CN104151430A - 重组抗表皮生长因子受体抗体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于适用于人类癌症治疗的重组抗体领域。更特定言的，本发明提供能够结合人类EGFR的抗体的组合物或混合物。具有3种或3种以上抗体的抗体组合物展示使代表性癌细胞系增殖减少的协同作用。使用包含两种不同嵌合抗hEGFR抗体的组合物亦获得有利结果，其在动物模型中展示基于迅速及有效受体内化、诱导终末分化及后续肿瘤根除的新的作用机制。本发明的抗体可在一生物反应器中以多克隆抗体形式制备。

Description

重组抗表皮生长因子受体抗体组合物
本申请是中国申请号为200880006835.0、发明名称为“重组抗表皮生长因子受体抗体组合物”且申请日为2008年2月27日的专利申请(PCT申请号为PCT/DK2008/050047)的分案申请。
【发明所属的技术领域】
本发明是关于适用于人类癌症治疗的重组抗体领域。
发明背景
表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)在细胞增殖以及细胞凋亡、血管生成及转移性扩散(对肿瘤发展至关重要的过程)中发挥重要作用(Salomon等人，Crit.Rev.Oncology/Haematology,19:183-232(1995)；Wu等人，J.Clin.Invest.,95:1897-1905(1995)；Karnes等人，Gastroenterology,114:930-939(1998)；Woodburn等人，Pharmacol.Therap.82:241-250(1999)；Price等人，Eur.J.Cancer,32A:1977-1982(1996))。实际上，研究已证明在包括非小细胞肺癌、前列腺癌、乳癌、胃癌及头部及颈部肿瘤的多种实体瘤中，EGFR介导细胞生长增加(SalomonDS等人，Critical Reviews in Oncology/Haematology,19:183-232(1995))。此外，现已知癌细胞表面上EGFR的过度活化与晚期疾病、转移性表型的发展及癌症患者的不良预后相关(Salomon DS等人，Critical Reviews inOncology/Haematology19:183-232(1995))。
此外，EGFR表达时常伴随EGFR表达肿瘤细胞中EGFR配体，尤其TGF-α及EGF的产生，此表明自分泌环参与该等细胞的发展(Baselga等人(1994)Pharmac.Therapeut.64:127-154；Modjtahedi等人(1994)Int.J.Oncology.4:277-296)。因此阻断该等EGFR配体与EGFR之间的相互作用可抑制肿瘤生长及存活(Baselga等人，(1994)Pharmac.Therapeut.64:127-154)。
EGFR为分子量为约170kDa的膜结合醣蛋白。EGFR由以短的23个氨基酸跨膜接头连接的糖基化外部配体结合域(621个残基)及细胞质域(542个残基)组成。EGFR的细胞外部分含有25个双硫键及12个N连接糖基化位点，且通常认为由四个子域组成。EGFR的X射线晶体结构表明该受体采用不能结合EGF的自抑制约束构形(tethered-conformation)(Ferguson等人，Mol Cell,2003，第11卷：507-517)与可介导EGF配体结合及受体二聚的活性构形(Garret等人，Cell2002，第110卷：763-773；Ogiso等人，Cell,2002，第110卷：775-787)。具体的，已暗示域I及域III为高亲和力配体结合位点的形成提供附加贡献。域II及域IV为富含半胱氨酸的层粘连蛋白样区域，其使蛋白质折叠稳定且含有可能的EGFR二聚界面。
已知EGFR以多种不同构形在细胞表面上存在，其中约束(tethered)构形或锁定构形最常见。约束构形不能二聚且因此无活性。已知治疗抗体艾比特思(Erbitux)通过与域III结合且在空间上妨碍受体达成非约束状态来使约束构形稳定。然而，一些受体可能仍能够接受非约束构形、结合配体且二聚。单克隆抗体(mAb)通常仅有效结合该等构形中的一者，且因此不能有效靶向展现其它构形的癌细胞或展现多种构形的癌细胞。
针对EGFR配体结合域的单克隆抗体(mAb)可阻断与EGFR配体的相互作用且随之阻断所得细胞内信号转导路径。
艾比特思TM(ErbituxTM)(西妥昔单抗(Cetuximab))为与人类(EGFR)胞外域特异性结合的重组、人类/小鼠嵌合单克隆抗体。艾比特思包含鼠类抗EGFR抗体的Fv区域与人类IgG1重链及κ轻链恒定区且分子量约为152kDa。艾比特思是在哺乳动物细胞培养物(鼠类骨髓瘤)中产生。艾比特思经批准用于治疗患有转移性结肠直肠癌且其肿瘤表达EGFR的患者。此外，艾比特思与放射性疗法组合用于治疗患有不能通过手术移除的头颈鳞状细胞癌的患者，或用作标准铂基疗法已失败的头颈鳞状细胞癌的第二线治疗。
维克替比TM(VectibixTM)(盘尼图单抗(panitumumab))为与人类EGFR特异性结合的人类IgG2κ单克隆抗体的重组。维克替比的分子量约为147kDa。盘尼图单抗是在遗传工程化的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary))中产生。维克替比经批准用于治疗患有转移性结肠直肠癌且其肿瘤表达EGFR，且疾病在含氟嘧啶、奥赛力铂(oxaliplatin)及伊立替康(irinotecan)的化学疗法方案治疗中或治疗之后仍发展的患者。
已在人类肿瘤细胞上鉴别出多种突变型EGF受体。此等突变型受体可使受体活性独立于配体结合(EGFRvIII)，从而导致致瘤性增强。可产生针对突变型EGFR的单克隆抗体，但该单克隆抗体将不必有效针对非突变型EGFR。
已在人类癌症患者中鉴别出EGFR的突变，其影响该等患者对针对EGFR的化学疗法的反应。WO2006/110478(Novartis)揭示EGFR开放阅读框架中的43个突变以及18个SNP。在两种或两种以上类型的肿瘤类型中鉴别到一些错义突变。WO2006/091899(Amgen)揭示在各种癌细胞中鉴别出的八个其它突变。该等突变中的一或多者可位于由目前批准的单克隆抗体中的之一结合的表位中或影响该表位的结构。携带该等突变的患者将不能由单克隆抗体治疗。
此外，文献中有报道展示糖基化位点中的至少一者的糖基化的异质性(Whitson等人，2005Biochemistry44:14920-31；Zhen等人，2003Biochemistry42；5478-92)。该异质性可直接或间接引起在肿瘤细胞之间不同的表位的差异暴露。
抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)为抗体介导杀死肿瘤细胞的替代性机制。ADCC的程度视若干因素而定，该等因素包括IgG亚型(IgM>IgG1>IgG2)、目标细胞上的抗体密度、抗体糖基化模式以及目标本身的特性。
Friedmann等人(PNAS2005,102:1915-20)已证明就通过结合有区别的EGFR表位来抑制EGF与EGFR结合的能力而选择的两种鼠类单克隆抗体，其能够协同地调降瞬时表达EGFR的KB细胞及CHO细胞中的受体表达。交叉竞争性EGF抑制抗体并不展现任何协同作用。
Modjtahedi等人(Cell Biophysics第22卷，1993,129-146)已测试若干大鼠抗EGFR抗体与不重叠的表位的组合。该等抗体具有不同同种型。在任何情况下，使用两种抗体的效果介于单独使用类似量的两种单克隆抗体的效果的中间。在体内与体外均证实该结果。
WO2004/032960(Merck Patent)揭示组合使用两种单克隆抗体Mab425与Mab225(西妥昔单抗)，与单独使用类似量的该等单克隆抗体中的每一者相比，产生增加量的与EGFR表达癌细胞表面结合的抗体。该公开案亦揭示当使用抗体组合时，与使用两种单克隆抗体相比，EGFR的下调会增加。
Perera等人(Clin Cancer Res2005:11(17):6390-99)揭示以两种鼠类单克隆抗体的组合治疗带有U87MG.de2-7异种移植物的小鼠的协同效果。该等抗体中的一者(mAb528)结合所有对西妥昔单抗具有类似特异性的EGFR亚型。另一者(mAB806)仅结合de2-7EGFR。U87MG.de2-7细胞系为经de2-7EGFR转染的细胞系。U87MG.DK细胞系表达de2-7EGFR的激酶失活变异体。当对带有U87MG.DK异种移植物的小鼠使用该等两种抗体时未观察到协同作用。在具有表达野生型EGFR的A431细胞系的异种移植模型中，作者未提供协同作用的证据。de2-7EGFR仅存在于有限量的癌症类型中，该等癌症类型诸如神经胶质瘤，(在某种程度上)乳癌及肺癌。
虽然该等研究已表明在某些情况下协同作用可存在于两种鼠类单克隆抗体之间，但其亦展示在许多情况下未发现协同作用。该等研究亦未提供有效针对多种临床相关癌细胞系的抗EGFR抗体组合物。
因此，对在以低剂量给与时能有效治疗和/或预防与EGFR过度表达相关的疾病的改良的针对EGFR的治疗抗体存在需要。亦对广泛适用的治疗性癌症抗体存在需要，其可在对由所述癌细胞表达的EGFR结构不具有详细认识的情况下使用。
发明内容
在一个方面，本发明涉及重组抗体组合物，其包含至少3种有区别的抗EGFR抗体分子，其中所述抗体结合EGFR的有区别的第一、第二和第三表位。
在进一步的方面，本发明涉及重组抗体组合物，其包含至少两种有区别的EGFR抗体分子，其中一种有区别的抗EGFR抗体分子选自以下抗体组成的组：992、1024、1030、1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344和1347，或具有这些抗体的CDR的抗体。
优选至少一个有区别的抗EGFR抗体分子选自下组：抗体992、1030、1024、1347、1277、1254、1320、1260、1261和1284或具有这些抗体的CDR的抗体。在本发明的特别优选的实施方案中，抗体组合物包含抗体992和1024或基于它们的CDR3序列的两抗体、或基于它们的VL和VH序列的抗体，或包含两种具有基本上相同的结合特异性的抗体。
已经证实本发明的代表性抗体组合物在抑制代表性癌细胞系增殖中有效，这指出了一种在癌症治疗中的体内用途。这些结果已经在用癌细胞球形体(cancer cell spheroid)进行的测定中得到了确认，癌细胞球形体可以更好地代表体内情况，其中癌细胞形成肿瘤。另外，本发明的抗体组合物表现出使来自癌球形体的细胞运动性降低，并由此降低形成转移的倾向。也已经证明了代表性抗体组合物在异种移植模型中的体内效力。这些结果已经确认了由抗体992和1024组成的特别优选的抗体组合物。
在小鼠中的人癌症异种移植模型中，本发明的代表性抗体组合物与可以通过商业方法获得的单克隆抗体Vectibix和Erbitux相比产生了显著更高的肿瘤细胞终末分化程度。看起来本发明的优选抗体组合物通过一种不同于单克隆抗体的作用机制工作，因为在用本发明的抗体组合物进行的处理终止后没有观察到肿瘤的再生。在用单克隆抗体进行的处理终止后观察到肿瘤再生。
在结合研究中，发明人证明了一些本发明提供的抗体表现出促进另外的抗体的结合，由此增加结合至受体的抗体总量。也已经证明结合三种结构域III抗体可促进后续的另外抗体的结合。这些观察结果明显支持了使用具有至少3种有区别的抗EGFR抗体分子的组合物的概念，其中抗体结合EGFR的有区别的第一、第二和第三表位。该效果也可以藉由选择提供这种特定效果的多个抗体，通过使用本发明的两种抗体的特定组合来获得。这些抗体是用于与其它抗体混合的优选候选。
本发明的组合物可以提供数种其它优势。癌细胞表达多种的EGFR。变异出现在构象中、糖基化中和一级结构(突变和SNP)中。单一的单克隆抗体可以靶向这些EGFR变异中的一些但不是全部。EGFR突变体可能是单克隆抗体的逃逸突变体。包含本发明的两种抗体的抗体或包含三种或更多种结合不同EGFR表位的不同抗体的抗体对突变体、SNP、缺失突变体和糖基化中的变异较不敏感。其证据为本发明的抗体混合针对一组代表多种多样EGFR构象和变异的人癌细胞系的广泛效力。
施用一种单克隆抗体还可能不完全关闭EGFR的激酶活性。对信号传导更有效的抑制可以通过抗体的组合来实现。
因此可能有益的是，在抗体混合物中包括与不同EGFR构象(例如，无束缚构象(untethered conformation)和受体二聚体)结合的抗体。这样的抗体混合物可能在抑制EGFR活性方面比仅结合多种构象之一的单克隆抗体更有力。
另外，通过使用在组合物中含有三种或更多种抗EGFR抗体的方法，可能可以提高抗体在肿瘤细胞表面的密度，从而与单克隆抗体相比增加经由ADCC的杀伤。
在进一步的方面中，本发明涉及用于制备抗体组合物的方法，包括：
a)用第一表达构建体转染第一真核细胞群体，所述第一表达构建体编码包含能够结合第一有区别的EGFR表位的第一VH和VL链关联对(cognatepair)的第一抗体；
b)用第二表达构建体转染第二真核细胞群体，所述第二表达构建体编码包含能够结合第二有区别的EGFR表位的第二VH和VL链关联对的第二抗体；
c)任选地对第三或其他的群体、表达构建体、关联对和EGFR表位重复步骤b)；
d)选择经转染的第一、第二和任选地其他的细胞群体；
e)将经转染的群体在一个器皿(pot)中组合以获得细胞库(cell bank)；
f)在允许抗体表达的条件下培养来自所述细胞库的细胞；和
g)从上清液回收并纯化抗体组合物。
为了便于制备、下游加工和表征，所有抗体包含相同的重链恒定区。
在进一步的方面中，本发明涉及包含至少两种真核细胞亚群的细胞库；每种亚群用一种编码抗体的表达构建体转染或转导，所述抗体包含能够结合有区别的EGFR表位的VH和VL链关联对。优选地，使用位点特异性整合来转染细胞。
另外，本发明涉及降低EGFR信号传导的方法，包括向表达EGFR的细胞的组合物施用本发明的抗体组合物并降低EGFR信号传导。
本发明还涉及杀死表达EGFR的细胞的方法，包括向表达EGFR的细胞的组合物施用任何本发明的抗体组合物并杀死表达EGFR的细胞。
还提供在表达EGFR的细胞中诱导凋亡的方法，包括向表达EGFR的细胞的组合物施用本发明的抗体组合物，从而诱导凋亡。
进一步的方面涉及抑制表达EGFR的细胞增殖的方法，包括向表达EGFR的细胞的组合物施用本发明的抗体组合物，从而抑制增殖。
本发明涉及在体内诱导肿瘤细胞分化的方法，包括向患有癌症的个体施用本发明的抗体组合物，从而诱导肿瘤细胞的分化。这个方面是基于在曝露于本发明的抗体组合物时观察到的对癌细胞体内终末分化的影响。
在进一步的方面中，本发明涉及药物用品，其包含本发明的抗体组合物和至少一种能够诱导癌细胞分化的化合物作为一个组合用于在癌症治疗中同时、分开或相继施用。通过将本发明的抗体组合物与已知诱导癌细胞终末分化的作用剂(agent)结合，能够进一步改进效果。
在更进一步的方面中，本发明涉及药物用品，其包含本发明的抗体组合物和至少一种化疗或抗肿瘤化合物作为组合用于在癌症治疗中同时、分开或相继施用。本发明的抗体组合物很有可能能够用于二线治疗，即在使用常规化疗或抗肿瘤剂治疗之后或与之同时进行，或在放射疗法和/或外科手术之后或与之同时进行。
在另一方面，提供选自下组的多核苷酸：具有图23(SEQ ID NO100)中所示核酸序列的核酸；编码具有图23(SEQ ID NO100)中所示氨基酸序列的多肽的核酸；具有图34A(SEQ ID NO102)中所示核酸序列的核酸；和编码具有图34A(SEQ ID NO102)中所示氨基酸序列的多肽的核酸。另外还提供包含图23(SEQ ID NO101)中所示氨基酸序列的多肽和包含图34B(SEQID NO103)中所示氨基酸序列的多肽；包含如上定义的所述核酸可操作地连接于能够指导所述核酸表达的启动子序列的表达载体；和用所述表达载体转染或转导的细胞。
这些序列构成猕猴(Cynomolgous)(即来自食蟹猴(Macaca fascicularis)的)EGFR多核苷酸和多肽序列。这个种的猴是广泛用于毒理学研究的动物。对于在包括针对人自身抗原的抗体的毒理学研究中具有任何价值的动物物种，关键是所述抗体也结合该毒理动物(tox-animal)中的靶蛋白，优选以大约相同的亲和力结合。借助本发明人的贡献，现在已使测试抗体与猕猴EGFR的结合成为可能。猕猴和人EGFR是高度同源的蛋白质，但令人惊奇的是发现了大量对人和猕猴EGFR的亲和力差异很大的抗体。这强调了使用准确的猕猴EGFR蛋白进行筛选的重要性，这种蛋白已由本发明人提供。
另外还提供用于筛选抗体对猕猴EGFR的结合的方法，包括步骤
-提供至少一种测试抗体；
-实施测定法以测定抗体与猕猴EGFR胞外结构域(图23，SEQ ID NO101)或全长猕猴EGFR(图34B，SEQ ID NO103)的结合；或抗体与表达猕猴EGFR胞外结构域或表达全长猕猴EGFR的细胞表面的结合；
-和选择至少一种结合猕猴EGFR胞外结构域的抗体。
所述方法可以进一步包括筛选与人EGFR胞外结构域的结合或与表达人EGFR的细胞的结合。
在进一步的方面中，本发明涉及用于鉴定抗EGFR抗体的方法，该抗体能够增强另一抗EGFR抗体对EGFR的同时结合，所述方法包括
a.在第一测定中，测定第一抗体对于固定量EGFR抗原的最大结合能力，
b.在第二测定中，用第二抗EGFR抗体使固定量EGFR抗原饱和，
c.将EGFR-抗体复合物与所述第一抗体接触，并测定最大结合能力，和
d.比较结合能力以测定步骤c的最大结合能力是否超过步骤a的最大结合能力。
本申请还涉及以下方面：
项1.一种重组抗体组合物，其包含至少3种有区别的抗EGFR抗体分子，其中所述抗体结合EGFR的有区别的第一、第二和第三表位。
项2.项1的抗体，其中所述表位不重叠。
项3.项1的抗体，其中至少一种有区别的抗体分子能够抑制EGF结合。
项4.项1的抗体，其中至少一种有区别的抗体分子能够防止EGFR磷酸化。
项5.项1的抗体，其中至少一种有区别的抗体分子能够增强EGFR的内化/降解。
项6.项1的抗体，其包含至少一种其它有区别的抗EGFR抗体分子，其中该其它抗体结合第四有区别的表位。
项7.项6的抗体，其包含至少一种其它有区别的抗EGFR抗体分子，其中该其它抗体结合第五有区别的表位。
项8.项7的抗体，其包含至少一种其它有区别的抗EGFR抗体分子，其中该其它抗体结合第六有区别的表位。
项9.项1的抗体，其包含至少一种域III抗体和至少一种域I/II抗体。
项10.项1的抗体，其包含至少两种域III抗体和一种域I抗体。
项11.项1的抗体，其包含至少两种域III抗体，诸如至少三种域III抗体。
项12.项1的抗体，其包含至少一种能够增强至少一种其它抗体与不同有区别的表位结合的抗体。
项13.项1的抗体，其中所述抗体为具有鼠类可变链与人类恒定链的嵌合抗体。
项14.项13的抗体，其中该人类恒定链为IgG1或IgG2。
项15.项1的抗体，其中至少一种抗体为人源化抗体。
项16.项1的抗体，其中至少一种抗体为人类抗体。
项17.项1的抗体，其中EGFR选自由人类EGFR、突变人类EGFR和人类EGFR的缺失变异体组成的组。
项18.项17的抗体，其中EGFR为人类EGFR与非人类灵长类EGFR两者。
项19.一种重组抗体组合物，其包含至少2种有区别的EGFR抗体分子，其中一种有区别的抗EGFR抗体分子是选自由具有以下抗体的CDR的抗体组成的组：992、1024、1030、1042、1208、1229、1254、1257、1260、1261、1277、1284、1308、1320、1344和1347。
项20.项19的重组抗体组合物，其中至少一种有区别的抗EGFR抗体分子是选自由具有以下抗体的CDR的抗体组成的组：992、1030、1024、1347、1277、1254、1320、1260、1261和1284。
项21.项19的重组抗体组合物，其中两种有区别的EGFR抗体分子是选自由具有以下抗体的CDR的抗体组成的组合的组：992+1030、992+1024、992+1042、992+1320、1277+1024。
项22.一种抗体组合物，其包含至少2种有区别的抗人类EGFR抗体分子，
a.其中第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL序列(SEQ ID NO72的氨基酸3-109)和VH序列(SEQ ID NO40的氨基酸3-124)的抗体、具有抗体992的CDR3s(SEQID NO116和111)的抗体、与抗体992结合相同表位的抗体、和能够抑制抗体992与人类EGFR结合的抗体；且
b.其中第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL序列(SEQ ID NO73的氨基酸3-114)和VH序列(SEQ ID NO41的氨基酸3-120)的抗体、具有抗体1024的CDR3s(SEQ ID NO120和114)的抗体、与抗体1024结合相同表位的抗体和能够抑制抗体1024与人类EGFR结合的抗体。
项23.项22的组合物，其中
a.该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL和VH序列的抗体、具有抗体992的CDR3的抗体、和与抗体992结合相同表位的抗体；且
b.该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL和VH序列的抗体、具有抗体1024的CDR3的抗体、和与抗体1024结合相同表位的抗体。
项24.项22的组合物，其中
a.该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL和VH序列的抗体、和具有抗体992的CDR3的抗体；且
b.该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL和VH序列的抗体、和具有抗体1024的CDR3的抗体。
项25.项22的组合物，其中
a.该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、和包含抗体992的VL和VH序列的抗体；且
b.该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、和包含抗体1024的VL和VH序列的抗体。
项26.项22的组合物，其包含抗体992和1024。
项27.项22的组合物，其中该第一和该第二抗EGFR抗体不抑制彼此与人类EGFR的结合。
项28.项22的组合物，其中所述抗体中的至少一者能够增加其它抗体对人类EGFR的最大结合能力。
项29.项22的组合物，其中该组合物中的该第一抗体相对于该第二抗体的比例是介于5％与95％之间，诸如介于10％与90％之间，较优选介于20％与80％之间，更优选介于30％与70％之间，更优选介于40％与60％之间，诸如介于45％与55％之间，诸如为约50％。
项30.项22的组合物，其中该第一和该第二抗体是同种型的IgG1或IgG2。
项31.项22的组合物，其中与抗体992结合相同表位的该抗体是选自包含以下克隆的抗体群：克隆1209、1204、992、996、1033和1220。
项32.项22的组合物，其中与抗体1024结合相同表位的该抗体是选自包含以下克隆的抗体群：克隆1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221和1218。
项33.项22的组合物，其中包含抗体992的CDR3的该抗体另外包含抗体992的VH和VL的CDR1与CDR2。
项34.项22的组合物，其中包含抗体1024的CDR3的该抗体另外包含抗体1024的VH和VL的CDR1与CDR2。
项35.项22的组合物，其中与抗体992竞争的该抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1208、1254和1277。
项36.项22的组合物，其中与抗体1024竞争的该抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1042和1320。
项37.项22的组合物，其中该组合物除该第一和该第二抗体之外不含有其它抗EGFR抗体。
项38.项22的组合物，其进一步包含第三有区别的抗EGFR抗体，其中该第三有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1030、包含抗体1030的VL序列(SEQ ID NO74的氨基酸3-114(113))和VH序列(SEQ ID NO42的氨基酸3-120)的抗体、具有抗体1030的CDR3s(SEQ ID NO112和119)的抗体、与抗体1030结合相同表位的抗体、和能够抑制抗体1030与人类EGFR结合的抗体。
项39.项37的组合物，其中该第三抗体使得该第一和/或第二抗体与人类EGFR的结合增强。
项40.项37的组合物，其中与抗体1030结合相同表位的该抗体是选自由以下克隆组成的抗体群：克隆1195、1030、1034、1194、980、981、1246和1223。
项41.项37的组合物，其中包含抗体1030的CDR3的该抗体另外包含抗体1030的VH和VL的CDR1和CDR2。
项42.项38的组合物，其中该组合物除该第一、该第二、和该第三抗体之外不含有其它抗EGFR抗体。
项43.项22的组合物，其中所述有区别的抗体经制备用于同时、依次或单独给药。
项44.项22的组合物，其中该组合物使得受体内化。
项45.项22的组合物，其中该组合物使得体内A431NS肿瘤退化。
项46.项22的组合物，其中该组合物能够诱导体内A431NS细胞的终末分化。
项47.项22的组合物，其中该组合物能够上调体内肿瘤内披蛋白(involucrin)表达。
项48.一种双特异性结合分子，其具有项22的抗体组合物的结合特异性。
项49.项48的双特异性结合分子，其包含抗体992和1024的CDR。
项50.项48的双特异性结合分子，其为双重可变域抗体。
项51.项48的双特异性结合分子，其为双特异性Fab片段或双特异性scFV。
项52.一种制造抗体组合物的方法，其包含：
a)以编码第一抗体的第一表达构建体转染第一真核细胞群体，所述第一抗体包含能够结合第一有区别的EGFR表位的VH和VL链的第一关联对；
b)以编码第二抗体的第二表达构建体转染第二真核细胞群体，所述第二抗体包含能够结合第二有区别的EGFR表位的VH和VL链的第二关联对；
c)对于第三或其它群体、表达构建体、关联对、和EGFR表位任选地重复步骤b)；
d)选择经转染的第一、第二和任选地其它细胞群体；
e)将所述经转染的群体在一器皿中组合以获得细胞库(cell bank)；
f)在允许所述抗体表达的条件下培养来自该细胞库中的细胞；和
g)自上清液中回收且纯化该抗体组合物。
项53.项52的方法，其中该抗体组合物为项1至18中任一的抗体组合物。
项54.项52的方法，其中所述细胞是以位点特异性整合方式转染。
项55.项52的方法，其中所述VH和VL链是来源于鼠类且所述抗体的恒定区是来源于人类。
项56.项55的方法，其中所有抗体均包含相同重链恒定区。
项57.一种细胞库，其包含真核细胞的至少两种子群体；各子群体是以一编码包含能够结合有区别的EGFR表位的VH和VL链的关联对之抗体的表达构建体转染或转导。
项58.项57的细胞库，其中该细胞库编码项1至18中任一的抗体组合物。
项59.项57的细胞库，其中所述细胞是使用位点特异性整合方式转染。
项60.一种降低EGFR信号转导的方法，其包含向表达EGFR的细胞组合物施用项1至47中任一的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，和降低该EGFR信号转导。
项61.一种杀死表达EGFR的细胞的方法，其包含向表达EGFR的细胞组合物施用项1至47中任一的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，和杀死所述EGFR表达细胞。
项62.一种在表达EGFR的细胞中诱导细胞凋亡的方法，其包含向表达EGFR的细胞组合物施用项1至47中任一的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，由此诱导细胞凋亡。
项63.一种抑制表达EGFR的细胞增殖的方法，其包含向表达EGFR的细胞组合物施用项1至47中任一项的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，由此抑制增殖。
项64.一种诱导体内肿瘤细胞分化的方法，其包含向患有癌症的个体施用项1至47中任一的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，由此诱导所述肿瘤细胞分化。
项65.项64的方法，其中该分化为终末分化。
项66.项64的方法，其中该分化伴随有内披蛋白表达增加。
项67.一种诱导EGFR内化的方法，其包含向表达EGFR的细胞给药有效量的项1至47中任一的抗体组合物、或项48至51中任一项的双特异性结合分子，由此诱导EGFR内化。
项68.一种药物组合物，其包含呈组合形式用于在癌症治疗中同时、单独或依次施用的两种或两种以上项1至47项中任一的抗体、或项48至51中任一项的双特异性结合分子。
项69.项68的制品，其进一步包含呈组合形式用于在癌症治疗中同时、单独或依次施用的至少一种能够诱导癌细胞分化的化合物。
项70.项69的制品，其中该化合物是选自由以下各物组成的组：视黄酸、苯基丁酸盐/酯、全反式视黄酸、活性形式维生素D。
项71.项68的制品，其进一步包含呈组合形式用于在癌症治疗中同时、单独或依次施用的至少一种化疗或抗肿瘤化合物。
项72.项71的制品，其中该化疗化合物是选自由以下各物组成的组：阿德力霉素(adriamycin)、顺铂(cisplatin)、紫杉醇(taxol)、阿霉素(doxorubicin)、拓朴替康(topotecan)、氟嘧啶、奥赛力铂(oxaliplatin)和伊立替康(irinotecan)。
项73.一种多核苷酸，其是选自由以下各物组成的组：
a.具有显示于SEQ ID NO100中的核酸序列的核酸；
b.编码具有显示于SEQ ID No101中的氨基酸序列的多肽的核酸；
c.具有显示于SEQ ID NO102中的核酸序列的核酸；
d.编码具有显示于SEQ ID NO103中的氨基酸序列的多肽的核酸；和
e.具有a至d中任一者的互补序列的核酸。
项74.一种表达载体，其包含项73的核酸，该核酸与能够指导该核酸表达的启动子序列操作性连接。
项75.一种细胞，其是以项74的表达载体转染或转导。
项76.一种多肽，其包含显示于SEQ ID NO101中的氨基酸序列。
项77.一种多肽，其包含显示于SEQ ID NO103中的氨基酸序列。
项78.一种用于筛选与猕猴(cynomolgous)EGFR结合的抗体的方法，其包含以下步骤：
a.提供至少一种测试抗体；
b.实施测定以确定与以下部分结合的抗体：
i)猕猴EGFR的胞外域(SEQ ID NO101)或全长猕猴EGFR(SEQ IDNO103)；或
ii)表达该猕猴EGFR胞外域(SEQ ID NO101)或表达全长猕猴EGFR(SEQ ID NO103)的细胞的表面；
c.和选择至少一种结合猕猴EGFR胞外域的抗体。
项79.项78的方法，其进一步包含就与人类EGFR胞外域的结合或与表达人类EGFR的细胞的结合进行筛选。
项80.一种鉴别能够增强另一抗EGFR抗体与EGFR的同时结合的抗EGFR抗体的方法，该方法包含
a.在第一鉴定中，测定第一抗体对于固定量的EGFR抗原的最大结合能力，
b.在第二鉴定中，以第二抗EGFR抗体饱和固定量的EGFR抗原，
c.使该EGFR抗体复合物与该第一抗体接触且测定最大结合能力，和
d.对比该结合能力以确定步骤c的该最大结合能力是否超过步骤a的最大结合能力。
项81.项80的方法，其中该EGFR抗原为固定在固体表面上的重组蛋白质。
项82.项80的方法，其中该EGFR抗原是存在于表达EGFR的细胞的表面上。
项83.项82的方法，其中该细胞包含编码EGFR的表达构建体。
项84.项80的方法，其中该第一抗体为免疫球蛋白且该第二抗体为Fab片段。
项85.项80的方法，其中所述鉴定为ELISA。
项86.项80的方法，其中EGFR抗原包含人类EGFR胞外域(SEQ IDNO108)或猕猴EGFR胞外域(SEQ ID NO101)。
【发明内容】
发明概述
该鉴定可用于鉴别具有类似于抗体992与1024的特性的其它抗体组合。
定义
术语「抗体」描述血清的功能性组份且通常指分子集合(抗体或免疫球蛋白)或一个分子(抗体分子或免疫球蛋白分子)。抗体分子能够与特定抗原决定簇(抗原或抗原性表位)结合或反应，此又可引起免疫效果机制的诱导。个别抗体分子通常认为具有单特异性，且抗体分子组合物可为单克隆(亦即由相同抗体分子组成)或多克隆(亦即由两种或两种以上与相同抗原或甚至有区别的不同抗原上的相同或不同表位反应的不同抗体分子组成)。各抗体分子均具有使其能够特异性地与其相应抗原结合的有区别的结构，且所有天然抗体分子均具有相同总的基本结构：两条相同轻链及两条相同重链。抗体亦共同称为免疫球蛋白。如本文中所使用的术语抗体亦意欲包括嵌合及单链抗体以及抗体的结合片段，诸如Fab、Fv片段或scFv片段，以及多聚形式，诸如二聚IgA分子或五价IgM。抗体可为人类、鼠类、嵌合、人源化或再成型抗体。
术语「关联VH和VL编码对」描述来源于(或包含于)相同抗体产生细胞内的VH和VL编码序列的初始对。因此，关联VH和VL对代表最初存在于该细胞所来源的供体中的VH和VL配对。术语「由VH和VL编码对表达的抗体」表明抗体或抗体片段是由含有VH和VL编码序列的载体、质粒或类似物产生。当关联VH和VL编码对表达为完全抗体或其稳定片段时，其保持最初由其所来源的细胞表达的抗体的结合亲和力及特异性。关联对文库亦称为关联对的全套(repertoire)或集合，且可个别地保存或汇集。
术语「CDR(complementarity determining region)」-互补决定区是如Lefranc等人(2003)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cellreceptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.Dev.CompImmunol27,55-77中所定义。
术语「重组多克隆蛋白质的有区别的成员」表示包含不同但同源蛋白质分子的蛋白质组合物中的一种蛋白质分子，其中各蛋白质分子与该组合物中的其它分子同源，且亦含有一或多段可变多肽序列，其特征在于多克隆蛋白质中的个别成员之间的氨基酸序列的差异。
术语「头接头启动子(head-to-head promoter)」是指将启动子对以密切接近方式安置以使由该等启动子驱动的两个基因片段的转录以相反的方向进行。头接头启动子亦可以两个启动子之间由不相关核酸组成的填充片段构建。该填充片段可容易地含有多于500个核苷酸。头接头启动子亦可称为双向启动子。
术语「免疫球蛋白」通常用作存在于血液或血清中的抗体的混合物的通用名称，但亦可用于表示来源于其它来源的抗体的混合物。
术语「免疫球蛋白分子」表示个别抗体分子，例如作为免疫球蛋白的一部分，或任何多克隆或单克隆抗体组合物的一部分。
术语「所关注的变异核酸分子文库」是用于描述共同编码「所关注的重组多克隆蛋白质」的核酸分子的集合。当用于转染时，所关注的变异核酸分子文库是含于表达载体文库中。该文库通常具有至少2、3、5、10、20、50、1000、104、105或106个不同成员。
术语「质量传递(mass transfer)」是用于描述所关注的核酸序列自一载体群体传递至另一载体群体，且对各DNA同时如此进行而不借助于所关注的个别DNA的分离。该等载体群体可为含有(例如)所关注的可变区、启动子、前导区或增强组件的文库。该等序列可随后在不预先自(例如)噬菌体载体分离的情况下移至哺乳动物表达载体中。尤其对于抗体序列而言，该技术确保在将文库自(例如)选择载体(例如噬菌体呈现载体)移至哺乳动物表达载体时不丧失VH与VL之间的连接的多样性。据此保留VH和VL的初始配对。
如本文中所使用的术语「操作性连接(operably linked)」是指一片段当置于与另一片段的功能关系中时与该另一片段连接。举例而言，编码信号序列的DNA若表达为参与多肽转移至内质网之前导序列则与编码该多肽的DNA操作性连接。再者，启动子或增强子若刺激编码序列的转录则与该序列操作性连接。
