KR20240007939A - 항-p-카드헤린 항체를 포함하는 항체 콘쥬게이트 및 이의 용도 - Google Patents

항-p-카드헤린 항체를 포함하는 항체 콘쥬게이트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명내용은 항-P-카드헤린 항체-약물 콘쥬게이트(ADC) 및 이의 용도, ADC를 생산하는 방법, 뿐만 아니라 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 이들의 기능을 검증하는 방법을 제공한다.

Description

항-p-카드헤린 항체를 포함하는 항체 콘쥬게이트 및 이의 용도
본 출원은 2021년 5월 13일에 출원된 국제 출원 PCT/CN2021/093652의 우선권을 주장하며, 상기 특허문헌은 본원에 참조로서 포함된다.
본 출원은 일반적으로 항체 및 항체-약물 콘쥬게이트에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 출원은 P-카드헤린(cadherin)에 대한 항체-약물 콘쥬게이트, 이의 제조방법 및 항체-약물 콘쥬게이트의 용도에 관한 것이다.
카드헤린(cadherin) 계열 단백질은 시스(cis) 및/또는 트랜스(trans) 방식으로 각 세포 표면의 두 카드헤린 분자 사이의 동종친화성(homophilic) 상호작용을 통해 세포 간 접착을 매개하고 카드헤린-카테닌 복합체는 부착형 접합의 주요 구성 요소를 구성한다. 이들 복합체는 또한 세포 성장, 분화, 세포 운동성 및 생존에 영향을 주어 세포 운명 결정(cell fate decisions)을 안내하는 주요 조절 메커니즘을 나타낸다 (Cavallaro and Dejana, Adhesion molecule signaling: not always a sticky business. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011 Mar; 12 (3):189-97).
P-카드헤린 (태반(Placental)-카드헤린, 또는 카드헤린-3, 인간의 CDH3 유전자에 의해 인코딩됨)은 118 kDa 당단백질 전형적 카드헤린이다. P-카드헤린은 26개의 아미노산 긴 신호 서열 및 803개의 아미노산 프로펩타이드를 가진 829개의 아미노산 단백질이다. 성숙 단백질은 3개의 개별 도메인으로 108번에서 시작한다: 인접 세포 사이의 지퍼 같은 구조에서 함께 작용하는 측면 디머(dimmers)를 생성하는 데 필수적인 5개의 세포외 카드헤린 반복(548 aa); 단일 막횡단 영역 (23 aa); 카드헤린을 액틴 세포골격에 연결하는, 카테닌과 상호작용하는 세포내 도메인인 고도로 보존된 세포질 꼬리 (151 aa).
P-카드헤린은 생쥐의 태반에서 발현되고, 또한 인간 태반 조직 (낮은 수준) 및 여러 인간 태아 구조(fetal structures)에서도 발현된다. 성인에서는, 표피 기저층, 유방, 전립선, 중피(mesothelium), 난소, 모낭 및 각막 내피와 같이, 일반적으로 E-카드헤린과 공동 발현되는 특정 조직에서만 발현된다 (Imai et al., Identification of a novel tumor-associated antigen, cadherin 3/P-cadherin, as a possible target for immunotherapy of pancreatic, gastric, and colorectal cancers. Clin. Cancer Res. 2008, 14, 6487-6495). 인간 단백질 참조 데이터베이스(HPRD: 00227)에 표시된 주요 발현 부위는 자궁내막, 사구체, 모낭, 각질세포, 유방 근상피(mammary myoepithelium), 멜라닌세포, 난모세포, 정자, 태반, 전립선, 망막, 혈청 및 피부이다.
P-카드헤린은 유방암 및 기타 종양에서 과발현되는 것으로 나타났으며, 불량한 예후와 상관관계가 있을 수 있다. 또한, 대장암, 비소세포 폐암(NSCLC; non-small cell lung cancer), 위암, 췌장암과 같은 여러 암에서 높은 발현과 양성률을 보였다. TCGA 데이터베이스에서, P-카드헤린은 다음 종양에서 5배 이상의 높은 발현을 보여주었다: 담관(cholangio) (10.6배), 결장(colon) (134배 및 104배), 식도(esophageal) (34배), 폐(6.56배 및 11.8배), 위(8.02배 및 11.6배) 및 갑상선(20.3배). P-cadherin은 다양한 조직 상황에서 세포 침입, 세포 운동성, 줄기 세포 활동 및 전이 형성을 포함한 종양 촉진 효과를 중재할 수 있다. 정상 조직에서의 P-카드헤린 유전자 발현은 매우 낮으며, 난소 및 유선에서는 매우 약한 발현만을 나타낸다 (GTex 데이터베이스 및 문헌).
항체 기반 치료법은 다양한 암 치료에 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단일클론 항체에 더하여, 세포 독성제 또는 세포 증식 억제제의 국소 전달을 위한 항체-약물 콘쥬게이트의 용도는 정상 세포보다는 종양 세포에 약물 부분의 표적 전달을 가능하게 한다.
항-P-카드헤린 항체 및 항체-약물 콘쥬게이트에 대한 당업자의 요구가 존재한다. 본 출원은 이러한 제한점 및 기타 문제점을 해결한다.
이러한 목적 및 기타 목적은 넓은 의미에서 개선된 효능을 갖는 항체를 제공하는 화합물, 방법, 조성물 및 제조물에 관한 것으로서 본 발명의 내용에 의해 제공된다. 본 발명의 내용에 의해 제공되는 이점은 항체 치료제 및 진단 분야에서 광범위하게 적용 가능하며 다양한 표적과 반응하는 항체와 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 P-카드헤린에 대한 항체, 항-P-카드헤린 항체를 포함하는 ADC, 및 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 ADC의 기능을 검증하는 방법을 제공한다. 본 발명의 ADC는 인간 면역 기능의 조절을 통해 다중 암의 치료를 위한 매우 강력한 제제를 제공한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 약물 모이어티에 콘쥬게이트된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)를 제공하며, 여기서 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 P-카드헤린에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음을 포함한다:
(A) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(HCDR):
(i) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 및
(B) 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR(LCDR):
(i) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
일 구현예에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음을 포함한다:
(A) 서열번호 1에 기재된 HCDR1; 서열번호 2에 기재된 HCDR2; 및 서열번호 3에 기재된 HCDR3; 및
(B) 서열번호 4에 기재된 LCDR1; 서열번호 5로 기재된 LCDR2; 및 서열번호 6에 기재된 LCDR3을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 약물 모이어티는 독소, 화학요법제, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로부터 선택된 세포독성제 또는 세포증식억제제를 포함한다. 예를 들어, 세포독성제는 DM1, DM3, DM4, 돌라스타틴(dolastatins), 돌라스타틴 펩타이드 유사체 및 아우리스타틴(auristatins)과 같은 유도체, 선택적으로 MMAE 및 MMAF와 같은 메이탄시노이드(maytansinoid)로부터 선택될 수 있다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 ADC는 식 Ab-(L-D)p를 가지며, 상기 Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, L은 링커 시스템이며, D는 약물 모이어티이고, p는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15 및 20과 같은 1 내지 20의 정수이다.
일 구현예에 있어서, L은 6-말레이미도카프로일 (6-maleimidocaproyl) (MC), 말레이미도프로파노일 (maleimidopropanoyl) (MP), 발린-시트룰린 (valine-citrulline) (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (alanine-phenylalanine) (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (p-aminobenzyloxycarbonyl) (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (N-Succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate) (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥세인-1 카르복실레이트 (N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate) (SMCC), N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate) (SIAB), 및 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노베닐옥시카르보닐 (6-maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenyloxycarbonyl) (MC-vc-PAB)로부터 선택되는 링커를 포함한다. 예를 들어, 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 일 구체적인 구현예에 있어서, 링커는 MC-vc-PAB이다.
구체적인 구현예에 있어서, ADC는 식 Ab-(L-MMAE)p를 가지고, p의 범위는 1 내지 8이다.
일 구현예에 있어서, 상기 링커는 항체 상의 티올기(thiol group)를 통해 항체에 부착된다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음을 포함한다:
(A) 중쇄 가변 영역(VH):
(i) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하면서도 P-카드헤린에 대한 특이적 결합 친화력을 유지하며; 또는
(iii) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상 (예를 들어 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 추가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함함; 및/또는
(B) 경쇄 가변 영역(VL):
(i) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
(ii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하면서도 P-카드헤린에 대한 특이적 결합 친화력을 유지하며; 또는
(iii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상 (예를 들어 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 추가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함함.
일 구현예에 있어서, VH 또는 VL 영역 내의 아미노산 중 적어도 하나의 추가, 결실 및/또는 치환은 임의의 CDR 서열이 아니라 프레임워크(FRW) 서열에 있다.
일 구현예에 있어서, 전술한 바와 같이 단리된(isolated) 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 프레임워크 서열 내의 아미노산의 하나 이상의 치환, 예를 들어 VH 또는 VL 영역의 FRW1, FRW2, FRW3, 및/또는 FRW4를 추가로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열번호 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 도메인과 같은 인간 IgG 불변 도메인, 선택적으로 인간 IgG1 불변 도메인 또는 그의 변이체를 추가로 포함한다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이다. 바람직하게, 항체는 완전 인간 단일클론 항체이다.
일 구현예에 있어서, 본원에 개시된 바와 같이 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 및 경쇄를 포함한다:
(a) 중쇄는 서열번호 7에 개시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9에 개시된 중쇄 불변 영역을 포함하고; 그리고
(b) 경쇄는 서열번호 8, 27 또는 28에 개시된 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 10에 개시된 경쇄 불변 영역을 포함한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 ADC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 본원에 정의된 ADC를 생산하는 방법에 관한 것이다:
- 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 벡터의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계;
- 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 분리하는 단계; 및
- 약물 모이어티를 항체 또는 이의 항원 결합 부분에 콘쥬게이트시키는 단계.
일 구현예에 있어서, 전술된 콘쥬게이트는 다음 단계를 포함한다: 약물 모이어티의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 약물-링커 중간체 D-L을 형성한 다음, D-L을 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 반응시키는 단계, 대안적으로, 항체를 링커 시약과 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성한 후, Ab-L을 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시켜 항체-약물 콘쥬게이트를 형성하는 단계. 일 구현예에 있어서, 형성된 ADC의 DAR의 범위는 약 1 내지 약 8 이고, 바람직하게는 약 4이다.
일 구현예에 있어서, 본 발명의 약물 모이어티는 독소, 화학요법제, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로부터 선택된 세포독성제 또는 세포증식억제제를 포함한다. 예를 들어, 세포독성제는 DM1, DM3, DM4, 돌라스타틴, 돌라스타틴 펩타이드 유사체 및 아우리스타틴과 같은 유도체, 선택적으로 MMAE 및 MMAF와 같은 메이탄시노이드로부터 선택될 수 있다. 구체적인 구현예에 있어서, 본원의 ADC에 포함된 약물 모이어티는 MMAE를 포함하거나 MMAE로 구성된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 대상체에서 P-카드헤린 관련 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것으로, 대상체의 P-카드헤린 관련 면역 반응이 조절되도록 대상체에게 본원에 개시된 ADC를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 유효량의 ADC 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 P-카드헤린 양성 암을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일 구현예에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 대장암, 난소암, 흑색종, 방광암, 신세포암, 간암, 전립선암, 위암, 췌장암, 비소세포 폐암, 자궁경부암, 식도암, 자궁내막암, 피부암, 두경부암, 고환암, 갑상선암, 요로상피암, 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma) 및 다발성 골수종으로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암, 전립선암 또는 결장암이다. 일 구현예에 있어서, 상기 암은 유방 관 암종을 포함하는 유방암이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 P-카드헤린 양성 암의 진단, 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 ADC의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 P-카드헤린 양성 암을 진단, 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 본 발명의 ADC에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 본 발명의 ADC, 및 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 키트 또는 장치 및 관련 방법에 관한 것이다.
전술한 내용은 요약된 것이므로 필요에 따라 단순화, 일반화 및 세부 사항의 생략이 포함되어 있고; 결과적으로, 당업자는 요약이 단지 예시적인 것뿐 어떠한 방식으로든 제한하려는 의도가 없음을 이해할 것이다. 본 명세서에 기재된 방법, 구성 및/또는 장치 및/또는 다른 주제의 다른 측면, 특징 및 장점은 본 명세서에 기재된 교시에서 명백해질 것이다. 이 요약은 청구된 주제의 주요 특징이나 필수적인 특징을 식별하기 위한 것이 아니며 청구된 주제의 범위를 결정하는 데 도움을 주기 위한 것도 아니다.
본 개시 내용은 다양한 형태로 구현될 수 있지만, 본 개시 내용의 원리를 예시하는 특정 예시적인 실시예가 여기에 개시되어 있다. 본 개시 내용은 예시된 특정 실시예에 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 더욱이, 여기에 사용된 모든 섹션 제목은 구성 목적만을 위한 것이며, 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시와 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 가져야 한다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고, 복수 용어는 단수를 포함한다. 보다 구체적으로, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "단백질"에 대한 언급은 복수의 단백질을 포함하고; "세포"에 대한 언급은 세포의 혼합물 등을 포함한다. 본 출원에서 "또는"의 사용은 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, "포함하는"이라는 용어뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함되는"과 같은 다른 형태의 사용은 제한되지 않는다. 또한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 범위에는 종점과 종점 사이의 모든 지점이 포함된다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려져 있는 통상적인 방법에 따라 수행되고, 달리 명시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기술된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th ed., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); 및 Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 명명법, 이들의 실험실 절차 및 기술은 해당 분야에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
정의
본 개시의 이해를 돕기 위해, 관련 용어의 정의 및 설명을 다음과 같이 제공한다.
본원에 사용된 용어 “항체(antibody)” 또는 “Ab”는 일반적으로 공유 이황화 결합 및 비공유 상호작용에 의해 함께 결합된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L) 폴리펩타이드를 포함하는 Y자형 사량체 단백질을 지칭한다. 항체의 경쇄는 κ경쇄와 λ경쇄로 분류될 수 있다. 중쇄는 μ, δ, γ, α 및 ε으로 분류될 수 있으며, 이는 각각 항체의 이소형을 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의한다. 경쇄 및 중쇄에서 가변 영역은 약 12개 이상의 아미노산으로 구성된 "J" 영역을 통해 불변 영역에 연결되고, 중쇄는 약 3개 이상의 아미노산으로 구성된 "D" 영역을 추가로 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH)과 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인(CH1, CH2 및 CH3)으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상대적으로 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)이라고 함)이 사이에 배치된 초가변 영역(CDR(상보성 결정 영역)이라고 함)으로 추가적으로 나눌 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 N-말단에서 C-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 각 중쇄/경쇄 쌍의 가변 영역(VH 및 VL)은 각각 항원 결합 부위를 형성한다. 다양한 영역 또는 도메인에서의 아미노산 분포는 일반적으로 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342:878-883; 및/또는 IMGT (http://www.imgt.org/)의 정의를 따른다. 항체는 다양한 항체 아이소타입, 예를 들어 IgG (예: IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위 유형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체일 수 있다.
본 출원의 맥락에서 상호교환적으로 사용될 수 있는 항체의 "항원 결합 부분(antigen-binding portion)" 또는 "항원 결합 단편(antigen-binding fragment)"이라는 용어는 전장 항체의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 의미하고, 이는 전장 항체가 특이적으로 결합하는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 유지하고/하거나 동일한 항원에 결합하기 위해 전장 항체와 경쟁한다. 일반적으로, Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., the second edition, Raven Press, N.Y. (1989), 이는 모든 목적을 위해 본 문서에 참조로 포함된다. 항체의 항원 결합 단편은 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생성될 수 있다. 일부 조건하에 항원 결합 단편에는 Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb 및 상보성 결정 영역(CDR) 단편, 단일 사슬 항체(예: scFv), 키메라 항체, 디아바디 및 폴리펩타이드에 특정 항원 결합 능력을 부여하기에 충분한 항체의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술(예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 효소적 또는 화학적 절단 방법)에 의해 주어진 항체 (예를 들어, 본 출원에 제공된 단일클론 항-인간 P-카드헤린 항체)로부터 얻어질 수 있고, 온전한 항체를 스크리닝하는 것과 동일한 방식으로 특이성에 대해 스크리닝될 수 있다.
항체와 관련된 "Fc"는 이황화 결합을 통해 제2 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역에 결합된 제1 중쇄의 두 번째 및 세 번째 불변 영역을 포함하는 항체의 부분을 의미하며, 선택적으로 힌지 영역의 일부 또는 전체도 포함한다. 항체의 Fc 부분은 항체 의존성 세포 매개 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity; ADCC) 및 보체 의존성 세포독성(complement dependent cytotoxicity; CDC)과 같은 다양한 이펙터 기능을 담당하지만 항원 결합에서는 기능하지 않는다.
본원에 사용된 용어 "P-카드헤린(P-cadherin)"은 태반 카드헤린을 의미하며 세포-세포 접착을 조절하는 막횡단 당단백질의 고전적인 카드헤린 계열의 구성원이다. 인간 P-카드헤린(CDH3 유전자에 의해 코딩됨)의 예시적인 서열은 표준 서열 및 여러 이소형을 포함하는 Uniprot 데이터베이스에서 ID P22223으로 얻을 수 있다. 본 명세서에서 "P-카드헤린"이라는 용어는 인간, 마우스, 사이노 P-카드헤린, 스플라이스/대립형질 변이체 및 이의 단편/유도체, 및 P-카드헤린의 재조합 키메라 형태를 포함하도록 의도되고, 표준 재조합 발현 방법으로 제조되거나 상업적으로 구입할 수 있다. 표준 P-카드헤린 서열은 829개의 아미노산으로 구성되며, 여기서 성숙한 단백질은 3개의 별개의 도메인을 갖는 아미노산 108에서 시작한다: 5개의 세포외 카드헤린 반복(548 aa), 단일 막횡단 영역(23 aa) 및 고도로 보존된 세포질 꼬리(151 aa).
본원에 사용된 용어 "E-카드헤린(E-cadherin)" 및 "N-카드헤린(N-cadherin)"은 각각 고전 카드헤린 계열의 구성원이기도 한 상피 카드헤린 및 신경 카드헤린을 의미한다. 카드헤린은 유형 I과 유형 II 하위 그룹으로 나뉜다. I형 카드헤린에는 E-카드헤린, N-카드헤린, P-카드헤린 및 망막 카드헤린(R-cadherin)이 포함되는 반면, 신장 카드헤린(K-cadherin)과 조골세포 카드헤린(OB-cadherin)은 II형 카드헤린이다. E- 카드헤린은 인간의 CDH1 유전자에 의해 암호화되며 CDH3 유전자와 66% 상동성을 공유한다. N- 카드헤린은 인간의 CDH2 유전자에 의해 암호화된다. E-카드헤린, N-카드헤린 및 P-카드헤린은 접착 단백질의 가장 특징적인 하위 그룹이다.
본원에 사용된 용어 "항-P-카드헤린 항체" 또는 "P-카드헤린 항체" 또는 "P-카드헤린에 대한 항체"는 P-카드헤린에 결합할 수 있는, 예를 들어 인간 P-카드헤린 단백질의 ECD 영역에 결합할 수 있는, 본원에 정의된 항체를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단일클론 항체(monoclonal antibody)" 또는 "mAb"는 단일 분자 조성의 항체 분자 제제를 지칭한다. 단일클론항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성과 친화성을 나타낸다.
항체 또는 항원-결합 도메인과 관련하여 본원에서 사용된 용어 "완전 인간(fully human)"은 항체 또는 항원 결합 도메인이 인간 또는 인간 면역 세포에 의해 생산되거나 비인간 공급원 예를 들어 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 활용하는 형질전환 비인간 동물로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열(들)을 갖거나 이로 구성된다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 완전 인간 항체는 비-인간 항체로부터 유래된 아미노산 잔기(특히 항원-결합 잔기)를 포함하지 않는다.
용어 "ADC" 또는 "항체-약물 컨쥬게이트(antibody-drug conjugate)" 또는 "면역컨쥬게이트(immunoconjugate)"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 세포독성제 또는 세포증식억제제, 예를 들어 화학요법제, 성장억제제, 독소 (예를 들어, 박테리아, 곰팡이, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 컨쥬게이트)와 같은 약물 부분에 컨쥬게이트된 항체를 포함한다. ADC는 일반적으로 식 Ab-(L-D)p를 가지며, 여기서 Ab는 항체 또는 이의 항원 결합 부분이고, L은 링커 시스템이며, D는 약물 모이어티이고, p는 1에서 20 사이의 정수이다.
본 명세서에 사용된 용어 "DAR" 또는 "약물 대 항체 비율(Drug-to-Antibody Ratio)"은 항체에 컨쥬게이트된 약물의 평균 수를 의미하며, 이는 ADC의 중요한 속성이다. DAR 값은 약물의 효능에 영향을 미치며, 낮은 약물 부하량은 효능을 감소시키는 반면, 높은 약물 부하량은 약동학(PK) 및 독성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 자외선-가시광선(UV/Vis) 분광법, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC), 전자분무 이온화 질량분석법과 결합된 액체 크로마토그래피 (LC-ESI-MS) 등 다양한 분석 방법을 사용하여 DAR을 측정할 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 DAR 값과 약물 로딩 분포를 특성화하는 선도적인 기술이다. 결합된 종은 증가된 약물 부하로 인해 증가된 소수성을 기반으로 분리된다. 시스테인 결합 ADC의 경우, 소수성이 가장 적은 비컨쥬게이트 항체가 먼저 용리되고 가장 소수성이고 대부분의 약물 결합 형태가 마지막으로 용출되어 정량적 용출 프로필이 생성된다. 피크의 면적 백분율은 각 약물이 로드된 ADC 종의 상대적인 양을 나타낸다. 페이로드 분포는 HIC 프로필에서 파생되는 반면 평균 DAR은 피크 면적 백분율에서 계산된다. 본원에 입증된 바와 같이, 본원에 개시된 항-P-카드헤린 ADC의 DAR은 약 1 내지 약 8 범위이다. 본원에 입증된 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-P-카드헤린 ADC의 DAR은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 본원에 입증된 일부 구현예에서, 본원에 개시된 항-P-카드헤린 ADC의 DAR은 약 4이다.
본 명세서에 사용된 용어 "페이로드 분포(payload distribution)"는 ADC의 또 다른 품질 속성이며, 다양한 수의 약물을 포함하는 항체의 분별에 의해 결정된다. DAR 및 페이로드 분포는 ADC 제품 균질성을 측정할 뿐만 아니라 표적 조직에 전달되는 페이로드의 양을 결정하여 ADC 효능과 안전성 모두에 직접적인 영향을 미친다. 뿐만 아니라, DAR 및 페이로드 분포 평가는 모두 ADC 제조에서 중요한 품질 관리 기준이다.
본원에서 사용된 용어 "자유 페이로드 대조군(free payload control)"은 항체를 로딩하지 않고 약물 모이어티에 연결된 링커를 의미한다. 예를 들어, Ab-(L-D)p 공식을 사용하는 ADC의 경우 자유 페이로드 대조군은 L-D를 나타낸다.
본 발명에서 용어 "세포독성 활성(cytotoxic activity)"은 항체-약물 컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트의 세포내 대사물질의 세포사멸, 세포증식억제 또는 성장 억제 효과를 의미한다. 세포독성 활성은 IC50 값으로 표현될 수 있으며, 이는 세포의 절반이 생존하는 단위 부피당 농도(몰 또는 질량)이다. 본원에 개시된 ADC는 0.1nM 이하, 예를 들어, 0.1 nM 이하, 0.09 nM 이하, 0.08 nM 이하, 0.07 nM 이하, 0.06 nM 이하, 0.05 nM 이하, 0.04 nM 이하, 0.03 nM 이하, 0.02 nM 이하 또는 그 이하의 IC50으로 인간 P-카드헤린 발현 암 세포에 대한 사멸 효과를 갖는 것으로 입증되었다.
본원에 사용된 용어 "링커(linker)"는 공유 결합 또는 항체를 약물 모이어티에 공유적으로 부착시키는 원자 사슬을 포함하는 화학적 모이어티를 의미한다. 다양한 구현예에서, 링커는 알킬디일(alkyldiyl), 아릴디일(aryldiyl), 헤테로아릴디일(heteroaryldiyl)과 같은 2가 라디칼, -(CR2)nO(CR2)n-와 같은 모이어티, 알킬옥시(alkyloxy) (예: 폴리에틸렌옥시, PEG, 폴리메틸렌옥시) 및 알킬아미노(alkylamino) (예: 폴리에틸렌아미노, 제파민(Jeffamine)TM)의 반복 단위; 및 숙시네이트, 숙신아미드, 디글리콜레이트(diglycolate), 말로네이트 및 카프로아미드를 포함하는 이산 에스테르 및 아미드를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "KD"는 Koff 대 Kon의 비율로부터 얻어지고 몰 농도(M)로 표현되는 특정 항체(또는 ADC)-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 의미하는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 용어 "Kon"은 특정 항체-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 의미하는 반면, 본원에 사용된 용어 "Koff"는 특정 항체-항원 상호 작용의 해리 속도 상수를 의미하도록 의도된다. 항체에 대한 KD 값은 당업계에 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "고친화도(high affinity)"는 항원과 항체(또는 ADC) 사이의 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 표면 플라스몬 공명, FACS 친화성 테스트, FACS 결합 테스트 및 ELISA 결합과 같은 친화성을 측정하기 위한 다양한 방법이 업계에 확립되어 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 ADC는 FACS 친화성 테스트로 측정했을 때 세포 표면, 예를 들어 P-카드헤린 발현 세포에서 발현되는 표적 항원에 대해 1×10-9M 이하의 KD, 더 바람직하게는 5×10-10 M 이하, 더 바람직하게는 4×10-10 M 이하, 더 바람직하게는 3×10-10 M 이하, 더 바람직하게는 2×10-10 M 이하, 더욱 더 바람직하게는 1×10-10 M 이하의 KD를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "EC50"은 "최대 유효 농도의 절반"으로도 지칭되며, 지정된 노출 시간 후 기준선과 최대치 사이의 중간에서 반응을 유도하는 약물, 항체 또는 독성물질의 농도를 의미한다. 본 출원의 맥락에서 EC50은 "nM" 또는 "M" 단위로 표현된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 ADC는 P-카드헤린 발현 세포와 1 nM 이하, 더 바람직하게는 0.5 nM 이하, 더 바람직하게는 0.1 nM 이하의 결합 친화도를 갖는다.
본 명세서에서 사용된 용어 "단리된 (isolated)"은 자연 상태에서 인공적인 수단에 의해 획득된 상태를 의미한다. 특정 "단리된 (isolated)" 물질 또는 구성요소가 자연에 존재하는 경우, 이는 자연 환경이 변하거나 물질이 자연 환경에서 분리되거나 둘 다이기 때문에 가능하다. 예를 들어, 어떤 살아있는 동물의 몸에는 어떤 분리되지 않은 어떤 폴리뉴클레오타이드나 폴리펩타이드가 자연적으로 존재하고, 이와 같은 자연상태에서 분리된 고순도의 동일한 폴리뉴클레오타이드나 폴리펩타이드를 단리된 폴리뉴클레오타이드나 폴리펩타이드라고 한다. "단리된 (isolated)"이란 혼합된 인공 또는 합성물질이나 그 밖에 단리된 물질의 활성에 영향을 주지 않는 불순한 물질을 제외한다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체"는 항원 특이성이 상이한 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것으로 의도된다(예를 들어, P-카드헤린 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 P-카드헤린 단백질 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없다). 그러나 인간 P-카드헤린 단백질에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 다른 종의 P-카드헤린 단백질과 같은 다른 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 내부에 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산 운반체를 의미한다. 벡터가 내부에 삽입된 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 허용하는 경우, 상기 벡터를 발현 벡터라고 한다. 벡터는 숙주 세포 내로의 형질전환, 형질도입 또는 형질감염에 의해 숙주 세포에서 발현된 운반된 유전 물질 요소를 가질 수 있다. 벡터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 플라스미드, 파지, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체; λ파지 또는 M13 파지와 같은 파지 및 동물 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 벡터로 사용될 수 있는 동물 바이러스에는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스(단순 포진 바이러스 등), 폭스 바이러스, 바큘로바이러스, 유두종 바이러스, 파포바 바이러스(예: SV40) 등이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 발현을 제어하기 위한 여러 요소를 포함할 수 있고, 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 벡터는 복제 원점을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "숙주 세포"는 관심 있는 단백질, 단백질 단편 또는 펩타이드를 생성하도록 조작될 수 있는 세포 시스템을 의미한다. 숙주 세포에는 배양된 세포, 예를 들어 CHO, BHK, NSO, SP2/0, YB2/0과 같은 설치류(래트, 마우스, 기니피그 또는 햄스터)로부터 유래된 포유동물 배양 세포; 또는 인간 조직 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포 및 곤충 세포, 및 형질전환 동물 또는 배양 조직 내에 포함된 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그의 세포의 자손도 포함한다. 돌연변이나 환경 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에 자손은 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 "숙주 세포"라는 용어의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "동일성"은 서열을 정렬하고 비교함으로써 결정되는, 2개 이상의 폴리펩타이드 분자 또는 2개 이상의 핵산 분자의 서열 사이의 관계를 지칭한다. "동일성 백분율"은 비교된 분자의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 사이의 동일한 잔기의 백분율을 의미하며 비교되는 분자 중 가장 작은 크기를 기준으로 계산된다. 이러한 계산을 위해 정렬의 차이(있는 경우)는 바람직하게는 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램(즉, "알고리즘")에 의해 해결된다. 정렬된 핵산 또는 폴리펩타이드의 동일성을 계산하는 데 사용할 수 있는 방법에는 Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:1073에 설명된 방법이 포함된다.
본원에 사용된 용어 "형질감염(transfection)"은 핵산이 진핵 세포, 특히 포유동물 세포에 도입되는 과정을 의미한다. 형질감염을 위한 프로토콜 및 기술에는 지질 형질감염과 전기천공법과 같은 화학적, 물리적 방법이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 다수의 형질감염 기술이 당업계에 잘 알려져 있으며 본원에 개시되어 있다. Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197 참조. 본 발명의 특정 구현예에서, 인간 P-카드헤린 유전자를 293F 세포에 형질감염시켰다.
본원에 사용된 용어 "하이브리도마" 및 용어 "하이브리도마 세포주"는 상호교환적으로 사용될 수 있다. "하이브리도마"라는 용어 및 "하이브리도마 세포주"라는 용어가 언급되는 경우에는 하이브리도마의 서브클론 및 자손 세포도 포함된다.
본원에 사용된 용어 "형광-활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting)" 또는 "FACS"는 특수 유형의 유세포 분석을 의미한다. 각 세포의 특정 광 산란 및 형광 특성을 기반으로 생물학적 세포의 이종 혼합물을 두 개 이상의 컨테이너로 한 번에 한 세포씩 분류하는 방법을 제공한다 (FlowMetric. "Sorting Out Fluorescence Activated Cell Sorting". Retrieved 2017-11-09). FACS를 수행하기 위한 기구는 당업자에게 공지되어 있으며 대중에게 상업적으로 이용 가능하다. 이러한 장비의 예로는 Becton Dickinson(Foster City, Calif.)의 FACS Star Plus, FACScan 및 FACSort 장비, Coulter Epics Division(Hialeah, Fla.)의 Epics C 및 Cytomation(Colorado Springs, Colo.)의 MoFlo가 있다.
"대상(subject)"이라는 용어는 임의의 인간 또는 인간이 아닌 동물을 포함하고, 바람직하게는 인간을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "암(cancer)"은 종양 또는 악성 세포 성장, 증식 또는 전이 매개, 고형 종양 및 백혈병과 같은 비고형 종양을 의미하며, 의학적 상태를 개시한다.
상태를 치료하는 맥락에서 본 명세서에 사용된 용어 "치료", "치료하는" 또는 "치료된"은, 일반적으로 인간 또는 동물의 치료 및 요법에 관한 것으로, 질병의 진행 억제와 같이 원하는 치료 효과가 달성되는 것을 의미하며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 질병의 퇴행, 질병의 호전 및 질병의 완치 등을 포함한다. 예방적 조치(예: 예방, 방지)로서의 치료도 포함된다. 암의 경우, "치료하는"은 종양이나 악성 세포의 성장, 증식, 전이, 또는 이들의 일부 조합을 약화시키거나 늦추는 것을 의미할 수 있다. 종양의 경우, "치료"에는 종양 전체 또는 일부의 제거, 종양 성장 및 전이의 억제 또는 둔화, 종양의 발달 예방 또는 지연, 또는 이들의 일부 조합이 포함된다.
본원에서 사용되는 '유효량'이라는 용어는 원하는 치료 요법에 따라 투여할 때 합리적인 유익성/위험성 비율에 상응하는 원하는 치료 효과를 생성하는 데 효과적인 활성 화합물 또는 활성 화합물을 포함하는 물질, 조성물 또는 제형의 양에 관한 것이다. 예를 들어, P-카드헤린 관련 질환 또는 상태의 치료와 관련하여 사용되는 경우 "유효량"은 상기 질환 또는 상태를 치료하는 데 효과적인 양 또는 농도의 본원에 개시된 ADC를 의미한다.
포유동물의 특정 질병 상태와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "예방하다", "예방" 또는 "예방하는"는 질병의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 이의 임상적 또는 준임상적 증상의 발현을 예방하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 그의 염이 제제 내의 다른 성분과 화학적으로 및/또는 물리적으로 양립 가능하고, 수용자와 생리학적으로 양립할 수 있음을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제"는 대상체 및 활성제와 약리학적으로 및/또는 생리학적으로 적합한 담체 및/또는 부형제를 의미하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있고 (예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995 참조), 여기에는 pH 조절제, 계면활성제, 보조제 및 이온 강도 강화제가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, pH 조절제는 인산염 완충액를 포함하나 이에 제한되지 않고; 계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 Tween-80을 포함하나 이에 제한되지 않으며; 이온 강도 강화제는 염화나트륨을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어쥬번트(adjuvant)"는 항원과 함께 유기체에 전달되거나 미리 유기체에 전달될 때 항원에 대한 면역 반응을 강화하거나 유기체의 면역 반응 유형을 변화시킬 수 있는 비특이적 면역증강제를 지칭한다. 다양한 어쥬번트가 존재하며, 알루미늄 어쥬번트(예를 들어, 수산화알루미늄), 프로인트 어쥬번트(예를 들어, 프로인트 완전 어쥬번트 및 프로인트 불완전 어쥬번트), 코리네박테리움 파르붐, 지질다당류, 사이토카인 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
항-P-카드헤린 항체
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 P-카드헤린에 대한 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 다음을 포함한다:
(A) 서열번호 7 또는 서열번호 7과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역, 및/또는
(B) 서열번호 8 또는 서열번호 8과 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역.
일 구현예에 있어서, 단리된 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다:
VH는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 중쇄 CDR(HCDR)을 포함한다:
(i) 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 1과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
(ii) 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 2와 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 및
(iii) 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 3과 다른 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 및
VL은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 경쇄 CDR(LCDR)을 포함한다:
(i) 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 4과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
(ii) 서열번호 5의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 5와 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
(iii) 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산의 아미노산 첨가, 결실 또는 치환에 의해 서열번호 6과 다른 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
일부 구현예에서, 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1; 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2; 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3; 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1; 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 또는 VL 영역은 각각 서열 번호 7 또는 8에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) 아미노산의 추가, 결실 및/또는 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 또는 VL 영역 내의 아미노산 중 적어도 하나의 추가, 결실 및/또는 치환은 임의의 CDR 서열이 아니라 프레임워크(FRW) 서열에 있다. 예를 들어, 위에서 설명한 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 프레임워크 서열, 예를 들어 VH 또는 VL 영역의 FRW1, FRW2, FRW3 및/또는 FRW4의 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 단리된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항원 결합 도메인이 P-카드헤린에 특이적으로 결합할 수 있는 한 임의의 적합한 프레임워크 영역(FR) 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 상술된 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부분은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv, 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택되는 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 항체는 인간화된다. 일부 구현예에서, 항체는 완전 인간 항체이다.
항체-약물 컨쥬게이트(ADC)
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 세포독성제 또는 세포증식억제제에 컨쥬게이트된 상기 기재된 항체를 포함하는 면역컨쥬게이트 또는 항체-약물 컨쥬게이트를 제공한다. 세포독성제는 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소(예: 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소(즉, 방사성 컨쥬게이트)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "컨쥬게이트(conjugate)"는 함께 결합되거나 연결된(예를 들어 공유적으로 연결된)을 의미하는 가장 넓은 정의로 본원에서 사용된다. 분자는 결합된 것처럼 작용하거나 작동할 때 "컨쥬게이트(conjugate)"된다.
세포독성제 또는 세포증식억제제의 국소 전달을 위한 항체-약물 컨쥬게이트의 용도, 예컨대, 암 치료에서 종양 세포를 죽이거나 억제하는 약물은 약물 모이어티를 종양으로 표적 전달하고 그 안에 세포 내 축적을 허용하며, 비컨쥬게이트 약물 제제의 전신 투여는 제거하고자 하는 종양 세포뿐만 아니라 정상 세포에 허용할 수 없는 수준의 독성을 초래할 수 있다 (Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), pp. 475-506). 다클론 항체와 단클론 항체 모두 이러한 전략에 유용한 것으로 보고되었다 (Rowland et al., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87). ADC에 사용할 수 있는 약물에는 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate), 빈데신(vindesine)과 같은 화학요법제; 독소, 예를 들어, 디프테리아 독소와 같은 박테리아 독소, 리신(ricin)과 같은 식물 독소, 젤다나마이신(geldanamycin), 메이탄시노이드(maytansinoids) 및 칼리케아미신(calicheamicin)과 같은 소분자 독소; 아우리스타틴 펩타이드(auristatin peptides), 아우리스타틴 E(AE) 및 돌라스타틴의 합성 유사체인 모노메틸아우리스타틴(MMAE)을 포함한다. MMAE는 천연 세포 증식 억제 유사 펩타이드인 돌라스타틴 10의 합성 유도체이다. 독소는 튜불린 결합, DNA 결합 또는 토포이소머라제 억제를 포함한 메커니즘을 통해 세포독성 및 세포증식억제 효과에 영향을 미칠 수 있다. 일부 세포독성 약물은 큰 항체나 단백질 수용체 리간드에 컨쥬게이트될 때 불활성이거나 일부 활성인 경향이 있다.
