DE3887635T2 - Verfahren zur Herstellung von Produkten von Fremdgenen. - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Produkten von Fremdgenen.

Info

Publication number
DE3887635T2
DE3887635T2 DE3887635T DE3887635T DE3887635T2 DE 3887635 T2 DE3887635 T2 DE 3887635T2 DE 3887635 T DE3887635 T DE 3887635T DE 3887635 T DE3887635 T DE 3887635T DE 3887635 T2 DE3887635 T2 DE 3887635T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
ltr
plasmid
mmtv
located downstream
active substance
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE3887635T
Other languages
English (en)
Other versions
DE3887635D1 (de
Inventor
Minoru S H Ko
Toshiya Takano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Daiichi Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of DE3887635D1 publication Critical patent/DE3887635D1/de
Publication of DE3887635T2 publication Critical patent/DE3887635T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/56—IFN-alpha
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/12011—Betaretrovirus, e.g. mouse mammary tumour virus
    • C12N2740/12041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/12043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten, wobei man (1) Animalzellen transformiert, entweder (a) unter Verwendung von zwei Plasmiden, nämlich einem Plasmid, das den MMTV-LTR und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und das darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält, und einem Plasmid, das den LTR und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoid- Rezeptor-Protein codiert und die darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält oder (b) unter Verwendung eines Plasmides, das den LTR, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoid-Rezeptor-Protein codiert und die stromabwärts des LTR insertiert ist, einen weiteren LTR und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, enthält, und (2) die transformierten Animalzellen in einem Medium, das ein Glucocorticoid in einer zur Induktion der mRNA-Transkription wirksamen Menge enthält, kultiviert.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Bei dem Versuch, ein kloniertes Gen zur Untersuchung seiner Funktion in Animalzellen zu exprimieren, ist es manchmal schwierig, transformierte Zellen zu erhalten, weil die Expression des Gens die Zellproliferation stört. Um dieses Problem zu vermeiden, ist es notwendig, ein Expressionssystem zu besitzen, bei dem der Expressionsgrad unter nichtinduzierenden Bedingungen niedrig ist, und bei dem die gewünschte Genexpression wirksam induziert werden kann.
  • MMTV ist ein Retrovirus oder RNA-Virus. In MMTV-infizierten Zellen kommt das Virus als Provirus vor, nämlich in Form einer DNA, die in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert ist. An jedem Ende der so integrierten DNA befindet sich ein LTR, dessen Länge etwa 1,3 kbp beträgt und das aus drei Regionen, U3-R-U5, besteht. Die beiden LTRs liegen in der gleichen Richtung.
  • Der LTR besitzt sowohl eine Promotorfunktion als auch eine Transkriptions-Terminatorfunktion. In der U3-Region des LTR befindet sich eine Region, die in der Lage ist, Glucocorticoid- Rezeptor-Proteine (GRs) zu binden, und dies reguliert die RNA- Synthese. Somit wirkt, wenn ein GR an diese Region bindet, der LTR-Promotor derart, daß eine RNA-Synthese initiiert wird, wodurch ein Protein produziert wird. Der Rezeptor (GR) ist jedoch, wenn er einzeln verwendet wird, nicht zu einer Bindung in der Lage; d. h., daß nur die aktive Form des GR, die das Glucocorticoid gebunden hat, an die Rezeptorbindungsstelle von U3 binden kann, um den LTR zu aktivieren.
  • Es ist bereits ein System bekannt, das den Long-Terminal-Repeat (LTR) des Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV) zur Glucocorticoidinduzierten Expression von Fremdgenen verwendet (F. Lee et al., Nature, 294, 228-232 (1981)).
  • Die WO 88/00975, die ein Dokument nach Art. 54 (3) und (4) EPC darstellt, betrifft ein Plasmid, das den Long-Terminal-Repeat (LTR) des Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV) und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoid-Rezeptor-Protein codiert und die stromabwärts des LTR liegt, umfaßt.
  • Da der maximale Expressionsgrad durch die Zahl der GR-Moleküle, die natürlicherweise in den Zellen vorhanden sind, beschränkt ist, ist ein hoher Grad der Induktion der gewünschten Genexpression, was zu einer Produktion des gewünschten Produktes in großen Mengen führt, nicht erreicht worden.
    • KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es ist eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von infizierten Zellen bereitzustellen, das geeignet ist zur Herstellung eines Fremdgens, wobei man (1) Animalzellen transformiert, entweder (a) unter Verwendung von zwei Plasmiden, nämlich einem Plasmid, das den MMTV-LTR (im folgenden als "LTR" bezeichnet) und ein Fremdgen (ein Gen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert), das darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält, und einem Plasmid, das den LTR und ein GR-Gen, das darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält, oder (b) unter Verwendung eines Plasmides, das den LTR, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoid-Rezeptor-Protein codiert, und die stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR und ein Fremdgen zur Herstellung einer physiologisch aktiven Substanz, das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Superinduktionsverfahren zur Herstellung von physiologisch aktiven Substanzen in guter Ausbeute bereitzustellen, wobei man (1) Animalzellen kultiviert, die ein Chromosom besitzen, das den LTR, ein davon stromabwärts gelegenes Fremdgen, einen weiteren LTR und ein stromabwärts des letztgenannten LTR liegendes GR-Gen enthält, und (2) ein Glucocorticoid zu den resultierenden kultivierten Zellen zugibt, um eine Genexpression zu induzieren.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, Plasmide und Animalzellen bereitzustellen, die zur Verwendung bei der Ausführung der obigen Verfahren geeignet sind.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 zeigt ein Plasmidkonstruktionsschema für das Plasmid pMDSG. Fig. 2 zeigt ein Plasmidkonstruktionsschema für die Plasmide pMMGR und pMMifα. Fig. 3 zeigt ein Plasmidkonstruktionsschema für das Plasmid mit einem Induktionsgen und einem Produktionsgen. Fig. 4 zeigt ein Plasmidkonstruktionsschema für das Plasmid pBM011.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Zu zwei exemplarischen Plasmiden, die erfindungsgemäß konstruiert worden sind, zählen ein Plasmid (pMMGR), das den MMTV-LTR, der mit Dexamethason, einem Glucocorticoid, induzierbar ist, und eine DNA-Sequenz, die für den Glucocorticoid- Rezeptor codiert [Ratten-Glucocorticoidrezeptorgen; überlassen von Dr. K.R. Yamamoto; s. Cell, 46, 389-399 (1986)), das darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält, und ein Plasmid (pMMgal), das den MMTV-LTR und das Escherichia coli β-gal-Gen, das darin stromabwärts des LTR insertiert ist, enthält. Als mit diesen beiden Plasmiden Maus-Ltk&supmin;-Zellen, eine Säuger-Zellkulturlinie, transfiziert wurden, fand man, daß der Expressionsgrad im Vergleich zur Durchführung der Transfektion mit pMMgal allein genauso niedrig war in Abwesenheit von Dexamethason, aber wenigstens 100 Mal höher bei Anwesenheit von Dexamethason.
  • Weiterhin wurde eine Genexpression in einem System, das ein darin stabil eingebautes Gen enthielt, unter Verwendung eines Plasmides (pMMifα) bestätigt, das das Interferon α-Gen an Stelle des β-gal-Gens enthielt.
  • Da erfindungsgemäß die Zellen, die in der Lage sind, eine gewünschte Substanz zu produzieren, den MMTV-LTR, ein stromabwärts des LTR liegendes GR-Gen, einen weiteren MMTV-LTR und ein Fremdgen, das für eine gewünschte Substanz codiert, und das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, enthalten, wird die Expression eines stromabwärts des LTR liegenden GR-Gens durch Zugabe eines Glucocorticoides induziert, so daß sich die Anzahl der in den Zellen vorhandenen GR-Moleküle erhöht. Somit kann die Expression eines Fremdgens, das für eine gewünschte Substanz codiert, zu einem hohen Level induziert werden, und die gewünschte Substanz kann in großen Mengen hergestellt werden.
  • Somit umfaßt die Erfindung:
  • (1) Ein Plasmid, das den Long-Terminal-Repeat (LTR) des Maus- Mamma-Tumor-Virus (MMTV) und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, umfaßt;
  • (2) Ein Plasmid, das den LTR des MMTV, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt;
  • (3) Ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, eine physiologisch aktive Substanz zu produzieren, wobei man eine Animalzelle cotransfiziert mit (a) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, umfaßt, und (b) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt;
  • (4) Ein Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, eine physiologisch aktive Substanz zu produzieren, wobei man eine Animalzelle transfiziert mit einem Plasmid, das den LTR des MMTV, eine DNA-Sequenz, die für den Glucocorticoidrezeptor codiert und stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt;
  • (5) Eine Animalzelle, die cotransfiziert ist mit (a) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, umfaßt, und (b) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des LTR liegt, umfaßt;
  • (6) Eine Animalzelle, die auf einem ihrer Chromosomen den LTR des MMTV, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, trägt;
  • (7) Eine Animalzelle, die transfiziert ist mit einem Plasmid, das den LTR des MMTV, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt;
  • (8) Ein Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten, wobei man (1) eine Animalzelle cotransfiziert mit (a) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, umfaßt, und (b) einem Plasmid, das den LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert und stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, umfaßt, und (2) die so erhaltene transfizierte Zelle in Gegenwart eines Glucocorticoides vermehrt, um so die Expression der physiologisch aktiven Substanz zu induzieren;
  • (9) Ein Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten, wobei man eine Animalzelle, die auf einem ihrer Chromosomen den LTR des MMTV, eine DNA-Sequenz, die für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codiert und stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein Fremdgen, das für eine physiologisch aktive Substanz codiert, trägt, in Gegenwart eines Glucocorticoides vermehrt, um so die Expression der physiologisch aktiven Substanz zu induzieren.