术语「多克隆抗体」描述能够与相同或不同抗原上的若干不同特定抗原决定簇结合或反应的不同抗体分子的组合物。通常认为多克隆抗体的可变性是位于所谓的多克隆抗体的可变区中。然而，在本发明的上下文中，多克隆性亦可理解为描述个别抗体分子之间的存在于所谓恒定区中的差异，例如在含有两种或两种以上抗体同种型的抗体混合物的情况下，该等抗体同种型诸如人类同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2，或鼠类同种型IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及IgA。出于本发明的目的，该多克隆抗体亦可称为「抗体组合物」。
术语「表位」通常用于描述动物中，较优选哺乳动物中且最优选人类中具有抗原或免疫原活性的较大分子的片段(proportion)或较大分子的部分(例如抗原或抗原性位点)。具有免疫原活性的表位为引发动物中抗体反应的较大分子的一部分。具有抗原活性的表位为较大分子的由此项技术中熟知的任何方法(例如由本文所述的免疫鉴定)所确定的抗体免疫特异性结合的部分。抗原性表位不必具有免疫原性。抗原为抗体或抗体片段免疫特异性结合的物质，例如毒素、病毒、细菌、蛋白质或DNA。抗原或抗原位点通常具有一个以上表位，除非其极小，且通常能够刺激免疫反应。表位可为线性的或构形的。线性表位由蛋白质分子上的由抗体识别的约6至10个邻接氨基酸组成。相反，构形(conformational)表位由不依次排列的氨基酸组成。此处抗体仅识别3维结构。当蛋白质分子折叠成三维结构时，形成表位的氨基酸并置以使抗体能够识别该序列。在变性蛋白质中仅线性表位可被识别。根据定义，构形表位须处于折叠蛋白质的外部。识别构形表位的抗体可能仅在轻微、未变性程序下结合。与相同抗原上的不同表位结合的抗体视表位的位置而定可对其所结合的抗原的活性具有不同的效果。与抗原的活性位点中的表位结合的抗体可完全阻断该抗原的功能，而在不同表位处结合的另一抗体可能单独对抗原活性无效果或具有极小效果。然而该等抗体仍可活化互补序列且因此使抗原消除，且当与一或多种在相同抗原的不同表位上结合的抗体组合时可产生协同效果。在本发明中，表位较优选为EGFR胞外域的片段。本发明的抗原较优选为抗体或抗体片段免疫特异性结合的胞外域EGFR蛋白质、多肽或其片段。EGFR相关抗原亦可为抗体或抗体片段免疫特异性结合的EGFR多肽胞外域或其片段的类似物或衍生物。
能够彼此竞争结合相同抗原的抗体可结合相同或重叠(overlapping)的表位或可具有彼此密切接近的结合位点，以便竞争主要由空间障碍引起。测定抗体之间的竞争的方法是描述于实施例中。
如本文中所使用的术语「多克隆蛋白质」或「多克隆性」是指包含不同但同源蛋白质分子的蛋白质组合物，该等蛋白质分子较优选选自免疫球蛋白超家族。因此，各蛋白质分子与组合物的其它分子同源，且亦含有一或多段可变多肽序列，其特征在于多克隆蛋白质的个别成员之间氨基酸序列的差异。该等多克隆蛋白质的已知实例包括抗体或免疫球蛋白分子、T细胞受体及B细胞受体。多克隆蛋白质可由所定义的蛋白质分子子集组成，所述子集已由诸如对所需目标的共有结合活性的共同特征定义，例如在针对所需目标抗原的多克隆抗体情况下。
「蛋白质」或「多肽」意谓任何氨基酸链，不考虑长度或翻译后修饰。蛋白质可以单体或的多聚体形式存在,包含两个或两个以上经组装的多肽链、蛋白质片段、多肽、寡肽或肽。
术语「RFLP」是指「限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism)」，一种在以限制酶裂解之后分析核酸分子片段的位移的胶体模式的方法。
术语「不规则性(scrambling)」描述以下情况，其中由个别细胞表达出两种或两种以上包含两种不同多肽链(例如来自免疫球蛋白超家族)的多克隆蛋白质的不同成员。该情况可在个别细胞整合入一对以上基因片段至基因组中时出现，其中各对基因片段编码多克隆蛋白质的不同成员。在该等情况中，可产生由该等基因片段表达的非所需多肽链组合。该等非所需多肽链组合可能不具有任何治疗效果。
术语「VH-VL链不规则性」为以上定义的不规则性的实例。在该实例中，VH和VL编码基因片段构成一对基因片段。该不规则性在由细胞产生非所需VH和VL多肽组合时发生，其中两个不同VH和VL编码基因片段对是整合入同一细胞中。该不规则性抗体分子不太可能保留其初始特异性且因此可能不具有任何治疗效果。
术语「转染」在本文中用作将外来DNA引入细胞中的广义术语。该术语亦意欲涵盖将外来DNA引入细胞中的其它功能等效方法，诸如转化、感染、转导或供体细胞与受体细胞的融合。
术语「可变多肽序列」及「可变区」可互换使用。
术语「有区别的表位」意谓当两种不同抗体结合有区别的表位时，存在低于100％的抗原结合竞争，较优选低于50％的抗原结合竞争，更优选基本上无抗原结合竞争。抗体对的「有区别的表位」的分析通常通过在饱和抗体条件下使用对表达EGFR的细胞及个别荧光标记抗体的FACS分析，或如实施例中所述使用捕获或结合至流动单元(cell)表面的EGFR抗原的表面电浆共振的结合实验来测定。
术语能够「抑制EGF结合」当应用于一种抗体分子时意谓该抗体分子对于与EGFR结合的EGF展现的IC50值小于10nM，较优选小于8nM，更优选小于7nM，更优选小于5nM，更优选小于4nM，更优选小于3nM，更优选小于2nM，更优选小于2nM，更优选小于1nM。
术语「表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor)」、「EGFR」及「EGFR抗原」在本文中可互换使用，且包括人类EGFR的变异体、同功异型物及物种同源物。在一较优选具体实例中，本发明的抗体与EGFR抗原的结合通过抑制或阻断EGFR配体与EGFR的结合抑制表达EGFR的细胞(例如肿瘤细胞)的生长。术语「EGFR配体」包含EGFR的所有(例如生理学)配体，包括(但不限于)EGF、TGF-α、结合EGF的肝素(HB-EGF)、双调蛋白(amphiregulin；AR)、和瑞古林(heregulin)、β-细胞调节素(cellulin)及表皮调节素(epiregulin；EPI)。在另一较优选具体实例中，本发明的抗体与EGFR抗原的结合介导效果细胞吞噬作用和/或杀死表达EGFR的细胞。
EGFR域结构：成熟EGFR(SwissProt acc.#P00533)的细胞外部分由621个氨基酸及四个受体域组成：域I包含残基1-165，域II包含残基166-312，域III包含残基313-481及域IV包含482-621(Cochran等人2004J immunol.Methods287,147-158)。已提出域I及域III有助于形成配体的高亲和力结合位点。域II及域IV为富含半胱氨酸层粘连蛋白样区域，其使蛋白质折叠稳定且含有可能的EGFR二聚界面。
如本文中所使用的术语「抑制生长」(例如提及细胞)意欲包括当使细胞与抗EGFR抗体接触时，与未与抗EGFR抗体接触的相同细胞的生长相比，前者的增殖(细胞数目增加)或代谢的可测量任何的减少，例如，抑制细胞培养物的生长至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
如本文中所使用的术语「抑制结合」及「阻断结合」(例如提及抑制/阻断EGFR配体与EGFR的结合)可互换使用且包含部分与完全抑制/阻断。抑制/阻断EGFR配体与EGFR结合较优选降低或改变在未抑制或阻断的情况下EGFR配体与EGFR结合时存在的细胞信号转导的正常程度或类型。抑制及阻断亦意欲包括EGFR配体在与抗EGFR抗体接触时，与未与抗EGFR抗体接触相比，前者与EGFR的结合亲和力的可测量任何的减少，例如，阻断EGFR配体与EGFR的结合至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％或100％。
术语「重组抗体」是用于描述由细胞或细胞系表达的一抗体分子或若干分子，其中该细胞或细胞系是经包含不与该细胞天然相关的该抗体的编码序列的表达载体转染。
【图式简单说明】
图1：脾细胞分选(对于详情请参见实施例1)。制作(描述)以下门：
·门1：活细胞(FSC/碘化丙啶图)。(左下图)
·门2：将浆细胞以CD43阳性/CD138阳性形式的门被圈选。(右下图)
·门3：双峰辨别(doublet discrimination)(右上图)
图2：鼠类-mSymplexTMPCR。用于扩增及同源(cognate)连接来自单一细胞的重链及轻链抗体基因的多重重叠延伸RT-PCR。对于详情请参考实施例1。
图3：鼠类全套克隆。通过重叠延伸拼接将来自单一浆细胞的编码VH/VL基因对的mSymplexTMPCR产物池拼接至编码人类κ恒定轻链的基因上。将编码完全人类-小鼠嵌合抗体的基因池插入表达载体中，继而插入双向启动子盒(2×CMV)。
图4：哺乳动物全长抗体表达载体00-VP-002的示意性代表图。Amp及Amp pro，氨苄青霉素(ampicillin)抗性基因及其启动子；pUC起点，pUC复制起点；CMV，驱动轻链及重链表达的哺乳动物启动子；IGHV前导区，基因组人类重链前导区；H填充片段，交换重链可变区编码序列的插入物；IGHG1，编码基因组免疫球蛋白同种型G1重链恒定区的序列(序列显示于附录2中)；兔B-珠蛋白A，兔β-珠蛋白polyA序列；IGKV前导区，鼠类κ前导区；L填充片段，交换轻链编码序列的插入物；SV40term，猿猴病毒40终止子序列；FRT，Flp识别目标位点；Neo，新霉素(neomycin)抗性基因；SV40poly A，猿猴病毒40poly A信号序列。
图5：450-620nm下吸光率差异的群分析。将上清液通过反应性群，如克隆编号之后的数字(1至4)所指示。深灰色表明代谢活性细胞数目减少，而淡灰色表明代谢活性细胞数目增加。黑色表明上清液对于代谢活性细胞的数目无影响。
图6A-B：如竞争ELISA中所测定的抗EGFR抗体对所列针对特定EGFR域的参考抗体的抑制程度。A)抑制计算。B)如下对抑制记分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈竞争(++)；75-100％：极强烈竞争(+++)。显示显著抑制(50-100％)的框填入灰色阴影。艾比特思及维克替比以双重复展示(四次独立实验)以说明鉴定的再现性。Ab2(225)为产生艾比特思的鼠类前躯物。
图7：在Biacore3000SPR机器上执行的单表位定位循环的说明图，其中样品mAb与四种不同参考抗体竞争结合EGFR胞外域。
图8A-B：如由使用SPR技术的竞争分析所测定的抗EGFR抗体对所列针对特定EGFR域的参考抗体的抑制程度。A)抑制计算。B)如下对抑制记分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈竞争(++)；75-100％：极强烈竞争(+++)。显示显著抑制(50-100％)的格为填入灰色阴影。标记*的克隆1229在该Biacore鉴定中不结合。
图9A-B：通过抗EGFR抗体对的SPR竞争分析对抗EGFR抗体全套内表位群的测定。将抗体根据假定的EGFR域识别分组。将其中发现抗体组合结合重叠表位产生大于50％抑制的格填入灰色阴影。将未进行测定的格填成黑色。A)抑制计算。B)如下对抑制记分：25-49％：中度竞争(+)；50-74％：强烈竞争(++)；75-100％：极强烈竞争(+++)。
图10A-B：如通过Biacore分析所测定的针对EGFR胞外域的参考抗体及抗EGFR抗体的表位定位。A)针对EGFR细胞外域(ECD)的域I或域I/II的抗体的表位定位。B)针对EGFR ECD的域III的抗体的表位定位。
图11A-D：针对EGFR上的不重叠表位的抗体的寡克隆混合物的同时结合的研究。A)依次添加针对域III、域I或未知特异性的抗体。单一样品mAb对于不同mAb混合物或单一mAb测试的抑制值是显示于填入阴影的框中。亦展示用于计算抑制的Ru最大值。B)针对EGFR上的不重叠表位的六种不同样品mAb与含有六种测试抗体的抗体混合物的竞争分析。不包括测试样品抗体的抗体混合物充当阳性对照。单一样品mAb针对不同mAb混合物测试的抑制值是显示于填入阴影的框中。亦展示用于计算抑制的Ru最大值。C)B中的分析的相应感应图说明抗体阻断且在某些情况下抗体增强结合。D)对于六种mAb抗体混合物测试针对域I、I/II及未知特异性的其它抗体。
图12A-B：通过对全长EGFR进行抗体滴定及检测与链霉抗生物素HRP试剂结合的经生物素标记的EGF配体来测定抗体介导的EGF配体阻断。分别将艾比特思、维克替比及西那格思IgG(帕利珠单抗)用作阳性及阴性对照。以测试抗体阻断所识别的抗体表位之后，通过添加用于检测的0.1μg/ml经生物素标记的EGF配体及二级链霉抗生物素-HRP偶联物来观测EGF配体竞争程度。
图13A-B：以指定抗体预处理对HN5细胞中EGF(50ng/ml)诱导的EGFR磷酸化的效果。将图中所指定的抗体(10μg/ml)与细胞一起培育30分钟，随后添加EGF保持7.5min。标记*的数据组显著地不同于对照((-)ctrl)数据组(p<0.05)。A.1208对EGFR磷酸化具有显著保护效果。B.1277及1320显著地防止EGF诱导的磷酸化。误差线表示三个独立实验的标准偏差。
图14：HN5细胞中磷酸化EGFR(pEGFR)及EGFR的细胞内Western分析。混合物表示992、1030与1042的最终浓度为10μg/ml的等摩尔混合物，其它抗体是以各10μg/ml的浓度使用。添加50μg/ml EGF保持7.5min，随后固定以刺激EGFR磷酸化。误差线表示6个独立(ctlr-)或3个独立数据点(992、1030、1042、混合物或艾比特思)的标准偏差。992、1030、混合物及艾比特思对于磷酸化具有显著(*＝p<0.05)保护效果。
图15：培育抗体对EGFR内化的效果。数据是以自细胞表面所移除的受体相对于初始染色的百分比的形式展示。误差线对应于SEM。
图16A-C：A431-NS细胞在不同浓度的抗体992、1030及1042及其混合物存在下由与未经处理的对照相比的代谢活性细胞百分比测量的生长曲线。1001为以类似同种型用作阴性对照的非功能抗体。
图17：A431-NS细胞在10μg/ml抗体992、1030及1042及其混合物及不同浓度EGFR配体EGF存在下由450nm下的吸光率测量的生长曲线。1001为以类似同种型用作阴性对照的非功能抗体。
图18：A431-NS细胞在不同浓度的抗体992及992与结合存在于域I、II或III中的不重叠表位的抗体的混合物存在下的生长曲线。1001为以类似同种型用作阴性对照的非功能抗体。
图19：A431NS细胞中的细胞凋亡。以10倍稀释液测试EGFR-混合物、个别单克隆抗体、艾比特思及维克替比。使用Roche的ELISA试剂盒测量凋亡细胞的组蛋白-DNA复合物。
图20：向每组有10只裸Balb/C Nu/Nu小鼠的四个组接种1×106个A431NS细胞。当肿瘤为约100mm3时开始处理。如箭头所指示，在实验期间向各组注射1mg/ml抗体五次。以数位测径器(callipers)测量肿瘤直径。结果是以平均肿瘤体积(+/-SEM)形式展示。
图21：当个别小鼠在图20中所展示的实验中被处死时，切除肿瘤且称重。展示平均值+/-SEM。星号表明显著性为P<0.05。
图22：A431-NS球状体在10μg/ml抗体1001、艾比特思、维克替比及结合不重叠表位的三种抗体的混合物992+1030+1042存在下的生长。1001为以类似同种型用作阴性对照的非功能抗体。
图23A-B：自来源于猕猴皮肤表皮的cDNA克隆的猕猴EGFR细胞外域的DNA(SEQ ID No.100)及蛋白质序列(SEQ ID NO.101)。
图24：所获得的猕猴EGFR ECD蛋白质序列(SEQ ID NO.101)与自GENBANK登录号X00588获得的人类EGFR ECD(SEQ ID NO108)的比对。亦展示一致序列(SEQ ID NO109)。
图25A-B：ELISA鉴定辨别结合人类或猕猴EGFR ECD或两者的交叉反应性与物种特异性抗体的实施例。
图26：来自异种移植小鼠的四个实验组中的每一者的代表性肿瘤切片的显微照片。在200倍放大率下，箭头指向体内A431细胞终末分化的集落(foci)。注意到在以三种抗EGFR克隆的混合物(992+1030+1042)处理的肿瘤中具有显著较大且较多终末分化的集落(上面两张图)。
图27：A)在添加10μg/ml对照抗体(利妥昔单抗(Rituximab)，抗CD-20)或992与1024的抗EGFR抗体混合物之后24小时以40倍放大率采集的HN5球状体的图像。B)使用软件Image J对由细胞覆盖的面积定量(*p<0.01)。
图28：以未经处理对照组的百分比形式展示四个处理组中内披蛋白(Involucrin)含量的图(*#¤p<0.005，分别与艾比特思、维克替比及阴性对照组相比较)。
图29：A)以60倍放大率采集的与10μg/ml Alexa-488标记的艾比特思或992+1024一起培育2小时的HN5及A431NS细胞的图像。B)以60倍放大率使用小针孔采集的与10μg/ml Alexa-488标记的艾比特思或992+1024一起培育2小时的A431NS细胞的图像。
图30：A)以60倍放大率采集的与10μg/ml Alexa-488标记的艾比特思或992+1024一起培育指定时段的HN5细胞的图像。
图31A-B：通过在ELISA中对A431-NS细胞及经纯化全长EGFR进行连续抗体滴定测定Fab992、1024及1030的抗原呈递特异性。结合的Fab抗体是通过二级山羊抗人类Fab特异性HRP偶联物观测。A)针对来自A431细胞的经纯化全长EGFR测试的Fab抗体。B)针对表达于A431-NS细胞表面上的EGFR测试的Fab抗体。
图32A-B：通过在ELISA中对三聚甲醛固定的A431-NS细胞进行连续滴定测定抗体992、1024、1030、艾比特思及维克替比的IgG及Fab片段的功能性亲和力。结合的Fab及IgG抗体是通过二级山羊抗人类Fab特异性HRP偶联物观测。抗RSV蛋白质F抗体西那格思是用作阴性对照抗体，且在所用ELISA鉴定中不展示任何结合。A)IgG抗体与A431-NS细胞的功能性结合。B)Fab抗体与A431-NS细胞的功能性结合。
图33A-C：预先以结合不重叠表位的Fab片段饱和受体之后对IgG与A431-NS细胞上的EGFR结合增强的测定。使指定Fab片段饱和在A431-NS细胞上所识别的EGFR表位30min，之后连续滴定特定IgG抗体，且在添加或不添加Fab的情况下结合的IgG是通过二级小鼠抗人类Fc HRP偶联物观测。A)预先以或未以指定Fab片段饱和受体的情况下IgG992与A431-NS细胞的结合特征。B)预先以或未以指定Fab片段饱和受体的情况下IgG1024与A431-NS细胞的结合特征。C)预先以或未以指定Fab片段饱和受体的情况下IgG1030与A431-NS细胞的结合特征。
图34A-B：猕猴全长EGFR cDNA(图34A；SEQ ID NO102)及所编码的蛋白质(图34B；SEQ ID NO103)。
图35：A431NS中以1μg/ml指定抗体/组合获得的细胞凋亡。以来自Roche的ELISA试剂盒检测组蛋白-DNA复合物。细胞凋亡程度是与阳性对照(最大细胞凋亡)有关。
图36：向Balb/C nu/nu小鼠注射1×106个A431NS细胞。当肿瘤平均为约100mm3时开始处理。小鼠接受17次抗体注射。第一次处理开始于第8日且最后一次在第34日。抗体/组合物以每剂0.5mg或每剂0.17mg注射。展示肿瘤体积的平均值+/-SEM。
图37：A431NS增殖的抑制。X轴展示本发明的3种抗体的不同代表性组合。Y轴展示呈未经处理的对照(对照)的百分比形式的代谢活性。误差线表示+/-SEM。对于其它详情请参见实施例6。
图38：两种不同剂量的992+1024混合物与艾比特思相比在A431NS人类肿瘤异种移植物中的生长抑制效果。向BALB/c nu/nu小鼠接种106个A431NS细胞。当肿瘤达到100mm3的平均尺寸时(第8日)，将小鼠随机分成每组9只的组且开始处理。将指定抗体以每剂0.5mg或每剂1mg注射，每周两次总共9次注射。图上的淡灰区域表明处理阶段。开始的虚线表示给定组中第一小鼠由于过度肿瘤尺寸而进行安乐死的时间点。在第60日计算每周2mg992+1024与每周2mg艾比特思及每周1mg992+1024与每周2mg艾比特思之间的统计学显著差异，其中除每周2mg992+1024组以外，所有组均终止。保留第60日之前排除的动物的肿瘤尺寸，因此，该图展示给定组中所有小鼠的累计肿瘤体积。展示平均值+/-SEM。
图39：以992+1024抗体混合物、艾比特思或对照抗体处理(与图38中所示相同的实验)的小鼠的存活率的Kaplan-Meyer图。结果以经处理小鼠的存活率百分比形式呈现。当对比992+1024与艾比特思时，观察到高剂量(每周2mg，P＝0.0008)与低剂量(每周1mg，P＝0.0004)组中小鼠存活率百分比之间的显著差异。亦，当与高剂量艾比特思相比时低剂量992+1024显著较佳(P＝0.0087)。使用对数等级检验(Log-rank test)(Mantel-Cox)计算统计学差异。
图40A-C：通过FACS分析进行IgG992、1024及1320针对经全长人类与猕猴EGFR转染的CHO细胞的交叉反应性的分析。结合抗体是以PE标记的山羊F(ab')2抗人类IgG FC检测。对表达EGFR的均匀细胞(SCC/FCS特性)执行的门被圈选。结合是表示为1nM浓度下最大抗体结合％。
图41A-B：992(A)及1024(B)的重链与轻链的鼠类(chi)与人源化(hu)候选者可变区的可变区氨基酸序列的Clustalw2比对。将如IMGT所定义的CDR区域加下划线；间隙由(-)表示，相同氨基酸由(*)表示，保守突变表示为(:)，半保守突变表示为(.)。黑体氨基酸表明在全人类框架变异体显示降低的结合亲和力的情况执行回复突变为初始鉴别出的鼠类残基的氨基酸位置。序列ID如下编号：人源化992VH(SEQ ID NO104)。人源化992VL(SEQ ID NO105)。人源化1024VH(SEQ ID NO106)。人源化1024VL(SEQ ID NO107)。嵌合992VH(SEQ ID NO40的aa3-124)。嵌合992VL(SEQ ID No72的aa3-109)。嵌合1024VH(SEQ IDNO41的aa3-120)。嵌合1024VL(SEQ ID NO73的aa3-114)。
图42A：992L1024的双重可变域编码基因的示意性代表图；992L1024IGHV(751bp)自5'AscI限制性位点开始表示，继而为992IGHV、ASTKGP接头、1024IGHV，且终止于3'XhoI限制性位点，992L1024IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位点开始表示，继而为992IGKV、TVAAP接头、1024IGKV、IGKC且终止于3'NotI限制性位点。
图42B：1024L992的双重可变域编码基因的示意性代表图；1024L992IGHV(751bp)自5'AscI限制性位点开始表示，继而为1024IGHV、ASTKGP接头、992IGHV，且终止于3'XhoI限制性位点，1024L992IGKV(1071bp)自5'NheI限制性位点开始表示，继而为1024IGKV、TVAAP接头、992IGKV、IGKC且终止于3'NotI限制性位点。
【实施方式】
发明详述
抗体混合物
在一具体实例中，本发明是关于包含能够结合至少三个有区别的EGFR表位，较优选三个不重叠EGFR表位的抗体分子的抗体组合物。抗体的不重叠性质较优选使用经不同标记的抗体在使用EGFR表达细胞的FACS分析中确定或通过使用利用经捕获或接合至流动单元表面的EGFR抗原的表面电浆共振确定。亦可使用如实施例中所述的基于ELISA的方法。结合三个不重叠EGFR表位的组合物可用于针对较宽范围的EGFR依赖性癌症类型，因为与靶向一或两个表位的单克隆抗体组合物相比，其较不易受EGFR构形差异影响且不易受突变影响。此外，结合三种不重叠EGFR表位的抗体组合物与靶向较少表位的组合物相比可提供优良的功效。详言的，该抗体组合物可对于体内癌细胞终末分化提供优良功效。图37结合三个有区别的hEGFR表位的有效抗体组合物的大量实施例说明该构想的一般适用性。
对于单克隆抗EGFR抗体疗法而言，特定比例的患者将不能有效地对抗体治疗起反应。对于一些患者而言，此可能归因于该抗体的迅速清除或由于该抗体在患者中产生针对该抗体的免疫反应。对于一些患者而言，缺乏反应可能由于其特定EGFR依赖性癌症表达某一构形的EGFR，在该构形中单克隆抗体不能结合其表位。此可能由于糖基化差异，由于域缺失或由于突变和/或SNP。
再者，对于一些癌症而言，由癌细胞的配体产生引起的自分泌EGFR刺激具有重要性，而在其它情况下，癌细胞表达EGFR无需配体刺激。对于后者癌症类型而言，能够抑制配体结合的抗体可能无效。
抗体能够结合EGFR上的至少三个有区别的表位的抗体组合物将更广泛适用，因为所有三个表位相对于抗体所识别的表位均改变的可能性减少。此外，所有抗体均由患者清除的可能性更小。最终，实施例展示在功能鉴定中，包含三种结合有区别的表位的抗体的混合物，其优于单克隆抗体且优于包含两种抗体的混合物。在诱导癌细胞的终末分化方面已使用结合不重叠表位的三种域III抗体最明确地证明优越性。该有效的抗体诱导癌细胞终末分化先前未有报导，且在设计有效的基于抗体的癌症疗法方面代表显著进步。随后的结果证明类似或更优良的结果可使用两种抗体的特定组合获得。
为获得改良的临床功效及针对更宽范围的EGFR依赖性癌症类型的更广泛的效用，可增加组合物中的抗体数目。因此，该组合物可包含能够结合四个不重叠表位的抗体。该组合物可包含能够结合五个不重叠表位的抗体。该组合物可包含能够结合六个不重叠表位的抗体。本申请案的实施例展示至少六种有区别的抗体可同时与EGFR结合(实施例3)。此并不排除可能或甚至有利地通过谨慎选择抗体来设计包含能够结合多于六个(诸如七个或八个)不重叠表位的抗体的组合物。
在另一具体实例中，组合物包含一种以上结合一个表位的抗体分子，诸如两种结合不同但重叠的表位的抗体。包括结合重叠表位的抗体可为有利的，因为此提高表位被结合的可能性。该可能性的一基本原理为：在一些患者和/或一些癌细胞中，表位可能由于构形变化或突变或SNP而改变。虽然此可能影响一种抗体的结合，但其可能不影响结合重叠表位的另一抗体的结合。此外，存在以下风险：该等抗体中的一者由于其被视为抗原而由患者清除。通过包括两种结合不同但重叠表位的抗体，减少清除两种抗体中的一者之后果及表位突变之后果。
因此在一具体实例中，组合物包含两种结合不同但重叠表位的抗体。在另一具体实例中，组合物包含两种结合相同表位的有区别的抗体分子。结合相同或重叠表位的抗体可具有相同或不同的同种型。
包含针对三个不重叠表位的抗体的抗体组合物因此包含四种、五种或六种有区别的抗体分子以便两种抗体结合两个重叠表位或同一第一表位，两种其它抗体结合两种其它重叠表位或同一第二表位，且两种抗体结合两种其它重叠表位或同一第三表位。当然，组合物可包含两种以上(诸如三种或四种)能够结合重叠表位或能够结合同一表位的抗体分子。因此，通过对于各表位具有一种以上抗体或通过具有结合重叠表位的若干抗体，包括于组合物中的抗体总数可超过6种。保持抗体总剂量恒定，各抗体浓度由于包括于组合物中的各其它抗体而降低。因此，预期对可包括于组合物中同时保持可接受的功效的抗体数目存在限制。根据表面电浆共振结合研究及增殖鉴定的观察结果且考虑到制造挑战，预期该限制(若存在)额外优点可通过将抗体数目自6种增加至7种、8种、9种、10种或更多而获得。当然，此并不排除该组合物包含多于10种抗体，诸如11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种或20种抗体或更多，诸如25种抗体或更多，例如30种抗体或更多，诸如40种抗体或更多，诸如50种抗体或更多。
虽然较优选在本发明的抗体组合物中包括能够结合至少三个不重叠EGFR表位的抗体，但使用能够结合两个不重叠EGFR表位的抗体的特定组合亦获得优良结果。该等较优选「两种抗体」组合物在下文中连同与如何设计本发明的抗体组合物有关的指导原则一起进行更详细地描述。已发现与包含抗体992、1030及1042的三种抗体组合物相比，当使用仅具有两种抗体(992及1024)的组合物时可获得类似或甚至改良的功效。由于抗体1024与1042属于同一群且因此具有相同结合特异性，实际上，对于三种抗体组合物所观察到的包括对终末分化的效果的结果可归因于该组合物中的仅两种结合特异性(992及1024/1042)。
在一具体实例中，组合物中至少一种抗体结合域III表位，更优选组合物包含至少两种结合域III表位的抗体，且组合物亦可包含三种结合域III表位的抗体。
较优选组合物包含至少一种结合域I表位的抗体且其可包含至少两种结合域I表位的抗体。
较优选组合物包含至少一种结合域II表位的抗体且可包含结合两个域II表位的抗体。
组合物亦可包含如本文中所定义的结合域I/II表位的抗体。
组合物可包含能够结合域IV表位的抗体。
较优选组合物包含至少一种能够抑制EGF结合的抗体分子。
在另一较优选具体实例中，组合物可包含能够防止EGFR磷酸化的抗体。
此外组合物可包含能够增强EGFR的内化/降解的抗体。
在一较优选具体实例中，组合物包含至少一种域III抗体及至少一种域I/II抗体。在另一较优选具体实例中，组合物包含至少两种域III抗体及一种域I抗体。
在另一较优选具体实例中，组合物包含至少两种域III抗体，诸如至少三种域III抗体。
组合物的抗体可为具有非人类可变链与人类恒定链的嵌合抗体。非人类可变链可来自小鼠、大鼠、绵羊、猪、鸡、非人类灵长类动物或其它合适动物。为获得全人类抗体，抗体可在具有人类抗体基因的转基因动物中产生。抗体亦可为所谓的人源化抗体，其中非人类CDR序列已植入人类框架序列中。
较优选人类恒定链为IgG1或IgG2同种型。更优选组合物中的所有抗体具有相同同种型以便于制造。然而，在组合物中可有利地包括不同同种型的抗体。
较优选本发明的抗体组合物包含能够与选自由以下EGFR组成的组的EGFR结合的抗体：人类EGFR、突变人类EGFR及人类EGFR的缺失变异体。较优选抗体能够结合人类与非人类灵长类EGFR两者，以便其可在临床实验之前在相关毒物学研究中加以测试。较优选非人类灵长类动物为猕猴(食蟹猴，Macaca fascicularis)。
为支持以上所确定的使用结合多个有区别的表位中的三个的抗体治疗EGFR依赖性癌症的构想，本发明的发明者已鉴别、制造且表征一系列针对EGFR的嵌合小鼠/人类抗体。该等嵌合抗体已个别地且以混合物形式与最新技术的单克隆抗体(以艾比特思TM(ErbituxTM)及维克替比TM(VectibixTM)例示)进行对比。
表1展示个别嵌合抗体的概述及与其有关的特征。抗体编号为贯穿本申请案所使用的参考数字。特异性为抗体所结合的EGFR域，如实施例3中所证实。ΔEGFR为抗体与EGFR突变体(EGFRvIII)结合的能力，如实施例1中所述。猕猴EGFR为抗体结合猕猴EGFR的能力(实施例10)。EGF inhib为抗体抑制EGF结合的能力(实施例4)。增殖为抗体抑制癌细胞系(A431及HN-5)增殖的能力(实施例6)。
表1本发明的抗体
抗体编号 特异性 ΔEGFR 猕猴EGFR EGF inhib 增殖
992 域III 不能/弱 能 能/弱 能
1030 域III 能 能 能 能
1024 域III 能 能 能
1042 域III 弱 能 (能) 能
1277 域III 能 能 能 HN5
1254 域III 能 能 能 HN5
1208 域III 能 能 能 能HN5+/-992
1320 域III 弱 不能 能 能
1257 域I/II 不能 能 不能 能
1261 域I 不能 能 不能 能
1229 非域I/II 能 不能 不能 能(A431)
1284 域I 不能 能 能 能
1344 域I/II 不能 能 nd HN5w/992
1260 域I/II 不能 能 能 A431
1308 域I 不能 能 nd HN5w/992
1347 域I 不能 能 nd HN5w/992
1428 域I及II 不能 能 能 HN5w/992
自使用单独及组合测试的嵌合抗体产生的增殖、结合、受体降解/失活及运动性鉴定及动物模型的数据，可获得多个结论。
使用两种癌细胞系HN-5及A431(实施例6)获得的结果已使用不同癌细胞系(MDA-MB-468乳癌细胞系；DU145-前列腺癌细胞系)进行重复。易于自该等实验了解到，由本发明的发明者提供的抗体组合显示针对极广泛的癌细胞系的功效，此支持该等抗体组合物针对多种EGFR构形的功效。
亦已证明在增殖鉴定中抗体混合物的优势在将生理学浓度的配体(EGF)添加至生长培养基中时高于不添加EGF时(图17)。根据文献(Hayashi及Sakamoto1998J Pharmacobiodyn11；146-51)，血清含有约1-1.8ng/ml或0.2-0.3nM EGF，而胃液据报导含有0.3ng/ml(约0.05nM)(Pessonen等人1987Life Sci.40；2489-94)。在体内环境中，可能存在EGF及其它EGFR配体，且因此抗体混合物的能力在EGFR配体存在下有效为本发明的抗体混合物的重要特征。
本发明的嵌合小鼠/人类抗体在组合使用时提供比单独使用时更优选的结果。此在若干实验(参见(例如)实施例6)中得以例示，在该等实验中，当单独测试时，抗体对癌细胞系(A431-NS)仅展示中度抗增殖效果，但在以任一组合使用时，展示显著优良的结果。该等结果已使用本发明的嵌合抗体的多种组合进行证实。尤其优良的结果已使用包含抗体992及1024的组合物获得。
举例而言，若干抗体已与抗体992、1208、1254及1277中的任一者一起在使用A431-NS及HN-5的抗增殖鉴定中进行测试。
受体结合研究已证明一些抗体可实际上刺激其它抗体的结合，以使得特定抗体在受体以一种或数种抗体饱和之后以较高数量与受体结合。抗体992的针对域III的结合明显受益于通过预先以一或多种结合不重叠表位的抗体来饱和受体所获得的该协同效果。当对于以结合不重叠表位的抗体饱和的EGFR测试针对未知表位的抗体1396时可见该合作效果的另一实例。
受体结合研究亦证明有可能使至少6种抗体与EGFR胞外域同时结合。该等6种抗体代表3种域III抗体、一种域I抗体、一种域I/II抗体及一种结合未知表位的抗体。有趣的是，三种域III抗体的结合似乎促进其它抗体之后续结合。此明显支持提供具有若干结合有区别的表位的抗体的抗体组合物的构想。
当设计针对EGFR的抗体组合物的组合物时，较优选使用结合不重叠表位的抗体，因为此提供较高协同效果。
混合物的抗体中的至少一种(当单独测试时)能够抑制配体与EGFR结合(例如能够抑制EGF结合，和/或能够抑制TGFα结合，和/或能够抑制双调蛋白结合)亦较优选。较优选能够抑制EGF结合的抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体992、1030、1024、1042、1208、1254、1277、1284、1320及1428，更优选选自由以下抗体组成的组：抗体1208、1260、1277及1320。
抗体混合物中的至少一种抗体成员能够降低EGFR磷酸化亦较优选。具有该特性的本发明的抗体的实例包括992、1030、1042、1208、1277及1320。
EGFR的域III对于配体与受体的结合很重要。此外，与域III结合的抗体可稳定呈不产生受体信号转导的约束单体构形的EGFR。因此较优选抗体组合物含有至少一种对域III具有特异性的抗体。较优选域III抗体包括抗体992、1024、1030、1208、1254、1277及1320。更优选至少域III抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体992、1254、1277、1208及1320。该抗体组合物可较优选包含一种以上域III抗体，诸如至少3种域III抗体，例如至少4种域III抗体，诸如至少5种域III抗体，例如至少6种域III抗体。
在另一较优选具体实例中，抗体组合物包含至少一种域I抗体。较优选该至少一种域I抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1284、1308、1344及1347。更优选该至少一种域I抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1284及1347。
在另一较优选具体实例中，抗体组合物包含至少一种域I/II抗体。较优选该至少一种域I/II抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1257、1260、1261、1428及1434。更优选该至少一种域I/II抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1261及1260。
本发明的两种抗体的有效特定组合包括：
抗体1280连同1024、1320、1308、1284、1260或1030，较优选与1320或1284。
