DE3485869T2 - Herstellung heterodimerer menschlicher fruchtbarkeitshormone. - Google Patents

Herstellung heterodimerer menschlicher fruchtbarkeitshormone.

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Description

  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung rekombinanter DNA-Techniken zur Herstellung heteropolymerer Proteinhormone.
  • Mittels rekombinanter DNA-Technologie wurden verschiedene Polypeptidketten in Wirtszellen wie Bakterien, Hefe und kultivierten Säugerzellen exprimiert. Fiddes, J.C. und Goodman, H.M. (1979) Nature Bd. 281, S. 351-356 und Fiddes, J.C. und Goodman, H.M. (1980) Nature Bd. 286, S. 684-687 beschreiben das Klonieren der Alpha- bzw. Beta-Untereinheiten des menschlichen Choriogonadotropins (HCG).
  • In US-A-4383036 (Kaname) wird ein Verfahren zur Herstellung von HCG beschrieben, wobei menschliche lymphoblastoide Zellen in ein Versuchstier implantiert, dem hier entnommen und in vitro kultiviert werden; dann wird akkumuliertes HCG von der Kultur geerntet.
  • Gemäß einem ersten Merkmal der Erfindung wird ein Verfahren zur Bereitung eines biologisch aktiven, posttranslational modifizierten, proteinischen, aus einer Vielzahl von Untereinheiten bestehenden Hormons geschaffen, wobei das Verfahren gemeinsames Synthetisieren jeder der Untereinheiten in einer eukaryontischen Zelle umfaßt, die mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transfektiert ist, die heterologe DNA beinhalten, die jede der Untereinheiten codiert. Das Hormon kann HCG, luteinisierendes Hormon (LH), follikelstimulierendes Hormon (FSH) oder schilddrüsenstimulierendes Hormon (TSH) sein.
  • Die post-translationale Modifikation kann Glykosylierung sein. Vorzugsweise ist das Hormon ein Fruchtbarkeitshormon und kann ein menschliches Hormon sein. Das Hormon kann heterodimer oder anders heteropolymer sein.
  • Gemäß einem zweiten Merkmal der Erfindung wird eine eukaryontische Zelle geschaffen, die mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transfektiert ist, wobei die Zelle ein biologisch aktives, posttranslational modifiziertes, proteinisches Hormon mit einer Vielzahl von Untereinheiten erzeugen kann, wobei die Untereinheiten des Hormons durch heterolologe DNA in dem oder den Expresionsvektor(en) codiert werden.
  • Die Zelle kann eine Affen- oder Mauszelle sein. Bei einigen Ausführungsformen ist die Zelle mit mehr als einem Expressionsvektor transfektiert und jeder Vektor umfaßt heterologe DNA, die eine bestimmte Untereinheit codiert, während in anderen Ausführungsformen die Zelle mit einem einzigen Expressionsvektor transfektiert ist, der eine heterologe DNA umfaßt, die jede Untereinheit codiert. Welche Anordnung auch bevorzugt ist, jede heterologe, Untereinheit-codierende DNA kann nach Wunsch unter der Kontrolle eines entsprechenden Promotors stehen; die Verwendung verschiedener Promotoren verringert vorteilhaft die Möglichkeit unerwünschter Rekombinationen auf ein Minimum. Zur Verwendung in dieser Erfindung bevorzugte Promotoren umfassen den späten SV40-Promotor, den Maus-Metallothionein- Promotor und den menschlichen Papillomvirus-Promotor. Der oder jeder Expressionsvektor kann von Plasmid stammende DNA und/oder von replizierendem Virus stammende DNA enthalten, wie zum Beispiel zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder-Papillomvirusgenoms. Andere bevorzugte wichtige Elemente des zweiten Merkmals entsprechen mutatis mutandis jenen des ersten Merkmals.
  • Gemäß einem dritten Merkmal der Erfindung wird ein Expressionsvektor geschaffen, der eine eukaryontische Zelle transfektieren kann, wobei der Vektor eine heterologe DNA beinhaltet, welche die Untereinheiten eines biologisch aktiven, posttranslational modifizierten, proteinischen Hormons mit einer Vielzahl von Untereinheiten codiert.
  • Gemäß einem vierten Merkmal der Erfindung wird ein Satz von Vektoren geschaffen, worin zumindest einer, und vorzugsweise jeder, der Vektoren zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder-Papillomvirusgenoms umfaßt.
  • Bevorzugte wichtige Elemente des dritten und vierten Merkmals entsprechen mutatis mutandis jenen des ersten und zweiten Merkmals.
  • "Untereinheit", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Teil eines Proteins, wobei der Teil, oder ein Homolog oder Analog davon, in der Natur durch eine bestimmte mRNA codiert wird. Nach diesem Kriterium besitzt sowohl HCG als auch LH und FSH mehr als eine Untereinheit.
  • Der Begriff "Expressionsvektor" betrifft einen Klonierungsvektor, der (zu dem Vektor) heterologe DNA unter der Kontrolle von Kontrollsequenzen beinhaltet, welche die Expression in einer Wirtszelle ermöglichen. Solche Vektoren umfassen replizierende Viren, Plasmide und Phagen.
  • Die Errindung ermöglicht die Herstellung eines biologisch aktiven, heteropolymeren, proteinischen Hormons aus einer einzigen Kultur transformierter Zellen. Bei der Herstellung beider Untereinheiten eines heteropolymeren Proteins in derselben Zelle ist das Rekombinieren der Untereinheiten von getrennten Kulturen zur Gewinnung eines aktiven heteropolymeren Moleküls nicht mehr erforderlich. Das System ermöglicht auch die Herstellung von Proteinen in einer einzigen Kultur, die in der Kultur eine post-translationale Modifikation, z.B. (Glykosylierung und proteolytische Weiterverarbeitung, für Aktivität oder Stabilität erfahren.
  • Die Verwendung autonom replizierender Expressionsvektoren in einigen Ausführungsformen verhindert einen unerwünschten Einfluß der gewünschten Codierungsregionen durch Kontrollsequenzen im Wirtschromosom.
  • Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein rekombinantes proteinisches Hormon wie oben beschrieben und einen Träger dafür umfaßt sowie die Verwendung eines derartigen rekombinanten Hormons in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Hormonmangel.
  • Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und zur Veranschaulichung ihrer Durchführung werden nun bevorzugte Ausführungsformen mit Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben, von welchen:
  • Fig. 1 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p-Alpha-SVHVP1 ist, das den Alpha-HCG-cDNA-Klon, Teile der viralen SV40-DNA und Sequenzen des Plasmids pBR 322 enthält;
  • Fig. 2 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p-Beta-SVVP1 ist, das den Beta-HCG-cDNA-Klon, Regionen der SV40-DNA und einen Teil des Plasmids pBR 322 enthält, welcher die Region beinhaltet, die dem Wirts-E. coli Ampicillin-Resistenz verleiht;
  • Fig. 3 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p-Alpha-Beta-SVVP1 ist, wobei die Alpha- und Beta-HCG-cDNA-Klone in die SV40-DNA inseriert werden;
  • Fig. 4 eine schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide pRF375 und pRF398 ist;
  • Fig. 5 eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids RF398-Alpha-t&sub2; ist;
  • Fig. 6 eine schematische Darstellung der Position einer 88 bp-Sonde im Beta- HCG-cDNA-Klon ist;
  • Fig. 7 die Beta-LH-Restriktionskarte und jene Teile zeigt, die zur in Fig. 8 dargestellten Konstruktion verwendet werden;
  • Fig. 8 eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids LH520H/B ist, welches den vollständigen reifen Beta-LH-cDNA-Klon enthält;
  • Fig. 9 eine schematische Darstellung der Konstruktion des viralen Vektors p-Alpha-LHSVVP1 ist; und
  • Fig. 10 eine schematische Darstellung der Konstruktion des BPV-haltigen Plasmids pCL28XhoLHBPV ist, welches die Beta-Untereinheit von LH codiert.
    • Struktur
  • Die Klonierungsvektoren der Erfindung weisen die obenbeschriebene allgemeine Struktur auf. Bevorzugte Vektoren weisen die in den Figuren dargestellten Strukturen auf und werden in der Folge genauer beschrieben.
    • Konstruktion von Klonierungsvektoren Isolierung von cDNA-Klonen, welche die Alpha- und Beta-Untereinheiten von HCG codieren
  • Alle hierin verwendeten Techniken werden genau in Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory) beschrieben, auf das hiermit Bezug genommen wird.
  • RNA wird aus plazentarem Gewebe durch folgendes Verfahren extrahiert. Die Homogenisierung des Gewebes wird in einem 1:1 Gemisch aus Phenol:100mM Na- Acetat (pH 5,5) enthaltend 1mM EDTA durchgeführt, das 20 Minuten auf 60ºC erwärmt wurde. Nach 10-minütigem Abkühlen auf Eis werden die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die warme Phenolextration wird noch zweimal wiederholt mit zwei anschließenden Extraktionen mit Chloroform.
  • Aus der wäßrigen Endphase wird RNA durch Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt.
  • Zur Anreicherung auf poly-A+-mRNA wird plazentare RNA über Oligo(dt)- Zellulose in 0,5M mit 10mM Tris-HCl gepuffertem NaCl, pH 7,5, geleitet und mit derselben Lösung gewaschen. Poly-A+-mRNA wird mit 10mM Tris-HCl (pH 7,5), 1mM EDTA, 0,05% SDS eluiert und zweimal mit Ethanol ausgefällt. Übliche Anfangsausbeuten betragen 1,5 - 2,0 mg der gesamten RNA pro g Gewebe, wovon etwa 2% poly-A+-mRNA ist.
  • Plazentare cDNA-Banken werden durch Umkehrtranskription von plazentarer mRNA, Synthese des zweiten Strangs mittels E.coli DNA-Polymerase I (großes Fragment), Behandlung mit S1-Nuclease und Homopolymer-Tailing (dC) mit terminaler Desoxynucleotidyltransferase erhalten; alle diese Schritte werden mit herkömmlichen Techniken durchgeführt.
  • In einer charakteristischen Zubereitung werden 20 - 30% Konversion der mRNA zu einzelsträngiger (ss) cDNA; 70% Resistenz gegenüber der Digestion mit S1-Nuclease nach der Synthese des zweiten Strangs; und dC "Enden" mit einer Länge von zehn bis fünfundzwanzig Basen erhalten. Diese cDNA-Moleküle werden dann DNA-Fragmenten des Plasmids pBR 322 aufgeschmolzen, das mit PstI digeriert wurde und an das dG "Enden" angefügt wurden. Diese rekombinanten Plasmide werden dann zur Transformierung von E. coli-Zellen verwendet, um eine cDNA-Bank zu erzeugen (transformierte Zellen werden auf Basis der Tetracyclin-Resistenz ausgewählt).
  • Zur Identifizierung des menschlichen Alpha-HCG-Klons wird ein 219 bp Fragment eines Maus-Alpha-thyreotropen Hormons (TSH) als Hybridisierungssonde verwendet. Diese Sonde weist eine 77% Sequenzhomologie mit dem menschlichen Klon auf. Sie wird durch Nick-Translation radioaktiv markiert und unter Bedingungen, die das Maß an Homologie berücksichtigen, an die cDNA-Bank hybridisiert. Stark hybridisierende Klone werden durch Restriktionskartierung analysiert und Klone, welche die vollständige Codierungssequenz von Alpha-HCG enthalten, werden durch DNA- Sequenzierung überprüft.
    • Konstruktion des Plasmids p-Alpha-SVHVP1
  • Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wird zur Konstruktion des Plasmids Alpha-970 H/B ein cDNA-Klon, der das Alpha-HCG-Fragment enthält, mit NcoI digeriert. Die NcoI-Stelle, genau 5' zum ATG-Codon, welches den Beginn der Translation signalisiert, wird aufgefüllt und an einen synthetischen HindIII-Linker ligiert. Gleichermaßen wird die natürliche HindIII-Stelle in der 3'-untranslatierten Region des Klons zerschnitten, mit E. Coli-DNA-Polymerase Klenow aufgefüllt und dann an einen synthetischen BamHI-Linker ligiert. Dieses Fragment wird in das Plasmid pBR 322 zwischen dessen HindIII- und BamHI-Stellen kloniert, um das Plasmid Alpha 574 H/B zu erhalten. Dieses Plasmid wird mit BamHI digeriert, mit alkalischer Phosphatase behandelt und an das 396 bp Sau3A-Fragment der SV40-DNA (0,07 bis 0,14 Karteneinheiten) ligiert, das von einem Polyacrylamidgel isoliert wurde. Das Ligationsgemisch wird zur Transformierung von E.coli zu Ampicillinresistenz verwendet und das gesuchte Plasmid Alpha-970 H/B wird unter den Transformanden identifiziert.
  • Die Konstruktion des Plasmids Q&sub2;7 erfolgt durch Zerschneiden von SV40 an der HpaII-Stelle, Erzeugung glatter Enden durch Digestion mit S1-Nuclease, Ligation an EcoRI-Linker, Digestion mit EcoRI und Klonierung des erhaltenen 1436 bp Fragments in die EcoRI-Stelle von pBR 322.
  • Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wird Q&sub2;7 vollständig mit EcoRI und teilweise mit HindIII digeriert; das Fragment aus 0,72 bis 0,94 Karteneinheiten wird isoliert und in Alpha-970 H/B kloniert, das mit EcoRI und HindIII digeriert und mit alkalischer Phosphatase behandelt wurde. Das Ligationsgemisch wird zur Transformierung von E.coli verwendet und das gesuchte Plasmid, p-Alpha-SVL, wird durch Restriktionskartierung unter den Transformanden identifiziert.
  • P-Alpha-SVL wird mit EcoRI digeriert und das Fragment von SV40 mit EcoRI-Enden, das 0 bis 0,72 Karteneinheiten umfaßt und den SV40-Replikationsursprung und die intakte frühe Region enthält, wird daran ligiert, um das Plasmid p-Alpha-SVHVP1 zu erzeugen, das von den E.coli-Transformanden isoliert wird.
    • Konstruktion des Plasmids p-Beta-SVVP1
  • Ein 579 bp cDNA-Klon, der für Beta-HCG codiert, wurde von John C. Fiddes, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Fiddes et al. (1980) Nature Bd. 286, S. 684-687) erhalten. Dieses Fragment wird an jedem Ende an synthetische BamHI-Linker ligiert. Nach der Digestion durch HgaI-Restriktionsenzym werden die Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und synthetische EcoRI-Linker daran ligiert, so daß eine EcoRI-Stelle etwa 10 bp 5' vom ATG-Codon der Signalpeptidcodierungssequenz liegt. Eine BamHI-Stelle befindet sich etwa 60 bp 3' vom Nonsensecodon, der das Ende der Codierungssequenz markiert. Mit Bezugnahme auf Fig. 2 wird dieses 556 bp EcoRI-BamHI-Fragment isoliert und in pBR 322 zwischen den EcoRI- und BamHI-Stellen kloniert, um das Plasmid p-Beta-556 R/B zu erhalten.
  • Zur Konstruktion des Plasmids pSVHR (Fig. 2) wird SV40-DNA teilweise mit HindIII digeriert, um lineare Moleküle zu erhalten, mit S1-Nuclease digeriert, um glatte Enden zur erhalten, an synthetische EcoRI-Linker ligiert und mit EcoRI und BamHI digeriert. Das Fragment, 0,94 bis 0,14 Karteneinheiten, das den SV40-Replikationsursprung und die frühe Region enthält, wird in pBR 322 als ein EcoRI-BamHI-Stück kloniert.
  • Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 2 wird die EcoRI-Stelle des Plasmids p-Beta-556 R/B in einer Reaktion methyliert, die durch EcoRI-Methylase katalysiert wird, und danach wird das Plasmid mit NdeI zerschnitten. EcoRI-Linker werden an die S1-behandelten glatten NdeI-Enden ligiert und durch Digestion mit EcoRI aktiviert, worauf eine Digestion mit BamHI folgt.
  • Das SV40-Fragment von pSVHR von der EcoRI-Stelle bis zur BamHI-Stelle wird isoliert und in einem Reaktionsgemisch ligiert, das die Digestionsfragmente von p-Beta 556 R/B enthält. Nach der Ligation wird das Gemisch mit SalI digeriert, um Plasmide zu beseitigen, die das EcoRI(NdeI)- BamHI-Stück von pBR 322 wieder inseriert haben. E. coli wird mit dem digerierten Ligationsgemisch transformiert und p-Beta-SVVP1 wird identifiziert und isoliert.
    • Konstruktion des Plasmids p-Alpha-Beta-SVVP1
  • Mit Bezugnahme auf Fig. 3 wird pBR 322/Kpn von pBR 322 durch Einfügen eines KpnI-Linkers in die einzige EcoRI-Stelle erhalten, nachdem diese Stelle durch Digestion mit EcoRI deletiert wurde, mit anschließender Digestion mit S1-Nuclease.
  • Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 3 wird SV40-DNA mit AvaII digeriert. Die versetzten Enden der erhaltenen Fragmente werden zur Bildung glatter Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und das Gemisch wird dann auf einem Polyacrylamidgel fraktioniert. Das Fragment aus 682 Basenpaaren (0,64 bis 0,77 Karteneinheiten), welches den Replikationsursprung und die einzige KpnI-Stelle enthält, wird von dem Gel isoliert, an synthetische HindIII-Linker ligiert und mit HindIII und KpnI digeriert.
  • Die erhaltenen Fragmente werden an pBR 322/Kpn ligiert. p266, welches das KpnI-HindIII-Fragment aus 266 Basenpaaren einschließlich der späten SV40-Promotorregion enthält, wird isoliert. p266 wird mit HindIII und BamHI zerschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.
  • Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 3 wird p-Beta-SVVPI/B wie folgt konstruiert: p-Beta-SVVPI (Fig. 2) wird mit EcoRI zerschnitten, worauf eine Ligation zur Beseitigung von pBR 322 Sequenzen folgt. Anschließend wird diese DNA mit BamHI zerschnitten und in die BamHI-Stelle von pBR 322 kloniert.
  • Das erhaltene Plasmid, p-Beta-SVVPI/B wird dann mit HindIII und BamHI digeriert und das HindIII-BamHI-Fragment aus 1003 Basenpaaren wird in p266 ligiert, um das Plasmid pBeta-VP1 266 zu erhalten, in welchem die Beta-HCG-cDNA stromabwärts von dem späten SV40-Promotor so angeordnet wird, daß ihr RNA- Transkript gespleißt würde, als ob es das virale VP1-Transkript wäre.
  • Die Alpha-HCG-cDNA wird in p-Beta-VP1 266 als ein HindIII-Fragment inseriert, das an seiner HindIII-Stelle zerschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt wurde. E. coli-Transformanden, die von dieser Ligation stammen, werden mittels Restriktionskartierung durchmustert und es werden jene Plasmide isoliert, welche die gewünschte Struktur aufweisen, in welcher die Alpha-HCG- cDNA VP2 in der richtigen Ausrichtung ersetzt hat, auf die stromabwärts die Beta- HCG-cDNA folgt, die VP1 ersetzt hat.
  • Ein derartiges isoliertes Plasmid, p-Alpha-Beta-VP1, wird zur Vervollständigung der Konstruktion von p-Alpha-Beta-SVVP1 verwendet. Das Plasmid wird mit KpnI zerschnitten und das vollständige SV40-Genom, mit KpnI zerschnitten, wird durch Ligation in diese Stelle inseriert. Nach der Transformation von E. coli wird ein Plasmid mit der erforderlichen Struktur, p-Alpha-Beta-SVVP1, isoliert. Dieses Plasmid enthält DNA, die sowohl die Alpha- als auch Beta-Untereinheiten von HCG codiert und daher die Expression beider Untereinheiten in Wirts-Säugerzellen steuern kann, wobei biologisch funktionelles, glykosyliertes heterodimeres HCG hergestellt wird (Glykosylierung erfolgt posttranslational).
    • Konstruktion der Plasmide pRF 375 und pRF 398
  • Mit Bezugnahme auf Fig. 4 wird das Plasmid CL28 (identisch mit Plasmid JYMMT(E); Hamer et al. (1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288), das den murinen Metallothionein-Promotors, SV40-DNA und pBR 322-Sequenzen enthält, mit der Restriktionsendonuclease BqlII zerschnitten. An dieser Stelle werden entweder cDNA-Klone von Alpha-HCG oder Beta-HCG inseriert, welche nichttranslatierte Regionen von etwa 10 und 30 bp an ihren 5'- und etwa 220 und 60 bp an ihren 3'-Enden enthalten. Diese Klone wurden durch Zugabe synthetischer BamHI-Linker an ihren Endpunkten genetisch manipuliert.
  • Die erhaltenen Plasmide pRF 302 (Alpha) oder pRF 394 (Beta) werden mit Restriktionsenzymen BamHI und SalI digeriert, um die SV40-DNA Sequenzen freizusetzen.
  • Plasmid pB2-2, welches das vollständige BPV-Genom und einige pBR 322 Sequenzen enthält, wird mit BamHI und SalI digeriert, um das BPV-Genom mit BamHI/SalI-Enden zu erhalten; dieses Fragment wird in pRF 302 (Alpha) und pRF 394 (Beta) ligiert, welche die Metallothionein-HCG-Sequenzen enthalten.
  • Nach der Transformation von E. coli werden die Plasmide pRF 375 und pRF 398 identifiziert und isoliert. Sie codieren, gesteuert von dem Maus-Metallothionein- Promotor, Alpha-HCG bzw. Beta-HCG.
    • Konstruktion des Plasmids RF 398 Alpha-t&sub2;
  • Mit Bezugnahme auf Fig. 5 wird das Plasmid p-Alpha-t&sub2; durch Klonierung des Alpha-HCG 574 HindIII-Fragments in Plasmid pVBt2 (V.B. Reddy et al., PNAS 79, 2064-2067, 1982) erhalten. p-Alpha-t&sub2;, das die Alpha-HCG-cDNA unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors enthält, wird mit EcoRI digeriert. Die 5'-Überhänge werden durch S1-Nuclease Digestion vor der Zugabe synthetischer BamHI-Linker durch Ligation stumpfer Enden entfernt.
  • Plasmid RF 398 (Fig. 4) wird mit BamHI digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das BamHI-Fragment aus 1735 Basenpaaren von p-Alpha-t&sub2; wird in RF 398 inseriert. Das erhaltene Plasmid RF 398-Alpha-t&sub2; wird von E. coli-Transformanden isoliert. Dieses Plasmid besitzt daher die Beta-HCG-cDNA in einer transkriptionalen Einheit unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein- Promotors und die Alpha-HCG-cDNA in einer transkriptionalen Einheit unter der Kontrolle des frühen SV40-Promotors.
    • Expression von luteinisierenden Hormon (LH)-cDNA-Klonen Konstruktion einer menschlichen Hypophysen-cDNA-Bank
  • RNA wird aus menschlichen Hypophysen durch Homogenisierung von 5 bis 10 Gramm der gefrorenen Drüsen in 20 ml einer Lösung bereitet, die 4 M Guanidinthiocyanat, 1 M 2-Mercaptoethanol, 0,05 M Na-Acetat (pH 5,0) und 0,001 M EDTA enthält. Pro ml Homogenat wird ein Gramm CsCl zugegeben und die Suspension bei 2.000 Upm 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird vorsichtig über einen 15 ml Polster der CsCl-Lösung (die 1,25 ml 1 M Na-Acetat (pH 5), 62,5 Mikroliter 0,4 M EDTA und 39,8 g CsCl bei einem Endvolumen von 35 ml enthält) geschichtet und bei 45.000 Upm im Ti 70 Rotor einer Beckman Ultrazentrifuge 18 - 24 h bei 20ºC zentrifugiert. Die als Häutchen im Gradienten sichtbare RNA wird mit einer Spritze entfernt, verdünnt und durch Zugabe von zwei Volumina Ethanol ausgefällt. Nach drei Auflösungs- und neuerlichen Fällungszyklen wird das RNA-Kügelchen in H&sub2;O gelöst und durch Zugabe konzentrierter Stammlösungen auf 0,01 M Tris-HCl (pH 7,5) und 0,5 M NaCl gebracht. Das Präparat wird dann durch zweimaliges Überleiten über Oligo(dt)-Zellulose auf poly-A+-mRNA angereichert, wie oben für plazentare RNA beschrieben wurde.
  • Aus der poly-A+mRNA wird, wie oben für plazentare poly-A+mRNA beschrieben wurde, eine menschliche Hypophysen-cDNA-Bank konstruiert, mit der Ausnahme, daß sowohl die E. coli DNA-Polymerase I (großes Fragment) als auch die Vogel-Myeoloblastosis-Virus-Umkehrtranskriptase schrittweise für die cDNA- Synthese des zweiten Strangs verwendet werden. Klenow wird zuerst verwendet. Die Reaktion wird durch Phenolextraktion beendet.
  • Die wäßrige Phase des zentrifügierten Extrakts wird auf eine 5 ml Säule aus BioGel A-5m aufgebracht. Fraktionen, die Material mit hohem Molekulargewicht enthalten, werden gepoolt, konzentriert, mit zwei Volumina Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl&sub2;, 140 mM KCl, 20 mM 2-Mercaptoethanol und in 1 mM jedes der vier Desoxyribonucleosid-Triphosphate zur Umkehrtranskription gelöst. Umkehrtranskriptase wird bis zu etwa 20 Einheiten pro Mikrogramm cDNA zugegeben. Doppelsträngige cDNA wird dann mit S1-Nuclease behandelt, durch Ansynthetisieren mit Enden versehen und wie oben beschrieben kloniert.
    • Isolierung von Beta-LH-cDNA-Klonen
  • Kolonien, die auf Nähragarplatten gezüchtet wurden, welche 25 Mikrogramm pro ml Tetracyclin enthielten, werden auf Nitrozellulosefilter gebracht. Die Kolonien werden in situ durch Behandlung mit 0,5 M NaOH lysiert und mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1,5 M NaCl, neutralisiert. Freigesetzte DNA wird auf dem Filter durch zweistündige Wärmebehandlung bei 80ºC in einem Vakuumofen fixiert.
  • Die Filter werden durch Hybridisierung an ein ³²p-markiertes 88 Basenpaar-Fragment des Beta-HCG-Klons geprüft, welches den Aminosäuren 16 bis 45 der reifen HCG- Beta-Kette entspricht, die 29 von 30 Aminosäuren mit dieser Region des Beta-LH- Polypeptids gemeinsam besitzt (Fig. 6). Die Hybridisierung wird über Nacht bei 32º in 50% Formamid, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-Citrat (pH 7,0), 2,5% Dextransulfat, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1 mg pro ml Rinderserumalbumin und zumindest 10&sup5; cpm pro Filter des ³²p markierten 88 bp Beta-HCG-Fragments durchgeführt. Vor der Autoradiographie werden die Filter mehrmals in 0,15 M NaCl, 0,015 M Na- Citrat bei 37º gewaschen. Einer der positiven isolierten Klone LH12 (Figur 7) wird weiter verwendet. LH12 ist 365 bp lang und beinhaltet Sequenzen, die für 15 Aminosäuren der prä-Beta-Signalsequenz und 105 Aminosäuren des reifen Beta-LH- Polypeptids codieren. Seine Nukleotidsequenz wird bestimmt. Da das vollständige reife Beta-LH nicht durch LH12 codiert wird, wird ein weiteres Screening der menschlichen Hypophyse-cDNA-Bank unter Verwendung eines 240 bp NcoI-PvuII-Fragments von LH12 (Fig. 7) als ³²p-markierte Hybridisierungssonde durchgeführt. Der Klon LH6 (Fig. 7) wird aus diesem Screening isoliert. LH6 enthält das vollständige 3'-Ende von Beta-LH, einschließlich der Region, die dem untranslatierten Teil der mRNA durch 27 A-Reste des poly-A "Endes" der mRNA entspricht. Es wurden keine Klone entdeckt, die sich weiter als LH12 in die 5'-Richtung erstreckten. DNA-Sequenzbestimmung der vollständigen, vereinten reifen Beta-LH Codierungsregionen zeigt zwei Unterschiede in der Aminosäuresequenz von Beta-LH zu den veröffentlichten Proteinsequenzdaten; Position 42 ist ein Metionin und Position 55 ein Valin. Die reife Beta-LH enthält auch 121 Aminosäuren, beruhend auf der cDNA-Sequenz.
  • Die in Fig. 8 dargestellte Konstruktion eines Klons, der eine intakte Signalpeptid-Codierungssequenz und die vollständige reife Beta-LH-Sequenz enthält, erfolgt unter Verwendung des in Fig. 7 dargestellten Restriktionsfragments. Ein 104 bp EcoRI-DdeI-Fragment wird aus dem Plasmid Beta 579 H isoliert und an ein isoliertes, anschließend mit PstI digeriertes, 181 bp DdeI-Fragment vom LH12 Plasmid ligiert. Nach der Ligation über Nacht bei 15ºC wird das Ligationsgemisch mit EcoRI und PstI digeriert und auf einem 7% Polyacrylamidgel fraktioniert, woraus das gesuchte 256 bp Fragment isoliert wird. Dieses Fragment verschmilzt die Beta-HCG- Signalsequenz mit jener des prä-Beta-LH derart, daß eine Codierungssequenz für ein 20 Aminosäure-Signalpeptid erzeugt wird.
  • Das 256 bp EcoRI-PstI-Fragment wird in mit EcoRI und PstI digeriertes pBR 322 kloniert, so daß das Plasmid LH-Beta 260 erhalten wird. Das 146 bp EcoRI-NcoI-Fragment, das in Fig. 8 dargestellt ist, wird aus einem Polyacrylamidgel isoliert und später wie in der Folge beschrieben zur Konstruktion verwendet.
  • Das LH6-Plasmid (Fig. 8) wird mit Sau3a digeriert und das 390 bp Fragment durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wird dann mit HincII digeriert, an BamHI-Linker ligiert, mit BamHI digeriert und in das Plasmid pAPP an der BamHI-Stelle kloniert. pAPP wird von pBR 322 durch Digestion mit AvaI, Auffüllen des 5'-Überhangs mit den dNTP's und dem großen Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli Digestion mit PvuII und Ligation zur Schließung des Plasmids, wobei die PvuII-Stelle entfernt wird, erhalten. Das Plasmid LH6B, das von der Ligation des 340 bp BamHI-Fragments in die BamHI-Stelle von pAPP isoliert wurde, wird mit EcoRI und PvuII digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Die Fragmente werden zu einer Mischung aus dem 145 bp EcoRI-NcoI-Fragment von LH-Beta 260, wie oben beschrieben, und dem isolierten 241 bp NcoI-PvuII-Fragment von dem in Fig. 8 dargestellten Plasmid LH12 ligiert. Die Ligationsmischung wird zur Transformierung von E. coli zur Ampicillinresistenz verwendet. Das Plasmid LH 520 H/B wird unter den Transformanden gefunden. LH 520 H/B enthält eine vollständige Beta-LH-Codierungssequenz einschließlich einer hybriden Signalpeptidsequenz.
    • Konstruktion von p-Alpha-LHSVVP1
  • Zur Exprimierung dieses prä-Beta-LH-Klons in einem Vektor auf SV40-Basis, wie dies bei den zuvor beschriebenen prä-Alpha- und prä-Beta-HCG-Klonen erfolgt, ist es zweckmäßig, eine EcoRI-Stelle sehr nahe bei ATG der prä-Beta- Codierungssequenz anzuordnen. Dies erfolgt durch Digestion von LH520 H/B mit HgaI, Auffüllen des 5'-Überhangs, Ligation an synthetische EcoRI-Linker, Digestion mit EcoRI und BamHI und Klonierung des isolierten 496 bp EcoRI-BamHI-Fragments in pBR 322, das mit EcoRI und BamHI digeriert und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt wurde. Das Plasmid pLH496 R/B wird aus E. coli isoliert, das mit diesem Ligationsgemisch transformiert wurde und als Quelle des zu exprimierenden 496 bp-Fragments verwendet wird.
  • Das Plasmid p-Alpha-Beta-VP1, dessen Konstruktion und Verwendung zur Exprimierung beider Untereinheiten von HCG zuvor beschrieben wurde (Fig. 3), wird mit EcoRI und BamHI digeriert und in ein Reaktionsgemisch ligiert, welches das Plasmid pLH496 R/B enthält, das mit beiden dieser Enzyme digeriert wurde (Fig. 9). Das Plasmid p-Alpha-LHVP1 wird unter den E. coli-Transformanden identifiziert. Wie in Fig. 9 dargestellt, wird die intakte virale frühe SV40-Region von p-Alpha-SVHVP1 (Fig. 1) erhalten und durch Ligation als KpnI-SalI-Fragment in p-Alpha-LHVP1 inseriert, das mit KpnI und SalI digeriert wurde, um das Plasmid p-Alpha-LHSVVP1 zu erhalten. Durch Zerschneiden dieses Plasmids mit BamHI und neuerliche Ligation wird das Virus Alpha-LHSVVP1 gebildet. Dieses Virus enthält kionierte cDNA für die allgemeine (für LH und HCG wie auch FSH und TSH) Alpha-Untereinheit und die spezifische Beta-LH-Untereinheit unter Kontrolle des späten SV40-Promotors. Die klonierten cDNAs werden so angeordnet, daß der allgemeine Alpha-Einschub die virale VP1-Proteincodierungssequenz und der Beta-LH- Einschub die virale VP2-Codierungssequenz ersetzt.
    • Insertion der Beta-LH-cDNA (mit Beta-HCG 5'-Ende des Signalpeptids) in ein Expressionssystem auf BPV-Basis
  • LH 520 H/B (Fig. 8) wird mit HindIII und BamHI digeriert, mit der E.coli DNA-Polymerase (Klenow) behandelt, an synthetische SalI-Linker ligiert, mit SalI digeriert und in die SalI-Stelle von pBR 322 kloniert. Das erhaltene Plasmid, LH 530 Sal, wird als Quelle des LH-cDNA-Klons zur Insertion in das Maus- Metallothioneingen des Plasmids CL28, wie in Fig. 10 dargestellt, verwendet.
  • CL28 wird mit BglII zerschnitten, mit S1-Nuclease behandelt und an XhoI-Linker ligiert. Nach der Digestion mit XhoI, Ligation und Digestion mit BglII, wird E. coli mit dem Reaktionsgemisch transformiert, um das Plasmid CL28Xho zu erhalten. Dieses Plasmid wird mit BamHI und SalI digeriert und an einen BamHI- und SalI-Verdau des Plasmids pB2-2 (Fig. 4) ligiert, um das Plasmid CL28XhoBPV zu erhalten. Letzterer LH-Einschub wird dann in die XhoI-Stelle von CL28XhoBPV als ein SalI-Fragment ligiert, da der 5'-Überhang des SalI-Verdaus komplementär zu jenem des XhoI-Verdaus ist. Nach der Digestion mit XhoI zur Entfernung des genetischen Hintergrunds wird E. coli transformiert und das gesuchte Plasmid pCL28XhoLHBVP isoliert, welches den (hybriden) prä-Beta-LH-Einschub in einem Plasmid auf BPV-Basis unter Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors enthält.
    • Transfektion und Infektion von Affen-Wirtszellen
  • Die Einschleusung von virushaltigen Vektoren in eukaryontische Zellen zur Herstellung eines heteropolymeren Proteins wird im allgemeinen wie folgt durchgeführt. Wenn die virale DNA und die homopolymere protein-codierende DNA in ein Plasmid eingeschleust werden, das zum Beispiel in E. coli enthalten ist, werden zuerst die Plasmidsequenzen (z.B. die pBR 322-Sequenzen) entfernt und die erhaltene DNA wird ligiert, um eine kreisförmige DNA zu bilden, welche die virale Region und die heteropolymere(n) protein-codierende(n) Sequenz(en) beinhaltet. Diese kreisförmige DNA enthält nicht die gesamte genetische Information, die zur Herstellung eines replizierenden Virus erforderlich ist; die anderen notwendigen Sequenzen (z.B. jene, die das Hüllprotein codieren) wurden durch die heteropolymere(n) proteincodierende(n) Sequenz(en) ersetzt. Die kreisförmige DNA, ohne die Plasmid-DNA, muß in der Größe annähernd der natürlich vorkommenden viralen DNA entsprechen, von der sie abstammt, um das Eindringen und Replizieren der DNA in geeignete Wirts-Säugerzellen zu ermöglichen.
  • Die kreisförmige DNA wird zur Transfektion von Wirtszellen zur Herstellung eines Virusstamms für spätere Infektionen verwendet. Da ein Teil der DNA, der zur Herstellung des Virus erforderlich ist, fehlt, muß die Transfektion in Verbindung mit Helfervirus-DNA erfolgen, welche die fehlende Funktion ausreichend codiert, um das replizierende Virus herzustellen.
  • Transfektierte Wirtszellen werden bis zur Lyse durch replizierende Viren gezüchtet und inkubiert. Der erhaltene replizierende Virusstamm, einschließlich der Helferviren, wird dann zur Infektion von Wirtszellen zur Herstellung des heteropolymeren Proteins verwendet. Der Virusstamm wird erhalten, da er im allgemeinen zur Infektion frischer Chargen von Wirtszellen wiederverwendet werden muß, da jede Kultur von infizierten, proteinerzeugenden Wirtszellen im allgemeinen möglicherweise durch das Virus lysiert wird.
  • Die obenbeschriebenen spezifischen rekombinanten DNA-Sequenzen werden zur Transfektion und anschließender Infektion von Wirtszellen wie folgt verwendet.
  • Die pBR 322 Sequenzen werden aus den obenbeschriebenen SV40-haltigen Plasmiden zur Herstellung transfektierender viraler DNA entfernt. Im Fall von p-Alpha-SVHVP1 und p-Alpha-Beta-SVVPI erfolgt dies durch Digestion mit BamHI und anschließende Ligation unter Bedingungen, welche den Ringschluß der Fragmente begünstigen, um (neben anderen Produkten) Alpha-SVHVP1 und Alpha-Beta- SVVPI zu erhalten. Bei p-Beta-SVVP1 kommen durch die Digestion mit EcoRI und die anschließende neuerliche Ligation der späte SV40-Promotor und die VP1-Spleißstelle unmittelbar neben dem Beta-HCG-cDNA-Einschub zu liegen, wobei gleichzeitig pBR 322-Sequenzen beseitigt und Beta-SVP1 gebildet wird. Gleichzeitig wird ptsA58 Bam (tsA58 SV40-virale DNA in die pBR 322 BamHI-Stelle kloniert) mit BamHI zerschnitten und ligiert, um selbstligierende Kreise zu erhalten. Analoge Verfahren werden bei den LH-Vektoren angewendet. Getrennte Virusstämme werden wie in der Folge beschrieben, hergestellt.
  • Die DNAs, die wie oben beschrieben zerschnitten und ligiert wurden, werden mit Ethanol gefällt und in sterilem Wasser gelöst. Etwa 1 ug ptsA58 Bam DNA (Helfervirus) und 10 ug rekombinante DNA (welche Alpha- und/oder Beta-HCG oder LH codiert) werden in einem sterilen Teströhrchen vereint, mit 2 ml TBS-Puffer (G. Kimura und R. Dulbecco 1972, Virology, 42, 79-81) und 1 ml einer 2 mg/ml DEAE- Dextranlösung vermischt und einer einlagigen Schicht konfluenter Affen-CV1-Zellen beigegeben, die zuvor zweimal mit 10 ml TBS in einem T-75 Kolben gewaschen wurden. Die Zellen werden 1-2 Stunden bei 37ºC mit gelegentlichem Schütteln stehengelassen, zweimal mit TBS gewaschen, mit 10 ml DMEM, das 5% fötales Kalbserum enthält, genährt und bei 40ºC 10 - 15 Tage stehengelassen. Nach der vollständigen Zellauflösung wird das Medium in ein Teströhrchen überführt, fünfmal gefroren und aufgetaut und bei 3.000 Upm fünf Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Überstände dienen als Virusstämme zur Infektion frischer CV1-Zellen.
  • Zur Durchführung einer Infektion werden CV1-Zellen in einem T-150-Kolben bis zur Bildung eines Zellrasens gezüchtet. 1 ml von einem der Virusstämme (die nach der obigen Beschreibung hergestellt wurden) wird dem Kolben beigegeben und die Zellen werden 5 Tage bei 40ºC inkubiert.
  • Für gemischte Infektionen werden CV1-Zellen in einem T-150-Kolben bis zur Bildung eines Zellrasens gezüchtet. Alpha-SVHVP1- und Beta-SVP1-Viren werden in einem 1:1 Verhältnis gemischt und 1 ml des gemischten Virus wird zur Infektion der CV1-Zellen bei 40ºC verwendet.
    • Transfektion von Mauszellen
  • Zur Herstellung von heterodimerem HCG mittels gemischter Transfektion werden fünf ug jedes BPV-Plasmids, d.h. pRF 375 (Alpha-HCG) und pRF 398 (Beta- HCG), vermischt und 0,5 ml einer 250 mM CaCl&sub2;-Lösung beigegeben, die 10ug Lachsspermien-DNA als Träger enthält. Diese Mischung wird in 0,5 ml von 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Natriumphosphat geperlt. Der Kalziumphosphatniederschlag kann sich innerhalb von 30-40 Minuten bei Raumtemperatur bilden.
  • 24 Stunden vor der Transfektion werden 5x10&sup5; Zellen von Maus C127-Zellen (erhältlich von Dr. Dean Hamer, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD) in eine 100 mm Schale oder einen T-75 Kolben eingebracht. Unmittelbar vor der Zugabe exogener DNA werden die Zellen mit frischem Medium (Dulbecco's Modified Medium, 10% fötales Kalbserum) genährt. Ein ml Kalziumphosphatniederschlag wird jeder Schale (10 ml) beigegeben und die Zellen werden 6 - 8 Stunden bei 37ºC inkubiert.
  • Das Medium wird abgesaugt und durch 5 ml 20% Glyzerol in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,0, 2 Minuten bei Raumtemperatur ersetzt. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit 10 ml Medium genährt und bei 37ºC inkubiert. Nach 20 - 24 Stunden wird das Medium ausgetauscht und in der Folge werden alle 3 - 4 Tage die Zellen wieder genährt. Einzelne Klone werden in T-25cm Kolben gezüchtet. Nach 7 - 21 Tagen können die Zellklone zur Analyse in größere Kolben überführt werden.
  • Zur Herstellung von heterodimerem HCG mittels einfacher Transfektion wird Plasmid RF 398-Alpha-t&sub2; in derselben Art verwendet wie die beiden obigen Plasmide zur gemischten Infektion verwendet wurden.
  • Zur Herstellung von heterodimerem LH werden die Plasmide PRF 375 und pCL28XhoLHBPV, wie oben für HCG beschrieben, vermischt.
  • Eine interessante Beobachtung war, daß bei Züchtung von Zellen, die nur Beta- HCG- oder Beta-LH-Codierungsvektoren ohne Alpha-codierende Zellen enthielten, faktisch keine Beta-Untereinheit erzeugt wird, während Zellen, die Alpha- und Beta- Codierungssequenzen enthalten, nicht nur ein Heterodimer, sondern auch eine freie Beta-Untereinheit erzeugen. Dies unterstützt die Annahme, daß die Erzeugung beider Untereinheiten in einer einzigen Zellkultur den zusätzlichen Vorteil aufweist, daß die Gegenwart der Alpha-Untereinheit irgendwie ermöglicht wird, um die Beta- Untereinheit zu stabilisieren.
    • Hinterlegungen
  • Folgende, wie oben beschrieben, wurden in der American Type Culture Collection, Rockville, MD hinterlegt:
  • Alpha-Beta SVVP1, ATTC VR2077;
  • Alpha SVHVP1, ATCC VR2075;
  • Beta SVVP1, ATCC VR2075;
  • pRF 375 in C127-Zellen, ATCC CRL8401;
  • pRF 398 in C127-Zellen, ATCC CRL8401;
  • pCL28XhoLHBPV E. coli; ATCC 39475;
  • pRF 398 Alpha-t&sub2; in C127-Zellen.
    • Verwendung
  • Die erfindungsgemäßen transformierten Zellinien werden zur Herstellung biologisch aktiver heteropolymerer Proteine verwendet. Erfindungsgemäß hergestelltes HCG, zum Beispiel, besitzt eine Reihe wohlbekannter medizinischer Anwendungsmöglichkeiten in Zusammenhang mit menschlicher Fruchtbarkeit.
    • Andere Ausführungsförmen
  • Andere Ausführungsformen sind in den folgenden Ansprüchen enthalten. Zum Beispiel:
  • Es können auch andere Wirtszellen, Vektoren, Promotoren, Transformierungssequenzen und Viren verwendet werden. Die Wirtszelle, die im allgemeinen verwendet wird, hängt von dem verwendeten Vektor ab. Wenn zum Beispiel der Vektor ein replizierendes Virus oder nichtreplizierende virale DNA ist, können die Wirtszellen durch diese Vektoren infiziert bzw. transfektiert werden; z.B. SV40-haltige Vektoren erfordern Affenwirtszellen, vorzugsweise CV1-Zellen. Wenn der Klonierungsvektor ein Plasmid mit prokaryontischen Kontrollsequenzen ist, werden prokaryontische Wirtszellen, z.B. E. coli, verwendet. Wenn der Klonierungsvektor ein Plasmid mit eukaryontischen Kontrollsequenzen ist, werden geeignete eukaryontische Wirtszellen, z.B. Maus-C127-Zellen verwendet.

Claims (36)

1. Verfahren zur Bereitung eines biologisch aktiven, post-translational modifizierten, proteinischen, aus einer Vielzahl von Untereinheiten bestehenden Hormons, wobei das Verfahren gemeinsames Synthetisieren jeder der Untereinheiten in einer eukaryontischen Zelle umfaßt, welche mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transfektiert ist, die heterologe DNA beinhalten, die jede der Untereinheiten codiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die posttranslationale Modifikation Glykosylierung ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Hormon ein Fruchtbarkeitshormon ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fruchtbarkeitshormon HCG oder 15 LH ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Hormon ein menschliches Hormon ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Hormon heteropolymer ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Hormon heterodimer ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zelle mit mehr als einem Expressionsvektor transfektiert ist, wobei jeder Vektor heterologe DNA umfaßt, die eine entsprechende Untereinheit codiert.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zelle mit einem einzigen Expressionsvektor transfektiert ist, der heterologe DNA umfaßt, die jede Untereinheit codiert.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die jede Untereinheit codierende, heterologe DNA von einem entsprechenden Promotor kontrolliert wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die heterologe DNA, die zumindest eine Untereinheit codiert, von dem späten SV40-Promotor oder dem Rinder-Papillomvirus-Promotor kontrolliert wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die heterologe DNA, die zumindest eine Untereinheit codiert, von dem Maus-Metallothionein-Promotor kontrolliert wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der oder die Expressionsvektoren von Plasmid stammende DNA und/oder von replizierendem Virus stammende DNA umfassen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der oder die Vektoren zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder-Papillomvirusgenoms umfassen.
15. Eukaryontische Zelle, die mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transfektiert ist, wobei die Zelle ein biologisch aktives, post-translational modifiziertes, proteinisches Hormon mit einer Vielzahl von Untereinheiten erzeugen kann, wobei die Untereinheiten des Hormons von der heterologen DNA in dem oder den Expressionsvektoren codiert werden.
16. Zelle nach Anspruch 15, wobei das Hormon ein Fruchtbarkeitshormon ist.
17. Zelle nach Anspruch 16, wobei das Fruchtbarkeitshormon HCG oder LH ist.
18. Zelle nach Anspruch 15, 16 oder 17, wobei das Hormon ein menschliches Hormon ist.
19. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei das Hormon heterodimer ist.
20. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 19, die mit mehr als einem Expressionsvektor transfektiert ist, wobei jeder Vektor heterologe DNA umfaßt, die eine entsprechende Untereinheit codiert.
21. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 19, die mit einem einzigen Expressionsvektor transfektiert ist, der heterologe DNA umfaßt, die jede Untereinheit codiert.
22. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 21, wobei die jede Untereinheit codierende, heterologe DNA von einem entsprechenden Promotor kontrolliert wird.
23. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 22, wobei die heterologe DNA, die zumindest eine Untereinheit codiert, von dem späten SV40-Promotor, dem Maus- Metallothionein-Promotor oder dem Rinder-Papillomvirus-Promotor kontrolliert wird.
24. Zelle nach einem der Ansprüche 15 bis 23, wobei der oder jeder Expressionsvektor von Plasmid stammende DNA und/oder von replizierendem Virus stammende DNA umfaßt.
25. Zelle nach Anspruch 24, wobei der oder jeder Vektor zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder-Papillomvirusgenoms umfaßt.
26. Expressionsvektor, der eine eukaryontische Zelle transfektieren kann, wobei der Vektor heterologe DNA umfaßt, welche die Untereinheiten eines biologisch aktiven, post-translational modifizierten, proteinischen Hormons mit einer Vielzahl von Untereinheiten codiert.
27. Vektor nach Anspruch 26, wobei die heterologe DNA, die jede Untereinheit codiert, von einem entsprechenden Promotor kontrolliert ist.
28. Vektor nach Anspruch 26 oder 27, der den späten SV40-Promotor, den Rinder-Papillomvirus-Promotor oder den Maus-Metallothionein-Promotor umfaßt.
29. Vektor nach Anspruch 26 oder 27, der von Plasmid stammende DNA und/oder von replizierendem Virus stammende DNA umfaßt.
30. Vektor nach Anspruch 29, der zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder-Papillomvirusgenoms umfaßt.
31. Satz von Expressionsvektoren, wobei jeder Vektor eine eukaryontische Zelle transfektieren kann und jeder Vektor heterologe DNA umfaßt, welche eine bestimmte Untereinheit eines biologisch aktiven, posttranslational modifizierten, pro teinischen Hormons mit einer Vielzahl von Untereinheiten codiert, wobei alle Untereinheiten des Hormons durch die heterologe DNA in den Vektoren codiert werden.
32. Satz von Vektoren nach Anspruch 31, wobei jeder Expressionsvektor den späten SV40-Promotor, den Rinder-Papillomvirus-Promotor oder den Maus- Metallothionein-Promotor umfaßt.
33. Satz von Vektoren nach Anspruch 31, wobei jeder Expressionsvektor von Plasmid stammende DNA und/oder von replizierendem Virus stammende DNA umfaßt.
34. Satz von Vektoren nach Anspruch 33, wobei zumindest einer, und vorzugsweise jeder, der Vektoren zumindest die 69% Transformierungsregion des Rinder- Papillomvirusgenoms umfaßt.
35. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren die Gewinnung des Hormons aus einer Kultur der Zellen umfaßt.
36. Verfahren zur Bereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Verfahren die Bereitung eines rekombinanten proteinischen Hormons durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und 35 und die Beigabe eines Trägers umfaßt.
DE8585900268T 1983-11-02 1984-10-31 Herstellung heterodimerer menschlicher fruchtbarkeitshormone. Expired - Lifetime DE3485869T2 (de)

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US06/548,228 US4840896A (en) 1983-11-02 1983-11-02 Heteropolymeric protein
PCT/US1984/001771 WO1985001959A1 (en) 1983-11-02 1984-10-31 Production of heterodimeric human fertlity hormones

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