JP3370324B2 - ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 - Google Patents
ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体Info
- Publication number
- JP3370324B2 JP3370324B2 JP50889892A JP50889892A JP3370324B2 JP 3370324 B2 JP3370324 B2 JP 3370324B2 JP 50889892 A JP50889892 A JP 50889892A JP 50889892 A JP50889892 A JP 50889892A JP 3370324 B2 JP3370324 B2 JP 3370324B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- chain
- region
- human
- antibody
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 521
- 101000599048 Homo sapiens Interleukin-6 receptor subunit alpha Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 102000052623 human IL6R Human genes 0.000 title claims abstract description 9
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 89
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 80
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 31
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 25
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 claims description 24
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 claims description 24
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 24
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 24
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 22
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 claims description 20
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 claims 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 102000010781 Interleukin-6 Receptors Human genes 0.000 abstract 3
- 108010038501 Interleukin-6 Receptors Proteins 0.000 abstract 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 193
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 175
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 160
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 120
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 113
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 98
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 92
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 81
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 80
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 67
- 239000000047 product Substances 0.000 description 66
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 61
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 49
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 49
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 49
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 46
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 33
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 28
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 26
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 26
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 25
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 25
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 22
- 238000013461 design Methods 0.000 description 20
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 19
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 18
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 17
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 17
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 16
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 13
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 13
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 13
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 11
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 11
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 10
- 101000935587 Homo sapiens Flavin reductase (NADPH) Proteins 0.000 description 10
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 9
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 5
- 101000865057 Thermococcus litoralis DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 4
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001024304 Mino Species 0.000 description 3
- 102000010292 Peptide Elongation Factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- XKJMBINCVNINCA-UHFFFAOYSA-N Alfalone Chemical compound CON(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XKJMBINCVNINCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108700031361 Brachyury Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101100452395 Mus musculus Il6ra gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- KVHHQGIIZCJATJ-UHFFFAOYSA-N 1-(4-chlorophenyl)-4-(dimethylamino)-2,3-dimethyl-2-butanol Chemical compound CN(C)CC(C)C(C)(O)CC1=CC=C(Cl)C=C1 KVHHQGIIZCJATJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150046224 ABAT gene Proteins 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102100021277 Beta-secretase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710150190 Beta-secretase 2 Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 101000658545 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Type I restriction enyme HindI endonuclease subunit Proteins 0.000 description 1
- 101100297421 Homarus americanus phc-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000690301 Homo sapiens Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 1
- 101001116548 Homo sapiens Protein CBFA2T1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000408495 Iton Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100065514 Mus musculus Eral1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001091370 Mus musculus Kallikrein-8 Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101150102573 PCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000004658 acute-phase response Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N anhydrous guanidine Natural products NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- VJBCNMFKFZIXHC-UHFFFAOYSA-N azanium;2-(4-methyl-5-oxo-4-propan-2-yl-1h-imidazol-2-yl)quinoline-3-carboxylate Chemical compound N.N1C(=O)C(C(C)C)(C)N=C1C1=NC2=CC=CC=C2C=C1C(O)=O VJBCNMFKFZIXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 1
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 125000004119 disulfanediyl group Chemical group *SS* 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- -1 guanidine thiol Chemical class 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000054751 human RUNX1T1 Human genes 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000000004 low energy electron diffraction Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000003584 mesangial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000008171 proliferative glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N temephos Chemical compound C1=CC(OP(=S)(OC)OC)=CC=C1SC1=CC=C(OP(=S)(OC)OC)C=C1 WWJZWCUNLNYYAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005758 transcription activity Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004418 trolamine Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
技術分野
本発明は、ヒトインターロイキン−６受容体（IL−6
R）に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ
領域）、ヒトIL−6Rに対するヒト／マウスキメラ抗体、
ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）
Ｖ領域の相補性決定領域（CDR）がヒトIL−6Rに対する
マウスモノクローナル抗体のCDRにより置き換えられて
いる再構成（reshaped）ヒト抗体に関する。本発明はさ
らに、上記の抗体又はその部分をコードするDNAを提供
する。本発明はさらに、前記DNAを含んで成るベクタ
ー、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転
換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトIL−6Rに
対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトIL−6Rに対する
再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。 背景技術 インターロイキン−６（IL−６）は一連の細胞により
生産される多機能サイトカインである。このものは免疫
応答、急性期反応及び造血を調節し、そして宿主防御機
構において中心的役割を演ずる。このものは広範な組織
に作用して、標的細胞の性質に応じて成長誘導効果、成
長阻害効果及び分化誘導効果を発揮する。IL−６に対す
る特異的レセプター（IL−6R）は、IL−６の多機能性に
従ってリンパ系細胞及び非リンパ系細胞上で発現され
る。IL−６遺伝子の異常発現が種々の疾患、特に自己免
疫疾患、メサンジウム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質
細胞腫／骨髄腫の発病に関与することが示唆されている
（Hiranoら、Immunol.Today,11,443−449,1990の総説を
参照のこと）。ヒト骨髄腫細胞はIL−６を生産しそして
IL−6Rを発現することが観察される。実験において、IL
−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での増殖を阻
害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌においてオート
クリン調節ループが機能していることが示された（Kawa
noら、Nature,332,83,1988）。 IL−6Rは種々の動物細胞の表面に存在し、そしてIL−
６に特異的に結合し、そして細胞表面上のIL−6R分子の
数が報告されている（Tagaら、J.Exp.Med.196,967,198
7）。さらに、ヒトIL−6RをコードするcDNAがクローン
化され、そしてIL−6Rの一次構造が報告されている（Ya
masakiら、Science,241,825,1988）。 マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免
疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そして
この理由のため、ヒトにおけるそれらの療法的価値は制
限される。ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短
い。さらに、ヒト抗マウス抗体は、予定された効果を妨
害するのみならず、患者における不都合なアレルギー応
答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなくして頻
回投与することはできない。 これらの問題を解決するため、ヒト型化（humanize
d）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの
方法でヒト型化することができる。より簡単な方法は、
可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に由来しそ
して定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を
作製する方法である。得られるキメラ抗体はもとのマウ
ス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもとのマウス
抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待
することができる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に
由来する蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そ
してそれ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低い
と予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免
疫原性が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がな
お生ずる可能性がある（LoBuglioら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,84,4220−4224,1989）。 マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複
雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさ
らに大幅に低下させるものである。この方法において
は、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領域（comp
lementarity determining region;CDR）をヒト可変領
域に移植して「再構成」（reshaped）ヒト可変領域を作
製する。次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定常
領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体の
ヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はCDRと極く一部
のフレームワーク（FR）のみである。CDRは超可変蛋白
質配列により構成されている。これらは種特異的配列を
示さない。これらの理由のため、マウスCDRを担持する
再構成ヒト抗体はもやはヒトCDRを含有する天然ヒト抗
体より強い免疫原性を有しないはずである。 前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的のために有
用であると予想されるが、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒ
ト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製
造方法であって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る
方法は存在しない。従って、特定の抗原に対する十分に
活性な再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が
必要である。ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル
抗体、すなわちPM1およびMT18は作製されており（特願
平２−189420）、そして本発明者らはヒトIL−6Rに対す
るマウスモノクローナル抗体AUK12−20、AUK64−７及び
AUK146−15を調製しているが、本発明者らはヒトIL−6R
に対する再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知らな
い。 さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌードマウス
に、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体が注
射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害されることを、本発
明者らは見出した。このことは、骨髄腫の治療のための
療法剤として抗ヒトIL−6R抗体が有用であることを示唆
している。従って本発明はヒトIL−6Rに対する、免疫原
性の低い抗体を提供しようとするものである。 発明の開示 従って、本発明はヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体
を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の
過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発
明はさらに、再構成ヒト抗体の部分、並びに再構成ヒト
抗体及びその部分並びにキメラ抗体の製造のための発現
系を提供する。 さらに具体的には、本発明は、ヒトIL−6Rに対するマ
ウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びにヒトIL−
6Rに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を提
供する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並
びに （２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体を提供す
る。 本発明はさらに、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR;並びにヒトIL−6Rに対す
るマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDRを提供
する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（FR）、及
び （２）ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
Ｌ鎖Ｖ領域のCDR、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＬ
鎖Ｖ領域；並びに （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のFR、及び （２）ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域のCDR、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域を提供する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のCDRを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＬ
鎖；並びに （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のCDRを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＨ
鎖を提供する。 本発明はさらにまた、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトＬ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＬ鎖CDRを含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトＨ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖CDRを含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提
供する。 本発明はまた、前記種々の抗体構成ポリペプチド、又
はその部分をコードするDNAに関する。 本発明はまた、上記DNAを含んで成るベクター、例え
ば発現ベクターに関する。 本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された
宿主を提供する。 本発明はさらにまた、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体
の製造方法、及びヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体の
製造方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の抗体ペプチドの発現のために有用
な、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）プロモーター／
エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示す。 図２は、ヒトIL−6Rに結合する本発明のキメラ抗体AU
K12−20の能力の確認のためのELISAの結果を示すグラフ
である。 図３は、ヒトIL−6RへのヒトIL−６の結合を阻害する
本発明のキメラ抗体AUK12−20の能力の確認のためのELI
SAの結果を示すグラフである。 図４は、ヒトIL−6Rへの本発明のキメラ抗体PM1a及び
PM1bの結合についてのELISAの結果を示すグラフであ
る。 図５は、ヒトIL−6RへのヒトIL−６の結合を阻害する
本発明のキメラ抗体PM1a及びPM1bの能力を試験するELIS
Aの結果を示すグラフである。 図６は、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムであ
る。 図７は、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムであ
る。 図８は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲ
ージョン・ファクター１α（HEF−１α）プロモーター
／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドHEF−12h−
ｇγ１の作製の過程を示す。 図９は、Ｌ鎖の発現のために有用な、HEF−１αプロ
モーター／エンハンサー系を含んで成る発現プラスミド
HEF−12k−gkの作製の過程を示す。 図10は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠
陥SV40プロモーター／エンハンサー配列に連結されたジ
ヒドロフォレートレダクターゼ（dhfr）及びHCMVプロモ
ーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドDHFR
−PMh−ｇγ１の作製の過程を示す。 図11は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠
陥SV40−プロモーター／エンハンサー配列に連結された
dhfr遺伝子及びEF1αプロモーター／エンハンサーを含
んで成る発現プラスミドDHFR−ΔＥ−RVh−PM1−ｆの作
製の過程を示す。 図12は、ヒトIL−6Rへの結合についての再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」及び「ｂ」の能
力を示すグラフである。 図13は、ヒトIL−6Rへの結合についての再構成ヒトPM
−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を示すグラ
フである。 図14は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構
成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を
示すグラフである。 図15は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のために有用
な、ヒトEF1−αプロモーター／エンハンサーを含んで
成る発現プラスミドHEF−VL−gk及びHEF−VH−ｇγ１を
示す。 図16は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージ
ョン「ａ」をコードするDNAの作製の過程を示す。 図17は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体Ｌ鎖Ｖ領域の能力の確認のためのELISAの結果を示
すグラフである。図中、標準AUK12−20（キメラ）はキ
メラAUK12−20抗体をCHO細胞により大量に製造して精製
したものについての結果を示す。 図18は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｂ」）
の能力についてのELISAの結果を示すグラフである。 図19は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｄ」）
の能力についてのELISAの結果を示すグラフである。 図20は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の化学
合成の過程を示す。 図21は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ａ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図22は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｂ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図23は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｃ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図24は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｄ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 発明を実施するための最良の形態 マウスＶ領域をコードするDNAのクローニング さらに詳しくは、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＶ領域をコードするDNAをクローン化する
ためには、遺伝子源として、ヒトIL−6Rに対するモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製すること
が必要である。この様なハイブリドーマとして、特願平
２−189420号明細書にはモノクローナル抗体PM1を生産
するマウスハイブリドーマPM1及び該抗体の性質が記載
されている。本明細書の参考例２にハイブリドーマPM1
の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒト
IL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマAUK12−20、AUK64−７及びAUK146−15を作
製している。これらのハイブリドーマの作製方法は本明
細書の参考例３に記載されている。 マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする目
的のDNAをクローン化するためハイブリドーマ細胞を破
壊し、そしてChirgwinら、Biochemistry 18,5294,1977
に記載されている常法により全RNAを得る。次に、この
全RNAを用いて、J.W.Larrickら、Biotechnology,７,93
4,1989に記載されている方法を用いて一本鎖cDNAを合成
する。 次に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて前記c
DNAの有意義な部分の特異的増幅を行う。マウスモノク
ローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号:1〜11に示す11種のオリゴヌクレオチドプ
ライマー（Mouse Kappa Variable;MKV）及び配列番
号:12に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Mause Ka
ppa Constant;MKC）をそれぞれ５′−末端プライマー
及び３′−末端プライマーとして使用する。前記MKVプ
ライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードす
るDNA配列とハイブリダイズし、そして前記MKCプライマ
ーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするDNA配列と
ハイブリダイズする。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖
Ｖ領域の増幅のため、配列番号:13〜22に示す10種のオ
リゴヌクレオチドプライマー（Mouse Heavy Variabl
e;MHV）及び配列番号:23に示すオリゴヌクレオチドプラ
イマー（Mouse Heavy Constant;MHC）をそれぞれ５′
−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用
する。 なお、５′−末端プライマーはその５′−末端近傍に
制限酵素Sal I切断部位を提供する配列GTCGACを含有
し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近傍
に制限酵素Xmal切断部位を提供するヌクレオチド配列CC
CGGGを含有する。これらの制限酵素切断部位は可変領域
をコードする目的のDNA断片をクローニングベクターに
サブクローニングするために用いられる。 次に増幅生成物を制限酵素Sal I及びXma Iで切断させ
て、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域を
コードするDNA断片を得る。他方、プラスミドpUC19のご
とき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素Sal I
及びXma Iにより切断させ、このpUC19に前記DNA断片を
連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的
とする可変領域をコードするDNA断片を含むプラスミド
を得る。 クローン化されたDNAの配列決定は任意の常法に従っ
て行うことができる。 目的とするDNAのクローン化及びその配列決定を実施
例１〜３に具体的に記載する。 相補性決定領域（CDR） 本発明はさらに、本発明の各Ｖ領域の超可変又は相補
性決定領域（CDR）を提供する。Ｌ鎖及びＨ鎖の各対の
Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこ
の領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の
比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、そ
れらは３個の超可変領域又はCDRにより連結されている
（Kabat,E.A.ら、「Sequences of Proteins of Imm
unological Interest」,US Dept.Health and Human
Services 1983）。前記４個のフレームワーク領域
（FR）の多くの部分はβ−シート構造をとり、CDRはル
ープを形成する。CDRはある場合にはβ−シート構造の
一部分を形成することもある。CDRはFRによって非常に
近い位置に保持され、そして他の領域のCDRと共に抗原
結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の
素材として有用なこれらのCDR、及びそれをコードするD
NAをも提供する。これらのCDR領域は、Ｖ領域の既知ア
ミノ酸配列と照合することによって、Kabat,E.A.ら、
「Sequences of Proteins of Immunological Inte
rest」の経験則から見出すことができ、実施例４におい
て具体的に説明する。 キメラ抗体の作製 ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計す
るに先立って、使用するCDRが実際に抗原結合領域を形
成することを確かめる必要がある。この目的のため、キ
メラ抗体を作製した。さらに実施例１及び２に記載され
る４種類のモノクローナル抗体のクローン化されたDNA
のヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒトIL−6R
抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知のマウス及びヒ
トの抗体のＶ領域と比較した。４種類のモノクローナル
抗体のそれぞれについて、１セットの典型的な機能的マ
ウスＬ及びＨ鎖Ｖ領域がクローニングされた。しかしな
がら、４種類すべてのマウス抗ヒトIL−6R抗体は比較的
異なるＶ領域を有していた。４種類の抗体は相互に単に
微小な相違ではなかった。クローン化されたマウスＶ領
域を用いて４種類のキメラ抗ヒトIL−6R抗体を作製し
た。 キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、PCR−
クローン化cDNAに見られるようなマウスリーダー配列及
びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存
在するヒトＣ領域をコードする配列に連結することを含
んで成る。前記４種類のモノクローナル抗体の内、モノ
クローナル抗体AUK12−20からのキメラ抗体の作製を実
施例５に記載する。 モノクローナル抗体PM−１からのキメラ抗体の作製を
実施例６に記載する。マウスPM−１κＬ鎖リーダー領域
及びＶ領域をコードするcDNAを、ヒトＬ鎖Ｃ領域をコー
ドするヒトゲノムDNAを含有する発現ベクターにPCR法を
用いてクローン化した。マウスPM−１抗体（単に「PM−
１抗体」又は「PM」という場合もある）のＨ鎖リーダー
及びＶ領域をコードするcDNAを、ヒトγ−1C領域をコー
ドするゲノムDNAを含有する発現ベクターにPCR法を用い
てサブクローン化した。特に設計されたPCRプライマー
を用いて、マウスPM−１抗体のＶ領域をコードするcDNA
をそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配
列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿入
されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で
適切に機能するようにした。次に、これらのプライマー
を用いてPCRにより増幅して得たマウスPM−１抗体のＶ
領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するHCMV発現ベ
クター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々
の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性
（transient）発現又は安定な発現のために適当であ
る。 マウスPM−１抗体中に存在するＶ領域と同じＶ領域を
有するキメラPM−１抗体（バージョンａ）の作製に加え
て、キメラPM−１抗体の第二のバージョン（バージョン
ｂ）を作製した。キメラPM−１抗体（バージョンｂ）に
おいては、Ｌ鎖Ｖ領域中の位置107のアミノ酸がアスパ
ラギンからリジンに変えられている。マウスPM−１抗体
からのＬ鎖Ｖ領域と他のマウスＬ鎖Ｖ領域との比較にお
いて、位置107におけるアルギニンの存在は異常である
ことが注目された。マウスκＬ鎖Ｖ領域においては、位
置107の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスPM
−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置107に非典型的なアミノ
酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するた
め、位置107を典型的なアミノ酸であるリジンに変え
た。この変更は、PCR−変異誘発法（M.Kammanら、Nucl.
Acids Res.（1987）17:5404）を用いてＬ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNA配列中に必要な変更を行うことにより達成
された。 キメラPM−１抗体バージョン（ａ）はヒトIL−6Rに結
合する活性を示した。キメラPM−１抗体バージョン
（ｂ）もバージョン（ａ）と同様にヒトIL−6Rに結合す
る。同様に、他の２種類のモノクローナル抗体AUK64−
７及びAUK146−15からキメラ抗体を作製した。４種類す
べてのキメラ抗体はヒトIL−6Rによく結合し、機能的測
定において、正しいマウスＶ領域がクローン化されそし
て配列が決定されていたことが示された。 ４種類のマウス抗ヒトIL−6R抗体から、ヒトIL−6Rに
対する再構成ヒト抗体の設計及び作製のための第一の候
補としてマウスPM−１抗体を選択した。マウスPM−１抗
体の選択は主として、ヌードマウスに移植されたヒト骨
髄腫細胞に対するマウス抗ヒトIL−6R抗体及びキメラ抗
体の効果を研究して得られた結果に基く。４種類のマウ
ス抗ヒトIL−6R抗体の内、PM−１抗体が最も強い抗腫瘍
細胞活性を示した。又、キメラPM−１抗体はキメラAUK1
2−20抗体よりも強い抗腫瘍活性を示した。 マウスモノクローナル抗体PM−１のＶ領域と既知のマウ
ス及びヒトの抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体のCDRがヒトモノクローナ
ル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するため
には、マウスモノクローナル抗体のFRとヒトモノクロー
ナル抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが望ま
しい。従って、マウスPM−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領
域を、OWL（or Leeds）database of protein seque
ncesに見出されるすべての既知マウス及びヒトのＶ領域
と比較した。 マウス抗体のＶ領域に関しては、PM−１抗体のＬ鎖Ｖ
領域はマウス抗体musigkcko（Chen,H.T.ら、J.Biol.Che
m.（1987）262:13579−13583）のＬ鎖Ｖ領域と最も類似
しており、93.5％の同一性（identity）が存在した。PM
−１抗体のＨ鎖Ｖ領域はマウス抗体musigvhr2（F.J.Gra
ntら、Nucl.Acids Res.（1987）15:5496）のＨ鎖Ｖ領
域に最も類似しており、84.0％の同一性が存在した。マ
ウスPM−１抗体のＶ領域は既知マウスＶ領域に高比率の
同一性を示し、マウスPM−１抗体のＶ領域が典型的なマ
ウスＶ領域であることが示される。このことはさらに、
クローン化されたDNA配列が正しいという間接的な証明
を与える。一般に、Ｈ鎖Ｖ領域間に比べてＬ鎖Ｖ領域間
の方がより高い比率の同一性が存在する。これはおそら
く、Ｈ鎖Ｖ領域に比べてＬ鎖Ｖ領域において一般的に観
察されるより少ない量の多様性のためであろう。 ヒト抗体のＶ領域に関しては、マウスPM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域は、REIとも称されるヒト抗体klhure（W.Palm
ら、Physiol.Chem.（1975）356:167−191）のＬ鎖Ｖ領
域に最も類似しており、72.2％の同一性が存在する。PM
−１抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒト抗体humighvap（VAP）
（H.W.Schroederら、Science（1987）238:791−793）に
最も類似しており、71.8％の同一性が存在する。マウス
PM−１抗体からの再構成抗体をいかに設計するかを考え
るためにヒトＶ領域との比較が最も重要である。ヒトＶ
領域への同一性の比率はマウスＶ領域への同一性の比率
より低い。これはマウスPM−１抗体のＶ領域がマウスＶ
領域に類似しており、そしてヒトＶ領域には類似してい
ないことの間接的証明である。この証明にまた、ヒト患
者における免疫原性の問題を解決するためにマウスPM−
１のＶ領域をヒト型化する（humanize）ことが最善であ
ることを示す。 マウスPM−１抗体のＶ領域をさらに、E.A.Kabatら、
（1987）Sequences ofProteins of Immunological Inte
rest,Forth Edition,U.S.Department of Health and Hu
man Services,U.S.Government Printing Officeにより
定義される、ヒトＶ領域の異なるサブグループについて
のコンセンサス配列と比較した。Ｖ領域のFR間で比較を
行った。その結果を表１に示す。 （１）コンセンサス配列はKabatら（1987）に記載され
ている マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のFRはヒトＬ鎖Ｖ領域
のサブグループＩ（HSG I）のコンセンサス配列からのF
Rに最も類似しており、70.1％の同一性が存在する。マ
ウスPM−１のＨ鎖Ｖ領域のFRはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグ
ループII（HSG II）のコンセンサス配列からのFRに最も
類似しており、52.9％の同一性が存在する。これらの結
果は、既知のヒト抗体との比較から得られた結果を支持
している。ヒトREI中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域の
サブグループＩに属し、そしてヒトVAP中のＨ鎖Ｖ領域
はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIに属する。 ヒト抗体中のＶ領域とのこれらの比較から、再構成ヒ
トPM−１抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域を
選択することが可能である。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（HSG I）に属
するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトPM−１
抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループII（HSG
II）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが最善であ
ろう。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計における第一段階
は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することで
あった。マウスPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のFRは、サブグ
ループＩに属するヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のFRに最も類似
していた（表１）。前記のごとく、マウスPM−１抗体の
Ｌ鎖Ｖ領域と既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較におい
て、それはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員
であるヒトＬ鎖Ｖ領域REIに最も類似していた。従っ
て、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてRE
IからのFRを使用した。また、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてREIのFRを使用
した。 REIに基くこれらのヒトFR中には、もとのヒトREIに比
べて５個の相違が存在する（kabatら、1987、によれば
位置39,71,104,105及び107;表２を参照のこと）。FR4中
の３個の変化（位置104,105及び107）は他のヒトκＬ鎖
からのＪ領域に基いており、そしてそれ故にヒトからの
逸脱を成すものではない（L.Riechmannら、Nature（198
8）322:21−25）。位置39及び71における２個の変化は
ラットCAMPATH−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のFR中に存在する
アミノ酸にもどる変化であった（Riechmannら、198
8）。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョン
を設計した。第一のバージョン（バージョン「ａ」）に
おいては、ヒトFRは再構成ヒトCAMPATH−1H抗体中に存
在するREIに基くFR（Riechmannら、1988）と同一であ
り、そしてマウスCDRはマウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域
中のCDRと同じであった。第二のバージョン（バージョ
ン「ｂ」）はバージョン「ａ」に基き、ヒトFR3中の位
置71におけるアミノ酸１個のみを異にする。C.Chothia
ら、J.Mol.Biol.（1987）196:901−917により定義され
るように、残基71はＬ鎖Ｖ領域のCDR1の標準的（canoni
cal）構造の部分である。この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ
領域のCDR1ループの構造に直接影響すると予想され、そ
してそれ故に抗体結合に大きく影響するであろう。マウ
スPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域において、位置71はチロシン
である。再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のバージョ
ン「ａ」の設計に使用した修飾されたREIのFRにおいて
は位置71はフェニルアラニンであった。再構成ヒトPM−
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」においては、位置
71のフェニルアラニンがマウスPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中
に見出されるようにチロシンに変えられている。表２
は、マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトCAMPAT
H−1H抗体中での使用のために修飾されたREIのFR（Riec
hmannら、1988）及び再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領
域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を
示す。 注:REIのFRは再構成ヒトCAMPATH−1H抗体中に見出さ
れるものである（Riechmannら、1988）。REIのFR中の５
個の下線を付したアミノ酸はヒトREIのアミノ酸配列（P
lamら、1975;0.Eppら、Biochemistry（1975）14:4943−
4952）から異なるアミノ酸である。マウスPM−１抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域中のFRはサブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ
領域に最も類似している（表１）。前記のごとく、マウ
スPM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域と既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との
比較において、これはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループII
の１構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域VAPに最も類似してい
た。ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの他の構成員であ
るヒトＨ鎖Ｖ領域NEWを、再構成ヒトPM−１抗体のＨ鎖
Ｖ領域の作製のための出発材料として、及び再構成ヒト
PM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用い
た。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョ
ンを設計した。６種類のバージョンのすべてにおいて、
ヒトFRは再構成D1.3中に存在するNEW FRに基いてお
り、そしてマウスCDRはマウスPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域中
のCDRと同じである。ヒトFR中の７個のアミノ酸残基
（位置1,27,28,29,30,48及び71;表３参照）は抗原結合
に不都合な影響を与える可能性を有するものと同定され
ている。マウスPM−１抗体のＶ領域のモデルにおいて、
Ｈ鎖Ｖ領域中の残基１はCDRループの近くに位置する表
面残基である。残基27,28,29、及び30は、C.Chothia
ら、Nature（1989）34:877−882により推定されるよう
にＨ鎖Ｖ領域のCDR1の標準的（canonical）構造の部分
であり、そして／又はＨ鎖Ｖ領域の第一構造ループの部
分を構成することがマウスPM−１抗体Ｖ領域のモデルに
おいて観察される（Chothiaら、1987）。残基48はマウ
スPM−１抗体のＶ領域のモデルにおいて埋った（burie
d）残基として観察された。埋った（buried）残基の変
化はＶ領域及びその抗原結合部位の全体構造を破壊する
可能性がある。残基71は、Chothiaら（1989）により予
想されるようにＨ鎖Ｖ領域のCDR2の標準（canonical）
構造の部分である。再構成ヒトPM−１抗体の６種類のバ
ージョンはヒトNEWのFR中のこれら７つの位置のアミノ
酸の変化の異る組合わせを含む（表３を参照のこと）。 注:NEWのFRには再構成ヒトCAMPATH−1H抗体の第一バ
ージョン（Riechmannら、1988）中に見出されるもので
ある。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域をコードするDNAの作製 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれ
の第一バージョンをコードするDNAを新規なPCR利用法を
用いて作製した。要約すれば、適当なヒトFRをすでに含
有する再構成ヒトＶ領域をコードするプラスミドをPCR
プライマーを用いて修飾し、ヒトＶ領域中に存在するCD
RをマウスPM−１抗体からのCDRにより置換した。再構成
ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNAの作製のた
めの出発材料は、再構成ヒトD1.3L鎖Ｖ領域をコードす
るDNAを含有するプラスミドDNAであった。この再構成ヒ
トD1.3L鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域REI中に存在するFRに
基いて作製された。再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を
コードするDNAの作製のための出発材料は再構成ヒトD1.
3H鎖Ｖ領域をコードするDNAであった。この再構成ヒトD
1.3抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAはヒトＨ鎖Ｖ領域NE
W（W.Verhoeyenら、Science（1988）239:1534−1536）
のFRをコードするDNAに基いて作製された。 所望のヒトFRをコードするDNAを含有する出発プラス
ミドDNAを選択した後、マウスD1.3CDRに代るマウスPM−
１抗体CDRの置換を可能にするようにPCRプライマーを設
計しそして合成した。各再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域に
つき、３種類のプライマーはマウスPM−１抗体CDRをコ
ードするDNA配列を含有し、そして２種類のプライマー
は再構成ヒトＶ領域をコードする全体DNA配列を挟むよ
うに設計されている。一連のPCR反応における５種類のP
CRプライマーの使用が、出発再構成ヒトＶ領域中に存在
するヒトFRをコードするDNA及びマウスPM−１抗体Ｖ領
域中に存在するCDRをコードするDNAから成るPCR生成物
をもたらした（実施例７、並びに図７及び図８を参照の
こと）。PCR生成物をクローン化し、そして配列決定し
て、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージ
ョン「ａ」全体DNA配列が正しいアミノ酸配列をコード
していることを確認した。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ
領域バージョン「ａ」の配列を配列番号55に示す。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の他のバージョンをコー
ドするDNAは、公表されているPCR−変異誘発法（Kamman
ら、1989）にわずかな変更を加えた方法を用いて作製し
た。再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計に関して記載し
たように、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追
加のバージョン（バージョン「ｂ」）をコードするDNA
を作製し、そして再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の５
種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，
「ｄ」，「ｅ」、及び「ｆ」をコードするDNAを作製し
た。これらの追加のバージョンは、第一バージョンから
の一連の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこれらの微
細な変化はPCR変異誘発を用いてDNA配列の微細な変更を
行うことにより達成された。DNA配列に必要な変化を導
入するPCRプライマーが設計された。一連のPCR反応に続
き、PCR生成物をクローン化し、そして配列決定してDNA
配列中の変化が計画通りに起っていることを確認した。
再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」の配
列を配列番号54に示す。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の種々のバージョンのDN
A配列を確認した後、再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域をコ
ードするDNAを、ヒトＣ領域をコードするDNAをすでに含
有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングし
た。すなわち、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドするDNAをヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするDNA配列に連結
し、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA
をヒトγ−1C領域をコードするDNA配列に連結した。再
構成ヒトPM−１抗体のより高いレベルの発現を達成する
ため、図１に示すようなHCMV発現ベクターを修飾して、
HCMVプロモーター・エンハンサー領域をヒトエロンゲー
ションファクター（human elongation factor;HEF−
１α）プロモーター・エンハンサーにより置き換えた
（図15を参照のこと）。 次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）と、Ｈ鎖
Ｖ領域バージョン（ａ）〜（ｆ）のすべての組合せをヒ
トIL−6Rへの結合について試験し、そしてその結果、実
施例11に詳細に記載するように、Ｌ鎖バージョン（ａ）
とＨ鎖バージョン（ｆ）とを含んで成る再構成ヒト抗体
がキメラPM−１抗体（ａ）と同じレベルでIL−6Rに結合
する能力を示した。 発現のレベルを改良するための、再構成ヒトPM−１抗体
Ｖ領域をコードするDNAの変更 COS細胞中で生産される再構成ヒトPM−１抗体の発現
レベルの検討において、再構成ヒトＨ鎖の発現が常に、
再構成ヒトＬ鎖又はキメラＬ鎖もしくはＨ鎖の発現レベ
ルに比べて約10分の１であることが明らかになった。低
レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
域にあるようであった。低レベルの発現が低レベルの転
写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒトPM−
１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクターにより同時形
質転換されたCOS細胞からRNAを調製した。マウスPM−１
抗体Ｖ領域をコードするDNAのPCRクローニングについて
記載したようにして一本鎖cDNAを合成した。再構成ヒト
Ｌ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列の両端を挟む
ように設計されたPCRプライマーを用いて、再構成ヒト
Ｌ鎖Ｖ領域又は再構成Ｈ鎖Ｖ領域に対応する前記一本鎖
cDNAからPCR生成物を生成せしめた。 再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAについて、２
種類のPCR生成物が存在し、一方は予想通り408bpの長さ
を有し、他方より短い299bpのPCR生成物であった。正し
いサイズのPCR生成物はPCR生成物の全生成量の約90％を
占め、そして短いPCR生成物は全生成量の約10％を占め
た。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域についてもやはり２種類のPC
R生成物が存在し、一方は予想通り444bpの長さを有し、
そして他方は370bpの長さの短いPCR生成物であった。し
かしながらこの場合、正しくない短い方のPCR生成物がP
CR生成物の全生成量の大部分、すなわち約90％を占め
た。正しいサイズのPCR生成物はPCR生成物の全生成量の
約10％に過ぎなかった。これらの結果は、再構成ヒトＶ
領域をコードするRNAの幾らかが欠失を含むことを示し
た。 どの配列が除去されたかを決定するため、短い方のPC
R生成物をクローニングし、そして配列決定した。DNA配
列から、Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のいずれについてもDNAの
特定の部分が欠けていることが明らかになった。除去さ
れた配列を挟むDNA配列の検討により、これらの配列は
スプライスドナー−アクセプター配列のコンセンサス配
列（Breathnach.Rら、Ann.Rev.Biochem.（1981）50:349
−383）に相当することが明らかとなった。再構成ヒト
Ｈ鎖の低い発現レベルは、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域の設計
が、どちらかと言えば効果的なスプライスドナー−アク
セプター部位を不注意に形成させたためであると説明さ
れた。さらに、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域の設計はどちらか
と言えば非効果的なスプライスドナー−アクセプター部
位を不注意に形成させたようであった。これらのスプラ
イスドナー−アクセプター部位を除去するため、ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれバージョン
「ａ」及び「ｆ」をコードするDNA配列のわずかな変更
を前記のPCR−変異誘発法を用いて行った。 低下した発現レベルの原因は、再構成ヒトＬ鎖及びＨ
鎖Ｖ領域（配列番号:54及び55）の両者のリーダー配列
をコードするDNA中のイントロンの存在であると考えら
れた。これらのイントロンはもともと、再構成ヒトD1.3
抗体のＶ領域（Verhoeyenら、1988）をコードするDNAの
作製において使用されたマウスμＨ鎖リーダー配列（M.
S.Neubergerら、Nature（1985）314:268−270）をコー
ドするDNAに由来する。再構成ヒトD1.3抗体をコードす
るDNAは、マウス免疫グロブリンプロモーターを用いる
哺乳類細胞ベクターにおいて発現されたためマウスリー
ダーイントロンの存在が重要であった。リーダーイント
ロンは免疫グロブリンプロモーターからの発現のために
は重要であるが、しかしHCMVのごときウィルスプロモー
ターからの発現のためには重要でない（M.S.Neuberger
ら、Nucl.Acids Res.（1988）16:6713−6724）配列を
含有している。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖をコ
ードするDNAが免疫グロブリンプロモーター以外のプロ
モーターを用いるベクターにおいて発現される場合、リ
ーダー配列中のイントロンは、再構成ヒトＶ領域をコー
ドするDNAのPCR−クローニングにより除去された（実施
例12を参照のこと）。 低下した発現レベルの他の可能性のある原因は、再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAとヒトγ
−1C領域をコードするDNAとの間のイントロン内の約190
bpの非機能的DNAの存在であると考えられた。再構成ヒ
トBI−8H鎖Ｖ領域（P.T.Jonesら、Nature（1986）321:5
22−525）をコードするDNAにもともと由来するDNA配列
から再構成ヒトPM−1H鎖Ｖ領域をコードするDNAを作製
した。この最初の再構成ヒトＶ領域をコードするDNAは
マウスNPのＨ鎖Ｖ領域（M.S.Neubergerら、Nature;M.S.
Neubergerら、EMBO J.（1983）2:1373−1378）をコー
ドするDNAから作製された。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNAと、発現ベクターに再構成ヒトＶ領域をコ
ードするDNAを連結するためのBamH I部位との間のイン
トロン中に存在する約190bpのこのストレッチは、再構
成ヒトＶ領域をコードするDNAのPCRクローニングの過程
で除去された。 発現レベルを改良するために変形された再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の最終バージョンのDNA配
列及びアミノ酸配列を配列番号:57及び56に示す。これ
らのDNA配列は、表２に示した再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」、並びに表３に示した再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」をコー
ドする。HEF−１α発現ベクター（図15）に挿入された
場合、これらのベクターはトランスフェクトされたCOS
細胞中で約２μg/mlの抗体を一過性に生産する。より多
量の再構成ヒトPM−１抗体を安定的に生産させるため、
dhfr遺伝子を組み込んだ新しいHEF−１α発現ベクター
を作製した（実施例10及び図11を参照のこと）。欠陥の
ある（crippled）SV40プロモーターを連結したdhfr遺伝
子を、ヒトγ−1H鎖を発現するHCMVベクターについて記
載したのと同様にして、ヒトγ−1H鎖を発現するHEF−
１αベクターに導入した。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖を
発現するHEF−１αベクター及び再構成ヒトPM−１抗体
Ｈ鎖を発現するHEF−１α−dhfrベクターをCHO dhfr
（−）細胞に同時形質転換した。安定に形質転換された
CHO細胞系を、ヌクレオシドを含有せず10％のFCS及び50
0μg/mlのG418を含有するAlpha−Minimum Essential
Medium（α−MEM）中で選択した。遺伝子増幅工程に先
立って、CHO細胞系は10μg/106細胞／日までの再構成ヒ
トPM−１抗体を生産することが観察された。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＶ領域と既知の
ヒト抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のカッパーＬ鎖
（κＬ）Ｖ領域のFRとヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグループ
（HSG）Ｉ〜IVのFRとの相同性、及びマウスモノクロー
ナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のFRとヒトＨ鎖Ｖ領域
のサブグループ（HSG）Ｉ〜IIIのFRとの相同性を表４に
示す。 表４に示した様に、マウスモノクローナル抗体AUK12
−20のカッパーＬ鎖（κＬ）Ｖ領域は、ヒトκＬ鎖Ｖ領
域のサブグループ（HSG）Ｉ〜IVとそれぞれ同程度（64
〜68％）の相同性を示す。タンパクのData base“LEED
S"の検索より、HSG−IVに属するヒト抗体Len（M.Schnei
derら、Physiol.Chem.356,507−557,1975）のＬ鎖Ｖ領
域が最も高い68％の相同性を示す。一方、マウスモノク
ローナル抗体PM−１のヒト型化に用いられているヒト抗
体REIはHSG−Ｉに属し、マウスモノクローナル抗体AUK1
2−20のＬ鎖Ｖ領域とは、62％の相同性を示す。またマ
ウスモノクローナル抗体AUK12−20のＬ鎖のcanonical構
造を調らべてみると（C.Chothiaら、J.Mol.Biol.（198
7）196:901〜917）、特にＬ鎖CDR2（L2）がLenよりREI
とよく一致する。 上記により、マウスモノクローナル抗体AUK12−20の
Ｌ鎖Ｖ領域のヒト型化に用いるヒト抗体は必ずしもHSG
−IVに属する抗体から選ぶ必要もなく、マウスモノクロ
ーナル抗体AUK12−20のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化には、マ
ウスモノクローナル抗体PM−１のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化
の場合と同様にREIを用いる。 表４に示す様に、AUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒ
トＨ鎖Ｖ領域のサブグループ−Ｉ（HSG−Ｉ）と最も高
い相同性を示す。また、Data base“LEEDS"の検索によ
り、やはりHSG Iに属するヒトHAX（Stollar,B.D.ら、J.
