JP2573215B2 - ペプチド類の生産法 - Google Patents
ペプチド類の生産法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、遺伝子工学的に有用な物質を生産する技術
に関するものである。
に関するものである。
従来技術 動物細胞を形質転換して培養し、有用な物質を生産す
る試みは種々報告されている。主な報告をその生産量の
概算と共に示すと次の如くである。
る試みは種々報告されている。主な報告をその生産量の
概算と共に示すと次の如くである。
ｉ）BPV（牛パピローマウイルス）−マウスC127系：ヒ
トIFN−γ遺伝子（cDNA）、SV40初期プロモーター３×1
05u/ml （R.Fukunaga et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81 5086（1984）） ii）SV40−CV−１系：ヒトIFN−β遺伝子（cDNA）、SV4
0初期プロモーター ２×104u/ml（D.Gheysenet al,J.M
ol.Appl.Genetics １ 305 （1982）） iii）SV40−COS系：ヒトインシュリン遺伝子（cDNA）、
SV40初期プロモーター（O.Laud et al,J.Biol.Chem.604
3（1983）） iv）Eco−gpt−CHO系：ヒトIFN−γ遺伝子（cDNA）SV40
初期プロモーター １×104u/ml（角谷徹他 生化学 5
6,915（1984）） ｖ）dhfr−CHO系：ヒトIFN−ｒ遺伝子（cDNA）、SV40初
期プロモーター１×105u/ml（S.Scahill et al Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 80,4654（1983）） これらの方法は夫々特徴があるが目的物質の生産性等
について未だ充分ではなく種々の方法の開発が期待され
る。
トIFN−γ遺伝子（cDNA）、SV40初期プロモーター３×1
05u/ml （R.Fukunaga et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81 5086（1984）） ii）SV40−CV−１系：ヒトIFN−β遺伝子（cDNA）、SV4
0初期プロモーター ２×104u/ml（D.Gheysenet al,J.M
ol.Appl.Genetics １ 305 （1982）） iii）SV40−COS系：ヒトインシュリン遺伝子（cDNA）、
SV40初期プロモーター（O.Laud et al,J.Biol.Chem.604
3（1983）） iv）Eco−gpt−CHO系：ヒトIFN−γ遺伝子（cDNA）SV40
初期プロモーター １×104u/ml（角谷徹他 生化学 5
6,915（1984）） ｖ）dhfr−CHO系：ヒトIFN−ｒ遺伝子（cDNA）、SV40初
期プロモーター１×105u/ml（S.Scahill et al Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 80,4654（1983）） これらの方法は夫々特徴があるが目的物質の生産性等
について未だ充分ではなく種々の方法の開発が期待され
る。
また、ミエローマは抗体産生細胞としてモノクローナ
ル抗体の生産に利用されているが、他のペプチド類の生
産については知られていない。
ル抗体の生産に利用されているが、他のペプチド類の生
産については知られていない。
発明の構成 本発明は、ミエローマ細胞を形質転換し、これを増殖
させてペプチド類を生産する方法に関し、更に詳しく
は、５′方向から３′方向へ次の配列 （１）SV40初期プロモーター （２）ペプチド類をコードする遺伝子 （３）SV40ターミネーター （４）SV40初期プロモーター （５）選択マーカーをコードする遺伝子 （６）SV40ターミネーター を有するベクターを用いて、ミエローマ細胞を形質転換
し、これを増殖させて所望のペプチド類（組織プラスミ
ノーゲン活性因子を除く）を生産させる方法に関する。
させてペプチド類を生産する方法に関し、更に詳しく
は、５′方向から３′方向へ次の配列 （１）SV40初期プロモーター （２）ペプチド類をコードする遺伝子 （３）SV40ターミネーター （４）SV40初期プロモーター （５）選択マーカーをコードする遺伝子 （６）SV40ターミネーター を有するベクターを用いて、ミエローマ細胞を形質転換
し、これを増殖させて所望のペプチド類（組織プラスミ
ノーゲン活性因子を除く）を生産させる方法に関する。
導入されたプラスミドは、ミエローマの染色体DNAに
組込まれて安定に保存される。遺伝子産物であるペプチ
ド類は恒久的に形質転換細胞より生産される（細胞は半
永久的に生存可能である）。
組込まれて安定に保存される。遺伝子産物であるペプチ
ド類は恒久的に形質転換細胞より生産される（細胞は半
永久的に生存可能である）。
ミエローマは非生産型または非分泌型（IgGに関し
て）用いれば、IgGが混在しないので目的のペプチド類
の精製に便利である。更に、ミエローマ細胞はマウス等
の動物の腹腔内で増殖させ得るので、大量の遺伝子産物
（ペプチド類）の取得も期待される。
て）用いれば、IgGが混在しないので目的のペプチド類
の精製に便利である。更に、ミエローマ細胞はマウス等
の動物の腹腔内で増殖させ得るので、大量の遺伝子産物
（ペプチド類）の取得も期待される。
本発明のもう一つの特徴は、５′方向から３′方向へ
次の配列 （１）SV40初期プロモーター （２）ペプチド類をコードする遺伝子 （３）SV40ターミネーター （４）SV40初期プロモーター （５）選択マーカーをコードする遺伝子 （６）SV40ターミネーター を有するベクターを用いることにより、遺伝子産物の生
産量が約10倍にも上昇する点である。
次の配列 （１）SV40初期プロモーター （２）ペプチド類をコードする遺伝子 （３）SV40ターミネーター （４）SV40初期プロモーター （５）選択マーカーをコードする遺伝子 （６）SV40ターミネーター を有するベクターを用いることにより、遺伝子産物の生
産量が約10倍にも上昇する点である。
宿主に用いる細胞としては、各種のミエローマ細胞お
よびミエローマ由来のハイブリドーマを挙げることがで
き、例えば、マウス、ラットおよびヒトのミエローマ細
胞がある。なかでも、IgG非生産型、非分泌型の細胞が
目的物の精製には好適である。マウスミエローマ細胞と
しては例えば、P3−X63−Ag8−U1（非分泌型）HGPRT~、
X63−Ag8−6.5.3（非生産型）HGPRT~、SP2/0−Ag14（非
生産型）HGPRT~等があり、実験材料として供給されてい
る（文献１および２参照）。
よびミエローマ由来のハイブリドーマを挙げることがで
き、例えば、マウス、ラットおよびヒトのミエローマ細
胞がある。なかでも、IgG非生産型、非分泌型の細胞が
目的物の精製には好適である。マウスミエローマ細胞と
しては例えば、P3−X63−Ag8−U1（非分泌型）HGPRT~、
X63−Ag8−6.5.3（非生産型）HGPRT~、SP2/0−Ag14（非
生産型）HGPRT~等があり、実験材料として供給されてい
る（文献１および２参照）。
ベクターとしては、動物細胞で発現させる強力なプロ
モーター（例えばSV40のプロモーター、BPVのプロモー
ター、メタロチオネインのプロモーター、dhfrのプロモ
ーター、各種末端反復領域LTR等）と選択マーカーを有
するものが適当である。この選択マーカーとしては、例
えば、Eco−gpt、tk、dhfrを挙げることが出来るが、そ
の他のよく知られたものを用いることもできる。
モーター（例えばSV40のプロモーター、BPVのプロモー
ター、メタロチオネインのプロモーター、dhfrのプロモ
ーター、各種末端反復領域LTR等）と選択マーカーを有
するものが適当である。この選択マーカーとしては、例
えば、Eco−gpt、tk、dhfrを挙げることが出来るが、そ
の他のよく知られたものを用いることもできる。
SV40のプロモーターの塩基配列は、文献３に開示され
ており、目的物の遺伝子と組合せたベクターは、実施例
等を参考にして通常の技術により容易に構築できる。ベ
クターの構築等に必要なDNA断片の切断、合成、検索、
単離等は一般的な方法で行なうことができる。文献４お
