JP5828902B2 - 非拮抗性ｅｇｆｒ結合分子およびその免疫複合体 - Google Patents

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Description

本発明の分野
本発明は全般的に、ＥＧＦＲに結合する抗体、その抗原結合断片、ポリペプチド、および免疫複合体に関連する。特に、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することはないが、免疫複合体としてＥＧＦＲ過剰発現性腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を有する抗ＥＧＦＲ抗体およびその断片に関連する。本発明はまた、悪性腫瘍などの疾患を診断および治療するために、そのようなＥＧＦＲ結合分子を使用する方法に関連する。
本発明の背景
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲまたはＥｒｂＢ１またはＨＥＲ１）は、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）およびＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含む、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーのメンバーである。これらのＲＴＫは、リガンド結合性細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、１回膜貫通ドメイン、ならびに触媒性キナーゼドメインおよびＣ末端テールを含む細胞内ドメインからなる相同性構造を共通して有する。受容体の二量体化と細胞内領域のトランスリン酸化を誘導する細胞外リガンドの結合によって、ＨＥＲキナーゼシグナル伝達が開始される。これらの事象は、細胞の増殖と生存にとって重要な下流シグナル伝達経路の活性化に至る最初のシグナルを生成する。
ＥＧＦＲは、頭部頸部腫瘍、大腸直腸腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、腎臓腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍および他の固形腫瘍などの上皮細胞起源の多くの種類の悪性腫瘍で過剰発現している。ＥＧＦＲ介在性シグナル伝達経路は腫瘍の成長と転移の進行において重要な役割を果たし、ＥＧＦＲを腫瘍治療の好適な標的とする（非特許文献１、非特許文献２）。現時点では、２つの小分子型チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）（エルロチニブ（タルセバ）およびゲフィチニブ（イレッサ））および２つの裸モノクローナル抗体（セツキシマブ（エルビタックス）およびパニツムマブ（ベクチビックス））を含む４つのＥＧＦＲ標的化薬剤が、大腸直腸癌、膵臓癌、頭部頸部癌および非小細胞性肺癌の治療に承認されている。これらの抗ＥＧＦＲ薬剤はＥＧＦＲの活性化と下流シグナル伝達を強固に阻害する。ＴＫＩはＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインへの結合についてＡＴＰと競合し（非特許文献３）、一方、前記の２つのモノクローナル抗体は前記受容体への結合についてＥＧＦＲリガンドと競合する（非特許文献４、 非特許文献５、非特許文献６）。
抗ＥＧＦＲ療法は完璧ではない。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害はある種の腫瘍で有効なだけである。例えば、抗ＥＧＦＲ抗体の有効性は、ＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡおよびＰＴＥＮの変異を有する大腸直腸癌患者では顕著に低下する（非特許文献７、非特許文献８）。さらに、小分子型ＥＧＦＲ阻害剤の活性は、活性化ＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者に限定される（非特許文献９、非特許文献１０、 非特許文献１１）。また、ＥＧＦＲ療法により皮膚傷害になる。皮膚の基底上皮細胞におけるＥＧＦＲ発現は表皮の正常な発生と生理に重要な役割を果たし、そして、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害が、ざ瘡様の皮膚発疹、皮膚乾燥、掻痒症、爪周囲炎、頭髪異常、粘膜炎およびまつ毛または顔の毛の成長の上昇を含む様々な皮膚傷害を引き起こす（非特許文献１２に概説される）。生命を危うくすることは滅多にないが、皮膚傷害は、患者の生活の質を低下させる身体的および精神社会的不快感の原因となる。さらに、患者の約１０％では、皮膚傷害が非常に重篤であるため、ＥＧＦＲ阻害剤の臨床成果を損なう治療の中断または中止が必要になる。
したがって、正常な組織に無害であるが、ＥＧＦＲ過剰発現性悪性腫瘍の治療になお非常に有効である改良型抗ＥＧＦＲ療法の必要性が存在する。この特定の必要性を処理するため、本発明は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することはないが、免疫複合体としてＥＧＦＲ発現性腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を有するユニークなＥＧＦＲ抗体に焦点を合わせる。
Ｂａｓｅｌｇａ， Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ， ７：２−８ （２００２） Ｙａｒｄｅｎ ａｎｄ Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ２：１２７−１３７ （２００１） Ｂａｓｅｌｇａ ａｎｄ Ａｒｔｅａｇａ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２３：２４４５−２４５９ （２０００５） Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２５９：７７５５−７７６０ （１９８４） Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １：１３１１−１３１８ （１９９５） Ｐｒｅｗｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ４：２９５７−２９６６ （１９９８） Ｄｅ Ｒｏｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ， １１：７５３−７６２ （２０１０） Ｂａｒｄｅｌｌｉ ａｎｄ Ｓｉｅｎｎａ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ２８： １２５４−１２６１ （２０１０） Ｌｉｎａｒｄｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ， ６： ３５２−３６６ （２００９） Ｐａｚ−Ａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ， １４： ５１−６９ （２００９） Ｍｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｃｏｖ Ｍｅｄ， ８： ２２７−２３１ （２００９） Ｌｉ ａｎｄ Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ， Ｔａｒｇ Ｏｎｃｏｌ ４：１０７−１１９ （２００９）
本発明の簡単な概要
本発明は全般的に、ＥＧＦＲに結合する抗体、その抗原結合断片、ポリペプチド、および免疫複合体に関連する。特に、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することはないが、免疫複合体としてＥＧＦＲ過剰発現性腫瘍細胞に対して高い細胞傷害性を有する抗ＥＧＦＲ抗体およびその断片に関連する。本発明はまた、悪性腫瘍などの疾患を診断および治療するために、そのようなＥＧＦＲ結合分子を使用する方法に関連する。
したがって、１つの実施形態において、本発明はヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片を対象とし、前記抗体は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）のＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しないという特徴からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する。
別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しないという特徴からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する。
別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しないという特徴からなる群より選択される少なくとも３つの特徴を有する。
別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しないという特徴からなる群より選択される少なくとも４つの特徴を有する。
別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しないという特徴からなる群より選択される少なくとも５つの特徴を有する。
別の実施形態において、本発明はヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片を対象とし、前記抗体は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しない。
別の実施形態において、本発明はヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片を対象とし、前記抗体は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しない、ならびに（ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導することはない。
別の実施形態において、本発明はヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片を対象とし、前記抗体は、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株とヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制しない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制しない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害しない、ならびに（ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導する。
別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１７〜２０からなる群より選択される基準ＶＨ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２１〜２４からなる群より選択される基準ＶＬ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＬ配列を含む。さらなる実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、基準ＶＨ配列およびＶＬ配列に対して少なくとも９５％同一なＶＨ配列およびＶＬ配列を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、基準ＶＨ配列およびＶＬ配列に対して少なくとも９９％同一なＶＨ配列およびＶＬ配列を含む。さらに別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）配列番号１７〜２０からなる群より選択されるＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２１〜２４からなる群より選択されるＶＬ配列を含む。
１つの実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は配列番号１７および配列番号２１を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は配列番号１８および配列番号２２を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は配列番号１９および配列番号２３を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は配列番号２０および配列番号２４を含む。
１つの実施形態において、本発明は、同一のヒトＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）配列番号１７のＶＨポリペプチドおよび配列番号２１のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｂ）配列番号１８のＶＨポリペプチドおよび配列番号２２のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｃ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２３のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに（ｄ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体からなる群より選択される抗体を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲへの基準抗体の結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記基準抗体は、（ａ）配列番号１７のＶＨポリペプチドおよび配列番号２１のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｂ）配列番号１８のＶＨポリペプチドおよび配列番号２２のＶＬポリペプチドを含む抗体、（ｃ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２３のＶＬポリペプチドを含む抗体、ならびに（ｄ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体からなる群より選択される。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリンａ軽鎖可変領域を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１、配列番号４および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号４および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１、配列番号５および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号５および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号７および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号７および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号９および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、前記抗体または抗原結合断片は、（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号９および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。
１つの実施形態において、本発明は、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供し、前記抗体またはその抗原結合断片は、（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号１０および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む。別の実施形態において、（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号１０および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項２７に記載の抗体または抗原結合断片。
１つの実施形態において、本発明の抗体または抗原結合断片は、ネズミ科、非ヒト、ヒト化、キメラ、再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）、またはヒト抗体または抗原結合断片である。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は全長型抗体である。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片は抗原結合断片である。別の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２、またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む。
本発明はまた、本明細書において記載されるＶＨ配列およびＶＬ配列を含むポリペプチドを提供する。
１つの実施形態において、本発明は、実質的に類似の結合親和性でヒトＥＧＦＲとマカクＥＧＦＲの両方に結合する抗体またはポリペプチドを提供する。１つの実施形態において、前記抗体またはポリペプチドは約１．０〜約１０ｎＭのＫｄでヒトＥＧＦＲとマカクＥＧＦＲに結合する。別の実施形態において、前記抗体またはポリペプチドは約１．０ｎＭまたはそれより良いＫｄでヒトＥＧＦＲとマカクＥＧＦＲに結合する。別の実施形態において、フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅまたは放射免疫アッセイによって結合親和性が測定される。
１つの実施形態において、本発明は、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片またはポリペプチドを産生する単離された細胞を提供する。
１つの実施形態において、本発明は、本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片またはポリペプチドを作製する方法を提供し、方法は、（ａ）前記抗体、その抗原結合断片またはポリペプチドを発現する細胞を培養すること、および（ｂ）前記抗体、その抗原結合断片またはポリペプチドを前記培養細胞から単離することを含む。１つの実施形態において、前記細胞は真核細胞である。
１つの実施形態において、本発明は、式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫複合体を提供し、（Ａ）は本明細書において記載される抗体またはその抗原結合断片またはポリペプチドであり、（Ｌ）はリンカーであり、および、（Ｃ）は細胞傷害性薬剤であり、ならびに、前記リンカー（Ｌ）が（Ａ）を（Ｃ）に連結する。別の実施形態において、前記リンカーは、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、親水性リンカーおよびジカルボン酸ベースリンカーからなる群より選択される。別の実施形態において、前記リンカーは非切断可能リンカーである。別の実施形態において、前記リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群より選択される。さらなる実施形態において、前記リンカーはＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である。
別の実施形態において、前記免疫複合体は、マイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾型ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アリスタチン（ａｒｉｓｔａｔｉｎ）、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体からなる群より選択される細胞傷害性薬剤、または前記薬剤の前駆薬を含む。別の実施形態において、前記細胞傷害性薬剤はマイタンシノイドである。さらなる実施形態において、前記細胞傷害性薬剤はＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である。
１つの実施形態において、本発明は、抗体もしくはその抗原結合断片または本明細書において記載されるポリペプチドまたは本明細書において記載される免疫複合体、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態において、前記医薬組成物は、第２の抗癌剤を含む。
１つの実施形態において、本発明は、標識された本発明の抗体もしくはその抗原結合断片、ポリペプチドまたは免疫複合体を含む診断用試薬を提供する。１つの実施形態において、前記標識は、放射性標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤および金属イオンからなる群より選択される。
１つの実施形態において、本発明は、本明細書において記載される抗体もしくはその抗原結合断片、ポリペプチドまたは免疫複合体を含むキットを提供する。
１つの実施形態において、本発明は、免疫複合体または本明細書において記載される医薬組成物と細胞を接触させることを含む、ＥＧＦＲ発現細胞の成長を抑制する方法を提供する。別の実施形態において、前記細胞は腫瘍細胞である。
１つの実施形態において、本発明は、新生物を有する患者を治療する方法であって、治療上有効量の本明細書において記載される免疫複合体または医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、前記新生物は、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部および頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖器系の新生物からなる群より選択される。別の実施形態において、前記方法は、前記対象に第２の抗癌剤を投与することを含む。さらなる実施形態において、その第２の抗癌剤は化学療法剤である。
１つの実施形態において、本発明は、患者の細胞増殖障害を治療する方法であって、治療上有効量の本明細書において記載される免疫複合体または医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法を提供する。別の実施形態において、前記細胞増殖障害は、新生物の他に、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大症、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓過形成、および他の任意の細胞増殖障害からなる群より選択される。
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記配列は、配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に少なくとも９５％同一な配列である。さらなる実施形態において、前記配列は、配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に少なくとも９９％同一である。
１つの実施形態において、本発明は、配列番号２９〜４０に少なくとも９０％同一である配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２９〜４０に少なくとも９５％同一な配列を含む。さらなる実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、配列番号２９〜４０に少なくとも９９％同一な配列を含む。さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号１７〜４０からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施形態において、本発明は、本明細書において記載されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
特定の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）のＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、という特徴からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する前記抗体。
（項目２）
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、という特徴からなる群より選択される少なくとも２つの特徴を有する、項目１に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３）
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、という特徴からなる群より選択される少なくとも３つの特徴を有する、項目２に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目４）
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、という特徴からなる群より選択される少なくとも４つの特徴を有する、項目３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目５）
前記抗体または抗原結合断片が、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、という特徴からなる群より選択される少なくとも５つの特徴を有する、項目４に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目６）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下ではケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制する、（ｄ）１００ｎＭ以下ではＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制する、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害する、前記抗体。
（項目７）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、ならびに（ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導することがない、前記抗体。
（項目８）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する非拮抗性抗体またはその抗原結合断片であって、（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株およびヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのＴＧＦαのＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトとＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下ではＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制する、（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、ならびに（ｆ）ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導する、前記抗体。
（項目９）
（ａ）配列番号１７〜２０からなる群より選択される基準ＶＨ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＨ配列；および（ｂ）配列番号２１〜２４からなる群より選択される基準ＶＬ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＬ配列を含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１０）
前記ＶＨ配列およびＶＬ配列が前記基準ＶＨ配列およびＶＬ配列に少なくとも９５％同一である、項目９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１１）
前記ＶＨ配列およびＶＬ配列が前記基準ＶＨ配列およびＶＬ配列に対して少なくとも９９％同一である、項目１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１２）
（ａ）配列番号１７〜２０からなる群より選択されるＶＨ配列；および（ｂ）配列番号２１〜２４からなる群より選択されるＶＬ配列を含む、項目１１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１３）
配列番号１７および配列番号２１を含む、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１４）
配列番号１８および配列番号２２を含む、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１５）
配列番号１９および配列番号２３を含む、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１６）
配列番号２０および配列番号２４を含む、項目１２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目１７）
（ａ）配列番号１７のＶＨポリペプチドおよび配列番号２１のＶＬポリペプチドを含む抗体；
（ｂ）配列番号１８のＶＨポリペプチドおよび配列番号２２のＶＬポリペプチドを含む抗体；
（ｃ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２３のＶＬポリペプチドを含む抗体；ならびに
（ｄ）（ｄ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体
からなる群より選択される抗体と同一のヒトＥＧＦＲエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
（項目１８）
（ａ）配列番号１７のＶＨポリペプチドおよび配列番号２１のＶＬポリペプチドを含む抗体；
（ｂ）配列番号１８のＶＨポリペプチドおよび配列番号２２のＶＬポリペプチドを含む抗体；
（ｃ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２３のＶＬポリペプチドを含む抗体；ならびに
（ｄ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む抗体
からなる群より選択される基準抗体である前記基準抗体のヒトＥＧＦＲに対する結合を競合的に阻害する抗体またはその抗原結合断片。
（項目１９）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目２０）
（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号２および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目１９に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２１）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１、配列番号４および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目２２）
（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号４および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目２１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目２３）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、配列番号１、配列番号５および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目２４）