Immunol.139,2496−2501,1987）がAUK12−20抗体のＨ鎖
Ｖ領域に対して約66％の相同性を示す。そこで再構成ヒ
トAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計においては、HSG I
に属するヒト抗体HAXのFR、及び同様にHSG Iに属するFR
を含有するヒト型化425抗体Ｈ鎖Ｖ領域（Kettleborough
C.A.,ら、Protein Engineering,４,773−783,1991）
のFRを用いる。ちなみに、AUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域は
ヒト型化425抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンａと約64％の
相同性を示す。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計 前記の理由により再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領
域のFRとしてREIのFRを使用し、表５に示すように再構
成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域を設計した。 注：アンダーラインを付した５個のヌクレオチドはCA
MPATH−1H抗体の設計において変えられたものである
（表２の注を参照のこと）。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計 前記の理由により、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域の設計に再構成ヒトVHa425のFRを用いる。ところ
で、こうして設計した再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域をコードするDNAのヌクレオチド配列はスプライス
供与配列とよく一致する配列を有することが見出され
た。このことから、再構成ヒトPM−１抗体の場合と同様
に異常なスプライシングが再構成ヒトAUK12−20抗体の
発現においても起こる可能性がある。このため、ヌクレ
オチド配列を部分的に変更することにより、スプライス
供与配列様の配列を除去した。この修正された配列をバ
ージョンａと称する。 さらに、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバー
ジョンｂ〜ｄを設計した。バージョンａ〜ｄのアミノ酸
配列を表６に示す。 注：ヒトサブグループIVH領域（HSG I）において１種
類の共通アミノ酸が特定できない位置はＸで示す。アン
ダーラインを付した２個のアミノ酸はHSG Iコンセンサ
ス配列中のアミノ酸と異る。RVHb,RVHc及びRVHdについ
てはRVHaと異るアミノ酸残基のみが示してある。 さらに、ヒト抗体HAX（J.Immunology 139,2496−250
1,1987,SLE患者由来Ｂ細胞由来のハイブリドーマ21/28
細胞の産生する抗体；そのアミノ酸配列はこの文献中の
Fig.6に記載されており、それをコードするDNAのヌクレ
オチド配列はFig.4及び５に記載されている）のFRを用
いて再構成ヒトAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」〜「ｄ」を次の表７に示すように設計した。 注:sle1220Ha中のアンダーラインを付した２個の残基
はHAXのFRからの変化を示す。sle1220Hb,sle1220Hc、及
びsle1220HdについてはHAXのFR中のアミノ酸と異るFR中
のアミノ酸のみを示す。 ヒトIL−6Rに対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒ
ト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、
例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸
状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌
細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好
ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類
細胞、例えばCOS細胞又はCHO細胞中で発現される。 これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常
用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト
・サイトメガロウィルス前期（human cytomegalovirus
immediate early;HCMV）プロモーターを使用するの
が好ましい。HCMVプロモーターを含有する発現ベクター
の例には、HCMV−VH−HCγ１、HCMV−VL−HCK、HCMV−1
2h−ｇγ１、HCMV−12κ−ｇκ等であって、pSV2neoに
由来するもの（図１を参照のこと）が含まれる。 本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はヒ
ト・エロンゲーション・ファクター１α（HEF−１α）
プロモーターである。このプロモーターを含有する発現
ベクターにはHEF−12h−ｇγ１及びHEF−12k−ｇκ（図
８及び図９）、並びにHEF−VH−ｇγ１及びHEF−VL−ｇ
κ（図15）が含まれる。 宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベクターは
さらにdhfr遺伝子を含有することができる。dhfr遺伝子
を含有する発現ベクターは例えばDHFR−ΔＥ−PMh−ｇ
γ１（図10）、DHFR−ΔＥ−RVh−PM1−ｆ（図11）等で
ある。 要約すれば、本発明はまず、ヒトIL−6Rに対するマウ
スモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域、並
びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNA及びＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNAを提供する。これらは、ヒトIL−6Rに対す
るヒト／マウスキメラ抗体及び再構成ヒト抗体の作製の
ために有用である。モノクローナル抗体は、例えばAUK1
2−20、PM−１、AUK64−７、及びAUK146−15である。Ｌ
鎖Ｖ領域は例えば配列番号:24,26,28又は30に示すアミ
ノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号:2
5,27,29,又は31に示すアミノ酸配列を有する。これらの
アミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号:24〜31に示す
ヌクレオチド配列によりコードされている。 本発明はまた、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並びに （２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域： を含んで成る、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体に関す
る。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並びにこれ
らをコードするDNAは前記の通りである。前記ヒトＬ鎖
Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、そし
て例えばヒトＣκ領域である。前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任
意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒ
トＣγ１領域である。 キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、
すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制
御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ
鎖Ｃ領域をコードするDNAを含んで成る発現ベクター、
並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御
領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコ
ードするDANを含んで成る発現ベクターを作製する。次
に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿
主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞を
イン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製
造する。 あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコ
ードするDNA並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領
域をコードするDNAを単一の発現ベクターに導入し、そ
して該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこ
の形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで
培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。 本発明はさらに、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び （２）ヒトＬ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＬ鎖CDRを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を
含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び （２）ヒトＨ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖CDRを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を
含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提
供する。 好ましい態様においては、前記Ｌ鎖CDRは配列番号24,
26,28及び30のいずれかに示されるアミノ酸配列であっ
て、該アミノ酸配列の範囲が表９において定義されるア
ミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖CDRは配列番号25,27,29及
び31に示されるアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の
範囲が表９において定義されるアミノ酸配列を有し；前
記ヒトＬ鎖FRがREIに由来するものであり；前記ヒトＨ
鎖FRはNEW又はHGS Iコンセンサス配列又はHAXに由来す
るものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であ
り；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１である。 好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表２において
RVLaとして示されるアミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は
表３にRVHa、RVHb、RVHc、RVHd、RVHe又はRVHfとして示
されるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列RVHfが最も
好ましい。 再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクタ
ー、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発
現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒト
Ｌ鎖をコードするDNAを含んで成る発現ベクター、及び
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域の
もとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするDNAを
含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、
これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主
細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞
をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗
体を生産せしめる。 あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするDNA及び再構
成ヒトＨ鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに導
入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、
次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン
−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せ
しめる。 こうして生産されたキメラ抗体又は再構成ヒト抗体
は、常法に従って、例えばプロテインＡアフィニティー
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過等により単離、精製することができる。 本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖はＨ鎖と組合
わせることにより完全な抗体を作製するために使用する
ことができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又は再構成ヒ
トＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製
するために用いることができる。 本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、
マウスＨ鎖Ｖ領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本
来、抗原であるヒトIL−6Rと結合する領域であり、それ
自体として、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医
薬、診断薬等として有用であると考えられる。 また、本発明のＬ鎖Ｖ領域CDR及びＨ鎖Ｖ領域CDRも、
本来、抗原であるヒトIL−6Rと結合する部分であり、そ
れ自体として又は他の蛋白質との融合蛋白質として医
薬、診断薬等として有用であると考えられる。 本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAはキメラ
Ｌ鎖をコードするDNA又は再構成ヒトＬ鎖をコードするD
NAの作製のために有用である。同様にマウスＨ鎖Ｖ領域
をコードするDNAはキメラＨ鎖をコードするDNA又は再構
成ヒトＨ鎖をコードするDNAの作製のために有用であ
る。 また、本発明のＬ鎖Ｖ領域CDRをコードするDNAは再構
成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA及び再構成ヒトＬ鎖
をコードするDNAの作製のために有用である。同様に本
発明のＨ鎖Ｖ領域CDRをコードするDNAは再構成ヒトＨ鎖
Ｖ領域をコードするDNA及び再構成ヒトＨ鎖をコードす
るDNA作製のために有用である。 実施例 次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明する
が、これにより本発明の範囲が限定されるものではな
い。 実施例1.ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体
のＶ領域をコードするDNAのクローン化 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域をコードするDNAを次の様にしてクローン化した。 1.全RNAの調製 ハイブリドーマAUK12−20からの全RNAを、Chirgwin
ら、Biochemistry,18,5294（1979）により記載されてい
る方法に従って調製した。すなわち、2.1×108個のハイ
ブリドーマAUK12−20の細胞を20mlの4Mグアニジンチオ
シアネート（Fulka）中で完全にホモジナイズさせた。
ホモジネートを遠心管中の5.3M塩化セシウム溶液層上に
重層し、次にこれをBeckman SW40ローター中で31,000r
pmにて20℃で24時間遠心分離することによりRNAを沈澱
させた。RNA沈澱物を80％エタノールにより洗浄し、そ
して1mM EDTA及び0.5％ SDSを含有する10mM Tris−H
Cl（pH7.5）150μｌ中に溶解し、そしてそれにProtenas
e（Boehringer）を0.5mg/mlとなるように添加した後、3
7℃にて20分間インキュベートした。混合物をフェノー
ル及びクロロホルムで抽出し、そしてRNAをエタノール
で沈澱させた。次に、RNA沈澱物を1mM EDTAを含有する
10mM Tris−HCl（pH7.5）200μｌに溶解した。 2.一本鎖cDNAの合成 J.W.Larrickら、Biotechnology,７,934（1989）によ
り記載されている方法に従って一本鎖cDNAを合成するた
め、前記のようにして調製した全RNAの約５μｇを40mM
KCl,6mM MgCl2,10mMジチオスレイトール、0.5mM dAT
P,0.5mM dGTP,0.5mM dCTP,0.5mM dTTP,35μＭ olig
o dTプライマー（Amersham）,48ユニットのRAV−２逆
転写酵素（RAV−2:Rous associated virus2;Amersha
m）及び25ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤
（Amersham）を含有する50mM Tris−HCl（pH8.3）緩衝
液10μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を37℃にて60
分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法のために直接使用した。 3.抗体可変領域をコードする遺伝子のPCR法による増幅 Thermal Cycler Model PHC−２（Techne）を用い
てPCR法を行った。 （１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅 PCR法に使用するプライマーは、配列番号:1〜11に示
すMKV（Mouse Kappa Variable）プライマー（マウス
カッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする）（S.
T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）、及び配列番
号:12に示すMCK（Mouse Kappa Constant）プライマー
（マウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする）
（S.T.JonesSら、Biotechnology,９,88,1991）であっ
た。 まず、10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl 0.1mM
dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,1.5mM
MgCl2,2.5ユニットのDNAポリメラーゼAmpliTaq（Perkin
Elmer Cetus）,0.25μＭのそれぞれのMKVプライマ
ー、３μＭのMKCプライマー及び一本鎖cDNA合成の反応
混合物１μｌを含有するPCR溶液100μｌを94℃の初期温
度にて1.5分間そして次に94℃にて１分間、50℃にて１
分間及び72℃にて１分間、この順序で加熱した。この温
度サイクルを25回反復した後、反応混合物をさらに72℃
にて10分間インキュベートした。 （２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするcDNAの増幅 PCRのためのプライマーとして配列番号:13〜22に示す
MHV（Mouse Heavy Variable）プライマー１〜10（S.
T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）、及び配列番
号:23に示すMHC（Mouse Heavy Constant）プライマー
（S.T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）を使用し
た。前記3.（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅につ
いて記載したのと同じ方法により増幅を行った。 4.PCR生成物の精製および断片化 前記のようにしてPCR法により増幅したDNA断片をQIAG
EN PCR生成物精製キット（QIAGEN Inc.US）を用いて
精製し、そして10mM MgCl2及び150mM NaClを含有する
100mM Tris−HCl（pH7.6）中で10ユニットの制限酵素S
al I（GIBCO BRL）を用いて37℃にて３時間消化した。
この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
し、そしてDNAをエタノール沈澱により回収した。次
に、DNAは沈澱物を10ユニットの制限酵素Xma I（New E
ngland Biolabs）により37℃にて２時間消化し、そし
て生ずるDNA断片を、低融点アガロース（FMC Bio.Prod
ucts,米国）を用いるアガロースゲル電気泳動により分
離した。 約450bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り取
りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容
積の2mM EDTA及び200mM NaClを含有する20mM Tris−
HCl（pH7.5）を加えた。この混合物をフェノール及びク
ロロホルムにより抽出し、そしてDNA断片をエタノール
沈澱により回収し、そして1mM EDTAを含有する10mM T
ris−HCl（pH7.5）に溶解した。こうして、マウスカッ
パ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るDNA
断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子を含
んで成るDNA断片を得た。上記DNA断片はいずれもその
５′−末端にSal I接着末端を有しそしてその３′−末
端にXma I接着末端を有する。 5.連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含んで成るSal I−Xma IDNA断片
約0.3μｇを、プラスミドpUC19をSal I及びXma Iで消化
することにより調製したpUC19ベクター約0.1μｇと、50
mM Tris−HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMジチオスレ
イトール、1mMスペルミジン、1mM ATP,0.1μg/mlのウ
シ血清アルブミン及び２ユニットT4DNAリガーゼ（New
England Biolabs）を含有する反応混合物中で、16℃に
て16時間反応させ連結した。 次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌DH5αのコン
ピテント細胞200μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で3
0分間、42℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置し
た。次いで800μｌのSOC培地（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Sambrookら、Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,1989）を加え、37℃にて１時間
インキュベートした後、２×YT寒天培地（Molecular C
loning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989）上にこの大腸
菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質
転換体を得た。 この形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含有す
る２×YT培地5ml中で37℃にて一夜培養し、そしてこの
培養物から、アルカリ法（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Sambrookら、Cold Spring Harbor L
aboratory Press,1989）に従ってプラスミドDNAを調製
した。 こうして得られた、ハイブリドーマAUK12−20に由来
するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
有するプラスミドをp12−k2と命名した。 上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマAUK12−20
に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有
するプラスミドをSal I−Xma I DNA断片から作成し、
そしてp12−h2と命名した。 実施例2.マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードす
るDNAのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリド
ーマPM1,AUK64−７及びAUK146−15に適用して下記のプ
ラスミドを得た： ハイブリドーマPM1由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドpPM−k3; ハイブリドーマPM1由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺
伝子を含有するプラスミドpPM−h1; ハイブリドーマAUK64−７由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含有するプラスミドp64−k4; ハイブリドーマAUK64−７由来のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドp64−h2; ハイブリドーマAUK146−15由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含有するプラスミドp146−k3;及
び ハイブリドーマAUK146−15由来のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドP146−h1。 なお、上記プラスミドを含有する大腸菌株は、Nation
al Collections of Industrial and Marine Bact
eria Limitedに、ブダペスト条約に基づいて、1991年
２月11日に寄託され、そして表８に示す受託番号を有す
る。 実施例3.DNAの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列を、
SequenaseTMVersion2.0キット（U.S.Biochemical Cor
p、米国）を用いて決定した。 まず、前記のようにして得られたプラスミド約３μｇ
を0.2N NaOHにより変性し、配列決定用プライマーとア
ニールさせ、そしてキット添付の処方に従って35S−dAT
Pにより標識した。次に、標識されたDNAを、8M尿素を含
有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した
後、ゲルを10％メタノール及び10％酢酸により固定し、
乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることに
より塩基配列を決定した。 各プラスミドのcDNAコード領域の塩基配列を配列番
号:24〜31に示す。 実施例4.CDRの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、即ち相補性決定領域（CDR）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、CDR領域のアミノ酸配
列の可変性は極めて高い（Kabat,E.A.ら、「Sequences
of Proteins of Immunological Interst」US Dept.Heal
th and Human Services,1983）。 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域の上記のアミノ酸配列に基き、そしてKabatらの報
告に従ってIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
各Ｖ領域のCDRを表９に示す如く決定した。 実施例5.クローン化されたcDNAの発現の確認（１）発現
プラスミドの作製 PCR法によりクローン化されたAUK12−20抗体のκＬ鎖
及びＨ鎖のＶ領域をコードするcDNAからキメラＬ鎖/H鎖
をコードするDNAを作製した。マウスAUK12−20のＶ領域
をコードするcDNAを、ヒトサイトメガロウイルス（HCM
V）のエンハンサー及びプロモーターを含有する哺乳類
細胞発現ベクター（HCMV発現ベクターと称する）（図1.
実施例８）中でヒトＣ領域をコードするDNAに容易に連
結するためには、AUK12−20抗体のＶ領域をコードする
マウスcDNA配列の５′−末端及び３′−末端に便利な制
限酵素切断部位を導入することが必要であった。 ５′−末端及び３′−末端へのこれらの修飾はPCR法
を用いて行った。２セットのPCRプライマーを設計しそ
して合成した。マウスＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域の両方
について、リーダー配列の始めをコードするDNAにハイ
ブリダイズし、効率的な翻訳のために必須のDNA配列（K
ozak,M.,J.Mol.Biol.196:947−950,1987）を維持しそし
てHCMV発現ベクターへのクローニングのためのHind III
部位を形成するために、Ｌ鎖Ｖ領域後方プライマー（配
列番号:32）、及びＨ鎖Ｖ領域後方プライマー（配列番
号:33）を調製した。前方PCR−プライマーは、Ｊ領域の
末端をコードするDNAにハイブリダイズし、Ｃ領域への
スプライシングのために必須のDNA配列を維持しそしてH
CMV発現ベクターでのヒトＣ領域への連結のためのBamH
I部位を形成するように、Ｌ鎖Ｖ領域前方プライマー
（配列番号34）、及びＨ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列
番号35）を調製した。 PCRによる増幅に続き、PCR生成物をHind III及びBamH
Iにより消化し、ヒトκ鎖又はγ−１鎖Ｃ領域DNAを含
有するHCMVベクターにクローン化し、そして塩基配列を
決定してPCR法による増幅中にエラーが生じなかったこ
とを確認した。得られる発現ベクターをHCMV−12k−gk
及びHCMV−12h−ｇγ１と称する。 HCMV発現ベクターの構造を図１に示す。プラスミドHC
MV−VL−HCκにおいて、VL領域は任意のマウスＬ鎖Ｖ領
域コード配列であることができる。この例において、AU
K12−20κＬ鎖Ｖ領域を挿入することによりHCMV−12k−
gkを得た。プラスミドHCMV−VH−HCγ１において、VH領
域は任意のマウスＨ鎖Ｖ領域コード配列であることがで
きる。この例においてはAUK12−20のＨ鎖Ｖ領域を挿入
してHCMV−12h−ｇγ１を得た。 COS細胞での一過性（transient）発現 キメラAUK12−20抗体のCOS細胞での一過性発現を見る
ため、前記発現ベクターをCOS細胞において試験した。G
ene Pulsar装置（BioRad）を用いる電気穿孔法（elect
roporation）によりDNAをCOS細胞に導入した。すなわ
ち、CO細胞を１×107個/mlになるようにphosphate−buf
fered saline（PBS）に懸濁し、この細胞浮遊液0.8ml
にDNA（各プラスミドについて10μｇ）を加えた。1,900
ボルト（Ｖ）、25マイクロファラッド（μＦ）の電気容
量にてパルスを与えた。 室温にて10分間の回復期間の後、エクレトロポレーシ
ョンした細胞を、10％のウシ胎児血清を含有するDMEM培
地（GIBCO）8mlに加えた。72時間のインキュベーション
の後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去
し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、又は−20℃に
て長時間貯蔵した。 酵素免疫測定法（ELISA）によるキメラ抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELISAに
より測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認
した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギの抗
ヒトIgG（Whole molecule）（Sigma）によりコートし
た。ブロックした後、COS細胞からの培養上清を段階希
釈しそして各ウエルに加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒト
IgG（γ鎖特異的、Sigma）を加えた。インキュベーショ
ン及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーシ
ョンの後、反応を停止しそして405nmにおける吸光度を
測定した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を用いた。 ヒトIL−6Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定
（ELISA） トランスフェクトされたCOS細胞からの培地をELISAに
より測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結合し得
るか否かを決定した。抗原への結合の検出のため、プレ
ートをMT18マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコ
ートした。１％ BSAでブロックした後、可溶性組換え
ヒトIL−6R（SR344）を加えた。 洗浄した後、COS細胞からの培養上清を段階希釈し、
そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄
の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGを加
えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を
加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そし
て405nmにおける吸光度を測定した。 この結果を図２に示した。キメラ抗体AUK12−20をコ
ードする遺伝子のCOS細胞へのトランスフェクションを
実施した。このCOS細胞の培養上清サンプルは、IL−6R
に対する強い結合能を示し、図２に○（オープンサーク
ル）で示す如く、サンプルの希釈度（抗体の濃度）依存
的に405nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にIL−6
Rレセプターに対する抗体が含まれていることが確認さ
れた。 ヒトIL−6RとIL−６の結合を阻害する能力の測定 トランスフェクトされたCOS細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、IL−6RとIL−６との結
合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化IL−６
との競合的結合阻害能を調べた。プレートをMT18マウス
モノクローナル抗体（参考例１）でコートした。ブロッ
キングの後、可溶性組換ヒトIL−6R（SR344）を加え
た。洗浄した後、COS細胞からのサンプルを段階希釈
し、そしてビオチン化IL−６と共に各ウエルに加えた。 洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ストレプト
アビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、
基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を
停止し、そして吸光度を405nmにて測定した。精製マウ
スAUK12−20モノクローナル抗体を陽性対照として用い
た。無関係の抗体を発現するCOS細胞からの培地を陰性
対照として用いた。 この結果を図３に示した。キメラ抗体12−20をコード
する遺伝子でトランスフェクトしたCOS細胞の培養上清
は、最高、及び２番目に高いサンプル濃度でIL−6RとIL
−６の結合を阻害した。すなわち、図３に●で示す如
く、サンプル希釈度（抗体の濃度）依存的に405nmにお
ける吸光度が変化し、サンプル中の抗体がIL−6RとIL−
６の結合を阻害していることが認められた。これは陽性
対照の吸光度の抗体濃度依存的変化（○）にほぼ一致す
ることからも確認出来た。 なお、陰性対照（△）は阻害活性が全く認められなか
った。 実施例6.クローン化cDNAの発現の確認（２）（キメラPM
−１抗体の作製） 発現ベクターの作製 キメラPM−１抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスPM−１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするcDNAクローンpPM−k3及びpPM−h1をPCR法により
変形し、そしてHCMV発現ベクター（図１を参照のこと）
に導入した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーpmk−
ｓ（配列番号:38）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライ
マーpmh−ｓ（配列番号:40）を、リーダー配列の最初を
コードするDNAにハイブリダイズし且つKozakコンセンサ
ス配列及びHind III制限部位を有するように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーpmk−ａ（配列番号:
36）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーpmh−ａ
（配列番号:39）を、Ｊ領域の末端をコードするDNA配列
にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びBamH
I制限部位を有するように設計した。 κＬ鎖Ｖ領域のため、２種類の前方プライマーを合成
した。ほとんどのκＬ鎖においては、位置107のリジン
が保存されているが、マウスPM−１κＬ鎖においては位
置107がアスパラギンである。キメラPM−１抗体の抗原
結合活性に対するこの変化の効果を検討するため、前方
プライマーpmk−ｂ（配列番号:37）を、位置107がアス
パラギンからリジンに変えるように設計した。PCR反応
に続き、PCR生成物を精製し、Hind III及びBamH Iで消
化し、そしてpUC19ベクター（Yanishe−Perronら、Gene
（1985）33:103−109）にサブクローニングした。DNA配
列決定の後、Hind III−BamH I断片を切出し、そしてＨ
鎖Ｖ領域については発現ベクターHCMV−VH−HCγ１にク
ローン化してHCMV−PMh−ｇγ１を得、そしてＬ鎖Ｖ領
域についてはHCMV−VL−HCκにクローン化してHCMV−PM
ka−gk及びHCMV−PMkb−gkを得た。 COS細胞のトランスフェクション キメラPM−１抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをCOS細胞において試験した。HCMV−pmh−
ｇγ１と、HCMV−pmka−gk又はHCMV−pmkb−gkのいずれ
かとを、Gene Pulsar装置（BioRad）を用いてエレクト
ロポレーションによりCOS細胞に同時形質転換した。DNA
（プラスミド当り10μｇ）を、PBS中１×107細胞/mlの
0.8mlのアリコートに加え、1,900V,25μＦの容量にてパ
ルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、10％のγ−グロブ
リン不含有ウシ胎児血清を含有するDulbecco′ｓ Modi
fied Eagle Medium（DMEM）（GIBCO）に加えた。72時
間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分
離により細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃に
て短時間貯蔵し、又は−20℃にて長期間貯蔵した。 キメラPM−１抗体の発現及び分析 ３日間の一過性発現の後、COS細胞からの培地を集
め、そしてキメラPM−１抗体について試験した。培地を
まずELISAにより分析して、トランスフェクトされたCOS
細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを決定した。
このアッセイにおいて標準として既知量の精製ヒトIgG
を用いることにより、COS細胞からの培地中に存在する
ヒト様抗体（この場合、キメラPM−１抗体）の量を推定
することが可能である。ヒト抗体の検出のため、プレー
トをヤギ抗−ヒトIgG（全体分子、Sigma）によりコート
した。ブロッキングの後、COS細胞からのサンプルを段
階希釈し、そして各ウェルに加えた。インキュベーショ
ン及び洗浄の後、アルカリホスフェターゼ結合ヤギ抗−
ヒトIgG（γ鎖特異的、Sigma）を加えた。インキュベー
ション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベ
ーションの後、反応を停止し、そして405nmでの吸光度
を測定した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を加え
た。 キメラPM−１抗体をコードする遺伝子を担持するベク
ターによりトランスフェクトされたCOS細胞からの培地
はヒト様抗体の発現について陽性であり、そしておよそ
の量が上記のようにして測定された。 次に、キメラPM−１抗体をコードする遺伝子を担持す
るベクターによりトランスフェクトされたCOS細胞から
の同じ培地をヒトIL−6Rに結合する能力について測定し
た。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒトIL−
6Rに対する抗体であるMT18マウスモノクローナル抗体
（参考例１）によりコートした。ブロッキングの後、可
溶性ヒトIL−6R（SR344）を加えた。洗浄した後、サン
プルを段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュ
ベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合
ヤギ抗−ヒトIgG（γ鎖特異的;Sigma）を添加した。イ
ンキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。
インキュベーションの後、反応を停止し、そして405nm
での吸光度を測定した。この測定のために標準品は存在
しなかった。 ２個のサンプルの内の１つは、マウスPM−１抗体中に
見られるＶ領域と同一のＶ領域を有するキメラ抗体（キ
メラPM−1a抗体、図４）をコードする遺伝子によるトラ
ンスフェクトからのサンプルであった。他の１つのサン
プルはＬ鎖Ｖ領域中の位置107に前記のような１個のア
ミノ酸変化を有するキメラ抗体（キメラPM−1b抗体、図
４）をコードする遺伝子によるトランスフェクションか
らのものであった。いずれのサンプルも、サンプルの希
釈により減少するIL−6Rに対する強い結合を示した。す
なわち、作製されたキメラPM−１抗体は機能的であり、
そしてその抗原によく結合することができる。最も重要
なことは、機能的キメラPM−１抗体の証明は、正しいマ
ウスPM−1V領域がクローン化されそして配列決定された
ことの直接の証拠である。Ｌ鎖Ｖ領域中の位置107にい
ずれのアミノ酸を有するキメラ抗体も抗原IL−6Rによく
結合した。マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置107
は抗原結合のためにあまり重要ではなく、そしてこの位
置におけるアスパラギン及びリジンのいずれも満足に機
能するようである。マウスPM−１抗体はそのＬ鎖Ｖ領域
のこの位置にアスパラギンを有するので、キメラPM−１
抗体を用いるその後のすべての研究は、マウスPM−１抗
体に見出されるそれと同じバージョンａを用いて行っ
た。 より多量のPM−１抗体を安定に生産するために、dhfr
遺伝子を含有する新たなHCMV発現ベクターを作製した。
キメラPM−１抗体のより高い発現レベルを達成するため
の第一段階は、ベクターHCMV−VH−HCγ１（図１）を変
形して、このベクターが欠陥のある（crippled）SV40プ
ロモーターエンハンサーにより発現されるdhfr遺伝子を
含有するようにすることであった。SV40エンハンサー要
素をpSV2−dhrfベクター（S.Subramaniら、Mol.Cell.Bi
ol.（1981）1:854−864）から除去し、そしてSV40プロ
モーターによって発現されるneo遺伝子の代りに「欠陥
のある」SV40プロモーターにより発現されるdhfr遺伝子
をHCMV−VH−HCγ１に挿入した。次に、この新しいHCMV
−VH−HCγ１−dhfrベクターにマウスPM−1V領域を挿入
した。この改良された発現ベクターの作製を実施例10に
詳細に記載する。 CHO dhfr（−）細胞（G.Urlaubら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1980）77:4216−4220）を２種類のプラスミド
DNAすなわちキメラPM−1aL鎖を発現するためのHCMV−VL
−HCκベクター（HCMV−PMka−gk）及びキメラPM−１
Ｈ鎖を発現するためのHCMV−VH−HCγ１−dhfrベクター
（DHFR−△Ｅ−PMh−ｇγ1;実施例10）により同時形質
転換した。DNA（各プラスミドにつき10μg/ml）をPBS中
１×107細胞/mlの0.8mlのアリコートに加えた。1900Vの
電圧25μＦの電気容量でパルスを与えた。室温にて10分
間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された
細胞を、ヌクレオシド及び10％ FCSを含有するAlpha
Minimal Essential Medium培地（α−MEM）10mlに加
えた。一夜のインキュベーションの後、培地を、ヌクレ
オシドを含有せず10％ FCS及び500μg/mlのG418（GIBC
O）を含有するα−MEMに変えて、dhfr+及びneo+形質転
換細胞の選択を行った。選択の後、選択されたクローン
を用いて遺伝子増幅を行った。２×10-8Mメソトレキセ
ート（MTX）中での１ラウンドの増幅の後、約3.9μg/10
6細胞／日のキメラPM−1aの抗体を生産する細胞系（PM1
k3−７）を選択した。 ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害するキメラ抗体の能
力についてのELISA測定 トランスフェクトされたCOS細胞において又は安定なC
HO細胞系において生産された抗体を測定して、それら
が、IL−6Rへのビオチン化IL−６の結合と競争するか否
かを決定した。プレートをマウス抗体MT18によりコート
した。ブロッキングの後、可溶性組換えヒトIL−6R（SR
344）を加えた。洗浄の後、COS細胞からのサンプルを段
階希釈し、そしてビオチン化IL−６と一緒に各ウエルに
加えた。洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ストレ
プトアビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止させ、そして405nmにおける吸光度を測定し
た。結果を図５に示す。 実施例7.再構成ヒトPM−１抗体の作製 より迅速に且つより効率的にCDR移植を達成するた
め、PCRによる逐次CDR移植法を開発した。この方法はPC
R変異誘発法（Kammanら、Nucl.Acid.Res.17:5404,198
9）に基く。 CDR移植のための選択されたヒトFRをコードするDNAを
含有する鋳型DNAを調製するために、適当な再構成ヒト
Ｖ領域をコードするDNAを便利なベクターに再クローニ
ングする必要があった。プラスミドalys11及びF10のDNA
はそれぞれ再構成ヒトD1.3のＬ鎖及びＨ鎖をコードして
おり、ヒトREIからのFRをコードするDNA及びNEWからのF
RをコードするDNAをそれぞれ含有する。再構成ヒトD1.3
のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を含有する約500bpの
Nco I−BamH1断片をalys11から切り出し、そしてHind I
II及びBamH Iで開裂されたpBR327にサブクローニングし
てプラスミドVl−lys−pBR327を得た。このVl−lys−pB
R327からのHind III−BamH I断片を、Hind III及びBamH
Iにより開裂されたpUC19に挿入してプラスミドVl−lys
−pUC19を得た。 再構成ヒトD1.3のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を
含有する約700bpのNco I−BamH I断片をF10から切り出
し、そしてHind III−Nco Iアダプターを用いてpBR327
のHind III−BamH I部位にサブクローニングし、Vh−ly
s−pBR327を得た。次に、このプラスミドからHind III
−BamH I断片を切り出し、そしてHind III及びBamH Iに
より開裂されたpUC19にサブクローニングしてVh−lys−
pUC19を得た。 なお、プラスミドalys11及び再構成ヒトD1.3のＬ鎖Ｖ
領域FRをコードするDNA配列はヒト型化CAMPATH−1H抗体
（Nature 332:323−327（1988））のそれと同じであ
る。鋳型として使用した、プラスミドF10中の再構成ヒ
トD1.3のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列は、V.Verhoey
ら、Science237:1534−1536（1988）のFig.2に記載され
ている。 図６は、再構成ヒトPM−１のＨ鎖Ｖ領域の第一バージ
ョンをコードするDNAの作製のために使用されたプライ
マー及びPCR反応を模式的に示す。後方プライマーＡ（A
PCR1;配列番号:41）及び前方プライマーＥ（APCR4;配列
番号:42）は、このベクター上のDNA配列にハイブリダイ
ズする。APCR1及びAPCR4はpUC19ベクターのために特に
設計されたが、ユニバーサルM13配列プライマーを使用
することもできる。 CDR1移植／変異誘発プライマーＢ（phv−1;配列番号:
43）、CDR2移植プライマーＣ（phv−2;配列番号:44）、
及びCDR3移植プライマーＤ（phv−3;配列番号:45）は40
〜60bpの長さを有し、マウスPM−１のＨ鎖Ｖ領域のCDR
をコードするDNA及び該CDRをコードするDNAを挟む鋳型D
NA中のヒトFRをコードするDNA配列から成る。第一のPCR
反応において前方プライマーAPCR4及び後方プライマー
Ｄを用いた。マウスPM−１のCDR3配列をコードするDNA
を含有する第一PCR生成物を精製し、そして第二PCR反応
において後方プライマーとしてのプライマーＣと共に前
方プライマーとして使用した。同様にして、マウスPM−
１のCDR2及びCDR3をコードするDNAを含有する第二PCR生
成物、並びにマウスPM−１の３個すべてのCDRをコード
するDNAを含有する第三PCR生成物をそれぞれ次のPCR段
階のプライマーとして使用した。完全な再構成ヒトPM−
1H鎖Ｖ領域をコードするDNAを有する第四PCR生成物を精
製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そしてさらに
分析するためにpUC19にサブクローニングした。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAの
作製のために３種類の変異誘発プライマーphv−1,phv−
２及びphv−３を合成した。これらは8M尿素を含有する1
2％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。変異誘発プ
ライマーphv−１は、マウスPM−１抗体のCDR1の移植の
ためのみならずヒトFR1中の位置27及び30におけるそれ
ぞれのSerからTyrへ、及びSerからThrへの変異のために
設計された。各100μｌのPCR反応物は典型的には10mM
Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,250μＭ
dNTP,50ngの鋳型DNA（Vh−lys−pUC19）,2.5uのAmpli
Taq（Perkin Elmer Cetus）、及びプライマーを含有
した。１μＭずつのphv−３プライマー及びAPCR4プライ
マーを含む第一のPCR反応を行い、94℃にて1.5分間の最
初の変性の後、94℃にて１分間、37℃にて１分間及び72
℃にて１分間の30サイクルを反復した。アニーリング段
階と合成段階の間の変温時間は2.5分間であった。最終
サイクルの完了の後、72℃にて10分間の最終伸長反応を
行った。523bpのPCR生成物を1.6％低融点アガロースゲ
ルを用いて精製し、そして次に第二のPCR反応における
プライマーとして使用した。 第二のPCR反応において約１μｇの精製された第一PCR
生成物及び25pmoleの変異誘発プライマーphv−２をプラ
イマーとして使用した。PCR条件は第一のPCR反応につい
て記載したのと同じであった。同様にして、第二のPCR
反応からの665bpのPCR生成物をプライマーphv−１と共
に第三のPCR反応において使用し、そして第三のPCR反応
からの737bpのPCR生成物をプライマーAPCR1と共に第四
のPCR反応において使用した。第四のPCR反応からの1.17
2kbのPCR生成物を精製し、Hind III及びBamH Iで消化
し、そして次に再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を含有
する約700bpの断片をpUC19ベクターにサブクローニング
した。配列決定した４個のクローンの内２個が正しいア
ミノ酸配列をコードするDNA配列を有しており、そしてp
UC−RVh−PM1aと命名した。 再構成PM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコー
ドするDNAを作製するため５種類の変異誘発PCRプライマ
ーを合成した。各PCR反応は前記の反応条件と本質的に
同じ条件下で行われた。バージョン「ｂ」のため、変異
誘発プライマーphv−m4（Val−71→Arg−71）（番号はK
abatらによる；表４参照）（配列番号:46）及びAPCR4
を、鋳型DNAとしてのpUC−RVh−PM1aと共に第一PCR反応
において使用した。この第1PCR反応からのPCR生成物を
精製し、そしてプライマーAPCR1と共に第二PCR反応にお
ける前方プライマーとして使用した。第二PCR反応から
のPCR生成物を1.6％低融点アガロースゲルを用いて精製
し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そしてpUC19に
てサブクローニングしてpUC−RVh−PM1bを得た。同様に
して、変異誘発プライマーphv−nm（Asp−１→Gln−
１）（配列番号:47）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いて
バージョン「ｃ」をコードするDNA（pUC−RVh−PM1c）
を得、変異誘発プライマーphv−m6（Ile−48→Met−4
8）（配列番号:48）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバ
ージョン「ｄ」をコードするDNA（pUC−RVh−PM1d）を
得、変異誘発プライマーphv−nm及び鋳型pUC−RVh−PM1
cを用いてバージョン「ｅ」をコードするDNA（pUC−RVh
−PM1e）を得、そして変異誘発プライマーphv−m7（Thr
−28→Ser−28、及びPhe−29→Ile−29）（配列番号:4
9）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバージョン「ｆ」
をコードするDNA（pUC−RVh−PM1f）を得た。再構成Ｈ
鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」のアミノ酸配列及びそれをコ
ードするヌクレオチド配列を配列番号54に示す。 図７は、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョンをコードするDNAの作製において使用したプライ
マー及びPCR反応を模式的に示す。再構成ヒトPM−１抗
体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコードするDNAの作製
のため、CDR1移植プライマーpkv−１（配列番号:50）、
CDR2移植プライマーpkv−２（配列番号:51）及びCDR3移
植プライマーpkv−３（配列番号:52）を合成し、そして
8M尿素を含有する12％ポリアクリルアミドゲル上で精製
した。上記のようにしてPCR反応を行った。第一PCR反応
物は１μＭずつのpkv−３プライマー及びAPCR4プライマ
ーを含有した。第一PCR反応からの350bpのPCR生成物を
1.5％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そして第
二PCR反応における前方プライマーとして使用した。第
二PCR反応からのPCR生成物を精製し、BamH I及びHind I
IIで消化し、そしてCDR3が移植されたDNAを含有する500
bp断片をDNA配列決定のためにpUC19ベクターにサブクロ
ーニングした。正しい配列を有するプラスミドDNAを同
定し、そして次のPCR反応における鋳型DNAとして使用し
た。第三PCR反応において25pmoleの変異誘発プライマー
pkv−２及びAPCR4を使用した。第三PCR反応からのPCR生
成物を精製し、そしてプライマーpkv−１と共に第四PCR
反応におけるプライマーとして使用した。同様にして、
第四PCR反応からのPCR生成物をAPCR1プライマーと共に
第五PCR反応におけるプライマーとして使用した。 第五PCR反応からの972bpのPCR生成物を精製し、BamH
I及びHind IIIにより消化し、そしてDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。CDR2領域において問
題点が認識され、さらに２回のPCR反応が必要であっ
た。第六PCR反応及び第七PCR反応において、pUC19ベク
ターにクローニングされた第五PCR反応からのPCR生成物
を鋳型DNAをして使用した。第六PCR反応においてプライ
マーはpkv−２及びAPCR4であった。第六PCR反応からのP
CR生成物を精製し、そしてAPCR1プライマーと共に第七P
CR反応におけるプライマーとして使用した。第七PCR反
応からのPCR精製物を精製し、BamH I及びHind IIIによ
り消化し、そして500bp DNA断片をDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。配列決定した５個の
クローンの内２個のクローンが正しいDNA配列を有して
いた。このクローンをpUC−RV1−PM1aと称する。この配
列を配列番号:55に示す。 再構成ヒトPM−１ Ｌ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコ
ードするDNAの作製のため、変異誘発プライマーpvk−m1
（配列番号:53）を合成した。PCR反応は本質的に前記の
通りであった。第一PCR反応において、変異誘発プライ
マーpkv−m1（Phe−71→Tyr−71）及びAPCR4プライマー
を鋳型DNAとしてのpUC−RV1−PM1aと共に使用した。第
一PCR反応からのPCR生成物を精製し、そしてAPCR1プラ
イマーと共に第二PCR反応におけるプライマーとして使
用した。第二PCR反応からのPCR生成物を精製し、BamH I
及びHind IIIにより消化し、そしてDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。このクローンをpUC−
RV1−PM1bと命名した。 実施例8.遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で、発現
させるためのヒトサイトメガロウイルス前期（HCMV）プ
ロモーターを用いるベクターの作製（図１） キメラPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA断片
及びキメラPM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA断
片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκＬ鎖又はヒトγ
−1H鎖を発現するように設計されたHCMV発現ベクター
（図１を参照のこと）HCMV−VL−KCκ及びHCMV−VH−HC
γ１にまず挿入した。該HCMV発現ベクターの作製のため
の詳細な記載は、Maedaら、Human Antibodies and H
ybridomas（1991）2:124−134;C.A.Kettleboroughら、P
rotein Engeneering（1991）4:773−783に公表されて
いる。両ベクターはpSV2neo（P.J.Southern et al.,
J.Mol.Appl.Genet.（1982）1:327−341）に基礎を置
き、そして免疫グロブリンＬ鎖又はＨ鎖の高レベルの転
写のためにヒトサイトメガロウイルス（HCMV）プロモー
ター及びエンハンサー（M.Boshartら、Cell（1985）41:
521−530）を含有する。 Ｌ鎖発現ベクターはヒトＣκ領域（T.H.Rabbittsら、
Carr.TOP.Microbiol.Immunol.（1984）114:166−171）
をコードするゲノムDNAを含有し、そしてＨ鎖発現ベク
ターはヒトＣγ１領域（N.Takahashiら、Cell（1982）2
9:671−679）をコードするゲノムDNAを含有する。これ
らのHCMV発現ベクターは多能であり、そして種々の哺乳
類細胞タイプにおける一過性（transient）発現及び安
定な発現のために使用することができる。 実施例9.遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で発現さ
せるためのヒトエロンゲーションファクター１α（HEF
−１α）プロモーターを使用するベクターの作製（図８
及び図９） ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・
フアクター１α（HEF−１α）は最も豊富な蛋白質の１
つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトEF
−１αプロモーター−エンハンサーの転写活性はSV40前
期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約100倍
である（D.W.Kimら、Gene（1990）91:217−223;及びT.U
etsukiら、J.Biol.Chem.（1989）264:5791−5798）。2.
5kbのHEF−１αプロモーター−エンハンサー領域は、該
遺伝子の５′−末端に接する約1.5kbのDNA、第一エクソ
ン中の33bp、第一イントロン中の943bp、及び第二エク
ソンの最初の部分の10bpから成る。この後2.5kbのHind
III−EcoR I断片をプラスミドpEF321−CAT（D.W.Kim
ら、Gene（1990）91:217−223;及びT.Uetsukiら、J.Bio
l.Chem.（1989）264:5791−5798）から切り出し、そし
てpdKCRベクター（M.Tsuchiyaら,Embo J.（1987）6:61
1−616）、K.O′Haraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vo
l.78,No.3,1527−1531,（1981）、（R.Fukunagaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA Val.81,5086−5090（1984））に
クローニングして、SV40前期プロモーター−エンハンサ
ーを含有する約300bpのHind III−EcoR I断片を置き換
えてpTEF−１を得た。 pTEF−１をEcoR Iで消化し、Klenowポリメラーゼでフ
ィルーインし、そしてHind IIIリンカーに連結した。次
に、この修飾されたpTEF−１ベクターDNAから約1.6kbの
Hind III−Sma I断片を切り出した。 HCMV−12h−ｇγ１をEcoR Iにより部分消化し、Kleno
wポリメラーゼによりフィルーインし、そして自己連結
することにより、実施例５において作製したHCMV−12h
−ｇγ１からプラスミドHCMV−12h−ｇγ１（ΔE2）を
作製した。 プラスミドHCMV−12h−ｇγ１（ΔE2）をEcoR Iで消
化し、Klenowポリメラーゼでフィルーインし、そしてHi
nd IIIで消化した。ヒトγ−1C領域をコードするDNA配
列を含有する約7kbの断片を、HEF−１αプロモーター−
エンハンサーを含有する前記の1.6kb Hind III−Sma I
断片に連結してHEF−12h−ｇγ１を得た。このベクター
中のHEF−１αプロモーター・エンハンサー領域は、
５′−領域に接する380bpのDNAを除き、pTEF−１中のそ
れと同一であった。Hind III−BamH I断片として存在す
るこのＨ鎖Ｖ領域は、他のＨ鎖Ｖ領域と容易に交換する
ことができる。 再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有するHin
d III−BamH I DNA断片をpUC−RVh−PM1a,pUC−RVh−PM
1b,pUC−RVh−PM1c,pUC−RVh−PM1d,pUC−RVh−PM1e及
びpUC−RVh−PM1f（実施例７）から切り出し、そして前
記のプラスミドHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部
位に挿入して、それぞれ発現ベクターRVh−PM1a,RVh−P
M1b,RVh−PM1c,RVh−PM1d,RVh−PM1e、及びRVh−PM1fを
得た。発現ベクターRVh−PM1a,RVh−PM1b,RVh−PM1c,RV
h−PM1e、及びRVh−PM1f、並びにHEF−PMh−ｇγ１は、
それぞれ再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」及び「ｆ」、
並びにマウスPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを
有する。 Ｌ鎖発現ベクターHEF−12k−gkを作製するため、HEF
−１αプロモーター−エンハンサー領域を含有する約3.
