DE3750348T2 - Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dazu zu verwendendes rekombinantes Plasmid und mit diesem Plasmid transformierte Myelomzellen. - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dazu zu verwendendes rekombinantes Plasmid und mit diesem Plasmid transformierte Myelomzellen.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung der Genetic Engineering- Technologie, ein rekombinantes Plasmid zur Verwendung bei diesem Verfahren und damit transformierte Myelomzellen.
- Verschiedene Versuche wurden unternommen, um Peptide durch Transformation von tierischen Zellen und Kultivierung der Transformanten herzustellen. Beispiele hierzu werden im folgenden unter Angabe der näherungsweise berechneten Produktivitätswerte aufgeführt.
- (i) BPV (Boviner Papilloma-Virus)-Maus C127 System: Humanes TFN-γ-Gen (cDNA), SV40-Early-Promoter; 3 · 10&sup5; U/ml (R. Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5086 (1984));
- (ii) SV40-CV-1 System: Humanes TFN-β-Gen (cDNA), SV40- Early-Promoter; 2 · 10&sup4; U/ml (D. Gheysen et al., J. Mol. Appl. Genetics, 1, 305 (1982));
- (iii) SV40-COS-System: Humanes Insulin-Gen (cDNA), SV40- Early-Promoter (O. Laud et al., J. Biol. Chem., 258, 6043 (1983));
- (iv) Eco-gpt-CHO-System: Humanes IFN-γ-Gen (cDNA), SV40- Early-Promoter 1 · 10&sup4; U/ml (T. Kadotani et al., Seikagaku, 56, 915 (1984)); und
- (v) dhfr-CHO-System: Humanes IFN-γ-Gen (cDNA), SV40-Early-Promoter; 1 · 10&sup5; U/ml (S. Scahill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4654 (1983)).
- Obwohl jedes dieser Verfahren seine charakteristischen Eigenschaften aufweist, ist jedes Verfahren dennoch nicht zufriedenstellend, insbesondere in bezug auf die Produktivität für das gewünschte Peptid.
- Myelome wurden außerdem als Antikörper-produzierende Zellen bei der Produktion von monoklonalen Antikörper-Peptiden verwendet. Deren Verwendung bei der Produktion anderer Peptide war jedoch bisher nicht bekannt.
- Die EP 0 117 058 beschreibt die Produktion eines reifen Proteins in Vertebraten-Wirtszellen. Insbesondere wird ein Vektor verwendet, der Strukturgene für ein bestimmtes Protein und für einen Marker umfaßt, wobei jedes davon unter der Kontrolle einer SV40-Early-Promoter-Sequenz steht. Die EP 0 117 059 betrifft die Produktion von menschlichem tPA in eukaryotischen Wirtszellen mit Hilfe von Expressionsvektoren, welche in ähnlicher Weise konstruiert sind.
- Die EP 0223 230, eingereicht am 20. November 1985 und veröffentlicht am 27. Mai 1987 betrifft ebenfalls die Produktion eines bestimmten Proteins in eukaryotischen Wirtszellen. Hierbei wird ein Vektor verwendet, der SV40-Early-Promoter-Sequenzen sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für das gewünschte Protein, gamma- IFN, codierenden Gens enthält.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden unter Verwendung von Myelomzellen, wobei man die Zellen transformiert und die transformierten Zellen kultiviert. Insbesondere betrifft die Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung gewünschter Peptide, wobei man Myelomzellen transformiert, wobei man als Vektor ein rekombinantes Plasmid verwendet, das die SV40-Early-Promoter- Sequenz sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für das gewünschte Peptid codierenden Gens aufweist und man anschließend die auf diese Weise transformierten Säugerzellen kultiviert.
- Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Peptids in großen Mengen, wobei man Myelomzellen mit einem rekombinanten Plasmid transformiert, welches die SV40-Early-Promoter-Sequenz sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für das gewünschte Peptid codierenden Gens enthält, und das als Vektor verwendet wird.
