KR20020013538A - 세포의 배양방법 - Google Patents

세포의 배양방법 Download PDF

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야수코 오자키
야수오 코이시하라
신-이치 카이호
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나가야마 오사무
츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
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Abstract

단백질을 생산하는 세포의 배양방법에 있어서, 구성적으로 이 단백질을 생산할 수 있는 1개의 형질전환세포를 이 세포의 친세포와 공배양하는 것을 특징으로 하는 방법.

Description

세포의 배양방법{METHOD OF CELL CULTIVATION}
단일 세포에서 증식한 세포군은, 세포군을 구성하는 하나 하나의 세포가 완전히 동일한 형질을 갖는 것으로 생각되어지고 있고, 이와 같은 균질한 세포군을 얻기 위한 단일세포클로닝은, 학술적으로도, 상업적으로도 중요한 기술로 되어 있다. 예를 들면, 균질한 제품을 생산하는 것이 필요한 의약품의 제조, 특히 균질한 단백질제제를 제조하기 위하여는, 이 단백질을 생산하는 단일의 세포를 선택, 분리하고, 그리고 증식시키는 것으로, 이 단백질을 생산하는 균질한 세포군을 구축할 필요가 있다. 따라서, 단백질, 특히 재조합 단백질을 생산함에 있어서는, 단일세포클리닝은 없어서는 안되는 기술로 되어 있다.
이제까지, 단일세포클로닝을 필요로하는 모노클로날항체의 제조에 있어서는, 항원으로 면역한 동물에서 얻어지는 비장세포와 불사화(不死化)한 미엘로마세포를 세포융합에 의해 하이브리도마를 제조하고, 제조된 불균질한 하이브리도마세포군의 하나 하나의 세포를 피더 세포(feeder cell)와 함께 배양하는, 소위 한계희석법이사용되어 왔었다. 이 때, 피더로서는 마이토마이신처리 또는 방사선처리하는 것으로 증식능을 결여시킨 비장세포 등이 사용되어 왔었다.
또, 배양이 곤란한 경우에는, IL-6 등의 증식인자를 배양계에 더욱 더 첨가하는 것이 행해져 왔었다. 그러나, 이들의 방법에서 사용되는 피더 세포는 균일한 세포군에서는 없고, 실험조작에 의한 편차가 큰 것, 증식능을 결여시키기 위한 전처리가 필요한 것 등의 결점이 있다. 또한, 세포에 따라서는, 피더 세포의 첨가, 또한 증식인자나 소태아혈청의 첨가를 행해도, 단일 세포에서 증식시키는 것이 곤란한 경우도 있었다.
본 발명은, 세포의 배양방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은 세포의 클로닝방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포배양에 의해 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 종래의 한계희석법의 결점을 갖지 않는, 1개 세포의 배양방법, 또는 세포의 클로닝방법을 제공함과 동시에, 세포배양에 의해 단백질을 얻는 방법을 제공한다.
본 발명자들은, 예의 연구의 결과, 단백질을 생산하는 형질전환세포 또는 하이브리도마세포 1개를 그의 친세포와 공배양함으로써, 효율 좋고 균질한 세포군을 구축할 수 있는 것을 발견했다.
<발명의 실시의 형태>
본 발명에 있어서, 「"1개"의 형질전환세포를 배양한다」라 함은, 1개의 세포에서 배양을 개시하는 것을 의미하며, 그의 배양의 과정에서 1개의 세포에서 증가한 복수의 세포를 배양하는 것을 포함하는 것은 말할 것도 없다.
형질전환세포라 함은, 유전자조작세포 및 하이브리도마세포를 포함하고, 구성적, 즉 단백질을 생산하도록 조작된 세포에 있어서, 그의 단백질의 생산을 유도할 필요가 없는 세포이다.
유전자조작세포라 함은, 소망하는 단백질을 구성적으로 생산하는 형질을 부여하기 위하여, 이 단백질을 코드하는 DNA를 도입한 형질전환세포를 의미한다. 유전자조작세포는, 소망하는 단백질을 코드하는 DNA를 적절한 발현벡타와 연결하고, 얻어진 발현벡타를 통상 사용되는 방법에 의해 세포에 도입해서 제조된다. 이와 같은 유전자조작세포에는, 이 DNA가 형질전환한 세포내부의 염색체에 삽입되어 있는 세포나 염색체 외부에 유지되어 있는 세포를 포함한다.
유전자조작세포의 조제에 적합한 세포로서, 모든 종류의 숙주세포가 포함되지만, 바람직하기는 진핵세포를 들 수가 있다. 진핵세포로서는, 동물세포, 예를 들면, 포유동물세포, 효모세포, 곤충세포 등을 들 수가 있다. 포유류세포로서는, 바람직하기는 CHO, COS, 미엘로마, BHK(baby hamster kindney), HeLa, Vero 등을 들 수가 있다. CHO 세포로서는, 특히 dhfr유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr CHO (Proc. Natl, Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220), CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275) 또는 CHO DG44 (Urlaub, Get al., Cell (1983) 33 (2) 405-412)을 적합하게 사용할 수가 있다.
하이브리도마세포라 함은, 소망하는 단백질을 구성적으로 생산하는 세포, 예를 들면 면역글로불린생산세포와 그 것에 적합성을 갖는 불사화세포(不死化細胞), 예를 들면 골수종세포(P3K, YB2/0, U266)를 융합시켜서 제조되는 하이브리드세포를의미한다. 그 외에, 하이브리도마세포로서, 소망하는 단백질을 생산하는 세포를 불사화시키는 수단, 예를 들면 Epstein-Barr 바이러스(EBV)의 사용 등에 의해 얻어지는 불사화세포도 포함한다. 하이브리도마세포의 제조에 제공되는 소망하는 단백질을 생산하는 세포는, 동물세포, 예를 들면 마우스, 랫트, 인간 등의 세포가 사용된다.
친세포라 함은, 단백질을 생산하는 세포와 같은 균주의 형질전환되기 전의 세포를 의미한다. 친세포로서는, 특히 단백질을 생산하는 세포의 조제에 사용한 세포가 바람직하다. 유전자조작세포의 친세포는, 예를 들면, 형질전환세포의 제작시에, 소망하는 단백질을 코드하는 DNA를 도입하기 위하여 사용한 세포이고, 형질전환하지 않은 세포이다. 하이브리도마세포의 친세포는, 예를 들면, 면역글로빈을 생산하는 세포와 융합하기 위하여 사용되는 불사화세포이다.
선택마커유전자라 함은, 소망하는 단백질을 생산하는 세포만 선택적으로 생존시키는 성질을 부여하는 유전자를 의미한다. 본 발명에 있어서, 단백질을 생산하는 형질전환세포는, 바람직하기는 선택마커유전자를 갖고 있다. 친세포는, 바람직하기는 선택마커유전자를 갖지 않는다.
유전자조작세포에 사용되는 선택마커유전자로서, 아미노글리코시드 트란스페라제(APH)유전자, 티미딘 키나제(TK)유전자, 대장균 키산틴 구아닌 포스포리보실 트란스페라제(HPRT)유전자, 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)유전자 등을 들 수가 있다. 따라서, 단백질을 생산하는 형질전환세포를 생존시키고, 또한 친세포를 사멸시키기 위하여는, 선택마커유전자가 발현되지 않으면 생존시킬 수 없는 조건하에서 세포를 배양하면 좋다. 이와 같은 조건으로서, G418, 메토트렉세이트 (metotrexate)의 첨가 등을 들 수가 있다.
하이브리도마세포에 사용되는 선택마커유전자로서, HPRT 등을 들 수가 있다. 융합에 제공되는 불사화세포에 선택마커유전자를 도입하든가, 또는 이미 선택마커유전자를 갖는 불사화세포를 사용하여, 이 세포와 소망하는 단백질을 생산하는 세포를 융합하면 좋다. 선택마커유전자를 갖는 세포를 선택마커유전자가 발현되지 않으면 생존할 수 없는 조건하에서 배양하면 좋다. 이와 같은 조건으로서, 히포크산틴-티미딘이 없는 배지에 의한 배양 등을 들 수가 있다.
세포가 생산하는 단백질은, 유용한 단백질 또는 생리학적으로 활성인 단백질이면 어느 것이라도 좋고, 바람직하기는 인간단백질이다. 이와 같은 단백질으로서는, 호르몬[뇌하수체호르몬방출인자, 옥시토신, 바소프레신, 부갑상선호르몬(PTH), 부갑상선호르몬관련펩티드(PTHrP), 성장호르몬(GH), 프로락틴, 가스트린, 세크레틴, 콜레시스토킨, 인슐린, 글루카곤, 갈시토닌], 효소(예를 들면, 글루코스옥시다제), 효소저해제(예를 들면, 키모스타틴), 림포카인 또는 사이토카인[예를 들면, 인터루킨-1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15 종양괴사인자(TNF), 인터페론 α(IFNα), 인터페론 β, 인터페론 γ, 인터페론 ω, 인터페론 τ], 조혈인자 [예를 들면, 에리트로포이틴 (EPO), 트롬보포이틴(TPO), 과립구 콜로니자극인자(G-CSF), 마크로파지-디콜로니-자극인자(M-CSF), 과립구 마크로파지-디클로니-자극인자(GM-CSF), 혈액간세포증식인자(SCF), 성장인자 또는 증식인자(예를 들면, 혈관상피성장인자(VEGF), 신경성장인자(NGF), 섬유아세포증식인자(FGF), 혈소판유래증식인자(PDGF), 트랜스포밍증식인자 β(TGF-β), 백혈구유주저지인자(LIF), 모양체신경영양인자(CNTF), 온코스타틴 M (OSM)], 면역글로불린[예를 들면, 인간항체, 키메라항체, 인간형화항체 또는 이들의 단편, Fv, scFv (single chain Fv), scFv 다이머]등을 들 수가 있다. 단백질은, 또, 세포가 하이브리도마세포인 경우, 특히 면역글로불린이다.
세포의 배양 또는 클로닝은, 통상 사용되는 조건을 사용하면 좋다. 처음에, 소망하는 단백질을 생산하는 세포를 적절한 배양액에 현탁한다. 배양액은, 통상 사용되는 배양액으로 좋고, 예를 들면 DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM 등을 사용할 수가 있다. 배양액에는 혈청보액, 예를 들면 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용하는 것도 가능하고, 또는 혈청을 함유하지 않는 배양액을 사용해도 좋다. 배양액의 pH는 약 6~8인 것이 바람직하다.
세포는, 바람직하기는 대수증식기에 있는 세포를 사용한다. 세포가 클러스터(clusters)를 형성하고 있는 경우, 적당한 구경의 시린지를 사용해서 시린징함으로써 세포를 풀수가 있다. 얻어진 세포현탁액을 적당히 희석하여, 세포배양용 플레이트에 세포1개/웰이 되도록 파종한다.
친세포도 동일하게 해서 조제하여, 약 1,000~20,000개, 바람직하기는 약 3,000~10,000개, 더욱 바람직하기는 약 5,000~10,000개의 친세포를 목적 세포 1개가 함유되는 웰에 첨가한다. 그리고, 적절한 조건하에서 배양하면 좋다. 배양은 통상 약 30~40℃에서 약 96~120시간 행하고, 필요에 따라서 적절한 이산화탄소농도하에서, 배지의 교환, 통기, 교반을 행한다.
배양되는 세포는 바람직하기는 선택마커유전자를 가지며, 친세포는 이 것을 갖지 않기 때문에, 건택마커유전자가 발현하는 조건으로 함으로써 친세포는 사멸하고, 목적하는 세포가 살아 남는다. 선택마커유전자가 발현하는 조건은, 예를 들면 선택마커유전자가 dhfr인 경우, 메토트렉세이트를 배양액에 첨가하면 좋다. 선택마커유전자가 발현된 후, 적절한 시간 동안 배양을 계속하고, 검경(檢鏡), 예를 들면 현미경하에서 관찰함으로써 살아 남은 세포의 콜로니형성을 확인한다. 콜로니형성이 확인되면, 세포군을 적당히 큰 세포배양기에 옮겨서, 확대배양을 할 수가 있다. 얻어진 콜로니는 1개의 세포에 유래하기 때문에, 콜로니형성이 확인되면 세포의 클로닝이 행해진 것을 의미한다.
얻어진 콜로니의 배양을 계속하고, 적당히 계대 및/또는 확대 배양하여, 생산된 소망의 단백질을 배양상징액 또는 세포로부터 회수함으로써, 균질한 단백질을 얻을 수가 있다. 얻어진 단백질은, 적당히, 칼럼 크로마토그라피 등을 조합해서 사용하고, 당업자에게 공지된 방법으로 정제하여 소망에 따라 보존해서 사용할 수가 있다. 단일 세포를 확대배양해서 얻어지는 단백질은 균질하므로, 그 후 정제도 용이하고, 더욱 순도가 높은 단백질을 고수량으로 얻을 수가 있다. 따라서, 의약품의 생산에 있어서는, 특히 생산 비용의 삭감에 유용하다. 어피니티 컬럼 크로마토그라피에 사용하는 컬럼으로서는, 예를 들면, 단백질에 대한 항체를 결합시킨 어피니티 컬럼 크로마토그라피를 사용할 수가 있다. 또, 단백질이 항체이면, 프로테인A 컬럼, 프로테인G 컬럼을 사용할 수가 있다.
구체적으로는, 프로테인A를 사용한 칼럼으로서는, Hyper D, Sepharose F.F.(Pharmacia) 등을 들 수가 있다. 이온교환 컬럼 크로마토그라피, 역상 컬럼 크로마토그라피, 겔여과 컬럼 크로마토그라피 등도 적합하게 조합해서 사용된다 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1966). 또, 컬럼 크로마토그라피 이외에도, 한외여과막법, 황화암모늄침전법을 사용해서 조정제하는 방법도 사용할 수가 있다.
본 발명의 단일세포클로닝법으로 클로닝되어 생산된 단백질은, 특히 의약조성물로서 사용할 수가 있다.
투여방법은, 단백질의 활성에 의존하지만, 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수가 있다. 예를 들면, 정맥내투여, 근육내투여, 피하투여, 복강내투여를 선택할 수가 있고, 환자의 년령, 증상에 따라 적당한 투여방법을 선택할 수가 있다. 또, 의약조성물은, 투여경로에 의존해서 약학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유하는 것이어도 좋다. 특히, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제, 등장제, 안정화제, 완충제, 용해보조제, 진통제, 황함유환원제, 산화방지제를 첨가할 수 있다.
이하 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예 1. 친세포와의 공배양
친세포인 CHO DG44세포는, 1% HT supplement (GIBCO-BRL사제) 첨가 CHO-S-SFMIIDPM배지 (GIBCO-BRL사제)의 배지를 사용해서 계대 및 배양하고, 대수증식기에있는 CHO DG44세포를 사용했다. 인간형화항HM1.24항체를 코드하는 유전자를 편입한 CHO DG44세포는, 국제공개번호 WO 98/14580에 기재된 방법에 의해 조제했다. 얻어진 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포(인간형화항HM1.24항체H쇄발현벡타-HEF-RVHs-AHM-gr1(FERM BP6127)과 인간형화항HM1.24항체L쇄발현벡타-HEF-RVLa-AHM-gk (FERM BP 5645)를 사용해서 CHO세포를 동시형질전환한 것)을 형질전환세포로서 사용했다.
인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포의 조제는, 국제공개번호 WO 98/14580과 동일한 방법에 의해 행하고, 이 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포는 640㎍/㎖ G418 (GIBCO-BRL사제), 50nM MTX 및 8nM L-글루타민 첨가 CD-CHO배지(GIBCO-BRL사제)에서 계대한 것을 사용했다. 이들의 세포는 세포 글러스터(cell clusters)를 약간 형성했기 때문에, 23G침으로 시린징처리를 행해서 세포로 풀어주었다.
인간형화항HM1.24 항체생산 CHO세포는, 계대에 사용한 배지로 세정한 후, 1개/웰이 되도록 이 배지를 사용해서 세포농도를 조제해서 세포현탁액 250mL (20개/㎖)로 했다. 친세포인 CHO DG44세포는, 100개/웰, 1000개/웰, 10,000개/웰이 되도록 같은 배지를 사용해서 세포농도를 조제함으로써, CHO DG44세포현탁액 150mL (각각 1 X 103개/㎖, 1 X 104개/mL, 1 X 105개/mL)로 했다.
인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포현탁액을 0.05㎖ 및 CHO DG44세포현탁액을 0.1mL씩 96웰 플레이트에 파종했다. 따라서, 각 웰에는 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포가 1개씩 존재한다. 동일한 96웰플레이트를 각각 15매씩 제작하여, 합계 각각1440샘플의 배양을 행했다.
37℃, 5% CO2인큐베이터에서 합계 14일간 배양한 후, 검경을 행하여, 콜로니형성이 확인된 웰에서 세포를 채취하고, 또한 동일한 배지를 사용해서 24웰 플레이트(1mL)에 확대 배양함으로써 세포의 안정증식을 확인했다. 검경에 의해 세포의 콜로니가 확인된 웰의 수를 하기 표 1에 나타냈다.
표 1
친주첨가 어세이의 클로닝결과
(a)
친주의 세포수 형성된 콜로니수
100개/웰 0
1,000개/웰 6
10,000개/웰 58
합계 64
(b)
친주의 세포수 형성된 콜로니수
1,000개/웰 6
10,000개/웰 30
합계 36
상기 표 1에 있어서, (a)는 검경시(14일 후)에 선택한 콜로니수(즉, 24웰에 계대한 콜로니수)를 나타내고, (b)는 24웰 플레이트에서 6웰 플레이트로 확대한 콜로니수를 나타낸다).
100개/웰의 CHO DG44세포와 공배양한 웰로부터는 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포의 콜로니형성은 전혀 얻어지지 아니했지만, 1,000개/웰 또는 10,000개/웰의 CHO DG44세포와 공배양한 경우에는 각각 6개, 30개 씩의 콜로니형성이 확인되었다.
따라서, 1,000개/웰 또는 10,000개/웰의 친세포와 공배양함으로서, 1개/웰의 세포농도에서도 형질전환세포는 증식하여, 싱글 클론을 얻는 것이 가능한 것으로 나타나며, 친세포와의 공배양을 이용한 방법에 의해, 이제까지 불가능한 것으로 생각되어 왔었던 단일세포 클로닝이 가능하게 되었다. 24웰플레이트를 사용한 확대배양에서 안정증식을 나타낸 클로니는, 640㎍/mL의 G418 및 50nM의 MTX 존재하에서 배양하여, 목적하는 균질한 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포를 얻었다.
실시예 2. 확대배양
확대배양한 인간형화항HM1.24/L항체생산 CHO세포 1 X 105개를, Primatone 10g/L 첨가 CHO S-SFMⅡ배지(6L X 3대)에서, pH 7.2, DO 60% 공기포화, 60rpm의 조건하에서 11일간 배양했다. 3대의 배양상징액을 합하여, 사토브란 (Sartobran) pH캡슐(Sartorius)로 여과하고, rProtein A FF 컬럼(Pharmacia)에 부하하고, 1M Nacl/10mM 구연산인산완충액 pH 7.5 및 10mM 구연산인산완충액 pH 7.5로 세정한 후, 2.5mM HCl pH 2.7의 용출조건으로 용출했다.
엔도톡신(endotoxins)을 제거하기 위하여, 얻어진 Protein A 용출획분에 Kurimover(栗田工業제)를 직접 투입하고, 4~10℃에서 6시간 동안 교반했다. 셀룰로스아세테이트 필터 0.2㎛(Corning사제)를 사용해서 여과해서, 인간형화항HM1.24항체용액 2.65㎖를 얻었다. 얻어진 인간형화항HM1.24항체는 역상 HPLC분석에서 거의 균질한 것이 확인되었다.
실시예 3
인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포와 인간형화항PTHrP항체생산 CHO세포를 사용해서, 친세포인 CHO DG44세포와의 공배양법에 의한 단일세포클리닝과 기타 방법(Conditioned medium법, 혈청첨가법, 세포용해질첨가법)에 의한 단일세포클로닝을 비교했다.
인간형화항PTHrP항체를 코드하는 유전자를 편입한 CHO DG44세포는, 국제공개번호 98/13388에 기재된 방법에 의해 조제했다. 얻어진 인간형화항PTHrP항체생산 CHO세포 (인간형화항PTHrP항체 H쇄 발현벡타-hMBC1Hc DNA /pUC19)(FERM BP-5629)와 인간형화항 PTHrP항체 L쇄 발현벡타-hMBC1Lq λcDNA /pUC19(FERM BP-5630)를 사용해서 CHO세포를 동시형질전환한 것)을 형질전환세포로서 사용했다. 또, 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포의 신선배지로서 GIBCO CHO-S-SFMⅡ 개변/CD-CHO배지 (half medium)를, 인간형화항 PTHrP항체생산 CHO세포의 신선배지로서 GIBCO CHO-S-SFMⅡ배지를 사용했다.
(1) 친주와의 공배양법
배양 1일째의 인간형화항HM1.24항체생산 CHO세포 또는, 인간형화항 PTHrP항체생산 CHO세포를 0.2㎖당 1개의 세포가 존재하도록 신선배지에 의해 희석하고, 여기에 5,000,000개의 친주세포인 DG44CHO세포를 첨가해서 현탁했다. 이 세포현탁액을 96웰 플레이트 5매에 대해서, 1웰당 0.2㎖ 파종했다.
(2) Conditioned medium (CM)법
배양 1일째의 형질전환세포배양액의 원심분리 후 상징액을 0.2㎛ 필터로 여과했다. 이 여액에, 배양 1일째의 형질전환세포 500개 상당량의 현탁액을 첨가하여, 전체량을 100㎖로 했다. 이 현탁액을 96웰 플레이트 5매에 대해서, 1웰당 0.2㎖씩 파종했다. 3일째의 배양액을 사용하는 방법에서는, 배양 3일째의 형질전환세포배양액의 원심분리 후 상징액을 갖고 동일한 방법에 의해 행했다.
(3) 혈청첨가법
배양 1일째의 형질전환세포배양액을 1 cell/200㎕이 되도록 신선배지에서 희석했다. 이 희석액 90㎖에 대해서, 10㎖의 FBS(Fetal Bovine Serum I.S.C. at # 3000 Lot # 300050933)을 첨가해서 현탁하고, 96웰 플레이트 5매에 대해서, 1웰당 0.2㎖씩 파종했다.
(4) 세포용해질 첨가법
배양 1일째의 형질전환세포배양액을 1cell/200㎕이 되도록 신선배지에서 희석했다. 이 희석액에, 세포용해질의 침전을 현탁하고, 96웰 플레이트 5매에 대해서 1웰당 0.2㎖씩 파종했다. 또한, 세포용해질의 조제는 이하와 같이 행했다. 즉, 배양 3일째의 친주세포 5,000,000개를 원심분리 후, 무균수 10㎖에 현탁했다. -80℃에서 동결하고, 이어서 37℃에서의 용해를 2회 반복한 후, 3500rpm에서 60분 동안 원심분리하고, 침전물을 무균수 10㎖로 린스한 후, 다시 3500rpm에서 60분 동안 원심분리해서 세포용해질을 제조했다.
<결과>
각 방법에 있어서 인간형화항HM1,24항체생산 CHO세포와 인간형화항 PTHrP항체생산 CHO세포의 콜로니출현을, 파종 후 20일 후 또는 21일 후에 관찰하여, 플레이트당 콜로니출현빈도를 하기 표 2에 나타냈다. 그 결과, 어느 세포의 경우에도,친주세포와의 공배양에 의해 단일세포 클로닝이 가능했다. 또, 인간형화항HM1.24항체의 경우에 관찰된 바와 같이, 다른 방법으로 단일세포 클로닝하는 것이 불가능한 경우에, 친주세포와 공배양하는 단일세포 클리닝은 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 대조용으로서, 형질전환세포에만 웰당 1개, 3개, 10개, 30개, 100개 파종한 경우, 어느 형질전환세포의 경우에도 웰당 30개 또는 100개의 세포를 파종한 경우에는 콜로니가 형성되었지만, 10개 이하의 형질전환세포를 파종한 경우에는 콜로니의 형성은 관찰되지 않았다.
표 2
각 클로닝방법에 있어서 콜로니출현수
(A) 인간형화항 PTHrP항체 (20일째)클로닝방법 콜로니출현수(콜로니/플레이트)
친주와의 공배양법Conditioned medium 법 (1일째)Conditioned medium 법 (3일째)혈청첨가법세포용해질 첨가법 23.010.66.627.24.6
(B) 인간형화항HM1.24항체 (21일째)클로닝방법 콜로니출현수(콜로니/플레이트)
친주와의 공배양법Conditioned medium 법 (1일째)Conditioned medium 법 (3일째)혈청첨가법세포용해질 첨가법 36.40.00.00.00.2
본 발명에 의해, 소망하는 단백질을 생산하는 1개의 세포를 배양 또는 클로닝하는 것이 가능하게 되었다.

Claims (15)

  1. 단백질을 생산하는 세포의 배양방법에 있어서, 구성적으로 이 단백질을 생산할 수 있는 1개의 형질전환세포를, 이 세포의 친세포와 공배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 단백질을 생산하는 세포의 클로닝방법에 있어서, 구성적으로 이 단백질을 생산할 수 있는 1개의 형질전환세포를 이 세포의 친세포와 공배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 형질전환세포가 하이브리도마세포 또는 유전자 재조합세포인 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 하이브리도마세포 또는 유전자 재조합세포가 선택마커유전자를 함유하는 세포인 방법.
  5. 제 1항 내지 4항 중 어느 항에 있어서, 유전자 재조합세포가 생산하는 단백질이 생리활성물질인 방법.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 방법에 있어서, 생리활성물질이 호르몬, 효소, 림포카인, 사이토카인, 성장인자, 증식인자, 전사인자 또는 이들의 유도체 또는 저해제인 방법.
  7. 제 1항 내지 3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하이브리도마세포 또는 유전자 재조합세포가 생산하는 단백질이 면역 글로불린 또는 면역 글로불린유도체인 방법.
  8. 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 면역 글로불린이 마우스항체, 랫트항체, 키메라항체, 인간형화항체 또는 인간항체인 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 인간형화항체가 인간형화항HM1.24 항체인 방법.
  10. 제 7항에 있어서, 면역글로불린유도체가 Fab, F(ab')2 또는 1본쇄 Fv인 방법.
  11. 제 1항 내지 10항에 있어서, 상기 형질전환세포가 포유동물세포, 효모세포 또는 곤충세포인 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 포유동물세포가 CHO세포인 방법.
  13. 제 1항 내지 12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 공배양하는 친세포의 수가 약 1,000~10,000개인 방법.
  14. 단백질을 제조하는 방법에 있어서,
    (1) 이 단백질을 구성적으로 생산할 수 있도록 유전자 조작한 형질전환세포를 제조하는 공정,
    (2) 이 형질전환세포를 1개씩 이 형질전환세포의 친세포와 공배양하여, 소망하는 특성을 갖는 형질전환세포를 선택하는 공정,
    (3) 공정 2에서 선택한 형질전환세포를 계대 및/또는 확대 배양하는 공정과,
    (4) 배양상징액 또는 세포로부터 이 단백질을 회수하는 공정으로 이루어지는 방법.
  15. 제 14항의 방법에 의해서 생산된 단백질을 함유하는 의약조성물.
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