0kbのPvu I−Hind III断片をHEF−12h−ｇγ１切り出
し、そして実施例５において作製したHCMV−Ｌ鎖発現ベ
クターHCMV−12k−gkからの約7.7kbのPvu I−Hind III
断片に連結してHEF−12k−gkを得た。Ｈ鎖発現ベクター
HEF−12h−ｇγ１の場合と同様に、Hind III−BamH I断
片として存在するHEF−12k−ｇ中のＬ鎖Ｖ領域をコード
するDNAは他のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAと容易に交換
することができる。なお、プラスミドHEF−PMh−ｇγ１
は、HEF−12h−ｇγ１（図８）のEF1αプロモーター領
域（Pvu I−Hind III断片）によりHCMV−pmh−ｇγ１の
HCHVプロモーター領域（Pvu I−Hind III断片）を置き
換えることにより作製したものである。 再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有するHin
d III−BamH I DNA断片をpUC−RV1−PM1a及びpUC−RV1
−PM1b（実施例７）から切り出し、そしてHEF−12k−gk
のHind III−BamH I部位に挿入し、それぞれ発現ベクタ
ーRV1−PM1a及びRV1−PM1bを得た。発現ベクターRV1−P
M1a及びRV1−PM1b、並びにHEF−PMK−gkはそれぞれ再構
成ヒトＬ鎖Ｖ領域「ａ」及び「ｂ」、並びにマウスPM−
１ Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNAを有する。なお、プラ
スミドHEF−PMK−gkは、HEF−12k−gk（図９）のEF1α
プロモーター領域（Pvu I−Hind III断片）によりHCMV
−pmka−gkのHCMVプロモーター領域（Pvu I−Hind III
断片） を置き換えることにより作製したものである。 実施例10.遺伝子操作された抗体をCHO細胞中で高レベル
で発現させるための、欠陥SV40プロモーター−エンハン
サー配列に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ
（dhfr）遺伝子を用いるベクターの作製（図10及び図1
1） SV40前期プロモーターからエンハンサー配列を除去す
るため、プラスミドpSV2−dhfr（S.Subramaniら、Mol.C
ell.Biol.（1981）1:854−864）（ATCC33694）をSph I
及びPvu IIで消化し、Klenowポリメラーゼでフィルーイ
ンし、そして自己連結してpSV2−dhfr−ΔＥを得た（図
10）。HCMVプロモーター、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA
及びヒトγ−1C領域をコードするDNAを含有する約3.7kb
のEcoR I断片を、EcoR Iによる部分消化によりHCMV−PM
h−ｇγ１から切り出した。この断片を、EcoR I−消化p
SV2−dhfr−ΔＥに連結してDHFR−ΔＥ−PMh−ｇγ１を
得た。 HEF−１αプロモーター−エンハンサーを用いるＨ鎖
発現ベクターに基いて類似のベクターを作製した（図11
を参照のこと）。HCMV−12h−ｇγ１に由来する約3.7kb
のEcoR I断片を、EcoR I−消化pSV2−dhfr−ΔＥと連結
してDHFR−ΔＥ−12h−ｇγ１を得た。DHFR−ΔＥ−12h
−ｇγ１中のdhfr配列に続くBamH I部位を、BamH Iによ
る部分消化、Klenowポリメラーゼによるフィルーイン及
び自己連結により除去した。dhfr cDNAを含有する約4k
bのPvu I−BamH I断片をこの修飾されたDHFR−ΔＥ−12
h−ｇγ１から切り出し、そして実施例12において作製
したRVh−PM1f−４からの約3kbのPvu I−BamH I断片に
連結してDHFR−ΔＥ−RVh−PM1fを得た。 上記の改良されたプラスミドは本発明の再構成ヒトPM
−１抗体の製造のために使用することができる。 実施例11.再構成ヒトPM−１抗体の種々のバージョンの
発現及び分析 再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各HE
F−１αベクターをCOS細胞に同時形質転換（co−transf
ect）した。標準対照としてキメラPM−１抗体のＬ鎖及
びＨ鎖を発現する各HEF−１αベクターもCOS細胞に同時
形質転換した。３日後，形質転換されたCOS細胞からの
培地を集め、そしてELISAにより（１）上清中に存在す
るヒトIgG抗体の量について、及び（２）IL−6Rに結合
するそのIgGの能力について分析した。次に、同じサン
プルをさらに、ELISAにより、ヒトIL−6RへのヒトIL−
６の結合を阻害する該抗体の能力について試験した。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖を発現する２種類のベクタ
ーの一方（RV1−PM1a又はRV1−PM1b）及びキメラPM−１
抗体Ｈ鎖を発現するベクター（HCMV−PMh−ｇγ１）に
よりCOS細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒ
トPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの評価を
行った。細胞をまた、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を
発現する各ベクター（HCMV−PMka−gk及びHCMV−PMh−
ｇγ１）により同時形質転換した。未精製のCOS細胞上
清を用いるデーターは、ヒトIL−6Rへの結合についての
測定において、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖のバージョン
「ａ」がキメラPM−１抗体Ｌ鎖と同等であることを示し
た。しかしながら、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖のバージ
ョン「ｂ」はヒトIL−6Rへの結合能を実質的に保持しな
かった。これらの結果から、FR3中の位置71のフェニル
アラニン（CAMPAHTH−1Hのために修飾されたヒトREI中
に存在する）からチロシン（天然ヒトREI及びマウスPM
−１抗体中に存在する）への変化は機能的抗原結合部位
の形成に対して非常に有害であることが結論された。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の種々のバージョン
を評価する次の実績において、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」を常に用いた。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖の発現する６種類のベクタ
ーの１つ（RVh−PM1a,RVh−PM1b,RVh−PM1c,RVh−PM1d,
RVh−PM1e又はRVh−PM1f）及び再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖のバージョン「ａ」を発現するベクター（RV1−PM1
a）によりCOS細胞を同時形質転換することにより、再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョンを評
価した。細胞を、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現
する各ベクター（HEF−PMk−gk及びHEF−PMh−ｇγ１）
によっても同時形質転換した。未精製のCOS細胞上清を
用いた予備データーが示すところによれば、ヒトIL−6R
への結合についての測定において、再構成ヒトPM−１抗
体Ｌ鎖のバージョン「ａ」及び再構成ヒトPM−１抗体Ｈ
鎖のバージョン「ｆ」は、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ
鎖と同等であった。 この予備データーを確認するため、キメラPM−１抗体
及び再構成ヒトPM−１抗体をCOS細胞上清から濃縮そし
てプロテインＡを用いて精製した。すなわち、COS細胞
からの培地を100kdカットオフ限外濾過装置（Amicon）
を用いて濃縮した。濃縮した培地をプロテインＡアガロ
ース（AffiGel Protein Ａ MAPS IIキット、BioRa
d）を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地
を、５ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化された
プロテインＡアガロースカラムに適用した。このカラム
を15ベッドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に
５ベッドボリウムの溶出緩衝液で溶出を行った。そして
マイクロコンセントレーター（Centricon 10,Amicon）
を用いて溶出液を濃縮し、溶出緩衝液をPBSに置換し
た。 キメラPM−１抗体、及び再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域のバー
ジョン「ａ」と再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバージョン
「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」又は「ｆ」と
から成る再構成ヒトPM−１抗体の精製されたサンプルの
分析を行った。Ｌ鎖の「ａ」バージョン＋Ｈ鎖の「ｆ」
バージョンが明らかに最良の再構成ヒトPM−１抗体であ
った。このものは、キメラPM−１抗体と同様にヒトIL−
6Rに結合する（図13）。これはまた、マウス抗体及びキ
メラ抗体と同様に、ヒトIL−６がヒトIL−6Rに結合する
のを阻害する（図14）。 実施例12.発現レベルを改良するための再構成ヒトPM−1
V領域の修正 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域（配列番
号:54及び55）のリーダー配列をコードするDNA配列内の
イントロンを除去するため、Ｖ領域をコードするcDNAを
PCRプライマーを用いて再クローニングした。Ｌ鎖及び
Ｈ鎖の発現ベクターRV1−PM1a及びRVh−PM1fをCOS細胞
に同時形質転換した。48時間後、全RNAを調製し（Chirg
winら、Biochemistry（1979）18:5294−5299）、そして
マウス抗体Ｖ領域のPCRクーロニングについて記載した
ようにして一本cDNA合成のために５μｇの全RNAを用い
た。３種類のPCRプライマーを設計し、そして合成し
た。LEV−P1（配列番号:60）及びHEV−P1（配列番号:5
8）はスプライスドナー配列及びBamH I部位を含有し、
そしてそれぞれＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための前方プラ
イマーとして使用した。 HEV−P2（配列番号:59）はHind III部位及びATG開始
コドンの前のKozakコンセンサス配列を含有し、そして
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための後方プライマーとして使
用した。100μｌずつのPCR反応物は20mM Tris−HCl（p
H8.8）,10mM KCl,10mM（NH4）2SO4,2mM MgSO4,0.1％
Triton Ｘ−100,0.1μｇのBSA,250μＭ dNTP,2.5u
のVent DNAポリメラーゼ（Bio.Labs,U.K.）、50％の一
本cDNA合成反応物並びに100pmoleずつの前方プライマー
及び後方プライマーを含有した。各PCRチューブは50μ
ｌの鉱油で覆い、そして94℃にて1.5分間の最初の変性
の後、94℃にて１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１
分間のサイクル反応を30回行い、そして次に72℃にて10
分間インキュベートした。Ｌ鎖Ｖ領域を含有する408bp
のPCR生成物及びＨ鎖Ｖ領域を含有する444bpのPCR生成
物を、2.0％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そ
してBamH I及びHind IIIにより消化し、そしてpUC19ベ
クターにサブクローニングし、それぞれpUC−RV1−PM1a
−３及びpUC−RVh−PM1f−３を得た。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域のDNA配
列は不適切なスプライスドナー部位及びアクセプター部
位を含有することが明らかになった（配列番号:54及び5
5を参照のこと）。Ｌ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻
度には使用されない（mRNAの約10％）が、Ｈ鎖Ｖ領域内
のこれらの部位は高頻度で使用される（mRNAの約90
％）。この異常なスプライシングが再構成ヒトPM−１抗
体の低レベルの発現をもたらした。Ｖ領域の異常なスプ
ライシングを回避するため、スプライス−ドナー部位を
PCR法により除去した。Ｈ鎖Ｖ領域について、後方プラ
イマーNEW−SP1（配列番号:61）及び前方プライマーNEW
−SP2（配列番号62）を合成した。このプライマーはDNA
配列TGG GTG AGAをDNA配列TGG GTT CGCに変える。P
CR反応の条件はcDNAのクローニングについて前記した通
りであったが、鋳型DNAは50ngのpUC−RVh−PM1f−３で
あり、そしてプライマーはHEV−P2とNEW−SP2、又はHEF
−P1とNEW−SP1のいずれかであった。 ２個のPCR反応からのPCR生成物を２％低融点アガロー
スゲルを用いて精製し、そしてPCR連結反応において使
用した。0.5μｇの第一PCR生成物を含有する98μｌのPC
R反応物及び５ユニットのVent DNAポリメラーゼを94℃
にて２分間、50℃にて２分間及び72℃にて５分間インキ
ュベートし、そして次に100pmoleずつのHEV−P1プライ
マー及びHEV−P2プライマーを加えた。PCRチューブを30
μｌの鉱油で覆い、そして94℃にて１分間、50℃にて１
分間及び72℃にて１分間の25サイクルのPCRにかけ、そ
して次に72℃にて10分間インキュベートした。 同様にして、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のス
プライス−ドナー領域をPCRプライマーREI−SP1（配列
番号:63）及びREI−SP2（配列番号:64）を用いて除去し
た。該プライマーはDNA配列CAG GTA AGGをDNA配列CAG
GAA AGGに変える。両PCR生成物、すなわちＬ鎖Ｖ領
域についての408bpのDNA断片及びＨ鎖Ｖ領域についての
444pbのDNA断片を2.0％低融点アガロースゲルを用いて
精製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そして配列
決定のためpUC19にサブクローニングしてpUC−RV1−PM1
a−４及びpUC−RVh−RM1f−４を得た。 RVh−PM1fのHind III−BamH I断片を、pUC−RVh−PM1
f−４のHind III−BamH I領域と置き換えることによ
り、RVh−PM1f−４を得た。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン「ａ」の配
列を配列番号57に示し、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領
域のイントロンが除去されたバージョン「ｆ」の配列を
配列番号56に示す。 実施例13.再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコード
するDNAの作製 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNA
の作製の工程を図16に示す。鋳型となるヒト抗体Ｌ鎖Ｖ
領域をコードする遺伝子は、制限酵素Hind III及びBamH
I部位を用いてpUC19ベクターに組み込まれている。８
個のPCRプライマー（Ａ〜Ｈ）を準備し、第１のPCRによ
り、Ｖ領域をコードする遺伝子を４つの領域に分けて増
幅させる。プライマーＡ及びＨは、pUC19ベクター上のD
NA配列と相補性を持つ。プライマーB,C及びＤは、それ
ぞれ移植するCDR領域の遺伝子配列を有する40〜60bpの
プライマーである。プライマーE,F及びＧは、それぞれ
プライマーB,C及びＤの５′側15〜20bpのDNA配列と相補
性を持つ。４個の第1PCRは、それぞれプライマーＡと
Ｅ、ＢとＦ、ＣとＧ、及びＤとＨを用いる。PCR生成物
Ａ−ＥはFR1をコードし、Ｂ−ＦはCDR1とFR2をコードす
る。Ａ−Ｅ断片の３′側とＢ−Ｆ断片の５′側は15〜20
bpの相補性を持つので、後に、これら断片を連結するこ
とが可能となる。同様に、Ｂ−Ｆ断片は、CDR2及びFR3
をコードするＣ−Ｇ断片とも相補性を持つ。そして、Ｃ
−Ｇ断片はさらに、CDR3とFR4をコードするＤ−Ｈ断片
とも相補性を持つ。こうしてこれら４種の断片は、互い
の相補性により連結が可能となる。PCR反応液中にてこ
れら４つの断片の連結反応を行った後、プライマーＡ及
びＨを加える事により、正しく４つの断片が連結したも
のが、この第２のPCRによって増幅してくる。こうして
得られた第２のPCR生成物は、３つの移植されたCDRを有
し、Hind III及びBamH Iの消化後、pUC19ベクターにサ
ブクローニングする。 さらに具体的には、鋳型として再構成ヒトPM−１抗体
Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするDNAがプラス
ミドpUC19に挿入されているプラスミドpUC−RV1−PM1a
−４を用いた。 前記プライマーＡ〜Ｈは次の配列を有する。後方プライマー 配列番号 前方プライマー 配列番号 A.REVERSE 83 E.1220−L1b 66 B.1220−L1 65 F.1220−L2b 68 C.1220−L2 67 G.1220−L3b 70 D.1220−L3 69 H.UNIVERSAL 82 CDR移植用の後方プライマー1220−L1,1220−L2及び12
20−L3については、8M尿素を含む12％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて精製後使用した。 100μｌずつのPCR反応物は20mM Tris−HCl（pH8.
8）,10mM KCl,10mM（NH4）2SO4,2mM MgSO4,0.1％ Tr
iton Ｘ−100,0.1μｇのBSA,250μｍ dNTP,5uのVent
DNAポリメラーゼ（BioLabs.U.K.）,50ngのpUC−RVl−
PM1a−４ DNA、そして各100pmolesの前方及び後方プラ
イマーを含有した。各PCRチューブは50μｌの鉱油で覆
い、そして94℃にて1.5分間の最初の変性の後、94℃に
て１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１分間の反応を
30サイクル行い、そして次に72℃にて10分間インキュベ
ートした。 252bp（Ａ−Ｅ）,96bp（Ｂ−Ｆ）,130bp（Ｃ−Ｇ）及
び123bp（Ｄ−Ｈ）の各PCR生成物を2.0％の低融点アガ
ロース（FMC,Bio.Products,USA）ゲルを用いて精製し
た。すなわち、各DNA断片を含有するアガロース片を切
り取りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと
同容積の2mM EDTA及び200mM NaClを含有する20mM Tr
is−HCl（pH7.5）を加えた。この混合物をフェノール及
びクロロホルムにより抽出し、そしてDNA断片をエタノ
ール沈澱により回収し、そして1mM EDTAを含有する10m
M Tris−HCl（pH7.5）に溶解し、そしてPCR連結反応に
おいて使用した。 次に、0.2μｇの各第１のPCR生成物及び５ユニットの
Vent DNAポリメラーゼを含有する98μｌのPCR反応液を
94℃にて２分間、50℃にて２分間及び72℃にて５分間イ
ンキュベートし、連結反応を行った。そして次に、各10
0pmoleのＡ（REVERSE）及びＨ（UNIVERSAL）プライマー
を加えて反応液を100μｌとした後、これを50μｌの鉱
油でおおい、そして94℃にて１分間、50℃にて１分間及
び72℃にて１分間の反応を30サイクル行い、そして次に
72℃にて10分間インキュベートした。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＬ鎖のCDRが移
植されたＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有する558bpの
第2PCRの生成物を2.0％低融点アガロースゲルを用いて
精製し、そしてBamH I及びHind IIIにより消化後、pUC1
9ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確認し、p
UC−RVL−1220aを得た。得られたＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表71
に示す。 次いで、Ｌ鎖発現ベクターを構築するため、再構成ヒ
トAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含有するHind III−BamH
I DNA断片を上記プラスミドpUC−RVL−1220aから切り出
し、Ｌ鎖発現ベクターHEF−12κ−ｇκのHind III−Bam
H I部位に挿入し、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域
バージョンａの発現ベクターであるRVL−1220aを得た。 実施例14.再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖の発現及び分析 COS細胞での一過性（transient）発現 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を発現するベクターRVL
−1220a及びキメラAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現するベクタ
ー、HEF−12h−ｇγ１（実施例５）によりCOS細胞を同
時形質転換することにより、再構成ヒトAUK12−20抗体
Ｌ鎖バージョン「ａ」の評価を行った。すなわち、COS
細胞を１×107個/mlになるようにphosphate−buffered
saline（PBS）に懸濁し、この細胞浮遊液0.8mlにDNA
（各プラスミドについて10μｇ）を加えた。Gene Puls
ar装置（BioRad）を用い1,900ボルト（Ｖ）、25マイク
ロファラッド（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。 室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーシ
ョンした細胞を、10％のウシ胎児血清（γ−グロブリン
不含）を含有するDMEM培地（GIBCO）20mlに加えた。72
時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心
分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃に
て短時間、又は−20℃にて長時間貯蔵した。 酵素免疫測定法（ELISA）によるヒト様抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELISAに
より測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認
した。ヒト様抗体を検出するため、プレートをヤギの抗
ヒトIgG（Whole molecule）（Sigma）によりコートし
た。ブロックした後、COS細胞からの培養上清を段階希
釈しそして各ウエルに加えた。 プレートのインキュベーション及び洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトIgG（γ鎖特異
的、Sigma）を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションし
た後、反応を停止しそして405nmにおける吸光度を測定
した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を用いた。 ヒトIL−6Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定
（ELISA） トランスフェクトされたCOS細胞からの上清をELISAに
より測定して、生産されたヒト様抗体が抗原IL−6Rに結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをMT18マウスモノクローナル抗体（参考例
１）でコートした。１％ BSAでブロックした後、可溶
性組換えヒトIL−6R（SR344）をプレートに加えた。 プレートを洗浄した後、COS細胞からの培養上清を段
階希釈し、そして該プレートの各ウエルに加えた。イン
キュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ
結合ヤギ抗−ヒトIgGをウエルに加えた。インキュベー
ション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベ
ーションの後、反応を停止し、そして405nmにおける吸
光度を測定した。 この結果を図17に示す。再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ
鎖バージョン「ａ」とキメラAUK12−20抗体Ｈ鎖の組み
合せによるヒト様抗体は、キメラAUK12−20抗体と同様
にヒトIL−6Rに対する強い結合能を示し、サンプルの希
釈度依存的に405nmにおける吸光度が変化し、サンプル
中にIL−6Rに対する抗体が含まれていることが確認され
た。また、この結果は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖
のバージョン「ａ」がキメラAUK12−20抗体Ｌ鎖と同様
に抗原結合能を持つことを示している。 実施例15.ヒトサブグループＩ（HSG I）コンセンサス配
列を用いた再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖遺伝子の構築 実施例13で示した方法と同様にして、AUK12−20抗体
Ｈ鎖Ｖ領域のCDRをヒトサブグループＩのコンセンサス
配列をFRとして有する再構成ヒトVHa425（Kettleboroug
hら、Protein Engineering,４,773−783,1991）に移植
した。まず、再構成ヒトVHa425（上記文献中、Fig3）を
コードするHind III−BamH I DNA断片をプラスミドHCM
V−RVHa−425−γ１から切り出し、pUC19ベクターのHin
d III−BamH I部位にサブクローニングし、pCU−RVH−4
25aを得た。これを鋳型DNAとして使用した。PCRに用い
る８個のプライマー（A1〜H1）を合成した。プライマー
1220−H1は、CDR1の移植及びThr−28からSer−28の変更
を誘導する様にデザインし、プライマー1220−H3はCDR3
の移植及びSer−94からArg−94への変異を誘導する様に
デザインした。プライマー1220−H1,1220−H2及び1220
−H3は、それぞれ8M尿素を含む12％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて精製後、使用した。各プライマーのヌクレ
オチド配列は次の通りである。後方プライマー 配列番号 前方プライマー 配列番号 A1.REVERSE 83 E1.1220−H1b 73 B1.1220−H1 72 F1.1220−H2b 75 C1.1220−H2 74 G1.1220−H3b 77 D1.1220−H3 76 H1.UNIVERSAL 82 PCRの条件は、鋳型DNAとしてpUC−RVH−425aを使用
し、Ｈ鎖CDR移植用プライマーとして上記のものを使用
した以外は実施例13に記載したものと同じであった。A1
とE1、B1とF1、C1とG1、及びD1とH1のプライマー対を用
いて第1PCR反応を行い、それぞれ186bp（A1−E1）,75bp
（B1−F1）,173bp（C1−G1）及び105bp（D1−H1）の各
第1PCR生成物を2.0％の低融点アガロースゲルにて精製
し、次の第2PCR連結反応において使用した。実施例13に
て示した条件に従い、各0.2μｇの上記第1PCR生成物を
用いて第2PCR（PCR連結反応を含む）を行い、マウスAUK
12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域CDRが移植されたヒトＨ鎖Ｖ領
域を含有する495bpのPCR生成物を得、これを2.0％低融
点アガロースゲルを用いて精製した。そしてBamH I及び
Hind IIIにより消化後、得られたBamH I−Hind III断片
をpUC19ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確
認して、pUC−RVH−1220aを得た。 ところで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNA配列を調らべた結果、スプライスの供与配
列とよく一致する配列が見い出された。この事は、再構
成ヒトPM−１抗体の作成時に問題となった異常なスプラ
イシングを引き起す可能性がある。そこで、この配列を
PCR法により変異させた。変異誘導プライマーとして、S
GI−SP1（配列番号97）及びSGI−SP2（配列番号98）を
合成した。このプライマーは、DNA配列AAG GTG AGCを
DNA配列AAA GCT AGCに変える。PCR反応の条件は、前
記条件と同様に行い、鋳型DNAは50ngのpUC−RVH−1220a
であり、そしてプライマーはSGI−SP1とUNIVERSAL（配
列番号82）、またはSGI−SP2とREVERSE（配列番号83）
のいずれかであった。 ２個のPCR反応からのPCR生成物を２％低融点アガロー
スゲルを用いて精製し、そしてPCR連結反応において使
用した。各0.2μｇの第1PCR生成物及び5uのVent DNAポ
リメラーゼを含有する98μｌのPCR反応液を94℃にて２
分間、50℃にて２分間、及び72℃にて５分間インキュベ
ートし連結反応を行った。そして次に100pmoleずつのUN
IVERSAL及びREVERSEプライマーを加え、50μｌの鉱油で
おおった後、94℃にて１分間、50℃にて１分間そして72
℃にて１分間の第2PCRを30サイクル行い、そして次に72
℃にて10分間インキュベートした。第2PCRで得られた49
5bpのDNA断片を2.0％低融点アガロースゲルを用いて精
製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、これをpUC19
ベクターにサブクローニングした後、塩基配列を確認し
て、pUC−RVH−1220a−２を得た。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコー
ドするDNAを含有するHind III−BamH I DNA断片を上記
pUC−RVH−1220a−２より切り出し、Ｈ鎖発現ベクターH
EF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に導入し、再
構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖のバージョンａの発現ベク
ターであるRVH−1220aを得た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョ
ン（ｂ〜ｄ）をコードするDNAを作成するために２組の
変異誘発PCRプライマーを合成した。各PCR反応は前記の
反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョン
「ｂ」をコードするDNAの作成のため、２種の第1PCRに
おいて、UNIVERSALプライマー（配列番号82）及び変異
誘発プライマー1220H−m1a（配列番号78）、あるいは、
REVERSEプライマー（配列番号83）と変異誘発プライマ
ー1220H−m1b（配列番号79）の各PCRプライマー、並び
に鋳型DNAとしてのpUC−RVH−1220aを用いた。それぞれ
202bp及び323bpの第1PCR生成物を2.0％低融点アガロー
スゲルを用いて精製後、前記の反応条件と同様に第2PCR
（PCR連結反応を含む）を行い、495bpの生成物（バージ
ョン「ｂ」）を得た。これをHind III−BamH Iにより消
化し、そして、pUC19ベクターにサブクローニングし、p
UC−RVH−1220bを得た。 同様にして、変異誘発プライマー1220H−m2a（配列番
号80）、1220H−m2b（配列番号81）及びこの生成物を鋳
型pUC−RVH−1220aを用いてPCR生成物（バージョン
「ｃ」をコードするDNA）を得、Hind III及びBamH Iで
消化し、pUC19ベクターのHind III−BamH I部位に挿入
してpUC−RVH−1220cを得た。さらに、変異誘発プライ
マー1220H−m1a（配列番号78）、1220H−m1b（配列番号
79）及び鋳型としてのpUC−RVH−1220cを用いてPCR生成
物（バージョンｄ）を得、これをHind III及びBamH Iで
消化してpCU19ベクターのHind III−BamH I部位に挿入
することによりpUC−RVH−1220dを得た。 なお、プラスミドpUC−RVH−1220b中にコードされて
いるの再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」のア
ミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配
列番号84に示し、pUC−RVH−1220d中にコードされてい
る再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域バージョン「ｄ」のアミノ酸配
列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表85に
示す。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖の各バージョ
ンの発現ベクターを構築するために、再構成ヒトAUK12
−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含むHind III−B
amH I断片をpCU−RVH−1220b,pUC−RVH−1220c、及びpU
C−RVH−1220dより切り出し、Ｈ鎖発現ベクターHEF−12
h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に挿入して、各バー
ジョンの発現ベクターRVH−1220b,RVH−1220c、及びRVH
−1220dをそれぞれ得た。 実施例16.再構成ヒトAUK12−20抗体の種々のバージョン
の発現及び分析 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベ
クターの１つ（RVH−1220a,RVH−1220b,RVH−1220c、ま
たはRVH−1220d）及び再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を
発現するベクターRVL−1220aによりCOS細胞を同時形質
転換することにより、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域の４種類のバージョンを評価した。比較のため、CO
S細胞をキメラAUK12−20抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各
ベクター（HEF−12h−ｇγ１及びHEF−12κ−ｇκ）に
よっても同時形質転換した。ヒトIR−6Rへの結合につい
ての測定において、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖と再
構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖のバージョン「ｂ」、ある
いは再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖と再構成ヒトAUK12−
20抗体Ｈ鎖のバージョン「ｄ」との組み合せによる再構
成ヒト12−20抗体は、キメラAUK12−20抗体と同等の結
合活性を示した。これらの結果を図18及び図19に示す。 実施例17.ヒト抗体HAXを用いた再構成ヒトAUK12−20抗
体Ｈ鎖遺伝子の構築 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域と
最も相同性の高いヒト抗体は、タンパクデータベース
“Leeds"の検索により、HAXであった（J.Immunology 1
39,2496−2501,1987,SLE患者由来Ｂ cell hydridoma
21/28の産生する抗体、遺伝子配列はFig.4,5に、アミ
ノ酸配列はFig.6に記載）。再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ
鎖Ｖ領域の設計を、HAX抗体のFR領域とマウスモノクロ
ーナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のCDRを用いて行っ
た。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のC
DRを含む再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バ
ージョン（Sle1220Ha）をコードする全DNAは化学合成に
て作成した。すなわち、全長439bpのsle1220Haをコード
するDNAを各々21bpの重複部位を有する90〜94bpの長さ
の６本のオリゴヌクレオチド（sle1220h1〜6;それぞ
れ、配列番号86〜91）に分けて設計した。オリゴヌクレ
オチドの設計にあたり、２次構造の検索を行ない、構造
上に問題のある部位に関して、アミノ酸置換がおきない
様に、コドンの第３塩基を変換した。これらのオリゴヌ
クレオチドの相互関係及び２本鎖合成DNAの完成までの
過程を図20に示す。 PCR法を用いて図20に示す反応を行う。すなわち６本
の合成オリゴヌクレオチドを同一PCR反応チューブに加
え、第１のPCR反応を行う。これにより、２つのオリゴ
ヌクレオチドのアニーリング伸長を行うことができ、さ
らに、４つのオリゴヌクレオチド、または、全長のオリ
ゴヌクレオチドを得ることができる。次に、末端プライ
マーＡ（配列番号92）及びＢ（配列番号93）を加え、第
２のPCR反応を行うことで、正しく全長を有するオリゴ
ヌクレオチドのみを増幅することができる。得られた生
成物を精製し、BamH I及びHind IIIにより消化後、pUC1
9ベクターにサブクローニングしてシークエンスを行
う。 具体的には、10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,
0.1mM dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,1.
5mM MgCl2及び2.5uのDNAポリメラーゼAmpliTaq（Perki
n Elmer Cetus）並びに各オリゴヌクレオチド5pmole
を含有する98μｌの反応混合物を94℃1.5分間の変性
後、94℃３分間、50℃２分間、72℃５分間の反応を３サ
イクル行い、次に72℃にて10分間インキュベートした。
反応液に50μＭの末端プライマーＡおよびＢを１μｌず
つ加え、80μｌの鉱油で覆い、94℃1.5分間の変性後、9
4℃にて１分間、50℃にて１分間、72℃１分間の反応を3
0サイクル行い、続いて72℃で10分間インキュベートし
た。439bpのPCR生成物を1.5％の低融点アガロースゲル
を用いて精製し、制限酵素BamH IおよびHind IIIにより
消化後、pUC19ベクターにサブクローニングして、塩基
配列を確認した。得られたクローンをpUC−RVH−sle122
0Haとした。このプラスミド中にコードされている再構
成ヒトAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の
アミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を
配列番号94に示す。 次いで、再構成ヒトAUK12−20（sle1220Ha）抗体Ｈ鎖
Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するHind III−BamH I
DNA断片をpUC−RVH−sle1220Haより切出し、Ｈ鎖発現
ベクターHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に導
入し、RVH−sle1220Haを得た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョ
ン（「ｂ」〜「ｄ」）を作成するため、２つの変異誘発
プライマーsle1220Hm1（配列番号95）、及びsle1220Hm2
（配列番号96）を合成した。各PCR反応では、実施例13
で示されているVent DNAポリメラーゼ及び反応液組成
を用いた。各PCR反応では、バージョン「ｂ」及びバー
ジョン「ｃ」については、鋳型としてのpUC−RVH−sle1
220Ha,50pmoleの変異誘発プライマーsle1220Hm1またはs
le1220Hm2及び50pmoleの末端プライマーＢを含有する反
応混合物を94℃1.5分間の変性の後、94℃１分、50℃１
分、72℃１分の30サイクルの反応にかけ、次に72℃で10
分間インキュベートした。235bpまたは178bpの生成物を
1.5％の低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のP
CR反応のプライマーとして使用した。すなわち、50pmol
eの末端プライマーＡと、0.2μｇのPCR生成物を加え、p
UC−RVH−sle1220Haを鋳型として、第2PCR反応を行い、
439bpの生成物を1.5％低融点アガロースゲルで精製、Ba
mH I及びHind IIIで消化後pUC19ベクターにサブクロー
ニングして、それぞれ再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域バージョン「ｂ」又は「ｃ」をコードするプラスミ
ドpUC−RVH−sle1220Hb又はpUC−RVH−sle1220Hcを得
た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン
「ｄ」をコードするDNAは次の様にして作製した。鋳型
としてのpUC−RVH−sle1220Hbを用いた。変異誘導プラ
イマーsle1220Hm2及び末端プライマーＢを50pmoleずつ
用いて第１のPCR反応を30サイクル行った。得られた178
bpのPCR生成物を1.6％の低融点アガロースゲルにより精
製し、第２のPCRのプライマーとして用いた。このプラ
イマーと50pmoleの末端プライマーＡを用いて第２のPCR
を行い、439bpのDNA断片を得た。これを、精製し、BamH
I及びHind IIIにて消化後pUC19ベクターにサブクロー
ニングし、ヌクレオチド配列を確認し、pUC−RVH−sle1
220Hdを得た。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖の各バージョ
ンの発現ベクターを構築するため、再構成ヒトAUK12−2
0抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含むBamH I−Hind I
II断片をpUC−RVH−sle1220Hb,pUC−RVH−sle1220Hc、
およびpUC−RVH−sle1220Hdより切り出し、Ｈ鎖発現ベ
クターHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に挿入
して、各発現ベクター、RVH−sle1220Hb,RVH−sle1220H
cおよびRVH−sle1220Hdをそれぞれ得た。 分析 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベ
クターのうちの１つ（RVH−sle1220Ha,RVH−sle1220Hb,
RVH−sle1220HcまたはRVH−sle1220Hd）および、再構成
ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を発現するベクターRVL−1220a
を用いてCOS細胞を同時形質転換することにより、再構
成ヒトAUK12−20H抗体Ｈ鎖Ｖ領域の４種類のバージョン
を、IL−6RへのIL−６の結合を阻害する能力について評
価した。この結果を図21〜24に示す。なお、これらの結
果は、生産された抗体をプロテインＡによって精製した
後に得られたものである。 上記のごとく、本発明によれば、キメラＬ鎖もしくは
再構成Ｌ鎖又はキメラＨ鎖もしくは再構成Ｈ鎖のＶ領
域、そして特にFR中の１個又は複数個のアミノ酸を他の
アミノ酸に置換してもなおヒトIL−6Rに結合する能力を
維持している。従って本発明は、その本来の性質を維持
している限り、１個又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸
により置換されている、キメラ抗体及び再構成ヒト抗
体、キメラＬ鎖及び再構成Ｌ鎖、キメラＨ鎖及び再構成
Ｈ鎖、再構成Ｌ鎖Ｖ領域、並びに再構成Ｈ鎖Ｖ領域、並
びにこれらをコードするDNAをも包含する。 参考例 本発明において使用される出発ハイブリドーマは次の
様にして作製された。 参考例1.ハイブリドーマ MT18の作製 ヒトIL−6Rに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表面
にヒトIL−6Rを発現するマウスＴ細胞を次の様にして作
製した。すなわち、Y.Hirataら、J.Immunol.Vol.143,29
00−2906（1989）に開示されているプラスミドpZipneo
IL−6Rを常法に従ってマウスＴ細胞系CTLL−２（ATCC
TIB214）にトランスフェクトし、生ずる形質転換体を
常法に従ってG418を用いてスクリーニングすることによ
り細胞あたり約30,000個のヒトIL−6Rを発現する細胞株
を得た。この細胞株をCTBC3と称する。 CTBC3細胞を常法に従ってRPMI1640中で培養し、そし
て培養細胞をPBS緩衝液により４回洗浄し、そして１×1
07個の細胞をC57BL/6マウスに腹腔内注射して免疫感作
した。この免疫感作は１週間に１回６週間にわたって行
った。 この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そして
常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫P3
U1細胞を融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にし
てスクリーニングした。IL−6R陰性ヒトＴ細胞系JURKAT
（ATCC CRL 8163）を、プラスミドpZipneo IL−6Rに
より同時トランスフェクトし、そして形質転換した細胞
をスクリーニングして、細胞当り約100,000個のIL−6R
を発現する細胞系を得た。この細胞系をNJBC8と命名し
た。 NP−40で細胞溶解したNJBC8を認識するがしかしNP−4
0で細胞溶解したJURKATを認識しない抗体を生産するハ
イブリドーマ細胞系をクローン化しそしてMT18と命名し
た。ハイブリドーマMT18は、工業技術院微生物工業技術
研究所にブダペスト条約のもとに1990年７月10日に微工
研条寄第2999号（FERM BP−2999）として寄託された。 参考例2.ハイブリドーマPM1の作製 ヒトIL−6Rに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトIL−6R
を次の様にして抽出した。３×109個のヒト骨髄腫細胞
（IL−6R生産細胞）を1mlの１％ジギトニン、10mMトリ
エタノールアミン緩衝液（pH7.4）,0.15M NaCl及び1mM
PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド；和光純
薬）中で溶解した。他方、参考例１において調製したハ
イブリドーマMT18により生産されたMT18抗体を、ブロム
シアンで活性化されたセファロース4B（Pharmacia）に
常法に従って結合させた。このMT18抗体結合セファロー
ス4Bを前記の細胞溶解物を混合することにより、セファ
ロース4B上のMT18抗体に前記可溶化したIL−6Rを結合さ
せた。セファロース4Bに非特異的に結合した物質を洗浄
除去し、そしてSepharose4BにMT18抗体を介して結合し
たIL−6Rを免疫原として使用した。 前記の免疫原を用いてBALB/cマウスを１週間に１回４
週間にわたり腹腔内に免疫感作した。次に、この免疫感
作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従って
ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞P3U1と融合
せしめた。融合した細胞を次のようにしてスクリーニン
グした。まず、培養上清及び0.01mlのProteinGセファロ
ース（Pharmacia）を混合して上清中の免疫グロブリン
をProteinGセファロースに吸着せしめた。他方、35S−
メチオニンにより内部標識された1011個のU266細胞を溶
解し、そしてMT18結合セファロース4Bを用いてIL−6Rを
アフィニティ精製した。次に、35S−メチオニンで標識
されたIL−6Rを、免疫グロブリンが結合している上記の
ProteinGセファロースにより免疫沈降せしめ、そして沈
澱をSDS−PAGEにより分析した。その結果、IL−6Rに特
異的に結合する抗体を生産する１個のハイブリドーマク
ローンを単離し、そしてPM1と命名した。ハイブリドー
マPM1は工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト
条約のもとに1990年７月10日に、微工研条寄第2998号
（FERM BP−2998）として寄託された。 参考例3.ハイブリドーマAUK12−20,AUK64−７及びAUK14
6−15の作製 免疫原として可溶性IL−6R（SR 344）を、Yasukawa,
K.らの、J.Biochem.108,673−676,1990、に記載されて
いる方法に従って調製した。 すなわち、Ｎ−末端から345番目のコドンが終止コド
ンにより置換されているIL−6RをコードするcDNAを含有
するプラスミドpECEdhfr344をCHO（5E27）細胞にトラン
スフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血
清培地（SF−０培地、三光純薬）中で培養し、そして得
られる上清をHF−Labl系（東ソー）により濃縮しそして
Blue−5PWカラム及びPhenyl−5PWカラムにより精製し
た。精製された可溶性IL−6RはSDS−PAGEで単一バンド
を示した。 雌性BALB/cAnNCrjマウス（日本クレア）に、１回の免
疫原量を10μg/マウスとしてFreundの完全アジュバント
（Bacto Adjuvant Complete H37Ra,Difco）と共に皮
下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の２週間及び３週
間後に、Freundの不完全アジュバント（Bacto Adjuvan
t Incomplete Freund,Difco）と共に同量の免疫原を
第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。最終免
疫感作（第四回注射）は第三回注射の１週間後に、アジ
ュバントを使ないで尾静脈内に行った。免疫感作された
マウスから血清試料を採取し、希釈緩衝液により段階的
に希釈し、そしてGoldsmith,P.K.,Analytical Biochem
isty,117,53−60,1981、に記載されている方法に従って
ELISA法により分析した。すなわち、SR344（0.1μg/m
l）によりコートされたプレートを１％BSAによりブロッ
クし、そして前記の希釈された試料をそれに加えた。SR
344に結合したマウスIgGをヤギの抗−マウスIgG/アルカ
リホスファターゼ（A/P）（ZYMED）及びアルカリホスフ
ァターゼ用基質（Sigma−104）を用いて測定した。血清
中の抗−SR344抗体の増加を確認した後、最終免疫感作
から３日後に、５匹のBALB/cマウスから脾臓細胞を得
た。脾臓細胞及び骨髄細胞株（P3U1）を25:1の比率で混
合し、PEG1500を用いて融合し、そして2000個のウエル
中で0.7〜1.1×106細胞／ウエルの細胞濃度で培養し
た。ウエルからの上清を、SR344に結合するそれらの能
力について（R344認識アッセイと称する第一次スクリー
ニング）、及びSR344とIL−6Rとの結合を阻害するそれ
らの能力について（1L−6/s1L6R結合阻害アッセイ（RBI
A）による）スクリーニングした。第一次スクリーニン
グが240個の陽性ウエルをもたらし、そして第二次スク
リーニングが36個の陽性ウエルをもたらした。 上記のSR344認識アッセイは次の様にして行った。ヤ
ギの抗マウスIg（Cappel）（１μg/ml）によりコートさ
れたプレート（MaxiSorp,Nunc）を１％BSAによりブロッ
クし、そして100μl/ウエルのハイブリドーマ培養上清
をそれに添加し、次に室温にて１時間インキュベートし
た。プレートを洗浄した後、20ng/mlのSR344をウエルに
加え、そして室温にて１時間インキュベーションを行っ
た。上清に由来する固定化された抗体により捕捉された
SR344の量を、ラビット抗SR344IgG（＃2,5μg/ml）、ヤ
ギの抗ラビットIgG−アルカリホスファターゼ（A/P）
（1:3000,Tago）及び基質（1mg/ml,Sigma−104）の添
加、並びにそれに続く405−600nmでの吸光度の測定によ
り定量した。 前記のRBIAは次の様にして行った。MT18抗体でコート
したプレートを100ng/mlのSR344（100μl/ウエル）で満
たし、そして室温にて１時間インキュベーションを行っ
た。プレートを洗浄した後、50μl/ウエルのハイブリド
ーマ培養上清及び50μl/ウエルのビオチン−IL−６結合
体（20ng/ml）をそれぞれのウエルに同時に加え、そし
てウエルを室温にて１時間インキュベートした。ストレ
プトアビジン−A/P（1:7000,PIERCE）及び対応する基質
（Sigma−104）を添加し、405−600nmでの吸光度を測定
することにより、SR344に結合したビオチン−1L−６の
量を測定した。 最後に、限界希釈法を２回反復することにより陽性ク
ローンを純化し、そしてSR344とIL−６との結合を阻害
する３個のハイブリドーマクローン、すなわちAUK12−2
0,AUK146−15及びAUK64−7;並びにSR344とIL−６との結
合を阻害しないハイブリドーマクローンAUK181−６を得
た。 産業上の利用可能性 本発明はヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提供