- Myelomzellen sind insofern von Vorteil, als sie die Fähigkeit zum schnellen Wachstum in vivo und in vitro besitzen, eine hohe Proteinsynthesekapazität aufweisen (für IgG) und sich bis zu einer hohen Zelldichte vermehren können. Ein herausragendes Merkmal dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Produktion von Peptiden in großer Menge dadurch erreicht wird, daß man die obigen vorteilhaften Eigenschaften von Myelomzellen mit dem starken, expressionsfördernden Effekt von SV40-Promoter und Enhancer kombiniert.
- Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein rekombinantes Plasmid, welches die SV40-Early-Promoter-Sequenz sowohl am 5'- stromaufwärts gelegenen Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für die gewünschten Peptide codierenden Gens aufweist, sowie Myelomzellen, welche mit dem rekombinanten Plasmid transformiert sind.
- Fig. 1 und Fig. 2 zeigen jeweils ein Vektor-Konstruktionsschema;
- Fig. 3 und Fig. 4 zeigen jeweils die Restriktions-Karte eines DNA-Fragments; und
- Fig. 5 bis Fig. 12 zeigen jeweils eine grobe Restriktions- Karte der verwendeten Plasmide.
- Die SV40-Early-Promoter-Sequenz am 5'-stromaufwärts gelegenen Ende des für die gewünschten Peptide codierenden Gens sollte innerhalb eines Bereichs von mehreren zehn Basenpaaren stromaufwärts vom Startcodon, vorzugsweise innerhalb mehrerer Basenpaare oder unmittelbar stromaufwärts vom Startcodon, liegen. Die andere SV40-Early-Promoter-Sequenz am 3'-stromabwärts gelegenen Ende sollte geeigneterweise innerhalb einer Region von mehreren Kilobasenpaaren, z. B. 2,5 kbp, stromabwärts von dem für die gewünschten Peptide codierenden Gens liegen.
- Das in die Animalzellen eingeführte Plasmid wird in die animale chromosomale DNA inkorporiert und darin stabil gehalten. Das Genprodukt, d. h. das Peptid, wird in stabiler Weise von den transformierten Zellen produziert und die transformierten Zellen sind unsterblich.
- Die Verwendung von nicht-produktiven oder nicht-sekretorischen (für IgG) Myelomzellen kann eine Kontamination mit IgG verhindern und ist somit von Vorteil für die Reinigung des gewünschten Peptids. Da Myelomzellenaußerdemim Peritonealraum eines Lebewesens, wie einer Maus, vervielfältigt werden können, sind die Genprodukte (Peptide) in großer Menge erwartungsgemäß herstellbar.
- Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Verwendung eines Vektors, der, wie oben erwähnt, den SV40-Promoter sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für das gewünschte Peptid (z. B. IFN) codierenden heterologen Gens enthält, eine etwa 10fach erhöhte Produktivität für das Genprodukt aufweist.
- Als Zellen, die als Wirtszellen verwendet werden können, sind zu nennen: verschiedene Myelomzellen, wie z. B. Myelomzellen von Maus, Ratte und Mensch. Davon sind nicht-IgG-produzierende oder nicht-IgG-ausscheidende Zellen vom Standpunkt der Produktreinigung geeignet. Die Zellinien P3-X63-Ag8-U1 (nicht-sekretorischer Typ) HGPRT&supmin;, X63-Ag8-6.5.3 (nicht-produktiver Typ) HGPRT&supmin; und SP2/O-Ag14 (nicht-produktiver Typ) HGPRT&supmin; sind Beispiele für Mausmyelomzellinien und sind aus dem Stand der Technik bekannt (Munemura (ed.): Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tokyo (1982); Iwasaki et al.: Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokyo (1982)).