  • Zu den Fremdgenprodukten, die erfindungsgemäß herzustellen sind, zählen verschiedene physiologisch aktive Substanzen, wie Lymphokine, Hormone, antigene Proteine, Peptide (z. B. tPAs) und Glycopeptide. Die Fremdgene, die für solche Substanzen codieren, können durch bekannte Methoden erhalten und verwendet werden.
  • Der LTR des MMTV ist bereits bekannt und wird von einer Reihe von Forschern bei deren Experimenten verwendet [s. J. Virol., 37, 226-238 (1981) und Nature, 294, 228-232 (1981)].
  • Das Glucocorticoidrezeptor-Protein und das dafür codierende Gen sind ebenfalls bekannt (s. Cell, 46, 389-399 (1986)).
  • Die Plasmide, die bei Anwendung der Erfindung verwendet werden, können auf übliche Weise konstruiert werden. Ein Beispiel wird hier später aufgeführt werden, mit dem Fall, daß zwei Plasmide eingesetzt werden.
  • Die Transfektion einer Zelle mit einem Induktions-Plasmid (enthaltend den LTR und ein GR-Gen) und einem Produktions- Plasmid (enthaltend den LTR und das Fremdgen, das für ein gewünschtes Produkt codiert) resultiert im Einbau des LTR-GR- Gens und des LTR-gewünschtes Produkt-Gens in ein Chromosom der Zelle. Zur Transfektion können die beiden Plasmide entweder gleichzeitig oder getrennt verwendet werden. Es ist natürlich möglich, eine Transfektion unter Verwendung eines einzelnen Plasmides durchzuführen, in das die beiden Gene insertiert worden sind.
  • Das Plasmid, das ein Induktions-Gen und ein Produktions-Gen enthält, kann konstruiert werden, indem man ein Induktions- Plasmid und ein Produktions-Plasmid, das jeweils vorher mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten worden ist, legiert.
  • Das Induktions-Plasmid und das Produktions-Plasmid, die in ein Chromosom einer Animalzelle eingebaut worden sind, können benachbart oder in einem Abstand zueinander vorliegen. Diese Plasmide können weiterhin auf verschiedenen Chromosomen liegen.
  • Wenn die transformierten Zellen in einem Glucocorticoidhaltigen Medium kultiviert werden, geschieht folgendes:
  • (1) Das Glucocorticoid bindet das Rezeptor-Protein (GR), das in geringen Mengen im Cytoplasma vorkommt, was eine aktivierte Form des Rezeptors ergibt.
  • (2) Diese aktive Form des Rezeptors erreicht den Kern und bindet an die Rezeptorbindungsstelle in U3 des MMTV-LTR auf dem Chromosom.
  • (3) Sodann wirkt der LTR-Promotor, wodurch das davon stromabwärts liegende Gen exprimiert wird und das GR-Protein produziert wird. (Das gewünschte Protein wird ebenso in einer geringen Menge produziert.)
  • (4) Das produzierte GR-Protein bindet das Glucocorticoid, was eine zusätzliche Menge der aktiven Form des Rezeptors ergibt. Die Wiederholung der Schritte (2)-(4) resultiert in der Produktion des GR-Proteins in einer erhöhten Menge in dem System, und dies führt zur Produktion des gewünschten Proteins in einer großen Menge.
  • Die Transfektion von Zellen mit dem Plasmid oder den Plasmiden kann mit üblichen Methoden durchgeführt werden, z. B. mit der Kalziumphosphat-Methode. Wenn zwei Plasmide verwendet werden, wird das Plasmid zur Produktion der gewünschten Substanz in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 mol, vorzugsweise von etwa 1 bis 10 mol, pro mol des GR-Gen-enthaltenden Plasmides verwendet.
  • Als Zellen können verschiedene kultivierte Zellinien verwendet werden, die für verschiedene Zwecke geschaffen worden sind und gegenwärtig erhältlich sind. Zum Beispiel können, neben anderen, die BHK 21 (von Baby-Hamster-Nieren abgeleitete Fibroblasten-ähnliche kultivierte Zellinie), CV-1 (von Affennieren abgeleitete Fibroblasten-ähnliche kultivierte Zellinie) und HeLa tk&supmin; (von humanem Cervix-Krebs abgeleitete kultivierte Zellinie) genannt werden. Die Zellkultur kann unter Verwendung von Medien und Verfahren, die für die jeweiligen Zellinien bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Zellen, in die das fragliche Gen und andere eingebaut worden sind, können mit jedem Verfahren, das allgemein auf diesem Gebiet angewendet wird, selektioniert werden. So können z. B., wenn ein Plasmid, das ein Gen für ein Enzym zur Inaktivierung eines Antibiotikums enthält, das stromabwärts des SV40- Promotors insertiert ist, als Gemisch mit einem Plasmid der erfindungsgemäßen Plasmide als Selektionsmarker verwendet wird, und resistente Stämme in einem Medium, das das relevante Antibiotikum enthält, selektiert werden, Stämme erhalten werden, bei denen die Plasmide in ein Chromosom eingebaut worden sind. Es ist natürlich möglich, eine Selektion durchzuführen, indem man ein Gen zur Selektion in eines der erfindungsgemäßen Plasmide insertiert.
