DE3852082T2

DE3852082T2 - Verfahren zur Erhöhung der Expression von Polypeptiden in rekombinanten Zellkulturen.

Info

Publication number: DE3852082T2
Application number: DE3852082T
Authority: DE
Inventors: Arthur D Levinson; Jennie P Mather
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-09-11
Filing date: 1988-09-12
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2008-09-13
Also published as: EP0307248A2; IE882769L; ATE113984T1; DE3852082D1; ES2065915T3; EP0307248B1; EP0307248A3; JPH01120300A; CA1312566C; IE64979B1; AU612404B2; JP2796547B2; AU2209988A

Description

Diese Erfindung betrifft die Herstellung von heterologen Polypeptiden in rekombinanten Wirtszellen. Im besonderen betrifft sie Verfahren zur Erhöhung der Ausbeuten von in rekombinanter, eukaryotischer Zellkultur erzeugten, heterologen Polypeptiden.
Viele Polypeptide wurden in rekombinanter, eukaryotischer Zellkultur synthetisiert, beispielsweise Plasminogenaktivatoren, Inhibin, TGF-β, Aktivin, Prorelaxin, Superoxid-Dismutase, Gewebefaktor, Abbaubeschleunigungsfaktor, virale Antigene und Enkephalinase. Von besonderem Interesse sind die Plasminogenaktivatoren, speziell menschlicher Plasminogenaktivator vom Gewebetyp (t-PA). Dieses Enzym und gewisse seiner Aminosäuresequenz-Varianten sind wohlbekannt und in der Literatur beschrieben, und es wird im allgemeinen in rekombinanter Säugetierzellkultur erzeugt. Siehe z. B. EP 093.619.
Typischerweise wird eine eukaryotische Wirtszelle, wie z. B. eine Hefe-, filamentöse Pilz-, Vertebraten- oder Nicht-Vertebratenzelle, mit für ein gewünschtes Polypeptid kodierender Nukleinsäure transfiziert, Transfektanten zur Aufnahme der Nukleinsäure ausgewählt und Transfektanten, die in der Lage sind, das gewünschte Polypeptid zu erzeugen, identifiziert. Die Transfektanten, die die größten Mengen an Polypeptid herstellen, werden durch Selektieren von Subklonen, die die für das gewünschte Polypeptid kodierende Nukleinsäureamplifiziert haben, identifiziert, wobei solche Subklone herkömmlicherweise meist dadurch identifiziert werden, daß Subklone, die ein Marker-Gen, wie Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), koamplifiziert haben, durch Kultur eines Selektionsmittels für das Marker-Gen in inkrementell zunehmenden Mengen selektiert werden. Subklone, die die transfizierte Nukleinsäure amplifiziert haben, werden durch ihre Fähigkeit, den Durchtritt durch Medien mit erhöhten Konzentrationen an Selektionsmittel zu überleben, identifiziert. Das Selektionsmittel ist im Fall von DHFR Methotrexat; Methotrexat bindet und inaktiviert DHFR, wodurch mehr DHFR benötigt wird. Amplifikation des DHFR-Gens ermöglicht den Subklonen, in Gegenwart einer gegebenen Menge an Methotrexat zu wachsen. Diese Vorgangsweise erleichterte die Herstellung und Identifikation von Rekombinanten, die brauchbare Mengen des gewünschten Polypeptids erzeugen.
Bei der zuvor beschriebenen Subklon-Selektion scheint es Grenzen für die Erhöhung der Ausbeuten an gewünschtem Polypeptid zu geben. Manchmal wachsen die Kulturen nur wenig und enthalten große Anteile an nicht-lebensfähigen und abnormalen Zellen. Ungeachtet dessen konzentrierten sich die Bemühungen auf diesem Gebiet, die allgemein auf Erhöhung der Ausbeuten rekombinanter Polypeptide gerichtet waren, auf die Anregung der Expressionsmengen von Polypeptid auf zellulärer Basis, z. B. auf Verwendung von stärkeren Promotoren und Verstärkern zur Erhöhung der Polypeptid-Ausbeute pro Zelle. Diese Strategie läßt den Einfluß der Zellebensfähigkeit und Wachstumseigenschaften auf die Nettoausbeute an Polypeptid aus der gesamten Zellkultur unberücksichtigt. Es wäre wünschenswert, bei rekombinanten Fermentationen die Ausbeuten sowohl hinsichtlich Kultur als auch hinsichtlich Zellen zu erhöhen. Die Anforderungen für die wichtigsten Verbesserungen, wie Fermenter, würden ebenso wie die Betriebskosten, wie z. B. für Medien und Labor, sinken.
Systeme zur Erhöhung der Zelldichte bei Fermentationen sind bekannt. Diese gelten aufgrund von vermehrter Ausrüstung und Kosten für Medien nicht als ökonomisch. Beispielsweise werden sehr hohe Zelldichten durch in Mikrotubularvorrichtungen durchgeführte Fermentationen mit kontinuierlichem oder periodischem Austausch des Mediums erzielt, jedoch sind die Fermenter teuer, sehr schwer zu rezyklieren, nur in begrenztem Ausmaß maßstäblich zu vergrößern und benötigen enorme Mengen an frischen Medien. Benötigt wird daher ein Verfahren zur Verbesserung der Dichte lebensfähiger Zellen in herkömmlichen Fermentertanks, die im kontinuierlichen oder im Batch-Verfahren betrieben werden.
Transformierte Zellen besitzen eine Vielzahl an Eigenschaften, von denen einige nur von einer aber von keiner anderen Zelle gezeigt werden. Im allgemeinen werden transformierte Zellen immortalisiert, d. h., sie erhalten die Fähigkeit zur unbegrenzten Zellteilung, und unterlaufen gewisse morphologische und kulturelle Veränderungen, wovon eine der Verlust von Kontaktinhibierung, wie durch Focus-Bildung in Zellmonoschichten gemessen, und eine andere die Bildung von Kolonien in Weichagar ist. Nicht alle der immortalisierten Zellen bilden jedoch Tumore in nackten Mäusen oder weisen Verlust von Kontaktinhibierung oder Focus-Bildung in Weichagar auf. Transfektion ist der Transfer von Nukleinsäure in das permanente, genetische Repertoire einer Wirtszelle. Für die Zwecke dieser Anmeldung werden Transfektion und Transformation nicht als synonym verstanden.
Es ist wohlbekannt, daß transformierte Säugetierzellinien größere Mengen an Proteasen, einschließlich Plasminogenaktivatoren, sekretieren als ihre untransformierten Vorläufer. Das scheint ungeachtet dessen, ob die Transformation als Resultat von chemischer Karzinogenese oder viraler Infektion erfolgte, der Fall zu sein. Siehe M. Duffy et al., "Eur. J. Cancer Clin. Oncol." 20(5): 577-82 (1984), R. Isseroff et al., "J. Invest. Dermatol." 80(4): 217-22 (1983), L. Green et al., "Carcinogenesis" 7(3): 477-80 (März 1986), B. Rajput et al., "Science", 8. Nov. 1985: S. 672, E. Major et al., "Virnlogy" 136(2): 359-67 (1984); J. O'Donnell-Tormey et al., "Cell", 27(1Pt.2): 85-95 (1981); J. Soric et al., "Biochim. Biophys. Acta." 719(3): 438-43 (1982); und M. Wainberg et al., "Eur. J. Cancer Clin. Oncol." 18(6): 545-51(1982). Tatsächlich wurde erhöhte Sekretion von Plasminogenaktivatoren als ein Indiz für Transformation verwendet (E. Gionti et al., "J. Biol. Chem." 258 : 7190 [1983] und K. Nakamura et al., "Mol. Cell Biol." 2(2): 147-53 [1982]). L. Skriveretal., "Eur. J. Biochem." 124(2): 409-14 (1982) und L. Nielsen et al., "Biochemistry" 21(25): 6410-5 (1982) berichteten jedoch, daß Plasminogenaktivator aus Transformanten in enzymatisch inaktiver Form freigesetzt werden kann, und andere beobachten, daß nicht alle transformierten Klone tatsächlich Plasminogenaktivator erzeugen (E. Angles-Cano et al., "Int. J. Cancer" 33(2) 277-80 [1984] und C. Cerni, "Oncology" 41(5): 349-56 [1984]). Die Expression von gesteigerten Mengen an endogenem Plasminogenaktivator wurde nicht ausschließlich einem besonderen viralen Gen oder Zellmechanismus zugeschrieben, obwohl Sistonen et al.