- Der verwendete Vektor sollte geeigneterweise einen starken Promoter aufweisen, der eine Genexpression in der animalen Zelle bewirken kann (z. B. einen SV40-Promoter, einen BPV-Promoter, einen Metallothionin-Promoter, einen dhfr-Promoter, verschiedene retrovirale "long terminal repeats" oder LTRs, welche alle aus dem Stand der Technik bekannt sind). Auch sollte er einen selektierbaren Marker besitzen. Als Promoter wird vorzugsweise ein SV40-Promoter verwendet. Als selektierbarer Marker sind beispielsweise zu nennen Eco-gpt (wie beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072-2076)), tk (wie beschrieben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3757 (1979)) und dhfr (wie beschrieben in Molec. Cell. Biol., 1, 845-864 (1981)). Alle diese Marker sind bekannt. Andere bekannte selektive Marker können ebenfalls verwendet werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Myelomzelle, welche mit einem Vektor transformiert ist, der die SV40-Early-Promotor-Sequenz sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende eines für das gewünschte Peptid codierenden Gens aufweist, wobei die erste SV40-Early-Promoter-Sequenz in einer Region von mehreren zehn Basenpaaren stromaufwärts vom Startcodon eines für das gewünschte Peptid codierenden Gens angeordnet ist und die zweite SV40-Early-Promoter-Sequenz in einer Region von mehreren Kilobasenpaaren stromabwärts von dem für das gewünschte Peptid codierenden Gen angeordnet ist. Vorzugsweise umfaßt der Vektor in 5' → 3'-Richtung:
- 1. eine erste SV40-Early-Promoter-Sequenz,
- 2. ein für das gewünschte Peptid codierendes Gen,
- 3. eine erste SV40-Terminatorsequenz,
- 4. eine zweite SV40-Early-Promoter-Sequenz,
- 5. ein für einen selektierbaren Marker codierendes Gen, und
- 6. eine zweite SV40-Terminatorsequenz.
- Die Basensequenz des SV40-Promoters ist in Science, 200, 495- 498 (1978) offenbart. Ein Vektor, in welchem der SV40-Promoter mit dem Gen für das gewünschte Polypeptid kombiniert ist, kann vom Fachmann beispielsweise unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele in einfacher Weise konstruiert werden. Spaltung, Synthese, Analyse, Isolierung und andere Behandlungsweisen von DNA-Fragmenten, welche für eine Vektorkonstruktion erforderlich sind, können unter Verwendung üblicher Techniken durchgeführt werden (Am. J. Hum. Genet., 31, 531 (1979); T. Maniatis et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)).
- Die Protoplastenfusionsmethode, die Kalziumphosphat-Methode oder dergleichen können zur Transformation der animalen Zellen mit dem rekombinanten Plasmid zur Einführung des betreffenden Gens in die Zellen verwendet werden (Mol. Cell. Biol., 1 (8), 743-752 (1981); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 825-829 (1983); Ogawara: Wakariyasui Tdenshi Kumikae (Comprehensible Gene Recombination), S. 144-165, Hirokawa Shoten, Tokyo (1985)).
- Die Zell-Multiplikation kann in vitro oder in vivo unter Anwendung geeigneter Methoden erhöht werden. Das jeweilige Zellmultiplikationssystem kann in geeigneter Weise in Abhängigkeit vom jeweiligen Fall und zum Zweck einer effizienten Produktion des gewünschten Polypeptids ausgewählt werden (Iwasaki et al: Tankuron Kotai (Monoclonal Antibodies), Kodansha, Tokyo (1982).
- Für die in vitro-Kultivierung können Medien verwendet werden, welche im allgemeinen zur Kultivierung von Myelomzellen in vitro verwendet werden, wie z. B. RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% (v/v) fötalem Kälberserum (FCS) oder RDF-Medium (RPMI- 1640:DMEM:F12 = 8 : 1 : 1), supplementiert mit 10% (v/v) FCS oder synthetisches Serum, wie Nu-Serum, oder serumfreie Medien, wie RDF-Medium (RPMI-1640:DMEM:F12 = 3 : 1 : 1), supplementiert mit ITES (Insulin, Transferrin, Ethanolamin und Selen) und Albumin. (Supplement No. 27 to Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Protein, Nucleic Acid and Enzyme), 453-455 (1984))
- Für die in vitro-Kultivierung können Petrischalen und Schüttelkolben verwendet werden. Als Kultivierungsmethode kann die Kultivierungsmethode bei hoher Dichte verwendet werden, wobei die Kultivierung bei einer Zelldichte von 10&sup6; Zellen/ml oder mehr (10&sup7;-10&sup8;) durchgeführt wird. Spezielle Beispiele umfassen die Hohlfaserkultivierung (beschrieben in Science, 178, 65 (1972)), die Mikrokapsel-Kultivierung (beschrieben in US-Patent 4,409,331), die Airlift-Kultivierung (beschrieben in Briochem. Soc. Trans., 13, 10 (1985)) und die Membran-Perfusions-Kultivierung (der Inkubator kann von Millipore Co., USA bezogen werden). Von diesen Verfahren ist die Hohlfaserkultivierung effizient und vorteilhaft (der hierfür erforderliche Inkubator kann von Amicon Co. oder Endotronics Co. bezogen werden). Die in vitro-Kultivierung kann unter Verwendung wohlbekannter Verfahren durchgeführt werden (Munemura (Hrsg.): Saibo Baiyo Manual (Manual of Cell Culture), Kodansha, Tokyo (1982) und Fukui et al. (Hrsg.): Saibo Baiyo Gijutsu (Cell Culture Technology), Kodansha, Tokyo (1985)). So kann beispielsweise die in vitro- Zellkultivierung in Gegenwart von 5% Kohlendioxid durchgeführt werden.
- Die in vivo-Multiplikation von Myelomzellen kann im Peritonealraum eines Lebewesens in bekannter Weise durchgeführt werden. Als Lebewesen sind insbesondere zu nennen die Mäusestämme Balb/c nu/nu oder Balb/c, in welche die Transplantation von Myelomzellen möglich ist (diese Mäusestämme können von Charles River Japan, Inc. bezogen werden).
- Die vorliegende Erfindung ist auf jegliche Art von nützlichen Peptiden anwendbar, wie z. B. auf Lyinphokine, wie Interferone, Tumornekrosefaktor und Interleukine; Hormone, wie Insulin und Wachstumshormon; antigene Proteine, wie Hepatitisvaccin und Influenzavaccin; Gewebe-Plasminogenaktivator und Somatomedine.
- Das produzierte Peptid kann mit Hilfe geeigneter Verfahren, wie z. B. durch Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Molekularsieb-Verfahren und dergleichen isoliert und gereinigt werden.
- Das folgende Beispiel, bei dem gamma-Interferon (γ-IFN) als Beispiel für das Peptid verwendet wird, veranschaulicht die vorliegende Erfindung, ohne diese jedoch zu beschränken.
- Das Plasmid pKSV-10 (Pharmacia P-L Biochemicals; Fig. 5, die Restriktionskarte des KpnI-BamHl-Fragments dieses Plasmids ist in Fig. 3 gezeigt) wird an der Bg1II-Schnittstelle unmittelbar hinter dem SV40-Early-Promoter geschnitten, und mit Hilfe des Klenow-Fragments geglättet. Anschließend wird ein SmaI-Linker (Takara Shuzo) insertiert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid pKSV-10-SmaI (vgl. Fig. 6) wird in Escherichia coli HB101 vermehrt.
- Getrennt davon wird das Human-γ-TFN-Gen enthaltende Plasmid pMK-5 (hinterlegt bei Fermentation Research Institute in Form von E. coli MK-5; Hinterlegungsnummer: FERM BP-1329 (vgl. Fig. 11)), mit BanIII und BamHI behandelt. Das auf diese Weise herausgeschnittene γ-IFN-Gen (genomisch) wird mit dem Klenow-Fragment geglättet und in pKSV-10-SmaI an der SmaI-Schnittstelle insertiert, wobei man pKSV-10-γ erhält (vgl. Fig. 7).
- Das Plasmid pSV-2-gpt (Bethesda Research Laboratories (vgl. Fig. 8) oder ATCC Nr. 37145) behandelt man mit PvuII und EcoRI. Das auf diese Weise herausgeschnittene Eco-gpt-Fragment ligiert man mit dem Fragment, das man durch Behandlung von Plasmid pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals) mit SmaI und EcoRI erhält. Dabei entsteht das Plasmid pUC13-SV-gpt (vgl. Fig. 9). Das Ecogpt-Gen (SV40-Promoter + Eco-gpt + SV-Terminator) schneidet man aus pUC13-SV-gpt mit BamHI aus. Das resultierende Fragment, dessen Restriktionskarte in Fig. 4 gezeigt ist, insertiert man in pKSV-10-γ (vgl. Fig. 7) (das eine BamHI-Schnittstelle am SV40-Terminatorende auf der 3'-Seite des γ-IFN-Gens aufweist) an der BamHI-Schittstelle, wobei man pKSV-10-γ-gpt (vgl. Fig. 10) erhält.
- Da das oben erwähnte Eco-gpt-Gen den SV40-Early-Promoter auf der 5'-stromaufwärts gelegenen Seite aufweist, befindet sich das γ-IFN-Gen in dem oben konstruierten Plasmid sandwichartig zwischen zwei SV40-Promotern. Dieses Plasmid verwendet man zur Transformation.
- Das tk-Gen (tk-Promoter + tk + tk-Terminator) schneidet man aus dem Plasmid pFG-5 (Proc. Natl. Acad. Sci. USAA, 76, 3757 (1979)) mit BamHI aus und insertiert es in pKSV-10-7 (vgl. Fig. 7) an der BamHI-Stelle, wobei man das Plasmid pKSV-10-γ-tk (vgl. Fig. 12) erhält. Dieses Plasmid besitzt nur einen SV40- Early-Promoter auf der 5'-Seite des γ-IFN-Gens. Dieses verwendet man zur Transformation.
- Escherichia coli, das den Vektor pKSV-10-γ-gpt (vgl. Fig. 10) trägt, kultiviert man bei 37ºC in L-Brühe (LB), welche Glucose (Endkonzentration 1% (w/v)) und Ampicillin (Endkonzentration 50 ug/ml) (Endvolumen 50 ml) enthält, bis die Turbidität (OD) bei 600 nm einen Wert von 0,5 erreicht. Die folgenden Behandlungsschritte werden bei 4ºC durchgeführt. Die Kulturbrühe zentrifugiert man 15 Minuten bei 3000 Upm, spült das Sediment mit 0,05 M Trispuffer (pH 8), enthaltend 20% (w/v) Sucrose, 1,25 ml des gleichen Puffers gibt man anschließend hinzu und rührt das Gemisch. Hierzu gibt man 0,25 ml Lysozyin (Sigma) (gelöst in 0,25 M Trispuffer (pH 8), 5 mg/ml) und läßt das resultierende Gemisch 5 Minuten stehen. Nach einer weiteren Zugabe von 0,5 ml 0,25 M EDTA, läßt man das Gemisch 5 Minuten stehen.
- Zu obigem Gemisch gibt man 0,5 ml 0,05 M Trispuffer (pH 8), erhöht die Temperatur auf 37ºC und läßt das Gemisch 15 Minuten stehen. Hierzu gibt man 10 ml DME-Medium, supplementiert mit Sucrose (Endkonzentration 10% (w/v)) und Magnesiumchlorid (Endkonzentration 10 mM). Das resultierende Gemisch läßt man 10 Minuten bei 37ºC stehen.
- Myelomzellen (1·10&sup7;; X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT&supmin;)) (Flow Laboratories Inc.-Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) gibt man zu der oben gemäß (1) erhaltenen Kultur hinzu. Das Gemisch zentrifugiert man 5 Minuten bei 1500 Upm. Den Überstand verwirft man und lockert das Sediment auf, gibt 0,5 ml einer Polyethylenglycol- Lösung (hergestellt durch Zugabe von Phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) zu 9 g PEG 4000 (Sigma) auf ein Volumen von 20 ml) langsam zum Sediment hinzu, wodurch das Sediment gleichmäßig suspendiert wird. Nach 1-minütigem Stehen gibt man acht 1-ml-Portionen DME-Medium bei 37ºC zu der Suspension in 30-Sekunden-Intervallen hinzu. Das gesamte Gemisch wird zentrifugiert und das Sediment suspendiert man in RPMI-XHT-Medium mit der im folgenden angegebenen Zusammensetzung. Die auf diese Weise erhaltene Zellsuspension verteilt man auf drei 96- er-Platten und inkubiert 48 Stunden.
- Zu RPMI-1640 (Gibco; 1 l) gibt man 36 mg Kanamycin, 120 mg Streptomycin, 250 mg Xanthin, 13, 6 mg Hypoxanthin, 3,87 mg Thyinidin, 3,5 ug 2-Mercaptoethanol und 2,0 g Natriumbicarbonat. Das Gesamtvolumen wird auf 1 Liter aufgefüllt. Hierzu gibt man 100 ml FCS (fötales Kälberserum).
- Die Selektion transformierter Zellen führt man aus durch Kultivierung in obigem Medium, welches mit Mycophenolsäure, 6 mg/l, (RPMI-XHMT) supplementiert ist. Nach 2-wöchiger Kultivierung und Ersetzen der Hälfte des Mediums durch eine frische Portion in 3-tägigen Intervallen ist die Selektion beendet.
- Für L(tk&supmin;)-Zellen (Thymidinkinase-deffiziente Maus-Fibroblastenzellen, wie beschrieben in Exp. Cell. Res., 31, 297-312) wurden pKSV-10-γ-gpt und pKSV-10-γ-tk mit Hilfe der Kalziumphosphat-Methode eingeführt. Die Selektion wurde in gleicher Weise wie oben beschrieben unter Verwendung von RPMI-XHMT-Mediuin bzw. RPMI-HAT-Medium durchgeführt.
- Die mit pKSV-10-γ-gpt transformierten Myelomzellen X63-Ag8- 6.5.3 (HGPRT&supmin;) wurden auf 5 · 10&sup4; Zellen/ml mit einem Medium der im folgenden angegebenen Zusammensetzung eingestellt. Eine 20-ml-Portion der Suspension gibt man in eine Schale mit einem Durchmesser von 100 mm und kultiviert 4 Tage in einem Tnkubator bei 37ºC. Die Zellen werden geerntet und in einem Schüttelkolben in einer Zelldichte von 8 · 10&sup4; Zellen/ml und einem Kulturvolumen von 100 ml vorgelegt und in einem bei 37ºC gehaltenen Klimaraum bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 50 Upm kultiviert.
- In einem Gemisch aus 8 Volumina RPMI-1640 (Sigma; 1 Liter), 1 Volumen DME (Sigma) und 1 Volumen F-12 (Sigma) löst man 25 mM HEPES (Sigma), 4 g Glucose, 2 g Natriumbicarbonat, 3,5 ug 2-Mercaptoethanol, 36 mg Kanamycin, 150 mg Streptomycin, 250 mg Xanthin, 13, 6 mg Hypoxanthin und 3,87 mg Thymidin und bringt das Gesamtvolumen auf 1 Liter. Hierzu gibt man Mycophenolsäure (6 mg/l). Das resultierende Gemisch wird außerdem durch 100 ml NU-Serum (Collaborative Research) ergänzt.
- Ab dem Tag 5 wird die Hälfte des Mediums durch eine frische Portion des Mediums täglich ersetzt. Die Kultivierung setzt man fort, wobei man die Zelldichte in dem Schüttelkolben bei 1,0 · 10&sup6; bis 1,5 · 10&sup6; pro ml hält. Den Kulturüberstand isoliert man täglich und testet diesen wie im folgenden beschrieben.
- Die gemäß Abschnitt II erhaltenen transformierten L-Zellen kultiviert man in 60 ml-Schalen in herkömmlicher Weise und testet den jeweiligen Überstand wie im folgenden beschrieben.
- In einem getrennten Ansatz werden 7 Wochen alte nackte Balb/c nu/nu-Mäuse intraperitoneal mit 0,5 ml Pristan (2,6,10, 14-Tetramethyl-pentadecan; Wako Pure Chemical Industries) inokuliert und nach einer Woche zusätzlich intraperitoneal mit 1 · 10&sup7; Myelomzellen X63-Ag8-6.5.3 (HGPRT&supmin;), transformiert mit pKSV-10- γ-gpt, inokuliert. Nach 20-tägiger Fütterung isoliert man die Ascitisflüssigkeit und testet diese wie im folgenden beschrieben.
- Kulturüberstand und Ascitisflüssigkeit-Proben testet man auf γ- IFN unter Verwendung des 50% -zytopathischer-Effekt-(CPE)-Inhibitionstests in einer 96-er Mikrotiterplatte wie von Philip et al. (Methods in Enzyinology, 78, 389-394 (1981)) beschrieben. Hierzu verwendet man menschliche Amnion-abgeleitete FL-Zellen und SV (Shindbis-Virus) zusammen mit α-IFN-Standard, erhältlich von NIH, und γ-IFN, erhältlich von Genentech.
- Die hierbei erhaltenen Testergebnisse sind im folgenden zusammengefaßt.
- In vitro-Kultur: Vektor Wirt γ-IFN-Titer Intraperitoneale Kultur in Balb/c nu/nu-Maus:
- Während die Kultivierung der Schüttelkultur über einen Zeitraum von 20 Tagen fortgesetzt wurde, blieb die Produktion in der Hälfte des täglich abgetrennten Mediums ab dem 5. Kultivierungstag annähernd gleich. Die Expression von 4 · 10&sup5; U/ml bei 50 ml Medium/100 ml Schüttelkolben/Tag stellt ein sehr hervorragendes Ergebnis dar. Es wird angenommen, daß eine Kultivierung bei hoher Dichte unter Verwendung von Hohlfasern eine Expression von 5 · 10&sup7; U/ml ergeben wird. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein exzellentes Verfahren zur Peptidherstellung dar.
- Die Expression des α-TFN-Gens, das anstelle des γ-IFN-Gens in pKSV-10-γ-gpt und X63-Ag8-6.5.3 verwendet wurde, ergab Titer von 1 · 10&sup4; U/ml bzw. 2 · 10³ U/ml.
- Führt man die Expression in pKSV-10-γ-gpt und X63-Ag8-6.5.3 in einer Schüttelkultur aus und verwendet ein Medium, das keinerlei Serum enthält (und lediglich Insulin, Transferrin, Selen, Ethanolamin und Rinderseruinalbumin (BSA) anstelle FCS enthält), so erhält man einen Titer von 1 · 10&sup6; U/ml.
Claims (7)
1. verfahren zur Herstellung von Peptiden, wobei man:
(1) Myelomzellen mit einem Vektor transformiert, der die SV40-
Early Promotor-Sequenz sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen
Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für das
Peptid codierenden Gens aufweist;
(2) die transformierten Zellen kultiviert und
(3) das gewünschte Peptid reinigt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Myelomzelle
ausgewählt ist unter Mausmyelomzellen, Rattenmyelomzellen und
menschlichen Myelomzellen.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die Mausmyelomzellen
ausgewählt sind unter P3-X63-Ag8-U1 HGPRT&supmin;, X63-Ag8-6.5.3
HGPRT&supmin; und SP2/0-Ag14 HGPRT&supmin;.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Peptid ausgewählt ist
unter Lymphokinen, Hormonen, antigenen Proteinen,
Gewebeplasminogenaktivator und Somatomedinen.
5. Myelomzelle, transformiert mit einem Vektor, der die SV40-
Early Promotor-Sequenz sowohl am 5'-stromaufwärts gelegenen
Ende als auch am 3'-stromabwärts gelegenen Ende des für ein
bestimmtes Peptid codierenden Gens aufweist, dadurch
gekennzeichnet, daß die erste SV40-Early Promotor-Sequenz in
einem Bereich von mehreren zehn Basenpaaren stromaufwärts vom
startcodon eines Gens für das jeweilige Peptid angeordnet ist
und die zweite SV40-Early Promotor-Sequenz in einem Bereich von
mehreren Kilobasenpaaren stromabwärts von dem für das jeweilige
Peptid codierenden Gen angeordnet ist.
6. Myelomzelle nach Anspruch 5, worin der Vektor in 5' → 3'-
Richtung folgendes umfaßt:
(1) eine erste SV40-Early Promotor-Sequenz,
(2) ein für das gewünschte Peptid codierendes Gen,
(3) eine erste SV40-Terminator-Seguenz,
(4) eine zweite SV40-Early Promotor-Sequenz,
(5) ein für einen selektiven Marker codierendes Gen, und
(6) eine zweite SV40-Terminator-Sequenz.
7. Myelomzellen nach Anspruch 5 oder 6, worin das gewünschte
Peptid ausgewählt ist unter Lymphokinen, Hormonen, antigenen
Proteinen, Gewebe-Plasminogenaktivator und Somatomedinen.
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