DK171489B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af flere underenheder, eukaryotisk celle, som er transficeret med en eller flere udtrykkelsesvektorer og er i stand til at producere et sådant hormon, udtrykkelsesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for underenhederne af hormonet, et sæt af udtrykkelsesvektorer, hvor hver vektor omf - Google Patents
Fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af flere underenheder, eukaryotisk celle, som er transficeret med en eller flere udtrykkelsesvektorer og er i stand til at producere et sådant hormon, udtrykkelsesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for underenhederne af hormonet, et sæt af udtrykkelsesvektorer, hvor hver vektor omf Download PDFInfo
- Publication number
- DK171489B1 DK171489B1 DK297185A DK297185A DK171489B1 DK 171489 B1 DK171489 B1 DK 171489B1 DK 297185 A DK297185 A DK 297185A DK 297185 A DK297185 A DK 297185A DK 171489 B1 DK171489 B1 DK 171489B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- hormone
- vector
- promoter
- heterologous dna
- subunits
- Prior art date
Links
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 33
- 239000005556 hormone Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 39
- 102000035123 post-translationally modified proteins Human genes 0.000 title claims description 8
- 108091005626 post-translationally modified proteins Proteins 0.000 title claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 85
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 66
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 claims description 10
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 claims description 8
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000035558 fertility Effects 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 16
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 abstract description 12
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 abstract description 12
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 abstract description 12
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 abstract description 8
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 abstract description 8
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 abstract description 8
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 abstract description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 46
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 31
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 21
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 18
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 18
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 18
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 18
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 16
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 5
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 5
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 5
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710166678 50S ribosomal protein L28, chloroplastic Proteins 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- ULSFNUQXUHMWNZ-UHFFFAOYSA-N crl-8401 Chemical compound O=C1C2=NC=CC=C2C2=NC=CC3=C2C1=NC=C3OC ULSFNUQXUHMWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000589877 Campylobacter coli Species 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000956 alloy Substances 0.000 description 1
- 229910045601 alloy Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 229920000140 heteropolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000029849 luteinization Effects 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000005059 placental tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4715—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/60—Vector systems having a special element relevant for transcription from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
- C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
DK 171489 Bl i
OPFINDELSENS BAGGRUND
Denne opfindelse angår anvendelsen af rekombinant-DNA-teknik til fremstilling af heteropolymere proteinhormoner.
5 Forskellige polypeptidkæder er via rekombinant-DNA-teknologi blevet udtrykt i værtsceller, såsom bakterier, gær og dyrkede pattedyrceller. Fiddes, J.C. og Goodman, H.M.
(1979) Nature Vol. 281, side 351-456, og Fiddes, J. C. og Goodman, H.M. (1980) Nature Vol. 286, side 684-687, be- 10 skriver kloningen af henholdsvis a- og β-underenhederne af humant choriongonadotropin (hCG).
I US patentskrift nr. 4 383 036 er beskrevet en fremgangsmåde til fremstilling af hCG, hvorved humane lympho-blastoidceller implanteres i et laboratoriedyr, høstes 15 fra dyret og dyrkes in vitro; akkumuleret hCG høstes derpå fra kulturen.
SAMMENFATNING AF OPFINDELSEN
Ifølge et første aspekt af opfindelsen tilvejebringes en fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, 20 posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af flere underenheder, hvilken fremgangsmåde omfatter, at hver af underenhederne syntetiseres på almindelig vis i en eukaryotisk celle transficeret med en eller flere ud-trykkelsesvektorer omfattende heterolog DNA, som koder 25 for hver af underenhederne. Hormonet kan være hCG, lutei-niseringshormon (LH), follikelstimulerende hormon (FSH) eller thyreoideastimulerende hormon (TSH).
Ifølge et andet aspekt af opfindelsen tilvejebringes en eukaryotisk celle transficeret med en eller flere udtryk-30 kelsesvektorer, hvilken celle er i stand til at producere et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon med flere underenheder, hvor hormonets underenheder er indkodet af heterolog DNA i udtrykkelsesvekto-ren eller -vektorerne.
DK 171489 B1 2
Cellen kan være en abe- eller musecelle. I nogle udførelsesformer transficeres cellen med mere end én udtrykkel-sesvektor, og hver vektor omfatter heterolog DNA, som koder for en respektiv underenhed, mens cellen i andre ud-5 førelsesformer transficeres med en enkelt udtrykkelses-vektor omfattende heterolog DNA, som koder for hver underenhed. Hvilket arrangement der end foretrækkes, kan hver heterolog DNA, som koder for en underenhed, om ønsket være under styring af en respektiv promotor; anven-10 delsen af forskellige promotorer minimerer på fordelagtig måde muligheden for skadelige rekombinationer. Foretrukne promotorer til anvendelse i forbindelse med denne opfindelse inkluderer den sene SV40-promotor, muse-metallo-thionein-promotoren og human papillomavirus-promotoren.
15 Udtrykkelsesvektoren eller hver udtrykkelsesvektor kan indeholde plasmid-afledt DNA og/eller replikerende virusafledt DNA, såsom mindst det 69% transformerende område af okse-papillomavirus-genomet. Andre foretrukne træk ved det andet aspekt er som ved det første aspekt med de nød-20 vendige ændringer.
Ifølge et tredje aspekt af opfindelsen tilvejebringes en udtrykkelsesvektor, som er i stand til at transficere en eukaryotisk celle, hvilken vektor omfatter heterolog DNA, som koder for underenhederne af et biologisk aktivt, 25 posttranslationelt modificeret proteinhormon med flere underenheder.
Ifølge et fjerde aspekt af opfindelsen tilvejebringes et sæt af vektorer, hvori mindst én, og fortrinsvis hver, af vektorerne omfatter mindst det 69% transformerende område 30 af okse-papillomavirus-genomet.
Foretrukne træk ved det tredje og fjerde aspekt er som for det første og andet aspekt med de nødvendige ændringer.
I denne beskrivelse henfører "underenhed" til en portion 35 af et protein, hvilken portion eller en homolog eller analog dertil i naturen kodes for af en særskilt mRNA.
DK 171489 B1 3
Hver af hCG, LH og FSH har mere end én underenhed efter det kriterie.
Betegnelsen "udtrykkelsesvektor" henfører til en kloningsvektor, som inkluderer heterolog (for vektoren) DNA 5 under styring af styresekvenser, som muliggør udtrykkelse i en værtscelle. Sådanne vektorer inkluderer replikerende viruser, plasmider og fager.
Opfindelsen muliggør produktionen af et biologisk aktivt heteropolymert protein ud fra en enkelt kultur af transit) formerede celler. Produktionen af begge underenheder af et heteropolymert protein i den samme celle eliminerer nødvendigheden af at rekombinere underenheder fra separate kulturer for at samle et aktivt heteropolymert molekyle. Systemet tillader også produktion i en enkelt kultur 15 af proteiner, som i kulturen undergår posttranslationel modifikation, f.eks. glycosylering og proteolytisk forarbejdning, med henblik på aktivitet eller stabilitet.
Anvendelsen af autonomt replikerende udtrykkelsesvektorer i nogle udførelsesformer forhindrer uønsket indflydelse 20 på de ønskede kodeområder fra styresekvenser i værtskromosomet .
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat, hvilken fremgangsmåde omfatter fremstilling af et rekombinant proteinhormon som be-25 skrevet ovenfor og blanding af dette med en bærer.
Andre fordele og træk ved opfindelsen vil fremgå af den følgende beskrivelse af foretrukne udførelsesformer deraf med henvisning til de ledsagende tegninger.
BESKRIVELSE AF DE FORTRUKNE UDFØRELSESFORMER
30 Først beskrives i korthed tegningerne.
DK 171489 B1 4 TQgninggr
Fig. 1 er et diagram af konstruktionen af plasmidet paSVHCPl, som indeholder ahCG-cDNA-klonen, portioner af SV40-viral DNA og sekvenser af plasmidet af pBR322.
5 Fig. 2 er et diagram af konstruktionen af plasmidet pPSWPl, som indeholder PhCG-cDNA-klonen, opråder af SV40-DNA og en portion af pBR322 inklusive området, der overfører resistens over for ampicillin på værten E. co- li.
10 Fig. 3 er et diagram af konstruktionen af plasmidet paSWPl, hvori a- og PhCG-cDNA-klonerne er indsat i SV40-DNA.
Fig. 4 er et diagram af konstruktionen af plasmiderne pRF375 og pRF398.
15 Fig. 5 er et diagram af konstruktionen af plasmidet pRF398at2·
Fig. 6 er et diagram, som belyser lokaliseringen af en 88 bp sonde i PhCG-cDNA-klonen.
Fig. 7 belyser PLH-restriktionskortet og stykkerne, der 20 er anvendt ved den i fig. 8 viste konstruktion.
Fig. 8 er et diagram af konstruktionen af et plasmid, LH520H/B, indeholdende den komplette modne pLH-cDNA-klon.
Fig. 9 er et diagram af konstruktionen af den virale vektor paLHSWPl.
25 Fig. 10 er et diagram af konstruktionen af det BPV-holdi-ge plasmid pCL28XholLHBPV, som koder for P-underenheden af LH.
DK 171489 B1 5
Struktur
Kloningsvektorerne ifølge opfindelsen har den almene struktur, som er anført i sammenfatningen af opfindelsen ovenfor. Foretrukne vektorer har de i figurerne 5 viste strukturer og beskrives mere detaljeret neden for .
Konstruktion af kloningsvektorer
Isolering af cDNA-kloner, som koder for g- og β-underenhe-derne af hCG
Al den her anvendte teknik er beskrevet i detaljer i 10 Maniatis et al., (1982), Molecular Cloning: A Laboratory
Manual (Cold Spring Harbor Laboratory), der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved denne henvisning.
RNA ekstraheres fra placentalt væv ved den følgende 15 metode. Homogenisering af vævet udføres i en 1:1 blanding af phenol og 100 mM natriumacetatopløsning (pH 55,) indeholdende 1 mM EDTA, som er blevet opvarmet til 60 °C i 20 minutter. Efter afkøling på is i 10 minutter adskilles faserne ved centrifugering. Den varme phenol-20 ekstraktion gentages to gange mere efterfulgt af to ekstraktioner med chloroform.
RNA udfældes fra den endelige vandige fase ved tilsætning af 2,5 volumener ethanol.
For at berige m.h.t. polyA+ mRNA sendes placental RNA over oligo(dT)-cellulose i 0,5 M NaCl-opløsning pufret 25 med 10 mM "Tris"-HCl, pH 7,5, og vaskes med den samme opløsning. PolyA+ mRNA elueres med 10 mM "Tris"-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,05 % SDS og udfældes 2 gange DK 171489 B1 6 med ethanol. Typiske begyndelsesudbytter er 1,5 - 2,0 mg total RNA pr. g væv, hvoraf omkring 2 % er polyA+ mRNA.
5 Placentale cDNA-biblioteker konstrueres ved revers trans cription af placental mRNA, anden-strengs-syntese under anvendelse af E. coli DNA-polymerase I (stort fragment), behandling med Sl-nuclease og påsætning af homopolymerhale (dC) med terminal deoxynucleotidyltransferase; alle 10 sådanne procedurer udføres ved konventionel teknik.
I en typisk præparation opnås 20 - 30 % omdannelse af mRNA til enkeltstrengs-(ss)-cDNA; 70 % resistens over for nedbrydning med nuel ease-SI efter anden-strengs-syn-tese; og dC-"haler" med en længde på 10 - 25 baser.
15 Disse cDNA-molekyler sammensmeltes derpå med DNA-frag- menter af plasmidet pBR322, som er blevet nedbrudt med PstI, og hvortil der er føjet dG-"haler". Disse rekom-binante plasmider anvendes derpå til at transformere E. coli celler for at frembringe et cDNA-bib11 otek (trans-20 formerede celler selekteres på basis af tetracyclin- resistens).
For at identificere den humane ahCG-klon anvendes et 219 bp fragment af en muse-aTSH-klon som hybridiserings-sonde. Denne sonde har 77 % sekvenshomologi med den 25 humane klon. Den mærkes radioaktivt ved haktrans1 at i on og hybridiseres til cDNA-biblloteket under betingelser, som tager hensyn til af graden af homologi. Stærkt hybn-diserende kloner analyseres ved restriktionskortlægning, og kloner indeholdende den komplette kodesekvens af 30 ahCG verificeres ved DNA-sekvensbestemmelse.
DK 171489 B1 7
Konstruktion af plasmidet potSVHVPl
Der gås frem som belyst i fig. 1. For at konstruere plasmidet a970H/B nedbrydes en cDNA-klon indeholdende othCG-fragmentet med Ncol. Ncol-sitet lige 5' for ATG-codonen, der signalerer start af translation, fyldes 5 ud og ligeres til en syntetisk Hindi11-1 i nker. På lignende måde skæres det naturlige Hindlll-site i klonens 3'-utranslaterede område, udfyldes med E. coli DNA-polyme-rase (Klenow-fragment) og ligeres derpå til en syntetisk BamHI-1inker. Dette fragment klones ind i plasmidet 10 pBR322 mellem dets HindlH- og BamHI-sites for at frem bringe plasmidet a574H/B. Dette plasmid nedbrydes med BamHI, behandles med alkalisk phosphatse og ligeres til 396 bp Sau3A-fragmentet af SV40-DNA (fra 0,07 til 0,14 kortenheder (m.u.)), som er blevet isoleret fra 13 en polyacrylamidgel. Ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli til ampici11mresistens, og det ønskede plasmid, &970H/B, identificeres blandt transformanterne .
Plasmidet (^7 konstrueres ved skæring af SV40 ved dets 20 Hpall-site, frembringelse af lige lange ender ved nedbryd ning med nuclease SI, påligering af EcoRI-linkere, nedbrydning med EcoRI og kloning af det resulterende 1436 bp fragment ind i EcoRI-sitet i pBR322.
Som belyst i fig. 1 nedbrydes Q27 fuldstændigt med EcoRI 23 og delvis med HindlH; fragmentet fra 0,72 til 0,94 kortenheder isoleres og klones ind i a970H/B, som er blevet nedbrudt med EcoRI og HindlH og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase (B.A.P.). Ligeringsblan-dingen anvendes til at transformere E. coli, og det 30 ønskede plasmid, paSVL, identificeres blandt transforman terne ved restriktionskortlægning.
paSVL nedbrydes med EcoRI, og fragmentet af SV40, med DK 171489 Bl
B
EcoRI-ender, der strækker sig fra 0 til 0,72 kortenheder og indeholder SV40-repllkationsonginet og det intakte tidlige område, ligeres til det for at frembringe plas-midet paSVHVPl, som isoleres fra E. coli transforman-5 ter.
Konstruktion af plasmidet pP-SVVPl
En 579 bp cDNA-klon, der koder for phCG, blev/ skaffet fra John C. Fiddes ved Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, New York, U.S.A. (Fiddes et al., 10 (1980), Nature Vol. 286, side 684 - 687). Dette fragment ligeres ved hver ende til syntetiske BamHI-linkere.
Efter nedbrydning med Hgal-restriktionsenzym fyldes enderne ud med Klenow-DNA-polymerase, og der ligeres syntetiske EcoRI-linkere på, således at et EcoRI-site 15 er omkring 10 bp 5' for ATG-codonen i signalpeptid-kode- sekvensen. Et BamHI-site er omkring 60 bp 3' for non-senscodonen, der markerer enden af kodesekvensen. Som belyst i fig. 2 isoleres dette 550 bp EcoRI-BamHI-frag-ment og klones ind i pBR322 mellem EcoRI- og BamHI-sitene 20 til dannelse af plasmidet pP556R/B.
For at konstruere plasmidet pSVHR (fig. 2) nedbrydes SV40-DNA delvis med Hindlll til opnåelse af lineære molekyler, nedbrydes med nuclease SI til frembringelse af lige lange ender, ligeres til syntetiske EcoRI-1inkere og nedbrydes med EcoRI og BamHI. Fragmentet fra 0,94 25 til 0,14 kortenheder, indeholdende repjlkationsonginet og det tidlige område fra SV40, klones ind i pBR322 som et EcoRI-BamHI-stykke .
Stadig med henvisning til fig. 2 methyleres EcoRI-sitet i plasmidet pP556R/B ved en reaktion katalyseret af 30 EcoRI-methy1 ase , hvorefter plasmidet skæres med Ndel.
DK 171489 B1 9
EcoRI-lankere ligeres til de Sl-behandlede stumpe Ndelender og aktiveres ved nedbrydning med EcoRI, efterfulgt af nedbrydning med BamHI.
SV40-fragmentet af pSVHR fra EcoRI-sitet til BamHI-sitet 5 isoleres og ligeres i en reaktlonsblanding indeholdende nedbrydningsfragmenterne af pp556R/B. Efter ligeringen nedbrydes blandingen med Sall for at eliminere plasmider, som har genindsat EcoRI (NdeI)-BamHI-stykket af pBR322.
E. coli transformeres med den nedbrudte 11geringsb1anding, 10 og pPSVVPl identificeres og isoleres.
Konstruktion af plasmidet pctPSUVPl
Som belyst i fig. 3 afledes pBR322/KpnI fra pBR322 ved indsætning af en Kpnl-linker i dets unikke EcoRI-site, efter at dette site er fjernet ved nedbrydning med EcoRI 15 efterfulgt af nedbrydning med nuclease SI.
Stadig ifølge fig. 3 nedbrydes SV40-DNA med Avail. De spidse ender af de resulterende fragmenter fyldes ud ved hjælp af Klenow-DNA-polymerase til dannelse af lige lange ender, og blandingen fraktioneres derefter på 20 en polyacrylamidgel. 682 bp fragmentet (0,64 til 0,07 kortenheder) indeholdende replikatlonsori gi net og det unikke KpnI-site isoleres fra gelen, ligeres til syntetiske Hindi 11-linkere og nedbrydes med Hindlll og KpnI.
De resulterende fragmenter ligeres til pBR322/Kpn. Plasmi-25 det p266, som indeholder 266 bp KpnI-HindlII-fragmentet inklusive det sene promotorområde fra SV40, isoleres. p266 skæres med Hindlll og BamHI og behandles med bakteriel alkalisk phosphatase (B.A.P.).
Stadig ifølge fig. 3 konstrueres pPSVVPl/B som følger: 10 DK 171489 Bl pPSVVPl (fig. 2) skæres med EcoRI efterfulgt af ligering for at fjerne pBR322-sekvenser. Derefter skæres denne DNA med BamHI og klones ind i BamHI-sitet i pBR322.
Det resulterende plasmid, pPSVV/Pl/B nedbrydes derefter 5 med Hindlll og BamHI, og 1003 bp Hindl11-BamHI-fragmentet ligeres ind i p266 til dannelse af plasmidet ρβ\/Ρ1-266, hvori phCG-cDNA'en er anbragt neden for den sene SV40-promotor på en sådan måde, at dens RNA-transcnpt ville blive splejset som om den var den virale VPl-transcript.
10 ahCG-cDNA'en indsættes i pPVPl-266 som et Hindi II-frag- ment, der er blevet skåret ved dets HindHI-site og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase (B.A.P.)· E. coli transformanter afledt fra denne ligering sigtes ved restriktionskortlægning, og der isoleres plasmider, 15 som har den ønskede struktur, hvori ahCG-cDNA'en har erstattet VP2 i den korrekte orientering efterfulgt nedstrøms af phCG-cDNA'en, som har erstattet VPl.
Et sådant isoleret plasmid, paPVPl, anvendes til at fuldende konstruktionen af papSVVPl. Plasmidet skæres 20 med Kpnl, og det fulde SV40-genom, skåret med Kpnl, indsættes ved ligenng i dette site. Efter transformation af E. coli isoleres et plasmid med den krævede struktur, papSVVPl. Dette plasmid indeholder DNA, der koder for både a- og p-underenhederne af hCG, og er 25 således i stand til at dirigere udtrykkeisen af begge underenheder i pattedyrværtsceller, hvorved der produceres biologisk funktionelt, glycosyleret heterodimert hCG ( giycosy 1ering sker post-translationelt) .
DK 171489 B1 11
Konstruktion af plasmiderne pRF375 og pRF398
Som belyst i fig. 4 skæres plasmidet CL28 (identisk med plasmidet JYMMT(E); Hamer et al., (1983), J. Mol.
Applied Gen., 1^, 273-288) indeholdende muse-metallothio-3 nem-promotoren, SV40-DNA og pBR322-sekvenser, med re- striktionsendonucleasen Bqlll. I dette site indsættes cDNA-kloner af enten ahCG eller ØhCG, indeholdende utrans-laterede områder på omkring 10 og 30 bp ved deres 5'-ende og på omring 220 og 60 bp ved deres 3'-ende. Disse kloner 10 er blevet genetisk tildannet ved tilføjelse af synetiske
BamHI-linkere ved deres ender.
De resulterende plasmider, pRF302 (a) eller pRF394 (0), nedbrydes med restriktionsenzymerne BamHI og Sall til frigørelse af 5V40-DNA-sekvenserne.
13 Plasmidet pB2-2, som indeholder hele BPV-genomet og nogle pBR322-sekvenser, nedbrydes med BamHI og Sall til opnåelse af BPV-genomet med BamHI/SalI-ender; dette fragment ligeres ind i pRF302 (a) og pRF394 (0) indeholdende metallothionein-hCG-sekvenserne.
20 Efter transformation af E. coli identificeres og isoleres plasmiderne pRF375 og pRF398. De koder for henholdsvis ahCG og ØhCG under styring af muse-metallothionein-promotoren.
Konstruktion af plasmidet RF398at^, 25 Som belyst i fig. 5 afledes plasmidet pat£ ved kloning af 574 bp Hindi11-fragmentet, der koder for ahCG, ind i plasmidet pVBt^ (V.B. Reddy et al., PNAS 79, 2064-2067, 1982). som indeholder ahCG-cDNA under styring af den tidlige SV40-promotor, nedbrydes med EcoRI. 5'- DK 171489 B1 12 udhængene fjernes ved nedbrydning med nuclease SI før tilføjelsen af syntetiske BamHI-1inkere ved stump-ende--11ge ring.
Plasmidet RF398 (fig. 4) nedbrydes med BamHI og behandles 5 med bakteriel alkalisk phosphatase (B.A.P.). 1735 bp
BamHl-fragmentet af po^ indsættes i RF398. Det resulterende plasmid RF398at2 isoleres fra E. coli transforman-ter. Dette plasmid har således phCG-cDNA'en i en trans-cnptionsenhed under styring af muse-met a 11 ot h i one i n-pro-10 motoren og ahCG-cDNA'en i en transeripti onsenhed styret af den tidlige SVAO-promotor.
Udtrykkelse af luteinisennqshormon-(LH)-cDNA-kloner
Konstruktion af et humant hypofyse-cDNA-bibliotek RNA fremstilles ud fra humane hypofyser ved homogenisering 15 af 5 - 10 g af de frosne kirtler i 20 ml af en opløsning indeholdende 4 M guanidinthiocyanat, 1 M 2-mercaptoetha-nol, 0,05 M Na-acetat (pH 5,0) og 0,001 M EDTA. Der tilsættes 1 g CsCl pr. ml homogenat, og suspensionen centrifugeres ved 2000 omdr./min. i 15 minutter. Supernan-20 ten anbringes omhyggeligt som et lag over en 15 ml pude af CsCl-opløsmng (indeholdende 1,25 ml 1 M Na-acetat (pH 5), 62,5 yul 0,4 M EDTA og 39,8 g CsCl i et s lutvolumen på 35 ml) og centrifugeres ved 45000 omdr./min i Ti 70 rotoren på en Beckmaultracentrifuge i 18 -25 24 timer ved 20 °C. RNA'en, der er synlig som en hinde i gradienten, udtages med en kanyle, fortyndes og udfældes ved tilsætning af 2 volumener ethanol. Efter 3 ganges opløsning og genudfældning opløses RNA-pillen i vand, og opløsningen bringes til 0,01 M "Tris"-HCl (pH 7,5) 30 og 0,5 M NaCl ved tilsætning af koncentrede lageropløs
ninger. Præparatet benges derpå m.h.t. polyA+ mRNA
DK 171489 B1 13 ved to passager over oli go-dT-ce11ulose som beskrevet ovenfor i tilfældet placental RNA. Et humant hypofyse-cDNA-bibliotek konstrueres ud fra polyA+ mRNA'en som beskrevet ovenfor for placental polyA+ mRNA, undtagen 5 at både det store fragment af E. coll DNA-po1ymerase I og fuglemyeloblastosisvirus-revers-transcriptase anvendes efter hinanden til anden-strengs-cDNA-syntese.
Klenow-enzymet anvendes først. Reaktionen stoppes ved phenolekstraktion.
10 Den vandige fase af den centrifugerede ekstrakt påføres en 3 ml søjle af "BioGel A-5m". Fraktioner indeholdende materiale med høj molekylvægt hældes sammen, koncentreres, udfældes med 2 volumener ethanol, tørres og opløses i 100 mM "Tns"-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl2, 140 mM KC1, 15 20 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM af hvert af de fire deoxy- ribonucleosidtriphosphater til omvendt transcription.
Re vers-transcriptase tilsættes i en mængde på omkring 20 enheder pr. ^,ug cDNA. Dobbeltstrenget cDNA behandles derpå med nuclease 51, påsættes hale og klones som beske-20 vet ovenfor.
Isolering af PLH-cDNA-kloner
Kolonier dyrket på næringsagarplader indeholdende 25 ^ug/ml tetracyclin overføres til nitrocellulosefiltre.
Kolonier lyseres in situ ved behandling med 0,5 M NaOH 25 og neutraliseres med 0,5 M "Tris"-HCl (pH 7,4) indehol dende 1,5 M NaCl. Frigjort DNA fikseres til filteret ved bagning ved 80 °C i en vakuumovn i to timer. Filtrene 32 screenes ved hybridisering til et P-mærket 88 bp fragment af ØhCG-klonen svarende til aminosyrerne 16 - 45 i den 30 modne hCG-pkæde, som har 29 af 30 aminosyrer fælles med dette område af β-LH-polypeptidet (fig. 6). Hybndi- 14 DK 171489 Bl sering udføres natten over ved 32 °C i 50 % formamid, 0,75 M NaCl, 0,075 M Na-citrat (pH 7,0), 2,5 % dextran-sulfat, 0,1 % po1yvmylpyrroli don, 0,1 mg/ml okseserum-albumin og mindst 10 tæl1inger/min pr. filter af P-mærket 88 bp phCG-f ragment. Filtrene vaskes flere gange 5 i 0,15 M NaCl, 0,015 M Na-citrat ved 37 °C før autora- diografi. En af de positive isolerede kloner LH12 (fig.
7) anvendes videre. LH12 er 365 bp lang og inkluderer sekvenser, der koder for 15 aminosyrer af præ-P-signal-sekvensen plus 105 aminosyrer af det modne PLH-polypep-10 tid. Dens nucleotid-sekvens er bestemt. Da LH12 ikke koder for det komplette modne PLH, udføres yderligere screening af det humane hypofyse-cDNA-bibliotek under anvendelse af et 240 bp NcoI-PvulI-fragment af LH12 (fig. 7) som P-mærket hybrldiseringssonde. Klonen 15 LH6 (fig. 7) isoleres fra denne screening. LH6 indeholder den komplette 3'-ende af pLH, inklusive området svarende til den utranslaterede portion af mRNA'en igennem 27 aminosyrerester af mRNA'ens polyA-"hale". Der findes ingen kloner, som strækker sig videre end LH12 i 5'-ret-20 ningen. DNA-sekvensbestemmelse af de komplette kombinerede modne PLH-kodeområder afslører to forskelle i aminosyre- sekvensen af PLH fra de publicerede proteinsekvensdata: Position 42 er methionin og position 55 er valin. Desuden indeholder det modne PLH 121 aminosyrer baseret på cDNA-25 sekvensen.
En klon indeholdende en intakt signalpeptid-kodesekvens og den komplette modne PLH-sekvens konstrueres som vist i fig. 8 under anvendelse af det i fig. 7 belyste restriktionsfragment. Et 104 bp EcoRI-DdeI-fragment isoleres fra plasmidet P579H og ligeres til et fra LH12-plasmidet 30 isoleret 181 bp DdeI-fragment, som derefter er nedbrudt med Pstl. Efter ligering natten over ved 15 °C nedbrydes 1 lgenngsbl andingen med EcoRI og Pstl og fraktioneres på DK 171489 B1 15 en 7 % polyacrylamidgel, hvorfra det ønskede 256 bp fragment isoleres. Dette fragment sammenknytter phCG-signalsekvensen med præ-PLH-signalsekvensen på en sådan måde, at der tilvejebringes en kodesekvens for et signal-5 peptid på 20 aminosyrer.
256 bp EcoRI-Pstl-fragmentet klones ind i pBR322 nedbrudt med EcoRI og PstI til opnåelse af plasmidet LHp260.
Det i fig. 8 viste 146 bp EcoRI-Ncol-fragment isoleres fra en polyacrylamidgel og anvendes senere i konstruk-10 tionen som beskrevet nedenfor.
LH6-plasmidet (fig. 8) nedbrydes med Sau3a, og 390 bp fragmentet isoleres ved polyacrylamidgel-elektroforese.
Dette fragment nedbrydes derpå med Hindi, ligeres til BamHI-1inkere, nedbrydes med BamHI og klones ind i plas-15 midet pAPP i BamHI-sitet. pAPP er afledt fra pBR322 ved nedbrydning med Aval, udfyldning i 5'-udhæn§et med dNTP'er og det store fragment af DNA-polymerase I fra E. coli, nedbrydning med Pvull og ligenng til lukning af plasmidet under eliminering af PvuII-sitet.
20 Plasmidet LH6B, isoleret fra ligeringen af 340 bp BamHI- fragmentet ind i BamHI-sitet i pAPP, nedbrydes med EcoRI og Pvull og behandles med bakteriel alkalisk phosphatase (B.A.P.). Fragmenterne ligeres til en blanding af 145 bp EcoRI-NcoI-fragmentet af LHa260, beskrevet ovenfor, 25 og det isolerede 241 bp Ncol-PvulI-fragment fra plasmi det LH12, vist i fig. 8. Ligeringsblandingen anvendes til at transformere E. coli til ampici11mresistens.
Plasmidet LH520H/B findes blandt transformanterne. LH520H/B indeholder en komplet pLH-kodesekvens inklusive en hybrid 30 signalpeptidsekvens.
DK 171489 B1 16
Konstruktion af paLHSVVPl
For at udtrykke denne præ-ØLH-klon i en SV40-baseret vektor, som det er blevet gjort for de tidligere beskrevne præ-α- og præ-Ø-hCG-kloner, er det ønskeligt at anbrin-5 ge et EcoRI-site meget tæt på ATG-codonen i præ-Ø-kodese- kvensen. Dette gennemføres ved nedbrydning af LH520H/B med Hgal, udfyldning i 5'-udhænget, påligering af syntetiske EcoRI-linkere, nedbrydning med EcoRI og BamHl og kloning af det isolerede 496 bp EcoRI-BamHI- fragment 10 ind i pBR322 nedbrudt med EcoRI og BamHl og behandlet med bakteriel alkalisk phosphatase. Plasmidet pLH496R/B isoleres fra E. coli transformeret med denne ligerings-blanding og anvendes som kilde til 496 bp fragmentet, som skal udtrykkes.
15 Plasmidet paØVPl, hvis konstruktion og anvendelse til udtrykkelse af begge underenheder af hCG er beskrevet tidligere (fig. 3), nedbrydes med EcoRI og BamHl og ligeres i en reaktionsblanding indeholdende plasmidet pLH496R/B, som er blevet nedbrudt med begge disse enzy-20 mer (fig. 9). Plasmidet paLHVPl identificeres blandt E. coli transformanterne. Som vist i fig. 9 tages det intakte tidlige SV40-område fra paSVHVPl (fig. 1) og indsættes ved ligering som et ΚρηI-Sa11-fragment i paLHVPl, som er blevet nedbrudt med Kpnl og Sall, til dannelse 25 af plasmidet paLHSVVPl. Ved skæring af dette plasmid med BamHl og religering dannes viruset aLHSVVPl. Dette virus indeholder klonede cDNA'er for den fælles (for LH og hCG såvel som FSH og TSH) α-underenhed og den specifikke pLH-underenhed under styring af den sene 30 SV40-promotor. De klonede cDNA'er er anbragt på en sådan måde, at den fælles α-indsætning erstattede den virale VPl-protein-kodesekvens, og PLH-indsætningen erstattede den virale VP2-kodesekvens.
DK 171489 B1 17
Indsætning af PLH-cDNA'en (med phCG 5'-ende af signal-peptid) i et BPV-baseret udtrykkelsessystem LH520H/B (fig. 8) nedbrydes med Hindlll og BamHI, behandles med E. coli DNA-polymerase (Klenow), ligeres til 5 syntetiske SalI-11 nkere, nedbrydes med Sall og klones ind i Sall-sitet i pBR322. Det resulterende plasmid, LH530Sal, anvendes som kilde til LH-cDNA-kIonen til indsætning i muse-metallothionem-genet i plasmidet CL28 som beskrevet i fig. 10.
10 CL28 skæres med Bglll, behandles med nuclease SI og ligeres til Xhol-linkere. Efter nedbrydning med Xhol, ligering og nedbrydning med Bglll transformeres E. coli med reaktionsblandingen til opnåelse af plasmidet CL28Xho.
Dette plasmid nedbrydes med BamHI og Sall og ligeres 15 til en BamHI plus SalI-nedbrydning af plasmidet pB2-2 (fig. 4) til dannelse af plasmidet CL28XhoBPV. Den sidstnævnte LH-indsætning ligeres derpå ind i Xhol-sitet i CL28XhoBP\/ som et Sal I - f ragment, da 5'-udhænget af SalI-nedbrydninger er komplementært med udhænget af 20 Xhol-nedbrydninger. Efter nedbrydning med Xhol for at fjerne baggrund transformeres E. coli, og det ønskede plasmid pCL28XhoLHBVP, indeholdende den hybride præ-PLH-indsætmng i et BPV-baseret plasmid under styring af muse-metallothionein-promotoren, isoleres.
25 Transfektion og infektion af abe værtsceller
Inkorporeringen af virusholdige vektorer i eukaryotiske celler til produktion af et heteropolymert protein gennemføres almindeligvis som følger. Hvis for det første den virale DNA og den homopolymere proteinkodende DNA 30 inkorporeres i et plasmid, som holdes i f. eks. E. coli, fjernes plasmidsekvenserne (f. eks. pBR322-sekvenserne), 18 DK 171489 Bl og den resulterende DNA ligeres til dannelse af cirkulær DNA, som inkluderer det v/irale område og sekvensen eller sekvenserne, der koder for det heteropolymere protein.
Denne cirkulære DNA indeholder almindeligvis ikke al 5 den genetiske information, der behøves til at frembringe et replikerende virus, idet de andre nødvendige sekvenser (f. eks. dem, som koder for kappeprotein) er blevet erstattet af sekvensen eller sekvenserne, der koder for det heteropolymere protein. Den cirkulære DNA, minus 10 plasmid DNA'en, må være tæt nok i størrelse på den natur ligt forekommende virale DNA, hvorfra den er afledt, til at gøre det muligt for DNA'en at træde ind i og replikeres i passende pattedyrværtsceller.
Den cirkulære DNA anvendes til at transficere værtsceller for at producere virusmateriale til senere infektioner.
15 Da noget af den DNA, der er nødvendig for at producere virus, mangler, må transfektionen ske i sammenhæng med hjælper-virus-DNA, som koder tilstrækkeligt for den manglende funktion til at producere replikerende virus.
Transficerede værtsceller dyrkes og inkuberes, indtil 20 de lyseres af replikerende virus. Det resulterende repli kerende virusmateriale, inklusive hjælpervirus, anvendes derpå til at inficere værtsceller til produktion af det heteropolymere protein. V irusmateri ale bevares, da det almindeligvis må genanvendes til at inficere 25 friske charger af værtsceller, eftersom hver kultur af inficerede proteinproducerende værtsceller almindelig-vis til sidst lyseres af viruset.
De specifikke rekombinante DNA-sekvenser, som er beskrevet ovenfor, anvendes til at transficere og derpå mfi-30 cere værtsceller som følger.
DK 171489 B1 19 pBR322-sekvenserne fjernes fra de ovenfor beskrevne SV40-holdige plasmider for at producere transficerende viral DNA. I tilfældet paSVHVPl og paØSVVPl gennemføres dette ved nedbrydning med BamHI efterfulgt af ligering 5 under betingelser, som favoriserer c irkular isering af fragmenterne til dannelse (blandt andre produkter) af paSVHVPl og paØSVVPl. I tilfælde af pØSVVPl bringer nedbrydning med EcoRI efterfulgt af religenng den sene SV40-promotor og VPl-splejsnmgsområdet i sidestilling 10 med ØhCG-cDNA-indsætningen samtidig med, at den eliminerer pBR322-sekvenser og danner PSVP1. Samtidig skæres ptsA5BBam (SV40-viral DNA tsA58 klonet ind pBR322-BamHI-sitet) med BamHI og ligeres til opnåelse af selvligerede cirkler. Analoge fremgangsmåder anvendes for LH-vektorerne. Sepa-13 rate virusbeholdninger fremstilles som beskrevet neden for.
DNA'erne, som er skåret og ligeret som beskrevet ovenfor, ethanol fældes og opløses i sterilt vand. Omkring 1 ^ug ptsA58Bam-DNA (hjælper vi rus) og 10 ^ug rekombinant DNA 20 (som koder for a- og/eller β-hCG eller -LH) kombineres i et sterilt reagensglas, blandes med 2 ml TBS-puffer (G. Kimura og R. Dulbecco 1972, Virology, 49, 79-81) og 1 ml af en 2 mg/ml DEAE-dextran-opløsmng og sættes til et monolag af sammenflydende abe-CV-l-celler, som 25 i forvejen er vasket 2 gange med 10 ml TBS i en T-75-kolbe.
Cellerne efterlades ved 37 °C i 1 - 2 timer under omrystning af og til, vaskes 2 gange med TBS, tilsættes 10 ml DMEM indeholdende 5 % føtalt kalveserum og efterlades ved 40 °C i 10 - 15 dage. Efter fuldstændig cellelyse 30 overføres mediet til et reagensglas, fryses og optøes 5 gange og centrifugeres ved 3000 omdr./min. i 5 minutter.
De resultererende supernatanter tjener som virusbeholdninger til infektion af friske CV-l-celler.
DK 171489 B1 20
For at gennemføre en infektion dyrkes CV-l-celler til sammenflydning i en T-150 kolbe. 1 ml af en af virus-beholdningerne (fremstillet som beskrevet ovenfor) sættes til kolben, og cellerne inkuberes ved 40 °C i 5 dage.
5 Til blandede infektioner dyrkes CV-l-celler til sammen flydning i en T-150 kolbe. aSVHVPl- og pSVVPl-virus blandes i forholdet 1:1, og 1 ml af det blandede virus anvendes til at inficere CV-l-celler ved 40 °C.
10 Transfektion af museceller
Til fremstilling af heterodimert hCG under anvendelse af en blandet transfektion blandes 5 ^ug af hvert BPV-plasmid, dvs. pRF375 (ahCG) og pRF398 (phCG) og sættes til 0,5 ml af en 250 mM CaCl^-opløsning mdehol-15 dende 10 ^ug laksesperma-DNA som bærer. Denne blanding bobles ind i 0,5 ml opløsning, som er 280 mM NaCl, 50 mM "Hepes" og 1,5 mM natriumphosphat. Calclumphosphatbund-faldet får lov at dannes i 30 - 40 minutter ved stuetemperatur.
20 24 timer før transfektionen anbringes 5 x 10^ celler af muse-C127-cellelinien (skaffet fra Dr. Dean Hamer,
National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD, U.S.A.) i en 100 mm skål eller T-75 kolbe. Umiddelbart før tilsætning af den exogene DNA tilføres cellerne frisk medium 25 ("Dulbecco's Modified Medium", 10 % føtalt kalveserum).
1 ml calciumphosphatbundfald sættes til hver skål (10 ml), og cellerne inkuberes i 6 - 8 timer ved 37 °C.
Mediet afsuges og erstattes med 5 ml 20 % glycerol i phosphatpufret saltopløsning, pH 7,0 (PBS) i 2 minutter 30 ved stuetemperatur. Cellerne vaskes med PBS, tilføres DK 171489 B1 21 10 ml medium og inkuberes ved 37 °C. Efter 20 - 24 timer skiftes mediet, og efterfølgende genfodring af cellerne udføres for hver 3-4 dage. Individuelle kloner dyrkes i T — 25 cm kolber. Efter 7-21 dage kan cellekloner 3 overføres til større kolber til analyse.
Til fremstilling af heterodimert hCG under anvendelse af en enkelt transfektion anvendes plasmidet pRF398at2 på samme måde som de ovennævnte to plasmider blev anvendt til en blandet infektion.
10 Til fremstilling af heterodimert LH blandes plasmiderne pRF373 og pCL28XhoLHBPV som beskrevet ovenfor i tilfælde af hCG.
En interessant iagttagelse er, at dyrkning af celler indeholdende phCG- eller pLH-kodende vektorer alene 15 i fravær af α-kodende celler praktisk taget ikke produ cerer nogen β-underenhed, medens celler indeholdende a- og β-kodende sekvenser producerer ikke blot hetero-dimere, men også fri β-underenhed. Dette giver støtte til den antagelse, at produktionen af begge underenheder 20 i en enkelt cellekultur har den yderligere fordel, at den på en eller anden måde gør det muligt, at tilstedeværelsen af α-underenheden stabiliserer β-underenheden.
Deponeringer
De følgende vektorer, beskrevet ovenfor, er blevet depone-25 ret i the Amercican Type Culture Collection, Rockville, MD; U.S.A.: otpSVVPl, ATCC VR2077; aSVHVPl, ATCC VR2075; PSV/VPl, ATCC VR2075; DK 171489 B1 22 pRF375 i C127-celler, ATCC CRL8401; pRF398 i C127-celler, ATCC CRL8401; pCL28XhoLHBPV C. coli, ATCC 39475; pRF398at2 i C127-celler, ATCC CRL8400.
Anvendelse
De transformerede cellelinier ifølge opfindelsen anvendes til at producere biologisk aktive heteropolymere proteiner. F. eks. har hCG fremstillet ifølge opfindelsen 5 et antal velkendte medicinske anvendelser forbundet med human fertilitet.
Andre udførelsesformer
Andre udførelsesformer er omfattet af de efterfølgende krav . F. eks.: 10 Der kan fremstilles andre heteropolymere proteiner, f. eks. follikelstimulerende hormon (FSH) eller thyreoi-deastimulerende hormon (TSH), ligesom humane eller animalske immunoglobuliner eller immunreaktions-antigener.
Det heteropolymere protein behøver ikke nødvendigvis 15 at produceres af én celle eller endog i én kultur. Et alternativ er at samdyrke to celler, hvoraf den ene producerer den ene underenhed og den anden producerer den anden underenhed; de secernerede underenheder kan derpå forbinde sig i mediet til dannelse af heterodimeren.
20 Et andet alternativ er at anvende separate kulturer, som hver producerer en forskellig underenhed, og derpå kombinere dyrkningsmedierne fra dem for at muliggøre samling til heteropolymeren.
Andre værtsceller, vektorer, promotorer, transformerende DK 171489 B1 23 sekvenser og virus kan også anvendes. Hvilken værtscelle, der anvendes, afhænger almindeligvis af den anvendte vektor. Hvis f. eks. vektoren er replikerende virus eller ikke-repiikerende viral DNA, skal værtscellerne 5 være celler, som er i stand til at henholdsvis inficeres eller transficeres af de vektorer; f. eks. kræver SV40-holdige vektorer abeværtsceller, fortrinsvis CV-l-celler.
Hvor kloningsvektoren er et plasmid med prokaryotiske styringssekvenser, anvendes prokaryotiske værtsceller, 10 f. eks. E. coli. Hvor kloningsvektoren er et plasmid med eukaryotiske styringssekvenser, anvendes passende eukaryotiske værtsceller, f. eks. muse-C127-celler.
Claims (36)
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af 5 flere underenheder, hvilken fremgangsmåde omfatter, at hver af underenhederne syntetiseres på almindelig vis i en eukaryotisk celle transficeret med en eller flere ud-trykkelsesvektorer omfattende heterolog DNA, som koder for hver af underenhederne.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvorved den posttransla- tionelle modificering er glycosylering.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, hvorved hormonet er et fertilitetetshormon.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, hvorved fertilitetshormo-15 net er hCG eller LH.
5 SV4O-promotor, okse-papillomavirus-promotoren eller muse-metallothionein-promotoren.
5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, hvorved hormonet er et humant hormon.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, hvorved hormonet er heteropolymert.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvorved hormonet er hete- rodimert.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, hvorved cellen transficeres med mere end én udtryk-kelsesvektor, idet hver vektor omfatter heterolog DNA, 25 som koder for en respektiv underenhed.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, hvorved cellen transficeres med en enkelt udtrykkel-sesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for hver underenhed. DK 171489 B1 25
10. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-9, hvorved den heterologe DNA, som koder for hver underenhed, er under styring af en respektiv promotor.
11. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 5 1-10, hvorved den heterologe DNA, som koder for mindst én underenhed, er under styring af den sene SV4O-promotor eller okse-papillomavirus-promotoren.
12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, hvorved den heterologe DNA, som koder for mindst én 10 underenhed, er under styring af muse-metallothionein-promotoren.
13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-12, hvorved udtrykkelsesvektoren eller hver udtrykkel-sesvektor omfatter plasmid-afledt DNA og/eller replike- 15 rende virus-afledt DNA.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvorved vektoren eller hver vektor omfatter mindst det 69% transformerende område af okse-papillomavirus-genomet.
15. Eukaryotisk celle transficeret med en eller flere ud-20 trykkelsesvektorer, hvilken celle er i stand til at producere et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon med flere underenheder, hvor hormonets underenheder er indkodet af heterolog DNA i udtrykkelsesvektoren eller -vektorerne.
16. Celle ifølge krav 15, hvori hormonet er et fertili tetshormon .
17. Celle ifølge krav 16, hvori fertilitetshormonet er hCG eller LH.
18. Celle ifølge krav 15, 16, eller 17, hvori hormonet er 30 et humant hormon. DK 171489 B1 26
19. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-18, hvori hormonet er heterodimert.
20. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-19, som er transficeret med mere end én udtrykkelsesvektor, 5 idet hver vektor omfatter heterolog DNA, som koder for en respektiv underenhed.
21. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-19, som er transficeret med en enkelt udtrykkelsesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for hver underenhed.
22. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-21, hvori den heterologe DNA, som koder for hver underenhed, er under styring af en respektiv promotor.
23. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-22, hvori den heterologe DNA, som koder for mindst én un- 15 derenhed, er under styring af den sene SV4O-promotor, muse-metal lothionein-promotoren eller okse-papillomavirus-promotoren.
24. Celle ifølge et hvilket som helst af kravene 15-23, hvori udtrykkelsesvektoren eller hver udtrykkelsesvektor 20 omfatter plasmid-afledt DNA og/eller replikerende virusafledt DNA.
25. Fremgangsmåde ifølge krav 24, hvori vektoren eller hver vektor omfatter mindst det 69% transformerende område af okse-papillomavirus-genomet.
26. Udtrykkelsesvektor, som er i stand til at transficere en eukaryotisk celle, hvilken vektor omfatter heterolog DNA, som koder for underenhederne af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon med flere underenheder. DK 171489 B1 27
27. Vektor ifølge krav 26, hvori den heterologe DNA, som koder for hver underenhed, er under styring af en respektiv promotor.
28. Vektor ifølge krav 26 eller 27 omfattende den sene
29. Vektor ifølge krav 26 eller 27, som omfatter plasmid-afledt DNA og/eller replikerende virus-afledt DNA.
30. Vektor ifølge krav 29, som omfatter mindst det 69% 10 transformerende område af okse-papillomavirus-genomet.
31. Et sæt af udtrykkelsesvektorer, hvor hver vektor er i stand til at transficere en eukaryotisk celle og hver vektor omfatter heterolog DNA, som koder for en respektiv underenhed af et biologisk aktivt, posttranslationelt mo- 15 dificeret proteinhormon med flere underenheder, hvori alle hormonets underenheder er indkodet af heterolog DNA i vektorerne.
32. Et sæt af vektorer ifølge krav 31, hvori hver udtryk-kelsesvektor omfatter den sene SV4O-promotor, okse- 20 papillomavirus-promotoren eller muse-metallothionein-promotoren.
33. Et sæt af vektorer ifølge krav 31, hvori hver udtryk-kelsesvektor omfatter plasmid-afledt DNA og/eller replikerende virus-afledt DNA.
34. Et sæt af vektorer ifølge krav 33, hvori mindst én, og fortrinsvis hver, af vektorerne omfatter mindst det 69% transformerende område af okse-papillomavirus-genomet .
35. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvilken fremgangsmåde 30 omfatter udvinding af hormonet fra en kultur af cellerne. DK 171489 B1 28
36. Fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat, hvilken fremgangsmåde omfatter fremstilling af et rekombinant proteinhormon ved en fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-14 og 35 og blanding af 5 dette med en bærer.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54821183A | 1983-11-02 | 1983-11-02 | |
| US54821183 | 1983-11-02 | ||
| US8401771 | 1984-10-31 | ||
| PCT/US1984/001771 WO1985001959A1 (en) | 1983-11-02 | 1984-10-31 | Production of heterodimeric human fertlity hormones |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK297185A DK297185A (da) | 1985-07-01 |
| DK297185D0 DK297185D0 (da) | 1985-07-01 |
| DK171489B1 true DK171489B1 (da) | 1996-11-25 |
Family
ID=24187868
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK297185A DK171489B1 (da) | 1983-11-02 | 1985-07-01 | Fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af flere underenheder, eukaryotisk celle, som er transficeret med en eller flere udtrykkelsesvektorer og er i stand til at producere et sådant hormon, udtrykkelsesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for underenhederne af hormonet, et sæt af udtrykkelsesvektorer, hvor hver vektor omf |
| DK297285A DK297285D0 (da) | 1983-11-02 | 1985-07-01 | Fremstilling af heterodimere humane fertilitetshormoner ved rekombinant metodologi |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK297285A DK297285D0 (da) | 1983-11-02 | 1985-07-01 | Fremstilling af heterodimere humane fertilitetshormoner ved rekombinant metodologi |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP0578328B1 (da) |
| AT (2) | ATE190461T1 (da) |
| DE (4) | DE10199035I2 (da) |
| DK (2) | DK171489B1 (da) |
| LU (1) | LU90770I2 (da) |
| MX (1) | MX9203334A (da) |
| NL (1) | NL300044I2 (da) |
| WO (1) | WO1985001959A1 (da) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5639639A (en) * | 1983-11-02 | 1997-06-17 | Genzyme Corporation | Recombinant heterodimeric human fertility hormones, and methods, cells, vectors and DNA for the production thereof |
| US4923805A (en) * | 1983-11-02 | 1990-05-08 | Integrated Genetics, Inc. | Fsh |
| JPS60145098A (ja) * | 1984-01-09 | 1985-07-31 | Suntory Ltd | 糖付加ポリペプチドの製造法 |
| WO1986007383A1 (en) * | 1985-06-04 | 1986-12-18 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Autoantigen vaccines |
| CA1340740C (en) * | 1987-12-08 | 1999-09-14 | Eileen R. Mulvihill | Co-expression in eukaryotic cells |
| US5648254A (en) * | 1988-01-15 | 1997-07-15 | Zymogenetics, Inc. | Co-expression in eukaryotic cells |
| US5705478A (en) * | 1989-02-21 | 1998-01-06 | Washington University | Covalently linked β subunits of the glycoprotein hormones as antagonists |
| US6225449B1 (en) | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| EP0461200B1 (en) * | 1989-02-21 | 1997-01-22 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
| US5792460A (en) * | 1989-02-21 | 1998-08-11 | Washington University | Modified glycoprotein hormones having a CTP at the amino terminus |
| US6028177A (en) * | 1991-10-04 | 2000-02-22 | Washington University | Methods of detecting single-chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
| US6737515B2 (en) | 1993-11-19 | 2004-05-18 | Washington University | Follicle stimulating hormone-glycosylation analogs |
| US6238890B1 (en) | 1994-02-18 | 2001-05-29 | Washington University | Single chain forms of the glycoprotein hormone quartet |
| MX9601320A (es) * | 1994-08-12 | 1997-05-31 | Univ Washington | Formas de cadena unica de cuarteto de hormona de glicoproteina. |
| DK0725795T3 (da) * | 1994-08-12 | 2004-05-17 | Univ Washington | Enkelt-kæde form af glycoprotein-hormon-kvartetten |
| US6635256B1 (en) | 1998-10-19 | 2003-10-21 | Washington University | Glycoprotein hormone compositions comprising two β subunits and methods of use thereof |
| US6103501A (en) * | 1997-11-17 | 2000-08-15 | Washington University | Single chain glycoprotein hormones comprising two β and one α subunits and recombinant production thereof |
| EP1013281A1 (en) | 1998-12-15 | 2000-06-28 | Applied Research Systems ARS Holding N.V. | hCG therapy for the treatment of breast cancer |
| JP2002541213A (ja) | 1999-04-13 | 2002-12-03 | インヘール セラピューティック システムズ， インコーポレイテッド | 不妊症の処置のための乾燥粉末処方物の肺投与 |
| JP2005509652A (ja) * | 2001-11-08 | 2005-04-14 | モイル，ウィリアム，アール | 蛋白質の瘤 |
| US7081446B2 (en) | 2002-01-31 | 2006-07-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Long-acting follicle stimulating hormone analogues and uses thereof |
| KR20080044836A (ko) | 2005-07-15 | 2008-05-21 | 라보라뚜와르 세로노 에스. 에이. | 자궁내막증 치료용 ｊｎｋ 억제제 |
| BRPI0613042A2 (pt) | 2005-07-15 | 2010-12-14 | Serono Lab | inibidores de jnk para o tratamento de endometriose |
| EA200800755A1 (ru) | 2005-09-07 | 2008-10-30 | Лаборатуар Сероно С.А. | Ikk ингибиторы, предназначенные для лечения эндометриоза |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2048894A (en) * | 1979-05-11 | 1980-12-17 | Gist Brocades Nv | Plasmid |
| US4419446A (en) * | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
| GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
-
1984
- 1984-10-31 EP EP93202294A patent/EP0578328B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 AT AT93202294T patent/ATE190461T1/de active
- 1984-10-31 DE DE2001199035 patent/DE10199035I2/de active Active
- 1984-10-31 DE DE3486469T patent/DE3486469T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 EP EP99107952A patent/EP0957167A1/en not_active Withdrawn
- 1984-10-31 MX MX9203334A patent/MX9203334A/es unknown
- 1984-10-31 WO PCT/US1984/001771 patent/WO1985001959A1/en active IP Right Grant
- 1984-10-31 DE DE2001199028 patent/DE10199028I2/de active Active
- 1984-10-31 AT AT92200198T patent/ATE169334T1/de active
- 1984-10-31 DE DE3486474T patent/DE3486474T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-10-31 EP EP85900268A patent/EP0160699B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-07-01 DK DK297185A patent/DK171489B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-07-01 DK DK297285A patent/DK297285D0/da not_active Application Discontinuation
-
2001
- 2001-05-03 LU LU90770C patent/LU90770I2/fr unknown
- 2001-05-10 NL NL300044C patent/NL300044I2/nl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3486469T2 (de) | 1999-04-15 |
| LU90770I2 (fr) | 2001-07-03 |
| ATE169334T1 (de) | 1998-08-15 |
| MX9203334A (es) | 1992-09-01 |
| EP0578328B1 (en) | 1999-12-29 |
| EP0160699A1 (en) | 1985-11-13 |
| WO1985001959A1 (en) | 1985-05-09 |
| DE3486469D1 (de) | 1998-09-10 |
| DE3486474D1 (de) | 2000-02-03 |
| DK297185A (da) | 1985-07-01 |
| DK297185D0 (da) | 1985-07-01 |
| EP0160699B1 (en) | 1992-08-12 |
| EP0578328A1 (en) | 1994-01-12 |
| NL300044I2 (nl) | 2001-12-01 |
| DE10199028I1 (de) | 2001-09-20 |
| ATE190461T1 (de) | 2000-04-15 |
| NL300044I1 (nl) | 2001-07-02 |
| EP0957167A1 (en) | 1999-11-17 |
| DE10199035I1 (de) | 2001-11-08 |
| DE10199028I2 (de) | 2004-07-01 |
| EP0160699A4 (en) | 1987-10-20 |
| DE10199035I2 (de) | 2006-03-16 |
| DK297285A (da) | 1985-07-01 |
| DK297285D0 (da) | 1985-07-01 |
| DE3486474T2 (de) | 2000-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK171489B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et biologisk aktivt, posttranslationelt modificeret proteinhormon sammensat af flere underenheder, eukaryotisk celle, som er transficeret med en eller flere udtrykkelsesvektorer og er i stand til at producere et sådant hormon, udtrykkelsesvektor omfattende heterolog DNA, som koder for underenhederne af hormonet, et sæt af udtrykkelsesvektorer, hvor hver vektor omf | |
| US4840896A (en) | Heteropolymeric protein | |
| US5856137A (en) | Nucleic acids encoding and recombinant production of the β subunit of lutenizing hormone | |
| CA2063810C (en) | Production of vascular endothelial cell growth factor | |
| US5219739A (en) | DNA sequences encoding bVEGF120 and hVEGF121 and methods for the production of bovine and human vascular endothelial cell growth factors, bVEGF120 and hVEGF121 | |
| DK172625B1 (da) | Ekspressionsvektor eller et par af ekspressionsvektorer omfattende heterolog DNA, som koder for alfa- og beta-underenhedern | |
| CA1341640C (en) | Recombinant fibroblast growth factors | |
| AU599572B2 (en) | Lymphokine production and purification | |
| CA1307753C (en) | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing mullerian inhibiting substance-like polypeptides | |
| NO303398B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av rekombinant biologisk aktivt humant erytropoietin, ekspresjonsvektor samt cellelinje til bruk ved fremstillingen | |
| JPH02467A (ja) | 組換え細胞の培養法 | |
| JPS61219395A (ja) | ＴＧＦ‐βをコードしている核酸およびその用途 | |
| US4992367A (en) | Enhanced expression of human interleukin-2 in mammalian cells | |
| JP2777132B2 (ja) | 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産 | |
| EP0162319B1 (en) | Method of joining heterologous genes | |
| EP0404458A2 (en) | Ovine follicle stimulating hormone | |
| JPH02195888A (ja) | ヒトインターロイキン２活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含有する組換えｄｎａ体および該組換えｄｎａ体により形質転換された原核生物細胞 | |
| EP0160091A1 (en) | Production of heterodimeric human fertility hormones | |
| JPS59192091A (ja) | コンピテント真核生物遺伝子生成物の発現方法および発現組成物 | |
| CA2022356A1 (en) | Method and materials for producing proteins | |
| NO179210B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av et LIF polypeptid, rekombinant DNA molekyl som koder for LIF polypeptidet samt vertscelle for å uttrykke dette |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |