CZ296790B6 - Variabilní oblast lehkého a tezkého retezce humanizované protilátky, humanizovaná protilátka a zpusob její prípravy, DNA, vektor, hostitelská bunka, terapeutické cinidlo - Google Patents
Variabilní oblast lehkého a tezkého retezce humanizované protilátky, humanizovaná protilátka a zpusob její prípravy, DNA, vektor, hostitelská bunka, terapeutické cinidlo Download PDFInfo
- Publication number
- CZ296790B6 CZ296790B6 CZ0117399A CZ117399A CZ296790B6 CZ 296790 B6 CZ296790 B6 CZ 296790B6 CZ 0117399 A CZ0117399 A CZ 0117399A CZ 117399 A CZ117399 A CZ 117399A CZ 296790 B6 CZ296790 B6 CZ 296790B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- antibody
- chain
- region
- human
- seq
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 124
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 22
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 82
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims abstract description 61
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 39
- 102100037086 Bone marrow stromal antigen 2 Human genes 0.000 claims description 9
- 108010051118 Bone Marrow Stromal Antigen 2 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 5
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 claims 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 claims 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 90
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 198
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 190
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 142
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 133
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 93
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 83
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 73
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 60
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 58
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 57
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 53
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 53
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 41
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 37
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 36
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 34
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 28
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 24
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 21
- 208000000924 Right ventricular hypertrophy Diseases 0.000 description 20
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 20
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 19
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 16
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 16
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 16
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 16
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 13
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 11
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 11
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 10
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 10
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 9
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 9
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical group C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 8
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 8
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 8
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 8
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 8
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 8
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 7
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 6
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 6
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 6
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 6
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 6
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 101500021084 Locusta migratoria 5 kDa peptide Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 5
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000036541 health Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Chemical group 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 229940124295 CD38 monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 3
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 3
- -1 deoxyribonucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 3
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical group OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100021933 C-C motif chemokine 25 Human genes 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000897486 Homo sapiens C-C motif chemokine 25 Proteins 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 235000010419 agar Nutrition 0.000 description 2
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000010841 mRNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O YMXHPSHLTSZXKH-RVBZMBCESA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- 102100031585 ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102000019260 B-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010012919 B-Cell Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 1
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 1
- 108700004676 Bence Jones Proteins 0.000 description 1
- HNNIWKQLJSNAEQ-UHFFFAOYSA-N Benzydamine hydrochloride Chemical compound Cl.C12=CC=CC=C2C(OCCCN(C)C)=NN1CC1=CC=CC=C1 HNNIWKQLJSNAEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000016918 Complement C3 Human genes 0.000 description 1
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000777636 Homo sapiens ADP-ribosyl cyclase/cyclic ADP-ribose hydrolase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001094831 Homo sapiens Phosphomannomutase 2 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000746372 Mus musculus Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000577979 Peromyscus spicilegus Species 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 102100035362 Phosphomannomutase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 208000021161 Plasma cell disease Diseases 0.000 description 1
- 208000007452 Plasmacytoma Diseases 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010057722 Synaptosomal-Associated Protein 25 Proteins 0.000 description 1
- 102100030552 Synaptosomal-associated protein 25 Human genes 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101100068489 Vicia faba AGPC gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001446 anti-myeloma Effects 0.000 description 1
- 238000011091 antibody purification Methods 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940105990 diglycerin Drugs 0.000 description 1
- GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N diglycerol Chemical compound OCC(O)COCC(O)CO GPLRAVKSCUXZTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000001400 expression cloning Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N n-heptadecyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCO GOQYKNQRPGWPLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001495 poly(sodium acrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011363 radioimmunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M sodium polyacrylate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C=C NNMHYFLPFNGQFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000230 xanthan gum Substances 0.000 description 1
- 229920001285 xanthan gum Polymers 0.000 description 1
- 235000010493 xanthan gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940082509 xanthan gum Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/3061—Blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hematology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Variabilní oblast lehkého retezce humanizované protilátky, která se váze k polypeptidu ze SEQ ID NO: 129 (antigen HM1.24), kde variabilní oblast lehkého retezce má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO : 106. Variabilní oblast tezkého retezce humanizované protilátky, která se váze k polypeptidu ze SEQ ID NO : 129 (HM1.24 antigen), kde variabilní oblast tezkého retezce má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO : 125 nebo 128. DNA kódující tyto oblasti a vektor tuto DNA obsahující a hostitelské bunky. Zpusob prípravy humanizované protilátky a terapeutické cinidlo pro lécení myelomu ji obsahující.
Description
Variabilní oblast lehkého a těžkého řetězce humanizované protilátky, humanizovaná protilátka a způsob její přípravy, DNA, vektor, hostitelská buňka, terapeutické činidlo
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká humanizovaných protilátek nebo jejich fragmentů, genů, které je kódují, způsobů přípravy těchto protilátek a využití zmíněných protilátek. Pozměněné humanizované protilátky anti-HM 1.24, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou užitečné jako léčebná činidla, např. pro léčbu myelomu.
Dosavadní stav techniky
Lidské B buňky procházejí řadou procesů, jež jsou klasifikovány na základě druhu exprimovaných povrchových antigenů a nakonec dozrávají v plazmatické buňky, které produkují protilátky. V konečném stupni jejich diferenciace, B buňky získávají na jedné straně schopnost produkovat cytoplazmatické imunoglobuliny a na straně druhé mizí s B buňkami asociované antigeny, jako jsou povrchové buněčné imunoglobuliny, HLA-DR CD20, Fc receptory, receptory C3 komplementu a podobné (Ling, N. R. a kol., Leucocyte Typing III (1986) str. 320, Oxford, UK, Oxford).
Dosud byly publikovány práce o monoklonálních protilátkách, jako jsou anti-PCA-1 (Anderson, K. C., a kol., J. Immunol. (1983) 130, 1132), anti-PC-1 (Anderson, K. C., a kol., J. Immunol. (1983) 132, 3172), anti-MM4 (Tong, A. M. W. a kol., Blood (1987) 69, 238) a podobných, které rozeznávají antigeny na buněčné membráně plazmatických buněk. Avšak anti-CD38 monoklonální protilátky jsou stále používány pro detekci plazmatických a myelomových buněk (Epstein, J. a kol., N. Engl. J. Med. (1990) 322, 664, Terstappen, L. W. Μ. M. a kol., Blood (1990) 76, 1739, Leo, R. a kol., Ann. Hematol. (1992) 64, 132, Shimazaki, C. a kol., Am. J. Hematol. (1992) 39, 159, Hata, H. a kol., Blood (1993) 81, 3357, Harada, H. a kol., Blood (1993) 81, 2658, Billadeau, D. a kol., J. Exp. Med. (1993) 178, 1023).
Anti-CD38 monoklonální protilátka je antigen spojený spíše s aktivací T buněk, než antigen spojený s diferenciací B buněk a je exprimován spolu s B buňkami i na různých buňkách jiných. Navíc, ačkoli CD38 není exprimován na některých lymfoplazmacytoidních buňkách, je silně exprimován na prekurzorech buněk krvetvorby. Z těchto důvodů se má za to, že anti-CD38 monoklonální protilátka není vhodná pro výzkum diferenciace a zrání lidských B buněk, nebo pro léčení nemocí plazmatických buněk.
Goto, T. a kol., popsali myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku, která rozeznává antigen o molekulové váze 29 až 33 kDa, který je exprimován specificky na liniích B buněk (Blood (1994) 84, 1922-1930). Protože se má za to, že antigen rozeznávaný anti-HM 1.24 monoklonální protilátkou souvisí s konečnou diferenciací B buněk (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Immun. (1992) 16, 688-691) a že podání anti-HM 1.24 monoklonální protilátky myši s transplantovaným plazmocytomem má za následek specifické hromadění protilátek na nádoru, (Shuji Ozaki a kol., The Program of Generál Assembly of the 19th Japan Myeloma Study Meeting, generál presentation 3), bylo předpokládáno, že anti-HM 1,24 monoklonální protilátka značená radioizotopem, může být použita pro určení umístění nádoru, pro místně cílenou terapii, jako je radioimunoterapie a podobně.
Dále zde výše zmíněný časopis Blood popisuje, že anti-HM 1.24 monoklonální protilátka vykazuje cytotoxickou aktivitu k buňkám myelomové buněčné linie RPMI8226, závislou na komplementu.
Myelom je neoplastická nemoc, charakterizovaná hromaděním monoklonálních plazmatických buněk (myelomové buňky) v kostním morku. Myelom je nemoc, v níž koncově diferencované
-1 CZ 296790 B6
B buňky, produkující a sekretující imunoglobuliny, nebo plazmatické buňky, mají monoklonálně zvýšený počet hlavně v kostním morku a v souhlase s tím jsou v séru detekovány monoklonální imunoglobuliny, nebo jejich složky, L řetězce a H řetězce (Masaaki Kosaka a kol., Nippon
Rinsho (1995) 53, 91-99).
Pro léčbu myelomu byly používány běžné chemoterapeutické prostředky, ale nebyly nalezeny efektivní léčebné prostředky, které by vedly k vymizení myelomu a prodloužení doby přežívání pacientů s myelomem. Proto je dlouho pociťována potřeba zavedení léků, které by měly léčebný účinek na myelom.
Myší monoklonální protilátky mají u lidí vysokou imunogenicitu (někdy označováno jako „antigenicita)“. Tím je pro člověka lékařská léčebná hodnota myších monoklonálních protilátek omezena. Např. myší protilátky podané člověku mohou být metabolizovány jako cizorodá látka tak, že jejich poločas v člověku je relativně krátký a tudíž nemohou plně prokázat své očekávané účinky. Navíc proti podaným myším protilátkám vytvářené lidské anti-myší protilátky mohou spustit imunologické odezvy, které jsou pro pacienty nežádoucí a nebezpečné, jako je sérová nemoc, jiné alergické reakce a podobně. Proto nemohou být myší monoklonální protilátky podávány lidem často.
Aby se rozřešily tyto problémy, byla vyvinuta metoda pro snížení imunogenicity protilátek jiného, než lidského původu, jako jsou např. monoklonální protilátky odvozené od myší. Příkladem takové metody je způsob, jak vytvořit chimémí protilátku, jejíž variabilní oblast (V oblast) je odvozena z původní myší protilátky a konstantní oblast (C oblast) je odvozena ze vhodné lidské protilátky.
Protože takto získané chimémí protilátky obsahují variabilní oblast původní myší protilátky v neporušené podobě, dá se očekávat, že se budou vázat k antigenu se specifícitou, která se shoduje se specifícitou původní myší protilátky. Navíc v chimémí protilátce je podíl aminokyselinových sekvencí, odvozených z „nikoli lidského“ zdroje podstatně redukován a tak se dá očekávat, že protilátka bude mít ve srovnání s původní myší protilátkou nízkou imunogenicitu. Chimémí protilátka se může vázat k antigenu stejným způsobem jako původní myší monoklonální protilátka a může také vyvolat imunologické odpovědi proti myší variabilní oblasti, třebaže je imunogenicita snížena (LoBuglio, A. F. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86, 4220-4224, 1989).
Druhý způsob snížení imunogenicity myších protilátek, třebaže je komplikovanější, může snížit potenciální imunogenicitu myších protilátek ještě daleko výrazněji. Při tomto způsobu je přenesena do variabilní oblasti lidské protilátky pouze oblast určující komplementaritu (CDR complementarity determining region) z myší protilátky a vznikne tak pozměněná („reshaped“) variabilní oblast lidské protilátky.
Avšak, aby vzniklá struktura oblasti určující komplementaritu pozměněné variabilní oblasti lidské protilátky byla co možná nejpodobnější variabilní oblasti původní myší protilátky, když je to nezbytné, může být z variabilní oblasti myší protilátky do variabilní oblasti lidské protilátky přenesena i část aminokyselinové sekvence podpůrné oblasti (FR - framework region), která podporuje CDR. Následkem toho je tato V oblast zušlechtěné pozměněné lidské protilátky vázána ke konstantní oblasti lidské protilátky. Část, která je odvozena z „nikoli lidské“ aminokyselinové sekvence v konečné formě pozměněné zušlechtěné lidské protilátky, je CDR a pouze část FR. CDR se skládá z hypervariabilních aminokyselinových sekvencí, které neobsahují druhově specifické sekvence. Proto zušlechtěná protilátka, nesoucí myší CDR by neměla mít silnější imunogenicitu, než přirozená lidská protilátka obsahující CDR lidské protilátky.
Pro informace, týkající se zušlechtěných protilátek viz Riechmann, L. a kol., Nátuře, 332, 323-327, 1988; Verhoeye, M. a kol., Science, 239, 1534-1536, 1988; Kettleborough, C. A. a kol., Protein Engng., 4, 773-783, 1991; Maeda, H. a kol., Human Antibodies and Hybridoma, 2, 124-134, 1991; Groman, S. D. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 4181-4185,
-2CZ 296790 B6
1991; Tempest, P. R. a kol., Bio/Technology, 9, 266-271, 1991; Co, M. S. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2869-2873, 1991; Carter, P. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 42854289, 1992; Co, M. S. a kol., J. Immunol., 148, 1149-1154, 1992 a Seto, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856, 1993.
Queena kol., (Mezinárodní přihláška WO 90/07861) popisuje způsob přípravy zušlechtěných protilátek proti IL-2 receptoru Anti-Tac. Nicméně je obtížné zcela zušlechtit všechny protilátky postupem uveřejněným v WO 90/07861. WO 90/07861 nepopisuje obecný způsob zušlechťování protilátek, ale pouze popisuje způsob zušlechťování protilátek Anti-Tac, které jsou jedny z protilátek proti receptoru IL-2. Navíc, i když je postup uveřejněný v WO 90/07861 přesně reprodukován, je obtížné vytvořit zušlechtěné protilátky, které mají aktivitu zcela totožnou s původními myšími protilátkami.
Obecně se aminokyselinové sekvence CDR/FR jednotlivých protilátek od sebe liší. Současně i určení aminokyselinového zbytku, který má být zaměněn při konstrukci zušlechtěných protilátek a výběr aminokyselinového zbytku, kterým má být výše uvedený zbytek zaměněn, se u jednotlivých protilátek liší. Proto postup zušlechťování protilátek uveřejněný v WO 90/07861 nelze uplatnit pro zušlechťování všech protilátek.
V práci Queen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, (1999) 86, 10029-10033 je uveřejněno podobné zjištění, pokud se týká WO 90/07861. Je zde popsáno, že zušlechtěné protilátky, získané postupem, popsaným v WO 90/07861, měly pouze třetinovou aktivitu původních myších protilátek. Jinými slovy to ukazuje, že postupem uveřejněným v WO 90/07861 nelze připravit zušlechtěnou protilátku, s aktivitou shodnou s původní myší protilátkou.
Práce Co a kol., Cancer Research (1996) 56, 1118-11125 byla publikována výše zmíněnou skupinou Queen a kol. Tato práce popisuje, že zušlechtěné protilátky, s aktivitou rovnající se původním myším protilátkám, nelze konstruovat ani způsobem určeným pro tvorbu zušlechtěných protilátek, uveřejněným v WO 90/07861. Tedy se nejen ukazuje, že samotným způsobem podle WO 90/07861 nelze připravit zušlechtěnou protilátku s aktivitou totožnou s původní myší protilátkou, ale i že tento způsob konstrukce zušlechtěných protilátek uveřejněný v WO 90/07861, nelze aplikovat při zušlechťování všech protilátek.
Ohtomo a kol., Molecular Immunology (1955) 32, 407-416 popisuje zušlechťování myších protilátek ONS-M21. V této práci je ukázáno, že aminokyselinový zbytek, který byl navrhován pro zušlechtění protilátek Anti-Tac v WO 90/07861 nemá vztah k aktivitě, a způsob uveřejněný v WO 90/07861 nelze použít.
Kettlenborough a kol., Protein Eng. (1991) 4, 773-783 popisuje, že několik zušlechtěných protilátek bylo konstruováno z myší protilátky záměnou aminokyselinových zbytků. Nicméně bylo zapotřebí záměny více aminokyselinových zbytků, než bylo navrženo ve způsobu zušlechťování Anti-Tac protilátek, popsaném v WO 90/07861.
Tyto uvedené práce naznačují, že způsob tvorby zušlechtěných protilátek uveřejněný v WO 90/07861 je technika použitelná pouze pro Anti-Tac protilátku tam popsanou, a že dokonce použití zmíněné technologie nevede k aktivitě, která by se rovnala aktivitě původní myší protilátky.
Původní myší protilátky, popsané v těchto pracech, mají aminokyselinové sekvence odlišné od sekvence Anti-Tac protilátky, popsané v WO 90/07861. Současně i způsob konstrukce zušlechtěných protilátek, který bylo možno použít pro Anti-Tac protilátku, nelze použít pro protilátky jiné. Podobně, protože myší protilátka anti-HM 1.24, která je předmětem tohoto vynálezu, má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od sekvence Anti-Tac protilátky, způsob konstrukce zušlechtěné protilátky, použitý pro Anti-Tac protilátku, nelze použít. Navíc, úspěšně konstruovaná zušlechtěná protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, má aminokyselinovou sekvenci odlišnou od
-3CZ 296790 B6 sekvence zušlechtěné Anti-Tac protilátky, popsané v WO 90/07861. Tato skutečnost také ukazuje, že stejný způsob nelze použít pro zušlechťování protilátek, které mají odlišné CDR-FR sekvence.
Tedy, ačkoli je původní myší protilátka pro zušlechťování známa, shoda CDR-FR sekvence zušlechtěné protilátky mající aktivitu, je potvrzena pouze metodou pokusu a omylu. Ve WO 90/07861 není zmínka o FR sekvenci, která je připojena k zušlechtěné protilátce, konstruované podle předkládaného vynálezu, ani o tom, že aktivní zušlechtěná protilátka může být připravena připojením FR sekvence, která je mnohem menší než sekvence CDR.
Jak je zde výše zmíněno, očekává se, že zušlechtění protilátky budou užitečné pro léčebné účely, ale zušlechtěná anti-HM 1.24 protilátka není známa, ani dokonce předpokládána. Navíc není dostupný standardizovaný způsob, který by byl obecně použitelný u kterékoli protilátky pro přípravu zušlechtěné protilátky, a mnoho vynalézavosti je potřeba při konstrukci zušlechtěné 15 protilátky, která by vykazovala dostatečnou vazebnou aktivitu, vazebně inhibični aktivitu a neutralizační aktivitu (např. Sáto, K. a kol., Cancer Res., 53, 851-856,1993).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález popisuje pozměněné anti-HM 1.24 protilátky. Předkládaný vynález dále popisuje fragmenty pozměněných protilátek. Dále předkládaný vynález popisuje expresní systém pro přípravu pozměněných protilátek a jejich fragmentů. Předkládaný vynález dále popisuje způsoby přípravy pozměněných anti-HM 1.24 protilátek a jejich fragmentů.
Přesněji řečeno, předkládaný vynález popisuje pozměněné protilátky, které specificky rozpoznají polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 103. cDNA, kódující zmíněný polypeptid, byla vložena mezi štěpná místa pro Xbal ve vektoru pUC19, čímž byl připraven plazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, obsahující tento plazmid pRS39-pUC19 30 byla uložena pro mezinárodní použití 5. října 1993 vNational Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, ΜΓΠ (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) pod přístupovým číslem FERM BP-4434 podle ustanovení Budapešťské smlouvy (viz Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).
Jako konkrétní provedení takových pozměněných protilátek je zmíněna pozměněná lidská protilátka anti-HM 1.24. Podrobný popis pozměněné lidské protilátky anti-HM 1.24 bude podán dále.
Zde předkládaný vynález dále popisuje V oblast pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, která obsahuje:
(1) podpůrnou oblast (FR) z V oblasti lidského L řetězce, a (2) CDR z V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a
V oblast pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:
(1) FR z V oblasti lidského H řetězce, a (2) CDR z V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
-4CZ 296790 B6
Zde předkládaný vynález dále popisuje pozměněný lidský L řetězec anti-HM 1.24 protilátky, který obsahuje:
(1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR lidského zL řetězce a CDR zL řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:
(1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast H řetězce, obsahující FR z lidského H řetězce a CDR zH řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
Zde předkládaný vynález dále popisuje pozměněnou lidskou protilátku anti-HM 1.24, která obsahuje:
(A) L řetězec obsahující (1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast L řetězce, obsahující FR z lidského L řetězce a CDR z L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a (Β) H řetězec obsahující (1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast H řetězce, obsahujícího FR z lidského H řetězce a CDR z H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující V oblast L řetězce anti-HM 1.24 protilátky a DNA, kódující V oblast H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující V oblast pozměněného lidského L řetězce anti-HM 1.24, obsahující:
(1) FR z V oblasti lidského L řetězce, a (2) CDR z V oblasti L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a
DNA kódující V oblast pozměněného lidského H řetězce anti-HM 1.24 protilátky obsahující:
(1) FR z V oblasti lidského H řetězce, a (2) CDR z V oblasti H řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a
Předkládaný vynález dále popisuje DNA kódující pozměněný lidský L řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:
(1) C oblast z lidského L řetězce, a (2) V oblast z L řetězce, obsahující FR z lidského L řetězce a CDR z L řetězce anti-HM 1.24 protilátky, a
-5CZ 296790 B6
DNA kódující pozměněný lidský H řetězec anti-HM 1.24 protilátky, obsahující:
(1) C oblast z lidského H řetězce, a (2) V oblast z H řetězce, obsahující FR z lidského H řetězce a CDR z H řetězce anti-HM 1.24 protilátky.
Předkládaný vynález dále popisuje vektor, obsahující kteroukoli z různých DNA, uvedených výše.
Předkládaný vynález dále popisuje hostitelské buňky, transformované výše uvedeným vektorem.
Předkládaný vynález dále popisuje způsoby přípravy pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, které sestávají z pěstování hostitelských buněk, které byly kotransfekovány expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující uvedený pozměněný lidský L řetězec a expresním vektorem, obsahujícím DNA, kódující uvedený pozměněný lidský H řetězec a získání požadované protilátky.
Předkládaný vynález dále popisuje farmaceutické prostředky, zvláště léčebné přípravky pro myelom, obsahující uvedenou pozměněnou lidskou protilátku.
Předkládaný vynález dále popisuje farmaceutické prostředky, které obsahují jako aktivní složku chimémí protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci publikovanou v SEQ ID NO: 103 a farmaceutické prostředky, obsahující jako aktivní složku pozměněnou lidskou protilátku, která specificky rozpoznává polypeptid s aminokyselinovou sekvencí publikovanou v SEQ ID NO: 103. Jako farmaceutický prostředek je zde publikováno léčebné činidlo pro myelom.
Způsob provedení vynálezu
1) Konstrukce chimémí protilátky (1) Klonování DNA, kódující V oblast myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky
Příprava mRNA
Pro klonování DNA, kódující V oblast myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky byla ze získaného hybridomu za pomoci běžné metody, jako je ultracentrifugační metoda, používající guanidin (Chirgwin, J. M. a kol., Biochemistry (1979), 18, 5294-5299), nebo metody AGPC (Chomczinski, P. a kol., (1987), 162, 156-159) připravena celková RNA a zní je připravena mRNA pomocí sloupců s Oligo(dT)-celulózou, které jsou součástí soupravy pro izolaci mRNA (vyráběno firmou Pharmacia). Navíc pomocí soupravy QuickPrep mRNA Purification Kit (vyráběno firmou Pharmacia) lze mRNA připravit bez extrakčního stupně celkové RNA.
Příprava a amplifikace cDNA
Z mRNA, získané ve výše uvedeném odstavci. „Příprava mRNA“, byla pomocí reverzní transkriptázy syntetizována DNA jak V oblasti L řetězce, tak H řetězce. cDNA V oblasti L řetězce je syntetizována pomocí soupravy AMV Reverse Transcriptase First-Strand cDNA Synthesis Kit. Pro amplifikaci syntetizované cDNA byl použit vhodný primer, který hybridizuje s leader sekvencí a C oblastí protilátkového genu (např. MKV primer, mající sekvenci bází uvedenou v SEQ ID NO: 29 až 39 a MKC primer, mající sekvenci bází uvedenou v SEQ ID NO: 40).
-6CZ 296790 B6
Syntéza a amplifikace cDNA V oblasti H řetězce může být provedena pomocí PCR (polymerázové řetězové reakce) metodou 5-RACE (Frohman, M. A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988, Belyavsky, A. a kol., Nucl. Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) pomocí soupravy 5'-Ampli FINDER RACE kit (CLONTECH). K 5' konci cDNA syntetizované jak uvedeno výše, byl ligo ván Ampli FINDER Anchor, a jako primer pro amplifíkaci V oblasti H řetězce může být použit primer, který specificky hybridizuje s Anchor primerem (SEQ ID NO: 77) a s konstantní oblastí (oblast Cy) myšího H řetězce (např. primer MHC2a, mající bázovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42).
Purifikace DNA a určení její sekvence bází
Byla provedena agarová gelová elektroforéza PCR produktu a známým postupem byl vyříznut požadovaný DNA fragment a DNA z něho byla vyizolována a vyčištěna a poté ligována do vektorové DNA.
DNA lze čistit pomocí dodávané soupravy (např. GENECLEAN II; BIO101). Kligování DNA fragmentů lze použít některou známou vektorovou DNA (např. pUC19, Bluescript apod.).
Výše uvedená DNA a výše uvedená vektorová DNA mohou být ligovány běžnou ligační soupravou (vyráběna Takara Shuzo), čímž je získán rekombinantní vektor. Získaný rekombinantní vektor je potom vnesen do Escherichia coli JMI09, poté jsou vybrány kolonie rezistentní k ampicilinu a vektorová DNA je připravena na základě známého postupu (J. Sambrook, a kol., „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Po štěpení výše uvedené vektorové DNA restrikčními enzymy je známou metodou určena sekvence bází požadované DNA (např. dideoxynukleotidovou metodou) (J. Sambrook, a kol., „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Při realizaci předkládaného vynálezu lze použít automatický sekvenační systém (DNA Sequencer 373A vyráběný ABI Co. Ltd.)
Oblast určující komplementaritu
V oblast z H řetězce a V oblast z L řetězce tvoří vazebné místo pro antigen, a jejich společné struktury mají podobné vlastnosti. Tak byla každá ze čtyř podpůrných oblastí (FR) ligována se třemi hypervariabilními oblastmi, tj. oblastmi určujícími komplementaritu (CDR). Aminokyselinové sekvence FR byly relativně dobře zachovány, zatímco mezi aminokyselinovými sekvencemi oblastí CDR je extrémně vysoká variabilita (Kabat, E. A. a kol., „Sequence ofProteins of Immunological Interesť, US Dept. Health and Human Services, 1983).
Mnohé části výše uvedených čtyř oblastí FR zaujímá strukturu β-listu (β-sheet) a následkem toho tři CDR vytvářejí smyčky. CDR mohou někdy tvořit část β-listu. Tři CDR se v prostoru nacházejí ve vzájemné těsné blízkosti a tvoří vazebné místo pro antigen se třemi CDR v párovací oblasti.
Na základě těchto skutečností, aminokyselinová sekvence variabilní oblasti myší anti-HM 1.24 protilátky se porovnává s databází aminokyselinových sekvencí protilátek, připravenou Kabat, E. A. a kol., „Sequence of Proteins of Immunological Interest“, US Dept. Health and Human Services, 1983, aby se zjistila homologie a tím našly oblasti CDR.
(2) Konstrukce expresního vektoru pro chimémí protilátku
Jakmile je DNA fragment, kódující V oblastí myšího L řetězce a H řetězce myší monoklonální protilátky klonován, chimémí anti-HM 1.24 protilátku je možno získat připojením těchto myších
V oblastí k DNA kódující konstantní oblast lidské protilátky a poté ji exprimovat.
-7CZ 296790 B6
Základní metoda pro konstrukci chimémí protilátky zahrnuje vazbu myší leader sekvence a sekvence V oblasti, která je přítomna v klonované cDNA, k sekvenci kódující C oblast lidské protilátky, již přítomné v expresním vektoru pro savčí buňky. Případně tato metoda zahrnuje vazbu myší leader sekvence a sekvence V oblasti, která je přítomna v klonované cDNA, k sekvenci kódující C oblast lidské protilátky a poté ligovat do expresního vektoru pro savčí buňky.
C oblastí lidské protilátky může být C oblast kteréhokoli H řetězce a C oblast kteréhokoli L řetězce. Jako příklad mohou být uvedeny Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4 lidského H řetězce, nebo CX nebo Ck L řetězce.
Pro produkci chimérní protilátky jsou konstruovány dva typy expresních vektorů: jsou to expresní vektor obsahující DNA V oblasti myšího L řetězce a C oblast lidského L řetězce pod kontrolou expresně regulační oblasti, jako je systém enhancer/promotor a dále expresní vektor obsahující DNA V oblasti myšího H řetězce a C oblast lidského H řetězce pod kontrolou expresně regulační 15 oblasti, jako je systém enhancer/promotor. Potom jsou za použití těchto expresních vektorů kotransfekovány hostitelské buňky, jako např. savčí buňky, a transformované buňky jsou pěstovány in vitro nebo in vivo a produkují chimérické protilátky (např. WO 91-16928).
Případně DNA kódující myší leader sekvenci a V oblast z L řetězce a C oblast z lidského 20 L řetězce a DNA kódující myší leader sekvenci a V oblast z H řetězce a C oblast z lidského
H řetězce, přítomné v klonované DNA, jsou vneseny do jednoho expresního vektoru (viz mezinárodní přihláška WO 94-11523) a hostitelská buňka je transformována za použití takovéhoto vektoru. Transformovaný hostitel je pak pěstován in vitro nebo in vivo a produkuje požadované chimémí protilátky.
(1) Konstrukce chimérního H řetězce
Expresní vektor pro H řetězec chimémí protilátky může být získán vnesením cDNA kódující V oblast myšího H řetězce do vhodného expresního vektoru, obsahujícího genomickou DNA 30 nebo cDNA, kódující C oblast H řetězce lidské protilátky. Jako příklady C oblasti H řetězce je možno uvést např. Cyl, Cy2, Cy3 nebo Cy4.
Konstrukce expresního vektoru pro chimémí H řetězec obsahující Cyl genomickou DNA
Jako expresní vektor, obsahující genomickou DNA pro Cyl jakožto C oblast H řetězce, může být použit např. HFE-PMh-gyl (mezinárodní přihláška WO 92/19759) nebo DHFR-AE-RVh-PMlf (mezinárodní přihláška WO 92/19759).
Aby bylo možno vložit cDNA kódující V oblast myšího H řetězce do těchto expresních vektorů, 40 mohou tam být metodou PCR zavedeny vhodné bázové sekvence. Tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primerů navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci bezprostředně před startovním kodonem, a PCR primerů navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a donorové místo sestřihu, kde je 45 primární transkript genomické DNA vhodně sestřižen za vzniku mRNA.
Na takto konstruovanou DNA, kódující V oblast myšího H řetězce je působeno vhodnými restrikčními enzymy, pak je vnesena do výše uvedeného expresního vektoru, a tak může být zkonstruován vektor, obsahující Cyl DNA a exprimující chimérní H řetězec.
Konstrukce expresního vektoru pro cDNA chimérního H řetězce
Expresní vektor, obsahující cDNA z Cyl jako C oblast z H řetězce, může být konstruován následovně. Může být konstruován připravením mRNA z buněk CHO, v nichž byl integrován expresní
-8CZ 296790 B6 vektor DHFR-AE-RVh-PMlf (WO 92/19759), kódující genomickou DNA V oblasti H řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast Cyl H řetězce lidské protilátky (N. Takahashi, a kol., Cell
29, 671-679, 1982) a expresní vektor RVl-PMla (WO 92/19759), kódující genomickou DNA
V oblasti L řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast κ řetězce lidského L řetězce protilátky; dále klonováním cDNA, obsahující V oblast z H řetězce zušlechtěné PM1 protilátky a C oblast Cyl z H řetězce lidské protilátky pomocí RT-PCR metody a ligováním do vhodného expresního vektoru pro živočišné buňky, za použití míst pro vhodné restrikční enzymy.
Aby bylo možno přímo ligovat cDNA, kódující V oblast myšího H řetězce k cDNA, obsahující C oblast Cyl z H řetězce lidské protilátky, mohou být pomocí PCR metody zavedeny vhodné bázové sekvence. Např. tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci bezprostředně před startovním kodonem, a PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym, použitý pro přímou ligaci C oblasti Cyl z H řetězce.
Expresní vektor, obsahující cDNA chimérního H řetězce, může být konstruován tak, že na takto konstruovanou DNA, kódující V oblast myšího H řetězce je působeno vhodným restrikčním enzymem, poté je ligo vána k výše zmíněné cDNA, obsahující C oblasti Cyl H řetězce a nakonec vložena do expresního vektoru, jako je pCOSl nebo pCHOl.
(2) Konstrukce L řetězce chimémí protilátky
Expresní vektor pro L řetězec chimérické protilátky může být získán spojením cDNA kódující
V oblast myšího L řetězce s genomickou DNA nebo cDNA, kódující C oblast L řetězce lidské protilátky, a poté vnesením do vhodného expresního vektoru. Jako příklad C oblasti L řetězce je možno uvést κ řetězec nebo λ řetězec.
Konstrukce expresního vektoru pro κ řetězec cDNA chimérního L řetězce.
Aby bylo možno konstruovat expresní vektor, obsahující cDNA kódující V oblast myšího L řetězce, mohou být pomocí PCR metody zavedeny vhodné bázové sekvence. Např. tyto vhodné bázové sekvence mohou být zavedeny metodou PCR za použití PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 5' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym a Kozákovu konvenční sekvenci a PCR primeru navrženého tak, aby obsahoval na 3' konci rozpoznávací sekvenci pro vhodný restrikční enzym.
Kappa řetězec (κ) C oblasti lidského L řetězce pro vazbu k V oblasti myšího L řetězce, může být vytvořen např. zHEF-PMlk-gk (Intemational Application Publication No. WO 92/19759), obsahujícího genomickou DNA. Expresní vektor pro κ řetězec L řetězce cDNA chimérické protilátky může být konstruován vnesením rozpoznávacích sekvencí pro vhodné restrikční enzymy pomocí metody PCR na 5' konec nebo 3' konec DNA, kódující κ řetězec C oblasti L řetězce, ligováním takto konstruované V oblasti myšího L řetězce ke κ řetězci C oblasti L řetězce a posléze vložením do expresního vektoru, jako je pCOSl nebo pCHOl.
2) Konstrukce pozměněné lidské protilátky (1) Navržení V oblasti pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Aby bylo možno konstruovat pozměněnou lidskou protilátku, v níž by CDR z myší monoklonální protilátky byla připojena k lidské protilátce, je žádoucí, aby existovala vysoká homologie mezi FR myší monoklonální protilátky a FR lidské protilátky. V oblasti z L řetězce a H řetězce myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátky byly tedy za pomoci Protein Data Bank porovnány s V oblastmi všech známých protilátek, jejichž struktury byly objasněny.
-9CZ 296790 B6
V oblast z L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci podskupiny IV V oblasti z L řetězce lidské protilátky (HSGIV), přičemž homologie je 66,4 %. Na druhé straně vykazuje 56,9% homologii sHSGI, 55,8% sHSGII a 61,5% homologii s HSGIII.
Pokud je V oblast z L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky, porovnána s V oblastmi z L řetězce známých lidských protilátek, vykazuje 67,0% homologii s V oblastí z L řetězce lidské protilátky REI, jedné z I podskupiny V oblastí L řetězce lidské protilátky. Proto byla FR z REI použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Byla navržena verze V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti—HM 1.24 protilátky. V této verzi byla FR lidské protilátky vytvořena totožně s FR oblastí odvozenou z REI, která je již přítomna v pozměněné lidské CAMPATH-1H protilátce (viz Reichmann, L. a kol., Nátuře 322, 21-25, (1988), s FR oblastí, obsaženou ve verzi V oblasti L řetězce pozměněné lidské PM-1 protilátce popsané v Intemational Application Publication No. WO 92-19759, a myší CDR byla vytvořena shodně s CDR z V oblasti L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.
Oblast V z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci
V oblasti z H řetězce lidské protilátky (HSGI) s homologii 54,7 %. Na druhé straně vykazuje 34,6% homologii sHSGII a 48,1% homologii sHSGIII. Když je V oblast zH řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblastí z H řetězce známých lidských protilátek, FR1 až FR3 byly nejvíce podobné V oblasti H řetězce lidské protilátky HG3, jedné z I podskupiny
V oblasti lidského H řetězce (Rechavi, G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), kdy homologie je 67,3 %.
Proto byla FR lidské protilátky HG3 použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Avšak, protože aminokyselinová sekvence FR4 lidské protilátky HG3 nebyla popsána, aminokyselinová sekvence FR4 z lidské protilátky JH6 (Ravetch, J. V. a kol., Cell, 27, 583-591), která vykazuje nejvyšší homologii sFR4 myší anti-HM 1.24 protilátky, byla použita jako FR4. FR4 z JH6 má kromě jedné aminokyseliny sekvenci shodnou s FR4 z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.
V první verzi a V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly FR1 až FR3 vytvořeny shodně s FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3, kromě toho, že aminokyseliny v pozici 30 v lidské FR1 a v pozici 71 v lidské FR3 byly shodné s aminokyselinami myší anti-HM 1.24 protilátky a CDR byla vytvořena shodně s CDR V oblasti H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.
(2) Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Řetězec L pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky je konstruován připojením CDR oblasti pomocí PCR metody. Postup je schematicky znázorněn na Obr. 4. Při konstrukci pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (verze a), která má FR odvozenou z lidské protilátky REI, bylo použito osm PCR primerů. Vnější primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly sDNA sekvencí HEF expresního vektoru HAF-VL-gK.
Primery LIS (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3S (SEQ ID NO: 51) mají negativní DNA sekvenci. Primery L1A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) a L3A (SEQ ID NO: 54) mají pozitivní DNA sekvenci, přičemž každý mají komplementární DNA sekvence (20 až 23 bázových párů) s DNA na 5'-konci primerů LIS, L2S a L3S.
-10CZ 296790 B6
V prvním stupni PCR byly provedeny 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3S-H a každý PCR produkt byl vyčištěn. Čtyřem PCR produktům z prvních PCR bylo umožněno vzájemné sestavení na základě jejich vlastní komplementarity (viz WO 92-19759). Poté byly přidány vnější primery A a H a byla amplifikována celková délka DNA kódující V oblast L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (druhá PCR). Ve výše uvedené PCR může být jako matrice použit plazmid HEF-RVL~M21a (viz. Intemational Application Publication No. WO 95-14041), kódující verzi a V oblasti zL řetězce pozměněné lidské ONS-M21 protilátky, založené na FR odvozené z lidské protilátky REI.
V prvním stupni PCR byla použita matricová DNA a každý z primerů.
PCR produkty A-L1A (215 bázových párů), L1S-L2A (98 bázových párů), L2S-L3A (140 bázových párů) a L3S-H (98 bázových párů) byly čištěny za použití 1,5% gelu znízkotající agarózy a byly sestaveny v průběhu 2. PCR. Ve druhé PCR byly použity všechny produkty první reakce a oba vnější primery (A a H).
Fragment dlouhý 515 bázových párů, který je výsledkem druhé PCR byl čištěn za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy, štěpen BamHI a HindlII, a takto získané DNA fragmenty byly klonovány do expresního vektoru HEF-VL-gK. Po určení DNA sekvence byl plazmid, obsahující správnou aminokyselinovou sekvenci V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, označen jako HEF-RVLa-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází
V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9.
Verze b V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky může být vytvořena mutagenezí pomocí PCR. Mutační primery FTY-l (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) jsou navrženy tak, aby mutovaly fenylalanin v pozici 71 na tyrozín.
Po amplifikaci výše uvedených primerů za použití plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jako matrice, byl získaný produkt vyčištěn. Po štěpení BamHI a HindlII byly získané DNA fragmenty klonovány do expresního vektoru HEF-VL-gK a získán tak plazmid HEF-RVLb-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEFRVLb-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.
(3) Konstrukce V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
3-1. Konstrukce verzí a až e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky může být navržena následujícím způsobem. Připojením DNA sekvence kódující FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3 a FR4 z lidské protilátky JH6 kDNA sekvenci kódující CDR z V oblasti H řetězce myší antiHM 1.24 protilátky, může být získána plná délka DNA, kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Poté je na 5' konec připojeno cílové místo pro HindlII spolu s Kozákovou konvenční sekvencí, na 3' konec je připojeno cílové místo pro BamHI spolu s donorovou sekvencí pro sestřih tak, aby bylo umožněno připojení do HEF expresního vektoru.
Takto uspořádaná DNA sekvence byla rozdělena do čtyř oligonukleotidů. Poté byly oligonukleotidy, které by potenciálně mohly bránit sestavení těchto oligonukleotidů, podrobeny počítačové analýze sekundárních struktur.
Sekvence čtyř oligonukleotidů RVH1 až RVH4 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO: 60. Tyto oligonukleotidy mají délku 119 až 144 bází a obsahují 25 až 26 bázových párů dlouhé
-11 CZ 296790 B6 překrývající se oblasti. Z těchto oligonukleotidů mají RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RVH4 (SEQ ID
NO: 60) negativní DNA sekvenci, zatímco RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) mají pozitivní DNA sekvenci. Postup pro sestavení těchto čtyř oligonukleotidů pomocí metody
PCR je ukázán na obrázku (viz Obr. 5).
PCR byla provedena za použití čtyř oligonukleotidů a RHP1 (SEQ ID NO: 61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) jako vnějších primerů.
Amplifíkovaný, 438 bázových párů dlouhý DNA fragment byl čištěn, štěpen HindlII a BamHI a poté klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl. Po určení sekvence bází byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci V oblasti H řetězce označen jako HEF-RVHa-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11.
Jednotlivé verze b, c, d a e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky jsou konstruovány následovně. Při konstruování verze b a dalších verzí V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, lze zkonstruovat trojrozměrný strukturální model V oblasti myší anti-HM 1.24 protilátky, aby bylo možno předpovědět polohy aminokyselinových zbytků, které budou v molekule protilátky zaměněny.
Za použití mutačních primerů BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze b amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHb-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHb-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12.
Za použití mutačních primerů CS (sekvence 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze c amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHc-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHc-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 13.
Za použití mutačních primerů DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin a threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze d amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHd-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHd-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 14.
Za použití mutačních primerů ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 67 na alanin a methionin v poloze 69 na leucin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze e amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHe-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHe-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15.
3-2. Konstrukce H řetězce hybridní V oblasti
Konstruováním H řetězce hybridní V oblasti je možno zkoumat, která FR V oblasti zušlechtěné protilátky přispívá k vazebné aktivitě a která k inhibování vazebné aktivity. U dvou, které byly zkonstruovány, jedna měla aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 až FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (hybridní anti-HM 1.24 protilátka myš/člověk), zatímco druhá měla aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24
- 12CZ 296790 B6 protilátky (hybridní anti-HM 1.24 protilátka člověk/myš). Aminokyselinové sekvence CDR oblastí jsou celé odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky.
Dva H řetězce hybridních V oblastí byly konstruovány pomocí metody PCR. Metoda je schematicky ukázána na Obr. 6 a Obr. 7. Pro konstrukci dvou H řetězců hybridních V oblastí mohou být použity čtyři primery. Vnější primery a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl. Konstrukční přiměř HYS (SEQ ID NO: 73) hybridního H řetězce je navržen tak, že má negativní DNA sekvenci a hybridní primer HYA (SEQ ID NO: 74) H řetězce má pozitivní DNA sekvenci tak, že obě DNA sekvence jsou vzájemně komplementární.
Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 až FR4 jsou z verze a v oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda splazmidem HEF-1.24H-gyl jako matrici, vnější primer a, a hybridní primer HYA pro H řetězec, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-RVHaAHM-gyl, hybridní primer pro H řetězec HYA a vnější primer h, a produkty obou PCR reakcí byly vyčištěny.
Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz Intemational Application Publication No. WO 92—19759). Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně syntetizována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda s plazmidem HEF-RVHa-AHM-gyl jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA pro H řetězec, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-1.24Hgyl, hybridní primer pro H řetězec HYS a vnější primer h, a produkty obou PCR reakcí byly vyčištěny.
Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz Intemational Application Publication No. WO 92-19759). Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně syntetizována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky.
PCR reakce prvního stupně, čištění PCR produktů, sestavení PCR produktů, PCR reakce druhého stupně a klonování do HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl byly provedeny podle postupu uvedeného v „Příkladu 9. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky“. Po určení DNA sekvence byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-MHRVH-AHM-gyl.
Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-MH-RVH-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 75. Také plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské
- 13CZ 296790 B6 anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-HM-RVH-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-HM-RVH-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 76.
3-3. Konstrukce verzí f až s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Každá z verzí f, g, h, i, j, j, 1, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H řetězce zušlechtěné lidské anti-HM 1.24 protilátky je konstruována následujícím způsobem. Při konstruování verze f a dalších verzí V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, lze zkonstruovat trojrozměrný strukturální model V oblasti myší anti-HM 1.24 protilátky jak bylo uvedeno výše, aby bylo možno předpovědět polohy aminokyselinových zbytků, které budou v molekule protilátky zaměněny.
Za použití mutačních primerů FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin a valin v poloze 78 na alanin a DNA plazmidu HEFRVHe-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze f amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHf-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHf-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 16.
Za použití mutačních primerů GS (SEQ ID NO: 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navržených tak, aby mutovaly alanin v poloze 40 na arginin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze g amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHg-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHg-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 17.
Za použití mutačních primerů FS a FA a DNA plazmidu HEF-RVHb-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze h amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHh-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 18.
Za použití mutačních primerů IS (SEQ ID NO: 82) a IA (SEQ ID NO: 83) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 83 na alanin a serin v poloze 84 na fenylalanin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze i amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHi-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHi-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 19.
Za použití mutačních primerů JS (SEQ ID NO: 84) a JA (SEQ ID NO: 85) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHf-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze j amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHj-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHj-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 20.
Za použití mutačních primerů KS (SEQ ID NO: 86) a KA (SEQ ID NO: 87) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHMgyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze k amplifíkována a byl získán plazmid HEFRVHk-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHk-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 21.
Za použití mutačních primerů LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO: 89) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 ha glutamin a serin v poloze 82B na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze I amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHI-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází
-14CZ 296790 B6
V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHI-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22.
Za použití mutačních primerů MS (SEQ ID NO: 90) a MA (SEQ ID NO: 91) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, serin v poloze 82b na izoleucin athreonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHm-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHm-AHM-gYl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 23.
Za použití mutačních primerů NS (SEQ ID NO: 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navržených tak, aby mutovaly serin v poloze 82b na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHn-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHn-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 24.
Za použití mutačních primerů OS (SEQ ID NO: 94) a OA (SEQ ID NO: 95) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze o amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHo-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHo-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ED NO: 25.
Za použití mutačních primerů PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze p amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHp-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEFRVHp-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 26.
Za použití mutačních primerů OS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze q amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHq-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHq-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 27.
Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmidu HEF-RVHp-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze r amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHr-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 28.
Za použití mutačních primerů SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) navržených tak, aby mutovaly methionin v poloze 69 na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze s amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHs-AHMgyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHs-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 102.
Aminokyselinové sekvence V oblasti konstruovaného L řetězce jsou uvedeny v Tabulce 1 a aminokyselinové sekvence V oblasti H řetězce jsou uvedeny v Tabulkách 2 až 4.
-15CZ 296790 B6
Tabulka 1
Aminokyselinová sekvence V oblasti L řetězce
AHM
HuSG 1 RE I
RYLa
RVLb
FR1
2
12345678901234567890123
DlYMTQSHKFMSTSYGDRYSITC
DIQMTQSPSSLSASYGDRYTITC
D1QMTQSPSSLSASVGDRVT1TC
CDR1 FR2
4
45678901234 567890123456789
KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLL1Y WYQQKPGKAPKLL1Y WYQQKPGKAPKLLIY
AHM
HuSG [
RE!
RVLa
RVLb
CDR2 FR3
6 7 8
01234 56 78901234567890123456789012345678
SASNRYT GVPDRÍTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYC GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC
GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC
AHM
HuSG I RE I RVI?.
RV Lb
CDR3 FR4
10
901234567 8901234567 QQHYSTPFT FGSGTKLEIK FGQGTKVEIK FGQGTKYEIK
-16CZ 296790 B6
Tabulka 2
Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce
AHM
HuSGI
HG3 RVHa
FR!
2 3
123456789012345678901234567890 QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT EVQLVQSGADYKKPGXSVXYSCKASGYTFS QVQtVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN -----------------------------T
CDR1 FR2
12345 67890123456789
PYWMQ WVKQRPGQGLEW1G
WVRQAPGXGLDWVG
WVRQAPGQGLEtfMG
RVHb --------------------------------T------------------RVHc ------------------------------T------------------RVHd ---------------------------- --T-----------------------RVHe -------------------------------T------------------RVHf ---------------------------------T------------------RVHg -----------------------------------T---------R--------RVHb ---------------------------------T ---------------------RVHi --------------------------------T------------------RVHj ---------------------------------T --------------------RVHk -·-------------------------------T ---------------------RVHI ----------------------------------T --------------------RVHm
RVHn --------------- T --------------------RVHo ----------- T ------ ------------------RVHp ------------ T -----------------------RVHq ------ T ----------------------RVlis ------- -T-------------------------17CZ 296790 B6
Tabulka 3
Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce
CDR2 FR3
6 7 8 9
012A3456789012345 67890123456789012ABC34 56-78901234
AHM 5IFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLS1LAFEDSAVYYCAR KuSGI RVTXTXDXSXNTAYMFLSSLRSEDTAVYYCAR
HG3 RVTMTRDTSTSTYYMELSSLRSEDTAVYYCAR
RVHa ------------------- ------A---------------------------RVHb ------------------ K----A--------------------------RVHc -------------------- ------A-K--------------------------RVHd ---------------------- x------A_k----------------------------RVHe -------------------A-L-A----------------------------RVHf -------------------- -A-L-A---S--A------------------RVHg --------------------------A-----------------------------RVHb ----------------------- X-----A_._S_..A------·--------------RVHi ------------------- x-----A---S--A--------Ap-------------RVHj --------------------- KA~L-A--~S--A---------------------RVHk - --------------- Κ----Λ---S--A--Q------------------RVHI --------------------- x----A_.._S__A__Q_.j-------------RVHm -------------------- K------A---S---A--Q--I-----S-------RYHn --------------------- K------A-- S--A------I---------------RVHo ----------------------- x-----a-. -s--A--------------S-------RVHd --------------------- ------A--------A-----------------------RVHq ---------------------- -.....A-· -S-------------------------RVHr --------------------- -----A-K a------------------------RVHs -....... -· I A-K-----A------------------------18CZ 296790 B6
Tabulka 4
Aminokyselinová sekvence V oblasti H řetězce (3)
CDR3 FR4 n
57890ABJK12 34567890123
AHM GLRRGGYYFDY WGQGTTLTVSS
HuSGI wgqgtlvtvss
JH6 WCQGTTVTVSS
RVHa ------------ -------------RVHb ------------- -------------RVIIc ------------- -------------RVHd -------------- ----------RYHe ----------- -------------RVHf ------------- ------------RVHg ----------- ------------RVHh ------------ ------------RYHi ---------------------------RVHj ------------- ------------RVHk ------------ ------------RVHI --------------- -------------RVHm ------------- --------------RYHn --------------- ------------RYHo ---------------- --------------RVHp -------------- --------------RVHq ---------------- ----------------RYHr -------------- ---------------RVHs -------------- -----------------
3. Produkce chimérních protilátek a pozměněných lidských protilátek
Pro produkci chimérických protilátek nebo pozměněných lidských protilátek byly konstruovány vždy dva expresní vektory, které obsahují DNA kódující V oblast myšího H řetězce a C oblast lidského H řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, a DNA kódující V oblast myšího L řetězce a C oblast lidského L řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, nebo expresní vektor, obsahující DNA kódující V oblast zušlechtěného H řetězce a C oblast lidského H řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor, a DNA kódující V oblast zušlechtěného L řetězce a C oblast lidského L řetězce, pod kontrolou oblasti regulující expresi, jako je systém zesilovač transkripce/promotor.
Potom je hostitelská buňka, jako je savčí buňka, transformována společně těmito dvěma vektory, transformované buňky jsou pěstovány in vitro nebo in vivo a produkují chimémí protilátky nebo pozměněné lidské protilátky (např. WO 91-16928). Navíc je protilátkový gen vnesen do savců, jako např. koza, a je tak vytvořen transgenní živočich, z jehož mléka je potom možno získat chimémí protilátky nebo pozměněné lidské protilátky.
Také V oblast H řetězce a C oblast H řetězce, a V oblast L řetězce a C oblast L řetězce jsou ligovány do jednoho vektoru, jímž je transformována vhodná hostitelská buňka a tím je navozena produkce protilátek. Tedy pro expresi chimérních protilátek jsou DNA kódující myší leader sekvenci, V oblast H řetězce a lidský H řetězec C oblasti, přítomné v klonované cDNA, a DNA
-19CZ 296790 B6 kódující myší leader sekvencemi a L řetězec V oblasti a lidský L řetězec C oblasti vneseny do jednoho expresního vektoru (viz WO 94-11523).
Pro expresi pozměněné lidské protilátky jsou DNA kódující V oblast zušlechtěného H řetězce a C oblast lidského H řetězce, a DNA kódující V oblast zušlechtěného L řetězce a C oblast lidského L řetězce vneseny do jednoho expresního vektoru (viz WO 94-11523). Pomocí uvedeného vektoru jsou hostitelské buňky transformovány a transformované buňky jsou pěstovány in vivo nebo in vitro a produkují požadovanou chimémí protilátku nebo pozměněnou lidskou protilátku.
Buňky, výše uvedeným postupem transformované genem kódujícím požadovanou chimérní protilátku nebo pozměněnou lidskou protilátku, jsou pěstovány a produkovaná chimémí protilátka nebo pozměněná lidská protilátka může být izolována buď zevnitř buňky, nebo z okolního média a vyčištěna do homogenního stavu.
Izolace a purifíkace požadovaného proteinu, uvedeného v tomto vynálezu, chimémí protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, mohou být provedeny pomocí afínitního sloupce. Jako sloupec, který využívá protein A, lze uvést HyperD, POROS, Sepharose F atd. Jako alternativní možnosti lze použít běžné izolace a purifíkace užívané pro proteiny, výběr metod není jakýmkoli způsobem omezen. Např. kombinace rozličných chromatografíckých metod, ultrafíltrace, vysolování, dialýzy a podobně podle potřeby, umožní izolaci a purifikaci chimérní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky.
Pro produkci chimémí anti-HM 1.24 protilátky nebo pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, uvedené v tomto vynálezu, lze použít jakoukoli expresní metodu, včetně např. eukaryotických buněk jako jsou živočišné buňky, zavedených systémů savčích buněčných linií, buněčných systémů hmyzích buněk, systémů buněk hub, kvasinkových buněčných systémů a prokaryotických buněk, jako jsou bakteriální buňky, např. buněk Escherichia coli apod. Je výhodné produkovat chimérní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, uvedené v tomto vynálezu, v COS buňkách, HeLa buňkách, Věro buňkách, buňkách myelomu nebo BHK buňkách.
V takovýchto případech mohou být použity obecné promotory, používané pro expresi v savčích buňkách. Např. s výhodou může být použit bezprostředně časný promotor lidského cytomegaloviru (HCMV). Příklady expresních vektorů, obsahujících HCMV promotor jsou např. HCMVVH-HCyl, HCMV-VL-HCk, atd., které jsou odvozeny zpSV2neo (Intemational Application Publication No. WO 92-19759).
Navíc jako promotory pro expresi genu v savčích buňkách v předkládaném vynálezu, lze použít virové promotory, např. retrovirů, polyoma vím, adenoviru, opičího vím (SV40) atd. a promotory odvozené ze savčích buněk, jako jsou lidský faktor pro elongaci polypeptidového řetězce la (HEF-la) atd. Např. když je použit promotor SV40, exprese může být snadno dosaženo při použití metody Mulligan a kol., (Nátuře 277, 108 (1079)), a když je použit promotor Hef-ΐα, lze použít metodu Mizushima, S. a kol., (Nucleic Acids Research, 18, 5322, 1990).
Pro replikaci lze použít systémy, které jsou odvozeny od viru SV40, polyomaviru, adenoviru, hovězího papillomaviru (BPV), adenoviru nebo podobně a pro zvýšení počtu kopií genu v hostitelském buněčném systému může expresní vektor obsahovat, jako selektivní markér, gen pro aminoglykosyl fosforibosyltransferázu (APH), gen pro thymidin kinázu (TK), gen pro xanthinguanidin fosforibosyltransferázu z Escherichia coli (Ecogpt), gen pro dihydrofolát reduktázu (DHFR) a podobně.
-20CZ 296790 B6
4. Vazebně inhibiční aktivita chimérní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky (1) Měření koncentrace protilátek
Koncentrace čištěných protilátek může být měřena ELISA testem nebo pomocí měření absorbace.
ELISA destičky pro měření koncentrace protilátek mohou být připraveny následujfcím postupem. V každé z 96 jamek ELISA destičky (např. Maxisorb, vyrobeno NUNC) byla imobilizováno 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgG při koncentraci 1 pg/ml.
Po blokování pomocí 100 pg/ml ředicího pufru (např. 50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% hovězí sérumalbumin (BSA), pH 8,1), je ke každé jamce přidáno sériové ředění supernatantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimérní protilátka, hybridní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka, např. supematant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimérní protilátka, hybridní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka. Poté je přidáno 100 pl kozí protilátky proti lidskému IgG, konjugované s alkalickou fosfatázou, roztok substrátu o koncentraci 1 mg/ml (Sigmal04, p-nitrofenylfosfát, vyrobeno SIGMA) a na přístroji pro odečítání mikrodestiček (Bio Rad) je měřena absorbance při 405 nm. Jako standard pro měření koncentrace může být používán lidský IgGlK (vyrobeno The Blonding Site). Koncentrace čištěné protilátky se získá měřením absorbance při 280 nm a spočtením za předpokladu, že 1 mg/ml odpovídá absorbanci 1,35 OD.
(2) Vazebná aktivita
Vazebnou aktivitu lze měřit „buněčným“ ELISA testem za použití linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL25). Destičky pro „buněčný“ ELISA test mohou být připraveny následujícím postupem. Buňky WISH, připravené ve vhodné koncentraci v médiu PRMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, jsou přidány do 96jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí a PBS(-) jsou fixovány 0,10 glutaraldehydem (vyrobeno Nakalai tesque).
Po blokování je ke každé jamce přidáno 100 pl sériových ředění supernatantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimérní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, např. supematant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimérní anti-HM 1.24 protilátka, protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a poté je přidána králičí protilátka proti lidskému IgG, značená peroxidázou (vyrobeno DAKO).
Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti je přidán roztok substrátu a dále inkubováno. Poté je reakce zastavena 50 pl 6 N kyseliny sírové a je měřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).
(3) Měření vazebně inhibiční aktivity
Vazebně inhibiční aktivita biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky je měřena „buněčným“ ELISA testem za pomoci linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL25). Destičky pro „buněčný,, ELISA test mohou být připraveny výše uvedeným postupem (2). Buňky WISH, připravené ve vhodné koncentraci v médiu PRMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, jsou přidány do 96jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí a PBS(-) jsou fixovány 0,1% glutaraldehydem (vyrobeno Nakalai tesque).
-21 CZ 296790 B6
Po blokování je ke každé jamce přidáno 50 μΐ sériových ředění supematantu z kultur buněk, v nichž je exprimována chimérní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, např. supematant kultur COS buněk nebo CHO buněk, nebo čištěná chimérní anti-HM 1.24 protilátka, hybridní anti-HM 1.24 protilátka nebo pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka současně s 50 μΐ 2 pg/ml biotinylované myší antiHM 1.24 protilátky, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a po promytí je přidán streptavidin, značený peroxidázou (vyrobeno DAKO).
Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti a následujícím promytí je přidán roztok substrátu a dále inkubováno. Poté je reakce zastavena 50 μΐ 6 N kyseliny sírové a měřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio-Rad).
Měření ADCC aktivity
ADCC aktivita chimérní protilátky nebo pozměněné lidské protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, může být měřena následujícím způsobem. Zaprvé jsou z lidské periferní krve nebo kostního morku odděleny pomocí hustotní centrifugacemononukleární buňky a připraveny z nich buňky efektorové. Buňky lidského myelomu jsou připraveny jako buňky cílové tím, že jsou buňky RPMI 8226 označeny pomocí 51Cr. Poté je k takto označeným cílovým buňkám přidána chimérní protilátka nebo pozměněná lidská protilátka, u níž je ADCC aktivita měřena, inkubováno a potom jsou k cílovým buňkám ve vhodném poměru přidány efektorové buňky a dále inkubováno.
Po inkubaci je odebrán supematant a změřena jeho radioaktivita na měřiči záření gama. Současně může být pro zjištění maxima uvolněné radioaktivity použit 1% NP-40. Cytotoxicíta (v %) může být spočtena jako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti NP-40 a C je radioaktivita (cpm), uvolněná v samotném kultivačním roztoku bez protilátek.
Když se očekává, že C oblast protilátky bude vykazovat ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu, lze jako C oblast protilátky použít lidskou Cyl nebo lidskou Cy3. Navíc buď přidáním, změnou nebo úpravou části aminokyselin C oblasti protilátky, lze navodit vyšší ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu.
Například existuje polymerizace IgG připomínající IgM, způsobená náhradou aminokyselin (Smith, R. I. F. & Morrison, S. L., BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683—688), dále polymerizace IgG připomínající IgM, způsobená přidáním aminokyselin (Smith, R. I. F. a kol., J. Immunol. (1995) 154, 2226-2236), exprese tandemově uspořádaných genů kódujících L řetězec (Shuford, W. a kol., Science (1991) 252, 724-727), dimerizace IgG, způsobená záměnou aminokyselin (Caron, P. C. a kol., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B. J. Immunology (1992) 148, 2918-2922, dimerizace IgG, způsobená chemickou modifikací (Wolff, E. A. a kol., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565) a navození efektorové funkce, způsobená změnou aminokyselin v kloubové oblasti protilátky (Norderhaug, L. a kol., Eur. j. Immunol (1991) 21, 23792384). Může se jich dosáhnout cílenou mutagenezí pomocí příměrů, přidáním sekvence baží za využití štěpných míst pro restrikční enzymy a chemickými modifikačními činidly, které indukují kovalentní vazby.
in vivo diagnostické činidlo pro myelom
Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, může být použita jako in vivo diagnostické činidlo pro myelom tím, zeje připojena ke značené sloučenině, jako je radioaktivní izotop nebo podobně.
-22CZ 296790 B6
Navíc fragmenty pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, jako jsou Fab, F(ab')2, Fv nebo jednotlivý řetězec Fv (scFv), kde Fv nebo Fv H řetězec a L řetězec jsou spojeny vhodným linkerem, který je připojen ke značené sloučenině jako je radioaktivní izotop nebo podobně, mohou být použity jako in vivo diagnostické činidlo pro myelom.
Specificky lze tyto protilátkové fragmenty získat zkonstruováním genu, kódujícího tyto protilátkové fragmenty, vnesením do expresního vektoru a poté exprimováním ve vhodných hostitelských buňkách, nebo štěpením pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky vhodným enzymem.
Výše uvedená in vivo diagnostika pro myelom mohou být systémově podávány parenterálním způsobem.
Farmaceutický prostředek a léčebné činidlo pro myelom
Aby byly potvrzeny léčebné účinky zušlechtěné anti-HM 1.24 protilátky, která je předmětem tohoto vynálezu, uvedené protilátky byly podávány živočichům s transplantovanými myelomovými buňkami a byly hodnoceny jejich protinádorové účinky.
Jako myelomové buňky, které jsou transplantovány živočichům, byly preferovány lidské myelomové buňky, z nichž lze uvést např. KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475), RPMI8226 (ATCC CCI155), ARH-77 (ATCC CRL 1621) a S6B45 (Suzuki, H. a kol., Eur. J. Immunol. (1992) 22, 1989-1993). Jako živočichové, kterým jsou uvedené buňky transplantovány, jsou s výhodou používáni takoví, u kterých jsou imunologické funkce potlačeny nebo chybí, zde lze jako příklad uvést nahé myši, myši SCID, béžové myši anahé krysy.
Navíc protinádorové účinky mohou být potvrzeny změnami v hladinách lidských imunoglobulinů v séru, měřením objemu anebo váhy nádoru, změnami v množství Bence Jonesových proteinů v moči, dobou přežití pokusných zvířat a podobně.
Farmaceutické prostředky nebo léčebná činidla pro myelom, která obsahují jako aktivní složku pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu, mohou být podávány parenterálním způsobem, buď systémově, nebo lokálně. Například si lze vybrat intravenózní injekce, jako jsou kapací infúze, intramuskulámí injekce, intraperitoneální injekce nebo subkutánní injekce a dávkový režim lze vybrat vhodně v závislosti na věku a zdravotním stavu pacientů.
Účinné dávkování je obyčejně vybráno v oblasti 0,01 mg až 1000 mg/kg tělesné váhy na dávku. Jinou možností je zvolit dávkování 5 mg na jedince, výhodněji 50 až 100 mg na jedince.
Farmaceutické prostředky nebo léčebná činidla pro myelom, která obsahují jako aktivní složku pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, která je předmětem tohoto vynálezu, mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné nosiče nebo příměsi, závisející na způsobu podání.
