FI97550C - Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja - Google Patents
Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja Download PDFInfo
- Publication number
- FI97550C FI97550C FI871607A FI871607A FI97550C FI 97550 C FI97550 C FI 97550C FI 871607 A FI871607 A FI 871607A FI 871607 A FI871607 A FI 871607A FI 97550 C FI97550 C FI 97550C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- cells
- plasmid
- gene
- desired peptide
- gene encoding
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
97550
Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja 5 Tämä keksintö koskee menetelmää peptidien tuotta miseksi, jossa käytetään hyväksi geenitekniikkaa, yhdis-telmäplasmidia käytettäväksi tässä menetelmässä ja tällä yhdistelmäplasmidilla transformoituja myeloomasoluja.
On tehty erilaisia yrityksiä peptidien tuottami-20 seksi transformoimalla eläinsoluja ja viljelemällä trans-formantteja. Seuraavassa luetellaan esimerkkejä näistä suurin piirtein laskettuine sääntöineen.
(i) BPV (naudan papilloomavirus) - hiiri C127 - järjestelmä: ihmisen IFN-Y^-geeni (cDNA) , SV40:n aikainen pro- 25 moottori; 3 x 10^ KY/ml /r. Fukunaga et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 5086/; (ii) SV40-CV-1-järjestelmä: ihmisen IFN-^-geeni (cDNA) , SV40:n aikainen promoottori; 2 x 104 KY/ml /D. Cheysen et ai., J. Mol, Appi. Genetics 1 (1982) 305/; 20 (lii) SV40-COS-järjestelmä: ihmisen insuliinigeeni (cDNA), SV40:n aikainen promoottori /jö, Laud et ai., J. Biol.
Chem, 258 (1983) 60437; (iv) Eco-gpt-CHO-järjestelmä: ihmisen IFN-~7^-geeni (cDNA) , 4 r- SV4Q:n aikainen promoottori; 1 x 10 KY/ml /T. Kadotan! 25 et ai., Seikagaku 56 (1984) 9157; ja (v) dhfr-CHO-järjestelmä: ihmisen IFN-Y^-geeni (cDNA), 5 - SV40:n aikainen promoottori; 1 x 10 KY/ml /S. Scahill et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 46547·
Vaikka kullakin näistä menetelmistä on omat omi-30 naispiirteensä, ovat kaikki menetelmät vielä epätyydyttäviä, erityisesti halutun peptidin saannon suhteen.
Myös myeloomia on käytetty vasta-aineita tuottavina soluina tuotettaessa monoklonaalisia vasta-ainepep-tidejä. Niiden käyttöä muiden peptidien tuottamiseen ei . 35 kuitenkaan vielä tunneta.
2 97550 Tämä keksintö koskee menetelmää peptidien tuottamiseksi käyttämällä transformoituja eläinsoluja, erityisesti myeloomasoluja, ja siinä transformoidaan solut ja viljellään transformoituja soluja. Tarkemmin määritelty-5 nä tämän keksinnön eräs suoritusmuoto koskee menetelmää haluttujen peptidien tuottamiseksi, jossa menetelmässä transformoidaan nisäkässoluja käyttämällä vektorina yhdiste lmäplasmidia, jossa on SV40:n aikainen promoottori-sekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä 10 (5’-puolella) että sen jäljessä (3’-puolella), ja tämän jälkeen viljellään näin transformoituja nisäkässoluja.
Tämän keksinnön eräs toinen suoritusmuoto koskee menetelmää halutun peptidin tuottamiseksi suurina määrinä, jossa menetelmässä transformoidaan myeloomasoluja 15 vektorina käytettävällä yhdistelmäplasmidilla, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä (33-puolella).
Myeloomasolut ovat edullisia siinä suhteessa, et-2Q tä niillä on kyky kasvaa nopeasti in vivo ja in vitro, suuri proteiinien syntetisointikapasiteetti (IgG:n suhteen) ja kyky monistua suureen solutiheyteen. Keksinnön tämän suoritusmuodon eräänä erinomaisena piirteenä on se, että saavutetaan peptidien tuotanto suurina määrinä 25 yhdistämällä myeloomasolujen edellä mainitut edulliset piirteet SV40-promoottorin ja -edistäjän voimakkaaseen ilmentymistä edistävään vaikutukseen.
Keksintö koskee lisäksi yhdistelmäplasmidia, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttuja 30 peptidejä koodaavan geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä (3’-puolella), ja mainitulla yhdistelmäplasmidilla transformoituja eläinsoluja.
Kuva 1 ja kuva 2 ovat molemmat vektorin konstruointia kuvaavia kaavioita; 35 kuva 3 ja kuva 4 esittävät molemmat erään DNA- 3 97550 fragmentin restriktiokarttaa; ja kuvat 5-12 esittävät kunkin käytetyn plasmidin karkeaa restriktiokarttaa.
Haluttuja peptidejä koodaavan geenin edellä (5 * — 5 puolella) olevan SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin tulisi sijaita alueella, joka on muutamia kymmeniä emäs-pareja aloituskodonin edellä, edullisesti muutaman emäs-parin etäisyydellä aloituskodonin edellä tai välittömästi sitä ennen. Mitä tulee jäljessä, 3'-puolella sijaitko sevaan toiseen SV4Q;n aikaiseen promoottoriin, sen on hyvä sijaita alueella, joka on muutaman kiloemäsparin, esimerkiksi 2,5 ke:n, sisällä haluttuja peptidejä koodaavan geenin jäljessä.
Eläinsoluihin tuotu plasmidi tulee sisällytetyk-si eläimen kromosomi-DNArhan ja jää sinne pysyvästi. Transformoidut solut tuottavat jatkuvasti geenituotetta, ts. peptidiä, ja transformoidut solut pystyvät elämään pysyvästi.
Käyttämällä tuottamattomia tai erittämättömiä 2o (XgG:n suhteeni myelooma-soluja voidaan välttää IgG-kon- taminaatio, ja tällainen käyttö on siten edullista halutun peptidin puhdistuksessa. Koska myeloomasoluja voidaan lisätä eläimen, kuten hiiren, vatsaontelossa, voidaan geenituotteita (peptidejä) odotetusti tuottaa suu-25 ria määriä.
Tämä keksinnön eräänä lisäpiirteenä on se, että vektorin käyttö, jossa SV40-promoottori sijaitsee sekä haluttua peptidiä (esimerkiksi IFN:a) koodaavan hetero-logisen geenin edellä (5’-puolella) että sen jäljessä 30 (3’-puolella), saa aikaan geenituotteen saannon kasvami sen noin kymmenkertaiseksi.
Isäntäsoluina käytettävinä soluina voidaan mainita erilaiset myeloomaeolut, esimerkiksi hiiren, rotan ja ihmisen myeloomasolut. Näistä tuotteen puhdistuksen kan-35 naita ovat sopivia IgG:tä tuottamattomat tai IgG:tä erit- 4 97550 tämättömät solut. Solulinjat P3-X63-Ag8-Ul (erittämätön tyyppi) HGPRT-, X63-Ag8-6.5.3 (tuottamaton tyyppi) HGPR- ja SP2/OAgl4 (tuottamaton tyyppi) HGPRT" ovat esimerkkejä tunnetuista hiiren myeloomasolulinjoista 5 /Munemura (toim.), Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tokio 1982; Iwasaki et al.,
Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokio 19827.
Käytettävässä vektorissa olisi hyvä olla voimakas IQ promoottori, jolla on kyky saada aikaan geenin ilmentyminen eläinsoluissa (esimerkiksi SV40-promoottori, BPV-promoottori, metallitioniinipromoottori, dhfr-promoot-tori, retroviruksen tai LTR:ien erilaiset pitkät terminaaliset toistuvat jaksot, jotka kaikki ovat hyvin tun-15 nettuja), ja selektiivinen markkeri. Promoottorina käytetään edullisesti SV40-promoottoria. Selektiivisenä markkerina voidaan mainita esimerkiksi Eco-gpt ^Proc.
Natl. Acad. Sei. USA 78 (1981) 2072-20767, tk ^Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 37577 3a 7M°lec· Cell.
20 Biol. 1 (1981) 845-8647, jotka kaikki ovat hyvin tunnettuja. Myös muita tunnettuja selektiivisiä markkereita voidaan käyttää.
SV40-promoottorin emässekvenssi esitetään julkaisussa Science 200 (1978) 495-498. Alan ammattimies 25 konstruoi helposti esimerkiksi jäljempänä esitettävien esimerkkien avulla. Vektorin, jossa SV40-promoottori yhdistetään haluttua polypeptidiä vastaavaan geeniin.
DNA-fragmenttien pilkkominen, syntetisoiminen, analysoiminen, eristäminen ja muut käsittelyt, jotka ovat 30 välttämättömiä vektorin muodostamiseksi, voidaan toteuttaa tavanomaisin menetelmin £Äm. J. Hum. Genet, 31 (1979) 531; T. Maniatis et ai.. Molecular Cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory 19827.
Protoplastifuusiomenetelmää, kalsiumfosfaatti-35 menetelmää tms. voidaan käyttää eläinsolujen transformoin- il 5 97550 tiin yhdistelmäplasmidilla kyseessä olevan geenin tuomiseksi soluihin /Mol. Cell. Biol. 1(8) (1981) 743-752;
Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80 (1983) 825-829; Ogawara, Wakariyasui Idenshi Kumikae (Comprehensible Gene Recom-5 bination), Hirokawa Shoten, Tokio 1985, s 144-165^.
Solujen monistumista voidaan edistää in vitro tai in vivo käyttämällä sopivia menetelmiä. Solujen monistus-järjestelmä on hyvä valita tapauksen mukaan ja halutun polypeptidin tuottamiseksi tehokkaasti /iwasaki et ai, 10 Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokio 1982/.
In vitro -viljelyssä voidaan käyttää alustoja, joita yleensä käytetään myeloomasolujen viljelyyn in vitro, esimerkiksi RPMI-1640-alustaa, joka on täydennetty 10:liä 15 tilavuus-%:11a naudan sikiöseerumia (FCS), tai RDF-alus-taa (RPMI-1640:DMEM:F12 suhteessa 8.1:1), joka on täydennetty 10:llä tilavuus-%:11a PCS:a tai synteettisellä seerumilla, kuten Nu-seerumilla, tai seerumittomalla alustalla, kuten RDF-alustalla (RPMI-1640:DMEM:F12 suh-20 teessä 3:1:1), joka on täydennetty ITES:llä) (insuliini, transferriini, etanoliamiini ja seleeni) ja albumiinilla. /Katso liite nro 27 julkaisuun Tanpakushitsu Kakusan,
Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme) (1984) 453-4557·
In vitro -viljelyssä käytettiin petrimaljoja ja 25 pyörityspulloja. Viljelymenetelmänä voidaan käyttää suu- fitiheyksistä viljelymenetelmää, jossa viljely tehdään 6 7 solutiheyden ollessa 10 solua/ml tai suurempi (10' - 10®) . Erityisesimerkkejä niistä ovat onttokuituviljely /Science 178 (1972) 657 r mikrokapselivil jely US-patentti jui-. 30 kaisu 4 409 331) , paineilmaviljely /Biochem. Soc. Trans. 13 (1985) 107 ja kalvoperfuusioviljely (inkubaattoria myy Millipore Co., USAl. Näistä onttokuituviljely on tehokas ja edullinen (inkubaattoria tätä menetelmää varten myy Amicon Co. tai Endotronics Co). In vitro-viljely voi-35 daan tehdä hyvin tunnetulla menetelmällä /ftunemura (toim.) , Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, 6 97550
Tokio 1982 ja Fukui et ai. (toim.), Saibo Baiyo Gijutsu (Cell Culture Technology), Kodansha, Tokio 19857. Niinpä in vitro-viljely tehdään esimerkiksi hiilidioksidin (5 %) läsnäollessa.
5 Myeloomasolujen lisääminen in vivo voidaan tehdä eläimen vatsaontelossa, kuten alalla hyvin tiedetään. Eläimistä mainittakoon erityisesti hiirikannat Balb/c nu/nu ja Balb/c, joihin on mahdollista siirtää myelooma-soluja (näitä hiirikantoja myy Charles River Japan, Inc). 10 Tämä keksintö soveltuu mihin tahansa käyttökel poisiin peptideihin, esimerkiksi lymfokiineihin, kuten interferoneihin, tuumorin nekroositekijään ja interleu-kiineihin; hormoneihin, kuten insuliiniin ja kasvuhormoniin; antigeenisiin proteiineihin, kuten hepatiitti-15 ja influenssarokotteisiin; plasminogeenin kudosaktivaat- toriin ja somatomediineihin.
Tuotettu peptidi voidaan eristää ja puhdistaa jollakin sopivalla tunnetulla menetelmällä, esimerkiksi affi-niteettikolonnikromatografiällä, ioninvaihtokromatogra-2o fiällä, molekyyliseulojen avulla jne.
Seuraava esimerkki, jossa käytettiin gammainter-feronia ( >^-IFN) esimerkkinä peptidistä, valaisee tätä keksintöä, mutta ei millään tavoin rajoita sitä.
Esimerkki 25 I, Vektorin muodostaminen (kuva 1) a, >*"-IFN -geenin insertoiminen perusvektoriin Plasmidi pKSV-10 (Pharmacia P-L Biochemicals; katso kuva 5, tämän plasmidin Kpnl-kohta - BamHI-kohta-fragmentin restriktiokartta esitetään kuvassa 3) katkais-30 tiin Bglll-kohdasta, joka sijaitsee välittömästi SV40:n aikaisen promoottorin jäljessä, ja tehtiin tylppäpäiseksi käyttämällä Klenow-fragmenttia, minkä jälkeen tehtiin Smal-kytkijän (Takara Shuzo) insertio. Siten saatua plas-midia pKSV-10-SmaI (katso kuva 6) lisättiin Escherichia 35 coli HBlOlrssä.
7 97550
Ihmisen '^-IFN-geenin sisältävä plasmidi pMK-5 /talletettu the Fermentation Research Institute E. coli MK-5:n muodossa; talletusnumero FERM BP-1329 (katso kuva 11)7 käsiteltiin erikseen Banlllrlla ja BamHirllä. Siten 5 irrotettu "V^-IFN—geeni (genominen) tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-fragmentilla ja insertoitiin pKSV-10-SmaI:een Smal-kohtaan, jolloin saatiin pKSV-10-V(katso kuva 7).
b. Selektiivisen Eco-gpt-markkerigeenin sijoittaminen pKSVplO-i^: aan 20 Plasmidi pSV-2-gpt ^Bethesda Research Laboratories (katso kuva 8) tai ATCC-nro 371457 käsiteltiin PcuIIrlla ja EvoRIrllä. Siten irrotettu Eco-gpt-fragmentti ligatoi-tiin fragmenttiin, joka saatiin käsittelemällä plasmidi pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals) Smal:llä ja EcoRIrllä, 25 jolloin saatiin plasmidi pUCl3-SV-gpt (katso kuva 9).
Eco-gpt-geeni (SV40-promoottori + Eco-gpt + SV-terminaat-tori) irrotettiin mainitusta pUCl3-SV-gpt:stä BamHIrllä. Tuloksena oleva fragmentti, jonka restriktiokartta esi-tetään kuvassa 4, insertoitiin pKSV-10-Vraan (katso kuva 20 7; BamHI-kohta SV40-terminaattorin päässä V'-IFN-geenin 3'-puolella) BamHI-kohtaan, jolloin saatiin pKSV-10-V^-gpt (katso kuva 10).
Koska edellä mainitun Eco-gpt-geenin edellä, 5’-puolella, on SV4Q;n aikainen promoottori, on \?"-IFN-geeni 25 edellä muodostetussa plasmidissa kahden SV40-promootto- rin välissä. Tätä plasmidia käytettiin transformointiin.
c. Selektiivisen tk-markkerigeenin tuominen pKSV-10-\^:aan (katso kuva 2) tk-geeni (tk-promoottori + tk + tk-terminaattori) 30 irrotettiin plasmidista pFG-5 /Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76 (1979) 37577 BamHirllä ja insertoitiin pKVS-10-V7aan (katso kuva 7) BamHI-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pKSV-10-V"-tk (katso kuva 12). Tässä plasmidissa on vain yksi SV4Q:n aikainen promoottori %^-IFN-geenin 5’-puolella. 35 Tätä plasmidia käytettiin transformointiin.
8 97550 II. Transformoidun myeloomalinjän perustaminen a. Plasmidin tuominen soluun protoplastifuusiolla (1) Protoplastipreparaatti
Escherichia colia, joka sisälsi vektorin pKSV-10-5 (katso kuva 10) kasvatettiin lämpötilassa 37 °C
L-liemessä (LB), joka sisälsi glukoosia /loppupitoisuus 1 % (paino/tilavuus// ja ampisilliinia (loppupitoisuus 50yUg/ml) (lopullinen tilavuus 50 ml), kunnes optinen tiheys (OD) aallonpituudella 600 nm mitattuna oli 0,5.
20 Seuraavat käsittelyt tehtiin lämpötilassa 4 °C. Kasvatus-lientä sentrifugoitiin kierrosnopeudella 300 min 1 15 min, huuhdottiin sedimentti 0,05 M Tris-puskurilla (pH 8), joka sisälsi 20 % (paino/tilavuus) sakkaroosia, lisättiin 1,25 ml samaa puskuria, ja sekoitettiin seos. Siihen li-25 sättiin 0,25 ml lysotsyymiä (Sigma) /liuotettu 0,25 M
Tris-puskuriin (pH 8) pitoisuudeksi 5 mg/ml7, ja saadun seoksen annettiin seistä 5 min. Kun oli lisätty vielä 0,5 ml 0,24 M EDTA-liuosta, seoksen annettiin seistä 5 min.
20 Edellä mainittuun seokseen lisättiin 0,5 ml 0,05 M Tris-puskuria (pH 8), lämpötila nostettiin 37 °C:ksi, ja seoksen annettiin seistä 15 min. Siihen lisättiin 10 ml sakkaroosilla /loppupitoisuus 10 % (paino/tilavuus// ja ma,gnesiumkloridilla (loppupitoisuus 10 mmol/1) täy-25 dennettyä DME-alustaa. Tuloksena olevan seoksen annettiin seistä 10 min lämpötilassa 37 °C.
(2) Protoplastien ja myeloomasolujen fuusiointi (transformoitujen solujen valmistus)
Myeloomasolut /1 x 10^ solua; X63-Ag8-6.5.3 (HGPR-), 30 Flow Laboratories Inc., Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd7 lisättiin edellä kohdassa (1) saatuun viljelmään. Seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 1500 min 5 min, Super-natantti heitettiin pois, sedimentti irrotettiin, ja siihen lisättiin hitaasti 0,5 ml polyetyleeniglykoliliuosta 35 /valmistettiin lisäämällä fosfaattipuskuroitua fysiolo- 9 97550 gista suolaliuosta (PBS) 9 g:an PEG 4000 (Sigma) lop-putilavuuteen 20 ml7 sedimentin suspendoimiseksi tasaisesti. Kun seoksen oli annettu seistä 1 min, lisättiin kahdeksan 1 ml:n annosta DME-alustaa lämpötilassa 37 °C 5 30 s:n välein. Koko seos sentrifugoitiin, ja sedimentti suspendoitiin RPMI-XHT-alustaan, jolla oli jäljempänä annettava koostumus. Siten saatu solususpensio jaettiin kolmeen 96-syvennyksiseen maljaan ja inkuboitiin 48 tuntia.
10 RPMI-XHT-alustan koostumus: RPMI-1640:een (Gibco; 1 litraa vastaava määrä) lisättiin 36 mg kanamysiiniä, 120 mg streptomysiiniä, 250 mg ksantiinia, 13,6 mg hypoksantiinia, 3,87 mg tyrni-diiniä, 3,5^ug 2-merkaptoetanolia ja 2,0 g natriumvety-15 karbonaattia. Täytettiin 1 litraksi. Tähän liuokseen lisättiin 100 ml FCS:ää (naudan sikiöseerumia).
Tämän jälkeen transformoitujen solujen valikointi tehtiin viljelemällä soluja edellä mainitussa mykofeno-lihapolla (6 mg/1) täydennetyssä alustassa (RPMI-XHMT) .
Kun soluja oli viljelty 2 viikkoa korvaten puolet alustasta tuoreella 3 vrk:n välein, valikointi oli saatettu loppuun.
L(tkj-solujen (tymidiinikinaasia vaativat hiiren fibroblastit; Exp. Cell. Res. 31, 297-312) ollessa kyseessä pKSV-10-V~gpt ja pKSV-10-^-tk tuotiin soluihin 25 kalsiumfosfaattimenetelmällä, ja valikointi tehtiin kuten edellä käyttämällä RPMI-XHMT-alustaa ja vastaavasti RPMJ>HAT-alustaa.
III. V'-IFNrn tuottaminen pKSV-lQ-'l^-gpt: llä transformoitujen myeloomasolu-30 jen X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT~) tiheys säädettiin arvoon 5 x 4 1Q solua/ml alustalla, jolla oli jäljempänä annettava koostumus. 20 ml:n annos suspensiota laitettiin maljaan, jonka läpimitta oli 10Q mm, ja kasvatettiin inkubaatto-rissa lämpötilassa 37°C 4 vrk. Solut otettiin talteen, 35 laitettiin pyörityspulloon tiheydeksi 8 x 10 solua/ml 10 97550 viljelmän tilavuuden ollessa 100 ml, ja kasvatettiin vakiolämpötilaan 37 °C säädetyssä huoneessa pyöritysno-peuden ollessa 50 min~^".
Alustan koostumus: 5 Seokseen, joka koostui 8 tilavuusosasta RPMI-1640 (Sigma, 1 litraa vastaava määrä), 1 tilavuusosasta DME: tä (Sigma) ja 1 tilavuusosasta F-12 (Sigma), liuotettiin HEPES-puskuria (25 mmol, Sigma), 4 g glukoosia, 2 g nat-riumvetykarbonaattia, 3,5^,ug 2-merkaptoetanolia, 36 mg kanamysiiniä, 150 mg streptomysiiniä, 350 mg ksantiinia, 13,6 mg hypoksantiinia ja 3,87 mg tymidiiniä, ja säädettiin lopputilavuus 1 litraksi. Tähän liuokseen lisättiin pykofenolihappoa pitoisuudeksi 6 mg/1. Saatu seos täydennettiin vielä 100 ml:11a NU-seerumia (Collaborative 35 Research).
Viidennestä päivästä aloittaen korvattiin puolet alustasta tuoreella joka päivä. Viljelyä jatkettiin pitäen solutiheys pyörityspullossa arvossa 1,0 x 10^-1,5 x 10^/ml. Päivittäin talteenotettu viljelmäsupernatantti tutkittiin jäljempänä esitettävällä tavalla.
Mitä kohdassa II saatuihin transformoituihin L-soluihin tulee, niitä viljeltiin 60 mmm maljoissa tavanomaisesti, ja tutkittiin kukin supernatantti jäljempänä kuvattavalla tavalla.
25 Erikseen inokuloitiin 7 viikon ikäiset Balb/c nu/nu-hiiret vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml:11a pristaa-nia (2,6,1Q,14-tetrametyylipentadekaani; Wako Pure Chemical Industries) ja viikon kuluttua samoin intraperitone-aalisesti pKSV-10-^-gpt:llä transformoiduilla myelooma-3Q soluilla X63-Ag8-6.5.3 (FTGPRT~) (1 x 10^). 20 vrk:n kuluttua kerättiin vesivatsaneste ja tutkittiin se jäljempänä kuvattavalla tavalla.
IV. 'V^-IFNm määrittäminen
Viljelmäsupernatantti- ja vesivatsanestenäytteis-35 tä tutkittiin 'V^-IFN 96-syvennyksisessä mikromaljassa 11 97550 käyttämällä koetta, jossa mitattiin sytopaattisen vaikutuksen (CPE) 50-%:inen esto Philipin et ai. /Methods on Enxymology, 78 (1981) 389-3947 kuvaamalla tavalla käyttämällä ihmisen vesikalvosta saatuja FL-soluja ja SV:tä 5 (Shindbis-virus) yhdessä standardi-o(.-iFN: n (NIH) ja Y^^IFNrn (Genentech) kanssa.
Saadut koetulokset esitetään seuraavassa.
In vitro-viljelmä Isäntä 'v^-IFN-pitoisuus (ky/ml) 10_____ pKSV-10- 7^-gpt X63-Ag8-6.5.3 4 x 105 (HGPRT ) pKSV-10- V"-gpt L (tk") 3 x 103 pKSV-10- V"-tk L (tk_) 3 x 102 2^5 Vatsaontelonsisäinen viljely Balb/c nu/nu-hiiressä: pKSV-10-V"-gpt X63-Ag8-6.5.3 7 x 105 (HGPRT-!
Vaikka pyörityspulloviljelyä jatkettiin 20 vrk, 2o Pysyi tuotteen määrä puolessa alustan tilavuudessa, joka otettiin talteen päivittäin päivästä 5 alkaen, lähes 5 muuttumattomana. Tuotantomäärä 4 x 10 yksikköä/ml vastaa 50 ml:aa alustaa/100 ml:n pyörityspullo päivässä ja on erinomainen. Arvioidaan, että suuritiheyksisessä 25 viljelyssä, jossa käytetään ontelokuituja, saataisiin aikaan tuotepitoisuus 5 x 10 yksikköä/ml. Tämä keksintö tarjoaa siten erinomaisen menetelmän peptidien tuottamiseksi .
oL -IFN-geenin, jota käytettiin 1^-IFN-geenin si-30 jasta pKSV-10- 'TYgpt-L(tk ) ja pKSV-10- i^-tk-L(tk )-yhdistelmissä, ilmentyminen johti tuotepitoisuuksiin 1 x 1Q4 yksikköä/ml ja vastaavasti 2 x 10J yksikköä/ml.
Kun tuotanto toteutettiin pKSV-10-\^-grt:n ja X63-Ag8-6.5.3:n yhdistelmässä pyöritysviljelmä käyttä-35 mällä alustaa, joka ei sisältänyt seerumia /sisälsi insu- 9 7ö„ 12 liinia, transferriiniä, seleeniä, etanoliamiinia ja naudan seerumialbumiinia (BSA) FCS:n sijasta7 saatiin tuo-tepitoisuus 1 x 106 yksikköä/ml.
il
Claims (8)
1. Menetelmä haluttujen peptidien tuottamiseksi, tunnettu siitä, että 5 (1) transformoidaan myeloomasoluja vektorilla, jossa on SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5'-puolella) että sen jäl-j essä (3'-puolella), (2) viljellään transformoituja soluja ja 10 (3) puhdistetaan halutut peptidit.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että myeloomasolu on hiiren myeloomasolu.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että hiiren myeloomasolu on X63-Ag8-6.5.3 HGPRT".
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että haluttu peptidi on lymfokiini .
5. Vektori, jossa on SV40:n aikainen promoottori sekvenssi sekä haluttua peptidiä koodaavan geenin edellä (5'-puolella) että sen jäljessä (3'-puolella), tunnettu siitä, että ensimmäinen SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sijaitsee alueella, joka käsittää usei-25 ta kymmeniä emäspareja haluttua peptidiä koodaavan geenin aloituskodonin edellä ja toinen SV40:n aikainen promoottorisekvenssi sijaitsee alueella, joka käsittää useita kiloemäspareja haluttua peptidiä koodaavan geenin jäljessä.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se sisältää 5' -» 3'-suunnassa (1) ensimmäisen SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin, (2) haluttua peptidiä koodaavan geenin, 35 (3) ensimmäisen SV40-lopetussekvenssin, 97550 (4) toisen SV40:n aikaisen promoottorisekvenssin, (5) selektiomarkkeria koodaavan geenin, ja (6) toisen SV40:n lopetussekvenssin.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen vektori, 5 tunnettu siitä, että haluttu peptidi on lymfo- kiini.
8. Myeloomasolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu jonkin patenttivaatimuksista 5-7 mukaisella vektorilla. 97550
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8552786 | 1986-04-14 | ||
JP8552786 | 1986-04-14 |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI871607A0 FI871607A0 (fi) | 1987-04-13 |
FI871607A FI871607A (fi) | 1987-10-15 |
FI97550B FI97550B (fi) | 1996-09-30 |
FI97550C true FI97550C (fi) | 1997-01-10 |
Family
ID=13861362
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI871607A FI97550C (fi) | 1986-04-14 | 1987-04-13 | Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5019499A (fi) |
EP (1) | EP0244677B1 (fi) |
JP (1) | JP2573215B2 (fi) |
KR (1) | KR960007195B1 (fi) |
CN (2) | CN1034427C (fi) |
AT (1) | ATE109827T1 (fi) |
AU (1) | AU600481B2 (fi) |
CA (1) | CA1297434C (fi) |
DE (1) | DE3750348T2 (fi) |
DK (1) | DK189987A (fi) |
FI (1) | FI97550C (fi) |
IE (1) | IE65500B1 (fi) |
IL (1) | IL82207A (fi) |
NO (1) | NO175872C (fi) |
PH (1) | PH26343A (fi) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU622870B2 (en) * | 1987-08-07 | 1992-04-30 | Medical Research Council, The | Vector for integration site independent gene expression in mammalian host cells |
GB8809129D0 (en) * | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Celltech Ltd | Recombinant dna methods vectors and host cells |
US5879936A (en) * | 1988-04-18 | 1999-03-09 | Aluguisse Holding A.G. | Recombinant DNA methods, vectors and host cells |
US5573937A (en) * | 1989-12-07 | 1996-11-12 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Serum free culture medium |
US5891693A (en) * | 1990-01-25 | 1999-04-06 | Alusuisse Holdings A.G. | Recombinant DNA methods vectors and host cells |
GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
EP0798379A3 (en) * | 1996-03-29 | 1999-10-06 | Tosoh Corporation | Human glutamic acid decarbocylase-expressing myeloma cell line |
UY26317A1 (es) * | 2000-08-30 | 2000-10-31 | Alfonso Cayota Carlos Pritsch | Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4713339A (en) * | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
AU572108B2 (en) * | 1983-01-19 | 1988-05-05 | Genentech Inc. | Human tpa production using vectors coding for dhfr protein |
US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
JPS61134324A (ja) * | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ヒト抗体h鎖遺伝子の発現方法 |
JPS61134325A (ja) * | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
WO1986005807A1 (en) * | 1985-04-01 | 1986-10-09 | Celltech Limited | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
JPH0714341B2 (ja) * | 1985-11-20 | 1995-02-22 | 鐘淵化学工業株式会社 | 蛋白質の高生産株の取得方法 |
JP2581668B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1997-02-12 | 三井東圧化学株式会社 | ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいdna配列とそれを含むベクタ−及び細胞 |
GB8607679D0 (en) * | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
-
1987
- 1987-04-10 CA CA000534474A patent/CA1297434C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-13 IE IE95287A patent/IE65500B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-04-13 PH PH35127A patent/PH26343A/en unknown
- 1987-04-13 IL IL82207A patent/IL82207A/xx unknown
- 1987-04-13 DK DK189987A patent/DK189987A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-04-13 FI FI871607A patent/FI97550C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-14 CN CN87102823A patent/CN1034427C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-14 KR KR1019870003544A patent/KR960007195B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-04-14 AT AT87105559T patent/ATE109827T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-04-14 EP EP87105559A patent/EP0244677B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-14 NO NO871573A patent/NO175872C/no unknown
- 1987-04-14 JP JP62091446A patent/JP2573215B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-14 US US07/038,177 patent/US5019499A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-14 AU AU71516/87A patent/AU600481B2/en not_active Ceased
- 1987-04-14 DE DE3750348T patent/DE3750348T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-09-28 CN CN94116755A patent/CN1107513A/zh active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA1297434C (en) | 1992-03-17 |
CN87102823A (zh) | 1987-11-04 |
IL82207A (en) | 1992-03-29 |
ATE109827T1 (de) | 1994-08-15 |
IE870952L (en) | 1987-10-14 |
KR960007195B1 (ko) | 1996-05-29 |
IE65500B1 (en) | 1995-11-01 |
NO175872C (no) | 1994-12-21 |
FI97550B (fi) | 1996-09-30 |
DE3750348T2 (de) | 1994-12-15 |
FI871607A (fi) | 1987-10-15 |
AU7151687A (en) | 1987-10-15 |
FI871607A0 (fi) | 1987-04-13 |
AU600481B2 (en) | 1990-08-16 |
CN1107513A (zh) | 1995-08-30 |
EP0244677A2 (en) | 1987-11-11 |
EP0244677B1 (en) | 1994-08-10 |
DE3750348D1 (de) | 1994-09-15 |
US5019499A (en) | 1991-05-28 |
NO175872B (fi) | 1994-09-12 |
DK189987D0 (da) | 1987-04-13 |
JP2573215B2 (ja) | 1997-01-22 |
DK189987A (da) | 1987-10-15 |
NO871573L (no) | 1987-10-15 |
PH26343A (en) | 1992-04-29 |
JPS6344897A (ja) | 1988-02-25 |
NO871573D0 (no) | 1987-04-14 |
IL82207A0 (en) | 1987-10-30 |
KR870010190A (ko) | 1987-11-30 |
CN1034427C (zh) | 1997-04-02 |
EP0244677A3 (en) | 1988-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3149182B2 (ja) | 多領域造血刺激因子類 | |
JP2957974B2 (ja) | エリスロポエチン活性を有するタンパク質の製造方法 | |
US5681718A (en) | Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof | |
KR950012804B1 (ko) | 재조합 인간인자 viii : c의 제조방법 및 그를 위해 사용되는 형질전환체 | |
AU611750B2 (en) | Monoclonal antibodies against human interleukin-4 and hybridomas producing the same | |
JP2003510070A (ja) | 細胞の無タンパク質かつ無血清の培養のための培地 | |
FI103987B (fi) | Interleukiini-7 | |
FI97550C (fi) | Menetelmä peptidien valmistamiseksi, menetelmässä käyttökelpoinen yhdistelmäplasmidi ja plasmidilla transformoituja myeloomasoluja | |
EP0239292B1 (en) | Production of proteins by cell culture | |
US4808523A (en) | Constitutive production of human IFN-β1 by mammalian cells transformed by the IFN-β1 gene fused to an SV40 early promoter | |
JPH04228066A (ja) | 外来遺伝子発現用培養細胞 | |
US4757018A (en) | Myeloma cell lines and uses thereof | |
JP2001120262A (ja) | 生理活性物質の産生増強方法 | |
WO1990002183A1 (en) | Production of a novel lymphokine exhibiting differentiation inhibitory activity | |
US20100093087A1 (en) | IL-17 Mediated Transfection Methods | |
AU620537B2 (en) | Human interleukin-4 muteins | |
JP4721522B2 (ja) | 細胞の培養方法 | |
JPH02195888A (ja) | ヒトインターロイキン2活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えdna体および該組換えdna体により形質転換された原核生物細胞 | |
KR100280241B1 (ko) | 융합 세포의 수득방법 | |
US5700915A (en) | Human interleukin immunopurification processes | |
Dreano et al. | Production of secretable proteins using the passage in vivo as tumours of cells carrying heat-inducible expression constructs | |
JP2576200B2 (ja) | 生理活性タンパク質の製造法 | |
KR920001379B1 (ko) | 유전자 재조합 기술을 이용한 당단백 호르몬의 제조방법 | |
GB2232998A (en) | Culture medium for hybridoma cells | |
Roggenbuck et al. | Cell Cluster Formation during Up-Scaling of a Human—Mouse Heterohybridoma Producing a Polyspecific Human IgM Antibody |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
BB | Publication of examined application | ||
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: DAIICHI SEIYAKU CO. LTD |