beobachteten, daß mit dem menschlichem c-Ha-rasVal 12-Onkogen und dem Neomycin-Phosphotransferase-Gen transfizierte NIH/3T3-Zellen Foci oder Kolonien bildeten (ein Indiz für Transformation), während abundante c-Ha-ras exprimierende Zellen sowohl ihre Actin- als auch Fibronectin-Netzwerke verloren hatten und eine erhöhte Plasminogenaktivator-Aktivität zeigten (Sistonen et al., "Exp. Cell Res." 168(2): 518-30 [Feb. 1987]).
Onkogene sind Nukleotidsequenzen, die transformierte Eigenschaften auf Wirtszellen übertragen. Sie werden typischerweise von viraler Nukleinsäure (v-Onc) oder zellulärer DNA (c-Onc oder Protoonkogene) abgeleitet. Typischerweise sind v- Oncs Hybride einer spezifischen Untergruppe aus einem oder mehreren normalen, verstümmelten oder variierenden c-Onc-Genen, die an die genomischen Elemente eines retroviralen Vektors gebunden sind, der zuvor das c-Onc-Gen oder dessen Variante eingefangen oder transduziert hatte. Wie in der folgenden Tabelle von R. Ascione et al. in Papas et al., Hrsg., Gene Amplification and Analysis Vol. 4, S. 257 (1986) dargestellt, sind viele Onkogene bekannt. Tabelle 1 Onkogene: Gruppe; Verwandtschaften; Ursprung; Krankheit und Aktivität Gruppen-Onkogen Ursprung virale Zelle Aktivität Krankheit Familie Kinasen Rous-Sarkom-Virus Huhn Tyrosin Sarkom Protein F&ijlig;inami-Sarkom-Virus Katzen Yamaguchi-Sarkom-Virus Gardner-Rasheed-Virus UR2-Sarkom-Virus McDonough-Sarkom-Virus Abelson-Leukämie-Virus begrenzte Sequenzhomologie zur src-Familie Moloney-Sarkom-Virus Maus Proteinkinase-Domänen-Homologie Tabelle 1 (Fortsetzung) Mäusesarkom-Virus Maus MH2-Vogelvirus Huhn Erythroblastose-Virus Reticuloendotheliose-Virus karzinogen-behandelte, menschliche Osteosarkomzeile isoliert durch Transfektion ras-Familie Harvey-Sarkom-Virus Ratte Kirsten-Sarkom-Virus Tabelle 1 (Fortsetzung) menschliche Tumor-DNA Wachstumsfaktor und Rezeptor sis-Familie Affensarkom-Virus Wollaffe isoliertes Neuroblastom myc-Familie MC29-Myelocytomatose-Virus MH2-Affenfirus Huhn Neuroblastom, Retinoblastom Mensch Tabelle 1 (Fortsetzung) anaplastisches Lungenkarzinom Mensch unbekannt sehr begrenzte Homologie zu c-myc myb-Familie Affenmyeloblastose Huhn E26-Virus Familie der allein vorkommenden FBJ-Osteosarkom-Virus Maus SK770-Virus E26-Virus Erythroblastose-Virus Tabelle 1 (Fortsetzung) B-Zellen-Neoplasmen isoliert durch Transfektion unbekannt T-Zellen-Neoplasmen
aDuale Onkogene des MH2-Virus.
b Duale Onkogene des Affenerythroblastose-Vi rus. Csehr entfernte Homologie zu src.
d Duale Onkogene des dreiteiligen E26-Virus-Genoms.
Bisher standen Onkogene im Mittelpunkt intensiver Studien, wobei zumindest einige der Autoren der vorliegenden Erfindung das kommerzielle Ziel hatten, Onkogene zu inaktivieren oder zu inhibieren, als therapeutischer Versuch der Krebsbehandlung oder zum Entwerfen diagnostischer Tests. Es zeigte sich jedoch, daß Onkogene an sich geringen kommerziellen Nutzen besaßen.
Es wird gewünscht, den Titer (Ausbeute pro Volumen) von Polypeptiden aus rekombinanten Zellkulturen zu erhöhen, weiters die Ausbeuten an Polypeptiden aus rekombinanter Zellkultur auf der Basis "pro Zelle" zu steigern, die Sekretion von heterologen Polypetiden aus rekombinanter Zellkultur in Fermentationstanks im Batch-Verfahren zu erhöhen, und die Dichte lebensfähiger Zellen rekombinanter, eukaryotischer Zellkulturen zu erhöhen.
EP-A-0 262.942 beschreibt Wirtszellkulturen, die mit dem t-PA- und dem RAS- Gen kotransfiziert wurden. Dieses Dokument fällt unter Artikel 54(3) EPC, weshalb es für die Frage nach dem erfindungsgemäßen Schritt nicht relevant ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das umfaßt: (a) das Transfizieren einer immortalisierten, eukaryotischen Stammwirtszelle mit für ein gewünschtes Polypeptid kodierender Nukleinsäure und einem Onkogen; und (b) das Identifizieren der Transfektanten aus Schritt (a), die höhere Ausbeuten an gewünschtem Polypeptid pro Volumen des Kulturmediums erzeugen als aus der Stammwirtszelle, die mit für das gewünschte Polypeptid kodierender Nukleinsäure, aber nicht mit dem Onkogen transfiziert wurde, erhalten werden.
Unter einem bevorzugten Aspekt umfaßt das Verfahren weiters das Kultivieren der Transfektanten aus Schritt (b), bis sich das gewünschte Polypeptid in der Kultur angesammelt hat, und anschließende Gewinnung des gewünschten Polypeptids aus der Kultur.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren: (a) das Transfizieren einer eukaryotischen Stammwirtszelle mit (i) für menschlichen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) kodierender Nukleinsäure; und (ii) einem Onkogen; und (b) das Identifizieren der Transfektanten aus Schritt (a), die höhere Ausbeuten an t-PA pro Volumen des Kulturmediums erzeugen als aus der Stammwirtszelle erhalten werden.
Die Erfindung stellt auch eine Wirtszellkultur bereit, umfassend (a) ein Onkogen unter der transkriptionalen Steuerung eines heterologen Promotors; (b) ein für ein gewünschtes Polypeptid kodierendes Gen; und (c) ein das gewünschte Polypeptid enthaltendes Kulturmedium.
Überraschenderweise scheinen Expressionsmengen des Onkogens nicht mit höheren Ausbeuten an gewünschtem Polypeptid in Zusammenhang zu stehen. Ein reproduzierbares Verhältnis von Transfektanten (4/46) mit dem v-src-Gen zeigt erhöhte Polypeptidexpression, ungeachtet dessen, daß (1) die positiven Klone äußerst geringe Mengen an - oder überhaupt kein - v-src-Protein exprimieren, wie durch Kinase-Assay festgestellt wurde, und daß (2) die verschiedenen Klone, die keine erhöhte Polypeptidexpression zeigen, trotzdem reichlich v-src-Protein produzieren. Klone mit hoher Ausbeute enthalten jedoch wirklich für das Onkogen kodierende DNA. Daher wurde beschlossen, die Transfektanten eher auf erhöhte Polypeptid-Ausbeuten als auf Onkogen-Expression zu screenen. Die von den bevorzugten Transfektanten dieser Erfindung produzierten, erhöhten t-PA-Ausbeuten sekretieren reichliche Mengen an heterologem, voll aktivem t-PA. Es war auch überraschend, daß die Onkogen- Transfektanten mit hohen Ausbeuten keine zusätzlichen, nachweisbaren, transformierten Eigenschaften neben der Stammzellinie und darüber hinaus erlangten, mit Ausnahme der Tatsache, daß Onkogen-DNA im Genom der Transfektanten nachgewiesen werden konnte.
Fig. 1. Konstruktion eines menschlichen Präproinsul in-Expressionsvektors, pSVEHIGDHFR, zur Schaffung einer insulin-unabhängigen Zellinie zur Produktion eines gewünschten Proteins.
Fig. 2. Konstruktion eines menschlichen Präproi nsu 1 in-Expressionsvektors, pSVEHIGNeo, zur Schaffung einer insulin-unabhängigen Zellinie zur Produktion eines gewünschten Proteins.
Fig. 3. Konstruktion von Plasmid pCVSVD22/preUKs4 zur Konstruktion von pSVEHlGDHFR.
Fig. 4. Konstruktion eines Ornithin-Decarboxylase (ODC)-Expressionsvektors zur Amplifikation des ODC-Gens und des kotransfizierten Präproinsulin-Gens.
