JPH02467A - 組換え細胞の培養法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 負可ｑ分野 本発明は、所望のタンパク質を発現するよう形質転換さ
れた脊椎動物宿主細胞の培養方法に関するものである。

さらに詳しくは、本発明は、培篠申での自身の生存およ
び増殖のために必要な因子（ファクター）類を生産する
宿主細胞を組換え技術によって創成することに関するも
のである。

発明の背景 過去ｌＯ平年間、分子生物学に関する知識、並びに該知
識の商業化は爆発的に増大した。それ以前に、極く少量
しか得られなかったタンパク質、例えば、少し名を挙げ
れば、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノ−ケン活性化
因子、および様々なノンポカイン頃等、をコードしてい
る遺伝子のクローニングおよび発現に偉人な成功か収め
られた。

１明は、これらのタンパク質を細菌の発現系または酵ｔ
１の発現系で生産する試みがなされた。多くのタンパク
質が、細胞培養中で好適に生産され得る。ノ＼Ｑが細胞
培養を利用する理由は、所望の９ンバク質のグリコジル
化、分泌された生成物の精製か容易、および適正なホー
ルディングとジスルフィド結合彰成を伴った、適正なタ
ンパク質プロセッシング、が得られることにある。

所望のタンパク質をコードしている遺伝子が咄乳鎮細胞
系統で発現されれば、次には、その生産を最適なものに
すべきである。細胞培養中でのタンパク質収獲の最適化
は、様々な方法で行い得る。

例えば、細胞の物理化学的、栄養学的、およびホルモン
学的環境を最適なものにすることによって改漫し得る。

哺乳類細胞は、インビボにおいては、極めて注意深くバ
ランスのとられた恒常的環境にある。細胞培養の歴史の
極く初期に、インビトロでの細胞増殖のための、完全に
規定された培地を得ることの（り点か認められていた（
ルイス（Ｌ　ｅｖｉｓ、　Ｍ、　Ｒ、）およびルイス（
Ｌ　ｅｗｉｓ、　Ｗ、　Ｈ、）、Ａ　ｎａｔ、　Ｒｅｃ
、　５　：２７７［１９１１］）。規定された培地は、
生存または増殖に必要な培地を含む、特殊な栄養および
ホルモン化学に関係している。大多数の細胞型は、ｌお
よびパフォーマンス（挙動）のために、物理的パラメー
ターが至適範囲であることに関して厳密さを必要とする
。様々な細胞培養系において調節される物理化学的なパ
ラメーターには、例えば、温度、ρＩ］、ｐＯｌ、およ
び浸透圧がある。細胞の栄養要求は、通常、至適環境を
提供するために開発された標準的な培地中に加えられて
いる。栄養物は、一般に、幾つかのカテゴリーに分ける
ことができる。即ち、アミノ酸およびその誘導体、脂肪
酸、複合脂質、炭水化物、糖、ビタミンおよび核酸誘導
体である。完全無欠であることを必要とするだけでなく
、栄養物の相対濃度が、個々の細胞型にとって最適であ
る必要がある。

大部分の細胞型は、たとえ栄養成分が最適であったとし
ても、栄養分のみを３イエする培地では最適な増殖を示
さないか、および／またはタンパク質を分泌しない。血
清が、培養物中で細胞を増殖させるための必須培地成分
とされ続けているのは、Ｌ記の理由による。様々な実験
により、細胞培養における血清の役割は、特定の細胞型
の成長刺激剤となるホルモン複合体を与えることにある
、という仮説か導かれた。サトウら（Ｓ　ａｔｏ、　Ｇ
　、　Ｈ、）ｒホルモンの生化学的作ｆＴＩＪ第［ＩＩ
Ｑｒリノトワ・ツク（Ｇ。

Ｌ　１ｔｖａｋ）編１、アカテ″ミンクブレス、Ｎ、Ｙ
、ｐ、３９１１、脳下垂体細胞系統は、ホルモン、成長
因子、およびトランスフェリンを補充した血清−不含の
培地で増殖したＬハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ、　！　、　
）およびサトつ（Ｓ　ａｔｏ、　Ｇ　、　）Ｎ　ａｔｕ
ｒｅ（Ｌ　ｏｎｄｏｎ）土５９：１３２（＋９７６））
。次いで、様々な組織を起源とする１′隻つかの細胞系
統の増殖のための、ホルモンｂｊ　充、血清不含条件が
開発された「マザー（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ　、　）およ
びサトウ（Ｓａｔｏ、Ｇ、）Ｅｘｐ、Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ
、　Ｉ　２０：１９　＋（１９７９）ｌバーンズ（Ｂ　
ａｒｎｅｓ、　Ｄ　、　）およびサトウ（Ｓａｇｏ、Ｇ
、）Ｃｅｌｌ　２２：６９（１９８１）］。これらの研
究から、血清不含培地中での細胞増殖に関して幾つかの
結論が導かれた。血清を、ホルモン、成長因子、および
輸送タンパク質の混合物で置き換えることができる。血
清不含培地に必要な補充物（ホルモン、成長因子および
輸送タンパク質を含む）は、細胞型によって異る。伝統
的に、補充物は、血清または器官抽出物のような、ＩＶ
合生物混合物の一部分として与えられてきた。

「ホルモン性」環境の最適化は、不明瞭な成長因子の必
要性を減少または消滅し、阻害因子を除去し、あるいは
重要なホルモンを所望のレベルにする。

しばしば、細胞は以下の群から選択される１またはそれ
以上のホルモンを必要とするニステロイド類、プロスタ
グランジン、成長因子、脳下垂体ホルモン、およびペプ
チドホルモン。大部分の細胞型は、血清不含培地で生存
するためにインシュリンを必要とする［サトウら（Ｓ　
ａｔｏ、　Ｇ、　Ｈ，）Ｇｒ。

ｗｔｈ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌ　ｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎａｌｌｙ
　Ｄｅ４ｉｎｅｄ　Ｍｅｄｉａ’（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ、　Ｙ、、　ｌ　９
８２１゜イン／ニリン非依ａ性のある種の突然変異体細
胞系統が報告されている［メンディズら（Ｍｅｎｄｉａ
ｚＥ、　）Ｉ　ｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌ１、＆　Ｄｅｖ
、　Ｂｉｏｌ、　２２（２）：６　Ｃ３＜Ｉ　９８６）
；セレロら（Ｓ　ｅｒｒｅｒｏ、　Ｇ、）　ｌ　ｎ　Ｖ
ｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．＆　Ｂｉｏｌ、　２↓（９）：５
３７（１９８５）１゜ホルモン類に加えて、細胞は、ト
ランスフェノン（血漿の鉄輸送タンパク）、セルロブラ
スミン（銅輸送タンパク）、および高密度リポタンパク
（脂質担体）等の輸送タンパクが細胞培地に加えられる
ことを必要とする。好適なホルモンまたは輸送タンパク
の組合わせは、各細胞型によって変るであろう。これら
のホルモンまたは輸送タンパクツ大部分は外的に加えら
れるか、極くまれには、特定の因子を必要としない変異
体セルラインが見出されている。

最近、細胞を、増殖の静止した拘束状態から、増殖のた
めの拘束状態に導くのに必要な事象を詳しく調べ上げる
ために細胞増殖に関する研究がなされた。この形質転換
には様々な因子が関与していることが分った。これら形
質転換された細胞は、培養中でペプチド成長因子を生産
することが見出されている［カブランら（Ｋａｐｌａｎ
、　Ｐ、　Ｌ、）ＰＮＡＳ　　７９：４８５−４８９（
１９８２）］。細胞が反応し得る因子を、その細胞が分
泌する／ステムは、［オートタリン（ａｕｔｏｃｒｉｎ
ｅ）Ｊと呼ばれている。オートタリンとして、多くの因
子が報告されている：ポンベシン（ｂｏｉｂｅｓ　ｉｎ
）、インターロイキン２［デュブレッら（Ｄｕｐｒｅｚ
、Ｖ、）ＰＮＡＳ　　８２：６９３２（１９８５）］；
形質転換成長因子アルファー（ＴＧＦα）、血小板誘導
成長因子（ＰＤＧＦ）：形質転換成長因子ベータ（ＴＧ
Ｆ−β［スポーン（Ｓｐｏｒｎ、Ｍ。

Ｂ、）およびロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ａ　、　Ｂ
　、　）Ｎ　ａｚｕｒｅ３１３ニア４５（１９８５）］
；肉腫成長因子（ＳＧＦ）［アンザノら（Ａ　ｎｚａｎ
ｏ、　Ｍ　、Ａ　、　）、ＰＮＡＳ　　８ｏ：６２６４
（１９８３）］；および造血性成長因子、顆粒球−マク
ロファージコロニー刺激因子（ＧＭ、−Ｃ５Ｆ）［ラン
グら（Ｌａｎｇ、　Ｒ，Ａ、）Ｃｅｌｌ　　４３　：５
３１（１９８５）］。

本発明は、特定の組換え宿主細胞のために規定された培
地を提供することを目的とするものである。また、本発
明は、組換え宿主細胞の維持および増殖に必要なポリペ
プチド因子の供給に伴う問題を解決することを目的とす
るものである。例えば、インシュリン等の幾つかのポリ
ペプチド因子は、ある培地条件下では不安定である。本
発明は、宿主細胞の増殖または生存に最適な局所環境を
与えることを目的とするものである。さらに詳しくは、
本発明は、細胞培養中の宿主細胞に必要なポリペプチド
因子の予備試験、例えば純度試験等、を不“冴にするこ
とを目的とするものである。また本発明は、外因性因子
の添加の必要性を解消することにより、細胞培養の汚染
危険率を低下することを目的とするものである。また本
発明は、培養中での組換え宿主細胞の生存および増殖に
必要なポリペプチド因子の自給（オートタリン）生産を
付与することにより、−層たくましい組換え宿主細胞を
生産することを目的とするものである。さらに本発明は
、培養条件に対する感受性が低い組換え宿り細胞を提供
することを目的とするものである。さらにまた本発明は
、細胞増殖または生存のだめの局所環境を与えることを
目的とするものである。さらにまた本発明は、必要なポ
リペプチド因子のオートクリン生産を通して細胞培養の
効率を高めることを目的とするものである。さらにまた
本発明は、規定培地の経費を減少することを目的とする
ものである。

灸叫悶句 本発明の目的は、その生存および増殖のためにポリペプ
チド因子を必要とするポリペプチド依ａ性宿主細胞を選
択し、該宿主細胞を特定のポリペプチド因子をコードす
る核酸で形質転換し、該宿主細胞を所望のタンパク質を
コードする核酸で形質転換し、形質転換された宿主細胞
を特定のポリペプチド因子を食合しない培地で培養する
ことからなる、刊換又宿主細胞の新規な培養方法によっ
て達成された。本発明に従って作成された旧胞はポリペ
プチド因子不含の培地で生存または増殖することができ
る。組換え宿主細胞は、ポリペプチド因子に対する要求
を自身で満たす。本発明以前には、組換え法により、宿
主細胞の生存および増殖に必要なポリペプチド因子（類
）を、宿主細胞自身に、培養中で供給させ得るというこ
とは認識されていなかった。驚（べきことに、必要なポ
リペプチド因子の供給は、宿主ｆｉｌ胞が所望のタンパ
ク質を（り用可能な量、生産する能力を制限するｔ３の
ではなかった。本発明は、組換え細胞培養における苫し
い経費の節減を提供するものである。この節約は、所望
のタンパク質の大量生産に関して、１千万ドル程度にな
る。従って、本発明のＢｇ様は、生ｒ′ｊまたは増殖に
必要なポリペプチド因子（頌）か欠如した培地で宿主細
胞を培養する方法に関するものである。また本発明の池
の咀様は、自身の生ａわよひ増殖に必要なポリペプチド
因子を発現するよう形質転換された宿主細胞に関するも
のである。さらにまた本発明の池の態様は、宿主細Ｑａ
の生存および増殖に必要なポリペプチド因子を３汀しな
い培地中の、ポリペプチド因子−彰質転換宿１−細胞を
含有する培養物に関するものである。

図面の簡単な２戦 第１図は、所望のタンパク質の生産のためのインシュリ
ン−非依存性細胞系統を樹立するために用いられたヒト
プレプロイン／、：Ｌリン発現発現ベクターｓＶＥＨＩ
ＧＤＨＦＲの構築模式図である。

第２図は所望のタンパク質の生産のためのインシュリン
−非依存性細胞系統を樹立するために用いられたヒトプ
レプロインシュリン発現ベクターｐＳ　Ｖ　Ｅ　ＨＩ　
ＧＮｅｏの構築模式図である。

第３図１ｉ　ｐ　Ｓ　Ｖ　Ｅ　ＨＩ　Ｇ　Ｄ　ＨＦ　Ｒ
ノ？！築に用いられたｐＣＶＳＶＤ２２ｐｒｅＬＪＫ５
４の構築模式図である。

第４図はオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＯ）遺１
云子およびコトランスフエクトされたプレプロインシュ
リン遺伝子の増幅に用いられたＯＤＣ発現ベクターの構
築模式図である。

第５ａ図は、５％全ＦＢＳの存在Ｆにおける２種類のイ
ンシュリン−非依存性細胞系統および対照細胞系統の増
殖状態を示すグラフであり、第５ｂ図は１％炭素／デキ
ストラン抽出ＦＢＳ（培地からのイン／、、Ｌリン除去
処理）中での２種類のイン／ニリン−年債（ｊ性細胞系
統および１４照細胞系統の増殖状態を示すグラフである
。

第６ａ図は、外因性インシュリン０〜１０μｇ／ｆｆ＆
のａ圧下、血清不含培地における対照細胞（ＣＨＯ、、
、／　Ｄ　ＨＦ　Ｒ−、プレブロインンコリン不含）の
増殖状態を示すグラフであり、第６ｂ図は血清不３条件
下での様々なイン／ニリン濃度におけるクローン７およ
び１２の代表的な増殖状態を示すグラフである。

第７図は、ＤＥＭＯプール（１００μＭ）および、同一
４件下においてｃ２ｏ（対照）よりはるかに高い力価を
示しすことにより、インシュリン非依存性とじＣ選択さ
れた非増幅クローン１３ｃ２Ｂプロインシユリン細胞系
統（Ｃ１，１３）のインシュリン非ａ在Ｆでの血清不含
培地における状態を示すグラフである。

第８図はトランスフェリンをコードしている発現ベクタ
ーｐＲＫ　Ｔ　Ｆのダイアグラムである。

第９図はトランスフェリンをコードするｃＤＮＡが挿入
されている発現へフタ−ρＲＫ５の構築模式図である。

第１Ｏ図〜第１２図はプラスミドｐｃｒｓ２゜８Ｑ２８
Ｄの構築模式図である。

詳しい説明 本明細書中、「ポリペプチド因子」という語句は、培養
中の宿主細胞が生存または増殖するのに必要なタンパク
質を指す。ポリペプチド因子は、ホルモン、成長因子、
ペプチドホルモン、オートタリン因子、輸送タンパク、
腫瘍遺伝子／プロト（原）腫瘍遺伝子等であってよい。

ポリペプチド因子の内、ホルモンの例として、Ｆｌえば
、インシュリン、プロインシュリン、卵胞刺激ホルモン
（ＦＳＨ）、カルシトニン、黄体形成ホルモン（Ｌ　Ｈ
）、グルカゴン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、甲状腺
刺激ホルモン（ＴＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン放出ホル
モン（ＴＲＨ）、チロキシン（Ｔ、）、成長ホルモンを
挙げることができる。その他のポリペプチド因子の例で
ある輸送タンパクには、トランスフェリン、血清アルブ
ミン、セルロブラスミン、低密度リポタンパク（ＬＤＬ
）、および高密度リポタンパク（ＨＤＬ）がある。時に
は、それを分泌した細胞が、その因子に応答するという
理由で、しばしばオートタリンと称されるポリペプチド
因子には、例えば、インターロイキン２、インシュリン
、インシ二Ｊン様成長囚子Ｉおよびｎ、形質転換成長因
子アルファ（ＴＧＦ−α）、面小板誘導成長因子（ＰＤ
ＧＦ）、ボンベシン、エリスロポエチン、形質転換成長
因子ベータ（ＴＧＦ−β）、肉腫成長因子（ＳＧＦ）、
表皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子（［’Ｇ
Ｆ）、トロンビン、神経成長因子、造血性成長因子およ
び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
３Ｆ）がある。池のポリペプチド因子の例として、ある
種の腫瘍遺伝子／プロト−腫瘍遺伝子の発現によるペプ
チドがある。本発明のポリペプチド因子に包含される、
これらプロト−腫瘍遺伝子にコードされているタンパク
質には、成長因子、形質導入タンパク質、および膜レセ
プターがある。成長因子には例えば、ｓｉｓ腫瘍遺伝子
にコードされているＰＤＧＦ（β〜サブユニット）があ
る。末梢膜タンパク質の例には、ｅｒｂ　−Ｂによって
コードされている切り詰められた細胞表面ＥＧＦレセプ
ター、ｒｍｓによってコードされている細胞表面Ｍ−Ｃ
３Ｆ／Ｃ３Ｆ−ルセプター、およびｎｅｕおよびｒｏｓ
によってコードされているレセプター類がある。形質導
入タンパク質の例には、ａｂｌによってフードされてい
る原形質膜内表面のチミンキナーゼがある。これらの腫
瘍遺伝子／プロ１−Ｊｌｉ瘍遺伝子にコードされている
ポリペプチド因子は通常培養培地に添加されないが、他
の必要なポリペプチドと置き換えることができる。本発
明の成長因子は非酵素であり、従って、ジヒドロ葉酸還
元酵素（ＤＨＦＲ）、オルニチンデカルボキシラーゼ（
ＯＤＣ）、チミジンキナーゼ、またはホスホトランスフ
ェラーゼのようなタンパク質は含まない。

「所望のタンパク質」という語句は、宿主細胞内で発現
させることが望まれるタンパク質であるが、正常な状態
では宿主細胞自身は生産しないが、または極く少量しか
生産しないタンパク質であり、しかも、通常は、細胞の
連続的な存在にとって不要膜タンパク質を指す。所望の
タンパク質には、約５アミノ酸というアミノ酸の少ない
タンパク質から第■囚子のような大きいタンパク質まで
含まれる。そのようなタンパク質には、プレーアミノ酸
配列またはプレプローアミノ酸配列を含有する分子、並
びに所望のタンパク質と共通の生物学的活性を顕し得る
アミノ酸変異体またはグリコジル化変異体（天然のアレ
ル変異体をも含む）が包含される。そのようなタンパク
質には、例えば、成長ホルモン、インシュリン、第■因
子、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子α
およびβ、Ｊンホトキシン、エンケファリナーゼ、ヒト
血清アルブミン、ムレリアン（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）阻
害物’Ｅｆ、レラキシン、組織因子タンパク質、インヒ
ビン、エリスロボエチン、インターフェロンα、β、γ
、過酸化物ディスムターゼ、崩壊促進因子、ＡＩＤＳエ
ンベロープの１部ようなウィルス抗原、並びにインター
ロイキンがある。所望のタンパク質がポリペプチド因子
であってもよい。

「細胞培養」または「培養物」という語句は、単一の細
胞から増殖した脊椎動物細胞の集団であって、ｌまたは
それ以北の世代にわたって増殖または生存する細胞集団
を指す。培養中でのｆｆ椎動物細胞の増殖または生存（
時には組織ｊ８養と称する）は、常巧）段となっている
ｌ：”ＭａＩＩｕａａｒｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ、　Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｓｅｒｕｍ　−Ｆ　ｒ
ｅｅ　［１ｏｒｉｏｎｅ　−５ｕｐｐｌｅａ＋ｅｎｔｅ
ｄ　Ｍｅｄｉａ”マザー（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ　、　Ｐ
、　）編（ＰＩｅｎｕｓ＋　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、　Ｙ、
　ｌ　９８４　）参照１゜１−宿主細胞」という語句は
、培養中で増殖し、所望のタンパク質およびポリペプチ
ド因子を発現し得るｒｆ椎幼動物細胞指す。適当な宿主
細胞には、例えば、ＳＶ４　Ｑで形質転換されたサル腎
ＣＶ［ライン［２９３、グラハムら（Ｇｒａｈａｔｈ、
　Ｆ、　Ｌ、）Ｊ　。

ＧＬ！ＩＴ　Ｖｉｒｏｌ、３６：５９（１９７’７）ｉ
；ベビーハムスンー腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣＣＬ　
１０１；チャイニーズハムスター卵果細砲−ＤＨＰＲ［
ＣＨＯ、エララブ（ｐ：ｒｌａｕｂ）およびチャソシン
（Ｃｈａｓ　ｉ　ｎ）　ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７ユコ４２
　１６（＋　　９８０）　＼０．マウスセロトリ細胞Ｉ
ＴＭ４、マザー（Ｍａｔｈｅｒ、　、＋Ｐ、）Ｂｉｏｌ
Ｒｅｐｒｏｄ４３：２４３　２５１（１９８０）ｌ　：
＋　ル腎細胞（ＣＶＩ　　ＡＴＣＣＣＣ［，７０）ニア
フリカミトリザル腎ｔ（１１１１１（Ｖ　Ｅ　ＲＯ−７
６、ＡＴＣＣＣＲ１１５８７）；ヒト頚がん細胞（１（
ＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣＩ、２）：イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ
。

Ａ’ｌ’ＣＣＣＣ［，３４）；バ、ファローラノト肝細
１１１（Ｌ３ＲＬ　　３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ　　１４４
２）；ヒ１」山着旧＋ａ（ｗｌ　３ｓ、ＡＴＣＣＣＣＬ
７５）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２、ｔ（Ｂ２Ｏ３３）；
マウス乳がん（〜１〜ＩＴ　Ｏ６０５６２、ΔＴＣＣＣ
ＣＬ５１）：およびＴＲＩ細胞［マザーら（Ｍａｔｈｅ
ｒ、　Ｊ　、　Ｐ、　）ΔｎｎａｌｓＮ、Ｙ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、３−８３：４４　６８（１９８２）］がある
。本発明にとって好ましい宿主細胞は、脊椎動物細胞で
あるが、昆虫細胞のような、他の一′も核性細胞を用い
ることもできる。

宿主細胞は所望のタンパク質をコードする核酸て１［ユ
質転換する前、またはそれと同時にボリベプナト因子を
コードする核酸で形質転換される。ボッペプチド因子を
コートする核酸をまず導入して所望のタンパク質をコー
ドする核酸で形質転換され得る、［ポリペプチド因子−
非依存性宿主細胞」をｎることか望ましい。

（ポリペプチド因子依存性宿主細胞−１という語（ｉＪ
は、生存または増殖のために、培養培地中に１またはそ
れ以−Ｌのポリペプチド因子を必要とする宿主細胞を指
す。特定の宿主細胞のためのポリペプチド因子（類）は
、当業者既知の、下記の常法により、決定することがで
きる。培地からポリペプチド因子を除去すると細胞が死
滅するか、その増殖が阻古される。それらの結果は、特
定の宿主細胞、ポリペプチド因子、培養条件、および細
胞主度のような他の因子によって左右される。

「培地」という語句は、培養中でａ推動物細胞が増殖す
る水性エマ環を指す。培地は、物理化学的、栄畏学的、
わよびホルモン的環境を含む。従来、培地は、増殖また
は生存に必要な栄伴および成長因子を添加して調製され
ていた。Ｙ血清不含培地ｊという語句は、血清を含有し
ない培地を指す。特定の細胞が培養中での増殖および生
存に必要とするホルモン類、成長因子類、輸送タンパク
質、ベブ子ドホルモン等は一般に血清中に見出され′Ｃ
お多フ、それらは音通、血清不含培地には補充物として
添加される。「規定培地」という語句は、培養中でｔ（
！Ｉ’ｌｌが生ｌ了および増殖するのに必要な栄養およ
びホルモン要求を含有する培地であって培地成分か分か
っている培地を指す。本発明か提供する規定培地は、一
般的な培ｌＩＩ！環境と局なる、特定の宿主細胞のため
の局所環境を確立するものである。

特定のポリペプチド因子（頌）を決定し、次いで、組換
え宿主細胞が必要とする規定培地を提供することは、細
胞培養に係る通常の技術者の行い得ることである。通常
、細胞系統は血清補充培地中に保持される。大多数の樹
立細胞系統は、数年間にわたー〕で、血清補充培地で増
殖されている。血清補充培地は、多かれ少なかれ、これ
らの細胞にインビボで必要なホルモンを提供し、かつ／
または細１泡を数種の必要なホルモンの少い状態、また
は（ｊ在しない状態に適合させていると考えられる。

特定の細胞系統のポリペプチド因子要求は幾つかの）ｊ
法で決定される。方法の選択は細胞系統に依（７する。

当業者には以下に例示する幾つかの可能なＪｊ法が知ら
れている。第１段階では、３〜６日間、細胞が生存およ
び／またはゆっくり増殖し得る条件を得る。大多数の細
胞にとってこれは、一部、接種密度の関数である。血清
不含培地に付青し、生存する細胞に関しては、適切な接
種密度を選択し、成長促進効果のあるホルモンの試験を
開始することが必要なだけである。最適なホルモン補充
が見出されたならば、生存に必要な接種密度は減少する
。ある場合には、プレート（平板培養）におけるホルモ
ンの効果は血清培養における効果と同様であるが、この
ことはすべての細胞型に当てはまるわけではない。それ
は、付着因子または増殖因子の添加の必要性が最初の間
だけであるためか、あるいは細胞を高密度で平板培養し
た時より高濃度に必要とされるからかもしれない。

形質転換された細胞および正常細胞の多くが、その付着
および増殖に必要な物質を産生ずることができる。

しかしながら、ある種の細胞は血清不含の培地を入れた
皿には付着しないか、たとえ２４時間でも生存すること
ができない。これらの細胞への最明の対処として幾つか
の方法が可能である。即ち、培養器を血清でプレコート
する；血清含有培地で１２〜２４時間細胞を平板培養し
た後、培地を血メー１不ａ培地と交換する；細胞が生存
するが増殖しない点まで血清濃度を減少する；様々な付
着因子を用いる。

次いで、様々なポリペプチド因子をこれらの最小条件下
で試験する。増殖のための最適条件が見出されたならば
、血清（またはプレインキュベーンヨン工程）を省略し
、かつ／または、精製付着因子および／またはポリペプ
チド因子で置き換える。

血清不含培地中の細胞は、通常、最適増殖のために、血
清不含培地にインシュリンまたはトランスフェリンを必
要とする。これらの２因子をまず試験すべきである。大
多数の細胞系統が１またはそれ以上の成長因子を必要と
する。これらには上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞
成長因子（ＦＧＦ）、インシュリン様成長因子！および
Ｉｔ（ＩＧＦＩ、ＩＣＦＩＩ）、神経成長因子（ＮＧＦ
）等が包含される。必要であり得る他の因子類には、プ
ロスタグランジン、ステロイド、輸送タンノ＜り質およ
び結合タンパク質（例、セルロブラスミン、高密度およ
び低密度リポタンパク質［ＨＤＬ、ＬＤＬ］、アルブミ
ン）：ホルモン、および脂肪酸が包含される。

ポリペプチド因子の試験は、増殖刺激作用を有すること
が分かっているポリペプチド因子の存在下、新規なポリ
ペプチド因子を段階的に試験する方法が最もよい。ポリ
ペプチド因子作用が付加的であることは滅多にないので
、ある場合にはこうすることが基本的である。または、
幾つかのポリペプチド因子は増殖のみを刺激することが
でき、−緒に加えるとそれらの効果は相殺されるか、阻
害される場合もある。

血清を完全にポリペプチド因子で置換することにより、
理想的には、血清中の細胞型に認められる時間および培
養効率に匹敵する（またはある場合にはそれ以上の）時
間と培養効率が倍加され、ポリペプチド因子を補充した
簡ｔｎ不含培地での連続的な継代培養中、細胞系統が保
持される。　添加される各ポリペプチド囚の量は該因子
について生理的範囲であるべきであるということは予測
される。しかしながら、このことは常にそうであるとは
限らないことを注意すべきである。ある場合にはより多
量が必要であり（例、インシュリン５〜１０μｇ）、池
の場合により少量であることを要する（例、ＴＰ　　Ｏ
，５０〜５０μｇ／酎）。最後に、より高度に精製され
たポリペプチド因子を加えることは、低純度形のポリペ
プチド因子を加える場合とりこなる応答を引き起こし得
る。さらに、培地に加えられる特定のポリペプチドの最
適ｆｌｔは培地が異なれば、細胞が異なる基質で増殖す
るので異なり、あるいは、池のポリペプチド因子が存在
すると異ってくる。

規定されていない培地については、ポリペプチド因子が
不存在か、または非活性であることが分っている条件（
例、血清欠如）で細胞を増殖させることで充分であるし
ニジカワら（Ｎ　ｉｓｈｉｋａｗａ）　Ｐ　ｒｏｅ。

ＮａＬｌ、Δｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　　７２：４８３
　４８７（１９７５）；カトウら（Ｋ　ａｔｏ）、１Ｅ
ｘｐｔ１．　　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５１３０ニア３−８１（
１９８０）；マクアスランら（ＭｃＡｕｓｌａｎ）Ｅｘ
ｐｔｌ、Ｃｅ１ｌ　　Ｒｅｓ、　　１２８：９５−　１
　０１（１９８０）：およびロスら（Ｒｏｓｓ）Ｃｅｌ
ｌ　　１４　：２０３−２１０（１９７８））。次いで
、ポリペプチド因子の存在下、または非存在下での細胞
増殖を測定し、該因子が増殖または生存のいずれに必要
とされているかを決定することができる。増殖を刺激す
るポリペプチドが、事実、既知ポリペプチドであるとい
うことを、論理的な確かさをも〜、て結論し得るよう、
試験されるポリペプチド因子は、充分に高純度でなけれ
ばならない。

「調節（コントロール）領域」とは、真核性遺伝子の５
゛オよび３°末端の、転写または翻訳に関与する特異的
な配列を指す。実際、全ての真核性遺伝子が転写が開始
される部位、即ちブロモ−タ一部位から約２５〜３０塩
基上流に、ＡＴに富んだ配列を有する。多くの遺伝子に
おいて転写開始部位の７０〜８０塩基上流に見出される
他の配列はＣＸ　ＣＡ　Ａ　ＴｊＪＩ域（ここにＸは何
であってもよい）である。大多数の真核性遺伝子の３°
末端にはＡＡＦＡ　Ａ　Ａ配列があり、これは転写され
たｍＲＮＡの３′末端にポリアデニル化テールを付与す
るためのシグナル配列であるらしい。

削孔類宿主細胞内でベクターからの転写をフン）０−ル
するのに好ましいプロモーターは様々な供給源、例えば
ウィルス由来のゲノム、即ち、ボＪオーマ、シミアンウ
ィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィ
ルス、Ｂ型肝ｉＭウィルスおよび最も好ま１、くはサイ
トメガロウィルス、またはベーターアクチンプロモータ
ーの如きヘテｏａ−ガスな師乳碩起源から得られる。Ｓ
Ｖ４０ウィルスの早期および後期プロモーターは５ｖ４
０ウイルスの複製起源をも含有している５ｖ４０制限断
片として都合よく得られる「ファイヤーズら（Ｆｉｅｒ
ｓ）、１９７８“ネイチャー”−Ｊ】コ　１１３１゜ヒ
トサイトメガロウィルスの極（イメディエイト）明期プ
ロモーターは、ｔ（ｉｎｄｒｌｌＥ制限断片として好都
合に得られる［グリーンナラエイら（Ｇ　ｒｅｃｎａｗ
ａｙ、Ｐ、　　Ｊ、　）、Ｇｅｎｅｌ　８，３５５　３
６０（１９７８）］。

より高等な真核細胞によるポリペプチド因子をフードす
るＤＮＡまたは所望のタンパク質をコードするＤＮＡの
転写は、エンハンサ−配列をベクターに挿入することに
よって増大される。エンハンサ−は通常約１０　３００
ｂｐのｃｉｓ作用をするＤＮＡｆｆ素であって、プロモ
ーターに作用し、その転写を増大する要素である。エン
ハンサ−は、比較的、方向性や位置に非依存性であり、
転写ｉ１１位の５°側［レイミンスら（Ｌ　ｅｉｍｉｎ
ｓ、　Ｌ　、　）　Ｐ　Ｎ　ＡＳ７８．９９３（１９８
１）１および３“［ラスキーら（１、ｕｓｋｙ、Ｍ、　
　Ｌ、　　）Ｍｏｉｌ、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏ、　　
３．１１０８（１９８３月、またはイントロンの中［パ
ネルジー（Ｂａｎｅｒｊｉ、Ｊ、　　Ｌ、　）Ｃｃｌ１
３３．７２９（１９８３）］または暗号配列の中［オス
ポーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｔ、　　Ｆ、　）Ｍｏ１．　
Ｃｅ１ｌ　　Ｂｉｏ、　　４．１２９３（＋９８４）］
に見出されている。今日、削孔類遺伝子由来の多くのエ
ンハンサ−が知られている（グロビン、エラスターゼ、
アルブミン、α−フェトプロティンおよびインシュリン
）。しかしながら、−・般に、真核細胞ウィルス由来の
エンハンサ−を用いることになろう。その様な例にはＳ
Ｖ４０の復製起源（ｂｐｌｏｏ〜２７０）の後期部位に
存在するエンハンサ−、サイトメガロウィルスの初期プ
ロモーターのエンハンサ−、ポリオーマ−の１υ製起源
の後期部位に存在するエンハンサ−１並びに”アデノウ
ィルスのエンハンサ−が含マれる。

脊椎動物宿主細胞をも含めて、真核性宿主細胞に用いら
れる発現ベクターはｍＲＮＡの発現に影響する、転写の
終止に必要な配列を含有している。

これらの領域は、ポリペプチド因子または所望のタンパ
ク質をコードする１ＲＮＡの非翻訳領域内のポリアデニ
ル化セグメントとして転写される。

３°非翻訳領域もまた、転写終止部位に包含される。

所望のタンパク質またはポリペプチド因子の発現ベクタ
ーは、選択遺伝子、選択可能なマーカーとも称する、を
含ａしている。哺乳類細胞にとって好適な選択マーカー
類を例示すると、ジヒドロ傭酸還元酵素（ＤＩＩＦＲ）
、チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。そのよ
うな選択マーカーが吐乳類宿主細胞にうまく導入される
と、形質転換された宿主細胞は、選択圧の下に置かれた
場合に生き残ることができる。選択方法には、明確に区
別される、広範な２種類（カテゴリー）の方法がある。

第１カテゴリーは、細胞代謝に基盤を置いており、補充
培地から独立して増殖する能力を持たない変異細胞系統
を用いる方法である。例として、Ｃｌｌ０　　ＤｉｌＦ
Ｒ−細胞およびマウス１．　ＴＫ細胞の２つがある。こ
れらの細胞は、チミジンやヒポキサンチンのような栄養
物の添加なしに増殖する能力を持たない。これらの細胞
は、ヌクレオチド合成経路を完結するのに必要なある種
の遺伝子を欠くために、この不足するヌクレオチドが補
充培地に供給されないと生存することができないのであ
る。培地に補充する方法に代えて、無傷のＤ　ＨＦ　Ｒ
遺伝子またはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いて
いる細胞に導入し、それらの増殖における要求を変化さ
せる方法がある。Ｄ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ遺伝子またはＴＫ遺
伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、補充のない
培地では生き残ることができない。

第２のカテゴリーはあらゆる細胞型に適用可能であって
、変異細胞系統を用いる必要がない選択方法、即ち、優
性選択法である。通常、これらの方法には、宿主細胞の
増殖を阻害する薬物を用いる。新規な遺伝子を含有する
細胞は薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択にお
いて生き残るであろう。

その様な顕苫な薬物を用いる選択法には、ネオマイシン
［サザーン（Ｓ　ｏｕＬｈｅｒｎ、　　Ｐ　）およびバ
ーブ（Ｂ　ｅｒｇ、　　Ｐ　、　）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ
　　２０９．１４２２（１９８０］またはハイグロマイ
シン［サジエンら（Ｓ　ｕｇｄｃｎ、　ｒ３　、　）、
Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：　４１０−４
＋　３（１９８５）］を用いる。

」１記の３例では適当な薬物、それぞれ、ネオマイシン
（０４１８またはジェネチシン）、ｘｇｐｔ（マイフッ
エノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐性を伝
えるために、真核性のコントロール下、細菌性遺伝子を
使用している。

“増幅“という語句は、細胞の染色体ＤＮＡ内の、単離
された領域が増加またはｔａ製されることを意味する。

増幅は、選択物質、例えばＤ　ＨＦ　Ｒを不活化するメ
トトレキセート（Ｍ”ｒＸ）のような物質の存在下で達
成される。Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子の増幅、またはＤＩＩＦ
Ｒ遺伝子の連続的なコピー作成により、多量のＭＴＸの
存在下でも、多量のＤ　ＨＦ　Ｒが産生されることにな
る。より多（のＭＴＸを添加することで、内因性ＤＩＩ
Ｒが存在していても、増幅圧が課される。所望のタンパ
ク質をコードするＤＮＡと、ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａまたは増幅遺伝子をイｆするプラスミドで吐乳類宿主
細胞をコトランスフェクトし、同時組込みを起こさせる
ことにより、所望の遺伝子の増幅を達成することができ
る。より多量のＭ′「Ｘ４度下で連続的に循環して増殖
し得る細胞を選択するだけで、より多くのＤＨＦＲを必
要とする細胞、その要求は選択遺伝子の複製によりかな
えられるが、を確保することができる。所望のタンパク
質をコードする遺伝子を、増幅可能な遺伝子と一緒に同
時組込みする限り、この遺伝子の複製により、所望のタ
ンパク質をコードする遺伝子の複製が増大されることに
なる。その結果、所望のタンパク質をコードしている遺
伝子（即ち、増幅された遺伝子）のコピー数が増加し、
所望のタンパク質が多く発現されることになる。

「形質転換」とは、ＤＮＡを生物内に導入することを意
味し、その結果、ＤＮＡが染色体外成分として、あるい
は染色体内に組込まれて複製することを意味する。特に
明示しない限り、本発明における大腸菌の形質転換法に
はグラノ＼ム（Ｇ　ｒａｈａｍ。

Ｆ、　）およびファン・デル・ニブ（Ｆａｎ　　ｄｅｒ
　　Ｅｂ。

八、）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　　５２：４５６−４５７（
１９７３）の方法を用いる。しカルながら、核酸注入、
プラトブラスト融合、電気穿孔法またはリポソーム笠の
他のＤＮＡを細胞に導入するための方法を用いることも
できる。真核細胞または、実質上細胞壁構造を有する細
胞を用いる場合には、ニーエンら（Ｃｏｈｅｎ、Ｆ、　
　Ｎ、　）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＬＩＳＡ）６９：２１１０（１９７２）の塩
化カルシウムを用いるカルシラ！・処理によるトランス
フェクションが好ましい。

所望のＩＩｆＷ号配列および調節配列を＊　’ｆＴ　す
る適当なベクターの構築は、標準的な絹換えＤ　Ｎ　Ａ
技術を用いる。中継したプラスミドまたはＤ　Ｎ　Ａ断
１ｔを開裂、修ｔｕｂ必要なプラスミドをＩｆ′、成す
るのに望ましい杉にライゲート（結合）させる。

プラスニド構築物中の正しい配列の確認のために、ライ
ゲーション混合物でＥ、　ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１２株
２１（Ａ”ｌＣＣ３１／＋４６）を形質転換し、アンピ
シリンまたはテトラガーイクリン面１性に基づいて適宜
、成功した形質転換体を選択する。

形質転換体からプラスミドを調製し、メノンングら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｅ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅｓ、　　９：３０
９（１９８１）の方法、またはマキサＡ（Ｍａｘａ＠）
、Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　　Ｅｎｚｙｉｏｌｏｇｙ、　６
５：４９９（１９８０）の方法で制限酵素分析および／
または配列決定を行い、分析する。

［トランスフ５．クション−１という語句は、実際にな
んらかの暗号配列が発現されるか丙かには関係なく、宿
−１，細胞に発現ベクターが取り込まれることをＱ昧す
る。当′を音は９くσｌランスフ５クンヨン法を知って
おり、それらには、例えば、ＣａＰＯ４法および電気穿
孔法かある。宿−１゛細胞内で、このベクターの機能か
生起されたとことを示すなんらかの微妙が認められたな
らば、通常、トランスフＳクレヨンは成功といえる。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる）ｊ
法または語句を説明セる。

［プラスミド」は小文字のｐを先頭にし、そしＣｌまた
は大文字お、上び／まｔ：は数字を続けることによ−・
て表わされる。本発明の出発物質であるプラスｉ＋・は
市販されているか、または非制限的な施設から−」電に
人丁１り能であり、あるいはこの様にしＣ人丁し、得る
プラスミド゛から、公知の方法に従ゲＣｊｌｌ　；１．
−Ｃることができる。更に、その（ロリ同笠なプラスミ
ドも当’Ｘ’＝Ｒには知られており、通常の技（４名に
と−）て自明であろう。

１）ＮＡの［ｌ白化１とは、’ｌ）ＮＡを、該ＤＮへの
ある（１゛ｆ置に′１．＋　＋、てのみ作用ケる酵素で
触媒的に開裂することを指４−０本発明において用いる
様々な制限酵素は市販されており、その反応条件、コフ
ァクター、およびその他必要なものは、当！Ｊ音既知の
ごとくにして用いた。分析［１的のためには、通常、プ
ラスミドまたはＤＮＡ断片１　ｔｔにと約２１１１位の
酵素を、緩ｉＩＩ液約２０ｕＱ中で用いる。プラスミド
の構築のためにＤＮＡ断片を＋１１離するｌ　Ｉ　ｎ’
Ｊの場合には、通常、さらに多量の緩ＩＩ液中で、１）
ＮＡ５〜１０μｇを酵素２０〜４（）中位により消化す
る。特定の制限酵素にと−）で適切なＶ；：　ｉｌｉ　
ｉｌｖ　ｔ；よび基質の量は！＋２；♂者により明示さ
れている。

般に、インキュベーション時間は３７°Ｃ−Ｃｌ時間か
採用されるが、１１（拾石の教示にｉｆｆニー）でＣ・
わり得る。消化後、反応混合物を直接ゲルに′！ＩＵ＋
１１しＣ所望の断片をｉｌｉ離する。

切断した断片の升イズ分画は、ゲノデルら（ＧＯｅｄｄ
ｅｌ、　Ｉ）、　　）Ｎｕｅｌｅｉｃ　　　Ａｃ１ｄｓ
　　　Ｒｅｓ、　　８　二４　０５７（＋９８０）の５
〜８％ポリアクリルアミドゲルを用いる方法で行う。

「脱りん酸化」とは、細菌性アルカリホスファター七（
１３ΔＰ）処理に、１す、５°末端のりん酸か除去され
ることをひ昧する。あるいは、［３ＲＩ、ＣＯＶ　ｅ制
限バッファー中のウシアル１１リホスフアターゼを用い
てず、よい。この１稈により、１也のｌ）ＮΔ断１１の
制御ｑＪｌ’ｌマ素切断部位・＼の挿入に妨げとなり得
る、１）　Ｎ　Ａ断１１の両制限末端が１閉１マ：また
は閉じたループをｊ［３成する。−とを防１１＃′る４
、脱りん酸化の方ｌ）、および試切は常ｔノ、通りであ
る［マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　′「）、
（”、、、　Ｓ　ＩＩ　Ｌ（１９８２）　Ｍ＋すｅｅｕ
ｌ＋−ｒＣＩｏｎｉｎｐ：　　ｌ　３３−１３４　ｒｆ
ｌｏ　１３Δｒ）を用いたＬス応は、酵素製品中に（ｒ
在しＣいる１り能性のあるエキソスクレ°ｒ−セの作用
を抑制するために、５０い４　　Ｔｒｉｓ中、６８℃に
おいて行なわれた。反Ｌ１−２１１時間行なわれる。Ｉ
ヌ応後、ｌ）　Ｎ　Ａ断１１をケル精製する。

けりゴヌクレオチド」とは、化学的にｌ’ｙ　ＨＡされ
ていて、しい・本鎖ポリデＡキシヌクレオチドまたは二
本鎖相補的ポリデオキシヌクレ４千ド鎖を指す。そのよ
うな合成Ａリコヌクレオチト′は５°りん酸をｆｒしＣ
いないの゛Ｃ５ヌクレＡチドキナーゼの存在下、Ａ　Ｔ
　Ｐと一緒にりん酸塩を加えないと他のオリゴヌクレオ
チドとライゲートしない。合成オリゴヌクレオチドは、
脱りん酸化されていない断片に結合する。

「ライゲーション（結合）」とは、２個の２本鎖核酸断
片の間にホスホジエステル結合を形成する工程を言う（
Ｔ、マニアティスら、前掲、ｐ１４６）。

特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべき適当な等モル環のＤＮ
Ａ断片０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼ（“リガー
ゼ”）１０単位を用いて行う。

［充填（フィリング）」または［平滑末端化（プランデ
ィング）］とは、制限酵素で開裂した核酸の粘着末端の
一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。

このことにより、粘着末端が消滅して平滑末端が形成さ
れる。この工程は、１個またはほんの少数の他の制限酵
素によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断
末端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレア
ーゼで形成された末端または他の充填後の粘着末端に適
合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段であ
る。一般に、平滑末端化は、目的とするＤＮＡ２〜１５
μ９を、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片８単位と
４種類のデオキシヌクレオチドＩ・リホスフェート各２
５０μＭの存在下、１０ｍＭ　　ＭｇＣＱｔ、１ｍＭジ
チオトレイトール、５０ｍＭ　　ＮａＣＱ、１０ｍＭ）
リス（ｐ）１７．５）バッファーの混液中、３７℃でイ
ンキュベートすることにより行われる。

ノΦ常、３０分後にフェノールおよびクロロホルムで抽
出し、エタノール沈澱に付すことによりインキュベーン
ヨンを終了する。

宿主細胞を、ポリペプチド因子および所望のタンパク質
を発現するベクターで形質転換した後、通常の方法で培
養する。当業者は、様々な細胞培養系を知っている。例
えば、平板培養系では、表面に付滑した細胞を増殖させ
る。培養容器に入れた、スチール、ガラス、有機ポリマ
ーまたはセラミ・ツク材料のような固体支持マトリック
スを用いてもよい。その他、アンカレッジ（停泊）依存
性細胞が付着している微少ビーズ担体の懸濁液、あるい
は懸濁させたビーズマトリックス内で増殖した細胞また
は該ビーズマトリックスにトラップ（閉じ込める）され
た細胞を含む懸濁液からなる系を用いることもできる。

その他、条件およびスケールアップの可能性を監視する
ことが容易な懸濁培養がある。培養系の選択は、特定の
宿主細胞および該細胞がアンカレッジ依存性か否か、と
られる操作：乳酸産生性等、種々の細胞特性；分泌か密
度依存性か否か；宿主細胞によって生産すべき所望のタ
ンパク質；および維持されるべき培養液の８徂等、幾つ
かの変動因子を考慮して当業者が決定することになる。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

ただし、これらの実施例は単なる例示にすきず、本発明
を制限するものとみなされるべきでない。

実施例１　インシュリンオートクリン（Ａ　ｕｔｏｃｒ
ｉｎｅ）細胞系統Ｃ２Ｂ１３の構築 Ａ）ヒトプロインシュリン発現ベクターの構築イン／ニ
リン遺伝子のｃＤＮＡクローン、ｐＨ＋３を用いて、ト
ランスフェクトした削孔類細胞内でヒトのプレプロイン
シュリン遺伝子を発現させるためのプラスミドを構築し
た。ＳＶ４０プロモーター、ヒトプレプロイン／ニリン
をコードしているｃＤＮＡ、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原
のポリ”Ｔテニル化部Ｌ　Ｊｆ２びにマウスのジヒドロ
葉酸還元酵素をコードしているｃＤＮＡを含有するベク
ター、ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲを構築した。

インシュリン非（衣存性宿主細胞系統の樹立に用いたプ
レプロインシュリン発現ベクターの構築工程図を第１図
に示す。３部からなるｐｓＶＥＨ１６構築方法を以下に
説明する。

ａ）ｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲ １）　ヒトプレプロインシュリンをコードしているｃＤ
ＮＡを、ｐｆ（Ｉ　３から、（Ｎｃｏ　Ｉ　−ＸｈｏＵ
　）消化により、４４０ｂρ断片中に得た。ｐＨ＋　３
は／ニアーら（Ｓｕｒｅｓ、　Ｉ、　）のＳ　ｃｉｅｎ
ｃｅ２０８　：　５７（１９８０）に記載されている。

プレプロインシュノンをコードしているｃＤＮＡを含有
する４４０ｂｐ断片を単離した。

２）インシュリンレセプタープラスミド（ｐＣＶ５ＶＥ
−ＨＩＲＩＣ，２、欧州特許公開Ｎｏ、０１９２３９２
．１９８６年８月２７［Ｊ公開）の５′末端から６３ｂ
ｐＸｂａｌ−ＮＣＯＩ断片を中離し、た。この断片は、
プレプロ１′ン／ニリンをニーＦしているｃｌ）ＮＡの
５°末端を５Ｖ４Ｑ初期プロモーターに融合するための
りンカーアグブターとしテ機能する。

３）べ々ター、ｐＣＶ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　２２／ｐｒｅＵ　
Ｋ　５４は、６５ｂｐリンカ−お、上びプロイン゛／ニ
リン〕責１云子の暗号配列とう・イｙ−ｈされるブラス
ミドハ。

クホーンを提１１するものであるか、以下のようにして
構築された。ｐｃＶｓＶＤ２２／ｐｒｅＵＫ５４、プラ
スミドバックボーンは第３図に示すように、３断片のラ
イゲージ１ンにより構築される。

（ｉ　）Ｓ　Ｖ　４０月期プロモーターは、プラスミド
ｐｃ　Ｖ　Ｓ　Ｖ　Ｅ　ｉ（Ｂ　Ｖ　（欧州特許公開Ｎ
ｏ、０１１７０６０．１９８４年８１１２９日公開）を
ｆ）ｖｕ！およびＸｂａｌで消化することにより調製さ
れた。

（ｉｉ）ブ（／ウロ牛ナーゼｃＤＮＡを含ａする断片は
、プラスミドｐ　ｐｒｅＵ　Ｋ　５４　　ｔｒｐ２０７
−１　（欧Ｉ１４特許公開Ｎｏ、００９２１８２．１９
８３年ｊＯ）Ｉ　２　Ｃ５Ｆ！公開）から得られた、３
該プラスミドをＣ＋　ａ　Ｉ消化に付した。Ｃ１ａｌ末
端を充填（フィリ／り）反応により平滑末端化した。Ｄ
ＮＡポリメラーセ１のフレノウ断片と４種類のデオキ／
リートスクレオチド・トリホスフェ−１−とを加えて、
Ｃ１ａｌ突出−本鎖末端を充填した。充填の後、プラス
ＥＦＤＮＡを第２の酵素、Ｘｂａｌで消化（また。

次いて、ｐｒｅＵ　Ｋ　５４のＸ１ｉａｌ−Ｃ１ａｌ（
充填）ｃＤＮＡ断片を！１１離した。

（ｊｉｉ）細菌性の１９製起源、１月（ＦＲｃＤＮＡ。

５１核性発現ｔｌｊ位、および肝炎ウィルス表面抗原の
３゛非翻ｙ＜領域を１−％　（Ｔするベクター断片は、
ｐＥＨ１５Ｄ　２２　（米国特許Ｎｏ、４，６２４．９
！８．１９８６年１１月２５日出願）から導かれた。こ
のプラスミドをまず、Ｂａｍ１ｌｌで消化した。次いで
、１−記、Ｃ１ａｌ’ｌ’Ｚ滑末端化におほろと同様に
して、［）ａｍＬＩｌ突ｔｌ末端をクレノウＤＮＡポリ
メラーセ１による充填反応で（Ｖ滑末端化した。Ｂａａ
ｌ目消化目土化充填の後、Ｉ）　Ｎ　ＡをＸｂａｌ消化
］２、Ｊくきい、１．３Ｋｂ断片を単離した。

これらの３断片を混合し、３断片の協調ライゲージ１ン
（コンサーチノド・ライゲージ１ン）に付し、連結した
。組換えｐＣＶ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　２２／ｐｒｅ［Ｊ　Ｋ５
４を回収した。充填したＣｌａｌ部位を充填したＢａ５
８１部位にライゲートすることにより、この連結部分に
無傷のＢａ５ｔ−１１部位が得られた。。

ｐＳＶＥＨ！ＧＤＨＦＲの構築のために、ｐＣＶＳＶＤ
２２／ＰｒｅＵＫ５４をＸｂａｌお５上びＢａｍＨｌで
消化し、ベクター断片を’４１離した。

ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦ１丈を得るための最終的な３部う
イゲーンフンには、ａ）プロインシュリンのｃＤＮＡを
含有ｒる４　４０ｂｐＮｃｏｌ　−Ｘｈｏｌｌ断片、ｂ
）このｃｌ）ＮＡをＳ■４０初明プ初子プロモーターす
るための、ｐＣＶＳＶＥ−ＨＩＲｃ−’１山来の６３ｂ
ｐＸｂａｌ−Ｎｃｏｌ断片、およびｃ）ＳＶ４０ｉ）　
ＨＦ　Ｒ転写単位、大腸菌のｒｆｌ製起源からのアンピ
ンリン耐性マーカー、ポリアデニル化を伴−た肝炎表面
抗原３°末端、および転写終止部位を含（ｆするｐｃＶ
ｓＶＤ２２／′ｐｒｅＵＫ５４由来のＸｂａｌ　−［３
ａ＠Ｈｌベクター断片を用いた。３断片を協、工１３方
向ライゲー／−ｌンにより連結、大腸菌に導入（ｂファ
ンスフオーム）した。彩°肖転換体を分析し、所望のＸ
■換え体を同定した。

ｔ））ｐｓ　Ｖ　Ｅ　Ｉ（ｔ　Ｇ　Ｎｅ。

プレブロインンユリン発現ベクターｐｓＶＥＨＩＧＮｃ
ｏの購莫模式図を第２図に示す。

このベクターは２断片の構築により組み立てらレタ。第
１断片は、上記ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲのｌ１ｉｎ旧■
断片である。この断片には、プレプロイン／ニリンをコ
ードしているｃＤＮＡと、ＤｌｌＦ　ＲをフードするＤ
　Ｎ　Ａの転写開始を指令するＳＶ　４　ｏ　ｉｌｌ　
ＩＩＪＩプロモーターとか（”Ｉ　Ｎされている。第２
断片をａ（Ｔするプラスミドバックボーンは、ｐＳＶＥ
ＮＥＯＢａ１６（欧州特許公開Ｎｏ、０１６０４５７．
１９８５年＋１ＪＪ６Ｂ公開）の５ｖ４０プロモーター
の丁度、下流に位置する１ｌ−０１（ｉ　ｎｄ　Ｉｔ！
部位を切断することで得られた。次いで、線状プラスミ
ドをつ／アルカリホスファターセで処理し、σ１環化を
防止した。ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲから得たＨｉｎｄ［
ＩＩ断片を、ｐｓＶＥＮＥＯＢａ１６の単一のＨｉｎｄ
ｌｌ［部位に挿入し、本来、マウス５Ｖ４０−Ｄ）（Ｆ
Ｒ転写単位の転写のためのＳＶ４０プロモーターを、プ
レプロインシュリン遺伝子の上流に位置させた。ライゲ
ーションの後、プラスミドを大腸菌２９４細胞に導入す
る。

組換え細胞は、制限分析により、プロインシュリンｃＤ
ＮＡを含有する断片が正しい方向性にあることを確かめ
ることによって同定される。方向性が適切であれば、本
来細菌のＮｅｏ遺伝子を転写するＳＶ４０プロモーター
は、ここではプレプロインシュリンｃＤＮＡの上流にあ
ってその転写を開始する。

ｃ）ｐＥ。

ＳＶ４０プロモーターのフントロール下にオルニチンデ
カルボキシラーゼ（ＯＤＣ）ｃＤＮＡを含有し、Ｂ型肝
炎ポリアデニル化配列と大腸菌内での選択のためにアン
ピシリン遺伝子を含有しているベクターを構築した。内
因性のＯＤＣ遺伝子は、ＯＤ　Ｃ阻害物質、アルファ　
ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）を用いた選択
により、哺乳類細胞中で増幅が可能である［マツコンロ
グ（ＭｃＣ。

ｎｌｏｇｕｅ、Ｌ、　）およびゴ、フイノ（Ｇｏｆｒｉ
ｎｏ、　Ｐ、　　Ｊ）、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、　　２５８．８３８４−８３８８（１９８３）および
マノコンログおよびゴ、フィ／、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　
　Ｃｈｅｍ、　　２５８．１２０８３−１２０８６（１
９８３）、１゜ 第４図に、２断片ライゲーションによるｐＥＯの構築模
式図を示す。

１、ＯＤＣの全暗号領域を含有する１６８８ｂｐを、ρ
ＢＲ３２２にクローンされた０ＤＣｃＤＮＡを含有する
プラスミドから得た（マツコンログら（Ｍｃｃｏｎｌｏ
ｇｕｅ、　Ｌ、　）Ｐｒｏｃ、　　Ｎａ１１．　　Δｃ
ａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８１：５４０−５４４［１９８４］；グブタ（Ｇ
ｕｐｔａ、Ｍ、　）およびゴノフィノ（Ｇｏｆｒｉｎｏ
、　Ｐ、　　Ｊ　、　）、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ
、　　２６０：２９４１−２９４４［１９８５］）。プ
ラスミドをＳａｌ［およびＰｖｕｌｌで切断した。末端
をフレ／つで充填して平滑末端化し、ゲル上で１６８８
対のＯＤＣ断片を単離した。

２、ＳＶ４０初期プロモーター、肝炎ポリアデニル化配
列、および大腸菌内での選択のためのＡＭＰ遺伝子を含
有する３５９３ｂｐ断片をプラスミドｐＳＶＰＡＤＨＦ
Ｒ（欧州特許公開Ｎｏ、０．０９３．６１９、該明細書
ではｔ−ＰＡをコードするＤＮＡの５°側５Ｖ４Ｑプロ
モーターに１９２ｂｐ断片を付加して修飾されたｐＥＴ
ＰＦＲとして記載されている。この付加された１９２ｂ
ｐ断片は追加のＨｉｎｄｌ１１部位を含有している６）
から単離した。

このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｃｌｌで切
断し、末端をフレノウＤＮＡポリメラーゼで充填し、ゲ
ル上で３５９３断片を単離した。

次いで、これらの２断片を２成分ライゲーションに付す
ことによって連結し、ｐＥｏを構築した（第４図参照）
。最終プラスミドの方向性および立体配置を制限分析に
よってチエツクした。

実施例２　インシュリン−非依存性細胞の選択ポリペプ
チド因子依存性細胞、この場合はＣＨＯ細胞のための特
定のポリペプチド因子、この場合はプロインシュリンに
対する要求を、インシュリンネ含培地にプロインシュリ
ンを補充することで行った。大多数の細胞か血清不含培
地で生存する上でインシュリンを必要とすることは知ら
れている（Ｓ　ａｔｏ、　Ｇ、　Ｈ，ら、前掲）。驚く
べきことには、培養中のＣＨＯ宿主網１泡では、プロイ
ンシュノンがインシュリンの代りとなった。即ち、ＣＨ
Ｏ／Ｄ　ＨＦ　Ｒ−細胞をプレブロインシコリンベクタ
ーでトランスフェクトし、プロインシュリンをオートタ
リンの形で供給した。

ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−細胞をｐｓ　Ｖ　Ｅ　ＮｅｏＢａ　
ｌ　６ブラスミドにより、りん酸カルシウム法［シモン
セン（Ｓ　ｉｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ，Ｃ，）およびレビン
ソン（Ｌｅｖｉｎｓｏｎ、Ａ、Ｄ、）ＰＮＡＳ８０：２
４９５　２４９９［＋９８３］の方法でトランスフェク
トし、細胞を血清不含（３５０ｎ　　Ｏｓｍ）、インシ
ュリンネ含Ｆ　−１２／ＤＭＥ（Ｇｉｂｃｏ）培地（Ｓ
　Ｆ　Ｉ　Ｐ）中、低密度で継代培養することによりイ
ンシュリン非依存性増殖に関して選択した。Ｆ−１２／
ＤＭＥは、高グルコース、ｌｘＧ［（Ｔ（０，０１９／
＆〜グリシン、０．０］５ｇ／４−ヒポキサンチン、お
よび０　、　　ＯＯ５ｙ、’Ｑ−チミ）ン）、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　Ｈｅｐｅｓ。

１．０Ｍｇ％’ｌ、トランスフェリン、１ｘ微噴成分［
マノキーハムら（ＭｃＫ　ｅｅｈａｍ、　Ｗ、　　１．
　、　）　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　７２１２０２３（１９７６
）、ソコンソン・マンニー・ケミカルス］、１ノｔＭリ
ルイノク（Ｉ　１ｎｏｌｅｉｃ）、Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ”。

Ｍ　　Ｔ、、および１ＸｌＯ’Ｍヒト。

ニー千ソン、エストラジオール、およヒプロケストロン
からなる。この培地で２週間経過した１（、生Ｈしてい
る細胞を、透析し、炭素、・デキストランＩ）　Ｅ　７
〜Ｅ抽出し、熱処理した５％ＦＩ３ｓを含有するＭＩ′
ＩＩ！（ＣｈＸ　−Ｆ　Ｂ　Ｓ　）を用いてレスキュー
（ｒｅｓｃｕｅ）　した。ＣＨＯ／Ｄ　ＨＦ　細胞は全
血清中で増りへするがＣｈＸ−ＦＢＳ中では、イン／ニ
リン捕充なしには増殖しない。しかしながら、ｃｈＸＦ
Ｂ８４−インシュリンの存在下での増殖を、インシュリ
ン単独の存在下での増殖と比較すると、ＣｈＸ−ＦＢＳ
は、他の必要成分を与え得るように思われる。即ち、Ｃ
ｈＸ−ＦＢＳの単独添加は、細胞自身でプロインシュリ
ンを供給し得る細胞の１ｑ製率（“レスキュー”）を増
大させる。血清の炭素抽出処理は、活性なインシュリン
の除去に、必要な処理である。即ち、インシュリンの唯
一の供給源はｊ１ニ質転換された宿主細胞であった。イ
ン／ニリンｊｌ依ａ性細胞を、コロニー彩態学およびサ
イズに１．（いてクローニングした。次いで、１％Ｃｈ
ＸＦ１３　Ｓ中での増殖に関してイン／ニリン非依ｎ性
Ｉｌｌ　Ｉｌｌをクローニングした。インンユリン不３
条件下での親細胞系統の複ｉＨ２能力は厳しく制限され
た（ｌ−２分割／週）か、彰質転換されたクローンは、
同じ期間に３０１０倍の細胞数増加を示した。

長期間に７度ってインシュリンの非存在下に生存し、増
殖し得る２個のクローンを人々Ｄ　Ｐ　７　ｋ；よびＤ
　ｆ）　＋　２と命名した。これらのインシュリン非１
１ｄｊ性細胞を、さらに、５ＦＩＦ中で、スピナー（撹
拌装置、５ｐｉｎｎｅｒ）およびプレート（平ＦＦｉ、
）で培丘して選択した。細胞を、スピナー（５００＊の
中、ｌＸＩＯ３細胞／７Ｑで接種した。平板培養におけ
る細胞の播種密度は２　Ｘ　１　（１５細胞／６０Ｉｎ
Ｉｌｌプレー　１−てあった。インシュリン非情１ｉ性
に関する選択を２週間行った１（、プレートおよびスピ
ナーの両だから生（ｊ細胞を通針し、抽出した５％ＦＢ
Ｓにレスキューした。スピナー培丘から得た細胞をその
時点て平板培養のために取った。連続希釈法を用い、細
胞を制限希釈によ・ってクローニングした。次いで、こ
れらのコロニーから得た細胞を１細胞７・ウニ・しの、
（１合で連続希釈した。クローニングは全”ｒ、Ｆ−１
２，／ＤＭＥ、高グルコース、５％ｊｚ素抽出１”　Ｂ
　Ｓ培地のび圧下で行なわれた。約１ケ月後、最明のク
ローニングから増殖し尽くした細口；４を１１Ｓ度、ｌ
細胞／ウェルの割合で希釈した。

次いで、生存し、増！ｌｌＱした細胞を１００ｍｍプレ
ートニ取−）だ。これらの細胞を５ＦＩＦ＋５００ｎＭ
％　ト１−レキセードに保持し、毎週継代培養した。

クローンＤＩ）７およびＤＰ１２は、生存および増殖能
力をｆＴすることか分かった。第５図に示されているよ
うに、χ・■照細胞には不ｉＪ能であったか、インシュ
リン非情ｒｊ性細胞は、インンユリン不倉培池で生存お
よび増殖することかできた。本ｔ’ｄ　１ｊｌｌの細胞
のイン７／ニリン非１７＜ａ性は、第６図に示されてい
る。培地中のイン／コリン濃度か低下する場合、対照細
胞のプレート当たりの細胞数は培地中のイン／コリン濃
度の減少に伴って減少するのに父・１し、イン／ニリン
非依（ｊ性細胞系統の増殖はず１を持されていた。

実施例３　インンユリンー年債存性細胞系統によるｔ−
ＰＡの生産 ’ｒ’＋ｒＪ：培地中でのｔ−ＰＡ発現をラジオイムノ
ア。

セイで定型分析した。純化ｔ−Ｐ　Ａおよび精製したヨ
ウ化トレーサーｔ−ＰＡを、濃度が１２５１　（１０ｎ
ｇ／　ｙｒＱの範囲になるよう、りん酸緩市化食塩水、
ｐＨ７、３，０，５％ウシ血清アルブミン、００１％Ｔ
ｗｅｅｎ８０、および０．０２％ナトリウムア〉・ドで
連続４釈した。適当に希釈した培地試ｔ［を放射活性に
ラヘルしたトレーサータンパク質にＩＪＩＩえた。しｚ
月ｏ、ｏｏｏ希釈のウサギ抗ｔ−ｒ）Ａ抗血清のＩｇＧ
画分のび圧下、室温で−（１、抗１！１＜をインキュベ
ー１−シた。ヤキ抗つサギ１ｇＧイムノビーズ（Ｂ　１
ｏｒａ＋、Ｉ）に室温で２時間吸収させることで抗体−
抗原フンフレノクスを沈殿さ）ｌた。

食塩水希釈液を加えた後、４°Ｃにおいて、２０００×
９で１０分間遠心することにより、ビーズを洗浄した。

上清を捨て、沈殿の放射活性をモニターした。比較標準
と比べて濃度をアサインした。

種々のポリペプチドがタンパク質の分泌に影響すると同
時に、宿主細胞の生存または増殖に影響を及ぼすことが
分かった。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、表皮成長因子
（ＥＧＦ）、インシュリンおよびトランスフェリンのよ
うなポリペプチド因子は培養細胞からのタンパク質の分
泌に影響することが示されている［リッチら（Ｒｉｃｈ
、に、　　Ａ、　）Ｅｎｄｃｒｉｎｏｌｏｇｙｌ　ｌ　
３（６）：２２８４　（１９８３）］。そこで、所望の
タンパク質の生産／分泌を評価するために所望のタンパ
ク質、組織プラスミノーゲン活性化因子、を産生ずる形
質転換体宿主細胞（Ｃ２Ｂ）を、インシュリン非依存性
にした。

インシュリン−非依存性の形での所望のタンパク質（例
、ｔ−ＰＡ）の分泌を支持する上で、内的に生産された
プロインシュリンが充分であるか否かを決定するために
、所望のタンパク質（この場合にはｔ−ｐＡ）の発現の
ために予め形質転換した宿主細胞を用いる外は、実施例
２記載の方法と同様にしてトランスフェクトした。実施
例１記械のベクター、ｐｓＶＥＨ［ＧＮｅｏを、増幅さ
れたし１）ＡおよびＤ　ＨＦ　Ｒを含有しているＣＨＯ
細胞系統（Ｃ２Ｂと称する）（欧州特許公開Ｎｏ、００
９３６１９）にトランスフェクトした。トランスフェク
ションは、りん酸カルシウム法で行った（シモンセン（
Ｓｉｍｏｎｓｃｎ、Ｃ，Ｃ，）およびレピア７７（Ｌｅ
ｖｉｎｓｏｎ、Ａ、　　Ｄ、　）ＰＮΔＳ８０：２４９
５−２４９９［１９８３］；ウィグラーら（Ｗ　１ｇ１
ｅｒ、　Ｍ、　）　ＰＮＡｓ７６：１２４２−１２５５
［］　９７９］）。Ｎａｏ遺ｂｃ子を発現するトランス
フェクトされた細胞を、０４１８含有培地での増殖に基
いて選択した。

プレプロインシュリンでトランスフェクトされたＣ２Ｂ
細胞を血清不含、インシュリンネ含（ＳＦｌ）のスピナ
ー（撹拌）およびプレート（平板）培養でインシュリン
非依存性に関して選択した。

血清不含培地は、標準化された上記記載の３５０ｍｏ　
ｓｍインシュリンネ含Ｆ−１２／ＤＭＥ培地である。そ
れは、グルコース、２ＫＧ＋−（Ｔ、１０ｍＭＨｅｐｅ
ｓ、１．０Ｍｇ／Ｌ）ランスフェリン、！×微量成分、
ｌμＭリルイノク（ｌｉｎｏｌｅｉｃ）、ＩＸＩＯ−Ｉ
ＯＭＴ３、およびＩＸ　１０−”Ｍヒドロコーチシン、
エストラジオール、およびプロゲストロンからなる。

インシュリン非依存性に関する選択をほぼ２週間行った
後、生存している細胞を、透析し、抽出した５％ＦＢＳ
を含有する培地を用いて、スピナー（撹拌）およびプレ
ート（平板）培地の両者からレスキューし、制限希釈に
より、２３クローンを誘導した。これらのクローンを、
インシュリンの非存在下、あるいは様々な濃度のインシ
ュリン（インシュリン至適濃度、２０μｙ、／　ｘ（ｌ
インシュリンをも含む）の存在下、血清不含条件におい
てｔ−ｐＡの生産に関してスクリーニングした。将来の
研究に最も明侍し得るクローン１３を取り出した。

実施例２および直前の例に記載のトランスフェクション
／選択によるインシュリン非依存性細胞創成法の別法と
して増幅、その結果のプロインシュリン発現の増大によ
る方法がある。即ち、ｔ−ｐＡ産生Ｃ２Ｂ細胞を、実施
例１　（ｂ）記載のｐＳＶＥＨＩＧＮｅｏベクターと実
施例１（ｃ）記載のｐＥｏベクターでコトランスフェク
シコン（同時トランスフェクション）した。これにより
、選択後にＤＦＭＯを用いた増幅が可能になる。同様の
コトランスフエクションー同時増幅（ファンブリフィケ
ーション）が、Ｓ　ｉｍｏｎｓｅｎ、　Ｃ、Ｃ、および
Ｌｅｖｉｎｓｏｎ。

Ａ、　　Ｉ）、（前掲）によって記載されている。

プレプロインシュリン−ＮｅｏベクターとｏＤＣベクタ
ー、即ちｐＥＯでコトランスフエクトされたＣ２Ｂ細胞
を、まず、Ｇ４１８含有培地で選択した。次いで、トラ
ンスフェクトされた０ＤＣｉＪ１云子を増幅させると共
に、プレプロインシュリンを共増幅させるために、０４
１８耐性細胞を２５、＋００．３００および５００μＭ
の漸増濃度のＤＦＭＯ中で増殖させた。この増幅工程の
後、増幅したｔ−ＰＡ（所望のタンパク質）選択圧下に
置くためにメトトレキセートをＤＦＭＯ含有培地に加え
た。プレプロインシュリンでトランスフェクトされたＣ
２Ｂ細胞を血清不含、インシュリンネ３（Ｓ　Ｆ　Ｉ　
Ｆ）のスピナーおよびブレート中でインシュ１ン非依ｆ
ｊ性に関して選択した。血清不含培地は、け準化された
−１−記に記・戎の３５０ｍ０ｓｉインシユリンネａＦ
−１２，／’ＤＭＥ培地である。それは、グルコース、
２ｘＧＨＴ、ｌ　ＯｍＭＨｅｐｅｓ、１．０〜ｉｇ／′
１．トランスフェリン、ＩＸＩ成分、ｌμＭリルイノク
（ｌｉｎｏｌｅｉｃ）、１ｘｉｏ−”ｖ’ｒｘ、および
ＩＸ　１０−’Ｍヒドロコーチシン、エストラジオール
、およびプロゲストロンからなる。

プレプロインシュリン遺伝子でトランスフェクトし、選
択されたイン／ニリン非依存性ＣＨＯ細抱によるｔ−Ｐ
Ａの生産、および別法のｐｓ　Ｖ　Ｅ　ＨＩＧＮｅｏで
トランスフェクトし、増幅する方法でＩ写られたインシ
ュリン非依存性ＣＨＯ細胞によるｒ−ｔ　Ｐ　Ａ産生を
第７図に示す。Ｃ２Ｂ（対照）細胞、Ｃ２Ｂ／クローン
１３インシユリン非依存性細胞および１００μＭ　ＤＦ
ＭＯ増幅プールをＰＩＦ培地で３回洗浄し、次いで、５
ＦＩＦ培地に再懸濁した。クローン１３および１００μ
Ｍ　ＤＦＭＯインシュリン非（ＩＺａ性細胞系統はイン
シュリン非行注下で、至適濃度のインシュリン存在下に
おいて対照Ｃ２］３細飽系統か達成するｔ　−Ｐ　Ａ力
価と同程疫の力価の１−ＰＡを産生した。

実Ｍｄ１１４　　トランスフェリン発現ベクターの構築 ａ）　ヒトトランスフェリンｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのｆｌｔｉ
ｌｉｌ成人男性事故死考の肝臓から、グアニシンチオノ
アナートホモジ不−ンヨン／塩化すチウム沈殿法［ブノ
サラら（Ｃａｔｈａｌａ、Ｇ、）ＤＮＡ　　２：３２９
（１９８３）］により、メツセンシャーＲＮＡ（角ＲＮ
　Ａ　）を調製した。

上記のｍＲＮＡを鋳型として用い、オリゴ（ｄＴ）ブラ
イミング［アマー／ヤム（Ａ　ｍｅｒｓｈａａ）　Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を用いる市販の牛ｙトを使用し
、製造者の教示に従って二本鎖の相補ＤＮＡ（ｄｓ−ｃ
ＤＮＡ）を合成した［オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ、　！
４　、　）およびバーブ（Ｂｃｒｇ、Ｐ、）Ｍｏ１．Ｃ
ｅ１１．Ｂｉｏｌ、２：１６１（１９８２）、およびガ
ブラー（Ｇ　ｕｂｌｅｒ、　Ｕ、　）およびホノフマン
（Ｈｏｆ「ｍａｎ、　Ｂ　、　Ｊ　、　）、Ｇｅｎｅ　
２５　：２６３（１９８３）に基く］。

以下に示すように、モ滑末端化したｄｓ−ｃＤＮＡの両
端にＤ　Ｎ　Ａオリゴヌクレオチドリンカーを結合（ラ
イゲーション）さゼ、ＥｃｏＲ１制限部位で終るｄｓ−
ｃＤＮＡを得た。

ｄｓ−ｃＤＮＡ ・　・　・・　・・　ＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＧＡ
Ｇ・・・・・・・＋ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ
ＴＴＡＡＳａｌ　ｌ　　　　Ｓｓｔ　Ｉ　　　　　　Ｅ
ｃｏＲＩＸｈｏ　１ このｄｓ　　ｅＤＮＡをポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、約２０００塩基対に移動したｄｓ−ｃＤ　Ｎ
　Ａ　’ｃＴ５気溶出によってゲルから回収した。

サイズ分画したｄｓ−ｃＤＮＡを、Ｅｃｏｌ之１切断の
ｉＬＦめ、市販のバクテリオファージラムダノく・ノケ
ージング抽出物［ストラノタジーン（Ｓ　ｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）１を用いてパッケージングしたバクテリオファ
ージラムダベクターｇｔｌＯ［ヒュンら（Ｈｙｕｎｈ、
　ＴＶ、）”ＤＮＡ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉ
ｑｕｅｓ％Ａ　　Ｐｒａｃｔ＋ｃａｔ　Ａｐｐｒｏａｃ
ｈ”Ｄ、Ｇｌｏｖｅｒ編、ｌ　ＲＬ　／’レス、：１ツ
クスフイード川９８５１にライゲートした。

パッケージングしたバクテリオファーンを大腸菌株ｃ６
００ｈＮ−ｆヒュンら、　（Ｈｙｕｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、
）ｌ−λｇｔｌＯおよびλｇｔｌｌでのｃＤＮＡライブ
ラリーの作］戊とスクリーニング、’Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｃｌ
ｏｎｉｔｉｇ”Ｇ　１ｏｖｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、編（ＩＲ
Ｌプレス、オノクスフォード。

ワシントンＤ、　Ｃ，）（１９８５）ＩＪ：で平板培促
し、次いで、バクテリオファージＤＮＡをレプリケート
命ニトロセルロース・フィルター［マニアティスら（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩ
ｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、
　Ｃｏ閉ＳｐｒｉｎｇＩ（ａｒｂｏｕｒＬ　ａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　（１９８２）］に移した。

ｂ）　　）ランスフェリンｃＤＮＡ’ｉ−ｉ有する組換
えクローンの同定 （３個のニトロセルロースフィルターを下記の合！戊Ａ
リコヌクレオチドでプローブした。この配列は、ヤング
ら（Ｙ　ａｎｇ）［Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎ　ａｔｌ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓ　ｅｉ。

ＵＳ　）＼　−亀」−・２７５：２−２７５６（１９８
４）１　が報告した、ヒトトランスフェリンｃ　Ｄ　Ｎ
　Ａのヌクレオチド計号Ｎｏ、Ｉ００からＮｏ、１７５
までの配列とハイブリダイズするように組立てられてい
る。

５’　　ＧＴＧ　ＴＧＣＡＧＴ　ＧＴＣＧＧＡ　ＧＣＡ
　ＴＧＡ　ＧＧＣＣＡＣＴＡＡ　ＧＴＧＣＣＡ　　ＧＡ
Ｇ　　ＴＴＴ　　ＣＣＧ　　ＣＧＡ　　ＣＣＡ　　ＴＡ
Ｔ　　ＧＡＡ　　ＡＡＧ　　ＣＧＴ　　ＣＡ　　３’標
準的なキナーゼ反応［マニアナイスら（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ＋Ｔ、）、前掲、１２５頁］により、オリゴヌクレオ
チドの５′末端に放射活性なりん酸基を付加して上記オ
リゴヌクレオチドを放射活性にラベルした。ハイブラリ
ダイゼーションバッフ１−中で３０％ホルムアミドを用
い、マニアナイス（同上、３２６頁）の方法に従ってハ
イブリダイゼーションを行った。オートラジオグラフィ
ー（マニアナイス、同上、３２６頁）により、ハイブリ
ダイゼーション陽性のプラークを同定し、精製するため
に６個のファージプラグを取り上げたくマニアナイス、
同上、６４頁）。

各プラグから得たファージを低密度で再度平板培養し、
１６時間増増殖−おいた後、再度、バタテリオファージ
をニトロセルロースフィルターに移した。これらのフィ
ルターを、同じオリゴヌクレオチドプローブを用いて上
記のごとく、スクリニングした。６プレートの各々から
、単一の、単離したプラークをとり上げた。これらのフ
ァージを用い、感受性の大腸菌、ｃ６００ｈＦ　Ｉ−［
ヒュン（Ｉｌｙｕｎｈ、　Ｔ、　Ｖ、）、前ｔＦ３Ｅの
培養物を感染させた。

標準的な小規模ファージ調製法（マニアナイス、同上、
３７３頁）により、６クローンの各々からファージＤＮ
Ａを！Ｉｌ製した。

各クローンから得たＤＮＡ４０μｇを制限酵素５ｓｔｌ
［ゴソフ（ＧｏｆＴ、　Ｓ　、　Ｐ、　）およびラムバ
ｙハ（Ｒａｍｂａｃｈ、　Ａ、）Ｇｅｎｅ　３　：３４
７　（１９７８月で消化した。これらの消化物を１％低
融点アガロースゲル［ストラール（Ｓ　Ｌｒｕｈｌ、　
Ｋ　、　）Ｂ　１ｏＬｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　３　：４５
２（１９８５）］上で処理した。クローンの内３つがほ
ぼ正しい２．３ｋｂのサイズの挿入体を示した（ヤング
ら、前掲）。ゲルから挿入体のバンドを切り取り、ＭＩ
３に基くベクター、ｍｐ１９［ヤニツ／ユーベロンら（
Ｙａｎｉｓｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ）Ｇｅｎｅ　３３：ＩＯ
３−１１９（１９８５）むよびフラング−ら（Ｎｏｒｒ
ａｎｄｅｒ、Ｊ、）Ｇｅｎｅ　２６：１０１（］　９８
３）］にサブクローニングした（ストラール、前掲）。

組換えファージのクローン（白色のプラーク）を取り、
末端配列の決定を行った。

クローンの１つは報告されたトランスフェリン配列（Ｙ
　ａｎｇら、前掲）と同じ完全な暗号配列を示した。こ
のクローンから得た挿入体をｐＵｃＩ９（Ｙａｎｉｓｈ
　−Ｐ　ｅｒｒｏｎ、前掲）の５ｓｔｒ部位にサブクロ
ーニング（Ｓ　ｔｒｕｈＬ前掲）した。組換え体クロー
ンをトランスフェリン−ｇａｌ含有含有プレートロ色コ
ロニーとして同定した。トランスフェリン暗号領域がＩ
ａｃＺプロモーター領域と反対方向である単一のクロー
ンからプラスミドＤＮＡを絹製した。

トランスフェリン暗号領域は、ｐＵＣベクターをＸｂａ
ｌ　−ＥｃｏＲ１部分消化し、２，３ＫｂＥｃ。

Ｒ１−Ｘｂａｌ断片として切り出された。この唯一の断
片を１％低融点ゲルで精製し、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ
　消化ｐＲＫ　５ベクターにサブクローニングした（Ｓ
　Ｌｒｕｈｌ、前掲）。このベクターの構築を以下、お
よび第９図に示す。次いで、ｐＲＫ５をＥｃｏＲ１／Ｘ
ｂａｆで消化し、２．　３　ＫｂＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａ
Ｉトランスフェリン断片の挿入部位を得た。次に、この
断片を挿入し、第８図記戦のｐＲＫＴＦＮを得た。

ｃ）ｐＲＫ５の構築 出発プラスミドｐｃ　Ｉ　Ｓ　２．８ｃ２８Ｄ（欧州特
許出願公開第２７２９２９号参照）を、以下に記載のご
と（にして構築した。

９０　ｋｄ／　７３　ｋｄ　ｅｘａｃｔと弥する、第■
囚子ノアミノ酸１〜７４０およびアミノ酸１６９０〜２
３３２を含有する変異体を作成した。この変異体は、７
３ｋｄサブユニツトに結合した９０ｋｄサブユニツトを
含有する。９０ｋｄサブユニツトはアミノ酸ｌ−７４０
を、７３ｋｄサブユニツトはアミノ酸１６９０−２３３
２を含有している。

上記第■囚子変異体をコードしている発現ベクターを構
築した。このプラスミドは第〜１因子のＢドメインを欠
失している。最も短い融合タンパク質（９０ｋｄ／　７
３　ｋ＋Ｉ　ｅｘａｃｔ）は、第■因子（７）ｌｆｉ能
活性を最大にするのに必要な第〜１囚子部分のみを含ｉ
ｆしている［イートンら（ＥａＬｏｎ、Ｄ、　　Ｅ、　
）Ｂｉｏｅｈｅｌｌｉｓｔｒｙλ−ｆｉ：５０５−５１
２（１９８２）ｉこの融合タンパク質を完全長の第〜・
１因子の発現にｆｆ２ｈであることか分か−）でいるＣ
ＩＢベクター系と１箇所異なるベクター系で発現させた
。第１０図に示されているように、ｐＦ８ｃＩｓのＣｌ
ａｌ部位に先行する１個のヌクレオチド、即ちグアノ、
・ン゛かチミンンに変化しており、そのために大腸菌の
ｄａｍ’株はＣｌａｌ部位を切断することを必要としな
い。

以下の断片で３成分（部）ライゲーションを行った。ａ
）　　ｐＦ　８ＣＩ　５（ｄａａ＋−株から単離し、１
３Ａり処理したもの）のｌ　２６１７ｂｐＣ１ａｌ　−
８ｓｔｌ　ｌ断片、ｂ）ｐＦ８ｃ［ｓの２１６ｂｐＳｓ
ｔ　ｌ　Ｉ　−Ｐｓｔｌ断片、およびＣ）キナーゼ処理
した、短いＰｓｔｌ−Ｃｌａｌ合成オリゴヌクレオチド
（第１０図参照、＊は変化したヌクレオチドを指す）。

第１０図にはまた、変異体の作成のために融合される、
第〜１因子の５”および３　”　Ｄ　Ｎ　ｒへ領域を含
ｆ−ｆスル、ｐｓＶＥＦＶＩ（欧州特許出願公開第１６
０６１５７号参照）の４０８ｂｐＢａｍｔ（！　−Ｈ１
ｎ旧■断片お上ひ４１６ｂｐＢａｍＨＩ　−Ｐｓｔ　ｌ
断片の号ブクロニングも示されている。

第１１図に、融合第■因子変ｗ体の構築に用いた３成分
ライケーンヨンを示す。２個の異なる断片、ＡおよびＢ
を同じｐｕｃｌ　１８ＢａｉＨＩ　−Ｐｓｔｌ　１３Ａ
Ｐベクターにクローニングした。へ断片は、構築のため
の、ｐＵｃ４０８８Ｆ（の４０８ｂｐｎａａ＋ＩＩ　Ｉ
　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を含有している。［３断片は、
融合領域を含ｆｆするオリゴスクレオチドを包含してい
る。この２本鎖オリゴヌクレオチドを第１１図に示す。

末端制限部位の完全なりＮＡ配列か第１１図に示されて
いるが、実際のオリゴヌクレオチドは、線を引いて示し
た制限部位の塩１人をＮｆｒｌ、ていない。ライゲーシ
ヲン反応の間に小会することを避けるために、これらの
オリゴスクレオチドをキナーゼ処理せずに用いた。

■３断片は、第１１図に示す、ｐＵｃ、８ｄ２８の構築
のためのＩＩ　１ｎｄｌｌｌ−Ｐｓｉ　Ｉオリゴスクレ
オチドである。

第１１図のごとく、Ａ断片とＢ断片をベクターにライゲ
ーシヨンした後、予測される連結部位の配列を、オリゴ
スクレオチドで囲まれた領域の１）ＮＡ配シリ決定によ
つて確認した。

第１２図のごとく、４成分ライゲーンフンにより隻′筺
体発現プラスミドを構築した。第１０図参照の融合プラ
スミドをＢａａＨＩおよびＰｓｔｌで切断し、４４３〜
６０６　ｈｐ断片を単離した１、１１成分ライケージ１
ンの残る３成分は、１）ｐＳＶＥＦ〜１（欧州特許公開
第１６０，４５７号）の１９４４ｂｐＣｌａ　Ｉ　−Ｂ
ａｍＨｌ断片、２）ｐＳ　Ｖ　Ｅ　Ｆ〜・１の２２０２
ｂｐＢａｍｌｌ　Ｉ−Ｘｂａｌ断片をさらにＰｓｔ！て
部分消化し、単離した１７８６ｂｐＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ
断片、および、３）第１０図記・賊のｐＣＩ　Ｓ　２．
　８ｃ２４１）の５８２８ｂｐＸｂａｌ−Ｃ１ａｌ　Ｂ
ＡＰ断片である。

バラグラフ１から６までのに′！括ａ号はｐｃ　ｉ　Ｓ
　２８ｃ２８Ｉ）によっており、そのＣＭｖブロモ−２
−に先行するＥｃｏＲ１部位の最明のＴを塩基計号１と
して表されている。サイトメガロウィルスの１力明プロ
モーターおよびイントロン、４ｔ！び（こＳ■１０複製
起源およびｐｏｌｙＡシグナルは、夫々別々のプラスミ
ドに配された。

ｌ　＋ｆイトメガロウイルスの初期プロモーターを、ｐ
ｃＩｓ２．８ｃ２８ＤのＥｅｏＲ１断片（９９９９−１
２０１）として、ｐＵｃｌ１８のＥｃｏＲＩ部ｆ１’ｌ
にクローニンクシタ［ヤニノシュ・ベロンラ０’、１ｎ
ｉ８ｈ　−Ｐｅｒｒｏｎ）Ｇｅｎｅ３３　：　ｌ　０３
（１９８５）Ｌｉ２個のクローンを取り１−げ、ｐＵｃ
１１８由来の１本鎖Ｄ　Ｎ　Ａが、１２０１位のＥｃｏ
Ｒ１部位から９５〕９位のＥｃｏＲ１部位までの配列決
定を行い１する方向性にあることに関してスクリーニン
グした。このクローンをｐＣＭＶＥ、／Ｉ）と命名した
９、２　部位待−Ｖ的突然変異誘発によってＳＰ（辷グ
Ｊ−ンら（Ｇｒｅｅｎ、Ｍ、　　Ｒ，）Ｃｅｌ１３２　
：６８１６９４（１９８３）］プロモーターを挿入する
ため１：ｐｃ　Ｍ　Ｖ　Ｅ　／　［）から１本鎖Ｄ　Ｎ
　Ａを調製した。

Ｓ　Ｐ　６プロモ一ター配列［Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ
１ｄｓ　　Ｒｅ訳　１２　７０４１（１９８＝１）第１
０参照］を含イト１−る合成１１０ｍｅｒ、　Ｓ　Ｐ　
６プロモーターの−６９から＋５までの配列と、ＣＭＶ
Ｅ／Ｐ配列に対応するオリゴマーのいずれかの末端の１
８ｂｐ断片とを一緒に用いた。突然変異誘発は標準的な
方法で行い、け識したｌＩｏｍｅｒを高ストリンジエン
シーおよび低ストリンジエンシーで用いてスクリーニン
グした。６個の可能性あるクローンを取り上げ、配列決
定した。陽性クローンを同定し、ｐＣＭＶ　Ｅ／Ｐ　Ｓ
　Ｐ　６と命名した。

３．５Ｐ６プロモーターを、例えば、Ｓ　Ｒ６ＲＮＡポ
リメラーゼを加え、適切な大きさのＲＮＡをチエツクす
ることで検査した結果、該プロモーターか活性であるこ
とが示された。

４、ｐＣＭＶＥ／Ｐ（ステップ１）およびｐＣＭＶＥ／
ＰＳＰ６（ステ、ブ２）中の、ｐＵｃ１１８山来のＣＩ
ａ［部位（９１２）からＳｍａ１部位に挿入するために
、Ｃ１ａｌ−３ｍａｌアダプターを作成した。

このアダプターをｐＵｃ１１８のＣ１ａｌ　−Ｓｍａｌ
部位にライゲートし、正しいクローンをスクリーニング
した。両者におけるリンカ−の配列決定を行い、クロー
ンをｐＣＭＶＥ／ＰＳ　Ｒ６−ＬおよびｐＣＭＶＥ／Ｐ
−Ｌと命名した。

５、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−ＬをＳ　ｍａ　［（リンカ
−／ｐＵＣｌ　１８の結合部分）およびＨｉｎｄｌｌｌ
（ｐＵＣＩｌａ中）で切断した。ｐｓＶＯＲＡＡ△Ｒ＋
１１（下記）由来のｌ−１ｐａｌ　（５５７３）からＨ
ｉｎｄ［ＩＩ（６１３６）までの断片をｐＣＭＶ　Ｅ／
Ｐ　Ｓ　Ｐ　６−　ＬのＳ　ｍａ　ｌ　−１（１ｎｄｆ
ｌｌに挿入した。このライゲーションをスクリーニング
し、クローンを単離してｐＣＭ　Ｖ　Ｅ　／　Ｐ　Ｓ　
Ｐ　６−１−−　Ｓ　Ｖ　ＯＲΔＡ△Ｒ１と命名した。

ａ）ｐｃＩｓ２．８ｃ２８ＤからＸｍｎ１（５４７５）
−Ｈｉｎｄｌｌｌ（６１３６）断片としてＳＶ、ｉ０膓
製起源およびｐｏｌｙＡシグナルを中離し、ｐＵｃｌ１
９の１ｌｉｎｄ［ＩからＳ　ｍａ　１部位にクローニン
グした。

これをｐｓＶＯＲＡＡと命名した。

ｂ）　　ＥｃｏＲｒ部分消化、フレノウで充填によって
５７１６位のＥｃｏＲ１部位を除去した。充填後の自己
ライゲーションによって得られたコロニーをスクリーニ
ングし、正しいクローンを単離してｐｓＶＯＲＡＡ△Ｒ
１１ｌと命名した。欠失されたＥｃｏＲ１部位を配列決
定によってチエツクした結果、適正であることが分かっ
た。

ｃ）ｐｓＶＯＲＡＡ△Ｒ１１ｌのＨｐａｌ（５５７３）
−ＨｉｎｄＩＩＩ（６１３６）断片を単離し、ｐＣＭ　
ＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌに挿入した（上記４．参照）。

６、ｐＣＭＶＥ／ＰＳＰ６−Ｌ−３ＶＯＲＡＡ△Ｒ１（
ステップ５）をＥｃｏＲＩ（９９９９位）切断し、充填
した後、自己ライゲーションに付した。

ＥｃｏＲ１部位を持たないクローンを同定し、ｐＲＫと
命名した。

７、ｐＲＫをＳｍａｌおよびＢａａ＋ＨＩで切断した。

この末端をフレノウで充填し、再ライゲーションした。

コロニーをスクリーニングした。陽性コロニーを同定し
、ｐＲＫ△Ｂ　ａｒａ／　Ｓ　ｍａ　３と命名した。

８、コンバーターを用いてｌ−１ｉｎｄｌ１１部位をＨ
ｐａ１部位に変換した。（コンバーターとは１つの制限
部位を他の制限部位に変換するために用いられるＤＮＡ
片である。この場合、１つの末端がＨｉｎｄＩＩ１帖η
末端と相捕的であり、他の末端にＨｐａｌ認識部位があ
る。）陽性クローンを同定し、ｐＲＫΔＢａｍ／Ｓｍａ
、ＨＩＩＩ−Ｈｐａｌ　ｌと命名した。

９、ｐＲＫΔＢａｍ／Ｓｍａ、１ＩＩＩｌ−ｔｌｐａｌ
　ｌをＰｓｔｌおよびＮｏｔｌで切断し、Ｒ１−Ｈ１１
１リンカ−およびＨｌｌｌ−Ｒ１リンカ−をライゲート
した。

６Ｉｌンカーについてのクローンを見出した。しかしな
がら、あまりりにも多くのＨｐａｌルミｌコンバーター
込んでいるということか分かった（２またはそれ以上の
コンバーターによりＰｖｕ１１部位が生成される）。従
って、これらのクローンをＨｐａｔで切断し、自己ライ
ゲーションさせなければならなかった。

ＩＱ、Ｒ１−Ｈ１ｌ＋クローン３およびＨＩＩＩＲ１ク
ローン５をＩｆ　ｐａ　［で切断し、希釈し、自己ライ
ゲーションに付した。陽性のものを同定した。

Ｒ１−Ｈ１１１クローンをｐＲＫ　５と命名した。

実１＋ｉＭ例５　　トランスフェリン−非（ＲＨ性Ｉｎ
　胞の選択 ＤＰフィンシュリン非（１＜　ｉ７性細胞を上記実施例
４記戦のｐＲＫＴＦＮでトランスフェクトした。

トランスフェクンヨンはＳ　ｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅ
ｖｉｎｓＯｎのりん酸力ルンウム共沈法（前掲）によっ
た。トランスフェクトされたｔｍ胞をハイグロマイシン
血、１性について選択した。・飄イグロマインン耐性細
胞のプールをクローニングし、幾つかのクローンを取１
）−トｉｆだ。クローニングにより、連続的な選択段階
で、栄養共生の非生産細胞の可能性か減少される。−ト
記クローンを血請不ａ（３５０ｎ　　ＯｓＩ＋１）トラ
ンスフェリン不ａ　Ｆ　　ｌ　２　／　Ｄ　Ｍ　Ｅ　培
地中で増殖させることにより、トランスフェリンを産生
ずる１′（ＩＩ胞糸系統選択した。Ｆｌ　２　％’　Ｄ
　Ｍ　Ｅは、鉄を添加しないことを除いて、上記の培地
と同様である。しかしながら、これらの条件下、鉄は、
他の培地成分の石純物として導入される（例、水、Ｎａ
Ｃ１等）。この少頃の鉄は、トランスフェリン非存在下
において最適の細胞増殖を支持するには不十分であるが
、おそらく、トランスフェリン−し・セフリー系による
鉄の取り込み効率が増大することにより、トランスフェ
リン存在下では細胞増殖を十分に支持する「マザー（Ｍ
ａｔｈｅｒ、　Ｊ、　　Ｐ、　）およびサトウ（Ｓａｔ
ｏ、Ｇ、　　）Ｌ　）Ｅｘｐｔｌ、　　Ｃｅ１１１＜（
詔１２０１９２１−２００（１９７９）］、ププレノン
−インフッフチＰ　ｒｅｚ　−１ｎｆａｎｔｅ、　Ｕ、
　）おＬびマザー（Ｍａｔｈｅｒ、　Ｊ　、　　Ｐ、　
）、Ｅｘｐｔｌ、　Ｃｅ１ｌＲｃｓ、１４２°３２５−
３３２（１９８２）］、次いで、この血清不含／　’ラ
ンスフェリンー鉄−不３１８地で１−２週間生存した細
胞を、５％抽出ＦＢＳを含んだＦ−１２／ＤＭＥ培地に
取った。次いで、ヒトトランスフェリンを添加した、ま
たは添加していない低鉄培地中で、クローンとトランス
フェクトされていない親細胞系統の増殖を比較すること
により、トランスフェリン非依存性についてクローンを
試験した。トランスフェリン−鉄−不Ａｍ件下で行った
とき、生存し、増殖することのできるクローンを、さら
にスピナーおよびプレート１−で選択した。。

続けて、選択したトランスフェリン非依存性クローンと
トランスフェクトされていない細胞系統との、血清不含
、インシュリンネ倉、トランスフエクト不な、および低
鉄分培地中、インシュリンおよびｌ・ランスフェリンの
存在または非存在丁での増殖を比較することにより、該
クローンをインシュリン非依存性に関して試験した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓ　Ｖ　［ミｔｔ　Ｉ　Ｇ　Ｄ　ＨＦ　Ｒの
構築模式図、第２図はｐｓＶＥＨＩＧＮｅｏの構築模式
図、第３図はｐＣ〜’５ＶＤ２２ｐｒｃＵＫ５４の構築
模式図、第、１図はＯＤＣ発現発現ツクター築模式図、
第５ａ図は、５％全ＦＢＳのζｊ存在下おける２種類の
インンユリンー年債存性細胞系統およびχ・Ｉ照細胞系
統の増殖状態を示すグラフ、第５ｂ図は１％炭素２、・
デキストラン抽出ＦＢＳ中での２種類のインンコリンー
年債ｌ′ｊ性細胞系統および対照細胞系統の増殖状態を
示すグラフ、第６ａ図は０〜１０ａｇ／りの２１囚性イ
ンンユリン（ｊ圧下での、血清不含培地における２、Ｊ
照細胞（ＣＨＯ／Ｄ）ＩＦＲ−、プレプロインシュリン
ネ含）の増殖状態を示すグラフ、第６ｂ図は血清不含条
件ドでの様々なインシュリン濃度におけるクローン７お
よび１２の一般的な増殖状態を示すグラフ、第７図は、
インシュリン非ｒｆ、圧下での血清不含培地におけろＤ
　Ｅ　Ｍ　Ｏブール（１００ａＭ）および、同し条件下
で、Ｃ２［３（χ・１照）よりはるかに高い力価を表す
ことによって証明されたインシュリン非依存性であると
選択すれた非増幅クローン１３Ｃ２Ｂ−プロインシユリ
ン細胞系統（Ｃ１，１３）のインンユリン非行圧下での
血清不含培地における状態を示すグラ乙第８図はトラン
スフェリンをコードしている発現ベクターｐＲＫＴＦの
模式図、第９図はｐＲＫ５の構築模式図、第１０図はｐ
ｃＩｓ２．８ｃ２４Ｄ、ｐＵｃ４０８ＢＨおよびｐＵｃ
４１６ＢＰの構築模式図、第１１図はｐＵｃ８ｄ２８の
構築模式図、第１２図はｐｃＩｓ２．８ｃ２５Ｄ、Ｉ）
ＣＩＳ２゜８ｃ２６Ｄ、ｐｃｉｓ２．８ｃ２７Ｄおよび
ｐＣＩＳ２．８Ｃ２８１）の構築模式図である。 特許出顎人　ジェネンテク。 インニーポレイテノド 代　理　人　弁理士　４山　葆　（外２名）ＣＭＯ／Ｄ
ＨＦＲ−／　７°ロインシ；リンぞ田所ジＣＨＯ１０１
４ＦＲ−／アロ４ンシラリ〉囮！已ＣＨＯ／ＤＨＦＲ一
対・、叩 ＣＨＯｌｏＨＦＫ−／プンンシュリン細肥Ｃ２Ｂ−プロ
インシュリン細月８ ・インシュ・ル２０ｐｇ／ｍ！。 Ｆｔａ、８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、宿主細胞の培養法であって、 ａ、ポリペプチド因子依存性宿主細胞のためのポリペプ
   チド因子を決定し、 ｂ、該宿主細胞を該ポリペプチド因子をコードする核酸
   で形質転換し、 ｃ、該宿主細胞を所望のタンパク質をコードする核酸で
   形質転換し、 ｄ、工程（ｃ）の形質転換細胞をポリペプチド因子を含
   有しない培地で培養することからなる方法。 ２、所望のタンパク質を回収する工程をも含む請求項１
   記載の方法。 ３、培地が血清不含の培地である請求項１記載の方法。 ４、宿主細胞が脊椎動物宿主細胞である請求項１記載の
   方法。 ５、宿主細胞がチャイニーズハムスターの卵巣細胞であ
   る請求項１記載の方法。 ６、ポリペプチド因子がプロインシュリンである請求項
   １記載の方法。 ７、ポリペプチド因子がトランスフェリンである請求項
   １記載の方法。 ８、ポリペプチド因子がトランスフェリンおよびインシ
   ュリンである請求項１記載の方法。 ９、所望のタンパク質とポリペプチド因子とを発現する
   よう形質転換された宿主細胞。 １０、脊椎動物細胞である請求項９記載の宿主細胞。 １１、チャイニーズハムスターの卵巣細胞である請求項
   ９記載の宿主細胞。 １２、ポリペプチド因子がプロインシュリンである請求
   項１１記載の宿主細胞。 １３、２９３細胞である請求項９記載の宿主細胞。 １４、ポリペプチド因子がプロインシュリンである請求
   項９記載の宿主細胞。 １５、ポリペプチド因子がトランスフェリンである請求
   項９記載の宿主細胞。 １６、請求項９記載の宿主細胞と、該宿主細胞によって
   発現されたポリペプチド因子を含有しない培地からなる
   培養物。 １７、培地が血清不含培地である請求項１６記載の培養
   物。 １８、培地中に含有されないポリペプチド因子がインシ
   ュリンである請求項１６記載の培養物。