抗体1254连同1024、1030、1260、1284、1308或1320，较优选与1320、1284或1260。
抗体1277连同1024、1030、1260、1284、1308或1320，较优选与1320、1284或1260。
抗体992连同1030、1260、1284、1308、1320或1024，较优选与1320、1024或1284。
两种抗体的优良且较优选混合物的实例包括992+1024；992+1320；992+1042；1277+1320；1208+1320。尤其较优选为992+1024。
具有三种抗体的较优选混合物包括：抗体
992+1030+1042；992+1320+1024；992+1024+1030；1320+1284+1261；1320+1214+1320；992+1284+1320；992+1255+1024；992+1030+1320；992+1024+1214；992+1261+1320；992+1024+1284；992+1024+1211；992+1024+1030；1260+1214+1254；992+1255+1320；992+1211+1320；992+1030+1261；992+1260+1030；992+1260+1320；992+1030+1214。
具有四种抗体的较优选混合物包括：抗体
992+1320+1024+1030；992+1024+1030+1284；1277+1320+1260+1347；1277+1320+1261+1347；1277+1320+1261+1284；1254+1320+1260+1347；1254+1320+1261+1347；1254+1320+1261+1284；1254+1024+1260+1347；1254+1024+1261+1347；1254+1024+1261+1284；1277+1024+1260+1347；1277+1024+1261+1347；1277+1024+1261+1284。
具有5种抗体的较优选混合物包括：
992+1030+1024+1260+1347；992+1030+1024+1261+1347；992+1030+1024+1261+1284；992+1030+1320+1260+1347；992+1030+1320+1261+1347；992+1030+1320+1261+1284。
具有8种抗体的一较优选混合物包括：
992+1030+1024+1277+1254+1320+1260+1261+1284+1347。
此外，为能够在非人类灵长类动物中执行毒物学研究，较优选组合物中的所有抗体均不仅与人类EGFR结合，而且与至少一种其它灵长类EGFR结合，该其它灵长类EGFR诸如黑猩猩(chimpanzee)、猕猴(Macacamulatta)、恒河猴(Rhesus monkey)及其它猴类或猕猴(cynomolgous monkey)的EGFR。猕猴(cynomolgous monkey)为相对较小的动物，且尤其适合于毒物学研究。因此，其它灵长类EGFR较优选为猕猴EGFR。较优选该等抗体以近似相同的亲和力与人类及非人类灵长类EGFR结合。
本发明当在一种组合物中组合2种、3种、4种、5种、6种、7种及8种抗体时在一或多个功能鉴定中展示优良结果。虽然该等数据对组合物中抗体数目的选择提供指导原则，但其不应以限制性方式进行解释。该组合物可包含多于8种抗体，尽管实验数据仅展示6种抗体的同时结合。可能存在组合物中包括多于6种抗体的其它原因，该等原因诸如抗体成员的清除速率的差异。
该等组合物的抗体的另一较优选特征为蛋白质均质性，从而可易于纯化该等抗体。对于个别抗体成员而言，为便于表征，具有一有区别的峰的离子交换层析图谱较优选。为便于表征最终抗体组合物，清晰的离子交换层析图谱亦较优选。当组合抗体时，较优选该等抗体可使用离子交换层析法加以区分，以便具有所有抗体的组合物可在一次操作中得以表征。
该等抗体可来自任何来源，诸如人类、鼠类、兔、鸡、猪、羊驼、绵羊。该等抗体亦可如实施例中所述为嵌合抗体或可使用此项技术中所述的熟知方法获得的其人源化、超人源化或再成型形式。
较优选抗体组合物
如随附实施例中所示，基于抗体992及1024的抗EGFR组合物具有独有且有区别的特性。抗体992的结合是由包括1024的其它抗体的结合增强。与市售抗体相对比，992与1024优先与细胞上所呈递的构形表位结合(实施例14及15)。992与1024的表位均与艾比特思及Vectibix表位重叠，但明显不同于艾比特思及维克替比表位。与个别抗体与不重叠表位结合的多种其它两种抗体组合物相对比，基于抗体992及1024的结合特异性的组合物迅速且有效引发受体内化。在以基于抗体992及1024的抗体组合物处理之后的动物模型中观察到，包括伴有内披蛋白(involucrin)表达增加及角化珠(keratin pearl)出现的终末分化的新颖作用机制。该独有的作用机制产生体外及体内的更有效且持续的生长抑制。此最明显地见于体内实施例中，其中肿瘤在终止治疗之后继续减少。在接受艾比特思的对照组中，肿瘤在终止治疗之后不久开始生长。此明显指示不同作用机制。
据信该新颖作用机制是通过使用由一种抗体组合物中的抗体992与1024所显示的两种结合特异性的组合达成。当使用不与抗体992及1024竞争的第三抗体时，例如在抗体992、1024与1030的三重组合中亦可见到该作用机制。
该等观察结果使得可设计包含至少2种有区别的抗人类EGFR抗体分子的抗体组合物，其中第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL序列(SEQ ID NO72的氨基酸3-109)及VH序列(SEQ ID NO40的氨基酸3-124)的抗体、具有抗体992的CDR3(SEQ ID NO116及111)的抗体、与抗体992结合相同表位的抗体及能够抑制抗体992与人类EGFR结合的抗体；且其中第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL序列(SEQ ID NO73的氨基酸3-114)及VH序列(SEQ ID NO41的氨基酸3-120)的抗体、具有抗体1024的CDR3(SEQ ID NO120及114)的抗体、与抗体1024结合相同表位的抗体及能够抑制抗体1024与人类EGFR结合的抗体。
较优选该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL序列及VH序列的抗体、具有抗体992的CDR3的抗体及与抗体992结合相同表位的抗体；且该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL序列及VH序列的抗体、具有抗体1024的CDR3的抗体及与抗体1024结合相同表位的抗体。
本发明涵盖抗体992及1024的CDR3序列中提供具有相同结合特异性的抗体的突变。因此在一具体实例中，具有与抗体992相同的结合特异性的抗体包含具有下式的CDRH3：
CTX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15W，其中X1至X15是个别地选自以下列出的氨基酸的群：
X1＝R或K；
X2＝N、D、E或Q；
X3＝G、A、V或S；
X4＝D、E、N或Q；
X5＝Y、F、W或H；
X6＝Y、F、W或H；
X7＝V、I、L或A；
X8＝S、T、G或A；
X9＝S、T、G或A；
X10＝G、A、V或S；
X11＝D、E、N或Q；
X12＝A、G、V或S；
X13＝M、L、I或V；
X14＝D或E；且
X15＝Y或F；
及由下式描述的CDRL3：CX1X2X3X4X5X6PPTF，其中X1至X6是个别地选自以下列出的氨基酸的群：
X1＝Q或H；
X2＝H、E或Q；
X3＝Y、F、W或H；
X4＝N、Q或H；
X5＝T、S、G或A；且
X6＝V、I、L或A。
因此在一具体实例中，具有与抗体1024相同的结合特异性的抗体包含具有下式的CDRH3：CVX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11W，其中X1至X11是个别地选自以下列出的氨基酸的群：
X1＝R或K；
X2＝Y、F、W或H；
X3＝Y、F、W或H；
X4＝G、A、V或S；
X5＝Y、F、W或H；
X6＝D、E、N或Q；
X7＝E或D；
X8＝A、G、V或S；
X9＝M、L、I或V；
X10＝D、E、N或Q；且
X11＝Y或F；
及由下式描述的CDRL3：CX1X2X3X4X5X6PX7TF，其中X1至X7是个别地选自以下列出的氨基酸的群：
X1＝A、G或V；
X2＝Q或H；
X3＝N、Q或H；
X4＝L、I、M或V；
X5＝E、D、N或Q；
X6＝L、I、M或V；且
X7＝Y、F、W或H。
具有突变型CDR3的抗体可使用标准技术制备且可使用本文所述的方法表达且进行结合测试。
根据本发明的此方面的抗体可为嵌合、人类、人源化、再成型或超人源化抗体。此可通过使用此项技术中已知的方法进行。举例而言，抗体992及1024可使用实施例18中所述的方法加以人源化。「超人源化」的方法是描述于US6,881,557中。
更优选该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992、包含抗体992的VL序列及VH序列的抗体，及具有抗体992的CDR3的抗体；且该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024、包含抗体1024的VL序列及VH序列的抗体及具有抗体1024的CDR3的抗体。
更优选该第一有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体992及包含抗体992的VL序列及VH序列的抗体；且该第二有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1024及包含抗体1024的VL序列及VH序列的抗体。
最优选该组合物包含抗体992及1024。
如所述，第一及第二抗EGFR抗体较优选不抑制彼此与人类EGFR的结合。甚至更优选地，该等抗体中的至少一种能够增加另一抗体对人类EGFR的最大结合能力。对于抗体992及1024观察到此效果(实施例16)。
两种抗体之间的比率不必精确地为1:1比率。因此，组合物中的第一抗体相对于第二抗体的比例可介于5％及95％之间，诸如介于10％与90％之间，较优选介于20％与80％之间，更优选介于30％与70％之间，更优选介于40％与60％之间，诸如介于45％与55％之间，诸如约为50％。
较优选第一及第二抗体具有同种型IgG1或IgG2。
本发明的发明者鉴别出的与抗体992结合相同表位的抗体的实例为来自包含以下克隆的抗体群的抗体：克隆1209、1204、992、996、1033及1220。
本发明的发明者鉴别出的与抗体1024结合相同表位的抗体的实例为来自包含以下克隆的抗体群的抗体：克隆1031、1036、1042、984、1024、1210、1217、1221及1218。
CDR3确定抗体的结合特异性。在较优选具体实例中，包含抗体992的CDR3的抗体另外包含抗体992的VH和VL的CDR1及CDR2。同样，包含抗体1024的CDR3的抗体较优选另外包含抗体1024的VH和VL的CDR1及CDR2。抗体的CDR序列可见于实施例17的表12中。
在其它具体实例中，与抗体992竞争的抗体是选自由以下抗体组成的组：抗体1208、1254及1277。同样，与抗体1024竞争的抗体可选自由以下抗体组成的组：抗体1042及1320。
在一具体实例中，组合物除该等第一及第二抗体外不含有其它抗体，更优选不含有其它抗EGFR抗体。
在其它具体实例中，组合物进一步包含第三有区别的抗EGFR抗体，其中该第三有区别的抗EGFR抗体分子是选自由以下抗体组成的组：抗体1030、包含抗体1030的VL序列(SEQ ID NO74的氨基酸3-113)及VH序列(SEQ ID NO42的氨基酸3-120)的抗体、具有抗体1030的CDR3(SEQID NO112及119)的抗体、与抗体1030结合相同表位的抗体及能够抑制抗体1030与人类EGFR结合的抗体。该第三抗体较优选使得该等第一和/或第二抗体与人类EGFR的结合增强。在一具体实例中，组合物除该等第一、第二及第三抗体外不含有其它抗体，更优选不含有其它抗EGFR抗体。
与抗体1030结合相同表位的抗体可选自由以下克隆组成的抗体群：克隆1195、1030、1034、1194、980、981、1246及1223。
包含抗体1030的CDR3的抗体可另外包含抗体1030的VH和VL的CDR1及CDR2。
该等抗体可调配于一容器中以供给药/施用。然而，其可个别地制造、纯化且表征且以部件试剂盒形式提供于2个或3个独立容器中，其中每一容器中具有一种抗体。因此其可同时、依次或单独给药。
在另一方面中，将抗体992及1024的两种结合特异性组合于一种双特异性结合分子中。较优选该双特异性结合分子包含抗体992及1024的CDR，更优选包含抗体992及1024的VH和VL序列。该双特异性结合分子可如实施例19中所述为双可变域抗体。双特异性结合分子亦可如文献中所述以双特异性Fab片段、双特异性scFV或双功能抗体形式设计。
基于抗体992及1024的结合特异性的抗体组合物较优选产生一或多种受体内化、体内A431NS肿瘤退化、诱导体内A431NS细胞终末分化及上调体内肿瘤内披蛋白表达。
本申请案提供若干具有与抗体992与1024的组合相同或类似效果的抗体的实例。该等抗体的实例包括自与该等两种抗体中的一种相同的免疫中获得，且属于与其相同群的抗体，及个别地与其竞争的抗体。具有相同或类似效果的抗体组合物可基于抗体992及1024的VL序列及VH序列以及基于该等抗体的CDR，尤其该等两种抗体的CDR3设计。
具有相同或类似效果的其它抗体组合物可通过基本上如实施例中所述进行免疫及筛选来制备。具有与抗体992及1024相同的结合特异性的抗体，可如本文所述在两个独立竞争鉴定中鉴别。最终，一种抗体增强另一抗体的结合的抗体组合物，可基本上如实施例16中所述通过进行结合实验来鉴别。抗体组合物可进一步如实施例中所述就对受体内化、体外及体内功效、结合亲和力等的效果进行筛选。
本发明的抗体组合物的用途
为用于体内治疗及预防与EGFR表达相关的疾病(例如过度表达)，使用任何合适给药途径(诸如注射及此项技术中已知的用于基于抗体的临床产品的其它给药途径)向患者(例如人类受试者)以治疗有效剂量(例如产生表达EGFR的肿瘤细胞的生长抑制、吞噬作用、运动性降低、终末分化和/或杀死该等肿瘤细胞的剂量)给药本发明的抗体。
可使用本发明的抗体治疗、改善和/或预防的典型EGFR相关疾病包括(但不限于)自体免疫疾病及癌症。举例而言，可治疗、改善和/或预防的癌症包括膀胱癌、乳癌、子宫/子宫颈癌、结肠癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、鳞状细胞癌、肺(非小细胞)癌、食道癌、头颈癌、皮肤癌。可治疗的自体免疫疾病包括(例如)牛皮癣。
在另一具体实例中，本发明是关于治疗、改善和/或预防以下疾病的方法：胶质母细胞瘤(glioblastoma)，包括多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme)；星形细胞瘤(astrocytoma)，包括儿童星形细胞瘤(childhood astrocytoma)；胶质瘤(glioma)；神经母细胞瘤(neuroblastoma)；胃肠道的神经内分泌肿瘤(neuroendocrine tumorsof the gastrointestinal tract)；支气管肺泡癌(bronchoalveolarcarcinoma)；滤泡状树突细胞肉瘤(follicular dendritic cellsarcoma)；唾液腺癌(salivary gland carcinoma)；造釉细胞瘤(ameloblastoma)；恶性周边神经鞘肿瘤(malignant peripheralnerve sheet tumor)；内分泌胰腺肿瘤(endocrine pancreatictumors)；或睾丸生殖细胞肿瘤(testicular germ cell tumors)，包括精原细胞瘤(seminoma)、胚胎癌(embryonal carcinoma)、卵黄囊瘤(yolk sac tumor)、畸胎瘤(teratoma)及绒膜癌(choriocarcinoma)。
可变重链及可变轻链编码对的分离及选择
产生抗EGFR重组抗体组合物的方法包括自合适来源分离编码可变重链(VH)及可变轻链(VL)的序列，由此产生VH和VL编码对的全套。通常，获得VH和VL编码序列的合适来源为含有淋巴细胞的细胞部分，诸如来自以人类EGFR多肽或肽，或以来源于表达人类EGFR的细胞的EGFR蛋白质，或以表达人类EGFR的细胞或该等细胞的部分免疫/接种的非人类动物的血液、脾脏或骨髓样品。较优选含有淋巴细胞的部分是自具有人类免疫球蛋白基因的非人类哺乳动物或转基因动物收集。所收集的含有淋巴细胞的细胞部分可进一步增殖以获得特定淋巴细胞群体，例如B淋巴细胞谱系的细胞。较优选使用磁珠细胞分选(magenetic bead cell sorting，MACS)和/或荧光活化细胞分选(fluorescence activated cell sorting，FACS)，利用(例如)B细胞、原浆细胞和/或浆细胞的谱系特异性细胞表面标记蛋白质执行增殖。较优选该含有淋巴细胞的细胞部分是针对B细胞、原浆细胞和/或浆细胞进行增殖或分选。甚至更优选地，自脾脏或血液分离具有CD43及CD138的高度表达的细胞。该等细胞有时称为循环浆细胞、早期浆细胞或原浆细胞。出于便利的原因，在本发明中仅将其称为浆细胞，尽管其它术语可互换使用。
VH和VL编码序列的分离可以传统方式执行，其中将VH和VL编码序列随机组合于载体中以产生VH和VL编码序列对的组合文库。然而，在本发明中，较优选反映对在EGFR免疫后的体液免疫反应中产生的抗体的多样性、亲和力及特异性。此包括保持最初存在于供体中的VH和VL配对，由此产生序列对的全套，其中各对编码相应于最初存在于由分离出该等序列的供体产生的抗体中的VH和VL对的可变重链(VH)及可变轻链(VL)。此亦称为VH和VL编码序列的关联对且该抗体称为同源抗体。较优选本发明的组合的或同源的VH和VL编码对是自小鼠供体获得，且因此该等序列为鼠类来源的。
存在产生VH和VL编码序列的关联对的若干不同方法，一方法包括自由含有淋巴细胞的细胞部分分选出的单细胞扩增且分离VH和VL编码序列。为获得类似于供体中VH和VL序列对的多样性的VH和VL编码序列对的全套，VH和VL对的不规则性(随机组合)尽可能小的高通量方法较优选，例如如WO2005/042774(以引用的方式并入本文中)中所述。
VH和VL编码序列可经单独扩增且在第二步骤中配对，或其可在扩增期间配对(Coronella等人2000.Nucleic Acids Res.28:E85；Babcook等人1996.PNAS93:7843-7848及WO2005/042774)。第二方法包括VH和VL编码序列的细胞内扩增及配对(Embleton等人1992.Nucleic Acids Res.20:3831-3837；Chapal等人1997.BioTechniques23:518-524)。第三方法为选择淋巴细胞抗体法(selected lymphocyte antibody method,SLAM)，其组合溶血性噬菌斑鉴定(hemolytic plaque assay)与VH和VL cDNA的克隆(Babcook等人1996.PNAS93:7843-7848)。可用于小鼠的另一方法为标准融合瘤(hybridome)技术，继而筛选及选择占优候选者(lead candidate)且随后克隆所编码的抗体。
在本发明的一较优选具体实例中，成员对反映负责由EGFR免疫产生的体液免疫反应的基因对的VH和VL编码对的全套是根据包含以下步骤的方法产生：i)提供来自以人类EGFR免疫的动物供体的含有淋巴细胞的细胞部分；ii)任选地自该细胞部分增殖B细胞或浆细胞；iii)获得分离单细胞的群体，其包含将细胞自该细胞部分个别地分配至多个器皿中；iv)在多重重叠延伸RT-PCR程序中，使用来源于该等所分离的单细胞的模板扩增VH和VL编码对且实现VH和VL编码对的连接；及v)任选地执行已连接VH和VL编码对的嵌套式PCR(nested PCR)。较优选使该等经分离的关联VH和VL编码对经受如下所述的筛选程序。
VH和VL序列对产生之后，随即执行筛选程序以鉴别编码具有针对EGFR相关抗原的结合反应性的VH和VL对的序列。较优选地，该EGFR相关抗原包含EGFR的细胞外部分，诸如域III、II、I和/或IV，该等域的片段或完整胞外域。其它抗原包括突变体，诸如EGFR或SNP的缺失突变体，或其片段。若VH和VL序列对为组合的，则可在筛选之前应用噬菌体呈现程序以增殖编码与EGFR结合的抗体片段的VH和VL对。
为反映以EGFR免疫后的体液免疫反应中所产生的抗体的多样性、亲和力及特异性，本发明已开发出关联对的筛选程序以获得可能的最广泛多样性。为筛选的目的而言，使用转染至合适宿主细胞中的细菌或哺乳动物筛选载体使关联VH和VL编码对的全套个别地表达为抗体片段(例如scFv或Fab)或全长抗体。可就以下(但不限于)方面筛选Fab/抗体的全套：与EGFR的反应性、针对表达EGFR的癌细胞系的抗增殖活性及抑制配体(例如EGF)与EGFR结合的能力、抑制磷酸化、诱导细胞凋亡、EGFR内化。
同时，针对诸如人类及任选地猕猴或黑猩猩或恒河猴EGFR肽的选定抗原筛选Fab/抗体的全套。该等抗原性肽可(例如)选自人类EGFR胞外域、人类突变型EGFR胞外域及猕猴EGFR胞外域或其片段。该等肽可经生物素标记以有利于在筛选期间固定在珠粒或板上。亦可使用替代性固定方法。该等抗原是基于EGFR生物学知识加以选择且可提供能够与该等抗原潜在结合的预期中和和/或保护效果抗体。该筛选程序可同样应用于组合噬菌体呈现文库。
用于筛选的重组EGFR蛋白质可表达于细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或另一合适表达系统中。对于正确加工(包括糖基化)而言，使该等蛋白质表达于哺乳动物细胞中。EGFR-ECD蛋白质可表达为可溶性蛋白质(无跨膜及细胞内区域)或其可与第三蛋白质融合以增加稳定性。若EGFR蛋白质与融合标签一起表达，则该融合配对物可在筛选之前裂解。除上述初级筛选之外，可执行第二级筛选以确保所选序列均不编码假阳性。
通常，免疫鉴定适合于在本发明中所执行的筛选。该等鉴定为此项技术中所熟知且由(例如)ELISPOT、ELISA、FLISA、膜鉴定(例如西方墨点法(Western blot))、过滤器上数组(array on filters)及FACS构成。可在无任何预先增殖步骤的情况下，使用由编码VH和VL对的序列产生的多肽执行该等鉴定。倘若VH和VL编码对的全套为关联对，则在筛选之前无需通过(例如)噬菌体呈现增殖。然而，在筛选组合文库时，免疫鉴定较优选与增殖方法组合或在增殖方法之后执行，该等增殖方法诸如噬菌体呈现、核糖体呈现、细菌表面呈现、酵母呈现、真核病毒呈现、RNA呈现或共价呈现法(回顾于FitzGerald,K.,2000.Drug Discov.Today5,253-258中)。
通常使筛选中所选出的VH和VL对编码序列实施测序，且对可变区多样性进行分析。详言的，关注CDR区域中的多样性且亦关注VH和VL家族概况。基于该等分析，选出编码VH和VL对的序列，其中该等VH和VL对代表自一或多个动物供体中所分离的EGFR结合抗体的总体多样性。较优选选出在所有CDR区域(CDRH1、CDRH2、CDRH3及CDRL1、CDRL2及CDRL3)中具有差异的序列。若存在具有一或多个相同或极类似CDR区且属于不同VH或VL家族的序列，则亦将其选出。较优选在所选序列对中，至少可变重链的CDR3区域(CDRH3)不同。可能地，VH和VL序列对的选择可严格基于CDRH3区的可变性。在序列的引发及扩增期间，在可变区的框架区中(尤其在第一框架区中)可能发生突变。较优选校正在第一框架区中发生的错误以确保序列完全或至少98％与种系来源的序列一致(例如)以使得VH和VL序列为完全鼠类来源的。
当确保所选编码VH和VL对的序列的集合的总体多样性高度代表遗传层面上在对EGFR免疫的体液反应中所见的多样性时，预期由所选VH和VL编码对的集合表达的抗体的总体特异性亦代表EGFR免疫动物中所产生的抗体的特异性。由所选VH和VL编码对的集合表达的抗体的特异性是否代表由供体产生的抗体的特异性的指示，其可通过将供体血液对所选抗原的抗体与由所选VH和VL编码对的集合表达的抗体的特异性加以比较来获得。此外，可对由所选VH和VL编码对的集合表达的抗体的特异性进一步进行分析。特异性程度与可检测结合反应性所针对的不同抗原的数目有关。在本发明的另一具体实例中，由所选VH和VL编码对的集合表达的个别抗体的特异性是通过表位定位进行分析。
表位定位可通过多种方法执行，该等方法不必彼此互相排斥。定位抗体分子的表位特异性的一种方法为评估，其与来源于目标抗原的初级结构的不同长度的肽的结合。该等肽既可为线性的亦可为构形的，且可用于多种鉴定格式，包括ELISA、FLISA及表面电浆共振(SPR，Biacore，FACS)。此外，该等肽可使用可用序列及结构数据经合理地选择以代表(例如)目标抗原的胞外区或保守区，或可设计为代表所选部分抗原或全部抗原的一组重叠肽(Meloen RH,Puijk WC,Schaaper WMM.Epitope mapping byPEPSCAN，Immunology Methods Manual中，编Iwan Lefkovits1997,Academic Press，第982-988页)。抗体克隆与一或多种该等肽的特定反应性通常为表位特异性的指示。然而，在许多情况下，肽为由针对蛋白质性抗原产生的抗体识别的表位的不良模拟物，此是由于缺乏天然或特定构形，且由于相比于抗体及肽，抗体与蛋白质抗原之间的相互作用的遮蔽表面积(buried surface area)通常较大。允许直接在蛋白质抗原上界定特异性的表位定位的第二种方法，是通过使用现有的、明确限定的抗体选择性地表位遮蔽进行。阻断之后第二探查抗体与抗原的结合减少通常指示共有或重叠表位。通过选择性遮蔽进行表位定位可通过多种免疫鉴定法执行，该等免疫鉴定法包括(但不限于)此项技术中所熟知的ELISA及Biacore(例如Ditzel等人1997.J.Mol.Biol.267:684-695；Aldaz-Carroll等人2005.J.Virol.79:6260-6271)。确定抗EGFR抗体的表位特异性的另一潜在方法为在抗体存在下选择逃避突变体。此可(例如)使用丙氨酸扫描执行。所关注的来自该等逃避突变体的基因的测序通常揭示那些氨基酸在抗原中对于抗体识别很重要且因此构成表位(的部分)。
自所选VH和VL编码对制备抗EGFR抗体组合物
本发明的抗体组合物可由一或数个生物反应器中的多克隆表达细胞系或其等效物产生。该方法之后可将抗EGFR抗体自反应器纯化为单一制备物而无需在处理期间分离构成抗EGFR抗体组合物的个别成员。若抗体组合物是在一个以上生物反应器中产生，则经纯化的抗EGFR抗体组合物可通过将自各生物反应器的经个别纯化上清液获得的抗体汇集获得。
产生重组抗体组合物的一种方法描述于WO2004/061104及WO2006/007850(该等参考文献是以引用的方式并入本文中)中。其中所描述的方法是基于抗体编码序列的位点特异性整合入个别宿主细胞的基因组中，从而在产生期间确保VH和VL蛋白质链保持其初始配对。此外，位点特异性整合使位置效果最小，且因此预期多克隆细胞系中的个别细胞的生长及表达特性极类似。一般而言，该方法涉及以下因素：i)具有一或多个重组酶识别位点的宿主细胞；ii)具有至少一个与宿主细胞的重组酶识别位点兼容的重组酶识别位点的表达载体；iii)通过将所选VH和VL编码对自筛选载体转移至表达载体以使得全长抗体或抗体片段可由该载体表达(若筛选载体与表达载体相同则该转移可为不必要的)来产生表达载体的集合；iv)以该表达载体集合及编码能够组合宿主细胞基因组中的重组酶识别位点与载体中的重组酶识别位点的重组酶的载体转染宿主细胞；v)自该经转染的宿主细胞获得/产生多克隆细胞系；及vi)自该多克隆细胞系表达且收集抗体组合物。
若对于一种组合物使用少数(2-3种或多于2-3种)抗体，则其可以类似于制造单克隆抗体的方式个别地表达且纯化，例如如WO2004/085474中所述。该等经纯化的抗体可在纯化后混合或包装于独立小瓶中以供在给药之前混合或用于单独给药。
较优选使用哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0或NS0细胞)、诸如NIH3T3的成纤维细胞及永生化人类细胞，诸如海拉细胞(HeLa cell)、HEK293细胞或PER.C6。然而亦可使用非哺乳动物真核或原核细胞，诸如植物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、真菌、大肠杆菌(E.coli)等。合适宿主细胞在其基因组中包含一或多个合适重组酶识别位点。宿主细胞亦应含有与整合位点操作性连接的选择模式以能够选择整合物(亦即，整合位点中具有抗EGFR Ab表达载体或表达载体片段的整合拷贝的细胞)。在基因组的预先确定的位置上具有FRT位点的细胞的制备描述于(例如)US5,677,177中。较优选宿主细胞仅具有单个整合位点，其是位于使整合物能够高度表达的位点(所谓热点(hot-spot))上。
合适表达载体包含匹配宿主细胞的重组酶识别位点的重组识别位点。较优选该重组酶识别位点与不同于关于构建宿主细胞所用的选择基因的合适选择基因连接。选择基因为此项技术中所熟知，且包括谷胺酰胺合成酶基因(glutamine synthetase，GS)、二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolatereductase gene，DHFR)及新霉素(neomycin)，其中GS或DHFR可用于所插入的VH和VL序列的基因扩增。载体亦可含有两个不同重组酶识别位点以使得抗体编码序列的重组酶介导的序列盒交换(recombinase-mediatedcassette exchange；RMCE)可选择性载体的完全整合。RMCE是描述于Langer等人2002；Schlake及Bode1994中。合适重组酶识别位点为此项技术中所熟知，且包括FRT、lox及attP/attB位点。较优选整合载体为同种型编码载体，其中恒定区(较优选包括内含子)在自筛选载体转移VH和VL编码对之前存在于载体中(或若筛选是对全长抗体执行则恒定区已存在于筛选载体中)。存在于载体中的恒定区可为全部重链恒定区(CH1至CH3或至CH4)或编码抗体的Fc部分的恒定区(CH2至CH3或至CH4)。在转移之前亦可存在轻链κ或λ恒定区。若存在，则存在的恒定区的数目的选择视所使用的筛选及转移系统而定。重链恒定区可选自同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD及IgE。较优选同种型为IgG1、IgG2和/或IgG3。此外，用于编码抗EGFR抗体的核酸的位点特异性整合的表达载体含有指导高程度表达VH和VL链中的每一者的合适启动子或等效序列。图4说明设计表达载体的一种可能方式，尽管多种其它设计为可能的。
自筛选载体转移所选VH和VL编码对可通过常规限制酶裂解及连接反应执行，以使得各表达载体分子含有一VH和VL编码对。较优选VH和VL编码对是经个别地转移，然而(若需要)其亦可能一起转移。当所有所选VH和VL编码对均转移至表达载体中时，获得表达载体的集合或文库。若需要亦可使用转移的选择性方法。若筛选载体与表达载体相同，则表达载体的文库是由筛选期间所选出的VH和VL序列对构成，该等VH和VL序列对是位于筛选/表达载体中。
将核酸序列转染至宿主细胞中的方法在此项技术中已知。为确保位点特异性整合，亦必须向宿主细胞提供合适重组酶。较优选是通过共转染编码重组酶的质粒而被实现。合适重组酶为(例如)Flp、Cre或噬菌体ΦC31整合酶，其与具有相应重组酶识别位点的宿主细胞/载体系统一起使用。宿主细胞可成批转染，此意谓在一单一反应中将表达载体的文库转染至细胞系中，由此获得多克隆细胞系。或者，可将表达载体的集合个别地转染至宿主细胞中，由此产生个别细胞系的集合(各细胞系产生具有特定特异性的抗体)。随后就位点特异性整合物对转染之后产生的细胞系(个别或多克隆)加以选择，且使其适合于生长于悬浮液及不含血清的培养基中，若该等细胞系在转染之前尚未具有该等特性。若个别地执行转染，则进一步对个别细胞系的生长特性及抗体产生进行分析。较优选选择具有类似增殖速率及抗体表达量的细胞系以供产生多克隆细胞系。随后通过以预定比率混合个别细胞系产生多克隆细胞系。一般而言，自多克隆细胞系制备多克隆主细胞库(polyclonal master cell bank；pMCB)、多克隆研究细胞库(polyclonal research cell bank；pRCB)和/或多克隆工作细胞库(polyclonalworking cell bank；pWCB)。多克隆细胞系是通过以预定比率混合个别细胞系产生。将多克隆细胞系分配至安瓿中，由此产生多克隆研究细胞库(pRCB)或多克隆主细胞库(pMCB)，多克隆工作细胞库(pWCB)可通过扩增研究或主细胞库的细胞自其产生。研究细胞库主要用于构想研究的证明，其中多克隆细胞系可能不包含与主细胞库中的多克隆细胞系一样多的个别抗体。通常，进一步扩增pMCB以制备用于生产目的的pWCB。pWCB用完之后，可扩增来自pMCB的新安瓿以制备新pWCB。
本发明的一具体实例为能够表达本发明的重组抗EGFR抗体组合物的多克隆细胞系。
本发明的另一具体实例为各个别细胞能够表达单个VH和VL编码对的多克隆细胞系，且该多克隆细胞系整体上能够表达VH和VL编码对的集合，其中各VH和VL对编码抗EGFR抗体。较优选VH和VL编码对的集合为根据本发明的方法产生的关联对。
本发明的重组抗体组合物可通过将来自pWCB的一安瓿在适当培养基中培养，以允许抗体充分表达且其中多克隆细胞系保持稳定的一段时间(窗口是介于约15日与50日之间)来制备。可使用诸如补料分批或灌注的培养法。重组抗体组合物是自培养基获得且通过常规纯化技术纯化。亲和力层析组合对于IgG的纯化通常使用与诸如离子交换层析、疏水相互作用及凝胶过滤之后续纯化步骤。纯化之后，(例如)通过离子交换层析评估多克隆抗体组合物中所有个别成员的存在。该抗体组合物的表征详细描述于WO2006/007853(以引用的方式并入本文中)中。
在重组宿主中表达抗体混合物的一替代方法描述于WO2004/009618中。该方法自单一细胞系产生具有与相同轻链接合的不同重链的抗体。若抗EGFR抗体组合物是由组合文库产生，则该方法可为适用的。
治疗组合物
本发明的另一方面为包含作为活性成份的本发明的抗EGFR抗体组合物或抗EGFR重组Fab或另一抗EGFR重组抗体片段组合物或双特异性结合分子的药物组合物。较优选该组合物的活性成份为如本发明所述的抗EGFR重组抗体组合物。该等组合物意欲用于改善和/或预防和/或治疗癌症。较优选向人类、家畜或宠物给药该药物组合物。
药物组合物进一步包含医药学上可接受的赋形剂。
抗EGFR抗体组合物或其抗体片段可以单位剂型与医药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂一起给药。可使用常规医药实践来提供合适配制物或组合物以向患有癌症的患者给药。在一较优选具体实例中，给药为治疗性的，此意谓在已诊断出癌症病状之后给药。可使用任何合适给药途径，例如，给药可为非经肠、静脉内、动脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、鼻内、气溶胶、栓剂或经口给药。举例而言，医药配制物可呈液体溶液或悬浮液的形式。对于经口给药而言，需要防止胃内降解。对于鼻内配制物而言，抗体可以粉剂、滴鼻剂或气溶胶形式给药。
本发明的药物组合物是以本身已知的方式制备，例如藉助于常规溶解、冻干、混合、造粒或调制方法。药物组合物可根据常规医药实践(参看(例如)Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版)，A.R.Gennaro编，2000,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia；PA andEncyclopedia of Pharmaceutical Technology，J.Swarbrick及J.C.Boylan编，1988-1999,Marcel Dekker,New York,NY中)调配。
