ES2241599T3 - Metodo de cultivo de celulas. - Google Patents

Abstract

Un método para cultivar una célula productora de proteína, que comprende las etapas de: (a) preparar células transformadas que pueden producir constitutivamente dicha proteína; (b) aislar una célula transformada individual de las células de la etapa (a); y (c) cocultivar la célula transformada individual de la etapa (b) con células originales; en el que las células transformadas son células modificadas por ingeniería genética o células de hibridoma, en el que si la célula transformada individual es una célula modificada por ingeniería genética, las células originales son células de la misma cepa antes de la transformación, y si la célula transformada individual es una célula de hibridoma, las células originales son células inmortalizadas utilizadas para hibridación para preparar el hibridoma.

Description

Método de cultivo de células.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de cultivo de células. La presente invención se refiere también a un método de examen de células. Además, la presente invención se refiere a un método de producción de una proteína mediante cultivo celular.

Antecedentes de la técnica

Se cree que un grupo de células crecidas a partir de una célula individual está compuesto por células que tienen cada una rasgos enteramente idénticos, y la clonación de una célula individual para obtener dicho grupo de células homogéneas se ha convertido en una tecnología importante tanto académica como comercialmente. Por ejemplo, para fabricar productos farmacéuticos para los que la preparación de productos homogéneos es un prerrequisito, especialmente para la fabricación de una proteína, es necesario seleccionar, aislar y hacer crecer una célula individual que produce dicha proteína y construir así grupos de células homogéneas que producen dicha proteína. La clonación de una célula individual se ha convertido, por lo tanto, en una tecnología indispensable para la producción de proteínas, en particular de proteínas recombinantes.

El método convencional de preparación de un anticuerpo monoclonal que requiere clonación de una célula individual ha empleado el denominado método de dilución límite, en el que células de bazo obtenidas a partir de un animal inmunizado con un antígeno y células de mieloma inmortalizadas se sometían a fusión celular para preparar hibridomas, y cada célula del grupo de células heterogéneas así preparado se cultivaba conjuntamente con una célula de alimentación. Como células de alimentación, en este caso, se han utilizado células de bazo que se sometieron a tratamiento con mitomicina o radiación, para privar a las células de la capacidad de crecer.

En casos en que el cultivo fuera difícil, se añadió adicionalmente un factor de crecimiento tal como IL-6 al sistema de cultivo. Sin embargo, estos métodos tenían las desventajas de que las células de alimentación utilizadas no eran un grupo de células homogéneas, la variación debida a los procedimientos experimentales era grande, era necesario un pretratamiento para incapacitar la capacidad de crecimiento, y similares. Además, en algunas células, el crecimiento de células individuales era difícil, incluso si se añadía célula de alimentación o si se añadían un factor de crecimiento y suero bovino fetal.

Sambrook et al., 1989: "Molecular Cloning", páginas 16.32-16.36, describe un método de transfección mediada por fosfato de calcio. Después de la etapa de transfección, las células pueden incubarse durante un periodo (tal como 24-60 horas) antes de ensayar la expresión de ADN o resembrar en medio selectivo.

El documento WO 98/13388 (en forma de la traducción al inglés del documento EP0962467) se refiere a un anticuerpo contra proteína relacionada con la hormona paratiroidea humana, a un ADN que codifica el anticuerpo, a un vector recombinante que contiene el ADN, a un transformante transformado con el vector recombinante, a un método para la preparación del anticuerpo y a usos del anticuerpo.

El documento WO 98/14580 (en forma de la traducción al inglés del documento EP 0960936) se refiere a un anticuerpo anti-HM1.24 humano reformado que se predice que es útil para tratamiento médico.

Kudo et al. (1991): "A simple and improved method to generate human hybridomas", Journal of Immunological Methods, vol. 145, nº 1-2, páginas 119-126, da a conocer un método mejorado para la producción de hibridomas humanos utilizando células de mieloma irradiadas (30 Gy) como células de alimentación.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un método de cultivo de una célula o un método de clonación de células y, al mismo tiempo, proporciona un método de obtención de una proteína mediante cultivo celular, no teniendo dicho método ninguna de las desventajas encontradas en el método de dilución límite convencional.