  • Das Glucocorticoid, das zur Induktion verwendet wird, kann man z. B. aus denen auswählen, die bekannt oder in der Literatur beschrieben sind, wie Dexamethason, Cortisone, Hydrocortisone und Dehydrocortisone.
  • Das Glucocorticoid wird dem Kulturmedium zugegeben, so daß man eine Endkonzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;&sup7; M erhält.
  • Die folgenden Beispiele dienen nur Illustrationszwecken, und es ist keineswegs beabsichtigt, den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu beschränken.
    • BEISPIEL 1 KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSVEKTORS pMMEx
  • Der Ki-MSV Plasmid-Klon 4 [N. Tsuchida et al., J. Virol., 38, 720 (1981)] wurde mit SmaI geschnitten, und ein Promotorenthaltendes Fragment (etwa 0,6 kbp) wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Das Fragment wurde in Gegenwart von T4-Ligase in pUC9 (Pharmacia), das vorher mit SmaI aufgeschnitten worden war, ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde verwendet, um Escherichia coli (im folgenden abgekürzt als E. coli) HB101 zu transformieren. Das so erhaltene Plasmid wurde pKi-LTR (s. Fig. 1) genannt.
  • Das Plasmid pKi-LTR wurde mit SmaI aufgeschnitten und in Gegenwart von T4-Ligase mit einem 5'-phosphorylierten HindIII- Linker ligiert, gefolgt von Spaltung mit HindIII. Ein U3- (Promotor-)enthaltendes Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert und in Gegenwart von T4-Ligase in pUC9, das vorher mit HindIII aufgeschnitten worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und ein Plasmid mit dem darin insertierten Fragment wurde erhalten (s. Fig. 1). Dieses Plasmid wurde mit AvaI und EcoRI aufgeschnitten. Getrennt davon wurde pKi-LTR mit AvaI und HaeIII aufgeschnitten, der EcoRI-Linker wurde zugegeben, und die Spaltung mit EcoRI wurde zur Konversion des HaeIII-Endes (glattes Ende) in ein EcoRI-Ende durchgeführt, wodurch man ein (U5)-enthaltendes Fragment (etwa 0,25 kbp) mit einer Poly(A)-Additionsregion erhielt. Das so erhaltene Fragment wurde in Gegenwart von T4-Ligase mit dem oben erwähnten pUC9-hergeleiteten Fragment ligiert. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und ein Plasmid mit dem insertierten Fragment wurde erhalten und pKIEx (s. Fig. 1) genannt.
  • Das Plasmid pMDSG [F. Lee et al., Nature, 294, 228 (1981)) wurde mit HindIII aufgeschnitten, und ein MMTV-Promotorenthaltendes Fragment (etwa 1,4 kbp) wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Getrennt davon wurde pKIEx mit HindIII aufgeschnitten, ein größeres Fragment, das den pKI-LTR- hergeleiteten Promotor nicht mehr besaß, wurde isoliert und in Gegenwart von T4-Ligase mit dem oben erwähnten 1,4 kbp-Fragment ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und ein Plasmid, pMMEx, mit dem darin insertierten MMTV-Promotor-Fragment wurde erhalten (s. Fig. 1).
    • BEISPIEL 2 Konstruktion der Expressionsvektoren pMMGR und pMMifα
  • Das Plasmid pRBal 117 [R. Miesfeld et al., Cell, 46, 389 (1986)) wurde mit BamHI aufgeschnitten, und ein das Ratten- Corticoidrezeptor-Gen enthaltendes Fragment (etwa 2,8 kbp) wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Dies Fragment wurde in Gegenwart von T4-Ligase in pMMEx, das vorher mit BamHI aufgeschnitten worden war, ligiert, das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und ein Plasmid mit dem darin insertierten Rezeptor-Gen, pMMGR, wurde erhalten (s. Fig. 2). Ein das Plasmidenthaltender Stamm, nämlich E. coli pMMGR, ist beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-2052 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt worden.
