JPH01120300A - 組換え細胞培養中でのポリペプチド発現の増大法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、組換え宿主細胞によるヘテロローガスなポリ
ペプチドの製造に関するものである。さらに詳しくは、
本発明は、組換え真核細胞の培養物中に生産されるヘテ
ロローガスなポリペプチドの収率を高める方法に関する
ものである。

従来技術ζ＋ｏ味力 多くのポリペプチドが組換え真核性細胞培養物中で生産
されている。そのようなポリペプチドには、例えばプラ
スミノーゲン活性化因子、インヒビン、ＴＧＦ−β、ア
クチビン、プロレラキシン、スーパーオキシド・ジスム
ターゼ、組織因子、崩壊促進因子、ウィルス抗原、およ
びエンケファリナーゼがある。特に興味深いのは、プラ
スミノ−ケン活性化因子、特に、ヒト組織型プラスミノ
ーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）である。この酵素および
そのアミノ酸配列における幾つかの変異体は周知であり
、文献に記載されており、その組換え哺乳類細胞培養中
での製造は一般的となっている。

通常、酵母、繊維状真菌（カビ）、を制動物または無を
制動物等の真核性宿主細胞を所望のポリペプチドをコー
ドする核酸でトランスフェクトし、核酸を取り込んだト
ランスフェクタンツを選択し、所望のポリペプチドを産
生じ得るトランスフェクタンツを同定する。所望のポリ
ペプチドをコードする核酸を増幅しているサブクローン
を選択することにより、最も大量にポリペプチドを産生
ずるトランスフェクタンツを同定することができる。

そのようなサブクローンの選択は、該サブクローンを、
デヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等のマーカー遺伝子
と一緒に、マーカー遺伝子選択試薬を漸増■で含有させ
た培養中で共増幅させて行うのが最も好都合である。ト
ランスフェクトされた核酸が増幅しているサブクローン
は、高められた濃度の選択試薬、例えばＤ　Ｉ−Ｉ　Ｆ
　Ｒの場合にはメトトレキセート、を含有する培地での
継代培養において生き残る能力を有することに基いて同
定される。

メトトレキセートはＤＨＦＲに結合して不活化するので
、より多くのＤ　Ｉ−ｆ　Ｆ　Ｒを必要とするものが確
立される。Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺ｆ云子の増幅により、サブク
ローンは、特定の濃度のメトトレキセー！・の存在下で
増殖できるようになる。この方法により、所望のポリペ
プチドを有用な量、生産する組換え体の調製および同定
か容易になる。

所望のポリペプチドの収率の向上における、上記サブク
ローン選折法の可能性には限界があると思われる。最終
的には、培養物の増殖は悪化し、大量の非生存性で異常
な細胞を含有するに至る。

この状況にも拘わらず、組換えポリペプチドの収率の一
般的な増大を目的とする当業者の努力は、細胞基準での
ポリペプチドの発現レベルを刺激すること、例えば、細
胞当たりのポリペプチド収率を増大するために、より強
力なプロモーターおよびエンハンサ−を使用すること、
に集中していた。

この方法は、細胞の生存性、および増殖性が全細胞培養
からのポリペプチドの総収量に与える影響を無視したも
のである。組換え発酵においては細胞当たりの収率と同
様に、培養物当たりの収率をも増大するこ゛とが望まし
い。発酵のような全資本的な改善の必要性は、培地や労
働力のような操作上の経費の軽減にかかわる。

発酵における細胞密度の増大システムは知られている。

しかしながら、それらのシステムでは装置や培地が増強
されており、経済性は考慮されていない。例えば、連続
的または間欠的な培地交換装置を備えた微少管（マイク
ロチューブ）装置内で発酵を行うと、細胞密度を非常に
高くすることができるが、この発酵は高価につき、再利
用は極めて困難であり、規模の拡張には限界がある上、
おびただしい量の新鮮な媒質が必要である。従って、従
来からの、バッチ方式または連続方式で操作されるタン
ク発酵において、生存可能な細胞密度を高める方法か求
められている。

形質転換された細胞は様々な特徴を示しており、その内
のあるものはある１つの細胞に保有されているが、他の
細胞には保有されていない。一般に、形質転換細胞は不
滅化される。即ち、それらは無限に細胞分裂し得るよう
になり、ある種の形態学上の変化および培養変化を来し
、その内の１つは細胞単層中でのフォーカス形成によっ
て測定される接触阻害の消滅であって、もう１つは、軟
寒天上でのコロニー形成である。しかしながら、全ての
不滅化細胞がヌードマウスで腫瘍を形成するとか、接触
阻害の喪失や軟寒天上でのコロニー形成を示すとは限ら
ない。トランスフェクションとは、宿主細胞の永代の遺
伝子目録（レパートリ−）に核酸を送り込むことである
。本出願の目的から、トランスフェクションと形質転換
とは同意語とみなさないこととする。

形質転換された哺乳類細胞系統（セルライン）は、形質
転換されていない子孫より、プラスミノーゲン活性化因
子をも含めて、プロテアーゼを多量に分泌することが知
られている。これは、形質転換が、化学的発がん他物質
またはウィルス感染のいずれによって引き起こされたか
、ということとは無関係におこるようである［デュッフ
ィーら（Ｍ、　ＤｕｆＴｙ）“Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ、　Ｏｎ、ｃｏｌ、　〃２０（５）：　５７７−８２
（ｉ９８４）、イツセロフら（Ｒ，ｌ５ｓｅｒｏｆｆ）
“Ｊ、　　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅａｍａｔｏビ８０（４
）：　２１７−２２（ｉ９８３）、グリーンら化。

Ｇｒｅｅｎ）“Ｃａｒｅ　ｉｎｏｇｅｎｅｓ　ｉｓ”７
（３）：　４７７−８０（Ｍａｒ、、１９８６）、ラン
プノドら（Ｂ、　Ｒａ、１ｐｕｔ）”５ｃｉｅｎｃｅ″
Ｎｏｖ、　８゜１９８５：　　ｐ、　６７２、メイジャ
ーら（Ｅ、Ｍａｊｏｒ）　”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”　１３
６（２）：　３５９−６７（ｉ９８４）、オツド不ル−
トーミイーら（Ｊ、Ｏ’ｄｏｎｎｅｌｌ−Ｔｏｒｍｅｙ
）　”Ｃｅ１ｌ”、　　２７（ｌＰｔ。

２）：　８５−９５（ｉ９８１）、ソリツクら（Ｊ、５
ｏｒｉｃ）　”Ｂｉｏｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、
　　Ａｃｔａ、”　７１９（３）＋　４３８−４３（ｉ
９８２）、ワインバーブら（Ｍ、　Ｗａｉｎｄｅｒｇ）
　”Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃ１１ｎ、　Ｏｎ
ｃ硅”１８（６）：　　５４５−５１（ｉ９８２）］。