し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域のCDRがヒトI
L−6Rに対するマウスモノクローナル抗体のCDRにより置
き換えられている。この再構成ヒト抗体の大部分がヒト
抗体に由来し、そしてCDRは抗原性が低いから、本発明
の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そして
それ故に療法用として期待される。 ブタペスト条約規則第13規則の２の寄託された微生物へ
の言及 寄託期間:National Collections of Industrial and Ma
rine Bacteria Limited あて名:23St Macher Drive,Aberdeen AB2 1RY,UNITED K
INGDOM 微生物の表示 寄託番号 寄託日 E. coli DH5α pPM−h1 NCIMB 40362 1991年２月12日 E. coli DH5α p12−h2 NCIMB 40363 1991年２月12日 E. coli DH5α p64−h2 NCIMB 40364 1991年２月12日 E. coli DH5α p146−h1 NCIMB 40365 1991年２月12日 E. coli DH5α pPM−k3 NCIMB 40366 1991年２月12日 E. coli DH5α p12−k2 NCIMB 40367 1991年２月12日 E. coli DH5α p64−k4 NCIMB 40368 1991年２月12日 E. coli DH5α p146−k3 NCIMB 40369 1991年２月12日 寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号微生物の表示 寄託番号 寄託日 MT18 FERM BP−2999 1990年７月10日 PM 1 FERM BP−2998 1990年７月10日
R）に対するマウスモノクローナル抗体の可変領域（Ｖ
領域）、ヒトIL−6Rに対するヒト／マウスキメラ抗体、
ヒトライト鎖（Ｌ鎖）Ｖ領域及びヒトヘビー鎖（Ｈ鎖）
Ｖ領域の相補性決定領域（CDR）がヒトIL−6Rに対する
マウスモノクローナル抗体のCDRにより置き換えられて
いる再構成（reshaped）ヒト抗体に関する。本発明はさ
らに、上記の抗体又はその部分をコードするDNAを提供
する。本発明はさらに、前記DNAを含んで成るベクタ
ー、特に発現ベクター、並びに該ベクターにより形質転
換された宿主に関する。本発明はさらに、ヒトIL−6Rに
対するキメラ抗体の製造方法、及びヒトIL−6Rに対する
再構成ヒト抗体の製造方法を提供する。 背景技術 インターロイキン−６（IL−６）は一連の細胞により
生産される多機能サイトカインである。このものは免疫
応答、急性期反応及び造血を調節し、そして宿主防御機
構において中心的役割を演ずる。このものは広範な組織
に作用して、標的細胞の性質に応じて成長誘導効果、成
長阻害効果及び分化誘導効果を発揮する。IL−６に対す
る特異的レセプター（IL−6R）は、IL−６の多機能性に
従ってリンパ系細胞及び非リンパ系細胞上で発現され
る。IL−６遺伝子の異常発現が種々の疾患、特に自己免
疫疾患、メサンジウム細胞増殖性糸球体腎炎、及び形質
細胞腫／骨髄腫の発病に関与することが示唆されている
（Hiranoら、Immunol.Today,11,443−449,1990の総説を
参照のこと）。ヒト骨髄腫細胞はIL−６を生産しそして
IL−6Rを発現することが観察される。実験において、IL
−６に対する抗体が骨髄腫細胞の試験管内での増殖を阻
害し、そしてそれ故にヒト骨髄腫の発癌においてオート
クリン調節ループが機能していることが示された（Kawa
noら、Nature,332,83,1988）。 IL−6Rは種々の動物細胞の表面に存在し、そしてIL−
６に特異的に結合し、そして細胞表面上のIL−6R分子の
数が報告されている（Tagaら、J.Exp.Med.196,967,198
7）。さらに、ヒトIL−6RをコードするcDNAがクローン
化され、そしてIL−6Rの一次構造が報告されている（Ya
masakiら、Science,241,825,1988）。 マウスのモノクローナル抗体はヒトにおいて高度に免
疫原性（「抗原性」という場合もある）があり、そして
この理由のため、ヒトにおけるそれらの療法的価値は制
限される。ヒトにおけるマウス抗体の半減期は比較的短
い。さらに、ヒト抗マウス抗体は、予定された効果を妨
害するのみならず、患者における不都合なアレルギー応
答の危険をもたらす免疫応答を惹起することなくして頻
回投与することはできない。 これらの問題を解決するため、ヒト型化（humanize
d）抗体の製造方法が開発された。マウス抗体は２つの
方法でヒト型化することができる。より簡単な方法は、
可変領域がもとのマウスモノクローナル抗体に由来しそ
して定常領域が適当なヒト抗体に由来するキメラ抗体を
作製する方法である。得られるキメラ抗体はもとのマウ
ス抗体の完全な可変領域を含有し、そしてもとのマウス
抗体と同一の特異性をもって抗原に結合することを期待
することができる。さらに、キメラ抗体ではヒト以外に
由来する蛋白質配列の比率が実質的に減少しており、そ
してそれ故にもとのマウス抗体に比べて免疫原性が低い
と予想される。キメラ抗体は抗原によく結合しそして免
疫原性が低いが、マウス可変領域に対する免疫応答がな
お生ずる可能性がある（LoBuglioら、Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,84,4220−4224,1989）。 マウス抗体をヒト型化するための第二の方法は一層複
雑であるが、しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさ
らに大幅に低下させるものである。この方法において
は、マウス抗体の可変領域からの相補性決定領域（comp
lementarity determining region;CDR）をヒト可変領
域に移植して「再構成」（reshaped）ヒト可変領域を作
製する。次に、これらの再構成ヒト可変領域をヒト定常
領域に連結する。最終的に再構成されたヒト型化抗体の
ヒト以外の蛋白質配列に由来する部分はCDRと極く一部
のフレームワーク（FR）のみである。CDRは超可変蛋白
質配列により構成されている。これらは種特異的配列を
示さない。これらの理由のため、マウスCDRを担持する
再構成ヒト抗体はもやはヒトCDRを含有する天然ヒト抗
体より強い免疫原性を有しないはずである。 前記のごとく、再構成ヒト抗体は療法目的のために有
用であると予想されるが、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒ
ト抗体は知られていない。さらに、再構成ヒト抗体の製
造方法であって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る
方法は存在しない。従って、特定の抗原に対する十分に
活性な再構成ヒト抗体を作製するためには種々の工夫が
必要である。ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル
抗体、すなわちPM1およびMT18は作製されており（特願
平２−189420）、そして本発明者らはヒトIL−6Rに対す
るマウスモノクローナル抗体AUK12−20、AUK64−７及び
AUK146−15を調製しているが、本発明者らはヒトIL−6R
に対する再構成ヒト抗体の作製を示唆する文献を知らな
い。 さらに、ヒト骨髄腫細胞株が移植されたヌードマウス
に、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体が注
射された時腫瘍の増殖が顕著に阻害されることを、本発
明者らは見出した。このことは、骨髄腫の治療のための
療法剤として抗ヒトIL−6R抗体が有用であることを示唆
している。従って本発明はヒトIL−6Rに対する、免疫原
性の低い抗体を提供しようとするものである。 発明の開示 従って、本発明はヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体
を提供する。本発明はまた、該再構成ヒト抗体の作製の
過程で有用なヒト／マウスキメラ抗体を提供する。本発
明はさらに、再構成ヒト抗体の部分、並びに再構成ヒト
抗体及びその部分並びにキメラ抗体の製造のための発現
系を提供する。 さらに具体的には、本発明は、ヒトIL−6Rに対するマ
ウスモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域；並びにヒトIL−
6Rに対するマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を提
供する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及びヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖；並
びに （２）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及びヒトIL−6Rに対するマウス
モノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体を提供す
る。 本発明はさらに、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＬ鎖Ｖ領域のCDR;並びにヒトIL−6Rに対す
るマウスモノクローナル抗体のＨ鎖Ｖ領域のCDRを提供
する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｖ領域のフレームワーク領域（FR）、及
び （２）ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
Ｌ鎖Ｖ領域のCDR、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＬ
鎖Ｖ領域；並びに （１）ヒトＨ鎖Ｖ領域のFR、及び （２）ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域のCDR、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＨ
鎖Ｖ領域を提供する。 本発明はさらに、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のCDRを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＬ
鎖；並びに （１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトFR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のCDRを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、 を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＨ
鎖を提供する。 本発明はさらにまた、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトＬ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＬ鎖CDRを含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、並びに （２）ヒトＨ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖CDRを含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提
供する。 本発明はまた、前記種々の抗体構成ポリペプチド、又
はその部分をコードするDNAに関する。 本発明はまた、上記DNAを含んで成るベクター、例え
ば発現ベクターに関する。 本発明はさらに、上記ベクターにより形質転換された
宿主を提供する。 本発明はさらにまた、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体
の製造方法、及びヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体の
製造方法を提供する。 図面の簡単な説明 図１は、本発明の抗体ペプチドの発現のために有用
な、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）プロモーター／
エンハンサー系を含んで成る発現ベクターを示す。 図２は、ヒトIL−6Rに結合する本発明のキメラ抗体AU
K12−20の能力の確認のためのELISAの結果を示すグラフ
である。 図３は、ヒトIL−6RへのヒトIL−６の結合を阻害する
本発明のキメラ抗体AUK12−20の能力の確認のためのELI
SAの結果を示すグラフである。 図４は、ヒトIL−6Rへの本発明のキメラ抗体PM1a及び
PM1bの結合についてのELISAの結果を示すグラフであ
る。 図５は、ヒトIL−6RへのヒトIL−６の結合を阻害する
本発明のキメラ抗体PM1a及びPM1bの能力を試験するELIS
Aの結果を示すグラフである。 図６は、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムであ
る。 図７は、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョン（バージョン「ａ」）の作製のダイアグラムであ
る。 図８は、Ｈ鎖の発現のために有用な、ヒト・エロンゲ
ージョン・ファクター１α（HEF−１α）プロモーター
／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドHEF−12h−
ｇγ１の作製の過程を示す。 図９は、Ｌ鎖の発現のために有用な、HEF−１αプロ
モーター／エンハンサー系を含んで成る発現プラスミド
HEF−12k−gkの作製の過程を示す。 図10は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠
陥SV40プロモーター／エンハンサー配列に連結されたジ
ヒドロフォレートレダクターゼ（dhfr）及びHCMVプロモ
ーター／エンハンサーを含んで成る発現プラスミドDHFR
−PMh−ｇγ１の作製の過程を示す。 図11は、Ｈ鎖の発現のために有用な、増幅のための欠
陥SV40−プロモーター／エンハンサー配列に連結された
dhfr遺伝子及びEF1αプロモーター／エンハンサーを含
んで成る発現プラスミドDHFR−ΔＥ−RVh−PM1−ｆの作
製の過程を示す。 図12は、ヒトIL−6Rへの結合についての再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」及び「ｂ」の能
力を示すグラフである。 図13は、ヒトIL−6Rへの結合についての再構成ヒトPM
−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を示すグラ
フである。 図14は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」＋再構
成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の能力を
示すグラフである。 図15は、それぞれＬ鎖及びＨ鎖の発現のために有用
な、ヒトEF1−αプロモーター／エンハンサーを含んで
成る発現プラスミドHEF−VL−gk及びHEF−VH−ｇγ１を
示す。 図16は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域バージ
ョン「ａ」をコードするDNAの作製の過程を示す。 図17は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体Ｌ鎖Ｖ領域の能力の確認のためのELISAの結果を示
すグラフである。図中、標準AUK12−20（キメラ）はキ
メラAUK12−20抗体をCHO細胞により大量に製造して精製
したものについての結果を示す。 図18は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｂ」）
の能力についてのELISAの結果を示すグラフである。 図19は、ヒトIL−6Rに結合する再構成ヒトAUK12−20
抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バージョン「ｄ」）
の能力についてのELISAの結果を示すグラフである。 図20は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の化学
合成の過程を示す。 図21は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ａ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図22は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｂ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図23は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｃ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 図24は、ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害する再構
成ヒトAUK12−20抗体（Ｌ鎖バージョン「ａ」＋Ｈ鎖バ
ージョン「ｄ」）の能力についてのELISAの結果を示す
グラフである。 発明を実施するための最良の形態 マウスＶ領域をコードするDNAのクローニング さらに詳しくは、ヒトIL−6Rに対するマウスモノクロ
ーナル抗体のＶ領域をコードするDNAをクローン化する
ためには、遺伝子源として、ヒトIL−6Rに対するモノク
ローナル抗体を生産するハイブリドーマを作製すること
が必要である。この様なハイブリドーマとして、特願平
２−189420号明細書にはモノクローナル抗体PM1を生産
するマウスハイブリドーマPM1及び該抗体の性質が記載
されている。本明細書の参考例２にハイブリドーマPM1
の作製方法を記載する。本発明者らは、それぞれがヒト
IL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマAUK12−20、AUK64−７及びAUK146−15を作
製している。これらのハイブリドーマの作製方法は本明
細書の参考例３に記載されている。 マウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする目
的のDNAをクローン化するためハイブリドーマ細胞を破
壊し、そしてChirgwinら、Biochemistry 18,5294,1977
に記載されている常法により全RNAを得る。次に、この
全RNAを用いて、J.W.Larrickら、Biotechnology,７,93
4,1989に記載されている方法を用いて一本鎖cDNAを合成
する。 次に、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いて前記c
DNAの有意義な部分の特異的増幅を行う。マウスモノク
ローナル抗体のカッパ（κ）型Ｌ鎖Ｖ領域の増幅のた
め、配列番号:1〜11に示す11種のオリゴヌクレオチドプ
ライマー（Mouse Kappa Variable;MKV）及び配列番
号:12に示すオリゴヌクレオチドプライマー（Mause Ka
ppa Constant;MKC）をそれぞれ５′−末端プライマー
及び３′−末端プライマーとして使用する。前記MKVプ
ライマーはマウスカッパ型Ｌ鎖リーダー配列をコードす
るDNA配列とハイブリダイズし、そして前記MKCプライマ
ーはマウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域をコードするDNA配列と
ハイブリダイズする。マウスモノクローナル抗体のＨ鎖
Ｖ領域の増幅のため、配列番号:13〜22に示す10種のオ
リゴヌクレオチドプライマー（Mouse Heavy Variabl
e;MHV）及び配列番号:23に示すオリゴヌクレオチドプラ
イマー（Mouse Heavy Constant;MHC）をそれぞれ５′
−末端プライマー及び３′−末端プライマーとして使用
する。 なお、５′−末端プライマーはその５′−末端近傍に
制限酵素Sal I切断部位を提供する配列GTCGACを含有
し、そして３′−末端プライマーはその５′−末端近傍
に制限酵素Xmal切断部位を提供するヌクレオチド配列CC
CGGGを含有する。これらの制限酵素切断部位は可変領域
をコードする目的のDNA断片をクローニングベクターに
サブクローニングするために用いられる。 次に増幅生成物を制限酵素Sal I及びXma Iで切断させ
て、マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域を
コードするDNA断片を得る。他方、プラスミドpUC19のご
とき適当なクローニングベクターを同じ制限酵素Sal I
及びXma Iにより切断させ、このpUC19に前記DNA断片を
連結することにより、マウスモノクローナル抗体の目的
とする可変領域をコードするDNA断片を含むプラスミド
を得る。 クローン化されたDNAの配列決定は任意の常法に従っ
て行うことができる。 目的とするDNAのクローン化及びその配列決定を実施
例１〜３に具体的に記載する。 相補性決定領域（CDR） 本発明はさらに、本発明の各Ｖ領域の超可変又は相補
性決定領域（CDR）を提供する。Ｌ鎖及びＨ鎖の各対の
Ｖ領域は抗原結合部位を形成する。Ｌ鎖及びＨ鎖上のこ
の領域は同様の全般的構造を有しそして各領域は配列の
比較的保存された４個のフレームワーク領域を含み、そ
れらは３個の超可変領域又はCDRにより連結されている
（Kabat,E.A.ら、「Sequences of Proteins of Imm
unological Interest」,US Dept.Health and Human
Services 1983）。前記４個のフレームワーク領域
（FR）の多くの部分はβ−シート構造をとり、CDRはル
ープを形成する。CDRはある場合にはβ−シート構造の
一部分を形成することもある。CDRはFRによって非常に
近い位置に保持され、そして他の領域のCDRと共に抗原
結合部位の形成に寄与する。本発明は、ヒト型化抗体の
素材として有用なこれらのCDR、及びそれをコードするD
NAをも提供する。これらのCDR領域は、Ｖ領域の既知ア
ミノ酸配列と照合することによって、Kabat,E.A.ら、
「Sequences of Proteins of Immunological Inte
rest」の経験則から見出すことができ、実施例４におい
て具体的に説明する。 キメラ抗体の作製 ヒトIL−6Rに対する抗体の再構成ヒトＶ領域を設計す
るに先立って、使用するCDRが実際に抗原結合領域を形
成することを確かめる必要がある。この目的のため、キ
メラ抗体を作製した。さらに実施例１及び２に記載され
る４種類のモノクローナル抗体のクローン化されたDNA
のヌクレオチド配列から推定されるマウス抗ヒトIL−6R
抗体のアミノ酸配列を相互に、及び既知のマウス及びヒ
トの抗体のＶ領域と比較した。４種類のモノクローナル
抗体のそれぞれについて、１セットの典型的な機能的マ
ウスＬ及びＨ鎖Ｖ領域がクローニングされた。しかしな
がら、４種類すべてのマウス抗ヒトIL−6R抗体は比較的
異なるＶ領域を有していた。４種類の抗体は相互に単に
微小な相違ではなかった。クローン化されたマウスＶ領
域を用いて４種類のキメラ抗ヒトIL−6R抗体を作製し
た。 キメラ抗体を作製するための基本的な方法は、PCR−
クローン化cDNAに見られるようなマウスリーダー配列及
びＶ領域配列を、哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存
在するヒトＣ領域をコードする配列に連結することを含
んで成る。前記４種類のモノクローナル抗体の内、モノ
クローナル抗体AUK12−20からのキメラ抗体の作製を実
施例５に記載する。 モノクローナル抗体PM−１からのキメラ抗体の作製を
実施例６に記載する。マウスPM−１κＬ鎖リーダー領域
及びＶ領域をコードするcDNAを、ヒトＬ鎖Ｃ領域をコー
ドするヒトゲノムDNAを含有する発現ベクターにPCR法を
用いてクローン化した。マウスPM−１抗体（単に「PM−
１抗体」又は「PM」という場合もある）のＨ鎖リーダー
及びＶ領域をコードするcDNAを、ヒトγ−1C領域をコー
ドするゲノムDNAを含有する発現ベクターにPCR法を用い
てサブクローン化した。特に設計されたPCRプライマー
を用いて、マウスPM−１抗体のＶ領域をコードするcDNA
をそれらの５′−及び３′−末端において適当な塩基配
列を導入して（１）それらが発現ベクターに容易に挿入
されるように、且つ（２）それらが該発現ベクター中で
適切に機能するようにした。次に、これらのプライマー
を用いてPCRにより増幅して得たマウスPM−１抗体のＶ
領域を、所望のヒトＣ領域をすでに含有するHCMV発現ベ
クター（図１）に挿入した。これらのベクターは、種々
の哺乳類細胞系における遺伝子操作された抗体の一過性
（transient）発現又は安定な発現のために適当であ
る。 マウスPM−１抗体中に存在するＶ領域と同じＶ領域を
有するキメラPM−１抗体（バージョンａ）の作製に加え
て、キメラPM−１抗体の第二のバージョン（バージョン
ｂ）を作製した。キメラPM−１抗体（バージョンｂ）に
おいては、Ｌ鎖Ｖ領域中の位置107のアミノ酸がアスパ
ラギンからリジンに変えられている。マウスPM−１抗体
からのＬ鎖Ｖ領域と他のマウスＬ鎖Ｖ領域との比較にお
いて、位置107におけるアルギニンの存在は異常である
ことが注目された。マウスκＬ鎖Ｖ領域においては、位
置107の最も典型的アミノ酸はリジンである。マウスPM
−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置107に非典型的なアミノ
酸であるアルギニンを有することの重要性を評価するた
め、位置107を典型的なアミノ酸であるリジンに変え
た。この変更は、PCR−変異誘発法（M.Kammanら、Nucl.
Acids Res.（1987）17:5404）を用いてＬ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNA配列中に必要な変更を行うことにより達成
された。 キメラPM−１抗体バージョン（ａ）はヒトIL−6Rに結
合する活性を示した。キメラPM−１抗体バージョン
（ｂ）もバージョン（ａ）と同様にヒトIL−6Rに結合す
る。同様に、他の２種類のモノクローナル抗体AUK64−
７及びAUK146−15からキメラ抗体を作製した。４種類す
べてのキメラ抗体はヒトIL−6Rによく結合し、機能的測
定において、正しいマウスＶ領域がクローン化されそし
て配列が決定されていたことが示された。 ４種類のマウス抗ヒトIL−6R抗体から、ヒトIL−6Rに
対する再構成ヒト抗体の設計及び作製のための第一の候
補としてマウスPM−１抗体を選択した。マウスPM−１抗
体の選択は主として、ヌードマウスに移植されたヒト骨
髄腫細胞に対するマウス抗ヒトIL−6R抗体及びキメラ抗
体の効果を研究して得られた結果に基く。４種類のマウ
ス抗ヒトIL−6R抗体の内、PM−１抗体が最も強い抗腫瘍
細胞活性を示した。又、キメラPM−１抗体はキメラAUK1
2−20抗体よりも強い抗腫瘍活性を示した。 マウスモノクローナル抗体PM−１のＶ領域と既知のマウ
ス及びヒトの抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体のCDRがヒトモノクローナ
ル抗体に移植されている再構成ヒト抗体を作製するため
には、マウスモノクローナル抗体のFRとヒトモノクロー
ナル抗体のFRとの間に高い相同性が存在することが望ま
しい。従って、マウスPM−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖のＶ領
域を、OWL（or Leeds）database of protein seque
ncesに見出されるすべての既知マウス及びヒトのＶ領域
と比較した。 マウス抗体のＶ領域に関しては、PM−１抗体のＬ鎖Ｖ
領域はマウス抗体musigkcko（Chen,H.T.ら、J.Biol.Che
m.（1987）262:13579−13583）のＬ鎖Ｖ領域と最も類似
しており、93.5％の同一性（identity）が存在した。PM
−１抗体のＨ鎖Ｖ領域はマウス抗体musigvhr2（F.J.Gra
ntら、Nucl.Acids Res.（1987）15:5496）のＨ鎖Ｖ領
域に最も類似しており、84.0％の同一性が存在した。マ
ウスPM−１抗体のＶ領域は既知マウスＶ領域に高比率の
同一性を示し、マウスPM−１抗体のＶ領域が典型的なマ
ウスＶ領域であることが示される。このことはさらに、
クローン化されたDNA配列が正しいという間接的な証明
を与える。一般に、Ｈ鎖Ｖ領域間に比べてＬ鎖Ｖ領域間
の方がより高い比率の同一性が存在する。これはおそら
く、Ｈ鎖Ｖ領域に比べてＬ鎖Ｖ領域において一般的に観
察されるより少ない量の多様性のためであろう。 ヒト抗体のＶ領域に関しては、マウスPM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域は、REIとも称されるヒト抗体klhure（W.Palm
ら、Physiol.Chem.（1975）356:167−191）のＬ鎖Ｖ領
域に最も類似しており、72.2％の同一性が存在する。PM
−１抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒト抗体humighvap（VAP）
（H.W.Schroederら、Science（1987）238:791−793）に
最も類似しており、71.8％の同一性が存在する。マウス
PM−１抗体からの再構成抗体をいかに設計するかを考え
るためにヒトＶ領域との比較が最も重要である。ヒトＶ
領域への同一性の比率はマウスＶ領域への同一性の比率
より低い。これはマウスPM−１抗体のＶ領域がマウスＶ
領域に類似しており、そしてヒトＶ領域には類似してい
ないことの間接的証明である。この証明にまた、ヒト患
者における免疫原性の問題を解決するためにマウスPM−
１のＶ領域をヒト型化する（humanize）ことが最善であ
ることを示す。 マウスPM−１抗体のＶ領域をさらに、E.A.Kabatら、
（1987）Sequences ofProteins of Immunological Inte
rest,Forth Edition,U.S.Department of Health and Hu
man Services,U.S.Government Printing Officeにより
定義される、ヒトＶ領域の異なるサブグループについて
のコンセンサス配列と比較した。Ｖ領域のFR間で比較を
行った。その結果を表１に示す。 （１）コンセンサス配列はKabatら（1987）に記載され
ている マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のFRはヒトＬ鎖Ｖ領域
のサブグループＩ（HSG I）のコンセンサス配列からのF
Rに最も類似しており、70.1％の同一性が存在する。マ
ウスPM−１のＨ鎖Ｖ領域のFRはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグ
ループII（HSG II）のコンセンサス配列からのFRに最も
類似しており、52.9％の同一性が存在する。これらの結
果は、既知のヒト抗体との比較から得られた結果を支持
している。ヒトREI中のＬ鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域の
サブグループＩに属し、そしてヒトVAP中のＨ鎖Ｖ領域
はヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIに属する。 ヒト抗体中のＶ領域とのこれらの比較から、再構成ヒ
トPM−１抗体のＶ領域の設計の基礎となるヒトＶ領域を
選択することが可能である。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域の設計のためにはサブグループＩ（HSG I）に属
するヒトＬ鎖Ｖ領域を使用し、そして再構成ヒトPM−１
抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計のためにはサブグループII（HSG
II）に属するヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域を用いるのが最善であ
ろう。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計における第一段階
は、設計の基礎となるヒト抗体Ｖ領域を選択することで
あった。マウスPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のFRは、サブグ
ループＩに属するヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のFRに最も類似
していた（表１）。前記のごとく、マウスPM−１抗体の
Ｌ鎖Ｖ領域と既知ヒト抗体Ｌ鎖Ｖ領域との比較におい
て、それはヒトＬ鎖Ｖ領域のサブグループＩの１構成員
であるヒトＬ鎖Ｖ領域REIに最も類似していた。従っ
て、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計においてRE
IからのFRを使用した。また、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域の作製のための出発材料としてREIのFRを使用
した。 REIに基くこれらのヒトFR中には、もとのヒトREIに比
べて５個の相違が存在する（kabatら、1987、によれば
位置39,71,104,105及び107;表２を参照のこと）。FR4中
の３個の変化（位置104,105及び107）は他のヒトκＬ鎖
からのＪ領域に基いており、そしてそれ故にヒトからの
逸脱を成すものではない（L.Riechmannら、Nature（198
8）322:21−25）。位置39及び71における２個の変化は
ラットCAMPATH−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のFR中に存在する
アミノ酸にもどる変化であった（Riechmannら、198
8）。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２つのバージョン
を設計した。第一のバージョン（バージョン「ａ」）に
おいては、ヒトFRは再構成ヒトCAMPATH−1H抗体中に存
在するREIに基くFR（Riechmannら、1988）と同一であ
り、そしてマウスCDRはマウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域
中のCDRと同じであった。第二のバージョン（バージョ
ン「ｂ」）はバージョン「ａ」に基き、ヒトFR3中の位
置71におけるアミノ酸１個のみを異にする。C.Chothia
ら、J.Mol.Biol.（1987）196:901−917により定義され
るように、残基71はＬ鎖Ｖ領域のCDR1の標準的（canoni
cal）構造の部分である。この位置のアミノ酸はＬ鎖Ｖ
領域のCDR1ループの構造に直接影響すると予想され、そ
してそれ故に抗体結合に大きく影響するであろう。マウ
スPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域において、位置71はチロシン
である。再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域のバージョ
ン「ａ」の設計に使用した修飾されたREIのFRにおいて
は位置71はフェニルアラニンであった。再構成ヒトPM−
１抗体Ｌ鎖Ｖ領域のバージョン「ｂ」においては、位置
71のフェニルアラニンがマウスPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中
に見出されるようにチロシンに変えられている。表２
は、マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトCAMPAT
H−1H抗体中での使用のために修飾されたREIのFR（Riec
hmannら、1988）及び再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領
域の２種類のバージョンの、それぞれのアミノ酸配列を
示す。 注:REIのFRは再構成ヒトCAMPATH−1H抗体中に見出さ
れるものである（Riechmannら、1988）。REIのFR中の５
個の下線を付したアミノ酸はヒトREIのアミノ酸配列（P
lamら、1975;0.Eppら、Biochemistry（1975）14:4943−
4952）から異なるアミノ酸である。マウスPM−１抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域中のFRはサブグループIIに属するヒトＨ鎖Ｖ
領域に最も類似している（表１）。前記のごとく、マウ
スPM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域と既知のヒトＨ鎖Ｖ領域との
比較において、これはヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループII
の１構成員であるヒトＨ鎖Ｖ領域VAPに最も類似してい
た。ヒトＨ鎖Ｖ領域のサブグループIIの他の構成員であ
るヒトＨ鎖Ｖ領域NEWを、再構成ヒトPM−１抗体のＨ鎖
Ｖ領域の作製のための出発材料として、及び再構成ヒト
PM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計のための基礎として用い
た。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョ
ンを設計した。６種類のバージョンのすべてにおいて、
ヒトFRは再構成D1.3中に存在するNEW FRに基いてお
り、そしてマウスCDRはマウスPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域中
のCDRと同じである。ヒトFR中の７個のアミノ酸残基
（位置1,27,28,29,30,48及び71;表３参照）は抗原結合
に不都合な影響を与える可能性を有するものと同定され
ている。マウスPM−１抗体のＶ領域のモデルにおいて、
Ｈ鎖Ｖ領域中の残基１はCDRループの近くに位置する表
面残基である。残基27,28,29、及び30は、C.Chothia
ら、Nature（1989）34:877−882により推定されるよう
にＨ鎖Ｖ領域のCDR1の標準的（canonical）構造の部分
であり、そして／又はＨ鎖Ｖ領域の第一構造ループの部
分を構成することがマウスPM−１抗体Ｖ領域のモデルに
おいて観察される（Chothiaら、1987）。残基48はマウ
スPM−１抗体のＶ領域のモデルにおいて埋った（burie
d）残基として観察された。埋った（buried）残基の変
化はＶ領域及びその抗原結合部位の全体構造を破壊する
可能性がある。残基71は、Chothiaら（1989）により予
想されるようにＨ鎖Ｖ領域のCDR2の標準（canonical）
構造の部分である。再構成ヒトPM−１抗体の６種類のバ
ージョンはヒトNEWのFR中のこれら７つの位置のアミノ
酸の変化の異る組合わせを含む（表３を参照のこと）。 注:NEWのFRには再構成ヒトCAMPATH−1H抗体の第一バ
ージョン（Riechmannら、1988）中に見出されるもので
ある。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域をコードするDNAの作製 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれ
の第一バージョンをコードするDNAを新規なPCR利用法を
用いて作製した。要約すれば、適当なヒトFRをすでに含
有する再構成ヒトＶ領域をコードするプラスミドをPCR
プライマーを用いて修飾し、ヒトＶ領域中に存在するCD
RをマウスPM−１抗体からのCDRにより置換した。再構成
ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNAの作製のた
めの出発材料は、再構成ヒトD1.3L鎖Ｖ領域をコードす
るDNAを含有するプラスミドDNAであった。この再構成ヒ
トD1.3L鎖Ｖ領域はヒトＬ鎖Ｖ領域REI中に存在するFRに
基いて作製された。再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を
コードするDNAの作製のための出発材料は再構成ヒトD1.
3H鎖Ｖ領域をコードするDNAであった。この再構成ヒトD
1.3抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAはヒトＨ鎖Ｖ領域NE
W（W.Verhoeyenら、Science（1988）239:1534−1536）
のFRをコードするDNAに基いて作製された。 所望のヒトFRをコードするDNAを含有する出発プラス
ミドDNAを選択した後、マウスD1.3CDRに代るマウスPM−
１抗体CDRの置換を可能にするようにPCRプライマーを設
計しそして合成した。各再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域に
つき、３種類のプライマーはマウスPM−１抗体CDRをコ
ードするDNA配列を含有し、そして２種類のプライマー
は再構成ヒトＶ領域をコードする全体DNA配列を挟むよ
うに設計されている。一連のPCR反応における５種類のP
CRプライマーの使用が、出発再構成ヒトＶ領域中に存在
するヒトFRをコードするDNA及びマウスPM−１抗体Ｖ領
域中に存在するCDRをコードするDNAから成るPCR生成物
をもたらした（実施例７、並びに図７及び図８を参照の
こと）。PCR生成物をクローン化し、そして配列決定し
て、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のバージ
ョン「ａ」全体DNA配列が正しいアミノ酸配列をコード
していることを確認した。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ
領域バージョン「ａ」の配列を配列番号55に示す。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の他のバージョンをコー
ドするDNAは、公表されているPCR−変異誘発法（Kamman
ら、1989）にわずかな変更を加えた方法を用いて作製し
た。再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の設計に関して記載し
たように、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の１つの追
加のバージョン（バージョン「ｂ」）をコードするDNA
を作製し、そして再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の５
種類の追加のバージョン（バージョン「ｂ」，「ｃ」，
「ｄ」，「ｅ」、及び「ｆ」をコードするDNAを作製し
た。これらの追加のバージョンは、第一バージョンから
の一連の微細な変化を含む。アミノ酸配列のこれらの微
細な変化はPCR変異誘発を用いてDNA配列の微細な変更を
行うことにより達成された。DNA配列に必要な変化を導
入するPCRプライマーが設計された。一連のPCR反応に続
き、PCR生成物をクローン化し、そして配列決定してDNA
配列中の変化が計画通りに起っていることを確認した。
再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」の配
列を配列番号54に示す。 再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域の種々のバージョンのDN
A配列を確認した後、再構成ヒトPM−１抗体Ｖ領域をコ
ードするDNAを、ヒトＣ領域をコードするDNAをすでに含
有する哺乳類細胞発現ベクターにサブクローニングし
た。すなわち、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドするDNAをヒトＬ鎖Ｃ領域をコードするDNA配列に連結
し、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA
をヒトγ−1C領域をコードするDNA配列に連結した。再
構成ヒトPM−１抗体のより高いレベルの発現を達成する
ため、図１に示すようなHCMV発現ベクターを修飾して、
HCMVプロモーター・エンハンサー領域をヒトエロンゲー
ションファクター（human elongation factor;HEF−
１α）プロモーター・エンハンサーにより置き換えた
（図15を参照のこと）。 次に再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）と、Ｈ鎖
Ｖ領域バージョン（ａ）〜（ｆ）のすべての組合せをヒ
トIL−6Rへの結合について試験し、そしてその結果、実
施例11に詳細に記載するように、Ｌ鎖バージョン（ａ）
とＨ鎖バージョン（ｆ）とを含んで成る再構成ヒト抗体
がキメラPM−１抗体（ａ）と同じレベルでIL−6Rに結合
する能力を示した。 発現のレベルを改良するための、再構成ヒトPM−１抗体
Ｖ領域をコードするDNAの変更 COS細胞中で生産される再構成ヒトPM−１抗体の発現
レベルの検討において、再構成ヒトＨ鎖の発現が常に、
再構成ヒトＬ鎖又はキメラＬ鎖もしくはＨ鎖の発現レベ
ルに比べて約10分の１であることが明らかになった。低
レベルの発現を生じさせる問題点は再構成ヒトＨ鎖Ｖ領
域にあるようであった。低レベルの発現が低レベルの転
写の結果であるか否かを特定するため、再構成ヒトPM−
１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各ベクターにより同時形
質転換されたCOS細胞からRNAを調製した。マウスPM−１
抗体Ｖ領域をコードするDNAのPCRクローニングについて
記載したようにして一本鎖cDNAを合成した。再構成ヒト
Ｌ鎖又はＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列の両端を挟む
ように設計されたPCRプライマーを用いて、再構成ヒト
Ｌ鎖Ｖ領域又は再構成Ｈ鎖Ｖ領域に対応する前記一本鎖
cDNAからPCR生成物を生成せしめた。 再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAについて、２
種類のPCR生成物が存在し、一方は予想通り408bpの長さ
を有し、他方より短い299bpのPCR生成物であった。正し
いサイズのPCR生成物はPCR生成物の全生成量の約90％を
占め、そして短いPCR生成物は全生成量の約10％を占め
た。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域についてもやはり２種類のPC
R生成物が存在し、一方は予想通り444bpの長さを有し、
そして他方は370bpの長さの短いPCR生成物であった。し
かしながらこの場合、正しくない短い方のPCR生成物がP
CR生成物の全生成量の大部分、すなわち約90％を占め
た。正しいサイズのPCR生成物はPCR生成物の全生成量の
約10％に過ぎなかった。これらの結果は、再構成ヒトＶ
領域をコードするRNAの幾らかが欠失を含むことを示し
た。 どの配列が除去されたかを決定するため、短い方のPC
R生成物をクローニングし、そして配列決定した。DNA配
列から、Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のいずれについてもDNAの
特定の部分が欠けていることが明らかになった。除去さ
れた配列を挟むDNA配列の検討により、これらの配列は
スプライスドナー−アクセプター配列のコンセンサス配
列（Breathnach.Rら、Ann.Rev.Biochem.（1981）50:349
−383）に相当することが明らかとなった。再構成ヒト
Ｈ鎖の低い発現レベルは、再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域の設計
が、どちらかと言えば効果的なスプライスドナー−アク
セプター部位を不注意に形成させたためであると説明さ
れた。さらに、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域の設計はどちらか
と言えば非効果的なスプライスドナー−アクセプター部
位を不注意に形成させたようであった。これらのスプラ
イスドナー−アクセプター部位を除去するため、ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域のそれぞれバージョン
「ａ」及び「ｆ」をコードするDNA配列のわずかな変更
を前記のPCR−変異誘発法を用いて行った。 低下した発現レベルの原因は、再構成ヒトＬ鎖及びＨ
鎖Ｖ領域（配列番号:54及び55）の両者のリーダー配列
をコードするDNA中のイントロンの存在であると考えら
れた。これらのイントロンはもともと、再構成ヒトD1.3
抗体のＶ領域（Verhoeyenら、1988）をコードするDNAの
作製において使用されたマウスμＨ鎖リーダー配列（M.
S.Neubergerら、Nature（1985）314:268−270）をコー
ドするDNAに由来する。再構成ヒトD1.3抗体をコードす
るDNAは、マウス免疫グロブリンプロモーターを用いる
哺乳類細胞ベクターにおいて発現されたためマウスリー
ダーイントロンの存在が重要であった。リーダーイント
ロンは免疫グロブリンプロモーターからの発現のために
は重要であるが、しかしHCMVのごときウィルスプロモー
ターからの発現のためには重要でない（M.S.Neuberger
ら、Nucl.Acids Res.（1988）16:6713−6724）配列を
含有している。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖をコ
ードするDNAが免疫グロブリンプロモーター以外のプロ
モーターを用いるベクターにおいて発現される場合、リ
ーダー配列中のイントロンは、再構成ヒトＶ領域をコー
ドするDNAのPCR−クローニングにより除去された（実施
例12を参照のこと）。 低下した発現レベルの他の可能性のある原因は、再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAとヒトγ
−1C領域をコードするDNAとの間のイントロン内の約190
bpの非機能的DNAの存在であると考えられた。再構成ヒ
トBI−8H鎖Ｖ領域（P.T.Jonesら、Nature（1986）321:5
22−525）をコードするDNAにもともと由来するDNA配列
から再構成ヒトPM−1H鎖Ｖ領域をコードするDNAを作製
した。この最初の再構成ヒトＶ領域をコードするDNAは
マウスNPのＨ鎖Ｖ領域（M.S.Neubergerら、Nature;M.S.
Neubergerら、EMBO J.（1983）2:1373−1378）をコー
ドするDNAから作製された。再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNAと、発現ベクターに再構成ヒトＶ領域をコ
ードするDNAを連結するためのBamH I部位との間のイン
トロン中に存在する約190bpのこのストレッチは、再構
成ヒトＶ領域をコードするDNAのPCRクローニングの過程
で除去された。 発現レベルを改良するために変形された再構成ヒトPM
−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖Ｖ領域の最終バージョンのDNA配
列及びアミノ酸配列を配列番号:57及び56に示す。これ
らのDNA配列は、表２に示した再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」、並びに表３に示した再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョン「ｆ」をコー
ドする。HEF−１α発現ベクター（図15）に挿入された
場合、これらのベクターはトランスフェクトされたCOS
細胞中で約２μg/mlの抗体を一過性に生産する。より多
量の再構成ヒトPM−１抗体を安定的に生産させるため、
dhfr遺伝子を組み込んだ新しいHEF−１α発現ベクター
を作製した（実施例10及び図11を参照のこと）。欠陥の
ある（crippled）SV40プロモーターを連結したdhfr遺伝
子を、ヒトγ−1H鎖を発現するHCMVベクターについて記
載したのと同様にして、ヒトγ−1H鎖を発現するHEF−
１αベクターに導入した。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖を
発現するHEF−１αベクター及び再構成ヒトPM−１抗体
Ｈ鎖を発現するHEF−１α−dhfrベクターをCHO dhfr
（−）細胞に同時形質転換した。安定に形質転換された
CHO細胞系を、ヌクレオシドを含有せず10％のFCS及び50
0μg/mlのG418を含有するAlpha−Minimum Essential
Medium（α−MEM）中で選択した。遺伝子増幅工程に先
立って、CHO細胞系は10μg/106細胞／日までの再構成ヒ
トPM−１抗体を生産することが観察された。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＶ領域と既知の
ヒト抗体のＶ領域との比較 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のカッパーＬ鎖
（κＬ）Ｖ領域のFRとヒトκＬ鎖Ｖ領域のサブグループ
（HSG）Ｉ〜IVのFRとの相同性、及びマウスモノクロー
ナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のFRとヒトＨ鎖Ｖ領域
のサブグループ（HSG）Ｉ〜IIIのFRとの相同性を表４に
示す。 表４に示した様に、マウスモノクローナル抗体AUK12
−20のカッパーＬ鎖（κＬ）Ｖ領域は、ヒトκＬ鎖Ｖ領
域のサブグループ（HSG）Ｉ〜IVとそれぞれ同程度（64
〜68％）の相同性を示す。タンパクのData base“LEED
S"の検索より、HSG−IVに属するヒト抗体Len（M.Schnei
derら、Physiol.Chem.356,507−557,1975）のＬ鎖Ｖ領
域が最も高い68％の相同性を示す。一方、マウスモノク
ローナル抗体PM−１のヒト型化に用いられているヒト抗
体REIはHSG−Ｉに属し、マウスモノクローナル抗体AUK1
2−20のＬ鎖Ｖ領域とは、62％の相同性を示す。またマ
ウスモノクローナル抗体AUK12−20のＬ鎖のcanonical構
造を調らべてみると（C.Chothiaら、J.Mol.Biol.（198
7）196:901〜917）、特にＬ鎖CDR2（L2）がLenよりREI
とよく一致する。 上記により、マウスモノクローナル抗体AUK12−20の
Ｌ鎖Ｖ領域のヒト型化に用いるヒト抗体は必ずしもHSG
−IVに属する抗体から選ぶ必要もなく、マウスモノクロ
ーナル抗体AUK12−20のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化には、マ
ウスモノクローナル抗体PM−１のＬ鎖Ｖ領域のヒト型化
の場合と同様にREIを用いる。 表４に示す様に、AUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域は、ヒ
トＨ鎖Ｖ領域のサブグループ−Ｉ（HSG−Ｉ）と最も高
い相同性を示す。また、Data base“LEEDS"の検索によ
り、やはりHSG Iに属するヒトHAX（Stollar,B.D.ら、J.