Jako příklady takových nosičů nebo příměsí zde mohou být uvedeny voda, farmaceuticky přijatelná organická rozpustidla, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinyl pyrrolidon, karboxyvinylový polymer, sodná sůl karboxymethylcelulózy, polyakrylát sodný, alginát sodný, ve vodě rozpustný dextran, sodná sůl karboxymethylového škrobu, pektin, methylcelulóza, ethylcelulóza, xanthanová klovatina, arabská guma, kasein, želatina, agar, diglycerin, glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol, vazelína, parafín, stearylalkohol, kyselina stearová, lidský sérumalbumin (HSA), manitol, sorbitol, laktóza, farmaceuticky přijatelná smáčedla a podobně. Použité příměsi mohou být vybrány z výše uvedených příkladů nebo jejich kombinací, ale nejen žních.
-23CZ 296790 B6
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 je graf znázorňující, jak je při FCM analýze, používající linií lidských myelomových buněk KPMM2, intenzita fluorescence chimérní anti-HM 1.24 protilátky posunuta ve srovnání s kontrolní protilátkou podobným způsobem, jako u myší anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 2 je graf znázorňující, jak při buněčném ELISA testu, používajícím buňky WISH, chimérní anti-HM 1.24 protilátka, podobně jako myší anti-HM 1.24 protilátka, inhibuje vazbu biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky na WISH buňky, v míře, která je úměrná koncentraci.
Obrázek 4 je diagram, představující způsob konstrukce L řetězce pozměněné lidské anti-HM
1.24 protilátky sestavením úseků CDR oblasti pomocí PCR metody.
Obrázek 5 je diagram, představující způsob sestavení oligonukleotidů RVH1, RVH2, RVH3 a RVH4 pomocí PCR metody při přípravě H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 6 je diagram, představující způsob konstrukce V oblasti H řetězce hybridní anti-HM
1.24 protilátky člověk/myš pomocí PCR metody.
Obrázek 7 je diagram, představující způsob konstrukce V oblasti H řetězce hybridní anti-HM
1.24 protilátky myš/člověk pomocí PCR metody.
Obrázek 8 je graf ukazující, že verze a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebnou schopnost pro antigen stejnou, jako chimérní anti-HM 1.24 protilátka. Indexy -1 a -2 ukazují, že se jedná o různé šarže.
Obrázek 9 je graf ukazující schopnost vázat antigen u pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze a L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a u chimérní anti-HM
1.24 protilátky.
Obrázek 10 je graf ukazující schopnost vázat antigen u pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze b L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a u chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 11 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze a L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a chimérní antiHM 1.24 protilátky.
Obrázek 12 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, v níž byla kombinována verze b L řetězce a verze a, b, f nebo h H řetězce a chimérní antiHM 1.24 protilátky.
Obrázek 13 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, b, c a d H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 14 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a a e H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimérní anti-HM 1.24 protilátky. Indecy -1 a -2 ukazují, že se jedná o různé šarže.
Obrázek 15 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí řetězce a, b, p a r H pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 16 je graf ukazující schopnost vázat antigen u hybridní anti-HM 1.24 protilátky člověk/myš, u hybridní anti-HM 1.24 protilátky myš/člověk a u chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
-24CZ 296790 B6
Obrázek 17 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, b, c af H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 18 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a a g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 19 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí a a g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 20 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí h a i H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 21 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí f, h a j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 22 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí h a i H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 23 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí f, h a j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 24 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí h, k, 1, m, n a o H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 25 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, h, p a q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 26 je graf ukazující inhibici schopnosti vázat se k buňkám WISH u verzí h, k, 1, m, n a o H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 27 je graf ukazující vazebně inhibiční schopnost u verzí a, h, p a q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 28 je graf ukazující schopnost vázat antigen u verzí a, c, p a r H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a u chimémí anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 29 je graf ukazující, že verze se pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebnou schopnost pro antigen stejnou, jako verze r pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 30 je graf ukazující, že verze se pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky má vazebně inhibiční schopnost stejnou, jako verze r pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Obrázek 31 je graf ukazující, že purifikovaná pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má stejnou schopnost vázat antigen, jako chimémí anti-HM 1.24 protilátka.
Obrázek 32 je graf ukazující, že purifikovaná pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má vazebně inhibiční schopnost stejnou, jako chimémí anti-HM 1.24 protilátka.
Obrázek 33 je graf ukazující, že podání chimérní anti-HM 1.24 protilátky prodloužilo ve srovnání s podáním kontrolního lidského IgGl období přežití u myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami.
Obrázek 34 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z periferní krve zdravého člověka použity jako buňky efektorové, pak kontrolní lidský IgGl nevykazuje cytotoxicitu pro buňky
-25CZ 296790 B6
KPMM2 a myší anti-HM 1.24 protilátka má také slabou cytotoxicitu, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje pro buňky KPMM2 silnou cytotoxicitu.
Obrázek 35 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z periferní krve zdravého člověka použity jako buňky efektorové, kontrolní lidský IgGl nevykazuje cytotoxicitu pro buňky ARH77 a myší anti-HM 1.24 protilátka má také slabou cytotoxicitu, zatímco pozměněná lidská antiHM 1.24 protilátka vykazuje pro buňky ARH-77 silnou cytotoxicitu.
Obrázek 36 je graf ukazující, že když jsou buňky odvozené z kostního morku myši SCID použity jako buňky efektorové, kontrolní lidský IgGl nevykazuje cytotoxicitu pro buňky KPMM2, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje při zvýšení koncentrace protilátek zvýšenou cytotoxicitu pro buňky KPMM2.
Obrázek 37 je graf ukazující, že hladina lidského IgG v séru myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami je zvýšena po podání kontrolního lidského IgG, ve srovnání s jeho hladinou před podáním, zatímco podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšení hladiny lidského IgG v séru.
Obrázek 38 je graf ukazující, že podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky myším s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami způsobí ve srovnání s podáním kontrolního lidského IgGl prodloužení období přežití.
Obrázek 39 je graf ukazující, že hladina lidského IgG v séru myší s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami je zvýšena po podání melphalanu a kontrolního lidského IgGl, ve srovnání s jeho hladinou před podáním, zatímco podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky inhibuje toto zvýšení hladiny lidského IgG v séru.
Obrázek 40 je graf ukazující, že podání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky myším s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami způsobí ve srovnání s podáním melphalanu nebo kontrolního lidského IgGl prodloužení období přežití.
Příklady provedení vynálezu
Dále bude předkládaný vynález vysvětlen na specifických příkladech.
Příklad 1: Klonování cDNA kódující V oblast myší anti-HM 1.24 protilátky
1. Izolace mediátorové RNA (mRNA)
Mediátorová RNA byla izolována za použití soupravy Fast Track mRNA Isolation Kit Version 3.2 (vyrobeno Invitrogen) podle přiloženého návodu z 2 x 108 hybridomových buněk (FERM BP-5233), které produkují myší anti-HM 1.24 protilátky.
2. Amplifíkace genu kódujícího variabilní oblast protilátky PCR metodou PCR byla provedena na termocykleru firmy Perkin Elrner Cetus.
2—1. Amplifíkace a fragmentace genu kódujícího V oblast myšího L řetězce
Podle takto izolované RNA byla syntetizována cDNA za použití soupravy AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (výrobce Life Science) a použita pro PCR. Jako primery pro PCR byly použity MKV (Mouše Kappa Variable) primery (Jones, S. T. a kol., Bio/Technology, 9, 88-89, (1991)), které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 29 až 39 a které hybridizují s leader sekvencí myšího kappa typu L řetězce.
-26CZ 296790 B6
100 μΐ roztoku PCR, obsahující lOmM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM MgCl2, 5 jednotek DNA polymerázy Ampli Taq (vyrobeno Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM primery MK.V, uvedené v SEQ ID NO: 29 až 39, 3 mM primer MKV, uvedený v SEQ ID NO: 40 a 100 ng jednořetězcové cDNA bylo převrstveno 50 μΐ minerálního oleje, poté zahřáto na počáteční teplotu 94 °C po dobu 3 minut, potom na 94 °C na 1 minutu, na 55 °C 1 na minutu a na 72 °C na 1 minutu, v uvedeném pořadí. Po opakování tohoto cyklu třicetkrát, byla reakční směs inkubována při 72 °C po dobu 10 minut. Amplifíkovaný DNA fragment byl vyčištěn v nízkotající agaróze (vyrobeno Sigma) a štěpen Xmal (vyrobeno New England Biolabs) a Sall (vyrobeno Takara Shuzo) při 37 °C.
2-1. Amplifíkace a fragmentace cDNA kódující V oblast myšího H řetězce
Gen kódující V oblast myšího H řetězce byl ampiifikován metodou 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA ends; Frohman, M. A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J. B. D. M. a kol., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991)). Poté co byla cDNA syntetizována pomocí primeru Pl (SEQ ID NO: 41), který hybridizuje specificky s konstantní oblastí myšího IgG2a, cDNA kódující V oblast myšího H řetězce byla amplifikována pomocí soupravy 5'-AmpliFINDER RACE KIT (vyrobeno CLONTECH), za použití primeru MHC2a (SEQ ID NO: 42), který hybridizuje specificky s konstantní oblastí myšího IgG2a a ukotvovacího primeru (SEQ ID NO: 77), který je součástí soupravy. Amplifíkovaný DNA fragment byl vyčištěn v nízkotající agaróze (vyrobeno Sigma) a štěpen EcoRI (vyrobeno Takara Shuzo New England Biolabs) a Xmal (vyrobeno Shuzo New England Biolabs) při 37 °C.
3. Spojení a transformace
DNA fragment obsahující gen kódující V oblast myšího L řetězce typu kappa, připravený výše uvedeným způsobem, byl ligován do vektoru pUC19 (připraveného štěpením Sall a Xmal) v reakční směsi obsahující 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP, 50 mg/ml polyethylenglykolu (8000) a jednu jednotku T4 DNA ligázy (vyrobeno GIBCO-BRL) při teplotě 16 °C po dobu 2,5 hodiny. Podobně byl připraven DNA fragment obsahující gen kódující V oblast myšího H řetězce a byl ligován do vektoru pUC19 (připraveného štěpením EcoRI a Xmal) při teplotě 16 °C po dobu 3 hodin.
Pak bylo 10 μΐ výše uvedené ligační směsi přidáno k 50 μΐ kompetentních buněk Escherichia coli DH5a, ponecháno na ledu 30 minut, na 42 °C jednu minutu a znovu jednu minutu na ledu. Po přidání 400 μΐ média 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) byly buňky inkubovány při 37 °C jednu hodinu a poté byly E. coli vysety na agar s 2xYT médiem (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), obsahující 50 μg/ml ampicilinu a inkubovány přes noc při 37 °C, aby byly získány transformanty E. coli.
Transformanty byly pěstovány přes noc při 37 °C v 10 ml média 2xYT obsahujícího 50 μg/ml ampicilinu a z této kultuiy byla alkalickou metodou připravena plazmidová DNA (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
Takto získaný plazmid, obsahující gen kódující V oblast myšího L řetězce typu kappa, odvozený z hybridomu, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku, byl nazván pUCHMVL9. Plazmid, získaný výše uvedeným postupem a obsahující gen kódující V oblast myšího H řetězce, odvozený z hybridomu, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku, byl nazván pUCHMVHR16.
-27CZ 296790 B6
Příklad 2: Určení sekvence bází DNA
Sekvence bází cDNA kódující oblasti ve výše uvedeném plazmidu byla určena použitím automatického DNA sekvenátoru (vyrobeno Applied Biosystem lne.) a soupravy Taq Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrobeno Applied Biosystem lne.) postupem, který uvádí výrobce.
Sekvence bází genu kódujícího V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky obsažená v plazmidu pUCHMVL9 je uvedena v SEQ ID NO: 1. Sekvence baží genu kódujícího V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky obsažená v plazmidu pUCHMVHRló je uvedena v SEQ ID NO: 2.
Příklad 3: Určení CDR
Základní struktury V oblasti L řetězce a H řetězce se vzájemně podobají, kdy čtyři podpůrné části jsou spojeny třemi hypervariabilními oblastmi, tj. oblastmi určujícími komplementaritu (complementarity determining region - CDR). Aminokyselinová sekvence podpůrné oblasti jsou relativně dosti stálé, ale variabilita v aminokyselinové sekvenci je extrémně vysoká (Kabat, E. A. a kol., „Sequences of Proteins of Immunological Interest“, US Dept. Health and Human Services, 1983).
Na základě těchto skutečností byla aminokyselinová sekvence variabilní oblasti anti-HM 1.24 protilátky porovnána s aminokyselinovými sekvencemi protilátek v databázi, aby byla zjištěna homologie a byla tak určena oblast CDR, jak je uvedena v Tabulce 5.
Tabulka 5
| Plazmid | Sekvence No. | CDR(1) | CDR(2) | CDR(3) |
| PUCHMVL9 | 3 až 5 | 24 až 34 | 50 až 56 | 89 až 97 |
| PUCHMVHR16 | 6 až 8 | 31 až 35 | 50 až 66 | 99 až 100 |
Příklad 4: Potvrzení exprese klonované cDNA (Konstrukce chimémí anti-HM 1.24 protilátky)
1. Konstrukce expresního vektoru
Aby bylo možno zkonstruovat expresní vektor, který exprimuje chimémí anti-HM 1.24 protilátku, cDNA klonů pUCHMVL9 a pUCHMVHRló, kódující V oblasti L řetězce a H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky byla modifikována PCR metodou a poté vnesena do expresního HEF vektoru (Intemational Application Publication No. WO 92-19759).
Zpětný primer ONS-L722S (SEQ ID NO: 43) pro V oblast L řetězce a zpětný primer VHR16S (SEQ ID NO: 44) pro V oblast H řetězce byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA, kódující počátek leader sekvence příslušné V oblasti a obsahují Kozákovu konvenční sekvenci (Kozák, M. a kol., J. Mol. Biol., 196, 947-950, (1987)) a rozpoznávací místo pro restrikční enzym HindlII. Přímý primer VL9A (SEQ ID NO: 45) pro V oblast L řetězce a přímý primer VHR16A (SEQ ID NO: 46) pro V oblast H řetězce byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA, kódující
-28CZ 296790 B6 konec J oblasti a obsahují donorovou sekvenci pro sestřih a rozpoznávací místo pro restrikční enzym BamHI.
100 μΙ PCR reakční směsi, obsahující 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCl2, 100 pM každého primerů, 100 ng matricové DNA (pUCHMVL9 nebo pUCHMVHRló) a 5 jednotek enzymu Ampli Taq bylo převrstveno 50 μΐ minerálního oleje, a po počáteční denaturaci při 94 °C, zahřáto na 94 °C na 1 minutu, na 55 °C na 1 minutu a na 72 °C na 1 minutu, a po opakování tohoto cyklu třicetkrát byla reakční směs inkubována při 72 °C po dobu 10 minut.
PCR produkt byl vyčištěn v 1,5% nízkotajícím agarózovém gelu a štěpen HindlII a BamHI, poté klonován do HEF-VL-gK pro V oblast L řetězce a do HEF-VH-gyl v případě V oblasti H řetězce. Po určení DNA sekvence byly plazmidy, které obsahují DNA fragment se správnou DNA sekvencí označeny HEF-1.24L-gK, popř. HEF-1.24H-gyl.
Oblasti kódující příslušné variabilní oblasti byly z výše uvedených plazmidů vyštěpeny restrikčními enzymy HindlII a BamHI a vytvořeny tak restrikční fragmenty, které byly vloženy do HindlII anebo do BamHI místa plazmidového vektoru pUC19 a byly označeny pUC19-l ,24L-gK popř. pUC19-1.24H-gyl.
Buňky Escherichia coli, obsahující příslušné plazmidy pUC-19-1.24L-gK a pUC19-1.24H-gyl byly označeny Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC191.24H-gyl) a byly 29. srpna 1996 uloženy pro mezinárodní použití vNational Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chrome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovými čísly FERM BP-5646, popř. FERM BP-5644, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.
2. Transformace buněk COS-7
Aby mohla být pozorována přechodná exprese chimémích anti-HM 1.24 protilátek, byly výše uvedené expresní vektory testovány na buňkách COS-7 (ATCC CRL-1651). HEF-1.24L-gK a HEF-1.24H-gyl byly společně transformovány do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno Bio Rad). Každá DNA (10 pg) byla přidána k 0,8 ml PBS, obsahujícího 1 x 107 buněk/ml a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 pF.
Po zotavovací periodě 10 minut při teplotě místnosti byly elektroporezované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10 % fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO2 inkubátoru BNA120D (vyrobeno TABAI) byl supematant z kultur odebrán, zbytky buněk byly odstraněny centrifugací a použity pro následující pokusy.
3. FCM analýza
Schopnost chimémích anti-HM 1.24 protilátek vázat antigen byla zkoumána průtokovou cytometrií (FCM - flow cytometry) za použití buněk KPMM2. Po promytí 4,7 x 105 buněk KPMM2 (Japan Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) vPBS(~) knim bylo přidáno 50 μΐ kultury COS-7 buněk, které produkují výše uvedené chimémí anti-HM 1.24 protilátky a 50 μΐ pufru FACS (PBS(-) obsahující 2 % hovězího fetálního séra a 0,1% azid sodný), nebo 5 pl purifikovaných myších anti-HM 1.24 protilátek o koncentraci 500 pg/ml a 95 pl pufru FACS a inkubováno na ledu po dobu 1 hodiny.
Jako kontrola bylo použito 50pl 2 pg/ml chimémí SK2 (Intemational Application Publication No. WO 94-28159) a 50 μΐ pufru FACS, nebo 5 μΐ 500 pg/ml purifíkovaného myšího IgG2aK (UPC10) (vyrobeno CAPPEL) namísto purifikované myší anti-HM 1.24 protilátky a 95 μΐ pufru
-29CZ 296790 B6
FACS a podobně inkubováno. Po promytí pufrem FACS bylo přidáno 100 μΐ 25 pg/ml kozí protilidské protilátky (GAH), konjugované s FITC (vyrobeno CAPPE) nebo 10 μg/ml kozí protimyší protilátky (GAM), konjugované s FITC (vyrobeno Becton Dickinson) a inkubováno na ledu po dobu 30 minut. Po promytí pufrem FACS bylo suspendováno v 1 ml pufru FACS a intenzita fluorescence každé buňky byla měřena přístrojem FACScan (vyrobeno Becton Dickinson).
Jak je uvedeno v Obr. 1, bylo zjištěno, že se chimérní anti-HM 1.24 protilátky vážou k buňkám KPMM2, protože se vrchol intenzity fluorescence posunul doprava v systému, kde byly k buňkám přidány chimérní anti-HM 1.24 protilátky, ve srovnání s kontrolou, podobně jako v případě, kdy byly přidány myší anti-HM 1.24 protilátky. To potvrdilo, že klonovaná cDNA kóduje variabilní oblast myší anti-HM 1.24 protilátky.
Příklad 5: Příprava buněčné line CHO, která stabilně produkuje chimérní anti-HM 1.24 protilátku
1. Konstrukce expresního vektoru pro chimérní H řetězec
Po štěpení výše uvedeného plazmidu HEF-1.24H-gyl restrikčními enzymy Pvul a BamHI byl fragment dlouhý 2,8 kbp, obsahující EF1 promotor a DNA kódující V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky vyčištěn na 1,5% nízkotajícím agarozovém gelu. Poté byl výše uvedený fragment vložen do 6 kbp fragmentu, připraveného štěpením expresního vektoru použitého pro lidský H řetězec, DHFR-AE-Rvh-PMlf (viz Intemational Application Publication No. WO 92/19759), obsahujícího DHFR gen a gen kódující konstantní oblast lidského H řetězce, restrikčními enzymy Pvul a BamHI, a byl zkonstruován tak expresní vektor DHFR-AE-HEF-1.24Hgyl pro H řetězec chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
2. Vnesení genu do buněk CHO
Aby byl pro chimérní anti-HM 1.24 protilátku vytvořen stabilní produkční systém, byly geny výše zmíněných expresních vektorů HEF-1.24H-gyl a DHFR-ÁE-HEF-1.24H-gyl, které byly linearizovány štěpením Pvul, současně vneseny elektroporační metodou do buněk CHO DXB11 (věnované z Medical Research Council Collaboration Center), za podmínek podobných výše uvedeným (výše uvedená transfekce buněk COS-7).
3. Genová amplifíkace pomocí MTX
Mezi CHO buňkami s vnesenými geny mohou přežít v beznukleosidovém α-MEM kultivačním roztoku (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 μg/ml G418 (výrobce GIBCOBRL) a 10 % hovězího fetálního séra, pouze ty buňky, do kterých byly současně vneseny oba expresní vektory, jak pro L řetězec, tak i pro H řetězec, a tak je možno je selektovat. Potom následovalo přidání 10 nM MTX (vyrobeno Sigma) kvýše uvedenému kultivačnímu roztoku. Mezi klony, které se pomnožily, byly vybrány takové, které produkovaly chimérní anti-HM 1.24 protilátku ve velkém množství. Výsledkem byly klony #8 až #13, které vykazovaly účinnost produkce chimérické protilátky asi 20 μg/ml a byly označeny jako buněčné linie, produkující chimérní anti-HM 1.24 protilátky.
Příklad 6: Konstrukce chimérní anti-HM 1.24 protilátky
Chimérní anti-HM 1.24 protilátka byla zkonstruována následujícím způsobem. Výše uvedené buňky CHO, produkující chimérní anti-HM 1.24 protilátku byly nepřetržitě kultivovány 30 dní za použití Dulbeccova média modifikovaného podle Iscoveho (vyrobeno GIBCO-BRL), obsahujícího 5% bezgramaglobulinové sérum novorozených telat (vyrobeno GIBCO-BRL) v zařízení
-30CZ 296790 B6 pro kultivaci buněk do vysoké hustoty Verax systém 20 (vyrobeno CELLEX BIOSCIENCE lne.).