  • Das das Interferon-α-Gen (ifα) enthaltende Plasmid pBP011 (siehe Referenzbeispiel) wurde mit NcoI und XbaI aufgeschnitten, und ein ifα enthaltendes Fragment (0,5 kbp) wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Dies Fragment wurde durch Behandlung mit dem DNA-Polymerase-I-Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTPs mit glatten Enden versehen und dann mit pMMEx, das vorher mit HincII aufgeschnitten worden war, ligiert, wodurch ein Plasmid, pMMifα, mit dem darin insertierten Gen erhalten wurde (s. Fig. 2). Ein das Plasmid enthaltender Stamm, nämlich E. coli MMifα, ist beim Fermentation Research Institute mit der Hinterlegungsnummer FERM BP- 2053 gemäß Budapester Vertrag hinterlegt worden.
    • BEISPIEL 3 Expression von Interferon α in L-Zellen
  • Ltk&supmin;-Zellen einer Maus-Fibroplasten-ähnlichen Zellinie ließ man in MEM (Eagle's minimales essentielles Medium), das mit 10% (v/v) FCS (fötales Kälberserum) ergänzt worden war, bis zu 1 · 106 Zellen pro Schale wachsen. Ein Austausch des Mediums durch frisches Medium wurde 4 Stunden vor der Transfektion durchgeführt. Ein Lösungsgemisch der folgenden drei Plasmide wurde hergestellt:
  • (Mol-Verhältnis)
  • pSV2neo (ATCC 37140) 0,5 ug ( 1)
  • pMMGR 33 ug (50)
  • pMMifα 5 ug (10)
  • pSV2neo, ein Plasmid, das ein Gen enthält, das für ein Neomycin-inaktivierendes Enzym codiert, was als Selektionsmarker dienen kann, wurde vom ATCC erworben. Zu dem Gemisch wurden 11,5 ug einer Träger-DNA (Rinder-Thymus-DNA) zugegeben. Wasser wurde zugegeben, um ein Gesamtvolumen von 2,2 ml zu erhalten, und sodann wurden 300 ul 2 M Kalziumchlorid zugegeben, was Lösung I ergab. Lösung 11 wurde hergestellt, die die folgende Zusammensetzung besaß
  • 2 · HBS (HEPES 10 g/l - Natriumchlorid 16 g/l) 2,5 ml
  • 100 · Phosphatpuffer (70 mM Na&sub2;HPO&sub4; - 70 mM NaH&sub2;PO&sub4;) 50 ul
  • Lösung I und Lösung II wurden langsam miteinander vermischt, was eine Suspension ergab. Nachdem man sie 30 Minuten lang stehengelassen hatte, wurde 1 ml der Suspension in eine Schale transferiert, die die darin wachsenden, oben erwähnten Ltk&supmin;- Zellen enthielt.
  • Nach 12 Stunden wurde das Medium durch frisches Medium ersetzt. Nach 2 weiteren Tagen begann eine Kultivierung in einem Medium, das 0,4 g pro Liter G418 (Gibco), ein Neomycin-ähnliches Antibiotikum, enthielt (Potenz: berechnet auf Basis der antimikrobiellen Aktivität), und wurde mit einem Mediumaustausch in 3- bis 4-tägigen Intervallen fortgesetzt. Kolonien, die 2 Wochen nach der DNA-Einführung gefunden wurden, wurden in eine 96-Loch-Mikrotiterplatte transferiert. Wenn die Löcher jeweils mit Zellen gefüllt waren (konfluent), wurde das Medium durch ein Medium ersetzt, das 1 · 10&supmin;&sup6; M Dexamethason enthielt. 2 Tage später wurde ein Interferon-Aktivitätsassay gemäß dem Verfahren, das in P.C. Familletti et al., Meth. Enzym., 78, 387 (1981) beschrieben ist, durchgeführt.
  • Unter den so erhaltenen Klonen wurden die 6 Kolonien mit dem höchsten Aktivitätsgrad ausgewählt und in Schalen (35 mm Durchmesser) transferiert. Nach Wachstum in den Schalen fast bis zur Konfluenz wurde das Wachstum für jeden Klon fast bis zur Konfluenz in zwei 35-mm Schalen wiederholt. Sodann wurde Dexamethason zu einer der beiden Schalen in einer Konzentration von 1 · 10&supmin;&sup6; M zugegeben. Das Dexamethason-ergänzte Medium und das Dexamethason-freie Medium wurden 48 Stunden nach Zugabe des Dexamethason auf ihre Interferonaktivität hin getestet.
  • 5 von 51 Klonen zeigten eine Interferonaktivität von nicht weniger als 104 U/ml mit einer Häufigkeit von etwa 1/5. Der Aktivitätsbereich 103 bis 5 · 103 U/ml besaß die höchste Häufigkeit (25 Klone). Für diejenigen Klone, die eine Aktivität aufwiesen, die 104 U/ml überstieg, sind die Aktivitätsdaten, die in Gegenwart von Dexamethason (+dex) und in dessen Abwesenheit (dex-) erhalten wurden, in der unten stehenden Tabelle gezeigt.
