DE3486474T2 - Produkte und Methoden für die Herstellung einer heterodimerer menschlicher LH mit einem Met42 Val55 alpha Untereinheit - Google Patents
Produkte und Methoden für die Herstellung einer heterodimerer menschlicher LH mit einem Met42 Val55 alpha UntereinheitInfo
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Description
- Diese Erfindung betrifft unter anderem die Verwendung rekombinanter DNA- Techniken zur Herstellung des Luteinisierungshormons (LH).
- Durch rekombinante DNA-Technologie wurden verschiedene Polypeptidketten in Wirtszellen, wie Bakterien, Hefe und kultivierten Säugetierzellen, exprimiert. Fiddes, J. C. und Goodman, H. M. (1979), Nature, Band 281, S. 351-356, und Fiddes J. C. und Goodman, H. M. (1980), Nature, Band 286, S. 684-687, beschreiben das Klonen der Alpha- bzw. Beta- Untereinheiten von humanem Choriongonadotropin (hCG).
- Kaname, US-Patent 4.383.036 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von hCG, wobei humane, lymphoblastoide Zellen in ein Versuchstier eingepflanzt, von dem Tier geerntet und in vitro kultiviert werden; angesammeltes hCG wird dann aus der Kultur geerntet.
- Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Protein bereitgestellt, das ein biologisch aktives, posttranslational modifiziertes Luteinisierungshormon (LH) mit einer α- und β- Untereinheit ist, wobei die β-Untereinheit 121 Aminosäuren lang ist und die Reste Met&sup4;² und Val&sup5;&sup5; hat. Das Protein kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das in einem der Ansprüche 16 bis 24 beschrieben ist. Es kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemeinsam mit einem Träger vorhanden sein und in der Medizin verwendet werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann wie in Anspruch 32 dargelegt hergestellt werden.
- In bevorzugten Ausführungsbeispielen wird das Protein durch eine eukaryontische Zelle synthetisiert, und das Protein wird posttranslational, insbesondere durch Glycosylierung, modifiziert.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein DNA-Molekül bereit, welches eine DNA- Sequenz aufweist, die für ein Luteinisierungshormon (LH) mit einer α- und β-Untereinheit kodiert, wobei die β-Untereinheit die Reste Met&sup4;² und Val&sup5;&sup5; hat.
- Die vorliegende Erfindung stellt weiters einen Expressionsvektor bereit, der zur Transfektion einer eukaryontischen Zelle imstande ist, wobei der Vektor heterologe DNA umfaßt, die für die α- und β-Untereinheiten von biologisch aktivem, posttranslational modifizierten Luteinisierungshormon (LH) kodiert, wobei die β-Untereinheit eine Länge von 121 Aminosäuren und die Reste Met&sup4;² und Val&sup5;&sup5; hat.
- Bevorzugte Expressionsvektoren sind in den Ansprüchen 3 bis 6 beschrieben. Es kann ein Satz von Expressionsvektoren bereitgestellt werden, wie in den Ansprüchen 7 bis 9 beschrieben ist. Die Expressionsvektoren können nach der Beschreibung in Anspruch 29 oder Anspruch 30 hergestellt werden.
- Es wird auch eine eukaryontische Zelle bereitgestellt, die mit einem oder mehreren Expressionsvektoren transfektiert ist, wobei die Zelle imstande ist, biologisch aktives, posttranslational modifiziertes Luteinisierungshormon (LH) mit α- und β-Untereinheiten zu erzeugen, wobei die β-Untereinheit von LH eine Länge von 121 Aminosäuren und die Reste Met&sup4;² und Val&sup5;&sup5; hat, wobei die Untereinheiten des LH durch heterologe DNA in dem/den Expressionsvektor(en) kodiert werden.
- Bevorzugte eukaryontische Zellen sind in den Ansprüchen 11 bis 15 beschrieben. Die eukaryontischen Zellen können nach der Beschreibung in Anspruch 31 hergestellt werden.
- Wie hierin verwendet, bezeichnet "Untereinheit" einen Teil eines Proteins, wobei der Teil, oder ein Homolog oder Analog davon, in der Natur durch eine Verschiedenheit in der mRNA kodiert wird.
- So werden zum Beispiel eine schwere Kette und eine leichte Kette eines IgG- Immunglobulins jeweils als Untereinheit betrachtet. Andererseits besteht Insulin aus zwei Ketten, die nicht als Untereinheiten angesehen werden, da beide in der Natur von einer einzigen mRNA kodiert werden, und eine Spaltung in zwei Ketten von Natur aus erst nach der Translation erfolgt.
- Der Begriff "Expressionsvektor" betrifft einen Klonierungsvektor, der (zu dem Vektor) heterologe DNA unter der Kontrolle von Kontrollsequenzen enthält, welche die Expression in einer Wirtszelle ermöglichen. Zu solchen Vektoren zählen replizierende Viren, Plasmide und Phagen.
- Die Erfindung ermöglicht somit die Herstellung eines biologisch aktiven Luteinisierungshormons aus einer einzigen Kultur transformierter Zellen. Die Herstellung beider Untereinheiten eines Luteinisierungshormons in derselben Zelle beseitigt die Notwendigkeit der Rekombination von Untereinheiten aus getrennten Kulturen zum Zusammenbauen eines aktiven, heteropolymeren Moleküls. Das System ermöglicht auch die Herstellung von Luteinisierungshormon in einer einzigen Kultur, das in der Kultur für die Aktivität oder Stabilität eine posttranslationale Modifizierung erfährt, z. B., eine Glycosylierung und proteolytische Verarbeitung.
- Die Verwendung von autonom replizierenden Expressionsvektoren verhindert eine unerwünschte Beeinflussung der gewünschten Kodierregionen durch Kontrollsequenzen in dem Wirtschromosom.
- Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung ihrer bevorzugten Ausführungsbeispiele und den Ansprüchen hervor.
- Es werden nun die bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung betrachtet, wobei zunächst ihre Zeichnungen kurz beschrieben werden (wenn Zeichnungen sich nicht auf die Erfindung als solche beziehen, sind sie nur zum Zwecke der Information bereitgestellt).
- Fig. 1 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p Alpha SVHVP1, das den Alpha hCG cDNA-Klon, Teile von viraler SV40-DNA und Sequenzen des Plasmids pBR 322 enthält.
- Fig. 2 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p Beta SVVP1, das den Beta hCG cDNA-Klon, Regionen von SV40-DNA und einen Teil von pBR 322 einschließlich der Region enthält, die dem Wirts-E. coli Ampicillinresistenz verleiht.
- Fig. 3 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids p Alpha Beta SVVP1, in dem die Alpha- und Beta hCG cDNA-Klone in SV40-DNA eingesetzt sind.
- Fig. 4 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion der Plasmide pRF375 und pRF398.
- Fig. 5 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des Plasmids RF398 Alpha t&sub2;.
- Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Position einer 88 bp Sonde in dem Beta hCG- cDNA-Klon zeigt.
- Fig. 7 zeigt die Beta-LH-Restriktionskarte und die Teile, die in der in Fig. 8 dargestellten Konstruktion verwendet werden.
- Fig. 8 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion eines Plasmids, LH520H/B, das den kompletten, reifen Beta-LH-cDNA-Klon enthält.
- Fig. 9 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des viralen Vektors p Alpha LHSVVP1.
- Fig. 10 ist eine schematische Darstellung der Konstruktion des BPV-haltigen Plasmids pCL28XhoLHBPV, das für die Beta-Untereinheit von LH kodiert.
- Die Klonierungsvektoren der Erfindung haben die allgemeine Struktur, die in der vorangehenden "Zusammenfassung der Erfindung" genannt ist. Bevorzugte Vektoren haben die in den Figuren dargestellten Strukturen und sind in der Folge ausführlicher beschrieben.
- Alle hierin verwendeten Techniken sind ausführlich in Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory), beschrieben, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
- RNA wird aus Plazentagewebe durch das folgende Verfahren extrahiert. Die Homogenisierung des Gewebes erfolgt in einer 1 : 1 Mischung von Phenol : 100 mM Na- Acetat (pH 5,5), enthaltend 1 mM EDTA, das 20 Min. auf 60º erwärmt wurde. Nach dem Abkühlen auf Eis über 10 Min. werden die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Die warme Phenolextraktion wird noch zweimal wiederholt, worauf zwei Extraktionen mit Chloroform folgen.
- RNA wird aus der letzten wässerigen Phase durch die Zugabe von 2,5 Volumina Ethanol ausgefällt.
- Zur Anreichung für poly A+ mRNA wird plazentäre RNA über Oligo(dT)-Zellulose in 0,5 M NaCl, gepuffert mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, geleitet und mit derselben Lösung gewaschen. Poly A+ mRNA wird mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05% SDS eluiert und zweimal mit Ethanol ausgefällt. Typische Anfangsausbeuten sind 1,5-2,0 mg gesamt RNA pro g Gewebe, von welcher etwa 2% poly A+ mRNA ist.
- Plazentäre cDNA-Banken werden durch reverse Transkription von plazentärer mRNA, Synthese des zweiten Stranges unter Verwendung von E. coli DNA Polymerase I (großes Fragment), Behandlung mit SI-Nuclease und Homopolymer-Tailing (dC) mit terminaler Desoxynucleotidyl-Transferase konstruiert; alle diese Prozeduren erfolgen durch herkömmliche Techniken.
- In einer typischen Zubereitung werden 20-30% Umwandlung von mRNA in einzelsträngige (ss) cDNA; 70% Resistenz gegenüber einem Aufschluß mit Nuclease S1 nach der Synthese des zweiten Stranges; und dC-"Schwänze" mit einer Länge von zehn bis fünfundzwanzig Basen erhalten. Diese cDNA-Moleküle werden dann an DNA-Fragmente des Plasmids pBR 322 aufgeschmolzen, das mit PstI aufgeschlossen wurde und dem dG- "Schwänze" hinzugefügt worden waren. Diese rekombinanten Plasmide werden dann zur Transformation von E. coli Zellen zur Erzeugung einer cDNA-Bank verwendet (transformierte Zellen werden auf der Basis der Tetracyclinresistenz gewählt).
- Zur Identifizierung des humanen Alpha hCG-Klons wird ein 219 bp Fragment eines Maus-Alpha-thyreotropen Hormon (TSH-) Klons als Hybridisierungssonde verwendet. Diese Sonde hat eine 77% Sequenzhomologie mit dem humanen Klon. Sie wird durch Nick- Translation radioaktiv markiert und an die cDNA-Bank unter Bedingungen hybridisiert, welche das Ausmaß der Homologie berücksichtigen. Stark hybridisierende Klone werden durch Restriktionskartierung analysiert, und Klone, welche die vollständige Kodierungssequenz von Alpha hCG enthalten, werden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
- Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wird zur Konstruktion des Plasmids Alpha 970 H/B ein cDNA-Klon, der das Alpha hCG-Fragment enthält, mit NcoI aufgeschlossen. Die NcoI- Stelle, die unmittelbar 5' zu dem ATG-Kodon liegt, das den Beginn der Translation signalisiert, wird aufgefüllt und an einen synthetischen HindIII-Linker ligiert. Ebenso wird die natürliche Hindill-Stelle in der 3' untranslatierten Region des Klons geschnitten, mit E. coli DNA Polymerase Klenow aufgefüllt und dann an einen synthetischen BamHI-Linker ligiert. Dieses Fragment wird in das Plasmid pBR 322 zwischen seinen HindIII- und BamHIStellen geklont, um das Plasmid Alpha 574 H/B zu erzeugen. Dieses Plasmid wird mit BamHI aufgeschlossen, mit alkalischer Phosphatase behandelt und an das 396 bp Sau3A- Fragment von SV40-DNA (von 0,07 bis 0,14 Karteneinheiten ("map units" - m.u.)) ligiert, das von einem Polyacrylamidgel isoliert worden war. Die Ligationsmischung wird verwendet, um E. coli zu Ampicillinresistenz zu transformieren, und das gewünschte Plasmid, Alpha 970 H/B wird unter den Transformanden identifiziert.
- Das Plasmid Q&sub2;7 wird durch Schneiden von SV40 an seiner HpaII-Stelle, Bilden von glatten Enden durch Aufschluß mit Nuclease 51, Ligieren an EcoRI-Linker, Aufschließen mit EcoRI und Klonen des erhaltenen 1436 bp Fragments in die EcoRI-Stelle von pBR 322 konstruiert.
- Mit Bezugnahme auf Fig. 1 wird Q&sub2;7 vollständig mit EcoRI und teilweise mit Hindlil aufgeschlossen; das Fragment von 0,72 bis 0,94 Karteneinheiten wird isoliert und in Alpha 970 H/B geklont, das mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen und mit alkalischer Phosphatase behandelt worden war. Die Ligationsmischung wird zur Transformation von E. coli verwendet und das gewünschte Plasmid, p Alpha SVL, wird unter den Transformanden durch Restriktionskartierung identifiziert.
- p Alpha SVL wird mit EcoRI aufgeschlossen, und das Fragment von SV40, mit EcoRI-Enden, das von 0 bis 0,72 Kartenabstandseinheiten reicht und den SV40 Replikationsursprung und die intakte frühe Region enthält, wird daran ligiert, um das Plasmid p Alpha SVHVPI zu erhalten, das von E. coli Transformanden isoliert wird.
- Ein 579 bp cDNA Klon, der für Beta hCG kodiert, wurde von John C. Fiddes, Cold Harbor Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (Fiddes et al. (1980) Nature, Band 286, S. 684-687) erhalten. Dieses Fragment wird an jedem Ende an synthetische BamHI-Linker ligiert. Nach dem Aufschluß durch HgaI-Restriktionsenzym werden die Enden mit Klenow DNA Polymerase aufgefüllt und synthetische EcoRI-Linker werden daran ligiert, so daß eine EcoRI-Stelle etwa 10 bp 5' zu dem ATG-Kodon der Signalpeptidkodierungssequenz liegt. Eine BamHI-Stelle liegt etwa 60 bp 3' zu dem Nonsense-Kodon, welches das Ende der Kodierungssequenz markiert. Mit Bezugnahme auf Fig. 2 wird dieses 556 bp EcoRI-BamHI-Fragment isoliert und in pBR 322 zwischen den EcoRI- und BamHI-Stellen geklont, um das Plasmid p Beta 556 R/B zu erhalten.
- Zur Konstruktion des Plasmids pSVHR (Fig. 2) wird SV40-DNA teilweise mit Hindill aufgeschlossen, um lineare Moleküle zu erhalten, mit Nuclease S1 zur Bildung glatter Enden aufgeschlossen, an synthetische EcoRI-Linker ligiert und mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen. Das Fragment von 0,94 bis 0,14 Karteneinheiten, das den SV40 Replikationsursprung und die frühe Region enthält, wird als ein EcoRI-BamHI-Stück in pBR 322 geklont.
- Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 2 wird die EcoRI-Stelle des Plasmids p Beta 556 R/B in einer Reaktion, die durch EcoRI-Methylase katalysiert wird, methyliert, wonach das Plasmid mit NdeI geschnitten wird. EcoRI-Linker werden an die SI behandelten NdeI glatten Enden ligiert und durch Aufschluß mit EcoRI aktiviert, wonach ein Aufschluß mit BamHI folgt.
- Das SV40-Fragment von pSVHR von der EcoRI-Stelle zu der BamHI-Stelle wird isoliert und in einer Reaktionsmischung, welche die Aufschlußfragmente von p Beta 556 R/B enthält, ligiert. Nach der Ligation wird die Mischung mit SaII zur Entfernung von Plasmiden aufgeschlossen, in welche das EcoRI (NdeI) bis BamHI-Stück von pBR 322 wieder eingesetzt ist. E. coli wird mit der aufgeschlossenen Ligationsmischung transformiert und p Beta SVVP1 wird identifiziert und isoliert.
- Mit Bezugnahme auf Fig. 3 wird pBR 322/Kpn von pBR 322 durch Einsetzen eines KpnI-Linkers in seine einzige EcoRI-Stelle abgeleitet, nachdem diese Stelle durch Aufschluß mit EcoRI deletiert wird, wonach ein Aufschluß mit S1 Nuclease folgt.
- Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 3 wird SV40-DNA mit AvaII aufgeschlossen. Die versetzten Enden der erhaltenen Fragmente werden mit Klenow DNA Polymerase zur Bildung glatter Enden aufgefüllt, und die Mischung wird dann auf einem Polyacrylamidgel fraktioniert. Das 682 Basenpaar Fragment (0,64 bis 0,77 Karteneinheiten), welches den Replikationsursprung und die einzige KpnI-Stelle enthält, wird von dem Gel isoliert, an synthetische HindIII-Linker ligiert, und mit Hindlil und KpnI aufgeschlossen.
- Die erhaltenen Fragmente werden an pBR 322/Kpn ligiert. p266, welches das 266 Basenpaar KpnI-HindIII-Fragment einschließlich der SV40 späten Promotorregion enthält, wird isoliert. p266 wird mit Hindill und BamHI geschnitten und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt.
- Mit weiterer Bezugnahme auf Fig. 3 wird p Beta SVVPI/B wie folgt konstruiert: p Beta SVVPI (Fig. 2) wird mit EcoRI geschnitten, wonach eine Ligation zur Entfernung von pBR 322 Sequenzen folgt. Anschließend wird diese DNA mit BamHI geschnitten und in die BamHI-Stelle von pBR 322 geklont.
- Das erhaltene Plasmid, p Beta SVVPI/B wird dann mit Hindill und BamHI aufgeschlossen und das 1003 Basenpaar HindIII-BamHI-Fragment wird in p266 ligiert, um das Plasmid p Beta VP1 266 zu erhalten, in dem die Beta hCG cDNA stromabwärts des SV40 späten Promotors derart angeordnet ist, daß ihr RNA-Transkript so gespleißt wird, als wäre es das virale VP1-Transkript.
- Die Alpha hCG cDNA wird in p Beta VP1 266 als ein HindIII-Fragment eingesetzt, das an seiner Hindill-Stelle geschnitten und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt wurde. E. coli-Transfonnanden, die von dieser Ligation abgeleitet werden, werden durch Restriktionskartierung durchmustert, und es werden Plasmide isoliert, welche die gewünschte Struktur aufweisen, in welcher die Alpha hCG cDNA das VP2 in der korrekten Orientierung ersetzt hat, worauf stromabwärts die Beta hCG cDNA folgt, die VP1 ersetzt hat.
- Ein solches isoliertes Plasmid, p Alpha Beta VP1, wird zur Vollendung der Konstruktion von p Alpha Beta SVVP1 verwendet. Das Plasmid wird mit KpnI geschnitten und das volle SV40 Genom, das mit KpnI geschnitten ist, wird durch Ligation in diese Stelle eingesetzt. Nach der Transformation von E. coli wird ein Plasmid mit der geforderten Sruktur, p Alpha Beta SVVP1, isoliert. Dieses Plasmid enthält DNA, die sowohl für die Alpha- als auch für die Beta-Untereinheit von hCG kodiert, und somit zum Lenken der Expression beider Untereinheiten in Wirtssäugetierzellen imstande ist, wodurch ein biologisch funktionelles, glycosyliertes, heterodimeres hCG erzeugt wird (die Glycosylierung erfolgt posttranslational).
- Mit Bezugnahme auf Fig. 4 wird das Plasmid (CL28 (identisch mit Plasmid JYMMT(E); Hamer et al. (1983) J. Mol. Applied Gen. 1, 273-288), welches den murinen Methallothionein-Promotor, SV40 DNA und pBR 322 Sequenzen enthält, mit der Restriktionsendonuclease BgIII geschnitten. An dieser Stelle werden cDNA-Klone von Alpha hCG oder Beta hCG eingesetzt, welche untranslatierte Regionen von etwa 10 und 30 bp an ihrem 5'-Ende und von etwa 220 und 60 bp an ihren 3'-Enden enthalten. Diese Klone wurden durch das Hinzufügen synthetischer BamHI-Linker an ihren Ende genetisch manipuliert.
- Die erhaltenen Plasmide pRF 302 (Alpha) oder pRF 394 (Beta) werden mit Restriktionsenzymen BamHI und SalI zur Freisetzung der SV40-DNA-Sequenzen aufgeschlossen.
- Plasmid pB2-2, welches das gesamte BPV-Genom und einige pBR 322-Sequenzen enthält, wird mit BamHI und SalI aufgeschlossen, um das BPV-Genom mit BamHI/SalI- Enden zu erhalten; dieses Fragment wird in pRF 302 (Alpha) und pRF 394 (Beta) ligiert, welche die Metallothionein-hCG-Sequenzen enthalten.
- Nach der Transformation von E. coli, werden Plasmide pRF 375 und pRF 398 identifiziert und isoliert. Sie kodieren für Alpha hCG bzw. Beta hCG unter der Kontrolle des Maus-Metallothioneinpromotors.
- Mit Bezugnahme auf Fig. 5 wird das Plasmid p Alpha t2 durch Klonen des Alpha hCG 574 HindIII-Fragments in Plasmid pVBt2 abgeleitet (V. B. Reddy et al., PNAS 79, 2064 -2067, 1982). p Alpha t2, welches die Alpha hCG cDNA unter der Kontrolle des frühen SV40 Promotors enthält, wird mit EcoRI aufgeschlossen. Die 5' Überhänge werden durch S1-Nucleaseaufschluß entfernt, bevor synthetische BamHI-Linker durch Ligation der stumpfen Enden hinzugefügt werden.
- Plasmid RF 398 (Fig. 4) wird mit BamHI aufgeschlossen und mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelt. Das 1735 Basenpaar BamHI-Fragment von p Alpha t&sub2; wird in RF 398 eingesetzt. Das erhaltene Plasmid RF 398 Alpha t&sub2; wird von E. coli Transformanden isoliert. Dieses Plasmid hat somit die Beta hCG cDNA in einer transkriptionalen Einheit unter der Kontrolle des Maus-Metallothioneinpromotors und die Alpha hCG cDNA in einer transkriptionalen Einheit unter der Kontrolle des SV40 frühen Promotors.
- RNA wird aus humanen Hypophysen durch Homogenisieren von 5 bis 1O Gramm der gefrorenen Drüsen in 20 ml einer Lösung hergestellt, die 4 M Guanidinthiocyanat, 1 M 2- Mercaptoethanol, 0,05 M Na-Acetat (pH 5,0) und 0,001 M EDTA enthält. 1 g CsCl wird pro ml Homogenat zugegeben und die Suspension wird bei 2.000 Upm 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird sorgfältig über einen 15 ml Polster CsCl-Lösung (enthaltend 1,25 ml 1 M Na-Acetat (pH 5), 62,5 Mikroliter 0,4 M EDTA und 39,8 g CsCI in einem Endvolumen von 35 ml) geschichtet und bei 45.000 Upm im Ti 70 Rotor einer Beckman Ultrazentrifuge 18-24 h bei 20ºC zentrifugiert. Die RNA, die als Pellikel in dem Gradient sichtbar ist, wird mit einer Spritze entfernt, verdünnt und durch die Zugabe von zwei Volumina Ethanol ausgefällt. Nach drei Zyklen der Auflösung und erneuten Ausfällung wird das RNA-Pellet in H&sub2;O aufgelöst und durch die Zugabe konzentrierter Stammlösungen auf 0,01 M Tris-Hcl (pH 7,5) und 0,5 M NaCl gebracht. Die Zubereitung wird dann auf poly A+ mRNA durch zwei Durchläufe über Oligo(dT)-Zellulose angereichert, wie zuvor im Falle der plazentären RNA beschrieben wurde.
- Eine humane Hypophysen-cDNA-Bank wird aus der poly A+ mRNA konstruiert, wie zuvor für plazentäre poly A+ mRNA beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß sowohl das große Fragment E. coli DNA Polymerase I als auch die Vogel-Myeloblastosis-Virus reverse Transkriptase sequentiell für die cDNA-Synthese des zweiten Stranges verwendet werden. Zuerst wird das Klenow-Fragment verwendet. Die Reaktion wird durch Phenolextraktion gestoppt.
- Die wässerige Phase des zentrifugierten Extraktes wird auf eine 5 ml Säule BioGel A-5m aufgebracht. Fraktionen, die das Material mit hohem Molekulargewicht enthalten, werden gepoolt, konzentriert, mit zwei Volumina Ethanol ausgefällt, getrocknet und in 100 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl&sub2;, 140 mM KCl, 20 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 1 mM der vier Desoxyribonucleosidtriphosphate zur reversen Transkription aufgelöst. Reverse Transkriptase wird etwa 20 Einheiten pro Mikrogramm cDNA zugegeben. Doppelsträngige cDNA wird dann mit Nuclease S1 behandelt, mit Schwänzen versehen, und wie zuvor beschrieben geklont.
- Kolonien, die auf Nähragarplatten gezüchtet wurden, die 25 Mikrogramm pro ml Tetracyclin enthielten, werden auf Nitrocellulosefilter übertragen. Die Kolonien werden in situ durch Behandlung mit 0,5 M NaOH lysiert und mit 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4), enthaltend 1,5 M NaCl, neutralisiert. Freigesetzte DNA wird auf dem Filter durch Backen bei 80ºC in einem Vakuumofen über 2 h fixiert. Die Filter werden durch Hybridisierung an ein ³²Pmarkiertes, 88 Basenpaar Fragment des Beta hCG-Klons durchmustert, welches den Aminosäuren 16 bis 45 der reifen hCG Beta-Kette entspricht, die 29 von 30 Aminosäuren mit dieser Region des Beta LH-Polypeptids gemeinsam hat (Fig. 6). Die Hybridisierung wird über Nacht bei 32º in 50% Formamid, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-Citrat (pH 7,0), 2,5% Dextransulfat, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1 mg pro ml Rinderserumalbumin und mindestens 10&sup5; cpm pro Filter des ³²P-märkierten, 88 bp Beta hCG-Fragmentes durchgeführt. Die Filter werden mehrere Male in 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-Citrat bei 37ºC vor der Autoradiographie gewaschen. Einer der positiven, isolierten Klone LH12 (Fig. 7) wird weiterverwendet. LH12 ist 365 bp lang und enthält Sequenzen, die für 15 Aminosäuren der Prä-Beta-Signalsequenz plus 105 Aminosäuren des reifen Beta-LH-Polypeptids kodieren. Seine Nucleotidsequenz wird bestimmt. Da das vollständige, reife Beta-LH nicht durch LH12 kodiert wird, wird eine weitere Durchmusterung der humanen Hypophysen-cDNA- Bank unter Verwendung eines 240 bp NcoI-PvuII-Fragmentes von LH12 (Fig. 7) als ³²Pmarkierte Hybridisierungsonde durchgeführt. Der Klon LH 6 (Fig. 7) wird aus dieser Durchmusterung isoliert. LH6 enthält das vollständige 3'-Ende von Beta-LH, einschließlich der Region, die dem untranslatierten Abschnitt der mRNA bis zu 27 A Resten des poly A "Schwanzes" der mRNA entspricht. Es wurden keine Klone gefunden, die weiter als LH12 in die 5'-Richtung reichten. Die DNA-Sequenzierung der vollständigen, kombinierten, reifen Beta-LH-Kodierungsregionen zeigt zwei Unterschiede in der Aminosäuresequenz von Beta- LH zu den veröffentlichten Proteinsequenzdaten: Position 42 ist ein Methionin und Position 55 ist ein Valin. Ebenso enthält das reife Beta-LH 121 Aminosäuren, basierend auf der cDNA-Sequenz.
- Ein Klon, der eine intakte Signalpeptid-Kodierungssequenz und die vollständige, reife Beta-LH-Sequenz enthält, wird unter Verwendung des in Fig. 7 dargestellten Restriktionsfragmentes konstruiert, wie in Fig. 8 dargestellt ist. Ein 104 bp EcoRI-DdeI- Fragment wird von dem Plasmid Beta 579 H isoliert und an ein 181 bp DdeI-Fragment ligiert, das von dem LH12 Plasmid isoliert und anschließend mit PstI aufgeschlossen wird. Nach der Ligation über Nacht bei 15ºC wird die Ligationsmischung mit EcoRI und PstI aufgeschlossen und auf einem 7% Polyacrylamidgel fraktioniert, von welchem das gewünschte 256 bp Fragment isoliert wird. Dieses Fragment schmilzt die Beta-hCG- Signalsequenz an jene des Prä-Beta-LH derart, daß eine Kodierungssequenz für ein 20 Aminosäuren Signalpeptid erhalten wird.
- Das 256 bp EcoRI-PstI-Fragment wird in pBR 322 geklont, das mit EcoRI und PstI aufgeschlossen wurde, so daß das Plasmid LH Beta 260 erhalten wird. Das 146 bp EcoRI- NcoI-Fragment, das in Fig. 8 angegeben ist, wird aus einem Polyacrylamidgel isoliert und später in der Konstruktion verwendet, wie in der Folge beschrieben ist.
- Das LH6-Plasmid (Fig. 8) wird mit Sau3a aufgeschlossen und das 390 bp Fragment wird durch Polyacrylamidgelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wird dann mit HincII aufgeschlossen, an BamHI-Linker ligiert, mit BamHI aufgeschlossen und in das Plasmid pAPP an der BamHI-Stelle geklont. pAPP wird von pBR 322 durch Aufschluß mit Aval, Auffüllen des 5'-Überhanges mit den dNTPs und dem großen Fragment DNA Polymerase I von E. coli, Aufschluß mit PvuII und Ligation zum Schließen des Plasmids, so daß die PvuII-Stelle entfernt wird, abgeleitet. Das Plasmid LH6B, das aus der Ligation des 340 bp BamHI-Fragmentes in die BamHI-Stelle von pAPP isoliert wird, wird mit EcoRI und PvuII aufgeschlossen und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt. Die Fragmente werden an eine Mischung des 145 bp EcoRI-NcoI-Fragmentes von LH Beta 260, wie zuvor beschrieben, und an das isolierte 241 bp NcoI-PvuII-Fragment von dem Plasmid LH12, das in Fig. 8 dargestellt ist, ligiert. Die Ligationsmischung wird zur Transformation von E. coli zu Ampicillinresistenz verwendet. Das Plasmid LH 520 H/B findet sich unter den Transformanden. LH 520 H/B enthält eine vollständige Beta-LH-Kodierungssequenz, einschließlich einer hybriden Signalpeptidsequenz.
- Zum Exprimieren dieses Prä-Beta-LH-Klons in einem auf SV40 basierenden Vektor, wie bei den zuvor beschriebenen Prä-Alpha- und Prä-Beta CG-Klonen, ist es wünschenswert, eine EcoRI-Stelle sehr nahe bei dem ATG der Prä-Beta-Kodierungssequenz anzuordnen. Dies erfolgt durch den Aufschluß von LH520 H/B mit HgaI, Auffüllen des 5' Überhanges, Ligieren an synthetische EcoRI-Linker, Aufschluß mit EcoRI und BamHI, und Klonen des isolierten, 496 bp EcoRI-BamHI-Fragmentes in pBR 322, das mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen und mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt ist. Das Plasmid pLH496 R/B wird von E. coli isoliert, das mit dieser Ligationsmischung transformiert ist, und als Quelle für das zu exprimierende 496 bp Fragment verwendet.
- Das Plasmid p Alpha Beta VP1, dessen Konstruktion und Verwendung in der Expression beider Untereinheiten von hCG früher beschrieben wurde (Fig. 3); wird mit EcoRI und BamHI aufgeschlossen und in eine Reaktionsmischung ligiert, die das Plasmid pLH496 RJB enthält, das mit diesen beiden Enzymen aufgeschlossen wurde (Fig. 9). Das Plasmid p Alpha LHVPI wird unter den E. coli Transformanden identifiziert. Wie in Fig. 9 dargestellt, wird die intakte, SV40, virale frühe Region von p Alpha SVHVP1 (Fig. 1) genommen und durch Ligation als ein KpnI-SalI-Fragment in p Alpha LHVP1 eingesetzt, das mit KpnI und SalI aufgeschlossen wurde, um das Plasmid p Alpha LHSVVP1 zu erhalten. Durch Schneiden dieses Plasmids mit BamHI und erneute Ligation wird das Virus Alpha LHSVVP1 gebildet. Dieses Virus enthält geklonte cDNAs für die gemeinsame (für LH und hCG, wie auch FSH und TSH) Alpha-Untereinheit und die spezifische Beta-LH-Untereinheit unter der Kontrolle des SV40 späten Promotors. Die geklonten cDNAs sind derart positioniert, daß der gemeinsame Alpha-Einschub die virale VP1 Proteinkodierungssequenz ersetzt und der Beta-LH-Einschub die virale VP2 Kodierungssequenz ersetzt.
- LH 520 H/B (Fig. 8) wird mit Hindill und BamHI aufgeschlossen, mit der E. coli DNA Polymerase (Klenow) behandelt, an synthetische SalI-Linker ligiert, mit SaII aufgeschlossen und in die SalI-Stelle von pBR 322 geklont. Das erhaltene Plasmid, LH 530 Sal, wird als Quelle für den LH cDNA Klon zum Einsetzen in das Maus-Metallothionein- Gen des Plasmids CL28 verwendet, wie in Fig. 10 beschrieben ist.
- CL28 wird mit BgIII geschnitten, mit Nuclease S1 behandelt und an XhoI-Linker ligiert. Nach dem Aufschluß mit XhoI, der Ligation und dem Aufschluß mit BgIII, wird E. coli mit der Reaktionsmischung transformiert, um das Plasmid CL28Xho zu erhalten. Dieses Plasmid wird mit BamHI und SalI aufgeschlossen und an einen BamHI- plus SalI-Aufschluß des Plasmids pB2-2 (Fig. 4) ligiert, um das Plasmid CL28XhoBPV zu erhalten. Der letztgenannte LH-Einschub wird dann in die XhoI-Stelle von CL28XhoBPV als SalI- Fragment ligiert, da der 5' Überhang von SalI-Aufschlüssen komplementär zu jenem von XhoI-Aufschlüssen ist. Nach dem Aufschluß mit XhoI zur Entfernung des Hintergrundes wird E. coli transformiert und das gewünschte Plasmid pCL28XhoLHBVP, das den (hybriden) Prä-Beta-LH-Einschub, in einem auf BPV basierenden Plasmid, unter der Kontrolle des Maus-Metallothionein-Promotors enthält, wird isoliert.
- Die Eingliederung von virushaltigen Vektoren in eukaryontische Zellen zur Erzeugung eines heteropolymeren Proteins wird im allgemeinen wie folgt ausgeführt. Wenn die virale DNA und die homopolymere, proteinkodierende DNA in ein Plasmid eingegliedert werden, das zum Beispiel in E. coli gehalten wird, werden zunächst die Plasmidsequenzen (z. B. die pBR 322 Sequenzen) entfernt und die erhaltene DNA wird zur Bildung einer kreisförmigen DNA ligiert, welche die virale Region und die heteropolymere, proteinkodierende Sequenz oder Sequenzen enthält. Diese kreisförmige DNA enthält im allgemeinen nicht die gesamte genetische Information, die zur Erzeugung eines replizierenden Virus notwendig ist, wobei die anderen notwendigen Sequenzen (z. B. jene, die für Hüllprotein kodieren) durch die heteropolymere, proteinkodierende Sequenz oder Sequenzen ersetzt wurden. Die kreisförmige DNA, minus der Plasmid DNA, muß annähernd so groß wie die in der Natur vorkommende virale DNA sein, aus welcher sie abgeleitet wird, so daß DNA in die richtigen Wirtssäugetierzellen eindringen und dort replizieren kann.
- Die kreisförmige DNA wird zur Transfektion von Wirtszellen verwendet, um einen Virusstamm für spätere Infektionen zu erzeugen. Da ein Teil der DNA, der zur Erzeugung des Virus notwendig ist, fehlt, muß die Transfektion in Verbindung mit Helfervirus-DNA erfolgen, die ausreichend für die fehlende Funktion kodiert, um ein replizierendes Virus zu erzeugen.
- Transfektierte Wirtszellen werden bis zur Lyse durch ein replizierendes Virus gezüchtet und inkubiert. Der erhaltene replizierende Virusstamm, einschließlich des Helfervirus, wird dann zur Infektion von Wirtszellen zur Erzeugung des heteropolymeren Proteins verwendet. Der Virusstamm wird erhalten, da er im allgemeinen zur Infektion frischer Chargen von Wirtszellen wiederverwendet werden muß, da jede Kultur von infizierten, proteinerzeugenden Wirtszellen im allgemeinen letztendlich von dem Virus lysiert wird.
- Die zuvor beschriebenen, spezifischen, rekombinanten DNA-Sequenzen werden zur Transfektion und dann Infektion von Wirtszellen wie folgt verwendet.
- Die pBR 322 Sequenzen werden aus den zuvor beschriebenen, SV40-haltigen Plasmiden entfernt, um transfektierende, virale DNA zu erzeugen. Im Fall von p Alpha SVHVP1 und p Alpha Beta SVVPI erfolgt dies durch Aufschluß mit BamHI, worauf eine Ligation unter Bedingungen erfolgt, die eine Zirkularisierung der Fragmente begünstigt, um (unter anderen Produkten) Alpha SVHVP1 und Alpha Beta SVVPI zu erhalten. Für p Beta SVVP1 bringt der Aufschluß mit EcoRI, auf den eine Religation folgt, gleichzeitig mit der Entfernung der pBR 322 Sequenzen den SV40 späten Promotor und die VP1-Spleißregion neben den Beta hCG cDNA Einschub und bildet Beta SVP1. Gleichzeitig wird ptsA58 Bam (tsA 58 SV40 virale DNA, die in die pBR 322 BamHI-Stelle geklont ist) mit BamHI geschnitten und ligiert, um selbst-ligierte Kreise zu erhalten. Analoge Verfahren werden für die LH-Vektoren verwendet. Getrennte Virusstämme werden wie in der Folge beschrieben hergestellt.
- Die DNAs, die nach der vorangehenden Beschreibung geschnitten und ligiert sind, werden mit Ethanol ausgefällt und in sterilem Wasser aufgelöst. Etwa 1 ug ptsA58 Bam DNA (Helfervirus) und 10 ug rekombinante DNA (die für Alpha und/oder Beta hCG oder LH kodiert) werden in einem sterilen Teströhrchen vereint, mit 2 ml TBS-Puffer (G. Kimura und R. Dulbecco 1971, Virogy, 49, 79-81) und 1 ml 2 mg/ml DEAE-Dextranlösung vermischt und einer Monoschicht konfluenter Affen-CV-1-Zellen zugegeben, die zuvor zweimal mit 10 ml TBS in einem T-75 Kolben gewaschen wurden. Die Zellen werden bei 37ºC 1-2 Stunden mit gelegentlichem Schütteln stehen gelassen, zweimal mit TBS gewaschen, mit 10 ml DMEM haltigem 5 % fötalem Kälberserum gespeist, und 10-15 Tage bei 40ºC belassen. Nach der vollständigen Zellyse wird das Medium in ein Teströhrchen übertragen, fünfmal gefroren und aufgetaut, und bei 3.000 Upm fünf Minuten zentrifugiert. Die erhaltenen Überstände dienen als Virusstämme zur Infektion frischer CV-1-Zellen.
- Zur Durchführung einer Infektion werden CV-1-Zellen bis zur Konfluenz in einem T- 150 Kolben gezüchtet. 1 ml von einem der Virusstämme (die nach der vorangehenden Beschreibung hergestellt wurden) wird dem Kolben zugesetzt und die Zellen werden 5 Tage bei 40ºC inkubiert.
- Für gemischte Infektionen werden CV-1-Zellen bis zur Konfluenz in einem T-150 Kolben gezüchtet. Alpha SVHVP1 und Beta SVP1 Viren werden in einem 1 : 1 Verhältnis gemischt und 1 ml des gemischten Virus wird zur Infektion von CV-1-Zellen bei 40ºC verwendet.
- Zur Erzeugung heterodimeren hCG unter Verwendung einer gemischten Transfektion, werden jeweils fünf ug von BPV Plasmid, d. h., pRF 375 (Alpha hCG) und pRF 398 (Beta hCG), gemischt und zu 0,5 ml einer 250 mM CaCl&sub2;-Lösung zugegeben, die 10 ug Lachsspermien-DNA als Träger enthält. Diese Mischung wird in 0,5 ml 280 mM NaCl, 50 mM Hepes und 1,5 mM Natriumphosphat geperlt. Der Kalziumphosphatniederschlag kann sich 30-40 Minuten bei Raumtemperatur bilden.
- 24 Stunden vor der Transfektion werden 5 · 10&sup5; Zellen von Maus-C127-Zellen (erhältlich von Dr. Dean Hamer, National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD) in eine 100 mm Schale oder einen T-75 Kolben eingebracht. Unmittelbar vor der Zugabe der exogenen DNA wird den Zellen frisches Medium zugeführt (Dulbeccos's Modified Medium, 10% fötales Kälberserum). 1 ml Kalziumphosphatniederschlag wird jeder Schale (10 ml) zugegeben und die Zellen werden 6-8 Stunden bei 37ºC inkubiert.
- Das Medium wird abgesaugt und durch 5 ml 20% Glycerol in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,0 (PBS) für 2 Minuten bei Raumtemperatur ersetzt. Die Zellen werden mit PBS gewaschen, mit 10 ml Medium gespeist und bei 37ºC inkubiert. Nach 20-24 Stunden wird das Medium gewechselt und anschließend erfolgt eine erneute Speisung der Zellen alle 3-4 Tage. Einzelne Klone werden in T-25 cm Kolben gezüchtet. Nach 7-21 Tagen können Zellklone in größere Kolben zur Analyse überführt werden.
- Zur Herstellung heterodimeren hCG unter Verwendung einer einzigen Transfektion wird Plasmid RF 398 Alpha ³/&sub4; auf dieselbe Weise verwendet, wie die obengenannten zwei Plasmide für eine gemischte Infektion verwendet wurden.
- Zur Herstellung von heterodimerem LH werden die Plasmide PRF 375 und pCL28XhoLHBPV gemischt, wie zuvor im Falle von hCG beschrieben wurde.
- Eine interessante Beobachtung ist, daß die Kultivierung von Zellen, die nur BetahCG- oder Beta-LH-kodierende Vektoren enthalten, ohne Alpha-kodierende Zellen, im Prinzip keine Beta-Untereinheit erzeugt, während Zellen, die Alpha- und Beta-kodierende Sequenzen enthalten, nicht nur ein Heterodimer, sondern auch eine freie Beta-Untereinheit erzeugen. Dies bekräftigt die Annahme, daß die Herstellung beider Untereinheiten in einer einzigen Zellkultur den zusätzlichen Vorteil hat, daß die Gegenwart der Alpha-Untereinheit in irgendeiner Weise die Beta-Untereinheit stabilisiert.
- Folgende, wie zuvor beschrieben, wurden in der American Type Cultur Collection, Rockville, MD, hinterlegt:
- Alpha Beta SVVP1, ATTC VR2077;
- Alpha SVHVP1, ATCC VR2075;
- Beta SVVP1, ATCC VR2075;
- pRF 375 in C127-Zellen, ATCC CRL8401;
- pRF 398 in C127-Zellen, ATCC CRL8401;
- pCL28XhoLHBPV E. coli, ATCC 39475;
- pRF 298 Alpha t&sub2; in C-127 Zellen.
- Transfektierte Zellen der Erfindung können zur Herstellung von biologisch aktivem Luteinisierungshormon verwendet werden.
- Andere Ausführungsbeispiele sind in den folgenden Ansprüchen enthalten. Zum Beispiel:
- Andere Wirtszellen, Vektoren, Promotoren, transformierende Sequenzen und Viren können ebenso verwendet werden. Die verwendete Wirtszelle hängt im allgemeinen von dem verwendeten Vektor ab. Wenn zum Beispiel der Vektor ein replizierendes Virus oder eine nicht-replizierende, virale DNA ist, sind die Wirtszellen Zellen, die durch diese Vektoren infiziert oder transfektiert werden können; z. B. benötigen SV40-haltige Vektoren Affenwirtszellen, vorzugsweise CV-1-Zellen. Wenn der Klonierungsvektor ein Plasmid mit prokaryontischen Kontrollsequenzen ist, werden prokaryontische Wirtszellen, z. B. E. coli, verwendet. Wenn der Klonierungsvektor ein Plasmid mit eukaryontischen Kontrollsequenzen ist, werden geeignete eukaryontische Wirtszellen, z. B. Maus-C127- Zellen, verwendet.
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