WO1992019759A1 - Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor - Google Patents

Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor Download PDF

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WO1992019759A1
WO1992019759A1 PCT/JP1992/000544 JP9200544W WO9219759A1 WO 1992019759 A1 WO1992019759 A1 WO 1992019759A1 JP 9200544 W JP9200544 W JP 9200544W WO 9219759 A1 WO9219759 A1 WO 9219759A1
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human
chain
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Masayuki Tsuchiya
Koh Sato
Mary Margaret Bendig
Steven Tarran Jones
José William SALDANHA
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
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Definitions

  • the present invention relates to a variable region (V region) of a mouse monoclonal antibody against human interleukin-16 receptor (IL-6R), a human mouse skimella antibody against human IL-6R, and a human antibody.
  • V region variable region
  • IL-6R human interleukin-16 receptor
  • ⁇ chain human heavy
  • the present invention relates to a human antibody.
  • the present invention further provides a DNA encoding the above antibody or a portion thereof.
  • the invention further relates to a vector comprising said DNA, in particular an expression vector, and a host transformed with said vector.
  • the present invention further provides a method for producing a chimeric antibody against human IL-16R, and a method for producing a reshaped human antibody against human IL-16R. Background technology
  • Interleukin-16 is a multifunctional site-powered insulin produced by a series of cells. It regulates the immune response, the acute phase response and hematopoiesis, and plays a central role in host defense mechanisms. It acts on a wide range of tissues and has growth-inducing, growth-inhibiting and differentiation effects depending on the properties of the target cells. Exercise effect.
  • Specific receptor pig for IL-6 is a multifunctional site-powered insulin produced by a series of cells. It regulates the immune response, the acute phase response and hematopoiesis, and plays a central role in host defense mechanisms. It acts on a wide range of tissues and has growth-inducing, growth-inhibiting and differentiation effects depending on the properties of the target cells. Exercise effect.
  • Specific receptor pig for IL-6 is a multifunctional site-powered insulin produced by a series of cells. It regulates the immune response, the acute phase response and hematopoiesis, and plays a central role in host defense mechanisms. It acts on a wide range of tissues and has
  • I L-6 R is a linker system according to the multi-functionality of I L-6.
  • Human myeloma cells produce IL-16 and IL-
  • Antibodies inhibit the growth of myeloma cells in vitro,
  • I L-6R is present on the surface of various animal cells, and I L
  • IL-16R molecules that specifically bind to I-6 and on the cell surface
  • Anti-mouse antibodies not only interfere with the intended effect, It cannot be administered as often without eliciting an immune response that poses a risk of adverse allergic response in the individual.
  • Mouse antibodies can be humanized in two ways. A simpler method is to generate chimeric antibodies in which the variable regions are derived from the original mouse monoclonal antibody and the constant regions are derived from the appropriate human antibody. The resulting chimeric antibody has the complete variable region of the original mouse antibody, and can be expected to bind to the antigen with the same specificity as the original mouse antibody. In addition, chimeric antibodies have a substantially reduced proportion of non-human derived protein sequences and are therefore expected to be less immunogenic than the original mouse antibodies. Chimeric antibodies bind well to antigens and are poorly immunogenic, but an immune response to the mouse variable region may still occur (L0 Bug 1 io et al., Proc. Natl. Acad. S ci. USA, 8 4, 4 2 2 0-4 2 2 4, 1 9 8 9) 0
  • the second method for humanizing mouse antibodies is more complex, but it further reduces the potential immunogenicity of the mouse antibodies.
  • a complementarity determining region (CDR) from the variable region of a mouse antibody is transplanted into a human variable region to produce a "reshaped" human variable region.
  • CDRs complementarity determining region
  • FR framework
  • reshaped human antibodies are expected to be useful for therapeutic purposes, but no reshaped human antibodies against human IL-16R are known. Furthermore, there is no method for producing reshaped human antibodies that is universally applicable to any particular antibody. Therefore, various measures are required to produce a sufficiently active reshaped human antibody against a specific antigen.
  • Mouse monoclonal antibodies against human IL-16R, ie, PM1 and MT18, have been produced (Japanese Patent Application No. 2-189420), and the present inventors have developed mouse antibodies against human IL-16R. Although monoclonal antibodies AUK12-20, AUK64-7 and AUK146-15 have been prepared, the present inventors have reconstructed human IL-16R human antibodies. I do not know any literature suggesting the production of antibodies.
  • an object of the present invention is to provide an antibody having low immunogenicity against human IL-16R. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a reshaped human antibody against human IL-16R.
  • the present invention also provides a human mouse chimeric antibody useful in the process of producing the reshaped human antibody.
  • the present invention further provides a reshaped human antibody part, and a reshaped human antibody and a part thereof, and an expression system for producing a chimeric antibody.
  • the present invention relates to the L chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-16R; and the H chain V region of a mouse monoclonal ⁇ -nal antibody against human IL-6R. I will provide a.
  • the present invention further provides
  • an L protein comprising a human L chain C region and an L protein V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-6R;
  • a chimeric antibody against human IL-6R comprising: a ⁇ chain comprising the human ⁇ chain C region and the ⁇ chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-16R.
  • the present invention further provides a CDR of the L domain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-6R; and a ⁇ chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-6R.
  • the present invention further provides
  • a reshaped human light L chain V region of an antibody against human IL-6R A reshaped human light L chain V region of an antibody against human IL-6R;
  • a reshaped human H chain V region of an antibody against human IL-6R is A reshaped human H chain V region of an antibody against human IL-6R.
  • the invention further provides
  • a reshaped human light chain of an antibody against human IL-6R A reshaped human light chain of an antibody against human IL-6R
  • the invention further provides
  • the present invention also relates to DNAs encoding the various antibody-constituting polypeptides or portions thereof.
  • the present invention also relates to a vector comprising the above DNA, for example, an expression vector.
  • the present invention further provides a host transformed with the above vector.
  • the present invention further provides a method for producing a chimeric antibody against human IL-6R and a method for producing a reshaped human antibody against human IL-6R.
  • FIG. 1 shows an expression vector comprising a human cytomegalovirus (HCMV) promoter Z enhancer system useful for expression of the antibody peptides of the present invention.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • FIG. 2 is a graph showing the results of ELISA for confirming the ability of the chimeric antibody AUK12-20 of the present invention to bind to human IL-16R.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of an ELISA for confirming the ability of the chimeric antibody AUK12-20 of the present invention to inhibit the binding of human IL-16 to human IL-6R. is there.
  • FIG. 4 shows the chimeric antibody PM1a of the present invention against human IL-16R. 4 is a graph showing the results of ELISA for binding of PM and PM lb.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of ELISA testing the ability of the chimeric antibodies PMla and PMlb of the present invention to inhibit the binding of human IL-16 to human IL-6R.
  • FIG. 6 is a diagram of the preparation of the first purge ion (version “aj”) of the reshaped human PM-1 antibody H chain V region
  • Figure 7 is a diagram of the reshaped human PM-1 antibody L chain V
  • FIG. 4 is a diagram of the fabrication of the first version of the region (version “a”).
  • Figure 8 shows the production of an expression plasmid HEF-12-g ⁇ 1, comprising the human 'longation' factor la: (HEF-1) promoter, which is useful for H chain expression. The process of is shown.
  • FIG. 9 shows the process of making an expression plasmid HEF-12k-gk comprising the HEF-l or Promoter Zenhansa system useful for light chain expression.
  • Figure 10 shows an expression comprising a dihydrofolate reductase (dhfr) and an HCMV promoter no enhancer linked to a defective SV40 promoter no enhancer sequence for amplification, useful for the expression of the heavy chain.
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • HCMV promoter no enhancer linked to a defective SV40 promoter no enhancer sequence for amplification useful for the expression of the heavy chain.
  • Figure 11 shows the expression plasmid DHFR, comprising the dfr gene and EF1 or promoter-enhancer linked to a defective SV40 promoter / enhancer sequence, useful for amplification of the H chain.
  • ⁇ ⁇ — RV h— PM 1 The process of making f is shown.
  • FIG. 12 is a graph showing the ability of purge ions “a” and “b” of the reshaped human PM-1 antibody L chain V region for binding to human IL-16R.
  • Figure 13 shows the reconstituted human PM-1 antibody H chain V region version "f" for binding to human IL-6R "f” + reconstituted human PM-1 antibody L chain V region purge region. It is a graph showing the ability of “a”.
  • Figure 14 shows the reconstituted human PM-1 antibody H chain that inhibits the binding of IL-6 to human IL-6R.
  • 6 is a graph showing the performance of a V-region version “a”.
  • Figure 1 5 is useful for expression of the L chain and H chain, respectively, human EFI - current originating comprising ⁇ promoter / Enhansa plus Mi de HEF- V L - gk and HEF- V h - g 1 Is shown.
  • FIG. 16 shows the process of preparing DNA encoding the reshaped human AUK12-20 antibody L domain V region version “a”.
  • FIG. 17 is a graph showing the results of ELISA for confirming the ability of the reshaped human AUK12-20 antibody L chain V region to bind to human IL-6R.
  • the standard AUK12-20 (Chimera) shows the results obtained by producing and purifying a large amount of Chimera AUK12-20 antibody using CHO cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of ELISA for the ability of the present invention.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of ELISA for the ability of reconstituted human AUK12-20 antibody (L-version “aj + H-version” dj) to bind to human IL-6R. It is.
  • FIG. 20 shows the process of chemical synthesis of the reshaped human s1e1220H antibody H chain V region.
  • Fig. 21 shows the reconstituted human sIe122OH antibody (L-version "a” + heavy-chain version "aj") that inhibits the binding of IL-16 to human IL-16R.
  • 4 is a graph showing the results of ELISA for the ability of the present invention.
  • Figure 22 shows the reconstituted human s1e122 antibody that inhibits the binding of IL-16 to human IL-16R (L-version "a” + H-chain version "b”).
  • 4 is a graph showing the results of ELISA for the ability of the present invention.
  • Figure 23 shows the results of the reconstituted human s1e1220 antibody (L-version "a” + H-version "cj") that inhibits the binding of IL-16 to human IL-16R.
  • 4 is a graph showing the results of ELISA for the ability.
  • Figure 24 shows the results of the reconstituted human sIe122 antibody (L-version "a” + H-version "dj"), which inhibits the binding of IL-16 to human IL-16R.
  • 5 is a graph showing the results of ELISA for performance.
  • RNA is obtained by the usual method.
  • a single-stranded cDNA is synthesized by the method described in J. W. Larrick, et al., Biotechnololgy, ⁇ , 934, 1989.
  • the significant portion of the cDNA is specifically amplified using the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • fc kappa
  • one of the oligonucleotide primers shown in SEQ ID NOs: 1 to 11 is used.
  • MKV kappa Variable
  • SEQ ID NO: 12 Oligonucleotide primer as shown in Table 2
  • Mouse K appa and onstant; MKC 3 ⁇ 4: 5'-terminal primer and 3'-terminal primer, respectively To use.
  • the MKV primer hybridizes with a DNA sequence encoding a mouse collared L chain leader sequence
  • the MKC primer hybridizes with a DNA sequence encoding a mouse collared L chain C region.
  • 10 kinds of oligonucleotide primers shown in SEQ ID NOS: 13 to 22 and SEQ ID NO: 23 are shown.
  • Oligonucleotide primers (Mouse Heavy Constant; MHC) are used as 5'-end primer and 3'-end primer, respectively.
  • the 5'-terminal primer has the sequence GTC GA C which provides a restriction enzyme S a1I cleavage site near the 5'-terminal, and the 3'-terminal primer is near the 5'-terminal. It has the nucleotide sequence CCCGGG which provides the restriction enzyme Xma1 cleavage site. These restriction enzyme cleavage sites are used for subcloning a DNA fragment encoding a variable region into a cloning vector.
  • the amplified product is cleaved with restriction enzymes Sa1I and XmaI to obtain a DNA fragment encoding the variable region of interest of the mouse monoclonal antibody.
  • an appropriate cloning vector such as plasmid PUC19 is Then, the DNA fragment is ligated to pUC19 to obtain a plasmid containing a DNA fragment encoding a variable region to be targeted by a mouse monoclonal antibody.
  • Sequencing of the cloned DNA can be performed according to any conventional method.
  • CDR Complementarity determining region
  • the present invention further provides a hypervariable or complementarity determining region (CDR) of each V region of the present invention.
  • CDR hypervariable or complementarity determining region
  • the V region of each pair of L and H chains forms an antigen binding site.
  • This region on the L and H chains has a similar general structure and each region contains four relatively conserved framework regions of sequence, which are three hypervariable regions or CDRs. (Kabat, EA, ";> equences of Proteinsof Immunological Interes-t", USDept. Healthand Human Services 1983).
  • Most of the four framework regions (FRs) have a 9-sheet structure, and the CDRs form loops. CDRs may form part of the ⁇ -sheet structure in some cases.
  • the CDRs are held very close by the FRs and, together with the CDRs in other regions, contribute to the formation of the antigen binding site.
  • the present invention also provides these CDRs useful as materials for humanized antibodies, and DNAs encoding them. By comparing these CDR regions with the known amino acid sequence of the V region, Kabat, E.A., et al., Can find out from the rules of thumb of "Sequences of Proteins of Immunol 1 ogica 1 Interestj. This is specifically described in Example 4.
  • the basic method for producing chimeric antibodies is to use the mouse leader sequence and V region sequence, as found in PCR-cloned cDII, to replace human C already present in mammalian cell expression vectors. Linking the region to a coding sequence. Monoclonal antibody among the above four types of monoclonal antibodies The production of chimeric antibodies from AUK12-20 is described in Example 5.
  • Example 6 The production of chimeric antibodies from the monoclonal antibody PM-1 is described in Example 6.
  • Mouse PM-1 cDNA coding for the L region leader region and V region was cloned by PCR using an expression vector containing human genomic DNA coding for the human L chain C region.
  • CDNA encoding the H chain leader and V region of mouse PM-1 antibody (sometimes simply referred to as “PM-1 antibody” or “PM”) is replaced by the genome encoding the human r-1 C region.
  • Expression vectors containing DNA were subcloned using the PCR method.
  • the cDNA encoding the V region of the mouse PM-1 antibody was ligated with the appropriate nucleotide sequence at their 5'- and 3'-ends.
  • a second version of the chimeric PM-1 antibody is used.
  • (Version b) was prepared.
  • the amino acid at position 107 in the L region V region has been changed from asparagine to lysine.
  • Comparison of the L-protein V region from mouse PM-1 antibody with other mouse L-chain V regions noted that the presence of arginine at position 107 was abnormal. In the mouse XL region V region, the most typical amino acid at position 107 is lysine.
  • chimeric antibodies were prepared from the other two monoclonal antibodies, AUK64-1 "7 and AUK146--15. All four chimeric antibodies were human IL-16. R bound well, and functional measurements showed that the correct mouse V region had been cloned and sequenced.
  • mouse PM-1 antibody was selected as the first indication for the design and production of a reshaped human antibody against human IL-6R.
  • the selection of mouse PM-1 antibodies is mainly based on the selection of mouse anti-human IL-16R antibody and chimeric antibody against human myeloma cells transplanted into nude mice. Based on results obtained by studying the effects.
  • PM-1 antibody showed the strongest antitumor cell activity.
  • the Chimera PM-1 antibody showed stronger antitumor activity than the Chimera AUK12-20 antibody.
  • the FRs of the mouse monoclonal antibody and the FRs of the human monoclonal antibody must be prepared. It is desirable that there be high homology between Therefore, the L region of the mouse PM-1 antibody and the V region of the H chain were compared to the V regions of all known mice and humans found in OWL (, 0 rLeeds) databasseofproteinsecs.
  • the V region of the L chain of the PM-1 antibody is the mouse antibody musigkcko (Cen, H.T., et al., J. Biol. Chem. : The most similar to the L-chain V region of 13 5 7 9 1 1 3 5 8 3), with 93.5% identity.
  • the H chain V region of the PM-1 antibody is the heavy chain V region of the mouse antibody musigvhr 2 (F. J. Grant, et al., Nucl. Acids Res. (19987) 15: 5496). It was most similar to the region, with 84.0% identity.
  • the V region of the mouse PM-1 antibody shows a high proportion of identity to the known mouse V region, indicating that the V region of the mouse PM-1 antibody is a typical mouse V region. This further provides indirect proof that the cloned DNA sequence is correct. In general, there is a higher percentage of identity between L chain V regions than between H chain V regions. This is probably due to the lower amount of diversity generally observed in the light chain V region compared to the H chain V region.
  • the light chain V region of the mouse PM-1 antibody is expressed by the human antibody k1 hure (also referred to as REI) (W. Palm et al., Physiol. Chem. (197) 5) 3 56: Most similar to the L chain V region of 1 6 7-9 1), with 72.2% identity.
  • the V region of the H chain of the PM-1 antibody is most similar to the human antibody humighvap (VAP) (HW Schroeder et al., Science (19987) 238: 791-17993). , 71.8% identity exists.
  • the comparison with the human V region is most important to consider how to design a reshaped antibody from the mouse PM-1 antibody.
  • the proportion of identity to the human V region is lower than the proportion of identity to the mouse V region. This is an indirect proof that the V region of the mouse PM-1 antibody is similar to the mouse V region and not similar to the human V region. This proof also shows that it is best to humanize the V region of mouse PM-1 (humanise) to resolve the immunogenicity problem in human patients.
  • the V region of the mouse PM-1 antibody is further defined by EA Kabat et al., 1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Forth Edition, US Department of Health and Human Services, US Government Printing Of ice. Comparisons were made with consensus sequences for different subgroups of the human V region. Comparisons were made between FRs in the V region. The results are shown in Table 1.
  • the FR of the light chain V region of the mouse PM-1 antibody is most similar to the FR from the consensus sequence of subgroup I (HSGI) of the human L protein V region, with 70.1% identity. Exists.
  • the FR of the H chain V region of mouse PM-1 is most similar to the FR from the consensus sequence of subgroup 11 (HSG II) of the human H region V region, with 52.9% identity. Exists.
  • the first step in designing the reshaped human PM-1 antibody V region was to select the human antibody V region on which to base the design.
  • the FRs in the mouse PM-1 antibody L chain V region were most similar to the FRs in the human antibody L chain V region belonging to subgroup I (Table 1).
  • the human L chain V region is a human L chain that is a member of subgroup I.
  • FR of REI was used as a starting material for producing the V region of the reshaped human PM-1 antibody L chain.
  • the human FR is identical to the REI-based FR present in the reconstituted human CAMPATH-1H antibody (Riechmann et al., 1988).
  • the mouse CDR was the same as the CDR in the mouse PM-1 L chain V region.
  • the second version (version "b") is based on version "a” and differs only in one amino acid at position 71 in human FR3.
  • Residue 71 is defined as the CDR1 of the light chain V region, as defined by C. C hothia et al., J. o 1. Biol. (19987) 1996: 91-91. Part of the canonical structure.
  • position 71 is tyrosine.
  • position 71 was phenylalanine in the FR of the modified REI.
  • version "b" of the reshaped human PM-1 antibody L chain V region the phenylalanine force at position 71; tyro, as found in the mouse PM-1 antibody L chain V region.
  • Table 2 shows the V regions of the light chain of the mouse PM-1 antibody and the FRs of REI modified for use in the reshaped human CAM PATH-1H antibody (Riechmann et al., 1988). The amino acid sequences of the two versions of the L-chain V region of the reconstituted human PM-1 antibody are shown.
  • RV L b The REI FR is found in the reshaped human CAM PAT-1H antibody (Riechmann et al., 1988).
  • the five underlined amino acids in the REI FR are the amino acid sequences of the human REI (Plam et al., 1979; 0. EPP et al., Biochemistry (19775) 14 : 4 9 4 3 It is an amino acid different from 4 9 5 2).
  • the FRs in the mouse PM-1 H chain V region are most similar to the human H chain V region belonging to subgroup II (Table 1). As described above, in comparison of the H chain V region of the mouse PM-1 antibody with the known human H chain V region, it was determined that the human H chain V region was a member of subgroup II.
  • H chain V region VAP The human H chain V region NEW, another member of the human H chain V region subgroup II, is used as a starting material for the production of the H chain V region of the reshaped human PM-1 antibody. And used as the basis for the design of the V region of the H chain of the reshaped human PM-1 antibody.
  • othia et al. are part of the canonical structure of CDR1 of the H chain V region, as deduced by Nature (19989) 34: 877-1828, and Constituting part of the first structural loop of the renal V region is observed in a model of the mouse PM-1 antibody V region (Ch0thia et al., 1989).
  • Residues 48 were observed as buried (buried) residues in a model of the V region of the mouse PM-1 antibody. Changes in buried (buried) residues may disrupt the overall structure of the V region and its antigen binding site.
  • Residue 71 is part of the canonical region C CDR2 canonical (canonical) structure as predicted by Chothia et al. (1989).
  • the six versions of the reshaped human PM-1 antibody contain different combinations of amino acid changes at these seven positions in the FR of human NEW (see Table 3).
  • RV spast FR The NEW FR is found in the first version of the reshaped human CAM PATH-1H antibody (Riechmann et al., 1988).
  • Preparation of DNA encoding V region of reshaped human PM-1 antibody Using DNA that encodes the first version of each of L domain and V region of reshaped human PM-1 antibody using a novel PCR method Produced. Briefly, the plasmid encoding the reconstituted human V region already possessing the appropriate human FR was modified using a PCR primer, and the CDRs present in the starting human V region were replaced with mouse PM-1. Replaced by CDR from antibody.
  • the starting material for the production of the DNA encoding the L chain V region of the reshaped human PM-1 antibody is plasmid DNA containing the DNA encoding the reshaped human D1.3 L protein V region. there were. This reconstituted human D1.3 L chain V region was generated based on FR present in the human L chain V region REI.
  • the starting material for the production of DNA encoding the reshaped human PM-1 antibody H chain V region was DNA encoding the reshaped human D1.3 H protein V region.
  • the DNA encoding the reshaped human D1.3 antibody H chain V region is a human H protein V region N EW (W. Verhoeyen et al., Science (1989) 239: 153 It was prepared based on the DNA encoding FR present in the DNA encoding 4—1 5 3 6).
  • PCR was performed to allow the replacement of the mouse PM-1 antibody CDR instead of the mouse D1.3 CDR.
  • An image was designed and synthesized.
  • the three primers contain the DNA sequence encoding the mouse PM-1 antibody CDR, and the two primers Ima is designed to sandwich the entire DNA sequence encoding the reshaped human V region.
  • the use of five PCR primers in a series of PCR reactions encodes human FR-encoding DNA present in the starting reconstituted human V region and CDR present in the mouse PM-1 antibody V region. This resulted in a PCR product consisting of DNA (see Example 7, and FIGS. 7 and 8).
  • the PCR product is cloned and sequenced, and the entire amino acid sequence of the reconstituted human PM-1 antibody L-chain and H-chain V region purge ion “a” is the correct amino acid sequence. Was confirmed.
  • the sequence of the reshaped human PM-1 antibody L chain V region version “a” is shown in SEQ ID NO: 55.
  • DNA encoding other versions of the reshaped human PM-1 antibody V region has minor modifications to the published PCR-mutagenesis method (Kamma ⁇ et al., 1989). Fabricated using the method.
  • One additional version of the reshaped human L chain V region (version "b"), as described for the design of the reshaped human V region. )
  • five additional versions of the reshaped human PM-1 antibody H chain V region (versions "b", “c">"d”,”e”).
  • These additional versions include a series of subtle changes from the first version. These subtle changes in the amino acid sequence are translated into PCR changes.
  • PCR primer was designed to introduce the necessary changes to the DNA sequence
  • a series of PCR reactions followed by a PCR product was cloned and sequenced to confirm that changes in the DNA sequence were occurring as planned.
  • SEQ ID NO: 54 shows the sequence of the reshaped human PM-1 antibody H chain V region version "f".
  • the DNA encoding the reshaped human PM-1 antibody V region was replaced with the human C region.
  • the coding DNA was subcloned into an already existing mammalian cell expression vector.
  • the DNA encoding the reshaped human PM-1 antibody V chain L region was ligated to the DNA sequence encoding the human L protein C region.
  • DNA encoding the reshaped human PM-1 antibody H chain V region was ligated to the DNA sequence encoding the human 1 C region.
  • the HCMV promoter-enhancer region is modified to modify the HCMV expression vector, as shown in Figure 1, to achieve a higher level of expression. HEF-l) Replaced by the promoter 'enhansa' (see Figure 15).
  • the reshaped human antibody comprising the L-chain version (a) and the H-chain version (f) is a chimeric PM-1 antibody.
  • the ability to bind to IL-16R was shown at the same level as (a).
  • PCR products For the DNA encoding the reshaped human light chain V region, there are two types of PCR products, one with a length of 408 bp, as expected, and a shorter PCR of 299 bp. It was a product. The correct size PCR product accounted for about 90% of the total PCR product, and the short PCR product accounted for about 10% of the total yield. There are also two types of PCR products for the reshaped human H chain V region, one with a length of 444 bp as expected, and the other with a short length of 37 O bp. In things I got it. However, in this case, the incorrect shorter PCR product made up the majority of the total PCR product, ie, about 90%. The correct size PCR product was only about 10% of the total PCR product. These results indicated that some of the RNA encoding the reshaped human V region was deleted.
  • the causes of the reduced expression levels are reconstituted human L-chain and heavy-chain V It was considered that there was an int in the DNA encoding the leader sequence of both regions (SEQ ID NOs: 54 and 55). These introns were originally derived from the mouse H chain leader sequence used in the construction of the DNA encoding the V region of the reshaped human D1.3 antibody (Verhoeyen et al., 1988).
  • DNA encoding the reshaped human D1.3 antibody was expressed in a mammalian cell vector using the mouse immunoglobulin promoter, the presence of the mouse leader intron was important. Leader intron is important for expression from the immunoglobulin promoter, but not for expression from a viral promoter, such as HCMV
  • the dhfr gene linked to the SV40 promoter was added to the HEF-1 ⁇ vector expressing the human r-11H chain in the same manner as described for the HCMV vector expressing human-1H.
  • HEF-1 or vector expressing reshaped human L-protein and HEF-1 or-dhfr vector expressing H-chain of reshaped human PM-1 antibody simultaneously to CHO dhfr (1) cells Transformation.
  • a stably transformed CH0 cell line was transformed with A1Pha — Minimum E without nucleosides and with 10% FCS and 500 / g / ml G418. Selected in ssential Medium (or—MEM).
  • CHO cell lines Prior to gene amplification step, CHO cell lines were observed to produce 1 0 // g Roh 1 0 6 reconstructed human PM- 1 antibody to cell Bruno day.
  • Mouse Monoclonal Antibody AUK12-20 Force The homology between FRs in the light chain (L) V region and the human L chain V region subgroup (HSG) I-IV FRs, and mouse Table 4 shows the homology between the FRs of the H chain V region of the monoclonal antibody AUK12-20 and the FRs of the human H chain V region subgroup (HSG) I-111. Table 4
  • the power of the murine monoclonal antibody AUK12—20 was determined to be similar to that of the human L protein (A: L) V region. Each shows the same degree of homology (64-68%). From the search for the protein D atabase "LEEDS", the human antibody Lent. Schneider belonging to HSG-IV and Phsiol. Hem. 3 56, 5 0 7-5 7 7, 1 9 7 5) L region V region shows the highest 68% homology.
  • the human antibody REI used for the human monoclonal antibody PM-1 belongs to HSG-I
  • the mouse monoclonal antibody AUK12-20 has the following structure: It shows 62% homology.
  • mouse monoclonal antibody AUK12—20 L protein C. C. hothia et al., J. Mo. 1. Biol. (19987)). 1 9 6: 9 0 1 to 9 1 7), especially L 2 matches REI better than L en. '* / 3 ⁇ 4
  • the mouse monoclonal antibody used for humanization of the L chain V region of AUK12-20 does not necessarily need to be selected from antibodies belonging to HSG-IV.
  • the REI is used in the same manner as in the case of the L-chain V region of the monoclonal monoclonal antibody PM-1. ,
  • the H chain V region of the AUK12-20 antibody shows the highest homology with subgroup I (HSGI) of the human H chain V region.
  • HSGI subgroup I
  • a search for Database "LEEDS” revealed that the human antibody HAX (St0 liar, BD etal. J. Immunol. 1339, 2496-6-250) also belonging to HSGI 1, 1987) show about 66% homology to the H chain V region of the AUK12-22 antibody.
  • a humanized antibody having a FR of the human antibody HAX belonging to HSGI and a FR belonging to the HSGI also belonging to HSGI Use FRs in the H region V gamut (. Kettleboroug C.A., et al., Protein Engineering, ⁇ , 773-783, 1991).
  • the AUK12-20 antibody H chain V region shows about 64% homology with version a of the humanized 425 antibody H protein V region.
  • the FR of REI was used as the FR of the V region of the reshaped human AUK12-20 antibody L chain, and the L region of the reshaped human AUK 12-22 antibody L chain V region was used as shown in Table 5. Was designed. M 5.
  • RV L DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSYMH
  • the nucleotide sequence of the DNA coding for the reshaped human AUK12-20 antibody H domain V region designed in this manner may have a sequence that closely matches the splice donor sequence. It has been found that, as with the reshaped human PM-1 antibody, aberrant splicing may occur in the expression of the reshaped human AUK12-20 antibody. For this reason, the splice donor sequence-like sequence was removed by partially changing the nucleotide sequence. This modified array is called version a.
  • versions b to (! Of the V region of the H chain V region of the reshaped human AUK12-20 antibody were designed.
  • the amino acid sequences of versions a to d are shown in Table 6.
  • RV H a WVRQAPGQGLBWVG YIDPPNGGTSYNQKFKG
  • RV right handa RVTMTLDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
  • RV H d Note: Positions where one common amino acid cannot be identified in the human subgroup IV K region (HSGI) are indicated by an X. The two underlined amino acids are different from the amino acids in the HSGI consensus sequence. RV h b, RV "For the c and RV H d only RV H a and amino acid residues different Ru is shown.
  • human antibody HAX J.Immunology 13 9, 24 9 6-25 01, 1987, 38
  • An antibody produced by hybridoma 21/28 cells derived from a vesicle; its amino acid sequence is described in Fig. 6 of this document, and the nucleotide sequence of the DNA encoding it is Fig. 4 and 5), the H chain V region versions “a” to “d” of the H chain V region of the antibody s1e122 0 antibody were used as shown in Table 7 below. Designed.
  • any expression system for example eukaryotic cells, eg animal cells, eg established mammalian cell lines, fungi Cells, yeast cells, and prokaryotic cells, such as bacterial cells, such as E. coli cells, can be used.
  • a chimeric or reshaped antibody of the invention is expressed in a mammalian cell, for example, a cosm or a CH0 cell.
  • a conventional conjugate useful for expression in mammalian cells A promoter can be used.
  • a human cytomegalovirus early (HCMV) 7 * motor examples of expression vectors that ⁇ the H CMV promoter, H CMV- V H - HC r 1, HCMV - V L - HCK, H CMV - a 1 2 h -gr 1, H CMV- 1 2 one like And those derived from p SV 2 neo (see Figure 1).
  • HEF-1 or human fermentation factor 1
  • HEF-1 or human fermentation factor 1
  • This is an expression vector promoter scratch to ⁇ HEF- 1 2 h- grl and HEF- 1 2 k- g «(FIGS. 8 and 9), as well as HEF- V H - gr 1 and HEF- V L - g A : (Fig. 15).
  • the expression vector may further comprise a dhfr gene.
  • the expression vectors having the dhiir gene are, for example, DHFRamE-PMh-gr110), DHFR-AE-RVh-PMl-i (Fig. 11) and the like.
  • the present invention firstly comprises the L-chain V region and the H-chain V region of a mouse monoclonal antibody against human IL-6R, and the DNA and H-chain V region encoding the L-chain V region. Provide DNA. These are useful for the production of a human mouse chimeric antibody against human IL-16R and a reshaped human antibody.
  • Monoclonal antibodies are, for example, AUK12-20,
  • the light chain V region which is PM-1, AUK64-7, and AUK146-15 has, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24, 26, 28 or 30;
  • the H chain V region has, for example, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, 27, 29, or 31. These amino acid sequences are encoded, for example, by the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 24 to 31, respectively.
  • the present invention also provides
  • the mouse L chain V region, mouse H chain V region, and DNA encoding them are as described above.
  • the human light chain C region can be any human light chain C region, and is, for example, a human C region.
  • the human H chain C region can be any human H chain C region, and is, for example, a human r-1 C region.
  • chimeric antibodies For the production of chimeric antibodies, two types of expression vectors, the mouse L protein V region and the human L protein C region, are controlled under the control of an expression control region such as the Enhansa-1 / promoter system. And an expression vector containing DNA encoding the mouse H protein V region and human H chain C region under the expression control region such as the Enhansano promoter system. I do. Next, host cells such as mammalian cells are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo. To produce chimeric antibodies.
  • an expression control region such as the Enhansa-1 / promoter system.
  • an expression vector containing DNA encoding the mouse H protein V region and human H chain C region under the expression control region such as the Enhansano promoter system. I do.
  • host cells such as mammalian cells are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vitro or in vivo. To produce chimeric antibodies.
  • DNA encoding a mouse L chain V region and a human L chain C region and DNA encoding a mouse H chain V region and a human H chain C region are introduced into a single expression vector; and A host cell is transformed using the vector, and the transformed host is cultured in vivo or in vitro to produce the desired chimeric antibody.
  • the invention further provides
  • the present invention provides a reshaped human antibody against human IL-6R, comprising:
  • the L chain CDR is an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 24, 26, 28 and 30, and the range of the amino acid sequence is defined in Table 9.
  • the H chain CDR has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25, 27, 29 and 31 and the range of the amino acid sequence is defined in Table 9.
  • the human L chain FR is derived from REI; the human H chain FR is derived from the NEW or HGSI consensus sequence or HAX; the human L chain C region is a human ATC region; and the human heavy chain C region is a human r-1C. It is.
  • the L region V region is the RV! It has a Amino acid sequence shown as a, H Zhen V region having the amino acid sequence shown in Table 3 RV H a, RVH b, RV H C, RV "d, RV” as e or RV " ⁇ .
  • the amino acid sequence RV is most preferred.
  • reshaped antibodies For the production of reshaped antibodies, two types of expression vectors are used, namely D encoding the reshaped human L protein as defined above under the control of an expression control region such as the Enhansa / promoter system.
  • host cells such as mammalian cells, are co-transformed with these expression vectors, and the transformed cells are cultured in vivo or in vitro to obtain reconstituted human antibodies. Produce.
  • the DNA encoding the reconstituted human L protein and the DNA encoding the reconstituted human H protein are introduced into a single expression vector, and the vector is used to transform a host.
  • the transformed host cells are then cultured in vivo or in vivo to produce the desired reshaped human antibody.
  • the chimeric antibody or the reshaped human antibody thus produced can be obtained by a conventional method, for example, using a protein A affinity; It can be isolated and purified by luffy, ion-exchange chromatography, gel filtration, etc.
  • the chimeric L chain or reconstituted human L chain of the present invention can be used to produce a complete antibody by combining with the H chain.
  • the chimeric H chain or reconstituted human H chain of the present invention can be used to produce a complete antibody by combining it with an L chain.
  • the mouse L chain V region, the reconstituted human L chain V region, the mouse H chain V region, and the reconstituted human H chain V region of the present invention originally bind to human IL-6R as an antigen. It is considered to be useful as a drug, a diagnostic agent, or the like as a protein itself or as a fusion protein with another protein.
  • L chain V region CDR and H chain V region CDR of the present invention are also originally a part that binds to the antigen, ie, human IL-6R, and are fusion proteins with themselves or with other proteins. It is considered to be useful as a medicine, diagnostic drug, etc.
  • the DNA encoding the mouse L chain V region of the present invention is useful for producing DNA encoding a chimeric L chain or DNA encoding a reconstituted human L chain.
  • DNA encoding a mouse H chain V region is useful for producing DNA encoding a chimeric H chain or DNA encoding a reconstituted human H chain.
  • the DNA encoding the L chain V region CDR of the present invention is useful for producing DNA encoding the reshaped human L chain V region and DNA encoding the reshaped L chain.
  • the DNA encoding the H chain V region CDR of the present invention is a reconstituted human H chain. It is useful for preparing DNA encoding the V region and DNA encoding the reshaped human heavy chain.
  • DNA encoding the variable region of the mouse monoclonal antibody against human IL-6R was cloned as follows.
  • the total RNA from Hypri-Dorma A U K 12-20 is Ch
  • RNA precipitate was dissolved in 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5) 2001, containing 1 mM EDTA.
  • the PCR method was performed using ThermalcCycleroddelPHC-2 (Techne).
  • the primers used for the PCR method are as shown in SEQ ID NOS: 1-11.
  • MKV (Mouse Kapa Variable) primer (hybridizes with the mouse kappa L chain leader sequence) (ST Jones et al., Biotechnol 0 gy, 9_, 88, 1991), and the sequence shown No. 12: MK C (Mouse Kapa Constant) primer (hybridizes with the mouse force collar type L chain C region) (ST Jones et al., Biotechnology, 9:88, 1) 9 9 1).
  • MHV Mae Heav Variable primers 1 to 10 shown in SEQ ID NOs: 13 to 22 as primers for PCR (ST J ones et al., Biotechn. 101, gy, 9, 88) , 1991) and SEQ ID NO:
  • the MH C (Mouse Heavy Constant) primer shown in 23 (ST. Jones et al., Biotechno 1 ogy, _9_, 88, 1991) was used.
  • Amplification was performed in the same manner as described for amplification of the L chain V region gene in 3. (1) above.
  • the DNA precipitate was digested with 10 units of the restriction enzyme XmaI (New Eng 1 and Bio 1 abs) at 37 for 2 hours, and the resulting DNA fragment was digested with Separation was performed by agarose gel electrophoresis using melting point agarose (FMCB i 0. Products, USA).
  • a piece of agarose containing a DNA fragment of approximately 450 bp in length was excised and melted at 65'C for 5 minutes, and the same volume of 2 mM EDTA and 200 mM NaCl was added. 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) was added. The mixture was extracted with phenol and black form, the DNA fragments were recovered by ethanol precipitation, and 1 mM EDTA was removed. ⁇ to 1 0 T ris - HC 1 and this was dissolved in (. P H7 5), D NA fragment consisting mouse force flange L chain variable region contains a gene encoding, and the mouse H chain variable region A DNA fragment comprising the encoding gene was obtained. All of the above DNA fragments have a Sail cohesive end at their 5'-end and an XmaI cohesive end at their 3'-end.
  • the transformant was cultured overnight at 37 in 5 ml of 2 XYT medium containing 50 ⁇ g Zml of ampicillin, and the culture was subjected to the Anorecari method (Molecular C). 1 oning: AL aboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) to prepare plasmid DNA.
  • a plasmid harboring a gene encoding a mouse ⁇ chain V region derived from high pri-doma A ⁇ K12-20 was created from the Sa1I-XmaI DNA fragment. And named P 1 2 — h 2.
  • Plasmid PPM—h1 having a gene encoding the H region V region derived from Hypridoma PM1;
  • Plasmid P146-h1 having a gene encoding the H chain V region derived from Hypridorma AUK146-15.
  • the Escherichia coli strain containing the above plasmid was deposited at Nati 0 na 1 Collections of Industria 1 andarine B acteria Limited, under the Budapest Treaty on Feb. 11, 1991, It has the accession number shown in Table 8.
  • the nucleotide sequence of the cDNA coding region in the above-mentioned plasmid was determined using a Sequenase Se TM Version 2.0 kit (U.SBiocHelmicalp, USA).
  • the modified by-obtained positive Mi de about 3 // g a 0 2 NN a 0 H as, by sequencing primer and ⁇ two Lumpur, and according to the formulation of kits accompanying Labeled with S — d ATP.
  • the labeled DNA is electrophoresed on a 6% polyacrylamide gel containing 8 M urea, and the gel is fixed with 10% methanol and 10% acetic acid, and dried. Then, the nucleotide sequence was determined by autoradiography.
  • SEQ ID NO nucleotide sequence of cDNA coding region of each plasmid 24 to 31 are shown.
  • the overall structures of the V regions of the L and H chains are similar to each other, with each of the four framework parts being linked by three hypervariable regions, the complementarity determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity determining regions
  • DNA encoding the chimeric L chain ZH chain was prepared from cDNA encoding the ⁇ L chain and H chain V region of the AUK12-20 antibody cloned by the PCR method.
  • the cDNA encoding the V region of mouse AUK12-20 was transformed into a mammalian cell expression vector having a human cytomegalovirus (HCMV) enhancer and promoter (referred to as HCMV expression vector).