（ａ）それぞれ、配列番号１、配列番号５および配列番号３の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１１、配列番号１２および配列番号１３の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目２３に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２５）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号７および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目２６）
（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号７および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目２５に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２７）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号９および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目２８）
（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号９および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目２７に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目２９）
ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
（ａ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号６、配列番号１０および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）１つ、２つ、または３つの保存的アミノ酸置換を例外として、それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
（項目３０）
（ａ）それぞれ、配列番号６、配列番号１０および配列番号８の基準重鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
（ｂ）それぞれ、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６の基準軽鎖ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列およびＣＤＲ３配列に同一なＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
を含む、項目２９に記載の抗体または抗原結合断片。
（項目３１）
前記抗体またはその抗原結合断片がネズミ科、非ヒト、ヒト化、キメラ、再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）またはヒトのものである、項目１〜３０のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３２）
全長型抗体である、項目１〜３１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３３）
抗原結合断片である、項目１〜３１のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３４）
前記抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、項目１〜３３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
（項目３５）
項目１〜３４のいずれか１項に記載のＶＨ配列およびＶＬ配列を含むポリペプチド。
（項目３６）
前記抗体またはその抗原結合断片が実質的に類似の結合親和性でヒトとマカクの両方のＥＧＦＲに結合する、項目１〜３５のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目３７）
約１．０〜約１０ｎＭのＫｄでヒトとマカクのＥＧＦＲに結合する、項目３６に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目３８）
約１．０ｎＭまたはそれより良好なＫｄでヒトとマカクのＥＧＦＲに結合する、項目３７に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目３９）
フローサイトメトリー、Ｂｉａｃｏｒｅまたは放射免疫アッセイにより前記結合親和性が測定される、項目３６〜３８のいずれか１項に記載の抗体またはポリペプチド。
（項目４０）
項目１〜３９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、またはポリペプチドを産生する、単離された細胞。
（項目４１）
項目１〜３９、７３および７４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、またはポリペプチドを作製する方法であって、（ａ）項目４０に記載の細胞を培養すること；および（ｂ）前記培養細胞から前記抗体、その抗原結合断片、またはポリペプチドを単離することを含む、前記方法。
（項目４２）
前記細胞が真核細胞である、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫複合体であって、式中、
（Ａ）は項目１〜３９、７３、および７４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、またはポリペプチドであり；
（Ｌ）はリンカーであり；そして
（Ｃ）は細胞傷害性薬剤であり；そして、
式中、前記リンカー（Ｌ）が（Ａ）を（Ｃ）に連結する前記免疫複合体。
（項目４４）
前記リンカーが切断可能リンカー、非切断可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群より選択される、項目４３に記載の免疫複合体。
（項目４５）
前記リンカーが非切断可能リンカーである、項目４４に記載の免疫複合体。
（項目４６）
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群より選択される、項目４５に記載の免疫複合体。
（項目４７）
前記リンカーがＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）である、項目４６に記載の免疫複合体。
（項目４８）
前記細胞傷害性薬剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾型ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アリスタチン（ａｒｉｓｔａｔｉｎ）、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体または前記薬剤の前駆薬からなる群より選択される、項目４３〜４７のいずれか１項に記載の免疫複合体。
（項目４９）
前記細胞傷害性薬剤がマイタンシノイドである、項目４８に記載の免疫複合体。
（項目５０）
前記細胞傷害性薬剤がＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、項目４９に記載の免疫複合体。
（項目５１）
項目１〜３９、７３および７４のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくはポリペプチド、または項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
（項目５２）
第２の抗癌剤をさらに含む、項目５１に記載の医薬組成物。
（項目５３）
標識されている、項目１〜３９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくはポリペプチド、または項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む診断用試薬。
（項目５４）
前記標識が、放射性標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤および金属イオンからなる群より選択される、項目５３に記載の診断用試薬。
（項目５５）
項目１〜３９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくはポリペプチド、または項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体を含むキット。
（項目５６）
ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を抑制する方法であって、項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体または項目５１もしくは５２に記載の医薬組成物と前記細胞を接触させることを含む前記方法。
（項目５７）
前記細胞が腫瘍細胞である、項目５６に記載の方法。
（項目５８）
新生物を有する患者を治療する方法であって、前記患者に治療上有効量の項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体または項目５１もしくは５２に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
（項目５９）
前記新生物が腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部および頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖器系の新生物からなる群より選択される、項目５８に記載の方法。
（項目６０）
前記対象に第２の抗癌剤を投与することをさらに含む、項目５８または５９に記載の方法。
（項目６１）
前記の第２の抗癌剤が化学療法剤である、項目６０に記載の方法。
（項目６２）
患者における細胞増殖障害を治療する方法であって、前記患者に治療上有効量の項目４３〜５０のいずれか１項に記載の免疫複合体または項目５１もしくは５２に記載の医薬組成物を投与することを含む前記方法。
（項目６３）
前記細胞増殖障害が、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大症、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓過形成、、および新生物以外の他の任意の細胞増殖障害からなる群より選択される、項目６２に記載の方法。
（項目６４）
配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９０％同一であるポリペプチドをコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目６５）
前記配列が、配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９５％同一である、項目６４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６６）
前記配列が、配列番号１７〜２８からなる群より選択される配列に対して少なくとも９９％同一である、項目６５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６７）
配列番号２９〜４０に対して少なくとも９０％同一である配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目６８）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２９〜４０に対して少なくとも９５％同一である配列を含む、項目６７に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目６９）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２９〜４０に対して少なくとも９９％同一である配列を含む、項目６８に記載の単離されたポリヌクレオチド。
（項目７０）
配列番号１７〜４０からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
（項目７１）
項目６４〜７０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
（項目７２）
項目７１に記載のベクターを含む宿主細胞。
（項目７３）
２０１０年１０月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４２４を有する前記プラスミドＤＮＡによりコードされる抗体またはその抗原結合断片。
（項目７４）
２０１０年１０月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４２３を有する前記ハイブリドーマにより産生される抗体またはその抗原結合断片。
表記の抗ＥＧＦＲ抗体のヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）とサルＥＧＦＲ（ｍａＥＧＦＲ）抗原への結合親和性を説明する表を示す。 ＭＬ６６ ＶＬ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）の再現（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）におけるフレームワーク表面残基の特定の変化を描写する表を示す。 ＭＬ６６ ＶＬ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）の再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）配列とネズミ科対応物のアラインメントを示す。 ＭＬ−６６（黒四角形）とｈｕＭＬ−６６（白四角形）のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合を描写する線グラフを示す。 ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞（Ａ）およびヒト初代ケラチノサイト（Ｂ）でのリガンド誘導性ＥＧＦＲリン酸化における表記の抗ＥＧＦＲ抗体の効果を描写するウエスタンブロットデータを示す。 外来性ＥＧＦＲリガンドが存在しないときの、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞でのＥＧＦＲリン酸化への表記の抗ＥＧＦＲ抗体の効果を描写するウエスタンブロットデータを示す。 ｍｕＥＧＦＲ−８（菱形）とｈｕＭＬ６６（白四角）が存在するときの、ビオチン化ＴＧＦα（Ａ）とＥＧＦ（Ｂ）リガンドの腫瘍細胞への結合を描写する線グラフを示す。 図８は、ヒト初代ケラチノサイトの増殖の抑制におけるｍｕＥＧＦＲ−８（菱形）とｈｕＭＬ６６（白四角）の能力を描写する線グラフを示す。 表記の濃度のＥＧＦ（Ａ）またはＴＧＦ （Ｂ）により刺激されたＭＣＦ１０Ａ細胞増殖の抑制におけるｍｕＥＧＦＲ−８（菱形）とｈｕＭＬ６６（白丸）の能力を描写する線グラフを示す。 ＮＣＩ−Ｈ２９２（Ａ）細胞株とＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（Ｂ）細胞株の基底細胞増殖の抑制におけるｍｕＥＧＦＲ−８（菱形）とｈｕＭＬ６６（白丸）の能力を描写する線グラフを示す。 表記の濃度のｍｕＥＧＦＲ−８（菱形）とｈｕＭＬ６６（白四角）が存在するときの、ビオチン化５２８抗体（Ａ）とセツキシマブ（Ｂ）のＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合を描写する線グラフを示す。 表記の濃度のｈｕＭＬ６６とｃｈＫＴＩ抗体が存在するときの、ＮＫ細胞媒介性の特異的殺滅％を描写する線グラフを示す。 図１３は、ｈｕＭＬ６６裸抗体（Ａ）とｍｕＥＧＦＲ−８裸抗体（Ｂ）およびそれらの対応するＤＭｘ複合体の結合曲線を示す。 ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株（Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株（Ｂ）およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞株（Ｃ）におけるＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体およびＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体の細胞傷害活性を描写する線グラフを示す。 過剰なＭＬ６６ブロッキング抗体が存在するとき、または、ＭＬ６６ブロッキング抗体が存在しないときの、ＫＢ細胞株におけるＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の細胞傷害活性を描写する線グラフを示す。 ＮＣＩ−Ｈ２２６細胞株（Ａ）、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株（Ｂ）およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞株（Ｃ）におけるｍｕＥＧＦＲ−８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の細胞傷害活性を描写する線グラフを示す。 表記のマイタンシノイド複合体で処置されたマウスにおけるＫＢ腫瘍異種移植片の増殖を描写する線グラフを示す。
本発明の詳細な説明
本発明は、非アンタゴニスト特性を有する、新しいクラスのＥＧＦＲ結合分子を提供する。また、抗ＥＧＦＲ抗体の免疫複合体は、インビボ腫瘍モデルを用いて示されるように、思いのほかよくＥＧＦＲ発現細胞を殺滅する。
Ｉ．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語と言い回しを以下に定義する。
本明細書において使用される場合、「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は成熟型チロシンキナーゼ細胞表面受容体を指す。「可溶性ＥＧＦＲ」または「ｓＥＧＦＲ」という用語は、ＥＧＦＲの細胞外リガンド結合性ドメインを含むＥＧＦＲの一部を指す。より具体的には、ｓＥＧＦＲは成熟型ＥＧＦＲのアミノ酸１〜６１９を含む（Ｕｌｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｂｅｒｒａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ａ−４３１ Ｅｐｉｄｅｒｍｏｉｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃｅｌｌｓ， Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ． ３０９， ４１８−２５ （１９８６））。
「ＥＧＦＲ媒介性癌」という言い回しは、正常な、対応する上皮組織でのレベルよりも高いレベルにまでＥＧＦＲが異常に活性化されている上皮腫瘍を特徴とする癌を指す。これらの比較的高いレベルのＥＧＦＲの活性が多くの種類の癌で腫瘍の成長を促進する。そのような癌には非小細胞性肺癌、乳癌、大腸直腸癌、頭部および頸部癌および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲの異常な活性化は前記受容体の過剰発現、遺伝子増幅、活性化変異、受容体リガンドの過剰発現、および／またはＥＧＦＲ活性の調節因子の喪失により生じ得る。
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を通じて、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述のものの組合せなどの標的を認識し、そして、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、抗体が所望の生物活性を示す限り、完全型ポリクローナル抗体、完全型モノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、およびＦｖ断片など）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つの完全型抗体から形成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変型免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それらの、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと称される重鎖定常ドメインの識別に基づき、主要な５つのクラスの免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれかの抗体であり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは異なる、そして、周知のサブユニット構造と三次元構造を持つ。抗体は裸抗体、または、毒素、放射性同位体などの他の分子との複合体であり得る。
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原、例えば、ＥＧＦＲの生物活性を阻害する、または、低下させる抗体である。いくつかの実施形態において、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は抗原の生物活性を実質的に、または完全に阻害する。生物活性は１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％低下させられることが可能であり、または１００％低下させられることさえ可能である。
抗体に関して、「ＥＧＦＲの活性化を阻害する能力」という言い回しは、本明細書において使用される場合、そのＥＧＦＲへの結合がヒトＥＧＦＲの活性化とその受容体が活性化して生じるヒトＥＧＦＲの生物活性を阻害することになる抗体に当てはまると意図される。細胞増殖アッセイ、アポトーシスアッセイ、受容体結合アッセイ、受容体リン酸化アッセイ、またはマウス腫瘍モデルのいずれかを用いて決定されるような（実施例を参照のこと）、ＥＧＦＲ生物活性の１つ以上の指標を測定することにより、ＥＧＦＲの活性化を阻害する抗体の能力をアッセイすることができる。
「抗ＥＧＦＲ抗体」または「ＥＧＦＲ結合抗体」という用語は、抗体が診断薬および／または治療薬としてＥＧＦＲを標的とすることに有用である程に、充分な親和性でＥＧＦＲに結合可能である抗体を指す。いくつかの抗ＥＧＦＲ抗体が当技術分野において公知である。例えば、セツキシマブ（Ａｂ２２５）および５２８Ａｂは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，９４３，５３３号に記載される。
抗ＥＧＦＲ抗体の無関連の非ＥＧＦＲタンパク質への結合の程度は、例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）により測定して、前記抗体のＥＧＦＲへの結合の約１０％未満であり得る。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合抗体は１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
「抗体断片」という用語は、完全型抗体の一部を指し、そして、完全型抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例にはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片およびＦｖ断片、線状抗体、単鎖抗体、および抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
「モノクローナル抗体」は、単一抗原性決定基、またはエピトープとの非常に特異的な認識および結合に関わる均一な抗体集団を指す。これは、典型的には様々な抗原性決定基に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は完全型モノクローナル抗体と全長型モノクローナル抗体の両方、ならびに抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変型免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、および形質導入動物を含むが、これらに限定されない様々な方法で作製されたそのような抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、または最小非ヒト（例えば、ネズミ科）配列を含むその断片である非ヒト（例えば、ネズミ科）抗体の形態を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター）のＣＤＲの残基により置換されるヒト免疫グロブリンである（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６）。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種由来の抗体の対応する残基により置換される。Ｆｖフレームワーク領域内および／または置換された非ヒト残基内のどちらかで、さらなる残基の置換により前記ヒト化抗体をさらに改変して、抗体特異性、親和性、および／または能力を改良し、そして、最適化することができる。概して、前記ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲ領域の全て、または実質的に全てを含む、少なくとも１つの、そして典型的には、２つ、または３つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、一方、ＦＲ領域の全て、または実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含み得る。ヒト化抗体を作製するために使用される方法の例は米国特許第５，２２５，５３９号に記載される。
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単体で、または組合せて指す。重鎖と軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲはＦＲにより近位にまとめられ、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲの決定には、少なくとも２つの技術、すなわち、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， （５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．））； および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７−９４８））がある。さらに、ＣＤＲの決定技術において、これらの２つのアプローチの組合せが時には使用される。
可変ドメイン内の残基（軽鎖のおよそ残基１〜１０７および重鎖のおよそ残基１〜１１３）に言及する際にＫａｂａｔ番号付システムが一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１））。
Ｋａｂａｔでの、アミノ酸位置番号付は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ． （１９９１）において、抗体の編集について、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインに使用される番号付システムを指す。この番号付システムを用いて、可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮化、またはＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に応じて、実際の線状アミノ酸配列がより少ない、または付加的なアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろに単一アミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）、および重鎖ＦＲ残基８２の後ろに挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含むことができる。所与の抗体について、前記抗体の配列とＫａｂａｔ番号付により番号付けられた「標準」配列の相同性領域の整列により、残基のＫａｂａｔ番号付を決定することができる。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置に言及する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７ （１９８７））。Ｋａｂａｔ番号付法を用いて番号付けするとき、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲ−Ｈ１ループの末端は、ループ長に応じてＨ３２とＨ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ番号付法がＨ３５ＡとＨ３５Ｂに挿入を配し、３５Ａと３５Ｂのどちらも存在しない場合、ループを３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり、３５Ａと３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わるためである）。ＡｂＭ超可変領域はＫａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造的ループの間の妥協点を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用される。
「ヒト抗体」という用語は、ヒトにより産生された抗体、または、当技術分野において公知の技術を用いて作製される、ヒトにより産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義には完全型もしくは全長型抗体、その断片、ならびに／または、例えば、ネズミ科軽鎖ポリペプチドおよびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体などの少なくとも１つのヒト重鎖および／もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。
「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が２つ以上の種に由来する抗体を指す。典型的には、軽鎖と重鎖の両方の可変領域が、所望の特異性、親和性および能力を有する哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギなど）の１種に由来する抗体の可変領域に対応し、一方、定常領域が、その種での免疫反応の誘発を避けるために、別の種（通常、ヒト）に由来する抗体の配列に相同である。
「エピトープ」または「抗原性決定基」という用語は本明細書において互換的に使用され、そして、特定の抗体による認識と特異的な結合が可能である抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドであるとき、エピトープは連続的アミノ酸およびタンパク質の三次折り畳みにより並置される非連続的アミノ酸の両方から形成され得る。連続的アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際、保持されるが、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、典型的には、タンパク質変性の際、失われる。典型的には、エピトープは、特有の空間的構造を有する少なくとも３アミノ酸、およびより一般には少なくとも５アミノ酸、または８〜１０アミノ酸を含む。
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合性相互作用の強さの総計を一般的に指す。別途、示されない限り、本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子Ｘのその相手Ｙへの親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）により表され得る。本明細書において記載される方法を含む、当技術分野において公知の一般的な方法により親和性を測定することができる。低親和性抗体は一般に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、速やかに抗原に結合し、より長く結合し続ける傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野において公知であり、本発明の目的のためにそれらのいずれも使用可能である。具体的で例示的な実施形態が以下に説明される。
結合親和性に言及するために本明細書において使用されるとき、「あるいはそれより良好な（ｏｒ ｂｅｔｔｅｒ）」は、分子とその結合相手の間のより強固な結合を指す。本明細書において使用されるとき、「あるいはそれより良好な（ｏｒ ｂｅｔｔｅｒ）」は、より小さいＫｄ数値により表される、より強固な結合を指す。例えば、「０．６ｎＭまたはそれより良好な（ｏｒ ｂｅｔｔｅｒ）」抗原への親和性を有する抗体の抗原への親和性は＜０．６ｎＭ、すなわち、０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭなど、または０．６ｎＭ未満の任意の値である。
「特異的に結合する」という表現により、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、そして、その結合が抗原結合ドメインとエピトープの間のいくらかの相補性を必要とすることが一般に意味される。この定義によれば、抗体が無作為で無関連のエピトープに結合するよりも容易に、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合するとき、その抗体はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。ある抗体があるエピトープに結合するその相対的親和性の意味を修飾するために、「特異性」という用語が本明細書において使用される。例えば、抗体「Ａ」は抗体「Ｂ」よりも所与のエピトープに高い特異性を持つとみなされることが可能である、または、抗体「Ａ」は、関連のエピトープ「Ｄ」に対するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言われることが可能である。
「優先的に結合する」という表現により、抗体が、関連の、同様の、相同の、または類似のエピトープに結合するよりも容易にエピトープに特異的に結合することが意味される。したがって、所与のエピトープに「優先的に結合する」抗体は、たとえ、そのような抗体が関連のエピトープと交差反応することができても、前記の関連のエピトープよりもそのエピトープに結合しやすいであろう。
基準抗体の所与のエピトープへの結合を、いくらか阻害する程度にまで、そのエピトープに抗体が優先的に結合する場合、その抗体は、前記エピトープへの基準抗体の結合を「競合的に阻害する」と言われる。競合的阻害は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイにより決定され得る。抗体が、所与のエピトープへの基準抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言われることが可能である。
「実質的に同様の」または「実質的に同じ」という言い回しは、本明細書において使用される場合、当業者が、２つの値の間の差異を、前記値（例えば、Ｋｄ値）により判断される生物学的特性に関して、生物学的および／または統計的にほとんど無い、または、全く無いとみなすほど、その２つの数値の間の類似性の程度が十分に高いことを示す（一般に、一方は本発明の抗体に関連し、他方は基準／対照抗体に関連する）。前記の２つの値の間の差異は、基準／対照抗体の値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満であり得る。２つの「実質的に同様の結合親和性」の間の差異は一般的に、基準／対照抗体の値の関数として、約１０％未満である。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、自然では見出されない形状のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物には、それらが自然で見いだされる形状ではもはやない程度にまで精製されたものが含まれる。いくつかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は実質的に純粋である。
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入汚染物質が無い）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である物質に当てはまる。
「免疫複合体」または「複合体」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞結合薬剤（すなわち、抗ＥＧＦＲ抗体、またはその断片）に結合した化合物またはその誘導体を指し、そして、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａにより定義され、式中、Ｃ＝細胞毒素、Ｌ＝リンカー、およびＡ＝細胞結合薬剤または抗ＥＧＦＲ抗体または抗体断片である。免疫複合体はまた順序が逆の一般式：Ａ−Ｌ−Ｃによっても定義され得る。
「リンカー」は、化合物、通常は、マイタンシノイドなどの薬品を抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片などの細胞結合薬剤に安定な共有結合により連結することができる任意の化学部分である。前記の化合物または抗体が活性を有するままでいる条件で、リンカーは、酸誘導性切断、光誘導性切断、ペプチダーゼ誘導性切断、エステラーゼ誘導性切断およびジスルフィド結合切断を受けやすい、または、それらに対し実質的に耐性を有する可能性がある。適切なリンカーは当技術分野においてよく知られており、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基が含まれる。リンカーにはまた、荷電リンカー、および、本明細書において記載され、および、当技術分野において公知であるようなその親水性型が含まれる。
「癌」および「癌性」という用語は、未制御の細胞増殖を特徴とする細胞集団を有する哺乳類動物での生理的状態を指す、または説明する。癌の例には癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病が含まれるが、これらに限定されない。「腫瘍」および「新生物」は過剰な細胞成長または増殖の結果生じる、前癌性傷害を含む良性（非癌性）か悪性（癌性）のどちらかの１つ以上の細胞を指す。治療され得る、および／または、予防され得る「癌」または「腫瘍原性」疾患の例には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経系（中枢および末梢の）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、および泌尿生殖器系の新生物が含まれる。
「癌細胞」、「腫瘍細胞」という用語および文法上の相当語は、腫瘍細胞集団の大部分を含む非腫瘍原性細胞と腫瘍原性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、腫瘍または前癌性傷害に由来する細胞集団の全体を指す。本明細書において使用される場合、再生し、そして、腫瘍細胞に分化する能力に欠く腫瘍細胞のみに言及し、癌幹細胞から区別するときは、「腫瘍細胞」という用語は「非腫瘍原性」という用語により修飾される。
「対象」という用語は、特定の治療の受容者であり得る、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳類動物）を指す。典型的には、「対象」および「患者」という用語は、ヒト対象に関して、本明細書において互換的に使用される。
１つ以上のさらなる治療薬「との併用」投与には同時（共同）投与および任意の順番の連続投与が含まれる。
「医薬製剤」という用語は、有効成分の生物活性が有効であることを可能にするような形態であり、そして、その製剤が投与されるであろう対象にとって受け入れがたいほど毒性が有る追加的な成分は含まない調剤薬を指す。前記製剤は無菌であり得る。
本明細書において開示されるような抗体の「有効量」は、具体的に記述されている目的を実行するために充分な量である。「有効量」は、記述されている目的に関連して、経験的に、およびルーチン的に決定され得る。
「治療上有効量」という用語は、対象または哺乳類動物での疾患または傷害を「治療する」ために有効な抗体または他の薬品の量を指す。癌の場合では、治療上有効量の薬品は、癌細胞の数を減らし、腫瘍サイズを減らし、周辺の器官への癌細胞の浸潤を抑制し（すなわち、ある程度遅らせる、または停止させる）、腫瘍転移を抑制し（すなわち、ある程度遅らせる、または停止させる）；腫瘍の成長をある程度抑制し；および／または癌に伴う症状の１つ以上をある程度除去することができる。本明細書における「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」の定義を参照のこと。前記薬品が増殖を防止することができる、および／または、存在している癌細胞を殺滅することができるという点で、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。「予防上有効量」は、所望の予防的結果を達成するのに必要な投薬量と必要な期間の有効な量を指す。必然的ではないが、典型的には、疾患前、または疾患の初期の段階で予防的用量が対象に用いられるので、予防上有効量は治療上有効量より少ない。
「標識」という語は、本明細書において使用されるとき、「標識化」抗体を作製するように直接的または間接的に抗体と複合体化される検出可能な化合物または組成物を指す。標識はそれ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であり得るか、酵素標識の場合では、検出可能である基質化合物または組成物の化学的変化を触媒することができる。
「化学療法剤」は、作用機序に関係なく、癌の治療に有用な化学化合物である。化学療法剤には、例えば、リツキシマブおよびシクロホスファミドなどのＣＤ２０のアンタゴニスト、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレジニゾン（ｐｒｅｄｉｎｉｓｏｎｅ）、フルダラビン、エトポシド、メトトレキサート、レナリドミド、クロラムブチル、ベンタムスチンならびに／またはそのような化学療法剤の改変版が含まれる。
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｏ ｔｒｅａｔ）」または「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」または「緩和（ｔｏ ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」などの用語は、１）診断された病状または障害を治癒する、遅滞させる、その症状を減少させる、および／または、その進行を停止させる治療手段と２）目的の病状または障害の発生を防止する、および／または、遅延させる予防的または防止的手段の両方を指す。したがって、治療を必要とする人には、既に障害を有する人、障害を持ちやすい人、および障害が防止される予定である人が含まれる。ある実施形態において、患者が次のうちの１つ以上を示す場合、その対象は本発明の方法に従って癌の「治療」が成功している：癌細胞の数の減少または癌細胞の完全な不在；腫瘍サイズの減少；例えば、癌の軟組織および骨への延展を含む、周辺の器官への癌細胞の浸潤の阻害またはその不在；腫瘍転移の阻害またはその不在；腫瘍の成長の阻害またはその不在；特定の癌に伴う１つ以上の症状の除去；疾病率と死亡率の低下；生活の質の改善；腫瘍原性の低下、腫瘍の腫瘍原性頻度または腫瘍原性能；腫瘍での癌幹細胞の数または発生頻度の低下；腫瘍原性細胞の非腫瘍原性状態への分化；またはそれら効果の組合せ。
「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において互換的に使用されるように、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、そして、それにはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾型ヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによって重合体に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドはメチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの、修飾型ヌクレオチドを含み得る。修飾が存在する場合は、重合体の構築の前、または後にヌクレオチドへの修飾が加えられ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは重合の後に、例えば、標識成分との複合体化によりさらに修飾され得る。他の種類の修飾には、例えば、「キャップ（ｃａｐ）」、天然ヌクレオチドの１つ以上の類似体との置換、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスフォトリエステル、ホスフォアミデート、カバメート（ｃａｂａｍａｔｅ）など）および荷電結合（例えば、ホスフォロチオエート、ホスフォロジチオエートなど）による修飾などのヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リシンなど）のような、ペンダント部分を含有する修飾、インターカレート剤（例えば、アクリジン、ソラーレンなど）を有する修飾、キレート剤（例えば、金属キレート剤、放射性金属キレート剤、ホウ素キレート剤、酸化金属キレート剤など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾型結合を有する修飾（例えば、α芳香族核酸など）、ならびにポリヌクレオチドの非修飾型が含まれる。さらに、糖に通常存在するヒドロキシル基のいずれかが、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基により置換され得、標準的な保護基により保護されることができ、または、さらなるヌクレオチドへのさらなる結合を準備するために活性化されることができ、または、固形支持体と複合体化されることができる。５’末端および３’末端のＯＨはリン酸化可能であり、または、１個から２０個の炭素原子のアミンまたは有機キャッピング基部分で置換できる。他のヒドロキシルはまた標準的な保護基に対して誘導化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースまたは２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの無塩基ヌクレオシド類似体を含む、一般的に当技術分野において公知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似型を含むことができる。１つ以上のホスフォジエステル結合が代わりの結合基によって置換され得る。これらの代わりの結合基には、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換され、各々ＲまたはＲ’が独立してＨまたは、所望によりエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含有する置換型もしくは非置換型アルキル（１〜２０Ｃ）である実施形態が含まれるが、これに限定されない。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに当てはまる。
「ベクター」という用語は、宿主細胞において目的の１つ以上の遺伝子または配列を送達でき、そして、所望により発現できるコンストラクトを意味する。ベクターの例には、ウイルス性ベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性濃縮剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などのある真核生物細胞が含まれるが、これらに限定されない。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸の重合体を指すために本明細書において互換的に使用される。その重合体は線状または分岐状であることができ、修飾型アミノ酸を含むことができ、そして非アミノ酸が割り込むことができる。その用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との複合体化などの他の任意の操作または修飾など、天然に、または介入により修飾されたアミノ酸重合体を包含することができる。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含むポリペプチドもまた定義に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体に基づいているので、ある実施形態において、前記ポリペプチドは単鎖または随伴鎖として存在し得ると理解される。
２つ以上の核酸またはポリペプチドに関しての「同一な」または「同一性」パーセントという用語は、前記配列の同一性の一部としてどのような保存的アミノ酸置換をも考慮することなく、一致が最大となるように比較および（必要に応じて、ギャップを挿入して）整列したとき、同一な、または特定のパーセンテージの同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列またはサブ配列を指す。配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査により同一性パーセントを測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において公知である。配列アラインメントアルゴリズムの１つのそのような非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：２２６４−２２６８に記載され、 Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９０：５８７３−５８７７において改変され、そしてＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれた（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３３８９−３４０２）アルゴリズムである。ある実施形態において、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−３４０２に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ２６６：４６０−４８０）、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア州）またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ社）は、配列を整列させるために使用され得る、他の公に利用可能であるソフトウェアである。ある実施形態において、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはＧＣＧソフトウェアのＧＡＰプログラムを用いて（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または９０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６のレングスウェイトを用いて）決定される。ある別の実施形態において、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． （４８）：４４４−４５３ （１９７０））を組み込んだＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用することができる（例えば、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスかＰＡＭ２５０マトリックスのどちらか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイト、および１、２、３、４、５のレングスウェイトを用いる）。あるいは、ある実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ， ４：１１−１７ （１９８９））を用いて決定される。例えば、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を用いて、および残基表付きＰＡＭ１２０、１２のギャップレングスペナルティおよび４のギャップペナルティを用いて、同一性パーセントを決定することができる。特定のアラインメントソフトウェアによる最大のアラインメントを得るための適切なパラメータは当業者により決定され得る。ある実施形態において、アラインメントソフトウェアの初期設定パラメータが使用される。ある実施形態において、第１アミノ酸配列の第２配列アミノ酸に対する同一性パーセンテージ「Ｘ」は１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、式中、Ｙは、（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムにより整列された）第１配列と第２配列のアラインメントにおいて同一性マッチとしてスコアされたアミノ酸残基の数であり、そしてＺは第２配列中の残基の総数である。第１配列の長さが第２配列よりも長い場合、第２配列に対する第１配列の同一性パーセントは、第１配列に対する第２配列の同一性パーセントよりも長いであろう。
非限定的な例としては、任意の特定のポリヌクレオチドが基準配列に対してある配列同一性パーセンテージを有しているかどうか（例えば、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一であるか、および、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか）、ある実施形態では、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ウィスコンシン配列解析パッケージ、Ｕｎｉｘ（登録商標）用第８版、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、５７５ サイエンス・ドライブ、マジソン、ウィスコンシン州５３７１１）を用いて決定することができる。Ｂｅｓｔｆｉｔは、２つの配列間の最も良い相同性区間を見つけ出すためにＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２ （１９８１）， ４８２−４８９）を使用する。特定の配列が本発明に従う基準配列に対して、例えば、９５％同一であるか決定するためにＢｅｓｔｆｉｔまたは他の任意の配列整列プログラムを使用するとき、同一性のパーセンテージが基準ヌクレオチド配列の全長にわたって計算され、そして、基準配列の総ヌクレオチド数の５％までの相同性のギャップが許容されるように、パラメータが設定される。
いくつかの実施形態において、本発明の２つの核酸またはポリペプチドが実質的に同一であり、これは、配列比較アルゴリズムを用いて、または目視検査により測定されるように、一致が最大となるように比較および整列すると、それらが少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、および、いくつかの実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一性を有していることを意味する。少なくとも約１０残基、約２０残基、約４０〜６０残基の長さの、またはその間の任意の介在値の配列領域にわたって同一性が存在することが可能であり、そして、６０〜８０残基よりも長い領域、例えば、少なくとも約９０〜１００残基にわたって同一性が存在することが可能であり、そして、いくつかの実施形態では、例えば、ヌクレオチド配列のコーディング領域などの比較されている配列の全長にわたってその配列が実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが当技術分野において定義されており、それらは塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、チロシンのフェニルアラニンへの置換は保存的置換である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは抗体の抗原、すなわち、前記ポリペプチドまたは抗体が結合するＥＧＦＲへの結合を抑止しない。抗原結合を排除しないヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は当技術分野において周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３２： １１８０−１ １８７ （１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １２（１０）：８７９−８８４ （１９９９）、および Ｂｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：．４１２−４１７ （１９９７）を参照のこと）。
本開示および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途、文脈から明確に指示されない限り、複数形を含む。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて実施形態が本明細書において記載される場合、その他の点では、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から基本的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される類似の実施形態もまた提供されると理解される。
「Ａおよび／またはＢ」などの句で使用されるような「および／または」という用語は、本明細書において、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」、ならびに「Ｂ」のどれも含むとされる。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの句で使用されるような「および／または」という用語は、次の実施形態：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）のそれぞれを包含するとされる。
ＩＩ．ＥＧＦＲ結合薬剤
腫瘍は、多くの場合、様々なリガンドリガンドに結合し、そして、無制限の腫瘍の成長を促進する成長因子受容体を過剰発現する。そのような成長因子受容体の１つの例は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーの受容体である。
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質ファミリーのメンバーによるシグナル伝達は、リガンドの結合により引き起こされるホモ二量体またはヘテロ二量体の形成に依存する。この受容体ファミリーは４つの膜結合型タンパク質、すなわちＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３およびＨＥＲ４からなる。これらのタンパク質の過剰発現は、乳房、大腸、卵巣、子宮内膜、胃、膵臓、前立腺および唾液腺の癌を含むが、これらに限定されない、多くの種類の癌の予後不良と相関づけられている。多数のグループが、腫瘍の成長を抑制するために、ＥＧＦＲタンパク質ファミリーの個々のメンバー（例えば、ＨＥＲ２／ｎｅｕまたはＥＧＦＲ）を標的とする戦略を開発してきているが、その治療のうち、これらの形態の癌を最終的に治癒させると証明されているものは無い。
本発明に従って、ＥＧＦＲに特異的に結合する新規の薬剤（例えば、抗体）が提供される。これらの新規の薬剤はＥＧＦＲ非拮抗性である。しかしながら、（例えば、免疫複合体として）エフェクターに結合するとき、前記免疫複合体が作用して、標的細胞の成長および／または増殖を抑制することができるように、そのエフェクターは殺活性をレスキューする。
したがって、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合する薬剤を提供する。これらの薬剤は本明細書において「ＥＧＦＲ結合薬剤」と称される。記載されるＥＧＦＲ結合薬剤は、非拮抗性抗体であるという点で先行技術のＥＧＦＲ結合薬剤と異なり、そして、それらはわずかに作動性であり得る。
ある実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合薬剤は抗体、免疫複合体またはポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤はヒト化抗体である。
ある実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合薬剤は次の作用のうちの１つ以上を有する：腫瘍細胞の増殖を抑制する、腫瘍中の癌幹細胞の出現頻度を低下させることにより腫瘍の腫瘍原性を低減させる、腫瘍の成長を抑制する、生存率を増加させる、腫瘍細胞の細胞死を引き起こす、腫瘍原性細胞を非腫瘍原性状態に分化させる、または腫瘍細胞転移を防止する。
いくつかの実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合薬剤は腫瘍体積を低下させることができる。ＥＧＦＲ結合薬剤の腫瘍体積を低下させる能力は、例えば、対照被検者の腫瘍体積の中央値で除算された治療対象の腫瘍体積の中央値である、％Ｔ／Ｃ値を測定することにより評価される。いくつかの実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤を用いる治療の結果、％Ｔ／Ｃ値が約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満または約５％未満になる。
ある実施形態において、ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する免疫複合体または他の薬剤が細胞傷害性薬剤による細胞死を引き起こす。例えば、ある実施形態において、ヒトＥＧＦＲ抗体に対する抗体が、ＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞においてタンパク質の内部移行により活性化されるマイタンシノイドと複合体化される。ある別の実施形態において、前記薬剤または抗体は複合体化されていない。
ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤は腫瘍の成長を抑制することができる。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤はインビボで（例えば、異種移植片マウスモデルおよび／または癌を有するヒトで）腫瘍の成長を抑制することができる。
ＥＧＦＲ結合薬剤はＥＧＦＲ抗体ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８ならびにその断片、異型体および誘導体を含む。ＥＧＦＲ結合薬剤はまた、抗体ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８と同じＥＧＦＲエピトープに特異的に結合するＥＧＦＲ結合薬剤を含む。ＥＧＦＲ結合薬剤はまた、抗体ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８を競合的に阻害するＥＧＦＲ結合薬剤を含む。ＭＬ６６の重鎖配列および軽鎖配列をコードするプラスミドは２０１０年１０月２１日に米国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）に寄託され、そして、ＰＴＡ−１１４２４の受託番号を与えられた。ＥＧＦＲ−８をコードするハイブリドーマは２０１０年１０月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして、ＰＴＡ−１１４２３の受託番号を与えられた。
ＥＧＦＲ結合薬剤はまた、ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８の重鎖ＣＤＲ配列および軽鎖ＣＤＲ配列を含むＥＧＦＲ結合薬剤を含む。ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８のＣＤＲ配列は、ネズミ科抗体とヒト化抗体の両方だが、下記の表１および２に記載される。
ＥＧＦＲ結合分子は、ＣＤＲ当たり、４つまでの（すなわち、０、１、２、３、または４つの）保存的アミノ酸置換を有するＭＬ６６またはＥＧＦＲ−８のＣＤＲを含む、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体、または抗原結合断片であり得る。
ポリペプチドは、本明細書において記載される個々の可変軽鎖または可変重鎖のうちの１つを含み得る。抗体およびポリペプチドはまた可変軽鎖と可変重鎖の両方を含み得る。ネズミ科およびヒト化ＭＬ６６およびＥＧＦＲ−８抗体の可変軽鎖配列および可変重鎖配列が下記の表３および４に提供される。
（ａ）配列番号１７〜２０に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号２１〜２４に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドもまた提供される。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号１７〜２４に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、ある実施形態において、前記ポリペプチドは（ａ）配列番号１７〜２０に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号２１〜２４に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、前記ポリペプチドは（ａ）配列番号１７〜２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび／または（ｂ）配列番号２１〜２４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合するネズミ科、キメラ、またはヒト化抗体である。ある実施形態において、配列番号１７〜２４に対してあるパーセンテージの配列同一性を有する前記ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみによって、配列番号１７〜２４と異なる。
（ａ）配列番号２５および２７に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号２６および２８に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含むポリペプチドもまた提供される。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号２５〜２８に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。したがって、ある実施形態において、前記ポリペプチドは（ａ）配列番号２５および２７に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号２６および２８に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、前記ポリペプチドは（ａ）配列番号２５および２７のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび／または（ｂ）配列番号２６および２８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する抗体および／またはポリペプチドである。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合するヒト化抗体である。ある実施形態において、配列番号２５〜２８に対してあるパーセンテージの配列同一性を有する前記ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換のみにより、配列番号２５〜２８と異なる。
Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５により説明されるものなどの、ハイブリドーマ方法を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。免疫抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発するために、前記ハイブリドーマ方法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物が上記のように免疫される。リンパ球はまたインビトロで免疫され得る。免疫後、リンパ球を単離し、そして、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適切な骨髄腫細胞株と融合して、次に未融合のリンパ球と骨髄腫細胞から選別することができるハイブリドーマ細胞を形成する。免疫沈澱、イムノブロッティングにより、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））により判定されるような、選択された抗原に対して特異的な指向性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、その後、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８６）を用いるインビトロ培養で、または動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖ができる。その後、前記モノクローナル抗体は培養液または腹水から、ポリクローナル抗体について上述したように精製され得る。
あるいは、モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるように、組換えＤＮＡ法を用いて作製され得る。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、前記抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲなどにより成熟型Ｂ細胞またはハイブリドーマ細胞から単離され、そして、それらの配列は従来の手法を用いて決定される。その後、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドは適切な発現ベクターにクローン化され、本来、免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入されると、その宿主細胞によってモノクローナル抗体が作製される。また、所望の種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を、記載されるように、所望の種のＣＤＲを発現するファージディスプレイライブラリーから単離することができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ， ３５２：６２４−６２８、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７）。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、別の抗体を作製するために組換えＤＮＡ技術を用いて、多種多様な方法でさらに改変され得る。いくつかの実施形態において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインが、１）キメラ抗体を作製するために、例えば、ヒト抗体のそれらの領域の代わりに置換されることができ、または、２）融合抗体を作製するために非免疫グロブリンポリペプチドの代わりに置換されることができる。いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体の所望の抗体断片を作成するために、前記定常領域が短縮または除去される。モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化するために、可変領域の部位特異的突然変異形成または高密度突然変異形成が用いられ得る。
いくつかの実施形態において、ヒトＥＧＦＲに対するモノクローナル抗体はヒト化抗体である。ある実施形態において、そのような抗体は、ヒト対象に投与されるとき、抗原性とＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を低減させるために治療的に使用される。当技術分野において公知の様々な技術を用いてヒト化抗体が作製され得る。ある別の実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体はヒト抗体である。
当技術分野において公知の様々な技術を用いてヒト抗体が直接調製され得る。インビトロで免疫されて、または標的抗原に対して指向性を有する抗体を産生する免疫された個体から単離された、不死化ヒトＢリンパ球が作製され得る（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， ｐ． ７７ （１９８５）、Ｂｏｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７ （１）：８６−９５、および米国特許第５，７５０，３７３を参照のこと）。また、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １４：３０９−３１４、Ｓｈｅｅｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９５：６１５７−６１６２、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１、およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１）に記載されるように、ヒト抗体を発現するファージライブラリーからヒト抗体を選択することができる。抗体ファージライブラリーの作製と使用についての技術はまた、米国特許第５，９６９，１０８号、第６，１７２，１９７号、第５，８８５，７９３号、第６，５２１，４０４号、第６，５４４，７３１号、第６，５５５，３１３号、第６，５８２，９１５号、第６，５９３，０８１号、第６，３００，０６４号、第６，６５３，０６８号、第６，７０６，４８４号、および第７，２６４，９６３号、およびＲｏｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， ２００７， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ．， ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｍｂ．２００７．１２．０１８（それらの各々の全体が参照により組み込まれる）に記載される。親和性成熟戦略と鎖シャッフリング（ｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）戦略（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３、その全体が参照により組み込まれる）が当技術分野において公知であり、そして、高親和性ヒト抗体を作製するために用いられ得る。
ヒト化抗体はまた、免疫されると、内在性免疫グロブリンの産生が無い状態で、全レパートリーのヒト抗体を産生することができる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有する形質導入マウスで作製され得る。このアプローチは米国特許第５，５４５，８０７号、第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、および第５，６６１，０１６号に記載される。
この発明はまた、ＥＧＦＲを特異的に認識する二重特異性抗体を包含する。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープを特異的に認識し、そして結合することができる抗体である。その異なるエピトープは同じ分子（例えば、同じＥＧＦＲ）内にあるか、例えば、両方の前記抗体がＥＧＦＲ、ならびに、例えば、１）Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３）もしくはＦｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、もしくはＣＤ１６）などの白血球上のエフェクター分子、または２）以下に詳細が説明されるような細胞傷害性薬剤を特異的に認識し、そして結合することができるように、異なる分子内にあるかのどちらかであり得る。
例示的な二重特異性抗体は２つの異なるエピトープに結合することができ、そのうちの少なくとも１つは本発明のポリペプチドに由来する。あるいは、特定の抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中するように、免疫グロブリン分子の抗‐抗原アームは、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、もしくはＢ７）、またはＩｇＧのＦｃ受容体などの白血球上のトリッガー分子に結合するアームと組み合わせられ得る。二重特異性抗体はまた、特定の抗原を発現する細胞に細胞傷害性薬剤を向けるために使用され得る。これらの抗体は抗原結合アーム、および細胞傷害性薬剤またはＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡもしくはＴＥＴＡなどの放射性核種キレート剤に結合するアームを有する。二重特異性抗体を作製する技術は当技術分野において一般的である（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３， Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７−５３９、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１、Ｓｕｒｅｓｈ ｅｔ ａｌ， １９８６， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １２１：１２０、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５−３６５９、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：２１７−２２５、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：５３６８、および米国特許第５，７３１，１６８）。二価よりも多い価数を有する抗体もまた考慮される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る（Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０ （１９９１））。したがって、ある実施形態において、ＥＧＦＲに対する抗体は多重特異性である。
ある実施形態において、例えば、腫瘍透過性を増すために、抗体断片が提供される。抗体断片の作製について、様々な技術が知られている。伝統的に、これらの断片は完全型抗体のタンパク質分解性消化に由来する（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７−１１７、Ｂｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１）。ある実施形態において、抗体断片は組換え技術により作製される。Ｆａｂ抗体断片、Ｆｖ抗体断片およびｓｃＦｖ抗体断片は全て大腸菌または他の宿主細胞で発現され、そして分泌されることができ、したがって、大量のこれらの断片の産生が可能になる。そのような抗体断片はまた先に考察した抗体ファージライブラリーから単離され得る。前記抗体断片は、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号に記載されるように、線状抗体であり、そして、単一特異性または二重特異性であり得る。抗体断片作製の他の技術は当業者に明らかである。
本発明によれば、ＥＧＦＲに特異的な単鎖抗体の作製のために技術を適合させることができる（米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、ＥＧＦＲへの所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片、またはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体の敏速で有効な同定を可能にするＦａｂ発現ライブラリー（Ｈｕｓｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１ （１９８９））の構築のために方法を適合させることができる。（ａ）抗体分子のペプシン消化により作製されたＦ（ａｂ’）２断片；（ｂ）Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作製されたＦａｂ断片、（ｃ）パパインと還元剤を用いる抗体分子の処理により作製されたＦａｂ断片、および（ｄ）Ｆｖ断片を含むが、これらに限定されない抗体断片が当技術分野における技術により作製され得る。
特に抗体断片の場合、その血清中半減期を増加させるために抗体を修飾することがさらに望ましい場合がある。例えば、抗体断片内の適切な領域の突然変異によりサルベージ受容体結合エピトープを抗体断片に組み込むことによって、または、その後、抗体断片とどちらかの末端もしくは内部で融合されるペプチドタグに前記エピトープを（例えば、ＤＮＡ合成またはペプチド合成により）組み込むことによって、これが達成され得る。
ヘテロ複合体化抗体もまた本発明の範囲内にある。ヘテロ複合体化抗体は２つの共有結合により結合された抗体からなる。そのような抗体は、例えば、免疫細胞を望まない細胞にターゲティングすると主張されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。架橋剤を当然必要とする方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いて、インビトロで前記抗体を調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合形成により免疫毒素を構築することができる。この目的に適切な試薬の例にはイミノチオレート（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｔｈｙｌ−４−ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）が含まれる。
本発明の目的のため、修飾型抗体は、ヒトＥＧＦＲのポリペプチドと前記抗体の結合のために備えられている任意の種類の可変領域を含み得るということが理解されるべきである。この点で、前記可変領域は、誘導されて液性反応を開始することができ、そして、所望の腫瘍関連抗原に対する免疫グロブリンを作製することができる任意の種類の哺乳類動物を含むことができ、またはそれに由来することができる。したがって、修飾型抗体の可変領域は、例えば、ヒト、ネズミ科、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル、マカクなど）またはオオカミの起源であり得る。いくつかの実施形態において、修飾型免疫グロブリンの可変領域と定常領域の両方がヒトのである。他の実施形態において、適合性が有る抗体の可変領域（通常、非ヒトソースに由来する）は、その分子の結合特性を改善し、または、その分子の免疫原性を低下させるために、操作または特異的に適合させることができる。この点で、本発明において有用な可変領域はヒト化され得、または、そうでなければ、導入されたアミノ酸配列を含むことにより改変され得る。
ある実施形態において、１つ以上のＣＤＲの少なくとも部分的置換により、そして、必要に応じて、部分的フレームワーク領域置換と配列変更により重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインを改変する。前記ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同じクラスまたはそれどころか同じサブクラスの抗体に由来し得るが、前記ＣＤＲは異なるクラスの抗体、および、ことによると異なる種の抗体に由来することが考えられる。１つの可変ドメインの抗原結合能力を別のものに振替えるために、ＣＤＲの全てをドナー可変領域のＣＤＲ全部で置き換えることが常に必要なわけではない。むしろ、いくつかの場合では、前記抗原結合部位の活性を維持するために必要な残基を振替えることが必要なだけである。米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号および第５，６９３，７６２号に示される説明を考慮すると、ルーチン的な実験を行うか試行錯誤による実験を行うかのどちらかにより免疫原性が低減した機能性抗体を得ることは優に当業者の能力の範囲内である。
可変領域の改変にも関わらず、本発明の修飾型抗体は、天然または未改変の定常領域を含む、およそ同じ免疫原性を有する抗体と比較すると、上昇した腫瘍局在性または減少した血清中半減期などの所望の生化学的特質をもたらすように、定常領域ドメインのうちの１つ以上の少なくとも一部が欠失されているか、またはそうでなければ改変されている抗体（例えば、全長型抗体またはその免疫反応性断片）を含むと当業者は理解する。いくつかの実施形態において、修飾型抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域の修飾は１つ以上のドメイン内の１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。すなわち、本明細書において開示される修飾型抗体は３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の１つ以上および／または軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）に改変または修飾を含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上のドメインが部分的または完全に欠失されている修飾型定常領域が考慮される。いくつかの実施形態において、前記修飾型抗体は、ＣＨ２ドメイン全体が取り除かれているドメイン欠失コンストラクトまたは異型体（ΔＣＨ２コンストラクト）を含む。いくつかの実施形態において、前記の取り除かれた定常領域ドメインは短アミノ酸スペーサー（例えば、１０残基）で置換され、典型的には存在しない定常領域によってもたらされるいくらかの分子的柔軟性を提供する。
それらの形状の他に、前記定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のＣ１成分の抗体への結合が補体系を活性化させる。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン化と溶解に重要である。補体の活性化はまた炎症反応を刺激し、そして、自己免疫過敏にも関係する可能性がある。また、抗体はＦｃ領域を介して細胞に結合し、抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体部位が細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。ＩｇＧ（γ受容体）、ＩｇＥ（η受容体）、ＩｇＡ（α受容体）およびＩｇＭ（μ受容体）を含む、異なるクラスの抗体に特異的である多数のＦｃ受容体が存在する。細胞表面上での抗体のＦｃ受容体への結合が抗体被覆粒子の貪食および破壊、免疫複合体の除去、抗体被覆標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性Ｔ細胞介在性細胞傷害、またはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症メディエーターの放出、胎盤通過および免疫グロブリン生産の制御を含む多数の重要で多様な生物学的反応を引き起こす。
ある実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合抗体は改変されたエフェクター機能を提供し、それは次にその投与される抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段による）欠失または不活化が、その循環する修飾型抗体のＦｃ受容体結合を低減させ、それによって腫瘍局在性を上昇させることができる。他の場合では、本発明と矛盾しない定常領域の修飾が補体の結合を適度なものにし、したがって、複合体化細胞毒素の血清中半減期と非特異的結合を減少させることがあり得る。定常領域のさらに他の修飾を用いて、抗原特異性または抗体の柔軟性の上昇により向上した局在性を可能にするジスルフィド結合またはオリゴサッカリド部分を除去することができる。同様に、優に当業者の理解の範囲内である、周知の生化学的または分子工学的技術を用いて、本発明に従う定常領域の修飾を容易に行うことができる。
ある実施形態において、抗体であるＥＧＦＲ結合薬剤が１つ以上のエフェクター機能を持たない。例えば、いくつかの実施形態において、前記抗体は抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を持たない。ある実施形態において、前記抗体はＦｃ受容体および／または補体因子に結合しない。ある実施形態において、前記抗体はエフェクター機能を持たない。
ある実施形態において、前記修飾型抗体は操作されてＣＨ３ドメインを各修飾型抗体のヒンジ領域に直接融合することができると留意される。他のコンストラクトでは、ヒンジ領域と改変型ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインの間にペプチドスペーサーを提供することが好ましい可能性がある。例えば、ＣＨ２ドメインが欠失されていて、そして、（修飾型にせよ非修飾型にせよ）残りのＣＨ３ドメインが５〜２０アミノ酸のスペーサーを用いてヒンジ領域に連結している、適合性が有るコンストラクトを発現することができるであろう。例えば、定常ドメインの調節性要素が遊離状態でアクセス可能なままでいること、または、ヒンジ領域が柔軟なままでいることを確実にするために、そのようなスペーサーを付加することができる。しかしながら、いくつかの場合では、アミノ酸スペーサーが免疫原性であり、そして、そのコンストラクトに対して望まない免疫反応を誘発することになる可能性があることが留意されるべきである。したがって、ある実施形態において、前記コンストラクトに付加される任意のスペーサーは、前記修飾型抗体の所望の生化学的特質を維持するように、相対的に非免疫原性であるか、またはそれどころか完全に除去される。
定常領域ドメイン全体の欠失の他に、部分的欠失、または少数もしくはそれどころか単一のアミノ酸の置換により本発明の抗体が提供され得ることが理解される。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域での単一のアミノ酸の突然変異が、実質的にＦｃ結合を低下させ、それによって腫瘍局在性を上昇させるのに充分である可能性がある。同様に、調節されるべきエフェクター機能（例えば、補体ＣＬＱ結合）を制御する１つ以上の定常領域ドメインの部分を単に欠失することが望ましい場合がある。定常領域のそのような部分的欠失が、対象の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておきながら、前記抗体の選択された特質（血清中半減期）を改善し得る。さらに、先に示唆したように、結果生じるコンストラクトのプロファイルを向上させる１つ以上のアミノ酸の突然変異または置換により、開示された抗体の定常領域を修飾することができる。この点で、前記修飾型抗体の立体構造および免疫原性を実質的に維持したまま、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって提供される活性を乱すことが可能であり得る。ある実施形態は、エフェクター機能の減少または上昇などの望ましい特性を向上させるため、または、より多くの細胞毒素もしくは炭水化物の接着に備えるために定常領域への１つ以上のアミノ酸の付加を含むことが可能である。そのような実施形態において、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入または複製することが望ましい可能性がある。
本発明は、本明細書において示されるキメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、またはそれらの抗体断片に実質的に相同な異型体および同等物をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換突然変異、すなわち、１つ以上のアミノ酸の類似のアミノ酸による置換を含むことができる。例えば、保存的置換は、例えば、１つの酸性アミノ酸の別の酸性アミノ酸による、１つの塩基性アミノ酸の別の塩基性アミノ酸による、または１つの中性アミノ酸の別のアミノ酸による置換などの、同じ一般的クラス内でのあるアミノ酸の別のアミノ酸による置換を指す。保存的アミノ酸置換により意図されることは当技術分野において周知である。
本発明のポリペプチドはヒトＥＧＦＲに対する抗体またはその断片を含む組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、または合成ポリペプチドであり得る。本発明のいくつかのアミノ酸配列は、そのタンパク質の構造または機能の著しい効果もなく、変更され得ることが当技術分野において認識される。したがって、本発明は、実質的な活性を示す、またはＥＧＦＲタンパク質に対する抗体もしくはその断片の領域を含む様々なポリペプチドをさらに含む。そのような変異体は欠失、挿入、逆位、反復および型置換を含む
前記のポリペプチド および 類似体は さらに 修飾されて、通常はそのタンパク質の一部ではない付加的な化学部分を含有することができる。それらの誘導体化部分はそのタンパク質の溶解度、生物学的半減期または吸収を改善することができる。前記部分は前記タンパク質などの任意の望ましい副作用を低減または除去することができる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （２０００） にそれらの部分についての概要を見出すことができる。
当技術分野において公知の任意の適切な方法により、本明細書において記載される単離されたポリペプチドを産生することができる。そのような方法は直接タンパク質合成法から単離されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、そして、適切な形質転換された宿主でそれらの配列を発現させることまでにわたる。いくつかの実施形態において、目的の野生型タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離または合成することにより、組換え技術を用いてＤＮＡ配列を構築することができる。所望により、部位特異的突然変異形成により前記配列に突然変異を起こさせて、その機能上の類似体を提供することができる。例えば、Ｚｏｅｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５６６２−５０６６ （１９８４）および米国特許第４，５８８，５８５号を参照のこと。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド合成機を用いる化学合成により、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を構築することができるであろう。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、そして、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好まれるコドンを選択して設計されることが可能である。目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために標準的な方法を適用することができる。例えば、折り返し翻訳された遺伝子を構築するために完全アミノ酸配列が使用され得る。また、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小オリゴヌクレオチドを合成そして結合させることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的会合のための５’または３’オーバーハングを含む。
一旦、（合成、部位特異的突然変異形成または別の方法により）組み立てられると、目的の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、そして、所望の宿主での前記タンパク質の発現に適切な発現制御配列に機能するように結合させられる。ヌクレオチドシークエンシング、制限酵素マップ作製、および適切な宿主での生物学的に活性が有るポリペプチドの発現により、適切な組み立てを確認することができる。当技術分野においてよく知られるように、宿主での形質移入遺伝子の高発現レベルを得るためには、その選択された発現宿主で機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列に機能するように前記遺伝子が結合されねばならない。
ある実施形態において、ヒトＥＧＦＲに対する抗体またはその断片をコードするＤＮＡを増幅し、そして、それを発現させるために組換え発現ベクターを用いる。組換え発現ベクターは、哺乳類遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに機能するように結合した、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片のポリペプチド鎖をコードする合成ＤＮＡ断片、またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を有する複製可能なＤＮＡコンストラクトである。転写ユニットは一般的に、以下に詳細が記載されるように、（１）遺伝因子、または遺伝子発現での調節性の役割を有するエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、そしてタンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、および（３）適切な転写および翻訳開始および終結配列、からなる集合体を含む。そのような調節性要素は転写を制御するためのオペレーター配列を含むことができる。通常、複製起点によって付与される宿主中で複製する能力、および、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子が追加的に組み込まれ得る。ＤＮＡ領域が機能的に互いに関連するとき、それらを機能するように結合する。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与する前駆体として発現する場合、それを前記ポリペプチドのＤＮＡに機能するように結合する。プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、それを前記配列に機能するように結合する。または、リボソーム結合部位が翻訳を可能にするように配置される場合、それをコード配列に機能するように結合する。酵母発現系での使用向けの構造エレメントは、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。あるいは、リーダー配列または輸送配列無しで組換えタンパク質が発現する場合、それはＮ末端メチオニン残基を含むことができる。この残基はその後、最終製品を提供するために、発現された組換えタンパク質から所望により切断され得る。
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主／ベクターの組合せを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌性宿主に有用な発現ベクターには、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの派生物を含む、大腸菌由来のプラスミドなどの公知の細菌性プラスミド、Ｍ１３などのより広い宿主範囲のプラスミドおよび繊維状一本鎖ＤＮＡファージが含まれる。
ＥＧＦＲ結合ポリペプチドまたは抗体（または抗原として使用するためのＥＧＦＲタンパク質）の発現に適切な宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫または高等真核細胞が含まれる。原核生物にはグラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高等真核細胞には、以下に記載されるような哺乳類起源の樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系もまた使用することができるであろう。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳類細胞宿主と用いるための適切なクローニングベクターおよび発現ベクターはＰｏｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ． （Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８５）によって記載され、その適切な開示が参照により本明細書に組み込まれる。抗体の産生を含むタンパク質産生の方法に関する追加情報は、例えば、米国特許公開第２００８／０１８７９５４号、米国特許第６，４１３，７４６号、および第６，６６０，５０１号、および国際特許公開第ＷＯ０４００９８２３号に見出すことができ、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
組換えタンパク質を発現するために、様々な哺乳類細胞培養系または昆虫細胞培養系もまた、好都合にも、使用される。そのようなタンパク質は一般に、正しく折り畳まれ、適切に修飾され、そして完全に機能的であるので、哺乳類細胞での組換えタンパク質の発現が行われ得る。適切な哺乳類宿主細胞系列の例には、Ｇｌｕｚｍａｎ （Ｃｅｌｌ ２３：１７５， １９８１）により記載されるサル腎臓細胞のＣＯＳ−７系列、ならびに、例えば、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞株、３Ｔ３細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨｅＬａ細胞株およびＢＨＫ細胞株を含む、適切なベクターの発現が可能である他の細胞株が含まれる。哺乳類発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適切なプロモーターおよびエンハンサー、および他の５’または３’隣接非転写配列などの非転写エレメント、ならびに必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびアクセプター部位、ならびに転写終結配列などの５’または３’非翻訳配列を含むことができる。昆虫細胞での異種性タンパク質の産生用のバキュロウイルス系はＬｕｃｋｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：４７ （１９８８）によって考察されている。
任意の適切な方法に従って、形質転換宿主により産生されたタンパク質を精製することができる。そのような標準的な方法はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィーおよびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解度、またはタンパク質精製の他の任意の標準的な技術による方法を含む。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグを前記タンパク質に結合することにより、適切な親和性カラムに通過させることによる簡便な精製を可能にすることができる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴およびＸ腺結晶解析のような技術を用いて物理的に特性解析され得る。
例えば、培地に組換えタンパク質を分泌する系に由来する上清はまず、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮される。濃縮ステップの次に、前記濃縮物を適切な精製マトリックスに供するすることができる。あるいは、イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックスまたは基材を用いることができる。前記マトリックスはアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製に一般的に用いられる他の種類であり得る。あるいは、陽イオン交換ステップを用いることができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。最後に、ＥＧＦＲ結合薬剤をさらに精製するために、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いる１回以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いることができる。均一な組換えタンパク質を提供するために、前述の精製ステップのいくつか、または全てを様々な組み合わせで用いることもできる。
例えば、細胞ペレットからの最初の抽出、それに続く１回以上の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーステップまたはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって、細菌培養物で産生された組換えタンパク質を単離することができる。最終精製ステップに高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。組換えタンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、周期的凍結融解、超音波破砕、機械的破砕または細胞溶解剤を含む、任意の簡便な方法により破砕され得る。
抗体および他のタンパク質の当技術分野において公知の精製方法にはまた、例えば、米国特許公開第２００８／０３１２４２５号、第２００８／０１７７０４８号、および第２００９／０１８７００５号に記載されるものが含まれ、それらの各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤は、抗体ではないポリペプチドである。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを特定し、そして、産生する様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｋｅｒｒａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １８：２９５−３０４ （２００７）、 Ｈｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５：１４−２７ （２００６）、 Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７：６５３−６５８ （２００６）、 Ｎｙｇｒｅｎ， ＦＥＢＳ Ｊ．， ２７５：２６６８−７６ （２００８）、およびＳｋｅｒｒａ， ＦＥＢＳ Ｊ．， ２７５：２６７７−８３ （２００８）を参照のこと。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合ポリペプチドを同定／産生するためにファージディスプレイ技術が用いられている。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、プロテインＡ、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択される種類のタンパク質スキャフォールドを含む。
いくつかの実施形態において、前記薬剤は非タンパク質分子である。ある実施形態において、前記薬剤は小分子である。コンビナトリアル化合物ライブラリーおよび非タンパク質ＥＧＦＲ結合薬剤の同定に有用な技術は当業者に公知である。例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ， １０：３４５−３５４ （２００８）、 Ｄｏｌｌｅ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｃｏｍｂ． Ｃｈｅｍ．， ９：８５５−９０２ （２００７）、 および Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙｙａ， Ｃｕｒｒ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ８：１３８３−４０４ （２００１）を参照のこと。あるさらなる実施形態において、前記薬剤は炭水化物、グリコサミノグリカン、糖タンパク質、またはプロテオグリカンである。
ある実施形態において、前記薬剤は核酸アプタマーである。アプタマーは、別の分子に結合するそれらの能力に基づいて（例えば、無作為に突然変異形成されたプールから）選択されたポリヌクレオチド分子である。いくつかの実施形態において、前記アプタマーはＤＮＡポリヌクレオチドを含む。ある別の実施形態において、前記アプタマーはＲＮＡポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、前記アプタマーは１つ以上の修飾型核酸残基を含む。核酸アプタマーを作製し、タンパク質への結合についてスクリーニングする方法は当技術分野においてよく知られている。例えば、各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２７０，１６３号、米国特許第５，６８３，８６７号、米国特許第５，７６３，５９５号、米国特許第６，３４４，３２１号、米国特許第７，３６８，２３６号、米国特許第５，５８２，９８１号、米国特許第５，７５６，２９１号、米国特許第５，８４０，８６７号、米国特許第７，３１２，３２５号、米国特許第７，３２９，７４２号、国際特許公開第ＷＯ０２／０７７２６２号、国際特許公開第ＷＯ０３／０７０９８４号、米国特許出願公開第２００５／０２３９１３４号、米国特許出願公開第２００５／０１２４５６５号、および米国特許出願公開第２００８／０２２７７３５号を参照のこと。
ＩＩＩ．免疫複合体
本発明はまた、薬品または前駆薬に結合または複合体化した抗ＥＧＦＲ抗体、抗体断片および本明細書において開示されるようなそれらの同等物を含む複合体（本明細書において免疫複合体とも称される）を対象とする。適切な薬品または前駆薬は当技術分野において公知である。前記薬品または前駆薬は細胞傷害性薬剤であり得る。本発明の細胞傷害性複合体で使用される細胞傷害性薬剤は、細胞を殺滅することとなる、または細胞死を誘導する、またはいくつかの方法で細胞の生存能を減少させる任意の化合物であることができ、そして、例えば、マイタンシノイド類およびマイタンシノイド類似体を含む。他の適切な細胞傷害性薬剤は、例えば、ベンゾジアゼピン類、タキソイド類、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン類およびデュオカルマイシン類似体、エンジイン類、例えば、カリケアマイシン類、ドラスタチンおよびオーリスタチン類を含むドラスタチン類似体、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブチルならびにモルホリノドキソルビシンである。
薬品または前駆薬を前記抗体または機能上の同等物に連結するために結合基を用いることによりそのような複合体を調製することができる。適切な結合基は当技術分野においてよく知られており、そして、例えば、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基を含む。
前記薬品または前駆薬は、例えば、ジスルフィド結合を介して前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片に結合され得る。リンカー分子または架橋剤は、前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片と反応することができる反応性化学基を含む。前記細胞結合薬剤との反応用の反応性化学基はＮ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルであり得る。さらに、リンカー分子は反応性化学基を含み、それは、ジスルフィド結合を形成する薬品と反応することができるジチオピリジル基であり得る。リンカー分子には、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １７３： ７２３−７３７ （１９７８）を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国特許公開第２００９０２７４７１３号を参照のこと）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６を参照のこと）、２−イミノチオラン、またはアセチルコハク酸無水物が含まれる。例えば、架橋試薬を用いて前記抗体または細胞結合薬剤を修飾することができ、その後、こうして得られた遊離チオール基または保護化チオール基を含む前記抗体または細胞結合薬剤をジスルフィド含有マイタンシノイドまたはチオール含有マイタンシノイドと反応させて複合体を作製する。ＨＰＬＣ、サイズ排除、吸着、イオン交換および親和性キャプチャーを含むが、これらに限定されないクロマトグラフィー、透析またはタンジェント流濾過によって前記複合体を精製することができる。
本発明の別の態様において、前記免疫複合体の力価、溶解性または有効性の増強において、ジスルフィド結合およびポリエチレングリコールスペーサーを介して細胞傷害性薬品に前記抗ＥＧＦＲ抗体を結合する。そのような切断可能親水性リンカーは国際公開第ＷＯ２００９／０１３４９７６号に記載される。このリンカー設計の追加的な利点は前記抗体‐薬品複合体の所望の高いモノマー比率と極めて少ない凝集である。この態様において、２〜８という狭い範囲の薬品負荷を有し、ポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ＝１−１４）を担持するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して連結した細胞結合薬剤と薬品の複合体が具体的に考慮され、そして、癌細胞に対して比較的高い生物学的活性を示し、そして、最小タンパク質凝集と共に高複合体収率および高モノマー比率といった所望の生化学的特性を有する複合体が説明される。
この態様において、式（Ｉ）の抗ＥＧＦＲ抗体薬品複合体または式（Ｉ’）の複合体が具体的に考慮され：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｙ−Ｄ］ｍ （Ｉ）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ２−ＣＨ２Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （Ｉ’）
式中、
ＣＢは抗ＥＧＦＲ抗体または断片を表し；
Ｄは薬品を表し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して前記細胞結合薬剤に結合した脂肪族単位、芳香族単位または複素環式単位を表し；
Ｙはジスルフィド結合を介して前記薬品に結合した脂肪族単位、芳香族単位または複素環式単位を表し；
ｌは０または１であり；
ｍは２から８までの整数であり；および
ｎは１から２４までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは２から６までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは３から５までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｎは２から８までの整数である。あるいは、例えば、米国特許第６，４４１，１６３号および第７，３６８，５６５号において開示されるように、細胞結合薬剤と反応するのに適切な反応性エステルを導入するために、前記薬品は最初に修飾され得る。活性化リンカー部分を含有するこれらの薬品と細胞結合薬剤の反応は細胞結合薬剤薬品複合体作製の別の方法を提供する。例えば、米国特許第６，７１６，８２１号に示されるように、ＰＥＧ結合基を用いて抗ＥＧＦＲ抗体または断片にマイタンシノイド類を結合することもできる。これらのＰＥＧ非切断可能結合基は水および非水性溶剤の両方で可溶性であり、そして、細胞結合薬剤に１つ以上の細胞傷害性薬剤を結合するために使用され得る。例示的なＰＥＧ結合基は、一方の末端の官能性スルフヒドリル基またはジスルヒド基および他方の末端の活性型エステルを介して、両端で細胞傷害性薬剤および細胞結合薬剤と反応するヘテロ二官能性ＰＥＧリンカーを含む。ＰＥＧ結合基を用いる細胞傷害性複合体の合成の一般的な例として、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６，７１６，８２１号を再び参照する。合成は、反応性ＰＥＧ部分を担持する１つ以上の細胞傷害性薬剤の細胞結合薬剤との反応で始まり、前記細胞結合薬剤のアミノ酸残基により各反応性ＰＥＧ部分の末端活性型エステルが置換されることになり、ＰＥＧ結合基を介して細胞結合薬剤に共有結合で結合した１つ以上の細胞傷害性薬剤を含む細胞傷害性複合体が生じる。あるいは、前記二官能性ＰＥＧ架橋剤を用いて前記細胞結合を修飾して（ピリジルジスルフィドなどの）反応性ジスルフィド部分を導入することができ、その後、チオール含有マイタンシノイドを用いてそれを処理して複合体をもたらすことができる。別の方法では、前記二官能性ＰＥＧ架橋剤を用いて前記細胞結合を修飾してチオール部分を導入することができ、その後、（ピリジルジスルフィドなどの）反応性ジスルフィド含有マイタンシノイドを用いてそれを処理して複合体をもたらすことができる。
非切断可能連結を有する抗体−マイタンシノイド複合体もまた調製され得る。そのような架橋剤は当技術分野において記述されており（米国特許公開第２００５０１６９９３３号を参照のこと）、そして、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジル−ヨードアセテートなどの架橋試薬を用いて、文献に記載されるように、前記抗体を修飾して１〜１０の反応基を導入する（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ ｅｔ ａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０１：３９５−３９９ （１９７９）、Ｈａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ５６−６３ （１９８４）、および Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ， Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １８：６９０−６９７ （１９７９））。その後、前記修飾型抗体を前記チオール含有マイタンシノイド誘導体と反応させて複合体を作製する。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５カラムによるゲル濾過によって、または透析もしくはタンジェント流濾過によって前記複合体を精製することができる。前記チオール含有マイタンシノイドを用いて前記修飾型抗体を処理し（１〜２モル当量／マレイミド基）、そして、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムによるゲル濾過、セラミックハイドロキシアパタイトカラムでのクロマトグラフィー、透析またはタンジェント流濾過またはそれらの方法の組合せにより抗体−マイタンシノイド複合体を精製する。典型的には、平均して、抗体あたり１〜１０マイタンシノイドが連結される。１つの方法は、マレイミド基を導入するためにスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）を用いて抗体を修飾して、次に、チオール含有マイタンシノイドを用いて前記修飾型抗体を反応させてチオエーテル結合複合体をもたらすことである。ここでも、抗体分子あたり１〜１０の薬品分子を用いて複合体が生じる。同様にして、抗体、抗体断片、および他のタンパク質のマイタンシノイド複合体を作製する。
本発明の別の態様において、ＥＧＦＲ抗体は、ＰＥＧスペーサーの中間性により非切断可能結合を介して前記薬品に結合させられる。薬品と前記抗ＥＧＦＲ抗体または断片の間のリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む適切な架橋試薬もまた当技術分野においてよく知られており、または、市販されている（例えば、オハイオ州、パウエルのＱｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎより）。当業者に知られている標準的な合成化学技術を用いて市販のＰＥＧそれ自体から適切なＰＥＧ含有架橋剤を合成することもできる。米国特許公開第２００９０２７４７１３号および国際公開第ＷＯ２００９／０１３４９７６号に詳細が記載される方法により、二官能性ＰＥＧ含有架橋剤と前記薬品を反応させて次の式、Ｚ−Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ、の化合物をもたらすことができ、それは次に前記細胞結合薬剤と反応して複合体をもたらすことができる。あるいは、前記二官能性ＰＥＧ架橋剤を用いて前記細胞結合を修飾して（マレイミドまたはハロアセトアミドなどの）チオール反応性基を導入することができ、その後、チオール含有マイタンシノイドを用いてそれを処理して複合体をもたらすことができる。別の方法では、前記二官能性ＰＥＧ架橋剤を用いて前記細胞結合を修飾してチオール部分を導入することができ、その後、（マレイミドまたはハロアセトアミドを担持するマイタンシノイドなどの）チオール反応性マイタンシノイドを用いてそれを処理して複合体をもたらすことができる。
したがって、本発明の別の態様は、式（ＩＩ）または式（ＩＩ’）の抗ＥＧＦＲ抗体薬品複合体であり：
ＣＢ−［Ｘｌ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｙｐ−Ｄ］ｍ （ＩＩ）
［Ｄ−Ｙｐ−（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−Ｘｌ］ｍ−ＣＢ （ＩＩ’）
式中、ＣＢは抗ＥＧＦＲ 抗体 または 断片を表し；
Ｄは薬品を表し；
Ｘはチオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して前記細胞結合薬剤に結合した脂肪族単位、芳香族単位または複素環式単位を表し；
Ｙはチオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素間結合およびヒドラゾン結合からなる群より選択される共有結合を介して前記薬品に結合した脂肪族単位、芳香族単位または複素環式単位を表し；
ｌは０または１であり；
ｐは０または１であり；
ｍは２から１５までの整数であり；および
ｎは１から２０００までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは２から８までの整数であり；および
いくつかの実施形態において、ｎは１から２４までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは２から６までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｍは３から５までの整数である。
いくつかの実施形態において、ｎは２から８までの整数である。適切なＰＥＧ含有リンカーの例には、前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片との反応のためにＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部分を、ならびに前記化合物との反応のためにマレイミド‐ベースまたはハロアセチル‐ベースの部分を有するリンカーが含まれる。本明細書において記載される方法によって、当技術分野において公知の任意の架橋剤にＰＥＧスペーサーを組み込むことができる。
本明細書において開示されるリンカーの多くが米国特許公開第２００５０１６９９３３号および第２００９０２７４７１３号、および国際公開第ＷＯ２００９／０１３４９７６号に詳しく記載され、それらの内容が完全に参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、約２〜約８薬品分子（「薬品負荷」）、例えば、マイタンシノイドを抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片に結合し、前記複合体の抗腫瘍効果が、同じ細胞結合薬剤に結合した薬品の数がより少ない、または、より多い薬品負荷と比較してずっと有効である態様を含む。「薬品負荷」は、本明細書において使用される場合、細胞結合薬剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片）に結合され得る薬品分子（例えば、マイタンシノイド）の数を指す。１つの態様において、細胞結合薬剤に結合され得る薬品分子の数は平均して約２から約８までであり得る（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１）。Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）マイタンシン（ＤＭ４）を使用することができる。
二官能性架橋試薬を前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片と反応させることにより前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片を修飾し、それによりリンカー分子の前記抗ＥＧＦＲ抗体またはその断片への共有結合をもたらすことができる。本明細書において使用される場合、「二官能性架橋試薬」は、本明細書において記載される薬品などの薬品に細胞結合薬剤を共有結合する任意の化学部分である。別の方法では、前記薬品によって、結合部分の一部が提供される。この点で、前記薬品へ前記細胞結合薬を結合させるために使用されるより大きいリンカー分子の一部である結合部分を前記薬品は含む。例えば、マイタンシノイドＤＭ１を形成するために、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するようにマイタンシンのＣ−３位の側鎖であるヒドロキシル基を修飾する。このマイタンシンのチオール化形態は修飾型細胞結合薬剤と反応して複合体を形成することができる。したがって、最後のリンカーは２つの構成要素から組み立てられ、そのうちの１つは前記架橋試薬によって提供され、一方、他方はＤＭ１の側鎖によって提供される。
血清アルブミンなどの中継的担体分子により前記薬品分子を前記抗体分子に結合することもできる。
本明細書において使用される場合、「細胞結合薬剤に結合した」または「抗ＥＧＦＲ抗体または断片に結合した」という表現は、細胞結合薬剤である抗ＥＧＦＲ抗体または断片に適切な結合基、またはその前駆体を介して結合した少なくとも１つの薬品誘導体を含む複合体分子を指す。１つの結合基はＳＭＣＣである。
ある実施形態において、本発明において有用な細胞傷害性薬剤はマイタンシノイド類およびマイタンシノイド類似体である。適切なマイタンシノイド類の例にはマイタンシノールのエステルおよびマイタンシノール類似体が含まれる。マイタンシノールおよびマイタンシノール類似体のように、微小管形成を阻害し、そして、哺乳類細胞にとって高い毒性がある任意の薬品が含まれる。
適切なマイタンシノールエステルの例には、修飾型芳香族環を有するもの、および他の位置に修飾を有するものが含まれる。そのような適切なマイタンシノイドは、米国特許第４，４２４，２１９号、第４，２５６，７４６号、第４，２９４，７５７号、第４，３０７，０１６号、第４，３１３，９４６号、第４，３１５，９２９号、第４，３３１，５９８号、第４，３６１，６５０号、第４，３６２，６６３号、第４，３６４，８６６号、第４，４５０，２５４号、第４，３２２，３４８号、第４，３７１，５３３号、第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号、第５，４７５，０９２号、第５，５８５，４９９号、第５，８４６，５４５号、第６，３３３，４１０号、第７，２７６，４９７号、および第７，４７３，７９６号に開示される。
ある実施形態において、本発明の免疫複合体は、正式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシンという名称の前記チオール含有マイタンシノイド（ＤＭ１）を細胞傷害性薬剤として活用する。ＤＭ１は次の構造式（ＩＩＩ）で表される。
別の実施形態において、本発明の複合体はチオール含有マイタンシノイドであるＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（例えば、ＤＭ４）を細胞傷害性薬剤として活用する。ＤＭ４は次の構造式（ＩＶ）で表される。
立体障害型チオール結合を含有する側鎖を含む別のマイタンシノイドはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’ −（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３という名称）であり、次の構造式（Ｖ）で表される。
本発明の複合体において、米国特許第５，２０８，０２０号および第７，２７６，４９７号に教示されるマイタンシノイド類の各々を用いることもできる。この点で、第５，２０８，０２０号および第７，２７６，６９７号の開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
マイタンシノイドの多くの位置が、結合部分を化学的に連結するための位置として働きうる。 例えば、ヒドロキシル基を有するＣ−３ 位， ヒドロキシメチルで修飾されるＣ−１４ 位，ヒドロキシで修飾されるＣ−１５ 位およびヒドロキシ基を有する Ｃ−２０ 位が全て有用であると予想される。いくつかの実施形態において、 Ｃ−３ 位は、結合部分を化学的に結合するための位置 として働き、そして、いくつかの特定の実施形態において，マイタンシノールのＣ−３ 位は、結合部分を化学的に結合するための位置として働く。
いくつかの複合体の構造の表示が以下に示される。
そのような抗体−マイタンシノイド複合体の作製についてのいくつかの説明が米国特許第６，３３３，４１０号、第６，４４１，１６３号、第６，７１６，８２１号、および第７，３６８，５６５号において提供され、その各々の全体が本明細書に組み込まれる。
一般に、反応性基を担持するジスルフィド部分を有する過剰なモル濃度のマイタンシノイド類ともに水性緩衝液中の抗体の溶液をインキュベートすることができる。過剰な（エタノールアミン、タウリンなどのような）アミンの添加により反応混合物をクエンチすることができる。その後、ゲル濾過によりマイタンシノイド−抗体複合体を精製することができる。
抗体分子あたりの結合したマイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度の比率を分光測定的に測定することにより決定され得る。マイタンシノイド分子／抗体の平均数は、例えば、１〜１０または２〜５であり得る。
抗ＥＧＦＲ免疫複合体を調製するためにアントラサイクリン化合物、ならびにその誘導体、中間体、および修飾型を使用することもできる。例えば、抗ＥＧＦＲ複合体中にドキソルビシン、ドキソルビシン誘導体、ドキソルビシン中間体、および修飾型ドキソルビシンを使用することができる。例示的な化合物は国際公開第ＷＯ２０１０／００９１２４号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような化合物には、例えば、次の式の化合物が含まれる。
式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基またはメトキシ基であり、そして、Ｒ２はＣ１−Ｃ５アルコキシ基、または薬剤的に許容可能なその塩である。
マイタンシノイドまたは他の薬品と抗体の複合体を、様々な望ましくない細胞株の増殖を抑制するそれらの能力についてインビトロで評価することができる。例えば、これらの化合物の細胞毒性の評価のためにＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９２およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍなどの細胞株を簡便に用いることができる。前記化合物に４〜５日間、評価される細胞を曝露ことができ、細胞の生存率が公知の方法による直接的アッセイで測定される。その後、そのアッセイの結果からＩＣ５０値を計算することができる。
本明細書において記載されるいくつかの実施形態に従って、細胞に前記免疫複合体を取り込ませることができる。ＥＧＦＲ発現細胞が前記免疫複合体を取り込む、または内部化すると、それによって、前記免疫複合体が治療効果を及ぼす。いくつかの特定の実施形態において、前記免疫複合体は、切断可能リンカーによって細胞傷害性薬剤に連結された抗体、抗体断片、またはポリペプチドを含み、そして、前記免疫複合体がＥＧＦＲ発現細胞によって内部化されると、前記細胞傷害性薬剤が前記抗体、抗体断片、またはポリペプチドから分離される。
いくつかの実施形態において、前記免疫複合体は腫瘍体積を低減させることができる。例えば、いくつかの実施形態において、免疫複合体を用いる治療により、％Ｔ／Ｃ値が約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％、または未満または約５％未満になる。
本発明の別の態様において、薬品の代わりにｓｉＲＮＡ分子を本発明の抗体に結合することができる。オリゴヌクレオチドの修飾に一般的に使用される方法により（例えば、米国特許公開第２００５０１０７３２５号および第２００７０２１３２９２号を参照のこと）、本発明の抗体にｓｉＲＮＡを結合することができる。したがって、その３’−ホスホロミダイト形態または５’−ホスホロミダイト形態のｓｉＲＮＡを、ヒドロキシル官能性を担持する架橋剤の一端と反応させて、ｓｉＲＮＡと前記架橋剤の間にエステル結合をもたらすことができる。同様に、末端アミノ基を担持する架橋剤との前記ｓｉＲＮＡホスホラミダイトの反応により、アミンによる前記ｓｉＲＮＡへの前記架橋剤の結合がもたらされる。あるいは、標準的な化学的方法により前記ｓｉＲＮＡを誘導体化してチオール基を導入することができる。修飾されてジスルフィド部分またはマレイミド部分が導入された抗体とこのチオール含有ｓｉＲＮＡを反応させて切断可能複合体または非切断可能複合体を作製することができる。この方法により、１〜２０の間のｓｉＲＮＡ分子を抗体に結合することができる。
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
ある実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲに特異的に結合するポリペプチドまたはそのようなポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、本発明は、ヒトＥＧＦＲに対する抗体をコードする、またはそのような抗体の断片をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形状またはＤＮＡの形状であり得る。ＤＮＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれ；そして、それは二本鎖または一本鎖である可能性があり、一本鎖である場合、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドは単離されたものである。ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
本発明は、配列番号１〜２８からなる群より選択される配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。
本発明は、下記の表７〜９に示されるものから選択される配列を含むポリヌクレオチドをさらに提供する。
配列番号２９〜４０に対して少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドもまた提供される。したがって、ある実施形態において、前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号２９〜３２、３７または３９に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチド、および／または（ｂ）配列番号３３〜３６、３８または４０に対して少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号２９〜３２、３７または３９のアミノ酸配列を有するポリペプチド；および／または（ｂ）配列番号３３〜３６、３８または４０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、発現と宿主細胞からのポリペプチドの分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、前記細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌性配列として機能するリーダー配列）に同じリーディングフレームで融合した成熟型ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、そして、宿主細胞によりそのリーダー配列を切断されてそのポリペプチドの成熟型を形成することができる。前記ポリヌクレオチドはまたは、成熟型タンパク質と付加的な５’アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードすることができる。プロ配列を有する成熟型タンパク質はプロタンパク質であり、そして、前記タンパク質の非活性型である。一旦、プロ配列が分離されると、活性型成熟型タンパク質が後に残る。
ある実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、例えば、そのコードポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列に同じリーディングフレームで融合した成熟型ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、前記マーカー配列は、細菌性宿主の場合では、そのマーカーに融合した成熟型ポリペプチドの精製に備えた、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであり得、または、前記マーカー配列は、哺乳類宿主（例えば、ＣＯＳ−７細胞）が使用されるとき、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）タグである可能性がある。
本発明はさらに、例えば、断片、類似体および誘導体をコードする、本明細書において先に説明したポリヌクレオチドの異型体に関連する。
前記ポリヌクレオチド異型体はコード領域、非コード領域、または両方での変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド異型体は、サイレントな置換、付加、または欠失をもたらすが、そのコードポリペプチドの特質または活性を変えることがない変異を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子コードの縮重に起因するサイレント置換によってヌクレオチド異型体を作製する。様々な理由のため、例えば、特定の宿主用にコドンの発現を最適化するためにポリヌクレオチド異型体を作製することができる（ヒトｍＲＮＡでのコドンを大腸菌などの細菌性宿主によって好まれるコドンに変える）。
本明細書において記載されるポリヌクレオチドを含むベクターと細胞もまた提供される。
ＩＶ．使用方法および医薬組成物
本発明のＥＧＦＲ結合薬剤（抗体、免疫複合体およびポリペプチドを含む）は、癌の治療などの治療法を含むが、これらに限定されない様々な用途において有用である。ある実施形態において、前記薬剤は腫瘍の成長の抑制、分化の誘導、腫瘍体積の低減、および／または腫瘍の腫瘍原性の低減に有用である。前記使用法はインビトロ方法、エクスビボ方法またはインビボ方法であり得る。ある実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合薬剤または抗体または免疫複合体、またはポリペプチドは、それが結合するヒトＥＧＦＲについて拮抗性ではない。
１つの態様において、本発明の抗ＥＧＦＲ抗体および免疫複合体は生物試料中のＥＧＦＲの存在の検出に有用である。「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」という用語は、本明細書において使用される場合、定量的または定性的検出を包含する。ある実施形態において、生物試料は細胞または組織を含む。
１つの態様において、本発明は生物試料中のＥＧＦＲの存在の検出方法を提供する。ある実施形態において、前記方法は、抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を許容する条件下で抗ＥＧＦＲ抗体を生物試料に接触させること、および、前記抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲの間で複合体が形成されるか検出することを含む。
１つの態様において、本発明は、ＥＧＦＲの発現上昇を伴う障害の検出方法を提供する。ある実施形態において、前記方法は、試験細胞を抗ＥＧＦＲ抗体と接触させること；前記抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を検出することにより、試験細胞によるＥＧＦＲの発現レベルを（定量的または定性的のどちらかで）決定すること；および試験細胞によるＥＧＦＲの発現レベルを対照細胞（例えば、試験細胞と同じ組織に起源を有する正常細胞、またはそのような正常細胞に匹敵するレベルのＥＧＦＲを発現する細胞）によるＥＧＦＲの発現レベルと比較することを含み、対照細胞と比較して高いレベルのＥＧＦＲの試験細胞による発現がＥＧＦＲの発現上昇に関係する障害の存在を示す。ある実施形態において、前記試験細胞は、ＥＧＦＲの発現上昇に関係する障害を有する疑いがある個体から得られる。ある実施形態において、前記障害は、癌または腫瘍などの細胞増殖障害である。
ある実施形態において、上記の方法などの診断または検出の方法は、細胞の表面上に発現されたＥＧＦＲ、またはＥＧＦＲをその表面に発現する細胞から得られた膜調製物中のＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出することを含む。ある実施形態において、前記方法は、前記方法は、抗ＥＧＦＲ抗体のＥＧＦＲへの結合を許容する条件下で抗ＥＧＦＲ抗体を細胞に接触させること、および、前記抗ＥＧＦＲ抗体と前記細胞の表面上のＥＧＦＲの間で複合体が形成されるか検出することを含む。細胞の表面上に発現されたＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出するための例示的な測定法は「ＦＡＣＳ」測定法である。
ＥＧＦＲへの抗ＥＧＦＲ抗体の結合を検出するために、ある他の方法を用いることができる。そのような方法には、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈澱アッセイ、蛍光免疫アッセイ、プロテインＡ免疫アッセイおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）などの当技術分野において周知の抗原結合アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は標識される。標識には、直接的に検出される標識または部分（蛍光標識、クロモフォア標識、電子密度標識、化学発光標識および放射活性標識など）、ならびに、例えば、酵素反応または分子的相互作用により間接的に検出される酵素またはリガンドなどの部分が含まれるが、これらに限定されない。
ある実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は不溶性マトリックスに固定化される。固定化は、溶液中で遊離状態のままでいる任意のＥＧＦＲから前記抗ＥＧＦＲ抗体を分離することを必要とする。これは、従来、非水溶性マトリックスもしくは表面（Ｂｅｎｎｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第３，７２０，７６０号）への吸着、または（例えば、グルタルアルデヒド架橋を用いる）共有結合によるように、アッセイ処置の前に前記抗ＥＧＦＲ抗体を不溶化するか、抗ＥＧＦＲ抗体とＥＧＦＲ間の複合体形成の後に前記抗ＥＧＦＲ抗体を、例えば、免疫沈澱により不溶化するかのどちらかによって達成される。
抗ＥＧＦＲ抗体の代わりに、またはそれに加えて本発明の免疫複合体を用いて、診断または検出についての上記の実施形態のいずれかを行うことができる。
ある実施形態において、前記ＥＧＦＲ結合薬剤またはアンタゴニスト（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）を用いて治療される疾患は癌である。ある実施形態において、前記癌は、前記ＥＧＦＲ結合薬剤（例えば、抗体）が結合するＥＧＦＲ発現細胞を特徴とする。
さらなる態様において、本発明は、膀胱、脳、頭部および頸部、膵臓、肺、乳房、卵巣、大腸、前立腺、皮膚および腎臓の癌を含む、ＥＧＦＲを発現する、とりわけ、ＥＧＦＲを異常に発現する（例えば、過剰発現する）細胞増殖障害を治療する改良された方法であって、治療上有効量の本発明の抗ＥＧＦＲ結合薬剤を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む方法を対象とする。別の実施形態において、前記抗体はヒト化抗体である。別の好ましい実施形態において、前記ヒト化抗体は、結合活性を保持するために必要な位置（例えば、ＳＤＲ）を除き、任意の位置に置換を含む修飾型ＣＤＲを含む。本発明の抗ＥＧＦＲ結合薬剤により治療される細胞増殖障害の例には、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頸部、神経系（中枢および末梢の）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖器系に位置する新生物が含まれるが、これらに限定されない。
同様に、他の細胞増殖障害も本発明の抗ＥＧＦＲ結合薬剤によって治療され得る。そのような細胞増殖障害の例には、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大症、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓過形成および先に記載した器官系に位置する、新生物を除く、他の任意の細胞増殖障害が含まれるが、これらに限定されない。
本発明は、本明細書において記載される抗体または他の薬剤を用いて腫瘍の成長を抑制する方法をさらに提供する。ある実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は、ＥＧＦＲ結合薬剤（例えば、抗体）と細胞をインビトロで接触させることを含む。例えば、ＥＧＦＲを発現する不死化細胞株または癌細胞株が、腫瘍の成長を抑制するための前記抗体または他の薬剤を添加した培地で培養される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞が、例えば、生検組織、胸水または血液試料などの患者試料から単離され、そして、腫瘍の成長を抑制するためのＥＧＦＲ結合薬剤を添加した培地で培養される。
いくつかの実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は、前記ＥＧＦＲ結合薬剤（例えば、抗体）と腫瘍または腫瘍細胞をインビボで接触させることを含む。ある実施形態において、ＥＧＦＲ結合薬剤と腫瘍または腫瘍細胞を接触させることは動物モデルにおいて行われる。例えば、腫瘍の成長を抑制するために、易感染性マウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）で成長させた、１つ以上のＥＧＦＲを発現する異種移植片にＥＧＦＲ結合薬剤を投与することができる。いくつかの実施形態において、癌幹細胞が、例えば、生検組織、胸水または血液試料などの患者試料から単離され、そして、易感染性マウスに注入され、その後、腫瘍細胞増殖を抑制するために、ＥＧＦＲ結合薬剤が投与される。いくつかの実施形態において、腫瘍の成長を防ぐために前記ＥＧＦＲ結合薬剤が腫瘍原性細胞の前記動物への導入と同時、またはすぐ後に投与される。いくつかの実施形態において、腫瘍原性細胞が特定のサイズに成長した後に前記ＥＧＦＲ結合薬剤が治療薬として投与される。
ある実施形態において、腫瘍の成長を抑制する方法は、治療上有効量のＥＧＦＲ結合薬剤を対象に投与することを含む。ある実施形態において、前記対象はヒトである。ある実施形態において、前記対象は腫瘍を有する、または腫瘍を除去されている。
ある実施形態において、前記腫瘍は、前記ＥＧＦＲ結合薬剤または抗体が結合するＥＧＦＲを発現する。
さらに、本発明は、対象における腫瘍の腫瘍原性を低減させる方法であって、治療上有効量のＥＧＦＲ結合薬剤をその対象に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、前記腫瘍は癌幹細胞を含む。ある実施形態において、前記腫瘍中における癌幹細胞の出現頻度は前記薬剤の投与により低下する。
本発明は、腫瘍原性細胞を非腫瘍原性細胞に分化させる方法であって、前記腫瘍原性細胞をＥＧＦＲ結合薬剤と接触させることを含む方法（例えば、腫瘍原性細胞を含む腫瘍を有する、またはそのような腫瘍を除去された対象にＥＧＦＲ結合薬剤を投与することによる）をさらに提供する。
腫瘍細胞を含むが、これに限定されない細胞の分化を誘導するための、本明細書において記載されるＥＧＦＲ結合薬剤、ポリペプチドまたは抗体の使用法もまた提供される。例えば、有効量の本明細書において記載されるＥＧＦＲ結合薬剤（例えば、抗ＥＧＦＲ抗体）と細胞を接触させることを含む、細胞の分化を誘導する方法が考えられている。治療上有効量のＥＧＦＲ結合薬剤、ポリペプチド、または抗体を対象に投与することを含む、前記対象の腫瘍中の細胞の分化を誘導する方法もまた提供される。ある実施形態において、前記腫瘍は膵臓腫瘍である。ある他の実施形態において、前記腫瘍は大腸腫瘍である。いくつかの実施形態において、前記治療方法は治療上有効量のＥＧＦＲ結合薬剤、ポリペプチド、または抗体を前記対象に投与することを含む。
本発明は、本明細書において記載されるＥＧＦＲ結合薬剤の１つ以上を含む医薬組成物をさらに提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は薬剤的に許容可能な媒体をさらに含む。これらの医薬組成物はヒト患者での腫瘍の成長の抑制と癌の治療に使用される。
ある実施形態において、本発明の精製抗体または薬剤を薬剤的に許容可能な媒体（例えば、担体、添加剤）と組み合わせることにより、貯蔵および使用のために製剤を調製する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ２０００）。適切な薬剤的に許容可能な媒体には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの非毒性緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノールアルコール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０アミノ酸残基未満）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性高分子；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノースまたはデキストリン類などの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびにＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
局所的治療または全身的治療のどちらかのために、多くの方法で本発明の医薬組成物を投与することができる。投与は経皮パッチ、軟膏、外用水薬、クリーム剤、ゲル剤、滴剤、坐剤、スプレー剤、液剤および粉剤などの局所投与（例えば、膣直腸内投与を含む粘膜への投与）；肺性投与（例えば、噴霧器によるものを含む、粉剤またはエアロゾル剤の吸入または吹送による投与；気管支内投与、鼻腔内投与、表皮性投与および経皮投与）；経口投与；または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内の注射もしくは点滴を含む非経口投与；または頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）投与であり得る。
本発明の抗体または免疫複合体は、抗癌特性を有する第２の化合物と、医用配合製剤で、または併用療法としての投与計画で組み合わせられ得る。前記の医用配合製剤または投与計画の第２の化合物は、互いに不利に影響しあうことが無いように、前記組合せのＡＤＣに対して相補的な活性を持つことができる。前記ＥＧＦＲ結合薬剤と第２の抗癌剤を含む医薬組成物もまた提供される。
疾患の治療について、本発明の抗体または薬剤の適切な投薬量は、全て治療を行う医師の自由裁量で、治療される疾患の種類、前記疾患の重症度と経過、前記疾患の反応性、前記抗体または薬剤が治療目的または予防目的で投与されるのかということ、それ以前の治療法、患者の病歴などに依存する。前記抗体または薬剤は一回で、または数日から数か月続く一連の治療にわたって、または治癒がもたらされるまで、または病状の軽減（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与され得る。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬品蓄積の測定値から計算することができ、そして、個々の抗体または薬剤の相対的な力価に応じて変化する。投与を行う医師は最適な投薬量、投薬方法および反復速度を容易に決定することができる。ある実施形態において、投薬量は、体重ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｍｇまでであり、そして、毎日、毎週、毎月または毎年１回以上投与され得る。ある実施形態において、前記抗体または他のＥＧＦＲ結合薬剤は二週間毎に１回または三週間毎に１回投与される。ある実施形態において、前記抗体または他のＥＧＦＲ結合薬剤の投薬量は体重ｋｇあたり約０．１ｍｇから約２０ｍｇまでである。治療を行う医師は、体液または組織中の前記薬品の測定された滞留時間および濃度に基づき、投与の反復速度を推定することができる。
併用療法は「相乗作用」をもたらすことができ、そして、「相乗的」であると判明し得る、すなわち、有効成分が一緒に使用されると、達成される効果が、別々に前記化合物を使用することにより生じる効果の合計よりも大きいと判明し得る。前記有効成分が、（１）配合単位剤形に共製剤され、そして、同時に投与または送達されるとき；（２）別々の製剤として交互に、もしくは並行して送達されるとき；または（３）ある他の投与計画により送達されるとき、相乗効果が達成され得る。交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）で送達されるとき、前記化合物が、例えば、別々の注射筒での異なる注射により、順次、投与または送達されるとき、相乗効果が達成され得る。一般的に、交互療法（ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）の間に、有効投薬量の各有効成分が順次、すなわち、連続的に投与され、一方、併用療法では、有効投薬量の２つ以上の有効成分が一緒に投与される。
ＶＩ．ＥＧＦＲ結合薬剤を含むキット
本発明は、本明細書において記載される抗体、免疫複合体または他の薬剤を含み、そして、本明細書において記載される方法を実行するために使用することができるキットを提供する。ある実施形態において、キットは、１つ以上の容器にＥＧＦＲに対する少なくとも１つの精製抗体を含む。いくつかの実施形態において、前記キットは、対照、アッセイを実行するための説明書、および結果の分析と発表のための任意の必要なソフトウェアの全てを含む、検出アッセイの実行に必要および／または充分な構成要素の全てを含む。開示された本発明の抗体、免疫複合体または他の薬剤を、当技術分野においてよく知られている確立されたキットフォーマットの１つに容易に組み込むことができることを当業者は容易に認識する。
ＥＧＦＲ結合薬剤（例えば、ＥＧＦＲ結合抗体）、ならびに第２の抗癌剤を含むキットがさらに提供される。ある実施形態において、前記の第２の抗癌剤は化学療法剤（例えば、リツキシマブ）である。
本明細書において記載される実施例および実施形態は例示のみを目的とし、そして、それらを踏まえて様々な改変または変更が当業者に示唆され、且つ、それらが本願の精神と範囲の中に含まれるべきであると理解される。
（実施例１）
ラットＭＬ６６ ＥＧＦＲ抗体の作製と選択
ラットＥＧＦＲ抗体を作製するために、Ｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ミズーリ州）中のＭＤＡ−ＭＢ４６８乳房癌細胞株（ＡＴＣＣ）膜調製物を用いてメスのＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）に皮下注射を行った。最初の免疫から３週間後にＰＢＳ中の同じ抗原で免疫を一度繰り返した。細胞融合の３日前にもう１用量の抗原を腹腔内注射した。標準的な動物実験プロトコルに従って前記ラットの脾臓を回収し、２枚の滅菌凍結顕微鏡用スライドグラスの間で磨りつぶして単一の細胞懸濁液を得た。ＡＣＫ溶解緩衝液を用いる赤血球の溶解の後、次に前記脾臓細胞をマウス骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（Ｐ３細胞）（Ｊ． Ｆ． Ｋｅａｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ． １９７９， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １２３： １５４８−１５５０）と１：３（Ｐ３細胞：脾臓細胞）の割合で混合し、そして、ポリエチレングリコール１５００（Ｒｏｃｈｅ）を用いて前記細胞を融合した。ハイブリドーマを選択するために、ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に融合細胞を再懸濁し、そして、２００μｌ／ウェルの割合でそれを平底９６ウェルプレートに蒔いた。その後、ハイブリドーマクローンが抗体スクリーニングに利用できるようになるまで、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で前記プレートをインキュベートした。
ヒトＥＧＦＲ発現ラットＹＢ２／０安定細胞と野生型ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ）を使用するホールセル（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ）ＥＬＩＳＡを用いてハイブリドーマ培養上清をスクリーニングした。ＥＧＦＲ発現ＹＢ２／０細胞株と反応するだけであり、親細胞株とは反応しないハイブリドーマクローンが限界希釈によりサブクローニングされた。安定的なサブクローンが培養され、そして、市販のアイソタイピング薬剤（Ｒｏｃｈｅ）を用いて前記抗体をアイソタイピングした。総計で１２種のＥＧＦＲ特異的ラットモノクローナル抗体が得られ、そして、他の実施例で説明されるそのユニークな特質のためにＭＬ６６クローンが選ばれた。
ネズミ科ＥＧＦＲ−８抗体の作製と選択
ネズミ科抗ＥＧＦＲ抗体を作製するために、メスのＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ウィルミントン、マサチューセッツ州）にＣＡ９２２（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（ＪＣＲＢ）、新宿、日本）およびＨＳＣ４（ＪＣＲＢ、新宿、日本）などの頭部および頸部扁平上皮癌細胞株を、２週間ごとに５回、マウスあたり５×１０６細胞の用量で皮下注射した。ハイブリドーマ作製のために殺処理される３日前に、免疫されたマウスはもう１用量の抗原の腹腔内注射を受けた。標準的な動物実験プロトコルに従って前記マウスの脾臓を回収し、２枚の滅菌凍結顕微鏡用スライドグラスの間で磨りつぶして単一のＲＰＭＩ−１６４０培地中の細胞懸濁液を得た。ＡＣＫ溶解緩衝液を用いて赤血球を溶解した後、次に前記脾臓細胞をマウス骨髄腫Ｐ３細胞と１：３（Ｐ３細胞：脾臓細胞）の割合で混合した。脾臓細胞とＰ３細胞の混合物は洗浄され、そして、融合媒体（０．３Ｍマンニトール／Ｄ−ソルビトール、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）中のプロネースを用いて室温で３分間処理された。ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の添加により反応を停止させ、その後、細胞を洗浄し、２ｍｌの冷融合メディアに再懸濁し、そして、ＢＴＸ ＥＣＭ ２００１電気融合マシン（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて融合した。ヒポキサンチン‐アミノプテリン‐チミジン（ＨＡＴ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０選択培地に融合細胞を穏やかに加え、３７℃で２０分間インキュベートし、その後、２００μｌ／ウェルの割合でそれを平底９６ウェルプレートに蒔いた。その後、ハイドリドーマクローンが抗体スクリーニングに利用できるようになるまで、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で前記プレートをインキュベートした。Ｊ． Ｌａｎｇｏｎｅ ａｎｄ Ｈ． Ｖｕｎａｋｉｓ （Ｅｄｓ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １２１， “Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ”； Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｆｌｏｒｉｄａ）およびＥ． Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ． Ｌａｎｅ （“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”；１９８８； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）に記載されるものを含む、免疫とハイブリドーマ作製の他の技術もまた使用可能である。
ＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理されていないか処理されている免疫細胞を使用するフローサイトメトリー結合アッセイを用いてハイブリドーマのスクリーニングを行った。ＥＧＦとのインキュベーションが細胞表面上のＥＧＦＲレベルを下方制御するので、ＥＧＦＲ特異的ハイブリドーマ上清は未処理の細胞と反応するのみであり、ＥＧＦ処理化細胞とは反応しないであろう。まず、無血清培地で一晩、スクリーニングの標的の細胞が培養され、そして、２つの部分に分けられた。その細胞の一方の部分が未処理で残され、他方の部分が３７℃、３時間ＥＧＦで処理された。ＥＧＦ処理細胞がＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）遠赤色ＤＤＡＯ−ＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識され、１：１の比率で未処理の細胞と混合され、そして、ハイブリドーマ上清と２時間氷上でインキュベートされた。その後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ−標識抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とインキュベートし、洗浄し、ホルマリン固定し、そして、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。ＥＧＦＲ特異的ハイブリドーマを増やし、そして、可溶性組換えヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン（ＲＥＬＩＡＴｅｃｈ）を抗原として用いるＥＬＩＳＡにより上清を再スクリーニングした。ヒトＥＧＦＲ発現Ａ４３１表皮癌細胞株（ＡＴＣＣ）とサルＥＧＦＲ発現Ｖｅｒｏ細胞株（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞株）（ＡＴＣＣ）を使用するフローサイトメトリー結合アッセイを用いて陽性のハイブリドーマを再スクリーニングした。簡単に述べると、前記ハイブリドーマ上清をＡ４３１細胞およびＤＤＡＯ−標識Ｖｅｒｏ細胞と氷上で１時間インキュベートした。前記細胞を２回洗浄し、そして、ＰＥ複合体化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と氷上で１時間インキュベートした。その後、前記細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ホルマリン固定し、そして、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて解析した。
ＥＧＦＲ過剰発現ＨＣＣ８２７細胞（ＡＴＣＣ）の基底増殖を抑制する能力について、ヒト抗原およびサル抗原の両方に反応する陽性ハイブリドーマクローンを試験した。簡単に述べると、１００μｌの１０％ＦＢＳ含有完全培地中、９６ウェルプレートに２０００細胞／ウェルの割合で、対数増殖するＨＣＣ８２７細胞をプレーティングした。１００μｌのハイブリドーマ上清を前記細胞に添加し、そして、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で混合物を３７℃で５日間インキュベートした。比色分析性ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、メリーランド州）を用いて細胞増殖のレベルを決定した。ＷＳＴ−８は生細胞中のデヒドロゲナーゼにより還元されて、組織培地中で可溶性であるオレンジ色のホルマザン産物となり、そして、生成したホルマザンの量は生細胞の数に正比例する。ＷＳＴ−８の最終体積の１０％が各ウェルに添加され、そして、さらに２〜４時間、プレートを３７℃でインキュベートした。その後、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州）で４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を測定することによりプレートを分析した。培地とＷＳＴ−８のみを有するウェルのバックグランドＡ４５０吸光度を全ての値から減算した。未処理の細胞を用いるウェルの平均値で各処理試料の値を除算することにより生存率を計算した（生存率＝（Ａ４５０処理試料−Ａ４５０バックグランド）／（Ａ４５０未処理試料−Ａ４５０バックグランド））。生存率０が、細胞が無いウェルでの値を示し、そして、１が、どのようなＥＧＦＲ抗体も含まない血清含有培地での細胞増殖のレベルを示すように、前記の結果が正規化された。ＨＣＣ８２７細胞増殖を抑制する能力の欠如のため、ＥＧＦＲ−８ハイブリドーマを選択した。限界希釈によりそれらをサブクローニングした。フローサイトメトリーによって親細胞と同じＥＧＦＲに対する反応性を示す１つのサブクローンがその後の解析のために選択された。安定なサブクローンが培養され、そして、市販のアイソタイピング試薬（Ｒｏｃｈｅ）を用いて前記抗体をアイソタイピングした。
抗体の精製
例えば、プロテインＡまたはプロテインＧクロマトグラフィー（Ｈｉ ＴｒａｐプロテインＡまたはプロテインＧ ＨＰ、１ｍＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの標準的な方法を用いてハイブリドーマサブクローン上清から抗体を精製した。簡単に述べると、１／１０体積の１Ｍトリス／塩酸緩衝液、ｐＨ８．０の添加によりクロマトグラフィー用に上清を調製した。ｐＨを調製した上清を０．２２μｍの濾過膜に通して濾過し、そして、結合緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で平衡化したカラムに負荷した。２８０ｎｍでの吸光が無い、安定したベースラインが得られるまで、結合緩衝液で前記カラムを洗浄した。０．１５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ２．８で、０．５ｍＬ／分の流速を用いて抗体を溶出した。約０．２５ｍＬの画分を採取し、そして、１／１０体積の１Ｍトリス／塩酸、ｐＨ８．０の添加によりそれらを中和した。ピーク画分を１×ＰＢＳに対して２回、一晩透析し、そして、０．２μｍの濾過膜を通して濾過することにより無菌化した。Ａ２８０での吸光度により精製抗体を定量した。
ネズミ科抗体について、第四級アンモニウム（Ｑ）クロマトグラフィーでのイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を用いて、プロテインＡ精製された画分をさらに精製した。簡単に述べると、プロテインＡ精製の試料を結合緩衝液（１０ｍＭトリス、１０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）に緩衝液交換し、そして、０．２２μｍのフィルターに通して濾過した。その後、１２０ｃｍ／時間の流速で結合緩衝液を用いて平衡化したＱファーストフロー樹脂（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に調製された試料を負荷した。前記試料中の全てのＭＡｂを結合するように、充分な容積を持つカラムが選択された。その後、２８０ｎｍでの吸光が無い、安定したベースラインが得られるまで、前記カラムを結合緩衝液で洗浄した。２０カラム体積（ＣＶ）での１０ｍＭから５００ｍＭまでの塩化ナトリウムの濃度勾配を開始することにより抗体を溶出した。２８０ｎｍ（Ａ２８０）での吸光度の測定値に基づきピーク画分を採取した。Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ１１００システム（Ａｇｉｌｅｎｔ、サンタクララ、カリフォルニア州）を用い、ＳＷＸＬガードカラム、６．０×４０ｍｍ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、モンゴメリービル、ペンシルバニア州）を用いるＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍでのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により単量体のパーセンテージを評価した。単量体の含量が９５％よりも多い画分をプールし、ＴＦＦシステムを用いてＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、そして、０．２μｍの濾過膜を通して濾過することにより無菌化した。精製された抗体のＩｇＧ濃度を、１．４７の吸光係数を用いてＡ２８０により決定した。優れた選択性を有する抗体を精製するためにセラミックハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）などの代わりの方法もまた使用された。ＩＥＸクロマトグラフィーについて説明されたものと同様のプロトコルを用いて、４０μｍの粒子サイズを有するタイプＩＩ ＣＨＴ樹脂（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。ＣＨＴ用の結合緩衝液は２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０に対応し、そして、２０ＣＶにわたる２０〜１６０ｍＭのリン酸ナトリウムの濃度勾配を用いて抗体を溶出した。
（実施例２）
ヒトとサルのＥＧＦＲ抗原への結合親和性
ヒト抗原およびサル抗原への前記ＥＧＦＲ抗体の結合親和性を決定するために、フローサイトメトリー結合アッセイにおいて、ＭＤＡ−ＭＢ４６８（ＡＴＣＣ）およびＡ４３１細胞（ＡＴＣＣ）などのＥＧＦＲ発現ヒト腫瘍細胞株ならびにＶｅｒｏ（ＡＴＣＣ）という名称のアフリカミドリザル腎臓細胞株を使用した。簡単に述べると、様々な濃度のＥＧＦＲ抗体と４℃で１時間インキュベートした。前記細胞を洗浄し、そして、ＰＥ複合体化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と前記細胞を４℃で１時間インキュベートした。その後、前記細胞を洗浄し、ホルマリン固定し、そして、ＦＡＣＳａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で解析した。これらの抗体の結合親和性を決定するために、セミログプロットで抗体濃度に対して幾何平均蛍光強度をプロットした。非線形回帰により用量反応曲線を生成し、そして、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ バージョン４（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて、各抗体の見かけの解離定数（Ｋｄ）に対応する前記曲線のＥＣ５０値が計算された。ＥＧＦＲ−８抗体、ＭＬ６６抗体、セツキシマブおよびパニツムマブはヒト腫瘍細胞株とＶｅｒｏ細胞の両方に対して強い特異的な結合を示した。図１に示されている表はヒトとサルのＥＧＦＲに対する各抗体のＫｄを記載している。
（実施例３）
ＭＬ６６抗体のＶＬ領域とＶＨ領域のクローニングおよびシークエンシング
製造業者のプロトコルに従ってＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡｇｅｎ）を用いて、５×１０６細胞のＭＬ６６ハイブリドーマから全細胞性ＲＮＡを調製した。その後、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。
ハイブリドーマ細胞に由来するｃＤＮＡでの初回のデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ）ＰＣＲ反応の方法は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （（２０００） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｓ． ２３３：１６７−７７）および Ｃｏ ｅｔ ａｌ． （ （１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９−５４）に記載される方法に基づいた。次のデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー、すなわち、ＥｃｏＭＨ１：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣ（配列番号４１）、ＥｃｏＭＨ２：ＣＴＴＣＣＧＧＡＡＴＴＣＳＡＲＧＴＮＭＡＧＣＴＧＳＡＧＳＡＧＴＣＷＧＧ（配列番号４２）およびＢａｍＩｇＧ１：ＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＧＣ（配列番号４３）を用いるＰＣＲによりＶＨ配列を増幅した。次のデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマー、すなわち、ＳａｃＩＭＫ：ＧＧＡＧＣＴＣＧＡＹＡＴＴＧＴＧＭＴＳＡＣＭＣＡＲＷＣＴＭＣＡ（配列番号４４）およびＨｉｎｄＫＬ：ＴＡＴＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣ（配列番号４５）を用いるＰＣＲによりＶＬ配列を増幅した。（混合塩基は次のように定義する：Ｎ＝Ｇ＋Ａ＋Ｔ＋Ｃ、Ｓ＝Ｇ＋Ｃ、Ｙ＝Ｃ＋Ｔ、Ｍ＝Ａ＋Ｃ、Ｒ＝Ａ＋Ｇ、Ｗ＝Ａ＋Ｔ）。その後、ＰＣＲ反応混合物を１％低融点アガロースゲルに流し、３００〜４００ｂｐのバンドを切り出し、Ｚｙｍｏ ＤＮＡミニカラムを用いて精製し、そして、シークエンシングのためにＡｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓに送付した。両方向からの可変領域ｃＤＮＡを生成するために、それぞれの５’ＰＣＲプライマーおよび３’ＰＣＲプライマーをシークエンシングプライマーとして使用した。ＤＮＡシークエンシングの結果からＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列を予測した。
ＶＬ ｃＤＮＡ配列およびＶＨ ｃＤＮＡ配列をクローン化するために使用したデジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーが５’末端配列を変更するので、完全な配列を確かめるために追加のシークエンシングの試みが必要とされた。抗体配列が引き出される、ラット生殖系列配列についてのＮＣＢＩ ＩｇＢｌａｓｔサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）を検索するために、予備検討段階のｃＤＮＡ配列が用いられた。その後、新しいＰＣＲ反応によりＰＣＲプライマーによって変更されていない、完全な可変領域ｃＤＮＡ配列が生じるように、ラット抗体の生殖系列関連リーダー配列にアニーリングするようにＰＣＲプライマーが設計された。あるいは、５’末端配列を得るために、Ｃｏ ｅｔ ａｌ．， （（１９９２） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１１４９−５４） に記載されるようなＲＡＣＥ法もまた使用された。上述したように、ＰＣＲ反応、バンド精製およびシークエンシングを行った。
配列の確定のための質量決定
全長型抗体ｃＤＮＡ配列を得るために、可変領域のｃＤＮＡ配列情報を生殖系列の定常領域配列と組み合わせた。その後、重鎖および軽鎖の分子量を計算し、そして、ラットＭＬ６６抗体のＬＣ／ＭＳ分析により得られた分子量と比較した。分子量の測定値はＭＬ６６の軽鎖および重鎖の両方のｃＤＮＡ配列と一致する。
ＭＬ６６抗体のヒト化
例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ， ９１（３）： ９６９−９７３ （１９９４） およびＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ９（１０）：８９５−９０４ （１９９６） などにおいて以前に説明された再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）方法に従って、ＭＬ６６抗体をヒト化した。一般に、再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）は軽鎖および重鎖の両方における可変領域フレームワーク表面残基の特定ならびにヒト同等物との置換を伴う。再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ） 抗体ではげっ歯類のＣＤＲは保存されている。ＭＬ６６の例示的なＣＤＲは表１０に示されているように限定される。再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）のために用いられるＡｂＭ重鎖ＣＤＲ２の限定に加えて、前記の表はラット版とヒト版のＭＬ６６についての例示的なＫａｂａｔ限定重鎖ＣＤＲ２を提供する。下線を引いた配列は、再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）ではＣＤＲと考えられなかったＫａｂａｔ重鎖ＣＤＲ２の部分を示す。
３０％以上の相対的アクセス可能性を有する任意の位置として表面残基位置を定義した（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｊ．Ｔ． ｅｔ． Ａｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９４； ２３５： ９５９−９７３）。その後、最も相同性が高いヒト表面配列を特定するために、計算された表面残基をヒト生殖系列表面配列と整列させた。軽鎖可変ドメインの置換表面として用いたヒト生殖系列配列はＩＧＫＶ７−３＊０１であり、そして、重鎖可変ドメインの置換表面として用いたヒト生殖系列配列はＩＧＨＶ４−３９＊０２であった。具体的なフレームワーク表面残基の変更が図１に示されている。軽鎖では総計で６つの表面残基、および重鎖では総計で９つの表面残基がヒトの相対物で置換された。図２は、軽鎖および重鎖の両方のＭＬ６６可変ドメインの再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）配列のラットの対応物とのアラインメントを示す。
ヒト化ＭＬ６６（ｈｕＭＬ６６）抗体の組換え発現
ｈｕＭＬ６６の可変領域配列がコドン最適化を受け、そして、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより合成された。単鎖哺乳類発現プラスミド中の各定常配列とのインフレームでのクローニングのために前記配列の両脇に制限酵素部位を配置する。ｐＡｂＫＺｅｏプラスミド中のＥｃｏＲＩ部位およびＢｓｉＷＩ部位に軽鎖可変領域をクローニングする。ｐＡｂＧ１Ｎｅｏプラスミド中のＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＡｐａ１部位に重鎖可変領域をクローニングする。一過性または安定的哺乳類細胞形質移入のどちらかにより組換え抗体を発現するために、これらのプラスミドを使用することができる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で組換え抗体を発現するために、改変型ＰＥＩ法（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３０：Ｅ９ （２００２））を用いて一過性形質移入を行った。上述したような標準的な方法を用いるプロテインＡクロマトグラフィーステップおよび最終精製クロマトグラフィーステップにより、上清を精製した。
（実施例４）
ヒト化抗体の結合親和性
ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞を用いるフローサイトメトリーアッセイで、ｈｕＭＬ６６抗体の結合親和性をネズミ科の対応物と比較した。実施例２に記載されるように前記結合アッセイを行い、そして、非線形回帰により生成した用量反応曲線が図４に示された。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン４（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて計算したＫｄによって、ヒト化がＭＬ６６抗体の結合親和性に影響しなかったことが示されている。抗ＫＴＩ（Ｋｕｎｉｔｚ型トリプシン阻害剤）抗体（ＡＴＣＣより得たハイブリドーマから産生される）を陰性対照として使用した。
（実施例５）
ＥＧＦＲリガンド誘導性ＥＧＦＲ活性化の阻害
ＥＧＦＲリガンドの結合はＥＧＦＲリン酸化とそれに続く下流シグナル伝達経路の活性化を誘導する。リガンド誘導性ＥＧＦＲ活性化における抗ＥＧＦＲ抗体の効果を調査するために、ＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍細胞株およびヒト初代成人性ケラチノサイトを用いるウエスタンブロット分析を実行した。簡単に述べると、６ウェルプレートに１×１０６細胞／ウェルの割合で細胞を蒔き、通常培地中で培養した。細胞を洗浄し、そして、０．１％ＢＳＡを含有する無血清／ＥＧＦ培地中で３７℃２時間細胞を飢餓状態に置いた。１０μｇ／ｍｌの抗体を前記細胞に添加し、そして、混合物を３７℃で３時間インキュベートした。前記混合物に５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を添加し、そして、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、そして、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質ライセートを分離し、そして、ニトロセルロース膜に転写した。前記の膜を５％ＢＳＡでブロックし、そして、抗リン酸化チロシン抗体（クローン４Ｇ１０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と４℃で一晩インキュベートした。前記の膜を洗浄し、ＨＲＰ複合体化抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と室温で１時間インキュベートし、そして、再度洗浄した。ＥＣＬ（増強型化学発光）システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてシグナルを検出した。各レーンに等量のタンパク質が負荷されたことを確実にするために、前記の膜がプローブ除去処理され、そして、抗β‐チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いる再検出に処された。
図５に示されるように、ＥＧＦ刺激により、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞およびヒト初代ケラチノサイトの両方での強いＥＧＦＲリン酸化がもたらされた。セツキシマブおよびパニツムマブを用いる細胞の処理がＥＧＦ誘導性ＥＧＦＲリン酸化を強く阻害する一方、ｈｕＭＬ６６抗体とｍｕＥＧＦＲ−８抗体はＥＧＦＲの活性化に影響を持たなかった。陰性対照として抗ＫＴＩ抗体を使用した。
（実施例６）
ＥＧＦＲ抗体の作動性活性
ＥＧＦＲリガンドが存在しないときのＥＧＦＲシグナル伝達に対する本発明のＥＧＦＲ抗体の効果を調査するために、実施例５に記載されるように、無血清培地でＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍細胞を飢餓状態に置いた。その後、前記細胞を１０μｇ／ｍｌのＥＧＦＲ抗体と３７℃で３時間インキュベートした。陽性対照として、未処理の細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと３７℃で１５分間インキュベートした。実施例５に記載されるように、タンパク質ライセートを調製し、そして、ウエスタンブロットを用いて分析した。図６に代表的な結果が示されている。ＥＧＦ処理により、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞における強いＥＧＦＲリン酸化が明らかに誘導された。同様に、ＥＧＦＲリン酸化のレベルはＥＧＦによるものよりも低かったが、ｍｕＥＧＦＲ−８抗体もまたＥＧＦＲのリン酸化を誘導した。対照的に、パニツムマブ、セツキシマブおよびｈｕＭＬ６６抗体は、前記リガンドが存在しないとき、ＥＧＦＲシグナル伝達に影響しなかった。実施例５および６に記載される結果によって、ＥＧＦＲ−８抗体は作動性である一方、ＭＬ−６６抗体はＥＧＦＲシグナル伝達に影響しないことが示される。
（実施例７）
リガンド結合の競合
ＥＧＦＲシグナル伝達阻害の１つのメカニズムはリガンド結合の阻止である。ＥＧＦＲ抗体がＥＧＦＲへのリガンドの結合を阻害するか検討するために、抗ＥＧＦＲ抗体の存在下でのビオチン化ＥＧＦＲリガンドのＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合をフローサイトメトリーにより測定した。製造業者の指示に従い、ＥＺ−リンクミクロスフホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン化キット（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックランド、イリノイ州）を用いてＴＧＦα（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）のビオチン化が行われた。ビオチン化ＥＧＦはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。競合アッセイの前に、ビオチン化リガンドの結合曲線を構築した。様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体をＥＣ５０濃度（ＥＧＦとＴＧＦαについて、それぞれ、１．８ｎＭおよび１０ｎＭ）のビオチン化リガンドと予備混合し、そして、その混合物を前記細胞と氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そして、ストレプトアビジン−ＡＰＣ複合体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と氷上で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、そしてＦｌｏｗＪｏプログラム（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いてＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で分析した。セミログプロットで抗体濃度に対して幾何平均蛍光強度をプロットした。図７に示されるように、セツキシマブおよびパニツムマブの両方がリガンドの結合を強く阻害したが、一方、陰性対照抗体、すなわち、抗ＫＴＩ抗体はどのような効果も持たなかった。興味深いことに、ｈｕＭＬ６６抗体はＴＧＦαの結合を増強するように見えたが（図７Ａ）、一方、それはＥＧＦの結合には最小の効果を持ち（図７Ｂ）、そして、ｍｕＥＧＦＲ−８抗体はＴＧＦαとＥＧＦの両方の結合を増強するように見えた。
（実施例８）
ヒト初代ケラチノサイトと正常上皮細胞株の増殖阻害アッセイ
皮膚、胃腸管および他の器官のヒト正常基底上皮細胞は生理的にＥＧＦＲを発現する。これらの組織におけるＥＧＦＲシグナル伝達は上皮細胞の増殖に重要である。セツキシマブおよびパニツムマブならびにエルロチニブおよびゲフィチニブなどの小チロシンキナーゼ阻害剤によるＥＧＦＲ機能の破壊が著しい皮膚傷害性を引き起こす。皮膚および他の上皮細胞における潜在的な傷害性を模倣するために、ヒト初代ケラチノサイト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と非腫瘍原性乳房上皮細胞株であるＭＣＦ１０Ａ（ＡＴＣＣ）を用いる増殖アッセイが構築された。このアッセイでは、製造業者により示唆されるＥＧＦＲリガンド含有培地中にウェルあたり１，５００〜２，０００細胞の割合で細胞をプレーティングし、そして、抗ＥＧＦＲ抗体と３７℃で５日間インキュベートした。ケラチノサイトアッセイ（図８）では、様々な濃度の抗体と共に０．２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで細胞が培養された。一方、ＭＣＦ１０Ａ細胞アッセイ（図９）では、様々な濃度のＥＧＦＲリガンドおよび一定の濃度（１０μｇ／ｍｌ）の抗体と細胞がインキュベートされた。比色分析性ＷＳＴ−８アッセイ（Ｄｏｊｉｎｄｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ロックビル、メリーランド州）を用いて細胞増殖のレベルを決定した。ＷＳＴ−８は生細胞中のデヒドロゲナーゼにより還元されて、組織培地中で可溶性であるオレンジ色のホルマザン産物となり、そして、生成したホルマザン産物の量は生細胞の数に正比例する。ＷＳＴ−８の最終体積の１０％が各ウェルに添加され、そして、さらに２〜４時間、加湿５％ＣＯ２インキュベーター内でプレートを３７℃でインキュベートした。その後、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーベール、カリフォルニア州）で４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を測定することによりプレートを分析した。培地とＷＳＴ−８のみを有するウェルのバックグランドＡ４５０吸光度を全ての値から減算した。未処理の細胞を用いるウェルの平均値で各処理試料の値を除算することにより生存率を計算した（生存率＝（Ａ４５０処理試料−Ａ４５０バックグランド）／（Ａ４５０未処理試料−Ａ４５０バックグランド））。０が、ＥＧＦが存在しないときの細胞増殖レベルを示し、そして、１が、どのようなＥＧＦＲ抗体処理も無く、ＥＧＦが存在するときの細胞増殖のレベルを示すように、前記の結果が正規化された。
前記増殖アッセイが行われる前に、前記抗ＥＧＦＲ抗体のヒト初代ケラチノサイトならびにＭＣＦ１０Ａ細胞への結合が確認された。ケラチノサイト増殖アッセイの代表的な結果が図８に示されている。傷害性プロファイルから予測されるように、セツキシマブおよびパニツムマブは用量依存的にケラチノサイト増殖を強く抑制したが、一方、ｈｕＭＬ６６抗体とｍｕＥＧＦＲ−８抗体は、陰性対照であるキメラＫＴＩ抗体と同様に、ケラチノサイトに対してほとんど、または、全く効果を持たなかった。同様に、図９に示されるように、セツキシマブおよびパニツムマブはＭＣＦ１０Ａ細胞増殖を強く抑制したが、一方、ｈｕＭＬ６６抗体とｍｕＥＧＦＲ−８抗体は正常上皮細胞の増殖にほとんど、または、全く効果を持たなかった。これらのデータは、ＭＬ６６抗体およびＥＧＦＲ−８抗体は、正常な上皮細胞に対して、セツキシマブおよびパニツムマブよりも傷害性が少ないことを示唆する。
（実施例９）
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞株の基底増殖の阻害
腫瘍細胞の基底レベルの増殖の阻害における抗ＥＧＦＲ抗体の能力を判定するために、ＥＧＦＲ発現ＮＣＩ−Ｈ２９２（ＡＴＣＣ）肺腫瘍細胞株およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ（ＮＣＩ）肺腫瘍細胞株を用いる増殖アッセイを構築した。１０％ＦＢＳ含有通常増殖培地にウェルあたり２，０００細胞の割合で細胞をプレーティングし、そして、様々な濃度の抗ＥＧＦＲ抗体の存在下で３７℃、５日間培養した。実施例８に記載されるように、比色分析性ＷＳＴ−８アッセイを用いて細胞増殖のレベルを判定した。生存率１が、抗ＥＧＦＲ抗体が無い通常増殖培地での細胞増殖を表し、そして、０が、どのような細胞も無いウェルを表すように、ＯＤの結果が正規化された。
図１０ＡおよびＢは、それぞれ、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞を用いる増殖アッセイの結果を示す。セツキシマブ処理およびパニツムマブ処理が用量依存的に両方の細胞株の増殖を抑制した。対照的に、ｈｕＭＬ６６抗体およびｍｕＥＧＦＲ−８抗体は腫瘍細胞増殖に影響しなかった。
（実施例１０）
抗ＥＧＦＲ抗体結合の競合
抗ＥＧＦＲ抗体の結合エピトープを識別するために、フローサイトメトリーを用いて抗体結合競合アッセイを行った。この実験では、様々な濃度の「競合」抗体の存在下でのビオチン化５２８抗体（ＡＴＣＣより得た５２８ハイブリドーマから産生される）およびセツキシマブのＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞への結合が測定された。５２８抗体とセツキシマブがまず実施例８に記載されるように標識された。様々な濃度のパニツムマブ、セツキシマブ、５２８、ｍｕＥＧＦＲ−８、ｈｕＭＬ６６およびＫＴＩ抗体と０．２ｎＭビオチン化５２８抗体またはセツキシマブを予備混合した。前記抗体混合物を標的のＡ４３１細胞と氷上で２時間インキュベートした。前記細胞を洗浄し、そして、ストレプトアビジン−アレクサ４８８複合体と氷上で１時間インキュベートした。洗浄後、前記細胞を固定し、そして、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｕｒで分析した。セミログプロットで抗体濃度に対して幾何平均蛍光強度をプロットし、そして、１００％が、競合抗体が存在しないときのビオチン化基準抗体の最大の結合を表し、そして、０％が、ビオチン化抗体が存在しないときのバックグランド染色を表すように、正規化された。図１１ＡおよびＢは、それぞれ、競合抗体が存在するときのビオチン化５２８抗体およびセツキシマブの代表的な結合結果を示す。５２８、セツキシマブおよびパニツムマブは互いに競合するが、一方、ｈｕＭＬ６６抗体およびｍｕＥＧＦＲ−８抗体はセツキシマブと５２８抗体の両方と競合しないことを図１１のデータは示し、本発明の抗体がセツキシマブおよび５２８抗体のエピトープとは異なるエピトープに結合することを示唆する。
（実施例１１）
ｈｕＥＧＦＲ抗体のＡＤＣＣ活性
新規に単離したヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をエフェクター細胞として使用して腫瘍細胞株の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を測定するために乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイを用いた（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２００１ ２７６（９）：６５９１−６０４）。ＮＫ細胞単離キットＩＩ（番号１３０−０９１−１５２；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニア州）のための改変されたプロトコルを用いて、正常なドナーからのヒト末梢血液（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、ブライトン、マサチューセッツ州）からＮＫ細胞をまず単離した。末梢血液を１×ＰＢＳで２倍に希釈した。５０ｍＬのコニカルチューブ中の２５ｍＬのフィコール・パック（Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ）に２５ｍＬの希釈血液を注意深く重層し、そして、４００ｇ、室温で４５分間遠心分離した。末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を境界面から採取し、新しい５０ｍＬのコニカルチューブに移し、そして、１×ＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＭＣを計数し、そして、ＭＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて２．５×１０７細胞／１００μｌの濃度に再懸濁し、その後、前記細胞懸濁液に１／４×体積のＮＫ細胞ビオチン−抗体カクテルを添加した。前記ＮＫ細胞ビオチン−抗体カクテルは、ＮＫ細胞を除くリンパ球に結合するビオチン化抗体を含み、その結果、ＮＫ細胞のネガティブ選択がもたらされる。前記混合物を４℃で１０分間インキュベートし、その後、３／５×体積のＭＡＣＳ緩衝液および前記ビオチン化抗体に結合するであろう２／５×体積のＮＫ細胞マイクロビーズカクテルが添加された。前記細胞抗体混合物を４℃でさらに１５分間インキュベートした。次に、５０ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を用いて細胞を１回洗浄し、そして、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。自動ＭＡＣＳ分離機（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＮＫ細胞を陰性画分として分離した。その結果のＮＫ細胞を３０ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（５％ウシ胎児血清、１％ペニシリン‐ストレプトマイシン、１ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％ １００×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を追加したＲＰＭＩ−１６４０）に一晩プレーティングした。その後のアッセイと全ての希釈はＲＨＢＰ培地（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡおよび１％ペニシリン‐ストレプトマイシンを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地）で行った。
丸底９６ウェルプレートにウェルあたり５０μＬのＲＨＢＰ培地中の様々な濃度の抗体を二つ組で分取した。標的細胞（この実験ではＡ４３１細胞株）をＲＨＢＰ培地に１０６細胞／ｍＬの割合で再懸濁し、そして、希釈抗体を含有する各ウェルに１００μＬ／ウェルの割合でそれを添加した。標的細胞と希釈抗体を含む前記プレートを室温で３０分間インキュベートした。その後、５０μＬ／ウェルの割合で標的細胞を含むウェルにＮＫ細胞を添加した。典型的な比率は１：３〜４（標的細胞：ＮＫ細胞）であった。各実験に次の対照を設定した：ＮＫ細胞のみ、標的細胞のみ（突発性ＬＤＨ放出）、標的細胞とＮＫ細胞（抗体非依存性ＬＤＨ放出）、標的細胞と１０％トライトンＸ−１００（最大ＬＤＨ放出）。細胞を溶解させるために前記混合物を３７℃で４時間インキュベートした。プレートを１２００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして、１００μＬの上清を注意深く新しい平底９６ウェルプレートに移した。細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ １ ６４４ ７９３）のＬＤＨ反応混合物（１００μＬ／ウェル）を各ウェルに添加し、そして、室温で５〜３０分間インキュベートした。試料の光学密度（ＯＤ）を４９０ｎｍで測定した（ＯＤ４９０）。次の式を用いて各試料のパーセント特異的溶解を決定した：パーセント特異的溶解＝１００×（試料の値−突発的放出）／（最大放出−突発的放出）。
図１２は、ｃｈＫＴＩ抗体のものと比較したｈｕＭＬ６６抗体の代表的なＡＤＣＣ活性を示す。ｈｕＭＬ６６抗体は用量依存的に標的細胞のＮＫ細胞媒介性殺滅を誘導し、最大特異的殺滅は５０％超に達した。対照的に、標的細胞に結合しないｃｈＫＴＩ抗体はＡＤＣＣを媒介することができなかった。
（実施例１２）
ｈｕＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の調製
（スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）リンカーをジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に溶解した。５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．５中の５ｍｇ／ｍＬの前記抗体を１０倍モル過剰のＳＭＣＣと共にインキュベートすることにより、ＳＭＣＣを用いてｈｕＥＧＦＲ抗体を修飾して前記抗体にマレイミドを導入した。外界温度で約１００分後、同じリン酸カリウム緩衝液で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５カラムを用いて前記反応混合物を精製した。抗体含有画分をプールし、そして、その後のステップに使用した。
前記マレイミドリンカーに対して１．７倍モル過剰のＤＭ１の１０ｍＭ溶液とＳＭＣＣ‐修飾型抗体を反応させた。前記反応を外界温度下で約１８時間撹拌した。ｐＨ６．５の１×ＰＢＳで平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５ゲル濾過カラムを通して前記複合体化反応混合物を濾過した。その後、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％ショ糖を含むｐＨ５．５の緩衝液にｈｕＥＧＦＲ抗体−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体を透析した。以前に報告されている抗体とＤＭ１の吸光係数（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３， ８６１８−８６２３ （１９９６）） を用い、抗体分子あたりの結合したＤＭ１分子の数を決定した。２５％アセトニトリル、１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化したＨｉＳｅｐカラムに２０〜５０μｇの複合体を注入し、そして、アセトニトリル中に溶出することにより複合体化反応後に存在する遊離マイタンシノイドのパーセンテージを決定した。２５２ｎｍの波長に設定した吸光度検出器を用いて（濃度勾配で溶出され、そして、公知の標準物との溶出時間の比較により同定された）総遊離マイタンシノイド種のピーク面積を測定し、そして、（カラム通過画分中の複合体ピークに溶出される）結合型マイタンシノイドに関連したピーク面積と比較して総遊離マイタンシノイド種のパーセンテージを計算した。ｈｕＥＧＦＲ抗体あたり３．５〜４ＤＭ１分子を有する複合体が得られ、未複合体化マイタンシノイドとして１％未満が存在した。
ｈｕＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の調製
例示的なＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカーをエタノールに溶解した。５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および３％エタノールを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で８ｍｇ／ｍＬのｈｕＥＧＦＲ抗体を５．５〜５倍モル過剰のＳＰＤＢリンカーと室温で約２時間インキュベートした。ＳＰＤＢ修飾型抗体をＰＢＳ、ｐＨ６．５で２倍に希釈し、そして、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）中のＤＭ４の濃溶液（１５〜３０ｍＭ）の添加により１．５倍モル過剰のマイタンシノイドＤＭ４を用いて修飾した。室温での一晩のインキュベーションの後、１０ｍＭヒスチジン、２５０ｍＭグリシン、１％ショ糖、ｐＨ５．５で平衡化したＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）Ｇ２５Ｆでのクロマトグラフィーにより複合体化抗体を精製した。以前に報告されている抗体とマイタンシノイドの吸光係数（Ｗｉｄｄｉｓｏｎ ＷＣ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ， ４９：４３９２−４４０８ （２００６）） を用い、抗体分子あたりの結合したＤＭ４分子の数を決定した。上述のように、総遊離マイタンシノイド種のパーセンテージを決定した。ｈｕＥＧＦＲ抗体あたり３．５〜４ＤＭ４分子を有する複合体が得られ、未複合体化マイタンシノイドとして１％未満が存在した。
（実施例１３）
マイタンシノイド 複合体の結合親和性
実施例２に記載されるように、ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞またはＡ４３１細胞を使用してｈｕＭＬ６６抗体マイタンシノイド複合体およびｍｕＥＧＦＲ−８抗体マイタンシノイド複合体の結合親和性が裸抗体の結合親和性と比較された。ｈｕＭＬ６６抗体と複合体の結合曲線（図１３Ａ）から計算されたＫｄは裸ｈｕＭＬ６６抗体について１．１２ｎＭであり、ｈｕＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体について２．３３ｎＭであり、そしてｈｕＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体について２．９３ｎＭであった。ｍｕＥＧＦＲ−８抗体と複合体の結合曲線（図１３Ｂ）から計算されたＫｄは裸ｍｕＥＧＦＲ−８抗体について１．４３ｎＭであり、そして、ｍｕＥＧＦＲ−８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体について４．５４ｎＭであった。このデータは、ＤＭ複合体化によってｈｕＭＬ６６およびｍｕＥＧＦＲ−８抗体のｈｕＥＧＦＲへの結合親和性が顕著に変更されないことを示す。
（実施例１４）
インビトロ細胞傷害性アッセイ
インビトロ細胞傷害性アッセイを用いてＥＧＦＲ抗体マイタンシノイド複合体の腫瘍細胞増殖を抑制する能力を測定した。簡単に述べると、１０％ＦＢＳを含有する完全ＲＰＭＩ培地１００μＬ中にウェルあたり１，５００〜３，０００細胞の割合で標的細胞をプレーティングした。５倍の希釈系列を用いて完全ＲＰＭＩ培地に複合体を希釈し、そして、ウェルあたり１００μＬを添加した。典型的には、最終濃度は３×１０−８Ｍから８×１０−１４Ｍまでの範囲であった。加湿５％ＣＯ２インキュベーター内で細胞を３７℃で５日間インキュベートした。比色分析性ＷＳＴ−８アッセイにより残っている細胞の生存性を決定し、そして、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）がマルチウェルプレートリーダーで測定された。未処理の対照の平均値で各処理試料の値を除算することにより生存率を算出した。各処理について、セミログプロットで抗体‐複合体濃度に対して生存率の値をプロットした。
図１４では、ｈｕＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体およびｈｕＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体のインビトロ細胞傷害性がｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体およびｃｈＫＴＩ−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体などの非特異的マイタンシノイド複合体の活性と比較された。典型的な細胞傷害性アッセイの結果がＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（ＡＴＣＣ）、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ）およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞（ＮＣＩ）について、それぞれ、図１３Ａ、ＢおよびＣに示されている。ｈｕＭＬ６６Ａｂ複合体は、３ｎＭから０．１ｎＭまでの範囲のＥＣ５０で３種のＥＧＦＲ発現性腫瘍細胞株において強くて特異的な細胞傷害性を示した。
図１５では、キメラＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（ｃｈＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１）の特異的傷害性がＫＢ細胞株で試験された。この実験では、過剰な裸ｃｈＭＬ６６抗体（１μＭ）と共に、またはそれ無しで標的細胞がｃｈＭＬ６６複合体とインキュベートされた。裸ｃｈＭＬ６６抗体はＭＬ６６複合体の結合を阻止し、したがって、前記複合体の特異的細胞傷害性を阻害した。ＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のＥＣ５０は、裸ＭＬ６６抗体によるブロッキングが有る場合と無い場合で、それぞれ、３０ｎＭおよび３ｎＭである。したがって、ＭＬ６６複合体について１ログの特異性ウィンドウが存在する。
図１６では、ｍｕＥＧＦＲ−８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のインビトロ細胞傷害性が非特異的ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体の活性と比較された。典型的な細胞傷害性アッセイの結果がＮＣＩ−Ｈ２２６細胞（ＡＴＣＣ）、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ）およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ細胞（ＮＣＩ）について、それぞれ、図１６Ａ、ＢおよびＣに示されている。ｍｕＥＧＦＲ−８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体は、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ２９２およびＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍにおいて、それぞれ、０．６８ｎＭ、０．４３ｎＭおよび３．０７ｎＭのＥＣ５０で３種のＥＧＦＲ発現性腫瘍細胞株において強くて特異的な細胞傷害性を示した。対照的に、ｃｈＫＴＩ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１はほとんど効果を持たず、そして、裸ｍｕＥＧＦＲ−８抗体は３種の細胞株全てでどのような傷害性も示さなかった。ＤＭｘ複合体化が本発明の非拮抗性ＥＧＦＲ抗体を高い細胞傷害性を有するものにすることをこれらのデータは示唆する。
（実施例１５）
ＫＢ腫瘍モデルにおけるｃｈＭＬ６６抗体マイタンシノイド複合体のインビボ有効性試験
ＳＣＩＤマウスの皮下に移植されたＥＧＦＲ発現ＫＢ細胞を用いて、確立された腫瘍異種移植片モデルにおいてｃｈＭＬ６６−抗体−マイタンシノイド複合体の活性を試験した。腫瘍が約１１５ｍｍ３の平均腫瘍体積に達したとき、腫瘍体積によって動物が無作為抽出されて処理群に分けられ、そして、２０もしくは１０ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１複合体または５もしくは２．５ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４複合体で１回注射された。図１７において、各処理群の平均腫瘍体積が腫瘍細胞の接種後の時間に対してプロットされている。ｃｈＭＬ６６−ＤＭ複合体を用いる処理が腫瘍の成長を著しく遅らせていることが明らかである。特に、５ｍｇ／ｋｇの用量でのｃｈＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４の処理により６匹のマウスうち３匹で腫瘍が無くなり、そして、６匹のマウス全てが完全奏効を経験した（明確な腫瘍が検出されなかった）。より少ない用量のｃｈＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４でもまた、６匹のマウスのうち４匹での完全奏効という結果になった。ｃｈＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１で処理されたマウスのどれも完全奏効を経験しなかった。しかしながら、複合体処理は腫瘍の成長を著しく抑制した。腫瘍の成長阻害のパーセント（％Ｔ／Ｃ）は、対照群の腫瘍体積が既定のサイズに達したときの対照群の腫瘍体積の中央値で除算した各処理群の腫瘍体積の中央値に対応する。４２％より下の％Ｔ／Ｃ値での処理は活性が有るとみなされるが、一方、１２％より下の％Ｔ／Ｃ値での処理は非常に活性が有るとみなされる。１０ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、２０ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、２．５ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４および５ｍｇ／ｋｇのｃｈＭＬ６６−ＳＰＤＢ−ＤＭ４について、細胞接種後２０日での％Ｔ／Ｃ値は、それぞれ、２３％、６％、０％または０％に対応する。ＫＢ腫瘍異種移植片においてｃｈＭＬ６６マイタンシノイド複合体は高い活性を有することをこの結果は示している。
前述の、具体的な実施形態の説明は本発明の一般的な性質を十分に明らかにしているので、当技術分野の技術内の知識を応用することにより、過度の実験を行うことなく、本発明の全般的な構想から逸脱することなく、容易にそのような具体的な実施形態を改変することができ、および／または、容易にそのような具体的な実施形態を様々な用途に適合させることができる。したがって、そのような適合と改変は、本明細書において提示される教示と指導に基づき、開示された実施形態の等価物の意味と範囲の内にあるものとされる。本明細書の語法または表現法が、本教示と指導を踏まえて当業者によって理解されるように、本明細書における表現法または語法は説明を目的とし、限定を目的とするものではないと理解されるものとする。
本発明の広がりと範囲は、上述の例示的な実施形態のいずれによっても限定されることがなく、以下の請求項とそれらの同等物に従って定義されるのみであるとされる。

Claims (51)

  1. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  2. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  3. （ａ）配列番号１７のＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２１のＶＬ配列を含む、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  4. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号１の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号５の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号３の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域；ならびに
    （ｂ）配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１３の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  5. （ａ）配列番号１８のＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２２のＶＬ配列を含む、請求項１または４に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  6. ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導することがない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  7. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号７の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号８の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  8. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号９の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号８の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  9. （ａ）配列番号１９のＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２３のＶＬ配列を含む、請求項７または８に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  10. ヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、
    （ａ）配列番号６の重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１０の重鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号８の重鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号１４の軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号１５の軽鎖ＣＤＲ２配列、および配列番号１６の軽鎖ＣＤＲ３配列を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域
    を含む、前記抗体またはその抗原結合断片。
  11. （ａ）配列番号２０のＶＨ配列、および（ｂ）配列番号２４のＶＬ配列を含む、請求項７または１０に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  12. ＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株で外来性ＥＧＦが存在しないときにＥＧＦＲのリン酸化を誘導する、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片であって、以下：（ａ）１０μｇ／ｍｌ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株またはヒト初代ケラチノサイトでの上皮成長因子（ＥＧＦ）誘導性ＥＧＦＲリン酸化を阻害しない、（ｂ）１００ｎＭ以下でＭＤＡ−ＭＢ４６８細胞株でのトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）のＥＧＦＲへの結合を阻害しない、（ｃ）１００ｎＭ以下でケラチノサイトまたはＭＣＦ−１０Ａ上皮細胞のリガンド誘導性増殖を２０％より多く抑制することがない、（ｄ）１００ｎＭ以下でＥＧＦＲ発現性ＮＣＩ−Ｈ２９２腫瘍細胞またはＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ腫瘍細胞の基底増殖の２０％より多く増殖を抑制することがない、ならびに（ｅ）１００ｎＭ以下でＡ４３１細胞株におけるセツキシマブおよび５２８抗体の結合を３０％より多く阻害することがない、
    という特徴からなる群より選択される少なくとも１つの特徴を有する、抗体またはその抗原結合断片。
  14. 前記抗体またはその抗原結合断片がネズミ科、非ヒト、ヒト化、キメラ、再現化（ｒｅｓｕｒｆａｃｅｄ）またはヒトのものである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  15. 全長型抗体である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  16. 抗原結合断片である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  17. 前記抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｖ−ＮＡＲドメイン、ＩｇＮａｒ、細胞内抗体、ＩｇＧΔＣＨ２、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、Ｆ（ａｂ’）３、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体、単一ドメイン抗体、ＤＶＤ−Ｉｇ、Ｆｃａｂ、ｍＡｂ２、（ｓｃＦｖ）２またはｓｃＦｖ−Ｆｃを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  18. １．０〜１０ｎＭのＫｄでヒトとマカクのＥＧＦＲに結合する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  19. １．０ｎＭまたはそれより良好なＫｄでヒトとマカクのＥＧＦＲに結合する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
  20. （ａ）配列番号１７のＶＨポリペプチドおよび配列番号２１のＶＬポリペプチド；（ｂ）配列番号１８のＶＨポリペプチドおよび配列番号２２のＶＬポリペプチド；（ｃ）配列番号１９のＶＨポリペプチドおよび配列番号２３のＶＬポリペプチド；または（ｄ）配列番号２０のＶＨポリペプチドおよび配列番号２４のＶＬポリペプチドを含む、ポリペプチド。
  21. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項２０に記載のポリペプチドを産生する、単離された細胞。
  22. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項２０に記載のポリペプチドを作製する方法であって、（ａ）請求項２１に記載の細胞を培養すること；および（ｂ）前記培養細胞から前記抗体、その抗原結合断片、またはポリペプチドを単離することを含む、前記方法。
  23. 前記細胞が真核細胞である、請求項２２に記載の方法。
  24. 式（Ａ）−（Ｌ）−（Ｃ）を有する免疫複合体であって、式中、
    （Ａ）は請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体またはその抗原結合断片、または請求項２０に記載のポリペプチドであり；
    （Ｌ）はリンカーであり；そして
    （Ｃ）は細胞傷害性薬剤であり；そして、
    式中、前記リンカー（Ｌ）が（Ａ）を（Ｃ）に連結する前記免疫複合体。
  25. 前記リンカーが切断可能リンカー、非切断可能リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸ベースのリンカーからなる群より選択される、請求項２４に記載の免疫複合体。
  26. 前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノエート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（スルホＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群より選択される、請求項２５に記載の免疫複合体。
  27. 前記リンカーがＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）である、請求項２６に記載の免疫複合体。
  28. 前記細胞傷害性薬剤がマイタンシノイド、マイタンシノイド類似体、ドキソルビシン、修飾型ドキソルビシン、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、アウリスタチン、トマイマイシン誘導体、およびレプトマイシン誘導体または前記薬剤の前駆薬からなる群より選択される、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の免疫複合体。
  29. 前記細胞傷害性薬剤がマイタンシノイドである、請求項２８に記載の免疫複合体。
  30. 前記細胞傷害性薬剤がＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）またはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、請求項２９に記載の免疫複合体。
  31. （Ａ）は、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片であり：
    （Ｌ）はＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーであり；そして
    （Ｃ）は細胞傷害性薬剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、
    請求項２４に記載の免疫複合体。
  32. （Ａ）は、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２２の軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片であり：
    （Ｌ）はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカーであり；そして
    （Ｃ）は細胞傷害性薬剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、
    請求項２４に記載の免疫複合体。
  33. （Ａ）は、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片であり：
    （Ｌ）はＮ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）リンカーであり；そして
    （Ｃ）は細胞傷害性薬剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）である、
    請求項２４に記載の免疫複合体。
  34. （Ａ）は、配列番号２０の重鎖可変領域および配列番号２４の軽鎖可変領域を含む、抗体またはその抗原結合断片であり：
    （Ｌ）はＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）リンカーであり；そして
    （Ｃ）は細胞傷害性薬剤Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）である、
    請求項２４に記載の免疫複合体。
  35. 前記免疫複合体が（Ａ）当たり２〜８個の（Ｃ）を含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の免疫複合体。
  36. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくは請求項２０に記載のポリペプチド、または請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体、および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
  37. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくは請求項２０に記載のポリペプチド、または請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体を含み、さらに、標識を含む診断用試薬。
  38. 前記標識が、放射性標識、フルオロフォア、クロモフォア、造影剤および金属イオンからなる群より選択される、請求項３７に記載の診断用試薬。
  39. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、もしくは請求項２０に記載のポリペプチド、または請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体を含むキット。
  40. ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を抑制するための、請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む組成物、またはＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を抑制するための、請求項３６に記載の医薬組成物。
  41. 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項４０に記載の組成物または医薬組成物。
  42. 新生物を有する患者を治療するための、治療上有効量の請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む組成物、または新生物を有する患者を治療するための、請求項３６に記載の医薬組成物。
  43. 前記新生物が腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺、眼、頭部および頸部、中枢神経系、末梢神経系、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖器系の新生物からなる群より選択される、請求項４２に記載の組成物または医薬組成物。
  44. 前記新生物が、膀胱癌、脳腫瘍、膵臓癌、肺癌、大腸癌、前立腺癌、および腎臓癌からなる群から選択される癌である、請求項４２に記載の組成物または医薬組成物。
  45. 患者における細胞増殖障害を治療するための、治療上有効量の請求項２４〜３５のいずれか１項に記載の免疫複合体を含む組成物、または患者における細胞増殖障害を治療するための、請求項３６に記載の医薬組成物。
  46. 前記細胞増殖障害が、副腎皮質過形成（クッシング病）、先天性副腎過形成、子宮内膜増殖症、良性前立腺肥大症、乳房過形成、内膜過形成、局所性上皮過形成（ヘック病）、皮脂腺過形成、代償性肝臓過形成、および新生物以外の他の任意の細胞増殖障害からなる群より選択される、請求項４５に記載の組成物または医薬組成物。
  47. 配列番号２９〜４０からなる群より選択される核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
  48. 請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  49. 請求項４８に記載のベクターを含む宿主細胞。
  50. ２０１０年１０月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４２４を有するプラスミドＤＮＡによりコードされる抗体またはその抗原結合断片。
  51. ２０１０年１０月２１日にＡＴＣＣに寄託され、そして、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４２３を有するハイブリドーマにより産生される抗体またはその抗原結合断片。
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