  • Die Anzahl der Kopien, die in die Chromosomen insertiert worden waren, wurde untersucht mittels Isolierung der chromosomalen DNA des Klons Lif10 und des Klons Lif41 und mittels Durchführung von Spaltungen mit BamHI, BamHI + PstI, und EcoRI, Agarosegelelektrophorese, Blotten auf Nitrocellulose und Hybridisierung mit pMMGR und pMMif&alpha;. Man fand heraus, daß bei beiden Klonen die Kopienanzahl etwa 100 jeweils für das GR-Gen und das Interferon &alpha;-Gen betrug. Tabelle Klon Nr. Relative Induktion (n-fach) Bemerkung: "< 2" bedeutet "unterhalb der Nachweisgrenze".
    • BEISPIEL 4 Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein Induktions-Gen und ein Produktions-Gen enthält
  • Das in Beispiel 2 erhaltene Plasmid pMMGR wurde partiell mit PvuII verdaut und ein Plasmid, das einen MMTV-LTR, ein GR-Gen und eine poly(A)-Additions-Region (etwa 4,8 kbp) enthielt, wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Getrennt davon wurde das in Beispiel 2 erhaltene Plasmid pMMif&alpha; mit NdeI geschnitten, gefolgt von einer Behandlung mit dem DNA- Polymerase I Klenow-Fragment in Gegenwart von dNTPs, um das geschnittene Ende in ein glattes Ende umzuwandeln. Dieses DNA- Fragment wurde mit dem oben erwähnten 4,8 kbp-Fragment in Gegenwart von T4-Ligase ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid wurde verwendet, um E. coli HB101 zu transformieren, und ein Plasmid mit einem Induktions-Gen und einem Produktions- Gen wurde erhalten (Fig. 3).
    • Referenzbeispiel Konstruktion des Plasmides pBP011
  • Das Plasmid pBM034 [Agric. Biol. Chem. 51(6), 1573-1580 (1987)] wurde mit XbaII und HpaII geschnitten, und ein Interferon &alpha;-Gen (if&alpha;)-enthaltendes Fragment (etwa 570 bp), dem das Initiations- Codon ATG fehlte, wurde mittels Agarosegelelektrophorese isoliert. Getrennt davon wurden die folgenden DNA-Fragmente, Pr-B-11 und Pr-B-12, chemisch synthetisiert.
  • Diese Fragmente waren komplementär zueinander, so daß sie eine doppelsträngige DNA bilden konnten. Weiterhin besaßen diese Fragmente eine NcoI-Schnittstelle und waren in der Lage, mit einem Ende an eine HpaII-Schnittstelle eines anderen DNA- Fragmentes zu binden. Pr-B-12 wurde an dessen 5'-Ende in Gegenwart von T4-Kinase phosphoryliert und an Pr-B-11 angelagert, um eine doppelsträngige DNA zu bilden.
  • Das so erhaltene angelagerte Fragment wurde in Gegenwart von T4-Ligase mit dem oben beschriebenen if&alpha;-Gen-enthaltenden Fragment ligiert, und ein etwa 600 bp großes DNA-Fragment wurde mittels Agarosegelelektrophorese erhalten. Sodann wurde das resultierende DNA-Fragment in Gegenwart von T4-Kinase phosphoryliert, gefolgt von einer Ligation in Gegenwart von T4- Ligase mit dem Plasmid pBM010 (siehe oben), das vorher mit EcoRV und XbaI geschnitten worden war. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde verwendet, um U. coli HB101 zu transformieren, und das aus den Transformanten erhaltene Plasmid wurde pBP011 genannt (Fig. 4).
  • Das erfindungsgemäße Superinduktionsverfahren besitzt die folgenden vorteilhaften Merkmale:
  • (i) Im nicht-induzierten Zustand ist der Expressionsgrad sehr niedrig. Diese Eigenschaft ist in den Fällen vorteilhaft, in denen das Expressionsprodukt toxisch auf die Zellen wirkt. Das heißt, daß in Systemen, bei denen Genprodukte kontinuierlich gebildet werden, wie in üblichen Hochexpressionssystemen, der Einbau des Gens in die Zellen zu einer Expression von cytotoxischen Substanzen führt und die Zellen nicht mehr in der Lage sind zu wachsen oder absterben, was zu einem Scheitern der Zellklonierung führt. Im Gegensatz dazu können Zellen in dem erfindungsgemäßen Superinduktionssystem, bei dem der Expressionsgrad im nicht-induzierten Zustand sehr niedrig ist, kloniert werden, ohne einen Schaden an ihnen zu verursachen, und die Induktion kann nach einer Massenkultivierung der Zellen bewirkt werden. Daher ist dieses Verfahren zur Produktion von großen Mengen der gewünschten Substanz geeignet.
  • (ii) Klone, die eine 10 000-fache oder größere relative Induktion zeigen, können mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Unter den bisher bekannten Systemen zur induzierbaren Gen-Expression ist das mit der höchsten relativen Induktion vielleicht ein System, das das MMTV einschließt, und bei einigen Zellklonen kann die Genexpression in einer Höhe induziert werden, die dem etwa 1000-fachen des mRNA-Gehaltes entspricht. Dies trifft jedoch nur auf die Fälle zu, in denen das Virus selbst in die Zellen eingebaut wird. Wenn Zellen mit einer Rekombinante transfiziert werden, die vom MMTV durch Insertion eines Markergens stromabwärts davon hergeleitet ist, beträgt die relative Induktion höchstens einige 10-fache, obwohl dies in Abhängigkeit von den Zellen variieren kann. Obwohl das erfindungsgemäße Superinduktions-System dem letztgenannten Fall insoweit ähnlich ist, als daß das Gen, das für das gewünschte Produkt codiert, für eine Transfektion stromabwärts des MMTV insertiert wird, kann ein sehr hoher Induktionsgrad in dem erfindungsgemäßen Superinduktions-System erreicht werden. Je höher die relative Induktion ist, desto höher ist der maximale Produktionsgrad. Somit ist das Superinduktions-Verfahren vorteilhaft für eine Produktion in großen Mengen.
  • Während die Erfindung detailliert und unter Bezugnahme auf besondere Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Sinn und Umfang abzuweichen.

Claims (9)

1. Plasmid, umfassend den Long Terminal Repeat (LTR) des Maus-Mamma-Tumor-Virus (MMTV) und eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein für eine physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen, das stromabwärts vom letztgenannten LTR liegt.
2. Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, eine physiologisch aktive Substanz herzustellen, indem man eine Animalzelle cotransfiziert mit (a) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, und (b) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und ein für eine-physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen, das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt.
3. Verfahren zur Herstellung von Zellen, die in der Lage sind, eine physiologisch aktive Substanz zu produzieren, umfassend die Transfektion einer Animalzelle mit einem Plasmid gemäß Anspruch 1.
4. Animalzelle, cotransfiziert mit (a) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, und (b) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und ein für eine physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen, das stromabwärts des LTR liegt.
5. Animalzelle, enthaltend auf einem ihrer Chromosomen den LTR des MMTV, eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein für eine physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen, das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt.
6. Animalzelle, transfiziert mit einem Plasmid gemäß Anspruch 1.
7. Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten, umfassend (1) die Cotransfektion einer Animalzelle mit (a) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, und (b) einem Plasmid, umfassend den LTR des MMTV und ein für eine physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen, das stromabwärts des letztgenannten LTR liegt, und (2) die Vermehrung der so erhaltenen transfizierten Zelle in Gegenwart eines Glucocorticoides, um die Expression der physiologisch aktiven Substanz zu induzieren.
8. Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten, umfassend die Vermehrung einer Animalzelle, die auf einem ihrer Chromosomen den LTR des MMTV, eine für das Glucocorticoidrezeptor-Protein codierende DNA-Sequenz, die stromabwärts des LTR liegt, einen weiteren LTR des MMTV und ein für eine physiologisch aktive Substanz codierendes Fremdgen trägt, in Gegenwart eines Glucocorticoides, um die Expression der physiologisch aktiven Substanz zu induzieren.
9. Verfahren zur Herstellung von Fremdgenprodukten gemäß den Ansprüchen 7 oder 8, wobei das Glucocorticoid ausgewählt ist unter Dexamethason, einem Cortison, einem Hydrocortison und einem Dehydrocortison.
DE3887635T 1987-11-09 1988-11-08 Verfahren zur Herstellung von Produkten von Fremdgenen. Expired - Lifetime DE3887635T2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP28289387 1987-11-09

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE3887635D1 DE3887635D1 (de) 1994-03-17
DE3887635T2 true DE3887635T2 (de) 1994-06-01

Family

ID=17658465

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE3887635T Expired - Lifetime DE3887635T2 (de) 1987-11-09 1988-11-08 Verfahren zur Herstellung von Produkten von Fremdgenen.

Country Status (6)

Country Link
US (2) US5646013A (de)
EP (1) EP0316717B1 (de)
AT (1) ATE101198T1 (de)
CA (1) CA1309044C (de)
DE (1) DE3887635T2 (de)
ES (1) ES2061604T3 (de)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7802587A (en) * 1986-08-01 1988-02-24 Genetics Institute Inc. High level inducible expression of heterologous genes
EP0495465A3 (en) * 1991-01-15 1992-12-16 Coulston International Corporation Immuno-enzymatic test for the detection of viral antibody
US5665873A (en) * 1995-02-09 1997-09-09 Dana Farber Cancer Institute Glucocorticoid response elements
FR2782732A1 (fr) * 1998-08-28 2000-03-03 Transgene Sa Systeme d'expression inductible
US6268178B1 (en) 1999-05-25 2001-07-31 Phage Biotechnology Corp. Phage-dependent super-production of biologically active protein and peptides
CA2524619A1 (en) * 2005-11-22 2007-05-22 Ottawa Health Research Institute Novel stem cells, nucleotide sequences and proteins therefrom

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH651308A5 (de) * 1980-07-01 1985-09-13 Hoffmann La Roche Interferone und deren herstellung.