较优选使用活性成份的溶液或悬浮液，且尤其等渗水性溶液或悬浮液来制备本发明的药物组合物。在仅包含活性成份或包含活性成份以及载剂(例如甘露糖醇)的冻干组合物的情况下，若可能，则可在使用之前制备该等溶液或悬浮液。药物组合物可经灭菌和/或可包含赋形剂，例如防腐剂、稳定剂、湿润和/或乳化剂、增溶剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲剂，且以本身已知的方式制备，例如藉助于常规溶解或冻干方法。该等溶液或悬浮液可包含粘度增加物质，诸如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮或明胶。
注射组合物是以惯用方式在无菌条件下制备；该等无菌条件亦应用于将组合物引入安瓿或小瓶中及密封容器。
药物组合物包含约1％至约95％，较优选约20％至约90％的活性成份。本发明的药物组合物可(例如)为单位剂型，诸如为安瓿、小瓶、栓剂、片剂、丸剂或胶囊的形式。配制物可以治疗或预防有效量(例如预防、去除或降低病理学病状的量)向人类个体给药以提供对于疾病或病状的治疗。欲给药的治疗剂的较优选剂量可能视以下变量而定：诸如癌症的严重程度、特定患者的总体健康状况、化合物赋形剂的配制物及其给药途径。
本发明的组合物的治疗性用途
本发明的药物组合物可用于治疗或改善哺乳动物中的疾病。可以本发明的药物组合物治疗或预防的病状，包括预防及治疗患者癌症，其较优选可以本发明的药物组合物进行治疗性治疗。
本发明的一具体实例为预防、治疗或改善哺乳动物中一或多种与癌症有关的症状的方法，其包含向该哺乳动物给药有效量的本发明的抗EGFR重组抗体组合物。
本发明的另一具体实例为本发明的抗EGFR重组抗体组合物的用途，其是用于制备供治疗、改善或预防哺乳动物中的一或多种与癌症有关的症状用的组合物。
较优选上述具体实例中的哺乳动物为人类、家畜或宠物。
已指示本发明的抗体可用于治疗某些实体瘤。基于包括EGFR表达量的多种因素，以下肿瘤类型似乎为较优选适应症：乳癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、头颈癌及非小细胞肺癌。就该等适应症中的每一者而言，三种临床路径似乎提供临床成功的与众不同的可能性：
辅助治疗：在辅助治疗中，患者将以与化疗剂或抗肿瘤剂和/或放射治疗组合的本发明的抗体治疗。上列初级目标(primary target)将以向标准第一及第二线治疗添加本发明的抗体的方案加以治疗。方案设计将着手解决由肿瘤块减小以及降低标准化学疗法常用剂量的能力评估的有效性。该等剂量减少由于降低化疗剂的剂量相关毒性而使得可进行额外和/或延长的治疗。先前技术的抗EGFR抗体已与或正与以下化疗剂或抗肿瘤剂组合用于若干辅助临床试验中：阿德力霉素(adriamycin)(艾比特思：晚期前列腺癌)、顺铂(cisplatin)(艾比特思：晚期头颈癌及肺癌)、紫杉醇(taxol)(艾比特思：乳癌)及阿霉素(doxorubicin)(艾比特思)。
本发明提供医药制品，其包含呈组合形式用于在癌症治疗中同时、单独或依次给药的本发明的抗体组合物及至少一种能够诱导癌细胞分化的化合物。通过将本发明的抗体组合物与已知诱导癌细胞终末分化的药剂组合可进一步改良其效果。
该至少一种化合物可选自由以下各物组成的组：视黄酸、反式视黄酸、顺视黄酸、苯基丁酸盐/酯、神经生长因子、二甲亚砜、活性形式的维生素D(3)、过氧化体增殖物活化受体γ、12-O-四癸酰基佛波醇13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol13-acetate)、六亚甲基-双-乙酰胺(hexamethylene-bis-acetamide)、转化生长因子-β、丁酸、环状AMP及维司力农(vesnarinone)。较优选该化合物是选自由以下各物组成的组：视黄酸、苯丁酸盐/酯、所有反式视黄酸、活性形式的维生素D。
包含本发明的抗体组合物及至少一种化疗或抗肿瘤化合物的医药制品可以供同时、单独或依次给药的组合形式用于癌症治疗中。该化疗化合物可选自由以下各物组成的组：阿德力霉素、顺铂、紫杉醇、阿霉素、拓朴替康(topotecan)、氟嘧啶、奥赛力铂及伊立替康。
单一疗法：就本发明的抗体在肿瘤的单一疗法中的用途而言，可在无化疗剂或抗肿瘤剂的情况下向患者给药该等抗体。经由使用本发明的抗体产生且在本文中讨论的临床前结果已显示作为独立治疗的阳性结果。
成像剂：经由使放射性核素(例如钇(90Y))与本发明的抗体结合，预期本发明的经放射性标记的抗体可用作诊断、成像剂。在该作用中，本发明的抗体将定位至实体瘤以及表达EGFR的细胞的转移性病变。就本发明的抗体作为成像剂的用途而言，该等抗体可在实体瘤的辅助外科治疗中用作手术前筛选以及手术后跟踪以确定哪些肿瘤残余和/或复发。(111In)-艾比特思抗体已在具有不可切除鳞状细胞肺癌瘤的患者的I期人类临床试验中用作成像剂。(Divgi等人,J.Natl.Cancer Inst.83:97-104(1991))。以标准前部及后部γ照相机跟踪患者。初步数据表明鉴别出所有原发性病变及大型转移性病变，而仅检测出一半小型转移性病变(小于1cm)。
酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，TKI)为主要衍生自喹唑啉的合成低分子量分子，其与受体的细胞内酪氨酸激酶域相互作用且通过竞争细胞内Mg-ATP结合位点抑制配体诱导的受体磷酸化。临床发展中若干TKI靶向EGFR，该等TKI包括吉非替尼(Gefitinib)(易瑞沙(Iressa)，ZD1839)、埃罗替尼(Erlotinib)(它赛瓦(Tarceva)，OSI-774)、拉帕替尼(Lapatinib)(泰克布(Tykerb)，GW572016)、卡纽替尼(Canertinib)(CI-1033)、EKB-569及PKI-166。TKI与抗EGFR的组合治疗已展示在体内与体外针对EGFR依赖性癌细胞均为有利的。包含本发明的抗体组合物及至少一种靶向EGFR的TKI的医药制品可以供同时、单独或依次给药的组合形式用于癌症治疗中。其它小分子抑制剂包括：索拉菲尼(Sorafinib)(raf及多种RTK)、舒尼替尼(Sunitinib)(多种RTK)、替罗莫司(Temsirolimus)(mTOR)、RAD001(mTOR)及AZD217(VEGFR2)。
在其它具体实例中，本发明的抗体组合物是与其它抗体治疗剂组合使用。该等抗体治疗剂的实例包括(例如)针对HER2的抗体(赫赛汀，Herceptin)及针对VEGF的抗体(阿瓦斯丁，avastin)。在其它具体实例中，本发明的抗体组合物是与已知刺激免疫系统的细胞的药剂组合使用，该组合治疗使得本发明的抗体组合物的功效的免疫介导增强提高。该等免疫刺激剂的实例包括(但不限于)重组白细胞介素(例如IL-21及IL-2)。
给药的剂量及途径
虽然本发明的抗体的特定剂量尚未确定，但某些剂量考虑因素可经由与已批准的类似产品(ImClone C225(艾比特思))相比较加以确定。C225抗体通常以在5mg/m2至400mg/m2范围内的剂量给药，其中较低剂量仅就安全性研究而言使用。因此，预期在患者中本发明抗体的剂量可在该范围内或更低，或许在50mg/m2至300mg/m2范围内，且仍然有效。与按mg/kg的常规剂量量度不同，呈mg/m2形式的剂量为基于表面积的量度且为经设计以包括自婴儿至成人的所有体型的患者的便利剂量量度。
可用于艾比特思(西妥昔单抗)的处方信息包括初始120分钟静脉内输液400mg/m2，继而每周60min输液250mg/m2。该等剂量推荐用于独立治疗以及与放射疗法的组合。对于维克替比(盘尼图单抗)而言，推荐剂量为每14日60分钟内给药6mg/kg。
Genmab的HuMaxEGFr抗体(佐姆单抗，zumutumumab)的预期临床剂量为8mg/kg HuMax-EGFr的初始剂量，继而每周输入维持剂量直至疾病进展。维持剂量应视需要进行调整直至患者产生剂量限制皮疹，至多为16mg/kg HuMax-EGFr的最大剂量(关键第III期研究(pivotal Phase III study)的剂量，可由Genmab的产品说明获得)。
如使用现今临床所用的单克隆抗EGFR抗体(艾比特思及维克替比)所观察到，本发明的抗体组合物的临床剂量可能受皮疹程度限制。猕猴的六周毒物学研究的资料展示，当本发明的抗体组合物以等效于以临床中所用的单克隆抗体中的一种治疗所使用的剂量给药时无皮疹病征(实施例20)。因此，本发明的抗体组合物可静脉内给药且每周给药250mg/m2(对于体表面积为1.8m2且体重为60kg的人类而言，转化为7.5mg/kg)。此外，可给予400mg/m2(对于体表面积为1.8m2且体重为60kg至人类而言，转化为12mg/kg)的初始负荷剂量，随后为后续每周给药。
预期三种有区别的传送方法适用于传送本发明的抗体。常规静脉内传送大概为大多数肿瘤的标准传送技术。然而，就腹膜腔中的肿瘤而言，诸如卵巢、胆管、其它管道及其类似物的肿瘤，腹膜内给药可证实有利于在肿瘤处获得高剂量的抗体且使抗体清除率最小。以类似方式，某些实体瘤具有适合于区域灌注的血管结构。区域灌注将使得肿瘤位点处可获得高剂量的抗体且使抗体的短期清除率最小。
如同任何基于蛋白质或抗体输液的治疗一般，安全性考虑主要关于(i)细胞激素释放症候群，亦即低血压、发烧、颤抖、寒颤，(ii)对物质的免疫原性反应的产生(亦即，患者产生针对治疗抗体的人类抗体，或HAHA或HACA反应)，及(iii)对表达EGF受体的正常细胞(例如表达EGFR的肝细胞)的毒性。标准测试及跟踪将用于监测该等安全性考虑中的每一者。详言的，将在临床追踪期间时常监测肝功能以评估对肝的损害(若存在)。
诊断用途
本发明的另一具体实例是针对诊断试剂盒。本发明的试剂盒包含根据本发明制备的抗EGFR抗体组合物，其蛋白质可以与可检测的标记进行标记或不经标记用于非标记检测。该试剂盒可用于鉴别患有与EGFR的过度表达有关的癌症的个体。
实施例
实施例1抗EGFR抗体的克隆
免疫
除EGFR过度表达细胞之外，亦通过注射不同经纯化蛋白质将雌性BALB/c品系(strain)A或C57B16小鼠(8-10周龄)用于免疫。
对于某些免疫使用市售EGFR蛋白质(R&D系统目录号1095-ER或Sigma#E3641)。对于其它免疫而言，使用以融合蛋白质形式产生的重组人类EGFR及EGFRvIII，其由EGFR或EGFRvIII的ECD与人类生长激素(hGH)组成，除实施例10b中所述的His-标签之外，亦包括烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus；TEV)-裂解位点。在某些情况下，通过TEV蛋白酶裂解且随后经镍管柱纯化来分离EGFR的ECD。
将每个细胞表达约107个受体的人类头颈癌细胞系HN5(Easty DM,Easty GC,Carter RL,Monaghan P,Butler LJ.Br J Cancer，1981年6月；43(6):772-85.Ten human carcinoma cell lines derived from squamouscarcinomas of the head and neck)用于基于细胞的免疫。将细胞在补充有10％FBS(胎牛血清)、3mM甘油、5mM丙酮酸钠及1％青霉素链霉素的DMEM培养基中培养。在各免疫之前，将细胞在PBS中洗涤，以TrypLE胰蛋白酶化且再悬浮于生长培养基中。随后将细胞悬浮液通过以250×g离心5min，移出且再悬浮于15ml无菌PBS中在PBS中洗涤两次。
将细胞或抗原以PBS稀释且随后以传氏佐剂(Freund's Adjuvant)1:1混合。佐剂是用于增强且调节免疫反应。对于第一次免疫使用完全传氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant；CFA)而对于后续免疫使用不完全传氏佐剂(Incomplete Freund's Adjuvant；IFA)。IFA为包含矿物油的水包油乳液，且CFA为添加有经热杀死、干燥的分枝杆菌(Mycobacterium)物种的IFA。两种佐剂均具有储积效果。CFA使免疫反应长期持久且用于第一次免疫以增强免疫反应，且IFA是用于后续免疫。该等乳液是通过在具有水的玻璃表面上添加一液滴进行测试。若该液滴保持为一液滴，则该乳液为稳定的且可执行注射。向小鼠仅给药稳定乳液。
视时程(参见表2)而定，对于各次注射使用25-100μg抗原或107个细胞。总计小鼠接受4次注射。所有小鼠均以300μl或200μl乳液注射。视时程而定，执行皮下(s.c)、腹膜内(i.p)或静脉内(i.v)注射。
结束时，将小鼠通过颈部错位处死(cervical dislocation)，且将脾脏移出且转移至74μm细胞滤网(Corning#136350-3479)中。将细胞经由过滤器分离(macerate)，再悬浮于具有10％FBS的冷RPMI1640中且以300×g离心5分钟。将细胞团粒再悬浮于具有1％FBS的RPMI1640中，经由50μm注射过滤器(BD#340603)过滤且通过离心收集。将细胞团粒再悬浮于具有10％DMSO的FCS中，随后低温保存，且将冷冻的细胞储存在-80℃下直至FACS分选。
鼠类浆细胞的FACS分选
将具有冷冻脾细胞的小瓶在37℃下解冻且在冰仍存在的情况下转移至15ml管中。涡旋的同时将10ml冰冷RPMI、10％FBS(胎牛血清)逐滴添加至管中。在10ml FACS PBS中洗涤一次之后，添加5ml FCS PBS，随后经由50μm Filcon过滤细胞。随后使细胞成团且再悬浮于1ml(最终体积)具有2％FBS的PBS中，且根据特定稀释度以抗CD43-FITC及抗CD138-PE染色至最终浓度为约5μg/ml。将细胞在4℃下在黑暗中培育20min。随后，以2ml FACS缓冲液将细胞洗涤2次。添加达15ml的FACS PBS。以1:100添加碘化丙啶(PI)(1份PI比100份FACS PBS缓冲液)，且随后将细胞分选至含有PCR反应缓冲液(参见下文)的96孔PCR板中，且以400×g离心(spin down)2min，随后将板于-80℃下冷冻。如图1所示，将浆细胞以CD43-阳性/CD-138阳性的门被圈选(gated)。
关联VH和VL对的连接
对被门圈选为浆细胞的单细胞执行VH和VL编码序列的连接，此有利于VH和VL编码序列的同源配对。该程序使用基于一步多重重叠延伸RT-PCR继而嵌套式PCR的两步PCR程序。本发明的实施例中所用的引物混合物仅扩增κ轻链。然而，若需要，则可将能够扩增λ轻链的引物添加至多重引物混合物及嵌套式PCR引物混合物中。若添加λ引物，则分选程序应进行调适以使λ阳性细胞不被排除。关联VH和VL序列连接的原理是于图2中说明。
将所制备的96孔PCR板解冻且所分选的细胞充当用于多重重叠延伸RT-PCR的模板。在单细胞分选之前添加至各孔中的分选缓冲液含有反应缓冲液(一步骤RT-PCR缓冲液；Qiagen)、RT-PCR的引物(参见表3)及RNase抑制剂(RNasin，Promega)。其中有一步骤补充RT-PCR酶混合物(25倍稀释液；Qiagen)及dNTP混合物(各200μM)以在20μl反应体积中获得给定最终浓度。将板在55℃下培育30分钟以允许自各细胞反转录RNA。RT之后，使板经受以下PCR循环：94℃下10min，35×(94℃下40sec，60℃下40sec，72℃下5min)，72℃下10min。
在具有利于高通量处理的用于24个96孔板的可剥离密封框(Peel SealBasket)的H20BIT热循环器(ABgene)中执行PCR反应。循环之后，将PCR板储存在-20℃下。
对于嵌套式PCR步骤而言，制备96孔PCR板，其中在各孔(20μl反应液)中具有以下混合物以获得给定最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、嵌套式引物混合物(参见表4)、Phusion DNA聚合酶(0.08U；Finnzymes)及FastStart高保真酶掺合物(0.8U；Roche)。自多重重叠延伸PCR反应液转移1μl作为嵌套式PCR的模板。使嵌套式PCR板经受以下热循环：35×(95℃下30sec，60℃下30sec，72℃下90sec)，72℃下10min。
以1％琼脂糖凝胶分析随机选择的反应液以证实具有约890个碱基对(bp)的重叠延伸片段的存在。
将板储存在-20℃下直至进一步加工该等PCR片段。
将来自嵌套式PCR的已连接VH和VL编码对的全套在不将来自不同供体的对混合的情况下汇集，且通过制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化。人类κ恒定轻链编码序列是通过重叠延伸至已连接VH和VL编码对的汇集PCR产物的VL编码区加以拼接(图3)。在含有以下各物的反应中自含有具有κ轻链的人类抗体的编码序列的质粒扩增人类κ恒定轻链编码序列：Phusion酶(2U；Finnzymes)、1×Phusion缓冲液、dNTP混合物(各200μM)、hKCforw-v2引物及κ3'引物(表5)及质粒模板pLL138(10ng/μl)，总体积为50μl。使反应经受以下热循环：25×(95℃下30sec，55℃下30sec，72℃下45sec)，72℃下10min。将所得PCR片段通过制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化。
通过后续以含有以下各物的重叠延伸PCR(总体积为50μl)的拼接使各全套的经纯化汇集的PCR片段与经扩增且纯化的人类κ恒定编码区(附录2)的PCR片段拼接：人类κ恒定编码区片段(1.4ng/μl)、经纯化汇集的PCR片段(1.4ng/μl)、Phusion DNA聚合酶(0.5U；Finnzymes)及FastStart高保真酶掺合物(0.2U；Roche)、1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、mhKCrev引物及mJH组引物(参见表5)。使反应液经受以下热循环：95℃下2min、25×(95℃下30sec，55℃下30sec，72℃下1min)，72℃下10min。将所得PCR片段(约1070个bp)通过制备型1％琼脂糖凝胶电泳纯化。
将关联VH和VL编码对插入筛选载体中
为鉴别具有针对EGFR的结合特异性的抗体，将所获得的VH和VL编码序列表达为全长抗体。此包括将VH和VL编码对的全套插入表达载体中且转染至宿主细胞中。
使用两步克隆程序来产生含有已连接VH和VL编码对的表达载体的全套。在统计学上，若表达载体的全套所含重组质粒多达用于产生筛选载体全套的同源配对VH和VL PCR产物的数目的十倍，则存在99％的可能性所有独有基因对均得以呈现。因此，若获得400个重叠延伸V基因片段，则产生至少4000个克隆的全套用于筛选。
简言的，已连接VH和VL编码对的全套的拼接至人类κ恒定编码区的经纯化PCR产物，在引入PCR产物末端的识别位点处以XhoI及NotI DNA核酸内切酶裂解。将经裂解且纯化的片段通过标准连接程序连接至经XhoI/NotI消化的哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002(图4)中。将连接混合物电穿孔至大肠杆菌中且添加至含有适当抗生素的2×YT板中，且在37℃下隔夜培育。使用标准DNA纯化法(Qiagen)将经扩增的载体全套自板中所回收的细胞纯化。通过使用AscI及NheI核酸内切酶裂解制备质粒以供插入启动子-前导区片段。该等酶的限制性位点是位于VH与VL编码基因对之间。载体纯化之后，通过标准连接程序将经AscI-NheI消化的双向哺乳动物启动子-前导区片段插入AscI及NheI限制性位点中。将已连接的载体在大肠杆菌中扩增且将质粒使用标准方法纯化。将所产生的筛选载体全套通过常规程序转型至大肠杆菌中。将所获得的菌落固定于384孔母板中且储存。所列菌落的数目超过所引入PCR产物的数目至少3倍，因此产生95％的可能性所获得的所有独有V基因对均存在。
就与EGFR胞外域的结合加以筛选
一般而言，以两步程序进行筛选。在ELISA中对抗体文库就重组EGFR蛋白质的反应性进行筛选，之后将FMAT(FLISA)用作基于细胞的方法，使用NR6wtEGFR细胞系，以检测EGFR-抗体与细胞表面表达的EGFR的结合。对于101及108/109文库(表2)，使用代表EGFR胞外域的重组EGFR执行ELISA。
对于ELISA，简言的，将Nunc maxisorb板(目录号464718)在4℃下以于PBS中稀释的1μg/ml蛋白质(内部产生)涂布隔夜。在以50μl2％-牛奶-PBS-T阻断之前将板以PBS+0.05％Tween20(PBS-T)洗涤一次。将板以PBS-T洗涤一次，添加20μl2％-牛奶-PBS-T及5μl FreeStyle CHO-S转染子(参见下文)上清液，且在R.T下培育1.5小时，之后，将板以每孔20μl PBS-T洗涤一次。添加以2％牛奶-PBS-T稀释至1:10000的二级抗体(HRP-山羊-抗人类IgG，Jackson，目录号109-035-097)以检测与孔结合的抗体且在室温下培育1小时。将板在PBS-T中洗涤一次，随后添加25μl基质(Kem-en-tec Diagnostics，目录号4390)，将其培育5min。培育之后添加25μl1M硫酸以终止反应。以ELISA读取器在450nm下检测特定信号。
对于基于细胞的FMAT检测抗EGFR抗体，在所述生长培养基中培养SKBR-3(ATCC#HTB-30)或NR6wtEGFR(Welsh等人，1991,J Cell Biol,114,3,533-543)细胞。对细胞进行计数且以稀释至1:40,000的复合Alexa-647的山羊-抗人类IgG(H-L)抗体(分子探针第A21445号，批号34686A)稀释至每毫升125,000个细胞。将总共20μl该悬浮液转移至384孔透明底Nunc板中。随后将10μl转染上清液添加至细胞中。6-10小时培育之后，测量反应液的FMAT信号。
筛选资料表明，在ELISA中总克隆中的221个(4.8％)为阳性。在FMAT中该等克隆中的93(2.0％)个亦为阳性。在FMAT中该等克隆中的总共220个(4.8％)为阳性，且其中127(220-93)个仅对于细胞表面抗原为阳性。以类似方式筛选111文库，但由于该免疫程序使得产生对于缺失突变EGFR受体EGFRvIII具有特异性的抗体，故ELISA筛选包括检测野生型EGFR与EGFRvIII的鉴定。在ELISA中鉴别出七个克隆对于EGFRvIII具有特异性，且有趣的是，在FMAT中，该等克隆对于wtEGFR表达细胞的染色为阴性。在FMAT及ELISA中鉴别出13个克隆对于wtEGFR为阳性，但对于EGFRvIII不为阳性，与101及108/109文库相比此为该文库所独有。所有ELISA阳性克隆经选择用于进一步分析。
序列分析及克隆选择
自初始母板(384孔形式)回收在ELISA中鉴别为EGFR特异性的克隆且固定至新板中。自该等克隆分离DNA，且提交用于V基因的DNA测序。将该等序列进行比对且选择所有独有克隆。所得序列的多重比对揭示各特定克隆的独有性且使得可鉴别独有抗体。根据220个克隆的序列分析，鉴别出70个遗传上有区别的抗体序列群。相关序列的各群可能是经由通用前体克隆的体细胞超突变衍生出。总体上，选择各群中的一至两个克隆用于验证序列及特异性。所选抗体可变序列的序列是显示于附录1中。核苷酸序列包括两端的限制性位点。因此，根据IMGT定义(Lefranc等人，(2003)IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains.Dev.Comp Immunol27,55-77)，相应翻译的氨基酸序列(使用DNA序列的第三阅读框架)在N末端包括并不形成VH和VL序列的部分的两个氨基酸。全部展示的VL序列包括相同人类κ恒定区，其以氨基酸-TVAAP-起始，且在C末端以-NRGEC结束。出于本发明的目的，术语VL序列当指特异性抗体时不包括κ恒定区及两个N末端氨基酸(LA-)。术语VH序列当指特异性抗体时不包括两个N末端氨基酸(RA-)。
序列及特异性验证
为验证编码抗体的克隆，制备DNA质粒且以2ml的规模执行FreeStyleCHO-S细胞(Invitrogen)的转染以供表达。转染之后96小时收集上清液。以标准抗IgG ELISA估算表达量，且通过EGFR及EGFRvIII特异性ELISA测定特异性。该等克隆中的85％证明具有正确的特异性及序列。
抗增殖效果的筛选
细胞损伤将不可避免地导致细胞保持及提供用于代谢性细胞功能及生长的能量的能力的丧失。代谢活性鉴定是基于该前提。通常其测量线粒体活性。细胞增殖试剂WST-1(Roche目录号11644807001)为测量活细胞代谢活性的即用基质。随后假定代谢活性与活细胞数目有关。在该实施例中，使用WST-1鉴定来测量以含有不同抗EGFR抗体的细胞培养物上清液处理之后代谢活性细胞的数目。
在执行WST-1鉴定之前，将2ml上清液中的不同体积(0、10、25、50及150μl)转移至96孔板的适当孔中。
随后将HN5细胞以1×PBS洗涤且通过以3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化剥离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。将上清液移除且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％FBS中。对细胞进行计数且调整其浓度，且将1500个细胞添加至具有上清液的孔中以便各孔总共含有200μl培养基。将板在调湿恒温箱中在37℃下培育4日。随后每孔添加20μl WST-1试剂且将板在37℃下培育一小时。随后将板转移至回转式盘震荡器(orbital plate shaker)中且再留置一小时。以ELISA读取器测量450及620nm(参考波长)下的吸光率。代谢活性细胞(metabolicallyactive cells，MAC)含量的差值如下计算为对照组上清液的百分比：
随后将该等值用作使用免费软件Cluster及TreeView，以执行的受控阶层群分析(基于在ELISA中的反应性加以分群)的基础。
较优选能够在抗体选择性过程的早期筛选功能性抗体。在使用于0.5％FBS中的HN5细胞执行的增殖鉴定中使用83个2ml转染的培养上清液来就生长抑制功能进行筛选。结果通过简单的阶层群分析观测。如群分析(图5)中可见，发现多种上清液以浓度依赖性方式减少代谢活性HN5细胞的数目(深灰色)(群2)。类似地，一些上清液以浓度依赖性方式增加代谢活性HN5细胞的数目(淡灰色)(群1、3及4)。有趣的观察结果为降低代谢活性HN5细胞数目的上清液具有反应性2(黑色箭头)，而增加代谢活性HN5细胞数目的上清液具有反应性1(灰色箭头)。具有反应性2的上清液在wtEGFR与EGFRvIII ELISA中均为阳性，而具有反应性1的上清液仅对wtEGFR具有反应性。因此，该等分析可提供ELISA中的抗体反应性与细胞鉴定中的功能性之间的联系。
克隆修复
当使用多重PCR方法时，由于引物简并性及高度同源性，预期存在某种程度的V基因家族内及V基因家族间交叉启动。交叉启动引入免疫球蛋白框架中并非天然存在的氨基酸以及若干潜在后果，例如结构变化及免疫原性增加，所有均导致治疗活性降低。
为消除该等缺陷且确保所选克隆反映天然体液免疫反应，该等交叉启动突变是在称为克隆修复的过程中进行校正。
在克隆修复程序的第一步骤中，将VH序列以含有对应于相关克隆所来源的VH基因的序列的引物组进行PCR扩增，由此校正由交叉启动引入的任何突变。将该PCR片段以XhoI及AscI消化，且使用常规连接程序连接回经XhoI/AscI消化的哺乳动物表达载体(图4)中。将连接的载体在大肠杆菌中扩增且将质粒通过标准方法纯化。将该VH序列进行测序以证实校正，且将载体以NheI/NotI消化以使其经制备以供插入轻链。
在第二步骤中，将完整轻链以含有对应于相关克隆所来源的VL基因的序列的引物组进行PCR扩增，由此校正由交叉启动引入的任何突变。将该PCR片段以NheI/NotI消化且连接至以上所制备的含有VH的载体中。将连接产物在大肠杆菌中扩增且将质粒通过标准方法纯化。随后，经轻链进行测序以证实校正。
在所选克隆的κ恒定区含有基因扩增期间引入的突变的情况下，将该κ恒定区替换为未突变恒定区。此以重叠PCR进行，其中将经修复的VL基因(在无恒定区的情况下扩增)与具有正确序列的恒定区(以独立PCR获得)融合。将整个序列进行扩增且克隆至上述含有VH的载体中，且将经修复的轻链进行测序以证实校正。
表2用于产生抗EGFR克隆的起始物质的免疫时程
表3RT-PCR多重重叠延伸引物混合物
W＝A/T、R＝A/G、S＝G/C、Y＝C/T、K＝G/T、M＝A/C、H＝ACT、B＝GCT；Conc.-最终浓度。
表4嵌套式引物组
K＝G/T、M＝A/C,D＝AGT；Conc.-最终浓度。
表5κ恒定拼接引物组
实施例2哺乳动物产生抗EGFR抗体
对于抗EGFR抗体的暂时表达使用FreeStyle MAX CHO表达系统(Invitrogen)。抗体是以200-2000ml的体积表达。
在转染之前约24小时，将CHO-S细胞进行继代以达到每毫升0.5×106个细胞的细胞浓度。将质粒(每毫升细胞培养基1.25μg)稀释于OptiPro无血清培养基中且与供货商推荐的FreeStyle MAX转染试剂的溶液混合。将转染试剂转移至细胞培养物中且6日后收集上清液。
使用亲和力层析步骤，使用用于纯化IgG1分子的蛋白质A-琼脂糖管柱(MabSelect Sure，GE Health Care)将所表达的抗体自培养物上清液纯化。使用0.1M甘氨酸(2.7)将抗体自管柱洗脱。汇集通过在280nm下测量吸光率确定的含有抗体的级分且以5mM乙酸钠、150mM NaCl(pH5)渗析。通过LAL鉴定就内毒素的存在测试经纯化的抗体样品。
实施例3表位特异性的确定
与参考抗体的竞争ELISA
通过使用如公开于(J.R.Cochran等人，JIM2004:287；147-158)中的与EGFR的已知域结合的参考抗体，开发出竞争ELISA，其可通过与对于抗EGFR抗体的人类Fc区具有特异性且不对小鼠或大鼠IgG Fc展现交叉反应性的二级试剂一起培育辨别抗EGFR抗体的结合表位。该ELISA是自公开于Ditzel等人，1995,The Journal of Immunology，第154卷，第2期，893-906中的描述改造而来。
通过将全长EGFR受体抗原以PBS稀释至0.5μg/ml；且在4℃下每个ELISA孔涂布50μl隔夜来执行表位阻断ELISA。次日早晨将孔以PBS-T洗涤两次且在室温下以PBS-T-1％BSA阻断一小时，继而在PBS-T中洗涤两次。随后将25μl鼠类或大鼠参考mAb以先前实验中已知的稀释度添加至独立ELISA孔中以产生200倍最大抗原结合。15min之后，将25μl抗EGFR抗体以2μg/ml的浓度添加至以参考抗体预培育的孔或含有25μl PBS的孔中。混合之后此产生1μg/ml抗EGFR抗体的最终浓度及参考抗体的100倍最大抗原结合。将抗体在室温下培育45min，之后将孔以PBS-T洗涤四次。将二级山羊-抗人类IgG HRP偶联物稀释至1:3000，且添加50μl至各孔中，继而在室温下培育30min。最终，将孔以PBS-T洗涤四次，且通过每孔添加50μl TMB使板显色且在620nm下每5-15-30min进行读取。抑制程度是由下式计算：％抑制＝(1-(OD竞争/OD无竞争(PBS)))×100。
ELISA试剂：
1)涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号：20012-019
2)抗原：自A431细胞纯化的野生型全长EGFR；Sigma E3641
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404
4)阻断/稀释缓冲液：PBS-T中的1％BSA(PBS-T-1％BSA)
5)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％Tween20(PBS-T)
6)阳性对照：艾比特思(Merck KGaA,64271Darmstadt,Germany,目录号：018964；西妥昔单抗)、维克替比(Amgen Inc,One Amgen Center Drive,Thousand Oaks CA91320-1799,USA,目录号241400；盘尼图单抗)
7)参考抗体：
·ICR10(大鼠)，Abcam，Ab231
·199.12(鼠类)，Lab Vision Ab-11，MS-396-PABX
·EGFR.1(鼠类)，Lab Vision Ab-3，MS-311-PABX
·H11(鼠类)，Lab Vision Ab-5，MS-316-PABX
·B1D8(鼠类)，Lab Vision Ab-16，MS-666-PABX
·111.6(鼠类)，Lab Vision Ab-10，MS-378-PABX
·225(鼠类)，Lab Vision Ab-2，MS-269-PABX
·528(鼠类)，Lab Vision Ab-1，MS-268-PABX
8)山羊-抗人类IgG HRP偶联物；Serotec,Star106P
9)TMB Plus；KemEnTec，目录号4390L
10)1M H2SO4
竞争ELISA的结果显示于图6中。ELISA竞争鉴定是用于根据所用针对EGFR胞外域产生的参考抗体的域特异性将抗EGFR抗体上清液分级。认为50-100％的抑制值为结合抗原上的重叠表位或密切接近表位的抗体对之间的显著竞争的指示，而低于50％的抑制值表明由该等抗体对识别的表位不密切接近，使得空间障碍降低。发现抗EGFR抗体结合包括域I、II及III的EGFR ECD上的多个表位。对于一些抗体而言，该分析不能辨别特异性mAb是否针对域I或域II。该等特异性为经标记的域I/II。此外，一些抗体似乎结合不能在所用的竞争ELISA中进一步推断出的独有表位(例如克隆1229及1320，图6)。有可能该等抗体中的一些是针对域IV，对于该域我们无任何参考抗体反应性。有趣的是，域III抗体基于由针对该域的测试鼠类参考抗体获得的不同竞争模式可进一步分成四个子群。组I仅由mAb992组成，发现该mAb992与参考抗体Ab1及Ab2竞争结合。组II由mAb1024及1042组成，二者均来源于相同Ig重排且因此在DNA及氨基酸层面上展示极密切的序列同源性。发现该等两种抗体仅与Ab2竞争结合。组III由mAb1030、1208及1277组成，其与参考抗体Ab1、Ab5及Ab10竞争结合。最后，组IV由mAb1254组成，其与所有所用的域III参考抗体Ab1、Ab2、Ab5及Ab10竞争结合。
使用表面电浆共振技术对有区别的表位进行与参考或同物种抗体的竞争分析
在含有四个流动单元的Biacore3000机器上执行SPR分析。根据制造商的说明，将CM5Biacore芯片与10,000共振单位(Ru)多克隆抗His抗体接合至流动单元1-4中。使用5μl/min的流速，以20μg/ml的浓度注入15μl6×His EGFR ECD，且使其捕获于已接合有抗His多克隆抗体的全部四个流动单元上。在参考实验期间，在抗原注射之后即刻在各流动单元中建立抗EGFR mAb的无竞争的最大结合。简言的，经具有所捕获的EGFR的全部流动单元以40μg/ml浓度注入5μl抗体，继而以低pH值的酸性洗涤液洗去抗体/抗原复合物(与10mM甘氨酸-HCl(pH2)接触10秒的时间)。测定抗EGFR抗体与各流动单元的最大结合之后，在相同Biacore循环中执行竞争实验。首先将流动单元以EGFR ECD抗原饱和，继而将不同参考抗体或抗EGFR抗体注入使用与上述相同的抗原饱和条件的独立流动单元中。该步骤立即继之以经以EGFR抗原及竞争抗体饱和的流动单元第二次注入抗EGFR抗体以使抗原或阻断抗体的解离最小。随后以低pH值的酸性洗涤液洗去抗体/抗原复合物(与10mM甘氨酸-HCl(pH2)接触10秒的时间)且以新的抗EGFR抗体重复整个以参考实验开始的循环。通过引入在注入各样品前后两秒所记录的报导点比较个别抗EGFR抗体竞争前后的Ru最大值来测定所测试的抗EGFR抗体的抑制程度。一Biacore循环的实施例是显示于图7中。
试剂：
1.CM5芯片；Biacore，目录号BR-1000-14
2.NHS；Biacore BR-1000-50
3.EDC；Biacore BR-1000-50
4.10mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)；Biacore，目录号BR-1003-50
5.Tetra-His抗体(不含BSA)；Qiagen，目录号34670
6.乙醇胺，1.0M，pH8.5；Biacore BR-1000-50
7.10×HBS-EP电泳缓冲液：0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.005％v/v界面活性剂P20
8.抗原：具有6×His的内部产生的重组人类EGFR胞外域。
9.10mM甘氨酸HCl(pH2.0)
10.参考抗体：
·ICR10(大鼠)，Abcam，Ab231
·199.12(鼠类)，Lab Vision Ab-11，MS-396-PABX
·EGFR.1(鼠类)，Lab Vision Ab-3，MS-311-PABX
·H11(鼠类)，Lab Vision Ab-5，MS-316-PABX
·B1D8(鼠类)，Lab Vision Ab-16，MS-666-PABX
·111.6(鼠类)，Lab Vision Ab-10，MS-378-PABX
·225(鼠类)，Lab Vision Ab-2，MS-269-PABX
·528(鼠类)，Lab Vision Ab-1，MS-268-PABX
为证实竞争ELISA中所获得的表位分析且为通过同物种抗EGFR抗体对之间的竞争执行进一步表位分析，建立基于由表面电浆共振实时测量的抗体结合的竞争鉴定。针对参考抗体组测试的抗EGFR克隆所获得的表位定位是显示于下图8中。认为50-100％的抑制值为结合抗原上的重叠表位或密切接近表位的抗体对之间显著竞争的指示，而低于50％的抑制值表明由该等抗体对识别的表位不密切接近，使得空间障碍降低。低于25％的抑制值不包括于重叠表位的分析中，因为认为其代表不明显的抑制。发现除1320以外的所有所测试的抗体均与一或多种所用参考抗体竞争，表明1320针对未知表位，对于该表位我们无任何参考抗体反应性。全人类或人源化抗体维克替比及艾比特思是包括于该分析中且发现其结合重叠表位。自竞争ELISA及竞争SPR分析获得的数据均对于所建立的抗EGFR抗体域特异性充分相关。然而，在两种鉴定中有时观察到个别参考抗体之间的竞赛模式的细微差异，或许是归因于ELISA竞争鉴定使用全长EGFR受体抗原而SPR竞争鉴定使用重组胞外域EGFR的实情。
在两种不同竞争鉴定中证实抗EGFR抗体的表位定位之后，研究抗EGFR抗体对的同物种组合的竞争分析以解决哪组抗体对识别有区别的表位及是否识别重叠表位的抗体对可进一步分成表位群。该分析的结果显示于图9中。又，在该分析中认为50-100％的抑制值为结合重叠表位的抗体对之间显著竞争的指示。该标准似乎为有效的，因为所测试的抗体与自身竞争，且因此识别全部重叠表位使得值介于70％-100％抑制之间，如图9所示。此外，该观察结果说明分析期间抗原或抗体对的解离似乎并不影响所测试抗体的实验结果。通过根据先前部分中所确定的假定EGFR ECD域特异性将抗体分组，发现仅结合域I或域I或II(I/II)的抗体主要与具有相同特异性的抗体成员成同一群，而不与识别域III的抗体成员成同一群。同样，发现域III抗体仅与识别域III的抗体成员竞争结合，而不与识别EGFR域I或I/II的抗体竞争。虽然发现来源于相同Ig重排的两种域III抗体1024及1042识别重叠表位，但重要的是未发现1024或1042与992或1030的成对组合产生显著竞争。因此，推断抗体992、1030及1024/1042识别EGFR ECD的域III上的三个不重叠表位。最终，发现mAb1320与均针对域III的mAb1024及1449竞争结合，且不与其它所测试的域III抗体竞争(未确定1320与1042的竞争)。因此，假定mAb1320结合在EGFR胞外域的域III周围。表位特异性的总观可见于图10中，其中说明针对EGFR ECD域I、I/II或III的抗体的表位定位。
如由SPR所测定发现992、1030及1024/1042的成对组合并不产生显著抗体竞争之后，设计新的Biacore实验以检验可同时与受体抗原结合的抗体的数量。首先研究以三种抗体992、1024及1030饱和域III对于针对不为域III的其它EGFR特异性的抗体的结合有何影响。该分析的结果显示于图11A中。单一抗体的抑制是通过以与单一抗体或在各Biacore循环中依次添加一种额外抗体所产生的至多三种抗体的抗体混合物的组合形式测试该等抗体而确定。为确保完全阻断所识别的表位，以40μg/ml的个别浓度测试抗体。如图11A中所示，发现三种域III抗体992、1024及1030同时与受体结合而无任何结合抑制。所观察到的对于所添加的各抗体增加的负抑制值进一步表明对于随后所添加的抗体的结合协同作用。重要的是，在将域III以该等三种抗体培育之后，针对域I/II(mAb1261)、域I(1347)或未知特异性(1361)的不重叠表位的其它抗体似乎可结合而无来自三种mAb混合物的表位阻断。此外，该等所测试抗体具有较小负抑制值，表明其在受体以三种mAb混合物饱和之后结合良好。因此该实验表明该等六种所测试抗体可同时与EGFR的ECD结合。为进一步测试该所观察到的现象，制备由所有测试抗体(1261、1347、992、1024、1030及1361)组成的抗体混合物且就该混合物中各个别样品抗体的抑制进行测试。亦测试不包括所测试样品抗体的抗体混合物以充当阳性对照。如图11B/C中所呈示，发现当对于与抗体的完全混合物一起培育的EGF受体的结合进行测试时，所有六种测试抗体均被抑制80-116％。然而，当自该混合物移除个别样品抗体时，未发现该特定样品抗体的显著抑制，说明该混合物中的抗体仅由自身阻断与EGF受体的结合。该实验清晰地说明至少六种识别不重叠表位的抗体可同时与EGFR结合。最后的实验对于以下问题进行研究：是否针对域I(1284)、I/II(1257)的其它抗体或未知特异性群(1183、1255)可与EGFR在其与该等六种抗体混合物一起培育时结合。如图11D中所呈示，在将EGFR与该等六种抗体混合物一起培育之后，所测试抗体均不能显著地与EGFR结合。此可能由于抗体集合并不包括针对六种已结合抗体未占据的位点中的任一者的抗体。或者，有可能实际上所测试域上的所有位点均被抗体阻断。
表6具有文献证明的针对EGFR胞外域的特异性的市售抗体
克隆 物种 域I 域II 域III
ICR10 大鼠 X
199.12/Ab11 小鼠 X
EGFR.1/Ab3 小鼠 X
H11/Ab5 小鼠 X
111.6/Ab10 小鼠 X
528/Ab-1 小鼠 X
225/Ab-2 小鼠 X
实施例4EGFR活化抑制
通过竞争ELISA测定抗体介导的EGF配体与EGFR受体结合的阻断
为证实所测试抗EGFR抗体与EGFR受体结合且同时阻断经生物素标记的EGF配体的结合，在4℃下将ELISA孔以每孔80μl于PBS中的0.5μg/ml浓度的全长EGFR涂布隔夜。次日早晨将孔以PBS-T洗涤两次且在室温下以150μl PBS-T-1％BSA阻断一小时，继而在PBS-T中洗涤两次。随后将80μl连续稀释的抗EGFR抗体及对照抗体添加至孔中且在室温下培育30min。抗体培育之后，将20μL经生物素标记的EGF配体以0.5μg/ml的浓度添加至含有抗EGFR抗体稀释液的所有孔中或仅含有PBS-T1％BSA的孔中，且在室温下培育1小时。随后将孔以PBS-T洗涤五次，继而与每孔100μl于阻断缓冲液中稀释至1:1000的链霉抗生物素-HRP二级试剂一起培育且在室温下培育30min。最终将孔以PBS-T洗涤五次且通过每孔添加100μL TMB基质且培育60min使板显色。培育之后，通过每孔添加100μl1M H2SO4使反应终止；且在OD450nm下读取板。
ELISA试剂：
1)涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号20012-019
2)抗原：自A431细胞纯化的野生型全长EGFR；Sigma E2645
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号442404
4)阻断/稀释缓冲液：PBS-T中的1％BSA(PBS-T-1％BSA)
5)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％Tween20(PBS-T)
6)阳性对照：艾比特思、维克替比
7)阴性对照：西那格思(Synagis)(Medimmune Inc，帕利珠单抗(Palivizumab)，目录号NDC60574-4111-1)
8)经生物素标记的EGF配体；Invitrogen，目录号E3477
9)链霉抗生物素-HRP，超敏性：Sigma S2438
10)TMB Plus；KemEnTec，目录号4390L
11)1M H2SO4
ELISA竞争鉴定是用于将抗EGFR抗体抑制经生物素标记的EGF配体与涂布至ELISA孔的全长EGFR受体结合的能力分级。如图12中所呈示，艾比特思与维克替比似乎均极有效地阻断EGF配体结合，而不针对EGFR的阴性对照抗体西那格思并不抑制EGF配体结合。如图12A中所示，对针对域III且识别不重叠表位的三种抗体992、1030及1042单独或以等摩尔混合物形式测试其抑制EGF配体结合的能力。当与艾比特思及维克替比相比时，三种所测试抗体中仅mAb1030展示适度EGF配体抑制活性。mAb992、1030与1042的等摩尔混合物在抑制EGF配体结合方面似乎比单独测试的单一抗体有效。发现1μg/ml的总IgG浓度的等摩尔混合物比单独测试的mAb1030抑制EGF配体结合有效两倍，且比单独测试的mAb992及1042有效四倍，证明混合识别不重叠表位的三种域III抗体的协同效果。如图12B中所示，在该鉴定中亦测试抗EGFR克隆1208、1260、1277及1320。当与艾比特思对照物相比时，该等四种克隆能够以剂量依赖方式抑制EGF配体结合，该方式比对于克隆992、1030及1042所观察到者有效。高于0.33μg/ml的浓度的抗EGFR克隆1208、1260、1277及1320似乎正如以相同浓度测试的艾比特思在阻断EGF配体结合方面同样有效。
抑制HN5细胞中EGF诱导的EGFR磷酸化的能力
在细胞内Western分析(in cell western analysis)中测试抗EGFR抗体对于EGFR磷酸化的反应性。该细胞内Western程序使得能够检测同一样品中的EGFR及磷酸化EGFR(pEGFR)，此亦使得有可能比较各抗体处理及数据组中的EGFR与pEGFR表达的比率。根据ATCC所提供的说明，将HN5细胞培养于补充有10％FCS及pen/strep的DMEM中。将43,000个HN5细胞接种于Nunc的96孔板(目录号167008)中，24h之后使其饥饿。将细胞在DMEM中饥饿16h，随后添加抗体。添加200μl于DMEM中最终浓度为10μg/ml的抗体且将混合物上下抽吸至少五次以便混合。抗体处理30分钟之后，以50μg/ml的浓度添加EGF至适当孔中且保持7.5min。基本上按照由细胞内西方试剂盒制造商(Odyssey,LI-COR biosciences)所提供的说明执行细胞内Western法。
EGF刺激之后，将细胞于3.7％甲醛(Sigma F-8775，批号71K500，含有约1％甲醇)中固定20分钟。使用PBS-TritonX-100(0.1％)洗涤五次，每次5min以使细胞膜可渗透，随后于LI-COR阻断缓冲液(927-40000)中阻断。以对应于所提供说明的浓度添加初级抗体，且在温和震荡情况下于RT下培育2.5h(总EGFR小鼠，1:500稀释液，biosource international，目录号AHR5062，及磷酸EGFR Tyr1173，兔1:100稀释液，biosource，目录号44-794G)。
与初级抗体一起培育之后，将细胞在PBS-T(0.1％Tween20)中洗涤五次历时五分钟，之后添加二级抗体(山羊-抗-兔IRDye680，1:200稀释液，LI-COR目录号926-32221，及山羊-抗-小鼠，IRDye800CW1:800稀释液；LI-COR目录号926-32210)且在温和震荡以铝箔覆盖的板的情况下于RT下培育1h。
以Tecan荧光读取器测量之前，将板在PBS-T中洗涤五次历时五分钟。通过突然中断板的投掷运动，向下开孔以去除洗涤液，继而与纸巾相抵敲击该板来终止所有洗涤。(与ELISA板的处理相同，其重要的处在于应注意：细胞在处理期间保持在板上，且洗涤液可通过该程序而非通过扰乱细胞单层完全性的抽吸移除)。通过在孔侧以多道吸管平缓抽吸移除最后洗涤所剩的任何残余洗涤液。对于680nm通道(激发675nm且发射705nm，两者频宽均为10nm)且对于800nm通道(激发762nm且发射798nm，两者频宽均为10nm)测量荧光信号。
使用细胞内Western分析，很明显三种抗体显著地(p<0.05)影响HN5细胞的pEGFR状态；1208、1277及1320抗体(图13)。
测试抗EGFR抗体的抗EGFR混合物(992、1030及1042)及其中个别抗体在抑制EGF诱导的EGFR磷酸化的细胞内Western分析中的效果。如图14中可见，992及1030及抗EGFR抗体混合物显著抑制EGF诱导的EGFR磷酸化(p<0.05)。
实施例5A431NS细胞中EGF受体的内化
使用TrypLE自80-90％长满T175培养瓶将A431NS细胞(ATCC#CRL-2592)胰蛋白酶化。将所分离的细胞在PBS中洗涤且悬浮于无血清的DMEM中。将细胞分成1-2ml的部分且在冰上与所检验的抗体一起培育30min。抗体浓度为10μg/ml。将细胞在DMEM(250g，4min，4℃)中洗涤三次且再悬浮于1.8ml DMEM中。将各部分分至六个FACS管中，各含有300μl细胞悬浮液。将各部分的三个管置于37℃水浴中恰好40min且将其它三个管立即置于冰上。培育之后，将细胞以(250g，4min，4℃)洗涤两次且将沉淀再溶解于100μl DMEM中的兔抗人类IgG FcγF(ab')2-FITC中。将细胞在4℃下培育30min，随后在4℃DMEM中洗涤三次，且以FACSCalibur分析。
结果显示于图15中。使用艾比特思及维克替比培育展示约30％的同等程度的受体内化，保持70％的初始表面染色。单独使用992培育产生约45％受体下调。使用含有结合不重叠表位的两种额外抗体的抗体混合物培育使受体下调增加：992+1024，74％；992+1024+1030，83％。
添加额外抗体并不使受体内化进一步增加。因此，似乎需要至少三种抗体来达成A431细胞中最大程度的内化。
实施例6增殖鉴定
细胞损伤将不可避免地引起细胞保持及提供用于代谢细胞功能及生长的能量的能力的丧失。代谢活性鉴定是基于该前提。通常其测量线粒体活性。细胞增殖试剂WST-1(Roche目录号11 644 807 001)为测量活细胞代谢活性的即用基质。随后假定代谢活性与活细胞数目有关。在该实施例中，使用WST-1鉴定来测量以不同浓度的不同抗体处理之后代谢活性细胞的数目。
在执行WST-1鉴定之前，将适当抗体及抗体混合物在补充有0.5％FBS及1％P/S的DMEM中稀释至20μg/ml的最终总抗体浓度，在具有最高抗体浓度的孔中产生10μg/ml的最终抗体浓度。随后将150μl该等溶液添加至96孔板的第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培养基添加至第11行中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发的影响。
随后将A431-NS细胞以1×PBS洗涤且通过以3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。将上清液移除且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升15,000个细胞。随后将100μl细胞悬浮液(每孔1500个细胞)添加至第2-11行中的实验孔中。将板在调湿恒温箱中在37℃下培育4日。随后每孔中添加20μl WST-1试剂且将板在37℃下培育一小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持一小时。以ELISA读取器测量450及620nm(参考波长)下的吸光率。代谢活性细胞(metabolically active cells，MAC)的量经如下计算为未经处理的对照的百分比：
对于EGF滴定研究，将配体在DMEM+0.5％FBS中稀释至20nM/ml的浓度，在具有最高EGF浓度的孔中产生10nM/ml的最终浓度。随后将150μl该溶液添加至96孔板的第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl EGF溶液。将100μl培养基添加至第11行中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发的影响。将适当抗体及抗体混合物在补充有0.5％FBS及1％P/S的DMEM中稀释至40μg/ml的最终总抗体浓度，在孔中产生10μg/ml的最终抗体浓度。随后将50μl该等溶液添加至96孔板中第2-9行的孔中。
随后将A431-NS细胞以1×PBS洗涤且通过以3ml胰蛋白酶溶液胰蛋白酶化分离。随后添加17ml完全培养基且将该等细胞以300×g(1200rcf)离心5min。将上清液移除且使细胞再悬浮于DMEM+0.5％FBS中。对细胞进行计数且将其浓度调整至每毫升40,000个细胞。随后将50μl细胞悬浮液(每孔2000个细胞)添加至第2-11行的实验孔中。将板在调湿恒温箱中在37℃下培育4日。随后每孔添加20μl WST-1试剂且将板在37℃下培育一小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持一小时。以ELISA读取器测量450及620nm(参考波长)下的吸光率。代谢活性细胞的量是通过450nm下的吸光率减去620nm的参考波长下的吸光率指示。
代谢活性细胞(MAC)的量经如下计算为未经处理的对照的百分比：
结果
为证明域III内的不重叠表位的三种抗EGFR抗体的混合物优于单一抗体，执行研究对A431-NS生长的抑制的实验。如图16A中可见，该等抗体单独为A431-NS生长的不良抑制剂，但在组合时可获得对431-NS生长的协同抑制效果。尽管992与1042或1030的混合物亦极有效，但所有三种的混合物在所有抗体浓度范围上均优于该等混合物。
研究个别抗体及抗体混合物对以不同浓度EGF刺激的A431-NS细胞生长的效果，且结果显示于图17中。如图17中可见，在不存在抗体的情况下，高于0.1nM的EGF浓度对于细胞具有毒性。然而，显然结合EGFR域III内的不重叠表位的三种抗体(992、1030及1042)的混合物协同发挥作用抑制存在EGF(当测试达至少0.3nM EGF时)的情况下A431-NS细胞的生长，且混合物优于所有单克隆抗体。
随后证明亦可通过将结合EGFR域III中的不重叠表位的两种抗体与结合EGFR域I或域II中的表位的抗体组合获得对A431-NS生长的协同抑制效果。如图18中可见，均为EGFR域III抗体的抗体992及1024与对EGFR域I具有反应性的抗体(1284)或对EGFR域I/II具有反应性的抗体(1434)的组合如与EGFR域III内的不重叠表位反应的三种抗体(992+1024+1030)一样有效。此外，该等抗体混合物比治疗性抗EGFR抗体艾比特思及维克替比在抑制A431-NS生长方面更有效。
使用两种其它癌细胞系DU145(ATCC#HTB-81)及MDA-MB-468(ATCC#HTB-132)执行类似鉴定。该等增殖鉴定的结果是显示于图16B及16C中。在该等两种情况下，三种抗体(992、1030及1042)的混合物均优于两种抗体的混合物及单一抗体。在DU145细胞中，三种抗体的混合物在所有浓度下均优于维克替比，且在MDA-MB-468中，在高浓度下优于维克替比。
使用类似于上述方法的方法测试三种抗EGFR抗体的不同组合。
结果
在A431NS细胞系中研究三种抗体的不同组合的效果。其中二十个最有效者的生长抑制活性是显示于图37中。与未经处理的对照相比，所有该等组合抑制A431NS细胞系的增殖大于60％。另一有趣的观察结果为除组合(992+1024+1254及992+1024+1320及992+1277+1320)之外，该等组合含有结合不重叠表位的抗体。由此可见，有可能设计结合有区别的表位的三种抗体的若干组合。
实施例7细胞凋亡
细胞凋亡为引起细胞死亡的生物机制。先前已通过使用抗EGFR抗体(诸如艾比特思)报导过该机制(Baselga J.The EGFR as a target foranticancer therapy-focus on cetuximab.Eur J Cancer.2001年9月:37，增刊4:S16-22)。其因此研究至以下程度，个别抗EGFR抗体992、1042及1030以及其混合物(992+1042+1030)能够诱导细胞凋亡。
在三重测定中将1×104个A431NS细胞在96孔培养板中补充有0.5％FBS及抗生素的DMEM中，在0.01μg/ml至10μg/ml浓度范围内的EGFR混合物(相等份数的992、1030、1042)、992、1030、1042、艾比特思或维克替比存在下培育。将细胞及抗体培育22h。随后收集上清液且以来自Roche，目录号：11774425001的ELISA试剂盒(Basel,Switzerland)测量组蛋白质-DNA复合物的存在。
使用A431NS细胞来比较混合物与单独单克隆抗体中的每一者以及与参考抗体维克替比及艾比特思的效果(结果参见图19)。以10倍稀释液测试该等抗体。当以1μg/ml及10μg/ml的浓度测试时，与个别单克隆抗体以及维克替比相比混合物显著(P<0.05)更有效。在1μg/ml下，与艾比特思相比，混合物在统计上显著(p<0.05)增加细胞凋亡。
实施例7b
除实施例7之外，根据与实施例7中所述相同的方法对于992+1024的混合物以及992+1024+1030的混合物的细胞凋亡活性进行研究(图35)。实际细胞凋亡程度与最大阳性对照有关。使用A431NS细胞，以1μg/ml，将该等两种混合物与艾比特思及个别单克隆抗体992、1024及1030以及对照抗体相比较。992+1024的混合物显著优于艾比特思及个别单克隆抗体(所有P<0.05)。
实施例8体内功效
对于由抗体992、1030及1042组成的抗EGFR混合物在使用A431NS细胞的裸鼠异种移植模型中研究其体内功效。其为广泛使用的用于研究单克隆抗癌症抗体(包括抗EGFR抗体)的效力的模型。裸鼠免疫功能不全且缺乏T细胞。此使得人类细胞可生长于该小鼠中。
将两组6-8周裸鼠皮下注射1×106个A431NS细胞。当平均肿瘤尺寸达到100mm3时开始处理。使小鼠以2-3日间隔接受腹膜内注射1mg抗体五次。使用数字测径器以两个直径测量肿瘤尺寸，且使用下式计算体积：肿瘤体积(mm3)＝L×W2×0.5，其中L为最长直径且W为最短直径(TeicherBA,Tumor Models in Cancer Research.Humana Press,NJ,USA2002，第596页)。实验结束时，切除肿瘤且称重。
将西那格思用作对照抗体。该实验亦包括使用与抗EGFR混合物(抗体992、1030与1024)相同的时程以相同量的艾比特思及维克替比处理。
如图20中可见，992、1030与1042的混合物显著抑制A431NS的肿瘤生长(P<0.05)。平均重量显示于图21中。结果与所测量的肿瘤尺寸相关。处理组与对照组之间存在显著差异。
实施例8b体内功效
除实施例8中所述的体内实验之外，在上述A431NS异种移植模型中研究992+1024及992+1024+1030的混合物(图36)。向每组有9只6-8周裸鼠的四个组皮下注射1×106个A431NS细胞。当平均肿瘤尺寸达到100mm3时，小鼠接受第一次抗体注射。三个组接受992+1024、992+1024+1030的混合物、艾比特思或对照抗体西那格思。小鼠总共接受注射0.5mg17次，一周4次。第一次注射在第8日给予且最后一次注射在第34日给予。测量肿瘤尺寸历时56日。终止抗体处理之后，接受艾比特思的小鼠肿瘤的尺寸开始扩大，而对于接受992+1024或992+1024+1030的混合物的两组中的小鼠而言，肿瘤尺寸继续减小。对于992+1024组，在第91日(终止处理之后57日)未观察到肿瘤尺寸扩大。在第56日，992+1024的组合的平均肿瘤尺寸显著(P<0.01)小于接受艾比特思的小鼠的平均肿瘤尺寸。
亦监测该实验中小鼠的存活率。当肿瘤达到最大允许尺寸时将小鼠记为死亡。下表展示接种肿瘤细胞之后56日存活小鼠的数目。与艾比特思相比，两个组合均可见提高的存活率。
组 992+1024 992+1024+1030 艾比特思 对照Ab
初始小鼠数目 9 9 9 9
在第56日剩余的小鼠 9 9 2 0
其它实验
实施例8中所述的异种移植实验的肿瘤溶胞物的初步资料展示992+1042+1030的组合诱导A431NS产生VEGF的有效下调，VEGF为血管生成的重要介质。血管形成增加为许多实体瘤中可见的现象，其为一种参与持续提供养分等的机制，因此影响存活条件。
此外，其它初步数据展示，当与艾比特思及维克替比相比时，实施例8中所述的异种移植实验的肿瘤溶胞物中可观察到992+1042+1030的抗体组合量增加。
实施例8c增强的体内肿瘤细胞分化
细胞的终末分化为包括细胞类型特异性基因表达程序活化的复杂过程，其引入使细胞增殖能力不可逆丧失的多步过程。在恶性疾病中，癌细胞通常处于特征为增殖速率增加的去分化状态，且提示能够诱导癌细胞终末分化的药物能够去除恶性细胞且重建正常细胞体内平衡(Pierce GB,Speers WC:Tumors as caricatures of the process of tissue renewal:prospectsfor therapy by directing differentiation.Cancer Res48:1996-2004,1988)。在某些实验条件下，先前已报导抗EGFR单克隆抗体能够使作为异种移植肿瘤在免疫受损小鼠中生长的人类鳞状癌细胞终末分化的速率增加(Milas L,Mason K,Hunter N,Petersen S,Yamakawa M,Ang K,Mendelsohn J,Fan Z:Invivo enhancement of tumor radioresponse by C225antiepidermal growth factorreceptor antibody.Clin Cancer Res6:701-8,2000；Modjtahedi H,Eccles S,Sandle J,Box G,Titley J,Dean C:Differentiation or immune destruction:twopathways for therapy of squamous cell carcinomas with antibodies to theepidermal growth factor receptor.Cancer Res54:1695-701,1994)。
我们以组织学方式检验抗EGFR处理的作为异种移植物在小鼠中生长的A431NS细胞的终末分化程度。该组织学研究包括自实施例8中所述的实验的四个实验组中的每一者随机选择的3个小鼠异种移植肿瘤。
将组织剖开且瞬间冷冻，随后与Tissue-Tek一起安装于低温切片机(Leitz，型号1720)上，切成5μm的切片且在superfrost plus载玻片上制成样品，随后经处理以供苏木精(hematoxylin)/伊红(eosin)染色。随后两个独立观察者以不知情方式进行所有组织切片的显微镜检验，对角质化区域(「角化珠」)记分作为终末分化程度的测量(Modjtahedi等人，1994)。表7列出所获得的结果。与以参考抗体艾比特思及维克替比处理的小鼠(分别为第2组及第3组)相比，以三种抗EGFR抗体的混合物处理的小鼠(992+1024+1030，第1组)具有显著较大且较多的终末分化癌细胞的集落(foci)。在接受PBS替代抗体的对照组(第4组)中未检测到终末分化。
使用装备有数字相机的显微镜获得代表性显微图像，参见图26。
总的，与艾比特思及维克替比单克隆抗体相比，结合域III内的不重叠表位的三种抗EGFR抗体(克隆992、1030及1042)的组合展示对体内肿瘤细胞出乎意外的增强的分化诱导效果。所观察到的对终末分化的效果得出以下结论：本发明的抗体组合物可用于与其它分化诱导剂(诸如视黄酸、4-丁酸苯酯)的组合疗法中。
表7
实施例8d本发明的抗体组合物的持续生长抑制效果
重复执行实施例8及8b中所提供的肿瘤异种移植实验以研究992+1024抗体混合物的体内功效。简言的，将BALB/c nu/nu小鼠皮下注射106个A431NS细胞至侧腹(flank)中。允许肿瘤异种移植物生长至100mm3的平均肿瘤尺寸(第7日)，此时将小鼠随机分成五组，每组九只动物，且开始抗体处理。该等五组接受高剂量(每周2mg)或低剂量(每周1mg)的992+1024混合物或参考抗体艾比特思，或高剂量(每周2mg)的对照抗体西那格思。所有小鼠总共接受注射0.5或1mg抗体9次，每周两次，在第7日开始且在第33日结束。
当与艾比特思相比时，高剂量(每周2mg)992+1024混合物在控制初始肿瘤生长及诱导长期肿瘤退化方面极有效(P＝0.0002，图38)。每周接受2mg992+1024混合物的动物在研究期间(实验开始之后118日，图38及39)均未死亡，与第60日仅九分之一动物剩余的高剂量(每周2mg)艾比特思组相比为显著较优选的结果(P＝0.0008，图39)。此证明992+1024处理对长期存活的持续效果。尽管不及高剂量有效，但低剂量992+1024混合物(每周1mg)亦能够控制肿瘤生长，且与高剂量(每周2mg)艾比特思相比当考虑肿瘤抑制(P＝0.0135，图38)与存活率(P＝0.0087，图39)时均显著较优选。该等结果证明992+1024组合甚至在低剂量下当与艾比特思相比时具有优良的效力。与已批准的单克隆抗体相比，该等结果亦证明由992+1024组合产生的持续生长抑制。
实施例9球状体生长
为进行球状体研究，向圆底96孔板中添加35μl120mg/ml聚-HEMA溶液且使其在流动通风柜中蒸发隔夜。聚-HEMA预防细胞粘附。将A431-NS细胞进行如上处理、计数，且将其浓度调整为每毫升100,000个细胞。随后将50μl细胞悬浮液(每孔5,000个细胞)以及50μl5％玛崔胶(matrigel)溶液添加至第2-11行的实验孔中。将200μl培养基添加至第1列及第8列以及第1行及第12行中以降低实验孔中培养基蒸发的影响。将板在300×g下离心5分钟且使其在调湿恒温箱中在37℃下成型(form)隔夜。次日将适当抗体及抗体混合物在空96孔板中稀释至20μg/ml的最终总抗体浓度。此是在补充有0.5％FBS及1％P/S的DMEM中进行，在具有最高抗体浓度的孔中产生10μg/ml的最终抗体浓度。随后将150μl该等溶液添加至96孔板的第2行孔中，且向下直至第9行进行三倍连续稀释以使各孔含有100μl抗体溶液。将100μl培养基添加至第11行中。随后将100μl该等溶液转移至含有球状体的板中且使其培育7日。随后每孔添加20μlWST-1试剂，且将板在37℃下培育一小时。随后将板转移至回转式盘震荡器中且再保持一小时。以ELISA读取器测量450及620nm(参考波长)下的吸光率。代谢活性细胞(MAC)的量经如下计算为未经处理的对照的百分比：
结合域III内的不重叠表位的三种抗体的混合物(992+1030+1042)有效抑制A431-NS球状体的生长，且比单克隆治疗性抗EGFR抗体艾比特思及维克替比更有效(图22)。
实施例10与猕猴EGFR ECD的结合
猕猴EGFR胞外域的克隆
由自表皮分离的猕猴cDNA，通过使用嵌套式PCR及来源于公开的全长人类EGFR序列的序列特异性引物(GENBANK X00588，Ullrich,A.等人，Nature309(5967),418-425(1984))克隆不包括信号肽的猕猴EGFR胞外域。
PCR试剂：
自正常皮肤表皮分离的猕猴cDNA：CytoMol Unimed，目录号：ccy34218，批号：A711054。
Phusion反应缓冲液(5×)：Finnzymes，目录号：F-518，批号：11。
Phusion酶：Finnzymes，F-530S(2U/μL)。
dNTP25mM：Bioline，目录号：BIO-39029，批号：DM-103F。
用于扩增包括部分信号序列及跨膜域的猕猴EGFR ECD的引物：
5'ATG引物：5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3'(SEQ ID NO 135)
3'Tm2引物：5'-TTCTCCACTGGGCGTAAGAG-3'(SEQ ID NO 136)
用于嵌套式PCR扩增猕猴EGFR ECD Bp1-1863且在跨膜域之前并入XbaI、MIuI限制性位点及终止密码子的引物：
5'EGFR XbaI：
5'-ATCTGCATTCTAGACTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGC-3'(SEQ ID NO137)
3'EGFR MiuI：
5'-TACTCGATGACGCGTTTAGGATGGGATCTTAGGCCCGTTCC-3'(SEQID NO138)
PCR条件：
30个循环：98℃/30sec解链，55℃/30sec退火，72℃/60sec延伸。30个循环之后，使PCR产物再延伸5min。
使用1μl模板及2单位Phusion酶在总体积为50μL的含有0.2mMdNTP、0.5μM引物的反应缓冲液中执行PCR反应。
获得具有约1800-1900Bp的表观长度的最终PCR条带，且克隆至表达载体中。所克隆的猕猴EGFR胞外域的DNA及蛋白质序列显示于图23中，且与人类EGFR ECD比对的猕猴EGFR ECD蛋白质序列显示于图24中。人类EGFR ECD与猕猴EGFR ECD DNA序列的比对展示97.6％的序列一致性，而相应蛋白质序列比对展示98.6％的序列一致性。
ELISA中人类与猕猴EGFR的胞外域之间的抗体交叉反应性的证明
为证实所测试抗EGFR抗体与人类及猕猴EGFR ECD的结合同样良好且因此批准猕猴中的毒物学研究，通过ELISA对自1μg/ml开始连续四倍稀释的抗体就与重组人类及猕猴EGFR ECD蛋白质的结合进行测试。认为在该鉴定中展示相同结合概况的抗体为良好物种EGFR交叉反应性的指示。在4℃下将ELISA孔以每孔50μl于PBS中浓度为1μg/ml的全长EGFR涂布隔夜。次日早晨将孔以PBS-T洗涤两次且在室温下以100μl PBS-T-1％BSA阻断一小时，继而在PBS-T中洗涤两次。随后将50μl连续稀释的抗EGFR抗体及对照抗体添加至孔中且在室温下培育一小时。抗体培育之后，将孔以PBS-T洗涤五次，继而与每孔50μl在阻断缓冲液中稀释至1:3000的链霉抗生物素-HRP二级试剂一起培育且在室温下培育30min。最终将孔以PBS-T洗涤五次且通过每孔添加50μL TMB基质且在室温下培育使板显色。培育之后，通过每孔添加100μl1M H2SO4使反应终止；且在OD450nm下读取板。
ELISA试剂：
1.ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404
2.抗原：人类rEGFR ECD；猕猴rEGFR ECD
3.涂布缓冲液：1×PBS；Gibco目录号20012-019
4.洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％Tween20(PBS-T)
5.阻断/稀释缓冲液：于PBS-T中的1％BSA
6.山羊-抗-人类IgG HRP偶联物：Serotec,Star106P
7.TMB Plus(KemEnTec目录号4390L)
8.(1M H2SO4)
如图25中所示，所述ELISA鉴定可辨别交叉反应的人类及猕猴抗EGFR ECD抗体(图25A)与仅识别小鼠免疫所用的人类EGFR ECD的物种特异性抗体(图25B)。
实施例11运动性的抑制
大多数癌症死亡是源于肿瘤细胞的播散及于远处位置中之后续生长。局部侵袭邻接正常组织损害体内平衡功能且妨碍肿瘤的手术或放射性切除。最近的研究已指出诱导出的运动性在促进该扩散中所发挥的主要作用。已知EGFR促进细胞运动性及扩散，且因此抑制EGFR介导的运动性为EGFR靶向药物的重要机制。
研究两种抗体992与1024的混合物对头颈癌细胞系运动性的效果。如实施例9中所述制备由10,000个细胞组成的球状体隔夜。随后将球状体转移至NUNC T25细胞培养瓶中且使其粘附隔夜。随后添加10μg/ml抗体混合物992+1024或阴性对照抗体，且将球状体再培育24小时。以40倍放大率采集图像且使用软件Image J测量由细胞覆盖的面积。
结果：如图27A中可见，添加EGFR特异性抗体992与1024使由肿瘤细胞覆盖的面积显著减小。在图27B中将运动性定量，该图展示，与阴性对照抗体相比，运动性降低约60％。该运动性降低为高度显著的p<0.01。
因此，抗体992与1024的组合有效抑制EGFR介导的肿瘤细胞运动性，其表明抗EGFR抗体的组合可用于治疗播散性疾病。
实施例12Sym004抗体组合物对内披蛋白的上调
内披蛋白为早期鳞状细胞分化的标记且为参与角质化外壳形成的蛋白质。因此内披蛋白含量可用作已分化肿瘤细胞的数目的量度。使用市售内披蛋白ELISA试剂盒(Biomedical Technologies)来估算在来自未经处理或以艾比特思、维克替比或抗体992+1030+1042的混合物处理的A431NS异种移植肿瘤的蛋白质溶胞物中的内披蛋白的含量。通过使用Qiagen的TissueLyzer使30-40mg肿瘤组织在1ml RIPA缓冲液中均质化来制备肿瘤溶胞物。使用Pierce的BCA蛋白质鉴定试剂盒测定各澄清溶胞物中的蛋白质浓度，且使用ELISA鉴定估算在各样品的0.4μg蛋白质中内披蛋白的含量。
结果：如图27中可见，与阴性对照及艾比特思或维克替比处理组相比，发现992+1030+1042处理组中的内披蛋白含量显著较高。因此抗体992、1030及1042的组合提高A431NS异种移植肿瘤中内披蛋白的含量，且因此可能诱导较高程度的A431NS分化。该结果与该特定处理组中所发现的大量角化珠(参见实施例8)充分一致。
实施例13通过Sym004抗体组合物使EGFR内化
一些抗体通过诱导其表面目标的内化而发挥功能。已知EGFR在由诸如EGF的配体活化时经历内化。
使用共聚焦显微镜术研究两种抗体992与1024的混合物诱导EGFR内化的能力。将A431NS及HN5细胞接种于LabTek的8孔腔室载玻片中，且在含有0.5％FBS的DMEM中培育隔夜。随后向细胞添加10μg/ml经Alexa-488标记的992+1024抗体混合物或对照抗体艾比特思，且随后培育不同时段。随后使用具有大针孔或小针孔的Biorad共聚焦显微镜以60倍放大率采集图像。
结果：如图29A中所示，添加经Alexa-488标记的EGFR特异性抗体992及1024历时2小时使得抗体在A431NS与HN5细胞系的细胞内小泡中累积。相比之下，艾比特思主要存在于细胞表面。图29B展示使用较小针孔获得的A431NS细胞图像，该较小针孔产生较薄细胞切片的图像。由该等图像很明显，抗体992+1024位于细胞内而艾比特思主要存在于细胞表面。图30展示992+1024介导的内化的时间范围，且早在添加抗体之后30分钟，可在细胞内小泡中发现该等抗体。4小时之后，几乎所有抗体992+1024均在细胞内发现，而表面染色较低或较弱。相比之下，艾比特思保留于细胞表面。亦获得证据展示由992+1024诱导的内化使得细胞中的EGFR持续降解且移除。
因此抗体992与1024的组合迅速且有效地诱导EGFR内化，而艾比特思不能。
实施例14使用表面电浆共振测量抗体亲和力
Sym004IgG抗体针对重组可溶性EGFR ECD的单价亲和力(monovalent affinity)的测量
在BIAcore2000上使用如Canziani,Klakamp等人，2004,Anal.Biochem,325:301-307中所述的鉴定执行本发明的全长IgG抗体的动力学分析，使得可测量完整IgG分子针对可溶性抗原的单价亲和力。简言的，根据制造商说明使约10,000Ru的多克隆抗人类IgG Fc抗体与CM5芯片表面接合，继而在抗Fc芯片表面上捕获25μg本发明的个别抗EGFR抗体或西那格思阴性对照。对于各克隆优化捕获的IgG的密度，以使该鉴定中所使用的最高抗原浓度的结合不超过25Ru。随后将250μL先前通过凝胶排阻层析法展示仅含有单价蛋白质的可溶性人类EGFR ECD以25μL/min的流速以HBS-EP缓冲液中的连续两倍稀释液注射以产生反应曲线。在循环之间通过10秒注射100mM H3PO4去除所捕获的抗体/抗原复合物使芯片表面再生。通过首先减去含有阴性对照抗体西那格思的流动单元的反应，继而减去由仅注射HBS-EP缓冲液产生的反应，执行动力学分析(「双重参考」，doublereferencing)。由所产生的感应图(sensogram)使用制造商所提供的BIA评估软件4.1全面评估结合速率常数(ka)及解离常数(kd)。
试剂：
1.CM5芯片：Biacore，目录号BR-1000-14
2.NHS：Biacore BR-1000-50
3.EDC：Biacore BR-1000-50
4.10mM乙酸盐缓冲液(pH4.5)：Biacore，目录号BR-1003-50
5.山羊抗-人类IgG Fc：Caltag，目录号H10500
6.乙醇胺，1.0M，pH8.5：Biacore BR-1000-50
7.10×HBS-EP电泳缓冲液：0.01M HEPES，pH7.4，0.15M NaCl，3mMEDTA，0.005％v/v界面活性剂P20
8.抗原：具有6×His的人类EGFR胞外域。
9.100mM H3PO4
所计算出的本发明的全长IgG针对可溶性人类EGFR ECD的单价亲和力显示于下表8中。
表8所测量出的抗EGFR IgG抗体针对可溶性受体的亲和力。抗体测量是通过在BIAcore2000上使用制造商所提供的评估软件的表面电浆共振执行。*992的亲和力是通过Scatchard分析测定。NA：不适用。
大多数所测试的Sym004抗体以在10-20nM范围内的亲和力识别可溶性人类EGFR ECD，除1260、1277及1284分别具有4.2nM、0.4nM及4.6nM的较高亲和力以外。最终发现992以比其它所测试抗体低得多的亲和力结合可溶性EGFR ECD。因此，该抗体的动力学分析须通过Scatchard分析测定，该分析揭示针对可溶性人类EGFR ECD的170nM的亲和力。
Sym004Fab抗体针对经固定重组EGFR ECD的亲和力的测量
为研究以可溶性与固定形式存在的EGFR ECD之间的抗原呈递的可能差异，对称为EGFR-Fc的由融合至人类IgG Fc的人类EGFR ECD组成的经固定嵌合EGFR受体抗原(R&D Systems,344-ER)执行一种新的亲和力测量。为此目的，产生IgG抗体992、1024及1030的Fab片段以使得可测量单价亲和力。
Fab产生：
使用Pierce的Fab制备试剂盒且根据制造商说明通过木瓜蛋白酶消化产生992、1024及1030的Fab片段。简言的，根据制造商说明，以NAP-5管柱(Amersham Biosciences)将2mg各IgG抗体以新鲜制备的含有20mM半胱氨酸-HCl的消化缓冲液(pH值7.0)进行缓冲液更换。随后将木瓜蛋白酶珠粒的350μl浆液在相同消化缓冲液中洗涤两次，随后将该等珠粒离心且弃去上清液。抗体是通过将1ml经缓冲液更换的IgG抗体添加至珠粒中，且在37℃下以1000rpm震荡的情况下培育隔夜来消化。次日早晨，通过以HiTrap Protein A管柱(Ge Healthcare)去除全长IgG将未消化的IgG自粗Fab分离。最终将所产生的Fab以PBS进行渗析隔夜且以SDS-PAGE在还原及非还原条件下分析。认为非还原条件下约50kDa的蛋白质条带为Fab成功产生的指示。
试剂：
1.ImmunoPure Fab制备试剂盒；Pierce；目录号44885
2.NAP5脱盐管柱；Amersham，目录号17-0853-02
3.PBS(pH7.2)；Gibco；#20012-019
4.HiTrap Protein A HP，1ml管柱；GE Healthcare；#17-0402-01
5.NuPAGE4-12％Novex Bis-Tris凝胶；Invitrogen；#NP0322BOX
6.分子标记；Seeblue Plus2；Invitrogen；#LC5925
7.抗EGFR抗体-各2.0mg
本发明的Fab抗体的动力学分析是以Biacore2000使用以极低密度固定于感应器表面上的重组抗原以避免质量转运(mass transport)的限制来执行。简言的，根据制造商的说明，使总共285Ru重组EGFR ECD-Fc嵌合体(R&D Systems,目录号344-ER)与CM5芯片表面接合。随后将来源于本发明的抗体的Fab片段以起始于经优化浓度的连续两倍稀释液测试，当在具有经固定EGFR芯片上测试时该经优化浓度不产生高于25的Ru最大值。通过首先减去由仅注射HBS-EP缓冲液产生的反应执行动力学分析。由所产生的感应图使用制造商所提供的BIA评估软件4.1全面评估结合速率常数(ka)及解离常数(kd)。
所计算出的本发明的所测试Fab片段针对经固定人类EGFR ECD的亲和力显示于下表9中。
表9所测量出的抗EGFR Fab抗体针对经固定受体的亲和力。抗体测量是通过在BIAcore2000上使用制造商所提供的评估软件的表面电浆共振执行。*992的亲和力是通过Scatchard分析测定。NA：不适用。
如上表9中所呈现，发现992及1024的Fab片段分别具有与先前实施例中所呈现的亲和力一致的150nM及26nM的亲和力，说明对于该等两种抗体而言，针对可溶性及固定EGFR的抗体识别存在较小差异。然而，与可溶性受体相比，抗体1030针对固定抗原展现2.3nM的高十倍的亲和力，且因此优先识别暴露于固定抗原上的表位。
实施例15：EGFR抗原呈递研究及对A431-NS细胞的功能性亲和力的分级
A431-NS细胞与经纯化全长EGFR受体的抗原呈递之间的比较。
由于动力学分析揭示抗体992以150-170nM之间的亲和力识别重组EGFR ECD，故研究是否该弱亲和力是归因于与自A431细胞纯化的重组EGFR ECD或全长EGFR上所呈递的构形相比，mAb992优先结合表达于A431-NS细胞上的EGFR的天然构形的实情。为研究EGF受体抗原呈递差异，使用Fab片段执行本发明的抗体亚群的同步ELISA结合研究以避免对所测试A431-NS细胞及来自相同细胞的经纯化全长EGFR的亲和力影响。
Fab产生：如实施例14中所述执行Fab片段的产生。
间接ELISA：为进行间接ELISA，在4℃下将全长EGFR(Sigma E2645)以于碳酸酯缓冲液中的1μg/ml涂布(每孔50μl)隔夜。次日早晨将孔以PBS-T洗涤两次且在室温下以含有1％BSA的PBS-T阻断一小时，继而在PBS-T中洗涤两次。随后将50μl Fab抗体于含有1％BSA的DMEM中的连续稀释液添加至独立ELISA孔中且在室温下培育1小时，之后，将孔以PBS-T洗涤四次。随后添加50μl于含有1％BSA的DMEM中稀释至1:5000的二级山羊-抗-人类(Fab特异性)HRP偶联物，且在冰上培育30min。最终，将孔以PBS-T洗涤四次，且通过每孔添加50μl TMB基质使板显色，且在620nm下每5-15-30min进行读取。与基质一起培育之后，通过添加1M H2SO4终止反应，且在450nm下读取吸光率。
试剂，间接ELISA：
1)涂布缓冲液：50mM碳酸酯缓冲液，pH9.8
2)抗原：自A431细胞纯化的野生型全长EGFR；Sigma E2645
3)ELISA板：NUNC Maxisorp；目录号：442404
4)洗涤缓冲液：1×PBS/0.05％Tween20(PBS-T)
5)阻断/稀释缓冲液：PBS-T中的1％BSA(PBS-T-1％BSA)
6)抗体稀释缓冲液：含有1％BSA的DMEM
7)山羊-抗-人类(Fab特异性)HRP偶联物：Jackson，目录号109-035-097
8)TMB Plus基质：KemEnTec，目录号4390L
9)1M H2SO4
细胞ELISA：通过对A431-NS细胞进行抗体滴定测定定义为产生半数最大OD(ED50)的摩尔浓度的相对结合亲和力。简言的，使10,000个A431-NS细胞在37℃下5％CO2下在含有添加有0.5％FCS及1％P/S的DMEM的96孔ELISA板中生长隔夜。次日早晨，将长满细胞(每孔约20,000个)以PBS洗涤两次，且通过在室温下与1％三聚甲醛溶液一起培育15min固定，继而以PBS洗涤四次。随后，将所测试的EGFR抗体及阴性对照抗体西那格思在含有1％BSA的DMEM中连续稀释，且将50μl各稀释液添加至孔中且在室温下培育1小时，之后，将孔以PBS洗涤四次。随后添加50μl于含有1％BSA的DMEM中稀释至1:5000的二级山羊-抗-人类(Fab特异性)HRP偶联物，且在冰上培育30min。最终，将孔以PBS-T洗涤四次，且通过每孔添加50μl TMB Plus基质使板显色，且在620nm下每5-15-30min进行读取。与基质一起培育之后，通过添加1M H2SO4终止反应，且在450nm下读取吸光率。通过减去仅与二级试剂结合的平均本底，继而通过绘制相对于所测试的各抗体的最大结合％使结合曲线正规化来计算表示为ED50值的功能性亲和力。
试剂，细胞ELISA：
1)DMEM培养基：Gibco，目录号41966-029
2)FCS：Gibco，目录号10099-141
3)Pen strep(P/S)：Gibco，目录号15140-122
4)ELISA板：Costar，目录号3595
5)洗涤缓冲液(PBS)：Gibco目录号20012-019
6)抗体稀释缓冲液：含有1％BSA的DMEM
7)细胞固定液：BD Biosciences，目录号340181
8)山羊-抗-人类(Fab特异性)HRP偶联物：Jackson，目录号109-035-097
9)TMB Plus基质：KemEnTec，目录号4390L
10)1M H2SO4
以同步ELISA结合研究，使用相同二级抗体试剂及培育时间来测定A431-NS细胞上所表达的EGF受体与来自相同细胞的经纯化受体的抗原呈递差异。结果显示于图31中。该实验清楚展示当与相同浓度的Fab1030的结合相比时，Fab抗体992及1024与涂布于ELISA孔中的经纯化全长EGFR结合较弱。然而，当以所有三种Fab均对其展示强结合活性的A431-NS细胞测试抗体时，992及1024的弱结合活性得以恢复。两种不同ELISA的比较说明与ELISA孔中经纯化抗原所呈递的构形不同，Fab992及1024优先结合表达于细胞表面上的天然EGFR构形。该结果亦提示表面电浆共振所测量出的992对于重组可溶性及经固定EGFR ECD的表观较弱亲和力是归因于测试系统中992抗体表位的不利呈递。
对A431-NS细胞的功能性亲和力的分级
使用如上述执行的细胞ELISA通过计算表示为ED50值的半数最大OD值将992、1024、1030、维克替比及艾比特思的IgG及Fab片段的功能性亲和力分级。该分析的结果显示于图32中，且所计算出的ED50值呈示于下表10中。
表10：表示为ED50值的功能性亲和力基于IgG的亲和性效果或Fab的单价亲和力的分级。通过对A431-NS细胞的连续抗体滴定来测定ED50值。SD：曲线拟合的标准偏差。
该实验清楚展示当考虑亲和性效果时，IgG992及1024似乎以高于艾比特思与维克替比的亲和性结合A431-NS细胞，而IgG1030在所测试的IgG抗体中具有最低亲和力。然而，当使用Fab片段测定细胞的单价亲和力时，992具有约10nM的最低亲和力。尽管如此，该单价功能性亲和力仍比以BIAcore测试者低至少15倍。
实施例16：抗体诱导的结合增强的研究
对本发明的抗体对执行的BIAcore竞争实验揭示，992及1024的结合在该等抗体针对彼此双向测试时分别增强约55％及58％(图9A)。为进一步研究此现象，设计使用未固定细胞的细胞ELISA以研究在预先以结合不重叠表位的抗体的Fab片段饱和受体之后一种抗体克隆的IgG结合的效果。
细胞ELISA：ELISA是基本上如实施例15中所述加以修改来执行。细胞不经固定以在添加抗体之后允许构形EGFR的弹性。简言的，使10,000个A431-NS细胞在37℃下5％CO2下在含有添加有0.5％FCS及1％P/S的DMEM的96孔ELISA板中生长隔夜。次日早晨，将长满细胞(每孔约20,000个)以PBS洗涤两次，且将用于研究抗体诱导的结合增强的孔与先前展示产生饱和结合的25μl40nM992、1024或1030的单一Fab片段，或12.5μl呈双重组合形式的80nM各单一Fab一起预培育。将25μl含有1％BSA的DMEM添加至用于测试不添加Fab片段的IgG抗体的孔中。添加Fab及培养基之后，将ELISA孔在室温下培育30min，之后将25μl以360nM浓度开始的本发明的IgG或西那格思阴性对照的连续三倍稀释液添加至孔中且在冰上培育一小时。随后，将孔以PBS洗涤四次，且添加50μl于含有1％BSA的DMEM中稀释至1:5000的二级单克隆小鼠-抗-人类(Fc特异性)HRP偶联物且在冰上培育30min。最终，将孔以PBS-T洗涤四次，且通过每孔添加50μl TMB基质使板显色，且在620nm下每5-15-30min进行读取。与基质一起培育之后，通过添加1M H2SO4终止反应，且在450nm下读取吸光率。通过减去仅与二级试剂结合的平均本底，继而通过绘制相对于所测试的各抗体的最大结合％使结合曲线正规化来计算表示为ED50值的功能性亲和力。
试剂，细胞ELISA：
1)DMEM培养基：Gibco，目录号41966-029
2)FCS：Gibco，目录号10099-141
3)Pen strep(P/S)：Gibco，目录号15140-122
4)ELISA板：Costar，目录号3595
5)Wash缓冲液(PBS)：Gibco目录号20012-019
6)抗体稀释缓冲液：含有1％BSA的DMEM
7)小鼠-抗-人类(Fc特异性)HRP偶联物：Ab-direct，目录号MCA647P
8)TMB Plus基质：KemEnTec，目录号4390L
9)1M H2SO4
通过同步ELISA结合研究，使用相同二级抗体试剂及培育时间测定抗体诱导的结合增强的研究。该研究的结果显示于图33中且所计算出的ED50值显示于下表11中。
表11：表示为ED50值的功能性亲和力基于预先以或未以所列Fab片段饱和受体的IgG的亲和性效果的分级。通过对A431-NS细胞的连续抗体IgG滴定来测定ED50值。SD：曲线拟合的标准偏差。
如图33及上表11中所呈现，在预先以1024或1030或1024以及1030的Fab片段饱和受体之后，IgG992展示明显增强的结合。与当单独测试IgG992时的0.6nM相比，与Fab片段一起培育产生分别为0.5；0.4及0.5nM的减小的ED50值。同样，当将细胞首先以Fab992饱和时IgG1024及1030亦展示增加的结合，且仅1024在Fab992与1030在IgG之前均添加至细胞中时展示增加的结合。该结果清楚说明具有一种以上针对相同目标受体上的不重叠表位的抗体的益处。
与实施例2相比，在该实验中测出略低的功能性亲和力。该结果可能归因于在本实施例中使用不同二级试剂且所测试IgG是与未固定细胞在冰上一起培育以避免内化的实情。
实施例16B全长猕猴EGFR的克隆
由自表皮分离的猕猴cDNA，通过使用嵌套式PCR及来源于公开的全长人类EGFR序列的序列特异性引物(GENBANK X00588，Ullrich,A.等人，Nature309(5967),418-425(1984))克隆包括信号肽的全长猕猴EGFR。
PCR试剂：
自正常皮肤表皮分离的猕猴cDNA：CytoMol Unimed，目录号：ccy34218，批号：A711054。
FastStart反应缓冲液(10×)：Roche，目录号：03 553 361 001
FastStart酶：Roche，Roche，目录号：03 553 361 001
Phusion酶：Finnzymes，F-530S(2U/μL)
dNTP25mM：Bioline，目录号：BIO-39029
用于扩增包括信号序列的全长猕猴EGFR的引物：
5'ATG引物：5'-TCTTCGGGAAGCAGCTATGC-3'(SEQ ID NO135)
3'STOP引物：5'-TCATGCTCCAATAAATTCACTG-3'(SEQ ID NO139)
PCR条件：
95℃/2min，40个循环：95℃/30sec，55℃/30sec，72℃/3min30sec，最终在72℃下培育5min。
用于嵌套式PCR扩增全长猕猴EGFR且并入Not及Xho限制性位点的引物：
E579Cyn Not5'：
5'-GGAGTCGGCGGCCGCACCATGCGACCCTCCGGGACGG-3(SEQ IDNO140)
E580Cyn Xho5'：
5'-GCATGTGACTCGAGTCATGCTCCAATAAATTCACTGC-3(SEQ ID NO141)
PCR条件：
95℃/2min，随后30个循环：95℃/30sec解链，55℃/30sec退火，72℃/3min延伸。30个循环之后，使PCR产物再延伸10min。
使用0.5μl模板及0.1μl Phusion酶、0.4μl FastStart酶，在总体积为50μL的最终浓度为1×FastStart缓冲液、0.2mM dNTP及0.2μM各引物的反应液缓冲液中执行PCR反应。
获得表观长度为约4000bp的PCR片段且使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen，Part No.4506-41)进行克隆且测序。所克隆猕猴EGFR的DNA及蛋白质序列显示于图34中。人类EGFR与猕猴EGFR蛋白质序列的比对展示99.2％的序列一致性。
通过FACS分析证明全长人类与猕猴EGFR之间的抗体交叉反应性
通过稳定转染使全长人类及猕猴EGFR表达于CHO细胞表面上，且通过FACS分析测试细胞与一组连续稀释的EGFR抗体的结合。测定是在KD依赖性条件下，通过在所有抗体连续稀释液中保持摩尔过量的抗体进行，该摩尔过量的抗体至少比表达于固定数目细胞的细胞表面上的EGFR抗原分子数高5倍。该设置允许对于所有所测试抗体浓度在完全受体饱和下进行抗体结合的FACS分析。
简言的，以BD FACS数组生物分析仪系统(BD FACS array BioanalyzerSystem)执行定量FACS分析以测定表达于以人类或猕猴全长EGFR转染的CHO细胞表面上的EGFR分子的数目。该分析是通过滴定细胞上经PE标记的艾比特思IgG来执行，且通过与由具有已知PE密度的Rainbow校准粒子制成的标准曲线比较来测定等效PE的分子数目。定量分析揭示经EGFR转染的CHO细胞在各细胞表面上呈现约350,000个分子。随后，以5nM开始连续5倍稀释的本发明的抗体通过与10,000个经EGFR转染的CHO细胞以增加的体积一起培育进行比较，该增加的体积允许在各测定中具有比表面呈现的EGFR抗原至少5倍摩尔过量的抗体。将抗体与细胞一起在震荡器上培育14小时以促进在所有所测试抗体浓度下的完全抗原饱和，同时向FACS缓冲液中添加0.02％NaN3且将温度保持在4℃下以防止受体内化。培育之后，将细胞在4℃下在1200RPM下团粒化5min且再悬浮于200μl FACS缓冲液中。随后将细胞以稀释至1:500的二级山羊F(ab')2抗人类IgG FcγPE染色且在4℃下在震荡器上培育30min。最后，将细胞在FACS缓冲液中洗涤两次且以BD FACS数组生物分析仪分析，其中圈选呈现均匀前向/侧向散射特性的EGFR表达CHO细胞。
FACS试剂：
Rainbow校准粒子：BD，目录号：559123
FACS缓冲液：1×PBS+2％FCS+0.02％NaN3
山羊F(ab')2抗人类IgG FcγPE：Jackson ImmunoResearch，目录号109-116-170
使用所述FACS结合鉴定来测定EGFR抗体IgG992及1024的交叉反应性，且与不与猕猴EGFR交叉反应的对照抗体IgG1320相比较。如下图40中所示，所述FACS鉴定极善于辨别展现人类与猕猴全长EGFR之间良好交叉反应性的抗体(图40A，IgG992及图40B，IgG1024)且物种特异性抗体仅识别全长人类EGFR(图40C，IgG1320)。由该分析可推断出，IgG992与1024均展现针对表达于经稳定转染的CHO细胞表面上的人类与猕猴全长EGFR的极佳交叉反应性。猕猴与人类EGFR之间的结合差异鉴于高度序列相似性令人吃惊，且强调就与用于临床前毒理学研究的动物中的确切目标序列的结合对抗体加以测试的重要性。
实施例17与992、1024及1030同源的克隆
基于免疫吸附鉴定(ELISA及基于细胞的鉴定)的EGFR结合抗体克隆的筛选使得可鉴别如先前实施例中所述的克隆992、1024、1030。亦鉴别与992、1024、1030同源的EGFR特异性克隆(表12)。
预期属于相同群的克隆具有相同结合特异性但可能以不同亲和力结合。因此，在本发明的抗体组合物中群中的克隆可彼此替换，其限制条件为该等克隆的结合亲和力不相差过多。
实施例18：抗体922及1024的人源化
所有抗体含有引发人类抗抗体反应的潜力。该反应在某种程度上与所用治疗性抗体的「人源性」程度相关联。不可能预测免疫原性且由此不能预测人类抗抗体，但对于临床使用存在优选具有高度人源性的抗体的趋势。本发明中所述的抗体的人源性可通过人源化处理[Reichert JM.Monoclonalantibodies in the clinic.Nature Biotechnol,2001；19:819-822；Reichert JM,Rosensweig CJ,Faden LB及Dewitz MC，Monoclonal antibody successes in theclinic.Nature Biotechnol,2005；23:1073-1078]增强。
鼠类mAb的人源化原则上是通过通常称为CDR移植的程序将互补决定区(CDR)移植于具有密切相关序列的IGHV及IGKV域的人类框架区(FR)上来达成(Jones PT,Dear PH,Foote J,Neuberger MS及Winter G，Replacingthe complementarity-determining regions in a human antibody with those from amouse.Nature,1986；321:522-525)。然而，仅超变区的简单CDR移植会使亲和力降低，因为一些框架氨基酸或区域产生与抗原的重要接触或支持抗原结合CDR环的构形[Queen C,Schneider WP,Selick HE,Payne PW,Landolfi NF,Duncan JF,Avdalovic NM,Levitt M,Junghans RP及Waldmann TA，Ahumanized antibody that binds to the interleukin2receptor.Proc Natl Acad SciU S A,1989；86:10029-10033；Al-Lazikani B,Lesk AM及Chothia C，Standardconformations for the canonical structures of immunoglobulins.J Mol Biol,1997；273:927-948]。因此，抗体人源化应包括将源于鼠类可变区的CDR环移植于密切同源的人类框架上，同时保留对抗原结合活性具有已证明的影响的关键鼠类框架残基(Winter,G.及W.J.Harris."Humanized antibodies."Immunol.Today14.6(1993):243-46)。已开发出若干方法且成功应用于达成人源化同时保留抗体亲和力及功能(Almagro,J.C.and J.Fransson."Humanization of antibodies."Front Biosci.13(2008):1619-33中所回顾)。人源化可通过合理方法达成，该等方法例如CDR移植、表面重塑、超人源化、人类序列含量优化(human string content optimization)，其均依赖于构建数个人源化抗体候选者。候选者的氨基酸序列是基于对抗体结构及个别氨基酸直接与间接经由稳定抗原相互作用区域的整体结构对于抗原结合的贡献的洞察及预测。通常候选者须经改进且使一些氨基酸回复突变为初始鼠类残基，因为各抗体具有一些未预见的个别限制条件。通常对于该等方法可能需要数轮连续设计、测试及再设计以保留亲和力及功能。替代方法为较经验的方法，其中产生大型组合文库，且具有所需特征的抗体通过诸如酵母或噬菌体呈现或替代性筛选法的方法进行选择而自变异体池增殖。
本发明所述的抗EGFR抗体可通过CDR移植于人类V区域中加以人源化。在较优选方案中，人类V区域是基于与初始鼠类V区域的同源性加以选择。亦可使用具有其它所要特征(诸如低免疫原性)的人类V基因区域。本实施例描述欲用于人源化992与1024抗EGFR嵌合抗体的方法。图41A中所给出的人源化序列是通过将IMGT定义的来自992IGHV的CDR区域移植于IGHV1-46/IGHJ4中且将992IGKV的CDR区域移植于IGKV1-27/IGKJ1-01中得以产生。图41B中所给出的氨基酸序列是通过将IMGT定义的来自1024IGHV的CDR区域移植于IGHV1-2*02/IGHJ6*02中且将1024IGKV的CDR区域移植于IGKV2-28*01/IGKJ2*01中计算机辅助(in silico)产生。合成编码指定人源化抗体的人工基因且插入哺乳动物表达载体中。如实施例3中所述进行抗体的表达、纯化及活性测试。初始测试之后，可如实施例14中所述通过表面电浆共振测定人源化抗体的结合动力学。类似地，可如实施例15中所述测定与表达于细胞表面上的hEGFR的结合。
若人源化氨基酸的结合活性显著低于对于初始抗体所观察到的结合活性，则由位于光标区(Vernier zone)的人源化框架残基或所提出的支持CDR区域结构的残基开始使用依次回复突变流程来使亲和力再生(Foote,J.and G.Winter."Antibody framework residues affecting the conformation of thehypervariable loops."J Mol.Biol.224.2(1992):487-99；Padlan,E.A."Anatomyof the antibody molecule."Mol.Immunol31.3(1994):169-217)。在IMGT编号中，该等残基对于992IGHV为氨基酸13、45及80；对于992IGKV为氨基酸25；对于1024IGHV为氨基酸13、45、80及82；对于1024IGKL为氨基酸78。可通过使用标准分子生物学方法使用PCR介导的位点定向诱变来构建该等突变。如上述测试所构建的突变。预期该等组的候选者将产生具有保留抗原结合特性的人源化抗体。然而通过在CDR区中通过位点定向诱变引入氨基酸取代获得的其它回复突变或亲和力成熟不能去除。
实施例19双重可变域抗体
双重可变域(dual variable domain，DVD)抗体蛋白质是通过以6个氨基酸的接头(ASTKGP)将992与1024的IGHV域串接融合且以5个氨基酸的接头(TVAAP)将992与1024的IGKV域串接融合加以工程化[Wu C,Ying H,Grinnell C,Bryant S,Miller R,Clabbers A,Bose S,McCarthy D,ZhuRR,Santora L,vis-Taber R,Kunes Y,Fung E,Schwartz A,Sakorafas P,Gu J,Tarcsa E,Murtaza A及Ghayur T.Simultaneous targeting of multiple diseasemediators by a dual-variable-domain immunoglobulin.Nature Biotechnol,2007；25:1290-1297]。双重IGHV与IGKV域融合后继而分别进行IGHC与IGKC域的融合。在一种全长DVD抗体(992L1024)中，992IGHV及IGKV为N末端，继而分别为接头及1024IGHV及IGKV。在第二种全长DVD抗体(1024L992)中，1024IGHV及IGKV为N末端，继而分别为接头及992IGHV及IGKV。将编码992及1024抗体的质粒DNA用作介导构建DVD编码基因的两步PCR的模板。首先分别扩增IGHV及IGKV的两个可变域编码区域，以使其在接头编码区的位置处含有重叠延伸区域(对于模板与引物组合参见表13及表14)。扩增编码C末端邻近可变域的IGKV基因以使人类轻链恒定域编码基因(IGKC)包括于编码序列中。双重可变域抗体亚单元的编码序列及氨基酸序列是显示于附录3中。
制备第一PCR，其中在各管(50μl反应液)中具有以下混合物以获得所给最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、引物(各10pmol)(参见表14)、FastStart高保真酶掺合物(2.2U；Roche)及100ng质粒模板(参见表14)。使PCR经受以下热循环：95℃下2min，20×(95℃下30sec，55℃下30sec，72℃下1min)，72℃下10min。将来自第一PCR反应的具有正确大小的所得PCR产物(参见表14)通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化，且用于通过重叠延伸PCR拼接两个可变域的第二步骤中。制备通过重叠延伸PCR拼接DNA片段的第二PCR，其中在各管(50μl反应液)中具有以下混合物以获得所给最终浓度：1×FastStart缓冲液(Roche)、dNTP混合物(各200μM)、引物(各10pmol，参见表15)、FastStart高保真酶掺合物(2.2U；Roche)及模板(100ng PCR片段，参见表15)。使PCR经受如上所定义的热循环。将来自第二PCR步骤的所得产物通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化，且以限制酶处理，AscI及XhoI用于双重IGHV，且NheI及NotI用于双重IGKV(包括IGKC)。将该等片段通过标准限制酶消化及连接程序连续地连接至哺乳动物IgG表达载体OO-VP-002(图4)中。将所得表达质粒载体在大肠杆菌中扩增且将质粒制备物通过标准方法纯化。将DVD抗体如实施例2中进行表达及纯化，且如实施例3-13中进行活性表征。
若所得抗体展示与目标hEGFr的结合降低或不与目标hEGFr结合，则可测试其它接头。
表13用于构建992与1024的DVD抗体的引物
表14用于自992及1024构建DVD编码基因的第一PCR步骤的引物与模板组合
*所扩增的编码序列包括IGKC基因
表15用于自992及1024构建DVD编码基因的第二PCR步骤(通过重叠延伸拼接)的引物与模板组合
实施例20：在猕猴中与艾比特思组合的6周静脉内给药毒性研究
研究目的：该研究的目的在于测定在向猕猴每周一次静脉内给药6周之后测试制品(992+1024)的毒性。
由于在使用EGFR抑制剂(如艾比特思及维克替比)的临床实践中毒性为剂量限制因素，故认为在早期评估临床相关剂量的992+1024的耐受性很重要。此是因992+1024似乎通过不同于其它EGFR靶向产品的机制发挥作用的实情而突出。其可潜在地产生新的不利效果或比使用其它EGFR抑制剂所见的效果更加严重。
将三只雌性猕猴的组以每周静脉内给药4/2.7mg/kg及12/8mg/kg992+1024及12/8mg/kg艾比特思处理6周。第一剂量4mg/kg及12mg/kg为负荷剂量且2.7mg/kg及8mg/kg为给药5次的维持剂量。12/8mg/kg剂量相当于临床实践中所给药的艾比特思的人类临床剂量。
#第一剂量是用于负荷剂量，第二剂量是用于自第8日起给药
在研究期间跟踪以下参数：死亡率、临床病征、体重、食物消耗、血液学、临床化学、器官重量、宏观发现(Macroscopic finding)。
结果
死亡率：在研究过程中无意外死亡。
临床病征：无治疗相关的不利临床观察结果。
体重：以992+1024或艾比特思治疗对体重无影响。
食物消耗：对食物消耗无明显影响。
血液学：无对血液学参数的影响表明以992+1024或艾比特思治疗的效果。
临床化学：无临床化学参数变化表面以任一测试制品治疗的效果。
在第4周，一只以每日4.2/2.7mg/kg992+1024给药的动物的天冬氨酸转氨酶及丙氨酸转氨酶含量与处理前的值相比增加。该等含量至第6周回到正常范围。由于在其它经处理动物中无类似效果，故肝脏酶的该增加的毒物学意义为未知的。
器官重量：经处理动物与对照动物之间的器官重量的毒物学意义无差异。
宏观发现：验尸检验未注意到一致观察结果表面992+1024或艾比特思的效果。
初步结论：初步资料展示992+1024在所测试剂量下耐受性良好且未观察到与治疗相关的不利效果。
实施例21.肺细胞癌株的生长抑制
已知肺癌细胞系表达酪氨酸激酶域中具有突变的EGFR(Steiner等人，Clin Cancer Res13.5(2007):1540-51)。通过类似于实施例6中所用的方法，研究两种抗体992与1024的组合抑制具有不同EGFR突变的肺癌细胞系HCC827及H1975生长的能力。
结果
如表16及表17中可见，992与1024的组合能够抑制两种细胞系的生长。该组合优于单克隆抗体992及1024且优于维克替比。
表16指定抗体针对HCC827细胞系的IC50值及最大生长抑制
HCC827 IC50(μg/ml) 最大抑制
艾比特思 0.013 80％
维克替比 0.100 60％
992 0.050 80％
1024 0.034 40％
992+1024 0.031 80％
表17指定抗体针对H1975细胞系的IC50值及最大生长抑制
H1975 IC50(μg/ml) 最大抑制
艾比特思 0.010 30％
维克替比 0.141 30％
992 0.056 30％
1024 - 0％
992+1024 0.024 30％
附录1，抗体可变区序列
>992VH(Seq.no.24)
cgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
tgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaactacgatgagaagttcaagagcaaggcc
acactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactctg
cggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtagcggggatgctatggactactggggtca
aggaacctcagtcaccgtctcg
>1024VH(Seq.no.25)
cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacaccttcaccagtcactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
tgagtggataggtgagattaatcctagcagcggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaaggcc
acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactctg
cggtctattattgtgtaagatactatggttacgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctcagt
caccgtctcg
>1030VH(Seq.no.26)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcactttcagtagttatgccctgtcttgggttcgccagactccagagaggaggct
ggagtgggtcgcatccattagtggtgttggtagcacctactttccagacagtgtgaagggccgtttcacc
atgtccagagataatgccaggaacatcctgtacctccaaatgagcagtctgaggtctgaggacacggcca
tgtattactgtgcaagaggttctgatggttacttctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt
caccgtctcg
>1042VH(Seq.no.27)
cgcgcccaggtgcagcttcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct
gtaaggcttctggctacaccttcaccagccactggatgcactgggtgcagcagaggcctggacaaggcct
tgagtggattggagagattcatcctagcaacggtcgtactaactacaatgagaagttcaagaacaaggcc
acactgactgtagacaaatctcccagcacagcctacatgcaactcagcagtttgacatctgaggactctg
cggtctattactgtgcaagatactatggttacgacgatgctatggactactggggtcaaggaacctcagt
caccgtctcg
>1208VH(Seq.no.28)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgctttcagtagctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacattggtagtggtgatgataatacccactatccagactctgtgaagggccgattc
accatctccagacacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatgtattactgtgcaagacagaagtatggtaactacggggacactatggactactggggtcaaggaac
ctcagtcaccgtctcg
>1229\VH(Seq.no.29)
cgcgcccaggttcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gctctgtctctggtttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagttatgtgggctggtggaaatacagattataattcggctctcatgtccagactgaac
atcagcaaggacaattccaagagccaagttttcttaaaagtgaacagtctacaaactgatgacacagcca
tgtactattgtaccagagatcccgatggttactacgtggggtggttcttcgatgtctggggcgcggggac
cacggtcaccgtctcg
>1254VH(Seq.no.30)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgcttacagtacctatgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacattagtagtggtggtgatgccgcctactatcccgacactgtgaagggccgattc
accatctccagagacaatgccaaaaacaccctatacctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatgtattactgtgcgaggtctcgctatggaaactacggggacgctatggactactggggtcaaggaac
ctcagtcaccgtctcg
>1257VH(Seq.no.31)
cgcgccgaggtccagctgcaacagtctggacctgagctggtgaaacctggggcttcagtgaagataccct
gcaagacttctggatacactttcactgactacaacatggcctgggtgaagcagagccatggaaagagcct
tgagtggattggagatattattcctaacaatggtggtgctatctacaaccagaaattcaagggcaaggcc
actttgactgtagacaaatcctccagtacagcctccatggagctccgcagcctgacatctgaggacactg
cagtctatttctgtgcaagaaagaatatctactataggtacgacggggcaggtgctctggactactgggg
tcaaggaacctcagtcaccgtctcg
>1260VH(Seq.no.32)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gcactgtctctgggttttcattaaccacctatggggtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaagcacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc
atcaagaaagacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca
tgtactactgtgccagagcctatggttacaactttgactattggggccaaggcaccactctcacagtctc
g
>1261VH(Seq.no.33)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactctcct
gtgcagtctctggattcactttcagtagctatgtcatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcaaccattactagtggtggtaggaacatctactatctagacagtgtgaaggggcgattc
actatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctgaggtctgaggacacgg
ccatgtattactgtgcaagacatgaggactataggtacgacggttactatgctatggactactggggtca
aggaacctcagtcaccgtctcg
>1277VH(Seq.no.34)
cgcgccgaagtgcagctggtggagtctgggggaggcttagtgaagcctggagagtccttgaaactctcct
gtgcagcctctggattcgctttcagttactctgacatgtcttgggttcgccagactccggagaagaggct
ggagtgggtcgcatacatgagtagtgctggtgatgtcaccttctattcagacactgtgaagggccgattc
accatctccagagacaatgccaagaacaccctgtatctgcaagtgagcagtctgaagtctgaggacacag
ccatatattactgtgtaagacaccgggacgtggctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgt
ctcg
>1284VH(Seq.no.35)
cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcagtgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacaccttcaccagcgactggatgcactggatgaaacagaggcctggacaaggcct
tgagtggattggagagattaatcctagtaacggtcgctctagctacaatgagaagttcaagagcaaggcc
acactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg
cggtctattactgtgcaagaataggtggtatctacgtggagacttactggggccaagggactctggtcac
tgtctcg
>1308VH(Seq.no.36)
cgcgccgaggtccagcttcagcagtctggagctgagctggtgaggcctgggtcctcagtgaagatttcct
gcaaggcttctggctatgcattcagtagctactggatgaactgggtgaggcagaggcctggacagggtct
tgagtggattggacagatttatcctggagatggtgatactaactacaatggaaagttcaagggtagagcc
acactgactgcaaacaaatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctaacatctgaggactctg
cggtctatttctgtgcaagaagggcatcttccctctatgatgtttacccctactactttgactactgggg
ccaaggcaccactctcacagtctcg
>1320VH(Seq.no.37)
cgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtgaagcctggggcttcaatgaagctgtcct
gcaaggcttctggctacaccttcaccaactactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggcct
tgaatggattggagaaattaatcctagcaacggtcgtactaattacaatgagaagttcaagagcaaggcc
acactgactgtagacaaatcgtccagcacagcctacatgcaactcagcagcctgacatctgaggactctg
gggtctattactgtgcaaaaggggggaactactatgattacgactgggactactggggccaaggcaccac
tctcacagtctcg
>1344VH(Seq.no.38)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcactt
gcactgtctctgggttttcattaaccatctatggtgtacactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggagtaatatgggctggtggaaacacaaattataattcggctctcatgtccagactgagc
atcagcaaagacaactccaagagtcaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagcca
tgtacttctgtgccagaggctatggctacaatttagactattggggccaaggcaccactctcacagtctc
g
>1347VH(Seq.no.39)
cgcgcccaggtgcagctgaaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccatcacat
gcaccgtctcaggattctcattaaccggccatggtgtaaactgggttcgccagcctccaggaaagggtct
ggagtggctgggaatgatatggggtgatggaagcacggactataattcaactctcaaatccagactgagt
atcagcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcagactgatgacaccgcca
ggtactactgtgccagaggctacggctacctttactactttgactactggggccaaggcaccactctcac
agtctcg
>992VH(Seq.no.40)
RAEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSRST
NYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYWGQGTS
VTVS
>1024VH(Seq.no.41)
RAQVQLQQPGAELVEPGGSVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSSGRN
NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRYYGYDEAMDYWGQGTSVTVS
>1030VH(Seq.no.42)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYALSWVRQTPERRLEWVASISGVGSTY
FPDSVKGRFTMSRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCARGSDGYFYAMDYWGQGTSVTVS
>1042VH(Seq.no.43)
RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSHWMHWVQQRPGQGLEWIGEIHPSNGRT
NYNEKFKNKATLTVDKSPSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYGYDDAMDYWGQGTSVTVS
>1208VH(Seq.no.44)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAFSSYDMSWVRQTPEKRLEWVAYIGSGDDNT
HYPDSVKGRFTISRHNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARQKYGNYGDTMDYWGQGTSVT
VS
>1229VH(Seq.no.45)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCSVSGFSLTIYGVHWVRQPPGKGLEWLGVMWAGGNTD
YNSALMSRLNISKDNSKSQVFLKVNSLQTDDTAMYYCTRDPDGYYVGWFFDVWGAGTTVT
VS
>1254VH(Seq.no.46)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFAYSTYDMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGDAA
YYPDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAMYYCARSRYGNYGDAMDYWGQGTSVT
VS
>1257VH(Seq.no.47)
RAEVQLQQSGPELVKPGASVKIPCKTSGYTFTDYNMAWVKQSHGKSLEWIGDIIPNNGGA
IYNQKFKGKATLTVDKSSSTASMELRSLTSEDTAVYFCARKNIYYRYDGAGALDYWGQGT
SVTVS
>1260VH(Seq.no.48)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTTYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGSTN
YNSALMSRLSIKKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARAYGYNFDYWGQGTTLTVS
>1261VH(Seq.no.49)
RAEVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFSSYVMSWVRQTPEKRLEWVATITSGGRNI
YYLDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAMYYCARHEDYRYDGYYAMDYWGQGTS
VTVS
>1277VH(Seq.no.50)
RAEVQLVESGGGLVKPGESLKLSCAASGFAFSYSDMSWVRQTPEKRLEWVAYMSSAGDVT
FYSDTVKGRFTISRDNAKNTLYLQVSSLKSEDTAIYYCVRHRDVAMDYWGQGTSVTVS
>1284VH(Seq.no.51)
RAQVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSDWMHWMKQRPGQGLEWIGEINPSNGRS
SYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARIGGIYVETYWGQGTLVTVS
>1308VH(Seq.no.52)
RAEVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVRQRPGQGLEWIGQIYPGDGDT
NYNGKFKGRATLTANKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARRASSLYDVYPYYFDYWGQGT
TLTVS
>1320VH(Seq.no.53)
RAQVQLQQPGAELVKPGASMKLSCKASGYTFTNYWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSNGRT
NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSGVYYCAKGGNYYDYDWDYWGQGTTLTV
S
>1344VH(Seq.no.54)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTIYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIWAGGNTN
YNSALMSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYFCARGYGYNLDYWGQGTTLTVS
>1347VH(Seq.no.55)
RAQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTGHGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTD
YNSTLKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTARYYCARGYGYLYYFDYWGQGTTLTVS
>992VL(Seq.no.56)
ctagccgacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga
acagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaacactata
atacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1024VL(Seq.no.57)
ctagccgacatcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatct
cctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagcc
aggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagt
agcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttatt
actgtgctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgt
ggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtg
tgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgg
gtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgac
gctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcg
cccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1030VL(Seq.no.58)
ctagccgacattgtgctgactcagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccattt
catgcagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttttatgcactggtaccaactgaaaccagg
acagccacccaaactcctcatctatcttgcatccaacctagaatctggggtccctgccaggttcagtggc
agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaagaggaggatgctgcaacctattact
gtcagcacagtagggagtttccgttaacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1042VL(Seq.no.59)
gatattgtgatgactcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgca
ggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagccaggcca
gtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagt
gggtcaagaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtg
ctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgc
accatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctg
ctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaact
cccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgag
caaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtc
acaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1208VL(Seq.no.60)
ctagccgatgttgtgatgactcagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaaactcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaagtacacatgttcccacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1229VL(Seq.no.61)
ctagccgacattgtgatgacccagtctcacaaattcatgtccacatcagtgggagacagggtcagcatca
cctgcaaggccagtcaggatgtgactaatgccgtagcctggtatcaacaaaaaccaggacaatctcctaa
actactgatttactgggcatccatccgacacactggagtccctgatcgcttcacaggcagtagatctggg
acagattatactctcaccatcaacagtgtgcaggctgaagacctggccctttattattgtcagcaacatt
ataacactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1254VL(Seq.no.62)
ctagccgatgttgtgatgacacagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggtaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaagctcctgctctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggagtctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaaatacacatgtgtacacgttcggaggggggacaaagttggaaataaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1257VL(Seq.no.63)
ctagcccaaattgtgctcacacagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccatga
cctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatttactggtaccagcagaagccaggatcctcccccagact
cctgatttatgacgcatccaacctggcttctggagtccctgttcgcttcagtggcagtgggtctgggacc
tcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcagtggagca
gttacccaatcacgttcggctcggggacaaagttggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt
catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc
tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtg
tcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta
cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc
aacaggggagagtgt
>1260VL(Seq.no.64)
ctagccgatatccagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagtgcaagtcagggcattaccaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctattactcatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtata
gtgagattccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1261VL(Seq.no.65)
ctagcccaaattgtgctgacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagaaggtcaccataa
cctgcagtgccagctcaagtgtaagttacatgcactggttccagcagaagccaggcacttctcccaaact
ctggatttatagtacatccaacctggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtggatctgggacc
tcttactctctcacaatcagccgaatggaggctgaagatgctgccacttattactgccagcaaaggagta
gttacccatacacgttcggaggggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt
catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttc
tatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtg
tcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta
cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc
aacaggggagagtgt
>1277VL(Seq.no.66)
ctagccgatgttgtgatgacccagactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatct
cttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaacacctatttacattggtacctgcagaagcc
aggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttctggggtcccagacaggttcagt
ggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggagtttatt
tctgctctcaaagtacacatgttccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1284VL(Seq.no.67)
ctagccgacattgtgctaacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccaccatct
catgcagggccagccaaagtgtcagtacatctacctatagttatatgcactggtatcaacagaaatcagg
acagccacccaaactcctcatcaagtatgcatccaacctagagtctggggtccctgccaggttcagtggc
agtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccatcctgtggaggaggaggatactgcaacatattact
gtcagcacagttgggagattccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggc
tgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgc
ctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggta
actcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct
gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgccc
gtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
>1308VL(Seq.no.68)
ctagccgacatccagatgacacaaactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagggcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
agtcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgga
acagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggta
atacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1320VL(Seq.no.69)
ctagccgacattcagatgacccagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatca
gttgcagtgcaagtcaggacattagcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctatcacacatcaactttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcaatata
gtaagcttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1344VL(Seq.no.70)
ctagccgacattcagatgacacagactacttcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatta
gttgcagtgcaagtcagggcattagtaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaa
actcctgatctattacacatcaagtttacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggg
acagattattctctcaccatcagcaacctggaacctgaagatattgccacttactattgtcagcagtata
gtaagcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgt
cttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataac
ttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggaga
gtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga
ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagc
ttcaacaggggagagtgt
>1347VL(Seq.no.71)
ctagccgaaaatgtgctgactcagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggaaaaggtcaccatga
cctgcagggccagctcaagtgtaagttccagttacttgcactggtaccagcaaaagtcaggtgcctcccc
caaactctggatttatagcacatccaacttggcttctggagtccctgctcgcttcagtggcagtgggtct
gggacctcttactctctcacagtcaacagtgtggagactgaagatgctgccacttattactgccaccagt
acagtggtttcccattcacgttcggctcggggaccaagctggagctgaaacgaactgtggctgcaccatc
tgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaat
aacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagg
agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagc
agactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaag
agcttcaacaggggagagtgt
>992VL(Seq.no.72)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV
PSRFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1024VL(Seq.no.73)
LADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAP
SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY
SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1030VL(Seq.no.74)
LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSFMHWYQLKPGQPPKLLIYLASNL
ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSREFPLTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1042VL(Seq.no.75)
DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLA
SGVPDRFSSSGSRTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL
SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1208VL(Seq.no.76)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1229VL(Seq.no.77)
LADIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVTNAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASIRHTGV
PDRFTGSRSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYNTPLTFGAGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1254VL(Seq.no.78)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLLYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVESEDLGVYFCSQNTHVYTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1257VL(Seq.no.79)
LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPGSSPRLLIYDASNLASGVP
VRFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPITFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1260VL(Seq.no.80)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGITNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYSSSLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSEIPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1261VL(Seq.no.81)
LAQIVLTQSPAIMSASPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVP
ARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPYTFGGGTKLELKRTVAAPSVFIFP
PSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL
TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1277VL(Seq.no.82)
LADVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSN
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1284VL(Seq.no.83)
LADIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVSTSTYSYMHWYQQKSGQPPKLLIKYASNL
ESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS
LSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1308VL(Seq.no.84)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKVLIYYTSRLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1320VL(Seq.no.85)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSTLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1344VL(Seq.no.86)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGV
PSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST
LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1347VL(Seq.no.87)
LAENVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSSSYLHWYQQKSGASPKLWIYSTSNLASG
VPARFSGSGSGTSYSLTVNSVETEDAATYYCHQYSGFPFTFGSGTKLELKRTVAAPSVFI
FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSS
TLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
附录2，抗体恒定区序列
>人类IGKC区(Seq.no.88)
ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataact
tctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagag
tgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagac
tacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagct
tcaacaggggagagtgttaataagcggccgccggtggaggcggt
>人类IGKC区(Seq.no.89)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDS
KDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
外显子1  1..298
内含子   299..689
外显子2  690..734
内含子   735..852
外显子3  853..1182
内含子   1183..1279
外显子4  1280..1602
>人类IGHG1恒定域基因组序列(Seq.no.90)
agtgcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacag
cggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccct
gaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtg
accgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacacca
aggtggacaagagagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcg
ctcctgcctggacgcatcccggctatgcagtcccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctctt
cacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggctctg
ggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctg
ccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccc
tcagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatct
tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctccagctcaaggc
gggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctcca
tctcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacac
cctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtc
aagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtaca
acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaa
gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtgggacc
cgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgctgta
ccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggaga
tgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtg
ggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc
ttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtga
tgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggtaaatga
>IGHG1(Seq.no.91)
SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT
VPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKA
LPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPV
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
附录3，双重可变域抗体序列
>992L1024\IGHV(Seq.no.92)
ggcgcgccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtgaggcctggagcttcagtgaagctgtc
ctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggc
cttgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaactacgatgagaagttcaagagcaagg
ccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagctcagcagcctgacatctgaggactc
tgcggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtagcggggatgctatggactactggggt
caaggaacctcagtcaccgtctcgtcagccagcaccaagggcccccaggtccaactgcagcagcctgggg
ctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacaccttcaccagtca
ctggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggataggtgagattaatcctagcagc
ggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaaggccacactgactgtagacaaatcctccagcacag
cctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattattgtgtaagatactatggtta
cgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgag
>992L1024\IGKV(Seq.no.93)
gctagccgacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatc
agttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgtta
aactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctgg
aacagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaacactat
aatacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcaccagaca
tcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatctcctgcaggtc
tagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagccaggccagtct
cctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcagtagcagtgggt
caggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctca
aaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactgtggctgcacca
tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctga
ataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccca
ggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa
gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa
agagcttcaacaggggagagtgttaataagcggccgc
>1024L992\IGHV(Seq.no.94)
ggcgcgcccaggtccaactgcagcagcctggggctgaactggtggagcctgggggttcagtgaagctgtc
ctgcaaggcttctggctacaccttcaccagtcactggatgcactgggtgaagcagaggcctggacaaggc
cttgagtggataggtgagattaatcctagcagcggtcgtaataactacaatgagaagttcaagagtaagg
ccacactgactgtagacaaatcctccagcacagcctacatgcaattcagcagcctgacatctgaggactc
tgcggtctattattgtgtaagatactatggttacgacgaagctatggactactggggtcaaggaacctca
gtcaccgtctcgtcagccagcaccaagggccccgaggtccaactgcagcaacctgggtctgagctggtga
ggcctggagcttcagtgaagctgtcctgcaaggcttctggctacacattcaccagctactggatgcactg
ggtgaagcagaggcctggacaaggccttgagtggattgggaatatttatcctggtagtcgtagtactaac
tacgatgagaagttcaagagcaaggccacactgactgtagacacatcctccagcacagcctacatgcagc
tcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtacaagaaatggggattactacgttagtag
cggggatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcgag
>1024L992\IGKV(Seq.no.95)
gctagccgacatcgtgatgacacaagctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttccatc
tcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattggtatctgcagaagc
caggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcctcaggagtcccagacaggttcag
tagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttat
tactgtgctcaaaatctagaacttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggaaataaaacgaactg
tggctgcaccagacattcagatgactcagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcac
catcagttgcaggacaagtcaggacattggcaattatttaaactggtatcagcagaaaccagatggaact
gttaaactcctgatctactacacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggt
ctggaacagatttttctctcaccattaacaacgtggagcaagaggatgttgccacttacttttgccaaca
ctataatacggttcctccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaacgaactgtggctgcacca
tctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctga
ataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactccca
ggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaa
gcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaa
agagcttcaacaggggagagtgttaataagcggccgc
>992L1024\IGHV(Seq.no.96)
RAEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSRST
NYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYWGQGTS
VTVSSASTKGPQVQLQQPGAELVEPGGSVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRPGQGLEWIG
EINPSSGRNNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRYYGYDEAMDYW
GQGTSVTVS
>992L1024\IGKV(Seq.no.97)
LADIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGV
PSRFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPDIVMT
QAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPD
RFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
>1024L992\IGHV(Seq.no.98)
RAQVQLQQPGAELVEPGGSVKLSCKASGYTFTSHWMHWVKQRPGQGLEWIGEINPSSGRN
NYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQFSSLTSEDSAVYYCVRYYGYDEAMDYWGQGTSVTVS
SASTKGPEVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIYP
GSRSTNYDEKFKSKATLTVDTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRNGDYYVSSGDAMDYW
GQGTSVTVS
>1024L992\IGKV(Seq.no.99)
LADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSN
LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPYTFGGGTKLEIKRTVAAP
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRTSQDIGNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPS
RFSGSGSGTDFSLTINNVEQEDVATYFCQHYNTVPPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP
SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT
LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (56)

1.一种抗人类EGFR抗体或其抗原结合表位，其包含SEQ ID NO:50中的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列及SEQ ID NO:82中的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体为人源化的。
3.权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO:50的第3-118位氨基酸的VH和含有SEQ ID NO:82的第3-113位氨基酸的VL。
4.一种抗体，其重链具有包含SEQ ID NO:50的第3-118位氨基酸的VH和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的恒定区，且其轻链包含SEQ ID NO:82的第3-220位氨基酸.
5.一种分离的核酸分子，其包含编码权利要求1至4中任一项的抗体的(1)重链或其抗原结合部分，或(2)轻链或其抗原结合部分，或(3)所述两者的核苷酸序列。
6.权利要求5的核酸分子，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:34或66.
7.一种载体，其包含权利要求5或6的核酸分子。
8.一种宿主细胞，其包含编码权利要求1至4中任一项的抗体的(1)重链或其抗原结合部分，或(2)轻链或其抗原结合部分，或(3)所述两者的核苷酸序列，其中所述宿主细胞不在人类当中。
9.一种重组抗体组合物，其包含第一抗人类EGFR抗体分子和区别于第一分子的第二抗人类EGFR抗体分子，其中所述第一抗EGFR抗体分子是权利要求1至4中任一项的抗体。
10.权利要求9的组合物，其中所述第一和第二抗人类EGFR抗体分子不抑制彼此与人类EGFR的结合。
11.权利要求9或10的组合物，其中所述抗体分子的至少一种能够增加其它抗体对人类EGFR的最大结合能力。
12.权利要求9至11中任一项的组合物，其中所述组合物中的第一抗体分子和第二抗体分子的量分别为5％和95％，或者分别为10％和90％，或者分别为20％和60％，或者分别为30％和70％，或者分别为40％和60％，或者分别为45％和55％，或者大约各50％。
13.权利要求9至12中任一项的组合物，其中所述抗体分子结合有区别的EGFR表位。
14.权利要求9至13中任一项的组合物，其中所述组合物除了所述第一和第二抗体分子外不含有其它抗人类EGFR抗体分子。
15.权利要求9至13中任一项的组合物，其还包含第三有区别的抗人类EGFR抗体分子
16.权利要求15的组合物，其中所述第三抗体分子导致所述第一和/或第二抗体分子与人类EGFR增强的结合。
17.权利要求15或16的组合物，其中所述抗体分子结合三种有区别的EGFR表位。
18.权利要求13或17的组合物，其中所述表位不重叠。
19.权利要求9至18中任一项的组合物，其中至少一种抗体分子能够抑制EGF结合。
20.权利要求9至19中任一项的组合物，其中至少一种抗体分子能够防止EGFR的磷酸化
21.权利要求9至20中任一项的组合物，其中至少一种抗体分子能够增强EGFR的内化或降解。
22.权利要求15至17中任一项的组合物，其包含至少一种其它抗人类EGFR抗体分子，其中所述其它抗体结合第四有区别的表位。
23.权利要求22的组合物，其包含至少一种其它抗人类EGFR抗体分子，其中所述其它抗体分子结合第五有区别的表位。
24.权利要求23的组合物，其包含至少一种其它抗人类EGFR抗体分子，其中所述其它抗体分子结合第六有区别的表位。
25.权利要求9至24中任一项的组合物，其包含至少一种域III抗体分子和至少一种域I/II抗体分子。
26.权利要求15至17和22至24中任一项的组合物，其包含至少两种域III抗体分子和一种域I抗体分子。
27.权利要求9至24中任一项的组合物，其包含至少两种域III抗体分子。
28.权利要求9至27中任一项的组合物，其包含至少一种能够增强至少一种其它抗体分子与有区别的表位结合的抗体分子。
29.权利要求9至28中任一项的组合物，其中至少一种抗体分子为具有鼠类可变区与人类恒定区的嵌合抗体。
30.权利要求29的组合物，其中所述人类恒定区来自IgG1或IgG2。
31.权利要求9至28中任一项的组合物，其中至少一种抗体分子为人源化抗体。
32.权利要求15至17中任一项的组合物，其中所述组合物除了所述第一、第二和第三抗体分子外不含有其它抗人类EGFR抗体分子。
33.一种试剂盒，其包含权利要求9至32中任一项的组合物，其中所述抗体分子在一个容器或在独立容器中调配用于同时、依次或单独给药。
34.权利要求9至32中任一项的组合物，其中所述组合物使得受体内化。
35.权利要求9至34中任一项的组合物，其中所述组合物能够诱导体内A431NS细胞的终末分化。
36.权利要求9至35中任一项的组合物，其中所述组合物能够上调体内肿瘤内披蛋白(involucrin)表达。
37.一种双特异性结合分子，其包含SEQ ID NO:50中的重链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列及SEQ ID NO:82中的轻链CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
38.权利要求37的双特异性结合分子，其中所述双特异性结合分子为双重可变域抗体。
39.权利要求37的双特异性结合分子，其中所述双特异性结合分子为双特异性Fab片段或双特异性scFv。
40.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于在表达EGFR的细胞中降低EGFR信号转导的药物组合物中的用途。
41.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于杀死表达EGFR的细胞的药物组合物中的用途。
42.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于在表达EGFR的细胞中诱导凋亡的药物组合物中的用途。
43.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于抑制表达EGFR的细胞增殖的药物组合物中的用途。
44.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于诱导体内肿瘤细胞分化的药物组合物中的用途。
45.权利要求44的用途，其中所述分化为终末分化。
46.权利要求44的用途，其中所述分化伴随有内披蛋白表达增加。
47.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于诱导EGFR内化的药物组合物中的用途。
48.权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子在制备用于在受试者中治疗癌症的药物组合物中的用途。
49.一种药物组合物，其包含权利要求1至4中任一项的抗体、权利要求9至32或34至36中任一项的组合物、权利要求37至39中任一项的双特异性结合分子和医药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。
50.权利要求49的药物组合物，其调配用于癌症治疗中的给药。
51.权利要求49或50的药物组合物，其进一步包括至少一种能够诱导癌细胞分化的化合物。
52.权利要求51的药物组合物，其中所述化合物是选自由以下各物组成的组：视黄酸、苯基丁酸盐/酯、全反式视黄酸、活性形式维生素D。
53.权利要求49至52中任一项的药物组合物，其进一步包含至少一种化疗化合物或至少一种抗肿瘤化合物。
54.权利要求53的药物组合物，其中所述化疗化合物是选自由以下各物组成的组：阿德力霉素、顺铂、紫杉醇、阿霉素、拓朴替康、氟嘧啶、奥赛力铂和伊立替康。
55.一种抗体组合物，其包含至少第一抗人类EGFR抗体分子和区别于所述第一分子的第二抗人类EGFR抗体分子，其中：
a)第一抗人类EGFR抗体分子具有包含含有SEQ ID NO:40的第3-124位氨基酸的VH的重链和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的恒定区，且具有包含SEQ ID NO:72的第3-216位氨基酸的轻链；和
b)第二抗人类EGFR抗体分子具有包含含有SEQ ID NO:41的第3-120位氨基酸的VH的重链和包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的恒定区，且具有包含SEQ ID NO:73的第3-221位氨基酸的轻链。
56.一种分离的核酸分子，其包含编码如下重链或其抗原结合部分、轻链或其抗原结合部分或者所述两者的核苷酸序列：
(a)一种抗体，其包含SEQ ID NO:40中的重链CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:72中的轻链CDR1、CDR2和CDR3；或者
(b)一种抗体，其包含SEQ ID NO:41中的重链CDR1、CDR2和CDR3及SEQ ID NO:73中的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
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