Ve dnech 13, 20, 23, 26 a 30 po založení kultury, byl kultivační roztok odebírán pomocí tlakové filtrační jednotky S ARTOBRAN (vyrobeno Sartorius) a poté byla chimémí anti-HM 1.24 protilátka čištěny afinitní metodou pomocí velkoobjemového sběrného systému Afi-Prep Systém (vyrobeno Nippon Gaishi) a sloupce Super Protein A (objem náplně: 100 ml, vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS jako absorpčního a promývacího pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCl (pH 8,0). Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 pg/ml.
Příklad 7: Zjišťování aktivity chimérní anti-HM 1.24 protilátky
Chimémí anti-HM 1.24 protilátka byla hodnocena následujícími testy vazebně inhibiční aktivity.
1. Měření vazebně inhibiční aktivity
1-1. Konstrukce biotinylované anti-HM 1.24 protilátky
Po naředění myší anti-HM 1.24 protilátky v 0,1 M hydrouhličitanovém pufru na koncentraci 4 mg/ml byly přidány 4 μΐ 50 mg/ml biotin-N-hydroxy sukcinimidu (vyrobeno EY LABS lne.) a ponecháno reagovat 3 hodiny při teplotě místnosti. Potom bylo přidáno 1,5 ml 0,2 M glycinového roztoku, inkubováno při teplotě místnosti po dobu 30 minut, aby došlo k zastavení reakce a pak byly odebírány frakce biotinylovaného IgG za použití sloupce PD-10 (vyrobeno Pharmacia Biotech).
1-2. Měření vazebně inhibiční aktivity
Vazebně inhibiční aktivita biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití linie lidských amniotických buněk WISH (ATCC CCL 25). Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly připraveny následujícím postupem. Buňky WISH, připravené v koncentraci 4 x 105 buněk/ml v médiu RPMI 1640, doplněném 10 % hovězího fetálního séra, byly přidány do 96ti jamkové destičky, inkubovány přes noc a po dvojím promytí PBS(-) byly fixovány 0,1% glutaraldehydem (vyrobeno Nakalai tesque).
Po blokování je ke každé jamce přidáno 50 μΐ sériových ředění chimérní anti-HM 1.24 protilátky nebo myší anti-HM 1.24 protilátky, získané afinitní purifikací, a současně 50 μΐ 2 pg/ml biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky, inkubováno 2 hodiny při teplotě místnosti a poté je přidán streptavidin, značený peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a byl přidán roztok substrátu. Po zastavení reakce přidáním 50 μΐ 6 N kyseliny sírové je měřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).
Výsledek uvedený v Obr. 2 ukázal, že chimérní anti-HM 1.24 protilátka má k biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátce totožnou vazebně inhibiční aktivitu jako myší anti-HM 1.24 protilátka. To znamená, že chimémí protilátka má tutéž V oblast jako myší anti-HM 1.24 protilátka.
-31 CZ 296790 B6
Příklad 9: Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
1. Navržení V oblasti pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Aby bylo možno zkonstruovat pozměněnou lidskou protilátku, v níž by CDR z myší monoklonální protilátky byla vnesena do lidské protilátky, je žádoucí, aby existovala vysoká homologie mezi FR myší protilátky a FR lidské protilátky. Tak byly V oblasti L řetězců a H řetězců myší antiHM 1.24 protilátky pomocí Protein Data Bank porovnány s V oblastmi všech známých protilátek, jejichž struktura byla objasněna.
V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci podskupiny IV (HSGIV) V oblasti L řetězce lidské protilátky, přičemž homologie je 66,4 %. Na druhé straně vykazuje 56,9% homologii sHSGI, 55,8% sHSGII a 61,5% homologii s HSGIII.
Pokud je V oblast L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblastí L řetězce známých lidských protilátek, vykazuje 67,0% homologii s V oblastí L řetězce lidské protilátky REI, jedné z I podskupiny V oblastí L řetězce lidské protilátky. Proto byla FR z REI použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Byla navržena verze a V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. V této verzi byla FR lidské protilátky vytvořena totožně s FR oblastí odvozenou z REI, která je přítomna v pozměněné lidské CAMPATH-1H protilátce (viz Reichmann, L. a kol., Nátuře 322, 21-25, (1988), FR obsažená ve verzi a V oblasti L řetězce pozměněné lidské PM-1 protilátky popsané v Intemational Application Publication No. WO 92-19759), a myší CDR byla vytvořena shodně s CDR ve V oblasti L řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.
V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky je nejvíce podobná konvenční sekvenci HSGI
V oblasti H řetězce lidské protilátky s homologii 54,7 %. Na druhé straně vykazuje 34,6% homologii s HSGII a 48,1% homologii s HSGIII. Když je V oblast H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky porovnána s V oblasti H řetězce známých lidských protilátek, FR1 až FR3 byly nejvíce podobné V oblasti H řetězce lidské protilátky HG3, jedné z I podskupiny V oblastí lidského H řetězce (Rechavi, G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 855-859), přičemž homologie je 67,3 %.
Proto byla FR lidské protilátky HG3 použita jako výchozí materiál pro konstrukci V oblastí H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. Avšak, protože aminokyselinová sekvence FR4 lidské protilátky HG3 nebyla popsána, byla použita aminokyselinová sekvence FR4 z lidské protilátky JH6 (Ravetch, J. V. a kol., Cell, 27, 583-591), která vykazuje nejvyšší homologii sFR4 H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky. FR4 z JH6 má kromě jedné aminokyseliny sekvenci shodnou s FR4 z H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky.
V prvé verzi a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly FR1 až FR3 vytvořeny shodně s FR1 až FR3 z lidské protilátky HG3 a CDR byla vytvořena shodně s CDR
V oblasti H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky kromě toho, že aminokyseliny v pozici 30 v lidské FR1 a v pozici 71 v lidské FR3, byly shodné s aminokyselinovými myší anti-HM 1.24 protilátky.
2. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl konstruován vnesením CDR oblasti pomocí PCR metody. Postup je znázorněn na Obr. 4. Při konstrukci pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky (verze a), která má FR odvozenu z lidské protilátky REI, bylo použito osm PCR primerů. Vnější primery A (SEQ ID NO: 47) a H (SEQ ID NO: 48) byly navrženy tak, aby hybridizovaly s DNA sekvencí expresního vektoru HAF-VL-gk.
-32CZ 296790 B6
Primery LIS (SEQ ID NO: 49), L2S (SEQ ID NO: 50) a L3S (SEQ ID NO: 51) mají negativní
DNA sekvenci. Primery LI A (SEQ ID NO: 52), L2A (SEQ ID NO: 53) a L3A (SEQ ID NO: 54) mají pozitivní DNA sekvenci, přičemž každý mají komplementární DNA sekvenci (20 až 23 bázových párů) k DNA na 5'-konci primerů LIS, L2S a L3S.
V prvním stupni PCR byly provedeny 4 PCR A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A a L3S-H a každý PCR produkt byl vyčištěn. Čtyřem PCR produktům z prvních PCR bylo umožněno vzájemné sestavení na základě jejich vlastní komplementarity (viz International Application Publication No. WO 92-19759). Poté byly přidány vnější primery A a H a byla amplifíkována celková délka DNA kódující V oblast L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (druhá PCR). Ve výše uvedené PCR může být jako matrice použit plazmid HEF-RVL-M21a (viz International Application Publication No. WO 95-14041), kódující verzi a V oblasti L řetězce pozměněné lidské ONS-M21 protilátky, založené na FR odvozené z lidské protilátky REI.
V prvním stupni PCR byla použita PCR směs, obsahující 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1, 0,1 mM deoxyribonukleotidtrifosfáty, 1,5 mM MgCl2, 100 ng matricové DNA, 100 pM každého primerů a 5 jednotek Ampli Taq. Každá reakce byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje. Po počáteční denaturaci zahřátím na teplotu 94 °C, byl proveden reakční cyklus 94 °C 1 minutu, 55 °C 1 minutu a 72 °C 1 minutu, potom byla reakční směs inkubována při 72 °C po dobu 10 minut.
PCR produkty A-L1A (215 bázových párů), L1S-L2A (98 bázových párů), L2S-L3A (140 bázových párů) a L3S-H (98 bázových párů) byly vyčištěny za použití 1,5% gelu znízkotající agarózy a byly sestaveny v průběhu 2. PCR. Ve druhé PCR bylo 98 μΐ PCR směsi obsahující pg každého produktu z 1. reakce a 5 jednotek Ampli Taq inkubováno ve dvou cyklech 94 °C minuty, 55 °C 2 minuty a 72 °C 2 minuty, potom bylo přidáno 100 pM každého vnějšího příměru (A a H). PCR reakce byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje a provedeno 30 cyklů PCR za podmínek uvedených výše.
Fragment dlouhý 515 bázových párů, kteiý je výsledkem druhé PCR byl vyčištai za použití 1,5% gelu z nízkotající agarózy, štěpen BamHI a HindlII, a takto získané DNA fragmenty byly klonovány do oblasti HEF expresního vektoru HEF-VL-gK. Po určení DNA sekvence byl plazmid, obsahující správnou aminokyselinovou sekvenci V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM
1.24 protilátky, označen jako HEF-RVLa-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází
V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9.
Verze b V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována mutagenezí pomocí PCR. Mutagenní primery FTY-1 (SEQ ID NO: 55) a FTY-2 (SEQ ID NO: 56) byly navrženy tak, aby mutovaly fenylalanin v pozici 71 na tyrozín.
Po amplifíkaci výše uvedených primerů za použití plazmidu HEF-RVLa-AHM-gK jako matrice, byl získaný produkt vyčištěn a štěpen BamHI a HindlII. Získané DNA fragmenty byly klonovány do HEF expresního vektoru HEF-VL-gK a získán tak plazmid HEF-RVlb-AHM-gK. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti L řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEFRVLb-AHM-gK jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.
3. Konstrukce V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
3-1. Konstrukce verzí a až e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla navržena následujícím způsobem. Připojením DNA sekvence kódující FR1 až FR3 lidské protilátky HG3
-33CZ 296790 B6 aFR4 lidské protilátky JH6 kDNA sekvenci kódující CDR V oblasti H řetězce myší lidské anti-HM 1.24 protilátky, byla navržena patřičně dlouhá DNA, kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Poté bylo na 5' konec připojeno cílové místo pro HindlII/Kozakova konvenční sekvence, na 3' konec bylo připojeno cílové místo pro BamHI/donorová sekvence pro sestřih tak, aby bylo umožněno připojení do HEF expresního vektoru.
Takto uspořádaná DNA sekvence byla rozdělena do čtyř oligonukleotidů. Poté byly oligonukleotidy, které by potenciálně mohly bránit sestavení těchto oligonukleotidů, podrobeny počítačové analýze sekundární struktury. Sekvence čtyř oligonukleotidů RVH1 až RVH4 jsou uvedeny v SEQ ID NO: 57 až SEQ ID NO; 60. Tyto oligonukleotidy mají délku 119 až 144 bází a obsahují 25 až 26 bázových párů dlouhé překrývající se oblasti. Z těchto oligonukleotidů mají RVH2 (SEQ ID NO: 58) a RVH4 (SEQ ID NO: 60) negativní DNA sekvenci, zatímco RVH1 (SEQ ID NO: 57) a RVH3 (SEQ ID NO: 59) mají pozitivní DNA sekvenci. Postup pro sestavení těchto čtyř oligonukleotidů pomocí metody PCR je ukázán na obrázku (viz Obr. 5).
PCR směs (98 μΐ) obsahující 100 ng každého ze čtyř nukleotidů a 5 jednotek Ampli Taq byla napřed denaturována zahřátím na teplotu 94 °C 2 minuty a potom byly provedeny dva cykly inkubace, obsahující 94 °C 2 minuty, 55 °C 2 minuty a 72 °C 2 minuty. Potom bylo přidáno 100 pM každého externího primeru RHP1 (SEQ ID NO: 61) a RHP2 (SEQ ID NO: 62) a reakce byla převrstvena 50 μΐ minerálního oleje. Po počáteční denaturaci 94 °C 1 minutu bylo provedeno 38 cyklů 94 °C 1 minutu, 55 °C 1 minutu a 72 °C 1 minutu a na závěr byla reakce inkubována 10 minut při 72 °C.
Amplifíkovaný, 438 bázových párů dlouhý DNA fragment byl vyčištěn na 1,5% nízkotající agaróze, štěpen HindlII a BamHI a poté klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl. Po určení sekvence bází byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující aminokyselinovou sekvenci správné V oblasti H řetězce označen jako HEF-RVHa-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHa-AHMgyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 11.
Jednotlivé verze, b, c, d a e V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky jsou konstruovány následovně.
Za použití mutačních primerů BS (SEQ ID NO: 63) a BA (SEQ ID NO: 64) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze b amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHb-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHb-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 12.
Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze c amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHc-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHc-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 13.
Za použití mutačních primerů DS (SEQ ID NO: 67) a DA (SEQ ID NO: 68) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin a threonin v poloze 73 na lyzin, a DNA plazmidu HEFRVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze d amplifíkována a byl získán plazmid HEF-RVHd-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHd-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 14.
-34CZ 296790 B6
Za použití mutačních ES (SEQ ID NO: 69) a EA (SEQ ID NO: 70) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 67 na alanin a methionin v poloze 69 na leucin, a DNA plazmidů HEF-RVHaAHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze e amplifikována a byl získán plazmid HEFRVHe-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidů HEF-RVHe-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15.
3-2. Konstrukce H řetězce hybridní V oblasti
Byly konstruovány dva H řetězce hybridní V oblasti. Jeden je hybridní anti-HM 1.24 protilátka myš/člověk, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, zatímco druhá je hybridní anti-HM 1.24 protilátka člověk/myš, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM
1.24 protilátky. Aminokyselinové sekvence CDR oblastí jsou celé odvozeny z myší anti-HM
1.24 protilátky.
Dva H řetězce hybridních V oblastí byly konstruovány pomocí metody PCR. Metoda je schematicky ukázána na Obr. 6 a Obr. 7. Pro konstrukci dvou H řetězců hybridních V oblastí byly použity čtyři primery. Vnější příměry a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) byly navrženy tak, aby hybridizovaly sDNA sekvencí HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl. Konstrukční primer HYS (SEQ ID NO: 73) hybridního H řetězce je navržen tak, že má negativní DNA sekvenci a hybridní primer HYA (SEQ ID NO: 74) H řetězce má pozitivní DNA sekvenci tak, že obě DNA sekvence jsou vzájemně komplementární.
Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byla v prvním stupni PCR použita PCR metoda s plazmidem HEF-1.24H-gyl jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA H řetězce, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-RVHaAHM-gyl, hybridní primer HYS H řetězce (SEQ ID NO: 73) a vnější primer h (SEQ ID NO: 72), a produkty obou PCR byly vyčištěny. Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz Intemational Application Publication No. WO 92-19759).
Poté byla po přidání vnějších primerů a (SEQ ID NO: 71) a h (SEQ ID NO: 72) v PCR reakci druhého stupně amplifikována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 jsou z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM
1.24 protilátky.
Pro konstrukci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky, byla v prvním stupni použita PCR metoda s plazmidem HEF-RVHa—AHM-gyl jako matricí, vnější primer a, a hybridní primer HYA H řetězce, a dále pak PCR metoda, používající jako matrici plazmid HEF-1.24H-gyl, hybridní primer HYS H řetězce a vnější primer h, a produkty obou PCR byly vyčištěny. Dva produkty z PCR reakcí prvního stupně byly ponechány sestavit se na základě vzájemné komplementarity (viz Intemational Application Publication No. WO 92-19759).
Poté byla po přidání vnějších primerů a a h v PCR reakci druhého stupně amplifikována DNA o plné délce, kódující H řetězec hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky.
-35CZ 296790 B6
PCR reakce prvního stupně, čištění PCR produktů, sestavení PCR produktů, PCR reakce druhého stupně a klonování do HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl byly provedeny podle postupů uvedených v „Příkladu 9. Konstrukce V oblasti L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky“.
Po určení DNA sekvence byl plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z myší anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-MH-RVH-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-MH-RVH-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 75. Také plazmid, který obsahuje DNA fragment, kódující správnou aminokyselinovou sekvenci H řetězce hybridní V oblasti, v níž jsou aminokyselinové sekvence FR1 a FR2 odvozeny z verze a V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a aminokyselinové sekvence FR3 a FR4 z myší anti-HM 1.24 protilátky nazván HEF-HM-RVH-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-HM-RVH-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 76.
3-3. Konstrukce verzí f až s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Každá z verzí f, g, h, i, j, k, 1, m, n, o, p, q, r a s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována následujícím způsobem.
Za použití mutačních primerů FS (sekvence 78) a FA (SEQ ID NO: 79) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin a valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmidu HEFRVHe-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze f amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHf-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHf-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 16.
Za použití mutačních primerů GS (SEQ ID NO: 80) a GA (SEQ ID NO: 81) navržených tak, aby mutovaly alanin v poloze 40 na arginin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze g amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHg-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHg-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 17.
Za použití mutačních primerů FS (SEQ ID NO: 78) a FA (SEQ ID NO: 79) a DNA plazmidu HEF-RVHb-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze h amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHh-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 18.
Za použití mutačních primerů IS (SEQ ID NO: 82) a IA (SEQ ID NO: 83) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 83 na alanin a serin v poloze 84 na fenylalanin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze i amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHi-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHi-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 19.
Za použití mutačních primerů JS (SEQ ID NO: 84) a JA (SEQ ID NO: 85) navržených tak, aby mutovaly arginin v poloze 66 na lyzin, a DNA plazmidu HEF-RVHf-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze j amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHj-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHj-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 20.
-36CZ 296790 B6
Za použití mutačních primerů KS (SEQ ID NO: 86) a KA (SEQ ID NO: 87) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHMgyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze k amplifikována a byl získán plazmid HEFRVHk-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHk-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 21.
Za použití mutačních primerů LS (SEQ ID NO: 88) a LA (SEQ ID NO: 89) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin a serin v poloze 82B na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze I amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHI-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHI-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 22.
Za použití mutačních primerů MS (SEQ ID NO: 90) a MA (SEQ ID NO: 91) navržených tak, aby mutovaly kyselinu glutamovou v poloze 81 na glutamin, serin v poloze 82b na izoleucin a threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHm-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHmAHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 23.
Za použití mutačních primerů NS (SEQ ID NO: 92) a NA (SEQ ID NO: 93) navržených tak, aby mutovaly serin v poloze 82b na izoleucin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze m amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHn-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHn-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 24.
Za použití mutačních primerů OS (SEQ ID NO: 94) a OA (SEQ ID NO: 95) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 87 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHh-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze o amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHo-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHo-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 25.
Za použití mutačních primerů PS (SEQ ID NO: 96) a PA (SEQ ID NO: 97) navržených tak, aby mutovaly valin v poloze 78 na alanin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze p amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHp-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEFRVHp-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 26.
Za použití mutačních primerů QS (SEQ ID NO: 98) a QA (SEQ ID NO: 99) navržených tak, aby mutovaly threonin v poloze 75 na serin, a DNA plazmidu HEF-RVHa-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze q amplifikována a byl získán plazmid HEF-RVHq-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHq-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 27.
Za použití mutačních primerů CS (SEQ ID NO: 65) a CA (SEQ ID NO: 66) a DNA plazmidu HEF-RVHp-AHM-gyl jako matrice pro PCR metodu, byla verze r amplifikována a byl získán plazmid HEF—RVHr-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 28.
Verze s V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla konstruována mutagenezí pomocí PCR. Mutačních primery SS (SEQ ID NO: 100) a SA (SEQ ID NO: 101) byly navrženy tak, aby mutovaly methionin v poloze 69 na izoleucin.
-37CZ 296790 B6
Poté, co výše uvedený primer byl amplifikován za použití HEF-RVHr-AHM-gyl jako matrice, výsledný produkt byl vyčištěn, štěpen BamHI a HindlII a získaný DNA fragment byl klonován do HEF expresního vektoru HEF-VH-gyl a získán tak plazmid HEF-RVHs-AHM-gyl. Aminokyselinová sekvence a sekvence bází V oblasti H řetězce, obsažené v tomto plazmidu HEFRVHs-AHM-gyl jsou uvedeny v SEQ ID NO: 102.
Oblasti, kódující variabilní oblast v každém z výše uvedených plazmidů HEF-RVLa-AHM-gK a HEF-RVHr-AHM-gyl byly vyštěpeny jako restrikční fragmenty restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Byly vloženy do HindlII a BamHI míst plazmidového vektoru pUC19 a získané plazmidy byly označeny pUC19-RVLa-AHM-gK popř. pUC19-RVHr-AHM-gyl.
Buňky Escherichia coli, obsahující příslušné plazmidy pUC19-RVLa-AHM-gK a pUC19RVHr-AHM-gyl byly označeny Escherichia coli DH5cc (pUC19-RVLa-AHM-gK) popř. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gyl) a byly 29. srpna 1996 uloženy pro mezinárodní použití v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovými čísly FERM BP-5645, popř. FERM BP-5643, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.
Oblasti, kódující variabilní oblast ve výše uvedeném plazmidu IIEF-RVHs-AHM-gyl byly vyštěpeny jako restrikční fragmenty restrikčními enzymy HindlII a BamHI. Byly vloženy do HindlII a BamHI míst plazmidového vektoru pUC19 a získaný plazmid byl označen pUC19RVHs-AHM-gyl.
Buňky Escherichia coli, obsahující plazmid pUC19-RVHs-AHM-gyl byly označeny Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gyl) a byly 29. září 1997 uloženy pro mezinárodní použití v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chrome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP-6127, za dodržení ustanovení Budapešťské smlouvy.
4. Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, chimérní anti-HM 1.24 protilátky a H řetězce hybridní protilátky
Aby bylo možno zhodnotit každý řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka a chimérní anti-HM 1.24 protilátka jako pozitivní kontrolní protilátka, byly exprimovány. Při konstrukci každé z verzí b a dalších V oblasti H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byl exprimován H řetězec hybridní protilátky, aby bylo možno posoudit, která aminokyselinová sekvence v FR by měla být nahrazena. Navíc byla exprimována v kombinaci s chimérním H řetězcem, aby bylo možno zhodnotit verzi a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
4-1. Exprese pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (1)
Deset pg každého z expresních vektorů (HEF-RVHa-AHM-gyl až HEF-RVHr-AHM-gyl) pro H řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresních vektorů (HEF-RVLaAHM-gK nebo HEF-RVLb-AHM-gK) pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky bylo společně transformováno do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno BioRad). Každá DNA (10 pg) byla přidána k 0,8 ml alikvotům, obsahujícím 1 x 107 buněk/ml v PBS a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 pF.
Po zotavovací periodě 10 minut při teplotě místnosti byly elektroporované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10% fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO2 inkubátoru BNA120D (vyrobeno TABAI) při teplotě 37 °C a 5% CO2, byl supematant z kultur odebrán, zbytky buněk byly odstraněny centri-38CZ 296790 B6 fugací při 1000 ot/min po dobu 5 minut v centrifuze 15PR-22 (vyrobeno HITACHI) vybavené rotorem 03 (vyrobeno HITACHI), provedena ultrafiltrace na mikrokoncentrátoru (Centricon 100, vyrobeno, Amicon) za použití centrifugy J2-21 (vyrobeno BECKMAN) vybavené rotorem JA20.1 (vyrobeno BECKMAN) a použit pro „buněčný“ ELISA test.
Exprese pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky (2)
Deset pg expresního vektoru (HEF-RVHs-AHM-gyl) pro verzi „s“ H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresního vektoru (HEF-RVla-AHM-gK) pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky bylo společně transformováno do buněk COS-7 elektroporací pomocí přístroje Gene Pulser (vyrobeno Bio Rad). Každá DNA (10 pg) byla přidána k 0,8 ml alikvotům, obsahujícím 1 x 107 buněk/ml v PBS a podrobena pulzům 1500 V s kapacitou 25 pF.
Po zotavovací periodě 10 minut při teplotě místnosti byly elektroporované buňky přidány do 30 ml kultivačního média DMEM (vyrobeno GIBCO), obsahujícího 10% fetálního hovězího séra bez γ-globulinu. Po inkubaci 72 hodin v CO2 inkubátoru BNA120D (vyrobeno TABAI) při teplotě 37 °C a 5% CO2, byl supematant z kultur odebrán, zbytky buněk byly odstraněny centrifugám při 1000 ot/min po dobu 5 minut v centrifuze 05PR-22 (vyrobeno HITACHI) vybavené rotorem 03 (vyrobeno HITACHI), provedena ultrafiltrace na mikrokoncentrátoru (Centricon 100, vyrobeno Amicon) za použití centrifugy J2-21 (vyrobeno BECKMAN) vybavené rotorem JA20.1 (vyrobeno BECKMAN) a sterilizován filtrací za použití filtru Millex GV13mm (vyrobeno Millipore) a použit pro „buněčný“ ELISA test.
4-2. Exprese chimémí anti-HM 1.24 protilátky
Za použití 10 pg expresního vektoru HEF-1.24H-gyl pro H řetězec chimérické anti-HM 1.24 protilátky a 10 pg expresního vektoru HEF-1.24H-gK pro L řetězec chimérní anti-HM 1.24 protilátky, byla pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky připravena chimémí anti-HM 1.24 protilátka pro použití v „buněčném“ ELISA testu.
4-3. Exprese anti-HM 1.24 protilátky obsahující verzi a zušlechtěného L řetězce a chimémí H řetězec
Za použití 10 pg každého z expresních vektorů HEF-1.24H-gyl pro H řetězec chimémí antiHM 1.24 protilátky a HEF-RVLa-AHM-gK pro verzi a L řetězce pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, byla anti-HM 1.24 protilátka pro použití v „buněčném“ ELISA testu a obsahující verzi a zušlechtěného L řetězce a chimémí H řetězec, připravena pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
4-4. Exprese H řetězce hybridní protilátky
Za použití 10 pg každého z expresních vektorů (HEF-MH-RVH-AHM-gyl nebo HEF-HMRVH-AHM-gyl) pro V oblast hybridního H řetězce a expresního vektoru HEF-RVLa-AHMgK pro L řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, byl připraven pomocí výše uvedené metody pro expresi pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky H řetězec hybridní protilátky pro použití v „buněčném“ ELISA testu.
4-5. Měření koncentrace protilátek
Koncentrace získaných protilátek byla měřena testem ELISA. Každá jamka v 96ti jamkové ELISA destičce (Maxisorb, vyrobeno NUNC) byla imobilizována přidáním 100 pl kozí protilátky proti lidskému IgG (vyrobeno BIO SOURCE) o koncentraci 1 pg/ml v pufru (0,1 M NaHCO3, 0,02% NaN3, pH 9,6) a inkubováním při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po blokování se
-39CZ 296790 B6
100 μΐ ředicího pufru (50 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl2, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% NaN3, 1% hovězí sérumalbumin (BSA), pH 8,1), bylo ke každé jamce přidáno 100 μΐ sériového ředění supernatantu z kultur buněk COS-7, které sekretují pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, chimémí anti-HM 1.24 protilátku nebo H řetězec hybridní protilátky, který byl koncentrován ultrafiltrací a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo přidáno 100 μΐ kozí protilátky proti lidskému IgG, konjugované s alkalickou fosfatázou (vyrobeno DAKO).
Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny a promytí bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu o koncentraci 1 pg/ml (Sigma 104, p-nitrofenylfosfát, SIGMA), rozpuštěného v substrátovém pufru (50 mM NaHCO3, 10 mM MgCl2, pH 9,8) a na přístroji pro odečítání mikrodestiček MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad) byla měřena absorbance při 405 nm. Jako standard pro měření koncentrace byl použit lidský IgGlK (vyrobeno The binding Sítě).
5. Příprava buněčné linie CHO, která stabilně produkuje pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku
5-1. Konstrukce expresního vektoru pro H řetězec pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Po štěpení výše uvedeného plazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl restrikčními enzymy Pvul a BamHI byl fragment dlouhý 2,8 kbp, obsahující DNA kódující EF1 promotor a DNA kódující V oblast H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, vyčištěn na 1,5% nízkotajícím agarozovém gelu. Poté byl výše uvedený fragment vložen do 6 kbp fragmentu, připraveného štěpením expresního vektoru, použitého pro lidský H řetězec, DHFR-AE-RVh-PMlf (Intemational Application Publication No. WO 92-19759), obsahujícího DHFR gen a gen kódující konstantní oblast lidského H řetězce, restrikčními enzymy Pvul a BamHI, a zkonstruován tak expresní vektor DHFRΔΕ-HEF-RVHr-AHM-gyl pro H řetězec pozměněné anti-HM 1.24 protilátky.
5-2. Vnesení genu do buněk CHO
Aby byl vytvořen stabilní produkční systém pro pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, byly geny výše zmíněných expresních vektorů DHFR-AE-HEF-RVHr-AHM-gyl a HEFRVLa-AHM-gK, které byly linearizovány štěpením Pvul, současně vneseny do buněk CHO DXB-11 elektroporační metodou, za podmínek podobných výše uvedeným (transfekce do výše uvedených buněk COS-7).
5-3. Genová amplifikace pomocí MTX
Mezi CHO buňkami s vnesenými geny mohou přežít v beznukleosidovém α-MEM kultivačním roztoku (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 pg/ml G418 (vyrobeno GIBCOBRL) a 10 % hovězího fetálního séra, pouze ty buňky, do kterých byly vneseny oba expresní vektory, jak pro L řetězec, tak pro H řetězec, a tímto způsobem byly selektovány. Potom následovalo přidání 10 nM MTX (vyrobeno Sigma) k výše uvedenému kultivačnímu médiu. Mezi klony, které se pomnožily, byly vybrány takové, které produkovaly pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku ve velkém množství. Výsledkem byl klon 1, který vykazoval účinnost produkce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky asi 3 μg/ml a byly označen jako buněčná linie, produkující pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
5-4. Konstrukce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka byla zkonstruována následujícím způsobem. Výše uvedené buňky CHO, produkující pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, byly kultivovány 10 dní v beznukleosidovém α-MEM kultivačním médiu (vyrobeno GIBCO-BRL), k němuž bylo přidáno 500 pg/ml G418 (vyrobeno GIBCO-BRL) a 10 % bezgamaglobulinového
-40CZ 296790 B6 hovězího fetálního séra, v CO2 inkubátoru BNAS120D (vyrobeno TABAI) při 37 °C v 5% CO2. Ve dnech 8 a 10 po založení kultury, byl kultivační roztok odebírán, zbytky buněk odstraněny pomocí centrifugace při 2000 ot/min po dobu 10 minut na centrifuze RL-500SP (vyrobeno Tomy Seiko) vybavené rotorem TS-9 a potom sterilizován filtrací za použití filtru (vyrobeno FALCON) s membránou s póry o průměru 0,45 pm.
Po přidání stejného objemu PBS(~) ke kultivačnímu roztoku z buněk CHO, které produkují pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, byla pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka čištěna afínitní metodou pomocí vysokorychlostního purifikačního systému ConSep LC100 (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS(-) jako absorpčního a promývacího pufru a 0,1 M pufr citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCl (pH 8,0), poté byly frakce koncentrovány centrifugační ultrafíltrací na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno MILLIPORE), byla provedena koncentrace a náhrada za PBS(-) a nakonec sterilizovány filtrací pomocí filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 μηι a získány tak čištěné pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky. Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 pg/ml.
Příklad 11: Zjišťování aktivity pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
U pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena vazebná aktivita k antigenu a vazebně inhibiční aktivity.
1. Metoda měření vazebné aktivity k antigenu a vazebně inhibiční aktivity
1-1. Měření vazebné aktivity k antigenu
Vazebná aktivita k antigenu byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití buněk WISH. Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly připraveny jak bylo popsáno výše v Příkladu 7.1-2.
Po blokování bylo ke každé jamce přidáno 100 μΐ sériových ředění pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, získané z koncentrátu supematantu kultur buněk COS-7 nebo čištěné ze supematantu kultur buněk CHO. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě místnosti byly promyty a poté byla přidána králičí protilátka proti lidskému IgG, značená peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a ke každé jamce bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu. Po inkubaci byla reakce zastavena přidáním 50 μΐ 6 N kyseliny sírové a byla změřena absorbance při 490 nm na MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).
1-2. Měření vazebně inhibiční aktivity
Vazebně inhibiční aktivita biotinylem značené myší anti-HM 1.24 protilátky byla měřena „buněčným“ ELISA testem za použití buněk WISH. Destičky pro „buněčný“ ELISA test byly, připraveny jak bylo uvedeno výše v Příkladu 7.1-2. Po blokování bylo ke každé jamce přidáno 50 μΐ sériových ředění pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, získané z koncentrátu supernatantu kultur buněk COS-7 nebo čištěné ze supematantu kultur buněk CHO spolu s 50 μΐ biotinylem značené myší anti-HM 1.24 protilátky. Po inkubaci 2 hodiny při teplotě místnosti a promytí byl přidán streptavidin značený peroxidázou (vyrobeno DAKO). Po inkubaci 1 hodinu při teplotě místnosti následovalo promytí a bylo přidáno 100 μΐ roztoku substrátu. Po inkubaci byla reakce zastavena přidáním 50 μΐ 6 N kyseliny sírové a byla změřena absorbance při 490 nm na přístroji MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad).
-41 CZ 296790 B6
2, Hodnocení pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
2-1. L řetězec
Verze b L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Jak je uvedeno v Obr. 8, když je verze a L řetězce exprimována v kombinaci s chimérickým H řetězcem, projevoval podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen. S očekáváním dalšího zvýšení aktivity a kompatability s H řetězcem byla konstruována verze b L řetězce. U verzí a a b L řetězce byly hodnoceny společně vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita při jejich kombinaci s verzemi a, b, f nebo h H řetězce. Jak je uvedeno v Obr. 9, 10, 11 a 12, verze a L řetězce má oproti verzi b vyšší oba tyto druhy aktivity při všech verzích a, b, f nebo h H řetězce. Proto byla pro následující pokusy použita verze a L řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
2-2. Verze a až e H řetězce
Verze a až e H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly hodnoceny v kombinaci s verzí a L řetězce, jak bylo uvedeno pro měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 11, 12, 13 a 14 ukázal, že všechny verze byly ve srovnání s chimémí anti-HM 1.24 protilátkou v obou hodnocených aktivitách slabší, což naznačuje, zeje vyžadována substituce další aminokyseliny.
2-3. H řetězec hybridní protilátky
H řetězec hybridní protilátky byl hodnocen stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 16 ukázal, že hybridní anti-HM 1.24 protilátka člověk/myš vykazuje podobnou aktivitu jako chimémí anti-HM 1.24 protilátka, pokud se týká vazebné aktivity pro antigen, zatímco hybridní anti-HM 1.24 protilátka myš/člověk má slabší aktivitu než chimémí anti-HM 1.24 protilátka. To ukazuje, že pro konstrukci pozměněné lidské antiHM 1.24 protilátky, která by měla vazebnou aktivitu pro antigen podobnou jako chimémí antiHM 1.24 protilátka, je nezbytné zaměnit aminokyseliny obsažené vFR3 nebo FR4.
2-4. Verze f až r H řetězce
Verze f H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 17 ukázal, že její vazebná aktivita pro antigen je snížena ve srovnání s chimémí anti-HM 1.24 protilátkou, ale je vyšší ve srovnání s výše uvedenými verzemi a až c, což značí, že kterákoli ze čtyř aminokyselin v pozicích 67, 69, 75 a 78, které byly nově zaměněny v této verzi, je odpovědná za aktivitu pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
Verze g H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jako je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen. Výsledek uvedený na Obr. 18 a 19 ukázal, že tato verze vykazovala nanejvýše podobnou úroveň aktivity jako výše uvedená verze a, což ukazuje, že jak je ukázáno pro výše uvedený H řetězec hybridní protilátky člověk/myš, aminokyselina na pozici 40, která byla zaměněna v této verzi, není odpovědná za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.
Verze h až j H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 20, 21, 22 a 23 ukázal, že všechny verze měly obě měřené aktivity ve srovnání s chimémí anti-HM 1.24 protilátkou slabší, ale byly podobné s výše zmíněnou verzí f, což značí, že aminokyseliny v pozicích 67 a 69, patřící mezi čtyři aminokyseliny, které byly nově zaměněny ve verzi f, nejsou odpovědné za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.
-42CZ 296790 B6
Verze k až p H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byly hodnoceny stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 24, 25, 26 a 27 ukázal, že všechny verze měly obě měřené aktivity ve srovnání s chimérní anti-HM 1.24 protilátkou slabší, ale byly podobné svýše zmíněnou verzí h, což značí, že aminokyseliny v pozici 80, které byly nově zaměněny v těchto šesti verzích, nejsou odpovědné za zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.
Verze q H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 25 a 27 ukázal, že tato verze měla obě měřené aktivity ve srovnání s výše zmíněnou verzí h nebo p, ale byla podobná výše zmíněné verzi a, což značí, že substituce aminokyseliny v pozici 78 je podstatná pro zvýšení aktivity pozměněné lidské protilátky.
Verze r H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena výše uvedenou metodou. Výsledek uvedený na Obr. 15 a 28 ukázal, že verze r má podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity jako chimérní lidské anti-HM 1.24 protilátka.
Výše uvedené výsledky ukázaly, že minimální záměny, vyžadované k tomu, aby pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka měla podobnou úroveň vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity jako myší anti-HM 1.24 protilátka nebo chimérní anti-HM 1.24 protilátka, jsou aminokyseliny na pozicích 30, 71 a 78 a dále 73.
Vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita pro verze H řetězce a až r pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky jsou uvedeny souhrnně v Tabulce 6.
| Tabulka 6 | ||
| Verze H řetězce | Vazebná aktivita pro antigen | Vazebně inhibiční aktivita |
| a | + | + |
| b | + | + |
| c | + | + |
| d | + | neměřeno |
| e | + | neměřeno |
| f | ++ | ++ |
| 9 | + | + |
| h | ++ | ++ |
| i | ++ | ++ |
| j | ++ | ++ |
| k | ++ | ++ |
| 1 | ++ | ++ |
| m | ++ | ++ |
| n | ++ | ++ |
| 0 | ++ | ++ |
| P | ++ | ++ |
| q | + | + |
| r | +++ | +++ |
-43CZ 296790 B6
2-5. Verze s H řetězce
Verze s H řetězce pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena v kombinaci s výše uvedenou verzí a L řetězce stejně, jak je uvedeno u měření vazebné aktivity pro antigen a vazebně inhibiční aktivity. Výsledek uvedený na Obr. 29 a 30 ukázal, že verze s měla obě měřené aktivity podobné jako verze r.
Jak bylo uvedeno výše, pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, která je předmětem tohoto vynálezu, si podržuje svou schopnost vazby k antigenu dokonce i když byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků zaměněn jinými aminokyselinami. V souhlase s tím předkládaný vynález zahrnuje pozměněnou lidskou anti-HM 1.24 protilátku, v níž byl jeden nebo více aminokyselinových zbytků zaměněno jinou aminokyselinou ve variabilní oblasti H řetězce nebo L řetězce, pokud si podrží původní vlastnosti.
3. Hodnocení purifikované pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky
U purifikované pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byla hodnocena výše uvedená vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita. Výsledek uvedený na Obr. 31 a 32 ukázal, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka měla obě měřené aktivity na podobné úrovni, jako je vazebná aktivita pro antigen a vazebně inhibiční aktivita chimémí anti-HM 1.24 protilátky. Tato skutečnost znamená, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má stejnou vazebnou aktivitu pro antigen jako myší anti-HM 1.24 protilátka.
Příklad 12: Protinádorový účinek chimérické anti-HM 1.24 protilátky proti myšímu modelu lidského myelomu
1. Příprava protilátek k podávání
1-1. Příprava chimémí anti-HM 1.24 protilátky
Purifikovaná chimémí anti-HM 1.24 protilátka získaná ve výše uvedeném Příkladě 6 byla koncentrována a pufr byl zaměněn za PBS(-) pomocí centrifugační ultrafíltrace na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno Amicon). Dále byla sterilizována filtrací pomocí membránového filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 pm. Filtrát byl upraven na koncentraci 200 pg/ml pomocí filtrací sterilizovaného PBS(~) a takto byl použit v následujících pokusech. Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 mg/ml.
1-2. Purifíkace kontrolního lidského IgGl
Lidský IgGl, který byl použit jako kontrola pro chimémí anti-HM 1.24 protilátky byl čištěn následujícím způsobem. Po přidání stejného objemu PBS(-) kHu IgGl Kappa Purified (vyrobeno BINDING SITES), byl čištěn afinitní metodou pomocí vysokorychlostního purifíkačního systému pro protilátky ConSep LC100 (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (vyrobeno Nippon Gaishi) za použití PBS(-) jako absorpčního pufru a 0,1 M pufru z citrátu sodného (pH 3) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. U eluovaných frakcí bylo pH okamžitě upraveno na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCl (pH 8,0), poté byly koncentrovány centrifugační ultrafiltrací na koncentrátoru Centriprep-10 (vyrobeno Amicon), koncentrovány, byla provedena náhrada pufru za PBS(-) a nakonec sterilizovány filtrací pomocí filtru MILLEXGV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 pm. Filtrát byl upraven na koncentraci 200 pg/ml pomocí filtrací sterilizovaného PBS(-) a použit v následujících pokusech. Koncentrace protilátek byla měřena absorbancí při 280 nm a spočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 mg/ml.
-44CZ 296790 B6
2. Způsob kvantifikace lidského sérového IgG v myším séru
Lidský IgG, obsažený v myším séru byl kvantifikován následujícím ELISA testem. Do jamek 96ti jamkové ELISA destičky (vyrobeno NUNC) bylo přidáno 100 μΐ kozího protilidského IgG, neředěného na koncentraci 1 μg/ml pomocí 0,1 M hydrouhličitanového pufru a inkubováno přes noc při 4 °C, aby došlo k imobilizaci protilátek. Po blokování bylo přidáno 100 μΐ sériově ředěného myšího séra nebo lidského IgG jako standard (vyrobeno CAPPEL) a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí bylo přidáno 100 μΐ 2000krát ředěného protilidského IgG značeného alkalickou fosfatázou a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Po promytí byl přidán roztok substrátu, inkubováno, a na přístroji pro odečítání mikrodestiček MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno Bio Rad) byla měřena absorbance při 405 nm.
3. Protinádorový účinek chimérní anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským myelomem
3-1. Příprava myší s transplantovaným lidským myelomem
Myši s transplantovaným lidským myelomem byly připraveny následujícím způsobem. Buňky KPMM2, pasážované in vivo na myších SCID (pěstované vNihon CLEA) byly připraveny v koncentraci 3 x 107 buněk/ml v médiu RPMI 1640, doplněném 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL). Dvěstě μΐ výše uvedené suspenze buněk KPMM2 bylo injikováno do ocasní žíly myším SCID (samci, stáří 8 týdnů, pěstované v Nihon CLEA), které den před tím intraperitoneálně obdržely 100 μΐ anti-asialo GM1 (vyrobeno Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.).
3-2. Podávání protilátek
Dvanáctý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum výše uvedených myší s transplantovaným lidským myelomem a lidský IgG v séru byl kvantifikován pomocí ELISA testu, uvedeného výše v bodě 2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru. Ve dnech 14, 21 a 28 po transplantaci buněk KPMM2 bylo těmto myším intraperitoneálně podáno 100 μΐ protilátek, připravených jak uvedeno výše v bodě
1.
3-3. Hodnocení protinádorového účinku chimémí anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským myelomem
Protinádorový účinek chimémí anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen na základě doby přežívání myší. Jak je ukázáno na Obr. 33, ty myši, které dostaly chimémí anti-HM 1.24 protilátku vykazovaly prodlouženou dobu přežívání ve srovnání s těmi, které dostaly kontrolní lidský IgG. Bylo tedy potvrzeno, že chimérní anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidskému myelomu, transplantovanému myším.
Příklad 13: Měření ADCC aktivity pozměněné lidské antí-HM 1.24 protilátky
ADCC aktivita (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity - buněčná cytotoxicita závislá na protilátkách) byla měřena podle metody uveřejněné v Current Protocols of Immunology, kap. 7. Imunologická studia u lidí, Editor, John E, Colligan a kol., John Wiley & Sons, lne., 1993.
1. Příprava efektorových buněk
Monocyty byly odděleny z periferní krve zdravých lidských jedinců pomocí metody hustotní centrifugace. K periferní krvi zdravých lidských jedinců tedy bylo přidáno stejné množství
-45CZ 296790 B6
PBS(-), směs byla navrstvena na Ficoll-Paque Plus (vyrobeno Pharmacia) a centrifugováno při
400 g po dobu 40 minut. Vrstva mononukleárních buněk byla odebrána, čtyřikrát promyta médiem RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) a jejich koncentrace byla upravena na 5 x 106 buněk/ml v témže kultivačním médiu.
Z buněk kostního morku myší SCID (pěstované v Nihon CLEA) byly indukovány LAK (Limphokine Activated Killer Cells - lymfokinem aktivované killer buňky). Buňky kostního morku byly tedy izolovány ze stehenní kosti myši a dvakrát promyty médiem RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) a jejich hustota upravena na 2 x 105 buněk/ml v témže kultivačním médiu. Tyto byly inkubovány s 50 ng/ml rekombinantního lidského IL-2 (vyrobeno R & D SYSTEMS) a 10 ng/ml rekombinantního myšího GM-CSF (vyrobeno R & D SYSTEMS) v CO2 inkubátoru (vyrobeno TABAI) po dobu 7 dní. Počet buněk byl upraven na 2 x 106 buněk/ml v témže kultivačním médiu.
2. Příprava cílových buněk
Lidská myelomové buněčná linie KPMM2 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) nebo z leukemie odvozené plazmatícké buňky ARH-77 (ATCC CCL-1621) byly radioaktivně označeny inkubací v médiu RPMI 1640 (vyrobeno GIBCO BRL), doplněným 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO BRL) společně s 0,1 mCi 51Cr-chromanu sodného (vyrobeno ICN) při 37 °C po dobu 60 minut. Po radioaktivním označení byly buňky třikrát promyty týmž kultivačním médiem a upraveny na koncentraci 2 x l(ý/ml.
3. Test ADCC
Do jednotlivých jamek 96ti jamkové destičky (dno ve tvaru U) (vyrobeno Becton Dickinson) bylo přidáno 50 μΐ 2 x 105 cílových buněk/ml, 50 μΐ pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky, myší anti-HM 1.24 protilátky, kontrolního lidského IgGl (vyrobeno THE B1NDING SITES) nebo kontrolního myšího IgG2a (UPC10, vyrobeno CAPPEL) a ponecháno reagovat při 4 °C po dobu 15 minut.
Sto μΐ efektorových buněk bylo kultivováno v CO2 inkubátoru 4 hodiny, když poměr (E:T) efektorových buněk (E) kcílovým buňkám (T) byl nastaven 0:1, 3,2:1, 8:1, 20:1 nebo50:1.
Sto μΐ supernatantu bylo odebráno a radioaktivita uvolněná do supematantu kultury byla zjišťována na měřiči záření gama (ARC-300, vyrobeno Aloka). Pro změření maximální radioaktivity byl použit 1 % NP-40 (vyrobeno Nakalai). Cytotoxicita (v %) byla spočtena jako (A-C)/(B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm), uvolněná v přítomnosti NP-40 a C je radioaktivita (cpm), uvolněná v samotném kultivačním médiu bez protilátky.
Obr. 34 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky, připravené z periferní krve zdravého lidského jedince použity jako efektorové buňky a buňky KPMM2 byly použity jako cílové buňky. Obr. 35 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky připravené z periferní krve zdravého lidského jedince použity jako efektorové buňky a buňky ARH-77 byly použity jako cílové buňky. Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, cytotoxicita se zvyšovala se zvýšením koncentrace protilátek ve srovnání s kontrolním lidským IgGl, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu.
Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje vyšší ADCC aktivitu než myší anti-HM 1.24 protilátka. Dále, když byly buňky KPMM2 použity jako cílové buňky, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci 0,1 pg/ml nebo vyšší nezpůsobilo změny v cytotoxicitě, což ukazuje, že
-46CZ 296790 B6 koncentrace 1 pg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu. Když byly buňky ARH-77 použity jako cílové buňky, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci pg/ml nebo vyšší nezpůsobilo změny v cytotoxicitě, což ukazuje, že koncentrace 1 pg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu.
Obr. 36 ukazuje výsledek získaný, když byly buňky, připravené z kostního morku myší SCID použity jako efektorové buňky. Když byla přidána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, cytotoxicita se zvyšovala se zvýšením koncentrace protilátek ve srovnání s kontrolním lidským IgGl, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu. Dále, přidání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky v koncentraci 0,1 μg/ml nebo vyšší nezpůsobilo změny v cytotoxicitě, což ukazuje, že koncentrace 0,1 pg/ml nebo vyšší má dostatečnou ADCC aktivitu.
Tyto výsledky ukazují, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazuje ADCC aktivitu ať jsou efektorové buňky odvozeny z člověka nebo z myši.
Příklad 14: Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidskému myelomu na myším modelu
1. Příprava protilátek k podávání
Pozměněná anti-HM 1.24 protilátka, získaná vnesením plazmidů HEF-RVLa-AHM-gk aplazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl do buněk CHO byla připravena v koncentracích 40, 200 a 1000 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a kontrolní lidský IgGl, získaný v Příkladu 12.1— byl připraven v koncentraci 200 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a tyto byly použity jako podávané protilátky.
2. Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším
2-1. Příprava myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu
Myši s transplantovanými buňkami lidského myelomu byly připraveny tak, jak je popsáno v Příkladě 12.3-1. Byly použity myši SCID (pět týdnů staré, pěstované v Ňihon CLEA).
2-2. Podávání protilátek
Devátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu, připravených ve výše uvedeném bodě 2-1 a byl vněm kvantifikován obsah lidského IgG pomocí testu ELISA, který byl popsán dříve v bodě 12.2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru.
Desátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo těmto myším intravenózně podáno 100 μΐ každé protilátky, připravené výše v bodě 1.
2-3. Hodnocení protinádorového účinku pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším
Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen podle změny množství lidského IgG v myším séru a podle doby přežívání myší.
Změny v množství lidského IgG v myším séru byly kvantifikovány u séra odebraného 35. den po transplantaci buněk KPMM2 tak, že byl zjišťován lidský IgG pomocí ELISA testu, uvedeného
-47CZ 296790 B6 v Příkladě 12.2. Výsledek uvedený na obr. 37 ukazuje, že ve skupině, které byl podán kontrolní lidský IgG, bylo množství lidského IgG 35. den po transplantaci buněk KPMM2 zvýšeno asi lOOOkrát, ve srovnání s 9. dnem (den před podáním protilátek), zatímco ve skupině, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, bylo toto množství téměř stejné nebo nižší než 9. den, to platilo po kteroukoli podanou dávku protilátek, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka potlačuje růst buněk KPMM2. Na druhé straně u doby přežívání, jak je uvedeno na Obr. 38, bylo pozorováno její prodloužení u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, oproti kontrolní skupině s kontrolním lidským IgG. Toto ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším.
Příklad 15: Porovnání protinádorového účinku u pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a používaného léku melphalan proti lidskému myelomu na myším moddu
1. Příprava léků pro podání
1-1. Příprava protilátek proti podání
Pozměněná anti-HM 1.24 protilátka, získaná vnesením plazmidu HEF-RVLa-AHM-gk a plazmidu HEF-RVHr-AHM-gyl do buněk CHO byla připravena v kontrolních 40, 200 a 1000 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a kontrolní lidský IgGl, získaný v Příkladu 12.12 byl připraven v koncentraci 200 pg/ml ve filtrací sterilizovaném PBS(-) a tyto byly použity jako podávané protilátky.
1- 2. Příprava melphalanu
Melphalan (vyrobeno SIGMA), který je současným lékem proti myelomu, byl připraven v koncentraci 0,1 mg/ml za použití 0,2% karboxymetylcelulózy (CMC) (vyrobeno Daicel Chemical Industries, Ltd.).
2. Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky a melphalanu proti buňkám lidského myelomu transplantovaným myším
2- 1. Příprava myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu
Myši s transplantovanými buňkami lidského myelomu byly připraveny podle Příkladu 14.2-1.
2-2. Podávání léků
Devátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo odebráno sérum zmíněných myší s transplantovanými buňkami lidského myelomu, připravených ve výše uvedeném bodě 2-1 a byl vněm kvantifikován obsah lidského IgG pomocí testu ELISA, který byl popsán výše v bodě 12.2. Usazení buněk KPMM2 v kostním morku bylo potvrzeno zvýšením hladiny lidského IgG v séru. Desátý den po transplantaci buněk KPMM2 bylo těmto myším intravenózně podáno 100 μΐ každé protilátky, připravené výše v bodě 1-1. Dále bylo od 10. dne po transplantaci myším podáváno orálně jednou denně po dobu 5 dnů 200 μΐ 0,2% roztoku CMC. Na druhé straně ve skupině, která odstávala melphalan, byl melphalanový roztok, připravený výše v odstavci 1-2, podáván v množství 100 μΐ na 10 gramů tělesné váhy (1 mg melphalanu/kg) po dobu 5 dnů od 10. dne po transplantaci buněk KPMM2.
-48CZ 296790 B6
2-3. Hodnocení protinádorového účinku pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším
Protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen podle změny množství lidského IgG v myším séru a podle doby přežívání myší.
Změny v množství lidského IgG v myším séru byly kvantifikovány u séra odebraného 35. den po transplantaci buněk KPMM2 tak, že byl zjišťován lidský IgG pomocí ELISA testu, uvedeného v Příkladu 12.2. Výsledek uvedený na Obr. 39 ukázal, že ve skupině, které byl podán kontrolní lidský IgG, bylo množství lidského IgG 35. den po transplantaci buněk KPMM2 zvýšeno asi lOOOkrát, ve srovnání s 9. dnem (den před podáním protilátek), zatímco se zdálo, že buňky KPMM2 v těchto myších rostly. Ve skupině, které byl podán melphalan, bylo množství lidského IgG v séru zvýšeno oproti stavu před podáním léku, ačkoli ne tolik, jako ve skupině s kontrolním lidským IgG. Tento výsledek ukazuje, že podání melphalanu nepotlačuje růst buněk KPMM2 dokonale. Na druhé straně u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, bylo množství lidského IgG v séru bylo v tento den menší, než 9. den po transplantaci, to platilo pro kteroukoli podanou dávku protilátek, což ukazuje, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka potlačuje růst buněk KPMM2.
Na druhé straně u doby přežívání bylo rovněž pozorováno, jak je uvedeno na Obr. 40, její prodloužení u skupiny, které byla podána pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka, oproti kontrolní skupině s kontrolním lidským IgG nebo oproti skupině s melphalanem. Z předešlého plyne, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek proti lidským myelomovým buňkám, transplantovaným myším a že protinádorový účinek zde představovaných protilátek je silnější, než používaného léku melphalanu.
Výše uvedené výsledky ukazují, že pokud byly použity efektorové buňky odvozené z lidského organizmu, myší anti-HM 1.24 protilátka měla malý cytotoxický účinek na lidské myelomové buňky, zatímco pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka a chimémí anti-HM 1.24 protilátka vykazovaly silný cytotoxicitu. Tato skutečnost ukazuje důležitost zušlechtění protilátky a poskytuje naději na užitečnost používání pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky u člověka.
Pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka vykazovala velmi silný protinádorový účinek u myší SCID s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami. Protože u člověka jsou efektorové buňky lidského původu a lymfocyty jsou normálně přítomny, je očekáván ještě silnější protinádorový účinek pozměněné lidské anti-HM 1.24 protilátky.
U modelu myelomu vykazovala pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka ve srovnání s existujícím lékem silný protinádorový účinek a proto se očekává, že pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka pomůže vytvořit lék nové generace pro léčení myelomu.
Referenční příklad 1. Konstrukce hybridomu produkujícího myší anti-HM +.24 monoklonální protilátku
Hybridom, který produkuje myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku, byl připraven pomocí metody popsané v Goto, T. a kol., Blood (1994), 84, 1992-1930.
Buněčná linie plazmatických buněk KPC-32 (1 χ 107 buněk), negativní na jaderný antigen viru Epsteina a Baarové, odvozená z kostního morku lidského pacienta s mnohočetným myelomem (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) byla dvakrát intraperitoneálně podána myším BALB/c (pěstované Charles River) každých 6 týdnů.
-49CZ 296790 B6
Aby se dále zvýšil titr vytvořených protilátek, bylo injikováno 1,5 x 106 buněk KPC-32 do sleziny myši tři dny před jejím utracením (Goto, T. a kol., Tukushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89).
Po usmrcení myši jí byla odebrána slezina a slezinné buňky odebrané podle Groth, de St.
& Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) byly použity k buněčné fúzi s myelomovými buňkami SP2/0.
Protilátky v supernatantu hybridomových kultur byly vyšetřovány testem ELISA (Posner, M.R. a kol. J. Immuno. Methods (1982) 48, 23) za použití destiček pokrytých buňkami KPC-32. Padesát tisíc buněk KPC-32 bylo suspendováno v 50 ml PBS a rozplněno do destiček s 96 jamkami 10 (dno tvaru „U“, Corning, vyrobeno Iwaki). Po blokování pomocí PBS, obsahujícího 1% hovězí serumalbumin (BSA), byl přidán supernatant z hybridomu a inkubován 2 hodiny při 4 °C. Poté reagoval s kozí protilátkou proti myšímu IgG (vyrobeno Zymed), označenou peroxidázou 1 hodinu při 4 °C, jednou promyt a nakonec byla provedena reakce s roztokem substrátu (ofenyldiamin) (vyrobeno Sumimoto Bakelite) při teplotě místnosti 30 minut.
Po ukončení reakce přidáním 2 N kyselinou sírovou, byla měřena absorbance při 492 nm pomocí přístroje na čtení destiček ELISA (vyrobeno Bio-Rad). Aby se vyloučily hybridomy produkující protilátky proti lidskému imunoglobulinu, byly supematanty pozitivních hybridomových kultur předem absorbovány s lidským sérem a byla vyšetřována jejich reaktivita sjinými subcelulámími 20 složkami. Pozitivní hybridomy byly vybrány a metodou průtokové cytometrie byla zjišťována jejich reaktivita s různými buněčnými liniemi a lidskými vzorky. Hybridomové klony, které byly nakonec vybrány, byly dvakrát klonovány, injikovány do břišní dutiny myší BALB/c, kterým byl podán přistaň, a nakonec byla z těchto myší získána ascitická tekutina.
Monoklonální protilátka z myších ascitů byla čištěna srážením síranem amonným a pomocí afinitní chromatografícké soupravy s Proteinem A (Ampure PA, vyrobeno Amersham). Vyčištěná protilátka byla konjugována s fluorescein izothiokyanátem (FITC) pomocí soupravy Quick Tag FITC konjugační soupravy (vyrobeno Boehringer Mammheim).
Výsledkem bylo, že monoklonální protilátky, produkované 30 hybridomovými klony, reagovalo s buňkami KPC-32 a RPMI 8226. Po klonování byla testována reaktivita supernatantu z těchto hybridomů sjinými buněčnými liniemi a mononukleámími buňkami, odvozenými z periferní krve.
Byly mezi nimi tři klony, které produkovaly monoklonální protilátky specificky reagující z plazmatickými buňkami. Z těchto tří byl vybrán hybridomový klon produkující monoklonální protilátku, která je nej užitečnější pro průtokovou cytometrickou analýzu a která má na komplementu závislou cytotoxícítu proti buňkám RPUI 8226 a byl nazván HM1.24. Podtřída monoklonální protilátky, produkované tímto hybridomem, byla určena testem ELISA ze použití králičích 40 protimyších protilátek, specifických k jednotlivým podtřídám (vyrobeno Zymed). Anti-HM 1.24 protilátka byla podtřídy IgG2a k. Hybridom, který produkuje anti-HM 1.24 protilátku byl uložen pro mezinárodní použití 14. září 1995 V National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Ihdustrial Scence and Technology, MÍTI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP-5233 za podmínek Budapešťské 45 smlouvy.
Referenční příklad 2. Klonování cDNA, kódující polypeptid HM 1.24 antigenu
1. Konstrukce cDNA knihovny
1) Příprava celkové RNA cDNA kódující HM 1.24 antigen, což je polypeptid specificky rozpoznávaný myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátkou, byla připravena následujícím způsobem.
-50CZ 296790 B6
Z lidské buněčné linie K.PMM2, odvozené z mnohočetného myelomu, byla připravena celková
RNA pomocí metody Chirgwin a kol. (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Tedy 2,2 x 108 buněk
KPMM2 bylo kompletně homogenizováno v 20 ml 4 M guanidin thiokyanátu (vyrobeno Nakalai tesque).
Homogenát byl nanesen na vrstvu 5,3 M chloridu česného v centrifugační zkumavce a potom centrifugován v rotoru Beckman SW40 při 31 000 ot/min při teplotě 20 °C po dobu 24 hodin, aby došlo k vy srážení RNA. Sraženina RNA byla promyta 70% etanolem, rozpuštěna v 300 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), obsahujícího 1 mM EDTA a 5% SDS. Po přidání Pronazy (vyrobeno Boehringer) do koncentrace 0,5 mg/ml, bylo inkubováno 30 minut při teplotě 37 °C. Směs byla extrahována fenolem a chloroformem a RNA vysrážena. Poté byla sraženina RNA rozpuštěna v 200 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), obsahujícího 1 mM EDTA.
2) Příprava póly (A)+RNA
Při použití 500 pg celkové RNA, připravené jak bylo popsáno výše, jakožto výchozí materiálu, poly(A)+RNA byla čištěna pomocí soupravy Fast Track 2.0m RNA Isolation Kit (vyrobeno Invitrogen), postupem uvedeným v návodu soupravy.
3) Konstrukce knihovny cDNA
Při použití 10 pg preparátu poly(A)+ RNA, připraveného jak bylo popsáno výše, jakož výchozího materiálu, byla syntetizována dvojřetězcová cDNA pomocí soupravy pro syntézu cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (vyrobeno Pharmacia), postupem uvedeným v návodu k soupravě, a za použití soupravy Directional Cloning Toolbox (vyrobeno Pharmacia) byl kní přiligován Eco RI adapter, postupem uvedeným v návodu k soupravě. Kinázování a štěpení EcoRI adaptéru pomocí restrikčního enzymu NotL bylo provedeno podle návodu přiloženého k soupravě. Dále byla dvojřetězcová cDNA s adaptérem, která měla velikost 500 bp nebo vyšší, izolována a vyčištěna pomocí 1,5% nízkotající agarózy (vyrobeno Sigma) a nakonec bylo získáno 40 μΐ dvojřetězcové cDNA s připojeným adaptérem.
Takto přiopravená dvojřetězcová cDNA s připojeným adaptérem byla ligována pomocí T4 DNA ligázy (vyrobeno GIBCO BRL) do vektoru pCOSl (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) 8-255196), který byl předem zpracován restrikčními enzymy EcoRI a Notl a alkalickou fosfatázou (vyrobeno Takara Shuzo), s tím zkonstruována knihovna cDNA. Zkonstruovaná knihovna cDNA byla transdukována do kmene Escherichia coli DH5a (vyrobeno GIBCO BRL) a celkový počet nezávislých klonů byl odhadnut na 2,5 x 106.
2. Klonování přímou expresí
1) Transfekce do buněk COS-7 cDNA byla amplifíkována pěstováním 5 x 105 klonů Escherichia coli, připravených jak bylo uvedeno výše, v médiu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sembrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu a plazmidová DNA byla získána z Eschericha coli alkalickou izolační metodou (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). Získaná plazmidová DNA byla transfekována do buněk COS-7 elektroporací za pomoci přístroje Gene Pulsar (vyrobeno BioRad).
pg čištěné plazmidové DNA bylo přidáno do 0,8 ml buněk COS-7, které byly suspendovány vPBS na koncentraci 1 x 107 buněk/ml a bylo na ně působeno elektrickými pulzy o napětí 1500 V a kapacitě 25 pF. Po 10 minutovém zotavovacím období při teplotě místnosti byly elek-51 CZ 296790 B6 troporézové buňky pěstovány pro dobu třech dní při 37 °C a 5% CO2 v médiu DMEM (vyrobeno
GIBCO BRL), doplněného 10% fetálním hovězím sérem.
2) Příprava adsorpční plotny
Adsorpční plotna pokrytá myší anti-HM 1.24 protilátkou byla připravena metodou podle B. Seed a kol., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Myši anti-HM 1.24 protilátka byla přidána do 50 mM Tris-HCl, pH 9,5 v koncentraci 10 pg/ml. Tři ml takto připraveného roztoku protilátek bylo přidáno na plotnu pro tkáňovou kultivaci o průměru 60 mm a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Poté byla plotna třikrát promyta roztokem 0,15 ml NaCl, blokována PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum 1 mM EDTA, 0,02% NaN3 a takto připravené plotny byly použity pro následující klonování.
3) Klonování cDNA knihovny
Buňky COS-7 transfekované tak, jak bylo popsáno výše, byly rozptýleny v PBS, obsahujícím 5 mM EDTA a poté jedenkrát promyty PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum. Buňky byly pak suspendovány v PBS, obsahujícím 5% fetální hovězí sérum a 0,02% NaN3 na koncentraci 1 x 106 buněk/ml, která byla pak přidána k adsorpční plotně, připravené jak bylo popsáno výše, a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po trojím opatrném promytí s PBS obsahujícím 5% fetální hovězí sérum a 0,02% NaN3, byla plazmidová DNA izolována z buněk vázaných k adsorpční plotně, za použití roztoku obsahujícího 0,6% SDS a 10 mM EDTA.
Získaná plazmidová DNA byla opět transdukována do buněk Eschericha coli DH5a. Po amplifíkaci plazmidové DNA, jakje výše uvedeno, byla DNA izolována alkalickou metodou. Získaná plazmidová DNA byla transfekována elektroporační metodou do buněk COS-7 a plazmidová DNA izolována z adsorbovaných buněk, jakje popsáno výše. Tentýž postup byl opakován ještě jednou a získaná plazmidová DNA byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a NotL. Na závěr byla potvrzena koncentrace inzertu o velikosti 0,9 kbp. Buňky Escherichia coli, transdukované části získané plazmidové DNA byly naočkovány na plotny s agarem 2-YT, obsahujícím ampicilin o koncentraci 50 pg/ml. Po kultivaci přes noc byla z jedné kolonie izolována DNA. Ta byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI aNotl a získán klon p3.19, nesoucí inzert 0,9kbp.
Sekvence bází tohoto klonu byla určena pomocí sekvenční soupravy PRISM, Dye Terminátor Cycl Sequencing Kit (vyrobeno Perkit Elmer) podle návodu, přiloženého k soustavě a DNA sekvenátoru ABI 373A (vyrobeno Perkin Elmer). Jeho aminokyselinová sekvence a sekvence bází jsou ukázány v SEQ ID NO: 103.
Komplementární DNA, která kóduje polypeptid s aminokyselinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO: 103 byla vnesena do Xbal štěpícího místa ve vektoru pUC19 a připravena jako plazmid pRS38-pUC19. Escherichia coli, obsahující tento plazmid pRS38-pUC19 byla uložena pro mezinárodní použití 5. října 1993 jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) v National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan) pod přístupovým číslem FERM BP4434 za podmínek Budapešťské smlouvy (viz Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694).
Průmyslová využitelnost
Protože pozměněná lidská anti-HM 1.24 protilátka je složena z oblasti určující komplementaritu, která pochází z myší anti-HM 1.24 protilátky, podpůrné oblasti pocházející z lidské protilátky a konstantní oblasti pocházející z lidské protilátky, má pro člověka nízkou antigenicitu, a proto se očekává, že bude používána jako léčebný prostředek, zvláště pro léčení myelomu.
-52CZ 296790 B6
Seznam organizmů, uložených pro mezinárodní použití
Název: National Instituce of Bioscience and Human Technology, Agency and Industrial Science and Technology, MITI
Adresa: Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba City, Ibalaki prefecture, Japan
1. Escherichia coli DH5a (pRS 38-pUC19)
Přístupové č.: FERM BP-4434
Datum uložení: 5, října 1993
2. Hybridom myš-myš HM 1.24
Přístupové č.: FERM BP-5233
Datum uložení: 27. dubna 1995
3. Escherichia coli DH5 a (pUC 19-RVHr-AMH-gy 1)
Přístupové č.: FERM GP-5643
Datum uložení: 29. srpna 1996
4. Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gyl)
Přístupové č.: FERM BP-5644
Datum uložení: 29. srpna 1996
5. Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gK)
Přístupové č.: FERM BP-5645
Datum uložení: 29. srpna 1996
6. Escherichia coli DH5a (pUC19-l .24L-gK)
Přístupové č. FERM BP-5646
Datum uložení: 29. srpna 1996
7. Escherichia coli DH5 a (pUC 19-RVHs-AHM-gy 1)
Přístupové č.: FERM BP-6127
Datum uložení: 29. září 1997
Claims (21)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Variabilní oblast lehkého řetězce humanizované protilátky, která se váže k polypeptidu ze SEQ ID NO: 129 (antigen HM1.24), kde variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 106.
- 2. Lehký řetězec humanizované protilátky, která se váže k polypeptidu ze SEQ ID NO: 129 (antigen HM1.24), obsahující variabilní oblast lehkého řetězce mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 106 a konstantní oblast lidského lehkého řetězce.
- 3. Lehký řetězec podle nároku 2, ve kterém konstantní oblasti lidského lehkého řetězce je Q.
- 4. Variabilní oblast těžkého řetězce humanizované protilátky, která se váže k polypeptidu ze SEQ ID NO: 129 (HM1.24 antigen), kde variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 125 nebo 128.-53CZ 296790 B6
- 5. Těžký řetězec humanizované protilátky, který se váže k polypeptidů ze SEQ ID NO: 129 (antigen HM1.24), obsahující variabilní oblast těžkého řetězce mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 125 nebo 128 a konstantní oblast lidského těžkého řetězce.
- 6. Těžký řetězec podle nároku 5, ve kterém konstantní oblastí lidského těžkého řetězce je Ql.
- 7. Humanizovaná protilátka, nebo její fragment, kterým je fragment Fab, F(ab')2, Fv nebo samostatný řetězec Fv, která se váže k polypeptidů ze SEQ ID NO: 129 (HM 1.24 antigen), obsahující lehké řetězce a těžké řetězce, kde každý lehký řetězec obsahuje variabilní oblast lehkého řetězce a konstantní oblast lidského lehkého řetězce, přičemž variabilní oblast lehkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID NO: 106, a každý těžký řetězec obsahuje variabilní oblast těžkého řetězce a konstantní oblast lidského těžkého řetězce, přičemž variabilní oblast těžkého řetězce má aminokyselinovou sekvenci ze SEQ ID NO: 125 až 128.
- 8. Humanizovaná protilátka podle nároku 7, kde konstantní oblastí lehkého řetězce je CK a konstantní oblastí těžkého řetězce je Cyl.
- 9. DNA kódující V oblast L řetězce podle nároku 1.
- 10. DNA kódující L řetězec podle nároku 2.
- 11. DNA kódující V oblast H řetězce podle nároku 4.
- 12. DNA kódující H řetězec podle nároku 5 nebo 6.
- 13. Vektor obsahující DNA podle nároku 9.
- 14. Vektor obsahující DNA podle nároku 10.
- 15. Vektor obsahující DNA podle nároku 11.
- 16. Vektor obsahující DNA podle nároku 12.
- 17. Vektor obsahující DNA podle nároku 10 a DNA podle nároku 12.
- 18. Hostitelské buňky kotransformované s vektorem podle nároku 14 a vektorem podle nároku 16.
- 19. Hostitelské buňky kotransformované s vektorem podle nároku 17.
- 20. Způsob přípravy humanizované protilátky, která se váže k polypeptidů ze SEQ ID NO: 129 (HM1.24 antigen), vyznačující se tím, že se kultivují hostitelské buňky podle nároků 18 nebo 19, a odděluje se humanizovaná protilátka.
- 21. Terapeutické činidlo pro léčení myelomu, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku humanizovanou protilátku, nebo její fragment, který je fragment Fab, F(ab')2, Fv nebo samostatný řetězec Fv podle kteréhokoliv z nároků 7 až 8.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26475696 | 1996-10-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ117399A3 CZ117399A3 (cs) | 1999-09-15 |
| CZ296790B6 true CZ296790B6 (cs) | 2006-06-14 |
Family
ID=17407753
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ0117399A CZ296790B6 (cs) | 1996-10-04 | 1997-10-03 | Variabilní oblast lehkého a tezkého retezce humanizované protilátky, humanizovaná protilátka a zpusob její prípravy, DNA, vektor, hostitelská bunka, terapeutické cinidlo |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6699974B2 (cs) |
| EP (1) | EP0960936B1 (cs) |
| KR (1) | KR100388256B1 (cs) |
| CN (2) | CN1765928A (cs) |
| AT (1) | ATE512224T1 (cs) |
| AU (1) | AU715156B2 (cs) |
| BR (1) | BR9712488A (cs) |
| CA (1) | CA2267072C (cs) |
| CZ (1) | CZ296790B6 (cs) |
| IL (1) | IL129286A0 (cs) |
| NO (1) | NO325178B1 (cs) |
| PL (1) | PL187642B1 (cs) |
| RU (1) | RU2184147C2 (cs) |
| SK (1) | SK44399A3 (cs) |
| TR (1) | TR199900722T2 (cs) |
| TW (1) | TW530064B (cs) |
| UA (1) | UA76934C2 (cs) |
| WO (1) | WO1998014580A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA978865B (cs) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE297219T1 (de) | 1997-02-12 | 2005-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antikörper als arzneimittel gegen lymphocytische tumore (ausschliesslich myelome) |
| EP0972524A4 (en) * | 1997-02-28 | 2001-03-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | LYMPHOCYTE ACTIVATION INHIBITORS |
| KR100362974B1 (ko) * | 1997-10-14 | 2002-11-30 | 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 | 림프구계 종양에 대한 항체의 증진제 |
| WO1999043703A1 (fr) * | 1998-02-25 | 1999-09-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Technique de dosage immunochimique de l'anticorps anti-hm1.24 |
| CA2343054C (en) | 1998-09-18 | 2007-10-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for detection or measurement of plasmacytoma cells |
| EP1176194B1 (en) * | 1999-05-10 | 2005-07-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of cell cultivation |
| KR20020025990A (ko) | 1999-08-23 | 2002-04-04 | 나가야마 오사무 | 에이치엠1.24 항원의 발현 증강제 |
| WO2001077362A1 (fr) * | 2000-04-06 | 2001-10-18 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Dosage immunologique d'anticorps anti hm1 . 24 |
| JP5485489B2 (ja) | 2000-08-11 | 2014-05-07 | 中外製薬株式会社 | 抗体含有安定化製剤 |
| US7592005B2 (en) * | 2000-12-28 | 2009-09-22 | Kirin Beer Kabushiki Kaisha | Monoclonal antibody |
| US7931897B2 (en) | 2001-02-07 | 2011-04-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Therapeutic agent for hematopoietic tumors |
| WO2002072615A1 (fr) | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de purification de proteines |
| CA2441228A1 (en) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Aphton Corporation | Combination treatment of pancreatic cancer |
| JP4297689B2 (ja) * | 2001-04-13 | 2009-07-15 | 中外製薬株式会社 | 抗原の発現量を定量する方法 |
| US20090191232A1 (en) * | 2001-05-04 | 2009-07-30 | Gevas Philip C | Combination therapy for the treatment of tumors |
| CN101240022B (zh) * | 2001-06-22 | 2012-07-18 | 中外制药株式会社 | 含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂 |
| CA2450898A1 (en) * | 2001-07-09 | 2003-01-23 | Aphton Corporation | Treatment and prevention of cancerous and pre-cancerous conditions of the liver, lung and esophagus |
| EP1475100B1 (en) * | 2002-02-14 | 2015-05-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Use of acetic acid for suppressing Fe ion induced problems in formulations of anti-HM1.24 or anti-IL6R antibodies |
| US20080219974A1 (en) * | 2002-03-01 | 2008-09-11 | Bernett Matthew J | Optimized antibodies that target hm1.24 |
| EP1513879B1 (en) * | 2002-06-03 | 2018-08-22 | Genentech, Inc. | Synthetic antibody phage libraries |
| EP1541165A4 (en) | 2002-08-27 | 2009-06-24 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR STABILIZING PROTEIN PREPARATION |
| US8420789B2 (en) | 2002-09-11 | 2013-04-16 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for removing DNA contaminants from a protein-containing sample |
| US7235376B2 (en) * | 2003-03-28 | 2007-06-26 | Receptor Biologix, Inc. | Gastrin hormone immunoassays |
| WO2005012531A2 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Genentech, Inc. | Antibody cdr polypeptide sequences with restricted diversity |
| JPWO2005014651A1 (ja) * | 2003-08-11 | 2006-11-24 | 中外製薬株式会社 | 糖鎖改変抗ｈｍ１．２４抗体 |
| JP4794303B2 (ja) * | 2003-10-10 | 2011-10-19 | 中外製薬株式会社 | 固形腫瘍治療剤 |
| CN102373214B (zh) * | 2003-11-05 | 2014-07-09 | 罗氏格黎卡特股份公司 | 具有增加的Fc受体结合亲和性和效应子功能的CD20抗体 |
| US20060122377A1 (en) * | 2004-02-19 | 2006-06-08 | Genentech, Inc. | CDR-repaired antibodies |
| WO2005095459A2 (en) * | 2004-03-29 | 2005-10-13 | Receptor Biologix, Inc. | Monoclonal antibodies to gastrin hormone |
| CA2580965C (en) * | 2004-09-22 | 2014-04-08 | Receptor Biologix, Inc. | Monoclonal antibodies to progastrin |
| AU2012216702B2 (en) * | 2005-08-26 | 2014-12-04 | Roche Glycart Ag | Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity |
| EP1931712B1 (en) * | 2005-08-26 | 2018-12-05 | Roche Glycart AG | Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity |
| EP2465870A1 (en) | 2005-11-07 | 2012-06-20 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with diversified and consensus VH/VL hypervariable sequences |
| US20070237764A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-10-11 | Genentech, Inc. | Binding polypeptides with restricted diversity sequences |
| WO2007074880A1 (ja) | 2005-12-28 | 2007-07-05 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 抗体含有安定化製剤 |
| WO2008036688A2 (en) * | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Xencor, Inc. | Optimized antibodies that target hm1.24 |
| PE20091174A1 (es) | 2007-12-27 | 2009-08-03 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulacion liquida con contenido de alta concentracion de anticuerpo |
| US8709424B2 (en) * | 2009-09-03 | 2014-04-29 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Anti-GITR antibodies |
| AR080428A1 (es) | 2010-01-20 | 2012-04-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Formulaciones liquidas estabilizadas contentivas de anticuerpos |
| EP2735315B1 (en) | 2011-07-19 | 2019-10-02 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Stable protein-containing preparation containing argininamide or valinamide |
| MY182178A (en) | 2011-09-01 | 2021-01-18 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for preparing a composition comprising highly concentrated antibodies by ultrafiltration |
| AU2014370873B2 (en) | 2013-12-27 | 2020-06-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for purifying antibody having low isoelectric point |
| US20170362304A1 (en) | 2014-08-20 | 2017-12-21 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for measuring viscosity of protein solution |
| MA40764A (fr) | 2014-09-26 | 2017-08-01 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité |
| US11583576B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-02-21 | Cancer Advances Inc. | Compositions and methods for inducing humoral and cellular immunities against tumors and cancer |
| US12150978B2 (en) | 2017-06-15 | 2024-11-26 | Cancer Advances Inc. | Compositions and methods for preventing tumors and cancer |
| CN109748964B (zh) * | 2017-11-01 | 2020-11-17 | 深圳宾德生物技术有限公司 | CD317单链抗体317scFv、其编码序列及制备方法和应用 |
| CN113226367B (zh) | 2018-04-06 | 2025-05-06 | Atyr医药公司 | 包括抗nrp2抗体的组合物和方法 |
| WO2019225568A1 (ja) | 2018-05-21 | 2019-11-28 | 中外製薬株式会社 | ガラス容器に封入された凍結乾燥製剤 |
| EP3805112A4 (en) | 2018-05-28 | 2022-03-09 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Filling nozzle |
| EP4037711A4 (en) | 2019-10-03 | 2024-02-14 | Atyr Pharma, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS USING ANTI-NRP2 ANTIBODIES |
| WO2023058723A1 (ja) | 2021-10-08 | 2023-04-13 | 中外製薬株式会社 | プレフィルドシリンジ製剤の調製方法 |
| AU2023262861A1 (en) | 2022-04-26 | 2024-11-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Pharmaceutical-preparation-containing syringe equipped with filter |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992019759A1 (en) * | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NO873164L (no) * | 1986-07-30 | 1988-02-01 | Teijin Ltd | Muse-humane kimaere antistoffer. |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| IL162181A (en) | 1988-12-28 | 2006-04-10 | Pdl Biopharma Inc | A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same |
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| GB9014932D0 (en) * | 1990-07-05 | 1990-08-22 | Celltech Ltd | Recombinant dna product and method |
| CA2195557C (en) * | 1994-08-12 | 2006-10-17 | Shui-On Leung | Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells |
| ATE297219T1 (de) * | 1997-02-12 | 2005-06-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Antikörper als arzneimittel gegen lymphocytische tumore (ausschliesslich myelome) |
| US20020034507A1 (en) * | 1997-02-28 | 2002-03-21 | Yasuo Koishihara | Inhibitor of lymphocyte activation |
| US7052873B2 (en) * | 1997-10-03 | 2006-05-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Natural human antibody |
| KR100362974B1 (ko) * | 1997-10-14 | 2002-11-30 | 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 | 림프구계 종양에 대한 항체의 증진제 |
| JP2006512895A (ja) * | 2002-06-28 | 2006-04-20 | ドマンティス リミテッド | リガンド |
-
1997
- 1997-03-10 UA UA99042469A patent/UA76934C2/uk unknown
- 1997-10-03 TR TR1999/00722T patent/TR199900722T2/xx unknown
- 1997-10-03 BR BR9712488-5A patent/BR9712488A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-10-03 CN CNA2005100687876A patent/CN1765928A/zh active Pending
- 1997-10-03 KR KR10-1999-7002902A patent/KR100388256B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-03 SK SK443-99A patent/SK44399A3/sk unknown
- 1997-10-03 CN CNB971992150A patent/CN1271205C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-03 PL PL97332742A patent/PL187642B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1997-10-03 RU RU99109034/13A patent/RU2184147C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1997-10-03 ZA ZA9708865A patent/ZA978865B/xx unknown
- 1997-10-03 AU AU43992/97A patent/AU715156B2/en not_active Ceased
- 1997-10-03 US US09/269,921 patent/US6699974B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-03 TW TW086114474A patent/TW530064B/zh not_active IP Right Cessation
- 1997-10-03 CZ CZ0117399A patent/CZ296790B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-10-03 WO PCT/JP1997/003553 patent/WO1998014580A1/ja active IP Right Grant
- 1997-10-03 IL IL12928697A patent/IL129286A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-10-03 EP EP97942246A patent/EP0960936B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-10-03 CA CA002267072A patent/CA2267072C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-03 AT AT97942246T patent/ATE512224T1/de not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-31 NO NO19991591A patent/NO325178B1/no unknown
-
2002
- 2002-08-13 US US10/218,253 patent/US7892543B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992019759A1 (en) * | 1991-04-25 | 1992-11-12 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Reconstituted human antibody against human interleukin 6 receptor |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Gideon, R. et al.: "Evolutionary aspects of immunoglobulin heavy chain variable region (VH) gene subgroups", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 855-859, 1983 * |
| Goto, T. et al.: "A Novel Membrane Antigen Selectively Expressed on Terminally Differentiated Human B Cells", Blood, 84(4), 1922-1930, 1994 * |
| Jeffrey, V.R. et al.: "Structure of the Human Immunoglobulin u Locus: Characterization of Embryonic and Rearranged J and D Genes", Cell, 27, 583-591, 1981 * |
| Lutz, R. et al.: "Reshaping human antibodies for therapy", Nature, 322, 323-327, 1988 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| UA76934C2 (en) | 2006-10-16 |
| KR20000048884A (ko) | 2000-07-25 |
| TW530064B (en) | 2003-05-01 |
| EP0960936B1 (en) | 2011-06-08 |
| SK44399A3 (en) | 2000-05-16 |
| TR199900722T2 (xx) | 1999-12-21 |
| NO325178B1 (no) | 2008-02-11 |
| ZA978865B (en) | 1998-04-20 |
| CN1235639A (zh) | 1999-11-17 |
| BR9712488A (pt) | 1999-10-19 |
| US20030129185A1 (en) | 2003-07-10 |
| PL187642B1 (pl) | 2004-08-31 |
| AU4399297A (en) | 1998-04-24 |
| ATE512224T1 (de) | 2011-06-15 |
| RU2184147C2 (ru) | 2002-06-27 |
| CA2267072C (en) | 2004-11-30 |
| NO991591D0 (no) | 1999-03-31 |
| US6699974B2 (en) | 2004-03-02 |
| CA2267072A1 (en) | 1998-04-09 |
| EP0960936A1 (en) | 1999-12-01 |
| HK1024261A1 (en) | 2000-10-05 |
| KR100388256B1 (ko) | 2003-06-19 |
| CN1765928A (zh) | 2006-05-03 |
| AU715156B2 (en) | 2000-01-20 |
| PL332742A1 (en) | 1999-10-11 |
| CN1271205C (zh) | 2006-08-23 |
| NO991591L (no) | 1999-06-01 |
| CZ117399A3 (cs) | 1999-09-15 |
| US20030045691A1 (en) | 2003-03-06 |
| US7892543B2 (en) | 2011-02-22 |
| IL129286A0 (en) | 2000-02-17 |
| EP0960936A4 (en) | 2005-01-19 |
| WO1998014580A1 (fr) | 1998-04-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ296790B6 (cs) | Variabilní oblast lehkého a tezkého retezce humanizované protilátky, humanizovaná protilátka a zpusob její prípravy, DNA, vektor, hostitelská bunka, terapeutické cinidlo | |
| US7052873B2 (en) | Natural human antibody | |
| JP2023109927A (ja) | ヒトのがんを治療するための特異的抗ｃｄ３８抗体 | |
| CN1649902B (zh) | 内在化抗-cd74抗体和使用方法 | |
| KR20140036274A (ko) | 항-cd52 인간화 항체 | |
| JP2019070004A (ja) | ヒトのがんを治療するための特異的抗ｃｄ３８抗体 | |
| WO2011004837A1 (ja) | 抗癌活性を有する抗体 | |
| WO2020092427A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS COMPRISING IgA ANTIBODY CONSTRUCTS | |
| JP3587664B2 (ja) | 再構成ヒト抗ｈｍ１．２４抗体 | |
| JP3587843B2 (ja) | 再構成ヒト抗ｈｍ１．２４抗体 | |
| JP4115425B2 (ja) | 再構成ヒト抗ｈｍ１．２４抗体 | |
| JP3552898B2 (ja) | リンパ球の活性化抑制剤 | |
| AU761036B2 (en) | Reconstituted human anti-human 1.24 antibody | |
| HK1023366A (en) | Reconstituted human anti-hm1.24 antibody | |
| IT201800005993A1 (it) | Complesso anticorpale ed usi derivati | |
| IT201800005991A1 (it) | Complesso anticorpale ed usi derivati | |
| HK1223116B (en) | Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers | |
| HK1181316B (en) | Notch1 binding agents and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20081003 |