Immunol.139,2496−2501,1987）がAUK12−20抗体のＨ鎖
Ｖ領域に対して約66％の相同性を示す。そこで再構成ヒ
トAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域の設計においては、HSG I
に属するヒト抗体HAXのFR、及び同様にHSG Iに属するFR
を含有するヒト型化425抗体Ｈ鎖Ｖ領域（Kettleborough
C.A.,ら、Protein Engineering,４,773−783,1991）
のFRを用いる。ちなみに、AUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域は
ヒト型化425抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバージョンａと約64％の
相同性を示す。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域の設計 前記の理由により再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領
域のFRとしてREIのFRを使用し、表５に示すように再構
成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域を設計した。 注：アンダーラインを付した５個のヌクレオチドはCA
MPATH−1H抗体の設計において変えられたものである
（表２の注を参照のこと）。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の設計 前記の理由により、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域の設計に再構成ヒトVHa425のFRを用いる。ところ
で、こうして設計した再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域をコードするDNAのヌクレオチド配列はスプライス
供与配列とよく一致する配列を有することが見出され
た。このことから、再構成ヒトPM−１抗体の場合と同様
に異常なスプライシングが再構成ヒトAUK12−20抗体の
発現においても起こる可能性がある。このため、ヌクレ
オチド配列を部分的に変更することにより、スプライス
供与配列様の配列を除去した。この修正された配列をバ
ージョンａと称する。 さらに、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域のバー
ジョンｂ〜ｄを設計した。バージョンａ〜ｄのアミノ酸
配列を表６に示す。 注：ヒトサブグループIVH領域（HSG I）において１種
類の共通アミノ酸が特定できない位置はＸで示す。アン
ダーラインを付した２個のアミノ酸はHSG Iコンセンサ
ス配列中のアミノ酸と異る。RVHb,RVHc及びRVHdについ
てはRVHaと異るアミノ酸残基のみが示してある。 さらに、ヒト抗体HAX（J.Immunology 139,2496−250
1,1987,SLE患者由来Ｂ細胞由来のハイブリドーマ21/28
細胞の産生する抗体；そのアミノ酸配列はこの文献中の
Fig.6に記載されており、それをコードするDNAのヌクレ
オチド配列はFig.4及び５に記載されている）のFRを用
いて再構成ヒトAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」〜「ｄ」を次の表７に示すように設計した。 注:sle1220Ha中のアンダーラインを付した２個の残基
はHAXのFRからの変化を示す。sle1220Hb,sle1220Hc、及
びsle1220HdについてはHAXのFR中のアミノ酸と異るFR中
のアミノ酸のみを示す。 ヒトIL−6Rに対する本発明のキメラ抗体又は再構成ヒ
ト抗体の製造のために任意の発現系、例えば真核細胞、
例えば動物細胞、例えば樹立された哺乳類細胞系、真糸
状菌細胞、及び酵母細胞、並びに原核細胞、例えば細菌
細胞、例えば大腸菌細胞等を使用することができる。好
ましくは、本発明のキメラ抗体又は再構成抗体は哺乳類
細胞、例えばCOS細胞又はCHO細胞中で発現される。 これらの場合、哺乳類細胞での発現のために有用な常
用のプロモーターを用いることができる。例えば、ヒト
・サイトメガロウィルス前期（human cytomegalovirus
immediate early;HCMV）プロモーターを使用するの
が好ましい。HCMVプロモーターを含有する発現ベクター
の例には、HCMV−VH−HCγ１、HCMV−VL−HCK、HCMV−1
2h−ｇγ１、HCMV−12κ−ｇκ等であって、pSV2neoに
由来するもの（図１を参照のこと）が含まれる。 本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はヒ
ト・エロンゲーション・ファクター１α（HEF−１α）
プロモーターである。このプロモーターを含有する発現
ベクターにはHEF−12h−ｇγ１及びHEF−12k−ｇκ（図
８及び図９）、並びにHEF−VH−ｇγ１及びHEF−VL−ｇ
κ（図15）が含まれる。 宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、発現ベクターは
さらにdhfr遺伝子を含有することができる。dhfr遺伝子
を含有する発現ベクターは例えばDHFR−ΔＥ−PMh−ｇ
γ１（図10）、DHFR−ΔＥ−RVh−PM1−ｆ（図11）等で
ある。 要約すれば、本発明はまず、ヒトIL−6Rに対するマウ
スモノクローナル抗体のＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域、並
びに該Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNA及びＨ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNAを提供する。これらは、ヒトIL−6Rに対す
るヒト／マウスキメラ抗体及び再構成ヒト抗体の作製の
ために有用である。モノクローナル抗体は、例えばAUK1
2−20、PM−１、AUK64−７、及びAUK146−15である。Ｌ
鎖Ｖ領域は例えば配列番号:24,26,28又は30に示すアミ
ノ酸配列を有し、そしてＨ鎖Ｖ領域は例えば配列番号:2
5,27,29,又は31に示すアミノ酸配列を有する。これらの
アミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号:24〜31に示す
ヌクレオチド配列によりコードされている。 本発明はまた、 （１）ヒトＬ鎖Ｃ領域及びマウスＬ鎖Ｖ領域；並びに （２）ヒトＨ鎖Ｃ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域： を含んで成る、ヒトIL−6Rに対するキメラ抗体に関す
る。マウスＬ鎖Ｖ領域及びマウスＨ鎖Ｖ領域並びにこれ
らをコードするDNAは前記の通りである。前記ヒトＬ鎖
Ｃ領域は任意のヒトＬ鎖Ｃ領域であることができ、そし
て例えばヒトＣκ領域である。前記ヒトＨ鎖Ｃ領域は任
意のヒトＨ鎖Ｃ領域であることができ、そして例えばヒ
トＣγ１領域である。 キメラ抗体の製造のためには２種類の発現ベクター、
すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制
御領域による制御のもとでマウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ
鎖Ｃ領域をコードするDNAを含んで成る発現ベクター、
並びにエンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御
領域のもとでマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領域をコ
ードするDANを含んで成る発現ベクターを作製する。次
に、これらの発現ベクターにより哺乳類細胞のごとき宿
主細胞を同時形質転換し、そして形質転換された細胞を
イン−ビトロ又はイン−ビボで培養してキメラ抗体を製
造する。 あるいは、マウスＬ鎖Ｖ領域及びヒトＬ鎖Ｃ領域をコ
ードするDNA並びにマウスＨ鎖Ｖ領域及びヒトＨ鎖Ｃ領
域をコードするDNAを単一の発現ベクターに導入し、そ
して該ベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、次にこ
の形質転換された宿主をイン−ビボ又はイン−ビトロで
培養して目的とするキメラ抗体を生産させる。 本発明はさらに、 （Ａ）（１）ヒトＬ鎖Ｃ領域、及び （２）ヒトＬ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＬ鎖CDRを含んで成るＬ鎖Ｖ領域、を
含んで成るＬ鎖；並びに （Ｂ）（１）ヒトＨ鎖Ｃ領域、及び （２）ヒトＨ鎖FR、及びヒトIL−6Rに対するマウスモノ
クローナル抗体のＨ鎖CDRを含んで成るＨ鎖Ｖ領域、を
含んで成るＨ鎖； を含んで成る、ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提
供する。 好ましい態様においては、前記Ｌ鎖CDRは配列番号24,
26,28及び30のいずれかに示されるアミノ酸配列であっ
て、該アミノ酸配列の範囲が表９において定義されるア
ミノ酸配列を有し、前記Ｈ鎖CDRは配列番号25,27,29及
び31に示されるアミノ酸配列であって該アミノ酸配列の
範囲が表９において定義されるアミノ酸配列を有し；前
記ヒトＬ鎖FRがREIに由来するものであり；前記ヒトＨ
鎖FRはNEW又はHGS Iコンセンサス配列又はHAXに由来す
るものであり；前記ヒトＬ鎖Ｃ領域はヒトＣκ領域であ
り；そして前記ヒトＨ鎖Ｃ領域はヒトＣγ１である。 好ましい態様においては、Ｌ鎖Ｖ領域は表２において
RVLaとして示されるアミノ酸配列を有し、Ｈ鎖Ｖ領域は
表３にRVHa、RVHb、RVHc、RVHd、RVHe又はRVHfとして示
されるアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列RVHfが最も
好ましい。 再構成抗体の製造のためには、２種類の発現ベクタ
ー、すなわちエンハンサー／プロモーター系のごとき発
現制御領域による制御のもとに前に定義した再構成ヒト
Ｌ鎖をコードするDNAを含んで成る発現ベクター、及び
エンハンサー／プロモーター系のごとき発現制御領域の
もとに前に定義した再構成ヒトＨ鎖をコードするDNAを
含んで成るもう一つの発現ベクターを作製する。次に、
これらの発現ベクターを用いて哺乳類細胞のごとき宿主
細胞を同時形質転換し、そしてこの形質転換された細胞
をイン−ビボ又はイン−ビトロで培養して再構成ヒト抗
体を生産せしめる。 あるいは、再構成ヒトＬ鎖をコードするDNA及び再構
成ヒトＨ鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに導
入し、そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、
次にこの形質転換された宿主細胞をイン−ビボ又はイン
−ビトロで培養して目的とする再構成ヒト抗体を生産せ
しめる。 こうして生産されたキメラ抗体又は再構成ヒト抗体
は、常法に従って、例えばプロテインＡアフィニティー
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル濾過等により単離、精製することができる。 本発明のキメラＬ鎖又は再構成ヒトＬ鎖はＨ鎖と組合
わせることにより完全な抗体を作製するために使用する
ことができる。同様に本発明のキメラＨ鎖又は再構成ヒ
トＨ鎖はＬ鎖と組合わせることにより完全な抗体を作製
するために用いることができる。 本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域、再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域、
マウスＨ鎖Ｖ領域、及び再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域は、本
来、抗原であるヒトIL−6Rと結合する領域であり、それ
自体として、又は他の蛋白質との融合蛋白質として医
薬、診断薬等として有用であると考えられる。 また、本発明のＬ鎖Ｖ領域CDR及びＨ鎖Ｖ領域CDRも、
本来、抗原であるヒトIL−6Rと結合する部分であり、そ
れ自体として又は他の蛋白質との融合蛋白質として医
薬、診断薬等として有用であると考えられる。 本発明のマウスＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAはキメラ
Ｌ鎖をコードするDNA又は再構成ヒトＬ鎖をコードするD
NAの作製のために有用である。同様にマウスＨ鎖Ｖ領域
をコードするDNAはキメラＨ鎖をコードするDNA又は再構
成ヒトＨ鎖をコードするDNAの作製のために有用であ
る。 また、本発明のＬ鎖Ｖ領域CDRをコードするDNAは再構
成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA及び再構成ヒトＬ鎖
をコードするDNAの作製のために有用である。同様に本
発明のＨ鎖Ｖ領域CDRをコードするDNAは再構成ヒトＨ鎖
Ｖ領域をコードするDNA及び再構成ヒトＨ鎖をコードす
るDNA作製のために有用である。 実施例 次に、本発明を下記の実施例により具体的に説明する
が、これにより本発明の範囲が限定されるものではな
い。 実施例1.ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体
のＶ領域をコードするDNAのクローン化 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域をコードするDNAを次の様にしてクローン化した。 1.全RNAの調製 ハイブリドーマAUK12−20からの全RNAを、Chirgwin
ら、Biochemistry,18,5294（1979）により記載されてい
る方法に従って調製した。すなわち、2.1×108個のハイ
ブリドーマAUK12−20の細胞を20mlの4Mグアニジンチオ
シアネート（Fulka）中で完全にホモジナイズさせた。
ホモジネートを遠心管中の5.3M塩化セシウム溶液層上に
重層し、次にこれをBeckman SW40ローター中で31,000r
pmにて20℃で24時間遠心分離することによりRNAを沈澱
させた。RNA沈澱物を80％エタノールにより洗浄し、そ
して1mM EDTA及び0.5％ SDSを含有する10mM Tris−H
Cl（pH7.5）150μｌ中に溶解し、そしてそれにProtenas
e（Boehringer）を0.5mg/mlとなるように添加した後、3
7℃にて20分間インキュベートした。混合物をフェノー
ル及びクロロホルムで抽出し、そしてRNAをエタノール
で沈澱させた。次に、RNA沈澱物を1mM EDTAを含有する
10mM Tris−HCl（pH7.5）200μｌに溶解した。 2.一本鎖cDNAの合成 J.W.Larrickら、Biotechnology,７,934（1989）によ
り記載されている方法に従って一本鎖cDNAを合成するた
め、前記のようにして調製した全RNAの約５μｇを40mM
KCl,6mM MgCl2,10mMジチオスレイトール、0.5mM dAT
P,0.5mM dGTP,0.5mM dCTP,0.5mM dTTP,35μＭ olig
o dTプライマー（Amersham）,48ユニットのRAV−２逆
転写酵素（RAV−2:Rous associated virus2;Amersha
m）及び25ユニットのヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤
（Amersham）を含有する50mM Tris−HCl（pH8.3）緩衝
液10μｌに溶解し、そしてこの反応混合物を37℃にて60
分間インキュベートしそして次のポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）法のために直接使用した。 3.抗体可変領域をコードする遺伝子のPCR法による増幅 Thermal Cycler Model PHC−２（Techne）を用い
てPCR法を行った。 （１）マウスＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子の増幅 PCR法に使用するプライマーは、配列番号:1〜11に示
すMKV（Mouse Kappa Variable）プライマー（マウス
カッパ型Ｌ鎖リーダー配列とハイブリダイズする）（S.
T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）、及び配列番
号:12に示すMCK（Mouse Kappa Constant）プライマー
（マウスカッパ型Ｌ鎖Ｃ領域とハイブリダイズする）
（S.T.JonesSら、Biotechnology,９,88,1991）であっ
た。 まず、10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl 0.1mM
dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,1.5mM
MgCl2,2.5ユニットのDNAポリメラーゼAmpliTaq（Perkin
Elmer Cetus）,0.25μＭのそれぞれのMKVプライマ
ー、３μＭのMKCプライマー及び一本鎖cDNA合成の反応
混合物１μｌを含有するPCR溶液100μｌを94℃の初期温
度にて1.5分間そして次に94℃にて１分間、50℃にて１
分間及び72℃にて１分間、この順序で加熱した。この温
度サイクルを25回反復した後、反応混合物をさらに72℃
にて10分間インキュベートした。 （２）マウスＨ鎖Ｖ領域をコードするcDNAの増幅 PCRのためのプライマーとして配列番号:13〜22に示す
MHV（Mouse Heavy Variable）プライマー１〜10（S.
T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）、及び配列番
号:23に示すMHC（Mouse Heavy Constant）プライマー
（S.T.Jonesら、Biotechnology,９,88,1991）を使用し
た。前記3.（１）においてＬ鎖Ｖ領域遺伝子の増幅につ
いて記載したのと同じ方法により増幅を行った。 4.PCR生成物の精製および断片化 前記のようにしてPCR法により増幅したDNA断片をQIAG
EN PCR生成物精製キット（QIAGEN Inc.US）を用いて
精製し、そして10mM MgCl2及び150mM NaClを含有する
100mM Tris−HCl（pH7.6）中で10ユニットの制限酵素S
al I（GIBCO BRL）を用いて37℃にて３時間消化した。
この消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出
し、そしてDNAをエタノール沈澱により回収した。次
に、DNAは沈澱物を10ユニットの制限酵素Xma I（New E
ngland Biolabs）により37℃にて２時間消化し、そし
て生ずるDNA断片を、低融点アガロース（FMC Bio.Prod
ucts,米国）を用いるアガロースゲル電気泳動により分
離した。 約450bp長のDNA断片を含有するアガロース片を切り取
りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと同容
積の2mM EDTA及び200mM NaClを含有する20mM Tris−
HCl（pH7.5）を加えた。この混合物をフェノール及びク
ロロホルムにより抽出し、そしてDNA断片をエタノール
沈澱により回収し、そして1mM EDTAを含有する10mM T
ris−HCl（pH7.5）に溶解した。こうして、マウスカッ
パ型Ｌ鎖可変領域をコードする遺伝子を含んで成るDNA
断片、及びマウスＨ鎖可変領域をコードする遺伝子を含
んで成るDNA断片を得た。上記DNA断片はいずれもその
５′−末端にSal I接着末端を有しそしてその３′−末
端にXma I接着末端を有する。 5.連結及び形質転換 上記のようにして調製したマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含んで成るSal I−Xma IDNA断片
約0.3μｇを、プラスミドpUC19をSal I及びXma Iで消化
することにより調製したpUC19ベクター約0.1μｇと、50
mM Tris−HCl（pH7.4）,10mM MgCl2,10mMジチオスレ
イトール、1mMスペルミジン、1mM ATP,0.1μg/mlのウ
シ血清アルブミン及び２ユニットT4DNAリガーゼ（New
England Biolabs）を含有する反応混合物中で、16℃に
て16時間反応させ連結した。 次に、７μｌの上記連結混合物を大腸菌DH5αのコン
ピテント細胞200μｌに加え、そしてこの細胞を氷上で3
0分間、42℃にて１分間そして再び氷上で１分間静置し
た。次いで800μｌのSOC培地（Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Sambrookら、Cold Spring Harbo
r Laboratory Press,1989）を加え、37℃にて１時間
インキュベートした後、２×YT寒天培地（Molecular C
loning:A Laboratory Manual,Sambrookら、Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1989）上にこの大腸
菌をまき、37℃にて一夜インキュベートして大腸菌形質
転換体を得た。 この形質転換体を、50μg/mlのアンピシリンを含有す
る２×YT培地5ml中で37℃にて一夜培養し、そしてこの
培養物から、アルカリ法（Molecular Cloning:A Labo
ratory Manual,Sambrookら、Cold Spring Harbor L
aboratory Press,1989）に従ってプラスミドDNAを調製
した。 こうして得られた、ハイブリドーマAUK12−20に由来
するマウスカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
有するプラスミドをp12−k2と命名した。 上記の同じ方法に従って、ハイブリドーマAUK12−20
に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含有
するプラスミドをSal I−Xma I DNA断片から作成し、
そしてp12−h2と命名した。 実施例2.マウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードす
るDNAのクローン化 実施例１に記載したのと実質上同じ方法をハイブリド
ーマPM1,AUK64−７及びAUK146−15に適用して下記のプ
ラスミドを得た： ハイブリドーマPM1由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域をコー
ドする遺伝子を含有するプラスミドpPM−k3; ハイブリドーマPM1由来のＨ鎖Ｖ領域をコードする遺
伝子を含有するプラスミドpPM−h1; ハイブリドーマAUK64−７由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含有するプラスミドp64−k4; ハイブリドーマAUK64−７由来のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドp64−h2; ハイブリドーマAUK146−15由来のカッパ型Ｌ鎖Ｖ領域
をコードする遺伝子を含有するプラスミドp146−k3;及
び ハイブリドーマAUK146−15由来のＨ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子を含有するプラスミドP146−h1。 なお、上記プラスミドを含有する大腸菌株は、Nation
al Collections of Industrial and Marine Bact
eria Limitedに、ブダペスト条約に基づいて、1991年
２月11日に寄託され、そして表８に示す受託番号を有す
る。 実施例3.DNAの塩基配列の決定 前記のプラスミド中のcDNAコード領域の塩基配列を、
SequenaseTMVersion2.0キット（U.S.Biochemical Cor
p、米国）を用いて決定した。 まず、前記のようにして得られたプラスミド約３μｇ
を0.2N NaOHにより変性し、配列決定用プライマーとア
ニールさせ、そしてキット添付の処方に従って35S−dAT
Pにより標識した。次に、標識されたDNAを、8M尿素を含
有する６％ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した
後、ゲルを10％メタノール及び10％酢酸により固定し、
乾燥し、そしてオートラジオグラフィーにかけることに
より塩基配列を決定した。 各プラスミドのcDNAコード領域の塩基配列を配列番
号:24〜31に示す。 実施例4.CDRの決定 Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域の全般的構造は、互いに類似性
を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分が３
つの超可変領域、即ち相補性決定領域（CDR）により連
結されている。フレームワークのアミノ酸配列は、比較
的良く保存されているが、一方、CDR領域のアミノ酸配
列の可変性は極めて高い（Kabat,E.A.ら、「Sequences
of Proteins of Immunological Interst」US Dept.Heal
th and Human Services,1983）。 ヒトIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の可変
領域の上記のアミノ酸配列に基き、そしてKabatらの報
告に従ってIL−6Rに対するマウスモノクローナル抗体の
各Ｖ領域のCDRを表９に示す如く決定した。 実施例5.クローン化されたcDNAの発現の確認（１）発現
プラスミドの作製 PCR法によりクローン化されたAUK12−20抗体のκＬ鎖
及びＨ鎖のＶ領域をコードするcDNAからキメラＬ鎖/H鎖
をコードするDNAを作製した。マウスAUK12−20のＶ領域
をコードするcDNAを、ヒトサイトメガロウイルス（HCM
V）のエンハンサー及びプロモーターを含有する哺乳類
細胞発現ベクター（HCMV発現ベクターと称する）（図1.
実施例８）中でヒトＣ領域をコードするDNAに容易に連
結するためには、AUK12−20抗体のＶ領域をコードする
マウスcDNA配列の５′−末端及び３′−末端に便利な制
限酵素切断部位を導入することが必要であった。 ５′−末端及び３′−末端へのこれらの修飾はPCR法
を用いて行った。２セットのPCRプライマーを設計しそ
して合成した。マウスＬ鎖Ｖ領域及びＨ鎖Ｖ領域の両方
について、リーダー配列の始めをコードするDNAにハイ
ブリダイズし、効率的な翻訳のために必須のDNA配列（K
ozak,M.,J.Mol.Biol.196:947−950,1987）を維持しそし
てHCMV発現ベクターへのクローニングのためのHind III
部位を形成するために、Ｌ鎖Ｖ領域後方プライマー（配
列番号:32）、及びＨ鎖Ｖ領域後方プライマー（配列番
号:33）を調製した。前方PCR−プライマーは、Ｊ領域の
末端をコードするDNAにハイブリダイズし、Ｃ領域への
スプライシングのために必須のDNA配列を維持しそしてH
CMV発現ベクターでのヒトＣ領域への連結のためのBamH
I部位を形成するように、Ｌ鎖Ｖ領域前方プライマー
（配列番号34）、及びＨ鎖Ｖ領域前方プライマー（配列
番号35）を調製した。 PCRによる増幅に続き、PCR生成物をHind III及びBamH
Iにより消化し、ヒトκ鎖又はγ−１鎖Ｃ領域DNAを含
有するHCMVベクターにクローン化し、そして塩基配列を
決定してPCR法による増幅中にエラーが生じなかったこ
とを確認した。得られる発現ベクターをHCMV−12k−gk
及びHCMV−12h−ｇγ１と称する。 HCMV発現ベクターの構造を図１に示す。プラスミドHC
MV−VL−HCκにおいて、VL領域は任意のマウスＬ鎖Ｖ領
域コード配列であることができる。この例において、AU
K12−20κＬ鎖Ｖ領域を挿入することによりHCMV−12k−
gkを得た。プラスミドHCMV−VH−HCγ１において、VH領
域は任意のマウスＨ鎖Ｖ領域コード配列であることがで
きる。この例においてはAUK12−20のＨ鎖Ｖ領域を挿入
してHCMV−12h−ｇγ１を得た。 COS細胞での一過性（transient）発現 キメラAUK12−20抗体のCOS細胞での一過性発現を見る
ため、前記発現ベクターをCOS細胞において試験した。G
ene Pulsar装置（BioRad）を用いる電気穿孔法（elect
roporation）によりDNAをCOS細胞に導入した。すなわ
ち、CO細胞を１×107個/mlになるようにphosphate−buf
fered saline（PBS）に懸濁し、この細胞浮遊液0.8ml
にDNA（各プラスミドについて10μｇ）を加えた。1,900
ボルト（Ｖ）、25マイクロファラッド（μＦ）の電気容
量にてパルスを与えた。 室温にて10分間の回復期間の後、エクレトロポレーシ
ョンした細胞を、10％のウシ胎児血清を含有するDMEM培
地（GIBCO）8mlに加えた。72時間のインキュベーション
の後、培養上清を集め、遠心分離して細胞破片を除去
し、そして無菌条件下で４℃にて短時間、又は−20℃に
て長時間貯蔵した。 酵素免疫測定法（ELISA）によるキメラ抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELISAに
より測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認
した。キメラ抗体を検出するため、プレートをヤギの抗
ヒトIgG（Whole molecule）（Sigma）によりコートし
た。ブロックした後、COS細胞からの培養上清を段階希
釈しそして各ウエルに加えた。インキュベーション及び
洗浄の後、アルカリホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒト
IgG（γ鎖特異的、Sigma）を加えた。インキュベーショ
ン及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベーシ
ョンの後、反応を停止しそして405nmにおける吸光度を
測定した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を用いた。 ヒトIL−6Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定
（ELISA） トランスフェクトされたCOS細胞からの培地をELISAに
より測定して、生産されたキメラ抗体が抗原に結合し得
るか否かを決定した。抗原への結合の検出のため、プレ
ートをMT18マウスモノクローナル抗体（参考例１）でコ
ートした。１％ BSAでブロックした後、可溶性組換え
ヒトIL−6R（SR344）を加えた。 洗浄した後、COS細胞からの培養上清を段階希釈し、
そして各ウエルに加えた。インキュベーション及び洗浄
の後、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgGを加
えた。インキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を
加えた。インキュベーションの後、反応を停止し、そし
て405nmにおける吸光度を測定した。 この結果を図２に示した。キメラ抗体AUK12−20をコ
ードする遺伝子のCOS細胞へのトランスフェクションを
実施した。このCOS細胞の培養上清サンプルは、IL−6R
に対する強い結合能を示し、図２に○（オープンサーク
ル）で示す如く、サンプルの希釈度（抗体の濃度）依存
的に405nmにおける吸光度が変化し、サンプル中にIL−6
Rレセプターに対する抗体が含まれていることが確認さ
れた。 ヒトIL−6RとIL−６の結合を阻害する能力の測定 トランスフェクトされたCOS細胞からの培養上清を測
定して培地中に存在する抗体が、IL−6RとIL−６との結
合を阻害するか否かを調べるために、ビオチン化IL−６
との競合的結合阻害能を調べた。プレートをMT18マウス
モノクローナル抗体（参考例１）でコートした。ブロッ
キングの後、可溶性組換ヒトIL−6R（SR344）を加え
た。洗浄した後、COS細胞からのサンプルを段階希釈
し、そしてビオチン化IL−６と共に各ウエルに加えた。 洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ストレプト
アビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄の後、
基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反応を
停止し、そして吸光度を405nmにて測定した。精製マウ
スAUK12−20モノクローナル抗体を陽性対照として用い
た。無関係の抗体を発現するCOS細胞からの培地を陰性
対照として用いた。 この結果を図３に示した。キメラ抗体12−20をコード
する遺伝子でトランスフェクトしたCOS細胞の培養上清
は、最高、及び２番目に高いサンプル濃度でIL−6RとIL
−６の結合を阻害した。すなわち、図３に●で示す如
く、サンプル希釈度（抗体の濃度）依存的に405nmにお
ける吸光度が変化し、サンプル中の抗体がIL−6RとIL−
６の結合を阻害していることが認められた。これは陽性
対照の吸光度の抗体濃度依存的変化（○）にほぼ一致す
ることからも確認出来た。 なお、陰性対照（△）は阻害活性が全く認められなか
った。 実施例6.クローン化cDNAの発現の確認（２）（キメラPM
−１抗体の作製） 発現ベクターの作製 キメラPM−１抗体を発現するベクターを作製するた
め、それぞれマウスPM−１κＬ鎖及びＨ鎖Ｖ領域をコー
ドするcDNAクローンpPM−k3及びpPM−h1をPCR法により
変形し、そしてHCMV発現ベクター（図１を参照のこと）
に導入した。Ｌ鎖Ｖ領域のための後方プライマーpmk−
ｓ（配列番号:38）及びＨ鎖Ｖ領域のための後方プライ
マーpmh−ｓ（配列番号:40）を、リーダー配列の最初を
コードするDNAにハイブリダイズし且つKozakコンセンサ
ス配列及びHind III制限部位を有するように設計した。
Ｌ鎖Ｖ領域のための前方プライマーpmk−ａ（配列番号:
36）及びＨ鎖Ｖ領域のための前方プライマーpmh−ａ
（配列番号:39）を、Ｊ領域の末端をコードするDNA配列
にハイブリダイズし且つスプライスドナー配列及びBamH
I制限部位を有するように設計した。 κＬ鎖Ｖ領域のため、２種類の前方プライマーを合成
した。ほとんどのκＬ鎖においては、位置107のリジン
が保存されているが、マウスPM−１κＬ鎖においては位
置107がアスパラギンである。キメラPM−１抗体の抗原
結合活性に対するこの変化の効果を検討するため、前方
プライマーpmk−ｂ（配列番号:37）を、位置107がアス
パラギンからリジンに変えるように設計した。PCR反応
に続き、PCR生成物を精製し、Hind III及びBamH Iで消
化し、そしてpUC19ベクター（Yanishe−Perronら、Gene
（1985）33:103−109）にサブクローニングした。DNA配
列決定の後、Hind III−BamH I断片を切出し、そしてＨ
鎖Ｖ領域については発現ベクターHCMV−VH−HCγ１にク
ローン化してHCMV−PMh−ｇγ１を得、そしてＬ鎖Ｖ領
域についてはHCMV−VL−HCκにクローン化してHCMV−PM
ka−gk及びHCMV−PMkb−gkを得た。 COS細胞のトランスフェクション キメラPM−１抗体の一過性発現を観察するため、前記
発現ベクターをCOS細胞において試験した。HCMV−pmh−
ｇγ１と、HCMV−pmka−gk又はHCMV−pmkb−gkのいずれ
かとを、Gene Pulsar装置（BioRad）を用いてエレクト
ロポレーションによりCOS細胞に同時形質転換した。DNA
（プラスミド当り10μｇ）を、PBS中１×107細胞/mlの
0.8mlのアリコートに加え、1,900V,25μＦの容量にてパ
ルスを与えた。室温にて10分間の回復期間の後、エレク
トロポレーション処理された細胞を、10％のγ−グロブ
リン不含有ウシ胎児血清を含有するDulbecco′ｓ Modi
fied Eagle Medium（DMEM）（GIBCO）に加えた。72時
間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心分
離により細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃に
て短時間貯蔵し、又は−20℃にて長期間貯蔵した。 キメラPM−１抗体の発現及び分析 ３日間の一過性発現の後、COS細胞からの培地を集
め、そしてキメラPM−１抗体について試験した。培地を
まずELISAにより分析して、トランスフェクトされたCOS
細胞によりヒト様抗体が生産されたか否かを決定した。
このアッセイにおいて標準として既知量の精製ヒトIgG
を用いることにより、COS細胞からの培地中に存在する
ヒト様抗体（この場合、キメラPM−１抗体）の量を推定
することが可能である。ヒト抗体の検出のため、プレー
トをヤギ抗−ヒトIgG（全体分子、Sigma）によりコート
した。ブロッキングの後、COS細胞からのサンプルを段
階希釈し、そして各ウェルに加えた。インキュベーショ
ン及び洗浄の後、アルカリホスフェターゼ結合ヤギ抗−
ヒトIgG（γ鎖特異的、Sigma）を加えた。インキュベー
ション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベ
ーションの後、反応を停止し、そして405nmでの吸光度
を測定した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を加え
た。 キメラPM−１抗体をコードする遺伝子を担持するベク
ターによりトランスフェクトされたCOS細胞からの培地
はヒト様抗体の発現について陽性であり、そしておよそ
の量が上記のようにして測定された。 次に、キメラPM−１抗体をコードする遺伝子を担持す
るベクターによりトランスフェクトされたCOS細胞から
の同じ培地をヒトIL−6Rに結合する能力について測定し
た。抗原への結合の測定のため、プレートを、ヒトIL−
6Rに対する抗体であるMT18マウスモノクローナル抗体
（参考例１）によりコートした。ブロッキングの後、可
溶性ヒトIL−6R（SR344）を加えた。洗浄した後、サン
プルを段階希釈し、そして各ウエルに加えた。インキュ
ベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合
ヤギ抗−ヒトIgG（γ鎖特異的;Sigma）を添加した。イ
ンキュベーション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。
インキュベーションの後、反応を停止し、そして405nm
での吸光度を測定した。この測定のために標準品は存在
しなかった。 ２個のサンプルの内の１つは、マウスPM−１抗体中に
見られるＶ領域と同一のＶ領域を有するキメラ抗体（キ
メラPM−1a抗体、図４）をコードする遺伝子によるトラ
ンスフェクトからのサンプルであった。他の１つのサン
プルはＬ鎖Ｖ領域中の位置107に前記のような１個のア
ミノ酸変化を有するキメラ抗体（キメラPM−1b抗体、図
４）をコードする遺伝子によるトランスフェクションか
らのものであった。いずれのサンプルも、サンプルの希
釈により減少するIL−6Rに対する強い結合を示した。す
なわち、作製されたキメラPM−１抗体は機能的であり、
そしてその抗原によく結合することができる。最も重要
なことは、機能的キメラPM−１抗体の証明は、正しいマ
ウスPM−1V領域がクローン化されそして配列決定された
ことの直接の証拠である。Ｌ鎖Ｖ領域中の位置107にい
ずれのアミノ酸を有するキメラ抗体も抗原IL−6Rによく
結合した。マウスPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域中の位置107
は抗原結合のためにあまり重要ではなく、そしてこの位
置におけるアスパラギン及びリジンのいずれも満足に機
能するようである。マウスPM−１抗体はそのＬ鎖Ｖ領域
のこの位置にアスパラギンを有するので、キメラPM−１
抗体を用いるその後のすべての研究は、マウスPM−１抗
体に見出されるそれと同じバージョンａを用いて行っ
た。 より多量のPM−１抗体を安定に生産するために、dhfr
遺伝子を含有する新たなHCMV発現ベクターを作製した。
キメラPM−１抗体のより高い発現レベルを達成するため
の第一段階は、ベクターHCMV−VH−HCγ１（図１）を変
形して、このベクターが欠陥のある（crippled）SV40プ
ロモーターエンハンサーにより発現されるdhfr遺伝子を
含有するようにすることであった。SV40エンハンサー要
素をpSV2−dhrfベクター（S.Subramaniら、Mol.Cell.Bi
ol.（1981）1:854−864）から除去し、そしてSV40プロ
モーターによって発現されるneo遺伝子の代りに「欠陥
のある」SV40プロモーターにより発現されるdhfr遺伝子
をHCMV−VH−HCγ１に挿入した。次に、この新しいHCMV
−VH−HCγ１−dhfrベクターにマウスPM−1V領域を挿入
した。この改良された発現ベクターの作製を実施例10に
詳細に記載する。 CHO dhfr（−）細胞（G.Urlaubら、Proc.Natl.Acad.
Sci.USA（1980）77:4216−4220）を２種類のプラスミド
DNAすなわちキメラPM−1aL鎖を発現するためのHCMV−VL
−HCκベクター（HCMV−PMka−gk）及びキメラPM−１
Ｈ鎖を発現するためのHCMV−VH−HCγ１−dhfrベクター
（DHFR−△Ｅ−PMh−ｇγ1;実施例10）により同時形質
転換した。DNA（各プラスミドにつき10μg/ml）をPBS中
１×107細胞/mlの0.8mlのアリコートに加えた。1900Vの
電圧25μＦの電気容量でパルスを与えた。室温にて10分
間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された
細胞を、ヌクレオシド及び10％ FCSを含有するAlpha
Minimal Essential Medium培地（α−MEM）10mlに加
えた。一夜のインキュベーションの後、培地を、ヌクレ
オシドを含有せず10％ FCS及び500μg/mlのG418（GIBC
O）を含有するα−MEMに変えて、dhfr+及びneo+形質転
換細胞の選択を行った。選択の後、選択されたクローン
を用いて遺伝子増幅を行った。２×10-8Mメソトレキセ
ート（MTX）中での１ラウンドの増幅の後、約3.9μg/10
6細胞／日のキメラPM−1aの抗体を生産する細胞系（PM1
k3−７）を選択した。 ヒトIL−6RへのIL−６の結合を阻害するキメラ抗体の能
力についてのELISA測定 トランスフェクトされたCOS細胞において又は安定なC
HO細胞系において生産された抗体を測定して、それら
が、IL−6Rへのビオチン化IL−６の結合と競争するか否
かを決定した。プレートをマウス抗体MT18によりコート
した。ブロッキングの後、可溶性組換えヒトIL−6R（SR
344）を加えた。洗浄の後、COS細胞からのサンプルを段
階希釈し、そしてビオチン化IL−６と一緒に各ウエルに
加えた。洗浄の後、アルカリホスファターゼ結合ストレ
プトアビジンを加えた。インキュベーション及び洗浄
後、基質緩衝液を加えた。インキュベーションの後、反
応を停止させ、そして405nmにおける吸光度を測定し
た。結果を図５に示す。 実施例7.再構成ヒトPM−１抗体の作製 より迅速に且つより効率的にCDR移植を達成するた
め、PCRによる逐次CDR移植法を開発した。この方法はPC
R変異誘発法（Kammanら、Nucl.Acid.Res.17:5404,198
9）に基く。 CDR移植のための選択されたヒトFRをコードするDNAを
含有する鋳型DNAを調製するために、適当な再構成ヒト
Ｖ領域をコードするDNAを便利なベクターに再クローニ
ングする必要があった。プラスミドalys11及びF10のDNA
はそれぞれ再構成ヒトD1.3のＬ鎖及びＨ鎖をコードして
おり、ヒトREIからのFRをコードするDNA及びNEWからのF
RをコードするDNAをそれぞれ含有する。再構成ヒトD1.3
のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を含有する約500bpの
Nco I−BamH1断片をalys11から切り出し、そしてHind I
II及びBamH Iで開裂されたpBR327にサブクローニングし
てプラスミドVl−lys−pBR327を得た。このVl−lys−pB
R327からのHind III−BamH I断片を、Hind III及びBamH
Iにより開裂されたpUC19に挿入してプラスミドVl−lys
−pUC19を得た。 再構成ヒトD1.3のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列を
含有する約700bpのNco I−BamH I断片をF10から切り出
し、そしてHind III−Nco Iアダプターを用いてpBR327
のHind III−BamH I部位にサブクローニングし、Vh−ly
s−pBR327を得た。次に、このプラスミドからHind III
−BamH I断片を切り出し、そしてHind III及びBamH Iに
より開裂されたpUC19にサブクローニングしてVh−lys−
pUC19を得た。 なお、プラスミドalys11及び再構成ヒトD1.3のＬ鎖Ｖ
領域FRをコードするDNA配列はヒト型化CAMPATH−1H抗体
（Nature 332:323−327（1988））のそれと同じであ
る。鋳型として使用した、プラスミドF10中の再構成ヒ
トD1.3のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA配列は、V.Verhoey
ら、Science237:1534−1536（1988）のFig.2に記載され
ている。 図６は、再構成ヒトPM−１のＨ鎖Ｖ領域の第一バージ
ョンをコードするDNAの作製のために使用されたプライ
マー及びPCR反応を模式的に示す。後方プライマーＡ（A
PCR1;配列番号:41）及び前方プライマーＥ（APCR4;配列
番号:42）は、このベクター上のDNA配列にハイブリダイ
ズする。APCR1及びAPCR4はpUC19ベクターのために特に
設計されたが、ユニバーサルM13配列プライマーを使用
することもできる。 CDR1移植／変異誘発プライマーＢ（phv−1;配列番号:
43）、CDR2移植プライマーＣ（phv−2;配列番号:44）、
及びCDR3移植プライマーＤ（phv−3;配列番号:45）は40
〜60bpの長さを有し、マウスPM−１のＨ鎖Ｖ領域のCDR
をコードするDNA及び該CDRをコードするDNAを挟む鋳型D
NA中のヒトFRをコードするDNA配列から成る。第一のPCR
反応において前方プライマーAPCR4及び後方プライマー
Ｄを用いた。マウスPM−１のCDR3配列をコードするDNA
を含有する第一PCR生成物を精製し、そして第二PCR反応
において後方プライマーとしてのプライマーＣと共に前
方プライマーとして使用した。同様にして、マウスPM−
１のCDR2及びCDR3をコードするDNAを含有する第二PCR生
成物、並びにマウスPM−１の３個すべてのCDRをコード
するDNAを含有する第三PCR生成物をそれぞれ次のPCR段
階のプライマーとして使用した。完全な再構成ヒトPM−
1H鎖Ｖ領域をコードするDNAを有する第四PCR生成物を精
製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そしてさらに
分析するためにpUC19にサブクローニングした。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAの
作製のために３種類の変異誘発プライマーphv−1,phv−
２及びphv−３を合成した。これらは8M尿素を含有する1
2％ポリアクリルアミドゲル上で精製した。変異誘発プ
ライマーphv−１は、マウスPM−１抗体のCDR1の移植の
ためのみならずヒトFR1中の位置27及び30におけるそれ
ぞれのSerからTyrへ、及びSerからThrへの変異のために
設計された。各100μｌのPCR反応物は典型的には10mM
Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,1.5mM MgCl2,250μＭ
dNTP,50ngの鋳型DNA（Vh−lys−pUC19）,2.5uのAmpli
Taq（Perkin Elmer Cetus）、及びプライマーを含有
した。１μＭずつのphv−３プライマー及びAPCR4プライ
マーを含む第一のPCR反応を行い、94℃にて1.5分間の最
初の変性の後、94℃にて１分間、37℃にて１分間及び72
℃にて１分間の30サイクルを反復した。アニーリング段
階と合成段階の間の変温時間は2.5分間であった。最終
サイクルの完了の後、72℃にて10分間の最終伸長反応を
行った。523bpのPCR生成物を1.6％低融点アガロースゲ
ルを用いて精製し、そして次に第二のPCR反応における
プライマーとして使用した。 第二のPCR反応において約１μｇの精製された第一PCR
生成物及び25pmoleの変異誘発プライマーphv−２をプラ
イマーとして使用した。PCR条件は第一のPCR反応につい
て記載したのと同じであった。同様にして、第二のPCR
反応からの665bpのPCR生成物をプライマーphv−１と共
に第三のPCR反応において使用し、そして第三のPCR反応
からの737bpのPCR生成物をプライマーAPCR1と共に第四
のPCR反応において使用した。第四のPCR反応からの1.17
2kbのPCR生成物を精製し、Hind III及びBamH Iで消化
し、そして次に再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域を含有
する約700bpの断片をpUC19ベクターにサブクローニング
した。配列決定した４個のクローンの内２個が正しいア
ミノ酸配列をコードするDNA配列を有しており、そしてp
UC−RVh−PM1aと命名した。 再構成PM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコー
ドするDNAを作製するため５種類の変異誘発PCRプライマ
ーを合成した。各PCR反応は前記の反応条件と本質的に
同じ条件下で行われた。バージョン「ｂ」のため、変異
誘発プライマーphv−m4（Val−71→Arg−71）（番号はK
abatらによる；表４参照）（配列番号:46）及びAPCR4
を、鋳型DNAとしてのpUC−RVh−PM1aと共に第一PCR反応
において使用した。この第1PCR反応からのPCR生成物を
精製し、そしてプライマーAPCR1と共に第二PCR反応にお
ける前方プライマーとして使用した。第二PCR反応から
のPCR生成物を1.6％低融点アガロースゲルを用いて精製
し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そしてpUC19に
てサブクローニングしてpUC−RVh−PM1bを得た。同様に
して、変異誘発プライマーphv−nm（Asp−１→Gln−
１）（配列番号:47）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いて
バージョン「ｃ」をコードするDNA（pUC−RVh−PM1c）
を得、変異誘発プライマーphv−m6（Ile−48→Met−4
8）（配列番号:48）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバ
ージョン「ｄ」をコードするDNA（pUC−RVh−PM1d）を
得、変異誘発プライマーphv−nm及び鋳型pUC−RVh−PM1
cを用いてバージョン「ｅ」をコードするDNA（pUC−RVh
−PM1e）を得、そして変異誘発プライマーphv−m7（Thr
−28→Ser−28、及びPhe−29→Ile−29）（配列番号:4
9）及び鋳型pUC−RVh−PM1bを用いてバージョン「ｆ」
をコードするDNA（pUC−RVh−PM1f）を得た。再構成Ｈ
鎖Ｖ領域バージョン「ｆ」のアミノ酸配列及びそれをコ
ードするヌクレオチド配列を配列番号54に示す。 図７は、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バー
ジョンをコードするDNAの作製において使用したプライ
マー及びPCR反応を模式的に示す。再構成ヒトPM−１抗
体Ｌ鎖Ｖ領域の第一バージョンをコードするDNAの作製
のため、CDR1移植プライマーpkv−１（配列番号:50）、
CDR2移植プライマーpkv−２（配列番号:51）及びCDR3移
植プライマーpkv−３（配列番号:52）を合成し、そして
8M尿素を含有する12％ポリアクリルアミドゲル上で精製
した。上記のようにしてPCR反応を行った。第一PCR反応
物は１μＭずつのpkv−３プライマー及びAPCR4プライマ
ーを含有した。第一PCR反応からの350bpのPCR生成物を
1.5％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そして第
二PCR反応における前方プライマーとして使用した。第
二PCR反応からのPCR生成物を精製し、BamH I及びHind I
IIで消化し、そしてCDR3が移植されたDNAを含有する500
bp断片をDNA配列決定のためにpUC19ベクターにサブクロ
ーニングした。正しい配列を有するプラスミドDNAを同
定し、そして次のPCR反応における鋳型DNAとして使用し
た。第三PCR反応において25pmoleの変異誘発プライマー
pkv−２及びAPCR4を使用した。第三PCR反応からのPCR生
成物を精製し、そしてプライマーpkv−１と共に第四PCR
反応におけるプライマーとして使用した。同様にして、
第四PCR反応からのPCR生成物をAPCR1プライマーと共に
第五PCR反応におけるプライマーとして使用した。 第五PCR反応からの972bpのPCR生成物を精製し、BamH
I及びHind IIIにより消化し、そしてDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。CDR2領域において問
題点が認識され、さらに２回のPCR反応が必要であっ
た。第六PCR反応及び第七PCR反応において、pUC19ベク
ターにクローニングされた第五PCR反応からのPCR生成物
を鋳型DNAをして使用した。第六PCR反応においてプライ
マーはpkv−２及びAPCR4であった。第六PCR反応からのP
CR生成物を精製し、そしてAPCR1プライマーと共に第七P
CR反応におけるプライマーとして使用した。第七PCR反
応からのPCR精製物を精製し、BamH I及びHind IIIによ
り消化し、そして500bp DNA断片をDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。配列決定した５個の
クローンの内２個のクローンが正しいDNA配列を有して
いた。このクローンをpUC−RV1−PM1aと称する。この配
列を配列番号:55に示す。 再構成ヒトPM−１ Ｌ鎖Ｖ領域の他のバージョンをコ
ードするDNAの作製のため、変異誘発プライマーpvk−m1
（配列番号:53）を合成した。PCR反応は本質的に前記の
通りであった。第一PCR反応において、変異誘発プライ
マーpkv−m1（Phe−71→Tyr−71）及びAPCR4プライマー
を鋳型DNAとしてのpUC−RV1−PM1aと共に使用した。第
一PCR反応からのPCR生成物を精製し、そしてAPCR1プラ
イマーと共に第二PCR反応におけるプライマーとして使
用した。第二PCR反応からのPCR生成物を精製し、BamH I
及びHind IIIにより消化し、そしてDNA配列決定のため
にpUC19にサブクローニングした。このクローンをpUC−
RV1−PM1bと命名した。 実施例8.遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で、発現
させるためのヒトサイトメガロウイルス前期（HCMV）プ
ロモーターを用いるベクターの作製（図１） キメラPM−１抗体のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA断片
及びキメラPM−１抗体のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA断
片を、それぞれ、哺乳類細胞中でヒトκＬ鎖又はヒトγ
−1H鎖を発現するように設計されたHCMV発現ベクター
（図１を参照のこと）HCMV−VL−KCκ及びHCMV−VH−HC
γ１にまず挿入した。該HCMV発現ベクターの作製のため
の詳細な記載は、Maedaら、Human Antibodies and H
ybridomas（1991）2:124−134;C.A.Kettleboroughら、P
rotein Engeneering（1991）4:773−783に公表されて
いる。両ベクターはpSV2neo（P.J.Southern et al.,
J.Mol.Appl.Genet.（1982）1:327−341）に基礎を置
き、そして免疫グロブリンＬ鎖又はＨ鎖の高レベルの転
写のためにヒトサイトメガロウイルス（HCMV）プロモー
ター及びエンハンサー（M.Boshartら、Cell（1985）41:
521−530）を含有する。 Ｌ鎖発現ベクターはヒトＣκ領域（T.H.Rabbittsら、
Carr.TOP.Microbiol.Immunol.（1984）114:166−171）
をコードするゲノムDNAを含有し、そしてＨ鎖発現ベク
ターはヒトＣγ１領域（N.Takahashiら、Cell（1982）2
9:671−679）をコードするゲノムDNAを含有する。これ
らのHCMV発現ベクターは多能であり、そして種々の哺乳
類細胞タイプにおける一過性（transient）発現及び安
定な発現のために使用することができる。 実施例9.遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で発現さ
せるためのヒトエロンゲーションファクター１α（HEF
−１α）プロモーターを使用するベクターの作製（図８
及び図９） ヒト・ポリペプチド・チェーン・エロンゲーション・
フアクター１α（HEF−１α）は最も豊富な蛋白質の１
つである。これはほとんどの細胞で発現される。ヒトEF
−１αプロモーター−エンハンサーの転写活性はSV40前
期プロモーター−エンハンサーのそれに比べて約100倍
である（D.W.Kimら、Gene（1990）91:217−223;及びT.U
etsukiら、J.Biol.Chem.（1989）264:5791−5798）。2.