Después de un intenso estudio, los inventores de la presente invención han encontrado que puede construirse eficazmente un grupo de células homogéneas cocultivando una célula transformada o una célula de hibridoma productora de proteína con la célula original.

Realizaciones para llevar a cabo la invención

Como se utiliza en la presente memoria "cultivar ``una'' célula transformada" significa iniciar el cultivo de una célula, y también cultivar una pluralidad de células crecidas a partir de una célula en el proceso de cultivo.

Las células transformadas, que comprenden células modificadas por ingeniería genética y células de hibridoma, son células que se manipulan para producir constitutivamente una proteína y que no necesitan inducirse para producir la proteína.

Las células modificadas por ingeniería genética designan aquellas células transformadas en las que se ha introducido ADN que codifica dicha proteína para conferir el rasgo de producción constitutiva de la proteína deseada. Pueden prepararse células modificadas por ingeniería genética ligando ADN que codifica la proteína deseada en un vector de expresión adecuado, e introduciendo el vector de expresión obtenido en una célula mediante un método utilizado habitualmente. Dichas células modificadas por ingeniería genética incluyen células en las que dicho ADN se ha insertado en el cromosoma dentro de la célula transformada y células en las que el ADN se ha retenido fuera de la célula.

Las células adecuadas para la preparación de células modificadas por ingeniería genética incluyen todos los tipos de células hospedadoras y, preferiblemente, pueden citarse células eucarióticas. Como células eucarióticas, pueden citarse células animales tales como células de mamífero, células de levadura, células de insecto y similares. Como células de mamífero, preferiblemente pueden citarse células CHO, COS, de mieloma, BHK (riñón de hámster recién nacido), Hela, Vero y otras células. Como células CHO, pueden utilizarse preferiblemente CHO dhfr- (Prot. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77: 4216-4220) que carecen del gen dhfr, CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60: 1275) o CHO DG44 (Urlaub, G. et al., Cell (1983) 33(2): 405-412).

Las células de hibridoma designan células híbridas preparadas fusionando células que producen constitutivamente la proteína deseada, tales como células productoras de inmunoglobulina, con células inmortalizadas compatibles con las mismas, tales como células de mieloma (P3K, YB2/0, U266). Además, las células de hibridoma incluyen células inmortalizadas, obtenidas por un medio de inmortalizar células, que producen la proteína deseada, por ejemplo mediante el uso del virus de Epstein-Barr (EBV). Como células productoras de la proteína deseada que se utilizan para preparar células de hibridoma, pueden utilizarse células animales tales como células de ratones, ratas y seres humanos y similares.

Células originales designa células, antes de transformarse, de las mismas cepas que las células productoras de proteína. Como células originales, específicamente, se utilizan preferiblemente aquellas células que se utilizaron para preparar células productoras de proteína. Las células originales de células modificadas por ingeniería genética son aquellas células que, por ejemplo, se utilizaron para introducir ADN que codifica la proteína deseada en la construcción de células transformadas y que no se han transformado. Las células originales de células de hibridoma son células inmortalizadas para uso en fusión con células productoras de inmunoglobulina.

Genes marcadores detectables designa genes que confieren el rasgo que posibilita sólo la supervivencia selectiva de las células productoras de la proteína deseada. Según la presente invención, las células transformadas que producen proteína contienen preferiblemente un gen marcador detectable. Preferiblemente, las células originales no contienen genes marcadores detectables.

Como genes marcadores detectables para uso en células modificadas por ingeniería genética, pueden citarse el gen de aminoglicósido transferasa (APH), el gen de timidina quinasa (TK), el gen de xantina guanina fosforibosiltransferasa de E. coli (HPRT), el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) y similares. Por tanto, para destruir las células originales manteniendo vivas las células transformadas productoras de proteína, es sólo necesario cultivar las células en unas condiciones en las que las células no puedan sobrevivir sin la expresión del gen marcador detectable. Dichas condiciones incluyen la adición de G418 y metotrexato, y similares.

Como gen marcador detectable para uso en las células de hibridoma, pueden citarse HPRT y similares. El gen marcador detectable puede introducirse en las células inmortalizadas a someter a fusión, o las células inmortalizadas que contienen ya el gen marcador detectable pueden fusionarse con las células que producen la proteína deseada. Las células que contienen el gen marcador detectable pueden cultivarse en condiciones en las que las células no puedan sobrevivir sin la expresión del gen marcador detectable. Dichas condiciones incluyen cultivar en un medio libre de hipoxantina-timidina, y similares.

La proteína producida por las células puede ser cualquier proteína que sea útil o biológicamente activa. Dichas proteínas incluyen hormonas (hormonas liberadoras de hormona pituitaria, oxitocinas, vasopresinas, hormona paratiroidea (PTH), péptidos relacionados con la hormona paratiroidea (PTHrP), hormona de crecimiento (GH), prolactina, gastrina, secretina, colecistoquinina, insulina, glucagón, calcitonina), enzimas (por ejemplo glucosa oxidasa), inhibidores enzimáticos (por ejemplo quimostatina), linfocinas o citocinas (por ejemplo interleucina-1, (IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, factor de necrosis tumoral (TNF), interferón-\alpha (IFN\alpha), interferón-\beta, interferón-\gamma, interferón-\omega, interferón-\tau), factores hematopoyéticos (por ejemplo eritropoyetina (EPO), tromboplastina (TPO), factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor estimulante de macrófago (M-CSF), factor estimulante de colonia de macrófago granulocito (GM-CSF), factor de crecimiento de células madre (SCF), factores de crecimiento (por ejemplo factor de crecimiento epitelial vascular (VEGF), factor de crecimiento neuronal (NGF), factor de crecimiento de fibroblasto (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta), factor inhibidor de la migración de leucocitos (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), oncostatina M (OSM)), inmunoglobulinas (por ejemplo anticuerpo humano, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado o fragmentos de los mismos, Fv, scFV (Fv monocatenario), scFV dimérico) y similares. Cuando la célula es una célula de hibridoma, la proteína es específicamente una inmunoglobulina.

El cultivo o clonación de células puede llevarse a cabo utilizando un método utilizado habitualmente. En primer lugar, se suspenden células que producen la proteína deseada en un medio de cultivo apropiado. El medio utilizado puede ser uno utilizado habitualmente, tal como DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM y similares. El medio puede estar combinado con suplementos séricos tales como suero de ternero fetal (FCS) o con un medio libre de suero. El pH del medio está preferiblemente en el intervalo de aproximadamente 6-8.

Las células utilizadas están preferiblemente en la fase de crecimiento logarítmico. Cuando las células han formado agrupaciones, pueden separarse utilizando una jeringuilla de calibre adecuado. La suspensión celular obtenida puede diluirse como sea apropiado, y sembrarse en una placa de cultivo celular a la proporción de una célula/pocillo.

Las células originales pueden prepararse de manera similar, y se añaden aproximadamente 1.000-20.000 células originales, preferiblemente aproximadamente 3.000-10.000 células, y más preferiblemente 5.000-10.000 células, a un pocillo que tiene una célula de interés. La placa puede cultivarse después en condiciones apropiadas. El cultivo puede llevarse a cabo generalmente aproximadamente a 30-40ºC durante aproximadamente 96-120 horas y, según sea necesario, bajo una concentración apropiada de dióxido de carbono, puede llevarse a cabo el reemplazo, aireación y agitación del medio.

Puesto que las células cultivadas contienen preferiblemente un gen marcador detectable mientras que las células originales no, las células originales se destruyen en las condiciones en las que el gen marcador detectable se expresa, dejando vivas las células de interés. Las condiciones en las que el gen marcador detectable puede expresarse pueden ser una adición de metotrexato al medio de cultivo cuando el gen marcador detectable es dhfr. Después de la expresión del gen marcador detectable, se continúa el cultivo durante un periodo apropiado de tiempo, y después se examina el cultivo, por ejemplo al microscopio, para confirmar la formación de colonias de las células que sobrevivieron. Después de la confirmación de la formación de colonia, se transfiere el cultivo a un recipiente de cultivo mayor según sea apropiado para un cultivo expandido. Puesto que las colonias obtenidas derivan de células individuales, la formación de colonia indica que las células se han clonado.

Se continúa el cultivo de la colonia obtenida y, según sea apropiado, se somete a subcultivo y/o cultivo expandido, y la proteína deseada producida puede recuperarse del sobrenadante de cultivo o de las células para obtener proteína homogénea. La proteína obtenida puede purificarse mediante combinación, según sea apropiado, de cromatografía en columna, etc., en un método conocido por los expertos en la técnica, y después puede almacenarse y utilizarse como se desee. Puesto que la proteína obtenida mediante el cultivo expandido de una célula individual es homogénea, la purificación posterior es también fácil y puede obtenerse una proteína con una mayor pureza en una gran cantidad. Es por tanto particularmente útil para reducir el coste de producir productos farmacéuticos. Como columna para uso en cromatografía de afinidad, puede utilizarse una cromatografía de columna de afinidad en la que se ha unido un anticuerpo a la proteína. Si la proteína es un anticuerpo, puede utilizarse una columna de proteína A o una columna de proteína G.

Específicamente, como columna que emplea proteína A, pueden citarse Hyper D, Sepharose F.F. (Pharmacia) y similares. Pueden combinarse adecuadamente cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía en columna de fase inversa, cromatografía en columna de filtración por gel, etc. ("Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual", ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Además de cromatografía en columna, puede utilizarse un método de purificación en bruto tal como un método de membrana de ultrafiltración, y un método de sulfato de amonio.

Las proteínas clonadas y producidas por la clonación de una célula individual de la presente invención pueden utilizarse específicamente como composiciones farmacéuticas. Aunque el método de administración depende de la actividad de las proteínas, pueden administrarse sistémica o localmente por vías parenterales. Por ejemplo, puede seleccionarse la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal, y el método de administración puede seleccionarse, según sea apropiado, dependiendo de la edad y del estado patológico del paciente. Además, dependiendo de la vía de administración, las composiciones farmacéuticas pueden contener vehículos y/o aditivos farmacéuticamente aceptables. En particular, pueden añadirse tensioactivos, agentes isotónicos, estabilizantes, tampones, agentes solubilizantes, analgésicos, reductores que contienen azufre y antioxidantes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención se explicará ahora con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Cocultivo con células originales

Se hicieron pasadas y se cultivaron células CHO DG44, las células originales, en medio CHO-S-SPM II (DPM) (fabricado por GIBCO-BRL) suplementado con 1% de suplemento HT (fabricado por GIBCO-BRL), y se utilizaron células CHO DG44 en la fase de crecimiento logarítmico. Se prepararon células CHO DG44 en las que se ha integrado un gen que codifica el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado mediante el método descrito en la publicación de patente internacional WO 98/14580. Se utilizaron las células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado así obtenidas (se utilizaron un vector de expresión HEF-RVHs-AHM-g\gammal (FERM BP6127) para cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado y un vector de expresión HEF-RVLa-AHM-g\kappa (FERM BP5645) para cadena L de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado para transformar simultáneamente las células CHO) como células transformadas.

Se prepararon células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado con un método similar al de la publicación de patente internacional WO 98/14580. Las células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado se subcultivaron en un medio CD-CHO (fabricado por GIBCO-BRL) suplementado con G418 640 \mug/ml (fabricado por GIBCO-BRL), MTX 50 nmol/l y L-glutamina 8 mmol/l antes del uso. Puesto que estas células habían formado ligeramente agrupaciones celulares, se realizó un tratamiento con jeringuilla con una aguja de 23G para separar las células.

Después de lavar las células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado con un medio utilizado para subcultivar, se ajustó la concentración celular a una célula/pocillo, utilizando dicho medio para obtener 250 ml de una suspensión celular (20 células/ml). Se ajustó la concentración celular de las células originales, células CHO DG44, utilizando el mismo medio, a 100 células/pocillo, 1.000 células/pocillo y 10.000 células/pocillo para obtener 150 ml de una suspensión celular (1 x 10^{3} células/ml, 1 x 10^{4} células/ml, 1 x 10^{5} células/ml).

Se sembraron 0,05 ml de la suspensión de células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado y 0,1 ml de cada una de las suspensiones de células CHO DG44 en una placa de 96 pocillos. Así, cada pocillo contenía una célula CHO productora de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado. De forma similar, se prepararon 15 placas de 96 pocillos para un total de 1440 muestras para cada suspensión.

Después de cultivar en un incubador a 5% de CO_{2} a 37ºC durante 14 días, se examinaron al microscopio. De los pocillos en los que se confirmó la formación de colonia, se recogieron células y se sometieron a cultivo expandido en una placa de 24 pocillos (1 ml) utilizando el mismo medio de cultivo para asegurar un crecimiento estable de las células. Se muestra el número de pocillos para los que se confirmaron colonias de las células en la Tabla
1.

TABLA 1 Resultado de clonación del ensayo de adición de cepa original

(a)
Número de células para la cepa original	Número de colonias formadas
100 células/pocillo	0
1.000 células/pocillo	6
10.000 células/pocillo	58
Total	64
(b)
Número de células para la cepa original	Número de colonias formadas
1.000 células/pocillo	6
10.000 células/pocillo	30
Total	36

En la Tabla 1, (a) indica el número de colonias seleccionadas durante el examen microscópico (concretamente, el número de colonias subcultivadas en 24 pocillos) (día 14), y (b) indica el número de colonias expandidas a partir de placas de 24 pocillos a placas de 6 pocillos.

No se formaron colonias de células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado en los pocillos cocultivados con 100 células/pocillo de células CHO DG44, mientras que en los pocillos cocultivados con 1.000 células/pocillo o 10.000 células/pocillo de células CHO DG44, se confirmaron 6 y 30 colonias, respectivamen-
te.

Por tanto, esto sugiere que mediante el cocultivo con 1.000 células/pocillo ó 10.000 células/pocillo de células originales puede hacerse crecer incluso una concentración de una célula/pocillo de la célula transformada para obtener clones individuales, y un método que utiliza cocultivo con células originales posibilitaba la clonación de célula individual que se había considerado anteriormente imposible. Las colonias que exhibieron un crecimiento estable en el cultivo expandido utilizando placas de 24 pocillos se cultivaron en presencia de G418 640 \mug/ml y MTX 50 nM, obteniéndose así células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado homogéneas.

Ejemplo 2 Cultivo expandido

Se cultivaron durante 11 días 1 x 10^{5} células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado que se sometieron a cultivo expandido en medio CHO-S-SFM II (6 litros x tres tanques) con adición de Primatone 10 g/l en condiciones de pH 7,2, saturación del aire DO60% y a 60 rpm. Se combinaron los sobrenadantes de cultivo de los tres tanques, se filtraron por Sartobran PH Capsule (Sartorius), se cargaron en una columna rProtein A FF (Pharmacia), se lavaron con NaCl 1M/tampón citrato-fosfato 10 mM, pH 7,5 y tampón citrato-fosfato 10 mM, pH 7,5 y después se eluyeron con HCl 2,5 mM, pH 2,7.

Para retirar las endotoxinas, se alimentó directamente Kurimover (Kurita Kogyo) a la fracción de elución de proteína A obtenida, que se agitó a 4-10ºC durante 6 horas. Al filtrar con un filtro de celulosa acetato de 0,2 \mum (Corning), se obtuvieron 2,65 ml de una solución de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado. Se confirmó que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado obtenido era casi homogéneo mediante análisis de HPLC en fase inversa.

Ejemplo 3

Utilizando células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado y células CHO productoras de anticuerpo anti-PHTrP humanizado, se compararon la clonación de célula individual mediante cocultivo con las células originales, células CHO DG44, y la clonación de célula individual mediante otros métodos (el método del medio acondicionado, el método de adición de suero y el método de lisado celular).

Se prepararon células CHO DG44 en las que se había integrado un gen que codifica el anticuerpo anti-PTHrP humanizado mediante el método descrito en la publicación de patente internacional WO 98/13388. Se utilizaron las células CHO productoras de anticuerpo anti-PTHrP humanizado así obtenidas (se utilizaron un vector de expresión hMBC1HcDNA/pUC19 (FERM BP-5629) para cadena H de anticuerpo anti-PTHrP humanizado y un vector de expresión hMBC1Lq \lambdacDNA/pUC19 (FERM BP-5630) para cadena L de anticuerpo anti-PTHrP humanizado para transformar simultáneamente las células CHO) como células transformadas. Además, se utilizó medio GIBCO CHO-S-SFMII-modificado/CD-CHO (la mitad del medio) como medio fresco para células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, y se utilizó medio GIBCO CHO-S-SFMII como medio fresco para células CHO productoras de anticuerpo anti-PTHrP humanizado.

(1) Método de cocultivo con células originales

Se diluyeron las células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado o las células CHO productoras de anticuerpo anti-PTHrP humanizado el día 1 de cultivo en un medio fresco, de tal modo que cada 0,2 ml del mismo contenga una célula, a la que se añadieron 5.000.000 células originales, células CHO DG44, y se suspendieron. Se inoculó la suspensión celular a 5 placas de 96 pocillos a 0,2 ml/pocillo.

(2) Método del medio acondicionado (CM)

Se filtró el sobrenadante después de centrifugar el cultivo celular transformado el día 1 de cultivo por un filtro de 0,2 \mum. Se añadió al filtrado la suspensión a una cantidad equivalente a 500 células transformadas el día 1 de cultivo, para preparar un volumen final de 100 ml. Se inoculó la suspensión celular a 5 placas de 96 pocillos a 0,2 ml/pocillo. En un método que emplea el líquido de cultivo el día 3 de cultivo, se utiliza el sobrenadante de centrifugación del líquido de cultivo celular transformado el día 3 de cultivo de manera similar.

(3) Método de adición de suero

Se diluyó el líquido de cultivo de células transformadas el día 1 de cultivo en medio fresco para obtener una célula/200 \mul. Se añadieron 10 ml de FBS (suero bovino fetal I.S.C. nº 3000, lote nº 300050933) a 90 ml de este diluyente y se suspendieron en 5 placas de 96 pocillos a 0,2 ml/pocillo.

(4) Método de adición de lisado celular

Se diluyó el líquido de cultivo de células transformadas el día 1 de cultivo en medio fresco para obtener una célula/200 \mul. Se suspendió el precipitado del lisado celular en este diluyente, que se sembró en 5 placas de 96 pocillos a 0,2 ml/pocillo. Se preparó el lisado celular anterior como sigue. Así, después de centrifugar 5.000.000 células de la cepa original el día 3 de cultivo, se suspendieron en 10 ml de agua estéril. Después de congelar a -80ºC y repetir el descongelamiento dos veces a 37ºC, se centrifugó a 3500 rpm durante 60 minutos. Se aclaró el precipitado con 10 ml de agua estéril y se centrifugó de nuevo a 3500 rpm durante 60 minutos para preparar un lisado celular.

Resultado

Se observó la aparición de colonias de células CHO productoras de anticuerpo anti-HM1.24 humanizado y células CHO productoras de anticuerpo anti-PTHrp humanizado para cada método el día 20 y 21 después de la siembra, y se muestra la tasa de aparición de colonias por placa en la Tabla 2. Como resultado, fue posible la clonación de una célula individual para ambas células mediante cocultivo con la célula de la cepa original. Cuando la clonación de célula individual era imposible con otros métodos, como se observó para el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado, la clonación de célula individual mediante cocultivo con las células de la cepa original acreditó ser eficaz. Cuando se sembraron 1, 3, 10, 30 y 100 células/pocillo sólo con las células transformadas como control, se formaron colonias para cualquiera de las células transformadas cuando se sembraron 30 ó 100 células, pero no se observaron colonias cuando se sembraron 10 células transformadas o menos.

TABLA 2 Tasa de aparición de colonias en cada método de clonación

(A) Anticuerpo anti-PTHrP (día 20)	Número de colonias aparecidas
Método de clonación	(colonias/placa)
Cocultivo con la cepa original	23,0
Método del medio acondicionado (día 1)	10,6
Método del medio acondicionado (día 3)	6,6
Método de adición de suero	27,2
Método de adición de lisado celular	4,6
(B) Anticuerpo anti-HM1.24 humanizado (día 21)	Número de colonias aparecidas
Método de clonación	(colonias/placa)
Cocultivo con la cepa original	36,4
Método del medio acondicionado (día 1)	0,0
Método del medio acondicionado (día 3)	0,0
Método de adición de suero	0,0
Método de adición de lisado celular	0,2

Aplicabilidad industrial

La presente invención posibilitó el cultivo o clonación de una célula que produce una proteína deseada.

Claims (12)

1. Un método para cultivar una célula productora de proteína, que comprende las etapas de:

(a) preparar células transformadas que pueden producir constitutivamente dicha proteína;

(b) aislar una célula transformada individual de las células de la etapa (a); y

(c) cocultivar la célula transformada individual de la etapa (b) con células originales;

en el que las células transformadas son células modificadas por ingeniería genética o células de hibridoma, en el que si la célula transformada individual es una célula modificada por ingeniería genética, las células originales son células de la misma cepa antes de la transformación, y si la célula transformada individual es una célula de hibridoma, las células originales son células inmortalizadas utilizadas para hibridación para preparar el hibridoma.

2. El método según la reivindicación 1, en el que dicha célula de hibridoma o la célula modificada por ingeniería genética es una célula que contiene un gen marcador detectable.

3. El método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la proteína producida mediante la célula modificada por ingeniería genética es una sustancia biológicamente activa.

4. El método según la reivindicación 3, en el que la sustancia biológicamente activa es una hormona, una enzima, una linfocina, una citocina, un factor de crecimiento o un factor de transcripción, o un derivado de los mismos.

5. Un método según la reivindicación 1, en el que la proteína producida por la célula de hibridoma o la célula modificada por ingeniería genética es una inmunoglobulina o un derivado de una inmunoglobulina.

6. El método según la reivindicación 5, en el que la inmunoglobulina es un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de rata, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

7. El método según la reivindicación 6, en el que el anticuerpo humanizado es anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.

8. El método según la reivindicación 5, en el que el derivado de una inmunoglobulina es Fab, F(ab')2 o un Fv monocatenario.

9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula transformada es una célula de mamífero, una célula de levadura o una célula de insecto.

10. El método según la reivindicación 9, en la que la célula de mamífero es la célula CHO.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el número de células originales a cocultivar es de aproximadamente 1.000 a 10.000.

12. Un método para producir una proteína, que comprende las etapas de:

(a) preparar células transformadas que pueden producir constitutivamente dicha proteína;

(b) aislar una célula transformada individual de las células de la etapa (a);

(c) cocultivar la célula individual de la etapa (b) con aproximadamente 1.000 a 10.000 células originales de la célula transformada para seleccionar una célula transformada que tiene la propiedad deseada;

(d) someter la célula transformada seleccionada en la etapa (c) a un subcultivo y/o un cultivo expandido; y

(e) recoger dicha proteína del sobrenadante de cultivo o la célula;

en el que las células transformadas son células modificadas por ingeniería genética o células de hibridoma, en el que si la célula transformada individual es una célula modificada por ingeniería genética, las células originales son células de la misma cepa antes de la transformación, y si la célula transformada individual es una célula de hibridoma, las células originales son células inmortalizadas utilizadas para hibridación para preparar el hibridoma.