마일로탁(MYLOTARG) (젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin), 칼리케아미신(calicheamicin)에 연결된 항-CD33 항체로 구성된 항체 약물 컨쥬게이트), 애드세트리스(Adcetris) (항-CD30 항체를 MMAE에 연결하는 브레툭시맙 베도틴(bretuximab vedotin)), 케싸일라(Kadcyla) (아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine); T-DM1), SGN-CD33A (바다스툭시맙 탈리린(vadastuximab talirine)), Rova-T (로발피투주맙 테시린 (rovalpituzumab tesirine)), 및 BAT8001(안정한 링커를 통해 메이탄신 유도체에 공유 결합된 인간화 항-HER2 항체) 등 다양한 암 치료용 ADC가 개발되었다.
면역컨쥬게이트 생성에 유용한 화학요법제는 아래에 설명되어 있다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신(ricin) A 사슬, 아브린(abrin) A 사슬, 모데신(modeccin) A 사슬, 알파사르신(alpha-sarcin), 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 에노마이신(enomycin) 및 트리코테센(tricothecenes)이 포함된다. WO 93/21232 published October 28, 1993 참조. 방사성컨쥬게이트항체 생산에는 다양한 방사성 핵종을 사용할 수 있다. 예로는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186Re가 있다.
항-P-카드헤린 항체와 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 돌라스타틴, 아우리스타틴, 트리코테센 및 CC1065와 같은 하나 이상의 소분자 독소의 컨쥬게이트, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체도 본원에서 고려된다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate; SPDP), 이미노티올란(iminothiolane; IT), 이미도에스테르(imidoesters)의 이중기능성 유도체(예: 디메틸 아디피미데이트 HCl(dimethyl adipimidate HCl)), 활성 에스테르(예: 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데하이드(예: 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)), 비스-아지도(bis-azido) 화합물(예: 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine)), 비스-디아조늄(bis-diazonium) 유도체(예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)), 디이소시아네이트(diisocyanates)(예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 이중활성 불소 화합물(예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))와 같은 다양한 이중기능성 단백질 결합제를 사용하여 만들어진다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al (1987) Science, 238:1098에 설명된대로 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(Carbon-14-labeled 1-isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylene triaminepentaacetic acid; MX-DTPA)은 방사성뉴클레오타이드를 항체에 컨쥬게이트시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다(WO94/11026).
특정 구현예에서, 본 발명은 프로테아제-절단성 링커를 통해 W3195-p1을 세포독성제에 연결함으로써 세포독성제에 컨쥬게이트된 항-P-카드헤린 단일클론 항체를 제공한다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 MMAE이다. 구체적으로, 이러한 ADC의 링커 시스템은 티올 반응성 말레이미도카프로일 스페이서(thiol reactive maleimidocaproyl spacer), 다이펩타이드 발린-시트룰린 링커("vc") 및 자가 희생적(self-immolative) p-아미노-벤질옥시카르보닐(p-amino-benzyloxycarbonyl)("PAB")을 포함할 수 있으며, 이는 혈류에서 안정하도록 설계되었다. 세포 표면의 P-cadherin에 결합하면 내재화가 시작된다. P-cadherin 발현 종양 세포로 내재화되면 미세소관 조립, 튜불린 의존성 GTP 가수분해 및 중합을 억제하여 강력한 세포 증식 억제 효과를 발휘하는 MMAE가 단백질 분해 절단을 통해 방출된다. 마지막으로, 튜불린에 결합한 후 MMAE는 세포 내의 미세소관 네트워크를 파괴하고, 이는 차례로 세포 주기 정지를 유도하고 P-카드헤린 발현 종양 세포의 세포사멸을 초래한다.
메이탄신 및 메이탄시노이드
일부 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이트된 본원에 개시된 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다.
메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 메이탄신은 동아프리카 관목인 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)에서 처음 분리되었으며 이후 특정 미생물이 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르와 같은 메이탄시노이드도 생산한다는 사실이 발견되었다(미국 특허 번호 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 이의 유도체 및 유사체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,137,230 및 4,371,533에 개시되어 있다.
메이탄시노이드 약물 모이어티는 다음과 같은 이유로 항체 약물 컨쥬게이트에서 매력적인 약물 모이어티이다: (i) 발효 또는 화학적 변형, 발효 생성물의 유도체화를 통해 비교적 쉽게 제조할 수 있고, (ii) 비-이황화물 링커를 통해 항체에 대한 컨쥬게이트에 적합한 작용기로 유도체화할 수 있으며, (iii) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 종양 세포주에 효과적이다.
메이탄시노이드 약물 모이어티로 사용하기에 적합한 메이탄신 화합물은 당업계에 잘 알려져 있으며, 공지된 방법에 따라 천연 공급원으로부터 분리될 수 있고, 유전공학 기술을 사용하여 생산되거나(Yu et al (2002) PNAS 99:7968-7973 참조), 공지된 방법에 따라 합성적으로 제조된 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체로부터 분리될 수 있다. 적합한 메이탄시노이드는 예를 들어 미국 특허 번호 5,208,020에 개시되어 있다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 분자의 방향족 고리 또는 다른 위치에서 변형된 메이탄시놀 유사체, 예를 들어 다양한 메이탄시놀 에스테르이다.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티에는 변형된 방향족 고리를 갖는 것들이 포함된다: C-19-데클로로(US 4256746)(안사미토신 P2(ansamytocin P2)의 리튬 알루미늄 수소화물 환원에 의해 제조됨); C-20-하이드록시(또는 C-20-데메틸) +/-C-19-데클로로(미국 특허 번호 4361650 및 4307016)(스트렙토미세스(Streptomyces) 또는 악티노마이세스(Actinomyces)를 사용한 탈메틸화 또는 LAH를 사용한 탈염소화에 의해 제조됨); 및 C-20-데메톡시, C-20-아실옥시(OCOR), +/-데클로로(미국 특허 번호 4,294,757)(아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해 제조됨) 및 다른 위치에 변형이 있는 것.
예시적인 메이탄시노이드 약물 모이어티에는 또한 다음과 같은 변형이 있는 것들이 포함된다: C-9-SH(US 4424219)(메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해 제조됨); C-14-알콕시메틸(데메톡시/CH2OR)(US 4331598); C-14-히드록시메틸 또는 아실옥시메틸(CH2OH 또는 CH2OAc)(US 4450254)(노카르디아(Nocardia)로부터 제조됨); C-15-하이드록시/아실옥시(US 4,364,866)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해 제조됨); C-15-메톡시(미국 특허 번호 4,313,946 및 4,315,929)(Trewia nudlflora로부터 분리됨); C-18-N-데메틸(미국 특허 번호 4,362,663 및 4,322,348)(스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해 제조됨); 및 4,5-데옥시(US 4371533)(메이탄시놀의 삼염화티타늄/LAH 환원에 의해 제조됨).
메이탄시노이드 약물 모이어티의 예시적인 구현예는 DM1, DM3 및 DM4를 포함한다. DM1의 구조는 아래와 같다:
상기 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커(L)에 대한 약물의 황 원자의 공유 부착을 나타낸다. SMCC에 의해 DM1에 연결된 HERCEPTIN(트라스투주맙(trastuzumab))이 보고되었다(WO 2005/037992, 이는 전문이 참조로 본원에 명시적으로 포함된다).
다음의 구조 및 약어를 갖는 예시적인 메이탄시노이드 항체 약물 컨쥬게이트 "Ab-(SMCC-DM1)p" (여기서 Ab는 항체이고 p는 1 내지 약 8임)은 다음과 같다(예: SMCC를 통해 연결됨):
항-P-카드헤린 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체 또는 메이탄시노이드 분자의 생물학적 활성을 크게 감소시키지 않으면서 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 연결함으로써 제조될 수 있다. 항체 분자당 평균 3~4개의 메이탄시노이드 분자가 컨쥬게이트된 경우 항체의 기능이나 용해도에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 표적 세포의 세포 독성을 향상시키는 효능을 보였지만, 독소/항체 분자가 하나만 있어도 네이키드 항체를 사용하는 것보다 세포 독성을 향상시킬 수 있을 것으로 예상된다.
항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하기 위해 당업계에 공지된 많은 연결기가 있으며, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020, 6,441,163, 또는 EP 특허 0 425 235 B1, Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992) 및 US 2005/0169933 A1에 개시된 것들을 포함하며, 그 공개 내용은 참조로 명시적으로 포함된다. 링커 성분 SMCC를 포함하는 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 미국 특허 출원 번호 11/141344에 개시된 바와 같이 제조될 수 있다. 상기 특허에 개시된 바와 같이 연결기에는 디설파이드기, 티오에테르기, 산 불안정기, 광불안정기, 펩티다제 불안정기, 또는 에스테라제 불안정기가 포함된다. 추가적인 연결기가 본 명세서에 기술되고 예시된다.
링커는 링크 유형에 따라 다양한 위치에서 메이탄시노이드 분자에 부착될 수 있다. 예를 들어, 에스테르 결합은 통상적인 커플링 기술을 사용하여 히드록실기와의 반응에 의해 형성될 수 있다. 반응은 하이드록실기를 갖는 C-3 위치, 하이드록시메틸로 변형된 C-14 위치, 하이드록실기로 변형된 C-15 위치 및 하이드록실기를 갖는 C-20 위치에서 일어날 수 있다. 바람직한 구현예에서, 연결은 메이탄시놀 또는 메이탄시놀 유사체의 C-3 위치에서 형성된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 항체(전장 또는 단편)는 하나 이상의 메이탄시노이드 분자에 컨쥬게이트된다. 면역컨쥬게이트의 일부 실시 형태에서, 세포독성제는 메이탄시노이드 DM1이다. 면역컨쥬게이트의 일부 구현예에서, 링커는 SPDP, SMCC, IT, SPDP 및 SPP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 예시적인 메이탄시노이드 항체 약물 컨쥬게이트는 Ab-(SPP-DM1)p, Ab-(SMCC-DM1)p, Ab-(BMPEO-DM1)p일 수 있다.
메이탄시노이드를 함유하는 면역컨쥬게이트, 이의 제조 방법 및 이의 치료 용도는 예를 들어, 미국 특허 번호 5,208,020; 5,416,064; 6,441,163 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1에 기재되어 있으며, 이들의 개시 내용은 참조로 명시적으로 본원에 포함된다.
아우리스타틴 및 돌로스타틴
일부 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 돌라스타틴 또는 돌로스타틴 펩타이드 유사체 및 유도체인 아우리스타틴에 컨쥬게이트된 본원에 개시된 항-P-카드헤린 항체를 포함한다(미국 특허 번호 5,635,483; 5,780,588). 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 핵 및 세포 분열을 방해하고 항암 및 항진균 활성을 갖는 것으로 나타났다(Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). 돌라스타틴 또는 아우리스타틴 약물 모이어티는 펩타이드 약물 모이어티의 N(아미노) 말단 또는 C(카르복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(WO 02/088172).
예시적인 아우리스타틴 구현예는 N-말단 연결된 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF를 포함하고, " enter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volume 45, Abstract Number 623, presented March 28, 2004"에 개시되어 있으며, 이 내용은 그 전체가 참고로 명시적으로 포함되어 있다.
예시적인 아우리스타틴 구체예는 MMAE이다(여기서 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타냄):
MMAE.
또 다른 예시적인 아우리스타틴 구체예는 MMAF이다(여기서 물결선은 항체 약물 컨쥬게이트의 링커(L)에 대한 공유 부착을 나타냄):
MMAF.
MMAE 또는 MMAF 및 다양한 링커 성분을 포함하는 추가의 예시적 구현예는 다음 구조 및 약어를 갖는다(여기서 Ab는 항체를 의미하고 p는 1 내지 약 8임)는 아래에 제시되어 있다. 예를 들어, VcMMAE(Mc-vc-PAB-MMAE)는 p-아미노벤질옥시카르보닐("PAB")을 통해 리소좀 절단 가능한 다이펩타이드 발린-시트룰린(vc) 및 티올반응성 말레이미도카프로일 스페이서(MC)에 연결된 MMAE를 사용하여 획득된다.
Ab-(MC-MMAE)p.
Ab-(MC-vc-PAB-MMAE)p.
전형적으로, 펩타이드 기반 약물 모이어티는 2개 이상의 아미노산 및/또는 펩타이드 단편 사이에 펩타이드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. 이러한 펩타이드 결합은 예를 들어 펩타이드 화학 분야에 잘 알려진 액상 합성 방법(E. Schroder and K. Lubke, “The Peptides”volume 1, pp 6-136, 965, cademic ress 참조)에 따라 제조될 수 있다. 아우리스타틴/돌라스타틴 약물 모이어티는 Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784의 방법에 따라 제조될 수 있다.
칼리케아미신
일부 다른 구현예에서, 면역컨쥬게이트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 컨쥬게이트된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 칼리케아미신 계열 항생제는 피코몰 미만 농도에서 이중 가닥 DNA 절단을 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γα2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θ을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체가 컨쥬게이트될 수 있는 또 다른 항종양 약물은 항엽산제인 QFA이다. 칼리케아미신과 QFA는 모두 세포 내 작용 부위를 갖고 있으며 원형질막을 쉽게 통과하지 못한다. 따라서 항체 매개 내재화를 통한 이들 제제의 세포 흡수는 세포 독성 효과를 크게 향상시킨다.
기타 세포독성제
본원에 개시된 바와 같은 항체에 컨쥬게이트될 수 있는 다른 항종양제는 BCNU, 스트렙토조이신(streptozoicin), 빈크리스틴(vincristine) 및 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 미국 특허 5,053,394, 5,770,710에 기술된 집합적으로 LL-E33288 복합체로 알려진 계열의 제제뿐만 아니라 에스페라미신(esperamicins)(미국 특허 5,877,296)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포에 독성을 갖고 세포의 기능을 감소 또는 억제하고/하거나 세포의 파괴를 유발하는 물질을 의미한다. 특정 실시예에서, 물질은 살아있는 유기체로부터 유래된 자연 발생 분자이다. 세포독성제의 예에는 박테리아(예: 디프테리아 독소(Diptheria toxin), 슈도모나스(Pseudomonas) 내독소 및 외독소, 포도구균(Staphylococcal) 장독소 A), 곰팡이(예: α-사르신(α-sarcin), 레스트릭토신(restrictocin)), 식물(예: 아브린(abrin), 리신(ricin), 모데신(modeccin), 비스쿠민(viscumin), 미국자리공(pokeweed) 항-바이러스 단백질, 사포닌(saporin), 젤로닌(gelonin), 모모리딘(momoridin), 트리코산틴(trichosanthin), 보리독소, 유동나무(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴(dianthin) 단백질, 미국자리공(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 (momordica charantia) 억제제, 커신(curcin), 크로틴(crotin), 비누풀(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌(gelonin), 미토겔린(mitogellin), 레스트릭토신(restrictocin), 페노마이신(phenomycin), 네오마이신 (neomycin) 및 트리코테센 (tricothecenes)) 또는 동물 (예: 세포 외 췌장 RNase와 같은 세포 독성 RNase; DNase I, 그 단편 및/또는 변이를 포함함) 소분자 독소 또는 효소 활성 독소가 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
본 개시의 목적을 위해, "화학요법제"는 암 세포의 성장, 증식 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 억제하는 화학적 화합물(예를 들어, 세포독성제 또는 세포증식억제제)을 포함한다. 이러한 화학 물질은 흔히 세포 성장이나 분열에 필요한 세포내 과정에 사용되므로 일반적으로 빠르게 성장하고 분열하는 암세포에 특히 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미세소관을 단량체로 분해하여 세포가 유사분열에 들어가는 것을 억제한다. 일반적으로, 화학요법제는 암성 세포 또는 암이 될 가능성이 있는 세포 또는 종양원성 자손(예를 들어 TIC)을 생성하는 세포를 억제하거나 억제하도록 고안된 모든 화학 제제를 포함할 수 있다. 이러한 제제는 종종 CHOP 또는 FOLFIRI와 같은 요법과 함께 조합하여 투여되며 가장 효과적이다.
본 발명의 항체와 컨쥬게이트될 수 있는 화학요법제의 예는 다음을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 알킬화제(alkylating agents), 알킬 설포네이트(alkyl sulfonates), 아지리딘(aziridines), 에틸렌이민(ethylenimine) 및 메틸라멜라민(methylamelamines), 아세토게닌(acetogenins), 캄프토테신(camptothecin), 브리오스타틴(bryostatin), 칼리스타틴(callystatin), CC-1065, 크립토피신(cryptophycins), 돌라스타틴(dolastatin), 듀오카르마이신(duocarmycin), 엘레우테로빈(eleutherobin), 판크라티스타틴(pancratistatin), 사르코딕틴(sarcodictyin), 스폰지스타틴(spongistatin), 머드타드 질소(nitrogen mustards), 항생제, 에네디인 항생제(enediyne antibiotics), 디네미신(dynemicin), 비스포스포네이트(bisphosphonates), 에스페라마이신(esperamicin), 색소단백질 에네디인 항생 발색단, 아클라시노마이신(aclacinomysins), 악티노마이신(actinomycin), 아우트라마이신(authramycin), 아자세린(azaserine), 블레오마이신(bleomycins), 칵티노마이신(cactinomycin), 카라비신(carabicin), 카르미노마이신(carminomycin), 카르지노필린(carzinophilin), 크로모마이시니스(chromomycinis), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신(detorubicin), 6-디아조-5-옥소-L-노르류신(6-diazo-5-oxo-L-norleucine), 아드리아마이신® 독소루비신 (ADRIAMYCIN®doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 에소루비신(esorubicin), 이다루비신(idarubicin), 마르셀로마이신(marcellomycin), 미토마이신(mitomycins), 미코페놀산(mycophenolic acid), 노갈라마이신(nogalamycin), 올리보마이신(olivomycins), 페플로마이신(peplomycin), 포트피로마이신(potfiromycin), 푸로마이신(puromycin), 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신(rodorubicin), 스트렙토니그린(streptonigrin), 스트렙토조신(streptozocin), 투베르시딘(tubercidin), 유베니멕스(ubenimex), 지노스타틴(zinostatin), 조루비신(zorubicin); 항대사물질, 에를로티닙(erlotinib), 베무라페닙(vemurafenib), 크리조티닙(crizotinib), 소라페닙(sorafenib), 이브루티닙(ibrutinib), 엔잘루타마이드(enzalutamide), 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항부신제, 프롤린산과 같은 엽산 보충제, 아세글라톤(aceglatone), 알도포스파미드 글리코시드(aldophosphamide glycoside), 아미노레불린산(aminolevulinic acid), 에닐루라실(eniluracil), 암사크린(amsacrine), 베스트라부실(bestrabucil), 비산트렌(bisantrene), 에다트락세이트(edatraxate), 데포파민(defofamine), 데메콜신(demecolcine), 디아지쿠온(diaziquone), 엘포르니틴(elfornithine), 엘립티늄 아세테이트(elliptinium acetate), 에포틸론(epothilone), 에토글루시드(etoglucid), 질산갈륨, 하이드록시우레아(hydroxyurea), 렌티난(lentinan), 로니다이닌(lonidainine), 메이탄시노이드(maytansinoids), 미토구아존(mitoguazone), 미톡산트론(mitoxantrone), 모피단몰(mopidanmol), 니트라에린(nitraerine), 펜토스타틴(pentostatin), 페나메트(phenamet), 피라루비신(pirarubicin), 로속산트론(losoxantrone), 포도필린산(podophyllinic acid), 2-에틸히드라지드(2- ethylhydrazide), 프로카바진(procarbazine), PSK® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR), 라족산(razoxane); 리족신(rhizoxin); 시조피란(sizofiran); 스피로게르마늄(spirogermanium); 테누아존산(tenuazonic acid); 트리아지콘(triaziquone); 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민(2,2',2"-trichlorotriethylamine); 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A(verracurin A), 로리딘 A(roridin A) 및 안구이딘 (anguidine)); 우레탄(urethan); 빈데신(vindesine); 다카르바진(dacarbazine); 만노무스틴(mannomustine); 미토브로니톨(mitobronitol); 미토락톨(mitolactol); 피포브로만(pipobroman); 게이시토신(gacytosine); 아라비노사이드(arabinoside) ("Ara-C"); 사이클로포스파미드(cyclophosphamide); 티오테파(thiotepa); 탁소이드(taxoids), 클로란부실(chloranbucil); GEMZAR® 젬시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌(6-thioguanine); 메르캅토퓨린(mercaptopurine); 메토트렉세이트(methotrexate); 백금 유사체, 빈블라스틴(vinblastine); 백금; 에토포시드(etoposide) (VP-16); 이포스파미드(ifosfamide); 미톡산트론(mitoxantrone); 빈크리스틴(vincristine); NAVELBINE® 비노렐빈(NAVELBINE® vinorelbine); 노반트론(novantrone); 테니포시드(teniposide); 에다트렉세이트(edatrexate); 다우노마이신(daunomycin); 아미노프테린(aminopterin); 젤로다(xeloda); 이반드로네이트(ibandronate); 이리노테칸(irinotecan)(캡토사르(Camptosar), CPT-11), 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(difluorometlhylornithine); 레티노이드(retinoids); 카페시타빈(capecitabine); 콤브레타스타틴(combretastatin); 류코보린(leucovorin); 옥살리플라틴(oxaliplatin); 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체. 또한 이 정의에는 항에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 항안드로겐과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항호르몬제 또한 포함되어 있고; 뿐만 아니라 트록사시타빈(troxacitabine)(1,3-디옥솔란 뉴클레오사이드 사이토신(1,3- dioxolane nucleoside cytosine) 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오타이드, VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제와 같은 리보자임; 백신, PROLEUKIN®rIL-2; LURTOTECAN®토포이소머라제 1 억제제; ABARELIX®rmRH; 비노렐빈(Vinorelbine), 에스페라마이신(Esperamicins) 및 이들의 약학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.
사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 이의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬(녹농균 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 유동나무 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 여주 억제제, 커신, 크로틴, 비누풀 억제제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, WO 93/21232 published October 28, 1993 참조.
본 발명은 항체와 핵산분해 활성을 갖는 화합물(예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예컨대 데옥시리보뉴클레아제; DNase) 사이에 형성된 면역컨쥬게이트를 추가로 고려한다.
종양을 선택적으로 파괴하기 위해 ADC는 고방사성 원자를 포함할 수 있다. 방사성컨쥬게이트항체 생산에는 다양한 방사성 동위원소가 이용 가능하다. 예로는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다. 컨쥬게이트가 검출을 위해 사용되는 경우, 이는 신티그래픽 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 요오드-123, 요오드-131, 인듐(indium)-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄(gadolinium), 망간 또는 철과 같은 핵자기 공명(NMR) 영상(자기 공명 영상, MRI로도 알려짐)을 위한 스핀 표지를 포함할 수 있다.
방사성 표지 또는 기타 표지는 공지된 방식으로 컨쥬게이트에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 생합성될 수 있거나, 예를 들어 수소 대신 불소-19를 포함하는 적합한 아미노산 전구체를 사용하여 화학적 아미노산 합성에 의해 합성될 수 있다. tc99m 또는 I123, Re186, Re188 및 In111과 같은 라벨은 펩타이드의 시스테인 잔기를 통해 부착될 수 있다. 이트륨(Yttrium)-90은 라이신 잔기를 통해 부착될 수 있다.
항체와 세포독성제의 컨쥬게이트는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate; SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) (SMCC) 이미노티올란(iminothiolane; IT), 이미도에스테르(imidoesters)의 이중기능성 유도체(예: 디메틸 아디피미데이트 HCl(dimethyl adipimidate HCl)), 활성 에스테르(예: 디숙신이미딜 수베레이트(disuccinimidyl suberate)), 알데하이드(예: 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)), 비스-아지도(bis-azido) 화합물(예: 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민(bis (p-azidobenzoyl) hexanediamine)), 비스-디아조늄(bis-diazonium) 유도체(예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민(bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine)), 디이소시아네이트(diisocyanates)(예: 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 이중활성 불소 화합물(예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠(1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene))와 같은 다양한 이중기능성 단백질 결합제를 사용하여 만들어진다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제 민감성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물 함유 링커가 사용될 수 있다.
약물 로딩
약물 로딩은 p와 DAR로 표시되고, DAR은 일반적인 ADC 공식 Ab-(L-D)p의 분자 내 항체당 약물 모이어티의 평균 수이며, Ab는 본원에 개시된 바와 같은 항-P-카드헤린 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭하고, L은 링커를 나타내며, D는 일반적으로 세포독성제 또는 세포증식억제제를 포함하는 약물 모이어티를 나타내고, p는 Ab 분자에 대한 약물 모이어티의 정수를 나타낸다. 약물 로딩 범위는 항체당 1~20개의 약물 모이어티(D)일 수 있다. ADC에는 1부터 20까지의 다양한 약물 부분과 결합된 항체 컬렉션이 포함된다. 컨쥬게이트 반응으로 인한 ADC 제조에서 항체당 약물 모이어티의 평균 수는 질량 분광학, ELISA 분석 및 HPLC와 같은 기존 수단을 통해 특성화할 수 있다. p에 대한 ADC의 정량적 분포도 결정될 수 있다. 어떤 경우에는 p가 다른 약물 로딩을 포함하는 ADC의 특정 값인 균질 ADC의 분리, 정제 및 특성 분석이 역상 HPLC 또는 전기 영동과 같은 수단을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 W3195-p1-MMAE 컨쥬게이트는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 측정된 DAR이 약 4이다.
일부 항체-약물 컨쥬게이트의 경우, p는 항체의 부착 부위 수에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 부착이 시스테인 티올인 경우, 항체는 단지 하나 또는 여러 개의 시스테인 티올 그룹을 가질 수 있거나, 링커가 부착될 수 있는 충분히 반응성인 티올 그룹을 단지 하나 또는 여러 개 가질 수 있다. 경우에 따라 약물 로딩이 높으면(예: p >5) 특정 항체-약물 컨쥬게이트의 응집, 불용성, 독성 또는 세포 투과성 손실이 발생할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 ADC에 대한 약물 로딩은 1 내지 약 8 범위이고;약 2 내지 약 6; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4; 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.6 내지 약 4.4, 약 3.7 내지 약 4.3, 약 3.8 내지 약 4.2, 또는 약 3.9 내지 약 4.1 범위이다. 일부 실시예에서, ADC는 약 3.5 내지 약 4.5 범위이다. 실제로, 특정 ADC의 경우, 항체당 약물 모이어티의 최적 비율은 8 미만일 수 있고 약 2 내지 약 5일 수 있는 것으로 나타났다. US 2005-0238649 A1(본원에 전체 내용이 참조로 포함됨)을 참조.
특정 구현예에서, 컨쥬게이트 반응 동안 이론적 최대치보다 적은 수의 약물 모이어티가 항체에 컨쥬게이트된다. 항체는 예를 들어 약물-링커 중간체 또는 링커 시약과 반응하지 않는 리신 잔기를 함유할 수 있다. 일반적으로 항체는 약물 부분에 연결될 수 있는 유리 반응성 시스테인 티올 그룹을 많이 포함하지 않으며; 실제로 항체의 대부분의 시스테인 티올 잔기는 이황화물 다리로 존재한다. 특정 구현예에서, 항체는 부분 또는 전체 환원 조건 하에 디티오트레이톨(dithiothreitol)(DTT) 또는 트리카르보닐에틸포스핀(tricarbonylethylphosphine)(TCEP)과 같은 환원제로 환원되어 반응성 시스테인 티올 기를 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 개시된 항체는 변성 조건에 적용되어 리신 또는 시스테인과 같은 반응성 친핵성 기를 드러낸다.
ADC의 로딩(약물/항체 비율)은 다음과 같은 다양한 방법으로 제어할 수 있다: (i) 항체에 비해 약물-링커 중간체 또는 링커 시약의 몰 과량을 제한, (ii) 컨쥬게이트 반응 시간 또는 온도를 제한, (iii) 시스테인 티올 변형을 위한 부분적 또는 제한적 환원 조건, (iv) 링커-약물 부착의 수 및/또는 위치를 제어하기 위해 시스테인 잔기의 수와 위치가 변형되도록 재조합 기술에 의해 항체의 아미노산 서열을 조작(예를 들어, 본원 및 WO2006/034488(본원에 전문이 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 제조된 thioMab 또는 thioFab).
하나 이상의 친핵성기가 약물-링커 중간체 또는 링커 시약에 이어 약물 모이티어 시약과 반응하는 경우, 결과물은 항체에 부착된 하나 이상의 약물 모이티어가 분포된 ADC 화합물의 혼합물이라는 것을 이해되어야 한다. 항체당 약물의 평균 수는 항체에 특이적이며 약물에 특이적인 이중 ELISA 항체 검정을 통해 혼합물로부터 계산할 수 있다. 개별 ADC 분자는 혼합물에서 질량 분광학으로 식별하고 HPLC, 예를 들어, 소수성 상호작용 크로마토그래피로 분리할 수 있다 (Hamblett, K.J., et al. "Effect of drug loading on the pharmacology, pharmacokinetics, and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate," Abstract No. 624, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004; Alley, S.C., et al. "Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates," Abstract No. 627, American Association for Cancer Research, 2004 Annual Meeting, March 27-31, 2004, Proceedings of the AACR, Volume 45, March 2004 참조).
항체 약물 컨쥬게이트의 제조
본원에 개시된 항체 약물 컨쥬게이트(ADC)에서, 항-P-카드헤린 항체(Ab) 또는 이의 항원 결합 부분은 하나 이상의 약물 모이어티(D)에 컨쥬게이트되며, 예를 들어 항체당 약 1 내지 약 20개의 약물 모이어티, 항체당 약 1 내지 약 10개의 약물 모이어티, 항체당 약 1 내지 약 8개의 약물 모이어티, 항체당 약 1 내지 약 5개의 약물 모이어티, 항체당 약 1 내지 약 4개의 약물 모이어티, 항체당 약 1 내지 약 3개의 약물 모이어티, 또는 항체당 약 1 내지 약 2개의 약물 모이어티에 링커(L)를 통해 컨쥬게이트된다. 항체당 약물 모이어티의 수는 일반적으로 항체 약물 컨쥬게이트 집단의 모든 컨쥬게이트에 대한 평균 수이기 때문에, 항체당 약물 모이어티의 수는 정수가 아닐 수 있다.
ADC는 다음을 포함하여 당업자에게 공지된 유기 화학 반응, 조건 및 시약을 사용하는 여러 경로에 의해 제조될 수 있다: (1) 공유 결합을 통해 항체의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응으로 Ab-L을 형성한 후 약물 모이어티 D와의 반응; 및 (2) 공유 결합을 통해 약물 모이어티의 친핵성 기와 2가 링커 시약의 반응으로 D-L을 형성한 후 항체의 친핵성 기와 반응. 일부 구현예에서, MC-VC-PAB와 연결된 MMAE 약물 모이어티(즉, MC-VC-PAB-MMAE)는 상업적으로 이용 가능하며(Lenena, biopharma) 항체와의 컨쥬게이트를 위해 직접 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 링커는 하나 이상의 링커 구성요소로 구성될 수 있다. 예시적인 링커 성분에는 6-말레이미도카프로일("MC"), 말레이미도프로파노일("MP"), 발린-시트룰린("val-cit" 또는 "vc"), 알라닌-페닐알라닌("ala-phe"), p-아미노벤질옥시카르보닐(" "PAB"), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트("SPP"), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1 카르복실레이트("SMCC') 및 N-숙신이미딜(4-요오도) -아세틸)아미노벤조에이트("SIAB")가 포함된다. 일부 구현예에서, 링커는 MC-vc-PAB이다. 추가적인 링커 구성요소는 당업계에 알려져 있으며 일부는 본 명세서에 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 링커는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 예시적인 아미노산 링커 성분에는 다이펩타이드, 트리펩타이드, 테트라펩타이드 또는 펜타펩타이드가 포함된다. 예시적인 다이펩타이드에는 발린-시트룰린(vc 또는 val-cit), 알라닌-페닐알라닌(af 또는 ala-phe)이 포함된다. 예시적인 트리펩타이드에는 글리신-발린-시트룰린(gly-val-cit) 및 글리신-글리신-글리신(gly-gly-gly)이 포함된다. 아미노산 링커 성분을 구성하는 아미노산 잔기에는 천연 발생 잔기뿐만 아니라 소수 아미노산 및 비천연 발생 아미노산 유사체(예: 시트룰린)도 포함된다. 아미노산 링커 성분은 특정 효소, 예를 들어 종양 관련 프로테아제, 카텝신 B, C 및 D, 또는 플라스민 프로테아제에 의한 효소 절단에 대한 선택성에 있어서 설계되고 최적화될 수 있다.
항체의 친핵성 그룹에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다: (i) N-말단 아민 그룹, (ii) 사이드체인 아민 그룹, 예를 들어 라이신, (iii) 사이드체인 티올 그룹, 예를 들어 시스테인, 및 (iv) 항체가 글리코실화된 당 수산기 또는 아미노기. 아민, 티올 및 하이드록실 그룹은 친핵성이며 다음과 같은 링커 모이어티 및 링커 시약의 친전자성 그룹과 반응하여 공유 결합을 형성할 수 있다: (i) NHS 에스테르, HOBt 에스테르, 할로포르메이트 및 산 할로겐화물과 같은 활성 에스테르; (ii) 할로아세트아미드와 같은 알킬 및 벤질 할라이드; (iii) 알데히드, 케톤, 카르복실 및 말레이미드 그룹. 특정 항체에는 환원 가능한 사슬 간 이황화물, 즉 시스테인 다리가 존재한다. 항체는 TCEP와 같은 환원제를 처리하여 링커 시약과의 컨쥬게이트에 대해 반응성이 있게 만들 수 있다. 따라서 각 시스테인 가교는 이론적으로 두 개의 반응성 티올 친핵체를 형성한다.
본 발명의 항체 약물 컨쥬게이트는 또한 링커 시약 또는 약물 상의 친핵성 치환체와 반응할 수 있는 친전자성 모이어티를 도입하기 위해 항체를 변형함으로써 생산될 수 있다.
링커-약물 모이어티를 항체, 면역글로불린 또는 이의 단편과 같은 세포 표적 단백질에 컨쥬게이트시키는 방법은 예를 들어 WO2006/034488(본원에 참고로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 대안적으로, 항체 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은 예를 들어 재조합 기술 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. DNA의 길이는 서로 인접하거나 컨쥬게이트의 원하는 특성을 파괴하지 않는 링커 펩타이드를 코딩하는 영역에 의해 단리된 컨쥬게이트의 두 부분을 코딩하는 각각의 영역을 포함할 수 있다.
실시예에 예시된 바와 같이, 본원에 개시된 항-P-카드헤린 항체는 TCEP로 환원시킨 후 상업적으로 구입한 MC-vc-PAB-MMAE, 즉 이미 약물 모이어티에 연결된 링커와 컨쥬게이트시킴으로써 제조될 수 있다.
특정 특성을 지닌 항-P-카드헤린 ADC
본 발명의 ADC는 특정한 기능적 특징 또는 특성을 특징으로 한다. 항체와 ADC의 시험관 내 및 생체 내 기능적 특성과 약리학적 활성은 표적에 대한 작용 메커니즘에 따라 분자 및 세포 수준에서 완전히 평가되었다. 본 명세서에 개시된 ADC는 다음 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
(a) nM 등급의 EC50으로 세포 표면 인간 P-카드헤린 발현 세포에 결합 (예를 들어, 1nM 이하, 0.5nM 이하, 0.3nM 이하, 0.2nM 이하, 0.1nM 이하, 0.09nM 이하, 0.08nM 이하), FACS에 의해 측정됨;
(b) 벤치마크 ADC에 필적하는 우수한 내재화 능력을 가짐;
(c) 적어도 14일 동안 혈청에서 안정함;
(d) 벤치마크 ADC와 비교하여 인간 P-카드헤린 발현 세포에 대해 더 나은 세포독성 효과를 나타내고, P-카드헤린 저발현 세포 또는 정상 세포에 대한 사멸 효과가 없음을 나타냄;
(e) FACS 친화도 테스트로 측정한 결과 벤치마크 ADC와 비교하여 인간 P-카드헤린에 대한 더 나은 결합을 나타냄;
(f) 벤치마크 ADC와 대조적으로 P-카드헤린의 발현이 낮은 인간 세포주에 대한 비특이적 결합을 나타내지 않음; 및
(g) 벤치마크 ADC와 비교하여 생체내 종양 모델에서 훨씬 더 나은 종양 억제 및 우수한 용량 의존적 항종양 효과를 나타냄.
약제학적 조성물
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 본원에 개시된 항-P-카드헤린 ADC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
조성물의 구성 요소
약제학적 조성물은 임의로 하나 이상의 추가적인 약제학적 활성 성분, 예를 들어 또 다른 항체 또는 약물을 함유할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 항-P-카데린 항체가 백신에 대한 면역 반응을 향상시키도록, 예를 들어 다른 면역 자극제, 항암제, 항바이러스제 또는 백신과의 병용 요법으로 투여될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 매체, 비수성 매체, 항균제, 등장성 제제, 완충제, 항산화제, 마취제, 현탁/분산제, 킬레이트제, 희석제, 보조제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 기타 당업자에게 알려진 다양한 성분 이상의 조합을 포함할 수 있다.
적합한 성분에는 예를 들어 항산화제, 충전제, 결합제, 붕해제, 완충제, 방부제, 윤활제, 향미제, 증점제, 착색제, 유화제 또는 설탕 및 사이클로덱스트린(cyclodextrin)과 같은 안정제가 포함될 수 있다. 적합한 항산화제에는 예를 들어 메티오닌, 아스코르브산, EDTA, 티오황산나트륨, 백금, 카탈라아제, 시트르산, 시스테인, 메르캅토 글리세롤(mercapto glycerol), 티오글리콜산(thioglycolic acid), 머캅토 소르비톨(Mercapto sorbitol), 부틸 메틸 아니솔(butyl methyl anisole), 부틸레이트된 하이드록시 톨루엔(butylated hydroxy toluene) 및/또는 프로필갈락트(propylgalacte)가 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 ADC 및 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 ADC가 메티오닌과 같은 하나 이상의 항산화제와 혼합되어 ADC가 산화되는 것을 방지하고, 그의 유효 기간을 연장하고/하거나 활성을 증가시킬 수 있는 다양한 방법을 제공한다.
추가로 예시하기 위해, 제약상 허용되는 담체는 다음을 포함할 수 있다: 예를 들어, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 등장성 포도당 주사, 멸균수 주사, 또는 포도당 및 젖산 링거 주사와 같은 수성 비히클, 식물성 고정유, 면실유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩기름과 같은 비수성 매개체, 정균(bacteriostatic) 또는 진균(fungistatic ) 농도의 항균제, 염화나트륨 또는 포도당과 같은 등장화제, 인산염 또는 구연산염 완충제와 같은 완충제, 황산수소나트륨과 같은 항산화제, 프로카인 염산염과 같은 국소 마취제, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨 (sodium carboxymethylcelluose), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(hydroxypropyl methylcellulose), 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 현탁 및 분산제, 폴리소르베이트 80(TWEEN-80)과 같은 유화제, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid)) 또는 EGTA(에틸렌 글리콜 테트라아세트산(ethylene glycol tetraacetic acid)), 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 수산화나트륨, 염산, 구연산 또는 젖산과 같은 격리 또는 킬레이트제. 담체로 사용되는 항미생물제는 페놀 또는 크레졸, 수은, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살(thimerosal), 염화벤잘코늄 및 염화벤제토늄을 포함하는 다회 용량 용기의 약제학적 조성물에 첨가될 수 있다. 적합한 부형제에는 예를 들어 물, 식염수, 포도당, 글리세롤 또는 에탄올이 포함될 수 있다. 적합한 무독성 보조 물질에는 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 안정제, 용해도 향상제, 또는 아세트산 나트륨, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트 또는 사이클로덱스트린과 같은 제제가 포함될 수 있다.
투여, 제제 및 투여량
본 발명의 약제학적 조성물은 경구(oral), 정맥(intravenous), 동맥 내(intra-arterial), 피하(subcutaneous), 비경구(parenteral), 비강 내(intranasal), 근육 내(intramuscular), 두개강 내(intracranial), 심장 내(intracardiac), 심실 내(intraventricular), 기관 내(intratracheal), 구강 내( buccal), 직장 내(rectal), 복강 내(intraperitoneal) 피내(intradermal), 국소(topical), 경피(transdermal), 및 척수(intrathecal) 내를 포함하되 이에 제한되지 않는 다양한 경로를 통해 생체 내에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하거나, 이식 또는 흡입을 통해 투여할 수 있다. 대상 조성물은 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제제화될 수 있으며; 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸을 포함하되 이에 국한되지 않는다. 적절한 제형 및 투여 경로는 의도된 적용 및 치료 요법에 따라 선택될 수 있다.
장내 투여에 적합한 제제에는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅된 정제를 포함한 정제, 엘릭서(elixirs), 현탁액, 시럽 또는 흡입제 및 이들의 서방형 제제가 포함된다.
비경구 투여(예: 주사)에 적합한 제제에는 활성 성분이 용해되거나 현탁되거나 달리 제공되는 수성 또는 비수성, 등장성, 발열원이 없는 멸균 액체(예: 용액, 현탁액)가 포함된다. 상기 액체는 항산화제, 완충제, 보존제, 안정제, 정균제, 현탁화제, 증점제 및 제형을 수취인의 혈액(또는 기타 관련 체액) 및 등장성으로 만드는 용질과 같은 기타 약제학적으로 허용되는 성분을 추가로 포함할 수 있다. 부형제의 예에는 물, 알코올, 폴리올, 글리세롤, 식물성 오일 등이 포함된다. 이러한 제제에 사용하기에 적합한 등장성 담체의 예에는 염화나트륨 주사액, 링거액 또는 젖산 링거 주사액이 포함된다. 마찬가지로, 용량, 시기 및 반복을 포함한 특정 투여 요법은 특정 개인과 해당 개인의 병력뿐만 아니라 약동학(예: 반감기, 제거율 등)과 같은 경험적 고려사항에 따라 달라질 것이다.
투여 빈도는 치료 과정 전반에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있으며, 증식성 또는 종양성 세포의 수 감소, 상기 신생물 세포의 감소 유지, 신생물 세포의 증식 감소 또는 전이 진행 지연을 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여되는 투여량은 잠재적인 부작용 및/또는 독성을 관리하기 위해 조정되거나 약화될 수 있다. 대안적으로, 대상 치료 조성물의 지속적인 서방 제제가 적절할 수 있다.
적절한 투여량은 환자마다 다를 수 있음이 당업자라면 이해할 수 있을 것이다. 최적의 용량을 결정할 때는 일반적으로 치료 효과와 위험 또는 유해한 부작용의 균형을 맞추는 것이 포함된다. 선택된 투여량은 특정 화합물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 화합물의 배설 속도, 치료 기간, 함께 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 질환의 중증도, 환자의 종, 성별, 나이, 체중, 상태, 일반 건강 및 이전 병력 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 화합물의 양과 투여 경로는 궁극적으로 의사, 수의사 또는 임상의의 재량에 따라 결정되지만, 일반적으로 상당한 유해하거나 해로운 부작용을 일으키지 않으면서 원하는 효과를 얻을 수 있는 작용 부위의 국소 농도를 달성하기 위해 투여량이 선택된다.
일반적으로, 본 발명의 ADC는 다양한 범위로 투여될 수 있다. 상기 범위는 용량당 약 5μg/kg 체중 내지 약 100mg/kg 체중; 용량당 약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중; 용량당 약 100μg/kg 체중 내지 약 10mg/kg 체중을 포함한다. 다른 범위로는 용량당 약 100μg/kg 체중 내지 약 20mg/kg 체중 및 용량당 약 0.5mg/kg 체중 내지 약 20mg/kg 체중이 포함된다. 특정 구현예에서, 투여량은 적어도 약 100 μg/kg 체중, 적어도 약 250 μg/kg 체중, 적어도 약 750 μg/kg 체중, 적어도 약 3 mg/kg 체중, 적어도 약 5 mg/kg 체중, 적어도 약 10 mg/kg 체중이다.
어떤 경우든, 본 발명의 ADC는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상에게 필요에 따라 투여된다. 투여 빈도의 결정은 주치의와 같은 당업자가 치료 중인 상태, 치료 대상자의 연령, 치료 중인 상태의 중증도, 치료 대상자의 일반적인 건강 상태 등을 고려하여 결정할 수 있다.
특정 바람직한 실시예에서, 본 발명의 ADC를 포함하는 치료 과정은 수주 또는 수개월에 걸쳐 선택된 의약품의 복수의 투여를 포함할 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 ADC는 매일 1회, 2일마다, 4일마다, 매주, 10일마다, 2주마다, 3주마다, 매월, 6주마다, 2개월마다, 10주마다 또는 3개월마다 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 투여량은 환자 반응 및 임상 실습에 기초하여 변경되거나 간격이 조정될 수 있음이 이해될 것이다.
투여량 및 요법은 또한 1회 이상의 투여(들)가 제공된 개체에서 개시된 치료 조성물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조된 치료용 조성물을 개인에게 점진적으로 투여할 수 있다. 선택된 구현예에서, 투여량은 경험적으로 결정되거나 관찰된 부작용 또는 독성에 기초하여 각각 점진적으로 증가하거나 감소하거나 약화될 수 있다. 선택한 조성물의 효능을 평가하기 위해 앞서 설명한 대로 특정 질병, 장애 또는 상태의 마커를 추적할 수 있다. 암의 경우, 촉진 또는 육안 관찰을 통한 종양 크기의 직접 측정, 엑스레이 또는 기타 영상 기술을 통한 종양 크기의 간접 측정이 포함되고; 직접 종양 생검 및 종양 샘플의 현미경 검사로 평가한 개선, 간접 종양 마커의 측정(예:, 전립선암의 경우 PSA) 또는 본원에 기술된 방법에 따라 확인된 종양형성 항원의 측정, 통증 또는 마비의 감소; 종양과 관련된 언어, 시각, 호흡 또는 기타 장애의 개선, 식욕 증가 또는 공인된 검사로 측정한 삶의 질 향상 또는 생존 연장이 포함된다. 투여량은 개인, 종양 질환의 유형, 종양 질환의 단계, 종양 질환이 개인의 다른 부위로 전이되기 시작했는지 여부, 과거 및 동시 사용 중인 치료법에 따라 달라질 것임은 당업자에게 명백할 것이다.
비경구 투여(예를 들어, 정맥내 주사)에 적합한 제제는 약 10μg/ml 내지 약 100mg/ml의 농도로 본원에 개시된 ADC를 포함할 것이다. 특정한 선택된 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분의 농도는 20 μg/ml, 40 μg/ml, 60 μg/ml, 80 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml, 300 μg/ml, μg/ml, 400μg/ml, 500μg/ml, 600μg/ml, 700μg/ml, 800μg/ml, 900μg/ml 또는 1mg/ml을 포함할 것이다. 다른 바람직한 실시 형태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 농도는 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, 12mg/ml, 14mg/ml, 16mg/ml, 18mg/ml, 20mg/ml, 25mg/ml, 30mg/ml, 35mg/ml, 40mg/ml, 45mg /ml, 50mg/ml, 60mg/ml, 70mg/ml, 80mg/ml, 90mg/ml 또는 100mg/ml을 포함할 것이다.
공개사항의 적용
본 개시내용의 ADC, ADC 조성물 및 방법은 예를 들어 면역 반응의 강화 및 표적화된 세포독성 효과를 포함하는 수많은 시험관내 및 생체내 유용성을 갖는다. 예를 들어, 이들 분자는 세포 성장(예를 들어 높은 P-카드헤린 발현을 갖는 세포)을 사멸하거나 억제하기 위해 시험관내 또는 생체외에서 배양 중인 P-카드헤린 발현 세포에, 또는 인간 대상체(예를 들어 생체내)에 투여될 수 있다. P-카드헤린에 대한 면역 반응은 또한 강화, 자극 또는 상향 조절 등으로 조절될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체에는 P-카드헤린 관련 면역 반응과 같은 면역 반응의 강화가 필요한 인간 환자가 포함된다. 일부 구현예에서, 대상체는 P-카드헤린 관련 암, 예를 들어 P-카드헤린의 과발현을 특징으로 하는 암의 치료가 필요하다. 일부 구현예에서, 방법은 생체내 암, 특히 P-카드헤린 관련 암의 치료에 특히 적합하다.
암을 포함한 질병의 치료
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 개시내용은 치료가 필요한 대상체 (예를 들어, 인간)에게 치료 유효량의 본원에 개시된 ADC를 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 장애 또는 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 장애 또는 질병은 암일 수 있다.
악성이든 양성이든, 원발성이든 이차성이든, P-카드헤린과 관련된 다양한 암은 본 개시내용에 제공된 방법으로 치료 또는 예방될 수 있다. 암은 고형암 또는 혈액학적 악성종양일 수 있다. 이러한 암의 예에는 기관지성 암종(예를 들어, 비소세포 폐암, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 암종 및 선암종), 폐포 세포 암종, 기관지 선종, 연골종성 과오종(비암성), 및 육종(암성)과 같은 폐암; 점액종, 섬유종, 횡문근종과 같은 심장암; 골연골종, 콘드로종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골성 골종, 거대 세포 종양, 연골육종, 다발성 골수종, 골육종, 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 유잉 종양(유잉 육종) 및 세망 세포 육종과 같은 골암; 신경교종(예: 다형성 교모세포종), 역형성성 성상세포종, 성상세포종, 희돌기아교종, 수모세포종, 척색종, 신경초종, 뇌수막종, 뇌하수체 선종, 송과체종, 골종, 혈관모세포종, 두개인두종, 척삭종, 생식선종, 기형종, 유피 낭종, 혈관종과 같은 뇌암; 대장암, 평활근종, 표피양암종, 선암종, 평활근육종, 위 선암종, 장 지방종, 장 신경섬유종, 장 섬유종, 대장 폴립 및 대장암과 같은 소화기계 암; 간세포 선종, 혈관종, 간세포 암종, 섬유층판 암종, 담관암종, 간모세포종 및 혈관육종과 같은 간암; 신장 선암종, 신장 세포 암종, 신장종, 및 신우의 이행 세포 암종과 같은 신장암; 방광암; 급성 림프구성(림프구성) 백혈병, 급성 골수성(골수성, 골수성, 골수모세포, 골수단구성) 백혈병, 만성 림프성 백혈병(예: 세자리 증후군 및 털세포 백혈병), 만성 골수성(골수성, 골수성, 과립구) 백혈병, 호지킨 림프종, 비- 호지킨 림프종, B 세포 림프종, 균상식육종 및 골수증식성 장애(진성적혈구증가증, 골수섬유증, 혈소판증가증 및 만성 골수성 백혈병과 같은 골수증식성 장애 포함)과 같은 혈액암; 기저 세포 암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 카포시 육종 및 파제트병과 같은 피부암; 두경부암; 망막모세포종 및 눈내 흑색암종과 같은 눈 관련 암; 양성 전립선 비대증, 전립선암 및 고환암(예를 들어, 정상피종, 기형종, 배아 암종 및 융모막암종)과 같은 남성 생식기 암; 유방암; 자궁암(자궁내막암종), 자궁경부암(자궁경부암종), 난소암(난소암종), 외음부암종, 질암종, 나팔관암, 포상기태 등의 여성 생식기암; 갑상선암(유두암, 여포암, 역형성암 또는 수질암 포함); 갈색세포종(부신); 부갑상선의 비암성 성장; 췌장암; 및 백혈병, 골수종, 비호지킨 림프종, 및 호지킨 림프종과 같은 혈액암이 있다. 일부 구현예에서, 암은 P-카드헤린 양성 고형 종양이다. 일부 구체적인 구현예에서, 암은 유방암이다. 일부 다른 구현예에서, 암은 결장직장암, 전립선암 또는 NSCLC이다.
일부 구현예에서, 암의 예는 B 세포 림프종(저등급/여포성 비호지킨 림프종(NHL); 소림프구(SL) NHL; 중간 등급/소포성 NHL;중간 등급 확산 NHL; 고급 면역아세포성 NHL; 고급 림프구성 NHL; 고급 소형 비절단 세포 NHL; 부피가 큰 질병 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS 관련 림프종; 및 Waldenstrom의 마크로글로불린혈증; 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프구성 백혈병(ALL); 모상세포백혈병; 만성 골수성 백혈병; 이식 후 림프 증식 장애(PTLD)뿐만 아니라 파코마토시스와 관련된 비정상적인 혈관 증식, 부종(예: 뇌종양과 관련된 부종), B 세포 증식 장애 및 메이그스 증후군)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 보다 구체적인 예에는 재발성 또는 불응성 NHL, 최전선 저급 NHL, III/IV기 NHL, 화학요법 저항성 NHL,전구체 B 림프구성 백혈병 및/또는 림프종, 소림프구성 림프종, B세포 만성 림프구성 백혈병 및/또는 전림프구성 백혈병 및/또는 소림프구성 림프종, B세포 전림프구성 림프종, 면역세포종 및/또는 림프형질구성 림프종, 림프형질세포성 림프종, 변연부 B세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 림프절외 변연부-MALT 림프종, 결절 변연부 림프종, 모상 세포 백혈병, 형질세포종 및/또는 형질세포 골수종, 저등급/여포성 림프종, 중간 등급/여포성 NHL, 맨틀 세포 림프종, 여포 중심 림프종 (여포성), 중급 확산 NHL, 미만성 거대 B세포 림프종, 공격적인 NHL(공격적인 최전선 NHL 및 공격적인 재발 NHL 포함), 자가 줄기 세포 이식 후 NHL 재발 또는 난치성, 원발성 종격동 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 고급 면역아세포성 NHL, 고급 림프구성 NHL, 고급 소형 비절단 세포 NHL, 부피가 큰 질병 NHL, 버킷 림프종, 전구체(말초) 거대 과립형 림프구성 백혈병, 균상 식육종 및/또는 세자리 증후군, 피부(피부) 림프종, 역형성 대세포 림프종,혈관중심성 림프종이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 구현예에서, 암의 예는 림프종(예: B세포 비호지킨 림프종(NHL)) 및 림프구성 백혈병을 추가로 포함하지만 이에 제한되지 않는 B세포 증식성 장애를 추가적으로 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 상기 림프종 및 림프구성 백혈병에는 예를 들어 다음이 포함된다: a) 여포성 림프종(follicular lymphomas), b) 소형 비절단 세포 림프종/버킷 림프종(풍토성 버킷 림프종, 산발성 버킷 림프종 및 비-버킷 림프종을 포함함), c) 변연부 림프종(marginal zone lymphomas) (결절외 변연부 B 세포 림프종(점막 관련 림프 조직 림프종, MALT), 결절 변연부 B 세포 림프종 및 비장 변연부 림프종을 포함함), d) 맨틀 세포 림프종(Mantle cell lymphoma) (MCL), e) 거대 세포 림프종(Large Cell Lymphoma)(미만성거대B세포 림프종(B-cell diffuse large cell lymphoma)(DLCL), 미만성 혼합 세포 림프종, 면역모세포 림프종, 원발성 종격동 B세포 림프종(Primary Mediastinal B-Cell Lymphoma), 혈관중심성 림프종-폐 B세포 림프종(Angiocentric Lymphoma- Pulmonary B-Cell Lymphoma)을 포함함), f) 모발상 세포 백혈병 (hairy cell leukemia), g) 림프구성 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), h) 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL)/소림프구성 림프종(SLL), B 세포 전림프구성 백혈병, i) 플라즈마 세포 신생물, 형질세포 골수종, 다발성 골수종, 형질세포종, 및/또는 j) 호지킨병(Hodgkin's disease).
본원에 개시된 ADC는 단독 요법으로 단독으로 사용될 수 있거나, 화학 요법, 방사선 요법, 기타 표적 요법 또는 세포 면역요법 등과 병용하여 사용될 수 있다.
병용 요법
본원에 개시된 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 항암 특성을 갖는 적어도 하나의 추가 화합물과 함께 약제학적 병용 제제 또는 병용 요법으로서의 투여 요법으로 병용될 수 있다. 약제학적 병용 제제 또는 투여 요법의 적어도 하나의 추가 화합물은 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않도록 조합의 ADC에 대해 보완적인 활성을 갖는다.
적어도 하나의 추가 화합물은 화학요법제, 세포독성제, 사이토카인, 성장 억제제, 항호르몬제 및/또는 심장보호제일 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 ADC를 함유하는 약제학적 조성물은 또한 튜불린 형성 억제제, 토포이소머라제 억제제 또는 DNA 결합제와 같은 화학요법제의 치료 유효량을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 화합물은 본 발명의 항-P-카드헤린 ADC이고, 적어도 하나의 추가 화합물은 항-P-카드헤린 항체 또는 ADC 이외의 치료 항체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 화합물은 트라스투주맙(trastuzumab) 또는 페르투주맙(pertuzumab)과 같은 항-HER2 항체이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 화합물은 P-카드헤린을 발현하는 조직에서 세포 증식성 질환을 치료하는데 효과적인 항체(네이키드 항체 또는 ADC)이다.
다른 치료 요법은 방사선 요법 및/또는 골수 및 말초 혈액 이식 및/또는 세포 독성 제제, 화학요법제 또는 성장 억제제를 포함하되 이에 제한되지 않는 본 발명에 따라 확인된 항암제의 투여와 병용될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 화학요법제는 예를 들어, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 히드록시다우노루비신(hydroxydaunorubicin), 아드리아마이신(adriamycin), 독소루빈신(doxorubincin), 빈크리스틴(vincristine)(OncovinTM), 프레드니솔론(prednisolone), CHOP, CVP 또는 COP와 같은 제제 또는 제제의 조합, 또는 항-PSCA, 항-HER2(예: 허셉틴®(Herceptin®), 옴니탁TM(OmnitargTM)) 또는 항-VEGF(예: 아바스틴(Avastin®))과 같은 면역치료제이다. 병용 요법은 동시 또는 순차적 요법으로 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합물은 2회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 병용 투여에는 별도의 제제 또는 단일 약제학적 제제를 사용하는 공동 투여, 및 어느 순서로든 연속 투여가 포함되며, 두 가지(또는 모든) 활성 약제가 동시에 생물학적 활성을 발휘하는 기간이 있는 것이 바람직하다.
일 구현예에서, ADC를 이용한 치료는 본원에서 확인된 항암제, 및 하나 이상의 화학요법제 또는 성장 억제제의 병용 투여를 포함하며, 이는 상이한 화학요법제의 칵테일의 공동 투여를 포함한다. 화학요법제에는 탁산(taxanes)(예: 파클리탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)) 및/또는 안트라사이클린(anthracycline) 항생제가 포함된다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조사의 지시에 따라 또는 숙련된 의사에 의해 경험적으로 결정된 대로 사용될 수 있다. 상기 화학요법의 준비 및 투약 일정은 “Chemotherapy Service", (1992) Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md.에도 설명되어 있다.
상기 병용 투여 약제에 대한 적절한 용량은 현재 사용 중인 약제이며, 새로 확인된 약제와 다른 화학요법제 또는 치료제의 병용 작용(시너지 효과)으로 인해 용량이 낮아질 수 있다.
병용 요법은 "시너지"를 제공하고 "시너지"를 입증할 수 있으며, 즉, 활성 성분을 함께 사용할 때 달성되는 효과는 화합물을 별도로 사용하여 발생하는 효과의 합보다 크다. 활성 성분이 다음과 같을 때 시너지 효과를 얻을 수 있다: (1) 결합된 단위 투여량 제형으로 공동 제형화되어 동시에 투여 또는 전달될 때;(2) 별도의 제형으로 교대로 또는 병행하여 전달될 때; 또는(3) 다른 요법에 의해. 대체 요법으로 전달되는 경우, 화합물을 예를 들어, 별도의 주사기로 서로 다른 주사를 통해, 순차적으로 투여하거나 전달할 때 시너지 효과를 얻을 수 있다. 일반적으로 대체 요법에서는 각 활성 성분의 유효 용량을 순차적으로, 즉 연속적으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는 두 가지 이상의 활성 성분을 함께 투여한다.
약제학적 팩 및 키트
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 기재된 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제조품 또는 "키트"가 제공된다. 제조품은 용기 및 용기 상에 있거나 용기와 연관된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 블리스터 팩 등이 포함된다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 재료로 만들어질 수 있다. 용기는 상태를 치료하는 데 효과적인 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 조성물을 담으며 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥 주사 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 ADC이다. 라벨 또는 패키지 삽입물에는 해당 조성물이 암과 같은 선택된 질환을 치료하는 데 사용된다는 내용이 개시되어 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 제조품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 정균 주사용수(BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 및 포도당 용액을 포함하는 두 번째(또는 세 번째) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
하나 이상의 ADC 용량을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 제약 팩 및 키트도 제공된다. 특정 구현예에서, 단위 용량이 제공되며, 단위용량은 예를 들어 하나 이상의 추가 약제를 포함하거나 포함하지 않는 ADC를 포함하는 미리 결정된 양의 조성물을 포함한다. 다른 구현예의 경우, 이러한 단위 용량은 일회용 사전 충전형 주사용 주사기로 공급된다. 또 다른 구현예에서, 단위 투여량에 포함된 조성물은 식염수, 수크로오스 등을 포함하거나; 인산염 등과 같은 완충제를 포함하거나; 안정적이고 효과적인 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 대안적으로, 특정 구현예에서, 컨쥬게이트 조성물은 적절한 액체, 예를 들어 멸균수 또는 식염수를 첨가하여 재구성될 수 있는 동결건조된 분말로 제공될 수 있다. 특정 바람직한 구현예에서, 조성물은 수크로스 및 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 응집을 억제하는 하나 이상의 물질을 포함한다. 용기(들) 상의 또는 이와 연관된 임의의 라벨은 동봉된 컨쥬게이트 조성물이 선택된 종양 질환의 치료에 사용됨을 나타낸다.
본 발명은 또한 부위-특이적 컨쥬게이트의 단일 용량 또는 다중 용량 투여 단위 및 선택적으로 하나 이상의 항암제를 생산하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 컨테이너 및 컨테이너에 부착되거나 컨테이너와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있으며, 컨쥬게이트 또는 비컨쥬게이트 형태의 개시된 컨쥬게이트의 약제학적 유효량을 함유할 수 있다. 다른 바람직한 실시예에서, 용기(들)는 멸균 접근 포트를 포함한다 (예를 들어, 용기는 정맥 주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖춘 바이알일 수 있다). 상기 키트는 일반적으로 이러한 키트는 조작된 컨쥬게이트의 약제학적으로 허용되는 제제를 적합한 용기에 함유하고, 선택적으로, 하나 이상의 동일하거나 다른 용기에 들어 있는 하나 이상의 항암제를 포함한다. 키트에는 진단 또는 병용 요법을 위한 기타 약학적으로 허용되는 제제가 포함될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 ADC에 더하여, 상기 키트는 화학요법제 또는 방사선요법제 약물과 같은 다양한 항암제 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있고; 항혈관신생제; 항전이제; 표적항암제; 세포독성제; 및/또는 기타 항암제를 포함한다.
키트의 구성요소가 하나 이상의 액체 용액으로 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액이고, 특히, 멸균 수성 또는 식염수 용액이 바람직하다. 다만, 키트의 구성성분은 건조분말 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 분말로 제공되는 경우, 적합한 용매를 첨가하여 분말을 재구성할 수 있다. 용매는 또한, 다른 용기에 담아 제공될 수 있다.
위에서 간략히 설명한 바와 같이, 키트에는 ADC 및 임의의 선택적 구성요소를 환자에게 투여하는 수단, 예를 들어, 하나 이상의 바늘, 정맥주사백 또는 주사기, 점안제, 피펫 또는 심지어 점안기, 피펫, 또는 제제가 동물에게 주사 또는 도입되거나 신체의 질병 부위에 적용될 수 있는 기타 유사한 장치가 포함될 수 있다. 본 개시의 키트는 또한 일반적으로 바이알 등을 포함하는 수단과 상업적 판매를 위해 밀폐된 상태로 다른 구성요소를 포함하는 수단, 예를 들어 원하는 바이알 및 기타 장치가 배치 및 유지되는 사출 또는 블로우 성형 플라스틱 용기를 포함할 것이다.
약어
MC = 6-말레이미도카프로일(6-maleimidocaproyl)
Val-Cit 또는 "vc" = 발린-시트룰린(프로테아제 절단 가능 링커의 예시적인 다이펩타이드)
PAB = p-아미노벤질옥시카르보닐(p-aminobenzyloxycarbonyl)(링커 성분의 예)
SPP = N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(N-succinimidyl-4-(2-pyridylthio)pentanoate)
SPDP = N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionate)
SMCC = 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카르복실레이트(succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate)
MMAE = 모노-메틸 아우리스타틴 E(mono-methyl auristatin E) (MW 718)
MMAF = 약물의 C 말단에 페닐알라닌이 있는 아우리스타틴 E(MMAE)의 변종(MW 731.5)
DM1 = N(2')-데아세틸-N(2')-(3-메르캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (N(2')-deacetyl-N(2')-(3-mercapto-1-oxopropyl)-maytansine)
DM3 = N(2')-데아세틸-N2-(4-메르캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (N(2')-deacetyl-N2-(4-mercapto-1-oxopentyl)-maytansine)
DM4 = N(2')-데아세틸-N2-(4-메르캅토-4-메틸-1-옥소펜틸)-메이탄신 (N(2')-deacetyl-N2-(4-mercapto-4-methyl-1-oxopentyl)-maytansine)
서열 목록 요약
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L의 CDR, 가변 영역, 불변 영역의 서열은 아래 표에 나열되어 있다.
[표 A] 가변 영역의 아미노산 서열
[표 B] W3195-1.53.1-p1-uIgG1L의 가변 영역 및 불변 영역의 아미노산 서열
[표 C] W3195-1.53.1-p1-uIgG1L의 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열
도 1a 내지 1b는 W3195-p1-MMAE(A) 및 BMK4-DM1(B)의 HPLC 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 2b는 HCT-116 세포(A) 및 NCI-H1650 세포(B)를 발현하는 인간 P-카드헤린에 대한 ADC의 FACS 결합 분석 결과를 나타낸다.
도 3은 FACS 결합에 의한 W3195-p1-MMAE의 혈청 안정성 결과를 나타낸다.
도 4a 내지 4f는 HCC-1954 세포(a), HCC-70 세포(b), HT-29 세포(c), A549 세포(d), MDA-MB-453 세포(e) 및 NCI-H1650 세포(f)에서 ADC의 세포독성효과를 나타낸다.
도 5a 내지 5b는 HCS 분석에 의한 HCC-1954 세포(a) 또는 NCI-H1650 세포(b)에 대한 ADC의 내재화 능력을 나타낸다.
도 6은 NCI-H1650 세포에 대한 FACS 친화성 테스트 결과를 나타낸다.
도 7은 huCDH3 ECD 도메인1(a), 도메인1+2(b), 도메인1+2+3(c), 도메인1+2+3+4(d) 및 ECD(e)에 대한 ELISA 결합을 사용한 도메인 결정 테스트 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 8b는 이종이식된 HCC70 유방 종양 모델에서 연구 I 단일 용량 생체내 효능 테스트의 체중 변화(a) 및 종양 성장 억제(b) 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 9b는 이종이식된 HCC70 유방 종양 모델에서의 연구 II 용량 반응 생체내 효능 시험의 체중 변화(a) 및 종양 성장 억제(b) 결과를 나타낸다.
도 10a 내지 10b는 이종이식 NCI-H1650 폐암 모델에서의 연구 II 용량 반응 생체내 효능 시험의 체중 변화(a) 및 종양 성장 억제(b) 결과를 나타낸다.
따라서 일반적으로 설명된 본 발명은 예시를 통해 제공되는 다음의 실시예를 참조함으로써 보다 쉽게 이해될 것이며, 이는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 실시예는 아래의 실험이 수행된 실험의 전부 또는 유일한 실험임을 나타내기 위한 것이 아니다.
실시예 1 : 재료, 항원, 벤치마크 항체 및 세포주의 준비
1.1 재료 준비
실시예에 사용된 상업적으로 이용 가능한 재료에 대한 정보는 표 1에 제공된다.
재료 공급사 카달로그 번호
HCT-116 ATCC CCL-247
HCC-1954 ATCC CRL-2338
HCC-70 ATCC CRL-2315
HT-29 ATCC HTB-38
A549 ATCC CCL-185
MDA-MB-453 ATCC HTB-131
NCI-H1650 ATCC CRL-5883
Jurkat ATCC TIB-152
HepG2 ATCC HB-8065
SK-OV-3 ECACC 91091004
Calu-6 ATCC HTB-56
A375 ATCC CRL-1619
A204 Jackson HTB-82
8505C Jackson ACC 219
H1 Hela Promega CRL-1958
293F Thermo Fisher R79007
BT474 ATCC HTB-20
Alexa647 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc Jackson 109-605-098
PE 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc Jackson 109-115-098
세포 역가 글로 Promega G7573
소 태아 혈청 (FBS) Corning 35-076-CV
Ni 컬럼 GE healthcare 173712
Protein A 컬럼 GE healthcare 175438
Protein G 컬럼 GE Healthcare 170618
HPLC-SEC TOSOH 0008541
NuPAGE4%-12% Bis-Tris Gel Thermo Fisher NP0322BOX
1.2 가용성 항원 발현 벡터의 구축
인간 P-카드헤린(Uniprot ID: P22223, aa 108-654)의 세포외 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열은 먼저 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화된 후 GENEWIZ(SuZhou, CHINA)에 의해 합성되었다. 그런 다음 DNA 세그먼트를 C-말단에 6xHis가 있는 pcDNA3.3 발현 벡터에 서브클로닝하였다. 인간, 시아노 및 마우스 P-카드헤린의 단백질 샘플도 Sino Biological에서 구입하였다.
1.3 BMK 항체 발현 벡터의 구축
2개의 벤치마크 항체의 가변 도메인을 인코딩하는 아미노산 서열(WO2016075670A1에 개시된 WBP319-BMK4, 서열 번호 8 및 18)을 먼저 포유동물 발현을 위해 코돈 최적화한 후 GENEWIZ(SuZhou, CHINA)에 의해 합성하였다. 그런 다음 DNA 세그먼트를 인간 IgG1 또는 IgG4(S228P)의 불변 영역을 갖는 pcDNA3.4 발현 벡터에 서브클로닝하였다.
1.4 단백질의 소규모 발현
VH 및 VL 유전자를 포함하는 플라스미드는 Expi293 세포(Thermofisher, A14635)에 공동 형질감염되었다. 제조업체가 제안한 프로토콜에 따라 세포를 5일 동안 배양하였다. 상층액을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
VH 및 VL 유전자를 포함하는 플라스미드는 ExpiCHO 세포(Thermofisher, A29133)에 공동 형질감염되었다. 제조업체가 제안한 프로토콜에 따라 세포를 10일 동안 배양하였다. 상층액을 수집하고 SDS-PAGE로 분석하였다.
1.5 Fc 태그가 붙은 단백질의 정제
Expi293 세포 또는 ExpiCHO 세포 발현 표적 단백질의 상층액을 수집하고, 정제를 위해 단백질 A 컬럼(GE Healthcare, Cat. 175438) 또는 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, Cat. 170618)을 사용하여 여과하였다. 정제된 Fc-태그된 단백질의 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정되었다. 크기와 순도는 각각 SDS-PAGE와 SEC-HPLC로 테스트한 후 -80℃에서 보관하였다.
실시예 2 : 단일클론 항체(mAbs) 및 항체-약물 컨쥬게이트(ADC) 생성
2.1 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L mAb의 생성
리드 항체인 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L(또는 W3195-p1로 약칭함)은 형질전환 OMT 쥐를 인간 P-카드헤린으로 면역화하고, 하이브리도마를 생성하며, 일련의 항체로 스크리닝 및 서브클로닝한 후, 서열 최적화(예: PTM 제거)를 통해 획득하였다.
2.2 벤치마크 ADC 생성: WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1
항체 WBP319-BMK4.uIgG1k는 50mM PB, 50mM NaCl, 2mM EDTA 및 pH 6.99 내지 4.3mg/mL에 용해되었다. 유기 공용매 DMA(Alfa Aesar, A10924)는 항체 용액에 20% 농도로 첨가되었고, 그 후, 3.8eq의 SMCC-DM1(Levenabiopharma, SET0101)을 첨가하였다. 컨쥬게이트 반응은 22℃에서 3시간 동안 수행되었다. 컨쥬게이트된 생성물을 30KD 한외여과 장치(Millipore, UFC903024)로 정제하고 20 mM 숙신산, pH 5.0에 보관하였다.
최종 산물은 농도와 DAR을 위해 UV-vis로, DAR, 응집 및 순도를 위해 SEC-HPLC로, 유리 약물 잔류물을 위해 RP-HPLC로, 내독소를 위해 Endosafe-PTS(Charlesriver, PTS100)로 특성화되었다.
2.3 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE(W3195-p1-MMAE라고도 명명함)의 생성
항체 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L을 40mM PB, 2mM EDTA.Na2, pH 7.0에 3.5mg/ml의 농도로 용해시켰다. 2.6eq의 TCEP(Pierce, 20490)를 항체 용액에 첨가하고 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그 후 환원된 항체에 DMA(Alfa Aesar, A10924)를 10% 농도로 첨가한 후, MC-vc-PAB-MMAE(Levenabiopharma, SET0201) 7eq를 첨가하였다. 컨쥬게이트 반응은 4℃에서 1시간 동안 수행되었다. 컨쥬게이트된 생성물을 40KD MWCO 탈염 컬럼(Zeba 스핀 탈염 컬럼, Ref 87772)으로 정제하고 20mM 히스티딘-아세테이트 pH5.5에 보관하였다.
최종 산물은 DAR 및 약물 분포를 위해 HIC-HPLC로, 응집 및 순도를 위해 SEC-HPLC로, 유리 약물 잔류물을 위해 RP-HPLC 및 내독소를 위해 Endosafe-PTS(Charlesriver, PTS100)로 특성화되었다.
도 1a 내지 1b에 표시된 대로 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 및 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1의 체류 시간은 ~7.864분 및 10.19분으로, 두 항체 모두 정상임을 나타낸다. 아래 표 2 내지 3에 나타낸 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L은 DAR 3.86을 사용하여 MMAE와의 컨쥬게이트에 성공하였고; WBP319-BMK4.uIgG1k는 DAR 3.33을 사용하여 DM1과의 컨쥬게이트에 성공하였다.
표 2는 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 특성 요약을 나타낸다.
표 3는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 특성 요약을 나타낸다.
실시예 3 : ADC의 시험관 내( In vitro ) 특성 분석
3.1 타겟 바인딩(FACS)
HCT-116 세포에서 발현된 P-카드헤린에 대한 ADC의 결합은 상술된 바와 같이, 동일한 절차를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정되었다. 간단히 말해서, HCT-116 또는 NCI-H1650 세포를 Versene(Invitrogen, #15040066)으로 수확하고, 1% BSA(Bovogen, #BSAS)/1X PBS(Ca+/Mg+)(Gibco, #14040-117)에 1Х106 cells/ml의 농도로 희석하였다. 1Х105 cells/well(100 μL)을 96-웰 U-플레이트(Corning, #3799)의 각 웰에 첨가하였고, 1500 rpm(Eppendorf, #5810R)에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 연속적으로 희석된 항체를 펠렛화된 세포에 100 μL/well씩 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 관련되지 않은 hIgG1 항체를 아이소타입 대조군으로 사용하였다. 세포를 4℃에서 5분간 1500 rpm으로 원심분리하여 180 μL/well씩 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)로 2회 세척하였다. 펠렛화된 세포를 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 1:500으로 희석된 100 μL/well Alexa647 컨쥬게이트 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson, #109-605-098)으로 암실, 4℃에서 30분 동안 재현탁시켰다. 그런 다음 세포를 상술된 바와 같이 두 번 세척하였다. 최종 세척 후, 세포를 100 μL의 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 재현탁하고, FACS Canto II 세포측정기(BD Biosciences)를 사용하여 형광 값을 측정하였다. 세포 표면 결합된 항-P-Cadherin 항체의 양은 평균 형광(MFI)을 측정하여 평가하였다. FACS 원시 데이터는 FlowJo 소프트웨어로 분석되었으며, 항체가 없거나 2차 항체만 포함된 웰을 사용하여 백그라운드 형광을 확립하였다. GraphPad Prism6 소프트웨어를 사용하여 4개 매개변수 비선형 회귀 분석을 통해 결합 EC50 값을 획득하였다.
도 2a 내지 2b 및 표 4 내지 5에 나타낸 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 W319-BMK4.uIgG1K(0.33nM)와 유사하게 인간 P-카드헤린-발현 HCT-116 세포에 0.17nM의 EC50으로 결합하는 것으로 나타났고; W319-BMK4.uIgG1K (0.16 nM)와 유사하게 인간 P-카드헤린-발현 NCI-H1650 세포에 0.075nM의 EC50으로 결합하는 것으로 나타났다.
표 4는 HCT-116 세포에 대한 ADC의 FACS 결합 결과를 나타낸다.
표 5는 NCI-H1650 세포에 대한 ADC의 FACS 결합 결과를 나타낸다.
항체 HCT-116
EC50 (nM) 최대 MFI
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.17 6164
W319-BMK4.uIgG1K 0.33 7651
아이소타입 대조군 >100 402
항체 NCI-H1650
EC50 (nM) 최대 MFI
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.075 3005
W319-BMK4.uIgG1K 0.16 4237
아이소타입 대조군 NA 331
3.2 혈청 안정성
인간 혈청 내 항체 안정성을 FACS로 테스트하였다. 간단히 말하면, 신선한 혈액을 4000 rpm에서 10분간 두 번 원심분리하여 인간 혈청을 신선하게 분리하였다. 항체를 새로 분리한 인간 혈청(혈청 함량 > 95%)과 혼합하였고, 37℃에서 각각 0, 1, 4, 7 및 14일 동안 배양한 후 샘플을 액체 질소 또는 드라이아이스/에탄올 배스에서 급속 냉동하였으며, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 대조군으로서, 항체 혈청 혼합물을 37℃ 배양 없이 즉시 동결시켰다. FACS 분석을 위해 서로 다른 시점의 샘플을 4℃에서 동시에 자유 해동(free-thawed)하였다. 해동된 항체를 연속적으로 희석하였고, 1Х105 cells/well의 HCT-116(ATCC, #CCL-247) 세포에 첨가하였으며, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세포는 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)로 두 번 세척하였다. 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 1:500으로 희석된 Alexa647 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson, #109-605-098)를 세포에 첨가하였고 4℃에서 30분 동안 배양하였다. 세포를 동일한 완충액으로 2회 세척하고, 염색된 세포의 평균 형광(MFI)을 FACS Canto II 세포계측기(BD Biosciences)를 사용하여 측정하였으며, FlowJo로 분석하였다. 항체가 없거나 2차 항체만 포함된 웰을 사용하여 백그라운드 형광을 확립하였다. GraphPad Prism6 소프트웨어를 사용하여 세포 결합에 대한 EC50 값을 얻기 위해 4개 매개변수 비선형 회귀 분석을 사용하였다.
도 3 및 표 6에 나타난 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 혈청 안정성 시험에서 최소 14일 동안 안정하였다.
표 6는 시간에 따른 FACS 바인딩 결과를 나타낸다.
3.3 ADC의 세포독성 분석
항-P-카드헤린 항체 약물 컨쥬게이트의 종양 세포 성장을 억제하는 능력을 시험관내(in vitro) 세포독성 분석을 사용하여 측정하였다. HCC-1954(ATCC, #CRL-2388), HCC-70(ATCC, #CRL-2315), HT-29(ATCC, #HTB-38), A549(ATCC, #CCL-185), MDA-MB-453(ATCC, #HTB-131) 및 NCI-H1650 세포를 통상적으로 배양하였고 10% 소태아혈청이 포함된 RPMI1640에서 분석하였다. 세포독성 분석을 위해, 각 세포주 당 50 μL의 세포를 96웰 투명 바닥 검정색 플레이트(Greiner, #655090)에 접종하였고, 웰당 총 세포 수는 HCC-1954의 경우, 4000 cells/well, HCC-70의 경우, 6000 cells/well, HT-29의 경우, 5000 cells/well, A549의 경우, 800 cells/well, MDA-MB-453의 경우, 5000 cells/well 및 NCI-H1650의 경우, 2000 cells/well이 되도록 하였다. 세포는 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 밤새 배양한 후, 적절한 농도의 항-CDH3 항체-약물 컨쥬게이트와 IgG1 아이소타입 대조 항체(50 μL/well)를 첨가하였다. Cell Titer Glo(Promega, #G7573)를 사용한 세포 생존력 분석 전 플레이트를 5일 동안 인큐베이터에 보관하였다. 50 μL의 Cell Titer Glo 용액을 각 웰에 첨가하고 실온에서 가볍게 흔들면서 10분 동안 배양하였다. 발광량은 Envision(PerkinElmer)을 이용하여 측정하였다. 항체를 첨가하지 않은 대조군 웰에서 얻은 휘도 값을 비교하여 각 항체에서 얻은 성장 억제 정도를 계산하였다. 항-P-Cadherin-ADC의 증식 억제 IC50 값은 GraphPad Prism6 소프트웨어를 사용한 4개 매개변수 비선형 회귀 분석으로 계산되었다.
도 4a 내지 4f 및 표 7 내지 12에 나타낸 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 (0.15nM)보다 우수한 0.011nM의 IC50으로 인간 P-카드헤린 발현 HCC-1954 세포에 대해 우수한 사멸 효과를 나타냈고; WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1(0.80nM)보다 우수한 0.065nM의 IC50으로 인간 P-카드헤린 발현 HCC-70 세포에 대해 우수한 사멸 효과를 나타냈으며; 인간 P-카드헤린 저발현 HT-29 세포에 대해 IC50 >10 nM로 사멸 효과는 나타나지 않았고; 인간 P-카드헤린 저발현 A549 세포에 대해 IC50 > 10 nM로 사멸 효과는 나타나지 않았으며; 인간 P-카드헤린 저발현 MDA-MB-453 세포에 대해IC50 >10 nM로 사멸 효과가 나타나지 않았고; WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1(1.14nM)보다 우수한 0.027nM의 IC50으로 인간 P-카드헤린 발현 NCI-H1650 세포에 대한 우수한 사멸 효과를 나타냈다.
항체 HCC-1954에서 ADC의 세포독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.011 96.9
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.15 96.8
아이소타입 대조군 >10 9.3
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 20.1
약물이 없는 (MMAE) 0.050 97.7
항체 HCC-70에서 ADC의 세포독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.065 90.7
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.80 75.5
아이소타입 대조군 >10 5.8
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 1.3
약물이 없는 (MMAE) 0.23 87.2
항체 HT-29에서 ADC의 세포독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE >10 -4.1
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 >10 -1.7
아이소타입 대조군 >10 1.6
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 -0.1
약물이 없는 (MMAE) 0.52 95.5
항체 A549에서 ADC의 독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE >10 -7.8
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 >10 -7.3
아이소타입 대조군 >10 -0.4
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 -5.4
약물이 없는 (MMAE) 1.37 89.2
항체 MDA-MB-453에서 ADC의 독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE >10 4.0
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 >10 -0.3
아이소타입 대조군 >10 5.2
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 -0.6
약물이 없는 (MMAE) 1.28 96.7
항체 NCI-H1650에서 ADC의 세포독성
IC50 (nM) 최대 Inh%
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.027 80
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 1.14 65
아이소타입 대조군 >10 1
프리 페이로드 대조군 (MC-VC-PAB-MMAE) >10 1
약물이 없는 (MMAE) 0.15 81
3.4 항체 매개 내재화 분석 (고함량 스크리닝, HCS)
Operetta CLS(PerkinElmer)는 샘플의 이미지를 빠른 속도와 감도로 수집하고 분석할 수 있는 고용량 이미징 및 분석 시스템이다. 분석 하루 전, Poly-D-Lysine(PDL)을 DPBS(Hyclone, #SH30028.03)에 8 μg/mL로 희석하고 96-well 투명 바닥 검정색 플레이트(Greinier, #655090)에 100 μL/well씩 추가하였다. PDL 코팅된 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후 상층액을 제거하였다. 100μL의 10% FBS(Hyclone, # SH30084.03) 함유된 RPMI1640 완전 배지(Gibco, #22400-089)에 HCC-1954(ATCC, CRL-2338) 세포 또는 NCI-H1650(ATCC, CRL-5883) 세포를 웰당 18000개 세포로 PDL 코팅 플레이트에 플레이팅하였다. 1일째에, 플레이트의 상층액을 버리고 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 연속적으로 희석된 항체를 100 μL/well씩 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 관련되지 않은 hIgG1 항체를 아이소타입 대조군으로 사용하였다.
HCC-1954 세포의 경우, 다중 채널 파이펫(Eppendorf)을 사용하여 세포를 100 μL의 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)로 세척한 다음, 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 1:150으로 희석된 PE 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson, # 109-115-098)에 암조건, 4℃에서 1시간 동안 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 상술한 바와 같이, 한 번 세척하고 37℃에서 2시간 동안 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 재현탁했다. 상층액을 버리고, 100 μL/well씩 ??치(quench) 완충액(0.1 M 글라이신, 0.15 M NaCl, pH를 2.5로 조정)을 첨가하였고 4℃에서 5분간 배양하였다. 그런 다음 세포를 상술한 바와 같이, 한 번 세척하고 DPBS(Hyclone, #SH30028.03)에 1:5000으로 희석된 Hoechst 33342(Invitrogen, #H3570)에 실온에서 15분 동안 재현탁했다. 상술한 바와 같이, DPBS(Hyclone, #SH30028.03)로 1회 세척한 후 세포를 4% PFA에 재현탁하였고, 4℃에 보관하였다.
NCI-H1650 세포의 경우, 다중 채널 파이펫(Eppendorf)을 사용하여 세포를 100μL의 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)로 세척한 다음, 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 1:150으로 희석된 PE 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson, # 109-115-098)에 암조건, 4℃에서 1시간 동안 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 상술한 바와 같이, 한 번 세척하고 37℃에서 2시간 동안 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 재현탁했다. 상층액을 버리고 세포를 실온에서 15분 동안 DPBS(Hyclone, #SH30028.03)에 1:5000으로 희석된 Hoechst 33342(Invitrogen, #H3570) 에 재현탁시켰다. 상술한 바와 같이, DPBS(Hyclone, #SH30028.03)로 1회 세척한 후 100 μL/well씩 ??치 완충액(0.1M 글리신, 0.15M NaCl, pH를 2.5로 조정)을 첨가하였고 4℃에서 5분간 배양하였다. 1% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)로 한 번 세척한 후 세포를 4% PFA에 재현탁하고 4℃에 보관하였다.
이미지는 operetta CLS(PerkinElmer)에 의해 수집 및 분석되었다. 내재화된 항-P-카드헤린 항체의 양은 세포당 평균 형광(MFI)을 측정하여 평가하였으며, 항체가 없거나 2차 항체만 포함된 웰을 사용하여 백그라운드 형광을 확립하였다. 내재화 EC50 값은 GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 4개 매개변수 비선형 회귀 분석을 통해 획득하였다.
도 5a 및 표 13에 나타난 바와 같이, W3195-1.53.1-uIgG1L-MMAE는 HCS 분석을 사용하여 0.023nM의 EC50으로 우수한 내재화 능력을 나타냈으며, 이는 BMK4(0.019nM)와 유사하였다.
표 13는 HCS 분석에서 HCC-1954 세포의 내재화 결과를 나타낸다.
항체 HCC-1954
EC50 (nM) 최대 MFI
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.023 1280
W319-BMK4.uIgG1K 0.019 1339
아이소타입 대조군 >10 184
도 5b 및 표 14에 나타낸 바와 같이, W3195-1.53.1-uIgG1L-MMAE는 HCS 분석을 사용하여 0.22nM의 EC50으로 우수한 내재화 능력을 나타냈으며, 이는 참조 ADC인 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1(0.57nM)보다 우수하였다.
표 14는 HCS 분석에서 NCI-H1650 세포의 내재화 결과를 나타낸다.
항체 NCI-H1650
EC50 (nM) 최대 MFI
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.22 94928
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.57 89885
아이소타입 대조군 N.A. 18
3.5 P-카드헤린에 대한 친화성(FACS)
NCI-H1650 세포를 5×104 cells/well의 밀도로 96웰 U-바닥 플레이트(BD)에 접종하였다. 테스트할 항체를 1X PBS/1% BSA에 연속적으로 희석하였고, 4℃에서 1시간 동안 세포와 함께 배양하였다. 플레이트를 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 이어서, 세포를 Alexa647 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc(Jackson)와 함께 4℃, 암조건에서 30분 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 100 μL 1X PBS/1% BSA에 재현탁시키고, 유세포 분석기(BD Canto II)로 형광 강도를 측정하였으며, FlowJo 소프트웨어로 분석하였다. 형광 강도는 정량 비드 표준 곡선(QuantumTM MESF Kits, Bangs Laboratories)을 기반으로 결합된 분자/세포로 변환되었다. KD는 Graphpad Prism 소프트웨어로 계산되었다.
결과는 표 15 및 도 6에 나타내었다. W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 인간 P-카드헤린 발현 NCI-H1650 세포에 대해 1.68E-10M의 KD로 우수한 결합 친화성을 나타내었고, 이는 W319-BMK4-uIgG1K-DM1(3.11E-10M)과 유사하였다.
표 15은 NCI-H1650 세포에 대한 ADC의 FACS 친화성 결과를 나타낸다.
샘플 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1
Bmax (M) 1.88E-10 2.49E-10
KD (M) 1.68E-10 3.11E-10
r 2 0.993 0.984
3.6 도메인 결정 결합(ELISA)
인간 P-Cadherin 세포외 도메인(ECD)에 대한 항체 약물 컨쥬게이트의 결합 도메인은 직접 단백질 결합 ELISA에 의해 결정되었다. 96웰 고단백질 결합 ELISA 플레이트(Nunc)를 코팅 완충액 중 항원으로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 모든 웰을 PBS/0.5?? Tween-20(v/v)으로 3회 세척하였고, 분석의 모든 다음 세척 단계를 동일하게 수행하였다. 그런 다음 웰을 2% BSA (Bovogen)/1X PBS (Ca+/Mg+) (Gibco)로 1시간 동안 블락킹하고 3회 세척하였다. 1차 항체 결합을 위해, BMK를 포함한 테스트 항체와 2% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 연속적으로 희석된 항체를 관련 웰에 첨가하였고, 주위 온도(ambient temperature)에서 2시간 동안 배양하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 2% BSA/1X PBS(Ca+/Mg+)에 희석된 2차 항체 염소 항-인간-IgG-F(ab')2-HRP (Jackson)를 100μL씩 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 상술한 바와 같이, 6번 세척하였다.
결합 검출을 위해 100μL의 테트라메틸벤지딘(TMB) 기질 용액(Invitrogen)을 모든 웰에 첨가한 후 100μL의 2M HCl로 반응을 중단시켰다. P-카드헤린 ECD (예: huCDH3 ECD, Uniprot ID: P22223 아미노산 108 내지 654), P-카드헤린 ECD 도메인 1 (아미노산 108 내지 236), P-카드헤린 ECD 도메인 1+2 (아미노산 108 내지 348), P-카드헤린 ECD 도메인 1+2+3 (아미노산 108 내지 461), P-카드헤린 ECD 도메인 1+2+3+4 (아미노산 108 내지 550) 단백질에 대한 결합하는 테스트 Ab의 정도는 SpectraMax® M5e 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 OD450 내지 OD540의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다.
표 16 및 도 7a 내지 7e에 나타낸 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 도메인 3(아미노산 348 내지 461)에 대한 결합을 나타냈고, 이는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1(도메인 1, 아미노산 108 내지 236)과 상이하였다.
표 16은 ADC의 도메인 결정 바인딩 결과를 나타낸다.
샘플 huCDH3 ECD 도메인1 huCDH3 ECD 도메인 1+2 huCDH3 ECD 도메인 1+2+3 huCDH3 ECD 도메인 1+2+3+4 huCDH3 ECD
EC50 (nM) 최대OD EC50 (nM) 최대OD EC50 (nM) 최대OD EC50 (nM) 최대OD EC50 (nM) 최대OD
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE N.A. 0.19 N.A. 0.16 0.20 0.95 0.17 0.75 0.23 0.65
WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.22 2.17 0.49 1.53 0.26 1.36 0.14 1.41 0.37 1.35
IgG1 아이소타입 대조군 N.A. 0.014 N.A. 0.014 N.A. 0.015 N.A. 0.03 N.A. 0.01
3.7 비특이적 결합(FACS)
인간 세포주를 1×105 cells/well의 밀도로 96웰 플레이트(BD)에 접종하였다. 10 μg/mL 항체 샘플을 세포에 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후, 세포를 재현탁시키고 PE-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgG Fc 항체(Jackson)와 함께 30분 동안 배양하였다. 세척 및 재현탁 후, 평균 형광 강도(MFI)를 유세포 분석기(BD Canto II)로 측정하였고 FlowJo로 분석하였다.
표 17에 나타난 바와 같이, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 12개 인간 세포주 모두에 대해 비특이적 결합 효과를 나타내지 않았다. WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1은 HepG2및 293F 세포주에 대한 비특이적 결합을 보여주었다.
표 17은 FACS에 의한 비특이적 결합 결과를 나타낸다.
세포/샘플 MFI
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 hIgG1K 아이소타입 대조군 hIgG1L 아이소타입 대조군 양성 대조군 블랭크 음성 대조군
Jurkat 63.5 31.6 17.2 16.1 14700 15.7 18.8
MDA-MB-453 47.4 63.5 19.6 19.5 1494 20.5 18.8
HT29 26.4 22.7 20.5 20.2 2310 18.8 21.2
HepG2 52.6 173 55 42.3 263 21.3 39.3
SK-OV-3 30.6 27.4 24.3 23.8 3820 23.6 24.1
Calu-6 38.5 61.2 18.8 18.6 3174 20.4 44.8
A375 20.3 20.5 17.4 18.7 1818 19.7 18.1
A204 29.4 69.8 27.4 26.7 5032 19.6 27.3
8505C 26.5 41.2 21.7 20.8 2694 20.2 21.5
H1 Hela 27 43.5 24 23.3 426 21.1 22.4
293F 35.1 90 17.1 17.9 2974 17.4 17.3
BT474 34.6 45.6 19 18.3 3344 15.5 18.3
실시예 4 : ADC의 생체내( In vivo ) 항종양 효능 연구
4.1 이종이식된 HCC70 유방 종양 모델 - 연구 I
이식을 위한 동물 준비 및 세포 배양
효능 연구에서 WBP3195-p1-ADC는 SCID-17B 암컷 마우스의 HCC70 유방 종양 모델에서 테스트되었다. 첫 번째 연구에는 28 내지 29주령의 암컷 SCID-17B 마우스(Beijing Vital River Lab Animal Technology Co. Ltd)가 사용되었다. HCC70 세포는 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RIPM1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 유지되었으며, 공기 중 5% CO2에서 37℃로 유지되었다. 종양 세포는 0.25% 트립신-EDTA 처리로 일주일에 2회 정기적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다. 수확된 세포를 1.0×108 cells/mL의 밀도로 PBS에 재현탁시킨 후 생존율이 90% 이상인 등가의 마트리겔(matrigel) (최종 1.0×107 cells/200 uL/마우스)을 첨가하고 동물의 오른쪽 앞 옆구리에 피하 이식하였다.
처리 및 데이터 수집
접종 후 10일째에 평균 종양 부피가 약 230mm3에 도달했을 때 동물을 무작위로 3개 그룹으로 분류했고 각 그룹에는 7마리의 마우스가 포함되었다. 3개 그룹의 쥐에게 각각 다음을 1mg/kg(단일 용량)으로 정맥 주사하였다: 아이소타입 대조군-MMAE, WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 및 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE. 정맥 주사일은 0일로 간주하였다. 모든 종양 연구에서 마우스의 체중을 측정하고 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양 성장을 측정하였다.
연구 지침 및 데이터 분석
연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)의 지침을 따른 Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다. 종양 부피는 공식(½(길이 Х 너비2))을 사용하여 계산되었다.
TGI(종양 성장 억제)는 TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] Х100% 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산되었다. Ti는 특정일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. T0는 치료 첫날 치료군의 평균 종양 부피이다. Vi는 Ti를 사용한 같은 날 비히클 대조군의 평균 종양 부피이고, V0는 치료 첫날 비히클 그룹의 평균 종양 부피이다. 체중 변화의 상대적 변화(RCBW)는 [(BWt-BW0)/BW0] × 100% 공식으로 계산하였으며, BW0은 0일의 평균 체중, BWt는 측정일의 평균 체중을 나타낸다. 결과는 평균과 표준오차(Mean ± SEM)로 나타내었다. 34일째의 데이터는 Graphpad Prism 6.0을 사용한 Ordinary one-way ANOVA Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었으며, p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, 각 그룹의 모든 동물에서 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 동물이 각 시험 항목에 잘 견딘다는 것을 나타낸다.
치료 후 34일에 이소타입 대조군의 평균 종양 부피는 1120mm3였으며 이는 HCC70 이종이식 유방 종양 모델이 잘 확립되었음을 나타낸다. 각 그룹의 34일차 TGI(%)는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1의 경우 40.91%, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE의 경우 85.15%였다. 아이소타입 대조군과 비교하여 모든 시험 항목은 종양 성장을 유의하게 억제하였고; WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1과 비교하여, W3195-p1-MMAE는 더 강력한 항종양 효과를 나타냈다 (p<0.01) (도 8b 및 표 18 참조).
표 18은 HCC70 유방 종양 억제 효과 비교를 나타낸다.
양방향 RM ANOVA, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001
4.2 이종이식된 HCC70 유방 종양 모델 - 연구 II
이식을 위한 동물 준비 및 세포 배양
효능 연구에서 WBP3195-p1-ADC는 SCID-17B 암컷 마우스의 HCC70 유방 종양 모델에서 테스트되었다. 37~38주령의 암컷 SCID-17B 마우스(Beijing Vital River Lab Animal Technology Co. Ltd) 100마리를 두 번째 연구에 사용하였다. HCC70 세포는 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스렙토마이신이 보충된 RIPM1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 유지되었으며, 5% CO2에서 37℃로 유지되었다. 종양 세포는 0.25% 트립신-EDTA 처리로 일주일에 2회 정기적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다. 수확된 세포를 1.0×108 cells/mL의 밀도로 PBS에 재현탁시킨 후 생존율이 90% 이상인 등가의 마트리겔(matrigel) (최종 1.0×107 cells/200 uL/마우스)을 첨가하고 동물의 오른쪽 앞 옆구리에 피하 이식하였다.
처리 및 데이터 수집
접종 후 10일째에 평균 종양 부피가 약 242mm3에 도달했을 때 동물을 무작위로 4개 그룹으로 분류했고 각 그룹에는 7마리의 마우스가 포함되었다. 4개 그룹의 쥐에게 각각 다음을 1mg/kg(단일 용량)으로 정맥 주사하였다: 아이소타입 대조군-MMAE 2.5mg/kg, WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.5mg/kg, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.5mg/kg 및 2.5mg/kg. 정맥 주사일은 0일로 간주하였다. 모든 종양 연구에서 마우스의 체중을 측정하고 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양 성장을 측정하였다.
데이터 분석 절차는 위에서 설명한 대로 수행되었다. 도 9a에 나타낸 바와 같이, 모든 그룹에서 뚜렷한 체중 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 동물이 각 시험 항목에 잘 견딘다는 것을 나타낸다.
치료 후 36일에 이소타입 대조군의 평균 종양 부피는 1202mm3였으며 이는 HCC70 이종이식 유방 종양 모델이 잘 확립되었음을 나타낸다. 각 그룹의 36일차 TGI(%)는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1 0.5mg/kg의 경우, 42.69%, W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 0.5mg/kg의 경우, 62.06% 및 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 2.5mg/kg의 경우, 122.67%이었다. 이소형 대조군과 비교하여 모든 시험 항목은 종양 성장을 유의하게 억제하였고; 0.5mg/kg에서 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 WBP319-BMK4.uIgG1k-DM1대비 강력한 항종양 효과를 나타냈다 (p<0.05). 2.5mg/kg에서는 치료 후 36일차에 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 치료군에서 5마리의 종양이 없는 동물이 관찰되었다. 결과는 W3195-p1-MMAE가 0.5mg/kg 및 2.5mg/kg에서 우수한 용량 의존적 항종양 효과를 나타냄을 보여준다 (도 9b 및 표 19 참조).
표 19는 다양한 용량에서의 HCC70 유방 종양 억제 효과 요약을 나타낸다.
양방향 RM ANOVA, * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001
4.3 이종이식 NCI-H1650 폐종양 모델
효능 연구에서 WBP3195-p1-ADC는 SCID-17B 암컷 마우스의 NCI-H1650 폐 종양 모델에서 테스트되었다. 7 내지 9주령의 암컷 SCID-17B 마우스(Shanghai Jihui Laboratory Animal Care Co.,Ltd.)를 연구에 사용하였다. NCI-H1650 세포는 5% CO2에서 37℃, 10% 소태아혈청, 100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 RIPM1640 배지에서 단층 배양으로 시험관 내에서 유지되었다. 종양 세포는 0.25% 트립신-EDTA 처리하여 일주일에 2회 정기적으로 계대배양하였다. 지수 성장 단계에서 성장하는 세포를 수확하고 종양 접종을 위해 계수하였다.
치료 모델의 경우, 각 마우스의 오른쪽 앞 옆구리에 NCI-H1650 종양 세포(100ul PBS에 재현탁된 0.5x107 cell)를 피하 접종하였다. 접종 후 22일에 평균 종양 부피가 약 137mm3에 도달했을 때 동물을 무작위로 4개 그룹으로 분류했고 각 그룹에는 6마리의 마우스가 포함되었다. 4개 그룹의 마우스에는 각각 PBS, 아이소타입 대조군-MMAE(2.5mg/kg), W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE(2.5mg/kg) 및 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE(5mg/kg)(단회 투여)을 정맥 투여하였다. 정맥 주사일은 0일로 간주하였다. 모든 종양 연구에서 마우스의 체중을 측정하고 캘리퍼스(calipers)를 사용하여 일주일에 두 번씩 종양 성장을 측정하였다.
연구에서 동물 취급, 관리 및 치료와 관련된 모든 절차는 실험 동물 관리 평가 및 인증 협회(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care; AAALAC)의 지침을 따른 Shanghai SIPPR-BK Laboratory Animal Co., Ltd의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에서 승인한 지침에 따라 수행되었다. 종양 부피는 공식(½(길이 Х 너비2))을 사용하여 계산되었다. TGI(종양 성장 억제)는 TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Vi-V0)] Х100% 공식을 사용하여 각 그룹에 대해 계산되었다. Ti는 특정일에 치료 그룹의 평균 종양 부피이다. T0는 치료 첫날 치료군의 평균 종양 부피이다. Vi는 Ti를 사용한 같은 날 비히클 대조군의 평균 종양 부피이고, V0는 치료 첫날 비히클 그룹의 평균 종양 부피이다. 체중은 공식으로 계산되었다. 31일째의 데이터는 Graphpad Prism 6.0을 사용한 양방향 ANOVA Tukey의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석되었으며 p<0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
각 그룹의 모든 동물에서 뚜렷한 체중 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 동물이 각 시험 항목에 잘 견딘다는 것을 나타낸다(도 10a). 치료 후 31일에 PBS 그룹과 아이소타입 대조-MMAE 그룹의 평균 종양 부피는 각각 1750.24 ± 210.76 mm3 및 1762.31 ± 197.71 mm3였다. W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 2.5mg/kg로 처리한 마우스의 평균 종양 부피는 1124.80 ± 132.22 mm3(TGI=38.69%)였고, 5mg/kg의 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE로 처리된 마우스의 평균 종양 부피는 9.92 ± 3.20 mm3(TGI=107.99%)였다. W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE(5mg/kg) 그룹에서는 종양이 없는 동물 한 마리가 관찰되었다(도 10b 및 표 20). PBS 처리군과 비교하여 고용량 처리에서 W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 뚜렷한 항종양 효과를 나타냈고(P<0.0001), W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE는 저용량 치료에서 부분적인 항종양 효과를 나타냈으며(P<0.0001), 저용량군보다 고용량군이 효과가 더 좋은 것으로 나타났다(p<0.0001). 저용량군과 고용량군 사이에서 용량 의존성이 관찰되었으며(p<0.0001), 고용량군에서는 종양이 없는 동물 1마리가 관찰되었다.
표 20은 NCI-H1650 폐암 억제 효과 요약을 나타낸다.
그룹 (mg/kg) PBS를 사용한 31일차 TGI(%) 31일차에 종양 없음(TV<20mm3), n/전체
PBS - 0/6
아이소타입 대조군-MMAE 2.5mg/kg -0.75 0/6
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 2.5mg/kg 38.69**** 0/6
W3195-1.53.1-p1-uIgG1L-MMAE 5mg/kg 107.99**** 5/6
당업자들은 본 발명의 의도 또는 중심 인용을 벗어나지 않으면서도 본 발명이 다른 구체적인 형태로 구현될 수 있음을 더욱 이해할 것이다. 본 발명의 전술한 설명은 예시적인 실시예를 개시한다는 점에서, 다른 변형이 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 상세히 설명된 특정 실시예에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위와 내용을 나타내는 것으로서 첨부된 청구항을 참조해야 한다.

Claims (26)

  1. 약물 모이어티에 콘쥬게이트된 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 항체-약물 콘쥬게이트(ADC)로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 P-카드헤린과 결합하고, 다음을 포함한다:
    서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1;
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2;
    서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3;
    서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1;
    서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2; 및
    서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 다음을 포함하는, ADC:
    (A) 서열번호 1에 기재된 HCDR1; 서열번호 2에 기재된 HCDR2; 및 서열번호 3에 기재된 HCDR3; 및
    (B) 서열번호 4에 기재된 LCDR1; 서열번호 5로 기재된 LCDR2; 및 서열번호 6에 기재된 LCDR3.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약물 모이어티는 독소, 화학요법제, 항생제, 방사성 동위원소 및 핵산분해 효소로부터 선택된 세포독성제 또는 세포증식억제제를 포함하는, ADC.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포독성제는 메이탄시노이드 (maytansinoids) (DM1, DM3, DM4와 같은), 돌라스타틴(dolastatins), 돌라스타틴 펩타이드 유사체 및 아우리스타틴(auristatins), 칼리세미신(calicheamicin), 트리코테센(trichothecene) 및 CC1065과 같은 이의 유도체로부터 선택되고, 선택적으로 세포독성제는 MMAE, DM1 또는 MMAF인 것인, ADC.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 Ab-(L-D)p 식을 가지고, 여기서 Ab는 항체 또는 항원 결합 부분이고, L은 링커이며, D는 약물 모이어티이고, p는 1에서 20 사이의 정수인 것인, ADC.
  6. 제5항에 있어서, 상기 링커는 프로테아제에 의해 절단될 수 있는 것인, ADC.
  7. 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 항체 상의 티올기를 통해 항체에 부착되는 것인, ADC.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커는 6-말레이미도카프로일 (6-maleimidocaproyl) (MC), 말레이미도프로파노일 (maleimidopropanoyl) (MP), 발린-시트룰린 (valine-citrulline) (val-cit), 알라닌-페닐알라닌 (alanine-phenylalanine) (ala-phe), p-아미노벤질옥시카르보닐 (p-aminobenzyloxycarbonyl) (PAB), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오)펜타노에이트 (N-Succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate) (SPP), N-숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥세인-1 카르복실레이트 (N-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1 carboxylate) (SMCC), N-숙신이미딜 (4-요오도-아세틸) 아미노벤조에이트 (N-Succinimidyl (4-iodo-acetyl) aminobenzoate) (SIAB), 및 6-말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노베닐옥시카르보닐 (6-maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenyloxycarbonyl) (MC-vc-PAB)로부터 선택되는 것인, ADC.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADC는 식 Ab-(L-MMAE)p를 가지고, p의 범위는 1 내지 8인 것인, ADC.
  10. 제9항에 있어서, 상기 링커는 MC-vc-PAB인 것인, ADC.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 다음을 포함하는 것인, ADC:
    (A) 중쇄 가변 영역(VH):
    (i) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 90% 또는 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하면서도 P-카드헤린에 대한 특이적 결합 친화력을 유지하며; 또는
    (iii) 서열번호 7에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상 (예를 들어 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 추가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함함; 및/또는
    (B) 경쇄 가변 영역(VL):
    (i) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
    (ii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하면서도 P-카드헤린에 대한 특이적 결합 친화력을 유지하며; 또는
    (iii) 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상 (예를 들어 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 추가, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함함.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 프레임워크 서열 내 예를 들어 VH 또는 VL 영역의 FRW1, FRW2, FRW3, 및/또는 FRW4의 아미노산의 하나 이상의 치환을 포함하는 것인, ADC.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 7에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8에 개시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, ADC.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 인간 IgG 불변 도메인, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 도메인, 바람직하게는 인간 IgG1 불변 도메인 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는 것인, ADC.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 중쇄는 서열번호 7에 개시된 중쇄 가변 영역 및 서열번호 9에 개시된 중쇄 불변 영역을 포함하고; 및
    (b) 경쇄는 서열번호 8, 27 또는 28에 개시된 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 10에 개시된 경쇄 불변 영역을 포함하는 것인, ADC.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체이고, 바람직하게, 완전 인간 단일클론 항체인 것인, ADC.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 ADC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 다음 단계를 포함하는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 ADC를 제조하는 방법:
    - 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 코딩하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 벡터의 발현에 적합한 조건 하에서 배양하는 단계;
    - 숙주 세포로부터 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 분리하는 단계; 및
    - 약물 모이어티의 친핵성 기를 링커 시약과 반응시켜 약물-링커 중간체 D-L을 형성한 다음, D-L을 항체 또는 이의 항원 결합 부분과 반응시키는 단계, 대안적으로, 항체를 링커 시약과 반응시켜 항체-링커 중간체 Ab-L을 형성한 후, Ab-L을 활성화된 약물 모이어티 D와 반응시켜 항체-약물 콘쥬게이트를 형성하는 단계.
  19. 제18항에 있어서, 상기 ADC의 평균 DAR은 약 1 내지 약 8의 범위인 것인, 방법.
  20. 대상에서 P-카데린 관련 면역 반응이 조절되도록 청구항 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 ADC 또는 청구항 제17항의 약제학적 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는 것인, 대상에서 P-카드헤린 관련 면역 반응을 조절하는 방법,
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 ADC 또는 제17항의 약제학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인, 대상에서 P-카드헤린 양성 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 암은 유방암, 결장암, 폐암, 난소암, 흑색종, 방광암, 신세포암, 간암, 전립선암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 식도암, 자궁내막암, 피부암, 두경부암, 고환암, 갑상선암, 요로상피암, 비호지킨 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma) 및 다발성 골수종으로부터 선택되는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 암은 유방암 (예: 유방 관 암종(breast ductal carcinoma)), 폐암 (예: 비소세포폐암) 또는 결장암인 것인, 방법.
  24. p-카드헤린 양성 암을 진단, 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 정의된 ADC의 용도.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, P-카드헤린 양성 암을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것인, ADC.
  26. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 ADC를 포함하는 컨테이너를 포함하는 암 치료 또는 진단용 키트.


KR1020237043207A 2021-05-13 2022-05-12 항-p-카드헤린 항체를 포함하는 항체 콘쥬게이트 및 이의 용도 KR20240007939A (ko)

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JP2006515318A (ja) * 2002-10-29 2006-05-25 ファルマシア・コーポレーション 特異的に発現する癌関連遺伝子、それによってコードされるポリペプチドおよびその使用方法
MX2007013304A (es) * 2005-04-26 2007-12-13 Pfizer Anticuerpos de p-caderina.
US8703920B2 (en) * 2008-11-10 2014-04-22 The Regents Of The University Of California Fully human antibodies against N-cadherin
WO2013150623A1 (ja) * 2012-04-04 2013-10-10 株式会社ペルセウスプロテオミクス 抗ｃｄｈ３（ｐ－カドヘリン）抗体の薬剤コンジュゲート
US9644028B2 (en) * 2013-02-15 2017-05-09 Perseus Proteomics Inc. Anti-CDH3 humanized antibody, drug conjugate thereof, and use thereof
MA40913A (fr) * 2014-11-14 2017-09-20 Novartis Ag Conjugués anticorps-médicament
WO2016203432A1 (en) * 2015-06-17 2016-12-22 Novartis Ag Antibody drug conjugates

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