5kbのHEF−１αプロモーター−エンハンサー領域は、該
遺伝子の５′−末端に接する約1.5kbのDNA、第一エクソ
ン中の33bp、第一イントロン中の943bp、及び第二エク
ソンの最初の部分の10bpから成る。この後2.5kbのHind
III−EcoR I断片をプラスミドpEF321−CAT（D.W.Kim
ら、Gene（1990）91:217−223;及びT.Uetsukiら、J.Bio
l.Chem.（1989）264:5791−5798）から切り出し、そし
てpdKCRベクター（M.Tsuchiyaら,Embo J.（1987）6:61
1−616）、K.O′Haraら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vo
l.78,No.3,1527−1531,（1981）、（R.Fukunagaら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA Val.81,5086−5090（1984））に
クローニングして、SV40前期プロモーター−エンハンサ
ーを含有する約300bpのHind III−EcoR I断片を置き換
えてpTEF−１を得た。 pTEF−１をEcoR Iで消化し、Klenowポリメラーゼでフ
ィルーインし、そしてHind IIIリンカーに連結した。次
に、この修飾されたpTEF−１ベクターDNAから約1.6kbの
Hind III−Sma I断片を切り出した。 HCMV−12h−ｇγ１をEcoR Iにより部分消化し、Kleno
wポリメラーゼによりフィルーインし、そして自己連結
することにより、実施例５において作製したHCMV−12h
−ｇγ１からプラスミドHCMV−12h−ｇγ１（ΔE2）を
作製した。 プラスミドHCMV−12h−ｇγ１（ΔE2）をEcoR Iで消
化し、Klenowポリメラーゼでフィルーインし、そしてHi
nd IIIで消化した。ヒトγ−1C領域をコードするDNA配
列を含有する約7kbの断片を、HEF−１αプロモーター−
エンハンサーを含有する前記の1.6kb Hind III−Sma I
断片に連結してHEF−12h−ｇγ１を得た。このベクター
中のHEF−１αプロモーター・エンハンサー領域は、
５′−領域に接する380bpのDNAを除き、pTEF−１中のそ
れと同一であった。Hind III−BamH I断片として存在す
るこのＨ鎖Ｖ領域は、他のＨ鎖Ｖ領域と容易に交換する
ことができる。 再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有するHin
d III−BamH I DNA断片をpUC−RVh−PM1a,pUC−RVh−PM
1b,pUC−RVh−PM1c,pUC−RVh−PM1d,pUC−RVh−PM1e及
びpUC−RVh−PM1f（実施例７）から切り出し、そして前
記のプラスミドHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部
位に挿入して、それぞれ発現ベクターRVh−PM1a,RVh−P
M1b,RVh−PM1c,RVh−PM1d,RVh−PM1e、及びRVh−PM1fを
得た。発現ベクターRVh−PM1a,RVh−PM1b,RVh−PM1c,RV
h−PM1e、及びRVh−PM1f、並びにHEF−PMh−ｇγ１は、
それぞれ再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン
「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」及び「ｆ」、
並びにマウスPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを
有する。 Ｌ鎖発現ベクターHEF−12k−gkを作製するため、HEF
−１αプロモーター−エンハンサー領域を含有する約3.
0kbのPvu I−Hind III断片をHEF−12h−ｇγ１切り出
し、そして実施例５において作製したHCMV−Ｌ鎖発現ベ
クターHCMV−12k−gkからの約7.7kbのPvu I−Hind III
断片に連結してHEF−12k−gkを得た。Ｈ鎖発現ベクター
HEF−12h−ｇγ１の場合と同様に、Hind III−BamH I断
片として存在するHEF−12k−ｇ中のＬ鎖Ｖ領域をコード
するDNAは他のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAと容易に交換
することができる。なお、プラスミドHEF−PMh−ｇγ１
は、HEF−12h−ｇγ１（図８）のEF1αプロモーター領
域（Pvu I−Hind III断片）によりHCMV−pmh−ｇγ１の
HCHVプロモーター領域（Pvu I−Hind III断片）を置き
換えることにより作製したものである。 再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有するHin
d III−BamH I DNA断片をpUC−RV1−PM1a及びpUC−RV1
−PM1b（実施例７）から切り出し、そしてHEF−12k−gk
のHind III−BamH I部位に挿入し、それぞれ発現ベクタ
ーRV1−PM1a及びRV1−PM1bを得た。発現ベクターRV1−P
M1a及びRV1−PM1b、並びにHEF−PMK−gkはそれぞれ再構
成ヒトＬ鎖Ｖ領域「ａ」及び「ｂ」、並びにマウスPM−
１ Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNAを有する。なお、プラ
スミドHEF−PMK−gkは、HEF−12k−gk（図９）のEF1α
プロモーター領域（Pvu I−Hind III断片）によりHCMV
−pmka−gkのHCMVプロモーター領域（Pvu I−Hind III
断片） を置き換えることにより作製したものである。 実施例10.遺伝子操作された抗体をCHO細胞中で高レベル
で発現させるための、欠陥SV40プロモーター−エンハン
サー配列に連結されたジヒドロフォレートレダクターゼ
（dhfr）遺伝子を用いるベクターの作製（図10及び図1
1） SV40前期プロモーターからエンハンサー配列を除去す
るため、プラスミドpSV2−dhfr（S.Subramaniら、Mol.C
ell.Biol.（1981）1:854−864）（ATCC33694）をSph I
及びPvu IIで消化し、Klenowポリメラーゼでフィルーイ
ンし、そして自己連結してpSV2−dhfr−ΔＥを得た（図
10）。HCMVプロモーター、Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNA
及びヒトγ−1C領域をコードするDNAを含有する約3.7kb
のEcoR I断片を、EcoR Iによる部分消化によりHCMV−PM
h−ｇγ１から切り出した。この断片を、EcoR I−消化p
SV2−dhfr−ΔＥに連結してDHFR−ΔＥ−PMh−ｇγ１を
得た。 HEF−１αプロモーター−エンハンサーを用いるＨ鎖
発現ベクターに基いて類似のベクターを作製した（図11
を参照のこと）。HCMV−12h−ｇγ１に由来する約3.7kb
のEcoR I断片を、EcoR I−消化pSV2−dhfr−ΔＥと連結
してDHFR−ΔＥ−12h−ｇγ１を得た。DHFR−ΔＥ−12h
−ｇγ１中のdhfr配列に続くBamH I部位を、BamH Iによ
る部分消化、Klenowポリメラーゼによるフィルーイン及
び自己連結により除去した。dhfr cDNAを含有する約4k
bのPvu I−BamH I断片をこの修飾されたDHFR−ΔＥ−12
h−ｇγ１から切り出し、そして実施例12において作製
したRVh−PM1f−４からの約3kbのPvu I−BamH I断片に
連結してDHFR−ΔＥ−RVh−PM1fを得た。 上記の改良されたプラスミドは本発明の再構成ヒトPM
−１抗体の製造のために使用することができる。 実施例11.再構成ヒトPM−１抗体の種々のバージョンの
発現及び分析 再構成ヒトPM−１抗体のＬ鎖及びＨ鎖を発現する各HE
F−１αベクターをCOS細胞に同時形質転換（co−transf
ect）した。標準対照としてキメラPM−１抗体のＬ鎖及
びＨ鎖を発現する各HEF−１αベクターもCOS細胞に同時
形質転換した。３日後，形質転換されたCOS細胞からの
培地を集め、そしてELISAにより（１）上清中に存在す
るヒトIgG抗体の量について、及び（２）IL−6Rに結合
するそのIgGの能力について分析した。次に、同じサン
プルをさらに、ELISAにより、ヒトIL−6RへのヒトIL−
６の結合を阻害する該抗体の能力について試験した。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖を発現する２種類のベクタ
ーの一方（RV1−PM1a又はRV1−PM1b）及びキメラPM−１
抗体Ｈ鎖を発現するベクター（HCMV−PMh−ｇγ１）に
よりCOS細胞を同時形質転換することにより、再構成ヒ
トPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域の２種類のバージョンの評価を
行った。細胞をまた、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を
発現する各ベクター（HCMV−PMka−gk及びHCMV−PMh−
ｇγ１）により同時形質転換した。未精製のCOS細胞上
清を用いるデーターは、ヒトIL−6Rへの結合についての
測定において、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖のバージョン
「ａ」がキメラPM−１抗体Ｌ鎖と同等であることを示し
た。しかしながら、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖のバージ
ョン「ｂ」はヒトIL−6Rへの結合能を実質的に保持しな
かった。これらの結果から、FR3中の位置71のフェニル
アラニン（CAMPAHTH−1Hのために修飾されたヒトREI中
に存在する）からチロシン（天然ヒトREI及びマウスPM
−１抗体中に存在する）への変化は機能的抗原結合部位
の形成に対して非常に有害であることが結論された。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の種々のバージョン
を評価する次の実績において、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖Ｖ領域のバージョン「ａ」を常に用いた。 再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖の発現する６種類のベクタ
ーの１つ（RVh−PM1a,RVh−PM1b,RVh−PM1c,RVh−PM1d,
RVh−PM1e又はRVh−PM1f）及び再構成ヒトPM−１抗体Ｌ
鎖のバージョン「ａ」を発現するベクター（RV1−PM1
a）によりCOS細胞を同時形質転換することにより、再構
成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領域の６種類のバージョンを評
価した。細胞を、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現
する各ベクター（HEF−PMk−gk及びHEF−PMh−ｇγ１）
によっても同時形質転換した。未精製のCOS細胞上清を
用いた予備データーが示すところによれば、ヒトIL−6R
への結合についての測定において、再構成ヒトPM−１抗
体Ｌ鎖のバージョン「ａ」及び再構成ヒトPM−１抗体Ｈ
鎖のバージョン「ｆ」は、キメラPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ
鎖と同等であった。 この予備データーを確認するため、キメラPM−１抗体
及び再構成ヒトPM−１抗体をCOS細胞上清から濃縮そし
てプロテインＡを用いて精製した。すなわち、COS細胞
からの培地を100kdカットオフ限外濾過装置（Amicon）
を用いて濃縮した。濃縮した培地をプロテインＡアガロ
ース（AffiGel Protein Ａ MAPS IIキット、BioRa
d）を用いて精製した。要約すれば、濃縮された培地
を、５ベッドボリウムの結合緩衝液により平衡化された
プロテインＡアガロースカラムに適用した。このカラム
を15ベッドボリウムの結合緩衝液で洗浄し、そして次に
５ベッドボリウムの溶出緩衝液で溶出を行った。そして
マイクロコンセントレーター（Centricon 10,Amicon）
を用いて溶出液を濃縮し、溶出緩衝液をPBSに置換し
た。 キメラPM−１抗体、及び再構成ヒトＬ鎖Ｖ領域のバー
ジョン「ａ」と再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域のバージョン
「ａ」，「ｂ」，「ｃ」，「ｄ」，「ｅ」又は「ｆ」と
から成る再構成ヒトPM−１抗体の精製されたサンプルの
分析を行った。Ｌ鎖の「ａ」バージョン＋Ｈ鎖の「ｆ」
バージョンが明らかに最良の再構成ヒトPM−１抗体であ
った。このものは、キメラPM−１抗体と同様にヒトIL−
6Rに結合する（図13）。これはまた、マウス抗体及びキ
メラ抗体と同様に、ヒトIL−６がヒトIL−6Rに結合する
のを阻害する（図14）。 実施例12.発現レベルを改良するための再構成ヒトPM−1
V領域の修正 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域（配列番
号:54及び55）のリーダー配列をコードするDNA配列内の
イントロンを除去するため、Ｖ領域をコードするcDNAを
PCRプライマーを用いて再クローニングした。Ｌ鎖及び
Ｈ鎖の発現ベクターRV1−PM1a及びRVh−PM1fをCOS細胞
に同時形質転換した。48時間後、全RNAを調製し（Chirg
winら、Biochemistry（1979）18:5294−5299）、そして
マウス抗体Ｖ領域のPCRクーロニングについて記載した
ようにして一本cDNA合成のために５μｇの全RNAを用い
た。３種類のPCRプライマーを設計し、そして合成し
た。LEV−P1（配列番号:60）及びHEV−P1（配列番号:5
8）はスプライスドナー配列及びBamH I部位を含有し、
そしてそれぞれＬ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための前方プラ
イマーとして使用した。 HEV−P2（配列番号:59）はHind III部位及びATG開始
コドンの前のKozakコンセンサス配列を含有し、そして
Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域のための後方プライマーとして使
用した。100μｌずつのPCR反応物は20mM Tris−HCl（p
H8.8）,10mM KCl,10mM（NH4）2SO4,2mM MgSO4,0.1％
Triton Ｘ−100,0.1μｇのBSA,250μＭ dNTP,2.5u
のVent DNAポリメラーゼ（Bio.Labs,U.K.）、50％の一
本cDNA合成反応物並びに100pmoleずつの前方プライマー
及び後方プライマーを含有した。各PCRチューブは50μ
ｌの鉱油で覆い、そして94℃にて1.5分間の最初の変性
の後、94℃にて１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１
分間のサイクル反応を30回行い、そして次に72℃にて10
分間インキュベートした。Ｌ鎖Ｖ領域を含有する408bp
のPCR生成物及びＨ鎖Ｖ領域を含有する444bpのPCR生成
物を、2.0％低融点アガロースゲルを用いて精製し、そ
してBamH I及びHind IIIにより消化し、そしてpUC19ベ
クターにサブクローニングし、それぞれpUC−RV1−PM1a
−３及びpUC−RVh−PM1f−３を得た。 再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域のDNA配
列は不適切なスプライスドナー部位及びアクセプター部
位を含有することが明らかになった（配列番号:54及び5
5を参照のこと）。Ｌ鎖Ｖ領域内のこれらの部位は高頻
度には使用されない（mRNAの約10％）が、Ｈ鎖Ｖ領域内
のこれらの部位は高頻度で使用される（mRNAの約90
％）。この異常なスプライシングが再構成ヒトPM−１抗
体の低レベルの発現をもたらした。Ｖ領域の異常なスプ
ライシングを回避するため、スプライス−ドナー部位を
PCR法により除去した。Ｈ鎖Ｖ領域について、後方プラ
イマーNEW−SP1（配列番号:61）及び前方プライマーNEW
−SP2（配列番号62）を合成した。このプライマーはDNA
配列TGG GTG AGAをDNA配列TGG GTT CGCに変える。P
CR反応の条件はcDNAのクローニングについて前記した通
りであったが、鋳型DNAは50ngのpUC−RVh−PM1f−３で
あり、そしてプライマーはHEV−P2とNEW−SP2、又はHEF
−P1とNEW−SP1のいずれかであった。 ２個のPCR反応からのPCR生成物を２％低融点アガロー
スゲルを用いて精製し、そしてPCR連結反応において使
用した。0.5μｇの第一PCR生成物を含有する98μｌのPC
R反応物及び５ユニットのVent DNAポリメラーゼを94℃
にて２分間、50℃にて２分間及び72℃にて５分間インキ
ュベートし、そして次に100pmoleずつのHEV−P1プライ
マー及びHEV−P2プライマーを加えた。PCRチューブを30
μｌの鉱油で覆い、そして94℃にて１分間、50℃にて１
分間及び72℃にて１分間の25サイクルのPCRにかけ、そ
して次に72℃にて10分間インキュベートした。 同様にして、再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖Ｖ領域中のス
プライス−ドナー領域をPCRプライマーREI−SP1（配列
番号:63）及びREI−SP2（配列番号:64）を用いて除去し
た。該プライマーはDNA配列CAG GTA AGGをDNA配列CAG
GAA AGGに変える。両PCR生成物、すなわちＬ鎖Ｖ領
域についての408bpのDNA断片及びＨ鎖Ｖ領域についての
444pbのDNA断片を2.0％低融点アガロースゲルを用いて
精製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、そして配列
決定のためpUC19にサブクローニングしてpUC−RV1−PM1
a−４及びpUC−RVh−RM1f−４を得た。 RVh−PM1fのHind III−BamH I断片を、pUC−RVh−PM1
f−４のHind III−BamH I領域と置き換えることによ
り、RVh−PM1f−４を得た。再構成ヒトPM−１抗体Ｌ鎖
Ｖ領域のイントロンが除去されたバージョン「ａ」の配
列を配列番号57に示し、再構成ヒトPM−１抗体Ｈ鎖Ｖ領
域のイントロンが除去されたバージョン「ｆ」の配列を
配列番号56に示す。 実施例13.再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコード
するDNAの作製 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域をコードするDNA
の作製の工程を図16に示す。鋳型となるヒト抗体Ｌ鎖Ｖ
領域をコードする遺伝子は、制限酵素Hind III及びBamH
I部位を用いてpUC19ベクターに組み込まれている。８
個のPCRプライマー（Ａ〜Ｈ）を準備し、第１のPCRによ
り、Ｖ領域をコードする遺伝子を４つの領域に分けて増
幅させる。プライマーＡ及びＨは、pUC19ベクター上のD
NA配列と相補性を持つ。プライマーB,C及びＤは、それ
ぞれ移植するCDR領域の遺伝子配列を有する40〜60bpの
プライマーである。プライマーE,F及びＧは、それぞれ
プライマーB,C及びＤの５′側15〜20bpのDNA配列と相補
性を持つ。４個の第1PCRは、それぞれプライマーＡと
Ｅ、ＢとＦ、ＣとＧ、及びＤとＨを用いる。PCR生成物
Ａ−ＥはFR1をコードし、Ｂ−ＦはCDR1とFR2をコードす
る。Ａ−Ｅ断片の３′側とＢ−Ｆ断片の５′側は15〜20
bpの相補性を持つので、後に、これら断片を連結するこ
とが可能となる。同様に、Ｂ−Ｆ断片は、CDR2及びFR3
をコードするＣ−Ｇ断片とも相補性を持つ。そして、Ｃ
−Ｇ断片はさらに、CDR3とFR4をコードするＤ−Ｈ断片
とも相補性を持つ。こうしてこれら４種の断片は、互い
の相補性により連結が可能となる。PCR反応液中にてこ
れら４つの断片の連結反応を行った後、プライマーＡ及
びＨを加える事により、正しく４つの断片が連結したも
のが、この第２のPCRによって増幅してくる。こうして
得られた第２のPCR生成物は、３つの移植されたCDRを有
し、Hind III及びBamH Iの消化後、pUC19ベクターにサ
ブクローニングする。 さらに具体的には、鋳型として再構成ヒトPM−１抗体
Ｌ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」をコードするDNAがプラス
ミドpUC19に挿入されているプラスミドpUC−RV1−PM1a
−４を用いた。 前記プライマーＡ〜Ｈは次の配列を有する。後方プライマー 配列番号 前方プライマー 配列番号 A.REVERSE 83 E.1220−L1b 66 B.1220−L1 65 F.1220−L2b 68 C.1220−L2 67 G.1220−L3b 70 D.1220−L3 69 H.UNIVERSAL 82 CDR移植用の後方プライマー1220−L1,1220−L2及び12
20−L3については、8M尿素を含む12％ポリアクリルアミ
ドゲルを用いて精製後使用した。 100μｌずつのPCR反応物は20mM Tris−HCl（pH8.
8）,10mM KCl,10mM（NH4）2SO4,2mM MgSO4,0.1％ Tr
iton Ｘ−100,0.1μｇのBSA,250μｍ dNTP,5uのVent
DNAポリメラーゼ（BioLabs.U.K.）,50ngのpUC−RVl−
PM1a−４ DNA、そして各100pmolesの前方及び後方プラ
イマーを含有した。各PCRチューブは50μｌの鉱油で覆
い、そして94℃にて1.5分間の最初の変性の後、94℃に
て１分間、50℃にて１分間及び72℃にて１分間の反応を
30サイクル行い、そして次に72℃にて10分間インキュベ
ートした。 252bp（Ａ−Ｅ）,96bp（Ｂ−Ｆ）,130bp（Ｃ−Ｇ）及
び123bp（Ｄ−Ｈ）の各PCR生成物を2.0％の低融点アガ
ロース（FMC,Bio.Products,USA）ゲルを用いて精製し
た。すなわち、各DNA断片を含有するアガロース片を切
り取りそして65℃にて５分間溶融せしめ、そしてこれと
同容積の2mM EDTA及び200mM NaClを含有する20mM Tr
is−HCl（pH7.5）を加えた。この混合物をフェノール及
びクロロホルムにより抽出し、そしてDNA断片をエタノ
ール沈澱により回収し、そして1mM EDTAを含有する10m
M Tris−HCl（pH7.5）に溶解し、そしてPCR連結反応に
おいて使用した。 次に、0.2μｇの各第１のPCR生成物及び５ユニットの
Vent DNAポリメラーゼを含有する98μｌのPCR反応液を
94℃にて２分間、50℃にて２分間及び72℃にて５分間イ
ンキュベートし、連結反応を行った。そして次に、各10
0pmoleのＡ（REVERSE）及びＨ（UNIVERSAL）プライマー
を加えて反応液を100μｌとした後、これを50μｌの鉱
油でおおい、そして94℃にて１分間、50℃にて１分間及
び72℃にて１分間の反応を30サイクル行い、そして次に
72℃にて10分間インキュベートした。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＬ鎖のCDRが移
植されたＬ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含有する558bpの
第2PCRの生成物を2.0％低融点アガロースゲルを用いて
精製し、そしてBamH I及びHind IIIにより消化後、pUC1
9ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確認し、p
UC−RVL−1220aを得た。得られたＬ鎖Ｖ領域のアミノ酸
配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表71
に示す。 次いで、Ｌ鎖発現ベクターを構築するため、再構成ヒ
トAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含有するHind III−BamH
I DNA断片を上記プラスミドpUC−RVL−1220aから切り出
し、Ｌ鎖発現ベクターHEF−12κ−ｇκのHind III−Bam
H I部位に挿入し、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖Ｖ領域
バージョンａの発現ベクターであるRVL−1220aを得た。 実施例14.再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖の発現及び分析 COS細胞での一過性（transient）発現 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を発現するベクターRVL
−1220a及びキメラAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現するベクタ
ー、HEF−12h−ｇγ１（実施例５）によりCOS細胞を同
時形質転換することにより、再構成ヒトAUK12−20抗体
Ｌ鎖バージョン「ａ」の評価を行った。すなわち、COS
細胞を１×107個/mlになるようにphosphate−buffered
saline（PBS）に懸濁し、この細胞浮遊液0.8mlにDNA
（各プラスミドについて10μｇ）を加えた。Gene Puls
ar装置（BioRad）を用い1,900ボルト（Ｖ）、25マイク
ロファラッド（μＦ）の電気容量にてパルスを与えた。 室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーシ
ョンした細胞を、10％のウシ胎児血清（γ−グロブリン
不含）を含有するDMEM培地（GIBCO）20mlに加えた。72
時間のインキュベーションの後、培養上清を集め、遠心
分離して細胞破片を除去し、そして無菌条件下で４℃に
て短時間、又は−20℃にて長時間貯蔵した。 酵素免疫測定法（ELISA）によるヒト様抗体の定量 トランスフェクトされたCOS細胞の培養上清をELISAに
より測定して、キメラ抗体が生産されていることを確認
した。ヒト様抗体を検出するため、プレートをヤギの抗
ヒトIgG（Whole molecule）（Sigma）によりコートし
た。ブロックした後、COS細胞からの培養上清を段階希
釈しそして各ウエルに加えた。 プレートのインキュベーション及び洗浄の後、アルカ
リホスファターゼ−結合ヤギ抗−ヒトIgG（γ鎖特異
的、Sigma）を加えた。インキュベーション及び洗浄の
後、基質緩衝液を加えた。さらにインキュベーションし
た後、反応を停止しそして405nmにおける吸光度を測定
した。標準として精製ヒトIgG（Sigma）を用いた。 ヒトIL−6Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定
（ELISA） トランスフェクトされたCOS細胞からの上清をELISAに
より測定して、生産されたヒト様抗体が抗原IL−6Rに結
合し得るか否かを決定した。抗原への結合の検出のた
め、プレートをMT18マウスモノクローナル抗体（参考例
１）でコートした。１％ BSAでブロックした後、可溶
性組換えヒトIL−6R（SR344）をプレートに加えた。 プレートを洗浄した後、COS細胞からの培養上清を段
階希釈し、そして該プレートの各ウエルに加えた。イン
キュベーション及び洗浄の後、アルカリホスファターゼ
結合ヤギ抗−ヒトIgGをウエルに加えた。インキュベー
ション及び洗浄の後、基質緩衝液を加えた。インキュベ
ーションの後、反応を停止し、そして405nmにおける吸
光度を測定した。 この結果を図17に示す。再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ
鎖バージョン「ａ」とキメラAUK12−20抗体Ｈ鎖の組み
合せによるヒト様抗体は、キメラAUK12−20抗体と同様
にヒトIL−6Rに対する強い結合能を示し、サンプルの希
釈度依存的に405nmにおける吸光度が変化し、サンプル
中にIL−6Rに対する抗体が含まれていることが確認され
た。また、この結果は、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖
のバージョン「ａ」がキメラAUK12−20抗体Ｌ鎖と同様
に抗原結合能を持つことを示している。 実施例15.ヒトサブグループＩ（HSG I）コンセンサス配
列を用いた再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖遺伝子の構築 実施例13で示した方法と同様にして、AUK12−20抗体
Ｈ鎖Ｖ領域のCDRをヒトサブグループＩのコンセンサス
配列をFRとして有する再構成ヒトVHa425（Kettleboroug
hら、Protein Engineering,４,773−783,1991）に移植
した。まず、再構成ヒトVHa425（上記文献中、Fig3）を
コードするHind III−BamH I DNA断片をプラスミドHCM
V−RVHa−425−γ１から切り出し、pUC19ベクターのHin
d III−BamH I部位にサブクローニングし、pCU−RVH−4
25aを得た。これを鋳型DNAとして使用した。PCRに用い
る８個のプライマー（A1〜H1）を合成した。プライマー
1220−H1は、CDR1の移植及びThr−28からSer−28の変更
を誘導する様にデザインし、プライマー1220−H3はCDR3
の移植及びSer−94からArg−94への変異を誘導する様に
デザインした。プライマー1220−H1,1220−H2及び1220
−H3は、それぞれ8M尿素を含む12％ポリアクリルアミド
ゲルを用いて精製後、使用した。各プライマーのヌクレ
オチド配列は次の通りである。後方プライマー 配列番号 前方プライマー 配列番号 A1.REVERSE 83 E1.1220−H1b 73 B1.1220−H1 72 F1.1220−H2b 75 C1.1220−H2 74 G1.1220−H3b 77 D1.1220−H3 76 H1.UNIVERSAL 82 PCRの条件は、鋳型DNAとしてpUC−RVH−425aを使用
し、Ｈ鎖CDR移植用プライマーとして上記のものを使用
した以外は実施例13に記載したものと同じであった。A1
とE1、B1とF1、C1とG1、及びD1とH1のプライマー対を用
いて第1PCR反応を行い、それぞれ186bp（A1−E1）,75bp
（B1−F1）,173bp（C1−G1）及び105bp（D1−H1）の各
第1PCR生成物を2.0％の低融点アガロースゲルにて精製
し、次の第2PCR連結反応において使用した。実施例13に
て示した条件に従い、各0.2μｇの上記第1PCR生成物を
用いて第2PCR（PCR連結反応を含む）を行い、マウスAUK
12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域CDRが移植されたヒトＨ鎖Ｖ領
域を含有する495bpのPCR生成物を得、これを2.0％低融
点アガロースゲルを用いて精製した。そしてBamH I及び
Hind IIIにより消化後、得られたBamH I−Hind III断片
をpUC19ベクターにサブクローニングし、塩基配列を確
認して、pUC−RVH−1220aを得た。 ところで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコ
ードするDNA配列を調らべた結果、スプライスの供与配
列とよく一致する配列が見い出された。この事は、再構
成ヒトPM−１抗体の作成時に問題となった異常なスプラ
イシングを引き起す可能性がある。そこで、この配列を
PCR法により変異させた。変異誘導プライマーとして、S
GI−SP1（配列番号97）及びSGI−SP2（配列番号98）を
合成した。このプライマーは、DNA配列AAG GTG AGCを
DNA配列AAA GCT AGCに変える。PCR反応の条件は、前
記条件と同様に行い、鋳型DNAは50ngのpUC−RVH−1220a
であり、そしてプライマーはSGI−SP1とUNIVERSAL（配
列番号82）、またはSGI−SP2とREVERSE（配列番号83）
のいずれかであった。 ２個のPCR反応からのPCR生成物を２％低融点アガロー
スゲルを用いて精製し、そしてPCR連結反応において使
用した。各0.2μｇの第1PCR生成物及び5uのVent DNAポ
リメラーゼを含有する98μｌのPCR反応液を94℃にて２
分間、50℃にて２分間、及び72℃にて５分間インキュベ
ートし連結反応を行った。そして次に100pmoleずつのUN
IVERSAL及びREVERSEプライマーを加え、50μｌの鉱油で
おおった後、94℃にて１分間、50℃にて１分間そして72
℃にて１分間の第2PCRを30サイクル行い、そして次に72
℃にて10分間インキュベートした。第2PCRで得られた49
5bpのDNA断片を2.0％低融点アガロースゲルを用いて精
製し、Hind III及びBamH Iにより消化し、これをpUC19
ベクターにサブクローニングした後、塩基配列を確認し
て、pUC−RVH−1220a−２を得た。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコー
ドするDNAを含有するHind III−BamH I DNA断片を上記
pUC−RVH−1220a−２より切り出し、Ｈ鎖発現ベクターH
EF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に導入し、再
構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖のバージョンａの発現ベク
ターであるRVH−1220aを得た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョ
ン（ｂ〜ｄ）をコードするDNAを作成するために２組の
変異誘発PCRプライマーを合成した。各PCR反応は前記の
反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。バージョン
「ｂ」をコードするDNAの作成のため、２種の第1PCRに
おいて、UNIVERSALプライマー（配列番号82）及び変異
誘発プライマー1220H−m1a（配列番号78）、あるいは、
REVERSEプライマー（配列番号83）と変異誘発プライマ
ー1220H−m1b（配列番号79）の各PCRプライマー、並び
に鋳型DNAとしてのpUC−RVH−1220aを用いた。それぞれ
202bp及び323bpの第1PCR生成物を2.0％低融点アガロー
スゲルを用いて精製後、前記の反応条件と同様に第2PCR
（PCR連結反応を含む）を行い、495bpの生成物（バージ
ョン「ｂ」）を得た。これをHind III−BamH Iにより消
化し、そして、pUC19ベクターにサブクローニングし、p
UC−RVH−1220bを得た。 同様にして、変異誘発プライマー1220H−m2a（配列番
号80）、1220H−m2b（配列番号81）及びこの生成物を鋳
型pUC−RVH−1220aを用いてPCR生成物（バージョン
「ｃ」をコードするDNA）を得、Hind III及びBamH Iで
消化し、pUC19ベクターのHind III−BamH I部位に挿入
してpUC−RVH−1220cを得た。さらに、変異誘発プライ
マー1220H−m1a（配列番号78）、1220H−m1b（配列番号
79）及び鋳型としてのpUC−RVH−1220cを用いてPCR生成
物（バージョンｄ）を得、これをHind III及びBamH Iで
消化してpCU19ベクターのHind III−BamH I部位に挿入
することによりpUC−RVH−1220dを得た。 なお、プラスミドpUC−RVH−1220b中にコードされて
いるの再構成ヒト抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ｂ」のア
ミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配
列番号84に示し、pUC−RVH−1220d中にコードされてい
る再構成ヒトＨ鎖Ｖ領域バージョン「ｄ」のアミノ酸配
列及びそれをコードするヌクレオチド配列を配列表85に
示す。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖の各バージョ
ンの発現ベクターを構築するために、再構成ヒトAUK12
−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含むHind III−B
amH I断片をpCU−RVH−1220b,pUC−RVH−1220c、及びpU
C−RVH−1220dより切り出し、Ｈ鎖発現ベクターHEF−12
h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に挿入して、各バー
ジョンの発現ベクターRVH−1220b,RVH−1220c、及びRVH
−1220dをそれぞれ得た。 実施例16.再構成ヒトAUK12−20抗体の種々のバージョン
の発現及び分析 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベ
クターの１つ（RVH−1220a,RVH−1220b,RVH−1220c、ま
たはRVH−1220d）及び再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を
発現するベクターRVL−1220aによりCOS細胞を同時形質
転換することにより、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域の４種類のバージョンを評価した。比較のため、CO
S細胞をキメラAUK12−20抗体Ｌ鎖及びＨ鎖を発現する各
ベクター（HEF−12h−ｇγ１及びHEF−12κ−ｇκ）に
よっても同時形質転換した。ヒトIR−6Rへの結合につい
ての測定において、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖と再
構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖のバージョン「ｂ」、ある
いは再構成ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖と再構成ヒトAUK12−
20抗体Ｈ鎖のバージョン「ｄ」との組み合せによる再構
成ヒト12−20抗体は、キメラAUK12−20抗体と同等の結
合活性を示した。これらの結果を図18及び図19に示す。 実施例17.ヒト抗体HAXを用いた再構成ヒトAUK12−20抗
体Ｈ鎖遺伝子の構築 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域と
最も相同性の高いヒト抗体は、タンパクデータベース
“Leeds"の検索により、HAXであった（J.Immunology 1
39,2496−2501,1987,SLE患者由来Ｂ cell hydridoma
21/28の産生する抗体、遺伝子配列はFig.4,5に、アミ
ノ酸配列はFig.6に記載）。再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ
鎖Ｖ領域の設計を、HAX抗体のFR領域とマウスモノクロ
ーナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のCDRを用いて行っ
た。 マウスモノクローナル抗体AUK12−20のＨ鎖Ｖ領域のC
DRを含む再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の第一バ
ージョン（Sle1220Ha）をコードする全DNAは化学合成に
て作成した。すなわち、全長439bpのsle1220Haをコード
するDNAを各々21bpの重複部位を有する90〜94bpの長さ
の６本のオリゴヌクレオチド（sle1220h1〜6;それぞ
れ、配列番号86〜91）に分けて設計した。オリゴヌクレ
オチドの設計にあたり、２次構造の検索を行ない、構造
上に問題のある部位に関して、アミノ酸置換がおきない
様に、コドンの第３塩基を変換した。これらのオリゴヌ
クレオチドの相互関係及び２本鎖合成DNAの完成までの
過程を図20に示す。 PCR法を用いて図20に示す反応を行う。すなわち６本
の合成オリゴヌクレオチドを同一PCR反応チューブに加
え、第１のPCR反応を行う。これにより、２つのオリゴ
ヌクレオチドのアニーリング伸長を行うことができ、さ
らに、４つのオリゴヌクレオチド、または、全長のオリ
ゴヌクレオチドを得ることができる。次に、末端プライ
マーＡ（配列番号92）及びＢ（配列番号93）を加え、第
２のPCR反応を行うことで、正しく全長を有するオリゴ
ヌクレオチドのみを増幅することができる。得られた生
成物を精製し、BamH I及びHind IIIにより消化後、pUC1
9ベクターにサブクローニングしてシークエンスを行
う。 具体的には、10mM Tris−HCl（pH8.3）,50mM KCl,
0.1mM dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP,0.1mM dTTP,1.
5mM MgCl2及び2.5uのDNAポリメラーゼAmpliTaq（Perki
n Elmer Cetus）並びに各オリゴヌクレオチド5pmole
を含有する98μｌの反応混合物を94℃1.5分間の変性
後、94℃３分間、50℃２分間、72℃５分間の反応を３サ
イクル行い、次に72℃にて10分間インキュベートした。
反応液に50μＭの末端プライマーＡおよびＢを１μｌず
つ加え、80μｌの鉱油で覆い、94℃1.5分間の変性後、9
4℃にて１分間、50℃にて１分間、72℃１分間の反応を3
0サイクル行い、続いて72℃で10分間インキュベートし
た。439bpのPCR生成物を1.5％の低融点アガロースゲル
を用いて精製し、制限酵素BamH IおよびHind IIIにより
消化後、pUC19ベクターにサブクローニングして、塩基
配列を確認した。得られたクローンをpUC−RVH−sle122
0Haとした。このプラスミド中にコードされている再構
成ヒトAUK12−20抗体のＨ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」の
アミノ酸配列及びそれをコードするヌクレオチド配列を
配列番号94に示す。 次いで、再構成ヒトAUK12−20（sle1220Ha）抗体Ｈ鎖
Ｖ領域をコードする遺伝子を含有するHind III−BamH I
DNA断片をpUC−RVH−sle1220Haより切出し、Ｈ鎖発現
ベクターHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に導
入し、RVH−sle1220Haを得た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域の他のバージョ
ン（「ｂ」〜「ｄ」）を作成するため、２つの変異誘発
プライマーsle1220Hm1（配列番号95）、及びsle1220Hm2
（配列番号96）を合成した。各PCR反応では、実施例13
で示されているVent DNAポリメラーゼ及び反応液組成
を用いた。各PCR反応では、バージョン「ｂ」及びバー
ジョン「ｃ」については、鋳型としてのpUC−RVH−sle1
220Ha,50pmoleの変異誘発プライマーsle1220Hm1またはs
le1220Hm2及び50pmoleの末端プライマーＢを含有する反
応混合物を94℃1.5分間の変性の後、94℃１分、50℃１
分、72℃１分の30サイクルの反応にかけ、次に72℃で10
分間インキュベートした。235bpまたは178bpの生成物を
1.5％の低融点アガロースゲルを用いて精製し、第２のP
CR反応のプライマーとして使用した。すなわち、50pmol
eの末端プライマーＡと、0.2μｇのPCR生成物を加え、p
UC−RVH−sle1220Haを鋳型として、第2PCR反応を行い、
439bpの生成物を1.5％低融点アガロースゲルで精製、Ba
mH I及びHind IIIで消化後pUC19ベクターにサブクロー
ニングして、それぞれ再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ
領域バージョン「ｂ」又は「ｃ」をコードするプラスミ
ドpUC−RVH−sle1220Hb又はpUC−RVH−sle1220Hcを得
た。 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖Ｖ領域バージョン
「ｄ」をコードするDNAは次の様にして作製した。鋳型
としてのpUC−RVH−sle1220Hbを用いた。変異誘導プラ
イマーsle1220Hm2及び末端プライマーＢを50pmoleずつ
用いて第１のPCR反応を30サイクル行った。得られた178
bpのPCR生成物を1.6％の低融点アガロースゲルにより精
製し、第２のPCRのプライマーとして用いた。このプラ
イマーと50pmoleの末端プライマーＡを用いて第２のPCR
を行い、439bpのDNA断片を得た。これを、精製し、BamH
I及びHind IIIにて消化後pUC19ベクターにサブクロー
ニングし、ヌクレオチド配列を確認し、pUC−RVH−sle1
220Hdを得た。 次いで、再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖の各バージョ
ンの発現ベクターを構築するため、再構成ヒトAUK12−2
0抗体Ｈ鎖Ｖ領域をコードするDNAを含むBamH I−Hind I
II断片をpUC−RVH−sle1220Hb,pUC−RVH−sle1220Hc、
およびpUC−RVH−sle1220Hdより切り出し、Ｈ鎖発現ベ
クターHEF−12h−ｇγ１のHind III−BamH I部位に挿入
して、各発現ベクター、RVH−sle1220Hb,RVH−sle1220H
cおよびRVH−sle1220Hdをそれぞれ得た。 分析 再構成ヒトAUK12−20抗体Ｈ鎖を発現する４種類のベ
クターのうちの１つ（RVH−sle1220Ha,RVH−sle1220Hb,
RVH−sle1220HcまたはRVH−sle1220Hd）および、再構成
ヒトAUK12−20抗体Ｌ鎖を発現するベクターRVL−1220a
を用いてCOS細胞を同時形質転換することにより、再構
成ヒトAUK12−20H抗体Ｈ鎖Ｖ領域の４種類のバージョン
を、IL−6RへのIL−６の結合を阻害する能力について評
価した。この結果を図21〜24に示す。なお、これらの結
果は、生産された抗体をプロテインＡによって精製した
後に得られたものである。 上記のごとく、本発明によれば、キメラＬ鎖もしくは
再構成Ｌ鎖又はキメラＨ鎖もしくは再構成Ｈ鎖のＶ領
域、そして特にFR中の１個又は複数個のアミノ酸を他の
アミノ酸に置換してもなおヒトIL−6Rに結合する能力を
維持している。従って本発明は、その本来の性質を維持
している限り、１個又は複数のアミノ酸が他のアミノ酸
により置換されている、キメラ抗体及び再構成ヒト抗
体、キメラＬ鎖及び再構成Ｌ鎖、キメラＨ鎖及び再構成
Ｈ鎖、再構成Ｌ鎖Ｖ領域、並びに再構成Ｈ鎖Ｖ領域、並
びにこれらをコードするDNAをも包含する。 参考例 本発明において使用される出発ハイブリドーマは次の
様にして作製された。 参考例1.ハイブリドーマ MT18の作製 ヒトIL−6Rに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製するため、免疫原として、細胞表面
にヒトIL−6Rを発現するマウスＴ細胞を次の様にして作
製した。すなわち、Y.Hirataら、J.Immunol.Vol.143,29
00−2906（1989）に開示されているプラスミドpZipneo
IL−6Rを常法に従ってマウスＴ細胞系CTLL−２（ATCC
TIB214）にトランスフェクトし、生ずる形質転換体を
常法に従ってG418を用いてスクリーニングすることによ
り細胞あたり約30,000個のヒトIL−6Rを発現する細胞株
を得た。この細胞株をCTBC3と称する。 CTBC3細胞を常法に従ってRPMI1640中で培養し、そし
て培養細胞をPBS緩衝液により４回洗浄し、そして１×1
07個の細胞をC57BL/6マウスに腹腔内注射して免疫感作
した。この免疫感作は１週間に１回６週間にわたって行
った。 この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、そして
常法に従ってポリエチレングリコールを用いて骨髄腫P3
U1細胞を融合せしめ、そして融合した細胞を次の様にし
てスクリーニングした。IL−6R陰性ヒトＴ細胞系JURKAT
（ATCC CRL 8163）を、プラスミドpZipneo IL−6Rに
より同時トランスフェクトし、そして形質転換した細胞
をスクリーニングして、細胞当り約100,000個のIL−6R
を発現する細胞系を得た。この細胞系をNJBC8と命名し
た。 NP−40で細胞溶解したNJBC8を認識するがしかしNP−4
0で細胞溶解したJURKATを認識しない抗体を生産するハ
イブリドーマ細胞系をクローン化しそしてMT18と命名し
た。ハイブリドーマMT18は、工業技術院微生物工業技術
研究所にブダペスト条約のもとに1990年７月10日に微工
研条寄第2999号（FERM BP−2999）として寄託された。 参考例2.ハイブリドーマPM1の作製 ヒトIL−6Rに対するモノクローナル抗体を生産するハ
イブリドーマを作製するため、抗原として、ヒトIL−6R
を次の様にして抽出した。３×109個のヒト骨髄腫細胞
（IL−6R生産細胞）を1mlの１％ジギトニン、10mMトリ
エタノールアミン緩衝液（pH7.4）,0.15M NaCl及び1mM
PMSF（フェニルメチルスルホニルフルオリド；和光純
薬）中で溶解した。他方、参考例１において調製したハ
イブリドーマMT18により生産されたMT18抗体を、ブロム
シアンで活性化されたセファロース4B（Pharmacia）に
常法に従って結合させた。このMT18抗体結合セファロー
ス4Bを前記の細胞溶解物を混合することにより、セファ
ロース4B上のMT18抗体に前記可溶化したIL−6Rを結合さ
せた。セファロース4Bに非特異的に結合した物質を洗浄
除去し、そしてSepharose4BにMT18抗体を介して結合し
たIL−6Rを免疫原として使用した。 前記の免疫原を用いてBALB/cマウスを１週間に１回４
週間にわたり腹腔内に免疫感作した。次に、この免疫感
作されたマウスから脾臓細胞を得、そして常法に従って
ポリエチレングリコールを用いて骨髄腫細胞P3U1と融合
せしめた。融合した細胞を次のようにしてスクリーニン
グした。まず、培養上清及び0.01mlのProteinGセファロ
ース（Pharmacia）を混合して上清中の免疫グロブリン
をProteinGセファロースに吸着せしめた。他方、35S−
メチオニンにより内部標識された1011個のU266細胞を溶
解し、そしてMT18結合セファロース4Bを用いてIL−6Rを
アフィニティ精製した。次に、35S−メチオニンで標識
されたIL−6Rを、免疫グロブリンが結合している上記の
ProteinGセファロースにより免疫沈降せしめ、そして沈
澱をSDS−PAGEにより分析した。その結果、IL−6Rに特
異的に結合する抗体を生産する１個のハイブリドーマク
ローンを単離し、そしてPM1と命名した。ハイブリドー
マPM1は工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト
条約のもとに1990年７月10日に、微工研条寄第2998号
（FERM BP−2998）として寄託された。 参考例3.ハイブリドーマAUK12−20,AUK64−７及びAUK14
6−15の作製 免疫原として可溶性IL−6R（SR 344）を、Yasukawa,
K.らの、J.Biochem.108,673−676,1990、に記載されて
いる方法に従って調製した。 すなわち、Ｎ−末端から345番目のコドンが終止コド
ンにより置換されているIL−6RをコードするcDNAを含有
するプラスミドpECEdhfr344をCHO（5E27）細胞にトラン
スフェクトし、そのトランスフェクトされた細胞を無血
清培地（SF−０培地、三光純薬）中で培養し、そして得
られる上清をHF−Labl系（東ソー）により濃縮しそして
Blue−5PWカラム及びPhenyl−5PWカラムにより精製し
た。精製された可溶性IL−6RはSDS−PAGEで単一バンド
を示した。 雌性BALB/cAnNCrjマウス（日本クレア）に、１回の免
疫原量を10μg/マウスとしてFreundの完全アジュバント
（Bacto Adjuvant Complete H37Ra,Difco）と共に皮
下注射し、そしてそれぞれ最初の注射の２週間及び３週
間後に、Freundの不完全アジュバント（Bacto Adjuvan
t Incomplete Freund,Difco）と共に同量の免疫原を
第二回及び第三回追加免疫として皮下注射した。最終免
疫感作（第四回注射）は第三回注射の１週間後に、アジ
ュバントを使ないで尾静脈内に行った。免疫感作された
マウスから血清試料を採取し、希釈緩衝液により段階的
に希釈し、そしてGoldsmith,P.K.,Analytical Biochem
isty,117,53−60,1981、に記載されている方法に従って
ELISA法により分析した。すなわち、SR344（0.1μg/m
l）によりコートされたプレートを１％BSAによりブロッ
クし、そして前記の希釈された試料をそれに加えた。SR
344に結合したマウスIgGをヤギの抗−マウスIgG/アルカ
リホスファターゼ（A/P）（ZYMED）及びアルカリホスフ
ァターゼ用基質（Sigma−104）を用いて測定した。血清
中の抗−SR344抗体の増加を確認した後、最終免疫感作
から３日後に、５匹のBALB/cマウスから脾臓細胞を得
た。脾臓細胞及び骨髄細胞株（P3U1）を25:1の比率で混
合し、PEG1500を用いて融合し、そして2000個のウエル
中で0.7〜1.1×106細胞／ウエルの細胞濃度で培養し
た。ウエルからの上清を、SR344に結合するそれらの能
力について（R344認識アッセイと称する第一次スクリー
ニング）、及びSR344とIL−6Rとの結合を阻害するそれ
らの能力について（1L−6/s1L6R結合阻害アッセイ（RBI
A）による）スクリーニングした。第一次スクリーニン
グが240個の陽性ウエルをもたらし、そして第二次スク
リーニングが36個の陽性ウエルをもたらした。 上記のSR344認識アッセイは次の様にして行った。ヤ
ギの抗マウスIg（Cappel）（１μg/ml）によりコートさ
れたプレート（MaxiSorp,Nunc）を１％BSAによりブロッ
クし、そして100μl/ウエルのハイブリドーマ培養上清
をそれに添加し、次に室温にて１時間インキュベートし
た。プレートを洗浄した後、20ng/mlのSR344をウエルに
加え、そして室温にて１時間インキュベーションを行っ
た。上清に由来する固定化された抗体により捕捉された
SR344の量を、ラビット抗SR344IgG（＃2,5μg/ml）、ヤ
ギの抗ラビットIgG−アルカリホスファターゼ（A/P）
（1:3000,Tago）及び基質（1mg/ml,Sigma−104）の添
加、並びにそれに続く405−600nmでの吸光度の測定によ
り定量した。 前記のRBIAは次の様にして行った。MT18抗体でコート
したプレートを100ng/mlのSR344（100μl/ウエル）で満
たし、そして室温にて１時間インキュベーションを行っ
た。プレートを洗浄した後、50μl/ウエルのハイブリド
ーマ培養上清及び50μl/ウエルのビオチン−IL−６結合
体（20ng/ml）をそれぞれのウエルに同時に加え、そし
てウエルを室温にて１時間インキュベートした。ストレ
プトアビジン−A/P（1:7000,PIERCE）及び対応する基質
（Sigma−104）を添加し、405−600nmでの吸光度を測定
することにより、SR344に結合したビオチン−1L−６の
量を測定した。 最後に、限界希釈法を２回反復することにより陽性ク
ローンを純化し、そしてSR344とIL−６との結合を阻害
する３個のハイブリドーマクローン、すなわちAUK12−2
0,AUK146−15及びAUK64−7;並びにSR344とIL−６との結
合を阻害しないハイブリドーマクローンAUK181−６を得
た。 産業上の利用可能性 本発明はヒトIL−6Rに対する再構成ヒト抗体を提供
し、この抗体においてはヒト抗体のＶ領域のCDRがヒトI
L−6Rに対するマウスモノクローナル抗体のCDRにより置
き換えられている。この再構成ヒト抗体の大部分がヒト
抗体に由来し、そしてCDRは抗原性が低いから、本発明
の再構成ヒト抗体はヒトに対する抗原性が低く、そして
それ故に療法用として期待される。 ブタペスト条約規則第13規則の２の寄託された微生物へ
の言及 寄託期間:National Collections of Industrial and Ma
rine Bacteria Limited あて名:23St Macher Drive,Aberdeen AB2 1RY,UNITED K
INGDOM 微生物の表示 寄託番号 寄託日 E. coli DH5α pPM−h1 NCIMB 40362 1991年２月12日 E. coli DH5α p12−h2 NCIMB 40363 1991年２月12日 E. coli DH5α p64−h2 NCIMB 40364 1991年２月12日 E. coli DH5α p146−h1 NCIMB 40365 1991年２月12日 E. coli DH5α pPM−k3 NCIMB 40366 1991年２月12日 E. coli DH5α p12−k2 NCIMB 40367 1991年２月12日 E. coli DH5α p64−k4 NCIMB 40368 1991年２月12日 E. coli DH5α p146−k3 NCIMB 40369 1991年２月12日 寄託機関：通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名：日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号微生物の表示 寄託番号 寄託日 MT18 FERM BP−2999 1990年７月10日 PM 1 FERM BP−2998 1990年７月10日
配列番号:1
配列の長さ:40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:2
配列の長さ:39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:3
配列の長さ:40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:4
配列の長さ:43
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:5
配列の長さ:40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:6
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:7
配列の長さ:41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:8
配列の長さ:41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:9
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:10
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:11
配列の長さ:38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:12
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:13
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:14
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:15
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:16
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:17
配列の長さ:40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:18
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:19
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:20
配列の長さ:33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:21
配列の長さ:40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:22
配列の長さ:37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:23
配列の長さ:28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:24
配列の長さ:393
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p12−k2
特徴:1..60 sig peptide
61..393 mat peptide
配列
配列番号:25
配列の長さ:405
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p12−h2
特徴:1..57 sig peptide
58..405 mat peptide
配列
配列番号:26
配列の長さ:381
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:pPM−k3
特徴:1..60 sig peptide
61..381 mat peptide
配列
配列番号:27
配列の長さ:411
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
鎖の数：二本鎖
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:pPM−h1
特徴:1..54 sig peptide
55..411 mat peptide
配列
配列番号:28
配列の長さ:393
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p64−k4
特徴:1..60 sig peptide
61..393 mat peptide
配列
配列の番号:29
配列の長さ:417
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p64−h2
特徴:1..57 sig peptide
58..417 mat peptide
配列
配列の番号:30
配列の長さ:381
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p146−k3
特徴:1..60 sig peptide
61..381 mat peptide
配列
配列番号:31
配列の長さ:402
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン:p146−h1
特徴:1..51 sig peptide
52..402 mat peptide
配列
配列番号:32
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:33
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:34
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:35
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:36
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:37
配列の長さ:35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:38
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:39
配列の長さ:39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:40
配列の長さ:36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:41
配列の長さ:17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:42
配列の長さ:18
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:43
配列の長さ:55
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:44
配列の長さ:63
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:45
配列の長さ:54
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:46
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:47
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:48
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:49
配列の長さ:29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:50
配列の長さ:48
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:51
配列の長さ:42
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:52
配列の長さ:50
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:53
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列
配列番号:54
配列の長さ:706
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成
起源
生物名：マウス及びヒト
直接の起源
クローン:pUC−RVh−PM1f
特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＨ
鎖Ｖ領域バージョン（ｆ）及びそれをコードする遺伝子 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−36:CDR1 アミノ酸 37−50:FR2 アミノ酸 51−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−６ Hind III部位 ヌクレオチド 54−135 intron ヌクレオチド 258−348 intron/aberrant splicing ヌクレオチド 505−706 intron ヌクレオチド 701−706 BamH I部位 配列 配列番号:55 配列の長さ:506 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−PM1a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺伝子 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−34:CDR1 アミノ酸 35−49:FR2 アミノ酸 50−56:CDR2 アミノ酸 57−88:FR3 アミノ酸 89−97:CDR3 アミノ酸 98−117:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 54−135:intron ヌクレオチド 268−376:intron/aberrant splicing ヌクレオチド 469−506:intron ヌクレオチド 501−506:BamH I部位 配列 配列番号:56 配列の長さ:438 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−PM1f−４ 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＨ
鎖Ｖ領域バージョン（ｆ）及びそれをコードする遺伝子
であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−36:CDR1 アミノ酸 37−50:FR2 アミノ酸 51−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 432−438:BamH I部位 配列 配列番号:57 配列の長さ:402 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−PM1a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺伝子
であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−34:CDR1 アミノ酸 35−49:FR2 アミノ酸 50−56:CDR2 アミノ酸 57−88:FR3 アミノ酸 89−97:CDR3 アミノ酸 98−107:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 397−402:BamH I部位 配列 配列番号:58 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:59 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:60 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:61 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:62 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:63 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:64 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:65 配列の長さ:66 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:66 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:67 配列の長さ:48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:68 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:69 配列の長さ:48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:70 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:71 配列の長さ:414 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−1220a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−38:CRD1 アミノ酸 39−53:FR2 アミノ酸 54−60:CDR2 アミノ酸 61−92:FR3 アミノ酸 93−101:CDR3 アミノ酸 102−111:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 408−414:BamH I部位 配列 配列番号:72 配列の長さ:45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:73 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:74 配列の長さ:69 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:75 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:76 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:77 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:78 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:79 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:80 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:81 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:82 配列の長さ:16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:83 配列の長さ:17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:84 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−1220b 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ｂ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 106−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:85 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−1220d 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ｄ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 106−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:86 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:87 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:88 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:89 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:90 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:91 配列の長さ:94 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:92 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:93 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:94 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVH−1220Ha 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトAUK12−20抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」及びそれをコードする遺伝
子。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 109−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:95 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:96 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:97 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:98 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列
鎖Ｖ領域バージョン（ｆ）及びそれをコードする遺伝子 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−36:CDR1 アミノ酸 37−50:FR2 アミノ酸 51−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−６ Hind III部位 ヌクレオチド 54−135 intron ヌクレオチド 258−348 intron/aberrant splicing ヌクレオチド 505−706 intron ヌクレオチド 701−706 BamH I部位 配列 配列番号:55 配列の長さ:506 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−PM1a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺伝子 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−34:CDR1 アミノ酸 35−49:FR2 アミノ酸 50−56:CDR2 アミノ酸 57−88:FR3 アミノ酸 89−97:CDR3 アミノ酸 98−117:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 54−135:intron ヌクレオチド 268−376:intron/aberrant splicing ヌクレオチド 469−506:intron ヌクレオチド 501−506:BamH I部位 配列 配列番号:56 配列の長さ:438 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−PM1f−４ 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＨ
鎖Ｖ領域バージョン（ｆ）及びそれをコードする遺伝子
であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−36:CDR1 アミノ酸 37−50:FR2 アミノ酸 51−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−108:CDR3 アミノ酸 109−119:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 432−438:BamH I部位 配列 配列番号:57 配列の長さ:402 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−PM1a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化PM−１抗体のＬ
鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺伝子
であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−34:CDR1 アミノ酸 35−49:FR2 アミノ酸 50−56:CDR2 アミノ酸 57−88:FR3 アミノ酸 89−97:CDR3 アミノ酸 98−107:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 397−402:BamH I部位 配列 配列番号:58 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:59 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:60 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:61 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:62 配列の長さ:33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:63 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:64 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:65 配列の長さ:66 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:66 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:67 配列の長さ:48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:68 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:69 配列の長さ:48 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:70 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:71 配列の長さ:414 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RV1−1220a 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＬ鎖Ｖ領域バージョン（ａ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸−19−−1:leader アミノ酸 １−23:FR1 アミノ酸 24−38:CRD1 アミノ酸 39−53:FR2 アミノ酸 54−60:CDR2 アミノ酸 61−92:FR3 アミノ酸 93−101:CDR3 アミノ酸 102−111:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 408−414:BamH I部位 配列 配列番号:72 配列の長さ:45 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:73 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:74 配列の長さ:69 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:75 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:76 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:77 配列の長さ:36 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:78 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:79 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:80 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:81 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:82 配列の長さ:16 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:83 配列の長さ:17 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:84 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−1220b 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ｂ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 106−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:85 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVh−1220d 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒト化AUK12−20抗体
のＨ鎖Ｖ領域バージョン（ｄ）及びそれをコードする遺
伝子であって、intronが除去されたもの。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 106−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:86 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:87 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:88 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:89 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:90 配列の長さ:90 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:91 配列の長さ:94 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:92 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:93 配列の長さ:15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:94 配列の長さ:433 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 起源 生物名：マウス及びヒト 直接の起源 クローン:pUC−RVH−1220Ha 特徴：ヒトIL−6Rに対する再構成ヒトAUK12−20抗体の
Ｈ鎖Ｖ領域バージョン「ａ」及びそれをコードする遺伝
子。 アミノ酸 −19−−1:leader アミノ酸 １−30:FR1 アミノ酸 31−35:CDR1 アミノ酸 36−49:FR2 アミノ酸 50−66:CDR2 アミノ酸 67−98:FR3 アミノ酸 99−105:CDR3 アミノ酸 109−116:FR4 ヌクレオチド １−6:Hind III部位 ヌクレオチド 427−433:BamH I部位 配列 配列番号:95 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:96 配列の長さ:27 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:97 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列 配列番号:98 配列の長さ:30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成DNA 配列
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
//(Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(72)発明者 ジョーンズ，スティーブン タレン
イギリス国，ハートフォードシャイヤー
ダブリュディー７ ８エイチエー，ラ
ッドレット，ザ クローズ 10
(72)発明者 サルダナ，ホセ ウィリアム
イギリス国，ミドルセックス イーエヌ
１ １ティーイー，エンフィールド，リ
ンカーン ウェイ 22
(56)参考文献 欧州特許出願公開2413908（ＥＰ，Ａ
１)
欧州特許出願公開2409607（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/02
C07K 16/28
C07K 16/46
C12P 21/08
G01N 33/531
ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤ
ＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (47)
- 【請求項１】次の構造： FR11−CDR11−FR21−CDR21−FR31−CDR31−FR41 〔式中、CDR11,CDR21及びCDR31は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（２））： を有する３個の相補性決定領域（CDR1）の１組を表わ
し；そして FR11,FR21,FR31及びFR41は、ヒトサブグループＩ抗体
（HSG I）のライト（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域由来の４個
のフレームワーク領域（FR1）の１組、あるいは前記フ
レームワーク領域中で１又は数個のアミノ酸の欠失、付
加及び／又は置換により修飾されており且つフレームワ
ーク領域の機能を有するフレームワーク領域の１組を表
わす〕 を有する、ヒトインターロイキン−６（IL−６）レセプ
ターに対するＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２】次の構造： FR11−CDR11−FR21−CDR21−FR31−CDR31−FR41 〔式中、CDR11,CDR21及びCDR31は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（２））： を有する３個の相補性決定領域（CDR1）の１組を表わ
し；そして FR11,FR21,FR31及びFR41は、ヒトサブグループＩ抗体
（HSG I）のライト（Ｌ）鎖可変（Ｖ）領域由来の４個
のフレームワーク領域（FR1）の１組、あるいは前記フ
レームワーク領域中で１又は数個のアミノ酸の欠失、付
加及び／又は置換により修飾されており且つフレームワ
ーク領域の機能を有するフレームワーク領域の１組を表
わす〕 を有し、且つ； 前記のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖と配列番号:56に示
すアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖と
から構成される再構成ヒト抗体が、前記SEQ（２）の配
列を有するマウスモノクローナル抗体と同等の、ヒトイ
ンターロイキン−６レセプターに対する結合能を有する
ことを特徴とするヒトインターロイキン−６（IL−６）
レセプターに対するＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項３】前記HSG IがREI抗体である、請求項１又は
２に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項４】前記REI抗体中のFR11,FR21,FR31及びFR41
が、下記SEQ（５）として表わされる１組のアミノ酸配
列： あるいは上記アミノ酸配列SEQ（５）に対して１又は数
個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾さ
れており（但し、FR31配列の15番目のPheがTyrにより置
換されることはない）且つフレームワーク領域の機能を
有しているアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいず
れか１項に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項５】配列番号:57に示すアミノ酸配列を有す
る、請求項１に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項６】（１）請求項１〜５のいずれか１項に記載
のヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖Ｖ領域；並
びに （２）ヒト抗体由来の定常（Ｃ）領域； を有するヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖。 - 【請求項７】前記Ｃ領域がＣκである、請求項６に記載
のＬ鎖。 - 【請求項８】次の構造： FR12−CDR12−FR22−CDR22−FR32−CDR32−FR42 〔式中、CDR12,CDR22及びCDR32は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（９））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR12,FR22,FR32及びFR42はヒトサブグループII抗体（HS
G II）のヘビー（Ｈ）鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワ
ーク領域（FR2）の１組、あるいは前記フレームワーク
領域中で１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は
置換により修飾されており且つフレームワーク領域の機
能を有するフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有する、ヒトIL−６レセプターに対するＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項９】次の構造： FR12−CDR12−FR22−CDR22−FR32−CDR32−FR42 〔式中、CDR12,CDR22及びCDR32は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（９））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR12,FR22,FR32及びFR42はヒトサブグループII抗体（HS
G II）のヘビー（Ｈ）鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワ
ーク領域（FR2）の１組、あるいは前記フレームワーク
領域中で１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は
置換により修飾されており且つフレームワーク領域の機
能を有するフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有し、且つ； 前記のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖と配列番号:57に示
すアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖と
から構成される再構成ヒト抗体が、前記SEQ（９）の配
列を有するマウスモノクローナル抗体と同等の、ヒトイ
ンターロイキン−６レセプターに対する結合能を有する
ことを特徴とするヒトIL−６レセプターに対するＨ鎖Ｖ
領域。 - 【請求項１０】前記HSG IIがNEW抗体である、請求項８
又は９に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項１１】前記NEW抗体中のFR12,FR22,FR32及びFR4
2が、SEQ（12）〜SEQ（17）のいずれか１つとして表わ
される１組のアミノ酸配列： あるいは、上記アミノ酸配列SEQ（12）〜SEQ（17）のい
ずれかにおいて１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／
又は置換により修飾されており且つフレームワーク領域
としての機能を維持しているアミノ酸配列を有する、請
求項８〜10のいずれか１項に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項１２】配列番号:56に示すアミノ酸配列を有す
る、請求項11に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項１３】（１）請求項８〜12のいずれか１項に記
載のヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖Ｖ領域；
並びに （２）ヒト抗体由来のＣ領域； を有するヒトIL−６レセプターに対する抗体のＨ鎖。 - 【請求項１４】前記Ｃ領域がＣγである、請求項13に記
載のＨ鎖。 - 【請求項１５】（Ａ）請求項６又は７に記載のヒトIL−
６レセプターに対する抗体のＬ鎖；並びに （Ｂ）請求項13又は14に記載のヒトIL−６レセプターに
対する抗体のＨ鎖； を有する、ヒトIL−６レセプターに対する再構成ヒト抗
体。 - 【請求項１６】次の構造： FR13−CDR13−FR23−CDR23−FR33−CDR33−FR43 〔式中、CDR13,CDR23及びCDR33は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（１））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR13,FR23,FR33及びFR43は、ヒトサブグループＩ抗体
（HSG I）のＬ鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワーク領
域（FR3）の１組、あるいは前記フレームワーク領域中
で１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換に
より修飾されており且つフレームワーク領域の機能を有
するフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有する、ヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖Ｖ
領域。 - 【請求項１７】次の構造： FR13−CDR13−FR23−CDR23−FR33−CDR33−FR43 〔式中、CDR13,CDR23及びCDR33は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（１））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR13,FR23,FR33及びFR43は、ヒトサブグループＩ抗体
（HSG I）のＬ鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワーク領
域（FR3）の１組、あるいは前記フレームワーク領域中
で１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換に
より修飾されており且つフレームワーク領域の機能を有
するフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有し、且つ； 前記のＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖と配列番号:84また
は85に示すアミノ酸配列を有するＨ鎖Ｖ領域を含んで成
るＨ鎖とから構成される再構成ヒト抗体が、前記SEQ
（１）の配列を有するマウスモノクローナル抗体と同等
の、ヒトインターロイキン−６レセプターに対する結合
能を有することを特徴とするヒトIL−６レセプターに対
するＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項１８】前記HSG IがREI抗体である、請求項16又
は17に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項１９】前記REI抗体中のFR13,FR23,FR33及びFR4
3が、SEQ（７）として表わされる１組のアミノ酸配列： あるいは上記アミノ酸配列SEQ（７）において１又は数
個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換により修飾さ
れており且つフレームワーク領域としての機能を維持し
ているアミノ酸配列を有する、請求項16〜18のいずれか
１項に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２０】配列番号:71により表わされるアミノ酸
配列を有する、請求項16に記載のＬ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２１】（１）請求項16〜20のいずれか１項に記
載のヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖Ｖ領域；
並びに （２）ヒト抗体由来のＣ領域； を有する、ヒトIL−６レセプターに対する抗体のＬ鎖。 - 【請求項２２】前記Ｃ領域がＣκである、請求項21に記
載のＬ鎖。 - 【請求項２３】次の構造： FR14−CDR14−FR24−CDR24−FR34−CDR34−FR44 〔式中、CDR14,CDR24及びCDR34は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（８））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR14,FR24,FR34及びFR44は、ヒトサブグループＩ（抗体
HSG I）のＨ鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワーク領域
（FR4）の１組、あるいは前記フレームワーク領域中で
１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換によ
り修飾されており且つフレームワーク領域の機能を有す
るフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有する、ヒトIL−６レセプターに対する抗体のＨ鎖Ｖ
領域。 - 【請求項２４】次の構造： FR14−CDR14−FR24−CDR24−FR34−CDR34−FR44 〔式中、CDR14,CDR24及びCDR34は、次の１組のアミノ酸
配列（SEQ（８））： を有する３個の相補性決定領域の１組を表わし；そして FR14,FR24,FR34及びFR44は、ヒトサブグループＩ抗体
（HSG I）のＨ鎖Ｖ領域由来の４個のフレームワーク領
域（FR4）の１組、あるいは前記フレームワーク領域中
で１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は置換に
より修飾されており且つフレームワーク領域の機能を有
するフレームワーク領域の１組を表わす〕 を有し、且つ； 前記のＨ鎖Ｖ領域を含んで成るＨ鎖と配列番号:71に示
すアミノ酸配列を有するＬ鎖Ｖ領域を含んで成るＬ鎖と
から構成される再構成ヒト抗体が、前記SEQ（８）の配
列を有するマウスモノクローナル抗体と同等の、ヒトイ
ンターロイキン−６レセプターに対する結合能を有する
ことを特徴とするヒトIL−６レセプターに対するＨ鎖Ｖ
領域。 - 【請求項２５】前記HSG Iが425抗体である、請求項23又
は24に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２６】前記HSG IがHAX抗体である、請求項23又
は24に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２７】前記425抗体中のFR14,FR24,FR34及びFR4
4が、SEQ（18）〜SEQ（21）のいずれか１つにより表わ
される１組のアミノ酸配列： あるいは上記アミノ酸配列SEQ（18）〜SEQ（21）のいず
れかに対して１又は数個のアミノ酸の欠失、付加及び／
又は置換により修飾されており且つフレームワーク領域
の機能を維持しているアミノ酸配列を有する、請求項23
〜25のいずれか１項に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２８】前記HAX抗体中のFR14,FR24,FR34及びFR4
4が、下記SEQ（22）〜SEQ（25）のいずれか１つとして
表わされる１組のアミノ酸配列： あるいは上記アミノ酸配列SEQ（22）〜SEQ（25）のいず
れかに対して１〜数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又
は置換により修飾されており且つフレームワーク領域と
しての機能を維持しているアミノ酸配列を有する、請求
項23,24又は26のいずれか１項に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項２９】配列番号:84に示すアミノ酸配列を有す
る、請求項23に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項３０】配列番号:85に示すアミノ酸配列を有す
る、請求項23に記載のＨ鎖Ｖ領域。 - 【請求項３１】（１）請求項26〜30のいずれか１項に記
載のヒトIL−６レセプターに対する抗体のＨ鎖Ｖ領域；
並びに （２）ヒト抗体由来のＣ領域； を有する、ヒトIL−６レセプターに対する抗体のＨ鎖。 - 【請求項３２】前記Ｃ領域がＣγである、請求項31に記
載のＨ鎖。 - 【請求項３３】（Ａ）請求項21又は22に記載のヒトIL−
６レセプターに対する抗体のＬ鎖；並びに （Ｂ）請求項31又は32に記載のヒトIL−６レセプターに
対する抗体のＨ鎖； を有する、ヒトIL−６レセプターに対する再構成ヒト抗
体。 - 【請求項３４】請求項１〜５及び16〜20のいずれか１項
に記載のＬ鎖Ｖ領域をコードするDNA。 - 【請求項３５】請求項6,7,21又は22に記載のＬ鎖をコー
ドするDNA。 - 【請求項３６】請求項８〜12及び23〜30のいずれか１項
に記載のＨ鎖Ｖ領域をコードするDNA。 - 【請求項３７】請求項13,14,31又は32のいずれか１項に
記載のＨ鎖をコードするDNA。 - 【請求項３８】請求項34に記載のDNAを含んで成るベク
ター。 - 【請求項３９】請求項35に記載のDNAを含んで成るベク
ター。 - 【請求項４０】請求項36に記載のDNAを含んで成るベク
ター。 - 【請求項４１】請求項37に記載のDNAを含んで成るベク
ター。 - 【請求項４２】請求項35に記載のDNAと、請求項37に記
載のDNAとを含んで成るベクター。 - 【請求項４３】請求項39に記載のベクターと、請求項41
に記載のベクターとにより形質転換された宿主細胞。 - 【請求項４４】請求項42に記載のベクターにより形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項４５】ヒトIL−６レセプターに対する再構成ヒ
ト抗体の製造方法であって、 請求項43又は44に記載の宿主細胞を培養し；そして 再構成ヒト抗体を採取する； ことを含んで成る方法。 - 【請求項４６】請求項15又は33に記載の再構成ヒト抗体
を含んで成るヒトインターロイキン−６レセプター検出
又は測定用試薬。 - 【請求項４７】請求項15又は33に記載の再構成ヒト抗体
を用いることを特徴とするヒトインターロイキン−６レ
セプターの検出又は測定方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3-95476 | 1991-04-25 | ||
| JP3095476A JPH05236966A (ja) | 1991-04-25 | 1991-04-25 | ヒトインターロイキン−６レセプターに対するマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードするｄｎａ |
| JP4032084A JPH05227970A (ja) | 1992-02-19 | 1992-02-19 | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 |
| JP4-32084 | 1992-02-19 | ||
| PCT/JP1992/000544 WO1992019759A1 (en) | 1991-04-25 | 1992-04-24 | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33828699A Division JP3176598B2 (ja) | 1991-04-25 | 1999-11-29 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3370324B2 true JP3370324B2 (ja) | 2003-01-27 |
Family
ID=26370596
Family Applications (6)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50889892A Expired - Lifetime JP3370324B2 (ja) | 1991-04-25 | 1992-04-24 | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 |
| JP33828699A Expired - Lifetime JP3176598B2 (ja) | 1991-04-25 | 1999-11-29 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2000229748A Expired - Lifetime JP3913965B2 (ja) | 1991-04-25 | 2000-07-28 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2003347675A Expired - Lifetime JP3616087B2 (ja) | 1991-04-25 | 2003-10-06 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2006338832A Withdrawn JP2007082560A (ja) | 1991-04-25 | 2006-12-15 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2007255248A Pending JP2008073049A (ja) | 1991-04-25 | 2007-09-28 | ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を産生するハイブリドーマ |
Family Applications After (5)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33828699A Expired - Lifetime JP3176598B2 (ja) | 1991-04-25 | 1999-11-29 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2000229748A Expired - Lifetime JP3913965B2 (ja) | 1991-04-25 | 2000-07-28 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2003347675A Expired - Lifetime JP3616087B2 (ja) | 1991-04-25 | 2003-10-06 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2006338832A Withdrawn JP2007082560A (ja) | 1991-04-25 | 2006-12-15 | ヒトインターロイキン−６受容体に対するキメラ抗体 |
| JP2007255248A Pending JP2008073049A (ja) | 1991-04-25 | 2007-09-28 | ヒトインターロイキン−６受容体に対する抗体を産生するハイブリドーマ |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5795965A (ja) |
| EP (1) | EP0628639B1 (ja) |
| JP (6) | JP3370324B2 (ja) |
| KR (1) | KR100249937B1 (ja) |
| AT (1) | ATE181575T1 (ja) |
| AU (2) | AU668349B2 (ja) |
| DE (2) | DE69229482T2 (ja) |
| DK (1) | DK0628639T3 (ja) |
| ES (1) | ES2134212T3 (ja) |
| GR (1) | GR3031174T3 (ja) |
| HU (1) | HU218140B (ja) |
| LU (1) | LU91556I2 (ja) |
| NL (1) | NL300383I2 (ja) |
| RU (1) | RU2139351C1 (ja) |
| TW (1) | TW205553B (ja) |
| WO (1) | WO1992019759A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021211006A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Federal State Budgetary Institution Center Of Biomedical Technologies Of Federal Medical And Biological Agency | Inhaled hexapeptide for treating interleukin-6 related respiratory diseases |
| WO2022005321A1 (en) | 2020-06-29 | 2022-01-06 | Federal State Budgetary Institution Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency | Inhaled tocilizumab for treating interleukin-6 related respiratory diseases |
Families Citing this family (328)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995006119A1 (en) * | 1993-08-24 | 1995-03-02 | Scotgen Limited | Recombinant humanized anti-human immunodeficiency virus antibody |
| US5472693A (en) * | 1993-02-16 | 1995-12-05 | The Dow Chemical Company | Family of anti-carcinoembryonic antigen chimeric antibodies |
| AU6808194A (en) * | 1993-05-31 | 1994-12-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstructed human antibody against human interleukin-6 |
| US5914110A (en) * | 1993-09-07 | 1999-06-22 | Smithkline Beecham Corporation | Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders |
| AU7949394A (en) | 1993-11-19 | 1995-06-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human medulloblastomatous cell |
| WO1995029690A1 (en) * | 1994-04-29 | 1995-11-09 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Biologically active peptides and methods of identifying the same |
| US8017121B2 (en) | 1994-06-30 | 2011-09-13 | Chugai Seiyaku Kabushika Kaisha | Chronic rheumatoid arthritis therapy containing IL-6 antagonist as effective component |
| ES2384222T3 (es) | 1994-10-07 | 2012-07-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Inhibición del crecimiento anómalo de células sinoviales utilizando un antagonista de IL-6 como principio activo |
| CN100350973C (zh) * | 1994-10-21 | 2007-11-28 | 岸本忠三 | 用于治疗il－6产生所致疾病的药物组合物 |
| CA2211578C (en) * | 1995-02-13 | 2010-09-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Muscle protein proteolysis inhibiting agent containing il-6 receptor antibody |
| PT923941E (pt) | 1996-06-27 | 2006-09-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Medicamentos para mieloma a serem utilizados com agentes antitumorais de mostarda nitrogenada |
| HUP9904177A3 (en) | 1996-09-26 | 2001-10-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibody against human parathormone related peptides |
| UA76934C2 (en) * | 1996-10-04 | 2006-10-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Reconstructed human anti-hm 1.24 antibody, coding dna, vector, host cell, method for production of reconstructed human antibody, pharmaceutical composition and drug for treating myeloma containing reconstructed human anti-hm 1.24 antibody |
| DE69830492T2 (de) | 1997-02-12 | 2006-03-16 | Chugai Seiyaku K.K. | Antikörper als ARZNEIMITTEL GEGEN LYMPHOCYTISCHE TUMORE (AUSSCHLIESSLICH MYELOME) |
| ATE547119T1 (de) | 1997-03-21 | 2012-03-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Präventives oder therapeutisches mittel mit einem il-6-antagonisten als wirkstoff für durch sensibilisierte t-zellen vermittelte erkrankungen |
| IL132896A0 (en) | 1997-05-15 | 2001-03-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Cachexia remedy |
| US20020187150A1 (en) * | 1997-08-15 | 2002-12-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventive and/or therapeutic agent for systemic lupus erythematosus comprising anti-IL-6 receptor antibody as an active ingredient |
| KR20010022846A (ko) * | 1997-08-15 | 2001-03-26 | 나가야마 오사무 | 항 인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로서 함유하는 전신성 홍반성 낭창의 예방 및/또는 치료제 |
| US6723319B1 (en) | 1998-03-17 | 2004-04-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of treating inflammatory intestinal diseases containing as the ingredient IL-6 receptors antibodies |
| ATE512225T1 (de) | 1998-04-03 | 2011-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Humanisierter antikörper gegen den menschlichen gewebefaktor (tf) und verfahren für die konstruktion eines solchen humanisierten antikörpers. |
| DE69934698T2 (de) | 1998-08-24 | 2007-10-04 | Chugai Seiyaku K.K. | Mittel zur vorbeugung oder behandlung von pankreatitis die anti-il-6 receptor antikörper als aktive komponente enthalten |
| BRPI9915679B8 (pt) | 1998-11-27 | 2021-05-25 | Darwin Discovery Ltd | composições e métodos para aumentar a mineralização óssea |
| US7696325B2 (en) | 1999-03-10 | 2010-04-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Polypeptide inducing apoptosis |
| AU7078200A (en) | 1999-08-27 | 2001-03-26 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Polypeptides, comprising il-6 ligand-binding receptor domains and related nucleic acids, antibodies, compositions, and methods of use |
| IL148980A0 (en) | 1999-10-01 | 2002-11-10 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | An antibody to human tissue factor and experimental animals having inserted cells with the gene encoding human tissue factor |
| GB0002666D0 (en) | 2000-02-04 | 2000-03-29 | Univ London | Blockade of voltage dependent sodium channels |
| ATE420661T1 (de) | 2000-04-28 | 2009-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Zellproliferation-inhibitoren |
| EP1314437B1 (en) | 2000-08-11 | 2014-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilized antibody-containing preparations |
| WO2002032374A2 (en) * | 2000-10-18 | 2002-04-25 | Immunex Corporation | Methods for treating il-18 mediated disorders |
| ATE391174T1 (de) | 2000-10-20 | 2008-04-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modifizierter tpo-agonisten antikörper |
| AU2002210918B2 (en) | 2000-10-20 | 2006-03-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Degraded agonist antibody |
| CN1308447C (zh) | 2000-10-20 | 2007-04-04 | 中外制药株式会社 | 低分子化的激动剂抗体 |
| DK1334731T3 (da) | 2000-10-25 | 2008-05-26 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Forebyggende eller terapeutisk middel mod psoriasis omfattende anti-IL-6-receptorantistof som aktiv bestanddel |
| WO2002036164A1 (fr) * | 2000-10-27 | 2002-05-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Agent abaissant le taux sanguin de vegf contenant un antagoniste de il-6 en tant que principe actif |
| AU2000279625A1 (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Blood mmp-3 level-lowering agent containing il-6 antgonist as the active ingredient |
| EP1364657B1 (en) | 2001-02-07 | 2016-12-28 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedies for myelocytic leukemia |
| AU2002322478A1 (en) * | 2001-03-02 | 2002-12-16 | Medimmune, Inc. | Methods of administering/dosing cd2 antagonists for the prevention and treatment of autoimmune disorders or inflammatory disorders |
| EP3088412B1 (en) | 2001-03-09 | 2021-05-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Protein purification method |
| UA80091C2 (en) | 2001-04-02 | 2007-08-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Remedies for infant chronic arthritis-relating diseases and still's disease which contain an interleukin-6 (il-6) antagonist |
| WO2002086492A1 (fr) | 2001-04-17 | 2002-10-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Procede de quantification de tensioactif |
| US20100056762A1 (en) * | 2001-05-11 | 2010-03-04 | Old Lloyd J | Specific binding proteins and uses thereof |
| US7589180B2 (en) * | 2001-05-11 | 2009-09-15 | Abbott Laboratories Inc. | Specific binding proteins and uses thereof |
| SI1475101T1 (sl) | 2002-02-14 | 2011-03-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Farmacevtski proizvodi iz raztopine, ki vsebuje protitelo |
| GB0208041D0 (en) * | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
| EP1498137A1 (en) * | 2002-04-25 | 2005-01-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Remedy for lung cancer |
| EP1513879B1 (en) * | 2002-06-03 | 2018-08-22 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
| EP1541165A4 (en) | 2002-08-27 | 2009-06-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION |
| AU2002338020A1 (en) | 2002-09-04 | 2004-03-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3 |
| CN100522989C (zh) | 2002-09-11 | 2009-08-05 | 中外制药株式会社 | 纯化蛋白质的方法 |
| MXPA05008713A (es) * | 2003-02-24 | 2005-09-20 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agente terapeutico para dano de medula espinal que comprende antagonista de interluceina-6. |
| JP2004279086A (ja) | 2003-03-13 | 2004-10-07 | Konica Minolta Holdings Inc | 放射線画像変換パネル及び放射線画像変換パネルの製造方法 |
| GB2401040A (en) | 2003-04-28 | 2004-11-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for treating interleukin-6 related diseases |
| RS20050934A (en) * | 2003-06-16 | 2008-04-04 | Celltech R. & D. Inc., | Antibodies specific for sclerostin and methods fo r increasing bone mineralization |
| TW200510532A (en) | 2003-07-15 | 2005-03-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | IgM production by transformed cell and method of quantifying the same |
| SI1690550T1 (sl) | 2003-10-17 | 2012-12-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Terapevtska sredstva za mezoteliom |
| US8298816B2 (en) | 2003-12-03 | 2012-10-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Expression systems using mammalian beta-actin promoter |
| US8617550B2 (en) | 2003-12-19 | 2013-12-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Treatment of vasculitis with IL-6 antagonist |
| AR048210A1 (es) | 2003-12-19 | 2006-04-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Un agente preventivo para la vasculitis. |
| BRPI0506679A (pt) * | 2004-02-11 | 2007-05-15 | Warner Lambert Co | métodos de tratar osteoartrite com antagonistas de il-6 |
| WO2005079479A2 (en) * | 2004-02-17 | 2005-09-01 | Absalus, Inc. | Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus |
| US7767792B2 (en) * | 2004-02-20 | 2010-08-03 | Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. | Antibodies to EGF receptor epitope peptides |
| AR048335A1 (es) * | 2004-03-24 | 2006-04-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agentes terapeuticos para trastornos del oido interno que contienen un antagonista de il- 6 como un ingrediente activo |
| EP3269738A1 (en) * | 2004-03-24 | 2018-01-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Subtypes of humanized antibody against interleukin-6 receptor |
| US7785903B2 (en) | 2004-04-09 | 2010-08-31 | Genentech, Inc. | Variable domain library and uses |
| GB0410627D0 (en) * | 2004-05-12 | 2004-06-16 | Scancell Ltd | Specific binding members |
| WO2006046661A1 (ja) * | 2004-10-28 | 2006-05-04 | Osaka University | インターロイキン－６阻害剤 |
| EP1835022B1 (en) | 2005-01-05 | 2015-02-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell culture method and utilization of the same |
| KR20070108270A (ko) * | 2005-02-28 | 2007-11-08 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 술폰아미드 화합물의 신규 병용 |
| EP1870459B1 (en) | 2005-03-31 | 2016-06-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association |
| EP1870458B1 (en) | 2005-03-31 | 2018-05-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | sc(Fv)2 STRUCTURAL ISOMERS |
| JO3058B1 (ar) * | 2005-04-29 | 2017-03-15 | Applied Molecular Evolution Inc | الاجسام المضادة لمضادات -اي ال-6,تركيباتها طرقها واستعمالاتها |
| US7592429B2 (en) | 2005-05-03 | 2009-09-22 | Ucb Sa | Sclerostin-binding antibody |
| US8003108B2 (en) | 2005-05-03 | 2011-08-23 | Amgen Inc. | Sclerostin epitopes |
| US9074189B2 (en) | 2005-06-08 | 2015-07-07 | Janssen Biotech, Inc. | Cellular therapy for ocular degeneration |
| CA2610987C (en) | 2005-06-10 | 2013-09-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stabilizer for protein preparation comprising meglumine and use thereof |
| CN101262885B (zh) | 2005-06-10 | 2015-04-01 | 中外制药株式会社 | 含有sc(Fv)2的药物组合物 |
| NZ595386A (en) * | 2005-08-11 | 2013-08-30 | Arpi Matossian Rogers | Peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease |
| CA2625773C (en) | 2005-10-14 | 2015-05-12 | Fukuoka University | Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation |
| KR101239051B1 (ko) | 2005-10-21 | 2013-03-04 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 심장질환 치료제 |
| EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
| EP1964574B1 (en) | 2005-11-14 | 2016-09-07 | Cellmid Limited | Method for treatment or prevention of disease associated with functional disorder of regulatory t cell |
| AR057582A1 (es) | 2005-11-15 | 2007-12-05 | Nat Hospital Organization | Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos |
| EP1967209B1 (en) | 2005-11-25 | 2012-06-06 | Keio University | Therapeutic agent for prostate cancer |
| EP1977763A4 (en) | 2005-12-28 | 2010-06-02 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | STABILIZER PREPARATION CONTAINING ANTIBODIES |
| AU2007208678B2 (en) | 2006-01-27 | 2013-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agents for diseases involving choroidal neovascularization |
| WO2007108505A1 (ja) | 2006-03-22 | 2007-09-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | エリスロポエチン溶液製剤 |
| DK2009101T3 (en) | 2006-03-31 | 2018-01-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antibody modification method for purification of a bispecific antibody |
| DK2006381T3 (en) | 2006-03-31 | 2016-02-22 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | PROCEDURE FOR REGULATING ANTIBODIES BLOOD PHARMACOKINETICS |
| US9260516B2 (en) * | 2006-04-07 | 2016-02-16 | Osaka University | Method for promoting muscle regeneration by administering an antibody to the IL-6 receptor |
| US8741643B2 (en) | 2006-04-28 | 2014-06-03 | Lifescan, Inc. | Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage |
| TWI422387B (zh) * | 2006-05-25 | 2014-01-11 | Glaxo Group Ltd | 免疫球蛋白 |
| MY159787A (en) | 2006-06-02 | 2017-01-31 | Regeneron Pharma | High affinity antibodies to human il-6 receptor |
| US8080248B2 (en) | 2006-06-02 | 2011-12-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating rheumatoid arthritis with an IL-6R antibody |
| EP2032166B1 (en) | 2006-06-13 | 2013-04-10 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating cancer |
| KR101351208B1 (ko) | 2006-06-21 | 2014-01-14 | 온코세라피 사이언스 가부시키가이샤 | Ｆｚｄ10에 대한 종양-표적화 모노클로날 항체 및 이의 용도 |
| AU2007285695B2 (en) | 2006-08-18 | 2012-05-24 | Ablynx N.V. | Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling |
| WO2008042611A2 (en) * | 2006-09-29 | 2008-04-10 | Centocor, Inc. | Method of using il6 antagonists with mitoxantrone for prostate cancer |
| EP2123302B1 (en) | 2007-01-23 | 2015-12-09 | Shinshu University | Il-6 inhibitors to treat chronic rejection |
| AU2008209482B2 (en) | 2007-01-24 | 2014-05-01 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating cancer |
| CN104013956B (zh) | 2007-01-25 | 2018-12-18 | 达娜-法勃肿瘤研究所公司 | 抗egfr抗体在治疗egfr突变体介导的疾病中的用途 |
| CL2008000719A1 (es) | 2007-03-12 | 2008-09-05 | Univ Tokushima Chugai Seiyaku | Agente terapeutico para cancer resistente a agentes quimioterapeuticos que comprende un anticuerpo que reconoce hla de clase i como ingrediente activo; composicion farmaceutica que comprende dicho anticuerpo; y metodo para tratar cancer resistente a |
| US8404235B2 (en) * | 2007-05-21 | 2013-03-26 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US7906117B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-03-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat cachexia, weakness, fatigue, and/or fever |
| US8062864B2 (en) | 2007-05-21 | 2011-11-22 | Alderbio Holdings Llc | Nucleic acids encoding antibodies to IL-6, and recombinant production of anti-IL-6 antibodies |
| LT2164514T (lt) | 2007-05-21 | 2017-03-10 | Alderbio Holdings Llc | Il-6 antikūnai ir jų naudojimas |
| US8252286B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-08-28 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US20090238825A1 (en) * | 2007-05-21 | 2009-09-24 | Kovacevich Brian R | Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies |
| US9701747B2 (en) | 2007-05-21 | 2017-07-11 | Alderbio Holdings Llc | Method of improving patient survivability and quality of life by anti-IL-6 antibody administration |
| US8178101B2 (en) | 2007-05-21 | 2012-05-15 | Alderbio Holdings Inc. | Use of anti-IL-6 antibodies having specific binding properties to treat cachexia |
| WO2008144757A1 (en) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Novel rabbit antibody humanization methods and humanized rabbit antibodies |
| JP5142265B2 (ja) * | 2007-05-28 | 2013-02-13 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 抗モータリン抗体のパラトープ及びエピトープ |
| US9080145B2 (en) | 2007-07-01 | 2015-07-14 | Lifescan Corporation | Single pluripotent stem cell culture |
| JP5424330B2 (ja) * | 2007-07-26 | 2014-02-26 | 国立大学法人大阪大学 | インターロイキン６受容体阻害剤を有効成分とする眼炎症疾患治療剤 |
| KR101617243B1 (ko) | 2007-07-31 | 2016-05-02 | 라이프스캔, 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
| CA2696360C (en) | 2007-08-14 | 2018-11-20 | Ludwig Institute For Cancer Research | Monoclonal antibody targeting the egfr receptor and uses thereof |
| CL2008002775A1 (es) | 2007-09-17 | 2008-11-07 | Amgen Inc | Uso de un agente de unión a esclerostina para inhibir la resorción ósea. |
| HUE029635T2 (en) * | 2007-09-26 | 2017-03-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | A method for modifying an isoelectric point of an antibody by amino acid substitution in CDR |
| CN101939425B (zh) | 2007-09-26 | 2014-05-14 | 中外制药株式会社 | 抗il-6受体抗体 |
| SG193868A1 (en) | 2007-09-26 | 2013-10-30 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Modified antibody constant region |
| BRPI0817482B8 (pt) | 2007-10-02 | 2021-05-25 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | uso de um anticorpo do receptor da interleucina-6 (il-6) no tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro (gvhd) |
| BRPI0818674B1 (pt) * | 2007-10-15 | 2023-01-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Métodos para produção de um anticorpo inteiro ou de um fragmento do mesmo e para preparação de fármacos, bem como vetor recombinante |
| EP2229434B1 (en) | 2007-11-27 | 2011-09-07 | Lifescan, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells |
| KR101643005B1 (ko) | 2007-12-05 | 2016-07-28 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용 |
| JPWO2009075344A1 (ja) | 2007-12-12 | 2011-04-28 | 独立行政法人国立がん研究センター | Ｍ−ｃｓｆ受容体を分子標的とするｍｌｌ白血病及びｍｏｚ白血病治療剤、およびその利用 |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| WO2009095489A2 (en) * | 2008-02-01 | 2009-08-06 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with il-6-mediated signalling |
| CN102046779A (zh) | 2008-02-21 | 2011-05-04 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 用于细胞粘附、培养和分离的方法、表面改性培养板和组合物 |
| DK2708559T3 (en) | 2008-04-11 | 2018-06-14 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules |
| US8623648B2 (en) | 2008-04-24 | 2014-01-07 | Janssen Biotech, Inc. | Treatment of pluripotent cells |
| EP2282769A4 (en) * | 2008-04-29 | 2012-04-25 | Abbott Lab | DUAL VARIABLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND ITS USES |
| MX2010012031A (es) | 2008-05-13 | 2011-01-20 | Novimmune Sa | Anticuerpos anti-il-6/il-6r y metodos de uso de los mismos. |
| EP2297209A4 (en) | 2008-06-03 | 2012-08-01 | Abbott Lab | IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF |
| JP5723769B2 (ja) | 2008-06-03 | 2015-05-27 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用 |
| TW201503898A (zh) | 2008-06-05 | 2015-02-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 神經浸潤抑制劑 |
| US8188235B2 (en) * | 2008-06-18 | 2012-05-29 | Pfizer Inc. | Antibodies to IL-6 and their uses |
| PL2310492T3 (pl) | 2008-06-30 | 2015-12-31 | Janssen Biotech Inc | Różnocowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych |
| EP2321422A4 (en) | 2008-07-08 | 2013-06-19 | Abbvie Inc | PROSTAGLANDINE E2 VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF |
| JP5560270B2 (ja) | 2008-07-08 | 2014-07-23 | オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | Ｎｏｔｃｈ結合剤およびアンタゴニストならびにその使用方法 |
| US9132189B2 (en) | 2008-07-08 | 2015-09-15 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Notch1 binding agents and methods of use thereof |
| TWI440469B (zh) * | 2008-09-26 | 2014-06-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Improved antibody molecules |
| AU2009308967C1 (en) | 2008-10-31 | 2017-04-20 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage |
| KR102025158B1 (ko) | 2008-10-31 | 2019-09-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 췌장 내분비 계통으로의 분화 |
| AU2009316583B2 (en) | 2008-11-20 | 2016-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | Methods and compositions for cell attachment and cultivation on planar substrates |
| MX356756B (es) | 2008-11-20 | 2018-06-11 | Centocor Ortho Biotech Inc | Células madre pluripotentes en microportadores. |
| US9212223B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-12-15 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to prevent or treat thrombosis |
| US8420089B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-04-16 | Alderbio Holdings Llc | Antagonists of IL-6 to raise albumin and/or lower CRP |
| US8323649B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-04 | Alderbio Holdings Llc | Antibodies to IL-6 and use thereof |
| US8992920B2 (en) | 2008-11-25 | 2015-03-31 | Alderbio Holdings Llc | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of arthritis |
| US8337847B2 (en) | 2008-11-25 | 2012-12-25 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating anemia using anti-IL-6 antibodies |
| US9452227B2 (en) * | 2008-11-25 | 2016-09-27 | Alderbio Holdings Llc | Methods of treating or diagnosing conditions associated with elevated IL-6 using anti-IL-6 antibodies or fragments |
| TWI682995B (zh) | 2009-03-19 | 2020-01-21 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗體恆定區域改變體 |
| JP5717624B2 (ja) | 2009-03-19 | 2015-05-13 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
| EP2417162A2 (en) | 2009-04-10 | 2012-02-15 | Ablynx N.V. | Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders |
| BRPI1013877A2 (pt) | 2009-04-10 | 2017-08-15 | Ablynx Nv | Sequências de aminoácidos melhoradas contra il-6r e polipeptídeos que compreendem os mesmos para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados com il-6r |
| US20110008766A1 (en) * | 2009-05-01 | 2011-01-13 | Abbott Laboratories | Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof |
| MA33405B1 (fr) | 2009-05-15 | 2012-07-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anticorps anti-axl |
| EP2456862A4 (en) | 2009-07-20 | 2013-02-27 | Janssen Biotech Inc | DIFFERENTIATION OF HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
| TWI523661B (zh) * | 2009-07-31 | 2016-03-01 | Shin Maeda | Anti-IL-6 receptor antibody in the manufacture of inhibitors of metastatic inhibition of lung cancer metastasis to the liver |
| TW201118166A (en) | 2009-09-24 | 2011-06-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | HLA class I-recognizing antibodies |
| WO2011037158A1 (ja) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
| WO2011047262A2 (en) * | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Abbott Laboratories | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| SI3202785T1 (sl) | 2009-10-26 | 2024-08-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Postopek za proizvodnjo glikoziliranega imunoglobulina |
| UY32979A (es) * | 2009-10-28 | 2011-02-28 | Abbott Lab | Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas |
| WO2011066369A2 (en) | 2009-11-24 | 2011-06-03 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Antagonists of il-6 to raise albumin and/or lower crp |
| US9775921B2 (en) | 2009-11-24 | 2017-10-03 | Alderbio Holdings Llc | Subcutaneously administrable composition containing anti-IL-6 antibody |
| CN102712902B (zh) | 2009-12-23 | 2019-01-08 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| CN102741395B (zh) | 2009-12-23 | 2016-03-16 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞的分化 |
| WO2011080796A1 (en) | 2009-12-28 | 2011-07-07 | Oncotherapy Science, Inc. | Anti-cdh3 antibodies and uses thereof |
| JO3417B1 (ar) | 2010-01-08 | 2019-10-20 | Regeneron Pharma | الصيغ المستقرة التي تحتوي على الأجسام المضادة لمضاد مستقبل( interleukin-6 (il-6r |
| ES2561102T3 (es) | 2010-01-13 | 2016-02-24 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Agentes de unión a Notch1 y procedimientos de uso de los mismos |
| TWI609698B (zh) | 2010-01-20 | 2018-01-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | 穩定化的含抗體溶液製劑 |
| RU2702198C2 (ru) | 2010-03-01 | 2019-10-04 | Янссен Байотек, Инк. | Способы очистки клеток, производных от плюрипотентных стволовых клеток |
| WO2011108714A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 中外製薬株式会社 | 抗体定常領域改変体 |
| WO2011108638A1 (ja) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | 大日本住友製薬株式会社 | 炎症性腸疾患用薬剤 |
| EP3372617B1 (en) | 2010-04-02 | 2024-07-24 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Binding fusion proteins, binding fusion protein-drug conjugates, xten-drug conjugates and methods of making and using same |
| WO2011128096A1 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| RU2587634C2 (ru) | 2010-05-12 | 2016-06-20 | Янссен Байотек, Инк. | Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека |
| DK3195880T3 (da) | 2010-05-14 | 2020-03-02 | Amgen Inc | Højkoncentrerede anti-sclerostin-antistofformuleringer |
| US20130149302A1 (en) | 2010-05-28 | 2013-06-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agents for pancreatic cancer |
| DK2578231T3 (da) | 2010-05-28 | 2022-12-12 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antitumor-t-celle-reaktionsforstærker |
| WO2011152503A1 (ja) | 2010-06-02 | 2011-12-08 | 大日本住友製薬株式会社 | 自己免疫疾患またはアレルギー疾患の治療剤 |
| CA2801107A1 (en) | 2010-06-07 | 2011-12-15 | F. Hoffman-La Roche Ag | Gene expression markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment |
| JO3330B1 (ar) * | 2010-06-10 | 2019-03-13 | Lilly Co Eli | الأجسام المضادة cgrp |
| JP2013537415A (ja) | 2010-08-03 | 2013-10-03 | アッヴィ・インコーポレイテッド | 二重可変ドメイン免疫グロブリンおよびその使用 |
| WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CA2809433A1 (en) | 2010-08-26 | 2012-03-01 | Abbvie Inc. | Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof |
| KR101851956B1 (ko) | 2010-08-31 | 2018-04-25 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 분화 |
| CA2821992A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| CA2815277A1 (en) * | 2010-10-29 | 2012-05-03 | Immunogen, Inc. | Novel egfr-binding molecules and immunoconjugates thereof |
| EA201390575A1 (ru) | 2010-10-29 | 2014-01-30 | Иммьюноджен, Инк. | Неантагонистические egfr-связывающие молекулы и их иммуноконъюгаты |
| WO2012064627A2 (en) | 2010-11-08 | 2012-05-18 | Genentech, Inc. | Subcutaneously administered anti-il-6 receptor antibody |
| RU2620071C2 (ru) | 2010-11-17 | 2017-05-22 | Чугаи Сеияку Кабушики Каиша | Мультиспецифическая связывающая антиген молекула, которая обладает альтернативной функцией к функции фактора свертывания крови viii |
| DK2643018T3 (da) | 2010-11-23 | 2021-01-18 | Vitaeris Inc | Anti-il-6-antistoffer til behandling af oral mucositis |
| TWI812066B (zh) | 2010-11-30 | 2023-08-11 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有鈣依存性的抗原結合能力之抗體 |
| WO2012101251A1 (en) | 2011-01-28 | 2012-08-02 | Sanofi | Human antibodies to pcsk9 for use in methods of treatment based on particular dosage regimens |
| KR20230005405A (ko) | 2011-02-25 | 2023-01-09 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체 |
| MX2013010011A (es) | 2011-03-01 | 2014-10-24 | Amgen Inc | Agentes de unión biespecífica. |
| MA35009B1 (fr) | 2011-03-25 | 2014-04-03 | Amgen Inc | Cristaux d'anticorps anti-sclérotine et formulations de ceux-ci |
| DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
| DK3006464T3 (en) | 2011-06-10 | 2018-09-17 | Canada Minister Nat Defence | ANTIRICIN ANTIBODIES AND APPLICATIONS THEREOF |
| US10400029B2 (en) | 2011-06-28 | 2019-09-03 | Inhibrx, Lp | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
| AU2012275287B2 (en) | 2011-06-28 | 2017-10-05 | Inhibrx, Inc. | Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof |
| US9574005B2 (en) | 2011-07-19 | 2017-02-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stable Protein-containing preparation containing argininamide or analogous compound thereof |
| AR087305A1 (es) | 2011-07-28 | 2014-03-12 | Regeneron Pharma | Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit |
| WO2013017656A1 (en) | 2011-08-02 | 2013-02-07 | Medizinische Universität Wien | Antagonists of ribonucleases for treating obesity |
| WO2013017691A1 (en) | 2011-08-04 | 2013-02-07 | Medizinische Universität Innsbruck | Cahgt1p inhibitors for use in the treatment of candidiasis |
| SI2739311T1 (en) | 2011-08-04 | 2018-07-31 | Amgen Inc. | Method for the treatment of bone defect defects |
| CN103889555B (zh) | 2011-09-01 | 2018-10-26 | 中外制药株式会社 | 通过超滤制备包含高度浓缩的抗体的组合物的方法 |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| EP2747782B1 (en) | 2011-09-23 | 2018-01-17 | Ablynx NV | Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling |
| TW201817744A (zh) | 2011-09-30 | 2018-05-16 | 日商中外製藥股份有限公司 | 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子 |
| DE102011083811A1 (de) * | 2011-09-30 | 2013-04-04 | Airbus Operations Gmbh | Sitzvorrichtung für ein Luft- oder Raumfahrzeug |
| EP3939996A1 (en) | 2011-09-30 | 2022-01-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities |
| EP3492109B1 (en) | 2011-10-03 | 2020-03-04 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| TWI589299B (zh) | 2011-10-11 | 2017-07-01 | 再生元醫藥公司 | 用於治療類風濕性關節炎之組成物及其使用方法 |
| WO2013059548A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Sanofi | Compositions and methods for treating cancer using jak2 inhibitor |
| CN109022465B (zh) | 2011-10-28 | 2022-04-29 | 特瓦制药澳大利亚私人有限公司 | 多肽构建体及其用途 |
| JO3370B1 (ar) | 2011-11-10 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6 |
| RU2014121820A (ru) | 2011-11-21 | 2015-12-27 | Иммьюноджен, Инк. | Способ лечения опухолей, устойчивых к анти-egfr терапиям, с помощью конъюгата антитела egfr с цитотоксическим средством |
| AU2011382454B2 (en) * | 2011-11-30 | 2017-02-23 | Abbvie Biotechnology Ltd | Vectors and host cells comprising a modified SV40 promoter for protein expression |
| SG11201403134PA (en) * | 2011-12-13 | 2014-07-30 | Nordic Nanovector As | Chimeric therapeutic anti - cd37 antibodie hh1 |
| JP2015501844A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
| KR102203056B1 (ko) | 2011-12-22 | 2021-01-14 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 인간 배아 줄기 세포의 단일 인슐린 호르몬 양성 세포로의 분화 |
| JP6363954B2 (ja) | 2011-12-28 | 2018-07-25 | アムジエン・インコーポレーテツド | 抗スクレロスチン抗体の使用による歯槽骨消失の治療方法 |
| US9120870B2 (en) | 2011-12-30 | 2015-09-01 | Abbvie Inc. | Dual specific binding proteins directed against IL-13 and IL-17 |
| EA030828B1 (ru) | 2012-03-15 | 2018-10-31 | Янссен Байотек, Инк. | Человеческие антитела к cd27, методы и применение |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| EP2833923A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS |
| WO2013156443A1 (en) | 2012-04-17 | 2013-10-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for the expression of polypeptides using modified nucleic acids |
| KR101510302B1 (ko) * | 2012-05-11 | 2015-04-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | Ｉｌ-６ 수용체를 표적으로 하는 항체가 생성되도록 미니서클 벡터를 통해 형질전환된 줄기세포 치료제 |
| KR101510831B1 (ko) * | 2012-05-11 | 2015-04-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 항 ｉｌ-６ｒ 및 ｔｎｆｒ２을 포함하는 이중특이적 단백질을 발현하는 미니서클 벡터를 포함하는 줄기세포 치료제 |
| KR101510830B1 (ko) | 2012-05-11 | 2015-04-10 | 가톨릭대학교 산학협력단 | 생리활성 단백질을 발현하는 미니서클을 이용하여 형질전환된 줄기세포를 통한 치료법 |
| CN108034633B (zh) | 2012-06-08 | 2022-08-02 | 詹森生物科技公司 | 人胚胎干细胞向胰腺内分泌细胞的分化 |
| EP3626267A1 (en) | 2012-07-05 | 2020-03-25 | UCB Pharma, S.A. | Treatment for bone diseases |
| EP2896291B1 (en) | 2012-09-13 | 2019-03-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Gene knock-in non-human animal |
| US9487590B2 (en) | 2012-09-25 | 2016-11-08 | Cytomx Therapeutics, Inc. | Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof |
| BR112015009961B1 (pt) | 2012-11-01 | 2020-10-20 | Abbvie Inc. | proteína de ligação capaz de se ligar a dll4 e vegf, bem como composição que a compreende como composição que a compreende |
| UY35148A (es) | 2012-11-21 | 2014-05-30 | Amgen Inc | Immunoglobulinas heterodiméricas |
| LT2922554T (lt) | 2012-11-26 | 2022-06-27 | Modernatx, Inc. | Terminaliai modifikuota rnr |
| BR112015015714A2 (pt) | 2012-12-31 | 2017-07-11 | Janssen Biotech Inc | suspensão e aglomeração de células pluripotentes humanas para diferenciação em célu-las endócrinas pancreáticas |
| EP2938724B1 (en) | 2012-12-31 | 2020-10-28 | Janssen Biotech, Inc. | Culturing of human embryonic stem cells at the air-liquid interface for differentiation into pancreatic endocrine cells |
| AU2013368224B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-09-27 | Janssen Biotech, Inc. | Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cells using HB9 regulators |
| US10370644B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-08-06 | Janssen Biotech, Inc. | Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| WO2014144280A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST IL-1β AND / OR IL-17 |
| US11117975B2 (en) | 2013-04-29 | 2021-09-14 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antibodies and fusions to attenuated interferon alpha-2B |
| DK3677591T5 (da) | 2013-04-29 | 2024-08-26 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | Anti-CD38 antistoffer og fusioner til svækket interferon alpha-2b |
| JP6442404B2 (ja) | 2013-06-11 | 2018-12-19 | 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター | 再発寛解型多発性硬化症（ｒｒｍｓ）患者の治療予後予測方法、及び新規治療適応判断方法 |
| RU2674996C2 (ru) | 2013-07-04 | 2018-12-14 | Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг | Иммуноферментный анализ с подавлением интерференции для определения антител к лекарствам в образцах сыворотки |
| CA2925256C (en) | 2013-09-27 | 2023-08-15 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing polypeptide heteromultimer |
| WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
| EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| US9017678B1 (en) | 2014-07-15 | 2015-04-28 | Kymab Limited | Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R |
| DE202014010499U1 (de) | 2013-12-17 | 2015-10-20 | Kymab Limited | Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung |
| FI3088517T3 (fi) | 2013-12-26 | 2023-11-30 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | Ihmisen Anti-IL-33 neutraloiva monoklonaalinen vasta-aine |
| CA3233584A1 (en) | 2013-12-27 | 2015-07-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for purifying antibody having low isoelectric point |
| EP2898896A1 (en) | 2014-01-22 | 2015-07-29 | Université Pierre et Marie Curie (Paris 6) | Agents for use in the treatment of retinal inflammation |
| WO2015116852A1 (en) | 2014-01-29 | 2015-08-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating rheumatoid arthritis by administering an il-6r antibody |
| TWI684600B (zh) | 2014-03-21 | 2020-02-11 | 美商艾伯維有限公司 | 抗－ｅｇｆｒ抗體及抗體藥物結合物 |
| UA119352C2 (uk) | 2014-05-01 | 2019-06-10 | Тева Фармасьютикалз Острейліа Пті Лтд | Комбінація леналідоміду або помалідоміду і конструкції анти-cd38 антитіло-атенуйований інтерферон альфа-2b та спосіб лікування суб'єкта, який має cd38-експресуючу пухлину |
| EP3143127B1 (en) | 2014-05-16 | 2021-07-14 | Janssen Biotech, Inc. | Use of small molecules to enhance mafa expression in pancreatic endocrine cells |
| US20170362304A1 (en) | 2014-08-20 | 2017-12-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for measuring viscosity of protein solution |
| MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
| EP3209327A1 (en) | 2014-10-21 | 2017-08-30 | Ablynx N.V. | Treatment of il-6r related diseases |
| PE20170908A1 (es) | 2014-10-29 | 2017-07-12 | Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd | VARIANTES DE INTERFERON a2b |
| WO2016094881A2 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Abbvie Inc. | Lrp-8 binding proteins |
| MA41142A (fr) | 2014-12-12 | 2017-10-17 | Amgen Inc | Anticorps anti-sclérostine et utilisation de ceux-ci pour traiter des affections osseuses en tant qu'élements du protocole de traitement |
| CA3008162A1 (en) | 2014-12-15 | 2016-06-23 | The Regents Of The University Of California | Bispecific or-gate chimeric antigen receptor responsive to cd19 and cd20 |
| US11384350B2 (en) | 2014-12-15 | 2022-07-12 | The Regents Of The University Of California | Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective T cell mediated killing |
| PL3233921T3 (pl) | 2014-12-19 | 2022-01-10 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Przeciwciała anty-c5 i sposoby ich stosowania |
| TWI779010B (zh) | 2014-12-19 | 2022-10-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 抗肌抑素之抗體、含變異Ｆｃ區域之多胜肽及使用方法 |
| EP3253778A1 (en) | 2015-02-05 | 2017-12-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Antibodies comprising an ion concentration dependent antigen-binding domain, fc region variants, il-8-binding antibodies, and uses therof |
| CN107249637A (zh) | 2015-02-27 | 2017-10-13 | 中外制药株式会社 | 用于治疗il‑6相关疾病的组合物 |
| AR104050A1 (es) | 2015-03-26 | 2017-06-21 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Proceso de producción con iones de cobre controlados |
| EP3279216A4 (en) | 2015-04-01 | 2019-06-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER |
| PL3299810T3 (pl) | 2015-05-19 | 2021-12-13 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Sposób określania zastosowania nowej terapii u pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (sm) |
| US11174317B2 (en) | 2015-06-04 | 2021-11-16 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Therapeutic agent for mental illness comprising IL-6 inhibitor as active ingredient |
| TW201710286A (zh) | 2015-06-15 | 2017-03-16 | 艾伯維有限公司 | 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白 |
| CN107922507B (zh) | 2015-08-18 | 2022-04-05 | 瑞泽恩制药公司 | 抗pcsk9抑制性抗体用来治疗接受脂蛋白单采的高脂血症患者 |
| CN108473583A (zh) | 2015-11-03 | 2018-08-31 | 赛诺菲生物技术公司 | 用于治疗葡萄膜炎和黄斑水肿的包含il6r抗体的组合物及其使用方法 |
| EP3394098A4 (en) | 2015-12-25 | 2019-11-13 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | ANTI-MYOSTATIN ANTIBODIES AND METHODS OF USE |
| EP3398965A4 (en) | 2015-12-28 | 2019-09-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR PROMOTING THE EFFICACY OF PURIFYING A POLYPEPTIDE CONTAINING AN FC REGION |
| WO2017147169A1 (en) | 2016-02-22 | 2017-08-31 | Ohio State Innovation Foundation | Chemoprevention using controlled-release formulations of anti-interleukin 6 agents, synthetic vitamin a analogues or metabolites, and estradiol metabolites |
| GB201604124D0 (en) | 2016-03-10 | 2016-04-27 | Ucb Biopharma Sprl | Pharmaceutical formulation |
| US11072666B2 (en) | 2016-03-14 | 2021-07-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy |
| MA45479A (fr) | 2016-04-14 | 2019-02-20 | Janssen Biotech Inc | Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen |
| KR102538749B1 (ko) | 2016-08-05 | 2023-06-01 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물 |
| AU2017319702A1 (en) | 2016-09-02 | 2019-04-11 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments |
| SG10201607778XA (en) | 2016-09-16 | 2018-04-27 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use |
| CN109862880A (zh) | 2016-09-27 | 2019-06-07 | 德国费森尤斯卡比有限公司 | 液体药物组合物 |
| KR102051177B1 (ko) * | 2016-10-19 | 2019-12-17 | 주식회사 엘지화학 | 전압 분배를 이용한 스위치 진단 장치 및 방법 |
| ES2882181T3 (es) | 2016-10-31 | 2021-12-01 | Fresenius Kabi Deutschland Gmbh | Composición farmacéutica líquida |
| WO2018156180A1 (en) | 2017-02-24 | 2018-08-30 | Kindred Biosciences, Inc. | Anti-il31 antibodies for veterinary use |
| EP3596175A4 (en) | 2017-03-17 | 2021-01-13 | The Ohio State Innovation Foundation | NANOPARTICLE FOR THE DELIVERY OF CHEMOPREVENTIVE AGENTS |
| US11851486B2 (en) | 2017-05-02 | 2023-12-26 | National Center Of Neurology And Psychiatry | Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils |
| CN107098969B (zh) * | 2017-06-28 | 2018-10-12 | 武汉波睿达生物科技有限公司 | 一种治疗hiv感染的嵌合抗原受体的重组基因构建及其应用 |
| IL272864B2 (en) | 2017-08-31 | 2024-03-01 | Mitsubishi Tanabe Pharma Corp | A therapeutic agent containing an IL-33 antagonist for the treatment of endometriosis |
| WO2019052457A1 (zh) | 2017-09-13 | 2019-03-21 | 江苏恒瑞医药股份有限公司 | Il-6r抗体、其抗原结合片段及医药用途 |
| JP7235249B2 (ja) | 2017-10-20 | 2023-03-08 | 学校法人兵庫医科大学 | 抗ｉｌ－６受容体抗体を含有する術後の癒着を抑制するための医薬組成物 |
| US20210363238A1 (en) | 2018-01-31 | 2021-11-25 | Motokazu Kato | Therapeutic agent for asthma containing il-6 inhibitor |
| CA3093729A1 (en) | 2018-03-15 | 2019-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use |
| SG11202008206TA (en) | 2018-03-30 | 2020-09-29 | Amgen Inc | C-terminal antibody variants |
| TWI840360B (zh) | 2018-05-21 | 2024-05-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | 密封於玻璃容器之凍結乾燥的製劑、套組、製造凍結乾燥製劑的方法、防止或減低凍結乾燥製劑的玻璃容器成霧的方法、及容器內面經過硫酸銨處理或ｖｉｓｔ處理之玻璃容器 |
| CN115636141A (zh) | 2018-05-28 | 2023-01-24 | 中外制药株式会社 | 填充喷嘴 |
| CN112955222A (zh) | 2018-08-29 | 2021-06-11 | 里珍纳龙药品有限公司 | 用于治疗患有类风湿性关节炎的个体的方法和组合物 |
| CN114206442A (zh) | 2019-01-31 | 2022-03-18 | 赛诺菲生物技术公司 | 用于治疗幼年特发性关节炎的抗il-6受体抗体 |
| BR112021017702A2 (pt) | 2019-03-29 | 2021-11-16 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Inibidor contendo anticorpo anti-receptor de il-6 para inibição de deterioração da função bhe |
| WO2020201362A2 (en) | 2019-04-02 | 2020-10-08 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods of predicting and preventing cancer in patients having premalignant lesions |
| TW202104244A (zh) | 2019-04-10 | 2021-02-01 | 日商中外製藥股份有限公司 | Fc區域改變抗體的純化方法 |
| KR20220019670A (ko) | 2019-04-17 | 2022-02-17 | 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠 | Il-6 저해제 및 ccr2 저해제를 조합하여 투여하는 것을 특징으로 하는 비뇨기암의 치료제 |
| WO2020257586A2 (en) | 2019-06-20 | 2020-12-24 | Baxalta Incorporated | Method of treatment with viral-based gene therapy |
| CN110483640B (zh) * | 2019-07-16 | 2020-05-01 | 北京汇智和源生物技术有限公司 | 白介素-6r的人源化单克隆抗体、其编码基因及应用 |
| MX2022010957A (es) | 2020-03-03 | 2023-01-24 | Twentyeight Seven Inc | Compuestos que se dirigen a las proteínas de unión al arn o a las proteínas modificadoras del arn. |
| WO2021194860A1 (en) | 2020-03-23 | 2021-09-30 | Genentech, Inc. | Tocilizumab and remdesivir combination therapy for covid-19 pneumonia |
| JP2023518814A (ja) | 2020-03-23 | 2023-05-08 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｃｏｖｉｄ－１９肺炎における、ｉｌ－６アンタゴニストに対する応答を予測するためのバイオマーカー |
| JP2023518815A (ja) | 2020-03-23 | 2023-05-08 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | Ｉｌ６アンタゴニストによるｃｏｖｉｄ－１９肺炎を含む肺炎の治療方法 |
| JP2023520249A (ja) | 2020-05-15 | 2023-05-16 | エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー | 非経口タンパク質溶液中の可視粒子形成の防止方法 |
| WO2021233246A1 (en) * | 2020-05-18 | 2021-11-25 | Biosion Inc. | Antibodies binding il6r and uses thereof |
| KR20220028972A (ko) | 2020-08-31 | 2022-03-08 | (주)셀트리온 | 안정한 약제학적 제제 |
| CN116685351A (zh) | 2020-09-17 | 2023-09-01 | 基因泰克公司 | Empacta的结果：一项用于评估托珠单抗在患有covid-19肺炎的住院患者中的功效和安全性的随机、双盲、安慰剂对照、多中心研究 |
| AR124681A1 (es) | 2021-01-20 | 2023-04-26 | Abbvie Inc | Conjugados anticuerpo-fármaco anti-egfr |
| WO2022165419A1 (en) | 2021-02-01 | 2022-08-04 | Kyverna Therapeutics, Inc. | Methods for increasing t-cell function |
| WO2022191306A1 (ja) | 2021-03-12 | 2022-09-15 | 中外製薬株式会社 | 重症筋無力症の治療または予防用の医薬組成物 |
| CN117980333A (zh) | 2021-06-11 | 2024-05-03 | 基因泰克公司 | 用st2拮抗剂治疗慢性阻塞性肺疾病的方法 |
| JPWO2023058723A1 (ja) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | ||
| WO2024107752A2 (en) | 2022-11-15 | 2024-05-23 | Onestone Therapeutics Llc | Compositions and methods for immunomodulatory bifunctional fusion molecules |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4304583A (en) * | 1980-06-02 | 1981-12-08 | Corning Glass Works | Process for drying optical waveguide preforms |
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
| GB8422238D0 (en) * | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
| GB8607679D0 (en) * | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
| US5082782A (en) | 1988-12-27 | 1992-01-21 | Worcester Polytechnic Institute | Production of horseshoe crab amebocytes in vitro |
| IL162181A (en) * | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| US5216128A (en) * | 1989-06-01 | 1993-06-01 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | IFN-β2/IL-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| ATE144713T1 (de) * | 1989-07-20 | 1996-11-15 | Tadamitsu Kishimoto | Antikörper gegen menschlichen interleukin-6- rezeptor |
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
-
1992
- 1992-04-24 DK DK92909376T patent/DK0628639T3/da active
- 1992-04-24 US US08/137,117 patent/US5795965A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 DE DE69229482T patent/DE69229482T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 ES ES92909376T patent/ES2134212T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 EP EP92909376A patent/EP0628639B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 RU RU93055358A patent/RU2139351C1/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 1992-04-24 TW TW081103237A patent/TW205553B/zh active
- 1992-04-24 DE DE122009000019C patent/DE122009000019I1/de active Pending
- 1992-04-24 AT AT92909376T patent/ATE181575T1/de active
- 1992-04-24 JP JP50889892A patent/JP3370324B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-24 HU HU9303002A patent/HU218140B/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 1992-04-24 WO PCT/JP1992/000544 patent/WO1992019759A1/ja active IP Right Grant
- 1992-04-24 AU AU16740/92A patent/AU668349B2/en not_active Expired
- 1992-04-24 KR KR1019930703229A patent/KR100249937B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-05-08 US US08/436,717 patent/US5817790A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-06-26 AU AU56213/96A patent/AU692100B2/en not_active Expired
-
1999
- 1999-09-08 GR GR990402267T patent/GR3031174T3/el unknown
- 1999-11-29 JP JP33828699A patent/JP3176598B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-07-28 JP JP2000229748A patent/JP3913965B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-10-06 JP JP2003347675A patent/JP3616087B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-05-04 US US10/837,904 patent/US7479543B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2006
- 2006-12-15 JP JP2006338832A patent/JP2007082560A/ja not_active Withdrawn
-
2007
- 2007-09-28 JP JP2007255248A patent/JP2008073049A/ja active Pending
-
2009
- 2009-04-02 NL NL300383C patent/NL300383I2/nl unknown
- 2009-04-24 LU LU91556C patent/LU91556I2/fr unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021211006A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Federal State Budgetary Institution Center Of Biomedical Technologies Of Federal Medical And Biological Agency | Inhaled hexapeptide for treating interleukin-6 related respiratory diseases |
| WO2022005321A1 (en) | 2020-06-29 | 2022-01-06 | Federal State Budgetary Institution Scientific center of biomedical technologies of Federal Medical and Biological Agency | Inhaled tocilizumab for treating interleukin-6 related respiratory diseases |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3370324B2 (ja) | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 | |
| JP7469432B2 (ja) | 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体、ｇｐｒｃ５ｄとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用 | |
| JP3081641B2 (ja) | 抗体の調製 | |
| AU763491B2 (en) | Antibodies to CD23, derivatives thereof, and their therapeutic uses | |
| CA2130436C (en) | Cloning and expression of humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4 | |
| USRE46877E1 (en) | Altered antibodies and their preparation | |
| EP3758752A1 (en) | Igm fc and j-chain mutations that affect igm serum half-life | |
| WO1994028159A1 (fr) | Anticorps humain reconstruit contre l'interleukine-6 humaine | |
| JPH11507535A (ja) | 腫瘍の成長を抑制する抗体および抗体フラグメント類 | |
| JPH08507680A (ja) | 組換え抗ｖｌａ４抗体分子 | |
| CN114364700A (zh) | 与nkg2d结合的抗体 | |
| KR20220123072A (ko) | 신규 폴리펩티드 복합체 | |
| KR20230025665A (ko) | Cd3에 결합하는 항체 | |
| TR201810773T4 (tr) | Onkostatin m?ye (osm) antijen bağlayıcı proteinler. | |
| JP3614183B2 (ja) | ヒトインターロイキン−６に対する再構成ヒト抗体 | |
| CA2266341A1 (en) | Composition and method for enhancing fibrinolysis using antibodies to alpha-2-antiplasmin | |
| JPH05227970A (ja) | ヒトインターロイキン−６受容体に対する再構成ヒト抗体 | |
| JP2022535061A (ja) | 二重特異性結合構築物 | |
| CN115551538A (zh) | 干扰IL-1β受体信号转导的药剂 | |
| WO2024061158A1 (en) | Slit2 related compositions and methods | |
| JP2024534824A (ja) | 操作された抗ｈｅｒ２二重特異性タンパク質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R153 | Grant of patent term extension |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141115 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141115 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141115 Year of fee payment: 12 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20141115 Year of fee payment: 12 |
|
| R153 | Grant of patent term extension |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20171115 Year of fee payment: 15 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |