4가 이중 특이성 항체를 제조하는 단계; (s2) 펩타이드와 가교 결합된 2가 코티닌 및 약물의 접합체를 제조하는 단계; 및 (s3) (s1) 단계에서 생성된 이중 특이성 항체 및 (s2) 단계에서 생성된 접합체를 혼합하는 단계를 포함하는 항체 약물 복합체의 제조 방법을 제공한다. 상기 (s3) 단계는 항-코티닌 단일쇄 가변 절편 및 2가 코티닌이 특이적으로 결합함으로써 항체 약물 복합체가 제조될 수 있다. 또한, 상기 2가 코티닌은 2개의 코티닌이 6~18 mer 펩타이드의 N 말단 및 C-말단에 가교 결합된 것이 사용될 수 있다. 또한, 상기 약물은 2가 코티닌과 가교 결합된 6~18 mer 펩타이드에서 리신 잔기와 접합될 수 있다. 또한, 상기 제조 방법은 a) 항-코티닌 scFv가 결합된 이중 특이성 항체를 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하는 단계; b) 상기 벡터를 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 c) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항체 약물 복합체의 유효량을 암을 갖는 동물에 처리하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 치료용 약학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 항체 약물 복합체의 용도를 제공한다.
본 발명의 암 치료 방법은 본 발명의 항체 약물 복합체를 포함하는 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, "치료학적으로 유효한 양"이라는 용어는 암 관련 질환의 예방 또는 치료에 유효한 본 발명의 항체 약물 복합체 또는 이를 포함하는 조성물의 양을 나타낸다.
본 발명의 약학적 조성물 중 항체 약물 복합체의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정 환자, 조성물 및 투여 방식에 대해 원하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양이 달성되도록 달라질 수 있다. 투여량 수준은 다양한 약력학 인자, 예를 들어 사용된 본 발명의 항체 약물 복합체의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 복합체의 배출 속도, 처치 기간, 복합체와 함께 사용된 다른 약물, 화합물 또는 물질, 치료받는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 일반적인 건강 및 이전의 의학적 병력 또는 기타 인자 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서, 약학적 조성물의 치료 투여량은 안전성 및 효능이 최적화되도록 적정될 수 있다. 본 발명의 항체 약물 복합체를 전신 투여하는 경우, 투여량 범위는 숙주 체중 1 kg 당 약 0.0001 내지 100 mg, 더욱 일반적으로는 0.01 내지 15 mg의 범위일 수 있다. 예를 들어, 치료 방법은 2주 당 1회, 또는 1개월 당 1회, 또는 3개월 내지 6개월마다 1회의 전신 투여를 수반할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항체 약물 복합체를 통해 약물의 반감기를 증진시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 실험예 3에서는 ERC6와 복합체를 형성할 때, 코티닌 페이로드(payload)의 안전성을 평가하기 위해 약동학 분석을 수행하였다. 실험 결과, 코티닌 페이로드는 분자량이 낮아 혈류에서 신속하게 제거되는 반면, 이것이 ERC6에 결합할 경우에는 반감기가 연장됨을 확인하였다. 나아가, 본 발명의 항체 약물 복합체는 펩타이드와 가교 결합된 2가 코티닌을 사용함으로써, 단일 코티닌-약물 접합체에 비해 복합체의 안정성이 현저하게 증진될 수 있다.
본 발명에 있어서 "항체"는, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 명세서에서 항체는 동물 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함할 수 있다. 또한 본 명세서에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 단편, 예컨대, Fab 도 포함할 수 있다. 상기 키메릭 항체는, 항체 가변영역 또는 이의 상보성 결정 영역(CDR)이 항체의 나머지 부분과 상이한 동물에서 기원된 항체를 말한다. 이러한 항체는, 예를 들어, 항체 가변 영역은 인간 이외의 동물 (예를 들면, 마우스, 토끼, 가금류 등)에서 유래하고, 항체 불변 영역은 인간에서 유래한 항체일 수 있다. 이러한 키메릭 항체는 당업계에 공지된 유전자 재조합 등의 방법으로 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서 "중쇄" 는, 항원에 대한 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH　및 3 개의 불변영역 도메인인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체 길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다. 또한, "경쇄" 는, 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역의 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL　및 불변영역 도메인 CL　을 포함하는 전체 길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 일컫는다.
본 발명에 있어서 "접합체" 는, 이형성 분자로서, 폴리머 분자, 친유성 화합물, 탄수화물 부분 또는 유기 유도화(derivatizing)제와 같은 한 개이상의 비-폴리펩티드 부분, 특히 폴리머 부분에 한 가지 이상의 폴리펩티드, 전형적으로는 하나의 폴리펩티드를 공유적으로 부착시켜 만들 수 있다. 추가적으로, 접합체는 하나 이상의 탄수화물 부분에, 특히 N- 또는 O- 글리코실화를 이용하여 부착될 수 있다. 공유적으로 부착시킨다는 의미는 폴리펩티드 및 비-폴리펩티드 부분을 직접적으로 서로 공유결합시키거나 연결 다리, 스페이스, 연결 부분, 또는 부분과 같은 중개부분 또는 부분등을 통하여 서로 간접적으로 공유결합적으로 연결된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명에 개시된 약물을 코티닌과 접합시킨 접합체가 본 정의에 포함된다.
또한, 본 발명은 인비트로(in vitro) 생물학적 분석 방법에 있어서, 코티닌과 약물의 접합체를 분석 도구로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 상기 인비트로 생물학적 분석 방법은 유동 세포 분석법, 웨스턴 블롯 분석법, 면역침강 분석법 및 효소-링크된 면역화학 분석법 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 약물 및 코티닌의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체는 코티닌을 합텐으로 이용함으로써 약물 및 항체 고유의 특성을 모두 보유할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 항체 약물 복합체는 분자의 특이적 반응성 및 기능과, 항체의 특성인 보체-매개 세포 독성(CDC), 항체-의존성 세포 독성(ADCC), 및 긴 생체내 반감기를 보유할 수 있다.
본 발명의 항체 약물 복합체는 항체가 특이적으로 결합하는 표적에 약물을 효과적으로 전달할 수 있으며, 체내 약물의 반감기를 증진시켜 치료 효과를 향상시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 이중 특이성 세툭시맙(Cetuximab) × 항-코티닌 항체 및 듀오카마이신과 접합된 2가 코티닌-펩타이드의 복합체는 KRAS 돌연변이를 갖는 EGFR-양성 세툭시맙 난치성 폐선암종에 현저한 항-종양 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 항체 약물 복합체 플랫폼은 항체의 최적화를 필요로 하지 않으며, 단순 배양을 통해 세포 독성 제제를 관심 항체에 결합시킴으로써 다단계 복합체 결합 절차를 크게 줄일 수 있다. 즉, 본 발명의 항체 약물 복합체 플랫폼은 종래의 ADC의 한계를 극복하고 궁극적으로 향후 더 효과적인 치료제를 개발하는데 사용될 수 있다.
도 1a~1d는 이중 특이성(세툭시맙 × 항-코티닌) 항체(ERC6)의 생성 및 특성을 나타낸다. 도 1a는 이중 특이성 항체를 사용한 항체 약물 복합체(ADC) 플랫폼의 개략도다. 이중 특이성(세툭시맙 × 항-코티닌) 항체(ERC6)는 인간 EGFR 및 코티닌 페이로드 모두에 대한 결합 특이성을 갖도록 설계된다. 도 1b는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타낸다. 정제된 ERC6를 4-12% (w/v) SDS-PAGE로 투입하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루로 겔을 염색함으로써 밴드가 시각화되었다. 1번 또는 2번 레인은 각각 환원제가 있거나 없는 샘플이다. 도 1c는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)다. 고성능 액체크로마토그래피를 사용한 SEC(SEC-HPLC)를 통해 정제된 ERC6를 분석하였다. 도 1d는 ERC6의 약동학 분석 결과를 나타낸다. 200 μg의 ERC6를 Balb/c 마우스(n=4)로 정맥 내 주사하고 혈액 샘플을 안와 내 정맥을 통해 수집하였다. ERC6의 순환 혈청 수준을 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)를 통해 분석하였다. 결과는 3회 수행된 실험으로부터 얻은 평균 ± SD로 나타내었다.
도 2a~2d는 인간 EGFR 및 코티닌에 ERC6의 결합 반응성을 나타낸다. 도 2a는 효소 면역분석법 결과를 나타낸다. 세툭시맙(Cetuximab), 항-코티닌-IgG 및 ERC6를 인간 EGFR 또는 코티닌이 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다. 웰을 HRP-복합 항-인간 IgG(Fab-특이적) 항체로 탐지하였다(probed). 도 2b는 가교 결합된 dPEG6 비오틴과 2가 코티닌 접합된 펩타이드의 화학적 구조를 나타낸다(코티닌-비오틴). 도 2c는 세툭시맙, 항-코티닌-IgG 및 ERC6를 인간 EGFR로 코팅된 마이크로타이터 플레이트의 다른 웰에 첨가한 후, 코티닌-비오틴을 첨가하고, 웰을 HRP-결합된 스트렙타비딘으로 탐지한 결과이다. 백그라운드 신호(background signal)는 BSA로 코팅된 대조군 웰에서 측정하였다. 흡광도는 650nm에서 측정하였다. 도 2d는 ERC6-복합 코티닌-비오틴의 약동학적 분석을 나타낸다. 100 μL의 멸균 PBS에 용해된 1.85 μg의 코티닌-비오틴과 함께 사전 배양한 200 μg의 ERC6를 Balb/c 마우스(n = 4)에 정맥 주사하였다. 혈액 샘플을 안와 내 정맥을 통해 수집하고 ERC6-복합 코티닌-비오틴의 순환 혈청 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 결과를 3회 수행된 실험으로부터 얻은 평균 ± SD로 나타내었다.
도 3a~3e는 EGFR 양성 폐선암종 세포주에 ERC6-복합 코티닌-듀오카마이신의 증진된 항-증식 효과를 나타낸다. 도 3a는 유세포 분석 결과이다. 코티닌-비오틴이 존재하거나 존재하지 않는 경우에, 세툭시맙, 항-코티닌-IgG 또는 ERC6와 함께 A549 세포를 배양하였다. 분석을 위해 세포를 PE-접합된 스트렙타비딘 및 FITC-접합된 항-인간 Fc로 탐지하였다. 도 3b는 자유 듀오카마이신(free duocarmycin)의 구조를 나타낸다. 도 3c는 네개의 듀오카마이신과 가교 결합된 2가 코티닌 접합된 펩타이드의 화학적 구조를 나타낸다(코티닌-듀오카마이신). R는 발린-시트룰린 PAB 연결된 디메틸 아미노에틸 듀오카마이신을 나타낸다. 도 3d는 자유 듀오카마이신의 세포 생존력 분석 결과이다. 도 3e는 코티닌-듀오카마이신의 세포 생존력 분석 결과이다. A549 세포주를 팔리비주맙 및 DMSO (●); 세툭시맙 및 DMSO (■); ERC6 및 DMSO (▲); 팔리비주맙 및 듀오카마이신 (○); 세툭시맙 및 듀오카마이신 (□); ERC6 및 듀오카마이신 (△)으로 처리하였다. 팔리비주맙은 이중 특이성 항체의 동형 대조군으로 사용되었다. DMSO는 코티닌-듀오카마이신의 비히클 대조군으로 사용되었다. 세포를 72시간 동안 배양한 후, Cell Titer-Glo 시약을 사용하여 세포 ATP 함량을 측정함으로써 상대적인 세포 생존력을 측정하였다. 결과는 3 회 수행된 실험으로부터 얻은 평균 ± SD로 나타내었다.
도 4a~4e는 마우스 이종 이식 종양 모델에서 ERC6-복합 코티닌 듀오카마이신의 증진된 항-증식 효과를 나타낸다. A549 세포를 각각의 Balb/c-누드 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양 부피가 150 mm3에 이를 때, 마우스를 세개의 그룹으로 무작위로 나누고(n=4/그룹) 5주 동안 처리하였다. 각 그룹을 팔리비주맙 및 코티닌-듀오카마이신, ERC6 및 비히클 또는 ERC6-복합 코티닌-듀오카마이신으로 복강 내 주사하였다. 팔리비주맙은 이중 특이성 항체의 동형 대조군으로 사용하였다. DMSO는 코르티닌 듀오카마이신의 비히클 대조군으로 사용하였다. 도 4a는 종양 부피를 32일 동안 측정한 결과이다. 도 4b는 체중을 처리 기간 동안 관찰한 결과이다. 도 4c는 32일째에 평균 종양 부피이다. 도 4d는 마우스가 희생될 때 해부된 종양의 평균 질량이다. 도 4e는 종점(end point)에서 세 처리 그룹의 종양의 사진을 나타낸다. 결과는 평균 ± SD로 나타내었다; 그룹과 비교 *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t 테스트(Student's t test).
도 5는 ERC6-복합 코티닌-비오틴의 약동학 분석 결과이다. (a) 100 μL의 멸균 PBS에 1:1 몰비로 용해된 964 pmole의 코티닌-비오틴으로 사전 배양한 200 μg의 ERC6를 Balb/c 마우스(n=4)에 정맥 내 주사하였다. 펩타이드는 두 코티닌 분자 사이에 6mer, 12mer 또는 18mer의 다양한 길이를 갖는다. 혈액 샘플을 안와 내 정맥을 통해 수집하고 ERC6-복합 코티닌-비오틴의 순환 혈청 수준을 ELISA를 통해 결정하였다. (b) 총 ERC6의 순환 혈청 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 결과는 평균 ± SD로 나타내었다; 그룹과 비교 *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t 테스트(Student's t test).
도 6은 EGFR-양성 폐선암종 세포주에 ERC6-복합 코티닌-DM1(emtansine)의 항-증식 효과를 나타낸다. 도 6a는 네개의 DM1과 가교 결합된 2가 코티닌 접합된 펩타이드의 화학적 구조를 나타낸다(코티닌-DM1). R은 MCC 연결된 DM1을 나타낸다. 도 6b는 코티닌-DM1(엠탄신)의 세포 생존력 분석 결과이다. A549 세포주를 팔리비주맙 및 DMSO (●); 세툭시맙 및 DMSO (■); ERC6 및 DMSO (▲); 팔리비주맙 및 코티닌-DM1 (○); 세툭시맙 및 코티닌-DM1 (□); ERC6 및 코티닌-DM1 (△)으로 처리하였다. 팔리비주맙을 이중 특이성 항체의 동형 대조군으로 사용하였다. DMSO를 코티닌-듀오카마이신의 비히클 대조군으로 사용하였다. 세포를 72시간 동안 배양한 후, 상대적인 세포 생존률을 Cell Titer-Glo 시약을 사용하여 세포 ATP 함량을 측정함으로써 결정하였다. 결과는 3회 수행한 실험으로부터 얻은 평균 ± SD로 나타내었다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 세포 배양
A549(인간 폐선암종) 세포를 한국 세포주 은행으로부터 수득하고, 5% CO2 및 습한 환경에서 37°C로 10% 열 비활성화된 소태아혈청(GIBCO, Grand Island, NY, USA), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지(웰젠, 한국)에 배양하였다. HEK293F 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)는 오비탈 쉐이킹 배양기(Minitron, INFORS HT, Bottmingen, Switzerland)에서 135 rpm으로 7% CO2 및 70% 습도로 37℃에서 벤트 캡(vent cap)이 있는 Erlenmeyer 조직 배양 플라스크(Corning Inc., NY, USA)에서 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 포함하는 FreeStyleTM 293 발현 배지(GIBCO)에서 생장시켰다.
실시예 2: 이중 특이성 세툭시맙(cetuximab) × 항-코티닌 항체(ERC6)의 제조 및 정제
이중 특이성 세툭시맙 × 항-코티닌 항체(ERC6) 발현 벡터를 제조하기 위해, 세툭시맙 경쇄 및 세툭시맙 중쇄 - 링커(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3 -항-코티닌 단쇄 가변 절편(scFv)을 코딩하는 유전자를 화학적으로 합성하였다(Genscript, Picataway, NJ, USA). 제한 부위, AgeI 및 XbaI를 세툭시맙의 경쇄를 코딩하는 유전자의 5' 및 3' 말단에 각각 삽입하였다. 추가적인 제한 부위, NheI 및 BsiWI를 세툭시맙의 중쇄를 코딩하는 유전자의 5' 말단 및 항-코티닌 scFv의 유전자의 3' 말단에 각각 삽입하였다. Park S, Lee DH, Park JG, Lee YT, Chung J. A sensitive enzyme immunoassay for measuring cotinine in passive smokers. Clin Chim Acta 2010; 411(17-18): 1238-42에 개시된 방법과 같이, 경쇄 및 중쇄 - 링커 - 항-코티닌-scFv를 재조합 단백질의 분비를 위해 설계된 포유동물 발현 벡터로 서브클론하였다.
Boussif O, Lezoualc'h F, Zanta MA, Mergny MD, Scherman D, Demeneix B et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(16): 7297-301에 개시된 방법과 같이, ERC6를 코딩하는 발현 벡터를 25-kDa 선형 폴리에틸렌이민(Polyscience, Warrington, PA, USA)을 사용하여 HEK293F(Invitrogen)으로 형질주입하였다. Kim H, Park S, Lee HK, Chung J. Application of bispecific antibody against antigen and hapten for immunodetection and immunopurification. Exp Mol Med 2013; 45: e43에 개시된 방법과 같이, ERC6를 단백질 A 아가로스 비드(RepliGen, Waltham, MA, USA)를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 통해 배양 상등액으로부터 정제하였다.
실시예 3: 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)
정제된 ERC6를 제조자의 지시에 따라 NuPage 4-12% Bis-Tris 겔(Invitrogen)을 사용하여 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)로 분석하였다. 상기 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250(Amresco, Colon, OH, USA)로 염색하였다.
실시예 4: 크기-배제 크로마토그래피(SEC)
300Å 기공을 함유하는 3 μm 입자로 포장된 Bio SEC-3 컬럼(7.8 × 300mm)이 장착된 Agilent 1260 Infinity 고압액체 크로마토그래피 (HPLC) 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여, 정제된 ERC6를 SEC-HPLC를 통해 분석하였다. 이동상은 pH 7.0의 50 mM 소듐 포스페이트 및 150 mM 소듐 클로라이드를 포함한다. 20 μL의 ERC6(1 mg/ml)를 주입하고 30분동안 1 mL/분의 유속으로 등용매성으로(isocratically) 용출하였다. 칼럼 유출물을 280 nm에서 자외선 검출기로 모니터링하고 mAU로 표시하였다. 단량체, 응집체 및 단편의 백분율을 피크 면적을 기준으로 정량화하였다.
실시예 5: 코티닌 복합체의 합성
본 실험에 사용된 모든 펩타이드는 Fmoc-고체상 펩타이드 합성(펩트론, 한국)을 사용하여 합성하였다. 두 트랜스-4'-코티닌카르복실산(Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)을 GGGGSKGGGGSK 및 GSKGSKGSKGSKK 펩타이드의 N 말단 및 C 말단에 자유 아민기로 가교 결합시켰다. 트리페닐포스핀(tetrakis) 팔라듐으로 펩타이드의 중간에서 리신 상의 알릴옥시카르보닐(alloc)기를 제거한 후, dPEG6 (Peptide international Inc., Louisville, KY, USA)를 GGGGSKGGGGSK 펩타이드의 자유 아민기에 결합시켰다. 이후 비오틴을 dPEG6 결합된 펩타이드(펩트론) 상 자유 아민에 가교 결합시켰다. 단순화를 위해, 비오틴과 가교 결합된 2가의 코티닌 접합된 펩타이드(코티닌-GGGGSK[(dPEG6)-비오틴]GGGGSK-코티닌)를 코티닌-비오틴으로 약칭한다.
4개의 발린-시트룰린 PAB 연결된 디메틸 아미노에틸 듀오카마이신을 2가 코티닌 가교결합된 GSKGSKGSKGSKK 펩타이드(Concortis, San Diego, CA, USA) 내 4개의 리신에 존재하는 자유 아미노기로 결합시켰다. 단순화를 위해, 네개의 듀오카마이신과 가교 결합된 2가 코티닌 접합된 펩타이드(코티닌-[GSK(듀오카마이신)]4K-코티닌)를 코티닌-듀오카마이신으로 약칭한다.
코티닌-비오틴 및 코티닌-듀오카마이신을 C18 칼럼을 사용하여 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 정제 후, 이들을 Capcell Pak C18 칼럼(4.6 × 50mm, 120Å) (Shiseido, Tokyo, Japan)이 장착된 Agilent 1100 capillary LC 및 HPLC 시스템(Shimadzu Corp., Kyoto, Japan)을 사용하여 질량 분석을 통해 분석 및 검증하였다.
실시예 6: ERC6와 코티닌 페이로드(payloads)의 복합화
ERC6와 코티닌 접합된 페이로드의 복합체를 생성하기 위해, 코티닌 페이로드 및 ERC6를 피펫팅(pipetting) 업 및 다운을 통해 일대일 몰 비율로 혼합시켰다. 이후, 혼합물을 실온에서 30분동안 배양하였다. 이후 복합체를 추가적인 변경 없이 인비트로(in vitro) 또는 인비보(in vivo)에서 사용하였다.
실시예 7: 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)
96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰(Corning)을 코팅 버퍼(증류수 내 0.1M 소듐 바이카르보네이트, pH 8.6) 내 인간 EGFR(Sigma) 또는 BSA 결합된 코티닌으로 4°C에서 밤새 코팅하고, 37°C에서 1시간 동안 PBS 내 3% [w/v] 소태아 혈청(BSA)으로 차단하였다. 50 μL 차단 버퍼 내 1 μg/mL 농도의 항체를 각 웰에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. PBS 내 0.05% [v/v] Tween 20(PBST)로 세척 이후, 차단 버퍼 내 희석된 HRP-결합된 항-인간 IgG (Fab 특이적) 항체(Sigma)를 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 플레이트를 0.05% PBST로 다시 세척하고, 50 μL의 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 기질 용액(TMB)(GenDEPOT, Barker, TX, USA)을 각 웰에 첨가하고, 흡광도를 Multiskan Ascent 마이크로플레이트 리더(Labsystems, Helsinki, Finland)로 650 nm로 측정하였다.
ERC6의 이중 특이성을 확인하기 위해, 인간 EGFR 코팅된 웰을 상기와 같이 항체와 함께 배양하였다. 0.05% PBST로 세척한 후, 코티닌-비오틴을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 차단 버퍼 내 희석된 HRP 결합된 스트렙타비딘(Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL, USA)을 이후 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, TMB를 각 웰에 첨가하고, 흡광도를 650 nm에서 측정하였다.
실시예 8: 약동학 분석(Pharmacokinetic analysis)
본 실험에 사용된 모든 실험 동물은 한국 국립암센터 연구소의 동물실험윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었다(허가 번호: NCC-15-267). 동물은 AAALAC 국제 동물 보호 정책에 따라 국립 암 센터 동물 시설에서 관리하였다.
8주령의 수컷 Balb/c 마우스에 일대일 몰비율로 100 μL 멸균 PBS에 용해된 ERC6(200 μg) 및 코티닌-비오틴(1.85 μg)의 복합체를 정맥 주사하였다(n=4/그룹). 주사 후 0, 1, 24, 48, 72, 96 및 168 시간에 안와 내 정맥으로부터 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액이 응고될 때까지 샘플을 실온에서 2시간 동안 유지시켰다. 이후 4°C에서 15분 동안 3,500 rpm으로 원심분리를 통해 혈청을 수집하였다. 전체 ERC6 및 ERC6 복합 코티닌 비오틴의 순환 혈청 수준은 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)를 통해 측정하였다.
혈청 샘플 내 총 ERC6는 하기와 같이 측정하였다: 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰(Corning)은 4°C에서 밤새 코팅 버퍼 내에서 염소 항-인간 IgG(Fc 특이적) 포획 항체(EMD Millipore, Darmstadt, Germany)로 코팅하고, PBS 내 3% BSA로 차단하였다. 차단 버퍼 및 표준 용액 내 희석된 혈청 샘플을 각 웰에 첨가하고 37°C에서 2시간 동안 배양하였다. 0.05% PBST로 세척한 이후, 차단 버퍼 내 희석된 HRP 결합된 항-인간 Ckappa 항체(Chemicon-Milipore, Billerica, MA, USA)를 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 이후, TMB(GenDEPOT)를 각 웰에 첨가하고, 흡광도를 650 nm로 측정하였다.
혈청 샘플 내 ERC6 및 코티닌-비오틴의 복합체를 하기와 같이 측정하였다: 인간 EGFR(Sigma) 코팅된 웰을 상기 설명된 것처럼 혈청 샘플과 함께 배양하였다. 0.05% PBST로 세척한 이후, HRP 결합된 스트렙타비딘(Thermo Fisher Scientific Pierce)을 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, TMB를 각 웰에 첨가하고, 흡광도를 650 nm에서 측정하였다.
실시예 9: 유동 세포 분석(Flow cytometry)
각 샘플 당 4×105 세포의 최종 농도로 A549 세포를 v-bottom 96-웰 플레이트(Corning)에 시드하였다(seeded). 30분 동안 37°C로 유동 세포 분석 버퍼(PBS 내 1% [w/v] BSA를 포함하는 0.1% [w/v] 소듐 아지드) 내 희석된 ERC6 및 코티닌-비오틴의 0 또는 100 nM로 세포를 처리하였다. 대조군 실험으로, ERC6 대신 팔리비주맙(palivizumab) (Synagis, Boehringer Ingelheim Pharma, Biberach an der Riss, Germany), 항-코티닌-IgG 또는 세툭시맙(cetuximab) (Erbitux, Merck K GaA, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 유동 세포 분석 버퍼로 세척 후, 어두운 곳에서 37°C로 1시간 동안 피코에리스린(PE)-결합된 스트렙타비딘(BD Biosciences Pharminogen, San Diego, CA, USA) 및 FITC-결합된 항-인간 IgG(Fc 특이적) 항체(Thermo Fisher Scientific Pierce)와 함께 세포를 배양하였다. 동일한 버퍼로 추가 세척 이후, 세포를 200 μL의 PBS에 재현탁시키고, 488-nm 레이저가 장착된 FACS Canto II instrument (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 사용하여 유동 세포 분석을 통해 분석하였다. 측정 당 1만개의 세포가 검출되었고, FlowJo 소프트웨어(TreeStar, Ashland, OR, USA)로 데이터를 분석했다.
실시예 10: 세포 생존능 분석
종양 세포 생존력에 대한 ERC6 및 코티닌-듀오카마이신의 영향을 Cell Titer-Glo 시약(Promega Corp., Madison, WI, USA)을 사용하여 평가했다. A549 세포를 검정색 벽으로 된 96-웰 플레이트(웰 당 4,000개 세포)에서 RPMI-1640 배지 50 μL에 시드하고, 5% CO2 및 습한 환경에서 37°C 로 밤새 접착시켰다. 이후, ERC6 및 코티닌-듀오카마이신의 복합체를 신선한 배양 배지로 10배 계열 희석시켰다(0.02 nM - 2000 nM). 대조군 실험에서, ERC6 대신 팔리비주맙(Boehringer Ingelheim Pharma), 또는 세툭시맙(Merck K GaA)을 사용하였다. 50 μL의 배지 내 코티닌-듀오카마이신 및 항체 희석물을 각 웰에 첨가하고 72 시간 동안 배양하였다. 각 웰에 Cell Titer-Glo 시약(Promega Corp.)를 첨가한 후, 제조자의 지시에 따라 마이크로플레이트 발광측정기(microplate luminometer)(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 발광 신호를 측정하였다. 모든 실험은 3배수로 수행하였다. 상대적인 세포 생존력은 대조군 발광 신호로 나눔으로써 계산하였다 [% 생존력 = (실험(Test)-배경(Background)) / (대조군(Control)-배경) × 100].
실시예 11: 이종 이식(Xenograft)
6주령의 암컷 Balb/c-누드 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 A549(1×107 세포)를 피하 주사했다. 종양의 부피가 약 150 mm3에 도달할 때, 모든 동물을 세개의 그룹으로 무작위로 나누고(n=4/그룹) 5주 동안 처리했다. 첫 2주 동안 일주일에 두번 적절한 대조군을 마우스에 복강 주사하였다: 그룹 I은 팔리비주맙(palivizumab) (2.15 mg/kg) 및 코티닌-듀오카마이신(95 μg/kg)를 투여; 그룹 II는 ERC6(3 mg/kg) 및 디메틸설폭사이드(DMSO) 투여; 그룹 III은 ERC6(3 mg/kg) 및 코티닌-듀오카마이신(95 μg/kg)의 복합체 투여. 이후, 상기 약물의 3배 투여량을 다음 3주 동안 주 3회 주사했다. 팔리비주맙은 이중 특이성 항체의 동형(isotype) 대조군으로 사용되었다. DMSO는 코티닌-듀오카마이신의 비히클 대조군으로 사용되었다. 종양 부피는 주사 32일 후 일주일에 두번 디지털 캘리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 부피는 길이 × (폭)2 × 0.5으로 계산하고, 상기 길이는 가장 긴 축이며 폭은 상기 길이에 수직인 거리다. 전신 독성은 일주일에 두번 체중을 측정하여 평가하였다. 주사 후 35일째에 마우스를 희생시키고 종양을 절개하고 무게를 측정하였다.
실시예 12: 면역 형광법(Immunofluorescence)
A549(1×107 세포)를 Balb/c-누드 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 평균 종양 부피가 500 mm3에 도달할 때, 종양을 갖는 마우스들은 하기의 단일 복강내(i.p.) 주사를 투여 받았다: 그룹 I은 144 μg의 팔리비주맙 및 1.85 μg의 코티닌-비오틴을 투여; 그룹 II는 200 μg의 ERC6 및 비히클(증류수)을 투여; 그룹 III은 ERC6 (200 μg) 및 코티닌-비오틴 (1.85 μg)의 복합체를 투여. 주사 후 24시간에 마우스를 이소플루란으로 마취시키고 PBS 내 4% [w/v] 파라포름알데히드 10 ml로 경심 관류(transcardial perfusion)를 통해 안락사시켰다. 해부된 종양을 4°C에서 24시간 동안 PBS 중의 30% [w/v] 수크로오스를 함유하는 동결 보존 용액 중에 평형화시키고, 액체 질소 상에 최적 절단 온도(OCT) 내장(embedding) 배지(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에 냉동시키고, 절개할 때까지 -80°C에 저장하였다. 면역 형광 염색을 위해, 4μm 두께로 동결 절편(cryosections)을 준비하고, PBS 내 4% 파라포름알데히드로 10분간 실온에 고정시켰다. PBS로 세척 이후, 상기 절편(sections)을 실온에서 1시간 동안 IHC-Tek 항체 희석액(pH 7.4)(IHC WORLD, Woodstock, MD, USA) 내 10% [v/v] 정상 염소 혈청(normal goat serum) (CST, Danvers, MA, USA)으로 차단하였다. 상기 조직 절편을 Alexa Fluor 488 결합된 스트렙타비딘(Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)과 함께 8시간 동안 배양하고, Alexa Fluor 594 결합된 항-인간 IgG 항체(Molecular Probes Inc.)로 4°C의 어둡고 습한 챔버에서 16시간 동안 염색하였다. PBS로 세척 후, 제조자의 지시에 따라 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Pierce, Rockford, IL, USA)로 핵을 염색하였다. 상기 절편을 형광 고정 배지(DAKO, Glostrup, Denmark)와 함께 슬라이드 상에 고정하고, FV1000 레이저 스캐닝 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 FV10 ASW 소프트웨어로 40배 확대 이미지를 얻었다. 방출 및 여기 필터는 동시에 3가지 색으로 이미지화 되도록 배열하였다.
통계 분석
실험에 사용된 통계는 GraphPad Prism version 5.0 소프트웨어(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 결과는 표시된 독립적인 측정 횟수에 대한 ± 표준 편차(SD)의 평균 값으로 표현하였다. 통계적 유의성은 투 테일드 언페어드 스튜던트 t-테스트(two tailed unpaired Student's t-test)를 사용하여 결정하고, 0.05 미만의 p 값은 통계적으로 중요한 것으로 간주하였다. P 값은 도면 및 이의 범례에 표시하였다.
실험예 1: 4가 이중 특이적 항체 포맷을 이용한 항체 약물 복합체 플랫폼의 설계
중쇄의 CH3 도메인에 두 단일쇄 가변 절편(scFvs)를 융합함으로써 IgG 기초의 4가 포맷으로 이중 특이성 항체를 설계하였다(도 1a). 유연성을 위해, 글리신 및 세린이 풍부한 펩타이드 링커[(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3]를 CH3 도메인 및 scFv 사이에 삽입하였다. 이로써, 이중 특이성 항체의 2개의 Fab 암(arms) 및 중쇄의 C 말단 상의 2개의 svFv를 포함하는 4가 항체가 생성되어, 각각 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 코티닌을 동시에 표적화시켰다. 이중 특이적 세툭시맙 × 항-코티닌 scFv 항체(ERC6)를 개발하기 위해, 세툭시맙 IgG, 링커 및 항-코티닌 scFv를 코딩하는 유전자 구조를 진핵 발현 벡터에 클로닝하였다. ER6는 단백질 A 친화성 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 일시적으로 형질주입된(transfected) HEK393F 배양 상등액으로부터 정제하였다.
종래의 항체 약물 복합체(ADC)는 항체에 약물을 결합하는데 복합체에 다단계 절차를 필요로 하며, 보통 최적화 과정이 필수적이다. 반면, 코티닌 결합 이중 특이성 항체를 사용하는 약물의 표적 전달은 코티닌과 약물의 접합을 필요로 한다. 따라서, 카르복시코티닌(트랜스-4-코티닌카르복실산) 화학 가교 절차를 잘 확립하면 종래의 ADC보다 플랫폼에 이점이 있다. 2개의 카르복시코티닌은 13개 아미노산 길이의 펩타이드의 N-말단 및 C-말단에서 가교 결합되었다. 2가 코티닌 가교 결합된 펩타이드에 대한 이중 특이성 항체의 결합력은 원자가(valency) 효과에 의해 더욱 안정해졌다(도 5). 목적에 따라 펩타이드 내의 라이신의 ε-아미노산 사슬에 다양한 페이로드(payloads)를 결합시킬 수 있다. 본 발명에서, 비오틴 또는 듀오카마이신을 2가 코티닌 복합된 펩타이드에 결합시켰다(도 2b, 3c).
실험예 2: 이중 특이적 세툭시맙(cetuximab) × 항-코티닌 scFv 항체(ERC6)의 특징
정제된 ERC6의 순도 및 분자량을 분석하기 위해, ERC6를 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔에서 시각화하였다. 206 kDa의 분자량을 갖는 주요 밴드는 비환원 조건에서 관찰되었고, 78 kDa 및 25 kDa의 두 가지 주요 밴드가 환원 조건에서 관찰되었다(도 1b). 206 kDa의 분자량을 갖는 재조합 단백질은 ProtParam 툴(ExPASy)에 의해 예측된, 완전히 조립된 ERC6에 상응한다. 25 kDa의 비변형된 경쇄 및 75kDa의 CH3 도메인 상의 하나의 scFv와 융합된 중쇄는 이황화 결합의 감소에 의해 시각화되었다. 따라서, 데이터는 이중 특이성 항체가 순수하고 손상 없이 제조되었음을 입증하였다.
정제된 재조합 단백질의 물리 화학적 성질을 고압 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC)를 이용한 크기 배제 크로마토그래피로 분석하였다. ERC6는 올바르게 조립된 형태에 상응하는 명확한 분자량을 갖는 단일 주요 피크로 나타났다. 이러한 데이터는 ERC6가 절편을 생산하지 않으며, 응집되지 않고, 멀티-머(multi-mers)를 생산함을 나타낸다(도 1c).
또한 약동학 분석을 인비보(in vivo)에서 ERC6의 안정성을 측정하기 위해 수행하였다. ERC6의 혈청 반감기를 Balb/c 마우스(n=4)에서 결정하였다. ERC6의 순환 혈청 수준은 안와 내 정맥으로부터 수득한 혈액 샘플을 사용하여 효소 연결된 면역흡착 분석(ELISA)를 통해 결정하였다. 정맥내로 주입된 ERC6는 마우스 혈청에서 5일째까지 안정하였으며, 이는 세툭시맙 IgG의 결과와 유사했다.
실험예 3: 인간 EGFR 및 코티닌에 ERC6의 결합 반응성
EGFR 및 코티닌에 대해 ERC6의 반응성을 실험하기 위해 효소 면역분석을 적용하였다(도 2a). EGFR에 대한 ERC6의 결합 활성이 확인됨에 따라, EGFR에 대한 반응성이 추가적 scFv와 무관함이 입증되었다. 또한, 코티닌에 대한 항-코티닌 scFv 모듈의 친화도가 유지되었음이 확인되었다(도 2a).
ERC6가 사람 EGFR 및 코티닌에 동시에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 스트렙타비딘-비오틴 검출 시스템을 사용하여 추가적인 효소 면역분석법을 수행하였다. 인간 EGFR 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 ERC6와 함께 배양한 후, 비오틴과 가교 결합된 2가 코티닌 결합된 펩타이드(코티닌-비오틴) (도 2b)를 각 웰에 첨가한 후, HRP-결합된 스트렙타비딘을 첨가하였다. ERC6는 EGFR 및 코티닌에 동시에 결합하였다(도 2c).
ERC6와 복합체를 형성할 때 코티닌 페이로드의 안전성을 평가하기 위해, 약동학 분석을 수행하였다. 코티닌-비오틴으로 미리 배양된 ERC6를 마우스(n=4)에 정맥 주사하고 순환 혈청 수준을 ELISA를 통해 측정하였다. 코티닌 페이로드(payload)는 이의 낮은 분자량(t1/2 = 0.557 h)으로 인해 마우스 혈류에서 신속하게 제거된다. 반면, 코티닌-비오틴의 순환 반감기는 ERC6에 결합함으로써 연장된다(t1/2 = 18 시간) (도 2d). 코티닌에 대한 ERC6의 이원성은 증가된 결합력에 의해 ERC6-복합 코티닌-비오틴의 안정성을 향상시킨다(도 6). 또한, 코티닌-비오틴의 클리어런스(clearance) 패턴은 ERC6의 분해 패턴과 일치하며, 이는 복합체의 반감기가 대부분 ERC6의 약동학에 의존한다는 것을 의미한다(도 2d).
실험예 4: KRAS 변이를 갖는 폐선암종 세포에 강력한 세포 독성 효과를 유발하는 ERC6-복합된 코티닌-듀오카마이신
A549는 세툭시맙(cetuximab)과 같은 EGFR 표적 치료에 대한 1차 저항성을 나타내는 KRAS 돌연변이와 함께 야생형 EGFR을 발현하는 폐선암종 세포주이다. 따라서, 야생형 EGFR 및 KRAS 돌연변이를 갖는 암세포에 ERC6 결합된 코티닌 세포 독성제의 효능을 시험하기 위해 상기 세포주를 사용하였다.
세포 독성 분석에 앞서, A549 세포 표면에서 EGFR의 발현은 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통해 확인하였다(도 3a). ERC6는 세툭시맙(cetuximab)과 유사한 수준으로 원형질막에 발현된 EGFR과 유사한 결합 활성을 보였다. 예상한 바와 같이, 코티닌-비오틴은 ERC6이 존재할 때만 A549 세포에 결합 활성을 나타내었다. 코티닌-비오틴 및 항-코티닌 IgG 또는 세툭시맙의 혼합물은 스트렙타비딘-PE에 기인한 유의한 신호를 생성하지 않았다. 추가로, 코티닌-비오틴은 EGFR에 대한 ERC6의 결합 능력에 영향을 미치지 않았다. 이러한 데이터는 ERC6가 동시 결합 활성에 의해 표적 특이적 방식으로 EGFR 양성 세포에 코티닌-비오틴의 전달을 매개함을 입증한다.
A549 세포에 대한 세포 독성 활성은 세포 생존능 분석을 통해 조사하였다(도 3e). 상대적인 세포 생존력은 생존 가능한 세포 수와 직접적으로 관련된 세포 ATP 함량을 측정함으로써 결정하였다. 페이로드(payload)가 없는 듀오카마이신(자유(free) 듀오카마이신)은 코티닌-듀오카마이신보다 강력한 항 종양 효과를 나타냈다(도 3d, 3e). 코티닌-듀오카마이신의 독성이 자유(free) 듀오카마이신보다 낮으면 세포질막을 통한 침투가 덜 효율적일 수 있다.
ERC6 또는 세툭시맙(cetuximab)도 A549 세포의 EGFR 표적 치료에 대한 1차 저항성 때문에 A549 세포의 증식을 유의하게 억제하지 못했다(도 3e). 그러나, ERC6와 코티닌-듀오카마이신을 조합할 때, 세툭시맙 또는 음성 대조군의 항체와 비교하여 코티닌-듀오카마이신 혼합물에 비해 세포 독성 효과가 현저하게 향상되었다.
최대 억제 농도의 절반(IC50)은 0.3 nM이다. 실험 결과는 ERC6가 수용체 매개된 세포내섭취(endocytosis)를 통해, EGFR 양성 세포로 코티닌-듀오카마이신의 내재화(internalization)를 효율적으로 촉진시킴을 입증하였다. 결과적으로, ERC6-복합체 코티닌-듀오카마이신은 세툭시맙(cetuximab)의 KRAS-매개된 일차 저항성을 극복할 수 있었다.
또한, 추가 실험을 통해 ERC6 및 코티닌-엠탄신(Cot-DM1)이 조합된 항체 약물 복합체의 세포 독성 효과를 실험하였다. 이러한 항체 약물 복합체도 상기 코티닌-듀오카마이신이 조합된 복합체와 마찬가지로, A549 세포주에 대한 현저하게 높은 세포 독성 효과를 보였다(도 6b).
실험예 5: 폐선암종을 갖는 동물 모델에서 종양 성장을 억제하는 ERC6-복합 코티닌-듀오카마이신
ERC6-복합 코티닌-듀오카마이신의 인비보(in vivo) 효능을 평가하기 위해, 세툭시맙-난치성(refractory) A549 세포를 마우스(n=4/그룹)로 이식하였다. 종양 체적이 150 mm3에 이를 때, 팔리비주맙(palivizumab) 및 코티닌-듀오카마이신, ERC6 및 비히클 또는 ERC6-복합 듀오카마이신을 5주간 복강 내 주사하였다. 마우스에 약물을 2주 동안 주 2회, 그 다음 3주 동안 주 3회 투여하였다.
ERC6-복합된 코티닌-듀오카마이신을 투여한 마우스는 코티닌-듀오카마이신 또는 ERC6 단독으로 처리한 동물에 비해 종양 성장이 억제되는 것으로 나타났다(도 4a). 코티닌-듀오카마이신이 인비트로(in vitro)에서 A549에 강력한 항 증식 효과를 보였으나, 이중 특이성 항체의 동형(isotype) 대조군은 인비보(in vivo)에서 종양 성장을 억제하지 못했다. 이러한 관찰 결과는 인비보(in vivo) 조건 하에서 코티닌-듀오카마이신만이 선택적으로 종양 부위에 전달되어 종양 성장을 억제할 수 없음을 보여준다. 비 특이성 및 낮은 분자량으로 인한 마우스 혈류로부터 신속한 제거는 이러한 효능 부족을 설명할 수 있다. 반면, ERC6는 코티닌 듀오카마이신이 순환 반감기를 연장시키고 EGFR 발현 종양 조직으로 전달되도록 한다. 따라서, ERC6 및 코티닌-듀오카마이신은 인비보(in vivo)에서 EGFR-양성 세툭시맙-난치성(refractory) 종양에서 항 증식 효능을 시너지적으로 상승시킨다.
또한, 5주간의 처리 기간 동안 마우스에서 유의한 체중 감소는 없었다(도 4b). 이러한 관찰 결과는 간접적으로 ERC6 및 코티닌-듀오카마이신에는 전신 독성이 없다는 것을 의미한다. 결과적으로, 이러한 데이터는 ERC6가 약물 전달체로서 작용하여, 전신 독성 없이 표적 특이적 방식으로 코티닌 결합 세포 독성 약물을 EGFR 발현 종양 조직에 선택적으로 전달할 수 있음을 가리킨다.
실험예 6: 마우스 이종 이식 종양 모델에서 ERC6-복합 코티닌 페이로드(payloads)의 조직 분포
약동학 분석은 ERC6 복합된 페이로드의 순환 반감기가 ERC6에 결합함으로써 연장됨을 입증했다. 항원 발현 종양 조직으로 코티닌 페이로드의 특이적 전달을 조사하기 위해, A549 이종 이식 마우스 모델에서 면역 형광 분석을 수행하였다. A549 세포를 각 Balb/c-누드 마우스의 왼쪽 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 500 mm3에 이를 때, 종양 보유 마우스에게 팔리비주맙(palivizuman) 및 코티닌-비오틴, 세툭시맙(cetuximab) 및 비히클(vehicle) 또는 ERC6-복합 코티닌-비오틴을 복강 내 주사하였다. 주사 24시간 후에 동물을 희생시키고, 해부된 종양 조직을 엑스비보(ex vivo) 이미지화 하였다. 종양 조직 상의 코티닌 페이로드 및 항체를 형광 표지된 2차 항체를 통해 검출하였다. 항체는 Alexa 594 표지된 항-인간 Fc(적색)에 의해 검출되었고 코티닌-비오틴은 Alexa 488 표지된 스트렙타비딘(녹색)에 의해 검출되었다. 참고로, 핵은 DAPI(푸른색)으로 염색하였으며, 이미지 배율은 x40이다. 공초점 현미경을 통해 ERC6 복합 코티닌-비오틴의 조직 분포를 관찰하였다.
이중 특이적 항체의 동형(isotype) 대조군으로 사용된 팔리비주맙(palivizumab)과 비교할 때, 인간 EGFR 양성 종양 조직에 ERC6의 축적이 관찰되었다. 또한, 코티닌-비오틴의 종양 내 위치는 ERC6를 주사한 경우에만 관찰되었다. ERC6가 없는 코티닌-비오틴은 이의 낮은 분자량으로 인해 혈류에서 빠르게 제거될 수 있다. 이러한 관찰 결과는 ERC6가 표적 특이적 방식으로 인비보(in vivo)에서 원하는 종양 부위에 선택적으로 코티닌 페이로드를 전달한다는 것을 증명한다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY R&DB FOUNDATION <120> A novel platform for antibody drug conjugate using a bispecific antibody <130> PCT17-057, SNU-2016-0600-US-PC <150> US 62/352,804 <151> 2016-06-21 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-cotinine scFv <400> 1 gaggtgcagc tggtggagag cgggggcggc ctggtgcagc ctggaggaag cctgcgactg 60 tcctgtgcag cttctggaca cctgcggaga agggactgga tgaactgggt gcggcaggca 120 ccaggaaaag gcctggagtg ggtcgcagcc atcggacgat ccggcgacac ctactatgct 180 acatgggcaa aaggcaggtt cacaattagt gctgatactt caaagaacac cgcatacctg 240 cagatgaata gtctgagggc cgaagacact gctgtgtact attgctcccg catcccttat 300 tttgggtgga acaatggaga tatttggggg cagggaacac tggtgactgt cagctcc 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of anti-cotinine scFv <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Leu Arg Arg Arg Asp 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Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 715 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain of tetravalent complex comprising bispecific cetuximab x anti-cotinine antibody <400> 10 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 465 470 475 480 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly His Leu Arg Arg 485 490 495 Arg Asp Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 500 505 510 Trp Val Ala Ala Ile Gly Arg Ser Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp 515 520 525 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala 530 535 540 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 545 550 555 560 Cys Ser Arg Ile Pro Tyr Phe Gly Trp Asn Asn Gly Asp Ile Trp Gly 565 570 575 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 580 585 590 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln 595 600 605 Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 610 615 620 Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Gln Ser Pro Tyr Ser Asn Glu Trp Leu 625 630 635 640 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 645 650 655 Arg Ile Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 660 665 670 Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 675 680 685 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Phe Gly Leu Phe 690 695 700 Leu Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 705 710 715

Claims (15)

  1. 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv)를 포함하는 이중 특이성 항체; 및
    펩타이드와 가교 결합된 2가 코티닌 및 약물의 접합체를 포함하는 항체 약물 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항-코티닌 단일쇄 가변 절편은 상기 2가 코티닌과 결합된 항체 약물 복합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 2가 코티닌은 2개의 코티닌이 각각 6~18 mer 펩타이드의 N 말단 및 C-말단에 가교 결합된 항체 약물 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 약물은 2가 코티닌과 가교 결합된 6~18 mer 펩타이드에서 리신 잔기와 접합된 항체 약물 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 CH3 도메인 및 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv) 사이에 펩타이드 링커 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3가 삽입된 항체 약물 복합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 약물은 듀오카마이신(Duocarmycin), 아우리스타틴(Auristatin), 콜히친(Colchicine), 안트라사이클린(Anthracycline), 칼리키아마이신(Calicheamicin), 메이탄시노이드(Maytansinoid), 피롤로벤조다이아제핀(Pyrrolobenzodiazepine), 돌라스타틴(Dolastatin), 툴불리신(Tubulysin),　메이탄시노이드(Maytansinoid), 독소루비신(Doxorubicin), 크립토피신(Cryptophycin), 에포틸론(Epothilone), 사프라닌(Safranin), 디아세틸콜히친(Deacetyl colchicine), 메이탄신올(Maytansinol), 베도틴(Vedotin), 마포도틴(Mafodotin), 엠탄신(Emtansine), 머탄신(Mertansine), 라브탄신(Ravtansine), 소라브탄신(Soravtansine), 탈리린(Talirine), 테시린(Tesirine), 인돌리노벤조디아제핀(Indolinobenzodiazepines), 이리노테칸 전구약물(Irinotecan prodrug), 엑사테칸 유도체(Exatecan derivative) 및 튜불린 억제자(Tubulin inhibitor)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나; 또는
    암을 발생시키는 유전자의 발현을 억제하는 siRNA인 항체 약물 복합체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 이중 특이성 항체는 세툭시맙(Cetuximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 오레고보맙(Oregovomab), 에드레콜로맙(Edrecolomab),　알렘투주맙(Alemtuzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 이브리투모맙(Ibritumomab　), 오파투무맙(Ofatumumab), 파니투무맙(Panitumumab), 리툭시맙(Rituximab), 토시투모맙(Tositumomab), 이필리무맙(Ipilimumab), 겜투주맙(Gemtuzumab), 브렌투시맙(Brentuximab), 베다스툭시맙(Vadastuximab), 글렙바투무맙(Glembatumumab), 데파투시주맙(Depatuxizumab), 폴라투주맙(Polatuzumab), 데닌투주맙(Denintuzumab), 엔포투맙(Enfortumab), 텔리소투주맙(Telisotuzumab), 티소투맙(Tisotumab), 피나투주맙(Pinatuzumab), 리파스투주맙(Lifastuzumab), 인두사투맙(Indusatumab), 밴돌투주맙(Vandortuzumab), 소피투주맙(Sofituzumab), 볼세투주맙(Vorsetuzumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 밀베투시맙(Mirvetuximab), 콜툭시맙(Coltuximab), 나라투시맙(Naratuximab), 인다투시맙(Indatuximab), 아네투맙(Anetumab), 롤보투주맙(Lorvotuzumab), 칸투주맙(Cantuzumab), 라프리투시맙(Laprituximab), 비바투주맙(Bivatuzumab), 바다스투시맙(Vadastuximab), 로발피투주맙(Rovalpituzumab), 이노투주맙(Inotuzumab), 사시투주맙(Sacituzumab), 라베투주맙(Labetuzumab), 밀라투주맙(Milatuzumab), 루팔투맙(Lupartumab) 및 아프루투맙(Aprutumab)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 항체 약물 복합체.
  8. 제1항의 항체 약물 복합체를 포함하는 암 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 KRAS 돌연변이를 갖는 폐선암종(lung adenocarcinoma)인 암 치료용 약학적 조성물.
  10. (s1) 항-코티닌 단일쇄 가변 절편(scFv)를 포함하는 이중 특이성 항체를 제조하는 단계;
    (s2) 펩타이드와 가교 결합된 2가 코티닌 및 약물의 접합체를 제조하는 단계; 및
    (s3) (s1) 단계에서 생성된 이중 특이성 항체 및 (s2) 단계에서 생성된 접합체를 혼합하는 단계를 포함하는 항체 약물 복합체의 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (s3) 단계는 항-코티닌 단일쇄 가변 절편 및 2가 코티닌이 특이적으로 결합하는 항체 약물 복합체의 제조 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 2가 코티닌은 2개의 코티닌이 6~18 mer 펩타이드의 N 말단 및 C-말단에 가교 결합된 항체 약물 복합체의 제조 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 약물은 2가 코티닌과 가교 결합된 6~18 mer 펩타이드에서 리신 잔기와 접합된 항체 약물 복합체의 제조 방법.
  14. 제1항의 항체 약물 복합체의 유효량을 암을 갖는 동물에 처리하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  15. 제1항의 항체 약물 복합체를 사용하여 약물의 반감기를 증진시키는 방법.
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