  • HCMV expression vector human cytomegalovirus
  • H chain V region forward primer SEQ ID NO: 34
  • H chain V region forward primer to form a Bam HI site for ligation to the human C region in the HCMV expression vector.
  • HCMV-12k-gk HCMV-12h-gr1.
  • Figure 1 shows the structure of the HCMV expression vector.
  • the VL region can be any mouse L chain V region coding sequence.
  • HCMV-12k-gk was obtained by inserting the AUK12-20 AT light chain V region.
  • Plasmid HCMV - V H - In HCT 1 it is possible VH region may be any mouse H chain V region coding sequence.
  • HMV V region of AUK12-20 was inserted to obtain HCMV-12h-grl.
  • the expression vectors were tested in C0S cells.
  • DNA was introduced into C0S cells by electroporation using a Gene Pulser apparatus (BioRad). That, phosphate so that the COS cells to 1 X 1 0 7 stubborn ml - buffer
  • the cells were suspended in edsaline (PBS), and DNA (10 ⁇ g per each plasmid) was added to 08 ml of the cell suspension. Pulses were applied at an electric capacity of 190 volts (V) and 25 microfarads (/ F).
  • the electroporated cells were added to 8 ml of DMEM medium (GIBCO) containing 10% fetal calf serum. 72 After 2 hours incubation, collect culture supernatant, centrifuge to remove cell debris-and under aseptic conditions 4 hours at short time or 120 ° C for long time Stored.
  • DMEM medium GIBCO
  • ELISA Immunosorbent Assay
  • the medium from the transfected COS cells was measured by ELISA to determine whether the produced chimeric antibodies could bind to the antigen. Plates were coated with MT18 mouse monoclonal antibody (Reference Example 1) for detection of antigen binding. After blocking with 1% BSA, soluble recombinant human IL-6R (SR344) was added.
  • the culture supernatant from COS cells was serially diluted and added to each well. After incubation and washing, alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG was added. After incubation and washing, substrate buffer was added. After incubation, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured.
  • the absorbance at 405 nm changes depending on the sample dilution (antibody concentration), and the antibody in the sample binds IL-16R to IL-16. Inhibition was observed. This was confirmed by the fact that the absorbance of the positive control almost coincided with the antibody concentration-dependent change ( ⁇ ).
  • the Hind III-Bam HI fragment is excised, and the expression vector for the H HCMV-V Stamm-HC1 cloned into HCMV—PMh-gr1, and for the L region V region HCMV—V—HC cloned into HCMV—PMka—gk and HCMV— PM kb—gk was obtained.
  • alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG (r-chain specific, Sigma) was added. After incubation and washing, substrate buffer was added. After incubation, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured. Purified human IgG (Sigma) was added as a standard.
  • the same medium from C0S cells transfected with a vector carrying the gene encoding the Chimera PM-1 antibody was measured for its ability to bind to human IL-6R.
  • the plate was coated with an MT18 mouse monoclonal antibody (Reference Example 1), which is an antibody against human IL-6R. After blocking, soluble human IL-16R (SR344) was added. After washing, the samples were serially diluted and added to each well. Incubation After washing and washing, alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG (r-chain specific; Sigma) was added. After incubation and washing, substrate buffer was added. After incubation, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured. There was no standard for this measurement.
  • a chimeric antibody (Chimeric PM-1a antibody, Fig. 4) that has a V region identical to that found in the mouse PM-1 antibody. This was a sample from a transacted child. Another sample contains a gene encoding a chimeric antibody (chimeric PM-1b antibody, Fig. 4) with one amino acid change as described above at position 107 in the light chain V region. All of the samples that were from the Transfection by E. coli showed strong binding to IL-16R that was reduced by dilution of the sample. That is, the produced chimeric PM-1 antibody is functional and can bind better to its antigen.
  • a new HCMV expression vector having a dh r gene was constructed.
  • CHO dhfr (I) cells (G. V rlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 7 7: 4 2 1 6-4 2 0) HCMV- VL- HC vector (HCMV-PMka-gk) for expressing plasmid DNA, Chimera PM-1a light chain, and Chimera PM-1H HCMV- VH -HC r.-Dhfr vector (DHFR- ⁇ -PM h-gr 1; Cotransformation was carried out according to Example 10).
  • D NA was added to (the brass Mi de diary 1 O / zg Zml) of 0. 8 ml of 1 X 1 0 7 cells / ml in PBS ⁇ Li Coat.
  • a pulse was applied with a voltage of 190 V and a capacity of 25 F. After a recovery period of 10 minutes at room temperature, the cells treated with electrophoresis were transformed into A1 pha Minima 1 Essential Medium medium ( ⁇ -MEM) 1 containing nucleosides and 10% FCS. Added to 0 ml. After overnight incubation, the culture medium was changed to or-MEM without 10% FCS and 500 g / ml G418 (GIBCO) without nucleosides, and dhfr + And ne 0 + transformed cells were selected. After selection, gene amplification was performed using the selected clones.
  • ⁇ -MEM A1 pha Minima 1 Essential Medium medium
  • Antibodies produced in transfected C0S cells or in stable CH0 cell lines were measured to determine if they competed for binding of biotinylated IL-16 to IL-6R. Were determined. Plates were coated with the mouse antibody MT18. After blocking, soluble recombinant human IL-6R (SR344) was added. After washing, samples from C0S cells were serially diluted and added to each well along with biotinylated IL-16. After washing, alkaline phosphatase-bound stripes Avidin was added. After incubation and washing, the substrate buffer was added. After incubation, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured. Figure 5 shows the results.
  • DNA encoding the appropriate reconstituted human V region was recloned into a convenient vector. I needed to do it.
  • the DNAs of plasmids a 1 ys 11 and F 10 encode the L and H proteins of reconstituted human D1.3, respectively, and DNA and FR encoding FR from human REI. Each has a DNA encoding FR from NEW.
  • DNA sequence encoding H region V region of reconstituted human D1.3 An approximately 70 Obp NcoI-BamHI fragment containing Fc was excised from F10, and was ligated to the HindIII-BamHI site of PBR327 using a HindIII-NcoI adapter. By subcloning, Vh-lys-PBR327 was obtained. Next, this plasmid, HindIII-BamHI fragment was excised, and subcloned into HindIII and BamHI cleaved pUC19 to obtain Vh-1 ys-p UC l 9 was obtained.
  • the DNA sequence encoding the L chain V region FR is humanized CAM P
  • FIG. 6 schematically shows the primer and PCR reactions used for the preparation of DNA encoding the first version of the V region of the H chain of reconstituted human PM-1.
  • R 1; SEQ ID NO: 41) and forward primer E (APCR 4 SEQ ID NO: 42) hybridize to the DNA sequence on this vector.
  • APCR1 and APCR4 were specifically designed for the pUC19 vector, but universal M13 sequence primers can also be used.
  • CDR1 transplantation Mutagenized primer B (phV-1; sequence No .: 43), CDR2 transplanted primer C (phv-2; SEQ ID NO: 44), and CDR3 transplanted primer D (phV-3; SEQ ID NO: 45) are 40 to 60.
  • DNA having a length of bp and encoding the CDR of the H region V region of mouse PM-1 and the DNA sequence encoding the human FR in the tandem DNA sandwiching the DNA encoding the CDR Become.
  • the front primer APCR4 and the rear primer D were used.
  • the first PCR product containing the DNA encoding the mouse PM-1 CDR3 sequence was purified and used as a forward primer in the second PCR reaction with primer C as the rear primer.
  • a second PCR product containing DNA encoding CDR2 and CDR3 of mouse PM-1 and a second PCR product containing DNA encoding all three CDRs of mouse PM-1 was used as a primer in the next PCR step.
  • the mutagenesis primer P hv-1 was used not only for the transplantation of CDR1 of mouse PM-1 antibody, but also for each Ser to Tyr at positions 27 and 30 in human FR1 and for S er to T hr Designed for mutation to Each 1 0 0/1 PCR reactions are typically l O iriM T ris - HC l (P H 8. 3), 5 0 mM KC 1, 1.
  • the second PCR reaction about 1 ⁇ g of the purified first PCR product and 25 m 01 e of the mutagenized primer Phv-2 were used as primers. PCR conditions were the same as described for the first PCR reaction. Similarly, the 665? From the second PCR reaction? 1? The product was used in a third PCR reaction with primer Phv-1 and the 7377 bp PCR product from the third PCR reaction was used in a fourth PCR reaction with primer APCR1. The 1.172 kb PCR product from the fourth PCR reaction was purified, digested with Hind III and BamHI, and then reconstituted. Approximately 700 bp fragment containing the PM-1 antibody H protein V region was subcloned into the PUC19 vector. Two of the four clones sequenced had a DNA sequence encoding the correct amino acid sequence and were named pUC-RVh-PMla.
  • mutagenesis PCR primers Five types were synthesized to prepare DNAs encoding other versions of the reshaped PM-1 antibody H protein V region. Each PCR reaction was performed under essentially the same conditions as described above. Due to version “b”, the mutagenic primer ⁇ ⁇ —m4 (V a1 -71 ⁇ Arg-71) (numbering according to Kabat et al .; see Table 4) (SEQ ID NO: 4) 6) and APCR 4 were used in the first PCR reaction with pUC—RVii—PM1a as type I DNA. The PCR product from this first PCR reaction was purified and used with Primer APCR1 as a forward primer in a second PCR reaction.
  • the PCR product from the second PCR reaction was purified using a 1.6% low melting point agarose gel, digested with HindIII and BamHI, and subcloned with PUC19 to obtain pUC-RVh — I got PM lb.
  • amino acid sequence of “f” and the nucleotide sequence encoding it are shown in SEQ ID NO: 54.
  • FIG. 7 schematically shows the primers and PCR reaction used in the preparation of DNA encoding the first version of the reshaped human PM-1 antibody L chain V region.
  • CDR1 transplanted primer-pk V-1 SEQ ID NO: 50
  • CDR2 transplanted primer-pkv— 2 SEQ ID NO: 51
  • CDR3 grafted primer pkv-3 SEQ ID NO: 52
  • the PCR reaction was performed as described above.
  • the #PCR reaction contained 1 ⁇ l of each of the pkv-3 primers and the APCR 4 primers.
  • the 350 bp PCR product from the first PCR reaction was purified using a 1.5% low melting point agarose gel and used as the forward primer in the second PCR reaction.
  • the PCR product from the second PCR reaction was purified, digested with BamHI and Hindlll, and CDR3 was transferred.
  • the 500 bp fragment containing the inoculated DNA was subcloned into the PUC19 vector for DNA sequencing. Plasmid DNA with the correct sequence was identified and used as Type I DNA in the next PCR reaction.
  • 25 pmo 1 e of mutagenic primer pkv-2 and APCR 4 were used.
  • the PCR product from the third PCR reaction was purified and used with Primer Pkv-1 as a primer in the fourth PCR reaction.
  • the PCR product from the fourth PCR reaction was used as a primer in the fifth PCR reaction together with the APCR1 primer.
  • the 972 bp PCR product from the fifth PCR reaction was purified, digested with BamHI and Hind111, and subcloned into PUC19 for DNA sequencing. A problem was identified in the CDR2 region, and two additional PCR reactions were required.
  • the PCR product from the fifth PCR reaction cloned into the PUC19 vector was used as Type II DNA.
  • the primers were Pkv-2 and APCR4.
  • the PCR product from the sixth PCR reaction was purified and used with the APCR1 primer as the primer in the seventh PCR reaction.
  • the PCR purified from the seventh PCR reaction was purified, digested with BamHI and HindIII, and the 500 bp DNA fragment was subcloned into PUC1.3 for DNA sequencing. Two of the five clones sequenced had the correct DNA sequence. This
  • the PCR product from the first PCR reaction was purified and used with the APCR1 primer as the primer in the second PCR reaction.
  • the PCR product from the second PCR reaction was purified, digested with BamHI and Hindlll, and subcloned into pUC19 for DNA sequencing. This clone is called p U C _ R V 1 — P M
  • Proposal i Example—8 Construction of a vector using a cytochrome megalovirus progenitor (HCMV) mouth motor to express a genetically engineered antibody in mammalian cells (Figure 1)
  • HCMV cytochrome megalovirus progenitor
  • a DNA fragment encoding the V region of the L chain of the chimera PM-1 antibody and a DNA fragment encoding the V region of the H chain of the chimera PM-1 antibody were isolated in human cells, respectively.
  • HCM human cytomegalovirus
  • the L-expression vector contains the human A: C region (TH R abbitts et al., Carr.TOP.Microbiol.Immuno 1. (1 984) 1 14:16 6—17 1). Contains the encoding genomic DNA, and the heavy chain expression vector
  • HCMV expression vectors are versatile and can be used for transient and stable expression in various mammalian cell types.
  • the human polypeptide chain elongation factor lo: (HEF-1 ⁇ ) is one of the most abundant proteins. It is expressed in most cells.
  • the transcriptional activity of human EF — l or b It is about 100 times as large as that of the Tehranhansa (D W. Kim, et al., Gene (199,0) 91: 2 17—22 3 and T. Uetsuki, et al., J. B. iol.Chem. (1 989) 2 64: 5 791 -5 798).
  • the 2.5 kb HEF-1 or promoter--enhancer region is about 1.5 kb DNA flanking the 5'-end of the gene, 33 bp in the first exon, 33 bp It is composed of 943 bp in the tropon and 10 bp in the first part of the second exon.
  • a 2.5 kb HindII-EcoRI fragment was added to plasmid p EF32 1 — CAT (DW Kim et al., Gene (1990) 91: 2 17—22 3; And T. Uetsuki et al., J. Biol. Chem. (1 989) 2 6 4: 5 7 9 1 — 5 7 9 8), and pd KCR vector (M.
  • PTEF-1 was digested with EcoRI, filled in with K1 enow polymerase, and ligated to the HindIII linker. Then, H ind lll about 1. 6 kb from the modified PTEF- 1 vector DNA - c cut out the S mal fragment H CMV—1 2 h-gr 1 was partially digested with Eco RI
  • Plasmid HCMV—12h—grl ( ⁇ 2) was digested with EcoRI, filtered with K1enow polymerase, and digested with HindIII. An approximately 7 kb fragment containing the DNA sequence encoding the human r11C region was ligated to the 1.6 kb HindIII-SmaI fragment containing the HEF-1 ⁇ open-ended motor--enhancer. The fragment was ligated to obtain HE F-12 h-grl.
  • the HEF-1 ⁇ promoter / enhancer region in this vector was identical to that in pTEF-1 except for the 38 Obp DNA flanking the 5′-region.
  • V h-PM 1 c, RV h — PM le and RV h — PM lf and HEF — PM h — grl are the reshaped human PM-11 antibody H chain V region version “a” and “b”, respectively. , "C”,
  • HEF-12k-gk HEF-1 or a promoter--an approximately 3.0 kb PVuI--HindIII fragment containing an enhancer region was converted to HEF-12h-- HCM cut out from gr 1 and produced in Example 5
  • the HEV-12k-gk was obtained by ligation to a 7.7 kb PvuI-HindIII fragment from the V-L chain expression vector HCMV-12k-gk.
  • HEF—12h—gr1 the DNA encoding the L protein V region in HEF—12k—gk present as a Hindll—BamHI fragment It can be easily exchanged for DNA encoding the L domain V region.
  • Plasmid HEF-PMh-gr1 is converted to HCMV-pmh-gr1 HCHV promoter by the EF1 or promoter region (Pvul-Hindlll fragment) of HEF-12-gr1 (Fig. 8).
  • RV 1 - PM 1 b RV 1 - PM 1 b
  • HEF- PM K - gk reconstruction human L Zhen V regions, respectively, "a” and "b", as well as a DNA encoding the mouse PM one 1 L Town V region.
  • bra Sumi de HEF- PM K - gk is, HEF- 1 2 k- gk ( Figure
  • HCMMV pmka—gk HCMV promoter region (Pvul—Hindlll fragment) by the EF1 or promoter region (PvuI-HindIII fragment)
  • the plasmid PSV2—dhir (S. Subramani et al., Mol. Cell. Biol. (1989)) 1:85 54-8 6) (AT CC 33694) was digested with Sphl and Pvu11, filtered with K1 enow volumease, and self-ligated to obtain PSV 2 — dhfr-rum E. ( Figure 10).
  • An approximately 3.7 kb EcoRI fragment containing the HCM V promoter, the DNA encoding the H protein V region, and the DNA encoding the human r—1C region was ligated with the EcoRI fragment. It was cut out from HCMV-PMh-grl by digestion.
  • This fragment was ligated to Eco RI—digested p SV 2—dhfr— ⁇ to obtain DHFR-room E—PM h—g ⁇ 1.
  • a similar vector was created based on the HEF-1o promoter—an H chain expression vector using an enhancer (see FIG. 11).
  • Eco RI—digested p SV 2—dhfr—E and DHFR—E 12—h The BamHI site following the dhir sequence in DHFE-amE-12h-gr1 was obtained by removing the BamHI site by partial digestion with BamHI, filin by Klenow polymerase and self-ligation. did.
  • the above improved plasmid can be used for the production of the reshaped human PM-1 antibody of the present invention.
  • Example 1 Expression and analysis of various versions of reshaped human PM-1 antibody
  • ⁇ Cells expressing the L chain and H chain of the reconstituted human PM-1 antibody were co-transformed (c0-transfected) into ⁇ cells.
  • each HEF-1 or vector expressing the chimera PM-1 antibody L chain and H chain was also co-transformed into C0S cells.
  • the medium from the transformed C0S cells was collected and analyzed by ELISA for (1) the amount of human IgG antibody present in the supernatant, and (2) binding to IL-6R. was analyzed for its ability to IgG. next, The same samples were further tested by ELISA for the ability of the antibody to inhibit binding of human IL-16 to human IL-16R.
  • HCMV chimera PM-1 antibody H-chain
  • HCMV-PMka-gk and HCMV-PMh-grl Two types of purge ions in the reshaped human PM-1 antibody L chain V region were evaluated by co-transforming _ ⁇ _ ⁇ ⁇ cells with ⁇ ⁇ gr 1). Cells were also co-transformed with vectors expressing the chimera PM-1 antibody light chain and H H (HCMV-PMka-gk and HCMV-PMh-grl). The data from unpurified 0 C 0 S cell supernatant was used to determine the binding of human IL-6R to the reconstituted human PM-1 antibody.
  • Example 1 Reconstructed humans to improve expression levels ⁇ Correction of 1 V region
  • the cDNA coding for the V region was recloned using PCR primers.
  • the expression vectors RV1—PMla and RVh—PM1 ⁇ for the L and H chains were co-transformed into C0S cells. 48 hours later, prepare a total of 13 ⁇ 4 ⁇ ', tCiiirgwin, Biochemistr (i979) 18: 52994-52299), and PCR antibody for mouse antibody V region. 5 ⁇ g of total RNA was used for single cDNA synthesis as described. 3 types PCR primers were designed and synthesized.
  • LEV-P1 (SEQ ID NO: 60) and HEV-P1 (SEQ ID NO: 58) have a subscribing donor sequence and a Bam HI site, and have V regions of the L chain and H chain, respectively. Used as a forward primer for
  • HEV-P2 (SEQ ID NO: 59) harbors a HindIII site and a Kozak consensus sequence before the ATG initiation codon, and a backward primer for the light chain and heavy chain V regions. Used as 1 0 0/1 by PCR reaction of 2 0 T ris - HC 1 ( . P H 8 8), 1 0 mM KC 1, 1 0 mM (NH 4) 2 S 04, 2 mM M g S 0 4 , 0.1% Triton X—100, 0.1 li / g BSA, 250 Md NTP, 2.5 u Vent DNA polymerase (Bio. Labs, UK).
  • a 50% single cDNA synthesis reaction product and a 10 O Opmo 1 e front primer and a rear primer were provided.
  • Each PCR tube was covered with 50 ⁇ l of mineral oil, and after an initial denaturation of 1.5 minutes at 94 and 94. 50 minutes at C for 1 minute.
  • the cycle reaction was performed 30 times at C for 1 minute and at 72 for 1 minute, and then incubated at 72 ° C for 10 minutes.
  • 408 bp PCR product with L chain V region and 4 4? with H chain V region? 013 ⁇ 4 The product was purified using a 2.0% low melting point agarose gel and digested with BamHI and Hindlll and subcloned into PUC 19 vectors, each with p UC -RV 1 PM.
  • V region of the reshaped human PM-1 antibody L chain and H chain was found to have inappropriate splice donor and acceptor sites (see SEQ ID NOS: 54 and 55). That). These sites within the light chain V region are not frequently used (approximately 10% of mRNA), while these sites within the heavy chain V region are frequently used (mRNA About 90%). This aberrant splicing resulted in low levels of expression of reshaped human PM-1 antibody. To avoid abnormal splicing of the V region, a part of the splice donor was removed by PCR.
  • a rear primer NEW-SP1 (SEQ ID NO: 61) and a forward primer NEW-SP2 (SEQ ID NO: 62) were synthesized.
  • This primer changes the DNA sequence TGGGTGA GA to the DNA sequence TGGGTTCGC.
  • the PCR reaction conditions were as described above for the cloning of the cDNA, but the type I DNA was 5 ng of pUC—RVh-PM1f13 and the primer was HEV—P2 And N EW—SP 2 or HEF—PI and N EW—SP 1.
  • PCR products from the two PCR reactions were purified using a 2% low melting point agarose gel and used in a PCR ligation reaction.
  • the splice-donor region in the reshaped human ⁇ -1 antibody L chain V region was replaced with the PCR primer R ⁇ I-S ⁇ 1 (SEQ ID NO: 63) and REI-SP 2 (sequence). No .: Removed using 64).
  • the primer changes the DNA sequence CAGGTAAGG to a DNA sequence CAGGAAAGG.
  • RV h—PM 1 f — 4 is obtained by replacing the Hind lll — B am HI fragment of RV h — PM lf with the H ind III — B am HI region of PUC-RV-PM l ⁇ — 4.
  • SEQ ID NO: 57 shows the sequence of version “a” in which the introns of the reshaped human PM-1 antibody L chain V region have been removed, and shows the sequence of the reshaped human PM-1 antibody H chain V region.
  • SEQ ID NO: 56 shows the sequence of the version "f" from which the indentation has been removed.
  • Example 1 Preparation of DNA coding for the reshaped human AUK12-20 antibody L chain V region
  • Reconstituted human AUK12-20 Antibody L chain V region coding Figure 16 shows the steps for preparing DNA.
  • the gene encoding the human antibody L chain V region, which becomes type III, is incorporated into the PUC19 vector using the restriction enzymes HindIII and BamHI sites.
  • Eight PCR primers (A to H) are prepared, and the gene encoding the V region is divided into four regions and amplified by the first PCR.
  • Primers A and H have the same DNA sequence as the pUC19 vector.
  • Primers B, C and D are 40 to 60 bp primers each having the gene sequence of the CDR region to be transplanted.
  • Primers E, F and G are complementary to the 15-20 bp DNA sequence on the 5 'side of primers B, C and D, respectively.
  • the four first PCRs use primers A and E, B and F, C and G, and D and H, respectively.
  • PCR products A-E encode FR1 and BF encodes CDR1 and FR2.
  • the 3 'side of the A-E fragment and the 5' side of the BF fragment have 15 to 20 bp of complementarity, so that these fragments can be ligated later.
  • the BF fragment is also complementary to the CG fragment encoding CDR2 and FR3.
  • the C-G fragment also has complementarity with the DH fragment encoding CDR3 and FR4.
  • these four types of fragments can be linked to each other by their mutual complementarity.
  • the second PCR product thus obtained has the three grafted CDRs and, after digestion with Hind III and Bam HI, is transformed into the pUC19 vector. Sub-cloning.
  • DNA encoding the reshaped human PM-1 antibody as type I and coding for the V region version "a" is inserted into the plasmid pUC19. Plus PUC — RV 1 — PM la — 4 was used.
  • Said primers A to H have the following sequence:
  • Rear primers for CDR transplantation 122-LI122-L2 and 122-L3 after purification using 12% polyacrylamide gel containing 8 M urea used.
  • the PCR reaction at 100/1 was 20 mM Tris-HC 1 (pH 8.8), 10 mM KC 1, 10 mfl (NH 4 ) 2 S 0 4 2 mM Mg S 04, 0.1% Triton X — 100, 0.1 lg g 0 BSA, 250 md NTP, 5 u Vent DNA polymerase (Bio Labs. U.K.), 5 O ng of p UC—RV 1 —PM la —40 ⁇ ⁇ , and each had forward and backward primers of 100 P mo 1 es.
  • Each PCR tube was covered with 50 ⁇ l of mineral oil and after an initial denaturation at 94 ° C for 1.5 minutes, followed by 94 ° C for 1 minute, 50 ° C for 1 minute and 72 ′. The reaction was performed for 30 minutes at C for 30 minutes, and then incubated for 70 minutes at 72 ° C.
  • New paper PCR products of 25 bp (A-E), 96 bp (B-F), 130 bp (C-G) and 123 bp (D-H) were reduced by 2.0%.
  • Purification was performed using melting point agarose (FMC, Bio. Products, USA) gel. That is, a piece of agarose containing each DNA fragment was cut out and melted at 65 ° C for 5 minutes, and the same volume of 2 mM N a C 1 2 0 mM to ⁇ the T ris - HC plus 1 (P H 7. 5). The mixture was extracted with phenol and lip form, and the DNA fragment was recovered by ethanol precipitation and dissolved in 10 mM Tris-HC1 (pH 7.5) containing ImM EDTA, And used in the PCR ligation reaction.
  • Mouse monoclonal antibody AUK12 A CDR of the L chain of 20 has a DNA encoding the V region of the L chain grafted with the grafted L chain V region.
  • the product of the second 558 bp PCR is 2.0% low melting point agarose gel. Purified using Le, and after B am Ri by the HI and H ind UI digestion to confirm the subcloned Ngushi, nucleotide sequence in PUC 1 9 vector, PUC - to obtain a 1 2 2 0 a - RV L .
  • the amino acid sequence of the obtained L protein V region and the nucleotide sequence encoding it are shown in Sequence Listing 71.
  • the HindIII-BamHI DNA fragment having the L region V region of the reshaped human 12—20 antibody was ligated with the above plasmid p UC—RV L— 122. Cleavage from 0a, insert the L-chain expression vector HEF-121g into Hindll-BamHI site and express reconstituted human AUK12-20 antibody L chain V region version a A vector, RV L — 122 0 a, was obtained.
  • Example 1 Expression and analysis of L chain of reconstituted human AUK12-20 antibody
  • HEF- 1 2 Reconstituted human AUK12-20 antibody L chain version "a" was evaluated by co-transformation of C0S cells with h-grl (Example 5). Ie, COS cells such that the 1 X 1 0 7 cells / ml phosphate - were suspended in bufferedsaline (PBS), 1 about this cell suspension 0. 8 ml DNA (each plus Mi de 1,900 volts (V) and 25 my using a GenePu1 sar device (BioRad) A pulse was given at the capacitance of the clofarad (F).
  • PBS bufferedsaline
  • the electroporated cells were added to 20 ml of DMEM medium (GIBCO) containing 10% fetal calf serum (r-globulin-free). 72 After incubation for 2 hours, collect the culture supernatant, centrifuge to remove cell debris, and store under sterile conditions for a short time at 4'C or for a long time at 120 did.
  • DMEM medium GIBCO
  • fetal calf serum r-globulin-free
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • alkaline phosphatase-conjugated goat anti-human IgG (r-chain specific, Sigma) was added. After incubation and washing, substrate buffer was added. After further incubation, the reaction was stopped and the absorbance at 405 nm was measured. Purified human IgG (Sigma) was used as a standard.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay to confirm binding ability to human IL-16R
  • Example 15 Construction of reshaped human 12-20 antibody H chain gene using human subgroup I (HSGI) consensus sequence
  • HSGI human subgroup I
  • the primers 122-H1, 12220-H2 and 122-H3 were used after purifying using a 12% polyacrylamide gel containing 8 M urea, respectively.
  • the nucleotide sequence of each primer is as follows.
  • Example 1 3 The first PCR reaction was carried out using the same primer pairs, A1 and El, B1 and Fl, C1 and Gl, and Dl and HI. -E 1), 75 bp (B 1-F 1), 1 73 bp (CI — The first PCR products of —Gl) and 105 bp (Dl—HI) were purified on a 2.0% low melting point agarose gel and used in the next second PCR ligation reaction.
  • the second PCR (initiating the PCR ligation reaction) was performed using 0.2 // g of the above-mentioned first PCR product, and the mouse AUK12-20 antibody was obtained.
  • a 495 bp PCR product containing the human H-domain V region into which the H-domain V CDRs were transplanted was obtained and purified using a 2.0% low-melting point agarose gel.
  • the B am HI ⁇ beauty after digestion by H ind lll, resulting B am HI - the H ind III fragment was subclasses Royungu the p UC l 9 vector to confirm the base sequence, PUC - RV H - 1 2 20 a was obtained.
  • the conditions for the PCR reaction is carried out similarly to the condition, ⁇ DNA is 5 0 ng of p UC- RV H - a 1 2 2 0 a, and primer is SGI - SP 1 and U N. IVERSAL (SEQ No. 8 2), or SGI — SP 2 and REVERSE (SEQ ID NO: 8 3).
  • the PCR products from the two PCR reactions were purified using a 2% low melting point agarose gel and used in a PCR ligation reaction.
  • the 981 PCR reaction solution containing 0.2 ⁇ g each of the first PCR product and 5 u of Vent DNA polymerase was mixed with 94 ⁇ (for 2 minutes at 50 ° C for 2 minutes.
  • the mixture was incubated for 5 minutes at ⁇ ⁇ and ⁇ 2, and the ligation reaction was performed.Next, UNIVERSAL and REVERSE primers of 100 Pm01e each were added, and the mixture was covered with 50 ⁇ 1 of mineral oil. 30 cycles of a second PCR, 1 minute at 94'C, 1 minute at 50'C, and 1 minute at 72, and then 10 minutes at 72 ° C.
  • the DNA fragment of 495 bp obtained in the second PCR was purified using a 2.0% low melting point agarose gel, digested with Hind III and Bam HI, and then digested with PUC 19 vector. After subcloning into DNA, the nucleotide sequence was confirmed, and PUC-RV fate112 2a-2 was obtained.
  • Two sets of mutagenic PCR primers were synthesized to generate DNA encoding other versions (b-d) of the reshaped human A UK12-22 antibody H chain V region. Each PCR reaction is described above. The reaction was performed under essentially the same conditions.
  • the second PCR (initiating the PCR ligation reaction) was carried out in the same manner as in the above reaction conditions. This gave a 495 bp product (version "b").
  • This H ind lll - was digested with B am HI, elements, sub claw and Jung to p UC l 9 vector, p UC RV H - to give a 1 2 2 0 b.
  • the mutagenic primers 122 H-m2a (SEQ ID NO: 80), 122 H-m2b (SEQ ID NO: 81) and the product — PCR product (DNA encoding version “c”) is obtained using RV H —122 0a, digested with Hindlll and BamHI, and pUC19 vector H
  • 220 c was obtained.
  • the mutagenic primers 122 0 H—m1a (SEQ ID NO: 78), 122 H— m1b (SEQ ID NO: 79) and PUC—RV H —1 as type I Using 220c, a PCR product (version d) was obtained, digested with HindIII and BamHI, and digested with HindIII of the pUC19 vector. PUC—RV H— 122 d was obtained by inserting into one BamHI site.
  • Example 1 Expression and analysis of various versions of reconstituted human 12-20 antibody
  • Reconstituted human 1 2 — 20 antibody One of four types of vectors that express the antibody H chain (RV H- 122 0 a, RV inconvenience-122 b, RV inconvenience 1 222 c or RV H - by co-transformation of COS cells by 1 2 2 0 a, -! 1 2 2 0 c) and reconstituted human AUK 1 2 - 2 0 antibody L chain base expressing compactors RV L Again Constituent human 12-20 The four versions of the antibody H chain V region were evaluated. For comparison, C0S cells were also analyzed using vectors expressing the chimera 12-20 antibody L chain and H chain (HEF-12h-gr1 and HEF-12-21g).
  • the human antibody with the highest homology to the H chain V region of the mouse monoclonal antibody AUK12-20 was HAX by searching the protein database "Leeds" (J. Immunol). 1 og 1 3 9, 2 4 9 6-2 5 0 1, 1 9 8 7, antibody and gene sequence produced by B cellybridoma 2 1/28 from SLE patient, Fig. 4 and 5, amino acid The acid sequence is described in Fig. 6).
  • the V region of the H chain V region of the reconstructed human slE22O antibody was designed using the FR region of the HAX antibody and the CDR of the H region V region of the mouse monoclonal antibody AUK12—20.
  • New paper was prepared by chemical synthesis. That is, a DNA encoding the full-length 439 bp 0 s 1 e122 OH antibody H protein V region has 6 DNAs each having a length of 90 to 94 bp each having a 21 bp overlap region. Gonucleotides (s1e1220hl-6; SEQ ID NOs: 86-91, respectively). In designing the oligonucleotide, a secondary structure was searched, and the third base of the codon was changed so that amino acid substitution did not occur at a site having a structural problem. Figure 20 shows the interrelationship between these oligonucleotides and the process up to the completion of the double-dye synthesis.
  • the reaction shown in FIG. 20 is performed using the PCR method. That is, six synthetic oligonucleotides are added to the same PCR reaction tube to perform the first PCR reaction. Thereby, annealing extension of two oligonucleotides can be performed, and further, four oligonucleotides or full-length oligonucleotides can be obtained.
  • the resulting product was purified, digested with BamHI and HindIII, and then subcloned into a PUC19 vector to complete the sequence.
  • the amino acid sequence of the H chain V region version “a” of the reshaped human s 1 e122 0 H antibody coded in this plasmid and the nucleotide encoding the same The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 94.
  • the mutation-inducing primer of PUC-RV fate—s 1 e 122 0 Ha, ⁇ 0 P mo 1 e Reaction mixture containing s1 el2 220 Hml or s1 e1 220 Hm2 and 50 pmole terminal primer B was added to the reaction mixture at 94'C after denaturing for 1.5 minutes, at 94 '.
  • Reconstructed human s 1 e 122 0 H antibody H protein V region version "DNA encoding dj was prepared as follows. P UC—RV H —S 1 e as type III 122 Hb was used.
  • the first PCR reaction was performed 30 cycles using 50 pmo 1 e each of the induced primers slel 220 Hm2 and the terminal primers B.
  • the resulting 178 bp PCR product was purified on a 1.6% low melting point agarose gel and used as a second PCR primer.
  • a second PCR was performed using this primer and 50 pmole ⁇ terminal primer A to obtain a DNA fragment of 439 bp. This was purified by subclasses b one Jung digestion after PUC 1 9 vector at B am HI and H ind lll, check the quinuclidine Reochi de sequence, PUC - RV H - S 1 e 1 2 2 0 H d I got
  • the reshaped human s1e1220H antibody encodes the H chain V region of the H chain.
  • Bam HI Hind III fragment containing DNA — PUC — RV K — s 1 e 1 2 2 0 H b, PUC-RVH — s 1 e 1 2 2 0 H ”and p UC — RV H — s 1 e 1 2 2 OH d and inserted into the H- expression vector HE — 1 2 ⁇ 1 — 81 1 11 11 (1111-1 Bam HI site), and each expression vector, RV H — slel 2 20 H b, RV Struktur— slel 220 Hc and RV H — slel 220 Hd were obtained respectively Reconstructed human s 1 e 122 0 H Four types of antibodies expressing H chain One of the vectors (RV H -s 1 e 122 0 Ha
  • the present invention relates to chimeric and reshaped human antibodies, chimeric L antibodies and chimeric L antibodies in which one or more amino acids have been replaced by other amino acids, as long as they retain their original properties. It also includes L chain, chimera H chain and reconstituted H chain, reconstituted L chain V region, and reconstituted H chain V region, and DNAs encoding them.
  • the starting hybridoma used in the present invention was prepared as follows.
  • mouse T cells expressing human IL-6R on the cell surface were prepared as an immunogen as follows. . That is, Y. Hirata et al., J. Immunol. Vol. 144, 290-0-290 (1989), a plasmid pZipneo IL-6R was purified from a mouse T-cell line, CTLL, according to a conventional method. 2 (AT CCTIB2 14), and the resulting transformant was screened using G18 according to a conventional method to give about 30 000 human IL per cell. A cell line expressing one 6R was obtained. This cell line is called CTBC3.
  • mice were cultured in R PM I 1 6 4 0 the CTBC 3 cells according to a conventional method, and the cultured cells were washed four times with PBS buffer, And C 5 7 BL Roh 6 mice 1 X 1 0 7 cells by The mice were immunized by intraperitoneal injection. This immunization was performed once a week for 6 weeks.
  • Spleen cells are obtained from the immunized mice, and the myeloma P3U1 cells are fused using polyethylene glycol according to a conventional method, and the fused cells are screened as follows. I did. Simultaneous transfection of the IL-6R negative human T cell line JURKAT (AT CCCRL 8163) with plasmid pZipneo IL-16R, and screening of transformed cells Thus, a cell line expressing about 100,000 IL-16R per cell was obtained. This cell line was named NJBC8.
  • a hybridoma cell line producing an antibody that recognizes NJBC8 lysed at NP-40 but does not recognize JURK AT lysed at NP-40 was cloned and designated MT18.
  • Hypri-Dorma MT 18 Deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest Treaty on July 10, 1990 as FERM BP- No. 299-29 (FE RM BP—29999).
  • FERM BP- No. 299-29 FE RM BP—29999
  • human IL-16R was extracted as an antigen as follows. 3 X 1 0 9 ⁇ of human myeloma cells (IL - 6 R producing cells) 1 ml of 1% diformate phosphatonin, 1 0 mM Application Benefits ethanol Amin slow Street solution (pH 7. A), 0. 1 It was dissolved in 5 MNaCI and ImM PMSF (phenylmethylsulfonylfluoride V; Wako Pure Chemical Industries).
  • the MT18 antibody produced by the hybridoma MT18 prepared in Reference Example 1 was bound to Bromcian-activated Sepharose 4B (Pharmacia) in a conventional manner.
  • the MT18 antibody-bound Sepharose 4B was mixed with the above-mentioned cell lysate to bind the solubilized IL-16R to the MT18 antibody on Sepharose 4B. Substances non-specifically bound to Sepharose 4B were washed away, and IL-6R bound to Sepharose 4B via MT18 antibody was used as the immunogen.
  • BALB mice were immunized intraperitoneally once a week for 4 weeks using the above immunogen.
  • spleen cells were obtained from the immunized mice, and fused with myeloma cells P3U1 using polyethylene glycol according to a conventional method.
  • the fused cells were screened as follows. Ma Instead, the culture supernatant was mixed with 0.01 ml of PrOtein G Sepharose (Pharmacia) to allow the immunoglobulin in the supernatant to be adsorbed to the Protein G Sepharose.
  • Hypri-Dorma clone which produces an antibody that specifically binds to IL-16R, was isolated, and the t- Hyperidoma, named PM1, was sent to the Institute of Microbial Industry and Technology, the Institute of Industrial Science and Technology. Deposited under the St. Treaty on July 10, 1990, as Deposit No. 298 (FE RM BP—2998).
  • Soluble IL-16R (SR3444) as an immunogen was described in Yasukawa, K. et al., J. Biochem. 108, 673- 706, 199, 90. It was prepared according to the method described.
  • the plasmid p ECE dhfr 344 which has a cDNA encoding IL-16R in which the codon at position 345 from the N-terminus is replaced by a stop codon is CHO (5E 2 7) Transfect the cells, and The cultured cells were cultured in serum-free medium (3-0 medium, Sanko Junyaku). The resulting supernatant was concentrated with HF-Lab1 (Tosoichi) and B1ue-5PW Purified with ram and Phenyl 1-5 PW columns. The purified soluble IL-16R showed a single band on SDS-PAGE.
  • Serum samples were collected from the immunized mice, serially diluted with dilution buffer, and used in Goldsmith, PK, Ana 1 tica 1 Biochemisty, 117, 53— The assay was performed by ELISA according to the method described in pp. 60, 198. That is, the sample was coated with SR344 (0.1 Ig / ml). Plates were blocked with 1% BSA and the diluted sample was added to it .. Mouse IgG bound to SR344 was transformed with goat anti-mouse IgG G alkaline phosphatase (AP). (ZYMED) and a substrate for alkaline phosphatase (Sigma-104).
  • spleen cells were obtained from 5 BALB / c mice.
  • the spleen and bone marrow cell lines (P3U1) were mixed at a ratio of 25: 1, fused using PEG 150, and 0.7-: 1 in 200 wells. . were cultured at a cell concentration of 1 XI 0 6 cells Noueru.