Ein hervorstechendes Merkmal dieser Erfindung ist die Verwendung von genetisch modifizierten Wirtszellen zur Steigerung der Dichte lebensfähiger Zellen und der Gesamtkulturausbeuten des gewünschten Polypeptids, statt sich mit teurer Fermentationsausrüstung und Medienaustausch aufzuhalten. Diese Verbesserung schuf neuen Boden für eukaryotische Zellkulturen, da es nun möglich ist, inkrementelle Steigerungen der Zellproduktivität auf Basis des Kulturvolumens zu amplifizieren. Jedes Onkogen, da in der Lage ist, dieses Ziel zu erreichen, ist hierin brauchbar.
In der vorliegenden Erfindung werden Onkogene verwendet, die - falls in eine Wirtszelle transfiziert - die Sättigungsdichte, spezifische Produktivität und Lebensfähigkeit der Zellen einer Suspensionskultur im Vergleich zu denselben Parametern, die von Wirtszellen vor der Transformation mit dem Onkogen gezeigt werden, verbessern Sättigungsdichte ist die unter vorgegebenen Kulturbedingungen erreichbare, maximale Anzahl an Zellen pro Volumen eines gegebenen Kulturmediums. Lebensfähigkeit der Zellen bezieht sich auf den Prozentsatz an bei einer gegebenen Sättigungsdichte lebensfähigen Zellen, d. h. fähig zu Wachstum und Replikation. Das Verfahren dieser Erfindung ermöglicht Steigerungen der Dichte lebensfähiger Zellen um ungefähr das 1,5- bis 10fache des Prozentsatzes an lebensfähigen Zellen, der ansonsten mit der unter denselben Bedingungen kultivierter Stammwirtszelle erreicht wird, und um das 1,1- bis 4fache der Sättigungsdichte der Kulturzellen. Letztlich führt das Verfahren dieser Erfindung zu gegenüber der Stammlinie erhöhter spezifischer Produktivität (produziertes Protein pro Zelle). Wie zuvor ausgeführt, sind viele Onkogene bekannt, und weitere werden in Zukunft entdeckt werden. Sie alle sind für diese Erfindung brauchbar, solange sie zumindest eine, vorzugsweise alle, dieser Eigenschaften aus verbesserter Sättigungsdichte, spezifischer Produktivität und Lebensfähigkeit der Kultur verleihen.
Nach Erfahrung der Autoren der vorliegenden Erfindung sollten die Wirtszellen empirisch an das Onkogen angepaßt werden, um die Dichte der Wirtszellen und die Lebensfähigkeit zu optimieren. Diese erreicht man typischerweise, indem eine Wirtszelle bereitgestellt wird, die ein gewünschtes Polypeptid synthetisiert und sekretiert, die Zelle mit Reihen von Onkogenen transfiziert wird (die alle beispielsweise aus den zuvor in Tabelle 1 beschriebenen Klassen ausgewählt werden), die Zelle kultiviert und die Transfektanten zur Synthese von gesteigerten Mengen des gewünschten Polypeptids analysiert werden. Jede herkömmliche Analyse des Polypeptids, z. B. immunologisch oder enzymatisch falls geeignet, wird zur Bestimmung der Erhöhung der Ausbeute an gewünschtem Polypeptid verwendet. So muß ein Onkogen oder eine Klasse von Onkogenen, das/die bei einer Wirtszelle wirksam ist, dies bei einer anderen nicht sein. Das optimale Onkogen wird durch übliche Screening- Verfahren, wie z. B. die in den Beispielen gezeigte Vorgangsweise, ausgewählt. Beispielsweise sind v-src und, in geringerem Ausmaß, v-myc effektiv bei der Erhöhung der Ausbeuten an t-PA aus insulin-unabhängigen CHO-Transfektanten, v-fos und aktiviertes c-Ha-ras zeigten jedoch keine Steigerung der t-PA-Ausbeuten unter den beobachteten Bedindungen.
Wirtszellen werden gegebenenfalls auch mit DNA transfiziert, die für einen Polypeptidfaktor kodiert, der Wachstumsunabhängigkeit von einer Substanz, die ansonsten dem Kulturmedium zugefügt werden muß, verleiht, d. h., der den Wirtszellen autokrinen Charakter verleiht. Beispiele für solche Substanzen sind Insulin, Proinsulin, Fibroblast-Wachstumsfaktor, aus Blutplättchchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (der auch als Onkogen wirken kann), EGF, TGF-α, Transferrin und Rezeptoren, Rezeptor- Analoge oder transduzierende Proteine dafür (von denen einige, z. B. v-rbB und Her-2, als Onkogene angesehen werden). Beispielsweise sind CHO-Zellen, bevorzugte Wirte zur Produktion vieler Polypeptide, abhängig von Insulin und Transferrin, werden jedoch durch Transformation mit für Proinsulin und Transferrin kodierender DNA unabhängig von Insulin und Transferrin gemacht. Die Nukleinsäure, die Unabhängigkeit von einem Polypeptidfaktor verleiht, wird vor, nach oder während der Transfektion mit dem Onkogen oder der für das gewünschte Polypeptid kodierenden Nukleinsäure in die Wirtszelle eingebracht.
Die in diesen Bereich inkludierten Wirtszellen sind kernhaltige Zellen, normalerweise Zellen aus multizellulären Organismen und vorzugsweise Säugetierzellen, aber ebenso Insekten-, Pflanzen- oder andere höhere eukaryotische Zellen. Diese Zellen stammen optional von unterschiedlichen Spezies als das gewünschte, zu erzeugende Polypeptid. Falls beispielsweise das gewünschte Polypeptid menschlich ist, stammt die Wirtszelle von einem niedereren Tier. Es sind jedoch auch menschliche Zelltransfektanten nicht ausgeschlossen und in vielen Fällen sogar bevorzugt. Wirtszellen werden typischerweise immortalisiert, d. h., sie sind stabile Zellinien. Geeignete Wirtszellen umfassen die Affennieren-CVI-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); die menschliche Embryonierenlinie (293, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36, 59 [1977]); Hamsterbaby-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); chinesische Hamstereierstockzell-DHFR (beschrieben von Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 [1980]); Mäuse-Sertolizellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod, 23, 243-251 [1980]); Affennierenzellen (CVI ATCC CCL 709); afrikanische Grünaffen-Nierenzellen (VERO-76, ATCC CRL-1 587); menschliche Halswirbelkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelratten-Leberzellen (BRL 3A, ATCC 1442); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäusebrusttumor (MMT 060562, ATCC CCLSI); Rattenhepatomzellen (HTC, MI.54, Baumann, H. et al., J. Cell Biol. 85,1-8 [1980]); und TR-I-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44-68 [1982]).
Expressionsvektoren werden verwendet, um Nukleinsäure so in einen Wirt einzubringen, daß sie durch den Wirt exprimiert wird. Expressionsvektoren brauchen nicht replizierbar zu sein, diese Eigenschaft ist jedoch für die Herstellung großer Mengen des Vektors dienlich. Vektoren enthalten (ein) Gen(e) von primärem Interesse (Polypeptidfaktoren, gewünschte oder Produkt-Polypeptide, Selektionsmarker, Onkogene und dergleichen) unter Steuerung eines Promotors und gemeinsam mit anderen, für Transkription und Translation notwendigen Komponenten. Vektoren enthalten im allgemeinen für die Terminierung der Transkription notwendige Sequenzen, die die mRNA-Expression beeinflussen. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente in den untranslatierten Abschnitt der mRNA, der für das gewünschte, heterologe Protein kodiert, transkribiert. Die untranslatierten 3'-Bereiche inkludieren auch Transkriptionsterminierungsstellen.
Expressionsvektoren enthalten ein oder mehrere Selektionsgene, die auch selektierbare Marker genannt werden. Ein Selektionsgen kodiert für ein Protein, manchmal als Sekundärprotein bezeichnet, das für Überleben oder Wachstum einer mit dem Vektor transformierten Wirtszelle nötig ist. Beispiele für geeignete, selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reduktase (DH FR), Thymidin-Kinase oder Neomycin. Falls solche selektierbare Marker erfolgreich in eine Säugetier-Wirtszelle transferiert werden, kann die transfizierte Säugetier-Wirtszelle unter selektivem Druck überleben. Es wird zwischen zwei weit verbreiteten Kategorien für selektive Systeme unterschieden. Die erste Kategorie basiert auf dem Metabolismus einer Zelle und der Verwendung einer mutanten Zellinie, der die Fähigkeit zu von einem ergänzten Medium unabhängigem Wachstum fehlt. Zwei Beispiele dafür sind: CHO-DHFR&supmin;-Zellen und Mäuse-LTK&supmin;-Zellen. Diesen Zellen fehlt die Fähigkeit, ohne Zugabe solcher Nährstoffe, wie Thymidin oder Hypoxanthin, zu wachsen. Da diesen Zellen gewisse Gene, die für einen vollständigen Nukleotidsyntheseweg notwendig sind, fehlen, können sie, ohne daß die fehlenden Nukleotide in einem ergänzten Medium bereitgestellt werden, nicht überleben. Eine Alternative zur Ergänzung des Mediums besteht in der Einbringung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, denen die entsprechenden Gene fehlen, wobei deren Wachstumsanforderungen abgeändert werden. Einzelne nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformierte Zellen sind nicht in der Lage, in nicht-ergänztem Medium zu überleben. Deshalb erfordert direkte Selektion jener Zellen Zellwachstum in Abwesenheit von ergänzenden Nährstoffen.
Die zweite Kategorie ist dominate Selektion, was ein Selektionsschema bezeichnet, das bei jedem Zelltyp verwendet wird und nicht den Einsatz einer mutanten Zellinie erfordert. Diese Schemata verwenden typischerweise ein Arzneimittel, um das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen mit einem neuen Gen exprimieren ein Protein, das Resistenz gegen das Arzneimittel verleiht, und überleben die Selektion. Beispiele für solche dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin, Southern, P. und Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 (1982), Mycophenolsäure, Mulligan, R.C. und Berg, P., Science 209,1422 (1980), oder Hygromycin, Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410-413 (1985). Diese drei eben angegebenen Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegen das geeignete Arzneimittel Neomycin (G418 oder Geneticin), xgpt (Myophenolsäure) bzw. Hygromycin.
Vektoren können Steuerbereiche, d. h., spezifische Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden von eukaryotischen Genen enthalten, die zur Steuerung entweder von Transkription oder Translation beitragen können. Tatsächlich besitzen alle eukaryotischen Gene einen AT-reichen Bereich, der sich ungefähr 25 - 30 Basen oberhalb der Stelle, wo Transkription initiert wird, befindet. Eine andere entdeckte Sequenz, 70-80 Basen oberhalb des Transkriptionsstarts, ist der CXCAAT-Bereich, wobei X jedes Nukleotid bedeuten kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene befindet sich eine eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für die Addition des Polyadenylierungsschwanzes an das 3'-Ende der transkribierten mRNA sein kann.
Vektoren enthalten Promotoren, d. h. Nukleotidsegmente, die von RNA- Polymerasemolekülen als Transkriptionsstartsignale erkannt werden. Promotoren, die die Transkription aus Vektoren in Säugetierwirtszellen steuern, können aus verschiedenen Quellen erhalten werden, beispielsweise die Genome von Viren, wie z. B. Polyoma, Affenvirus 40 ("Simian Virus 40", SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und Cytomegalovirus, oder aus heterologen Säugetierpromotoren, z. B. β-ActinPromotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden auf herkömmliche Weise als SV40-Restriktionsfragment, das auch den viralen SV40- Replikationsursprung enthält, erhalten. Fiers et al., 1978, "Nature", 273 : 113. Der unmittelbare frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird herkömmlicherweise als HindIII-E-Restriktionsfragment erhalten. Grennaway, P.J. et al., Gene 18, 355-360 (1982). Natürlich sind hierin auch Promotoren der Wirtszelle oder verwandte Spezies brauchbar. Promotoren sind an das Gen ligiert, z. B. zu exprimierender Selektionsmarker. Die Ausrichtung und Stellung von Promotoren ist den Fachleuten bekannt.
Vektoren enthalten wahlweise einen Beschleuniger, ein cis-aktives DNA- Element, üblicherweise mit etwa 10-300 bp, das auf einen Promotor zur Steigerung seiner transkriptionalen Aktivität einwirkt. Die Transkription einer für ein gewünschtes, heterologes Protein kodierenden DNA durch höhere Eukaryoten wird durch Einfügen einer Beschleunigersequenz in den Vektor erhöht. Beschleuniger sind von Ausrichtung und Stellung relativ unabhängig, da sie an 5' (Laimins, L. et al., PNAS 78, 993 [1983]) und an 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 [1983]) zur Transkriptionseinheit oder innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell, 33, 729 [1983]) oder innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1984]) entdeckt wurden. Viele Beschleunigersequenzen sind nun aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise jedoch verwendet man einen Beschleuniger aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele umfassen den SV40- Beschleuniger an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100-270), den Beschleuniger des frühen Cytomegalovirus-Promotors, den Polyoma-Beschleuniger an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirusbeschleuniger.
"Amplifikation" bezieht sich auf die Vermehrung oder Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Amplifikation wird durch Einsatz eines Selektionsmittels, z. B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert erreicht. Amplifikation oder das erfolgreiche Anfertigen von Kopien des DHFR-Gens führt zu größeren Mengen an DHFR, die angesichts größerer Mengen an MTX produziert werden. Ungeachtet der Gegenwart von endogener DHFR wird ein Amplifikationsdruck angelegt, indem immer mehr MTX dem Medium zugefügt werden. Amplifikation eines gewünschten Gens kann durch Kotransfizieren einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid, das eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA besitzt, und mit dem DHFR- oder Amplifikations-Gen, so daß Kointegration auftreten kann. Daß die Zelle mehr DHFR benötigt, was durch Replikation des Selektionsgens erreicht wird, wird dadurch sichergestellt, daß nur Zellen selektiert werden, die in aufeinanderfolgenden Zyklen immer größer werdender MTX- Konzentration wachsen können. Solange das für ein gewünschtes Protein kodierende Gen in das amplifizierbare Gen kointegriert wurde, bewirkt Replikation dieses Gens auch Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Die Folge davon ist, daß vermehrte Kopien des Gens, d. h. eines amplifizierten Gens, das für das gewünschte Protein kodiert, mehr an gewünschtem Protein exprimieren.