よび５参照。
ており、目的物の遺伝子と組合せたベクターは、実施例
等を参考にして通常の技術により容易に構築できる。ベ
クターの構築等に必要なDNA断片の切断、合成、検索、
単離等は一般的な方法で行なうことができる。文献４お
よび５参照。
動物細胞を形質転換して目的の遺伝子を導入するに
は、プロトプラスト融合法やリン酸カルシウム法等の一
般的方法を応用できる。文献６〜８参照。
は、プロトプラスト融合法やリン酸カルシウム法等の一
般的方法を応用できる。文献６〜８参照。
細胞の増殖は、in vitroで行なうか、またはin vivo
でマウスやラット等の腹腔内で行なうことができ、目的
に応じて適宜選択し、効率よく目的物を生産すればよ
い。文献２参照。
でマウスやラット等の腹腔内で行なうことができ、目的
に応じて適宜選択し、効率よく目的物を生産すればよ
い。文献２参照。
in vitroでの培養に用いる倍地としては、ミエローマ
の培養に通常用いられるものでよいが、例えば、RPMI−
1640培地にFCSを10％加えたもの、RDF培地（RPMI−164
0:DMEM:F12＝8:1:1）に牛脂児血清（FCS）または合成血
清を10％加えたもの、あるいはRDF倍地（RPMI−1640:DE
ME:F12＝3:1:1）にITES（インスリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミンおよびセレン）およびアルブミン
を加えた無血清培地等があり、種々のものが報告および
市販されている。文献９参照。
の培養に通常用いられるものでよいが、例えば、RPMI−
1640培地にFCSを10％加えたもの、RDF培地（RPMI−164
0:DMEM:F12＝8:1:1）に牛脂児血清（FCS）または合成血
清を10％加えたもの、あるいはRDF倍地（RPMI−1640:DE
ME:F12＝3:1:1）にITES（インスリン、トランスフェリ
ン、エタノールアミンおよびセレン）およびアルブミン
を加えた無血清培地等があり、種々のものが報告および
市販されている。文献９参照。
培養には、ディッシュやスピナーフラスコを使用でき
るが、ホローファイバーを用いた高密度培養法も効率的
で有利である。さらに、マイクロカプセル法、エアーリ
フト培養法、メンブランパーフィジョン培養法等があ
る。文献12〜15参照。
るが、ホローファイバーを用いた高密度培養法も効率的
で有利である。さらに、マイクロカプセル法、エアーリ
フト培養法、メンブランパーフィジョン培養法等があ
る。文献12〜15参照。
細胞の培養は、５％二酸化炭素の存在下で行なう等、
一般的な方法、例えば文献１および10の記載に準じて行
なえばよい。
一般的な方法、例えば文献１および10の記載に準じて行
なえばよい。
in vivoでの増殖も、通常使用されている動物と方法
で行なえばよいが、例えば、ミエローマ細胞の移植が可
能なBalb/c nu/nu、Balb/cの如き系統のマウスを挙げる
ことが出来る。
で行なえばよいが、例えば、ミエローマ細胞の移植が可
能なBalb/c nu/nu、Balb/cの如き系統のマウスを挙げる
ことが出来る。
生産するペプチド類としては特に制限はなく、この分
野の通常の知識に基いて選ぶことができ、例えば、イン
ターフェロン類、腫瘍壊死因子、インターロイキンのよ
うなリンホカイン類、インスリン、成長ホルモンのよう
なホルモン類、肝炎ワクチン、インフルエンザワクチン
のような多くの抗原蛋白質類やソマトメジン等をあげる
ことができる。
野の通常の知識に基いて選ぶことができ、例えば、イン
ターフェロン類、腫瘍壊死因子、インターロイキンのよ
うなリンホカイン類、インスリン、成長ホルモンのよう
なホルモン類、肝炎ワクチン、インフルエンザワクチン
のような多くの抗原蛋白質類やソマトメジン等をあげる
ことができる。
生産されたペプチド類は、イオン交換クロマトグラフ
ィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過等の通常
の方法で分離、精製することができる。
ィ、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過等の通常
の方法で分離、精製することができる。
次にガンマーインターフェロン（γ−IFN）をペプチ
ドの例として用いた実施例を挙げて説明するが限定の意
味はない。
ドの例として用いた実施例を挙げて説明するが限定の意
味はない。
実施例 I:ベクターの構築（第１図） a.基本ベクターへのγ−IFN遺伝子の挿入： プラスミドpKSV−10 （Pharmacia P−L Biochem−ica
ls;このプラスミドのKpnIサイトからBamH Iサイトまで
の断片の地図を第３図に示す）をSV40初期プロモーター
直後のBgI IIサイトで切断し、クレノーフラグメントで
ブラントエンド化し、Sma Iリンカー（宝酒造）を挿入
してプラスミドpKSV−10−Sma Iを製し、これを大腸菌H
B101で増殖させた。
ls;このプラスミドのKpnIサイトからBamH Iサイトまで
の断片の地図を第３図に示す）をSV40初期プロモーター
直後のBgI IIサイトで切断し、クレノーフラグメントで
ブラントエンド化し、Sma Iリンカー（宝酒造）を挿入
してプラスミドpKSV−10−Sma Iを製し、これを大腸菌H
B101で増殖させた。
一方ヒトγ−IFN遺伝子を含むプラスミドpMK−５（E.
coli MK−５、FERM P−8736後にFERM BP−1329として微
生物工業技術研究所に保管委託）をBan IIIとBamH Iで
処理して、γ−IFN遺伝子（genomic）を切出し、クレノ
ーフラグメントでブラントエンド化し、これをpKSV−10
−Sma IのSma Iサイトに挿入してpKSV−10−γを得た。
coli MK−５、FERM P−8736後にFERM BP−1329として微
生物工業技術研究所に保管委託）をBan IIIとBamH Iで
処理して、γ−IFN遺伝子（genomic）を切出し、クレノ
ーフラグメントでブラントエンド化し、これをpKSV−10
−Sma IのSma Iサイトに挿入してpKSV−10−γを得た。
b.pKSV−10−γへの選択マーカーEco−gpt遺伝子の挿
入： プラミドpSV−２−gpt（Bethesda Research Laborato
riesまたはATCC No.37145）をPvu IIとEcoR Iで処理し
てEco−gpt断片を切出し、これをプラスミドpUC 13（Ph
armacia P−L Biochemicals）をSma IとEcoR Iとで処理
して得た断片とライゲートしてプラスミドpUC13−SV−g
ptを得た。このプラスミドよりEco−gpt遺伝子（SV40プ
ロモーター＋Eco−gpt＋SV40ターミネータ）をBamH Iで
切出し（この断片の地図を第４図に示す）、pKSV−10−
γ（γ−IFN遺伝子の３′側にあるSV40のターミネータ
ー末端にBam Iサイトがある）のBamH Iサイトに挿入し
てpKSV−10−γ−gptを得た。
入： プラミドpSV−２−gpt（Bethesda Research Laborato
riesまたはATCC No.37145）をPvu IIとEcoR Iで処理し
てEco−gpt断片を切出し、これをプラスミドpUC 13（Ph
armacia P−L Biochemicals）をSma IとEcoR Iとで処理
して得た断片とライゲートしてプラスミドpUC13−SV−g
ptを得た。このプラスミドよりEco−gpt遺伝子（SV40プ
ロモーター＋Eco−gpt＋SV40ターミネータ）をBamH Iで
切出し（この断片の地図を第４図に示す）、pKSV−10−
γ（γ−IFN遺伝子の３′側にあるSV40のターミネータ
ー末端にBam Iサイトがある）のBamH Iサイトに挿入し
てpKSV−10−γ−gptを得た。
このEco−gpt遺伝子はSV40初期プロモーターを５′上
流にもっているので、出来上がったプラスミドではγ−
IFN遺伝子が二つのSV40プロモーターではさまれている
状態である。このプラスミドを形質転換に用いた。
流にもっているので、出来上がったプラスミドではγ−
IFN遺伝子が二つのSV40プロモーターではさまれている
状態である。このプラスミドを形質転換に用いた。
c.pKSV−10−γへの選択マーカーtk遺伝子の導入 プラスミドpFG−５（文献11）よりBamH Iで切出したt
k遺伝子（tkのプロモーター＋tk＋tkのターミネータ
ー）をpKSV−10−γのBamH Iサイトに挿入してプラスミ
ドpKSV−10−γ−tkを得た。このもののSV40初期プロモ
ーターはγ−IFN遺伝子の５′側に一つあるだけであ
る。このプラスミドを形質転換に用いた。
k遺伝子（tkのプロモーター＋tk＋tkのターミネータ
ー）をpKSV−10−γのBamH Iサイトに挿入してプラスミ
ドpKSV−10−γ−tkを得た。このもののSV40初期プロモ
ーターはγ−IFN遺伝子の５′側に一つあるだけであ
る。このプラスミドを形質転換に用いた。
II.形質転換ミエローマの樹立 a.プロトプラスト融合によるプラスミドの導入 １）プロトプラストの作成 グルコース（最終濃度１％）、アンピシリン（最終濃
度50μg/ml）を含有するＬブロス（LB）に、ベクター
（pKSV−10−γ−gpt）を含有する大腸菌を加えたもの5
0mlを600nmにおける濁度（OD）が0.5になるまで37℃で
培養した。以後の処理は４℃で行なった。培養液を3000
rpmで15分遠心し沈渣を20％蔗糖含有0.05Mトリス緩衝液
（pH8）で洗浄し、同じ緩衝液1.25mlを加えて撹拌し
た。これに、リゾチーム（Sigma）、0.25ml（0.25Mトリ
ス緩衝液（pH8）に5mg/mlに溶解）を加えて５分間放置
し、さらに0.25M EDTA 0.5mlを加えて５分間放置した。
度50μg/ml）を含有するＬブロス（LB）に、ベクター
（pKSV−10−γ−gpt）を含有する大腸菌を加えたもの5
0mlを600nmにおける濁度（OD）が0.5になるまで37℃で
培養した。以後の処理は４℃で行なった。培養液を3000
rpmで15分遠心し沈渣を20％蔗糖含有0.05Mトリス緩衝液
（pH8）で洗浄し、同じ緩衝液1.25mlを加えて撹拌し
た。これに、リゾチーム（Sigma）、0.25ml（0.25Mトリ
ス緩衝液（pH8）に5mg/mlに溶解）を加えて５分間放置
し、さらに0.25M EDTA 0.5mlを加えて５分間放置した。
これに0.05Mトリス緩衝液（pH8）0.5mlを加えて温度
を37℃にして15分間放置した。この液に蔗糖（最終濃度
10％）、塩化マグネシウム（最終濃度10mM）を加えたDM
E培養液10mlを加えて室温に10分間放置した。
を37℃にして15分間放置した。この液に蔗糖（最終濃度
10％）、塩化マグネシウム（最終濃度10mM）を加えたDM
E培養液10mlを加えて室温に10分間放置した。
２）プロトプラストとミエローマの融合（形質転換細胞
の作成） １）で得たプロトプラスト懸濁液に、ミエローマ細胞
（X63−Ag8−6.5.3）（HGPRT~）（Flow−大日本製薬）
１×107個を加え1500rpmで５分間遠心した。上清を捨て
沈渣をほぐしてこれにポリエチレングリコール液（Sigm
a PEG4000 9gに燐酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えて20m
lにしたもの）0.5mlをゆっくり加えて均一に懸濁した。
１分間放置後、これに37℃のDME培養液を30秒毎に1mlず
つ計８回加えた。これを遠心して、沈渣を次の組成のRP
MI−XHT培養液に懸濁させて96穴プレート３枚にまき、4
8時間培養した。
の作成） １）で得たプロトプラスト懸濁液に、ミエローマ細胞
（X63−Ag8−6.5.3）（HGPRT~）（Flow−大日本製薬）
１×107個を加え1500rpmで５分間遠心した。上清を捨て
沈渣をほぐしてこれにポリエチレングリコール液（Sigm
a PEG4000 9gに燐酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えて20m
lにしたもの）0.5mlをゆっくり加えて均一に懸濁した。
１分間放置後、これに37℃のDME培養液を30秒毎に1mlず
つ計８回加えた。これを遠心して、沈渣を次の組成のRP
MI−XHT培養液に懸濁させて96穴プレート３枚にまき、4
8時間培養した。
RPMI−XHT培養液組成 RPMI−1640（Gibco 1用）にカナマイシン36mg、スト
レプトマイシン120mg、キサンチン250mg、ヒポキサンチ
ン13.6mg、チミジン3.87mg、２−メルカプトエタノール
3.5μｇおよび炭素水素ナトリウム2gを加え、全量を１
とし、これにFCS（牛脂児血清）100mlを加えた 次いでミコフェノール酸を6mg/1になるように加えた
前記の培養液（PRMI−XHMTと呼ぶ）で培養して形質転換
細胞を選別し、３日おきに培養液を半分取換えて２週間
培養し選別を完了した。
レプトマイシン120mg、キサンチン250mg、ヒポキサンチ
ン13.6mg、チミジン3.87mg、２−メルカプトエタノール
3.5μｇおよび炭素水素ナトリウム2gを加え、全量を１
とし、これにFCS（牛脂児血清）100mlを加えた 次いでミコフェノール酸を6mg/1になるように加えた
前記の培養液（PRMI−XHMTと呼ぶ）で培養して形質転換
細胞を選別し、３日おきに培養液を半分取換えて２週間
培養し選別を完了した。
なお、Ｌ（tk~）細胞についてはpKSV−10−γ−gptお
よびpKSV−10−γ−tkをリン酸カルシウム法によって導
入し、それぞれRPMI−XHMTおよびRPMI−HAT培地を用い
て同様に選別した。
よびpKSV−10−γ−tkをリン酸カルシウム法によって導
入し、それぞれRPMI−XHMTおよびRPMI−HAT培地を用い
て同様に選別した。
III.γ−IFNの発現 IIで得た培養細胞（pKSV−10−γ−gptで形質転換し
たミエローマ細胞X63−Ag8−6.5.3（HGPRT~））を、次
の組成の培養液に、５×104/mlに調整し、その20mlを10
0mm径ディッシュに入れてインキュベーター中37℃で４
日間培養した。細胞を集めて細胞密度８×104/ml、培養
液量100mlをスピナーフラスコに入れて37℃の恒温室中
で撹拌数50rpmで培養した。
たミエローマ細胞X63−Ag8−6.5.3（HGPRT~））を、次
の組成の培養液に、５×104/mlに調整し、その20mlを10
0mm径ディッシュに入れてインキュベーター中37℃で４
日間培養した。細胞を集めて細胞密度８×104/ml、培養
液量100mlをスピナーフラスコに入れて37℃の恒温室中
で撹拌数50rpmで培養した。
培養液組成 RPMI−1640（Sigma 1用）８容、DME（Sigma）１容
Ｆ−12（Sigma）１容の割合の液中に、HEPES（Sigma）2
5mM、グルコース4g、炭酸水素ナトリウム2g、２−メル
カプトエタノール3.5μｇ、カナマイシン36mg、ストレ
プトマイシン150mg、キサンチン250mg、ヒポキサンチン
13.6mg、チミジン3.87mgが含まれるように全量を１と
し、これにミコフェノール酸を6mg/1になるように加
え、NU血清（Collaborative Research）100mlを加え
た。
Ｆ−12（Sigma）１容の割合の液中に、HEPES（Sigma）2
5mM、グルコース4g、炭酸水素ナトリウム2g、２−メル
カプトエタノール3.5μｇ、カナマイシン36mg、ストレ
プトマイシン150mg、キサンチン250mg、ヒポキサンチン
13.6mg、チミジン3.87mgが含まれるように全量を１と
し、これにミコフェノール酸を6mg/1になるように加
え、NU血清（Collaborative Research）100mlを加え
た。
培養開始５日後より毎日培養液の半量を回収して新鮮
な培地と取り替えた。スピナーフラスコ培養液中の細胞
密度を1.0×106〜1.5×106/mlに保ちつつ培養を続け
た。毎日回収した培養液の上清をアッセイに用いた。
な培地と取り替えた。スピナーフラスコ培養液中の細胞
密度を1.0×106〜1.5×106/mlに保ちつつ培養を続け
た。毎日回収した培養液の上清をアッセイに用いた。
IIで得た形質転換Ｌ細胞については、60nmのディッシ
ュで常法通り培養した上清をアッセイした。
ュで常法通り培養した上清をアッセイした。
また、７週令のヌードマウスBalb/c nu/nuに、プリス
タン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン；和光純
薬）0.5mlを腹腔内に接種し、１週間後これにpKSV−10
−γ−gptで形質転換したミエローマ細胞X63−Ag8−6.
5.3（HGPRT~）１×107個を腹腔内接種し飼育した。20日
後に腹水を採取してアッセイに用いた。
タン（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン；和光純
薬）0.5mlを腹腔内に接種し、１週間後これにpKSV−10
−γ−gptで形質転換したミエローマ細胞X63−Ag8−6.
5.3（HGPRT~）１×107個を腹腔内接種し飼育した。20日
後に腹水を採取してアッセイに用いた。
IV.γ−IFNのアッセイ フィリップらの報告（Method in Enzymology 78 389
〜394（1981）に準じて、ヒト羊膜由来FL細胞とSV（Sin
dbis virus）を用い、96穴タイタートレイで、NIHのα
−IFN標準品と、ジェネンテク社のγ−IFNとの50％CEP
阻止法（cytopathic effectinhibition assay）により
測定した。
〜394（1981）に準じて、ヒト羊膜由来FL細胞とSV（Sin
dbis virus）を用い、96穴タイタートレイで、NIHのα
−IFN標準品と、ジェネンテク社のγ−IFNとの50％CEP
阻止法（cytopathic effectinhibition assay）により
測定した。
発明の効果 実施例で得られたアッセイの結果を次に示す。
スピナーカルチャーでの培養は20日間継続したが、開
始５日後より毎日半量回収した培養液の生産量は殆ど変
わらなかった。この４×105u/mlの発現は50ml培養液/10
0mlスピナーフラスコ／日に相当し極めて優れた生産量
である。スピナーカルチャーに潅流培養装置を装着すれ
ば高密度培養が可能であり、１〜５×106u/ml以上の高
生産を長期間維持できるものと推定される。
始５日後より毎日半量回収した培養液の生産量は殆ど変
わらなかった。この４×105u/mlの発現は50ml培養液/10
0mlスピナーフラスコ／日に相当し極めて優れた生産量
である。スピナーカルチャーに潅流培養装置を装着すれ
ば高密度培養が可能であり、１〜５×106u/ml以上の高
生産を長期間維持できるものと推定される。
また、ミエローマ細胞はホローファイバー培養法を始
めとする種々の高密度培養法が適用可能であり、これら
の培養手法を利用すれば更に高発現（例えば５×107u/m
l）が期待でき、しかも目的のペプチド類の分離精製を
簡略化できる。
めとする種々の高密度培養法が適用可能であり、これら
の培養手法を利用すれば更に高発現（例えば５×107u/m
l）が期待でき、しかも目的のペプチド類の分離精製を
簡略化できる。
なお、pKSV−10−γ−gptとＬ（tk~）細胞の、および
pKSV−10−γ−tkとＬ（tk~）細胞の組合せにおいて、
γ−IFN遺伝子の代りにα−IFN遺伝子を用いて発現を試
みたところ、それぞれ１×104u/mlと２×103u/mlのタイ
ターが得られた。
pKSV−10−γ−tkとＬ（tk~）細胞の組合せにおいて、
γ−IFN遺伝子の代りにα−IFN遺伝子を用いて発現を試
みたところ、それぞれ１×104u/mlと２×103u/mlのタイ
ターが得られた。
また、pKSV−10−γ−gptとX63−Ag8−6.5.3細胞の組
合せで、無血清培地（FCSの代りにインスリン、トラン
スフェリン、セレン、エタノールアミンおよび牛血清ア
ルブミンを加える）を使用したスピナーカルチャー培養
では１×106u/mlのタイターが得られた。
合せで、無血清培地（FCSの代りにインスリン、トラン
スフェリン、セレン、エタノールアミンおよび牛血清ア
ルブミンを加える）を使用したスピナーカルチャー培養
では１×106u/mlのタイターが得られた。
以上の如く本発明は極めて優れたペプチド類の生産法
である。
である。
文献１ 宗村編 細胞培養マニュアル 講談社（1982） 文献２ 岩崎等 単クローン抗体 講談社（1982） 文献３ Science 200 495〜498 （1978） 文献４ Am.J.Hum.Genet.,31 531（1979） 文献５ T.Manitatis et al.Molecular Cloning;Cold S
pring Harbor Laboratory（1982） 文献６ Mol.Cell.Biol.１（８）743〜752（1981） 文献７ Proc.Acad.Natl.Sci.USA 80 825〜829（1983） 文献８ 小河原 わかりやすい遺伝子組換え 144〜165
（1985）広川書店 文献９ 別冊27 蛋白質核酸酵素453〜455（1984） 文献10 福井等編 細胞培養技術 講談社（1985） 文献11 Proc.Acad.Natl.Sci.USA 76 3757（1979） 文献12 Science,178 65 （1972） 文献13 米国特許 4,409,331 文献14 Biochem.Soc.Trans.,13 10 （1985） 文献15 村上浩紀編 細胞制御工学 学窓社
pring Harbor Laboratory（1982） 文献６ Mol.Cell.Biol.１（８）743〜752（1981） 文献７ Proc.Acad.Natl.Sci.USA 80 825〜829（1983） 文献８ 小河原 わかりやすい遺伝子組換え 144〜165
（1985）広川書店 文献９ 別冊27 蛋白質核酸酵素453〜455（1984） 文献10 福井等編 細胞培養技術 講談社（1985） 文献11 Proc.Acad.Natl.Sci.USA 76 3757（1979） 文献12 Science,178 65 （1972） 文献13 米国特許 4,409,331 文献14 Biochem.Soc.Trans.,13 10 （1985） 文献15 村上浩紀編 細胞制御工学 学窓社
第１図および第２図はベクター構築工程図であり第３図
および第４図はDNA断片の地図であり、第５図乃至第12
図は用いたプラスミドの概略地図である。
および第４図はDNA断片の地図であり、第５図乃至第12
図は用いたプラスミドの概略地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 杉山 則文 東京都江戸川区北葛西１丁目16番13号 第一製薬中央研究所内 合議体 審判長 石田 吉信 審判官 田中 久直 審判官 鈴木 恵理子 (56)参考文献 特開 昭59−183693（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−126978（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−134324（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−134325（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−296890（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−502377（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／1533（ＷＯ，Ａ１)
Claims (1)
- 【請求項１】ミエローマ細胞を形質転換し、これを増殖
させて所望のペプチド類（組織プラスミノーゲン活性因
子を除く）を生産させる方法において、５′方向から
３′方向へ次の配列を有するベクターを用いることを特
徴とする生産法 （１）SV40初期プロモーター （２）ペプチド類をコードする遺伝子 （３）SV40ターミネーター （４）SV40初期プロモーター （５）選択マーカーをコードする遺伝子 （６）SV40ターミネーター
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
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1994
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