  • the supernatants from the wells were analyzed for their ability to bind to SR344 (primary screening, referred to as the R344 recognition assembly), and the interaction between SR344 and IL-6R. Their ability to inhibit binding was screened (by 1L-16 / s1L6R binding inhibition assay (RBIA)).
  • the first screening yielded 240 positive jewels and the second screened Jung yielded 36 positive jewels.
  • SR 3 4 4 recognition case was performed as follows. Plates (MaxiSorp, Nunc) coated with goat anti-mouse Ig (C appel) (lg Zml) were blocked with 1% BSA and 100-1 wells Of the hybridoma culture supernatant was added thereto, and then incubated at room temperature for 1 hour. After washing the plate, 20 ng / ml of SR344 was added to the well, and the plate was incubated at room temperature for 1 hour. The amount of SR344 captured by the immobilized antibody derived from the supernatant was measured using rabbit anti-SR344 IgG (# 2, 5 g / ml) and goat anti-rabbit.
  • IgG-Al lipophosphatase (1: 300, T ago) and substrate (1 mgZml, Sigma-104) and its addition was quantified by measuring the absorbance at 4 0 5- 6 0 0n m followed les.
  • the RBIA was performed as follows. The plate coated with the MT18 antibody was filled with 100 ng Zml of SR344 (100 ⁇ 1 Zell) and incubated for 1 hour at room temperature. After washing the plate, 501 / well of hybridoma culture supernatant and 50 ⁇ 1 well of IL-1 conjugate (20 ng / ml) were simultaneously added to each well. The wells were then incubated for 1 hour at room temperature. Add streptavidin-AZP (1: 700, PIERCE) and the corresponding substrate (Sigma-104) and measure the absorbance at 450-600 nm to determine the SR. The amount of biotin-IL-16 bound to 344 was measured.
  • the present invention provides a reshaped human antibody against human IL-16R, wherein the CDRs of the V region of the human antibody are replaced by CDRs of a mouse monoclonal antibody against human IL-16R.
  • I have.
  • Most of this reshaped human antibody is derived from human antibodies, and CDRs have low antigenicity. Human antibodies have low antigenicity to humans and are therefore expected as therapeutics.
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
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  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • Organism name Mouse Immediate origin
  • GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
  • Sequence type nucleic acid
  • ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAT 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glulie Asn
  • Sequence type nucleic acid
  • TAC TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT 384 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
  • Sequence type nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid
  • GAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTC ACT GCA GAT ACA TCT TCC AAC 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
  • Sequence Length 381 Sequence type: nucleic acid
  • Sequence type nucleic acid

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Description

明 細 書 ヒ ト イ ンターロ イ キ ン一 6受容体に対する再構成ヒ ト抗体 技 術 分 野
本発明は、 ヒ トイ ンターロイキン一 6受容体 （ I L— 6 R ) に対するマウスモノ ク ローナル抗体の可変領域 （ V領域） 、 ヒ ト I L— 6 Rに対するヒ ト Ζマウ スキメ ラ抗体、 ヒ ト ラ イ ト鎖 （ L鎖） V領域及びヒ トヘビー鎖 （Η鎖） V領域の相補 性決定領域 （ C D R ) がヒ ト I L一 6 Rに対するマウ スモノ クローナル抗体の C D Rにより置き換えられている再構成
( r e s h a p e d ) ヒ ト抗体に関する。 本発明はさらに、 上記の抗体又はその部分をコー ドする D N Aを提供する。 本 発明はさらに、 前記 D NAを含んで成るベクター、 特に発現 ベクター、 並びに該ベクターにより形質転換された宿主に関 する。 本発明はさらに、 ヒ ト I L一 6 Rに対するキメ ラ抗体 の製造方法、 及びヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の 製造方法を提供する。 背 景 技 術
イ ンターロイキン一 6 ( I L— 6 ) は一連の細胞により生 産される多機能サイ ト力イ ンである。 このものは免疫応答、 急性期反応及び造血を調節し、 そして宿主防御機構において 中心的役割を演ずる。 このものは広範な組織に作用して、 標 的細胞の性質に応じて成長誘導効果、 成長阻害効果及び分化 誘導効果を発揮する。 I L一 6に対する特異的レセブタ一
( I L - 6 R ) は、 I L— 6の多機能性に従ってリ ンパ系細
胞及び非リ ンバ系細胞上で発現される。 I L一 6遺伝子の異
常発現が種々の疾患、 特に自己免疫疾患、 メサンジゥム細胞
増殖性糸球体腎炎、 及び形質細胞腫ノ骨髄腫の発病に関与す
ることか'示唆されている （ H i r a n o ら、 I mm u n o I .
T o d a y , 1 1 , 4 4 3 — 4 4 9 , 1 9 9 0の総説を参照
のこと） 。 ヒ ト骨髄腫細胞は I L一 6を生産しそして I L—
6 Rを発現することが観察される。 実験において、 I L一 6
に対する抗体が骨髓腫細胞の試験管内での増殖を阻害し、 そ
してそれ故にヒ ト骨髄腫の発癌においてォー トク リ ン調節ル
ープが機能していることが示された （ K a w a n o ら、 N a
t u r e , 3 3 2 , 8 3 , 1 9 8 8 ) 。
I L - 6 Rは種々の動物細胞の表面に存在し、 そして I L
一 6に特異的に結合し、 そして細胞表面上の I L一 6 R分子
の数が報告されている （ T a g a ら、 J . E x p . M e d ,
1 9 6 , 9 6 7 , 1 9 8 7 ) 。 さらに、 ヒ ト I L— 6 Rをコ
ードする c D NAがクローン化され、 そして I L— の一
次構造が報告されている （Y a m a s a k i ら、 S c i e n
c e , 2 4 1 , 8 2 5， 1 9 8 8 ) 0
マウスのモノ ク口一ナル抗体はヒ トにおいて高度に免疫原
性 （ 「抗原性」 という場合もある） があり、 そしてこの理由
のため、 ヒ トにおけるそれらの療法的価値は制限される。 ヒ *、 トにおけるマウス抗体の半減期は比較的短い。 さらに、 ヒ ト
抗マウス抗体は、 予定された効果を妨害するのみならず、 患 者における不都合なァレルギ一応答の危険をもたらす免疫応 答を惹起するこ とな く して頻回投与することはできない。
これらの問題を解決するため、 ヒ ト型化 （ h u m a n i z e d ) 抗体の製造方法が開発された。 マウス抗体は 2つの方 法でヒ ト型化することができる。 より簡単な方法は、 可変領 域がもとのマウスモノ ク ローナル抗体に由来しそして定常領 域が適当なヒ ト抗体に由来するキメ ラ抗体を作製する方法で ある。 得られるキメ ラ抗体はもとのマウス抗体の完全な可変 領域を舍有し、 そしてもとのマウス抗体と同一の特異性をも つて抗原に結合するこ とを期待することができる。 さ らに、 キメ ラ抗体ではヒ ト以外に由来する蛋白質配列の比率が実質 的に減少しており、 そしてそれ故にもとのマウス抗体に比べ て免疫原性が低いと予想される。 キメ ラ抗体は抗原によ く結 合しそして免疫原性が低いが、 マウ ス可変領域に対する免疫 応答がなお生ずる可能性がある （ L 0 B u g 1 i o ら、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A, 8 4 , 4 2 2 0 - 4 2 2 4 , 1 9 8 9 ) 0
マウス抗体をヒ ト型化するための第二の方法は一層複雑で あるが、 しかしマウス抗体の潜在的な免疫原性をさ らに大幅 に低下させるものである。 この方法においては、 マウス抗体 の可変領域からの相補性決定領域 （ c o m p l e m e n t a r i t y d e t e r m i n i n g r e g i o n ; C D R ) をヒ ト可変領域に移植して 「再構成」 （ r e s h a p e d ) ヒ ト可変領域を作製する。 次に、 これらの再構成ヒ ト可変領 域をヒ ト定常領域に連結する。 最終的に再構成されたヒ ト型 抗体のヒ ト以外の蛋白質配列に由来する部分は C D Rと極く 一部のフレームワーク （ F R ) のみである。 C D Rは超可変 蛋白質配列により構成されている。 これらは種特異的配列を 示さない。 これらの理由のため、 マウス C D Rを担持する再 構成ヒ ト抗体はもばゃヒ ト C D Rを舍有する天然ヒ ト抗体よ り強い免疫原性を有しないはずである。
前記のごと く、 再構成ヒ ト抗体は療法目的のために有用で あると予想されるが、 ヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗 体は知られていない。 さらに、 再構成ヒ ト抗体の製造方法で あって任意の特定の抗体に普遍的に適用し得る方法は存在し ない。 従って、 特定の抗原に対する十分に活性な再構成ヒ ト 抗体を作製するためには種々の工夫が必要である。 ヒ ト I L 一 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体、 すなわち P M 1 および MT 1 8は作製されており （特願平 2 -189420) 、 そ して本発明者らはヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クロ一 ナル抗体 A U K 1 2— 2 0、 AU K 6 4— 7及び AUK 1 4 6 - 1 5を調製しているが、 本発明者らはヒ ト I L一 6 Rに 対する再構成ヒ ト抗体の作製を示唆する文献を知らない。
さらに、 ヒ ト骨髄腫細胞株が移植されたヌー ドマウスに、 ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体が注射さ れた時腫瘍の増殖が顕著に阻害されることを、 本発明者らは 見出した。 このことは、 骨髄腫の治療のための療法剤として 抗ヒ ト I L— 6 R抗体が有用であることを示唆している。 従 つて本発明はヒ ト I L一 6 Rに対する、 免疫原性の低い抗体 を提供しょう とするものである。 発 明 の 開 示
従って、 本発明はヒ ト I L 一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体 を提供する。 本発明はまた、 該再構成ヒ ト抗体の作製の過程 で有用なヒ トノマウスキメ ラ抗体を提供する。 本発明はさ ら に、 再構成ヒ ト抗体の部分、 並びに再構成ヒ ト抗体及びその 部分並びにキメ ラ抗体の製造のための発現系を提供する。
さ らに具体的には、 本発明は、 ヒ ト I L 一 6 Rに対するマ ウスモノ ク ローナル抗体の L鎖 V領域 ； 並びにヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク α—ナル抗体の H鎮 V領域を提供す る。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウ スモノ ク ローナル抗体の L鎮 V領域を含んで成る L鎮 ； 並び に
( 2 ) ヒ ト Η鎖 C領域、 及びヒ ト I L 一 6 Rに対するマウ スモノ ク ローナル抗体の Η鎖 V領域を含んで成る Η鎖 ； を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対するキメ ラ抗体を提供す 本発明はさ らに、 ヒ ト I L— 6 Rに対するマウ スモノ ク ロ ーナル抗体の L鎮 V領域の C D R ； 並びにヒ ト I L— 6 Rに 対するマウ スモノ ク ローナル抗体の Η鎖 V領域の C D Rを提 供する。
本発明はさ らに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 V領域のフ レームワーク領域 （ F R ) 、 及 び ( 2 ) ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の L鎖 V領域の C D R、
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト L 鎖 V領域；並びに
( 1 ) ヒ ト H鎖 V領域の F R、 及び
( 2 ) ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体 の H鏆 V領域の C D R、
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト H 鎖 V領域を提供する。
本発明はさらに、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体の C D Rを含んで成る L鎖 V領域、
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト L 鎖 ； 並びに
( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ ク口一ナル抗体の C D Rを含んで成る H鎖 V領域、
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト H鎮を提供する。
本発明はさらにまた、
( A) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎮 F R、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウス モノ ク ローナル抗体の L鎮 C D Rを舎んで成る L鎮 ； 並びに ( B ) ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 並びに ( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウス モノ ク ローナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎖 ； を含んで成る、 ヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体を提 供する。
本発明はまた、 前記種々の抗体構成ポリ ペプチ ド、 又はそ の部分をコー ドする DNAに関する。
本発明はまた、 上記 D NAを含んで成るベクター、 例えば 発現べクターに関する。
本発明はさ らに、 上記ベクターにより形質転換された宿主 を提供する。
本発明はさ らにまた、 ヒ ト I L— 6 Rに対するキメ ラ抗体 の製造方法、 及びヒ ト I L— 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の 製造方法を提供する。 図面の簡単な説明
図 1 は、 本発明の抗体ペプチ ドの発現のために有用な、 ヒ トサイ トメ ガロウイ ノレス （ H CMV) プロモーター Zェ ンハ ンサ一系を含んで成る発現べクターを示す。
図 2は、 ヒ ト I L一 6 Rに結合する本発明のキメ ラ抗体 A U K 1 2 - 2 0の能力の確認のための E L I S Aの結果を示 すグラフである。
図 3は、 ヒ ト I L— 6 Rへの ヒ ト I L一 6の結合を阻害す る本発明のキメ ラ抗体 AU K 1 2— 2 0の能力の確認のため の E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 4は、 ヒ ト I L一 6 Rへの本発明のキメ ラ抗体 P M 1 a 及び P M l bの結合についての E L I S Aの結果を示すグラ フである。
図 5 は、 ヒ ト I L— 6 Rへのヒ ト I L一 6 の結合を阻害す る本発明のキメ ラ抗体 P M l a及び P M l bの能力を試験す る E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 6は、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域の第一パージ ヨ ン （バージョ ン 「 a j ) の作製のダイアグラムである。 図 7は、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎮 V領域の第一バージ ヨ ン （バージョ ン 「 a 」 ） の作製のダイアグラムである。 図 8は、 H鎖の発現のために有用な、 ヒ ト ' ェロンゲーシ ヨ ン ' ファクター l a: ( H E F - 1 ) プロモーターノエン ハンサーを含んで成る発現プラスミ ド H E F— 1 2 - g τ 1 の作製の過程を示す。
図 9は、 L鎖の発現のために有用な、 H E F— l orプロモ 一ター Zェンハンサ一系を含んで成る発現プラスミ ド H E F - 1 2 k - g kの作製の過程を示す。
図 1 0 は、 H鎖の発現のために有用な、 増幅のための欠陥 S V 4 0プロモーターノエンハンサー配列に連結されたジヒ ドロフォ レー ト レダクターゼ （ d h f r ) 及び H C M Vプロ モーターノエンハンサーを含んで成る発現プラスミ ド D H F R - P M h - g l の作製の過程を示す。
図 1 1 は、 H鎖の発現のために有用な、 増幅のための欠陥 S V 4 0 一プロモーター /ェンハンサー配列に連結された d f r遺伝子及び E F 1 orプロモータ一ノエンハンサーを舍 んで成る発現プラスミ ド D H F R— Δ Ε— R V h— P M 1 — f の作製の過程を示す。
図 1 2は、 ヒ ト I L一 6 Rへの結合についての再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域のパージヨ ン 「 a」 及び 「 b」 の能 力を示すダラフである。
図 1 3は、 ヒ ト I L— 6 Rへの結合についての再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域のバージョ ン 「 f 」 +再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域パージヨ ン 「 a 」 の能力を示すグラフ である。
図 1 4は、 ヒ ト I L— 6 Rへの I L— 6の結合を阻害する 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域のバージヨ ン 「 f 」 +再 構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域バージヨ ン 「 a」 の能力を 示すグラフである。
図 1 5は、 それぞれ L鎖及び H鎖の発現のために有用な、 ヒ ト E F I — αプロモーター/ェンハンサーを含んで成る発 現プラス ミ ド H E F— VL — g k及び H E F— V h - g 1 を示す。
図 1 6は、 再構成ヒ ト AU K 1 2— 2 0抗体 L鎮 V領域バ 一ジョ ン 「 a」 をコー ドする D N Aの作製の過程を示す。
図 1 7は、 ヒ ト I L— 6 Rに結合する再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖 V領域の能力の確認のための E L I S Aの 結果を示すグラフである。 図中、 標準 AU K 1 2 - 2 0 (キ メ ラ） はキメ ラ A U K 1 2— 2 0抗体を C H O細胞により大 量に製造して精製したものについての結果を示す。
図 1 8は、 ヒ ト I L一 6 Rに結合する再構成ヒ ト A U K 1 2— 2 0抗体 （ L鎖バージョ ン 「 a」 + H鎖バージョ ン 「 b j ) の能力についての E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 1 9は、 ヒ ト I L— 6 Rに結合する再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 （ L鎮バージヨ ン 「 a j + H鎮バージヨ ン 「 d j) の能力についての E L I S Aの結果を示すグラフである。
図 2 0は、 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖 V領域の 化学合成の過程を示す。
図 2 1 は、 ヒ ト I L一 6 Rへの I L一 6の結合を胆害する 再構成ヒ ト s I e 1 2 2 0 H抗体 （ L鎮バージョ ン 「 a」 + H鎖バージヨ ン 「 a j ) の能力についての E L I S Aの結果 を示すグラフである。
図 2 2は、 ヒ ト I L一 6 Rへの I L一 6の結合を阻害する 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0抗体 （ L鎮バージヨ ン 「 a」 + H 鎖バージヨ ン 「 b」 ） の能力についての E L I S Aの結果を 示すグラフである。
図 2 3は、 ヒ ト I L一 6 Rへの I L一 6の結合を阻害する 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0抗体 （ L鎮バージョ ン 「 a」 + H 鎮バージョ ン 「 c j ) の能力についての E L I S Aの結果を 示すグラフである。
図 2 4は、 ヒ ト I L一 6 Rへの I L一 6の結合を阻害する 再構成ヒ ト s I e 1 2 2 0抗体 （ L鎮バージヨ ン 「 a」 + H 鎮バージヨ ン 「 d j ) の能力についての E L I S Aの結果を 示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
マウス V領域をコー ドする D NAのク ローユング さ らに詳し く は、 ヒ ト I L — 6 Rに対するマウスモノ ク ロ ーナル抗体の V領域をコー ドする D N Aをク ローン化するた めには、 遺伝子源として、 ヒ ト I L — 6 Rに対するモノ ク ロ ーナル抗体を生産するハイ プリ ドーマを作製するこ とが必要 である。 この様なハイ プリ ドーマと して、 特願平 2 — 189420 号明細書にはモノ ク ローナル抗体 P M 1 を生産するマウスハ イ ブリ ドーマ P M 1及び該抗体の性質が記載されている。 本 明細書の参考例 2 にハイ プリ ドーマ P M 1 の作製方法を記載 する。 本発明者らは、 それぞれがヒ ト I L — 6 Rに対するマ ウスモノ ク ローナル抗体を生産するハイ プリ ドーマ A U K 1 2 — 2 0、 A U K 6 4 — 7及び A U K 1 6 — 1 5 を作製し ている。 これらのハイ プリ ドーマの作製方法は本明細書の参 考例 3 に記載されている。
マウスモノ ク ローナル抗体の可変領域をコー ドする目的の D N Aをク ローン化するためハイ プリ ドーマ細胞を破壊し、 そしてし h i r g w i n り、 B i o c h e m i s t r y _1_ i, 5 2 9 4 , 1 9 7 7 に記載されている常法により全 R N Aを得る。 次に、 この全 R N Aを用いて、 J . W. L a r r i c k ら、 B i o t e c h n o l o g y , 丄， 9 3 4 , 1 9 8 9 に記載されている方法を用いて一本鎖 c D N Aを合成す る。
次に、 ポリ メ ラ一ゼ連鎖反応 （ P C R ) 法を用いて前記 c D N Aの有意義な部分の特異的増幅を行う。 マウスモノ ク ロ ーナル抗体のカ ッパ ( fc ) 型 L鎖 V領域の増幅のため、 配列 番号 ： 1〜 1 1 に示す 1 1種のオ リ ゴヌク レオチ ドプライ マ 一 (M o u s e K a p p a V a r i a b l e ; M K V ) 及び配列番号 ： 1 2に示すォリ ゴヌク レオチ ドプライ マー M o u s e K a p p a し o n s t a n t ; M K C ) ¾: それぞれ 5 ' —末端ブライマー及び 3 ' —末端プライマーと して使用する。 前記 M K Vプライ マーはマウス力 ツバ型 L鎖 リーダー配列をコードする D N A配列とハイブリダィズし、 そして前記 M K Cプライマーはマウスカ ツバ型 L鎮 C領域を コードする D N A配列とハイブリダィズする。 マウスモノク ローナル抗体の H鎖 V領域の増幅のため、 配列番号 ： 1 3〜 2 2に示す 1 0種のオリ ゴヌク レオチドブライマー （M o u s e H e a v y V a r i a b l e MH V ) 及び配列番 号： 2 3に示すオリ ゴヌク レオチ ドプライマー （M o u s e H e a v y C o n s t a n t ； M H C ) をそれぞれ 5 ' —末端プライマー及び 3 ' —末端ブライマーとして使用する。 なお、 5 ' —末端プライマ一はその 5 ' —末端近傍に制限 酵素 S a 1 I切断部位を提供する配列 G T C GA Cを舍有し、 そして 3 ' —末端プライマーはその 5 ' —末端近傍に制限酵 素 X m a 1切断部位を提供するヌク レオチド配列 C C C G G Gを舍有する。 これらの制限酵素切断部位は可変領域をコー ドする目的の D NA断片をクローニングベクターにサブク ロ 一ユングするために用いられる。
次に増幅生成物を制限酵素 S a 1 I及び X m a I で切断さ せて、 マウスモノクローナル抗体の目的とする可変領域をコ ードする D N A断片を得る。 他方、 プラスミ ド P U C 1 9 の ごとき適当なクローニングベクタ一を同じ制限酵素 S a 1 I 及び X m a I により切断させ、 この p U C 1 9に前記 D N A 断片を連結することにより、 マウスモノ ク ローナル抗体の目 的とする可変領域をコー ドする D N A断片を舍むブラス ミ ド を得る。
クローン化された D N Aの配列決定は任意の常法に従って 行う ことができる。
目的とする D NAのクローン化及びその配列決定を実施例 1〜 3に具体的に記載する。
相補性決定領域 （ C D R )
本発明はさ らに、 本発明の各 V領域の超可変又は相補性決 定領域 （ C D R ) を提供する。 L鎖及び H鎖の各対の V領域 は抗原結合部位を形成する。 L鎮及び H鎖上のこの領域は同 様の全般的構造を有しそして各領域は配列の比較的保存され た 4個のフレームワーク領域を舍み、 それらは 3個の超可変 領域又は C D Rにより連結されている （ K a b a t , E . A. り、 「；> e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I mm u n o l o g i c a l I n t e r e s -t 」 ， U S D e p t . H e a l t h a n d H u m a n S e r v i c e s 1 9 8 3 ) 。 前記 4個のフ レームワーク領域 （ F R ) の多く の部分は 9—シー ト構造をとり、 C D Rはループを形 成する。 C D Rはある場合には ^—シー ト構造の一部分を形 成することもある。 C D Rは F Rによって非常に近い位置に 保持され、 そして他の領域の C D Rと共に抗原結合部位の形 成に寄与する。 本発明は、 ヒ ト型化抗体の素材として有用な これらの C D R、 及びそれをコー ドする D NAをも提供する。 これらの C D R領域は、 V領域の既知アミノ酸配列と照合す ることによって、 K a b a t , E . A. ら、 「 S e q u e n c e s o f P r o t e i n s o f I m m u n o 1 o g i c a 1 I n t e r e s t j の経験則から見出すことが でき、 実施例 4において具体的に説明する。
キメ ラ抗体の作製 ξ ヒ ト I L一 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト V領域を設計す るに先立って、 使用する C D Rが実際に抗原結合領域を形成 することを確かめる必要がある。 この目的のため、 キメ ラ抗 体を作製した。 さらに実施例 1及び 2に記載される 4種類の モノ ク ローナル抗体のク ローン化された DNAのヌク レオチ ド配列から推定されるマウス抗ヒ ト I L— 6 R抗体のァミノ 酸配列を相互に、 及び既知のマウス及びヒ トの抗体の V領域 と比較した。 4種類のモノ クローナル抗体のそれぞれについ て、 1セ ッ トの典型的な機能的マウス L及び Η鎖 V領域がク ローニングされた。 しかしながら、 4種類すベてのマウス抗 ヒ ト I L— 6 R抗体は比較的異なる V領域を有していた。 4 種類の抗体は相互に単に微小な相違ではなかった。 クローン 化されたマウス V領域を用いて 4種類のキメ ラ抗ヒ ト I L一 6 R抗体を作製した。
キメ ラ抗体を作製するための基本的な方法は、 P C R—ク ローン化 c D Ν Αに見られるようなマウスリーダ一配列及び V領域配列を、 哺乳類細胞発現ベクター中にすでに存在する ヒ ト C領域をコー ドする配列に連結することを含んで成る。 前記 4種類のモノ ク ローナル抗体の内、 モノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0からのキメ ラ抗体の作製を実施例 5に記載 する。
モノ ク ローナル抗体 P M— 1からのキメ ラ抗体の作製を実 施例 6に記載する。 マウス P M— 1 L鎮リーダー領域及び V領域をコー ドする c D N Aを、 ヒ ト L鎖 C領域をコー ドす る ヒ トゲノ ム D N Aを舍有する発現べクターに P C R法を用 いてク ローン化した。 マウス P M— 1抗体 （単に 「 P M— 1 抗体」 又は 「 P M」 という場合もある） の H鎖リーダー及び V領域をコー ドする c D N Aを、 ヒ ト r — 1 C領域をコー ド するゲノ ム D N Aを舍有する発現べクターに P C R法を用い てサブク ローン化した。 特に設計された P C Rプライ マ一を 用いて、 マウス P M— 1抗体の V領域をコー ドする c D N A をそれらの 5 ' —及び 3 ' —末端において適当な塩基配列を 導入して （ 1 ) それらが発現ベクターに容易に揷入されるよ うに、 且つ （ 2 ) それらが該発現べクタ一中で適切に機能す るようにした。 次に、 これらのプライ マーを用いて P C Rに より増幅して得たマウス P M— 1抗体の V領域を、 所望のヒ ト C領域をすでに舍有する H C M V発現ベクター （図 1 ) に 挿入した。 これらのベクターは、 種々の哺乳類細胞系におけ る遺伝子操作された抗体の一過性 （ t r a n s i e II t ) 発 現又は安定な発現のために適当である。
マウ ス P M— 1抗体中に存在する V領域と同じ V領域を有 するキメ ラ P M— 1 抗体 （バージョ ン a ) の作製に加えて、 キメ ラ P M— 1抗体の第二のバ一ジョ ン （バ一ジョ ン b ) を 作製した。 キメ ラ P M— 1抗体 （バージ ョ ン b ) においては、 L鎮 V領域中の位置 1 0 7のァミノ酸がァスバラギンからリ ジンに変えられている。 マウス PM— 1抗体からの L鎮 V領 域と他のマウス L鎖 V領域との比較において、 位置 1 0 7に おけるアルギニンの存在は異常であることが注目された。 マ ウス X L鎮 V領域においては、 位置 1 0 7の最も典型的ァミ ノ酸はリ ジンである。 マウス P M— 1抗体の L鎖 V領域中の 位置 1 0 7に非典型的なァミノ酸であるアルギニンを有する ことの重要性を評価するため、 位置 1 0 7を典型的なァミノ 酸であるリ ジンに変えた。 この変更は、 P C R—変異誘発法 ( M. K a mm a nら、 N u c l . A c i d s R e s . ( 1 9 8 7 ) 1 7 : 5 4 0 4 ) を用いて L鎮 V領域をコ一ド する D N A配列中に必要な変更を行う ことにより達成された。 キメ ラ P M— 1抗体バージョ ン （ a ) はヒ ト I L— 6 Rに 結合する活性を示した。 キメ ラ P M— 1抗体バージョ ン （ b ) もパージヨ ン （ a ) と同様にヒ ト I L一 6 Rに結合する。 同 様に、 他の 2種類のモノ ク ローナル抗体 A U K 6 4一 "7及び A U K 1 4 6— 1 5からキメ ラ抗体を作製した。 4種類すベ てのキメ ラ抗体はヒ ト I L一 6 Rによ く結合し、 機能的測定 において、 正しいマウス V領域がクローン化されそして配列 が決定されていたことが示された。
種類のマウス抗ヒ ト I L一 6 R抗体から、 ヒ ト I L— 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の設計及び作製のための第一の候 捕としてマウス PM— 1抗体を選択した。 マウス PM— 1抗 体の選択は主として、 ヌー ドマウスに移植されたヒ ト骨髄腫 細胞に対するマウス抗ヒ ト I L一 6 R抗体及びキメ ラ抗体の 効果を研究して得られた結果に基く。 4種類のマウ ス抗ヒ ト 1 ー 6 1¾抗体の内、 P M - 1抗体が最も強い抗腫瘍細胞活 性を示した。 又、 キメ ラ P M— 1抗体はキメ ラ A U K 1 2 — 2 0抗体より も強い抗腫瘍性を示した。
マウスモノ ク ローナル抗休 P M— 1 の V領域と既知のマウ ス及びヒ トの抗体の V領域との比較
マウスモノ ク ローナル抗体の C D Rがヒ ト モノ ク ローナル 抗体に移植されている再構成ヒ ト抗体を作製するためには、 マウスモノ ク 口一ナル抗体の F Rと ヒ トモノ ク 口一ナル抗体 の F Rとの間に高い相同性が存在することが望ましい。 従つ て、 マウス P M— 1抗体の L鎮及び H鎖の V領域を、 OW L (, 0 r L e e d s ) d a t a b a s e o f p r o t e i n s e q u e n c e s に見出されるすべての既知マウ ス 及びヒ ト の V領域と比較した。
マウス抗体の V領域に関しては、 P M— 1抗体の L鎖 V領 域はマウス抗体 m u s i g k c k o ( C e n , H . T. ら、 J . B i o l . C h e m. ( 1 9 8 7 ) 2 6 2 : 1 3 5 7 9 一 1 3 5 8 3 ) の L鎖 V領域と最も類似しており、 9 3. 5 %の同一性 （ i d e n t i t y ) が存在した。 P M— 1抗体 の H鎖 V領域はマウ ス抗体 m u s i g v h r 2 ( F . J . G r a n t ら、 N u c l . A c i d s R e s . ( 1 9 8 7 ) 1 5 ： 5 4 9 6 ) の H鎖 V領域に最も類似しており、 8 4. 0 %の同一性が存在した。 マウス P M— 1抗体の V領域は既 知マウ ス V領域に高比率の同一性を示し、 マウ ス P M— 1抗 体の V領域が典型的なマウス V領域であることが示される。 このことはさらに、 クローン化された D N A配列が正しいと いう間接的な証明を与える。 一般に、 H鎖 V領域間に比べて L鎖 V領域間の方がより高い比率の同一性が存在する。 これ はおそら く、 H鎮 V領域に比べて L鎖 V領域において一般的 に観察されるより少ない量の多様性のためであろう。
ヒ ト抗体の V領域に関しては、 マウス P M— 1抗体の L鎖 V領域は、 R E I とも称されるヒ ト抗体 k 1 h u r e ( W. P a l mら、 P h y s i o l . C h e m. ( 1 9 7 5 ) 3 5 6 : 1 6 7 - 1 9 1 ) の L鎖 V領域に最も類似しており、 7 2. 2 %の同一性が存在する。 P M— 1抗体の H鎖 V領域は、 ヒ ト抗体 h u m i g h v a p (V A P) (H. W. S c h r o e d e r ら、 S c i e n c e ( 1 9 8 7 ) 2 3 8 : 7 9 1 — 7 9 3 ) に最も類似しており、 7 1. 8 %の同一性が存在する。 マウス P M— 1抗体からの再構成抗体をいかに設計するかを 考えるためにヒ ト V領域との比較が最も重要である。 ヒ ト V 領域への同一性の比率はマウス V領域への同一性の比率より 低い。 これはマウス P M— 1抗体の V領域がマウス V領域に 類似しており、 そしてヒ ト V領域には類似していないことの 間接的証明である。 この証明にまた、 ヒ ト患者における免疫 原性の問題を解決するためにマウス P M— 1の V領域をヒ ト 型化する （ h u m a n i z e ) ことが最善であることを示す。
マウス P M— 1抗体の V領域をさらに、 E.A. Kabatら、 、1987) Sequences of Pro teins of Immunological Interest, Forth Edition, U.S. Department of Health and Human Ser vices, U.S. Government Printing Of f iceにより定義される . ヒ ト V領域の異なるサブグループについてのコ ンセンサス配 列と比較した。 V領域の F R間で比較を行った。 その結果を 表 1に示す。
¾ L
マウス PM— 1の V領域の F Rと、 異なる種々のサブグルー プのヒ ト V領域のコ ンセ ンサス配列 <n の F Rとの間の同一 性 （％)
A. L鎖 V領域における F R
H S G I H S GII H S G III H S G IV
7 0. 1 5 3. 3 6 0. 7 5 9. 8 B . H鎖 V領域における F R
H S G I H S G II H S G III
4 4. 1 5 2. 9 4 9. 2
(1) コ ンセ ンサス配列は K a b a t ら （ 1 9 8 7 ) に記載 されている
マウ ス P M— 1抗体の L鎖 V領域の F Rはヒ ト L鎮 V領域 のサブグループ I ( H S G I ) のコ ンセ ンサス配列からの F Rに最も類似しており、 7 0. 1 %の同一性が存在する。 マ ウス P M— 1の H鎖 V領域の F Rはヒ ト H鎮 V領域のサブグ ループ 11 ( H S G II ) のコ ンセ ンサス配列からの F Rに最も 類似しており、 5 2. 9 %の同一性が存在する。 これらの結 果は、 既知のヒ ト抗体との比較から得られた結果を支持して いる。 ヒ ト R E I中の L鎖 V領域はヒ ト L鎖 V領域のサブグ ループ Iに属し、 そしてヒ ト V A P中の H鎖 V領域はヒ ト H 鎮 V領域のサブグループ 11に属する。 ヒ ト抗体中の V領域とのこれらの比較から、 再構成ヒ ト P M— 1抗体の V領域の設計の基礎となるヒ ト V領域を選択す ることが可能である。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域の 設計のためにはサブグループ I ( H S G I ) に属するヒ ト L 鎖 V領域を使用し、 そして再構成ヒ ト PM— 1抗体 H鎮 V領 域の設計のためにはサブグループ 11 ( H S G 11 ) に属するヒ ト抗体 H鎖 V領域を用いるのが最善であろう。
再構成ヒ ト PM— 1抗体 V領域の設計
再構成ヒ ト PM— 1抗体 V領域の設計における第一段階は、 設計の基礎となるヒ ト抗体 V領域を選択することであった。 マウス P M— 1抗体 L鎖 V領域中の F Rは、 サブグループ I に属するヒ ト抗体 L鎖 V領域中の F Rに最も類似していた (表 1 ) 。 前記のごと く、 マウス P M— 1抗体の L鎖 V領域 と既知ヒ ト抗体 L鎖 V領域との比較において、 それはヒ ト L 鎮 V領域のサブグループ Iの 1構成員であるヒ ト L鎖 V領域 R E I に最も類似していた。 従って、 再構成ヒ ト P M— 1抗 体 L鎖 V領域の設計において R E Iからの F Rを使用した。 また、 再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖 V領域の作製のための出 発材料として R E Iの F Rを使用した。
R E Iに基く これらのヒ ト F R中には、 もとのヒ ト R E I に比べて 5偭の相違が存在する （ k a b a t ら、 1 9 8 7、 によれば位置 3 9 , 7 1 , 1 0 4 , 1 0 5及び 1 0 7 ;表 2 を参照のこと） 。 F R 4中の 3個の変化 （位置 1 0 4 , 1 0 5及び 1 0 7 ) は他のヒ ト L鎖からの J領域に基いており、 そしてそれ故にヒ トからの逸脱を成すものではない （ L . R i e c h m a n n ら、 N a t u r e ( 1 9 8 8 ) 3 2 2 : 2 1 一 2 5 ) 。 位置 3 9及び 7 1 における 2個の変化はラ ッ ト C AM P A T H - 1抗体の L鎖 V領域の F R中に存在するァ ミノ酸にもどる変化であった （ R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8
再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域の 2つのバージョ ンを 設計した。 第一のバージョ ン （バージョ ン 「 a 」 ） において は、 ヒ ト F Rは再構成ヒ ト C A M P A T H— 1 H抗体中に存 在する R E I に基く F R ( R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) と同一であり、 そしてマウス C D Rはマウス P M— 1抗体の L鎖 V領域中の C D Rと同じであった。 第二のバージョ ン (バージョ ン 「 b」 ） はバージョ ン 「 a 」 に基き、 ヒ ト F R 3中の位置 7 1 におけるア ミノ酸 1個のみを異にする。 C. C h o t h i a ら、 J . o 1. B i o l . ( 1 9 8 7 ) 1 9 6 : 9 0 1 — 9 1 7により定義されるように、 残基 7 1 は L鎖 V領域の C D R 1 の標準的 （ c a n o n i c a l ) 構造 の部分である。 この位置のア ミノ酸は L鎮 V領域の C D R 1 ループの構造に直接影響する と予想され、 そしてそれ故に抗 体結合に大き く 影響するであろう。 マウス P M— 1抗体の L 鎖 V領域において、 位置 7 1 はチロ シンである。 再構成ヒ ト P M - 1抗体の L鎖 V領域のパージヨ ン 「 a 」 の設計に使用 した修飾された R E I の F Rにおいては位置 7 1 はフヱ ニル ァラニンであった。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域のバ 一ジョ ン 「 b 」 においては、 位置 7 1 のフエ二ルァラニ ン力'； マウス P M— 1抗体 L鎖 V領域中に見出されるよう にチロ シ 22
ンに変えられている。 表 2 は、 マウス P M— 1抗体の L鎖 V 領域、 再構成ヒ ト C AM P A T H— 1 H抗体中での使用のた めに修飾された R E I の F R ( R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) 及び再構成ヒ ト P M— 1抗体の L鎖 V領域の 2種類の バージョ ンの、 それぞれのア ミノ酸配列を示す。
表 2
FBI CDRl
1 2 3
12345678901234567890123 45678901234
67 YT YT
Figure imgf000024_0001
FR4
10
8901234567
VLPM-1 FGGGTKLEIN
REI FGQGTKVEI BVLa FGQGTKVEIK
RVLb 注 ： R E I の F Rは再構成ヒ ト CAM P AT H— 1 H抗体 中に見出されるものである （ R i e c h m a n nら、 1 9 8 8 ) 。 R E Iの F R中の 5個の下線を付したア ミ ノ酸はヒ ト R E Iのァ ミノ酸配列 （ P l a mら、 1 9 7 5 ; 0. E P P ら、 B i o c h e m i s t r y ( 1 9 7 5 ) 1 4 : 4 9 4 3 一 4 9 5 2 ) から異なるア ミ ノ酸である。 マウス P M— 1抗 体の H鎖 V領域中の F Rはサブグループ IIに属するヒ ト H鎖 V領域に最も類似している （表 1 ) 。 前記のごと く 、 マウ ス P M— 1抗体の H鎖 V領域と既知のヒ ト H鎖 V領域との比較 において、 これはヒ ト H鎖 V領域のサブグループ IIの 1構成 員である ヒ ト H鎖 V領域 VA Pに最も類似していた。 ヒ ト H 鎖 V領域のサブグループ IIの他の構成員である ヒ ト H鎖 V領 域 NEWを、 再構成ヒ ト PM— 1抗体の H鎖 V領域の作製の ための出発材料と して、 及び再構成ヒ ト P M— 1抗体の H鎖 V領域の設計のための基礎と して用いた。
再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域の 6種類のバージョ ン を設計した。 6種類のバージョ ンのすべてにおいて、 ヒ ト F Rは再構成 D 1. 3中に存在する N EW F Rに基いており、 そしてマウス C D Rはマウス P M— 1抗体 H鎮 V領域中の C D Rと同じである。 ヒ ト F R中の 7個のア ミノ酸残基 （位置 1 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 , 4 8及び 7 1 ； 表 3参照） は 抗原結合に不都合な影響を与える可能性を有するものと同定 されている。 マウス P M— 1抗体の V領域のモデルにおいて、 H鎖 V領域中の残基 1 は C D Rループの近く に位置する表面 残基である。 残基 2 7 , 2 8 , 2 9、 及び 3 0は、 C. C RRRRRRN V VVVVVEV H H H H p w H H H
d β f c a b
o t h i a ら、 N a t u r e ( 1 9 8 9 ) 3 4 ： 8 7 7 - 8 8 2により推定されるように H鎖 V領域の C D R 1 の標準的 ( c a n o n i c a l ) 構造の部分であり、 そしてノ又は H 鎮 V領域の第一構造ループの部分を構成することがマウス P M— 1抗体 V領域のモデルにおいて観察される （ C h 0 t h i a ら、 1 9 8 7 ) 。 残基 4 8 はマウス P M— 1抗体の V領 域のモデルにおいて埋つた （ b u r i e d ) 残基として観察 された。 埋つた （ b u r i e d ) 残基の変化は V領域及びそ の抗原結合部位の全体構造を破壌する可能性がある。 残基 7 1 は、 C h o t h i a ら （ 1 9 8 9 ) により予想されるよう に H鎮 V領域の C D R 2の標準 （ c a n o n i c a l ) 構造 の部分である。 再構成ヒ ト P M— 1抗体の 6種類のバージョ ンはヒ ト N E Wの F R中のこれら 7つの位置のア ミノ酸の変 化の異る組合わせを含む （表 3を参照のこと） 。
表 3
FR1 CDR1
1 2 3
123456789012345678901234567890 123455
A
DVQLQESGPVLVKPS8SLSLTCTVTGYSIT SDHAKS QVQLQESGPGLV PS TLSLTCTVSGSTFS QVQLQBSGPGLVRPSQTLSLTCTVSGYTFT SDHAWS
Y--T
D Y--T
Y--T
D Y--T
YSIT FR2 CDR2
5 6
67890123456789 01223456789012345
A
VHPM- WIR8FPGNKLBWMG YIS- YSGITTYNPSLKS
NEW WVRQPPGRGLEWIG
V„a WVRQPPGRGLEWIG YIS- YSGITTYNPSLKS
RV„b
RV„c
RVHd M-
RVHe M-
RV„f
FR3
7 8 9
67890123456789012222345678901234
ABC
V„PM-1 RISIT DTSKNQFFLQLNSVTTGDTSTYYCAR