実際、プラスミノーゲン活性化因子の分泌増大は、形質
転換の指枕の１つとして利用されている［ジオンデイら
（Ｅ、　Ｇｉｏｎｔ　ｉ）“Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｃｍ、
”　２５８ニア１９０（ｉ９８３）、ナカムラら（Ｋ、
　Ｎａｋａｍｕｒａ）　”Ｍｏ１．　Ｃｅｌ　ｌ　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｐ　２（２）：　１４Ｌ−５３（ｉ９８２）］
。しかしながら、スクライバ−ら（Ｌ、５ｋｒｉｖｅｒ
）　”Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、”　１２４（２）
：　４０９−１４（ｉ９８２）およびニールセンら化、
Ｎ１ｅｌｓｅｎ）　”Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ”　２
１（２５）：　６４１０−５（ｉ９８２）は、プラスミ
ノーゲン活性化因子は、酵素的に不活化された形で形質
転換体から分泌されるかもしれないと報告しており、ま
た、形質転換されたクローンの全てが、実際にプラスミ
ノーゲン活性化因子を産生ずるわけではないという他の
観察も報告されている［工ンシェルスーカノら（Ｅ、　
Ａｎｇｌｅｓ−Ｃａｎｏ）　”Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎ
ｃｅｒ″３３（２）：　２７７−８０（ｉ９８４）およ
びセルニ（ｃ，Ｃｅｒｎｉ）“Ｏｎｃｏｌｏｇｙ”　４
１（５）：　（ｉ９８４）’ｌ。内因性プラスミノ−ケ
ン活性化因子の発現量の増大が、最終的に特定のウィル
ス遺伝子または他の細胞機構に帰されたわけではないか
′、シスト不ン（Ｓ　１ｓｔｏｎｅｎ）らは、ヒトｃ−
［（ａ−ｒａｓＶａｌ　　１２腫瘍遺伝子とネオマイシ
ンホスホトランスフェラーゼ遺伝子によってトランスフ
ェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞が、フォーカスまたは
コロニー（形質転換の指標）を形成したが、大量のｃ−
）（ａ−ｒａｓＶａｌを発現した細ｌＩ包は、そのアク
チンおよびフィフ゛口不りチンネノトワーク（網状構造
）を失い、プラスミノーゲン活性化因子活性の増大を示
していることを認めたしシストネンら（Ｓｉｓｔｏｎｅ
ｎ）、”Ｅｘｐ、Ｃｅｊｌ　Ｒｅｓ”１６８　（２）：
５１８−３０（Ｆｅｂ、、１９８０）］。

腫瘍遺伝子は、形質転換された性質を宿主に付与するヌ
クレオチド配列である。−船釣に、それらはウィルスの
核酸（ｖ−ｏｎｃ）、または細胞性ＤＮＡ（ｃ−ｏｎｃ
またはプロト（原）腫瘍遺伝子）から導かれる。通常、
Ｖ−ＯｎＣ類は、予め、ｃ　　ｏｎｅ遺伝子またはその
変異体を捕獲（カブチュアー）したか、導入（トランス
デユース）されたレトロウィルスベクターのゲノム要素
（エレメント）に結合した、■またはそれ以上の、正常
な、または切り詰められた、あるいは変異したｃ　　ｏ
ｎｃ遺伝子の特殊なサブッセソトからなるハイブリッド
である。以下の表に示すように、多くの腫瘍遺伝子が知
られている［ＰａｐａＳらのアッション（Ｒ、Ａ　ｓｃ
　１ｏｉｅ）編、「遺伝子増幅および分析」第４巻、２
５７頁（ｉ９８６）から］。

（以下余白） これまでは、腫瘍遺伝子は集中的な研究の中心であり、
少なくともその研究の幾分かは、がん治療のための治療
上の手段として、腫瘍遺伝子を不活化または阻害するで
あろうという商業的な目的で、または診断試験を計画す
る目的でなされてきた。しかしながら、腫瘍遺伝子自身
には殆んど商業的な利用価値はない。

本発明の目的は、組換え細胞培養物におけるポリペプチ
ドの力価（容量あたりの収量）を高めることにある。

また、本発明は、組換え細胞培養物からのポリペプチド
の収量を、細胞基準で増大することを目的とするもので
ある。

また、本発明は、バッチタンク発酵における組換え細胞
培養からのヘテロローガスなポリペプチドの分泌を促進
する方法に関するものである。

また、本発明は、組換え真核性細胞培養における生細胞
（ｖｉａｂｌｅ　　ｃｅｌｌ）の密度を増大することを
目的とするものである。

これらの、または他の目的は、本発明全体を考慮すれば
、当業者には明らかとなるであろう。

本発明の目的は、（ａ）所望のポリペプチドをコードす
る核酸と腫瘍遺伝子とによって真核性の親細胞をトラン
スフェクトし；（ｂ）親宿主細胞より多量の、培地容量
当たりの所望のポリペプチドを生産するステップ（ａ）
のトランスフェクタンツを同定することからなる方法に
より達成された。

本発明においては、ステップ（ｂ）におけるトランスフ
ェクタンツを、所望のポリペプチドが培養物中に蓄積さ
れるまで培養した後、所望のポリペプチドを培養物から
回収することが好ましい。

本発明の目的達成には、（ａ）真核性の親宿主細胞を、
（ｉ）ヒ組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）
をフードする核酸と（ｉｉ）腫瘍遺伝子とによってトラ
ンスフェクトし；（ｂ）親宿主細胞より多量の、培地容
量当たりのｔ−ＰＡを生産するステップ（ａ）のトラン
スフェクタンツを同定することからなる方法が好ましい
。

本発明はまｌこ９、（ａ）ヘテロローガスなプロモータ
ーの転写コントロール下にある腫瘍遺伝子と、（ト）所
望のポリペプチドをコードする遺伝子、および（ｃ）所
望のポリペプチドを含有する培養培地からなる宿主細胞
培養物を提供するものである。

驚くべきことには、腫瘍遺伝子の発現レベルと所望のポ
リペプチドの収量の増大とは関連性がないよってある。

再生産性ある割合（４／４６）の、ｖ−ｓｒｃ遺伝子を
伴ったトランスフェクタンッは、（＋）キナーゼ分析に
よる測定における陽性クローンがｖ−ｓｒｃタンパク質
を極（少量しか発現しないか、またはｖ−ｓｒｃタンパ
ク質を全く発現せず、（２）幾つかのクローンは大組に
ｖ−ｓｔｃタンパク質を発現するが、ポリペプチドの発
現増大は示さない、にもかかわらず、ポリペプチド発現
の増大を示した。しかしながら、高収率のクローンは腫
瘍遺伝子をコードする、そのＤＮＡ配列を含有している
。

従って、本発明者らは、腫瘍遺伝子の発現ではなく、む
しろポリペプチド収率の増大に関してトランスフェクタ
ンッをスクリーニングすべきであると結論した。高収量
のｔ−ＰＡは、本発明の好ましいトランスフェクタンッ
により製造され、それはおびただしい量のへテロローガ
スｔ−ＰＡを分泌し、そのｔ−ＰＡは完全な活性を有し
ていた。

意外にも、トランスフェクタンッのゲノム内に腫瘍遺伝
子のＤＮＡを検出し得るという事実を別にして、高収率
の腫瘍遺伝子トランスフェクシンツは、親細胞系統の特
性を凌駕する、より優れた、検出可能な他の形質転換特
性を獲得していなかった。

以下に、図面について説明する。

第１図はヒトプレプロインシュリンの発現ベクターであ
って、所望のタンパク質の製造のためのインシュリン非
依存性細胞系統の樹立に用いられた、ｐＳＶＥＨＩＧＤ
ＨＦＲの構築模式図である。

第２図はヒトプレプロインシュリンの発現ベクターであ
って、所望のタンパク質の製造のためのインシュリン非
依存性細胞系統の樹立に用いられた、ｐｓＶＥＨＩＧＮ
ｅｏの構築模式図である。

第３図ｆｉｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲの構築に用いられた
プラスミド、ｐＣＶＳＶＤ２２／ｐｒｅＵＫ５４の構築
模式図である。

第４図はオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）ａｆ
ｉ子およびコトランスフェクト（同時トランスフェクシ
ョン）されたプレプロインシュリン遺伝子の増幅のため
に用いられるＯＤＣ発現ベクターの構築模式図である。

本発明は、高価な発酵装置や培地交換に頼らず、生細胞
の密度を増大し、所望のポリペプチドの全培養あたりの
収量を高めるために、遺伝的に［ｒ飾された宿主細胞を
用いることを特徴とするものである。こうして、培地容
量あたりの細胞生産性が高められ、収益の増大が可能と
なったので、本発明の改良は、真核細胞培養に新らしい
分野を打ち問いたとといえる。この目的を具現化し得る
腫瘍遺伝子なら何でも本発明に用い得る。

本発明の目的において、腫瘍遺伝子とは、それを用いて
宿主細胞をトランスフェクトした場合、腫瘍遺伝子で形
質転換される以前の宿主細胞と同一パラメーターについ
て比較したとき、１び濁培養物の飽和密度、特異的生産
性、並びに想濁培養物の細胞生存率が改善されるような
核酸を指すものと定義する。飽和密度とは、ある一定の
培養条件下で達成し得る、特定の培地の容量あたりの最
大細胞数を指す。細胞の生存率とは、特定の飽和密度に
おいて生存し得る、即ち、増殖し、複製し得る細胞の密
度を指す。本発明方法によれば、生細胞密度は、同じ条
件下で親宿主細胞培養物から得られる細胞生存率の約１
．５〜１０倍の増加、飽和培養細胞密度は約１．１〜４
倍の増加が達成され得る。最後に、本発明方法によれば
、親細胞系統と比較した場合、特異的生産性（細胞あた
りのタンパク質の生産性）が増大される。上記のごと（
、多くの腫瘍遺伝子が知られており、将来、他の腫瘍遺
伝子が知られるようになるであろう。それらは、飽和密
度の向上、特異的な生産性、および培養物の生存性から
なる特徴の少なくとも１つ、好ましくはこれらの特徴全
てを付与するものである限り、すべて、本発明に有用で
ある。

宿主細胞の密度と生存性を至適化するために、宿主細胞
は腫瘍遺伝子と適合していなければならないということ
が本発明者らの経験から分かった。

このことは、−団の腫瘍遺伝子（例えば、上記表１に記
載の様々なりラスから選択される各腫瘍遺伝子）で宿主
細胞をトランンスフェクトし、該細胞を培養し、目的と
するポリペプチド合成レベルの増大に関してトランスフ
ェリンツを分析することで、所望のポリペプチドを合成
し、かつ分泌する宿主細胞を得るという典型的な方法で
達成することができる。通常のポリペプチド分析法、例
えば、適切な免疫的、または酵素的手法を用いて所望の
ポリペプチドの収量の増大を測定すればよい。従って、
ある宿主細胞にとって有効な腫瘍遺伝子または腫瘍遺伝
子類が他の宿主細胞にとっては有用でないかもしれない
。好適な腫瘍遺伝子は、実施例記載の常套手段のスクリ
ーニング法で選択されることになろう。例えば、ｙ−ｓ
ｒｃおよび、それよりわずかではあるがｖ−ｍｙｃは、
インシュリン依存性ＣＨＯトランスフエクタンッによる
ｔ−ｐＡ収量を増大するが、ｖ−ｆｏｓおよび活性化ｃ
−Ｈａ−ｒａｓは実験条件下ではそのような作用を示さ
なかった。

宿主細胞を、さもなくば培養培地に添加しなければなら
ない物質からの非依存性増殖を付与するポリペプチド因
子、即ち、宿主細胞に自律性を付与する因子、をコード
するＤＮＡでトランンスフェクトしてもよい。そのよう
な物質の例として、インシュリン、プロインシュリン、
線維芽細胞成長因子、血小板誘導成長因子（それは腫瘍
遺伝子としても作用する）、ＥＧＦ　　ＴＧＦ−α、ト
ランスフェリン、およびレセプター類、レセプター類似
体、またはそのための形質導入タンパク質（そのうちの
あるもの、例えば、ｖ−ｅｒｂＢおよびＨｅｒ−２は腫
瘍遺伝子と考えられている）を挙げることができる。例
えば、多くのポリペプチドに生産に好適な宿主であるＣ
ＨＯ細胞はインシュリンおよびトランスフェリン依存性
であるが、プロインシュリンおよびトランスフェリンを
コードするＤＮＡ配列で形質転換するとインシュリンお
よびトランスフェリン非依存性になる。ポリペプチド因
子からの独立性を付与する核酸は、腫瘍遺伝子または所
望のポリペプチドをコードする核酸によるトランンスフ
ェクションの前、後または同時に宿主細胞に導入するこ
とができる。

本発明の範囲内に包含される宿主細胞は、有核細胞、通
常、多細胞生物由来の細胞であって、哺乳類細胞が好ま
しいが、昆虫、植物、または池の高等真核生物細胞であ
ってもよい。これらの細胞は、生産すべき所望のポリペ
プチドとは異なる種から得られるものであってもよい。

例えば、所望のポリペプチドはヒトポリペプチドであり
、宿主細胞は下等動物に由来していてよい。しかしなが
ら、ヒト細胞トランスフェリンツを排斥するものではな
く、むしろ多くの場合に好ましい。

宿主細胞は、通常、不滅化されている。すなわち、それ
らは安定化された細胞系統である。適当な宿主細胞には
、５Ｖ４Ｑで形質転換されたサル腎ＣＶＩ系統（ｃＯ３
−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ヒト胚性腎細胞系統
（２９３、グラハムら（Ｇｒａｈａｍ、　　Ｆ、Ｌ、）
Ｊ、Ｇｅｎ、　　Ｖｉｒｏｌ、３６　５９　−［１９７
７］）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣＣ
ＣＬ　１０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞−ＤＨ
ＦＲ（ウーラウブ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチャッシン（
ｃＨａｓｉｎ）、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７ヱ４２１６［１
９８０コ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、マーサー（
Ｍａｔｈｅｒ、　　Ｊ、Ｐ、）Ｂｉｏｌ、　　Ｒｅｐｒ
。

ｄ、λ旦　２４３−２５１［１９８０］）、サル腎細胞
（ｃＶｌ、ＡＴＣＣＣＣＬ　　７０）、アフリカミドリ
ザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８
７）、ヒト頚部がん細胞（ＨＥＬＡ。

ＡＴＣＣＣＣＬ２）、イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ３４）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ　　
３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ　ｌ
　３８、ＡＴＣＣＣＣＬ７５）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ
２．８０６５）、マウス乳がん（ＭＭＴＯ６０５６２、
ＡＴＣＣＣＣＬ５１）、ラット肝がん細胞（ＨＴＣ，Ｍ
ｌ、５４、バウマンら（Ｂａｕｍａｎｎ、　　Ｈ，）Ｊ
、Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ、　　８５　１−８、［１９
８０］）、およびＴＲ−Ｉ細胞（マーサーら（Ｍａｔｈ
ｅｒ、　　Ｊ、Ｒ，）Ａｎｎａｌｓ　　Ｎ、Ｙ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ。

ｌ１３−　４４−６８［１９８２］）がある。

発現ベクターは宿主に核酸を導入し、該宿主によりそれ
を発現させるものである。発現ベクターは、必ずしも魔
製可能でなくてもよいが、この性質はベクターを大量調
製するためには好都合である。ベクターは、基本的な重
要物質（ポリペプチド因子類、所望のまたは生産物ポリ
ペプチド、選択マーカー、腫瘍遺伝子等）の遺伝子（類
）を、プロモーターのコントロール下、複製および翻訳
に必要な他の成分と一緒に含有しているであろう。

一般に、ベクターはｍＲＮＡの発現に影響する、転写終
止配列を含有している。これらの領域は、所望のへテロ
ローガスタンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳領域
内のポリアデニル化セグメントとして転写される。３′
非翻訳領域もまた、転写終止部位に包含される。

発現ベクターは、１またはそれ以上の選択遺伝子、選択
可能なマーカーとも称する、を含有している。選択遺伝
子はベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増
殖に必要な、ときには第２タンパク質と称されるタンパ
ク質をコードしている。哺乳類細胞にとって好適な選択
マーカー類を例示すると、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）、チミジンキナーゼまたはネオマイシンである。