"Transfektion" bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, ganz gleich ob irgendwelche Kodiersequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann bekannt, beispielsweise CaPO&sub4; und Elektroporation. Man erkennt erfolgreiche Transfektion im allgemeinen an irgendeinem auftretenden Hinweis auf das Wirken dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle. Im Kontext der vorliegenden Erfindung bezieht sich Transfektion jedoch normalerweise auf stabile Integration eines Onkogens in eine Wirtskultur über zahlreiche Generationen.
Die gewünschten Polypeptide umfassen Polypeptide mit bis hinunter zu ungefähr 5 Resten, sind aber typischerweise Proteine. Die gewünschten Polypeptide stammen von jeder Spezies an Pflanzen, Mikroben oder Tieren, oder können Varianten oder synthetische Polypeptide ohne entsprechendes Gegenstück in der Natur sein. Normalerweise sind die Polypeptide Proteine von Tier und vorzugsweise Mensch mit therapeutischem Nutzen. Enzyme und Hormone sind die am meisten verbreiteten Klassen der gewünschten Polypeptide. Solche Polypeptide umfassen beispielsweise Inhibin, Plasminogenaktivatoren, TGF-β, Activin, Prorelaxin, Superoxid-Dismutasen, Gewebefaktor, Abbaubeschleunigungsfaktor, virale Antigene oder Enkephalinase. Das bevorzugte Polypeptid ist menschlicher t-PA.
Die Wirtsvektorsysteme, die in Übereinstimmung mit dieser Erfindung konstruiert werden, werden unter Bedingungen und in Medien, die ansonsten für die fraglichen Wirtszellen geeignet sind, kultiviert. Verständlicherweise benötigt jedes Wirtsvektorsystem ein unterschiedliches Medium zur optimalen Leistung, doch liegt die Selektion des besten Kulturmediums im Bereich des normalen Fachwissens. Auf ähnliche Weise unterliegen andere Kulturparameter, wie Temperatur, Belüftungsrate, Gasgehalt und dergleichen, üblichem Experimentieren.
Lebensfähige Zellen werden nach irgendeinem herkömmlichen Verfahren bestimmt, obwohl das bevorzugte Verfahren Färben mit Trypan-Blau gefolgt von hämocytometrischer Analyse ist. Im allgemeinen erfolgt Analyse auf lebensfähige Zellen nach ungefähr 7 Tagen Kultur. Während der Sättigungsphase ist der Einfluß des Onkogens am größten, sowohl was die erreichte Maximaldichte als auch den Anteil an gesunden, lebensfähigen Zellen in der gesättigten Kultur betrifft.
Um die folgenden Beispiele zu vereinfachen, werden gewisse häufig auftretende Verfahren und Begriffe beschrieben.
"Plasmide" sind durch ein kleingeschriebenes p bezeichnet, dem Großbuchstaben und/oder Zahlen vorangehen und/oder folgen. Die Ausgangsplasmide hierin sind entweder im Handel erhältlich, uneingeschränkt für die Allgemeinheit erhältlich, oder sie können nach veröffentlichten Verfahren aus verfügbaren Plasmiden konstruiert werden. Außerdem sind nach dem Stand der Technik zu den beschriebenen äquivalente Plasmide bekannt und werden dem durchschnittlich ausgebildeten Fachmann klar sein.
"Digestion" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA, den Restriktionsstellen, angreift. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Kofaktoren und anderen Anforderungen wurden so eingesetzt, wie dem Fachmann mit durchschnittlicher Ausbildung bekannt wäre. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 ug Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung verwendet. Um DNA-Fragmente zur Plasmidkonstruktion zu isolieren, werden typischerweise 5 bis 50 ug DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen digeriert. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme werden vom Hersteller angegeben. Üblicherweise werden Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37ºC eingesetzt, sie können aber entsprechend der Anweisungen des Anbieters variieren. Nach der Digestion wird die Reaktion direkt auf einem Gel laufen gelassen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
"Dephosphorylierung" bezeichnet das Entfernen der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren hindert die beiden Restriktions-gespaltenen Enden eines DNA-Fragments daran, zu "zirkularisieren", oder eine geschlossene Schleife zu bilden, die die Einfügung eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle behindern würde. Die Dephosphorylierung erfolgt mit herkömmlichen Verfahren und Reagenzien. Maniatis, T. et al., CSHL 1982, "Molecular Cloning" S. 133-134 (1982). Umsetzungen unter Verwendung von BAP werden in 50 mM Tris bei 68ºC durchgeführt, um die Wirkung irgendwelcher Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Umsetzungen wurden 1 Stunde lang durchgeführt. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment mit Gel gereinigt.
"Oligonukleotide" bezieht sich auf kurze, ein- oder doppelstrangige Polydesoxynukleotide, die nach bekannten Verfahren chemisch synthetisiert und danach auf Polyacrylamidgelen gereinigt werden können.
"Ligation" bezieht sich auf ein Verfahren zur Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., Id., S. 146). Wenn nicht anders vorgesehen, kann die Ligation unter Verwendung bekannter Puffer und Bedingungen mit 10 Einheiten T4 DNA-Ligase ("Ligase") pro 0,5 ug in etwa äquimolarer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente erreicht werden.
Mit "Auffüllen" oder "Abstumpfen" ist ein Verfahren gemeint, mit dem das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer durch Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Das eliminiert den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Dieses Verfahren ist ein vielseitiges Werkzeug zur Umwandlung eines durch Restriktion geschnittenen Endes, das mit den durch nur eine oder wenige andere Restriktionsenzyme erzeugten Enden kohäsiv sein kann, in einen Terminus, der mit jeder stumpfschneidenden Restriktionsendonuklease oder anderem aufgefüllten kohäsiven Terminus kompatibel ist. Typischerweise wird Abstumpfen durch Inkubieren von 2-15 ug der Ziel-DNA in 10 mM MgCl&sub2;&sub1; 1 mM Dithiotreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5)-Puffer bei etwa 37ºC in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase 1 und 250 uM eines jeden der vier Desoxynukleosidtriphosphate erreicht. Die Inkubation wird im allgemeinen nach 30minütiger Extraktion mit Phenol und Chloroform und Ausfällung mit Äthanol abgeschlossen.
"Northern-Blotting" ist ein Verfahren, wodurch die Gegenwart einer zellulären mRNA durch Hybridisierung an ein bekanntes, markiertes Oligonukleotid oder DNA- Fragment bestätigt wird. Für die Zwecke hierin bedeutet Northern-Analyse, falls nicht anders angegeben, die elektrophoretische Trennung der mRNA auf 1%-iger Agarose in Gegenwart eines Denaturanten (7%-iges Formaldehyd) und den Transfer zu Nitrozellulose-Hybridisierung an dem markierten Fragment, wie von Maniatis, T. et al., Id., S. 202 beschrieben.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Illustration der Erfindung und sollen diese nicht einschränken.

Beispiel 1

Konstruktion der insulinautokrinen Zellinie C2B 13

A) Konstruktion von menschlichem Proinslin-Expressionsvektor

Der cDNA-Klon des Insulingens, pHl3, stellte die Kodierungssequenz des menschlichen Präproinsulingens zur Konstruktion von Plasmiden bereit, um die Expression von Präproinsulin in transfizierten Säugetierzellen zu lenken. Es wurde der Vektor pSVEHIGDHFR konstruiert, der den SV40-Promotor, die für menschliches Präproinsulin kodierende cDNA, die Hepatitis B-Virusoberflächenantigen- Polyadenylierungsstelle und die für Mäuse-Dihydrofolatreduktase kodierende cDNA enthält.
Fig. 1 zeigt die Konstruktionsschritte des Präproinsulinvektors, der verwendet wird, um eine insulinunabhängige Wirtszellinie zu etablieren. Die drei Teile der Konstruktion von pSVEHIGDHFR werden nachstehend im Detail angeführt:

a) pSVEHIGDHFR

1) die für menschliches Präproinsulin kodierende cDNA wurde in einem 440bp- Fragment aus pHI3 durch einen (NcoI-XhoII)-Digest erhalten. PH13 wird in Sures, I. et al., "Science" 208 : 57 (1980) beschrieben. Das die für Präproinsulin kodierende cDNA enthaltende Fragment mit 440 bp wurde isoliert.
2) Ein XbaI-NcoI-Fragment mit 63 bp wurde aus dem 5'-Ende des Insulinrezeptorplasmids (pCVSVE-HIRIc.2, EP-A Nr. 0192392, veröffentlicht am 27. Augsut 1986) isoliert. Dieses Fragment fungierte als ein Linker-Adapter zum Verschmelzen des 5'-Endes der für Präproinsulin kodierenden cDNA an den SV40 frühen Promotor.
3) Der Vektor, pCVSVD22/preUk54, der das Plasmidrückgrat, das an den Linker mit 63 bp ligiert ist, und für das Proinsulingen kodierende Sequenzen bereitstellt, wurde wie nachstehend beschrieben hergestellt. PCVSVD22/preU K54, das Plasmidrückgrat, ist das Produkt einer Drei-Fragment-Ligation, wie im Diagramm von Fig. 3 dargestellt.
i) Der SV40 frühe Promotor wird durch Digerieren von Plasmid pCVSVEHBV (EP- A-117060, veröffentlicht am 29. Augsut 1984) mit Pvul und XbaI erhalten.
ii) Das die Präurokinase cDNA enthaltende Fragment wurde aus Plasmid p preUKs4 trp207-I erhalten (EP-A-0921 82, veröffentlicht am 26. Oktober 1983). Das Plasmid wurde mit CIaI digeriert. Die Clal-Enden werden durch eine Auffüllreaktion abgestumpft. Das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I plus alle 4 Desoxyribonukleotidtriphosphate werden zugegeben, um die CIal vorspringenden einstrangigen Enden aufzufüllen. Nach dem Auffüllen wird Plasmid-DNA mit dem zweiten Enzym, XbaI, digeriert. Das XbaI-CIal (aufgefüllte) preUK54< :DNA-Fragment wurde dann isoliert.
iii) Das den bakteriellen Replikationsursprung, die DHFR cDNA, eukaryotische Expressionseinheit und die 3' untranslatierte Region von Heptatitisvirusoberflächenantigen enthaltende Vektorfragment wurde von pEH ED22 abgeleitet (US-PS-4,624,918, ausgegeben am 25. November 1986). Das Plasmid wurde zuerst mit BamHI geschnitten. Die vorspringenden BamHI-Enden wurden dann durch eine Auffüllreaktion mit Klenow DNA-Polymerase I abgestumpft, wie in dem oben detailliert für Clal-Abstumpfung beschriebenen Verfahren. Nach der BamHI-Digestion und dem Auffüllen wurde die DNA mit XbaI geschnitten und das große Fragment mit 4,3 Kb isoliert.
Diese drei Fragmente wurden miteinander gemischt und in einer gezielten Ligation mit drei Fragmenten ligiert. Das rekombinante pCVSVD22/preUk54 wurde wiedergewonnen. Ligation einer aufgefüllten CIal-Stelle an eine aufgefüllte BamHI-Stelle führt zu einer intakten BamHI-Stelle an dieser Verbindungsstelle.
Um pSVEHIGDHFR zu konstruieren, wurde pCVSVD22/preUk54 mit XbaI und BamHI digeriert und das Vektorfragment isoliert.
Die letzte Ligation mit drei Fragmenten zur Gewinnung von pSVEHIGDHFR verwendete: a) das die cDNA für Proinsulin enthaltende 440bp NcoI-XhoII Fragment; b) ein 63bp XbaI-Ncol-Fragment von pCVSVE-HIRc-2, um die cDNA an den SV40 frühen Promotor zu binden; und c) das XbaI-BamHl -Vektorfragment von pCVSVD22/preUK54,
das die SV40-DH FR-Transkriptionseinheit, den Ampicillinresistenzmarkerreplikationsursprung in E.coli, und das 3'-Ende des Hepatitisoberflächenantigens mit der Polyadenylierungs- und Transkriptionsterminierungs-Stelle enthält. Die drei Fragmente wurden miteinander in einer gezielten Dreiwegligation ligiert und in E.coli transformiert. Transformanten wurden analysiert und der gewünschte Rekombinant identifiziert.

b) pSVEHIGNeo

Fig. 2 zeigt die Schritte zur Konstruktion des Präproinsulinexpressionsvektors pSVEHIGNeo.
Dieser Vektor wurde via Zweifragmentkonstruktion konstruiert. Das erste Fragment war ein HindIII-Fragment des zuvor beschriebenen pSVEHIGDHFR. In dem Fragment war für Präproinsulin kodierende cDNA und der SV40 frühe Promotor, der die Transkription der für DHFR kodierenden DNA initiiert, inkludiert. Das das zweite Fragment umfassende Plasmidrückgrat wurde durch Digerieren an der einzigen HindIII- Stelle gerade stromabwärts des SV40 Promotors von pSVENEEOBa16 (EP-A Nr. 0160457, veröffentlicht am 6. November 1985) erhalten. Das linearisierte Plasmid wurde dann mit alkalischer Kalbsphosphatase behandelt, um Rezirkularisation zu verhindern. Das HindIII-Fragment von pSVEHIGDHFR wurde an der einzigen HindIII- Stelle von pSVENeoBa16 so eingeführt, daß der ursprünglich die Mäuse-SV40-DHFR- Transkriptionseinheit transkribierende SV40 Promotor sich stromaufwärts des Präproinsulingens befindet. Nach der Ligation wird das Plasmid in E.coli 294-Zellen transformiert.
Rekombinante Zellen werden durch Restriktionanalyse identifiziert, um die korrekte Orientierung des die Präproinsulin cDNA enthaltenden Fragments sicherzustellen. In der korrekten Orientierung befindet sich der SV40 Promotor, der ursprünglich das bakterielle Neo-Gen transkribierte, nun stromaufwärts und initiiert die Transkription der Präproinsulin cDNA.
c) pEO Es wurde ein Vektor konstruiert, der die Ornithin-Decarboxylase-(ODC)-cDNA unter der Steuerung des SV40 Promotors enthält, und der eine Hepatitis B- Polyadenylierungssequenz und ein Ampicillin-Gen zur Selektion in E.coli besitzt. Das endogene ODC-Gen kann in Säugetierzellen durch Selektion mit dem ODC-Inhibitor Alphadifluormethylornithin (DFMO) amplifiziert werden. (McCon logue, L. & Coffino, P., J. Biol. Chem. 258, 8384-8388 [1983]; McConlogue, L. & Coffino, P., J. Biol. Chem. 258 : 12083-12086 [1983]).
Fig. 4 zeigt die Schritte zur Konstruktion von pEO via Zweifragmentligation.
1. Ein 1688 bp ODC-Fragment, das den gesamten Kodierungsbereich der ODC enthält, wurde aus einem Plasmid, das in pBR322 geklonte ODC-cDNA enthält, erhalten (McConlogue, L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 540-544 [1984]; Gupta, M. & Coffino, P. J. Biol. Chem. 260 : 2941-2944 [1985]). Das Plasmid wurde mit Sall und PvuII geschnitten. Die Enden wurden durch Auffüllen mit Klenow abgestumpft und das 1688 bp ODC-Fragment wurde auf einem Gel isoliert.
2. Ein 3593 bp Fragment, das den SV40 frühen Promotor, die Hepatitis- Polyadenylierungssequenz und das AMP-Gen zur Selektion in E.coli enthält, wurde aus dem Plasmid pSVPADHFR isoliert. (EP-A Nr. 0,093,619 bezog sich darauf als pETPFR, das durch Zugabe von 192bp-Fragment am SV40 Promotor 5' der für tPA kodierenden DNA modifiziert wurde. Das zusätzliche 192bp-Fragment inkludierte eine zusätzliche HindIII-Stelle.) Das Plasmid wurde mit HindIII und SacII geschnitten, die Enden mit Klenow-DNA-Polymerase aufgefüllt und das 3593-Fragment auf einem Gel isoliert.
Diese beiden Fragmente wurden dann miteinander in einer Zweiweg-Ligation ligiert und bilden pEO. (Siehe Fig. 4). Orientierung und Konfiguration der Fragmente im Endplasmid wurden durch Restriktionsanalyse überprüft.

B) Selektion von insulin-unabhängigen t-PA-Zellen (C2B13)

Um festzustellen, ob endogen produziertes Proinsulin ausreicht, um die Sekretion eines gewünschten Proteins (z. B. t-PA) auf insulin-unabhängige Weise zu unterstützen, erfolgte eine Transfektion auf eine Weise, die ähnlich zu jener in Beispiel 2 beschriebenen war, nur unter Verwendung einer zuvor transformierten Wirtszelle zur Expression eines gewünschten Proteins, in diesem Fall t-PA. Der in Beispiel 1 beschriebene Vektor pSVEHIGNeo wurde in die CHO-Zellinie (als C2B bezeichnet), die amplifizierten tPA und DHFR enthält, transfiziert (EP-A Nr. 0093619). Die Transfektion erfolgte nach dem Kalziumphosphat-Kopräzipitationsverfahren (Simonsen, C.C. & Levinson, A.D., PNAS 80 : 2495-2499 [1983]; Wigler, M. et al., PNAS [USA] 76 : 1242- 1255 [1979]). Transfizierte Zellen, die das Nec-Gen exprimierten, wurden durch Wachstum in G418-hältigem Medium selektiert.
Die mit dem Präproinsulin transfizierten C2B-Zellen wurden auf Insulin- Unabhängigkeit in serumfreien, insulinfreien (SFlF) Rollflaschen und Platten selektiert. Das serumfreie Medium war das zuvor beschriebene, übliche, 350 Osm insulinfreie F- 12/DME-Medium: Glukose; 2xGHT; 10mM Hepes; 1.0 mg/l Transferrin; 1x Spurenelemente; 1 uM Linolensäure; 1·10&supmin;¹&sup0;M T&sub3; und 1·10&supmin;&sup8; M Hydrocortison, Estradiol und Progesteron.
Nach fast zwei Wochen Selektion auf Insulinunabhängigkeit wurden die überlebenden Zellen mit einem 5% an dialysiertem, extrahiertem FBS enthaltendem Medium von sowohl den Platten als auch den Rollflaschen abgenommen und durch Grenzverdünnung 23 Klone abgeleitet. Diese Klone wurden auf tPA-Produktion unter serumfreien Bedingungen in Abwesenheit von Insulin und in Gegenwart variierender Insulinkonzentrationen (einschließlich einer Optimalkonzentration von 20 ug/ml Insulin) gescreent. Klon 13 wurde als der vielversprechendste für die weitere Arbeit ausgesucht.
C2B-(Kontroll)Zellen, insulin-unabhängige C2B/Klon 13-Zellen und der amplifizierte 100 uM DFMO-Pool wurden dreimal in SFIF-Medium gespült und in SFIF- Medium wiederum suspendiert. Klon 13 und die insulin-unabhängigen 100 uM Zellinien produzierten tPA in Abwesenheit von Insulin mit Titern, die äquivalent zu jenen waren, die aus der C2B-Kontrollzellinie in Gegenwart von optimalen Konzentrationen an Insulin erhalten wurden.

Beispiel 2

Herstellung und Identifizierung von t-PA-hypersekretierenden Klonen

Falls nicht anders angegeben, war das Kulturmedium 50/50 F-12/DMEM GHT mit 7,5% an dialysiertem Rinderfötenserum. Verständlicherweise erzeugen andere Kulturmedien größere Mengen an t-PA und höhere Zelldichten als die mit diesem Medium erhaltenen, serumhältiges Medium führte jedoch zu etwas verbesserter Lebensfähigkeit der Zellen. Ungefähr 500.000 C2B13-Zellen, die auf extrazellulären Matrixplatten kultiviert worden waren (Accurate Chemical and Scientific Co.), wurden mit einer CaPO&sub4;-Fällung von pSVsGPT (Mulligan et al., "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A." 78 : 2072-2076 [1981]) und p158-SVE-src-LTR (Snydor et al., "Cell" 32 : 891-901 [1983]) (1 : 10 Gewichtsteile) bei 37ºC 3 h lang transfiziert. Kontrollplasmid (pBR322) wurde
unter denselben Bedingungen transfiziert. Die Zellen wurden danach bei 37ºC unter 5% CO&sub2; auf einem Kulturmedium mit 200-400 ug Hygromycin B/ml kultiviert. Das Medium wurde während dieser Zeit jeden 2. Tag ausgetauscht, um die Antibiotikummenge beizubehalten. Anschließend wurden Kolonien, die sich auf den Platten entwickelt hatten, abgenommen und auft-PA-Synthese und Lebensfähigkeit analysiert. Jeder Klon wurde durch Impfen von 200.000 Zellen in Kulturschalen mit 0,5 ml Kulturmedium kultiviert und an den Tagen 7 und 11 durch t-PA-ELlSA auf t-PA- Expressionsmengen überprüft. Nach dem 6. Tag und alle zwei Tage danach wurde das Volumen pro Schale durch Zugabe von mehr Kulturmedium auf 0,5 ml aufgefüllt, nachdem für Assays jede 30λ-Probe gezogen worden war.
Diese Vorgangsweise wurde viermal wiederholt, was 4 positive Klone von ungefähr 46 Transfektanten-Klonen ergab. Ein positiver Klon wurde definiert als ein Klon, in dem die Menge an t-PA zumindest um 50% höher als in der Stammlinie am 6. Tag war. Ein Klon, 2C2, wurde zur weiteren Analyse ausgewählt.
Klon 2C2 und C2B1 3 wurden wie zuvor beschrieben kultiviert, nur daß t-PA- Analysen jeden zweiten Tag erfolgten. Die Ergebnisse sind anschließend als prozentuelle Erhöhung der t-PA-Ausbeute für Klon 2C2 gegenüber den Ausbeuten, die mit C2B13 unter denselben Kulturbedingungen erhalten wurden, dargestellt. Tag Ausbeutenerhöhung
Die Menge an von 2C2-Zellen produziertem t-PA während des ersten Tages der Kultivierung erreichte etwa das Doppelte der Stammzellinie in wiederholten Experimenten, was beweist, daß die Menge an t-PA pro Zelle durch die src- Transformation erhöht wird. Die gesteigerten Kulturausbeuten konnten auch auf erhöhte Dichte der Kulturzellen zurückgeführt werden. In Fermenter-Durchläufen erreichte die 2C2-Zellinie Dichten von ungefähr 5-7 · 10&sup6; Zellen/ml, während die Stammlinie typischerweise nur Dichten von 1-3 · 10&sup6; Zellen/ml erreichte.
Die src-Transfektanten wiesen auch einen höheren Anteil an lebensfähigen Zellen als Kulturen der Stammlinie auf. Färben mit Trypan-Blau (Gibco) erfolgte durch Trypsinisieren der Zellen in den Kulturnäpfen, Entfernen der Flüssigkeit aus dem Napf, Zentrifugieren der Suspension, um ein Zell-Pellet zu erhalten, Retrypsinisieren des Pellets, Suspendieren der disaggregierten Zellen im Kulturmedium, Zählen der gesamten Zellen mittels Coulter-Zähler, Färben mit Trypan-Blau und Zählen von toten (blauen) Zellen auf einem Hämocytometer. Der Prozentsatz an lebensfähigen Zellen an den Tagen 7 und 8 der Kultur betrug 15% bzw. 13% für die C2B13-Zellen (die Stammzellen) und 92% bzw. 98% für die 2C2-Zellen (die src-Transfektanten), was die Fähigkeit der src-Transfektion, den Wirtszellen langfristige Kulturstabilität bei hoher Dichte zu verleihen, aufzeigt.

Beispiel 3

Erhöhung der t-PA-Expression in nicht-autokrinen Zellen

Es wurde Beispiel 2 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die transformierte Zelle die t-PA-transformierte, in Beispiel 1 beschriebene CHO-Zellinie C2B war. Der stabile C2B-Transformant ist insulin-abhängig. Einer von ungefähr 20 src-Transformanten wies, nach den Kriterien aus Beispiel 2 beurteilt, beträchtlich erhöhte t-PA-Ausbeuten auf.

Claims

1. Verfahren umfassend:

(a) das Transfizieren einer immortalisierten eukaryotischen Wirtsmutterzelle mit Nukleinsäure, die für ein erwünschtes Polypeptid kodiert, und mit einem Onkogen; und

(b) das ldentifzieren der Transfektanten von Schritt (a), die größere Ausbeuten des erwünschten Polypeptids pro Volumen Kulturmedium erzeugen, als aus der Wirtsmutterzelle, die mit Nukleinsäure, die für das erwünschte Polypeptid kodiert, jedoch nicht mit dem Onkogen transfiziert ist, gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Wirtsmutterzelle mit der für das erwünschte Polypeptid kodierenden Nukleinsäure vor dem Transfizieren der Wirtszelle mit dem Onkogen transfiziert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die eukaryotische Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Polypeptid menschlich ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin das Polypeptid ein Plasminogenaktivator, Inhibin, TGF-β, Activin, Prorelaxin, Superoxiddismutase, Gewebefaktor, abbaubeschleunigender Faktor, ein virales Antigen oder eine Enkephalinase ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das Polypeptid t-PA ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, worin die Wirtszelle auch mit einem verstärkbaren Marker transfiziert wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, worin das Onkogen eine virale Nukleinsäure ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Onkogen v-src ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, worin das Polypeptid für die Lebensfähigkeit oder das Wachstum der Wirtsmutterzelle nicht erforderlich ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, weiters umfassend das Kultivieren der Transfektanten von Schritt (b), bis sich das erwünschte Polypeptid in der Kultur ansammelt und das anschließende Gewinnen der erwünschten Polypeptids aus der Kultur.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-11, worin das Polypeptid ein sekretiertes Polypeptid ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, worin die Wirtszelle auch mit Nukleinsäure transfiziert wird, die für einen Polypeptid-Wachstumsfaktor kodiert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin der Wachstumsfaktor Insulin oder Proinsulin ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-14, worin die für das erwünschte Polypeptid kodierende Nukleinsäure nicht unter der transkriptionalen Steuerung ihrer nativen zellularen transkriptionalen Steuersequenzen steht.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die für das erwünschte Polypeptid kodierende Nukleinsäure unter der Steuerung eines viralen Promotors steht.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Polypeptid menschlicher Gewebeplasminogenaktivator (t-PA) ist.

18. Verfahren nach Anspruch 1 7, worin das Onkogen v-src ist und die Wirtszelle einen Nichtprimaten-Säugetierursprung aufweist.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin die Wirtszelle auch mit Nukleinsäure transfiziert wird, die für einen Polypeptid-Wachstumsfaktor kodiert.

20. Wirtszellenkultur umfassend

(a) ein Onkogen unter der transkriptionalen Steuerung eines heterologen Promotors;

(b) ein für ein erwünschtes Polypeptid kodierendes Gen; und

(c) ein das erwünschte Polypeptid enthaltendes Kulturmedium.

21. Zellkultur nach Anspruch 20, worin das erwünschte Polypeptid für das Wachstum oder Überleben der Zellkultur nicht erforderlich ist.