NEW EVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYCAR
V„a RVTMし VDTSKNQFSし RtSSVTAADTAVYYCAR
RVHb β ^
RV„c R
VHd R
V„e R
RV„f R—
CDB3 FR4
10 11
5678900012 34567890123
AB
VHPM-1 SLARTTAMDY WGQGTSVTVSS
NEW WGQGSLVTVSS
RV„a SLARTTAMDY WGQGSLVTVSS
RVHb
RV„c
RV„d
RV„e
RV„f 注 ： N E Wの F Rには再構成ヒ ト C AM P A T H— 1 H抗 体の第一バージ ョ ン （ R i e c h m a n n ら、 1 9 8 8 ) 中 に見出される ものである。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 V領域をコードする D N Aの作製 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎮及び H鎖 V領域のそれぞれの 第一バージヨ ンをコードする D N Aを新規な P C R利用法を 用いて作製した。 要約すれば、 適当なヒ ト F Rをすでに舍有 する再構成ヒ ト V領域をコードするプラスミ ドを P C Rブラ ィマーを用いて修飾し、 出発ヒ ト V領域中に存在する C D R をマウス P M— 1抗体からの C D Rにより置換した。 再構成 ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域をコードする D N Aの作製のた めの出発材料は、 再構成ヒ ト D 1. 3 L鎮 V領域をコードす る D N Aを舍有するプラスミ ド D N Aであった。 この再構成 ヒ ト D 1. 3 L鎖 V領域はヒ ト L鎖 V領域 R E I中に存在す る F Rに基いて作製された。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V 領域をコードする D N Aの作製のための出発材料は再構成ヒ ト D 1. 3 H鎮 V領域をコードする D N Aであった。 この再 構成ヒ ト D 1. 3抗体 H鎖 V領域をコードする D NAはヒ ト H鎮 V領域 N EW (W. V e r h o e y e n ら、 S c i e n c e ( 1 9 8 8 ) 2 3 9 : 1 5 3 4 — 1 5 3 6 ) をコードす る D NA中に存在する F Rをコードする D NAに基いて作製 された。
所望のヒ ト F Rをコードする D N Aを舍有する出癸ブラス ミ ド D NAを選択した後、 マウス D l . 3 C D Rに代るマウ ス P M— 1抗体 C D Rの置換を可能にするように P C Rプラ イマ一を設計しそして合成した。 各再構成ヒ ト P M— 1抗体 V領域にっき、 3種類のプライ マーはマウス P M— 1抗体 C D Rをコードする D N A配列を舍有し、 そして 2種類のプラ イマ一は再構成ヒ ト V領域をコー ドする全体 D N A配列を挟 むように設計されている。 一連の P C R反応における 5種類 の P C Rプライマーの使用が、 出発再構成ヒ ト V領域中に存 在するヒ ト F Rをコー ドする D N A及びマウス P M— 1抗体 V領域中に存在する C D Rをコードする D N Aから成る P C R生成物をもたらした （実施例 7、 並びに図 7及び図 8を参 照のこと） 。 P C R生成物をク ローン化し、 そして配列決定 して、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎮及び H鎖 V領域のパージ ヨ ン 「 a 」 の全体 D N A配列が正しいア ミ ノ酸配列をコ一ド していることを確認した。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領 域バージ ョ ン 「 a 」 の配列を配列番号 5 5に示す。
再構成ヒ ト P M— 1抗体 V領域の他のバージ ョ ンをコー ド する D N Aは、 公表されている P C R—変異誘発法 （ K a m m a ηら、 1 9 8 9 ) にわずかな変更を加えた方法を用いて 作製した。 再構成ヒ ト Ρ Μ— 1抗体 V領域の設計に関して記 載したように、 再構成ヒ ト Ρ Μ— 1抗体 L鎖 V領域の 1 つの 追加のバ一ジ ョ ン （バージ ョ ン 「 b」 ） をコー ドする D N A を作製し、 そして再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域の 5種 類の追加のバージョ ン （バージ ョ ン 「 b」 ， 「 c 」 > 「 d 」 ， 「 e 」 、 及び 「 f 」 をコー ドする D N Aを作製した。 これら の追加のバージョ ンは、 第一バージョ ンからの一連の微細な 変化を含む。 ァ ミノ酸配列のこれらの微細な変化は P C R変 異誘発を用いて D N A配列の微細な変更を行う ことにより達. 成された。 D N A配列に必要な変化を導入する P C Rプラ イ マーが設計された。 一連の P C R反応に続き、 P C R生成物 をクローン化し、 そして配列決定して D NA配列中の変化が 計画通りに起っていることを確認した。 再構成ヒ ト P M— 1 抗体 H鎖 V領域バージヨ ン 「 f 」 の配列を配列番号 5 4に示 す。
再構成ヒ ト P M— 1抗体 V領域の種々のバ一ジョ ンの D N A配列を配列決定により確認した後、 再構成ヒ ト P M— 1抗 体 V領域をコードする D N Aを、 ヒ ト C領域をコー ドする D N Aをすでに舍有する哺乳類細胞発現べクターにサブクロー ユングした。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 V鎖 L領域をコードす る D NAをヒ ト L鎮 C領域をコー ドする D N A配列に連結し た。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域をコードする D N A をヒ ト 一 1 C領域をコードする D N A配列に連結した。 再 構成ヒ ト P M— 1抗体のより高レベルの発現を達成するため、 図 1 に示すような H CM V発現べクタ一を修飾して、 H C M Vプロモーター · ェンハンサ一領域をヒ トェロ ンゲーショ ン ファ クター 、 h u m a n e l o n g a t i o n f a c t o r ； H E F— l ) プロモーター ' ェンハンサ一により置 き換えた （図 1 5を参照のこと） 。
次に再構成ヒ ト L鎮 V領域パージョ ン （ a ) と、 H鎖 V領 域バージョ ン （ a ) 〜 （ f ) のすベての組合せをヒ ト I L一 6 Rへの結合について試験し、 そしてその結果、 実施例 1 1 に詳細に記載するように、 L鎖バージョ ン （ a ) と H鎖バー ジョ ン （ f ) とを含んで成る再構成ヒ ト抗体がキメ ラ P M— 1抗体 （ a ) と同じレベルで I L一 6 Rに結合する能力を示 した。
新たな用紙 発現のレベルを改良するための、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 V領域をコー ドする D N Aの変更
_g_Q ^細胞中で生産される再構成ヒ ト P M— 1抗体の発現 レベルの検討において、 再構成ヒ ト H鎖の発現が常に、 再構 成ヒ ト L鎮又はキメ ラ L鎖もしく は H鎖の発現レベルに比べ て約 1 0分の 1 であることが明らかになった。 低レベルの発 現を生じさせる問題点は再構成ヒ ト H鎮 V領域にあるようで あった。 低レベルの発現が低レベルの転写の結果であるか否 かを特定するため、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖及び H鎖を 発現する各ベクターにより同時形質転換された C 0 S細胞か ら R NAを調製した。 マウス P M— 1抗体 V領域をコー ドす る D N Aの P C Rクローニングについて記載したようにして 一本鎖 c D N Aを合成した。 再構成ヒ ト L鎖又は H鎖 V領域 をコー ドする D N A配列の両端を挟むように設計された P C Rプライ マーを用いて、 再構成ヒ ト L鎮 V領域又は再構成 H 鎖 V領域に対応する前記一本鎖 c D N Aから P C R生成物を 生成せしめた。
再構成ヒ ト L鎖 V領域をコードする D N Aについて、 2種 類の P C R生成物が存在し、 一方は予想通り 4 0 8 bpの長さ を有し、 他方はより短い 2 9 9 bpの P C R生成物であつた。 正しいサイ ズの P C R生成物は P C R生成物の全生成量の約 9 0 %を占め、 そして短い P C R生成物は全生成量の約 1 0 %を占めた。 再構成ヒ ト H鎖 V領域についてもやはり 2種類 の P C R生成物が存在し、 一方は予想通り 4 4 4 bpの長さを 有し、 そして他方は 3 7 O bpの長さの短い P C R生成物であ つた。 しかしながらこの場合、 正しくない短い方の P C R生 成物が P C R生成物の全生成量の大部分、 すなわち約 9 0 % を占めた。 正しいサイズの P C R生成物は P C R生成物の全 生成量の約 1 0 %に過ぎなかった。 これらの結果は、 再構成 ヒ ト V領域をコ一ドする R N Aの幾らかが欠失を舍むことを 示した。
どの配列が除去されたかを決定するため、 短い方の P C R 生成物をクローユングし、 そして配列決定した。 D NA配列 から、 L鎖及び H鎮 V領域のいずれについても D N Aの特定 の部分が欠けていることが明らかになった。 除去された配列 を挟む D N A配列の検討により、 これらの配列はスプライス ドナ——ァクセプタ一配列のコ ンセ ンサス配列 （ B r e a t h n a c h . Rら、 A n n . R e v. B i o c h e m. 1 9 8 1 ) 5 0 ： 3 4 9 - 3 8 3 ) に相当することが明らかと なった。 再構成ヒ ト H鎖の低い発現レベルは、 再構成ヒ ト H 鎖 V領域の設計が、 どちらかと言えば効果的なスブラィス ド ナ一ーァクセブター部位を不注意に形成させたためであると 説明された。 さらに、 再構成ヒ ト L鎖 V領域の設計はどちら かと言えば非効果的なスプライス ドナ一一ァクセプタ一部位 を不注意に形成させたようであった。 これらのスプライス ド ナー一ァクセプター部位を除去するため、 ヒ ト P M— 1抗体 L鎮及び H鎖 V領域のそれぞれバージョ ン 「 a 」 及び 「 f 」 をコードする D N A配列のわずかな変更を前記の P C R—変 異誘発法を用いて行った。
低下した発現レベルの原因は、 再構成ヒ ト L鎮及び H鎖 V 領域 （配列番号 ： 5 4及び 5 5 ) の両者のリーダー配列をコ 一ドする D N A中のィ ン ト 口 ンの存在であると考えられた。 これらのイ ン ト ロ ンはもともと、 再構成ヒ ト D 1. 3抗体の V領域 （ V e r h o e y e n ら、 1 9 8 8 ) をコー ドする D N Aの作製において使用されたマウス H鎖リーダー配列
(M. S . N e u b e r g e r ら、 N a t u r e ( 1 9 8 5 ) 3 1 ： 2 6 8 - 2 7 0 ) をコー ドする D N Aに由来する。 再構成ヒ ト D 1. 3抗体をコー ドする D N Aは、 マウス免疫 グロプリ ンプロモータ一を用いる哺乳類細胞ベクターにおい て発現されたためマウスリーダーィ ン ト ロ ンの存在が重要で あった。 リーダーィ ン ト ロ ンは免疫グロブリ ンプロモーター からの発現のためには重要であるが、 しかし H C M Vのごと きウィルスプロモーターからの発現のためには重要でない
M. S . N e u b e r g e r り、 N u c l . A c i d s R e s . ( 1 9 8 8 ) 1 6 : 6 7 1 3 — 6 7 2 4 ) 配列を舍 有している。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖及び H鎮をコー ド する D N Aが免疫グロブリ ンプロモータ一以外のプ口モータ 一を用いるベクターにおいて発現される場合、 リーダー配列 中のィ ン トロンは、 再構成ヒ ト V領域をコ一 ドする D N Aの P C R—クローニングにより除まされた （実施例 1 2を参照 のこ と） 。
低下した発現レベルの他の可能性ある原因は、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎮 V領域をコー ドする D N Aとヒ ト γ — 1 C 領域をコー ドする D N Aとの間のィ ン トロ ン内の約 1 9 0 bp の非機能的 D N Aの存在であると考えられた。 再構成ヒ ト B I — 8 H鎮 V領域 （ P. T. J o n e s ら、 N a t u r e ( 1 9 8 6 ) 3 2 1 : 5 2 2— 5 2 5 ) をコー ドする DNA にもともと由来する DNA配列から再構成ヒ ト P M— 1 H鎖 V領域をコードする D N Aを作製した。 この最初の再構成ヒ ト V領域をコー ドする DNAはマウス NPの H鎖 V領域 （M. S. N e u b e r g e r り、 N a t u r e ; M, S. N e u b e r g e r ら、 EMB O J. ( 1 9 8 3 ) 2 : 1 3 7 3 一 1 3 7 8 ) をコードする D N Aから作製された。 再構成ヒ ト H鎮 V領域をコードする D N Aと、 発現ベクターに再構成 ヒ ト V領域をコー ドする D N Aを連結するための B a m H I 部位との間のィ ン ト ロ ン中に存在する約 1 9 0 bpのこのス ト レツチは、 再構成ヒ ト V領域をコードする D NAの P C Rク ローニングの過程で除去された。
発現レベルを改良するために変形された再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖及び H鎖 V領域の最終バージヨ ンの D N A配列及 びァミノ酸配列を配列番号： 5 7及び 5 6に示す。 これらの DNA配列は、 表 2に示した再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖 V 領域のバージョ ン 「 a j 、 並びに表 3に示した再構成ヒ ト P M - 1抗体 H鎖 V領域のバージヨ ン 「 ί」 をコードする。 H E F - 1 or発現ベクター （図 1 5 ) に挿入された場合、 これ らのベクターは ト ランスフエク トされた C 0 S細胞中で約 2 gノ mlの抗体を一過性に生産する。 より多量の再構成ヒ ト P M— 1抗体を安定的に生産させるため、 d h i r遺伝子を 組み込んだ新しい H E F— 1 or発現べクタ一を作製した （実 施例 1 0及び図 1 1を参照のこと） 。 欠陥のある （ c r i p p l e d ) S V 4 0プロモーターを連結した d h f r遺伝子 を、 ヒ ト — 1 H鎮を発現する H C M Vベク ターについて記 載したのと同様にして、 ヒ ト r一 1 H鎖を発現する H E F— 1 αベク ターに導入した。 再構成ヒ ト Ρ Μ— 1抗体 L鎮を発 現する H E F— 1 orベクター及び再構成ヒ ト PM— 1抗体 H 鎖を発現する H E F— 1 or - d h f rベクターを C H O d h f r (一） 細胞に同時形質転換した。 安定に形質転換され た C H 0細胞系を、 ヌク レオ シ ドを舍有せず 1 0 %の F C S 及び 5 0 0 / g/mlの G 4 1 8を舍有する A l P h a — M i n i m u m E s s e n t i a l M e d i u m ( or— ME M) 中で選択した。 遺伝子増幅工程に先立って、 C H O細胞 系は 1 0 // gノ 1 06 細胞ノ日までの再構成ヒ ト PM— 1抗 体を生産することが観察された。
マウスモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2— 2 0の V領域と既 知のヒ ト抗体の V領域との比較
マウ スモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 - 2 0の力 ッパ一 L 鎖 （ L ) V領域の F Rと ヒ ト L鎖 V領域のサブグループ ( H S G) I〜IVの F Rとの相同性、 及びマウ スモノ ク ロ一 ナル抗体 A U K 1 2 - 2 0の H鎖 V領域の F Rとヒ ト H鎖 V 領域のサブグループ （ H S G ) I〜 111 の F Rとの相同性を 表 4に示す。 表 4
マウス A U K 1 2 — 2 0抗体の V領域の F Rと異る種々のサ ブグループのヒ ト V領域のコ ンセ ンサス配列の F R との間の 同一性 （％)
A. L鎮 V領域における F R
H S G I H S GII H S G III H S GIV
6 5 . 8 6 . 0 6 7. 6 6 7 . 6 B . H鎮 V領域における F R
H S G I H S G II H S G III
5 8 . 6 3 5 . 3 4 9. 1
表 4に示した様に、 マウスモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0の力 ッパー L鎮 （ A: L ) V領域は、 ヒ ト κ L鎮 V領域 のサブグループ （ H S G ) I 〜 IVとそれぞれ同程度 （ 6 4〜 6 8 %) の相同性を示す。 タンパクの D a t a b a s e " L E E D S " の検索より、 H S G— IVに属するヒ ト抗体 L e n t . S c h n e i d e r り、 P h s i o l . し h e m. 3 5 6 , 5 0 7 - 5 5 7 , 1 9 7 5 ) の L鎮 V領域が最 も高い 6 8 %の相同性を示す。 一方、 マウスモノ ク ローナル 抗体 P M— 1 のヒ ト型化に用いられているヒ ト抗体 R E I は H S G— I に属し、 マウスモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0のし鎮¥領域とは、 6 2 %の相同性を示す。 またマウス モノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0 の L鎮の c a n o n ί c a I構造を調らベてみると （ C . C h o t h i a ら、 J . M o 1 . B i o l . ( 1 9 8 7 ) 1 9 6 : 9 0 1 〜 9 1 7 ) 、 特に L 2が L e nより R E I とよ く一致す.る。 ' * /¾ 上記により、 マウスモノ ク ローナル抗体 AU K 1 2 - 2 0 の L鎖 V領域のヒ ト型化に用いるヒ ト抗体は必ずしも H S G —IVに属する抗体から選ぶ必要もなく、 マウスモノ ク ローナ ル抗体 A U K 1 2— 2 0の L鎖 V領域のヒ ト型化には、 マゥ スモノ ク ローナル抗体 P M— 1の L鎖 V領域のヒ ト型化の場 合と同様に R E Iを用いる。 ，
表 4に示す様に、 AU K 1 2— 2 0抗体の H鎖 V領域は、 ヒ ト H鎖 V領域のサブグループ I ( H S G I ) と最も高い相 同性を示す。 また、 D a t a b a s e " L E E D S " の検 索により、 やはり H S G I に属するヒ ト抗体 HAX ( S t 0 l i a r , B . D. e t a l . J. I mm u n o l . 1 3 9 , 2 4 9 6 - 2 5 0 1 , 1 9 8 7 ) が AU K 1 2— 2 0抗体の H鎖 V領域に対して約 6 6 %の相同性を示す。 そこで再構成 ヒ ト A U K 1 2— 2 0抗体の H鎖 V領域の設計においては、 H S G I に属するヒ ト抗体 HAXの F R、 及び同様に H S G Iに属する F Rを舍有するヒ ト型化 4 2 5抗体 H鎮 V額域 (. K e t t l e b o r o u g C. A . , ら、 P r o t e i n E n g i n e e r i n g , 丄， 7 7 3 - 7 8 3 , 1 9 9 1 ) の F Rを用いる。 ちなみに、 AU K 1 2— 2 0抗体 H 鎖 V領域はヒ ト型化 4 2 5抗体 H鎮 V領域のバージョ ン a と 約 6 4 %の相同性を示す。
再構成ヒ ト A U K 1 2— 2 0抗体 L鎮 V領域の設計
前記の理由により再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖 V 領域の F Rとして R E I の F Rを使用し、 表 5に示すように 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖 V領域を設計した。 M 5.
FBI CDR1
1 2 3
12345678901234567890123 45677778901234
ABCD
VLAUK12-20 DIVLTQSPASLGVSLG&RATISC RAS SVSTSGYSYMH
RBI DiaMTQSPSSLSASVGDRVTITC
RVL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSYMH
FR2 CDR2
4 5
567890123456789 0123456
VLAU 12-20 WYaBKPGfiTPKLLIY ASNLES
RBI WYQ8TPGKAPKLLIY
RVL WYQQKPGKAPKLLIY ASNLES
FR3 CDR3
6 7 8 9
78901234567890123456789012345678 901234567
VLAUK12-20 GVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVBBEDAATYYC QHSRENPYT
BEI GVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPBDIATYYC
RVL GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLBPBDIATYYC QHSRENPYT
FR4
10
8901234567
VL讓 12-20 FGGGTKLBIK
REI FGQGTKし QIT
FG&GTKVEIK 注 ： アンダーライ ンを付した 5個のヌク レオチ ドは C A M P A T H - 1 H抗体の設計において変えられたものである (表 2の注を参照のこと） 。 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 H鎖 V領域の設計
前記の理由により、 再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 H鎖 V領域の設計に再構成ヒ ト VH a 4 2 5の F Rを用いる。 と ころで、 こう して設計した再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 H鎮 V領域をコー ドする D N Aのヌク レオチ ド配列はスプラ ィス供与配列とよ く一致する配列を有することが見出された, このことから、 再構成ヒ ト P M— 1抗体の場合と同様に異常 なスプライ シングが再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体の発現 においても起こる可能性がある。 このため、 ヌク レオチ ド配 列を部分的に変更することにより、 スプライス供与配列様の 配列を除去した。 この修正された配列をバージヨ ン a と称す る。
さらに、 再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 H鎖 V領域のバ 一ジョ ン b〜（！を設計した。 バージョ ン a〜 d のアミノ酸配 列を表 6に示す。
M 6_
FBI CDR1 1 2 Q
123456789012345678901234567890 12345
V„AUK12-20 EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFT SYYIH
HSGI ZV&し VQSGAEVKKPGXSVXVSCKASGYTFS
瞧し VQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH
Figure imgf000039_0001
RVHd FR2 CDR2
4 5 6
67890123456789 01223456789012345
A
VHAUK12-20 WV QSHGKSLEWIG YIDPFNGGTSYNQKFKG
HSGI WVRQAPGXGLBWVG
RVHa WVRQAPGQGLBWVG YIDPPNGGTSYNQKFKG
RVHb
RV„c I一
RV„d 1—
FR3
7 8 9
67890123456789012222345678901234
ABC
VHAU 12-20 KflTLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCAR
HSGI RVTXTXDXSXNTAYMELSSL SEDTAVYYCAR
RV„a RVTMTLDTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR
RVHb —— V
RV„c
RV„d K—— V
CDR3 FR4
10 11
5678900012 34567890123
AB
V„AU 12-20 GGN- F--AY WGQGTLVTVSA
HSGI WGQGTLVTVSS
RV„a GGN-RF--AY GQGTLVTVSS
VHb
RV„c
RVHd 注 ： ヒ トサブグループ I V K 領域 （ H S G I ) において 1 種類の共通ァミノ酸が特定できない位置は Xで示す。 アンダ 一ラ イ ンを付した 2個のア ミノ酸は H S G I コ ンセ ンサス配 列中のアミノ酸と異る。 R Vh b , R V„ c及び R VH dに ついては R VH a と異るア ミノ酸残基のみが示してある。
さらに、 ヒ ト抗体 HA X ( J . I mm u n o l o g y 1 3 9 , 2 4 9 6 - 2 5 0 1 , 1 9 8 7 , 3 8患者由来8細 胞由来のハイ プリ ドーマ 2 1 / 2 8細胞の産生する抗体 ； そ のアミノ酸配列はこの文献中の F i g . 6に記載されており それをコードする D N Aのヌ ク レオチ ド配列は F i g . 4及 び 5に記載されている） の F Rを用いて再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0抗体の H鎖 V領域バージョ ン 「 a 」 〜 「 d 」 を次の表 7に示すように設計した。
M L
FBI CDR1
J 0 Q
123456789012345678901234567890 12345
VHAUK12-20 EIQLQQSGPELMKPGASVKISCKASGYSFT SYYIH
HAX QVQLVaSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT
sle:
1220Ha QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFT SYYIH
1220Hb S--
1220Hc S-
1220Hd S
FR2 CDR2
4 5 6
67890123456789 0122223456789012345
ABC
V„AUK12-20 WVKQSHGKSし EWIG YIDP--FNGGTSYNQKFKG HAX WVRQAPGQ LEWMG
1220Ha WV QAPGQRLBWMG YIDP--FNGGTSYNQKFKG 1220Hb —一 I一
1220Hc
1220Hd
FR3
7 8 9
67890123456789012222345678901234
ABC
VH謹 12-20 KATLTVDKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYYCA
HAX RVTITRDTSASTAYMELSSLRSBDTAVYYCAR
s 1 β :
1220Ha RVTITVDTSASTAYMELSSLRSBDTAVYYCAR
1220Hb V
1220Hc K—— V
1220Hd Κ—— V
CDR3 FR4
10 11
5678900012 34567890123
ΑΒ
VHAUK12-20 GGN-RF--AY WGQGTLVTVSA
HAX WGQGTLVTVSS
s 1 β =
1220Ha GGN-RF--A? WGQGTLVTVSS
1220Hb
1220Hc
1220Hd
注 ： s 1 e 1 2 2 O H a中のアンダーライ ンを付した 2個 の残基は H A Xの F Rからの変化を示す。 s l e l 2 2 0 H b , s I e l 2 2 0 H c、 及び s l e l 2 2 0 H d について は H A Xの F R中のアミノ酸と異る F R中のア ミノ酸のみを 示す。
ヒ ト I L— 6 Rに対する本発明のキメ ラ抗体又は再構成ヒ ト抗体の製造のために任意の発現系、 例えば真核細胞、 例え ば動物細胞、 例えば樹立された哺乳類細胞系、 真糸状菌細胞、 及び酵母細胞、 並びに原核細胞、 例えば細菌細胞、 例えば大 腸菌細胞等を使用することができる。 好ましく は、 本発明の キメ ラ抗体又は再構成抗体は哺乳類細胞、 例えば c 0 sm 又は C H 0細胞中で発現される。
これらの場合、 哺乳類細胞での発現のために有用な常用の プロモーターを用いる こ とができる。 例えば、 ヒ ト · サイ ト メ ガ'ロ ウ イ ノレス前期 ( h u m a n c y t o m e g a 1 o v i r u s i mm e d i a t e e a r l y ; H CMV ) 7* 口モーターを使用するのが好ま しい。 H CMVプロモーター を舍有する発現ベクターの例には、 H CMV— VH — H C r 1 、 H C M V - VL - H C K 、 H CMV - 1 2 h -g r 1 、 H CMV— 1 2 一 等であって、 p S V 2 n e oに由来 するもの （図 1を参照のこ と） が舍まれる。
本発明のために有用なプロモーターの他の具体例はヒ ト · ェ ロ ンゲーシ ヨ ン . フ ァ ク ター 1 ( H E F - 1 or ) プロモ 一ターである。 このプロモータ一を舍有する発現ベクターに は H E F— 1 2 h— g r l及び H E F— 1 2 k— g « (図 8 及び図 9 ) 、 並びに H E F— VH - g r 1及び H E F— VL - g A: (図 1 5 ) が舍まれる。
宿主細胞系中での遺伝子増幅のため、 発現ベクターはさ ら に d h f r遺伝子を舍有するこ とができる。 d h i r遺伝子 を舍有する発現べクタ一は例えば D H F R—厶 E— P M h— g r 1 1 0 ) 、 D H F R— A E— R V h— P M l — i (図 1 1 ) 等である。
要約すれば、 本発明はまず、 ヒ ト I L— 6 Rに対するマウ スモノ ク ローナル抗体の L鎖 V領域及び H鎖 V領域、 並びに 該 L鎖 V領域をコー ドする D N A及び H鎖 V領域をコ一ドす る D NAを提供する。 これらは、 ヒ ト I L一 6 Rに対する ヒ トノマウスキメ ラ抗体及び再構成ヒ ト抗体の作製のために有 用である。 モノ ク ローナル抗体は、 例えば A U K 1 2— 2 0、 P M— 1、 A U K 6 4 — 7、 及び A U K 1 4 6 — 1 5である L鎖 V領域は例えば配列番号 ： 2 4 , 2 6 , 2 8又は 3 0に 示すァミノ酸配列を有し、 そして H鎖 V領域は例えば配列番 号 ： 2 5 , 2 7 , 2 9 , 又は 3 1 に示すァミノ酸配列を有す る。 これらのアミノ酸配列は例えばそれぞれ配列番号 ： 2 4 〜 3 1 に示すヌク レオチ ド配列によりコードされている。 本発明はまた、
( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域及びマウス L鎖 V領域 ； 並びに ( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域及びマウス H鎖 V領域 ：
を含んで成る、 ヒ ト I L一 6 Rに対するキメ ラ抗体に関す る。 マウス L鎖 V領域及びマウス H鎮 V領域並びにこれらを コードする D N Aは前記の通りである。 前記ヒ ト L鎖 C領域 は任意のヒ ト L鎖 C領域であることができ、 そして例えばヒ ト C領域である。 前記ヒ ト H鎖 C領域は任意のヒ ト H鎖 C 領域であることができ、 そして例えばヒ ト r — 1 C領域であ る。
キメ ラ抗体の製造のためには 2種類の発現ベクター、 すな わちェンハンサ一/プロモーター系のごとき発現制御領域に よる制御のもとでマウス L鎮 V領域及びヒ ト L鎮 C領域をコ ードする D N Aを含んで成る発現ベクター、 並びにェンハン サーノプロモーター系のごとき発現制御領域のもとでマウス H鎮 V領域及びヒ ト H鎖 C領域をコードする D NAを舎んで 成る発現ベクターを作製する。 次に、 これらの発現ベクター により哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、 そし て形質転換された細胞をィ ンービ トロ又はィ ン—ビボで培養 してキメ ラ抗体を製造する。
あるいは、 マウス L鎖 V領域及びヒ ト L鎖 C領域をコー ド する D N A並びにマウ ス H鎖 V領域及びヒ ト H鎖 C領域をコ ー ドする D N Aを単一の発現ベクターに導入し、 そして該べ クタ一を用いて宿主細胞を形質転換し、 次にこの形質転換さ れた宿主をィ ン— ビボ又はィ ン―ビ ト ロで培養して目的とす るキメ ラ抗体を生産させる。
本発明はさらに、
( A ) ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウ ス モノ クローナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鎮 V領域、 を含んで成る L鎖 ； 並びに
( B ) ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及び
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 & Rに対するマウス モノ クローナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鑌 V領域、 を含んで成る H鎖 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体を 提供する。
好ましい態様においては、 前記 L鎖 C D Rは配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0 のいずれかに示されるァ ミノ酸配列であ つて、 該ァ ミノ酸配列の範囲が表 9において定義されるア ミ ノ酸配列を有し、 前記 H鎖 C D Rは配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 に示されるァ ミノ酸配列であって該ァ ミノ酸配列 の範囲が表 9において定義されるァ ミノ酸配列を有し ； 前記 ヒ ト L鎮 F Rが R E I に由来する ものであり ； 前記ヒ ト H鎖 F Rは N E W又は H G S I コ ンセンサス配列又は H A Xに由 来するものであり ； 前記ヒ ト L鎮 C領域はヒ ト AT C領域であ り ； そして前記ヒ ト H鎖 C領域はヒ ト r— 1 Cである。
好ましい態様においては、 L鎮 V領域は表 2において R V！ a として示されるァミノ酸配列を有し、 H鎮 V領域は表 3に R V H a、 R V H b、 R V H C、 R V„ d、 R V„ e又は R V„ ί として示されるアミノ酸配列を有する。 ア ミノ酸配列 R V„ ίが最も好ましい。
再構成抗体の製造のためには、 2種類の発現ベクター、 す なわちェンハンサ一/プロモーター系のごとき発現制御領域 による制御のもとに前に定義した再構成ヒ ト L鎮をコードす る D Ν Αを含んで成る発現ベクター、 及びェンハンサーノブ 口モーター系のごとき発現制御領域のもとに前に定義した再 構成ヒ ト H鎮をコードする D N Aを含んで成るもう一つの発 現ベクターを作製する。 次に、 これらの発現ベクターを用い て哺乳類細胞のごとき宿主細胞を同時形質転換し、 そしてこ の形質転換された細胞をィ ンービポ又はィ ン―ビ ト ロで培養 して再構成ヒ ト抗体を生産せしめる。
あるいは、 再構成ヒ ト L鎮をコ一ドする D N A及び再構成 ヒ ト H鎮をコードする D N Aを単一の発現べクタ一に導入し、 そしてこのベクターを用いて宿主を形質転換し、 次にこの形 質転換された宿主細胞をィ ンービボ又はィ ンービ ト 口で培養 して目的とする再構成ヒ ト抗体を生産せしめる。
こう して生産されたキメ ラ抗体又は再構成ヒ ト抗体は、 常 法に従って、 例えばプロティ ン Aァフィ；ティークロマ トグ ラフィー、 イオン交換ク ロマ トグラフィー、 ゲル濾過等によ り単離、 精製することができる。
本発明のキメ ラ L鎖又は再構成ヒ ト L鎖は H鎖と組合わせ るこ とにより完全な抗体を作製するために使用する こ とがで きる。 同様に本発明のキメ ラ H鎖又は再構成ヒ ト H鎖は L鎖 と組合わせるこ とにより完全な抗体を作製するために用いる ことができる。
本発明のマウ ス L鎖 V領域、 再構成ヒ ト L鎖 V領域、 マウ ス H鎖 V領域、 及び再構成ヒ ト H鎖 V領域は、 本来、 抗原で ある ヒ ト I L— 6 Rと結合する領域であり、 それ自体として. 又は他の蛋白質との融合蛋白質と して医薬、 診断薬等と して 有用であると考えられる。
また、 本発明の L鎖 V領域 C D R及び H鎖 V領域 C D R も- 本来、 抗原であるヒ ト I L— 6 Rと結合する部分であり、 そ れ自体と して又は他の蛋白質との融合蛋白質として医薬、 診 断薬等として有用であると考えられる。
本発明のマウ ス L鎖 V領域をコー ドする D N Aはキメ ラ L 鎖をコー ドする D N A又は再構成ヒ ト L鎖をコー ドする D N Aの作製のために有用である。 同様にマ ウ ス H鎖 V領域をコ ー ドする D N Aはキメ ラ H鎖をコー ドする D N A又は再構成 ヒ ト H鎖をコー ドする D N Aの作製のために有用である。
また、 本発明の L鎖 V領域 C D Rをコー ドする D N Aは再 構成ヒ ト L鎮 V領域をコー ドする D N A及び再構成 ト L鎖 をコー ドする D N Aの作製のために有用である。 同様に本発 明の H鎖 V領域 C D Rをコー ドする D N Aは再構成ヒ ト H鎖 V領域をコードする D N A及び再構成ヒ ト H鎖をコードする D NA作製のために有用である。
M SL
次に、 本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、 これにより本発明の範囲が限定されるものではない。
実施例 1. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル 抗体の V領域をコードする D NAのクローン化
ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体の可変 領域をコードする D NAを次の様にしてクローン化した。
1. 全 R N Aの調製
ハイプリ ドーマ A U K 1 2 - 2 0からの全 R NAを、 C h
1 r g w i nり、 B i o c h e m i s t r y , 1 8 , 5 2 9
4 ( 1 9 7 9 ) により記載されている方法に従って調製した。 すなわち、 2. 1 X 1 08 偭のハイプリ ド一マ A U K 1 2 —
2 0の細胞を 2 0 mlの 4 Mグァニジンチオシァネー ト
( F u 1 k a ) 中で完全にホモジナイズさせた。 ホモジネ一 トを遠心管中の 5. 3 M塩化セシウム溶液層上に重層し、 次 にこれを B e c k m a n S W 4 0 ローター中で 3 1 , 0 0 0 rpm にて 2 0てで 2 4時間遠心分離することにより R NA を沈殺させた。 R N A沈殺物を 8 0 %エタノールにより洗浄 し、 そして I mM E D TA及び 0. 5 % S D Sを舍有する lOmM T r i s — H C 1 (PH 7. 5 ) 中に溶解し、 そしてそれに P r o t e n a s e ( B o e h r i n g e r ) を 0. 5 mg/mlとなるように添加した後、 3 7てにて 2 0分 間ィ ンキュベー ト した。 混合物をフヱノ ール及びク ロ 口ホル ムで抽出し、 そして R N Aをエタノールで沈澱させた。 次に、 R N A沈澱物を l mM E D T Aを舍有する 10mM T r i s — H C 1 (pH 7. 5 ) 2 0 0 1 に溶解した。
2. 一本鎮 c D N Aの合成
J . W. L a r r i c k ら、 B i o t e c h n o l o g y ,
_1. 9 3 4 ( 1 9 8 9 ) により記載されている方法に従って 一本鎖 c D N Aを合成するため、 前記のようにして調製した 全 R NAの約 5 μ gを 40mM K C 1 , 6mM M g C 1 z , 1 0 mMジチオスレィ トール、 0. 5 mM d A T P , 0. 5 mM d G T P , 0. 5 mM d C T P , 0. 5 mM d T T P , 3 5 / M o l i g o d Tプライマー （Am e r s h a m ) , 4 8ュニッ トの R A V— 2逆転写酵素 （ R A V— 2 ： R o u s a s s o c i a t e d v i r u s 2 ； Am e r s h a m ) 及び 2 5ュニ ッ トのヒ ト胎盤リ ボヌク レアーゼ阻害剤 （ Am e r s h a m ) を舍有する 5 0 mM T r i s — H C 1 (pH 8. 3 ) 緩衝液 1 0 / 1 に溶解し、 そしてこの反応混合物を 3 7 てにて 6 0分間イ ンキュベー ト しそして次のポリ メ ラー ゼ連鎖反応 （ P C R ) 法のために直接使用した。
3. 抗体可変領域をコー ドする遣伝子の P C R法による増
T h e r m a l C y c l e r o d e l P H C - 2 ( T e c h n e ) を用いて P C R法を行った。
( 1 ) マウス L鎖 V領域をコー ドする遣伝子の増幅
P C R法に使用するプライマーは、 配列番号 ： 1 〜 1 1 に 示す MKV (M o u s e K a p a V a r i a b l e ) プライマー （マウスカ ッパ型 L鎖リーダー配列とハイブリダ ィズする） （ S. T. J o n e s ら、 B i o t e c h n o l 0 g y , 9_, 8 8 , 1 9 9 1 ) 、 及び配列番号 ： 1 2に示す MK C (M o u s e K a p a C o n s t a n t ) プラ イマ一 （マウス力 ツバ型 L鎖 C領域とハイブリダィズする） ( S . T. J o n e s ら、 B i o t e c h n o l o g y , 9 : 8 8 , 1 9 9 1 ) であった。
まず、 l OmM T r i s— H C 1 (PH 8. 3 ) ， 5 0 mM K C 1 0. ImM d A T P , 0. 1 mM d GT P, 0. 1 mM d C T P , 0. 1 mM d TT P, 1. 5 mM M g C 12 , 2. 5ユニッ トの DNAポリ メ ラーゼ Am p l i T a q ( P e r k i n E l m e r C e t u s ) , 0. 2 5 〃 Mのそ れぞれの M K Vプライマー、 3 〃 Μの M K Cプライマー及び —本鎖 c D N A合成の反応混合物 を舍有する P C R溶 液 1 0 0 1を 9 4ての初期温度にて 1. 5分間そして次に 9 4てにて 1分間、 5 0 'Cにて 1分間及び 7 2てにて 1分間、 この順序で加熱した。 この温度サイ クルを 2 5回反復した後、 反応混合物をさらに 7 2 'Cにて 1 0分間ィ ンキューべ一ト し
( 2 ) マウス H鎖 V領域をコードする c D N Aの増幅
P C Rのためのプライ マーとして配列番号 ： 1 3〜 2 2に 示す MH V (M o u s e H e a v V a r i a b l e ) プライマ一 1〜 1 0 ( S. T. J o n e s ら、 B i o t e c h n 0 1 0 g y , 9 , 8 8 , 1 9 9 1 ) 、 及び配列番号 ： 2 3に示す MH C (M o u s e H e a v y C o n s t a n t ) プライ マ一 （ S. T . J o n e s ら、 B i o t e c h n o 1 o g y , _9_, 8 8 , 1 9 9 1 ) を使用した。 前記 3. ( 1 ) において L鎖 V領域遺伝子の増幅について記載したの と同じ方法により増幅を行った。
4. P C R生成物の精製および断片化
前記のようにして P C R法により増幅した D N A断片を Q I AG E N P C R生成物精製キ ッ ト （ Q I AG E N I n c . U S ) を用いて精製し、 そして 1 OmM g C 12 及び 1 5 0 mM N a C lを舍有する l O OmM T r i s — H C 1 (pH 7. 6 ) 中で 1 0ユニッ トの制限酵素 S a l l ( G I B C O B R L ) を用いて 3 7てにて 3時間消化した。 この消 化混合物をフヱノール及びク口口ホルムで抽出し、 そして D N Aをエタノール沈澱により回収した。 次に、 D NA沈澱物 を 1 0ュニッ トの制限酵素 Xm a I (N e w E n g 1 a n d B i o 1 a b s ) により 3 7てにて 2時間消化し、 そし て生ずる D NA断片を、 低融点ァガロース （ F M C B i 0 . P r o d u c t s , 米国） を用いるァガロースゲル電気泳動 により分離した。
約 4 5 0 bp長の D N A断片を舍有するァガロース片を切り 取りそして 6 5 'Cにて 5分間溶融せしめ、 そしてこれと同容 積の 2mM E D TA及び 2 0 0 mM N a C l を舍有する 2 0 mM T r i s - H C 1 (pH 7. 5 ) を加えた。 この混合物を フエノール及びク ロ口ホルムにより抽出し、 そして D NA断 片をエタノール沈澱により回収し、 そして l mM E D TAを 舍有する 1 0 T r i s — H C 1 (PH7. 5 ) に溶解した こう して、 マウス力 ツバ型 L鎖可変領域をコー ドする遺伝子 を含んで成る D NA断片、 及びマウス H鎖可変領域をコード する遺伝子を含んで成る D N A断片を得た。 上記 D NA断片 はいずれもその 5 ' —末端に S a i l接着末端を有しそして その 3 ' —末端に X m a I接着末端を有する。
5. 違結及び形質転換
上記のようにして調製したマウス力 ッパ型 L鎖 V領域をコ 一ドする遣伝子を含んで成る S a 1 I 一 X m a I D NA断片 約 0. 3 gを、 プラス ミ ド P U C 1 9を S a 1 I及び Xm a Iで消化することにより調製した P U C 1 9べクター約 0. と、 5 0 mM T r i s — H C 1 (PH 7. 4 ) , 1 0 mM M g C 12 , l O mMジチオスレィ トール、 l mMスペルミ ジ ン、 1 mM A T P, 0. 1 g /mlのゥ シ血清アルブミ ン及 び 2ユニッ ト T 4 D NAリ ガーゼ （N e w E n g l a n d B i o 1 a b s ) を舍有する反応混合物中で、 1 6てにて 1 6時間反応させ連結した。
次に、 7 1 の上記連結混合物を大腸菌 D H 5 orのコ ンビ テン ト細胞 2 0 0 / 1 に加え、 そしてこの細胞を氷上で 3 0 分間、 4 2 'Cにて 1分間そして再び水！:で 1分間静置した。 次いで 8 0 0 ^ 1 の S O C培地 （M o l e c u ! a r C 1 0 n i n g ： A L a b o r a t o r M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) を加え、 3 7てにて 1時間イ ンキュベー ト した後、 2 X Y T寒天培地 ( o l e c u l a r C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) 上にこの大腸菌をまき、 3 7 'Cにて一夜 イ ンキ ュベー ト して大腸菌形質転換体を得た。
こ の形質転換体を、 5 0 ^ g Zmlのア ンピシ リ ンを舍有す る 2 X Y T培地 5 ml中で 3 7 にて一夜培養し、 そしてこの 培養物から、 ァノレカ リ法 （M o l e c u l a r C 1 o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l , S a m b r o o k ら、 C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , 1 9 8 9 ) に従ってプラス ミ ド D N Aを調製した。
こ う して得られた、 ハイ プリ ドーマ A U K 1 2 - 2 0に由 来するマウ ス力 ツバ型 L鎮 V領域をコー ドする遺伝子を舍有 するプラス ミ ドを p 1 2 — k 2 と命名した。
上記の同じ方法に従って、 ハイ プリ ドーマ A ϋ K 1 2 - 2 0 に由来するマウ ス Η鎖 V領域をコー ドする遺伝子を舍有 するプラス ミ ドを S a 1 I - X m a I D N A断片から作成 し、 そして P 1 2 — h 2 と命名した。
実施例 2 , マウ スモノ ク ローナル抗体の V領域をコ ー ドす る D N Aのク ロー ン化
実施例 1 に記載したのと実質上同じ方法をハイ プリ ドーマ P M 1 , A U K 6 4 一 7及び A U K 1 6 — 1 5 に適用して 下記のプラス ミ ドを得た ：
ハイ プリ ドーマ P M 1 由来のカ ツパ型 L鎖 V領域をコ一ド
新た な用紙 する遣伝子を舍有するプラスミ ド P P M— k 3 ；
ハイプリ ドーマ P M 1由来の H鎮 V領域をコードする遺伝 子を舍有するプラスミ ド P P M— h 1 ；
ハイブリ ドーマ AUK 6 4 - 7由来の力 ツバ型 L鎮 V領域 をコードする遺伝子を舍有するブラスミ ド p 6 4— k 4 ； ハイブリ ドーマ AUK 6 4 - 7由来の H鎮 V領域をコー ド
I
する遺伝子を含有するブラスミ ド P 6 4— h 2 ；
ハイプリ ドーマ A U K 1 4 6— 1 5由来のカ ッパ型 L鎖 V 領域をコードする遺伝子を舍有するブラスミ ド P 1 4 6— k 3 ；及び
ハイプリ ドーマ A U K 1 4 6— 1 5由来の H鎖 V領域をコ 一ドする遺伝子を舍有するプラスミ ド P 1 4 6— h 1。
なお、 上記プラスミ ドを舍有する大腸菌株は、 N a t i 0 n a 1 C o l l e c t i o n s o f I n d u s t r i a 1 a n d a r i n e B a c t e r i a L i m i t e dに、 ブダペス ト条約に基づいて、 1 9 9 1年 2月 1 1 曰に寄託され、 そして表 8に示す受託番号を有する。
プラス ド' 配列番号 ： 受託番号
P 1 2 ― k 2 2 4 N C I M B 4 0 3 6 7
P 1 2 h 2 2 5 N C I M B 4 0 3 6 3
P P M k 3 2 6 N C I M B 4 0 3 6 6
P P M h 1 2 7 N C I M B 4 0 3} 6 2
P 6 4 k 4 2 8 N C I M B 4 0 3 6 8
P 6 4 h 2 2 9 N C I M B 4 0 3 6 4
P 1 4 6 k 3 3 0 N C I M B 4 0 3 6 9
P 1 4 6 1 3 1 N C I M B 4 0 3 6 5 実施例 3 . D N Aの塩基配列の決定
前記のブラス ミ ド中の c D N Aコー ド領域の塩基配列を、 S e q u e n a s e ™V e r s i o n 2 . 0 キ ッ ト ( U . S B i o c h e m i c a l C o r p、 米国） を用いて決定し た。
まず、 前記のよう にして得られたプラス ミ ド約 3 // gを 0 2 N N a 0 Hにより変性し、 配列決定用プライ マーとァニ ールさせ、 そしてキ ッ ト添付の処方に従って35 S — d A T P により標識した。 次に、 標識された D N Aを、 8 M尿素を舍 有する 6 %ポリ アク リ ルァ ミ ドゲルにて電気泳動した後、 ゲ ルを 1 0 %メ タノ ール及び 1 0 %酢酸により固定し、 乾燥し そしてオー ト ラジオグラフ ィ 一にかける こ とにより塩基配列 を決定した。
各プラス ミ ドの c D N Aコ一 ド領域の塩基配列を配列番号 2 4〜 3 1 に示す。
実施 t 例 4. C D Rの決定
L鎖及び H鎖の V領域の全般的構造は、 互いに類似性を有 しており、 それぞれ 4つのフ レームワーク部分が 3つの超可 変領域、 即ち相補性決定領域 （ C D R ) により連結されてい る。 フ レームワークのアミノ酸配列は、 比較的良く保存され ている力 一方、 C D R領域のアミノ酸配列の可変性は極め て高い ( Kaba t, B. A. り、 ^Sequences of Proteins of Imm unological In teres t j US Dep t . Health and Human Servic es, 1983) 。
ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体の可変 領域の上記のァミノ酸配列に基き、 そして K cn a b a t らの報 告に従って I L一 6 Rに対するマウスモノ ク口一ナル抗体の 各 V領域の C D Rを表 9に示す如く決定した。 D C
表 9 プラスミ ド 配列番号： CDR(l) CDR (2) CDR (3)
(ァミ ノ酸番号）
Figure imgf000056_0001
Pl2-h2 25 31 -35 50-66 99- 105
PPM-K3 26 24-34 50-56 89-97
27 31 -36 51 -66 99- 108
28 24-38 54-60 93-101
Figure imgf000056_0002
Pl46 -k3 30 24 - 34 89-97
Pl46 -hi 31 31 -35 50— 66 99- 106 実施例 5. ク ローン化された c D N Aの発現の確認 ( 1 ) 現プラス ミ ドの作製
P C R法により クローン化された A U K 1 2 — 2 0抗体の κ L鎖及び H鎖の V領域をコー ドする c D N Aからキメ ラ L 鎖 Z H鎖をコー ドする D N Aを作製した。 マウス A U K 1 2 - 2 0 の V領域をコードする c D N Aを、 ヒ トサイ トメ ガロ ウィルス （ H C M V ) のェンハンサー及びプロモーターを舍 有する哺乳類細胞発現ベクター （ H C M V発現ベクターと称 する） （図 1. 実施例 8 ) 中でヒ ト C領域をコー ドする D N Aに容易に連結するためには、 A U K 1 2 — 2 0抗体の V領 域をコー ドするマウス c D N A配列の 5 ' —末端及び 3 ' - 末端に便利な制限酵素切断部位を導入することが必要であつ た。
5 ' —末端及び 3 ' —末端へのこれらの修飾は P C R法を 用いて行った。 2セッ トの P C Rプライ マーを設計しそして 合成した。 マウス L鎖 V領域及び H鎖 V領域の両方について、 リーダー配列の始めをコー ドする D N Aにハイ ブリダィズし、 効率的な翻訳のために必須の D N A配列 （ K 0 z a k , M . s J . M o 1 . B i o l . 1 9 6 : 9 4 7 - 9 5 0 , 1 9 8 7 ) を維持しそして H C M V発現ベクターへのク ローニングのた めの H i n d ill 部位を形成するために、 L鎖 V領域後方プ ライマー （配列番号 ： 3 2 ) 、 及び H鎖 V領域後方ブラィ マ 一 （配列番号 ： 3 3 ) を調製した。 前方 P C R —プライ マー. は、 J領域の末端をコー ドする D N Aにハイ ブリダィ ズし、 C領域へのスブライ シングのために必須の D N A配列を維持 しそして H C M V発現ベクターでのヒ ト C領域への連結のた めの B a m H I部位を形成するように、 L鎖 V領域前方ブラ ィマー （配列番号 3 4 ) 、 及び H鎮 V領域前方ブライマ一 (配列番号 3 5 ) を調製した。
P C Rによる增幅に続き、 P C R生成物を H i n d III 及 び B a m H I により消化し、 ヒ ト κ鎮又は r一 1鎮 C領域 D N Aを舍有する H C M Vベクターにクローン化し、 そして塩 基配列を決定して P C R法による增幅中にヱラーが生じなか つたことを確認した。 得られる発現ベクターを H C M V — 1 2 k— g k及び H C M V — 1 2 h - g r 1 と称する。
H C M V発現べクターの構造を図 1 に示す。 プラス ミ ド H C M V — V L— H C ATにおいて、 V L 領域は任意のマウス L 鎖 V領域コード配列であることができる。 この例において、 A U K 1 2 ~ 2 0 AT L鎖 V領域を挿入することにより H C M V— 1 2 k— g kを得た。 プラスミ ド H C M V - V H — H C T 1 において、 V H 領域は任意のマウス H鎖 V領域コード配 列であることができる。 この例においては A U K 1 2 - 2 0 の H鎮 V領域を挿入して H C M V— 1 2 h— g r lを得た。
C O S細胞での一過性 （ t r a n s i e n t ) 発現
キメ ラ A U K 1 2 — 2 0抗体の C O S細胞での一過性発現 を見るため、 前記発現べクターを C 0 S細胞において試験し た。 G e n e P u l s a r装置 （ B i o R a d ) を用いる 電気穿孔法 （ e l e c t r o p o r a t i o n ) により D N Aを C 0 S細胞に導入した。 すなわち、 C O S細胞を 1 X 1 07 倔 mlになるように p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) に懸濁し、 この細胞浮遊液 0 8 mlに D N A (各プラス ミ ドについ 1 0 〃 g ) を加えた。 1 9 0 0ボルト （ V ) 、 2 5マイ ク ロファ ラ ッ ド （ / F ) の電 気容量にてパルスを与えた。
室温にて 1 0分間の回復期間の後、 ェク レ ト ロポレーショ ンした細胞を、 1 0 %のゥシ胎児血清を舍有する DMEM培 地 （ G I B C O ) 8mlに加えた。 7 2時間のイ ンキュベーシ ョ ンの後、 培養上清を集め、 遠心分離して細胞破片を除去し- そして無菌条件下で 4てにて短時間、 又は一 2 0 'Cにて長時 間貯蔵した。
醇素免疫測定法 （ E L I S A ) によるキメ ラ抗体の定量 ト ラ ンスフヱク トされた C O S細胞の培養上清を E L I S Aにより測定して、 キメ ラ抗体が生産されていることを確認 した。 キメ ラ抗体を検出するため、 プレー トをャギの抗ヒ ト I g G ( W h 0 1 e m o l e c u l e ) ( s i g m a ^ iこ よりコー ト した。 ブロ ック した後、 C O S細胞からの培養上 清を段階希釈しそして各ゥエルに加えた。 ィ ンキュベーショ ン及び洗浄の後、 アル力 リ ホスファタ一ゼー結合ャギ抗— ヒ ト I g G ( r鎖特異的、 S i g m a ) を加えた。 イ ンキュべ —ショ ン及び洗浄の後、 基質緩衝液を加えた。 ィ ンキュベー ショ ンの後、 反応を停止しそして 4 0 5 nmにおける吸光度を 測定した。 標準として精製ヒ ト I g G ( S i g m a ) を用い た。 ヒ ト I L一 6 Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定 ( E L I S A )
ト ラ ンスフヱ ク トされた C O S細胞からの培地を E L I S Aにより測定して、 生産されたキメ ラ抗体が抗原に結合し得 るか否かを決定した。 抗原への結合の検出のため、 プレー ト を M T 1 8 マウスモノ ク ローナル抗体 （参考例 1 ) でコー ト した。 1 % B S Aでブロ ックした後、 可溶性組換えヒ ト I L - 6 R ( S R 3 4 4 ) を加えた。
洗浄した後、 C 0 S細胞からの培養上清を段階希釈し、 そ して各ゥエルに加えた。 ィ ンキュベーショ ン及び洗浄の後、 アルカ リホスファタ一ゼ結合ャギ抗ヒ ト I g Gを加えた。 ィ ンキュベーシ ョ ン及び洗浄の後、 基質緩衝液を加えた。 ィ ン キュベ一ショ ンの後、 反応を停止し、 そして 4 0 5 nmにおけ る吸光度を測定した。
この結果を図 2に示した。 キメ ラ抗体 A U K 1 2— 2 0を コ一ドする遺伝子の C O S細胞への ト ラ ンスフヱク ショ ンを 実施した。 この C 0 S細胞の培養上清サンプルは、 I L— 6 Rに対する強い結合能を示し、 図 2に〇 （オープンサークル） で示す如く、 サ ンプルの希釈度 （抗体の濃度） 依存的に 4 0 5 nmにおける吸光度が変化し、 サンプル中に I L— 6 R レセ ブタ一に対する抗体が舍まれていることが確認された。
ヒ ト I L— 6 Rと I L 一 6の結合を阻害する能力の測定 ト ラ ンスフヱク トされた C 0 S細胞からの培養上清を測定 して培地中に存在する抗体が、 I L一 6 Rと I L— 6 との結 合を阻害するか否かを調べるために、 ビォチン化 I L 一 6 と の競合的結合阻害能を調べた。 プレー トを MT 1 8マウスモ ノ ク ローナル抗体 （参考例 1 ) でコー ト した。 ブロ ッキ ング の後、 可溶性組換ヒ ト I L— 6 R ( S R 3 4 4 ) を加えた。 洗浄した後、 C 0 S細胞からのサンプルを段階希釈し、 そし てピオチン化 I L一 6 と共に各ゥエルに加えた。
洗浄した後、 アルカ リ ホスファ ターゼ結合ス ト レプ トアビ ジンを加えた。 イ ンキュベーショ ン及び洗浄の後基質緩衝液 を加えた。 イ ンキュベーショ ンの後、 反応を停止し、 そして 吸光度を 4 0 5 ηηιにて測定した。 精製マウス A U K 1 2 — 2 0モノ ク ローナル抗体を陽性対照として用いた。 無関係の抗 体を発現する C 0 S細胞からの培地を陰性対照として用いた《 この結果を図 3に示した。 キメ ラ抗体 A U K 1 2 — 2 0を コ一ドする遺伝子で トランスフヱク ト した C O S細胞の培養 上清は、 最高、 及び 2番目に高いサンプル濃度で I L— 6 R と I L— 6の結合を阻害した。 すなわち、 図 3に秦で示す如 く、 サンプル希釈度 （抗体の濃度） 依存的に 4 0 5 nmにおけ る吸光度が変化し、 サンプル中の抗体が I L一 6 Rと I L一 6の結合を阻害していることが認められた。 これは陽性対照 の吸光度の抗体濃度依存的変化 （〇） にほぼ一致することか らも確認出来た。
なお、 陰性対照 （厶） は阻害活性が全く認められなかった。 実施例 6. ク ローン化 c D N Aの発現の確認 （ 2 ) (キメ ラ P M— 1抗体の作製）
発現べクターの作製
キメ ラ P M— 1抗体を発現するベクターを作製するため、 それぞれマウス P M— 1 L鎖及び H鎖 V領域をコードする c D N Aクローン p P M— k 3及び P P M— h 1を P C R法 により変形し、 そして H C M V発現ベクター （図 1を参照の こと） に導入した。 L鑌 V頷域のための後方プライマー P m k - s (配列番号： 3 8 ) 及び H鎖 V領域のための後方ブラ ィマー p m h - s (配列番号 ： 4 0 ) を、 リーダー配列の最 初をコードする D N Aにハイブリダィズし且つ K o z a kコ ンセ ンサス配列及び H i n d III 制限部位を有するように設 計した。 L鎮 V領域のための前方プライマ一 p m k — a (配 列番号 ： 3 6 ) 及び H鎖 V領域のための前方ブライマ一 p m - a (配列番号： 3 9 ) を、 J領域の末端をコードする D N A配列にハイプリダイズし且つスブラィス ドナー配列及び B a m H I制限部位を有するように設計した。
L鎮 V領域のため、 2種類の前方プライマーを合成した。 ほとんどの L鎮においては、 位置 1 0 7のリ ジ ンが保存さ れているが、 マウス P M— 1 A: L鎖においては位置 1 0 7力く ァスバラギンである。 キメ ラ P M— 1抗体の抗原結合活性に 対するこの変化の効果を検討するため、 前方プライマー p m k — b (配列番号 ： 3 7 ) を、 位置 1 0 7 がァスパラギンか らリ ジンに変るように設計した。 P C R反応に続き、 P C R 生成物を精製し、 H i n d ill 及び B a m H I で消化し、 そ して P U C 1 9ベクター （ Y a n i s h e — P e r r o n ら、 G e n e ( 1 9 8 5 ) 3 3 ： 1 0 3 — 1 0 9 ) にサブクロー ユングした。 D N A配列決定の後、 H i n d III - B a m H I断片を切出し、 そして H鎮 V領域については発現ベクター H C M V - V„ - H C 1にクローン化して H CMV— P M h - g r 1を得、 そして L鎮 V領域については H CMV— V — H C にクローン化して H CMV— P M k a— g k及び H CMV— P M k b— g kを得た。
C O S細胞の トランスフヱク ショ ン
キメ ラ P M— 1抗体の一過性発現を観察するため、 前記発 現ベクターを _^Q_ ^細胞において試験した。 H CMV— p m h— g lと、 H CMV— p m k a— g k又は H CMV— p m k b— g kのいずれかとを、 G e n e P u 1 s a r装置
( B i o R a d ) を用いてエ レク ト ロポ レーシ ョ ンによ り^ _ ϋ細胞に同時形質転換した。 D NA (プラス ミ ド当り 1 0 U g ) を、 P B S中 1 X 1 07 細胞/ mlの 0. 8mlのァリ コ ー トに加え、 1 , 9 0 0 V, 2 5 〃 Fの容量にてパルスを与 えた。 室温にて 1 0分間の回復期間の後、 エ レク トロポ レー シヨ ン処理された細胞を、 1 0 %の 7"—グロブリ ン不舍有ゥ シ胎児血清を舍有する D u 1 b e c c 0 ' s
M o d i f i e d E a l e M e d i u m ( DMEM)
( G I B C O ) に加えた。 7 2時間のイ ンキュベー シ ョ ンの 後、 培養.上清を集め、 遠心分離により細胞破片を除まし、 そ して無菌条件下で 4 'Cにて短期間貯蔵し、 又は一 2 0てにて 長期間貯蔵した。
キメ ラ PM— 1抗体の発現及び分折
3 日間の一過性発現の後、 C 0 S細胞からの培地を集め、 そしてキメ ラ P M— 1抗体について試験した。 培地をまず E L I S Aにより分析して、 ト ラ ンスフヱク 卜された C O S細 胞により ヒ ト様抗体が生産されたか否かを決定した。 このァ ッセィにおいて標準として既知量の精製ヒ ト I g Gを用いる ことにより、 C 0 S細胞からの培地中に存在するヒ ト様抗体 (この場合、 キメ ラ PM— 1抗体） の量を推定することが可 能である。 ヒ ト抗体の検出のため、 プレー トをャギ抗ーヒ ト I g G (全体分子、 S i g m a ) によりコー ト した。 ブロ ッ キングの後、 細胞からのサンプルを段階希釈し、 そし て各ゥヱルに加えた。 ィ ンキュベーショ ン及び洗浄の後、 ァ ルカリ ホスフヱターゼ結合ャギ抗一ヒ ト I g G ( r鎖特異的、 S i g m a ) を加えた。 イ ンキュべ一ショ ン及び洗浄の後、 基質緩衝液を加えた。 ィ ンキュベーショ ンの後、 反応を停止 し、 そして 4 0 5nmでの吸光度を測定した。 標準として精製 ヒ ト I g G ( S i g m a ) を加えた。
キメ ラ P M— 1抗体をコードする遺伝子を担持するべクタ 一により トラ ンスフエク 卜された C 0 S細胞からの培地はヒ ト様抗体の発現について陽性であり、 そしておよその量が上 記のようにして測定された。
次に、 キメ ラ P M— 1抗体をコー ドする遺伝子を担持する ベクターにより ト ランスフヱク トされた C 0 S細胞からの同 じ培地をヒ ト I L— 6 Rに結合する能力について測定した。 抗原への結合の測定のため、 プレー トを、 ヒ ト I L— 6 Rに 対する抗体である MT 1 8マウスモノ クローナル抗体 （参考 例 1 ) により コー ト した。 ブロ ッキングの後、 可溶性ヒ ト I L一 6 R ( S R 3 4 4 ) を加えた。 洗浄した後、 サンプルを 段階希釈し、 そして各ゥエルに加えた。 イ ンキュベーショ ン 及び洗浄の後、 アルカ リ ホスフ ァターゼ結合ャギ抗一 ヒ ト I g G ( r鎖特異的 ； S i g m a ) を添加した。 イ ンキュベー シ ョ ン及び洗浄の後、 基質緩衝液を加えた。 ィ ンキュベーシ ョ ンの後、 反応を停止し、 そして 4 0 5 nmでの吸光度を測定 した。 この測定のために標準品は存在しなかった。
2偭のサンプルの内の 1 つは、 マウス P M— 1 抗体中に見 られる V領域と同一の V領域を有するキメ ラ抗体 （キメ ラ P M - 1 a抗体、 図 4 ) をコー ドする遣伝子による ト ラ ンスフ ェク トからのサンプルであった。 他の 1 つのサンプルは L鎖 V領域中の位置 1 0 7 に前記のような 1個のア ミノ酸変化を 有するキメ ラ抗体 （キメ ラ P M— 1 b抗体、 図 4 ) をコー ド する遺伝子による ト ラ ンスフヱク ショ ンからのものであった いずれのサンプルも、 サンブルの希釈により減少する I L 一 6 Rに対する強い結合を示した。 すなわち、 作製されたキメ ラ P M— 1抗体は機能的であり、 そしてその抗原によ く 結合 する こ とができる。 最も重要なこ とは、 機能的キメ ラ P M— 1抗体の証明は、 正しいマウス P M— 1 V領域がク ロ-一ン化 されそして配列決定されたこ との直接の証拠である。 L鎖 V 領域中の位置 1 0 7 にいずれのア ミノ酸を有するキメ ラ抗体 も抗原 I L — 6 Rによ く 結合した。 マウ ス P M— 1 抗体の L 鎖 V領域中の位置 1 0 7 は抗原結合のためにあま り重要では な く 、 そしてこの位置におけるァスバラギン及びリ ジンのい ずれも満足に機能するようである。 マウス P M— 1 抗体はそ の L鎮 V領域のこ の位置にァスパラギ ンを有するので、 キメ ラ P M— 1 抗体を用いるその後のすべての研究は、 マウス P M - 1抗体に見出されるそれと同じバージョ ン aを用いて行 つ 7こ 0
より多量の P M— 1抗体を安定に生産するために、 d h ί r遺伝子を舍有する新たな H CM V発現ベクターを作製した。 キメ ラ P M— 1抗体のより高い発現レベルを達成するための 第一段階は、 ベクター H CMV— VH — H C r , (図 1 ) を 変形して、 このべクターが欠陥のある （ c r i p p l e d ) S V 4 0プロモーターェンハンサ一により発現される d h f r遺伝子を舍有するようにすることであった。 S V 4 0ェン ハンサ一要素を p S V 2— d h f Γベクター （ s . S u b r a m a n i ら、 M o l . C e l l . B i o l . ( 1 9 8 1 ) 1 ： 8 5 4 - 8 6 4 ) から除去し、 そして S V 4 0プロモー ターによつて発現される n e 0遺伝子の代りに 「欠陥のある j S V 4 0プロモーターにより発現される d h f r遺伝子を H C M V - V„ - H C 1 に挿入した。 次に、 この新しい H C M V - V H - E C τ I — d li f rベクターにマウス PM— I V領域を揷入した。 この改良された発現ベクターの作製を 実施例 1 0に詳細に記載する。
C H O d h f r (一） 細胞 （G. V r l a u bら、 P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A ( 1 9 8 0 ) 7 7 ： 4 2 1 6 - 4 2 2 0 ) を 2種類のプラスミ ド DNAすな わちキメ ラ PM— 1 a L鎖を発現するための H CMV— VL 一 H C ベクター （H CMV— PMk a— g k ) 及びキメ ラ PM— 1 H鎮を発現するための H C M V— V H - H C r . - d h f rベクタ一 （D H F R— ΔΕ— P M h— g r 1 ； 実 施例 1 0 ) により同時形質転換した。 D NA (各ブラス ミ ド にっき 1 O /z g Zml) を P B S中 1 X 1 07 細胞/ mlの 0. 8 mlのァ リ コー トに加えた。 1 9 0 0 Vの電圧 2 5 Fの電 気容量でパルスを与えた。 室温にて 1 0分間の回復期間の後、 エレク トロボレーシヨ ン処理された細胞を、 ヌク レオシ ド及 び 1 0 % F C Sを舍有する A 1 p h a M i n i m a 1 E s s e n t i a l M e d i u m培地 （ α— MEM) 1 0 mlに加えた。 一夜のィ ンキュベーショ ンの後、 培地を、 ヌク レオシ ドを舍有せず 1 0 % F C S及び 5 0 0 g/mlの G 4 1 8 ( G I B C O ) を舍有する or— MEMに変えて、 d h f r + 及び n e 0 + 形質転換細胞の選択を行った。 選択の後、 選択されたクローンを用いて遣伝子増幅を行った。 2 X 1 0一8 Mメ ソ ト レキセー ト （MTX ) 中での 1 ラウ ン ドの増幅の後、 約 3. 9 ^ gノ 1 06 細胞ノ日のキメ ラ P M— l aの抗体を 生産する細胞系 （ P M 1 k 3 - 7 ) を選択した。
ヒ ト I L— 6 Rへの I L— 6の結合を胆害するキメ ラ抗体 の能力についての E L I S A測定
トラ ンスフヱク トされた C 0 S細胞において又は安定な C H 0細胞系において生産された抗体を測定して、 それらが、 I L— 6 Rへのピオチン化 I L一 6の結合と競争するか否か を決定した。 プレー トをマウス抗体 MT 1 8により コー ト し た。 ブロ ッキングの後、 可溶性組換えヒ ト I L— 6 R ( S R 3 4 4 ) を加えた。 洗浄の後、 C 0 S細胞からのサンプルを 段階希釈し、 そしてピオチン化 I L一 6 と一緒に各ゥエルに 加えた。 洗浄の後、 アルカ リ ホスファ ターゼ結合ス ト レプ ト アビジンを加えた。 イ ンキュベーショ ン及び洗浄後、 基質緩 衝液を加えた。 ィ ンキュベーショ ンの後、 反応を停止させ、 そして 4 0 5 nmにおける吸光度を測定した。 結果を図 5に示 す。
実施例 7. 再構成ヒ ト P M— 1抗体の作製
より迅速に且つより効率的に C D R移植を達成するため、 P C Rによる逐次 C D R移植法を開発した。 この方法は P C R変異誘発法 （ K a mm a nら、 N u c l . A c i d . R e s . 1 7 : 5 4 0 4 , 1 9 8 9 ) に基く。
C D R移植のための選択されたヒ ト F Rをコー ドする D N Aを舍有する鐯型 D N Aを調製するために、 適当な再構成ヒ ト V領域をコー ドする D NAを便利なベクターに再クロー二 ングする必要があつた。 プラスミ ド a 1 y s 1 1及び F 1 0 の D N Aはそれぞれ再構成ヒ ト D 1. 3の L鎮及び H鎮をコ ードしており、 ヒ ト R E Iからの F Rをコードする D NA及 び N E Wからの F Rをコードする D N Aをそれぞれ舍有する。 再構成ヒ ト D 1.3の L鎮 V領域をコ一ドする D N A配列を 舍有する約 5 0 0 bpのN c o I — B a m H l断片を a 1 y s 1 1から切り出し、 そして H i n d lll 及び B a m H Iで開 裂された P B R 3 2 7にサブクロ一ユングしてプラスミ ド V 1 — I y s — P B R 3 2 7を得た。 この V I — l y s — p B R 3 2 7力、らの H i n d lll — B a m H I断片を、 H i n d ΙΠ 及び B a m H I により開裂された p U C 1 9に挿入して ブラス ミ ド V I — 1 y s - p U C 1 9を得た。
再構成ヒ ト D 1. 3の H鎮 V領域をコードする D N A配列 を舍有する約 7 0 O bpの N c o I - B a m H I断片を F 1 0 から切り出し、 そして H i n d III 一 N c o Iアダプターを 用いて P B R 3 2 7の H i n d lll - B a m H I部位にサブ ク ローユングし、 V h— l y s— P B R 3 2 7を得た。 次に このプラス ミ ドカ、ら H i n d III 一 B a m H I断片を切り出 し、 そして H i n d lll 及び B a mH I により開裂された p U C 1 9にサブク ローニングして V h— 1 y s— p U C l 9 を得た。
なお、 プラス ミ ド a 1 y s 1 1及び再構成ヒ ト D 1. 3の
L鎖 V領域 F Rをコー ドする D N A配列はヒ ト型化 CAM P
ATH - 1 H抗体 （N a t u r e 3 3 2 : 3 2 3— 3 2 7
( 1 9 8 8))のそれと同じである。 铸型と して使用した、 プ ラス ミ ド F 1 0中の再構成ヒ ト D 1. 3の H鎖 V領域をコ一 ドする D NA配列は、 V. V e r h o e y ら、 S c i e n c e 2 3 7 : 1 5 3 4— 1 5 3 6 ( 1 9 8 8 ) の F i g. 2に 記載されている。
図 6は、 再構成ヒ ト P M— 1の H鎖 V領域の第一バージョ ンをコー ドする D NAの作製のために使用されたプライ マー 及び P C R反応を模式的に示す。 後方ブライ マー A (A P C
R 1 ； 配列番号 ： 4 1 ) 及び前方ブライ マ一 E (A P C R 4 配列番号 ： 4 2 ) は、 このベクター上の D N A配列にハイ ブ リダィ ズする。 A P C R 1及び A P C R 4は p U C l 9べク ターのために特に設計されたが、 ユニバーサル M 1 3配列プ ライ マーを使用することもできる。
C D R 1移植 変異誘発プライ マー B ( p h V - 1 ； 配列 番号： 4 3 ) 、 C D R 2移植プライマ一 C ( p h v - 2 ；配 列番号： 4 4 ) 、 及び C D R 3移植プライマ一 D ( p h V - 3 ；配列番号 ： 4 5 ) は 4 0〜 6 0 bpの長さを有し、 マウス PM— 1の H鎮 V領域の C D Rをコードする D NA及び該 C D Rをコードする D N Aを挟む涛型 D NA中のヒ ト F Rをコ ードする D N A配列から成る。 第一の P C R反応において前 方プライマー A P C R 4及び後方プライマー Dを用いた。 マ ウス PM— 1の C D R 3配列をコードする D NAを舍有する 第一 P C R生成物を精製し、 そして第二 P C R反応において 後方プライマ一としてのプライマー Cと共に前方プライマー として使用した。 同様にして、 マウス P M— 1の C D R 2及 び C D R 3をコードする DN Aを舍有する第二 P C R生成物、 並びにマウス PM— 1の 3個すベての C D Rをコードする D N Aを舍有する第三 P C R生成物をそれぞれ次の P C R段階 のプライマ一として使用した。 完全な再構成ヒ ト P M— 1 H鎖 V領域をコードする DNAを有する第四 P C R生成物を 精製し、 H i n dlll 及び B a mH Iにより消化し、 そして さらに分折するために P U C 1 9にサブクローユングした。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域をコードする D N Aの 作製のために 3種類の変異誘発プライマー P h V — 1 , h v— 2及び P h v— 3を合成した。 これらは 8 M尿素を舍有 する 1 2 %ポリアク リルァ ミ ドゲル上で精製した。 変異誘発 プライマー P h v — 1は、 マウス P M— 1抗体の C D R 1の 移植のためのみならずヒ ト F R 1中の位置 2 7及び 3 0にお けるそれぞれの S e rから T y rへ、 及び S e rから T h r への変異のために設計された。 各 1 0 0 / 1 の P C R反応物 は典型的には l O iriM T r i s — H C l (PH 8. 3 ) , 5 0 mM K C 1 , 1. 5 mM M g C 1 2 , 2 5 0 / M d N T P , 5 0 ngの踌型 D N A ( V h — 1 y s — p U C 1 9 ) > 2. 5 uの Am p l i T a q ( P e r k i n E l m e r C e t u s ) 、 及びプライマーを舍有した。 1 ずつの p h V - 3プライマー及び A P C R ブライマーを舍む第一の P C R 反応を行い、 9 4てにて 1 . 5分間の最初の変性の後、 9 4 'Cにて 1分間、 3 7てにて 1分間及び Ί 2てにて 1分間の 3 0 サイ クルを反復した。 ァニーリ ング段階と合成段階の間の 変温時間は 2. 5分間であった。 最終サイ クルの完了の後、 7 2てにて 1 0分間の最終伸長反応を行った。 5 2 3 bpの P C R生成物を 1. 6 %低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 そして次に第二の P C R反応におけるプライマーとして使用 した。
第二の P C R反応において約 1 μ gの精製された第一 P C R生成物及び 2 5 m 0 1 e の変異誘発ブライ マ一 P h v - 2をプライマーとして使用した。 P C R条件は第一の P C R 反応について記載したのと同じであった。 同様にして、 第二 の P C R反応からの 6 6 5 の？ じ 1？生成物をプライ マー P h v — 1 と共に第三の P C R反応において使用し、 そして第 三の P C R反応からの 7 3 7 bpの P C R生成物をプライ マー A P C R 1 と共に第四の P C R反応において使用した。 第四 の P C R反応からの 1 . 1 7 2 kbの P C R生成物を精製し、 H i n d III 及び B a m H I で消化し、 そして次に再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎮 V領域を舍有する約 7 0 0 bpの断片を P U C 1 9ベクターにサブクローユングした。 配列決定した 4 個のクローンの内 2個が正しいァミノ酸配列をコー ドする D NA配列を有しており、 そして p U C— R V h— P M l a と 命名した。
再構成 P M— 1抗体 H鎮 V領域の他のバージョ ンをコード する D N Aを作製するため 5種類の変異誘発 P C Rブライマ 一を合成した。 各 P C R反応は前記の反応条件と本質的に同 じ条件下で行われた。 バージョ ン 「 b」 のため、 変異誘発プ ライマー Ρ ίι ν— m 4 ( V a 1 - 7 1→A r g - 7 1 ) (番 号は K a b a t らによる ； 表 4参照） （配列番号 ： 4 6 ) 及 び A P C R 4を、 鐯型 D NAとしての p U C— R V ii— P M 1 a と共に第一 P C R反応において使用した。 この第 1 P C R反応からの P C R生成物を精製し、 そしてブライマー A P C R 1 と共に第二 P C R反応における前方プライマーとして 使用した。 第二 P C R反応からの P C R生成物を 1. 6 %低 融点ァガロースゲルを用いて精製し、 H i n d III 及び B a m H I により消化し、 そして P U C 1 9にてサブクローニン グして p U C— R V h— P M l bを得た。 同様にして、 変異 誘発プライマー p h v— n m (A s p — l→G l n— 1 ) (配列番号： 4 7 ) 及び鏵型 P U C - R V h - P M l bを用 いてバージョ ン 「 c」 をコードする D NA ( p U C - R V — P M l c ) を得、 変異誘発ブライマ一 p h v— m 6 ( I I e - 4 8→M e t - 4 8 ) (配列番号 ： 4 8 ) 及び铸型 P U C一 R V h— P M l bを用いてバージョ ン 「 d j をコー ドす る D NA ( p U C - R V h - P M l d ) を得、 変異誘発プラ イマ一 P h v— n m及び铸型 p U C— R V h— P M 1 cを用 いてバーシヨ ン 「 e 」 をコー ドする D N A ( p U C - R V h - P M 1 e ) を得、 そして変異誘発ブライマ一 p h v— m 7
( T h r — 2 8→S e r — 2 8、 及び P h e — 2 9→ I 1 e - 2 9 ) (配列番号 ： 4 9 ) 及び铸型 p U C— R V h— P M 1 bを用いてバージョ ン 「 f 」 をコー ドする D N A ( p U C - R V h - P M 1 f ) を得た。 再構成 H鎖 V領域バーシヨ ン
「 f 」 のァ ミノ酸配列及びそれをコー ドするヌク レオチ ド配 列を配列番号 5 4に示す。
図 7 は、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域の第一バ一ジ ヨ ンをコー ドする D N Aの作製において使用したプライマー 及び P C R反応を模式的に示す。 再構成ヒ ト P M— 1抗体し 鎖 V領域の第一バージョ ンをコードする D N Aの作製のため， C D R 1移植ブライマ一 p k V— 1 (配列番号 ： 5 0 ) 、 C D R 2移植ブライマ一 p k v— 2 (配列番号 ： 5 1 ) 及び C D R 3移植ブライマ一 p k v— 3 (配列番号 ： 5 2 ) を合成 し、 そして 8 M尿素を舍有する 1 2 %ポリ アク リルァ ミ ドゲ ル上で精製した。 前記のようにして P C R反応を行った。 第 — P C R反応物は 1 μ Μずつの p k v— 3プライ マー及び A P C R 4 プライ マーを含有した。 第一 P C R反応からの 3 5 0 bpの P C R生成物を 1. 5 %低融点ァガロースゲルを用い て精製し、 そして第二 P C R反応における前方プライマーと して使用した。 第二 P C R反応からの P C R生成物を精製し、 B a m H I及び H i n d lll で消化し、 そして C D R 3が移 植された D N Aを舍有する 5 0 0 bp断片を D N A配列決定の ために P U C 1 9ベクターにサブク ローユングした。 正しい 配列を有するプラスミ ド D N Aを同定し、 そして次の P C R 反応における鐯型 D N Aとして使用した。 第三 P C R反応に おいて 2 5 p m o 1 eの変異誘発プライマー p k v— 2及び A P C R 4を使用した。 第三 P C R反応からの P C R生成物 を精製し、 そしてブライマー P k v— 1 と共に第四 P C R反 応におけるプライマ一として使用した。 同様にして、 第四 P C R反応からの P C R生成物を A P C R 1 プライマーと共に 第五 P C R反応におけるプライマーとして使用した。
第五 P C R反応からの 9 7 2 bpの P C R生成物を精製し、 B a m H I及び H i n d 111 により消化し、 そして D N A配 列決定のために P U C 1 9にサブクローユングした。 C D R 2領域において問題点が認識され、 さらに 2回の P C R反応 が必要であった。 第六 P C R反応及び第七 P C R反応におい て、 P U C 1 9ベクターにク ローニングされた第五 P C R反 応からの P C R生成物を铸型 D N Aをして使用した。 第六 P C R反応においてプライマーは P k v— 2及び A P C R 4で あった。 第六 P C R反応からの P C R生成物を精製し、 そし て A P C R 1 プライマーと共に第七 P C R反応におけるブラ イマ一として使用した。 第七 P C R反応からの P C R精製物 を精製し、 B a m H I及び H i n d III により消化し、 そし て 5 0 0 bp D N A断片を D N A配列決定のために P U C 1 . 3にサブクローニングした。 配列決定した 5個のクローン 内 2個のクローンが正しい D N A配列を有していた。 このク
新たな ^紙 ローンを p U C— R V 1 — P M 1 a と称する。 この配列を配 列番号 ： 5 5 に示す。
再構成ヒ ト P M— 1 L鎖 V領域の他のバージョ ンをコ一 ドする D N Aの作製のため、 変異誘発プライ マー P V k— m
1 (配列番号 ： 5 3 ) を合成した。 P C R反応は本質的に前 記の通りであった。 第一 P C R反応において、 変異誘発ブラ イ マ一 P k v — m l ( P h e— 7 1→T y r — 7 1 ) 及び A
P C R 4 プライ マーを铸型 D N Aとしての p U C— R V 1 ―
P M 1 a と共に使用した。 第一 P C R反応からの P C R生成 物を精製し、 そして A P C R 1 プライ マーと共に第二 P C R 反応におけるプライ マーと して使用した。 第二 P C R反応か らの P C R生成物を精製し、 B a m H I及び H i n d lll に より消化し、 そして D N A配列決定のために p U C 1 9 にサ ブク ローニングした。 このク ローンを p U C _ R V 1 — P M
1 b と命名した。
案 i 例— 8. 遺伝子操作された抗体を哺乳類細胞中で、 発現 させるためのヒ トサイ トメ ガロウ ィ ルス前期 （ H C M V ) ブ 口モーターを用いるベクタ一の作製 （図 1 )
キメ ラ P M— 1抗体の L鎖 V領域をコー ドする D N A断片 及びキメ ラ P M— 1抗体の H鎮 V領域をコー ドする D N A断 片を、 それぞれ、 哺乳類細胞中でヒ ト し鎖又はヒ ト r - i
H鎖を発現するよう に設計された H C M V発現ベクター （図
1 を参照のこ と） H C M V— V L — K C 及び H C M V— V H
- H C r 1 にまず挿入した。 該 H C M V発現べクタ一の作製. のための詳細な記載は、 M a e d a ら、 H u m a n A n t i b o d i e s a n d H y b r i d o m a s ( 1 9 9 】
新た な用紙 2 : 1 2 4 — 1 3 4 ; C. A. K e t t l e b o r o u g h ら、 P r o t e i n E n g e n e e r i n g ( 1 9 9 1 )
4 : 7 7 3 - 7 8 3 に公表されている。 両ベクターは P S V
2 n e o ( P . J . S o u t h e r n e t a 1 . , J . M o 1 . A p p l . G e n e t . ( 1 9 8 2 ) 1 : 3 2 7 - 3
4 1 ) に基礎を置き、 そして免疫グロプリ ン L鎖又は H鎮の 高レベルの転写のためにヒ トサイ トメガロウィルス （ H C M
V ) プロモーター及びェン八ンサー （M. B 0 s h a r t ら，
C e l l ( 1 9 8 5 ) 4 1 : 5 2 1 — 5 3 0 ) を舍有する。
L鎮発現べクタ一はヒ ト A: C領域 （ T. H. R a b b i t t s ら、 C a r r . T O P . M i c r o b i o l . I m m u n o 1 . ( 1 9 8 4 ) 1 1 4 : 1 6 6 — 1 7 1 ) をコードす るゲノム D N Aを舍有し、 そして H鎖発現べクターはヒ ト r
- 1 C領域 （N. T a k a h a s ii i ら、 C e l l ( 1 9 8
2 ) 2 9 : 6 7 1 — 6 7 9 ) をコードするゲノム D N Aを舍 有する。 これらの H C M V発現ベクターは多能であり、 そし て種々の哺乳類細胞タィブにおける一過性 （ t r a n s i e n t ) 発現及び安定な発現のために使用することができる。
Figure imgf000076_0001
ヒ ト · ボリ ペプチ ド · チェーン · エロ ンゲーショ ン · ファ クタ一 l o: ( H E F — 1 α ) は最も豊富な蛋白質の 1つであ る。 これはほとんどの細胞で発現される。 ヒ ト E F — l orブ 口モーター一ェンハンサ一の転写活性は S V 4 0前期プロモ 一ターーェンハンサ一のそれに比べて約 1 0 0倍である （ D W. K i mら、 G e n e ( 1 9 9 0 ) 9 1 : 2 1 7— 2 2 3 及び T. U e t s u k i ら、 J . B i o l . C h e m. ( 1 9 8 9 ) 2 6 4 : 5 7 9 1 - 5 7 9 8 ) 。 2. 5kbの H E F - 1 orプロモータ——ェ ンハ ンサ一領域は、 該遣伝子の 5 ' —末端に接する約 1. 5kbのD NA、 第ーェク ソ ン中の 3 3 bp、 第一イ ン ト ロ ン中の 9 4 3 bp、 及び第二ェク ソ ンの最初 の部分の 1 0 bpから成る。 この後 2. 5kbの H i n d lll ― E c o R I断片をプラス ミ ド p E F 3 2 1 — CAT ( D. W. K i mら、 G e n e ( 1 9 9 0 ) 9 1 : 2 1 7— 2 2 3 ;及 び T. U e t s u k i ら、 J. B i o l . C h e m. ( 1 9 8 9 ) 2 6 4 : 5 7 9 1 — 5 7 9 8 ) から切り出し、 そして p d K C Rベクタ一 （M. T s u c h i y a ら， Em b o J. ( 1 9 8 7 ) 6 : 6 1 1 — 6 1 6 ) 、 K. 0 ' H a r a ら、 P r o c . N a t l . A c a d. S c i . U S A V o 1. 7 8 , N o . 3 , 1 5 2 7 - 1 5 3 1 , ( 1 9 8 1 ) 、 ( R . F u k u n a g a ら、 P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A V a 1. 8 1 , 5 0 8 6 - 5 0 9 0
( 1 9 8 4))にク ローニ ングして、 S V 4 0前期プロモータ ——ェ ンハンサーを舍有する約 3 0 0 bpの H i n d III - E c o R I 断片を置き換えて P T E F — 1を得た。
P T E F— 1を E c o R Iで消化し、 K 1 e n o wポリ メ ラーゼでフ ィ ル一ィ ン し、 そ して H i n d III リ ンカーに連 結した。 次に、 この修飾された P T E F— 1ベクター D N A から約 1. 6kbの H i n d lll — S m a l断片を切り出した c H CMV— 1 2 h - g r 1を E c o R Iにより部分消化し
K 1 e n o wポリ メ ラーゼにより フィルーィ ンし、 そして自 己連結することにより、 実施例 5において作製した H CM V 一 1 2 h - g 1からプラス ミ ド H CMV— 1 2 h - g r 1
(厶 E 2 ) を作製した。
プラス ミ ド H CMV— 1 2 h— g r l (ΔΕ 2 ) を E c o R Iで消化し、 K 1 e n o wポリメ ラーゼでフィルーィ ンし， そして H i n d III で消化した。 ヒ ト r一 1 C領域をコ一ド する D N A配列を舍有する約 7 kbの断片を、 H E F— 1 αプ 口モータ——ェンハンサーを舍有する前記の 1. 6 kb H i n d III - S m a I断片に連結して H E F- 1 2 h - g r l を得た。 このベクター中の H E F— 1 αプロモーター · ェン ハンサー領域は、 5 ' —領域に接する 3 8 Obpの DNAを除 き、 p TE F— 1中のそれと同一であった。 H i n dlll ― B a mH I断片として存在するこの H鎖 V領域は、 他の H鎖 V領域と容易に交換することができる。
再構成ヒ ト H鎮 V領域をコードする D N Aを舍有する H i n d III - B a m H I D N A断片を p U C— R V h— PM 1 a , p U C -R V h - P M l , p U C -R V h - P M l c , p U C-R V h - PM l d , p U C-R V h— P M l e及び p U C-R V h - PM l f (実施例 7 ) から切り出し、 そし て前記のプラスミ ド H E F— 1 2 h - g r 1の H i n d III - B a m H I部位に挿入して、 それぞれ発現べクター R V ίι 一 PM l a , R V h - P M 1 b , R V h - Ρ Μ 1 c , R V h - P M 1 d , R V h - P M 1 e、 及び R V h— PM 1 f を得 た。 発現ベクター R V h— P M 1 a , R V h - P M 1 b , R
V h - P M 1 c , R V h — P M l e、 及び R V h — P M l f 並びに H E F— P M h — g r l は、 それぞれ再構成ヒ ト P M 一 1抗体 H鎖 V領域バージョ ン 「 a 」 ， 「 b」 ， 「 c 」 ，
「 d 」 ， 「 e 」 及び 「 f 」 、 並びにマウス P M— 1抗体 H鎖 V領域をコー ドする D N Aを有する。
L鎖発現ベクター H E F— 1 2 k - g kを作製するため、 H E F— 1 orプロモータ——ェ ンハンサー領域を舍有する約 3. 0 kbの P V u I — H i n d III 断片を H E F — 1 2 h — g r 1 ら切り出し、 そして実施例 5において作製した H C M
V - L鎖発現べクター H C M V— 1 2 k — g kからの約 7. 7 kbの P v u I — H i n d III 断片に連結して H E F — 1 2 k— g kを得た。 H鎖発現ベクター H E F— 1 2 h — g r 1 の場合と同様に、 H i n d lll — B a m H I 断片として存在 する H E F— 1 2 k— g k中の L鎮 V領域をコー ドする D N Aは他の L鎮 V領域をコー ドする D N Aと容易に交換するこ とができる。 なお、 プラスミ ド H E F— P M h — g r 1 は、 H E F— 1 2 - g r 1 (図 8 ) の E F 1 orプロモーター領 域 （ P v u l — H i n d lll 断片） により H C M V— p m h - g r 1 の H C H Vプロモーター領域 （ P v u I - H i n d III 断片） を置き換えることにより作製したものである。 再構成ヒ ト L鎖 V領域をコー ドする D N Aを舍有する H i n d lll — B a m H I D N A断片を p U C— R V l — P M l a及び P U C — R V 1 — P M l b (実施例 7 ) から切り出し、 そして H E F— 1 2 k — g kの H i n d lll — B a m H I部 位に挿入し、 それぞれ発現ベクター R V 1 — P M 1 a及び R
V I — P M 1 bを得た。 発現ベクター R V 1 — P M l a及び
R V 1 - P M 1 b、 並びに H E F— P MK — g kはそれぞれ 再構成ヒ ト L鎮 V領域 「 a 」 及び 「 b」 、 並びにマウス P M 一 1 L鎮 V領域をコードする D N Aを有する。 なお、 ブラ スミ ド H E F— P MK — g kは、 H E F— 1 2 k— g k (図
9 ) の E F 1 orプロモーター領域 （ P v u I 一 H i n d III 断片） により H C M V— p m k a — g kの H C MVプロモー ター領域 （ P v u l — H i n d lll 断片）
を置き換えることにより作製したものである。
Figure imgf000080_0001
S V 4 0前期プロモーターからェ ンハンサー配列を除去す るため、 プラスミ ド P S V 2 — d h i r ( S . S u b r a m a n i ら、 M o l . C e l l . B i o l . ( 1 9 8 1 ) 1 : 8 5 4 - 8 6 ) (AT C C 3 3 6 9 4 ) を S p h l及び P v u 11で消化し、 K 1 e n o wボリ メ ラーゼでフ ィ ルーイ ン し、 そして自己連結して P S V 2 — d h f r—厶 Eを得た (図 1 0 ) 。 H CM Vプロモーター、 H鎮 V領域をコードす る D NA及びヒ ト r — 1 C領域をコードする D NAを舍有す る約 3. 7 kbの E c o R I断片を、 E c o R I による部分消 化により H C M V— P M h— g r l らか切り出した。 この断 片を、 E c o R I —消化 p S V 2 — d h f r — Δ Εに連結し て D H F R—厶 E— P M h— g τ 1を得た。 H E F - 1 oプロモータ——ェンハンサーを用いる H鎖発 現ベクターに基いて類似のベクタ一を作製した （図 1 1を参 照のこと） 。 H CMV— 1 2 h— g r lに由来する約 3. 7 kbの E c o R I断片を、 E c o R I —消化 p S V 2— d h f r—厶 Eと連結して D H F R—厶 E— 1 2 h— g r 1を得た, D H F E—厶 E— 1 2 h— g r 1中の d h i r配列に続く B a mH I部位を、 B a mH Iによる部分消化、 K l e n o w ボリ メ ラーゼによるフィルーィ ン及び自己連結により除去し た。 d h f r c DNAを舍有する約 4kbの P v u l — B a m H I断片をこの修飾された D H F R— Δ Ε— 1 2 h - g r 1から切り出し、 そして実施例 1 2において作製した R V h — P M 1 ί — 4からの約 3kbの P v u I — B a mH I断片に 連結して D H F R—厶 E— R V h— P M l f を得た。
上記の改良されたプラス ミ ドは本発明の再構成ヒ ト P M— 1抗体の製造のために使用することができる。
実施例 1 1. 再構成ヒ ト P M— 1抗体の種々のバージョ ン の発現及び分折
再構成ヒ ト P M— 1抗体の L鎖及び H鎖を発現する各 H E F— 1 oべクターを ^細胞に同時形質転換 （ c 0— t r a n s f e c t ) した。 標準対照としてキメ ラ P M— 1抗体 の L鎮及び H鎖を発現する各 H E F— 1 orベクターも C 0 S 細胞に同時形質転換した。 3日後， 形質転換された C 0 S細 胞からの培地を集め、 そして E L I S Aにより （ 1 ) 上清中 に存在するヒ ト I g G抗体の量について、 及び （ 2 ) I L - 6 Rに結合するその I g Gの能力について分析した。 次に、 同じサンプルをさらに、 E L I S Aにより、 ヒ ト I L一 6 R へのヒ ト I L一 6の結合を阻害する該抗体の能力について試 験した。
再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖を発現する 2種類のベクター の一方 （R V 1— PM 1 a又は R V 1— PM 1 b ) 及びキメ ラ P M— 1抗体 H鎮を発現するベクター （H CMV— ΡΜ ίι 一 g r 1 ) により _ς_ο ^細胞を同時形質転換することにより、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域の 2種類のパージヨ ンの 評価を行った。 細胞をまた、 キメ ラ PM— 1抗体 L鎖及び H 鑌を発現する各ベクター （ H C M V— P M k a— g k及び H CMV— PM h— g r l ) により同時形質転換した。 未精製 0 C 0 S細胞上清を用いるデーターは、 ヒ ト I L— 6 Rへの 結合についての測定において、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎮 のパージヨ ン 「 a j がキメ ラ P M— 1抗体 L鎮と同等である ことを示した。 しかしながら、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 のバージョ ン 「 b j はヒ ト I L一 6 Rへの結合能を実質的に 保持しなかった。 これらの結果から、 F R 3中の位置 7 1の フェニルァラニン （CAMP.AH TH— 1 Hのために修飾さ れたヒ ト R E I中に存在する） からチロシン （天然ヒ ト R E I及びマウス P M— 1抗体中に存在する） への変化は機能的 抗原結合部位の形成に対して非常に有害であることが結論さ れた。
再構成ヒ ト PM— 1抗体 H鎖 V領域の種々のバージョ ンを 評価する次の実績において、 再構成ヒ ト PM— 1抗体 L鎖 V 領域のバージヨ ン 「 a」 を常に用いた。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖の発現する 6種類のベクタ一 の 1つ （ R V h— P M l a , R V - P M 1 b , R V h - P 1 c , R V - P M 1 d , R V h— P M l e又は R V h—
P M 1 f ) 及び再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖のバージ ョ ン
「 a」 を発現するベクター （ R V 1 — P M 1 a ) により C 0 細胞を同時形質転換することにより、 再構成ヒ ト P M— 1 抗体 H鎖 V領域の 6種類のバージ ョ ンを評価した。 細胞を、 キメ ラ P M— 1抗体 L鎖及び H鎮を発現する各ベク ター （ H E F— P M k— g k及び H E F— P M h— g r 1 ) によ って も同時形質転換した。 未精製の _Q_Q ^細胞上清を用いた予備 データーが示すところによれば、 ヒ ト I L— 6 Rへの結合に ついての測定において、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖のバー ジョ ン 「 a」 及び再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖のバージ ョ ン
「 f 」 は、 キメ ラ P M— 1抗体 L鎖及び H鎖と同等であった。 こ の予備データーを確認するため、 キメ ラ P M— 1抗体及 び再構成ヒ ト P M— 1抗体を _Q_Q_ 細胞上清から濃縮そして プロティ ン Αを用いて精製した。 すなわち、 C O S細胞から の培地を 1 0 O k dカ ツ トオフ限外濾過装置 （Am i c o n ) を用いて濃縮した。 濃縮した培地をプロティ ン Aァガロース
( A f f i G e 1 P r o t e i n A MA P S IIキ ッ ト、 B i o R a d ) を用いて精製した。 要約すれば、 濃縮された 培地を、 5ベッ ドボリ ゥ ムの結合緩衝液により平衡化された プロティ ン Aァガロースカ ラ ムに適用した。 このカ ラムを 1 5べッ ドボリ ウムの結合緩衝液で洗浄し、 そして次に 5ベ ッ ドボリ ウムの溶出緩衝液で溶出を行った。 そしてマイ ク ロコ ンセン ト レーター ( C e n t r i c o n 1 0 , Am i c o n ) を用いて溶出液を濃縮し、 溶出緩衝液を P B Sに置換し た。
キメ ラ P M— 1抗体、 及び再構成ヒ ト L鎖 V領域のバージ ヨ ン 「 a」 と再構成ヒ ト H鎖 V領域のバージョ ン 「 a j , 「 b j , 「 c j , 「 d」 ， 「 e j 又は 「 ί j とから成る再構 成ヒ ト P M— 1抗体の精製されたサンプルの分折を行った。 L鎮の 「 a」 バージョ ン + H鎮の 「 ί」 バージョ ンが明らか に最良の再構成ヒ ト Ρ Μ— 1抗体であつた。 このものは、 キ メ ラ Ρ Μ— 1抗体と同様にヒ ト I L— 6 Rに結合する （図 1
3 ) 。 これはまた、 マウス抗体及びキメ ラ抗体と同様に、 ヒ ト I L一 6がヒ ト I L一 6 Rに結合するのを阻害する （図 1
4 ) ο
実施例 1 2. 発現レベルを改良するための再構成ヒ ト ΡΜ 一 1 V領域の修正
再構成ヒ ト ΡΜ— 1抗体 L鎖及び Η鎖の V領域 （配列番号：
5 4及び 5 5 ) のリーダー配列をコー ドする D Ν Α配列内の イ ン トロンを除去するため、 V領域をコー ドする c D N Aを P C Rプライマーを用いて再クローユングした。 L鎮及び H 鎖の発現ベクター R V 1 — PM l a及び R V h— PM 1 ίを C 0 S細胞に同時形質転換した。 4 8時間後、 全1¾ ^' を調 製し t C ii i r g w i nり、 B i o c h e m i s t r ( i 9 7 9 ) 1 8 : 5 2 9 4— 5 2 9 9 ) 、 そしてマウス抗体 V 領域の P C Rクーロユングについて記載したようにして一本 c D N A合成のために 5 〃 gの全 R N Aを用いた。 3種類の P C Rプライ マーを設計し、 そして合成した。 L E V— P 1 (配列番号 ： 6 0 ) 及び H E V— P 1 (配列番号 ： 5 8 ) はスブラィ ス ドナー配列及び B a m H I部位を舍有し、 そし てそれぞれ L鎖及び H鎮の V領域のための前方プライ マーと して使用した。
H E V - P 2 (配列番号 ： 5 9 ) は H i n d III 部位及び A T G開始コ ド ンの前の K o z a k コ ンセ ンサス配列を舍有 し、 そして L鎖及び H鎖の V領域のための後方プライマーと して使用した。 1 0 0 / 1 ずつの P C R反応物は 2 0 T r i s - H C 1 ( p H 8 . 8 ) , 1 0 mM K C 1 , 1 0 mM ( N H 4 ) 2 S 04 , 2 mM M g S 04 , 0. 1 % T r i t o n X— 1 0 0 , 0. l i/ gの B S A, 2 5 0 M d N T P , 2. 5 uの V e n t D N Aポリメ ラ一ゼ （ B i o . L a b s , U. K. ) . 5 0 %の一本 c D N A合成反応物並 びに 1 0 O p m o 1 eずつの前方プライマー及び後方プラ イ マーを舍有した。 各 P C Rチューブは 5 0 μ 1 の鉱油で覆い, そして 9 4てにて 1 . 5分間の最初の変性の後、 9 4 。Cにて 1分間、 5 0 。Cにて 1分間及び 7 2てにて 1分間のサイ ク ル 反応を 3 0回行い、 そして次に 7 2 ΐにて 1 0分間ィ ンキュ ペー ト した。 L鎖 V領域を舍有する 4 0 8 bpの P C R生成物 及び H鎖 V領域を舍有する 4 4 4 の？ 01¾生成物を、 2. 0 %低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 そして B a m H I 及び H i n d lll により消化し、 そして P U C 1 9 ベク タ 一にサブクローニ ングし、 それぞれ p U C - R V 1 一 P M 1 a — 3及び P U C — R V h — P M 1 f — 3を得た。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖及び H鎖の V領域の D N A配 列は不適切なスプライス ドナー部位及びァクセプター部位を 舍有することが明らかになつた （配列番号： 5 4及び 5 5を 参照のこと） 。 L鎖 V領域内のこれらの部位は高頻度には使 用されない （m R NAの約 1 0 %) が、 H鎖 V領域内のこれ らの部位は高頻度で使用される （m R NAの約 9 0 %) 。 こ の異常なスプライ シ ングが再構成ヒ ト P M— 1抗体の低レべ ルの発現をもたらした。 V領域の異常なスプライ シングを回 避するため、 スプライス一 ドナ一部位を P C R法により除去 した。 H鎖 V領域について、 後方プライマー N EW— S P 1 (配列番号： 6 1 ) 及び前方ブライマ一 N EW— S P 2 (配 列番号 6 2 ) を合成した。 このプライマーば D N A配列 T G G G T G A GAを D NA配列 T G G G T T C G Cに 変える。 P C R反応の条件は c D NAのクローニングについ て前記した通りであつたが、 鐯型 D NAは 5 O ngの p U C— R V h - P M 1 f 一 3であり、 そしてプライマーは H E V— P 2 と N EW— S P 2、 又は H E F— P I と N EW— S P 1 のいずれかであつた。
2個の P C R反応からの P C R生成物を 2 %低融点ァガロ ースゲルを用いて精製し、 そして P C R連結反応において使 用した。 0. 5 gの第一 P C R生成物を舍有する 9 8 1 の P C R反応物及び 5ユニッ トの V e n t D NAポリ メ ラ ーゼを 9 4 'Cにて 2分間、 5 0 てにて 2分間及び 7 2てにて 5分間イ ンキュベー ト し、 そして次に 1 O O p m o 1 eずつ の H E V— P 1ブライマー及び H E V— P 2プライマーを加 えた。 P C Rチューブを 3 0 μ 1 の鉱油で覆い、 そして 9 4 •Cにて 1分間、 5 0てにて 1分間及び Ί 2 ·(：にて 1分間の 2 5サイ クルの P C Rにかけ、 そして次に 7 2 'Cにて 1 0分間 イ ンキュベー ト した。
同様にして、 再構成ヒ ト Ρ Μ— 1抗体 L鎖 V領域中のスプ ライス一 ドナー領域を P C Rプライマ一 R Ε I — S Ρ 1 (配 列番号 ： 6 3 ) 及び R E I — S P 2 (配列番号 ： 6 4 ) を用 いて除去した。 該プライマーは D Ν Α配列 C A G G T A A G Gを D NA配列 C A G G A A A G Gに変える。 両 P C R生成物、 すなわち L鎖 V領域についての 4 0 8 bP0 D N A断片及び H鎖 V領域についての 4 4 4 bpの D N A断片を 2. 0 %低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 H i n d III 及 び B a m H I により消化し、 そして配列決定のため P U C 1 9にサブク 口一ユングして p U C— R V 1 — P M 1 a — 4及 び p U C— R V h— R M l f — 4を得た。
R V h— P M l f の H i n d lll — B a m H I 断片を、 P U C - R V - P M l ί — 4の H i n d III — B a m H I領 域と置き換えることにより、 R V h— P M 1 f — 4を得た。 再構成ヒ ト P M— 1抗体 L鎖 V領域のィ ン ト ロ ンが除去され たバージョ ン 「 a 」 の配列を配列番号 5 7 に示し、 再構成ヒ ト P M— 1抗体 H鎖 V領域のィ ン ト口 ンが除去されたバ一ジ ヨ ン 「 f 」 の配列を配列番号 5 6に示す。
実施例 1 3. 再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 L鎖 V領域 をコー ドする D N Aの作製
再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖 V領域をコー ドする D N Aの作製の工程を図 1 6に示す。 铸型となるヒ ト抗体 L 鎖 V領域をコー ドする遺伝子は、 制限酵素 H i n d III 及び B a m H I部位を用いて P U C 1 9ベクターに組み込まれて いる。 8個の P C Rプライマー （ A〜 H ) を準備し、 第 1の P C Rにより、 V領域をコ一ドする遺伝子を 4つの領域に分 けて増幅させる。 ブライマー A及び Hは、 p U C 1 9ベクタ 一上の D N A配列と栢捕性を持つ。 プライマー B, C及び D は、 それぞれ移植する C D R領域の遺伝子配列を有する 4 0 〜6 0 bpのプライマーである。 プライマー E, F及び Gは、 それぞれプライマー B , C及び Dの 5 ' 側 1 5〜2 0 bpの D NA配列と相捕性を持つ。 4個の第 1 P C Rは、 それぞれプ ライマー Aと E、 Bと F、 Cと G、 及び Dと Hを用いる。 P C R生成物 A— Eは F R 1をコードし、 B— Fは C D R 1 と F R 2をコードする。 A— E断片の 3 ' 側と B— F断片の 5 ' 側は 1 5〜2 0 bpの相補性を持つので、 後に、 これら断片を 連結することが可能となる。 同様に、 B— F断片は、 C D R 2及び F R 3をコードする C— G断片とも相補性を持つ。 そ して、 C— G断片はさらに、 C D R 3と F R 4をコードする D— H断片とも相補性を持つ。 こう してこれら 4種の断片は、 互いの相捕性により連結が可能となる。 P C R反応液中にて これら 4つの断片の連結反応を行った後、 プライマー A及び Hを加える事により、 正しく 4つの断片が連結したものが、 この第 2の P C Rによって増幅してく る。 こう して得られた 第 2の P C R生成物は、 3つの移植された C D Rを有し、 H i n d III 及び B a m H Iの消化後、 p U C 1 9ベクターに サブク ローニ ングする。
さ らに具体的には、 踌型と して再構成ヒ ト P M — 1 抗体し 鎖 V領域バージ ョ ン 「 a 」 をコー ドする D N Aがプラ ス ミ ド p U C 1 9 に挿入されているプラス ミ ド P U C — R V 1 — P M l a — 4を用いた。
前記ブライ マー A〜Hは次の配列を有する。
後方ブライ マ一 配列番号 前方ブライ マ一 配列番号
A. REVERSE 83 E. 1220— Lib 66
B. 1220 - L1 65 F. 1220— L2b 68
C. 1220 -L2 67 G. 1220 -L3b 70
D. 1220 - L3 69 H. UNIVERSAし 82
C D R移植用の後方プライ マー 1 2 2 0 — L I 1 2 2 0 — L 2及び 1 2 2 0 — L 3 については、 8 M尿素を舍む 1 2 %ポリ アク リルァ ミ ドゲルを用いて精製後使用した。
1 0 0 / 1 ずつの P C R反応物は 2 0 mM T r i s — H C 1 (pH 8. 8 ) ， 1 0 mM K C 1 , 1 0 mfl (N H 4)2 S 04 2 mM M g S 04 , 0. 1 % T r i t o n X — 1 0 0 , 0. l 〃 g 0 B S A, 2 5 0 〃 m d N T P , 5 uの V e n t D N Aポリ メ ラーゼ （ B i o L a b s . U . K . ) , 5 O ngの p U C— R V 1 — P M l a — 4 0丄^ 、 そして各 1 0 0 P m o 1 e s の前方及び後方プライ マーを舍有した。 各 P C Rチューブは 5 0 μ 1 の鉱油で覆い、 そして 9 4 てにて 1 . 5分間の最初の変性の後、 9 4 てにて 1分間、 5 0 °Cに て 1 分間及び 7 2 'Cにて 1 分間の反応を 3 0 サイ クル行い、 そ して次に 7 2 てにて 1 0分間ィ ンキュペー ト した。
新た な用紙 2 5 2 bp ( A - E ) , 9 6 bp ( B - F ) , 1 3 0 bp ( C - G ) 及び 1 2 3 bp ( D— H ) の各 P C R生成物を 2. 0 %の 低融点ァガロース （ F M C, B i o . P r o d u c t s , U S A) ゲルを用いて精製した。 すなわち、 各 D NA断片を舍 有するァガロース片を切り取りそして 6 5てにて 5分間溶融 せしめ、 そしてこれと同容積の 2 mM £ 0丁八及び 2 0
Figure imgf000090_0001
N a C 1 を舍有する 2 0 mM T r i s — H C 1 (PH 7. 5 ) を加えた。 この混合物をフヱノ ール及びク 口口ホルムにより 抽出し、 そして D N A断片をエタノール沈鎩により回収し、 そして I mM E D T Aを含有する 1 0 mM T r i s — H C 1 (pH7. 5 ) に溶解し、 そして P C R連結反応において使用 した。
次に、 0. 2 〃 gの各第 1 の P C R生成物及び 5ユニッ ト の V e n t D NAポリメ ラーゼを舍有する 9 8 〃 1 の P C R反応液を 9 4てにて 2分間、 5 0 'Cにて 2分間及び 7 2て にて 5分間イ ンキュベー ト し、 連結反応を行った。 そして次 に、 各 l O O p m o 1 eの A ( R E V E R S E ) 及び H ( ϋ Ν I V E R S A L ) プライマーを加えて反応液を 1 0 0 a 1 とした後、 これを 5 0 〃 1 の鉱油でおおい、 そして 9 4 に て 1分間、 5 0てにて 1分間及び 7 2てにて 1分間の反応を 3 0サイ クル行い、 そして次に 7 2 'Cにて 1 0分間ィ ンキュ ペー ト した。
マウスモノ クローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0の L鎖の C D Rが移植された L鎖 V領域をコー ドする D N Aを舍有する 5 5 8 bpの第 2 P C Rの生成物を 2. 0 %低融点ァガロースゲ ルを用いて精製し、 そして B a m H I及び H i n d UI によ り消化後、 P U C 1 9ベクターにサブクローニ ングし、 塩基 配列を確認し、 P U C — R VL - 1 2 2 0 aを得た。 得られ た L鎮 V領域のァ ミノ酸配列及びそれをコードするヌク レオ チ ド配列を配列表 7 1 に示す。
次いで、 L鎮発現ベクターを構築するため、 再構成ヒ ト 1 2 — 2 0抗体 L鎖 V領域を舍有する H i n d III - B a m H I D N A断片を上記プラス ミ ド p U C— R VL — 1 2 2 0 a から切り出し、 L鎮発現ベクター H E F— 1 2 一 g の H i n d lll — B a m H I 部位に挿入し、 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖 V領域バ一ジヨ ン aの発現べクターである R VL — 1 2 2 0 aを得た。
実施例 1 4. 再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 L鎖の発現 及び分折
C O S細胞での一過性 （ t r a n s i e n t ) 発現
再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 L鎖を発現する ベク ター R VL 一 1 2 2 0 a及びキメ ラ 1 2 — 2 0抗体 H鎖を発現す るべク タ一、 H E F— 1 2 h— g r l (実施例 5 ) によ り C 0 S細胞を同時形質転換することにより、 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖バージ ョ ン 「 a 」 の評価を行った。 すな わち、 C O S細胞を 1 X 1 07 個 /mlになるように p h o s p h a t e — b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) に 懸濁し、 この細胞浮遊液 0. 8 mlに D N A (各プラ ス ミ ドに ついて 1 を加えた。 G e n e P u 1 s a r装置 ( B i o R a d ) を用い 1 , 9 0 0ボル ト （ V ) 、 2 5マイ クロファラ ッ ド （ F ) の電気容量にてパルスを与えた。
室温にて 1 0分間の回復期間の後、 ェクレ トロポレーショ ンした細胞を、 1 0 %のゥ シ胎児血清 （ r一グロブリ ン不舍） を舍有する D M E M培地 （G I B C O) 2 0 mlに加えた。 7 2時間のィ ンキュベーショ ンの後、 培養上清を集め、 遠心分 離して細胞破片を除去し、 そして無菌条件下で 4 'Cにて短時 間、 又は一 2 0てにて長時間貯蔵した。
酵素免疫測定法 （E L I S A) によるヒ ト様抗体の定量 トランスフヱク トされた C O S細胞の培養上清を E L I S Aにより測定して、 キメ ラ抗体が生産されていることを確認 した。 ヒ ト様抗体を検出するため、 プレー トをャギの抗ヒ ト I g G ( W 0 1 e m o l e c u l e ) ( S i gm a ) に よりコートした。 ブロ ック した後、 C O S細胞からの培養上 清を段階希釈しそして各ゥエルに加えた。
プレー トのィ ンキュベーショ ン及び洗浄の後、 ァルカ リ ホ スファターゼ—結合ャギ抗—ヒ ト I g G ( r鎖特異的、 S i g m a ) を加えた。 イ ンキュベーショ ン及び洗浄の後、 基質 緩衝液を加えた。 さらにィ ンキュベーショ ンした後、 反応を 停止しそして 4 0 5 nmにおける吸光度を測定した。 標準とし て精製ヒ ト I g G ( S i gm a ) を用いた。
ヒ ト I L一 6 Rへの結合能を確認するための酵素免疫測定 ( E L I S A )
ト ラ ンスフヱク トされた C O S細胞からの上清を E L I S Aにより測定して、 生産されたヒ ト様抗体が抗原 I L— 6 R に結合し得るか否かを決定した。 抗原への結合の検出のため、 プレー トを MT 1 8マウスモノ ク ローナル抗体 （参考例 1 ) でコー ト した。 1 % B S Aでブロ ック した後、 可镕性組換 ぇヒ ト I L— 6 R ( S R 3 4 4 ) をプレー トに加えた。
プレー トを洗浄した後、 C 0 S細胞からの培養上清を段階 希釈し、 そして該プレー ト の各ゥエルに加えた。 イ ンキュべ ーシ ョ ン及び洗浄の後、 アルカ リ ホスファターゼ結合ャギ抗
I, ー ヒ ト I g Gをゥエルに加えた。 ィ ンキュベーシ ョ ン及び洗 浄の後、 基質緩衝液を加えた。 ィ ンキュベーシ ョ ンの後、 反 応を停止し、 そして 4 0 5 nmにおける吸光度を測定した。
この結果を図 1 7に示す。 再構成ヒ ト AU K 1 2— 2 0抗 体 L鎖バージ ョ ン 「 a」 とキメ ラ 1 2— 2 0抗体 H鎖の組み 合せによるヒ ト様抗体は、 キメ ラ 1 2— 2 0抗体と同様にヒ ト I L一 6 Rに対する強い結合能を示し、 サ ンプルの希釈度 依存的に 4 0 5 nmにおける吸光度が変化し、 サンプル中に I L - 6 Rに対する抗体が舍まれていることが確認された。 ま た、 この結果は、 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖のノ、 - 一ジョ ン 「 a 」 がキメ ラ AU K l 2 - 2 0抗体 L鎖と同様に 抗原結合能を持つことを示している。
実施例 1 5. ヒ トサブグループ I ( H S G I ) コ ンセ ンサ ス配列を用いた再構成ヒ ト 1 2— 2 0抗体 H鎖遣伝子の構築 実施例 1 3で示した方法と同様にして、 A U K 1 2— 2 0 抗体 H鎖 V領域の C D Rをヒ トサブグループ I のコ ンセ ンサ ス配列を F Rとして有する再構成ヒ ト VH a 4 2 5 ( K e t t l e b o r o u g hら、 P r o t e i n E n g i n e e r i n g , 4 , 7 7 3 - 7 8 3 , 1 9 9 1 ) に移植した。 ま ず、 再構成ヒ ト VK a 4 2 5 (上記文献中、 F i g 3 ) をコ ー ドする H i n dlll — B a mH I DN A断片をプラスミ ド H CMV— R VHa— 4 2 5— r lから切り出し、 p U C l 9ベクターの H i n d III 一 B a m H I部位にサブクロー二 ングし、 p U C— R VK — 4 2 5 aを得た。 これを铸型 D N Aとして使用した。 P C Rに用いる 8個のプライマー （A 1 〜H 1 ) を合成した。 ブライマー 1 2 2 0— H Iは、 C D R 1の移植及び T h r— 2 8から S e r— 2 8の変更を誘導す る様にデザイ ンし、 プライマー 1 2 2 0— H 3は C D R 3の 移植及び S e r— 9 4から A r g— 9 4への変異を誘導する 様にデザイ ンした。 プライマー 1 2 2 0—H 1 , 1 2 2 0— H 2及び 1 2 2 0— H 3は、 それぞれ 8 M尿素を含む 1 2 % ボリアク リルァミ ドゲルを用いて精製後、 使用した。 各ブラ イマ一のヌク レオチ ド配列は次の通りである。
後方ブラィマー 配列番号 前方プライマー 配列番号
Al. REVERSE 83 El. 1220-Hlb 73 B1. 1220— HI 72 Fl. 1220-H2b 75
CI. 1220-H2 74 Gl. 1220-H3b 77 Dl. 1220-H3 76 HI. UNIVERSAL 82
P C Rの条件は、 鐯型 D NAとして p U C— R VH - 4 2 5 aを使用し、 H鎖 C D R移植用プライマ一として上記のも のを使用した以外は実施例 1 3に記載したのと同じであった, A 1 と E l、 B 1 と F l、 C 1 と G l、 及び D l と H Iのブ ラィマー対を用いて第 1 P C R反応を行い、 それぞれ 1 8 6 bp ( A 1 - E 1 ) , 7 5 bp ( B 1 - F 1 ) , 1 7 3 bp ( C I — G l ) 及び 1 0 5 bp ( D l — H I ) の各第 1 P C R生成物 を 2. 0 %の低融点ァガロースゲルにて精製し、 次の第 2 P C R連結反応において使用した。 実施例 1 3にて示した条件 に従い、 各 0. 2 // gの上記第 1 P C R生成物を用いて第 2 P C R ( P C R連結反応を舍む） を行い、 マウス A U K 1 2 一 2 0抗体の H鎮 V領域 C D Rが移植されたヒ ト H鎮 V領域 を舍有する 4 9 5 bpの P C R生成物を得、 これを 2. 0 %低 融点ァガロースゲルを用いて精製した。 そして B a m H I 及 び H i n d lll により消化後、 得られた B a m H I — H i n d III 断片を p U C l 9ベクターにサブク ローユングし、 塩 基配列を確認して、 P U C — R V H — 1 2 2 0 aを得た。
ところで、 再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 H鎖 V領域を コードする D N A配列を調らベた結果、 スブライ スの供与配 列とよ く一致する配列が見い出された。 この事は、 再構成ヒ ト P M— 1抗体の作成時に問題となつた異常なスプライ シン グを引き起す可能性がある。 そこで、 この配列を P C R法に より変異させた。 変異誘導プライマーとして、 S G I — S P 1 (配列番号 9 7 ) 及び S G I — S P 2 (配列番号 9 8 ) を 合成した。 このプライマ一は、 D N A配列 A A G G T G A G Cを D N A配列A A A G T C A G Cに変える。 P C R反応の条件は、 前記条件と同様に行い、 铸型 D N Aは 5 0 ngの p U C— R VH — 1 2 2 0 aであり、 そしてプライ マー は S G I — S P 1 と U N. I V E R S A L (配列番号 8 2 ) 、 または S G I — S P 2 と R E V E R S E (配列番号 8 3 ) の いずれかであった。 2個の P C R反応からの P C R生成物を 2 %低融点ァガロ ースゲルを用いて精製し、 そして P C R連結反応において使 用した。 各 0. 2 〃 gの第 1 P C R生成物及び 5 uの V e n t D N Aポリメ ラーゼを舍有する 9 8 1の P C R反応液 を 9 4 ·( にて 2分間、 5 0 'Cにて 2分間、 及び Ί 2てにて 5 分簡ィ ンキュベー トし連結反応を行った。 そして次に 1 0 0 P m 0 1 eずつの U N I V E R S A L及び R E V E R S Eブ ライマーを加え、 5 0 〃 1の鉱油でおおつた後、 9 4 'Cにて 1分間、 5 0 'Cにて 1分間そして 7 2てにて 1分間の第 2 P CRを 3 0サイ クル行い、 そして次に 7 2 ΐにて 1 0分間ィ ンキュペート した。 第 2 P C Rで得られた 4 9 5 bpの DNA 断片を 2. 0 %低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 H i n d III 及び B a m H Iにより消化し、 これを P U C 1 9ベ クタ一にサブクローニングした後、 塩基配列を確認して、 P U C - R V„ 一 1 2 2 0 a— 2を得た。
次いで、 再構成ヒ ト AUK 1 2 - 2 0抗体 H鎖 V領域をコ ードする D N Aを舍有する H i n d III - B a m H I D N A断片を上記 p U C— R VH — 1 2 2 0 a— 2より切り出し、 H鎖発現べクタ一 H E F— 1 2 h— g lの H i n dlll 一 B a m H I部位に導入し、 再構成ヒ ト AUK 1 2— 2 0抗体 H鎮のバージョ ン aの発現ベクターである R VH — 1 2 2 0 aを得た。
再構成ヒ ト A UK 1 2 - 2 0抗体 H鎖 V領域の他のバージ ヨ ン （ b〜d ) をコードする D NAを作成するために 2組の 変異誘発 P C Rプライマーを合成した。 各 P C R反応は前記 の反応条件と本質的に同じ条件下で行われた。 バージョ ン 「 b」 をコー ドする D N Aの作成のため、 2種の第 1 P C R において、 U N I V E R S A Lプライマー （配列番号 8 2 ) 及び変異誘発ブライマ一 1 2 2 0 H— m l a (配列番号 7 8 ) あるいは、 R E V E R S Eプライマ一 （配列番号 8 3 ) と変 異誘発ブライマ一 1 2 2 0 H— m l b (配列番号 7 9 ) の各 P C Rブライマー、 並びに铸型 D N Aとしての P U C — R V H — 1 2 2 0 aを用いた。 それぞれ 2 0 2 bp及び 3 2 3 bpの第 1 P C R生成物を 2. 0 %低融点ァガロースゲルを用いて精 製後、 前記の反応条件と同様に第 2 P C R ( P C R連結反応 を舍む） を行い、 4 9 5 bpの生成物 （バージョ ン 「 b」 ） を 得た。 これを H i n d lll — B a m H I により消化し、 そし て、 p U C l 9ベクターにサブクローユングし、 p U C— R V H — 1 2 2 0 bを得た。
同様にして、 変異誘発プライ マ一 1 2 2 0 H - m 2 a (配 列番号 8 0 ) 、 1 2 2 0 H -m 2 b (配列番号 8 1 ) 及びこ の生成物を铸型 P U C— R VH — 1 2 2 0 aを用いて P C R 生成物 （バージョ ン 「 c 」 をコー ドする D N A ) を得、 H i n d lll 及び B a m H I で消化し、 p U C 1 9 ベクターの H
1 n d III — B a m H I 部位に揷入して p U C— R VH — 1
2 2 0 cを得た。 さ らに、 変異誘発プライマ一 1 2 2 0 H— m 1 a (配列番号 7 8 ) 、 1 2 2 0 H - m 1 b (配列番号 7 9 ) 及び铸型としての P U C— R VH — 1 2 2 0 cを用いて P C R生成物 （バージョ ン d ) を得、 これを H i n d III 及 び B a m H I で消化して p U C l 9ベクターの H i n d III 一 B a m H I部位に揷入することにより P U C— R VH — 1 2 2 0 dを得た。
なお、 プラスミ ド P U C — R V H — 1 2 2 0 b中にコード されているの再構成ヒ ト抗体 H鎖 V領域バージョ ン 「 b j の ァミノ酸配列及びそれをコー ドするヌク レオチ ド配列を配列 番号 8 4に示し、 P U C — R V H — 1 2 2 0 d中にコー ドさ れている再構成ヒ ト H鎮 V領域バージヨ ン 「 d j のアミノ酸 配列及びそれをコードするヌ ク レオチド配列を配列表 8 5に 示す。
次いで、 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 H鎖の各パージ ョ ンの発現ベクターを構築するために、 再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 H鎖 V領域をコードする D N Aを舍む H i n d III 一 B a m H I断片を p U C— R VH — 1 2 2 0 b , p U C - R V„ 一 1 2 2 0 c、 及び P U C — R V H - 1 2 2 0 d より切り出し、 H鎖発現ベクター H E F— 1 2 - g τ 1 の H i n d III — B a m H I部位に挿入して、 各バ一ジョ ンの 発現べクタ一 R V H — 1 2 2 0 b , R V H — 1 2 2 0 c、 及 び R VH — 1 2 2 0 dをそれぞれ得た。
荬施例 1 6. 再構成ヒ ト 1 2 — 2 0抗体の種々のパージョ ンの発現及び分折
再構成ヒ ト 1 2 — 2 0抗体 H鎖を発現する 4種類のベクタ 一の 1 つ （ R V H - 1 2 2 0 a , R V„ - 1 2 2 0 b , R V„ 一 1 2 2 0 c、 または R V H — 1 2 2 0 c! ) 及び再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 L鎖を発現するべクター R VL — 1 2 2 0 a により C O S細胞を同時形質転換することにより、 再 構成ヒ ト 1 2 — 2 0抗体 H鎖 V領域の 4種類のバージョ ンを 評価した。 比較のため、 C 0 S細胞をキメ ラ 1 2 — 2 0抗体 L鎖及び H鎖を発現する各べクター （ H E F— 1 2 h— g r 1及び H E F— 1 2 一 g ；） によつても同時形質転換した, ヒ ト I L一 6 Rへの結合についての測定において、 苒構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 L鎮と再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0 抗体 H鎖のバージョ ン 「 b」 、 あるいは再構成ヒ ト A U K 1 2 - 2 0抗体 L鎖と再構成ヒ ト A U K 1 2 — 2 0抗体 H鎖の バ一ジヨ ン 「 d 」 との組み合せによる再構成ヒ ト 1 2 — 2 0 抗体は、 キメ ラ 1 2 — 2 0抗体と同等の結合活性を示した。 これらの結果を図 1 8及び図 1 9に示す。
実施例 1 Ί . ヒ .ト抗体 H A Xを用いた再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鑌遺伝子の構築
マウスモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 - 2 0 の H鎖 V領域 と最も相同性の高いヒ ト抗体は、 タ ンパクデータべ一ス " L e e d s " の検索により、 H A Xであった （ J . I m m u n o 1 o g 1 3 9 , 2 4 9 6 - 2 5 0 1 , 1 9 8 7 , S L E患者由来 B c e l l y b r i d o m a 2 1 / 2 8 の産生する抗体、 遺伝子配列は F i g . 4 , 5 に、 ア ミ ノ酸 配列は F i g . 6に記載） 。 再構成ヒ ト s l e l 2 2 0 H抗 体 H鎖 V領域の設計を、 H A X抗体の F R領域とマ ウ スモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0 の H鎮 V領域の C D Rを用 いて行った。
マウ スモノ ク ローナル抗体 A U K 1 2 — 2 0 の H鎖 V領域 の C D Rを舍む再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖 V領¾
新た 用紙 をコードする全 D N Aは化学合成にて作成した。 すなわち、 全長 4 3 9 bp0 s 1 e 1 2 2 O H抗体 H鎮 V領域をコー ドす る D NAを各々 2 1 bpの重複部位を有する 9 0〜 9 4 bpの長 さの 6本のオリ ゴヌク レオチ ド （ s 1 e 1 2 2 0 h l〜 6 ； それぞれ、 配列番号 8 6〜 9 1 ) に分けて設計した。 ォリゴ ヌク レオチ ドの設計にあたり、 2次構造の検索を行ない、 構 造上に問題のある部位に関して、 ァミノ酸置換がおきない様 に、 コ ドンの第 3塩基を変換した。 これらのオリ ゴヌク レオ チ ドの相互関係及び 2本鎮合成 D Ν Αの完成までの過程を図 2 0に示す。
P C R法を用いて図 2 0に示す反応を行う。 すなわち 6本 の合成ォリゴヌク レオチ ドを同一 P C R反応チューブに加え、 第 1 の P C R反応を行う。 これにより、 2つのオリ ゴヌク レ ォチ ドのアニーリ ング伸長を行う ことができ、 さらに、 4つ のオリ ゴヌク レオチ ド、 または、 全長のオリ ゴヌク レオチ ド を得ることができる。 次に、 末端プライマー A (配列番号 9 2 ) 及び B (配列番号 9 3 ) を加え、 第 2の P C R反応を行 う ことで、 正し く全長を有するォリゴヌク レオチ ドのみを増 幅することができる。 得られた生成物を精製し、 B a m H I 及び H i n d III により消化後、 P U C 1 9ベクターにサブ ク ローニングしてシークェンスを 亍ぅ。
具体的には、 1 0 0 mM T r i s — H C 1 (PH 8. 3 ) , 5 0 mM K C 1 , 0. 1 mM d A T P , 0. 1 mM d. G T P , 0. 1 mM d C T P , 0. 1 mM d T T P , 1. 5 m« M g C I 2 及び 2. 5 uの D NAポリ メ ラーゼ Am p 1 i T a ( P e r k i n E l m e r C e t u s ) 並びに各オリ ゴ ヌク レオチ ド 5 p m o 1 eを舍有する 9 8 ^/ 1 の反応混合物 を 9 4 'C 1. 5分間の変性後、 9 4て 3分間、 5 0て 2分間 7 2 ΐ 5分間の反応を 3サイ クル行い、 次に 7 2 ΐにて 1 0 分間ィ ンキュペー ト した。 反応液に 5 0 μ Μの末端プライマ 一 Αおよび Βを 1 〃 1ずつ加え、 8 0 〃 1 の鉱油で覆い、 9 4て 1. 5分間の変性後、 9 4てにて 1分間、 5 0てにて 1 分間、 7 2て 1分間の反応を 3 0サイ クル行い、 続いて 7 2 。Cで 1 0分間イ ンキュベー ト した。 4 3 9 bpの P C R生成物 を 1. 5 %の低融点ァガロースゲルを用いて精製し、 制限酵 素 B a m H Iおよび Η ί η d III により消化後、 P U C 1 9 ベクターにサブクロ一ユングして、 塩基配列を確認した。 得 られたクローンを p U C— R VH - s 1 e l 2 2 0 H a とし た。 このプラス ミ ド中にコー ドされている再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体の H鎖 V領域バ一ジヨ ン 「 a 」 のア ミノ酸配 列及びそれをコー ドするヌク レオチ ド配列を配列番号 9 4に 示す。
次いで、 再構成ヒ ト s l e l 2 2 0 ( s 1 e 1 2 2 0 H ) 抗体 H鎖 V領域をコー ドする遺伝子を舍有する H i n d III - B a m H I D NA断片を p U C— R VH — s 1 e 1 2 2 O H aより切出し、 H鎖発現ベクター H E F— 1 2 h - g τ 1の H i n d lll — B a mH I部位に導入し、 R VH - s 1 e 1 2 2 0 H aを得た。
再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖 V領域の他のバージ ヨ ン （ 「 b」 〜 「 d」 ） を作成するため、 2つの変異誘発プ ライマー s l e l 2 2 0 H m l (配列番号 9 5 ) 、 及び s I e 1 2 2 0 H m 2 (配列番号 9 6 ) を合成した。 各 P C R反 応では、 実施例 1 3で示されている V e n t D N Aボリメ ラーゼ及び反応液組成を用いた。 各 P C R反応では、 パージ ヨ ン 「 b」 及びバージョ ン 「 c 」 については、 铸型としての P U C - R V„ — s 1 e 1 2 2 0 H a , δ 0 P m o 1 eの変 異誘発ブライマー s 1 e l 2 2 0 H m l または s 1 e 1 2 2 0 H m 2及び 5 0 p m o l eの末端ブライマ一 Bを舍有する 反応混合物を 9 4 'C 1. 5分間の変性の後、 9 4 'C 1分、 5 0て 1分、 7 2で 1分の 3 0サイ クルの反応にかけ、 次に 7 2てで 1 0分間イ ンキュベー ト した。 2 3 5 bpまたは 1 了 8 bpの生成物を 1. 5 %の低融点ァガロースゲルを用いて精製 し、 第 2の P C R反応のプライ マーとして使用した。 すなわ ち、 5 0 P m 0 1 eの末端プライマー Aと、 0. 2 〃 g 0 P C R生成物を加え、 P U C— R VH — s l e l 2 2 0 H aを 鐃型として、 第 2 P C R反応を行い、 4 3 9 bpの生成物を 1. 5 %低融点ァガロースゲルで精製、 B a m H I及び H i n d III で消化後 P U C 1 9ベクタ一にサブクローユングし て、 それぞれ構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎮 V領域パー ジョ ン 「 b j 又は '「 c j をコー ドするプラス ミ ド p U C _ R V„ — s I e l 2 2 0 H b又は p U C— R VH — s I e 1 2 2 0 H cを得た。
再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎮 V領域バージョ ン 「 d j をコー ドする D N Aは次の様にして作製した。 铸型と しての p U C— R VH — S 1 e 1 2 2 0 H bを用いた。 変異
新たな用羝 誘導ブライマ一 s l e l 2 2 0 H m 2及び末端ブライ マ一 B を 5 0 p m o 1 eずつ用いて第 1 の P C R反応を 3 0サイ ク ル行った。 得られた 1 7 8 bpの P C R生成物を 1. 6 %の低 融点ァガロースゲルにより精製し、 第 2の P C Rのプライ マ 一として用いた。 このプライマーと 5 0 p m o l e ©末端プ ライマー Aを用いて第 2 の P C Rを行い、 4 3 9 bpの D N A 断片を得た。 これを、 精製し、 B a m H I及び H i n d lll にて消化後 P U C 1 9ベクターにサブク ロ一ユングし、 ヌク レオチ ド配列を確認し、 P U C — R V H — S 1 e 1 2 2 0 H dを得た。
次いで、 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖の各バージ ョ ンの発現ベクターを構築するため、 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖 V領域をコードする D NAを舍む B a m H I — H i n d III 断片を P U C — R VK — s 1 e 1 2 2 0 H b , P U C - R V H — s 1 e 1 2 2 0 H " および p U C— R VH — s 1 e 1 2 2 O H dより切り出し、 H鎮発現べクタ一 H E — 1 2 }1 — 8 1 の 11 1 11 (1111 一 B a m H I 部位に挿入 して、 各発現ベクター、 R VH — s l e l 2 2 0 H b , R V„ — s l e l 2 2 0 H cおよび R VH — s l e l 2 2 0 H dを それぞれ得た。 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎖を発現する 4種類の ベクタ一のうちの 1 つ （ R VH - s 1 e 1 2 2 0 H a , R V κ.
- s 1 e 1 2 2 0 Η b , R VH — s l e l 2 2 0 H cまたは
R VH — s 1 e 1 2 2 0 H d ) および、 再構成ヒ ト 1 2 — 2 0抗体 L鎖を発現するベクター R VL — 1 2 2 0 aを用い て C O S細胞を同時形質転換することにより、 再構成ヒ ト s 1 e 1 2 2 0 H抗体 H鎮 V領域の 4種類のバージョ ンを、 I L— 6 Rへの I L一 6の結合を阻害する能力について評価し た。 この結果を図 2 1〜 2 4に示す。 なお、 これらの結果は 生産された抗体をプロティ ン Aによって精製した後に得られ たものである。
上記のごと く、 本発明によれば、 キメ ラ L鎖もしく は再構 成 L鎮又はキメ ラ H鎖もしく は再構成 H鎖の V領域、 そして 特に R F中の 1偭又は複数個のァミノ酸を他のアミノ酸に置 換してもなおヒ ト I L一 6 Rに結合する能力を維持している。 従って本発明は、 その本来の性質を維持している限り、 1個 又は複数のァミノ酸が他のアミノ酸により置換されている、 キメ ラ抗体及び再構成ヒ ト抗体、 キメ ラ L鎮及び再構成 L鎖、 キメ ラ H鎮及び再構成 H鎖、 再構成 L鎖 V領域、 並びに再構 成 H鎖 V領域、 並びにこれらをコードする D N Aをも包含す る。
参考例
本発明において使用される出発ハイプリ ドーマは次の様に して作製された。
参考例 1. ハイブリ ドーマ M T 1 8の作製
ヒ ト I L— 6 Rに対するモノ ク ローナル抗体を生産するハ イブリ ドーマを作製するため、 免疫原として、 細胞表面にヒ ト I L— 6 Rを発現するマウス T細胞を次の様にして作製し た。 すなわち、 Y. H i r a t a ら、 J. I mm u n o l . V o l . 1 4 3， 2 9 0 0 - 2 9 0 6 ( 1 9 8 9 ) に開示さ れているプラス ミ ド p Z i p n e o I L— 6 Rを常法に従 つてマウス T細胞系 C T L L一 2 (AT C C T I B 2 1 4 ) に ト ラ ンスフヱク ト し、 生ずる形質転換体を常法に従って G 1 8を用いてスク リ ーニングするこ とにより細胞あたり約 3 0 , 0 0 0個のヒ ト I L一 6 Rを発現する細胞株を得た。 この細胞株を C T B C 3と称する。
C T B C 3細胞を常法に従って R PM I 1 6 4 0中で培養 し、 そして培養細胞を P B S緩衝液により 4回洗浄し、 そし て 1 X 1 07 個の細胞を C 5 7 B Lノ 6マウスに腹腔内注射 して免疫感作した。 この免疫感作は 1週間に 1回 6週間にわ たって行った。
この免疫感作されたマウスから脾臓細胞を得、 そして常法 に従ってポリ エチレングリ コールを用いて骨髄腫 P 3 U 1細 胞を融合せしめ、 そして融合した細胞を次の様にしてスク リ 一二ングした。 I L— 6 R陰性ヒ ト T細胞系 J U R K A T (AT C C C R L 8 1 6 3 ) を、 プラス ミ ド p Z i p n e o I L一 6 Rにより同時ト ラ ンスフエク ト し、 そして形 質転換された細胞をスク リーユングして、 細胞当り約 1 0 0 , 0 0 0個の I L一 6 Rを発現する細胞系を得た。 この細胞系 を N J B C 8 と命名した。
N P - 4 0で細胞溶解した N J B C 8を認識するがしかし N P— 4 0で細胞溶解した J U R K ATを認識しない抗体を 生産するハイプリ ドーマ細胞系をクローン化しそして MT 1 8と命名した。 ハイプリ ドーマ MT 1 8は、 工業技術院微生 物工業技術研究所にブダぺス ト条約のもとに 1 9 9 0年 7月 1 0 日に微ェ研条寄第 2 9 9 9号 （ F E RM B P— 2 9 9 9 ) として寄託された。
参考例 2. ハイプリ ドーマ P M 1 の作製
ヒ ト I L一 6 Rに対するモノ ク ローナル抗体を生産するハ ィプリ ドーマを作製するため、 抗原として、 ヒ ト I L一 6 R を次の様にして抽出した。 3 X 1 09 偭のヒ ト骨髄腫細胞 ( I L - 6 R生産細胞） を 1 mlの 1 %ジギ トニン、 1 0 mMト リエタノールアミ ン緩街液 （pH 7. A ) , 0. 1 5 M N a C I及び I mM P M S F (フエ二ルメ チルスルホニルフルォ V ド ；和光純薬） 中で溶解した。 他方、 参考例 1において調 製したハイプリ ドーマ MT 1 8により生産された MT 1 8抗 体を、 ブロムシアンで活性化されたセファ ロース 4 B ( P h a r m a c i a ) に常法に従って結合させた。 この MT 1 8 抗体結合セファ ロース 4 Bを前記の細胞溶解物を混合するこ とにより、 セファロース 4 B上の MT 1 8抗体に前記可溶化 した I L一 6 Rを結合させた。 セファ ロース 4 Bに非特異的 に結合した物質を洗浄除去し、 そして S e p h a r o s e 4 Bに MT 1 8抗体を介して結合した I L— 6 Rを免疫原とし て使用した。
前記の免疫原を用いて B A L Bノ cマウスを 1週間に 1回 4週簡にわたり腹腔内に免疫感作した。 次に、 この免疫感作 されたマウスから脾臓細胞を得、 そして常法に従ってポリエ チレンダリ コールを用いて骨髄腫細胞 P 3 U 1 と融合せしめ た。 融合した細胞を次のようにしてスク リーニングした。 ま ず、 培養上清及び 0. 0 1 mlの P r 0 t e i n Gセファ ロー ス （ P h a r m a c i a ) を混合して上清中の免疫グロブリ ンを P r o t e i n Gセファ ロースに吸着せしめた。 他方、 35S—メチォニンにより内部標識された 1 011個の U 2 6 6 細胞を溶解し、 そして MT 1 8結合セフア ロース 4 Bを用い て I L一 6 Rをァフィ二ティ精製した。 次に、 35 S—メ チォ ニンで標識された I L一 6 Rを、 免疫グロブリ ンが結合して いる上記の P r 0 t e i n Gセファ ロースにより免疫沈降せ しめ、 そして沈澱を S D S— P A G Eにより分析した。 その 結果、 I L一 6 Rに特異的に結合する抗体を生産する 1個の ハイプリ ドーマク ローンを単離し、 そして P M 1 と命名した t ハイプリ ドーマ P M 1 は工業技術院微生物工業技術研究所に ブダぺス ト条約のもとに 1 9 9 0年 7月 1 0日に、 微ェ研条 寄第 2 9 9 8号 （ F E RM B P— 2 9 9 8 ) として寄託さ れた。
参考例 3 , ハイ プリ ドーマ A U K 1 2— 2 0 , AU K 6 4 ー 7及び 111^ 1 4 6— 1 5の作製
免疫原として可溶性 I L一 6 R ( S R 3 4 4 ) を、 Y a s u k a w a , K. らの、 J . B i o c h e m. 1 0 8 , 6 7 3 - 6 7 6 , 1 9 9 0、 に記載されている方法に従って調 製した。
すなわち、 N—末端から 3 4 5番目のコ ドンが終止コ ドン により置換されている I L一 6 Rをコードする c D NAを舍 有するプラス ミ ド p E C E d h f r 3 4 4を C H O ( 5 E 2 7 ) 細胞に ト ラ ンスフエク ト し、 その ト ラ ンスフエク トされ た細胞を無血清培地 （ 3 ー 0培地、 三光純薬） 中で培養し. そして得られる上清を H F — L a b 1系 （東ソ一） により濃 縮しそして B 1 u e — 5 P Wカ ラム及び P h e n y 1 — 5 P Wカ ラムにより精製した。 精製された可溶性 I L一 6 Rは S D S — P A G Eで単一バン ドを示した。
雌性 B A L B / c A n N C r j マウス （日本ク レア） に、 1回の免疫原量を 1 0 g /マウスとして F r e u n dの完 全アジュノ ン ト （ B a c t o A d j u v a n t C o m P 1 e t e H 3 7 R a , D i f c o ) と共に皮下注射し、 そ してそれぞれ最初の注射の 2週間及び 3週間後に、 F r e u n d の不完全ァ ジュノ ン ト （ B a c t o A d j u v a n t I n c o m p l e t e F r e u n d , D i f c o j と共 に同量の免疫原を第二回及び第 面追加免疫として皮下注射 した。 最終免疫感作 （第四回注射） は第三回注射の 1週間後 に、 アジュバン トを使わないで尾静脈内に行った。 免疫感作 されたマウスから血清試料を採取し、 希釈緩衝液により段階 的に希釈し、 そして G o l d s m i t h , P . K . , A n a 1 t i c a 1 B i o c h e m i s t y , 1 1 7 , 5 3 — 6 0 , 1 9 8 1、 に記載されている方法に従って E L I S A 法により分折した。 すなわち、 S R 3 4 4 ( 0 . I u g /ml ) によりコー トされたプレー トを 1 % B S Aによりブロ ック し、 そして前記の希釈された試料をそれに加えた。 S R 3 4 4に 結合したマウス I g Gをャギの抗ーマウス I g GZアルカ リ ホスファターゼ （ A P ) ( Z Y M E D ) 及びアルカ リ ホス ファターゼ用基質 （ S i g m a — 1 0 4 ) を用いて測定した。 血清中の抗ー S R 3 4 4抗体の増加を確認した後、 最終免疫 感作から 3日後に、 5匹の B A L B/ cマウスから脾臓細胞 を得た。 脾臓細胞及び骨髄細胞株 （ P 3 U 1 ) を 2 5 : 1の 比率で混合し、 P E G 1 5 0 0を用いて融合し、 そして 2 0 0 0個のゥエル中で 0. 7〜 ： 1. 1 X I 06 細胞ノウエルの 細胞濃度で培養した。 ゥエルからの上清を、 S R 3 4 4に結 合するそれらの能力について （ R 3 4 4認識ア ツセィ と称す る第一次スク リ ーニング） 、 及び S R 3 4 4 と I L— 6 Rと の結合を阻害するそれらの能力について （ 1 L一 6 / s 1 L 6 R結合阻害ァ ッセィ （ R B I A) による） スク リーニング した。 第一次スク リーニングが 2 4 0個の陽性ゥエルをもた らし、 そして第二次スク リーユングが 3 6個の陽性ゥエルを もたらした。
上記の S R 3 4 4認識ァッセィ は次の様にして行つた。 ャ ギの抗マウス I g ( C a p p e l ) ( l g Zml ) によりコ ー トされたプレー ト （M a x i S o r p , N u n c ) を 1 % B SAによりブロ ック し、 そして 1 0 0 〃 1ノウエルのハイ ブリ ドーマ培養上清をそれに添加し、 次に室温にて 1時間ィ ンキュペー ト した。 プレー トを洗浄した後、 2 0 n gノ mlの S R 3 4 4をゥエルに加え、 そして室温にて 1時間ィ ンキュ ベーショ ンを行った。 上清に由来する固定化された抗体によ り捕捉された S R 3 4 4の量を、 ラビッ ト抗 S R 3 4 4 I g G ( # 2 , 5 g /ml ) 、 ャギの抗ラビッ ト I g G—アル力 リホスファ ターゼ （AZP ) ( 1 : 3 0 0 0 , T a g o ) 及 び基質 （ 1 mgZml, S i g m a - 1 0 4 ) の添加、 並びにそ れに続く 4 0 5— 6 0 0nmでの吸光度の測定により定量した。 前記の R B I Aは次の様にして行った。 MT 1 8抗体でコ ートしたプレー トを l O O n gZmlの S R 3 4 4 ( 1 0 0 〃 1 Zゥエル） で満たし、 そして室温にて 1時間ィ ンキュベー ヨ ンを行った。 プレートを洗浄した後、 5 0 1 /ゥエルの ハィブリ ドーマ培養上清及び 5 0 ^ 1 ゥェルのビォ^ン一 I L - 6結合体 （ 2 0 n g /ml) をそれぞれのゥエルに同時 に加え、 そしてゥエルを室温にて 1時間ィ ンキュベー ト した。 ス ト レブ トァビジン一 AZP ( 1 : 7 0 0 0 , P I E R C E ) 及び対応する基質 （ S i g m a— 1 0 4 ) を添加し、 4 0 5 一 6 0 0 nmでの吸光度を測定することにより、 S R 3 4 4に 結合したビォチン一 I L一 6の量を測定した。
最後に、 限界希釈法を 2回反復することにより陽性クロー ンを純化し、 そして S R 3 4 4と I L— 6との結合を阻害す る 3個のハイプリ ドーマクローン、 すなわち AUK 1 2— 2 0 , AUK 1 4 6— 1 5及び AUK 6 4— 7 ;並びに S R 3 4 4と I L— 6との結合を阻害しないハイプリ ドーマクロー ン AUK 1 8 1— 6を得た。 産業上の利用可能性
本発明はヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体を提供し、 この抗体においてはヒ ト抗体の V領域の C D Rがヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体の C D Rにより置き 換えられている。 この再構成ヒ ト抗体の大部分がヒ ト抗体に 由来し、 そして C D Rは抗原性が低いから、 本発明の再構成 ヒ ト抗体はヒ トに対する抗原性が低く、 そしてそれ故に療法 用として期待される。 ブ夕ぺス ト条約規則第 1 3規則の 2の寄託された微生物への 言及
Figure imgf000111_0001
： National Col lections of Industrial and Marine
Bacteria Limited
あて名 ： 23St Macher Drive, Aberdeen AB2 1RY, UNITED
KINGDOM
微生物の表示 寄託番号 寄託日 col i DH5 a pPM- hi NCIMB 40362 1991年 2月 12日 col i DH5 o Pl2- h2 NCIMB 40363 1991年 2月 12日 col i DH5 a p64- h2 NCIMB 40364 1991年 2月 12曰 col i DH5 Pl46 -hi NCIMB 40365 1991年 2月 12日 col i DH5 a pPM- k3 NCIMB 40366 1991年 2月 12日 col i DH5 oc Pl2- k2 NCIMB 40367 1991年 2月 12日 col i DH5 a p64- k4 NCIMB 40368 1991年 2月 12日
E. col i DH5 oc P146 -k3 NCIMB 40369 1991年 2月 12日 寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号
微生物の表示 寄託番号 寄託曰
NT18 FERM BP-2999 1990年 7.月 10日 PM 1 FERM BP- 2998 1990年 7月 10日 【配列表 2
配列番号： 1
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGTTGC CTGTTAGGCT GTTGGTGCTG 40 配列番号： 2
配列の長さ： 39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直 H'状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGAGWCAG ACACACTCCT GYTATGGGT 39 配列番号： 3
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGTGTGC TCACTCAGGT CCTGGSGTTG 40 配列番号：
配列の長さ： 43
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGGRCCC CTGCTCAGWT TYTTGGMWTC TTG 43 配列番号： 5
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGATTTWC AGGTGCAGAT TWTCAGCTTC 40 配列番号： 6
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGGTKCY YTGYTSAGYT YCTGRGG 37 配列番号： 7
配列の長さ： 41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCWTCA AGATGGAGTC ACAKWYYCWG G 41 配列番号： 8
配列の長さ： 41
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の觀：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGTGGGGAY CTKTTTYCMM TTTTTCAATT G 41 配列番号： 9
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGTRTCCW CASCTCAGTT CCTTG 35 配列番号： 10
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGTATATAT GTTTGTTGTC TATTTCT 37 配列番号： 11
配列の長さ： 38
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGAAGCCC CAGCTCAGCT TCTCTTCC 38 配列番号： 12
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGATCCCGGG TGGATGGTGG GAAGATG 27 配列番号： 13
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAAATGCA GCTGGGTCAT STTCTTC 37
配列番号： 14
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の觀：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGATGGA GCTHTATCAT SYTCTT 36
配列番号： 15
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D MA
配列
ACTAGTCGAC ATGAAGKTGT GGTTAAACTG GGTTTTT 37 配列番号： 16
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGRACTTTG GGYTCAGCTT GRTTT 35
配列番号： 17
配列の長さ： 0
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGACTCCA GGCTCAATTT AGTTTTCCTT 40 配列番号： 18
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGCTGTCY TRGSGCTRCT CTTCTGC 37 配列番号： 19
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の觀：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGRATGGA GCKGGRTCTT TMTCTT 36
配列番号： 20
配列の長さ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鑌
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGAGAGTGC TGATTCTTTT GTG 33
配列番号： 21
配列の長さ： 40
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 A
配列
ACTAGTCGAC ATGGMTTGGG TGTGGAMCTT GCTATTCCTG 40 配列番号： 22
配列の長さ： 37
配列の型：核酸
鎖の数：一本鑌
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACTAGTCGAC ATGGGCAGAC TTACATTCTC ATTCCTG 37
配列番号： 23
配列の長さ： 28
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28
配列番号： 24
配列の長さ： 393
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源
生物名：マウス 直接の起源
クローン： pl2-k2
特徴- 1. .60 sig peptide
61. .393 mat peptide
配列
ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro -20 -15 -10 -5
GGT TCC ACT GGT GAC ATT GTG CTG ACA CAG TCT CCT GCT TCC TTA GGT 96 Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Gly
1 5 10
GTA TCT CTG GGG CAG AGG GCC ACC ATC TCA TGC AGG GCC AGC AAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser
15 20 25
GTC AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA CCA 192 Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
30 35 40
GGA CAG ACA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CTT GCA TCC AAC CTA GAA TCT 240 Gly Gin Thr Pro Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
45 50 55 60
GGG GTC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65 70 75
CTC AAC ATC CAT CCT GTG GAG GAG GAG GAT GCT GCA ACC TAT TAC TGT 33G Leu Asn lie His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
80 85 90 01 S ΐ - naq OJJ Aig Jas ui9 «19 na an nig ias siH ie/\
96 9VV 91V 913 3V9133 V9D 131 9V3 9V3 913 3XV 9V91313V0 319
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2 139 V09 I3V V99 VOX 9101130X1010 III OXtf 33309V 931 VDD 9IV
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6Π
PPS00/Z6d£/JDd 6S.61/Z6 OM CCT GGG GCT TCA GTG AAG ATA TCC TGC AAG GCT TCT GGT TAC TCA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
15 20 25
ACT AGC TAT TAC ATA CAC TGG GTG AAG CAG AGC CAT GGA AAG AGC CTT 192 Thr Ser Tyr Tyr lie His Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATT GGA TAT ATT GAT CCT TTC AAT GGT GGT ACT AGC TAC AAC 240 Glu Trp lie Gly Tyr lie Asp Pro Phe Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn
50 55 60
CAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GTT GAC AAA TCT TCC AGC 288 Gin Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
65 70 75
ACA GCC TAC ATG CAT CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCA GTC 336 Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCA AGG GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC TGG GGC CM GGG 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly
95 100 105
ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA 405 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
110 115 配列番号： 26
配列の長さ： 381
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎮状 配列の種類： cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン： pPM-k3
特徴： 1. .60 s ig peptide
61. .381 mat peptide
配列
ATG GTG TCC TCA GCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Ser Ala Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gin -20 -15 -10 -5 GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp l ie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser
1 5 10
GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr l ie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp
15 20 25
ATT AGC AGT TAT TTA AAC TGG TAT CAG CAG AAA CCA GAT GGA ACT ATT 192 He Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr He
30 35 40
AAA CTC CTG ATC TAC TAC ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu l ie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Va l Pro Ser
45 50 55 60
AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AAC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gl y Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr l ie Asn
65 70 75 MC CTG GAG CAA GAA GAC ATT GCC ACT TAC TTT TGC CAA CAG GGT AAC 336 Asn Leu Glu Gin Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn
80 85 90
ACG CTT CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAT 381 Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Asn
95 100 105 配列番号： 27
配列の長さ： 411
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎖状
鎖の数： J.m
配列の種類： cDNA 生物名：マウス
直接の起源
クローン： pPM-hl
特徴： 1. .54 sig peptide
55. .411 mat peptide
配列
ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TGG CTG TTC ACA GCC TTT CCT GGT ATC 48 Met Arg Val Leu l ie Leu Leu Trp Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly He
-15 -10 -5
CTG TCT GAT GTG CAG CTT CAG GAG TCG GGA CCT GTC CTG GTG AAG CCT 9G Leu Ser Asp Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro
- 1 5 10 新た TCT CAG TCT CTG TCC CTC ACC TGC ACT GTC ACT GGC TAC TCA ATC ACC 144 Ser Gin Ser し eu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser l ie Thr
15 20 25 30
AGT GAT CAT GCC TGG AGC TGG ATC CGG CAG TTT CCA GGA AAC AAA CTG 192 Ser Asp His Ala Trp Ser Trp l ie Arg Gin Phe Pro Gly Asn Lys Leu
35 40 45
GAG TGG ATG GGC TAC ATA AGT TAC AGT GGT ATC ACT ACC TAC AAC CCA 240 Glu Trp Met Gly Tyr He Ser Tyr Ser Gly l ie Thr Thr Tyr Asn Pro
50 55 60
TCT CTC AAA AGT CGA ATC TCT ATC ACT CGA GAC ACA TCC AA AAC CAG 288 Ser し eu Lys Ser Arg l ie Ser l ie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin
65 70 75
TTC TTC CTA CAG TTG AAT TCT GTG ACT ACT GGG GAC ACG TCC ACA TAT 336 Phe Phe Leu Gin Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ser Thr Tyr
80 85 90
TAC TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT 384 Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
95 100 105 110
CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 411 Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 配列番号： 28
配列の長さ： 393
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポ口ジー：直鎮状 配列の種類： cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン： P64-k4
特徴 s 1. .60 sig peptide
61. .393 mat peptide
配列
ATG GAG TCA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTG CTG CTG CTC TGG GTT CCA 48 Met Glu Ser Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
-20 -15 -10 - 5
GGT TCC ACA GGT GAC ATT GTG TTG ATC CAA TCT CCA GCT TCT TTG GCT 96 Gly Ser Thr Gly Asp lie Val Leu lie Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala
- 1 5 10
GTG TCT CTA GGG CAG AGG GCC ACC ATA TCC TGC AGA GCC AGT GAA AGT 144 Val Ser Leu Gly Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser
15 20 25
GTT GAT AGT TAT GGC AAT AGT TTT ATG CAC TGG TAC CAG CAG AAA CCA 192 Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro
30 35 40
GGA CAG CCA CCC AAA CTC CTC ATC TAT CGT GCA TCC AflC CTA GAA TCT 240 Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
45 50 55 60
GGG ATC CCT GCC AGG TTC AGT GGC AGT GGG TCT AGG ACA GAC TTC ACC 288 Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr
65 70 75 CTC ACC ATT AAT CCT GTG GAG GCT GAT GAT GTT GCA ACC TAT TAC TGT 336 Leu Thr lie Asn Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
80 85 90
CAG CAA AGT AAT GAG GAT CCT CCC ACG TTC GGT GCT GGG ACC AAG CTG 384 Gin Gin Ser Asn Glu Asp Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu
95 100 105
GAG CTG AAA 393 Glu Leu Lys
110 配列の番号： 29
配列の長さ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA 生物名：マウス
直接の起源
クローン： p64-h2
特徴： 1. .57 sig peptide
58. .417 mat peptide
配列
ATG GGA TGG AGC GGG GTC TTT ATC TTC CTC CTG TCA GTA ACT GCA GGT 48 Met Gly Trp Ser Gly Val Phe l ie Phe Leu Leu Ser Val Thr Ala Gly
-15 -10 -5 GTC CAC TCC CAG GTT CAA TTG CAG CAG TCT GGA GCT GAG TTG ATG AAG 96 Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys
-1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG ATC TCC TGC AAG GCT ACT GGC TAC ACA TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe
15 20 25
AGT AGT TAT TGG ATA GTG TGG ATA AAG CAG AGG CCT GGA CAT GGC CTT 192 Ser Ser Tyr Trp lie Val Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly His Gly Leu
30 35 40 45
GAG TGG ATT GGA GAG ATT TTA CCT GGA ACC GGT AGT ACT AAC TAC AAT 240 Glu Trp lie Gly Glu lie Leu Pro Gly Thr Gly Ser Thr Asn Tyr Asn
50 55 60
GAG AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTC ACT GCA GAT ACA TCT TCC AAC 288 Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn
65 70 75
ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC AGC CTG ACA TCT GAG GAC TCT GCC GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
80 85 90
TAT TAC TGT GCA AGT CTA GAC AGC TCG GGC TAC TAT GCT ATG GAC TAT 384 Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
95 100 105
TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 417 Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
110 115 120 配列の番号： 30
配列の長さ： 381 配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン： P146-k3
特徴- 1. .60 sig peptide
61. .381 mat peptide
配列
ATG GTG TCC ACA CCT CAG TTC CTT GGT CTC CTG TTG ATC TGT TTT CAA 48 Met Val Ser Thr Pro Gin Phe Leu Gly Leu Leu Leu l ie Cys Phe Gin -20 -15 -10 -5
GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA CAG ACT ACA TCC TCC CTG TCT 96 Gly Thr Arg Cys Asp l ie Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser し eu Ser
- 1 5 10 GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC AGT TGC AGG GCA AGT CAG GAC 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr l ie Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp
15 20 25
ATT AGT AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAA CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT 192 l ie Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val
30 35 40
AAA CTC CTG ATC TAC TAT ACA TCA AGA TTA CAC TCA GGA GTC CCA TCA 240 Lys Leu Leu l ie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser
45 50 55 60 AGG TTC AGT GGC AGT 6GG TCT GGA ACA GAT TAT TCT CTC ACC ATT AGC 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser
65 70 75
AAC CTG GAG CAA GAA GAT ATT GCC AGT TAC TTT TGC CAA CAG GGT TAT 336 Asn Leu Glu Gin Glu Asp lie Ala Ser Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Tyr
80 85 90
ACG CCT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG TTG GAA ATC AAA 381 Thr Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys
95 100 105 配列番号： 31
配列の長さ： 402
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類： cDNA
起源
生物名：マウス
直接の起源
クローン： pl46-hl
特徴- 1..51 sig peptide
52. . 02 mat peptide
配列
ATG GAG CTG GAT CTT TAT CTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT GTC TAC 48 Met Glu Leu Asp Leu Tyr Leu lie Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr
-15 -10 -5 2
SIT
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922 dU IVX DID 909 131 0V3 DVD I3X V33 911 33V 33V 3X0 WO 3XV OVX
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6 333 103 VDV V33 910 X39 399 9V0 DID 9V3 119 VOX
621
PPSQ0/Z6dr/lDd 6SI61/Z6 OM 配列番号： 32
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACAAAGCTTC CACCATGGAG TCAGACACAC TCCTG 35 配列番号： 33
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGCTAAGCTT CCACCATGGG ATGGAGCGGG ATCTTT 36 配列番号： 34
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 35 配列番号： 35
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTTGGATCCA CTCACCTGCA GAGACAGTTA CCAGAG 36
配列番号： 36
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
CTTGGATCCA CTCACGATTT ATTTCCAGCT TGGTC 35
配列番号： 37
配列の長さ： 35
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポ口ジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
CTTGGATCCA CTCACGTTTT ATTTCCAGCT TGGTC 3δ 配列番号： 38
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACAAAGCTTC CACCATGGTG TCCTCAGCTC AGTTCC 36 配列番号： 39
配列の長さ： 39
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D MA
配列
TGTTAGATCT ACTCACCTGA GGAGACAGTG ACTGAGGTT 39 配列番号： 0
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTCTAAGCTT CCACCATGAG AGTGCTGATT CTTTTG 36 配列番号： 41
配列の長さ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
TACGCAAACC GCCTCTC 17 配列番号： 42
配列の長さ： 18
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D A
配列
GAGTGCACCA TATGCGGT 18 配列番号： 3
配列の長さ： 55
配列の型：核酸
鎖の数：一本鑌
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACCGTGTCTG GCTACACCTT CACCAGCGAT CATGCCTGGA GCTGGGTGAG ACAGC 配列番号： 4
配列の長さ： 63
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
TGAGTGGATT GGATACATTA GTTATAGTGG AATCACAACC TATAATCCAT 50 CTCTCAAATC CAG 63
配列番号： 5
配列の長さ： 54
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎖
トポロジー：直 ϋ状
配列の種類：合成 D N A
配列
TATTATTGTG CMGATCCCT AGCTCGGACT ACGGCTATGG ACTACTGGGG TCAA 54
配列番号： 6
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D MA
配列
GTGACAATGC TGAGAGACAC CAGCAfiG 27 配列番号： 47
配列の長さ： 24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGTGTCCACT CCGATGTCCA ACTG 24
配列番号： 8
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGTCTTGAGT GGATGGGATA CATTAGT 27
配列番号： 9
配列の長さ： 29
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTGTCTGGCT ACTCAATTAC CAGCATCAT 29 配列番号： 50
配列の長さ： 48
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
TGTAGAGCCA GCCAGGACAT CAGCAGTTAC CTGAACTGGT ACCAGCAG 48
配列番号： 51
配列の長さ： 42
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
ATCTACTACA CCTCCAGACT GCACTCTGGT GTGCCAAGCA GA 42
配列番号： 52
配列の長さ： 50
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の麵：合成 D N A
配列
ACCTACTACT GCCAACAGGG TAACACGCTT CCATACACGT TCGGCCAAGG 50 配列番号： 53
配列の長さ ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AGCGGTACCG ACTACACCTT CACCATC 27
配列番号： 54
配列の長さ： 706
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成
起源
生物名：マウス及びヒ ト
直接の起源
クローン： pUC-RVh-PMlf
特徴： ヒト IL— 6Bに対する再構成ヒト化 PM-1抗体の H鎖 V領域バージョン (f) 及びそれをコードする遺伝子
アミノ酸 -19— -1： leader
アミノ酸 1—30 : FBI
アミノ酸 31— 36 : CDB1
アミノ酸 37— 50 : FB2
アミノ酸 51—66： CDR2
アミノ酸 67— 98 : FR3 アミノ酸 99一 108:CDB3
アミノ酸 109-119:FR4
ヌクレオチド 1—6 Hind III部位
ヌクレオチド 54— 135 intron
ヌクレオチド 258—348 intron/aberrant spl icing
ヌクレオチド 505— 706 intron
ヌクレオチド 701— 706 Bam HI部位
配列
AAGCTTC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 49
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10
ACA G GTAAGGGGCT CACAGTAGCA GGCTTGAGGT CTGGACATAT ATATGGGTGA 103 Thr
-5
CAATGACATC CACTTTGCCT TTCTCTCCAC AG GT GTC CAC TCC CAG GTC CAA 155
Gly Val His Ser Gin Val Gin
1
CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC 203 Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser
5 10 15
CTG ACC TGC ACC GTG TCT GGC TAC TCA ATT ACC AGC GAT CAT GCC TGG 251 Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser l ie Thr Ser Asp His Ala Trp
20 25 30 35
AGC TGG GTG AGA CAG CCA CCT GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA TAC 299 Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp He Gly Tyr
40 45 50 ATT AGT TAT AGT GGA ATC ACA ACC TAT AAT CCA TCT CTC AAA TCC AGA 347 He Ser Tyr Ser Gly He Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg
55 60 65
GTG ACA ATG CTG AGA GAC ACC AGC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC 395 Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu
70 75 80
AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC GCG GTT TAT TAT TGT GCA AGA TCC 443 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
85 90 95
CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGC AGC CTC GTC 491 Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val
100 105 110 115
ACA GTC TCC TCA G GTGAGTCCTT ACAACCTCTC TCTTCTATTC AGCTTAAATA 544 Thr Val Ser Ser
GATTTTACTG CATTTGTTGG GGGGGAAATG TGTGTATCTG AATTTCAGGT CATGAAGGAC 604 TAGGGACACC TTGGGAGTCA GAAAGGGTCA TTGGGAGCCC GGGCTGATGC AGACAGACAT 664 CCTCAGCTCC CAGACTTCAT GGCCAGAGAT TTATAGGGAT CC 706 配列番号： 55
配列の長さ： 506
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA 生物名：マウス及びヒト 新たな用紙 直接の起源
クローン： pUC-BVl- PMla
特徵：ヒト IL一 6Bに対する苒構成ヒト化 PM-1抗体の L鎖 V領域バージョン (a) 及びそれをコードする遺伝子
アミノ酸 -19一- 1： leader
アミノ酸 1—23 : FBI
アミノ酸 24— 34 : CDB1
アミノ酸 35— 49 : FB2
アミノ酸 50— 56 : CDB2
アミノ酸 57— 88 : FR3
アミノ酸 89— 97 : CDB3
アミノ酸 98— 117:FB4
ヌクレオチド 1 _ 6 ： Hind III 部位
ヌクレオチド 54— 135: intron
ヌクレオチド 268—376: intron/aberrant splicing
ヌクレオチド 469—506: intron
ヌクレオチド 501— 506: Bam HI 部位
配列
AAGCTTC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA GCT 49
Met Gly Trp Ser Cys lie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala -15 -10
ACA G GTAAGGGGCT CACAGTAGCA GGCTTGAGGT CTGGACATAT ATATGGGTGA 103 Thr
-5
CAATGACATC CACTTTGCCT TTCTCTCCAC G GT GTC CAC TCC GAC ATC CAG 155
Gly Val His Ser Asp l ie Gin
1 ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG 203 Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
5 10 15
ACC ATC ACC TGT AGA GCC AGC CAG GAC ATC AGC AGT TAC CTG AAT TGG 251 Thr l ie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp 20 25 30 35
TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TAC ACC 299 Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu l ie Tyr Tyr Thr
40 45 50
TCC AGA CTG CAC TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC 347 Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
55 60 65
GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC 395 Gl Thr Asp Phe Thr Phe Thr l ie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp He
70 75 80
GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAG GGT AAC ACG CTT CCA TAC ACG TTC GGC 443 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
85 90 95
CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C GTGAGTAGAA TTTAAACTTT 488 Gin Gly Thr Lys Val Glu l ie Lys
100 105
GCTTCCTCAG TTGGATCC 506 配列番号： 56
配列の長さ： 438
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成■ 生物名：マウス及びヒ クローン： pUC-RVh-PMlf-4
特徴：ヒト IL一 6Bに対する再構成ヒト化 PM- 1抗体の H鎖 V領域バージョン (f) 及びそれをコードする遺伝子であって、 intronが除去されたもの。 アミノ酸 - 19— -1： leader
アミノ酸 1—30 : FBI
アミノ酸 31— 36 : CDR1
アミノ酸 37— 50 : FB2
アミノ酸 51— 66 : CDB2
アミノ酸 67— 98 : 1¾3
アミノ酸 99— 108:CDR3
アミノ酸 109-119:FR4
ヌクレオチド 1一 6 ： Hind III部位
ヌクレオチド 432— 438: Bam HI部位
配列
AAGCTTCCAC C ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 50
Met Gly Trp Ser Cys He lie Leu Phe Leu Val Ala Thr
-15 -10
GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT 98 Ala Thr Gly Val His Ser Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly
-5 1 5 10
新たな用艉 CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG ACC TGC ACC GTG TCT GGC 146 Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly
15 20 25
TAC TCA ATT ACC AGC GAT CAT GCC TGG AGC TGG GTT CGC CAG CCA CCT 194 Tyr Ser l ie Thr Ser Asp His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro
30 35 40
GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA TAC ATT AGT TAT AGT GGA ATC ACA 242 Gly Arg Gly Leu Glu Trp l ie Gly Tyr l ie Ser Tyr Ser Gly l ie Thr
45 50 55
ACC TAT AAT CCA TCT CTC AAA TCC AGA GTG ACA ATG CTG AGA GAC ACC 290 Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr
60 65 70
AGC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC 338 Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
75 80 85 90
ACC GCG GTT TAT TAT TGT GCA AGA TCC CTA GCT CGG ACT ACG GCT ATG 386 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met
95 100 105
GAC TAC TGG GGT CAA GGC AGC CTC GTC ACA GTC TCC TCA G GTGAGTGGAT 436 Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
CC 438 配列番号： 57
配列の長さ： 02
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖 トポロジー ·*直鎖状
配列の種類：合成 MA 生物名：マウス及びヒト
直接の起源
クローン： pUC-EVl-P la
特徴：ヒ ト IL— 6Rに対する再構成ヒト化 PM- 1抗体の L鎮 V領域バージョン (a) 及びそれをコードする遺伝子であって、 intronが除去されたもの。 アミノ酸 -19— -1 : leader
アミノ酸 1 -23： FR1
アミノ酸 24—34 : CDR1
アミノ酸 35— 49 : FB2
アミノ酸 50— 56 : CDR2
アミノ酸 57— 88 : FR3
アミノ酸 89— 97 : CDB3
アミノ酸 98—107:FB4
ヌクレオチド 1一 6 ： Hind III §Μ立
ヌクレオチド 397—402: Bam HI部位
配列
AAGCTTCCAC C ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 50
Met Gly Trp Ser Cys l ie lie Leu Phe Leu Val Ala Thr
- 15 -10
GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 98 Ala Thr Gly Val His Ser Asp l ie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
-5 1 5 10
新たな用紙 CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCC AGC 146 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr l ie Thr Cys Arg Ala Ser
15 20 25
CAG GAC ATC AGC AGT TAC CTG AAT TGG TAC CAG CAG AAG CCA G6A AAG 194 Gin Asp l ie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys
30 35 40
GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC TAC ACC TCC AGA CTG CAC TCT GGT GTG 242 Ala Pro Lys Leu Leu l ie Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
45 50 55
CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC 290 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
60 65 70
ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAA CAG 338 He Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp l ie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin
75 80 85 90
GGT AAC ACG CTT CCA TAC ACG TTC GGC CAA GG6 ACC AAG GTG GAA ATC 386 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu l ie
95 100 105
AAA C GTGAGTGGAT CC 402 Lys
配列番号： 58
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A 配列
TAAGGATCCA CTCACCTGAG GAGACTGTGA CGAGGC 36 配列番号： 59
配列の長さ： 32
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D MA
配列
ATCAAGCTTC CACCATGGGA TGGAGCTGTA TC 32 配列番号： 60
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポ口ジ一：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AATGGATCC5 CTCACGTTTG ATTTCCACCT 30 配列番号： 61
配列の長さ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の觀：合成 D N A 配列
CATGCCTGGA GCTGGGTTCG CCAGCCACCT GGA 33 配列番号： 62
配列の長さ： 33
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 '
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
TCCAGGTGGC TGGCGAACCC AGCTCCAGGC ATG 33 配列番号： 63
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
CAGCAGAAGC CAGGAAAGGC TCCAAAGCTG 30 配列番号： 64
配列の長さ：30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A 配列
CAGCTTTGGA GCCTTTCCTG GCTTCTGCTG 30
配列番号： 65
配列の長さ： 66
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACCTGTAGAG CCAGCAAGAG TGTTAGTACA TCTGGCTATA GTTATATGCA 50 CTGGTACCAG CAGAAG 66
配列番号： 66
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GCTGGCTCTA CAGGT 15
配列番号： 67
配列の長さ： 48
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状 配列の種類：合成 D N A
配列
AAGCTGCTGA TCTACCTTCC ATCCACCCTG GAATCTGGTG TGCCAAGC 48
配列番号： 68
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTAGATCAGC AGCTT 15 配列番号： 69
配列の長さ： 8
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GCTACCTACT ACTGCCAGCA CAGTAGGGAG ACCCCATACA CGTTCGGC 48
配列番号： 70
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成 DN A
配列
CTGGCAGTAG GTAGC 15 配列番号： 71
配列の長さ： 414
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鎮
トポロジー ··直鏆状
配列の種類：合成 DM 生物名：マウス及びヒト クローン： pliC-BVl- 1220a
特徴：ヒト IL一 に対する再構成ヒト化 AM12- 20抗体の L鎖 V領域バージョ (a)及びそれをコードする遺伝子であって、 intronが除去されたも ©。 アミノ酸 -19- -1: leader
アミノ酸 1— 23: P
アミノ酸 24— 38 :CDB1
アミノ酸 39— 53 :FB2
アミノ酸 54— 60:CDR2
アミノ酸 61— 92:FB3
アミノ酸 93-101:CDR3
アミノ酸 102-111:FR4
ヌクレオチド 1一 6 ： Hind III部位
ヌクレオチド 408—414: Bam HI部位 新たな甩镞 配列
AAGCTTCCAC C ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA GCA ACA 50
Met Gly Trp Ser Cys l ie l ie Leu Phe Leu Val Ala Thr
-15 -10
GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC 98 Ala Thr Gly Val His Ser Asp l ie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser
- 5 -1 1 5 10
CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AGA GCC AGC 146 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr l ie Thr Cys Arg Ala Ser
15 20 25
AAG AGT GTT AGT ACA TCT GGC TAT AGT TAT ATG CAC TGG TAC CAG CAG 194 Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin
30 35 40
AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC CTT GCA TCC AAC CTG 242 Lys Pro Gly Lys Ala Pro lys Leu Leu l ie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu
45 50 55
GAA TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC 290 Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
60 65 70
TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC 338 Phe Thr Phe Thr l ie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp l ie Ala Thr Tyr
75 80 85 90
TAC TGC CAG CAC AGT AGG GAG AAC CCA TAC ACG TTC GGC CAA GGG ACC 386 Tyr Cys Gin His Ser Arg Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr
95 100 105 AAG GTG GAA ATC AAA CGTGAGTGGA TCC 414 Lys Val Glu lie Lys
110 配列番号： 72
配列の長さ： 45
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGTTATTCAT TCACTAGTTA TTACATACAC TGGGTTAGAC AGGCC 45 配列番号： 73
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AGTGAATGAA TAACCGCTAG CTTTACA 27 配列番号： 74
配列の長さ： 69
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鑌状 配列の種類：合成 D N A
配列
GAGTGGGTGG GCTATATTGA TCCTTTCAAT GGTGGTACTA GCTATAATCA 50 GAAGTTCAAG GGCAGGGTT 69 配列番号： 75
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ATAGCCCACC CACTC 15 配列番号： 76
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGGGGTAACC GCTTTGCTTA CTGGGGACAG GGTACC 36 配列番号： 77
配列の長さ： 36
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮 トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
AGCAAAGCGG TTACCCCCTC TGGCGCAGTA GTAGAC 36 配列番号： 78 t
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
CAAGGTTACC ATGACCGTGG ACACCTCTAC 30 配列番号： 79
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
CACGGTCATG GTAACCTTGC CCTTGAACTT 30 配列番号： 80
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮 トポ口ジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGGCTCGAAT GGATTGGCTA TATTGATCCT 30 配列番号： 81
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AGGATCAATA TAGCCAATCC ATTCGAGCCC 30 配列番号： 82
配列の長さ： 16
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTAAAACGAG GCCAGT 16 配列番号： 83
配列の長さ： 17
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DN A
配列
AACAGCTATG ACCATGA 17
配列番号： 84
配列の長さ： 433
配列の型：核酸
鎖の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 DNA 生物名：マウス及びヒト
直接の起源
クローン： pUC-BVh- 1220b
特徴：ヒト IL— 6βに対する再構成ヒト化 AUK12- 20抗体の Η鎮 V領域バージョン (b)及びそれをコードする遺伝子であって、 intronが除去されたもの。 アミノ酸 -19— - l:Ieader
アミノ酸 1— 30: FR1
アミノ酸 31— 35: CDR1
アミノ酸 36—49 : FB2
アミノ酸 50— 66: CDR2
アミノ酸 67— 98 :FR3
アミノ酸 99— 105:CDR3
アミノ酸 106— 116:FB4
ヌクレオチド 1—6 ： Hind III部位
ヌクレオチド 427—433: Bam HI部位 新たな用紙 配列
AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC 51
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala
-15 -10
GTG GCT CCT GGG GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala
-5 -1 1 5
GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA GCT AGC 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 25
GGT TAT TCA TTC ACT AGT TAT TAC ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCA 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr l ie His Trp Val Arg Gin Ala Pro
30 35 40
GGC CAA GGG CTC GAG TGG GTG GGC TAT ATT GAT CCT TTC AAT GGT GGT 243 Gly Gin Gly Leu Glu Trp Val Gly Tyr l ie Asp Pro Phe Asn Gly Gly,
45 50 55
ACT AGC TAT AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GTT ACC ATG ACC GTG GAC 291 Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp
60 65 70
ACC TCT ACA AAC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG 339 Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
75 80 85
GAC ACT GCA GTC TAC TAC TGC GCC AGA GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC · 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr
90 95 100 105 TGG GGA CAG GGT ACC CTT GTC ACC GTC AGT TCA GGTGAGTGGA TCC 433 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 配列番号： 85
配列の長さ： 433
配列の型：核酸
鎮の数：ニ本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DM 生物名：マウス及びヒト
直接の起源
クローン： pUC- BVh- 1220d
特徴：ヒト IL— に対する再構成ヒト化 AUK12-20抗体の H鎮 V領域バージョン (d)及びそれをコードする遺伝子であって、 intronが除去されたもの。 アミノ酸 -19一- 1: leader
アミノ酸 1— 30:FIU
アミノ酸 31— 35:CDB1
アミノ酸 36— 49:FB2
アミノ酸 50— 66 : CDB2
アミノ酸 67— 98: FB3
アミノ酸 99—105:CDR3
アミノ酸 106-116:FR4
ヌクレオチド 1一 6 ： Hind III部位
ヌクレオチド 427— 433: Bam HI部位 新たな ¾ S 配列
AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TGG ACC TGG CGC GTG TTT TGC CTG CTC GCC 51
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Cys Leu Leu Ala
-15 -10
GTG GCT CCT GGG GCC CAC AGC CAG GTG CAA CTA GTG CAG TCC GGC GCC 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala
- 5 - 1 1 5
GAA GTG AAG AAA CCC GGT GCT TCC GTG AAA GTC AGC TGT AAA GCT AGC 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 25
GGT TAT TCA TTC ACT AGT TAT TAC ATA CAC TGG GTT AGA CAG GCC CCA 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro
30 35 40
GGC CAA GGG CTC GAA TGG ATT GGC TAT ATT GAT CCT TTC AAT GGT GGT 243 Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Tyr lie Asp Pro Phe Asn Gly Gly
45 50 55
ACT AGC TAT AAT CAG AAG TTC AAG GGC AAG GTT ACC ATG ACC GTG GAC 291 Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Val Asp
60 65 70
ACC TCT ACA AAC ACC GCC TAC ATG GAA CTG TCC AGC CTG CGC TCC GAG 339 Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
75 80 85
GAC ACT GCA GTC TAC TAC TGC GCC AGA GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr
90 95 100 105 TGG GGA CAG GGT ACC CTT GTC ACC GTC AGT TCA GGTGAGTGGA TCC 433 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115
配列番号： 86
配列の長さ： 90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GATAAGCTTG CCGCCACCAT GGACTGGACC TGGAGGGTCT TCTTCTTGCT 50 GGCTGTAGCT CCAGGTGCTC ACTCCCAGGT GCAGCTTGTG 90
配列番号： 87
配列の長さ： 90
配列の型：核酸
鎮の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D MA
配列
CACTCCCAGG TGCAGCTTGT GCAGTCTGGA GCTGAGGTGA AGAAGCCTGG 50 GGCCTCAGTG AAGGTTTCCT GCflAGGCTTC TGGATACTCA 90
配列番号： 88
配列の長さ： 90
配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
TGCAAGGCTT CTGGATACTC ATTCACTAGT TATTACATAC ACTGGGTGCG 50 CCAGGCCCCC GGACAAAGGC TTGAGTGGAT GGGATATATT 90 配列番号： 89
配列の長さ： 90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
CTTGAGTGGA TGGGATATAT TGACCCTTTC AATGGTGGTA CTAGCTATAA 50 TCAGAAGTTC AAGGGCAGAG TCACCATTAC CGTAGACACA 90 配列番号： 90
配列の長さ： 90
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTCACCATTA CCGTAGACAC ATCCGCGAGC ACAGCCTACA TGGAGCTGAG 50 CAGCCTGAGA TCTGAAGACA CGGCTGTGTA TTACTGTGCG 90 配列番号： 91
配列の長さ： 94
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GAGAGGGGGT AACCGCTTTG CTTACTGGGG 50 CCAGGGAflCC CTGGTCACCG TCTCCTCAGG TGAGTGGATC CGAC 94
配列番号： 92
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GATAAGCTTG CCGCC 15
配列番号： 93
配列の長さ： 15
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
GTCGGATCCA CTCAC 15 配列番号： 94
配列の長さ： 433
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 DNA
起源
生物名：マウス及びヒト
直接の起源
クローン： pUC- RVH - sle 1220Ha
特徴：ヒト IL—6Rに対する再構成ヒト sleAUK12— 20抗体の H鎖 V領域バージョン 「 a」及びそれをコードする遺伝子。
アミノ酸 - 19—- l:leader
アミノ酸 1— 30 : FR1
アミノ酸 31— 35: CDR1
アミノ酸 36— 49 : FR2
アミノ酸 50— 66: CDR2
アミノ酸 67— 98 : FR3
アミノ酸 99一 105:CDR3
アミノ酸 109-116:F 4
ヌクレオチド 1— 6 ： Hind III 部位
ヌクレオチド 427—433: Bam HI 部位
配列
AAGCTTGCCG CCACC ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT 5：
Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala
-15 -10 新た な用紙 GTA GCT CCA GGT GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTT GTG CAG TCT GGA GCT 99 Val Ala Pro Gly Ala His Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala
- 5 -1 1 5
GAG GTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT 147 Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 10 15 20 , 25
GGA TAC TCA TTC ACT AGT TAT TAC ATA CAC TGG GTG CGC CAG GCC CCC 195 Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro
30 35 40
GGA CAA AGG CTT GAG TGG ATG GGA TAT ATT GAC CCT TTC AAT GGT GGT 243 Gly Gin Arg Leu Glu Trp Met Gly Tyr lie Asp Pro Phe Asn Gly Gly
45 50 55
ACT AGC TAT AAT CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC GTA GAC 291 Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr He Thr Val Asp
60 65 70
ACA TCC GCG AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGT CTG AGA TCT GAA 339 Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
75 80 85
GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA GGG GGT AAC CGC TTT GCT TAC 387 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Arg Phe Ala Tyr
90 95 100 105
TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGTGAGTGGA TCC 433 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
110 115 配列番号： 95
配列の長さ： 27 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AGGCTTGAGT GGATTGGATA TATTGAC , 27 配列番号： 96
配列の長さ： 27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成 D N A
配列
AAGTTCAAGG GCAAGGTCAC CATTACC 27 配列番号： 97
配列の長さ： 30
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鎮状
配列の種類：合成 D N A
配列
GGTGCTTCCG TGAAAGTCAG CTGTAAAGCT 30
配列番号： 98
配列の長さ： 30 配列の型：核酸
鎖の数：一本鎮
トポロジー：直鏆状
配列の種類：合成 D N A .
配列
AGCTTTftCAG CTGACTTTCA CGGAAGCACC 30

Claims

請 求 の 範 囲
1. ヒ ト イ ンターロ イ キ ン一 6受容体 （ I L一 6 R ) に対 するマウスモノ クローナル抗体のラィ ト鎖 （ L鎖） 可変領域
( V領域） 。
2. 配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0のいずれかに示さ れるァミノ酸配列を有する請求項 1 に記載の L鎖 V領域。
3. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体の ヘビー鎮 （ H鎖） V領域。
4. 配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 のいずれかに示さ れるァ ミノ酸配列を有する請求項 3に記載の H鎮 V領域。
5. ( 1 ) ヒ ト L鎖定常領域 （ C領域） 、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体の L鎮 V領域を舍ん で成る L鎖 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 C領域、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマゥ スモノ ク ローナル抗体の H鎖 V領域を含んで成る H鎖 ； を含んで成るキメ ラ抗体。
6. 前記マウス L鎮 V領域が配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及 び 3 0のいずれかに示されるアミノ酸配列を有し、 そして前 記マウス H鎖 V領域が配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 の いずれかに示されるァミノ酸配列を有する、 請求項 5に記載 のキメ ラ抗体。
7. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体の. L鎖 V領域の相補性決定領域 （ C D R ) 。
8. 配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0のいずれかに示さ れるァミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の範囲が表 9によ り定義される、 請求項 7に記載の C D R。
9. ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体の H鎖 V領域の C D R。
1 0. 配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 のいずれかに示 されるァミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の範囲が表 9に より定義される、 請求項 9に記載の C D R。
1 1. ( 1 ) ヒ ト L鑌 V領域のフ レームワーク領域（F R), 及び
( 2 ) ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の L鎮 V領域の C D R、
を含んで成るヒ ト I L一 6 Rに対する抗体の再構成 （ r e s h a p e d ) ヒ ト L鎮 V領域。
1 2. 前記 C D Rが配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0の いずれかに示されるァミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の 範囲が表 9により定義される、 請求項 1 1に記載の再構成ヒ ト L鎮 V領域。
1 3. 前記 F Rがヒ ト抗体 R E I に由来する、 請求項 1 1 に記載の再構成ヒ ト L鎖 V領域。
1 4. 表 2において R VL a又は R VL bとして示される ァミノ酸配列を有する請求項 1 1 に記載の再構成ヒ ト L鑌 V 領域。
1 5. 表 5において R VL として表わされるァミノ酸配列 を有する請求項 1 1 に記載の再構成ヒ ト L鎮 V領域。
1 6. ( 1 ) ヒ ト H鎮 V領域の F R、 及び ( 2 ) ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の H鎖 V領域の C D R、
を舎んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト H 鎖 V領域。
1 7. 前記 C D Rが配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 の いずれかに示されるァ ミノ酸配列を有し、 該ァ ミノ酸配列の 範囲が表 9により定義される、 請求項 1 6に記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域。
1 8. 前記 F Rがヒ ト抗体 N E W又は H A Xに由来する、 請求項 1 6に記載の再構成ヒ ト H鎮 V領域。
1 9. 表 3に R VH a , R V„ b , R V„ c , R V„ d , R V„ e、 又は R VH f として示されるア ミノ酸配列を有す る、 請求項 1 6に記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域。
2 0. 表 6における R VH a , R VH b , R V„ c もしく は R VH d、 又は表 7における R VH a , R V„ b , R V„ c もしく は R VH d として示されるア ミノ酸配列を有する、 請求項 1 Ίに記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域。
2 1. ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウ ス モノ ク ロ一ナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域、 を含んで成るヒ ト I L— 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の L鎖。
2 2. 前記ヒ ト L鎖 C領域がヒ ト r一 I C領域であり、 ヒ ト L鎖 F Rが R E I に由来し、 前記 L鎖 C D Rが配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0 のいずれかに示されるア ミノ酸配列 を有し、 該ァ ミノ酸配列の範囲は表 9に定義される通りであ る、 請求項 2 1 に記載の再構成ヒ ト抗体 L鎖。
2 3. 前記 L鎮 V領域が表 2において R VL a又は R VL bとして示されるァミノ酸配列を有する、 請求項 2 1 に記載 の再構成ヒ ト抗体 L鎖。
2 4. 前記 L鎖 V領域が表 5において R VL として表わさ れるアミノ酸配列を有する、 請求項 2 1に記載の再構成ヒ ト 抗体 L鎖。
2 5. ( 1 ) ヒ ト H鑌 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウス モノクローナル抗体の H鑌 C D Rを含んで成る H鎮 V領域、 を含んで成るヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の H鑌。
2 6. 前記ヒ ト H鎮 C領域がヒ ト κ C領域であり、 前記ヒ ト H鎮 F Rが N E W又は H A Xに由来し、 前記 H鎮 C D Rが 配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 のいずれかに示されるァ ミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の範囲が表 9において定 義される通りである、 請求項 2 5に記載の再構成ヒ ト抗体 H 鎖。
2 7. 前記 H鎖 V領域が表 3に R VH a , R V„ b , R V„ c又は R VH d として示されるアミノ酸配列を有する、 請求 項 2 5に記載の再構成ヒ ト抗体 H鎖。
2 8. 前記 H鎮 V領域が表 6における！？ VH a , R V„ b , R V„ c もしく は R VK d又は表 7における R VH a , R V„ b , R V„ c又は R VK d として示されるアミノ酸配列を有 する、 請求項 2 5に記載の再構成ヒ ト抗体 H鎖。
2 9. (A) ( 1 ) ヒ ト L鎮 C領域、 及び
新たな 敏 ( 2 ) ヒ ト L鎖 F R、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウス モノ ク ローナル抗体の L鎖 C D Rを含んで成る L鎖 V領域、 を含んで成る L鎖 ； 並びに
( B ) ( 1 ) ヒ ト H鎮 C領域、 並びに
( 2 ) ヒ ト H鎖 F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウス モノ ク ローナル抗体の H鎖 C D Rを含んで成る H鎮 V領域、 を含んで成る H鎖 ；
を含んで成るヒ ド I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体。
3 0. 前記 L鎖 C D Rが配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0のいずれかに示されるァミノ酸配列を有し、 該アミノ酸配 列の範囲が表 9に定義される通りであり ； H鎖 C D Rが配列 番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 のいずれかに示されるァミノ 酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の範囲が表 9において定義さ れる通りであり ； ヒ ト L鎖 F Rが R E I に由来し ； 前記ヒ ト H鎮 F Rが N E W又は H A Xに由来し、 前記ヒ ト L鎖 C領域 はヒ ト Γ 一 I C領域であり ； そ して前記ヒ ト H鎖 C領域はヒ ト A C領域である、 請求項 2 9に記載の再構成ヒ ト抗体。
3 1. 前記 L鎖 V領域が表 2において R VL a又は R V L b として示されるァミノ酸配列を有する、 請求項 2 9に記載 の再構成ヒ ト抗体。
3 2. 前記 L鎖 V領域が表 5において R VL として示され るァミノ酸配列を有する、 請求項 2 9に記載の再構成ヒ ト抗 体。
3 3. 前記 H鎖 V領域が表 3に R VH a , R V„ b , R V„ c , R V„ d , R V„ e、 又は R VH f と して示されるア ミ ノ酸配列を有する、 請求項 2 9に記載の再構成ヒ ト抗体。
3 4. 前記 H鎖 V領域が表 6における R VK a , R V„ b， R V„ c もしく は R VK d又は表 7における R Vh a , R V„ b , R V„ c もしく は R VH dとして示されるアミノ酸配列 を有する、 請求項 2 9に記載の再構成ヒ ト抗体。
3 5. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の L鎮 V領域をコードする D NA。
3 6. 前記 L鎮 V領域が配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0のいずれかに示されるァ ミノ酸配列を有する、 請求項 3 5 に記載の D N A。
3 7. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体 の H鎖 V領域をコードする D NA。
3 8. 前記 H鎖 V領域が配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1のいずれかに示されるァミノ酸配列を有する、 請求項 3 7 に記載の D NA。
3 9. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の L鎮 V領域の C D Rをコードする D N A。
4 0. 前記 C D Rが配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0の いずれかに示されるァミノ酸配列を有し、 該ァ ミノ酸配列の 範西が表 9に定義される請求項 3 9に記載の C D Rをコード する D N A。
4 1. ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の H鎮 V領域の C D Rをコードする D N A。
4 2. 前記 C D Rが配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1 の いずれかに示されるァミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の 範囲が表 9において定義される、 請求項 4 1 に記載の C D R をコー ドする D N A。
4 3. ( 1 ) ヒ ト L鎖 V領域の F R、 及び
( 2 ) ヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体 の L鎖 V領域の C D R、
を含んで成る、 ヒ ト I L一 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト L 鎖 V領域をコードする D NA。
4 4. 前記 C D Rが配列番号 2 4 , 2 6 , 2 8及び 3 0の いずれかに示されるアミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の 範囲が表 9に定義される、 請求項 4 3に記載の再構成ヒ ト L 鎖 V領域をコー ドする D NA。
4 5. 前記 F Rが R E I に由来する、 請求項 4 3に記載の 再構成ヒ ト L鎖 V領域をコー ドする D N A。
4 6. 前記 L鎖 V領域が表 2における R V L a又は R V b として示されるア ミノ酸配列を有する、 請求項 4 3に記載 の D N A。
4 7. 前記 L鎖 V領域が表 5 における R Vi_ として示され るア ミノ酸配列を有する、 請求項 4 3に記載の D N A。
4 8. 配列番号 5 7 に示されるヌク レオチ ド配列を有する 請求項 4 3に記載の D N A。
4 9. ( 1 ) ヒ ト H鎖 V領域の F R、 及び
( 2 ) ヒ ト I L— 6 Rに対するマウ スモノ ク ローナル抗体 の H鎖 V領域の C D R、
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト H 鎖 V領域をコードする D N A。
5 0. 前記 C D Rが配列番号 2 5 , 2 7 , 2 9及び 3 1の いずれかに示されるァミノ酸配列を有し、 該ァミノ酸配列の 範囲が表 9に定義される、 請求項 4 9に記載の再構成ヒ ト H 鎮 V領域をコードする D NAft
5 1. 前記 F Rが NEW又は HAXに由来する、 請求項 4 9に記載の再構成ヒ ト H鎮 V領域をコー ドする DNA。
5 2. H鎮 V領域が表 3に R VH a , R VH b , R V„ c , R V„ d , R V„ e、 又は R VH f として示されるアミノ酸 配列を有する、 請求項 4 9に記載の再構成ヒ ト H鎖 V領域を コードする DMA。
5 3. 前記 H鎖 V領域が表 6における R VK a , R V„ b , R V„ cもしく は R VH d又は表 7における R VH a , R V„ b, R V„ cもしく は R VK dとして示されるアミノ酸配列 を有する、 請求項 4 9に記載の D NA。
5 4. 配列番号 5 6に示されるヌク レオチ ド配列を有する、 請求項 4 9に記載の D NA。
5 5. ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域 ；並びに
( 2 ) ヒ ト F R、 及びヒ ト I L一 6 Rに対するマウスモノ クローナル抗体の C D Rを含んで成る L鎮 V領域 ；
を舎んで成るヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト L 鎮をコードする DNA。
5 6. 前記 L鎖 V領域が配列番号 5 7に示されるヌク レオ チ ド配列を有する請求項 5 5に記載の D NA。
5 7. ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域 ； 並びに
( 2 ) ヒ ト F R、 及びヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ
新たな用紙 ク ロ一ナル抗体の C D Rを含んで成る H鎖 V領域 ； を含んで成る ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体の再構成ヒ ト H 鎖をコー ドする D N A。
5 8. 前記 H鎖 V領域が配列番号 5 6に示されるヌク レオ チ ド配列を有する請求項 5 7に記載の D N A。
5 9. 請求項 3 5 , 3 7 , 3 9 , 4 1 , 4 3 , 4 9 , 5 5
I： 及び 5 7のいずれか 1項に記載の D NAを含んで成るベクタ
6 0. 請求項 3 5 , 3 7 , 3 9 , 4 1 , 4 3 , 4 9 , 5 5 及び 5 7のいずれか 1項に記載の DNAを含んで成るベクタ —により形質転換された宿主細胞。
6 1. ( 1 ) ヒ ト L鎖 C領域 ； 及び
( 2 ) ヒ ト I L— 6 Rに対するマウスモノ ク ローナル抗体 の L鎮 V領域 ；
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体のキメ ラ L鎖を コー ドする D N A。
6 2. ( 1 ) ヒ ト H鎖 C領域 ； 及び
( 2 ) ヒ ト I L— 6 Rに対するマウ スモノ ク ローナル抗体 の H鎖 V領域
を含んで成る、 ヒ ト I L— 6 Rに対する抗体のキメ ラ H鎖 をコー ドする D NA。
6 3. ヒ ト I L— 6 Rに対するキメ ラ抗体の製造方法であ つて、
請求項 6 1に記載の D N Aを含んで成る発現ベクター及び 請求項 6 2に記載の D NAを含んで成る発現ベクターにより 同時形質転換された宿主細胞を培養し、 そして
目的とする抗体を回収する、
段階を含んで成る方法。
6 4. ヒ ト I L一 6 Rに対する再構成ヒ ト抗体の製造方法 であって、
請求項 5 5に記載の DN Aを含んで成る発現ベクター及び 請求項 5 7に記載の D N Aを含んで成る発現ベクターにより 同時形質転換された宿主細胞を培養し、 そして
目的とする抗体を回収する、
ことを含んで成る方法。
6 5. 配列番号 8 5 , 8 6又は 9 4に示すヌク レオチ ド配 列を有する、 請求項 4 9に記載の D NA。
6 6. 配列番号 7 1に示すヌク レオチ ド配列を有する、 請 求項 4 3に記載の DNA。
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