そのような選択マーカーが哺乳類宿主細胞にうまく導入
されると、トランンスフエクトされた宿主細胞は、選択
圧の下に置かれた場合に生き残ることができる。選択方
法には、明確に区別される、広範な２種類（カテゴリー
）の方法がある。第１カテゴリーは、細胞代謝に基盤を
置いており、補充培地から独立して増殖する能力を持た
ない変異細胞系統を用いる方法である。例として、ＣＨ
ＯＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞の２つがあ
る。これらの細胞は、チミジンやヒボキサンチンのよう
な栄養物の添加なしに増殖する能力を持たない。これら
の細胞は、ヌクレオチド合成経路を完結するのに必要な
ある種の遺伝子を欠くために、この不足するヌクレオチ
ドが補充培地に供給されないと生存することができない
のである。培地に補充する方法に代えて、無傷のＤＨＦ
Ｒ遺伝子またはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠い
ている細胞に導入し、それらの増殖における要求を変化
させる方法がある。ＤＨＦＲ遺伝子またはＴＫ遺伝子で
形質転換されなかった個々の細胞は、補充のない培地で
は生き残ることができない。従って、補充栄養物の不在
下で増殖する細胞を求めることによって、そのような細
胞の直接選択が行なわれる。

第２のカテゴリーはあらゆる細胞型に適用可能であって
、変異細胞系統を用いる必要がない選択計画方法、即ち
、優性選択法である。通常、これらの方法には、宿主細
胞の増殖を阻害する薬物を用いる。新規な遺伝子を含有
する細胞は薬物耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択
において生き残るであろう。

その様な顕著な薬物を用いる選択法には、ネオマイシン
［サザーン（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｐ　）およびバ
ーブ（Ｂ　ｅｒｇ、　　Ｐ　、　）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ
　　２０９．１４２２（ｉ９８０」またはハイグロマイ
シン［サジエンら（Ｓ　ｕｇｄｅｎ、　Ｂ、　）、Ｍｏ
１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：　４１Ｏ−４１３
（ｉ９８５）］を用いる。

その様な顕著な薬物を用いる選択法には、ネオマイシン
［サザーン（Ｓ　ｏｕｔｈｅｒｎ、　　Ｐ　）およびバ
ーブ（Ｂｅｒｇ、Ｐ、）、Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ　　２０９
．１４２２（ｉ９８０］またはハイグロマイシン［サジ
エンら（Ｓ　ｕｇｄｅｎ、　Ｂ　、　）、Ｍｏ１．　Ｃ
ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５：　４１０−４１３（ｉ９８
５）］。上記の３例では適当な薬物、それぞれ、ネオマ
イシン（０４１８またはジェネチシン）、ｘｇｐｔ（マ
イコフェノール酸）またはハイグロマイシンに対する耐
性を伝えるために、真核性のコントロール下、細菌性遺
伝子を使用している。

ベクターはコントロール領域、即ち、転写または翻訳の
いずれかのコントロールに関係する真核性遺伝子の５°
または３°末端の特異な配列を含有していてもよい。実
際、全ての真核性遺伝子か転写開始部位から約２５〜３
０塩基上流に、転写が開始される部位であるＡＴに富ん
だ配列を有する。

転写開始部位の７０〜８０塩基上流に見出される他の配
列はＣＸＣＡＡＴ領域（ここにＸは何であてもよい）で
ある。大多数の真核性遺伝子の３′末端にはＡＡＴＡＡ
Ａ配列があり、これは転写されたｍＲＮＡの３′末端に
ポリアデニル化テールを付与するためのシグナル配列で
あるらしい。

ベクターは、転写開始シグナルとしてＲＮＡポリメラー
ゼ分子に認識されるヌクレオチドセグメントであるプロ
モーターを含有している。哺乳類宿主細胞内でベクター
からの転写をコントロールするプロモーターは様々な供
給源、例えばウィルス由来のゲノム、即ち、ポリオーマ
、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス
、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルスおよびサイトメガ
ロウィルス、またはベーターアクチンプロモーターの如
きヘテロローガスな哺乳類起源から得られる。

ＳＶ４０ウィルスの早期および後期プロモーターは５Ｖ
４Ｑウイルスの複製起源をも含有している５Ｖ４Ｑ制限
断片として都合よく得られる［ファイヤーズら（Ｆ　１
ｅｒｓ）、１９７８”ネイチャー”２７３：１．１３］
。ヒトサイトメガロウィルスの直（イメディエイト）初
期プロモーターは、ＨｉｎｄｌＩ［ＥＩＪ限断片として
好都合に得られる［グリーンナラエイら（Ｇｒｅｅｎａ
ｗａｙ、　Ｐ、　　Ｊ　、　）、Ｇｅｎｅｌ　８．３５
５−３６０（ｉ９７８）コ。勿論、本発明においては、
宿主細胞またはその近縁種から得られたプロモーターも
有用であることは当然である。プロモーターは発現され
るべき遺伝子、例えば選択マーカーとライゲート（連結
）される。プロモーターの方向性および位置は当業者に
既知である。

ベクターは所望によりエンハンサ−１通常約１Ｏ−３０
０ｂｐのｃｉｓ作用をするＤＮＡ要素であって、プロモ
ーターに作用し、その転写を増大する要素である、を含
有していてよい。より高等な真核細胞による、所望のへ
テロローガスタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、
エンハンサ−配列をベクターに挿入することによって増
強される。

エンハンサ−は、比較的、方向性や位置に非依存性であ
り、転写単位の５°側［レイミンスら（Ｌｅｉｍｉｎｓ
、　Ｌ、　）ＰＮＡＳ　７８．９９３（ｉ９８１）１お
よび３′［ラスキーら（Ｌｕｓｋｙ、Ｍ、　　Ｌ、　）
Ｍａｉｌ、　　Ｃｅ１Ｉ　　Ｂｉｏ、　　３．１１０８
（ｉ９８３）］、またはイントロンの中［パネルジー（
Ｂａｎｅｒｊｉ、　Ｊ、　　Ｌ、　）Ｃｅ１１３３．７
２９（ｉ９８３）］または暗号配列の中［オスポーン（
Ｏｓｂｏｒｎｅ、Ｔ、　　Ｆ、　）Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ
　　Ｂｉｏ。

４．１２９３（ｉ９８４）］に見出されている。今日、
叩乳類遺伝子由来の多くのエンハンサ−が知られている
（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプ
ロティンおよびインシュリン）。

しかしながら、一般に、真核細胞ウィルス由来のエンハ
ンサ−を用いることになろう。その様な例としてＳＶ４
０の複製起源（ｂｐｌｏｏ〜２７０）の後期部位に存在
するエンハンサ−、サイトメガロウィルスの初期プロモ
ーターのエンハンサ−、ポリオーマ−の複製起源の後期
部位に存在するエンハンサ−１並ヒにアデノウィルスの
エンハンサ−が含まれる。

“増幅”という語句は、細胞の染色体ＤＮＡ内の、単離
された領域が増加または複製されることを意味する。増
幅は、選択物質、例えばＤＨＦＲを不活化するメトトレ
キセート（ＭＴＸ）のような物質の存在下で達成される
。Ｄ　ＨＦ　Ｒ遺伝子の増幅、またはＤ　ＨＦ　Ｒ遺伝
子の連続的なコピー作成により、多量のＭＴＸの存在下
でも、多量のＤＨＦＲが産生されることになる。より多
くのＭＴＸを添加することで、内因性ＤＨＦＲが存在し
ていても、増幅圧が課される。所望のタンパク質をコー
ドするＤＮＡと、Ｄ　ＨＦ　ＲをコードするＤＮＡまた
は増幅遺伝子を有するプラスミドで哺乳類宿主細胞をコ
トランスフェクトし、同時組込みを起こさせることによ
り、所望の遺伝子の増幅を達成することができる。より
多量のＭＴＸ′ａ度下で連続的に循環して増殖し得る細
胞を選択するだけで、より多くのＤＨＦＲを必要とする
細胞、その要求は選択遺伝子の複製によりかなえられる
が、を確保することができる。所望のタンパク質をコー
ドする遺伝子を、増幅可能な遺伝子と一緒に同時組込み
する限り、この遺伝子の複製により、所望のタンパク質
をコードする遺伝子の痕製が増大されることになる。そ
の結果、所望のタンパク質をコードしている遺伝子（即
ち、増幅された遺伝子）のコピー数が増加し、所望のタ
ンパク質が多く発現されることになる。

“トランスフェクション”という語句は、実際になんら
かの暗号配列が発現されるか否かには関係なく、宿主細
胞に発現ベクターか取り込まれることを意味する。当業
者は多くのトランスフェクション法を知っており、それ
らには、例えば、ＣａＰＯ４法および電気穿孔法がある
。宿主細胞内で、このベクターの機能が生起されたとこ
とを示すなんらかの徴候が認められたならば、通常、ト
ランスフェクションは成功といえる。しかしながら、本
発明との関係においては、トランスフェクションとは、
普通、各世代に渡って、宿主培養中に腫瘍遺伝子が安定
に組込まれることを指すものとする。

所望のポリペプチドには、約５残基という残基数の少な
いものも含まれるが、通常はタンパク質である。所望の
ポリペプチドは、植物、微生物または動物の任意の撞に
由来するもの、あるいはそれらは変異体であってもよく
、または自然界に対応物のない合成ポリペプチドであっ
てもよい。通常、ポリペプチドは治療上有用な動物タン
パク質、好ましくはヒトタンパク質である。所望のポリ
ペプチドとして最も行き渡っているのは、酵素およびホ
ルモンである。例えば、そのようなポリペプチドには、
インヒビン、ブラスミ／−ゲン活性化因子、ＴＧＦ−β
。アク手ビン、プロレラキシン、過酸化物ジスムターゼ
、組織因子、崩壊促進因子、ウィルス抗原またはエンケ
ファリナーゼがある。

好ましいポリペプチドはヒトｔ−ＰＡである。

本発明に従って構築された宿主−ベクター系を、問題の
宿主細胞に適した条件および培地で培養する。それぞれ
の宿主−ベクター系が、最もよく機能するために必要な
培地は異なっており、最適な培養培地の選択は通常の技
術範囲であるということは理解されるであろう。同様に
、温度、通気性マおよびガス含有量等の他の培養パラメ
ーターも通常の実験上の事柄である。

生細胞の定量は、通常の方法のいずれによっても行うこ
とができるが、トリブトファンンブルー染色を行った後
、血球計数機で測定する方法が好ましい。一般に、生細
胞の分析は、培養物の密度が飽和に達したとき、ＣＨＯ
細胞の場合には培養後約７日目、に行われる。腫瘍遺伝
子の影響は、最大密度を得ること、および飽和培養物中
に健康な生細胞の占める割合が最大である、という意味
で、飽和相の期間中に最も大きい。

実施例の記載を簡単にするため、頻繁に用いられる方法
または語句を説明する。

“プラスミド”は小文字のｐを先頭にし、モして／また
は大文字および／または数字を続けることによって表わ
される。本発明の出発物質であるプラスミドは市販され
ているか、または非制限的な施設から一般に入手可能で
あり、あるいはこの様にして入手し得るプラスミドから
、公知の方法に従って組立てることができる。更に、そ
の他の同等なプラスミドも当業者には知られており、通
常の技術者にとって自明であろう。

ＤＮＡの“消化″とは、ＤＮＡを、該ＤＮＡのある位置
に対してのみ作用する酵素で触媒的に開裂することを指
す。本発明において用いる様々な制限酵素は市販されて
おり、その反応条件、コファクター、およびその他必要
なものは、当業者既知のごとくにして用いた。分析目的
のためには、通常、プラスミドまたはＤＮＡ断片１μｇ
と約２単位の酵素を、緩衝液約２０μＱ中で用いる。プ
ラスミドの構築のためにＤＮＡ断片を単離する目的の場
合には、通常、さらに多量の緩衝液中で、ＤＮＡ５〜１
０μｇを酵素２０〜４０単位により消化する。特定の制
限酵素にとって適切な緩衝液および基質の量は製造者に
より明示されている。−般に、インキュベーション時間
は３７°Ｃで１時間が採用されるが、供給者の教示に従
って変わり得る。消化後、反応混合物を直接ゲルに適用
して所望の断片を単離する。

“脱りん酸化″とは、細菌性アルカリホスファターゼ（
ＢＡＰ）処理により、５′末端のりん酸が除去されるこ
とを意味する。この工程により、他のＤＮＡ断片の制限
酵素切断部位への挿入に妨げとなり得る、ＤＮＡ断片の
両制限末端が「閉環」または閉じたループを形成するこ
とを防止する。脱りん酸化の方法および試薬は常法通り
である［マニアティスら（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ、　Ｔ　
）、Ｃ３ＨＬ（ｉ９８２）Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　（ン
１ｏｎｉｎｇ　　１３３　１３４頁］。ＢＡＰを用いた
反応は、酵素製品中に存在している可能性のあるエキソ
ヌクレアーゼの作用を抑制するために、５部ｍＭ　　Ｔ
ｒｉｓ中、６８°Ｃにおいて行なわれる。反応は１時間
行なわれる。反応後、ＤＮＡ断片をゲル精製する。“オ
リゴヌクレオチドとは、短い一本鎖または二本鎖ポリデ
オキシヌクレオチドであって、既知の方法によって化学
的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲル上で精う
ソされたものである。

“ライゲーション（結合）”とは、２個の２本鎖核酸断
片の間にホスホジエステル結合を形成する工程を言う（
Ｔ、マニアティスら、前掲ｐｉ　４６）。

特に明示しない限り、ライゲーションは既知の緩衝液と
条件を使用し、ライゲートすべき適当な等モル■のＤＮ
Ａ断片０．　５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーゼく“リガ
ーゼ”）１０単位を用いて行う。

“充填（フィリング）”または“平滑末端化（プランデ
ィング）”とは、制限酵素で開裂した核酸の粘着末端の
一本鎖末端を二本鎖に変換する工程を指す。

このことにより、粘着末端が消滅して平滑末端か形成さ
れる。この工程は、１個またはほんの少数の他の制限酵
素によって作られた末端とのみ結合し得る制限的な切断
末端を、あらゆる、平滑に切断する制限エンドヌクレア
ーゼで形成された末端または池の充填後の粘着末端に適
合し得る末端に変える上で多方面に利用可能な手段であ
る。一般に、平滑末端化は、目的とするＤＮＡ２〜１５
μ９を、ＤＮＡポリメラーゼ■のフレノウ断片８単位と
４種類のデオキシヌクレオチドトリホスフェート各２５
０μＭの存在下、１０ｍＭ　　ＭｇＣ（！−１１ｍＭジ
チオトレイトール、５０ｍＭ　　ＮａＣＱ、ＩＱｍＭト
リス（ｐＨ７，５）バッファーの混液中、３７°Ｃでイ
ンキュベートすることにより行われる。

通常、３０分後にフェノールおよびクロロホルムで抽出
し、エタノール沈澱に付すことによりインキュベーショ
ンを終了する。

Ｍノ−ザーン”プロッティングとは、既知の、標識した
オリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ断片とのハイブリザイ
ゼーションにより、細胞性ｍＲＮＡのｔｊ在を確認する
方法である。本発明においては、特に明記しない限り、
ノーザーン分析とは、変性剤（７％ホルムアルデヒド）
の存在下、１％アガロースゲル上でｍＲＮＡを電気泳動
的に分離し、標識した断片とのニトロセルロース上での
ハイブリザイゼーションに付すことを意味するものとす
る［マニアティスら、前掲、２０２頁］。

以下に実施例を挙げ、本発明の詳細な説明する。

たたし、これらの実施例は本発明を制限するものではな
い。

実施例１　インシュリンオートクリン（Ａ　ｕｔｏｃｒ
ｉｎｅ）細胞系統Ｃ２Ｂ１３の構築 Ａ）ヒトプロインシュリン発現ベクターの構築インシュ
リン遺伝子のｃＤＮＡクローン、ｐＨ１３を用いて、ト
ランスフェクトしｌ；哺乳類細胞内でヒトのプレプロイ
ンシュリン遺伝子を発現させるためのプラスミドを構築
した。ＳＶ４０プロモーター、ヒトプレプロインシュリ
ンをコードしているｃＤＮＡＳＢ型肝炎ウィルス表面抗
原のポリアデニル化部位、並びにマウスのジヒドロ葉酸
還元酵素をコードしているｃＤＮＡを含有するベクター
、ｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲを構築した。

インシュリン非依存性宿主細胞系統の樹立に用イタプレ
プロインシュリン発現ベクターの構築工程図を第１図に
示す。３部からなるｐＳＶＥＨＩＧ構築方法を以下に説
明する。

ａ）ｐＳＶＥＨＩＧＤＩ（ＦＲ １）　ヒトプレプロインシュリンをコードしているｃＤ
ＮＡを、ｐＨ１３から、（Ｎｃｏｌ　−ＸｈｏＩＩ）消
化により、４４０ｂｐ断片中に得た。ｐＨＩ　３はシュ
ア−ら（Ｓｕｒｅｓ、　１．　）のＳ　ｃｉｅｎｃｅ２
０８　＋　５７（ｉ９８０）に記載されている。プレプ
ロインシュリンをコードしているｃＤＮＡを含有する４
４０ｂｐ断片を単離した。

２）インシュリンレセプタープラスミド（ｐＣＶＳＶＥ
−ＨＩ　ＲＩｃ２、欧州特許公開Ｎｏ、０１９２３９２
．１９８６年８月２７日公開）の５′末端から６３ｂｐ
Ｘｂａｌ−ＮｃｏＩ断片を単離した。この断片は、プレ
プロインシュリンをコードしているｃＤＮＡの５′末端
を５Ｖ４Ｑ初期プロモーターに融合するためのリンカ−
アダプターとして機能する。

３）ベクター、ｐＣＶＳＶＤ２２／ｐｒｅＵＫ５４は、
６５ｂｐリンカ−およびプロインシュリン遺伝子の暗号
配列とライゲートされるプラスミドバックボーンを提供
するものであるが、以下のようにして構築された。ｐＣ
ＶＳＶＤ２２／ｐｒｅＵＫ５４、プラスミドバックボー
ンは第３図に示すように、３断片のライゲーションによ
り構築される。

（ｉ）ＳＶ４０初期プロモーターは、プラスミドｐＣＶ
ＳＶＥＨＢＶ（欧州特許公開Ｎｏ、０１１７０６０．１
９８４年８月２９日公開）をＰｖｕｌおよびＸｂａＩで
消化することにより調製された。

（ｉｉ）プレウロキナーゼｃＤＮＡを含有する断片は、
プラスミドｐｐｒｅＵＫ５４　　ｔ、ｒｐ２０７−１（
欧州特許公開Ｎｏ、００９２１８２．１９８３年１０月
２６日公開）から得られた。該プラスミドをＣ１ａｌ消
化に付した。Ｃ１ａｌ末端を充填（フィリング）反応に
より平滑末端化した。ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ
断片と４種類のデオキシリボヌクレオチドφトリホスフ
ェートとを加えて、Ｃ１ａＩ突出−本鎖末端を充填した
。充填の後、プラスミドＤＮＡを第２の酵素、ＸｂａＩ
で消化した。

次いで、ｐｒｅＵ　Ｋ　５４のＸｂａＩ　−Ｃ１ａ巨充
填）ｃＤＮＡ断片を単離した。

（ｉｉｉ　）細菌性の複製起源、ＤＨＦＲｃＤＮＡ。

真核性発現単位、および肝炎ウィルス表面抗原の３′非
翻訳領域を含有するベクター断片は、ｐＥＨＥＤ２２（
米国特許Ｎｏ、４，６２４，９１８．１９８６年１１月
２５日出願）から導かれた。このプラスミドをまず、Ｂ
ａｍＨＩで消化した。次いで、上記、Ｃ１ａｌ平滑末端
化におけると同様にして、ＢａｍＨＩ突出末端をフレノ
ウＤＮＡポリメラーゼ■による充填反応で平滑末端化し
た。ＢａｍＨＩ消化および充填の後、ＤＮＡをＸｂａｌ
消化し、大きい４．３Ｋｂ断片を単離した。

これらの３断片を混合し、３断片の協調ライゲーション
（コンサーチノド・ライゲーション）に付し、連結した
。組換えｐＣＶ　Ｓ　Ｖ　Ｄ　２２／ｐｒｅＵ　Ｋ５４
を回収した。充填したＣｌａｌ部位を充填したＢａｍＨ
Ｉ部位にライゲートすることにより、この連結部分に無
傷のＢａｍ８１部位が得られた。

ｐＳ　Ｖ　Ｅ　ＨＩ　Ｇ　Ｄ　ＨＦ　Ｒノ構築０）タメ
ニ、ｐＣＶＳＶＤ２２／ｐｒｅＵＫ５４をＸｂａｌおよ
びＢａｍＨＩで消化し、ベクター断片を単離した。

ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲを得るための最終的な３部ライ
ゲーションには、ａ）プロインシュリンのｃＤＮＡを含
有する４　４０ｂｐＮｃｏｌ　−Ｘｈｏ［Ｉ断片、ｂ）
このｃＤＮＡを５Ｖ４Ｑ初期プロモーターに連結するた
めの、ｐＣ’ＶＳＶＥ−ＨＩＲｃ−２由来の６３ｂｐＸ
ｂａｌ−ＮｃｏＩ断片、およびｃ）ＳＶ４０−Ｄ　ＨＦ
　Ｒ転写単位、大腸菌の複製起源からのアンピシリン耐
性マーカー、ポリアデニル化を伴った肝炎表面抗原３′
末端、および転写終止部位を含有するｐＣＶＳＶＤ２２
／ｐｒｅＵＫ５４由来のＸｂａｌ−ＢａｍＨＩベクター
断片を用いた。３断片を協調３方向ライゲーシヨンによ
り連結、大腸菌に導入（トファンスフォーム）した。形
質転換体を分近し、所望の組換え体を同定した。

ｂ）ｐＳ　Ｖ　Ｅ　ＨＩ　Ｇ　Ｎｅ。

プレプロインシュリン発現ベクターｐＳＶＥＨＩＧＮｅ
ｏの構築模式図を第２図に示す。

このベクターは２断片の構築により組み立てられた。第
１断片は、上記ｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲのＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片である。この断片には、プレプロインシュリンを
コードしているｃＤＮｋと、ＤＨＦＲをコードするＤＮ
Ａの転写開始を指令するＳＶ４０初期プロモーターとが
含有されている。第２断片を含有するプラスミドバック
ボーンは、ｐＳＶＥＮＥＯＢａ１６（欧州特許公開Ｎｏ
、０１６０４５７．１９８５年１１月６日公開）（７）
ＳＶ４０プロモーターの丁度、下流に位置する単一のＨ
ｉｎｄＩ［１部位を切断することで得られた。次いで、
線状プラスミドをウシアルカリホスファターゼで処理し
、再環化を防止した。ｐｓＶＥＨＩＧＤＨＦＲから得た
Ｈｉｎｄｕ断片を、ｐｓＶＥＮＥＯＢａ１６の単一のＨ
ｉｎｄｎ１部位に挿入し、本来、マウス５Ｖ４０−ＤＨ
ＦＲ転写単位の転写のためのＳＶ４０プロモーターを、
プレプロインシュリン遺伝子の上流に位置させた。ライ
ゲーションの後、プラスミドを大腸菌２９４細胞に導入
する。

組換え細胞は、制限分析により、プロインシュリンｃＤ
ＮＡを含有する断片が正しい方向性にあることを確かめ
ることによって同定される。方向性が適切であれば、本
来細菌のＮｅｏ遺伝子を転写するＳＶ４０プロモーター
は、ここではプレプロインシュリンｃＤＮＡの上流にあ
ってその転写を開始する。

ｃ）ｐＥＯ ＳＶ４０プロモーターのコントロール下にオルニチンデ
カルボキシラーゼ（ＯＤＣ）ｃＤＮＡを含有し、Ｂ型肝
炎ポリアデニル化配列と大腸菌内での選択のためにアン
ピシリン遺伝子を含有しているベクターを構築した。内
因性のＯＤＣ遺伝子は、ｏｏｃ阻＝物質、アルファ　ジ
フルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）を用いた選択に
より、哺乳類細胞中で増幅が可能である［マツコンログ
（Ｍ　ｃ　Ｃ。

ｎｌｏｇｕｅ、　Ｌ、　）およびゴソフイノ（Ｇｏｆｆ
ｉｎｏ、　Ｐ、　　Ｊ　。

）、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　２５８．８
３８４−８３８８（ｉ９８３）およびマンコンログおよ
びゴッフイノ、Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｍ、　　
２５８．１２０８３−１２０８６（ｉ９８３）、］。

第４図に、２断片ライゲーションによるｐＥＯの構築模
式図を示す。

１．０ＤＣの全暗号領域を含有する１６８８ｂｐを、ｐ
ＢＲ３２２にクローンされた○ＤＣｃＤＮＡを含有する
プラスミドから得た（マツコンログら（ＭｃｃｏＭｌｏ
ｇｕｅ、Ｌ、　）Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ８１：５４０−５４４［１９８４］；グプタ（Ｇ
ｕｐｔａ、Ｍ、　）およびゴッフィノ（Ｇｏｆｒｉｎｏ
、Ｐ、　　Ｊ、　）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６０
：２９４１　２９４４［１９８５］）。プラスミドを５
ａｌｌおよびＰｖｕｌｌで切断した。末端をフレノウで
充填して平滑末端化し、ゲル上で１６８８対のＯＤＣ断
片を単離した。

２、ＳＶ４０初斯プロモーター、肝炎ポリアデニル化配
列、および大腸菌内での選択のためのＡＭＰ遺伝子を含
有する３５９３ｂｐ断片をプラスミドｐＳＶＰＡＤＨＦ
Ｒ（欧州特許公開Ｎｏ、０．０９３．６１９、該明細書
ではｔ−ＰＡをコードするＤＮＡの５°側ＳＶ４０プロ
モーターに１９２ｂｐ断片を付加して修飾されたｐＥＴ
ＰＦＲとして記載されている。この付加された１９２ｂ
ｐ断片は追加のＨｉｎｄ１１１部位を含有している。）
から単離した。

このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよび５ａｃｌｌで切
断し、末端をフレノウＤＮＡポリメラーゼで充填し、ゲ
ル上で３５９３断片を単離した。

次いで、これらの２断片を２成分ライゲーションに付す
ことによって連結し、ｐＥｏを構築した（第４図参照）
。最終プラスミドの方向性および立体配置を制限分析に
よってチエツクした。

Ｂ）インシュリン−非依存性のｔ−ｐΔ細胞（ｃ２Ｂ１
３）の選択 インシュリン−非依存性の形での所望のタンパク質（例
、ｔ−ＰＡ）の分泌を支持する上で、内的に生産された
プロインシュリンが充分であるか否かを決定するために
、所望のタンパク質（この場合にはｔ−ＰＡ）の発現の
ために予め形質転換した宿主細胞を用いる外は、実施例
２記戦の方法と同様にしてトランスフェクトした。実施
例１記載のベクター、ｐＳＶＥＨＩＧＮｅｏを、増幅さ
れたＬ−ＰＡおよびＤＨＦＲを含有しているＣ　ＨＯ細
胞系統（ｃ２Ｂと称する）（欧州特許公開Ｎｏ、００９
３６１９）にトランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンは、りん酸カルシウム法で行った（シモンセン（Ｓ
ｉｍｏｎｓｅｎ、Ｃ，Ｃ，）およびレビンソン（Ｌｅｖ
ｉｎｓｏｎ、Ａ、Ｄ、）ＰＮＡＳ８０：２４９５−２４
９９［１９８３コ；ウィグラーら（Ｗｆｇｌｅｒ、　Ｍ
、　）　ＰＮΔＳ７６：１２４２−１２５５［１９７９
］）。ＮｅＯ遺伝子を発現するトランスフェクトされた
細胞を、Ｇ４１８含有培地での増殖に基いて選択した。

プレプロインシュリンでトランスフェクトされたＣ２Ｂ
細胞を血清不含、インシュリンネ含（ＳＰＩＦ）撹拌培
養および平板培養でインシュリン非依存性に関して選択
した。血清不含培地は、標準化された上記に記載の３５
０ｍＯｓｍインシュリンネ含Ｆ−１２／ＤＭＥ培地であ
る。それは、グルコース、２ＸＧＨＴ、ｌＯｍＭＨｅｐ
ｅｓ、１．０Ｍｇ／Ｌｔ−ランスフェリン、１×微微量
分、１μＭリルイック（ｌ　１ｎｏｌｅｉｃ）、ｌＸｌ
０−’°ＭＴ３、およヒｌ×１０〜８Ｍヒドロコーチシ
ン、エストラジオール、およびプロゲストロンからなる
。

インシュリン非依存性に関する選択をほぼ２週間行った
後、生存している細胞を、透析し、抽出した５％ＦＢＳ
を含有する培地を用いて、撹拌培地および平板培地の両
者から救出し、制限希釈により、２３クローンを誘導し
た。これらのクローンを、インシュリンの非存在下、あ
るいは様々な濃度のインシュリン（インシュリン至適濃
度、２０μｇ／ｍＱインシュリンをも含む）の存在下、
血清不含条件においてｔ−ＰＡの生産に関してスクリー
ニングした。将来の研究に最も期待し得るクローン１３
を取り出した。

Ｃ２Ｂ（対照）細胞、Ｃ２Ｂ／クローン１３インシュリ
ン−非依存性細胞、および１００μＭＤＦＭＯ増幅プー
ルを５ＰＩＦ培地で３回洗浄し、次いで、５ＦＩＦ培地
に再怒濁した。クローン１３および１００μＭインシュ
リン−非依存性細胞系統はインシュリン非存在下で、至
適濃度のインシュリン存在下において対照Ｃ２Ｂ細胞系
統が達成するｔ−ＰＡ力価と同程度の力価のｔ−ＰＡを
産生じた。

実施例２　　ｔ−ＰＡ高分泌クローンの調製および同定 特に明記しない限り、培養培地は、７．５％透析したウ
シ胎児血清を含んだ５０１５０　　Ｆ−１２／ＤＭＥＭ
　　ＧＨＴ−培地である。他の培養培地によれば、この
培地よりも高収量でｔ−ＰＡが生産され、高い細胞密度
が得られるかもしれないが、血清含有培地は、幾分、細
胞の生存率を向上するようである。細胞外のマトリック
スプレート（Ａｃｃｕｒａｔｅ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
　ａｎｄ　　Ｃｏ、　）上で培養した約５００，０００
のＣ２Ｂ１３細胞をｐＳＶ５ＧＰＴ［ムリガンら（Ｍ　
ｕ　ｌ　ｌ　ｉｇａｎ）、Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　
　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ７８：２０７２−２０７６
（ｉ９８１）］およびｐ１５８　　ＳＶＥ　　ｓｒｃ　
　ＬＴＲ［シンドールら（Ｓｙｎｄｏｒ）Ｃｅ１１３２
：８９１−９０１（ｉ９８３）］のＣａ　Ｐ　Ｏ４沈殿
で３７°Ｃにおいて３時間、トランスフェクトした（重
量比１　：　１０）。同じ条件下、対照プラスミドｐＢ
Ｒ３２２をトランスフェクトした。次いで、細胞を５％
Ｃ０＝ｎｏ存在下、ハイグロマイシンＢ２０Ｏ−４００
μｇ／ｍ（ｌを含んだ培地で３７°Ｃにおいて２週間培
養した。抗生物レベルを維持するために、この期間中、
２日おきに培地交換を行った。次いで、プレート上に広
がったコロニーを取り、ｔ−ｐＡ６成と生存性について
解析した。培養培地０．シ１を含んだ培養皿に２００，
０００細胞の割合で播種して各クローンを培養し、７お
よび１１日ローｔ−ＰＡＥＬＩｓＡ法でｔ−ＰＡの発現
レベルを分析した。６日後、および以後は２日毎に、３
０λづつの試料を分析のために抜き取った後、培養培地
を添加することにより、皿当たりの容量を０．５ｄに戻
した。

この行程を４回繰り返し、約４９のトランスフェクトさ
れたクローンから陽性クローン４つを得た。

陽性クローンは、６８目のｔ−Ｐ　Ａｆｉｔが、親細胞
系統より少なくとも５０％多いものと定義した。

１つのクローン２Ｃ２を以後の分析のために選択した。

２日毎にｔ−ＰＡ分析を行う外は上記同様にクローン２
Ｃ２およびＣ２Ｂ　１３を培養した。結果を以下に示す
。結果は、同一条件下に、クローン２Ｃ２から得られた
ｔ−ＰＡ収量のＣ２Ｂ１３培養から得られたｔ−ＰＡ収
量に対する増加率（％）として示されている。

日 日　　　　　　　　　　　４　　　　６　　　　８１０
１２１４収量増加（％）６４　６０　３２　５６　５６
　６８培養第１日の２Ｃ２細胞によるｔ−ＰＡ生産量は
、繰り返し実験することで、親細胞系統の約２倍になり
、ｓｒｃ形質転換による細胞当たりのｔ−ＰＡＪ増大が
示唆された。この培養収量の向上はまた、細胞密度の増
大に帰すことができる。発酵では、２Ｃ２細胞系統は約
５−７Ｘ１０６細胞／肩Ｑの密度を達成したのに対し、
親細胞系統は通常、１−３Ｘ１０’細胞／ｌの密度を達
成し得るにすぎない。

ｓｒｃトランスフエクタンッはまた、親細胞系統の培養
物より、高い生細胞率を示した。培養ウェル中の細胞を
トリプシン処理し、ウェルから液体を除去し、懸濁物を
遠心して細胞ペレットを得、該ペレットを再度トリプシ
ン処理し、解会合した細胞を培養培地に懸濁し、コール
タ−（ｃｏｕｌｔｅｒ）カウンターで計数し、トリパン
ブルーで染色してトリパンブルー染色（Ｇｉｂｃｏ）を
行い、血球計数計で死細胞（青色）を数えた。培養７お
よび８口重の生細胞の割合（％）は、Ｃ２Ｂ１３（親）
細胞についてそれぞれ１５および１３％、２Ｃ２細胞（
ｓｒｃトランスフエクタンツ）についてそれぞれ９２お
よび９８％であり、ｓｒｃトランスフェクションによっ
て、宿主細胞に長期的な高密度培養での安定性が付与さ
れることが証明された。

実施例３　非−オートクリン細胞における１−ＰＡ発現
の増大 形質転換された細胞が実施例１記載のｔ−ＰＡ形質転換
ＣＨ○細胞系統Ｃ２Ｂである外は、実施例２の操作を繰
り返した。Ｃ２Ｂ安定化形質転換体はインシュリン依存
性である。約２０のｓｒｃ形質転換体の内１個か、実施
例２の基準に従って判定した結果、ｔ−ＰＡ収率の有意
な増大を示した。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＳＶＥＨＩＧＤＨＦＲの構築模式
図、第２図はプラスミドｐＳＶＥＨＩＧＮｅｏの構築模
式図、第３図はプラスミドｐＣｖ　ｓＶ　Ｄ　２２／ｐ
ｒｅＵ　Ｋの構築模式図、第４図はプラスミドｐＥｏの
構築模式図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）所望のポリペプチドをコードする核酸と腫瘍
   遺伝子によって真核性の親宿主細胞をトランスフェクト
   し、 （ｂ）親宿主細胞より多量の、培地容量当たりの所望の
   ポリペプチドを生産する工程（ａ）のトランスフェクタ
   ンツを同定することからなる方法。 ２、親宿主細胞を腫瘍遺伝子でトランスフェクトする前
   に、所望のポリペプチドをコードする核酸で該宿主細胞
   をトランスフェクトすることからなる請求項１に記載の
   方法。 ３、真核性宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１または
   ２に記載の方法。 ４、ポリペプチドがヒト起源である請求項１、２または
   ３に記載の方法。 ５、ポリペプチドがプラスミノーゲン活性化因子、イン
   ヒビン、ＴＧＦ−β、アクチビン、プロレラキシン、ス
   ーパーオキシド・ジスムターゼ、組織因子、崩壊促進因
   子、ウィルス抗原、またはエンケファリナーゼである請
   求項１〜４のいずれかに記載の方法。 ６、ポリペプチドがヒト組織プラスミノーゲン活性化因
   子である請求項５に記載の方法。 ７、宿主が、増幅可能なマーカーによってもトランスフ
   ェクトされている請求項１〜６のいずれかに記載の方法
   。 ８、腫瘍遺伝子がウィルスの核酸である請求項１〜７の
   いずれかに記載の方法。 ９、腫瘍遺伝子がｖ−￥ｓｒｃ￥である請求項８に記載
   の方法。 １０、ポリペプチドが親宿主細胞の生存、または増殖に
   必須ではない、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法
   。 １１、工程（ｂ）のトランスフェクタンツを、所望のポ
   リペプチドが培養物中に蓄積されるまで培養した後、培
   養物から所望のポリペプチドを回収することをも含む請
   求項１〜１０のいずれかに記載の方法。 １２、ポリペプチドが分泌型ポリペプチドである請求項
   １〜１１のいずれかに記載の方法。 １３、宿主細胞が、ポリペプチド成長因子をコードする
   核酸によってもトランスフェクトされている請求項１〜
   １２のいずれかに記載の方法。 １４、成長因子がインシュリンまたはプロインシュリン
   である請求項１３に記載の方法。 １５、所望のポリペプチドをコードする核酸が、該核酸
   の本来の細胞の転写調節配列によって転写をコントロー
   ルされていない請求項１〜１４のいずれかに記載の方法
   。 １６、所望のポリペプチドをコードする核酸が、ウィル
   スのプロモーターによりコントロールされている請求項
   １５に記載の方法。 １７、（ａ）真核性の親宿主細胞を、（ｉ）ヒト組織プ
   ラスミノーゲン活性化因子をコードする核酸、および（
   ｉｉ）腫瘍遺伝子でトランスフェクトし、（ｂ）親宿主
   細胞より多量の、培地容量当たりのヒト組織プラスミノ
   ーゲン活性化因子を生産する工程（ａ）のトランスフェ
   クタンツを同定することからなる方法。 １８、腫瘍遺伝子がｖ−￥ｓｒｃ￥であり、宿主細胞が
   霊長類以外の哺乳類起源のものである請求項１７に記載
   の方法。 １９、宿主細胞が、ポリペプチド成長因子をコードする
   核酸によってもトランスフェクトされている請求項１７
   または１８に記載の方法。 ２０、（ａ）ヘテロローガスなプロモーターの転写コン
   トロール下にある腫瘍遺伝子、 （ｂ）所望のポリペプチドをコードする遺伝子、および （ｃ）所望のポリペプチドを含有する培養培地からなる
   宿主細胞培養物。 ２１、所望のポリペプチドが、細胞培養の増殖または生
   存に必須ではない請求項２０に記載の培養物。