US4374927A (en) * 1981-02-24 1983-02-22 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University Extrachromosomal regulation of expression
EP0105141A3 (de) * 1982-09-09 1985-12-04 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rekombinante DNS Moleküle, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung zur Herstellung von Hepatitis B Oberflächen-Antigen (HBsAg) und pharmazeutische Zusammensetzungen die das HBsAg enthalten
JPH0630590B2 (ja) * 1985-08-30 1994-04-27 株式会社ヤクルト本社 複合プラスミドベクタ−
EP0213628A3 (de) * 1985-09-03 1988-09-21 Yeda Research And Development Company, Ltd. Expression von Superoxiddismutase in eukaryotischen Zellen
AU7802587A (en) * 1986-08-01 1988-02-24 Genetics Institute Inc. High level inducible expression of heterologous genes
US5071773A (en) * 1986-10-24 1991-12-10 The Salk Institute For Biological Studies Hormone receptor-related bioassays

Also Published As

Publication number Publication date
ATE101198T1 (de) 1994-02-15
EP0316717B1 (de) 1994-02-02
DE3887635D1 (de) 1994-03-17
EP0316717A1 (de) 1989-05-24
US5534419A (en) 1996-07-09
CA1309044C (en) 1992-10-20
ES2061604T3 (es) 1994-12-16
US5646013A (en) 1997-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3884610T2 (de) Durch sterole regulierbare promoterelemente.
DE3586335T2 (de) Herstellung von gamma-interferon.
DE69402863T2 (de) Regulierung der stellen-spezifischen rekombination durch stellen-spezifische fusionsproteine, die aus rekombinase und nuklearem rezeptor bestehen
DE69032809T2 (de) Herstellung von Proteinen mittels homologer Rekombination
DE68926892T3 (de) Verfahren zur Herstellung von Zellen, die stabil integrierte fremde DNS mit hoher Kopiezahl enthalten, durch dieses Verfahren hergestellte Zellen und Verwendung dieser Zellen zur Herstellung von durch diese fremde DNS kodierten Polypeptiden
DE3486469T2 (de) Herstellung heterodimirer menschlicher Fruchtbarkeitshormone
DE69830312T2 (de) Methode zur spezifischen integration von genen in säugetierzellen durch homologe rekombination, und vektoren zu deren durchführung
DE3650774T2 (de) Rekombinante Fibroblasten-Wachstums-Faktoren
DE3485869T2 (de) Herstellung heterodimerer menschlicher fruchtbarkeitshormone.
DE69030740T2 (de) Rekombinantes DNS-Verfahren und Wirtszellen
DE3382789T2 (de) Tierische Interferone, Verfahren bei deren Herstellung, dieselben enthaltende Zusammensetzungen, kodierende DNS-Sequenzen hierfür und diese Sequenzen enthaltende Expressionsvektoren und dadurch transformierte Zellen.
DE69329031T2 (de) Das dorsalgewebe beeinflussender faktor
DE69231676T2 (de) Methoden zur selektion von rekombinanten wirtszellen welche hohe mengen von einem gewünschten protein exprimieren
DE69432901T2 (de) Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen
CH663619A5 (de) Polypeptide, welche die aminosaeuresequenz und die biologische aktivitaet von reifem human-immuninterferon aufweisen.
DE69131426T2 (de) Neue wasserlösliche polypeptide mit hoher affinität für alpha- und beta- interferone
DE69331931T2 (de) Synthetische eukaryotische Promotoren welche zwei induzierbare Elemente enthalten
DE69132429T2 (de) Expressionssystem
DE69027948T2 (de) Reinigung von rekombinantem, menschlichem Interleukin-3
EP1000154B1 (de) Identifizierung humaner zellinien zur produktion humaner proteine durch endogene genaktivierung
DE69227589T2 (de) Ecdysteroid-abhängige gen regulierung in säugetier-zellen
DE69331551T2 (de) Rinder-&#34;hitzeschock&#34;-promoter und dessen verwendung
DE3750348T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dazu zu verwendendes rekombinantes Plasmid und mit diesem Plasmid transformierte Myelomzellen.
DE602005003369T2 (de) Neue sequenz um die expression einer nukleinsäure zu erhöhen
DE69125292T2 (de) Expression in nicht-tumorbildenden menschlichen Lymphoblasten Zellinien mit einem integrierenden Vektor

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition