CN115991775A

CN115991775A - 抗cxcr4单域抗体、双特异性抗体及药物偶联物

Info

Publication number: CN115991775A
Application number: CN202211279740.4A
Authority: CN
Inventors: 王峰; 张雨菡; 杜娟娟
Original assignee: Institute of Biophysics of CAS
Current assignee: Institute of Biophysics of CAS
Priority date: 2021-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明提供了一种亲和力降低的抗CXCR4单域抗体、基于亲和力降低的抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及其药物偶联物；所述亲和力降低的双特异性抗体或双特异性抗体ADC其在细胞内的内化不依赖于细胞表面的受体比率(有效性提高)，并且对细胞的选择性大大提高(有效性提高、毒性降低)，为本领域构建有效靶向肿瘤、同时降低对正常细胞毒性的ADC的提高了有益的参考。

Description

抗CXCR4单域抗体、双特异性抗体及药物偶联物

技术领域：

本发明涉及一种抗CXCR4单域抗体、基于抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及药物偶联物，具体涉及一种亲和力降低的抗CXCR4单域抗体、基于亲和力降低的抗CXCR4单域抗体的双特异性抗体及其药物偶联物。

背景：

抗体药物偶联物(ADC)是一种新兴的肿瘤治疗平台，可选择性地向表达癌症特异性受体的肿瘤细胞递送细胞毒药物(Beck,A.et al,Nat Rev Drug Discov 2017,16(5),315-337；Khongorzul,P.et al,Mol Cancer Res 2020,18(1),3-19；Sievers,E.L.et al,Annu Rev Med 2013,64(1),15-29)。利用单克隆抗体对肿瘤表面受体的特异性识别以及细胞毒药物的效力，ADC显著提高了细胞毒药物化学疗法的治疗指数(TI)。到目前为止，已有11种ADC上市，另有80多种ADCs正处于临床开发阶段，用于各种血液和实体恶性肿瘤(Coats,S.et al,Clin Cancer Res 2019,25(18),5441-5448)。理想的ADC靶受体应该在肿瘤中具有高表达水平，而在正常组织中很少或没有表达以确保有效和选择性的负载细胞毒药物。此外，ADC必须能够被靶细胞有效地内化并运输到溶酶体以确保所载药物能够释放(Ritchie,M.et al,MAbs 2013,5(1),13-21)。尽管ADC在癌症治疗方面取得了巨大成功，但由于缺乏可靶向的癌症相关受体，新型ADC的开发仍然受到限制。

CXCR4(CD184)是一种G蛋白偶联受体，与各种血液和非血液学恶性肿瘤的进展有关(Karpova,D.et al,Stem Cells 2015,33(8),2391-9；Ratajczak,M.Z.et al,Leukemia2006,20(11),1915-24)。CXCR4在多种人类癌症中表达，是乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤和急性髓细胞白血病等癌症的不良预后marker(Chatterjee,S.et al,Adv Cancer Res 2014,124,31-82；Okuyama Kishima,M.et al,Anal Cell Pathol(Amst)2015,2015,891020；Spoo,A.C.et al,Blood 2007,109(2),786-91)。此外，在转移性恶性肿瘤和肿瘤干细胞(cancer steem cell，CSC)中可见CXCR4的表达上调。最近的研究评估了CXCR4作为治疗血液恶性肿瘤和转移性实体瘤潜在靶点的可能性(Cancilla,D.et al,Front Oncol 2020,10,1672；Zhou,W.et al,Curr Med Chem 2019,26(17),3026-3041)，已经有多个CXCR4拮抗剂如AMD3100(Plerixafor，小分子CXCR4拮抗剂)、BTK140(14个氨基酸残基的合成肽)和anti-CXCR4抗体(如BMS-936564)等正处于用于治疗AML和多发性骨髓瘤的临床研究阶段(Broussas,M.et al,Mol Cancer Ther 2016,15(8),1890-9；Kuhne,M.R.et al,ClinCancer Res 2013,19(2),357-66)。此外，由于CXCR4与其配体结合后可被靶细胞有效内化，因此，基于CXCR4的ADC开发被视为治疗肿瘤的一种潜在治疗策略(Costa,M.J.et al,SciRep 2019,9(1),2443；Kularatne,S.A.et al,Angew Chem Int Ed Engl 2014,53(44),11863-7)。

然而，由于CXCR4广泛表达于正常细胞特别是造血细胞和淋巴细胞上，靶向CXCR4的ADC可能会对正常组织造成毒性(Nimmagadda,S.et al,J Nucl Med 2009,50(7),1124-30)。因此，靶向CXCR4、肿瘤特异性的ADC为实现针对各种血液和实体恶性肿瘤的有效、安全的治疗提供了有吸引力的机会。

B淋巴细胞特异性抗原CD20是一种经过充分验证的、治疗B细胞相关恶性肿瘤的有效靶点。然而，抗CD20单克隆抗体的有效性在一定程度上受到治疗耐受的限制(Beider,K.et al,Clin Cancer Res 2013,19(13),3495-507；Glennie,M.J.et al,Mol Immunol2007,44(16),3823-37)。此外，CD20内化性很差也限制了其作为ADC靶受体的应用(Dransfield,I.,Blood 2014；123(5):606-7)。

发明内容：

双特异性抗体是提高ADC功效或选择性的可行策略。目前主要存在两类双特异性ADC。第一类双特异性ADC靶向细胞表面受体和溶酶体目标受体，通过增加溶酶体转运，提高ADC的疗效。而另一类双特异性ADC通过同时结合两个细胞表面受体提高对细胞的选择性，其中有一个亚类，其可同时靶向非内化受体和快速内化受体，大大拓宽了可用于ADC的双特异性抗体的组合。但是这种同时靶向非内化受体和快速内化受体的双特异性ADC，其是否内化以及内化的强弱高度依赖于细胞表面的受体比率，极大限制了可以从双特异性ADC中受益的患者比例。

本发明在快速内化的抗CXCR4 CDR区引入突变，获得了一系列亲和力不同的抗CXCR4变体，并在此基础上构建了一系列亲和力可调的双特异性抗CXCR4×抗CD20变体及双特异性ADC。本发明的双特性抗CXCR4×抗CD20变体在细胞内的内化不依赖于细胞表面的受体比率，在Ramous细胞中，抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4×抗CD20变体均能有效内化至细胞，且抗CXCR4×抗CD20变体表现出比抗CXCR4×抗RSV变体或抗CD20高得多的内吞率；亲和力减弱的抗CXCR4大大增强了双特异性抗CXCR4×抗CD20变体ADC对Ramous(CXCR4+/CD20+)和Raji(CXCRR+/CD20+)细胞的毒性(与亲本双特异性ADC相比，在Ramous的毒性增强了近2倍，在Raji的毒性增强了3.6倍作用)；此外，亲和力减弱的双特异性抗CXCR4×抗CD20变体ADC能够实现对CXCR4+/CD20+B细胞的选择性杀伤(而非CXCR4+/CD20-细胞)。本发明以亲和力减弱的抗CXCR4单域抗体为基础，将抗肿瘤细胞表面抗原的抗体(例如抗CD20抗体)与之融合，由此获得的双特异性抗体或双特异性抗体ADC在靶细胞内的内化不依赖于靶细胞表面的受体比率，可显著提高抗肿瘤细胞表面抗原的抗体的内化，从而增强其有效性，同时大大提高了对靶细胞的选择性从而降低其不期望的毒性。由此，本发明为本领域构建有效靶向肿瘤、同时降低对正常细胞毒性的ADC开辟了道路。

具体来说，本发明提供了如下技术方案：

(1)结合CXCR4的单域抗体，所述单域抗体包含减弱其与CXCR亲和力的氨基酸置换。

(2)根据1所述的单域抗体，所述氨基酸置换位于CDR区。

(3)根据(2)所述的单域抗体，所述单域抗体在CDR区内的如下至少一个位置含有氨基酸置换：Y32(本申请均采用Kabat编号)、R53、R57、Y64、R111、Y115、Y117。

(4)根据(2)所述的单域抗体，所述氨基酸置换包含以下至少之一：Y32A、R53A、R57A、Y64A、R111A、Y115A、Y117A。

(5)根据(4)所述的单域抗体，其中所述单域抗体选自具有如SEQ ID NO.2至8所示序列的可变区。

(6)一种双特异性抗体，其包括：如(1)至(5)任一项所述的单域抗体的第一抗原结合结构域，以及特异性结合肿瘤细胞表面抗原的第二结合结构域。

(7)根据(6)所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域与第一Fc连接，所述第二抗原结合结构域与第二Fc连接。

(8)根据(7)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc包含减弱其自身形成同源二聚体的氨基酸置换，所述第二Fc包含减弱其自身形成同源二聚体的氨基酸置换。

(9)根据(8)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc进一步包含促进第一Fc和第二Fc形成异源二聚体的氨基酸置换。

(10)根据(8)或(9)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc或第二Fc含有不同的氨基酸置换。

(11)根据(7)至(10)中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

(12)根据(11)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc来自IgG1，且在如下至少一个位置含有氨基酸置换：T350、L351、F405、Y407、T366、K392、T394。

(12)根据(11)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc含有至少如下之一的氨基酸置换：T350V、L351Y、F405A、Y407V、T366L、K392L、T394W。

(13)根据(11)或(12)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和所述第二Fc选自：

(a)包含根据Kabat编号的T350V，L351Y，F405A，Y407V氨基酸置换的第一Fc，包含T350V、T366L、K392L、T394W氨基酸置换的第二Fc，或

(b)包含根据Kabat编号的T350V、T366L、K392L、T394W氨基酸置换的第一Fc，包含T350V，L351Y，F405A，Y407V氨基酸置换的第二Fc，或

(c)具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的第一Fc，具有如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的第二Fc，或

(d)具有如SEQ ID NO.11所示氨基酸序列的第一Fc，具有如SEQ ID NO.10所示氨基酸序列的第二Fc。

(14)根据(11)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc来自IgG4，且在如下至少一个位置含有氨基酸置换：E356、K439、R409。

(15)根据(14)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc含有至少如下之一的氨基酸置换：E356K、K439E、R409K。

(16)根据(14)所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc含有至少如下之一的氨基酸置换：E356K、R409K；K439E、R409K。

(27)根据(6)至(16)中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合结构域包含VH和VL。

(28)根据(27)所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合结构域的VH与第二Fc融合。

(29)根据(27)所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合结构域进一步包含重链恒定区CH1、轻链恒定区CL。

(30)根据(29)所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合结构域通过FabH与第二Fc融合。

(31)根据(6)至(30)中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞抗原选自：CD20、CD19、HER2、EGFR、GPC3、PSMA等。

(32)根据(31)所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表面抗原选自CD20。

(33)根据(32)所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合肿瘤细胞表面抗原CD20的第二抗原结合结构域具有分别包含如SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3，和分别包含如SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者具有如SEQ ID NO.12所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO.13所示氨基酸序列的轻链可变区。

(34)根据(33)所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：如SEQ ID NO:28所示的第一链、SEQ ID NO:29所示的第二链，SEQ ID NO.30所示的第三链。

(35)根据(31)所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表面抗原选自EGFR。

(36)根据(35)所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合肿瘤细胞表面抗原EGFR的第二抗原结合结构域具有分别包含如SEQ ID NO.38所示氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3，和分别包含如SEQ ID NO.39所示氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者具有如SEQ ID NO.38所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO.39所示氨基酸序列的轻链可变区。

(37)根据(36)所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：如SEQ ID NO:46所示的第一链、SEQ ID NO:47所示的第二链，SEQ ID NO.30所示的第三链。

(38)根据(31)所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表面抗原选自HER2。

(39)根据(38)所述的双特异性抗体，其中所述特异性结合肿瘤细胞表面抗原HER2的第二抗原结合结构域具有分别包含如SEQ ID NO.40所示氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3，和分别包含如SEQ ID NO.41所示氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者具有如SEQ ID NO.40所示氨基酸序列的重链可变区，和如SEQ ID NO.41所示氨基酸序列的轻链可变区。

(40)根据(39)所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体包含：如SEQ ID NO:48所示的第一链、SEQ ID NO:49所示的第二链，SEQ ID NO.30所示的第三链。

(41)多核苷酸，其编码根据(1)至(5)中任一项所述的单域抗体，或者编码根据(6)至(40)中任一项所述的双特异性抗体。

(42)载体，其包含根据(41)所述的多核苷酸。

(43)宿主细胞，其包含根据(41)所述的多核苷酸或根据(42)所述的载体。

(44)抗体药物偶联物，其包含根据(6)至(40)任一项所述的双特异性抗体和细胞毒性部分，所述细胞毒部分选自药物、毒素或放射性同位素，其中所述细胞毒部分与所述双特异性抗体缀合，进一步地，所述细胞毒部分与所述双特异性抗体的第一结合部分或/和第二结合部分缀合。

(45)如(44)所述的抗体药物偶联物，其中所述细胞毒部分选自单甲基阿里他汀E(MMAE)、美登素、DM1、DM4、卡奇霉素、吡咯并苯并二氮(PBD)、倍癌霉素(CAS NO.130288)、duostatin、duostatin-3、duostatin-5、雷查霉素(CC-1065)、阿里他汀、单甲基阿里他汀F(MMAF)、SN-38、多柔比星、多拉司他汀、基于IGN的毒素、α-鹅膏菌素或前述任何一种的类似物、衍生物或前药。

(46)药物组合物，其包括根据(1)至(5)中任一项所述的单域抗体或如(6)至(40)中任一项所述的双特异性抗体或如(44)至(45)中任一项所述的抗体药物偶联物，及药学上可接受的载体。

(47)根据(1)至(5)中任一项所述的单域抗体，或如(6)至(40)中任一项所述的双特异性抗体，或如(44)至(45)中任一项所述的抗体药物偶联物在用于制备治疗和预防疾病的药物中的应用。

(48)根据(47)所述的应用，其中所述疾病是肿瘤。

附图说明：

图1为抗CXCR4×抗CD20双特异性抗体及其对照抗体(抗CXCR4×抗RSV和抗CD20)的设计示意图。

图2为重组表达的双抗及其偶联物在非还原(无DTT)和还原条件(50mM DTT)下的SDS-PAGE。

图3为MMAE与硫醇抗体反应合成抗体药物偶联物的示意图。

图4为Ramos、Jurkat、Raji细胞上CXCR4和CD20的相对密度。

图5为用MMAE、抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CD20和相应ADC处理72小时后，Ramos(CD20+/CXCR4+)细胞、Raji(CD20+/CXCR4+)细胞、Jurkat(CD20-/CXCR4+)细胞的存活率百分比。

图6为抗CXCR4×抗CD20突变体(A)、抗CXCR4×抗RSV突变体(B)与Jurkat细胞的结合曲线。

图7为抗CXCR4×抗CD20突变体(A)、抗CXCR4×抗RSV突变体(B)与Raji细胞的结合曲线。

图8为Ramos细胞与Alexa Fluor 488标记的抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CD20、抗CXCR4(C)×抗CD20或抗CXCR4(C)×抗RSV孵育后，流式细胞术检测的细胞平均荧光强度。

图9为用内吞抑制剂处理与pHrodo red标记的抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV或抗CD20(50nM，1小时)孵育的Ramous细胞后，细胞表面相对荧光强度(无内吞抑制剂处理的细胞表面荧光强度设定为100％。

图10为用不同抗体处理后被内化的CD20的WB检测。

图11为用不同ADC处理后，Jurkat(CD20-/CXCR4+)细胞、Ramos(CD20+/CXCR4+)细胞或或Raji(CD20+/CXCR4+)细胞的存活率百分比。

图12用抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE处理的Jurkat/Ramos共培养物中Jurkat(CD20-/CXCR4+)细胞和(CD20+/CXCR4+)Ramos细胞数目。

图13为用不同浓度的抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE处理96小时的OCI-LY8细胞的存活率百分比。

图14为用不同浓度的抗CXCR4×抗CD20-MMAE、抗CXCR4×抗RSV-MMAE、抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE处理72小时的健康T细胞的存活率百分比。

图15为治疗期间和治疗后的肿瘤生长曲线(平均值±标准差)，其中**p≤0.01,***p≤0.001。

图16A为处死小鼠后各治疗组研究结束时各组肿瘤重量，其中**p≤0.01,***p≤0.001；(16B)治疗期间和治疗后各治疗组小鼠的体重。

实施例

实验材料和方法

1，实验材料

除非另有说明，所有化学品均从常见的商业来源购买并按原样使用。Ramos、Raji和Jurkat细胞均自中国科学院典型培养物保藏中心(中国上海)，并培养于补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中。pFuse-hIgG1e3-Fc2购自InvivoGen(San Diego,CA)。MMAE(maleimidocaproyl-monomethyl auristatin E)购自Med Chem Express。BALB/c裸鼠购自华富康(中国北京)。

2，抗CD20表达载体的克隆

编码利妥昔单抗重链和轻链Fab区的DNA由IDT(Coralville,Iowa)合成。PCR扩增利妥昔单抗轻链(VL-CL)并克隆至无hIgG1 Fc的pFuse载体中。PCR扩增利妥昔Fab重链(VH-CH1)，并克隆至pFuse-hIgG1-Fc-Knob(Fc含有以下突变：T350V，L351Y，F405A，Y407V)载体中。抗CD20第三条链的表达载体为pFuse-hIgG1-Fc-Hole(Fc含有以下突变：T350V、T366L、K392L、T394W)。所构建的表达质粒均通过DNA测序确认。

3，抗CXCR4×抗CD20融合蛋白和抗CXCR4×抗CD20突变体的克隆

抗CXCR4×抗CD20的利妥昔单抗重链和轻链部分与抗CD20相同。编码抗CXCR4纳米抗体的DNA由金唯智合成，并克隆至pFuse-hIgG1-Fc-Hole(Fc具有以下突变：T350V、T366L、K392L、T394W)载体中。通过定点突变在抗CXCR4纳米抗体中分别引入下述突变：Y32A、R53A、R57A、Y64A、R111A、Y115A、Y117A，并依次命名为抗CXCR4(A)～抗CXCR4(G)。利用前述抗CXCR4突变体构建抗CXCR4×抗CD20抗体突变体，并依次命名为抗CXCR4(A)×抗CD20～抗CXCR4(G)×抗CD20，所有构建的质粒均通过DNA测序确认。

4，抗CXCR4×抗RSV抗体和抗CXCR4×抗RSV突变体的克隆

编码Synagis轻链和Synagis重链Fab区的DNA由IDT,Inc.(Coralville,Iowa)合成。PCR扩增Synagis Fab重链(VH-CH1)并克隆至载体pFuse-hIgG1-Fc-Knob(Fc具有以下突变：T350V、L351Y、F405A、Y407V)。PCR扩增Synagis轻链(VL-CL)并克隆至无hIgG1 Fc片段的pFuse载体中。抗CXCR4抗体的第三条链与抗CXCR4×抗CD20融合蛋白的第三条链相同。利用前述构建的抗CXCR4突变体构建抗CXCR4×抗RSV抗体突变体，并依次命名为抗CXCR4(A)×抗RSV～抗CXCR4(A)×抗CD20。所有构建的质粒均通过DNA测序确认。

5，抗体的表达和纯化

将含有3×10E7个细胞的28mL FreeStyle HEK 293细胞接种至125mL摇瓶。将编码轻链、重链以及Fc-Hole的质粒用1mL Opti-MEM培养基稀释后，加入到含有60μL 293fectin(Invitrogen,Inc)的1mL Opti-MEM中室温孵育30分钟，将质粒与293fectin的混合物添加到细胞悬浮液中，于37℃，5％ CO2，125rpm培养细胞。分别于转染后48小时和96小时收集细胞上清，Protein A和MonoS离子交换层析纯化融合蛋白，SDS-PAGE、MS(质谱)和凝胶排阻色谱分析纯化的蛋白质。

6，抗体偶联物的制备及纯化

偶联前，将抗体通过Amicon过滤器(EMD Millipore)将缓冲液换为含1mM-EDTA的PBS缓冲液(pH 7.4)中(蛋白质终浓度为18μM)。取2.2μL SATP储备溶液(25mM,DMSO)添加到抗体溶液中(SATP终浓度为272μM)于室温下孵育2小时，随后通过Amicon过滤器纯化。添加1/10体积的0.5M盐酸羟胺(含50mM磷酸钠、25mM EDTA，pH 7.5)将乙酰化-SH基团去乙酰化，室温反应1小时，将巯基修饰的抗体与未反应的盐酸羟胺分离。MMAE通过马来酰亚胺-硫醇反应与硫醇化抗体偶联。抗体药物偶联物通过Amicon过滤器纯化，并通过ESI-Q-TOF高分辨率质谱(安捷伦)评估药物抗体比(DAR)

7，CXCR4⁺/CD20^-Jurkat细胞和CXCR4⁺/CD20⁺Raji细胞的结合测定

CXCR4⁺/CD20^-Jurkat细胞和CXCR4⁺/CD20⁺Raji细胞于含有10％FBS和1％ Pen/Strep的RPMI 1640中培养。离心收集CXCR4+/CD20-Jurkat细胞和CXCR4+/CD20+Raji细胞，PBS洗涤后，PBS/5％ BSA(含有5％BSA的PBS)室温封闭1小时，将细胞以5×10⁵/100μL的密度重新悬浮于PBS/5％ BSA中，加入不同的抗体于4℃孵育1小时。PBS/5％ BSA洗涤3次后，加入goat anti-human IgG-Alexa Flour 488抗体(A-11013，Invitrogen)(溶于PBS/5％BSA)，于4℃孵育1小时，BD Fortessa流式细胞仪检测和分析荧光信号。

8，抗体结合CXCR4+/CD20+Ramos细胞的共聚焦表征。

CXCR4+/CD20+Ramos细胞于补充有10％ FBS和1％ Pen/Strep的RPMI 1640中培养。将2×10E4个Ramos细胞接种于聚赖氨酸包被的共聚焦培养皿中孵育过夜，待细胞贴附于培养皿底部后，加入50nM Alexa Fluor488(A20000,Invitrogen)标记的抗体于37℃孵育1.5小时，PBS洗去未结合的抗体，于Zeiss LSM780上获取共焦图像。

9，通过荧光显微镜表征抗体溶酶体转运

将2×10E4个Ramos细胞接种于平底96孔板中培养过夜，加入50nM pHrodo Red(P36600,Invitrogen)标记的抗体于37℃,5％CO2中孵育24小时，奥林巴斯荧光显微镜观察荧光图像。

10，Western Blot检测内化的CD20

5×10⁴个Ramos细胞用预冷的PBS洗涤3次，加入0.5mg/mL EZ-Link^TMSulfo-NHS-SS-Biotin(A39258，Thermo)于4℃孵育30分钟，含100mM甘氨酸的PBS洗涤细胞3次终止反应。将细胞于37℃、5％ CO2下与50nM抗体孵育2小时。4℃孵育10分钟终止生物素化CD20的内吞，随后将细胞与含有20mM DTT、100mM NaCl的50mM Tris-HCl(pH＝8.7)于4℃孵育20分钟以去除未内化的生物素。PBS洗涤细胞3次，RIPA缓冲液裂解后，4℃，16,000x g离心10分钟收集细胞上清。Pierce BCA Protein Assay Kit测试总蛋白质浓度。将等量的蛋白质与NeutrAvidin Agrose Resins(29202,Thermo)于4℃轻轻旋转孵育2小时后，将Agroseresin重悬于1×SDS-PAGE上样缓冲液中，进行WB检测。对于WB分析，使用rabbit anti-human CD20(ab64088，Abcam)、goat anti-rabbit IgG HRP(CW0103S，CWBio)检测内化的CD20。化学发光印迹图像由ImageQuant LAS 4000系统获取。

11，抗体内吞率的检测

将1×10⁵Ramos细胞接种于平底96孔板中，通过用50nM Alexa Fluor488(A20000,Invitrogen)标记的抗体处理细胞2小时、4小时、6小时、8小时。在淬灭非内化AlexaFluor488标记的抗体的荧光后，BD Fortessa流式细胞仪检测和分析内化AlexaFluor488488标记的抗体的荧光信号。

12，抗体的内吞途径

1×105Ramos细胞接种于平底96孔板，用内化抑制剂(50μM MβCD、10μg/mL氯丙嗪、80μM Dynasore或400μM阿米洛利)处理30分钟后，加入50nM pHrodo Red标记的抗体于37℃孵育1小时，使用BD Fortessa流式细胞仪检测和分析内化pHrodo Red抗体的荧光信号。

13，体外细胞毒性试验

Jurkat、Ramos、Raji细胞于含有10％ FBS、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(Cellgro)中培养。检测前一天晚上，将10E4个细胞接种于平底96孔板中(90μL/孔)于37℃、5％ CO2下培养。次日，将抗体和ADC样品过滤除菌、梯度稀释后加入上述孔中(10μL/孔)于37℃，5％ CO2培养72小时(板边缘填充200μL培养基以防止蒸发)。每孔加入0.1％刃天青钠盐(10μL/孔)，孵育3h后酶标仪(Infinite 200,Tecan)检测荧光信号，并用Graphpad Prism处理和绘制数据。以仅用PBS处理的细胞(作为阴性对照)的存活率为100％。

14，Ramos/Jurkat共培养物中的体外细胞毒性测定

Jurkat和Ramos细胞在补充有10％ FBS、100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基(Cellgro)中培养。在测定之前，根据厂家说明书，分别用calcein-AM(65-0853-39，Invitrogen)和Celltracker Red CMTPX(C34552，Invitrogen)对Ramos细胞和Jurkat细胞染色。染色后，PBS洗涤细胞3次去除游离染料，计数细胞，并按实验所需的比例混合。将1.5×10E4 Ramos/Jurkat混合细胞接种至U型底96孔板中(90μL/孔)，往每个孔中加入10μL稀释的ADC，于37℃，5％ CO2下孵育72小时，BD Fortessa流式细胞仪(带有高通量采样器(HTS)分析Ramos和Jurkat细胞的细胞数。

15，体内肿瘤异种移植模型

5-6周龄BALB/c裸鼠皮下接种5×10E6个Ramos细胞，用数显卡尺测量肿瘤体积＝0.5×长×宽2(mm3)。当肿瘤达到约100mm3时，将小鼠分为6组：18mg/kg抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、9mg/kg抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、18mg/kg抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE，18mg/kg抗CD20-MMAE，30mg/kg CA-C抗体，PBS。在第一天和第五天给小鼠注射两次样品。每两天监测肿瘤状态和体重。

实验结果：

1，双特异性抗体的构建、表达和纯化

我们采用“knobs-into-holes”技术构建了不对称双特异性抗体抗CXCR4×抗CD20。将CXCR4纳米抗体238D4通过具有14个氨基酸的连接肽(GSTSGSGKSSEGKG)与人IgG1Fc突变体(T350V、T366L、K392L、T394W，命名为Fc-hole)的N端融合，获得238D4-Fc(hole)(图1)。在利妥昔单抗重链中引入T350V、L351Y、F405A、Y407V(命名为Fc-knob)突变以与238D4-Fc(hole)配对，从而产生二价抗CXCR4×抗CD20双特异性抗体。在palivizumab(一种不与人/小鼠抗原结合的对照抗体)的Fc中引入了类似的突变(命名为Fc-knob)，将palivizumabFc(knob)与238D4-Fc(hole)配对形成CXCR4单特异性抗体对照(命名为抗CXCR4×抗RSV)。具有Fc-knob突变的利妥昔单抗与Fc-hole配对以构建另一个单特异性对照(命名为抗CD20)。

本申请的序列如下：

抗CXCR4(238D4)(SEQ ID NO.1)氨基酸序列：

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(A)(SEQ ID NO.2)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNAAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(B)(SEQ ID NO.3)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITASGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(C)(SEQ ID NO.4)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVASGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(D)(SEQ ID NO.5)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIAGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(E)(SEQ ID NO.6)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALARFEYDYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(F)(SEQ ID NO.7)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEADYSGQGTQVTVSS

抗CXCR4(G)(SEQ ID NO.8)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDASGQGTQVTVSS

抗CXCR4(238D4)(SEQ ID NO.26)核苷酸序列

GAAGTTCAGCTGATGGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGGCTGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTCGTACCTTCAACAACTACGCTATGGGTTGGTTCCGTCGTGCTCCGAAAGGTGAACGTGAATTCGTTGCTGCTATCACCCGTTCTGGTGTTCGTTCTGGTGTTTCTGCTATCTACGGTGACTCTGTTAAAGACCGTTTCACCATCTCTCGTGACAACGCTAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCTGTTTACACCTGCGCTGCTTCTGCTATCGGTTCTGGTGCGCTCCGTAGGTTCGAATACGACTACTCTGGTCAGGGTACTCAGGTTACCGTAAGCTCT

Fc-knob(SEQ ID NO.10)氨基酸序列

TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Fc-hole(SEQ ID NO.11)氨基酸序列：

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CD20(rituximab)VH(SEQ ID NO.12)氨基酸序列：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA

抗CD20(rituximab)VL(SEQ ID NO.13)氨基酸序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEI

抗RSV VH(SEQ ID NO.14)氨基酸序列：

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSS

抗RSV VL(SEQ ID NO.15)氨基酸序列：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEI

抗CD20 chain-1(SEQ ID NO.16)氨基酸序列：

QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗CD20 chain-2(SEQ ID NO.17)氨基酸序列：

QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CD20 chain-3(SEQ ID NO.18)氨基酸序列

TCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Fc-knob(SEQ ID NO.19)核苷酸序列

ACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGCTGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACCTGACCTGGCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

Fc-hole(SEQ ID NO.20)核苷酸序列

ACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGTACCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCGCCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CD20 VH(SEQ ID NO.21)核苷酸序列

CAGGTGCAGCTCCAGCAGCCGGGAGCAGAATTGGTTAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAATGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTATAACATGCATTGGGTAAAACAGACCCCCGGCAGAGGTCTCGAGTGGATCGGAGCGATTTATCCGGGCAATGGAGACACTTCCTATAATCAGAAATTTAAGGGCAAGGCCACTCTCACAGCCGACAAGTCTTCATCCACCGCTTATATGCAGCTGAGCTCCTTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTTTACTATTGCGCACGAAGCACGTACTACGGGGGAGATTGGTACTTTAACGTGTGGGGGGCCGGAACCACCGTGACTGTGTCTGCT

抗CD20 VL(SEQ ID NO.22)核苷酸序列

CAGATTGTGTTGTCTCAGTCCCCCGCAATTCTCAGTGCGTCCCCCGGCGAAAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCTTCCTCCTCAGTGAGTTATATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCAAGCCCGAAGCCGTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGAGGTTCTCTGGTTCTGGCAGCGGGACCAGTTACTCACTCACCATTTCCCGGGTTGAGGCCGAAGATGCCGCTACTTATTATTGCCAACAGTGGACCTCCAATCCGCCAACATTTGGGGGAGGGACTAAACTGGAGATT

抗RSV VH(SEQ ID NO.23)核苷酸序列

CAGGTGACCCTGCGCGAGTCCGGCCCTGCACTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTGTCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGATCCGGCAGCCTCCCGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCTGACATCTGGTGGGACGACAAGAAGGACTACAACCCCTCCCTGAAGTCCCGCCTGACCATCTCCAAGGACACCTCCAAGAACCAGGTGGTGCTGAAGGTGACCAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCGCCCGCTCAATGATTACCAACTGGTACTTCGACGTGTGGGGaGCCGGTACCACCGTGACCGTGTCTTCC

抗RSV VL(SEQ ID NO.24)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGTGCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCTTCCAGGGCTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATC

抗CD20 chain-1(SEQ ID NO.25)核苷酸序列

CAGATTGTGTTGTCTCAGTCCCCCGCAATTCTCAGTGCGTCCCCCGGCGAAAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCTTCCTCCTCAGTGAGTTATATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCAGGATCAAGCCCGAAGCCGTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGAGGTTCTCTGGTTCTGGCAGCGGGACCAGTTACTCACTCACCATTTCCCGGGTTGAGGCCGAAGATGCCGCTACTTATTATTGCCAACAGTGGACCTCCAATCCGCCAACATTTGGGGGAGGGACTAAACTGGAGATTAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

抗CD20 chain-2(SEQ ID NO.26)核苷酸序列

CAGGTGCAGCTCCAGCAGCCGGGAGCAGAATTGGTTAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAAATGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCTCCTATAACATGCATTGGGTAAAACAGACCCCCGGCAGAGGTCTCGAGTGGATCGGAGCGATTTATCCGGGCAATGGAGACACTTCCTATAATCAGAAATTTAAGGGCAAGGCCACTCTCACAGCCGACAAGTCTTCATCCACCGCTTATATGCAGCTGAGCTCCTTGACCTCTGAGGACAGCGCCGTTTACTATTGCGCACGAAGCACGTACTACGGGGGAGATTGGTACTTTAACGTGTGGGGGGCCGGAACCACCGTGACTGTGTCTGCTGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGTACCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCGCCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CD20 chain-3(SEQ ID NO.27)核苷酸序列

抗CXCR4×抗CD20 chaini-1(SEQ ID NO.28)氨基酸序列

抗CXCR4×抗CD20 chain-2(SEQ ID NO.29)氨基酸序列

抗CXCR4×抗CD20 chain-3(SEQ ID NO.30)氨基酸序列

EVQLMESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAPKGEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSSGSTSGSGKSSEGKGTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVLPPSRDELTKNQVSLLCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYLTWPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CXCR4×抗RSV chain-1(SEQ ID NO.31)氨基酸序列

QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMSVGWIRQPPGKALEWLADIWWDDKKDYNPSLKSRLTISKDTSKNQVVLKVTNMDPADTATYYCARSMITNWYFDVWGAGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CXCR4×抗RSV chain-2(SEQ ID NO.32)氨基酸序列

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCKCQLSVGYMHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗CXCR4×抗CD20 chaini-1(SEQ ID NO.33)核苷酸序列

抗CXCR4×抗CD20 chain-2(SEQ ID NO.34)核苷酸序列

抗CXCR4×抗CD20 chain-3(SEQ ID NO.35)核苷酸序列

GAAGTTCAGCTGATGGAATCTGGTGGTGGTCTGGTTCAGGCTGGTGGTTCTCTGCGTCTGTCTTGCGCTGCTTCTGGTCGTACCTTCAACAACTACGCTATGGGTTGGTTCCGTCGTGCTCCGAAAGGTGAACGTGAATTCGTTGCTGCTATCACCCGTTCTGGTGTTCGTTCTGGTGTTTCTGCTATCTACGGTGACTCTGTTAAAGACCGTTTCACCATCTCTCGTGACAACGCTAAAAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCTCTGAAACCGGAAGACACCGCTGTTTACACCTGCGCTGCTTCTGCTATCGGTTCTGGTGCGCTCCGTAGGTTCGAATACGACTACTCTGGTCAGGGTACTCAGGTTACCGTAAGCTCTGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGAGCAGCGAGGGCAAGGGCACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGCTGCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGCTGTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACCTGACCTGGCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CXCR4×抗RSV chain-1(SEQ ID NO.36)核苷酸序列

CAGGTGACCCTGCGCGAGTCCGGCCCtGCaCTGGTGAAGCCCACCCAGACCCTGACCCTGACCTGCACCTTCTCCGGCTTCTCCCTGTCCACCTCCGGCATGTCCGTGGGCTGGATCCGgCAGCCtCCCGGCAAGGCCCTGGAGTGGCTGGCtGACATCTGGTGGGACGACAAGAAGGACTACAACCCCTCCCTGAAGTCCCGCCTGACCATCTCCAAGGACACCTCCAAGAACCAGGTGGTGCTGAAGGTGACCAACATGGACCCCGCCGACACCGCCACCTACTACTGCGCCCGCTCAATGATTACCAACTGGTACTTCGACGTGTGGGGaGCCGGtACCACCGTGACCGTGTCtTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGTACCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCGCCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CXCR4×抗RSV chain-2(SEQ ID NO.37)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAAGTGCCAGCTGTCCGTGGGCTACATGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCCGGCGTGCCCTCCCGCTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGACCATCTCCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCTTCCAGGGCTCCGGCTACCCCTTCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

aEGFR VH(SEQ ID NO.38)氨基酸序列：

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSS

aEGFR VL(SEQ ID NO.39)氨基酸序列：

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEI

aHER2 VH(SEQ ID NO.40)氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS

aHER2 VL(SEQ ID NO.41)氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKLEI

aEGFR VH(SEQ ID NO.42)核苷酸序列

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCGACTACTACTGGACCTGGATCCGCCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACATCTACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCAGCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCATCTACTACTGCGTGCGCGACCGCGTGACCGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACTGTGTCTAGC

aEGFR VL(SEQ ID NO.43)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGAGACCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCACTTCGACCACCTGCCCCTGGCCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATC

aHER2 VH(SEQ ID NO.44)核苷酸序列

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCAATATTAAGGACACTTACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCACGTATTTATCCTACCAATGGTTACACACGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCGCAGACACTTCCAAGAACACGGCGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTTCGAGATGGGGCGGTGACGGCTTCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA

aHER2 VL(SEQ ID NO.45)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGATGTGAATACCGCGGTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTTCTTGTATAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTAGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCATTACACTACCCCTCCGACGTTCGGCCAAGGTACCAAGGTGGAGATC

抗CXCR4×aEGFR chain-1(SEQ ID NO.46)氨基酸序列

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSSGDYYWTWIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CXCR4×aEGFR chain-2(SEQ ID NO.47)氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗CXCR4×aHER2 chain-1(SEQ ID NO.48)氨基酸序列

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYVYPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFALVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗CXCR4×aHER2 chain-2(SEQ ID NO.49)氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

抗CXCR4×aEGFR chain-1(SEQ ID NO.50)核苷酸序列

CAGGTGCAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCAGCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCGTGAGCAGCGGCGACTACTACTGGACCTGGATCCGCCAGAGCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCCACATCTACTACAGCGGCAACACCAACTACAACCCCAGCCTGAAGAGCCGCCTGACCATCAGCATCGACACCAGCAAGACCCAGTTCAGCCTGAAGCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCATCTACTACTGCGTGCGCGACCGCGTGACCGGCGCCTTCGACATCTGGGGCCAGGGCACCATGGTGACTGTGTCTAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGTACCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCGCCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CXCR4×aEGFR chain-2(SEQ ID NO.51)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCCAGGCCAGCCAGGACATCAGCAACTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGACGCCAGCAACCTGGAGACCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCACTTCGACCACCTGCCCCTGGCCTTCGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

抗CXCR4×aHER2 chain-1(SEQ ID NO.52)核苷酸序列

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGGTTCAATATTAAGGACACTTACATCCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCACGTATTTATCCTACCAATGGTTACACACGCTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCGCAGACACTTCCAAGAACACGGCGTATCTTCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTTCGAGATGGGGCGGTGACGGCTTCTATGCCATGGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCCCTGGCCCCCAGCAGCAAGAGCACCAGCGGCGGCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCCGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACCCACACCTGCCCCCCCTGCCCCGCCCCCGAGCTGCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGCACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAGGACCCCGAGGTGAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGCGAGGAGCAGTACAACAGCACCTACCGCGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAACAAGGCCCTGCCCGCCCCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCCCAGGTGTACGTGTACCCCCCCAGCCGCGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCGCCCTGGTGAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCCGCTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCCCGGCAAG

抗CXCR4×aHER2 chain-2(SEQ ID NO.53)核苷酸序列

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGGATGTGAATACCGCGGTCGCATGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTGCATCCTTCTTGTATAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTAGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGCATTACACTACCCCTCCGACGTTCGGCCAAGGTACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGTCCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

通过瞬时转染在Free-Style HEK293细胞中表达前述的双抗或对照抗体，ProteinA纯化后抗体产率为～8mg/L。随后我们进行离子交换层析(MonoS column)分析其纯度：对于前述三种抗体，均只观察到1个主峰。SDS-PAGE并未观察到Fc错配产物(图2)，在非还原条件下，抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4×抗RSV的表观分子量约为150kDa，由于糖基化而高于理论分子量(120kDa)。同样，抗CD20的表观分子量约为120kDa，也高于其理论分子量(97kDa)；在还原条件下，可见三种不同分子量的链。由于糖基化作用，抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV和抗CD20的重链在约55kDa处迁移，高于49kDa的理论分子量。这三种抗体的轻链迁移约25kDa，与23kDa的预期分子量一致。抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4×抗RSV中的238D4-Fc(hole)链在约45kDa处迁移，与40kDa的预期分子量一致。抗CD20中的第三条链是Fc-hole，其表观分子量约为30kDa，与其理论分子量25kDa一致。抗体用PNGase去糖基化后进行的质谱检测也进一步验证了分子量(未显示)。

2，双特异性抗体偶联物的构建。

为了探索抗CXCR4×抗CD20作为靶向肿瘤ADC的抗体的潜力，我们构建了基于抗CXCR4×抗CD20、微管蛋白抑制剂单甲基auristatin E(MMAE)作为细胞毒药物的ADC。我们选择稳定的、不可切割的亲水性接头，以确保能将完整的ADC递送至肿瘤，随后在溶酶体中迅速释放MMAE。MMAE通过两步法偶联至抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV和抗CD20上的赖氨酸残基(图3)。

SDS-PAGE和QTOF质谱用于确认ADC是否已成功偶联。非特异性偶联后，异质分子量增加，与未偶联抗体相比，SDS-PAGE显示出略微加宽的条带(图2B)。抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CD20和其对应的ADC(抗CXCR4×抗CD20-MMAE、抗CXCR4×抗RSV-MMAE和抗CD20-MMAE)用PNGase去糖基化并用二硫苏糖醇(DTT)还原后进行QTOF质谱分析：除了抗CXCR4×抗CD20的重链未修饰(48997Da)外，还观察到了对应于1-6个MMAE修饰的额外峰(结果未显示)。类似地，抗CXCR4×抗CD20-MMAE显示出对应于1-3次MMAE修饰的额外轻链峰。根据质谱中峰的比率，计算出抗CXCR4×抗CD20-MMAE的平均药物抗体比(DAR)约为5.8。抗CXCR4×抗RSV-MMAE和抗CD20-MMAE的质谱表现出相似的峰分布(结果未显示)。抗CXCR4×抗RSV-MMAE和抗CD20-MMAE的DAR分别为5.3和4.8。

接下来我们使用具有不同受体表达水平(图4)的三种细胞系，即Ramos(CD20⁺/CXCR4⁺)、Raji(CD20⁺/CXCR4⁺)和Jurkat(CD20^-/CXCR4⁺)体外评估ADC的细胞毒性。将细胞用抗CXCR4×抗CD20-MMAE、抗CXCR4×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE、及其未偶联的抗体或MMAE处理72小时后，用Alamar-Blue测定法测量细胞活力。与未偶联的抗体(抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV和抗CD20)相比，ADC(抗CXCR4×抗CD20-MMAE、抗CXCR4×抗RSV-MMAE和抗CD20-MMAE)对CD20+/CXCR4+Ramos细胞明显具有更高的细胞毒性(图5)，且抗CXCR4×抗CD20-MMAE(IC50＝0.75±1.04nM)显示出比抗CXCR4×抗RSV-MMAE(IC50＝2.75±1.11nM)和抗CD20-MMAE(IC50＝25.30±1.04nM)更高的细胞毒性，表明双特异性抗CXCR4×抗CD20-MMAE在CD20+/CXCR4+Ramos细胞上比单特异性对照更有效。在CD20+/CXCR4+Raji细胞上也观察到类似的结果(图5)。相比之下，抗CXCR4×抗CD20-MMAE和抗CXCR4×抗RSV-MMAE对CD20-/CXCR4+Jurkat细胞显示出等效的细胞毒性(抗CXCR4×抗CD20-MMAE的IC50＝4.36±1.04nM，抗CXCR4-RSV-MMAE的IC50＝5.22±1.04nM)，提示抗CXCR4×抗CD20-MMAE对Ramos和Raji细胞上的毒性增加是由于与Ramos或Raji细胞上的CD20的额外结合。总之，这些数据表明双特异性抗CXCR4×抗CD20-MMAE以依赖于CXCR4和CD20的方式能更有效地杀死CD20+/CXCR4+细胞。

3，亲和力减弱的CXCR4×CD20双特异性抗体变体的产生和表征

为了进一步优化双特异性ADC对CXCR4+/CD20+阳性细胞的选择性(与CXCR4单特异性ADC相比)，我们构建了一系列亲和力减弱的CXCR4抗体突变体(抗CXCR4(A)∽抗CXCR4(G))，用这些CXCR4抗体突变体构建了抗CXCR4×抗CD20变体和抗CXCR4×抗RSV变体，并分别命名为抗CXCR4(A)×抗CD20∽抗CXCR4(G)×抗CD20，以及抗CXCR4(A)×抗RSV∽抗CXCR4(G)×抗RSV。流式细胞术评估这些双特异性抗体突变体对Jurkat细胞(CD20-/CXCR4+)的结合亲和力。与亲本双特异性抗体相比，抗CXCR4×抗CD20突变体与Jurkat的亲和力下降了约0.7-238倍，抗CXCR4×抗RSV突变体下降了0.4-200倍(图6)，提示亲和力下降由抗CXCR4纳米抗体的突变与CXCR4的结合力减弱导致。其中，含R57A突变的抗CXCR4(C)×抗RSV和抗CXCR4(C)×抗CD20突变体与CXCR4的亲和力最低。此外，携带相同突变的抗CXCR4×抗CD20突变体与抗CXCR4×抗RSV突变体对CXCR4具有相似的亲和力，表明抗CD20/抗RSV的Fab臂不影响双抗对CXCR4的结合亲和力。

与之相反的是，抗CXCR4×抗CD20突变体和抗CXCR4×抗RSV突变体在CD20+/CXCR4+Raji细胞上表现不同(图7)。抗CXCR4×抗RSV突变体与Raji细胞的亲和力比亲本抗CXCR4×抗RSV下降了0.8-160倍，与我们在Jurkat细胞上观察到的相似，而抗CXCR4×抗CD20突变体与Raji的亲和力却与亲本抗CXCR4×抗CD20类似(图7)。含R57A突变的双特异性抗体突变体和抗CXCR4单特异性抗体突变体与Raji的亲和力相差最大，因此，我们选择抗CXCR4(C)×抗CD20和抗CXCR4(C)×抗RSV进行进一步研究。将抗CXCR4×抗CD20,抗CXCR4×抗RSV,抗CXCR4(C)×抗CD20,抗CXCR4(C)×抗RSV用Alexa Fluor488标记后，与Ramous细胞(CD20+/CXCR4+)孵育1.5h，于共聚焦显微镜下观察发现：抗CXCR4(C)×抗RSV和抗CD20处理组仅见微弱的细胞表面定位，而亲和力减弱的抗CXCR4(C)×抗CD20处理组的细胞表面则有非常强的荧光，提示Ramous细胞表面有更多的抗CXCR4×抗CD20抗体(与对照抗体抗CD20和抗CXCR4×抗RSV相比)。

4，不同抗体的内吞作用和内吞途径

我们将抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV或抗CD20用Alexa Fluor 488标记后，与Ramous细胞(CD20+/CXCR4+)孵育不同的时间，流式细胞术检测细胞表面的荧光。结果显示：只结合CXCR4的抗CXCR4×抗RSV的内吞率就较高，表明其不借助CD20即可发挥较好的内吞作用。抗CXCR4×抗CD20与抗CXCR4×抗RSV表面荧光未见显著差异(图8)，而抗CXCR4(C)×抗CD20表现出比抗CXCR4(C)×抗RSV或抗CD20强得多的表面荧光。接着，我们用pH敏感的荧光基团pHrodo Red标记抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV、抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV和抗CD20后，与细胞孵育24小时后发现：Ramos细胞摄入的抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV或抗CXCR4(C)×抗CD20明显增加，而摄入的抗CXCR4(C)×抗RSV或抗CD20与孵育前相比，并无太大变化。这些结果表明，双特异性抗CXCR4(C)×抗CD20突变体比其单特异性对照(抗CXCR4(C)×抗RSV突变体或抗CD20)能介导更有效的细胞摄取。

为了研究双特异性抗体的内吞途径，在Ramos细胞与pHrodo标记的抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV、抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV和抗CD20抗体孵育之前以及孵育过程中用不同的内吞抑制剂(50μM甲基-β-环糊精(MβCD)、10μg/mL氯丙嗪、80μMdynasore或400μM阿米洛利)处理，通过比较有和没有内吞抑制剂的流式细胞术中的荧光信号变化，可以了解每种抗体所采取的内吞途径。如图9所示，dynasore处理的细胞摄取的抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV、抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4×抗RSV最少，氯丙嗪次之，，这一观察结果与先前关于CXCR4介导的内吞作用的报道(J Cell Biol 1997,139(3),651-664)一致。dynasore处理后的细胞，对抗CD20的内吞效率为PBS组的50％，表明dynasore一定程度上抑制了抗CD20的内吞作用这些结果表明CXCR4结合臂主要介导双特异性抗体的内吞作用。

5，细胞表面CD20可以被双特异性抗体拖入细胞中

为了研究内化差的CD20是否会被“拖入”细胞，我们用WB检测Ramous细胞与抗CXCR4×抗CD20、抗CXCR4×抗RSV、抗CXCR4(C)×抗CD20、抗CXCR4(C)×抗RSV、抗CD20孵育后内化的CD20。将细胞用sulfo-NHS-SS-biotin处理后与抗体孵育2小时，20mM DTT去除细胞表面残留的生物素，WB检测内化的CD20。我们观察到：与PBS处理的细胞相比，抗CXCR4(C)×抗RSV和抗CXCR4×抗RSV处理的细胞其内化的抗CD20并未增加。此外，抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4(C)×抗CD20组的CD20内化均明显增加(图10)，提示存在“拖拽”效应，这与先前关于利妥昔介导CD20内吞的报道(Beers,S.A.et al,Semin Hematol 2010,47(2),107-14)一致。这些观察结果表明抗CXCR4×抗CD20和抗CXCR4(C)×抗CD20至少部分以与CD20结合的方式被内化至细胞中。

6，CXCR4亲和力减弱的抗CXCR4(C)×抗CD20在体外表现出改善的选择性

为了探索亲和力减弱的双特异性ADC对细胞的选择性，我们将抗CXCR4(C)×抗CD20和抗CXCR4(C)×抗RSV与MMAE偶联。与抗CXCR4×抗CD20-MMAE和抗CXCR4×抗RSV-MMAE一样，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE和抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE对CD20-/CXCR4+Jurkat细胞具有类似的细胞毒性(图11)。在CD20+/CXCR4+Ramos和Raji细胞上，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE的IC50s分别为3.3±1.05nM和7.5±1.16nM，远低于抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE在Ramos和Raji的IC50(Ramous上的IC50s＝22.23±1.05nM,Raji上的IC50s＝84.75±1.16nM)，该毒性增强效应(Ramos上增强7倍，Raji上增强11倍)比抗CXCR4×抗CD20-MMAE相对于抗CXCR4×抗RSV-MMAE的毒性增强更为明显(抗CXCR4×抗CD20-MMAE对Ramous的毒性为抗CXCR4×抗RSV-MMAE的3.7倍；对Raji的毒性为抗CXCR4×抗RSV-MMAE的3.1倍)。

为了模拟癌细胞和健康细胞共存状态下对癌细胞的选择性杀伤，将Ramos/Jurkat共培养物(其中，Jurkat视为正常血液细胞，Ramous视为肿瘤细胞)与抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE或MMAE孵育。其中，抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE和MMAE均未表现出细胞选择性。与之不同的是，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE在CD20+/CXCR4+Ramos细胞上显示出比在CD20-/CXCR4+Jurkat细胞上更高的细胞毒性(图12)。抗CD20-MMAE对CD20+Ramous细胞无选择性杀伤，进一步证实了CD20的内化差。总之，这些结果表明亲和力减弱的抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE在CD20-/CXCR4+细胞存在的情况下可以选择性地杀死CD20+/CXCR4+癌细胞。

尽管利妥昔单抗是B细胞恶性肿瘤的重大突破，但约有一半的患者出现先天性和获得性耐药，导致对治疗无反应或原发病早期复发。相当大比例的利妥昔耐药是由于患者对抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或细胞凋亡不敏感而导致的，很少是由于CD20丢失或表达下调导致。我们将抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE或抗CD20-MMAE与利妥昔耐受细胞OCI-LY837一起孵育。96小时后发现，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE对OCI-LY8细胞的细胞毒性高于抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE、抗CD20-MMAE(图13)，表明抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE可能可以成为克服利妥昔单抗耐药性的策略。

为进一步研究抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE对健康T细胞的细胞毒性。我们用不同的ADCs处理T细胞72h，所有ADCs对T细胞没有明显的细胞毒性(图14)，这可能是由于我们构建的双特异性抗体为1+1架构。

7，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE的体内抗肿瘤功效

为了研究ADC在体内的分布和抗肿瘤功效，我们通过在BALB/c裸鼠皮下接种5×10⁶Ramos细胞建立了肿瘤异种移植模型用于功效研究。当皮下肿瘤平均体积达到100mm3(第14天)时，往小鼠静脉注射抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE(18mg/kg或9mg/kg)、抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE(18mg/kg)，抗CD20-MMAE(18mg/kg)或抗CXCR4(C)×抗CD20抗体(30mg/kg)。于第一次注射后4天(第19天)以相同方式进行第二次注射。治疗期间和治疗后每两天监测肿瘤大小和体重。抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE在9mg/kg和18mg/kg的剂量下均能显著抑制肿瘤生长，而单价抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE对肿瘤生长没有明显影响(图15)。抗CD20-MMAE以及抗CXCR4×抗CD20(30mg/kg)表现出中等的肿瘤抑制作用。研究结束时的肿瘤重量显示出类似的趋势(图16A)。H&E染色和TUNEL染色显示抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE治疗组的肿瘤组织被破坏，细胞凋亡增加，进一步支持我们观察到的结果(抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE对肿瘤生长的强烈抑制)。在所有组中均未检测与治疗相关的体重减轻(图16B)。总之，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE可有效地抑制肿瘤生长，且没有可观察到的系统毒性。

在本发明中，我们构建了一种双特异性抗体ADC，其靶向快速内化受体CXCR4和内化性差的受体CD20，实现了对CXCR4+/CD20+B细胞的选择性杀伤(而非CXCR4+/CD20-细胞)。通过减弱与CXCR4的亲和力，提高了双特异性ADC的细胞选择性。据报道，双特异性抗体是提高ADC功效或选择性的可行策略。目前主要存在两类双特异性ADC。第一类双特异性ADC靶向细胞表面受体和溶酶体目标受体，通过增加溶酶体转运，提高疗效。另一类双特异性ADC涉及同时结合两个细胞表面受体以提高选择性。在第二类中，有一个亚类，具有“引导效应器”特征，可同时靶向非内化受体和快速内化受体，但由于其选择性高度依赖于受体比率，限制了可以从双特异性ADC中受益的患者比例。在我们的研究中，我们测试了CXCR4/CD20比率从0.5到9.2之间的三种不同细胞系。在这些细胞系上，与单价抗CXCR4(C)×抗RSV-MMAE相比，抗CXCR4(C)×抗CD20-MMAE可以改善细胞毒性，并且未观察到明显的对受体比率的依赖。我们认为，由于CD20内化差以及抗CXCR4突变体对CXCR4的亲和力减弱，由单价结合引起的内化被最小化，进而使我们能够在更广泛的受体比率内实现高选择性。

CXCR4在肿瘤中的过度表达有助于肿瘤生长、侵袭、血管生成、转移、复发和治疗耐受。然而，健康组织中广泛的CXCR4表达在很大程度上限制了抗CXCR4尤其是抗CXCR4 ADC的治疗。我们的策略使得以依赖于细胞类型的方式调节抗CXCR4 ADC的细胞毒性成为可能。事实上，在我们的研究中没有在健康T细胞中检测到可观察到的细胞毒性。此外，我们希望通过改变bsAb中另一臂的靶标，可以将该系统扩展到其他过表达CXCR4的肿瘤类型。

总之，我们设计并构建了CXCR4×CD20双特异性ADC，其可优先杀死CXCR4+/CD20+B细胞(与CXCR4+/CD20-细胞相比)，并且可以通过减弱CXCR4结合臂的亲和力来提高选择性。该双特异性ADC在体外和体内均能有效诱导CD20+/CXCR4+癌细胞的根除，而未观察到健康T细胞的毒性。这些结果证明了构建有效靶向肿瘤、同时降低对正常细胞毒性的ADC的可能性，代表一种有前途的癌症治疗方法。此外，对利妥昔耐药的细胞对CXCR4×CD20双特异性ADC反应良好，表明该策略是克服利妥昔单抗耐药性的可能方法。毕竟，使用针对快速内化抗原和内化性差的抗原的双特异性ADC的策略可以扩展到其他受体对，进一步拓宽ADC可用靶点的选择范围。

Claims

1.结合CXCR4的单域抗体，所述单域抗体具有选自如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.8之一的氨基酸序列。

2.一种双特异性抗体，其包括

a)第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含结合CXCR4的修饰的单域抗体，其中该单域抗体与其亲本抗体相比具有降低的对CXCR4的结合亲和力；

b)第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域特异性结合肿瘤细胞表面抗原。

3.权利要求2所述的双特异性抗体，其中所述修饰的单域抗体包含相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个氨基酸置换、缺失、添加或插入的氨基酸序列，例如选自SEQ ID NOs:2-8的任一序列。

4.权利要求2或3所述的双特异性抗体，其中所述第一抗原结合结构域与第一Fc融合，所述第二抗原结合结构域与第二Fc融合。

5.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc与所述第二Fc不同，且所述第一Fc与所述第二Fc各自包含减弱其自身形成同源二聚体的氨基酸置换。

6.权利要求4所述的双特异性抗体，其中所述第一Fc和第二Fc具有如下的氨基酸置换：

a)第一Fc包含根据Kabat编号的T350V，L351Y，F405A，Y407V氨基酸置换，第二Fc包含T350V、T366L、K392L、T394W氨基酸置换；或

b)第一Fc包含根据Kabat编号的T350V、T366L、K392L、T394W氨基酸置换，第二Fc包含T350V，L351Y，F405A，Y407V氨基酸置换。

7.权利要求2-6中任一项所述的双特异性抗体，其中所述肿瘤细胞表面抗原选自：CD20、CD19、HER2、EGFR、GPC3、PSMA。

8.一种药物偶联物，其包含如权利要求2-7中任一项的双特异抗体和细胞毒部分，该细胞毒部分选自药物、毒素或放射性同位素，其中细胞毒部分与所述双特异性抗体的第一结合部分或/和第二结合部分缀合。

9.一种药物组合物，其包括如权利要求1所述的单域抗体或权利要求2-7中任一项所述的双特异性抗体或权利要求8所述的药物偶联物，及药学上可接受的载体。

10.如权利要求1所述的单域抗体、或权利要求2-7中任一项所述的双特异性抗体、或权利要求8所述的药物偶联物、或权利要求9所述的药物组合物在用于制备治疗和预防疾病的药物中的应用。