DE60025829T2

DE60025829T2 - Expressionsvektoren und anwendungsmethoden

Info

Publication number: DE60025829T2
Application number: DE60025829T
Authority: DE
Inventors: Vanessa San Mateo CHISHOLM; W. Craig Portola Valley CROWLEY; A. Lynne San Francisco KRUMMEN; G. Yu-Ju Albany MENG
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-11
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-07-12
Also published as: JP2003504059A; EP1196566A1; WO2001004306A1; US20070037254A1; DK1196566T3; EP1196566B1; ES2257303T3; CA2385102A1; AU5927300A; DE60025829D1; ATE317011T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Polynucleotidkonstrukte zum Screenen und Gewinnen von hochexprimierenden Zellen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Herstellung von stabilen Säugetierzelllinien, die ein heterologes Gen von Interesse exprimieren, beginnt mit der Transfektion einer selektierten Zelllinie mit dem heterologen Gen und üblicherweise einem selektierbaren Markergen (z.B. Neomycin^R). Das heterologe Gen und das selektierbare Gen können in einem einzelnen Vektor kloniert und daraus exprimiert werden oder aber aus zwei getrennten Vektoren, die co-transfiziert wurden. Wenige Tage nach der Transfektion werden die Zellen in Medium gegeben, das das Selektionsmittel (z.B. G418 für neo^R-Marker) enthält, und bei Selektion 4–8 Wochen kultiviert. Nachdem sich wirkstoffresistente Kolonien oder Foci gebildet hatten, werden diese Zellen isoliert, vermehrt und auf Expression des erwünschten Genprodukts gescreent. Werden das Gen von Interesse und das selektierbare Markergen aufgrund von fehlender physikalischer Bindung zwischen dem selektierbaren Markergen und dem Produktgen an getrennten Vektoren kloniert, die in die Wirtszelle co-transfiziert sind, so ist Überleben unter Wirkstoffselektion kein gutes Zeichen für stabile Einführung und Expression des Gens von Interesse in der Wirtszelle. Die transfizierte Zellpopulation kann eine Fülle von nicht-produktiven Klonen enthalten. Das Ausplattieren und Kultivieren aller transfizierten Zellen einschließlich zahlreicher Nicht-Produzenten konsumiert viel Zeit, Mühe und teure Materialien wie Medium, Serum und Wirkstoffe. Typischerweise ist das Screenen einer großen Anzahl an Kolonien oder Foci erforderlich, um Zellen zu isolieren, die hohe Konzentrationen des Produkts von Interesse exprimieren.
Mehrere Verfahren wurden bisher verwendet, um Gentransformation und -expression zu überwachen. Diese Verfahren umfassen die Verwendung von Reportermolekülen wie Chloramphenicol-Acetyltransferase oder β-Galactosidase oder die Bildung von Fusionsproteinen mit Kodiersequenzen für β-Galactosidase, Glühwürmchen- Luciferase und bakterielle Luciferase. Diese Expressionstests erfordern, dass diese Zellen fixiert und mit exogen zugesetzten Substraten oder Co-Faktoren inkubiert werden, wodurch die Zellprobe zerstört wird, und können nur eingeschränkt verwendet werden, wenn Zelllebensfähigkeit aufrechterhalten werden muss. Ein Verfahren, das auf der Co-Expression von E.-coli-β-gal-Enzym basiert, ermöglicht zytometrisches Sortieren von Lebendzellen (Nolan et al., PNAS USA 85, 2603–2607 (1988)). Hierbei ist jedoch eine hypotonische Behandlung erforderlich, um die Zellen mit dem fluorogenen Substrat vorzubeladen, und die Aktivität muss nach einer bestimmten Zeitspanne vor dem Sortieren inhibiert werden.
Das Aufkommen von grünfluoreszierendem Protein (GFP) als Reportermolekül stellte mehrere Vorteile beim Screenen und Identifizieren von Zellen, die das heterologe Gen exprimieren, bereit. Co-Expression von GFP ermöglicht Echtzeitanalyse und das Sortieren von Transfektanten durch Fluoreszenz ohne das Erfordernis von zusätzlichen Substraten oder Cofaktoren und ohne Zerstörung der Zellprobe. Die Verwendung von GFP als Reportermolekül zur Überwachung von Gentransfer wurde in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben. Chalfie et al. beschreiben im US-Patent Nr. 5.491.084 ein Verfahren zur Selektion von Zellen, die ein Protein von Interesse exprimieren, das Co-Transfektion von Zellen mit einem DNA-Molekül, das eine Sequenz enthält, die für ein Protein von Interesse kodiert, und einem zweiten DNA-Molekül, das für GFP kodiert, und anschließendes Selektieren von Zellen, die GFP exprimieren, umfasst. Gubin et al. beschreiben in Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 347–350 (1997), Transfektion von CHO-Zellen mit einem Plasmid, das für GFP und neo kodiert, um die stabile Expression von GFP in Abwesenheit von selektiven Wachstumsbedingungen zu untersuchen. Mosser et al. beschreiben in Biotechnique 22, 150–154 (1997), die Verwendung eines Plasmids, das eine dicistronische Expressionskassette enthält, die für GFP und ein Targetgen kodiert, in einem Verfahren zum Screenen und Selektieren von Zellen, die induzierbare Produkte exprimieren. Das Targetgen wurde an einen steuerbaren Promotor gebunden. Das Plasmid inkorporiert eine virale interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES), um die Expression einer dicistronischen mRNA, die sowohl für GFP als auch ein Protein von Interesse kodiert, zu ermöglichen. Dieses von Mosser beschriebene Plasmid enthält kein selektierba res Gen; das selektierbare Gen wird in einem getrennten Plasmid bereitgestellt, das mit dem GFP/Targetgen-kodierenden Plasmid nacheinander transfiziert oder co-transfiziert wird. Diesem Expressionssystem fehlt räumliche und transkriptionale Bindung zwischen dem Gen von Interesse, dem Wirkstoff-selektierbaren Marker und GFP. Levenson et al., Human Gene Therapy 9, 1233–1236 (1998), beschreiben Retrovirusvektoren, die einen einzelnen Promotor, gefolgt von einer Mehrfach-Klonierungsstelle, eine virale interne Ribosomeneintrittsstellen-(IRES-)Sequenz und ein selektierbares Markergen enthalten. Die verwendeten selektierbaren Marker waren jene, die Resistenz gegenüber G418, Puromycin, Hygromycin B, Histidinol D und Phelomycin verliehen, und umfassten auch GFP.
Frühere Vektoren, die eine interne Ribosomeneintrittsstelle inkorporieren, abgeleitet von Elementen der Picornavirus-Familie, worin die IRES zwischen dem Produktgen und dem stromab gelegenen selektierbaren Markergen angeordnet ist, wurden bereits beschrieben (siehe Pelletier et al., Nature 334, 320–325 (1988); Jang et al., J. Virol. 63, 1651–1660 (1989); und Davies et al., J. Virol. 66, 1924–1932 (1992)).
GFP wurde bereits erfolgreich an andere Wirkstoff-resistente Genprodukte fusioniert (siehe z.B. Bennett et al., Biotechniques 24, 478–482 (1998); Primig et al., Gene 215, 181–189 (1998)). Bennett et al. beschreiben ein GFP, das an ein Zeomycin^TM-Resistenzgen (Zeo^®) fusioniert ist, um einen bifunktionellen selektierbaren Marker zur Identifikation und Selektion von transfizierten Säugetierzellen zu bilden. Primig beschreibt einen GFPneo-Vektor zur Untersuchung von Enhancern.
Lucas et al. beschreiben in Nucleic Acids Res. 24, 1774–1779 (1996), Expressionsvektoren für CHO-Zellen, die sowohl den amplifizierbaren selektierbaren Marker DHFR als auch eine cDNA von Interesse aus einem einzelnen primären Transkript über differenzielles Spleißen exprimieren. Crowley beschreibt im US-Patent Nr. 5.561.053 ein Verfahren zur Selektion von hochproduzierenden Wirtszellen unter Verwendung eines DNA-Konstrukts, das ein amplifizierbares selektierbares Gen, das innerhalb eines Introns angeordnet ist, und ein Produktgen stromab enthält. Sowohl das amplifizierbare selektierbare Gen als auch das Produktgen unterliegen der Steu erung einer einzelnen Transkriptionsregulationsregion. Die Zellen werden unter Bedingungen kultiviert, um Genamplifikation auftreten zu lassen. Die Vektoren und Selektionsverfahren von Lucas et al. und Crowley binden kein GFP ein, um Screening zu erleichtern. In diesen und anderen Berichten wurde GFP nie in Verbindung mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker in einem einzelnen Vektor verwendet, um ein Protein von Interesse zu exprimieren.
Die EP 0711835 beschreibt Expressionskonstrukte, die einen Selektionsmarker wie den dominanten Selektionsmarker Hygromycin-B-Phosphotransferase (HPH) enthalten. HPH ist eng mit dem amplifizierbaren Gen DHFR verbunden, um ihre Co-Amplifikation als ein doppeldominanter Marker zu fördern. Die DHFR/HPH-Fusion ist operabel an denselben Promotor wie das Gen von Interesse („Fremdgen") gebunden, wodurch eine räumliche und transkriptionelle Bindung zwischen dem amplifizierbaren Gen und dem Gen von Interesse aufrechterhalten wird (siehe 1).
Aus der obigen Erläuterung geht eindeutig hervor, dass es Entwicklungspotential für ein besseres Expressionssystem gibt, das die Effizienz von Selektion von und Screening auf rekombinante(n) Zellen, die hohe Konzentrationen eines erwünschten Produkts exprimieren, verbessert. Es wäre von Vorteil, das Gen von Interesse und die selektierbaren Marker in einem einzelnen Vektor zur Verfügung zu haben und in der Lage zu sein, auf rekombinante Wirtszellen zu selektieren, die das Gen von Interesse amplifizierten, um das Produktionsniveau zu optimieren. Weiters wäre es von Vorteil, wenn das Screeningverfahren das Screenen von großen Mengen an Zellen zugleich ermöglichte und weniger arbeitsintensiv wäre. Die vorliegende Erfindung kommt den Einschränkungen herkömmlicher Vektoren und Screeningverfahren bei und stellt weitere Vorteile bereit, die aus der nachstehenden detaillierten Beschreibung klar hervorgehen werden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt Vektoren bereit, die ein effizienteres Verfahren zur Identifikation und Selektion von bzw. auf stabile(n) eukaryotische(n) Zellen, die hohe Konzentrationen eines erwünschten Produkts exprimieren, ermöglichen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Polynucleotid bereit, das die folgenden drei Komponenten umfasst: a) ein amplifizierbares selektierbares Gen; b) ein grün fluoreszierendes Protein-(GFP-)Gen; und c) zumindest eine Klonierungsstelle zur Insertion einer selektierten Sequenz, die für ein erwünschtes Produkt kodiert, worin die selektierte Sequenz operabel an entweder das amplifizierbare selektierbare Gen oder das GFP-Gen und an einen Promotor gebunden ist. Das Polynucleotid umfasst zwei Transkriptionseinheiten.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das amplifizierbare selektierbare Gen aus der aus den Genen, die für Dihydrofolatreductase (DHFR) und Glutaminsynthetase kodieren, bestehenden Gruppe ausgewählt. Das DHFR-Gen ist am meisten bevorzugt.
Die GFPs, die zur Verwendung in den Polynucleotiden der Erfindung geeignet sind, umfassen Wildtyp- sowie mutiertes GFP. In einer Ausführungsform kodiert das Polynucleotid für eine GFP-Mutente, die eine höhere Fluoreszenz-Intensität als das Wildtyp-GFP aufweist. Ein spezifisches mutiertes GFP ist GFP-S65T mit einer Serin-zu-Threonin-Substitution an Aminosäure 65 des Wildtyp-Proteins aus Aequorea victoria.
Die Polynucleotide gemäß den vorangehenden Ausführungsformen umfassen weiters ein Intron zwischen dem Promotor und der selektierten Sequenz, wobei das Intron durch eine 5'-Spleißdonorstelle und eine 3'-Spleißakzeptorstelle definiert ist. Introns, die zur Verwendung in den vorliegenden Vektoren geeignet sind, sind vorzugsweise effiziente Introns, die eine Spleißeffizienz von zumindest 95% bereitstellen. Ein Konstrukt enthält das amplifizierbare selektierbare GFP-Fusionsgen innerhalb des Introns positioniert, worin sowohl das Fusionsgen als auch die selektierte Sequenz operabel aneinander und an den Promotor, der 5' vom Intron vorhanden ist, gebunden sind.
In Bezug auf alle Zwei-Transkriptionseinheiten-Konstrukte, die hierin beschrieben werden, geht eindeutig hervor, dass die Positionen des amplifizierbaren selektierbaren Gens und des GFP-Gens umgekehrt werden können, d.h. ihre Positionen sind untereinander austauschbar.
Die Erfindung stellt weiters ein Polynucleotid mit zwei Transkriptionseinheiten bereit, worin das Polynucleotid eine erste Transkriptionseinheit, die einen ersten Promotor gefolgt von einem Intron und der selektierten Sequenz umfasst; und eine zweite Transkriptionseinheit, die einen zweiten Promotor und ein Intron 3' vom zweiten Promotor umfasst; umfasst. Das Intron in der ersten Transkriptionseinheit ist das erste Intron, und das Intron in der zweiten Transkriptionseinheit ist das zweite Intron; beide, das erste und das zweite Intron, sind durch eine 5'-Spleißdonorstelle und eine 3'-Spleißakzeptorstelle definiert, wodurch eine Spleißeffizienz von zumindest 95 bereitgestellt wird. In dieser Ausführungsform kann das amplifizierbare selektierbare Gen im Intron in der ersten Transkriptionseinheit positioniert sein, worin sowohl das amplifizierbare selektierbare Gen als auch die selektierte Sequenz operabel an den ersten Promotor gebunden ist, während das GFP 3' vom leeren zweiten Intron positioniert und operabel an den zweiten Promotor in der zweiten Transkriptionseinheit gebunden ist. Umgekehrt kann das GFP-Gen im Intron in der ersten Transkriptionseinheit und das amplifizierbare selektierbare Gen in der zweiten Transkriptionseinheit positioniert sein. Die zweite Transkriptionseinheit kann weiters eine selektierte Sequenz umfassen, die operabel an den zweiten Promotor gebunden ist. Die selektierte Sequenz in der ersten Transkriptionseinheit ist die erste selektierte Sequenz, und die selektierte Sequenz in der zweiten Transkriptionseinheit ist die zweite selektierte Sequenz, worin die zweite selektierte Sequenz für ein zweites erwünschtes Produkt innerhalb des Polynucleotids kodiert. Im Konstrukt dieser Konfiguration kann das amplifizierbare selektierbare Gen im ersten Intron positioniert und das GFP-Gen im zweiten Intron positioniert sein. Alternativ dazu können die Positionen dieser zwei Genen umgekehrt werden.
In einer separaten Ausführungsform des Polynucleotids, das zwei Transkriptionseinheiten zusätzlich zum zweiten Intron enthält, kann die zweite Transkriptionseinheit weiters eine IRES 3' von der zweiten selektierten Sequenz umfassen. In einem Polynucleotid dieser Konfiguration ist das amplifizierbare selektierbare Gen im ersten Intron positioniert und operabel an den ersten Promotor gebunden, und das GFP-Gen ist 3' von der IRES positioniert und operabel an den zweiten Promotor gebunden.
In den vorangehend genannten Polynucleotiden, die zwei Transkriptionseinheiten und einen Promotor in jeder Einheit enthalten, können dieselben oder unterschiedliche Promotortypen als erster Promotor und zweiter Promotor verwendet werden. Es werden Polynucleotide bereitgestellt, worin einer oder mehrere der Promotoren in den Transkriptionseinheiten ein induzierbarer Promotor ist/sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor in der Transkriptionseinheit oder den Transkriptionseinheiten der CMV-IE- oder der SV40-Promotor.
In bevorzugten Ausführungsformen enthalten die Polynucleotide der Erfindung eine selektierte Sequenz, die für ein Protein kodiert, das aus der aus Cytokinen, Lymphokinen, Enzymen, Antikörpern und Rezeptoren bestehenden Gruppe ausgewählt ist. In spezifischen Ausführungsformen kodiert die selektierte Sequenz für Neuronotrophin-3, Desoxyribonuclease, Gefäßendothelwachstumsfaktor, Immunglobulin und Her2-Zelloberflächenprotein.
Ist das erwünschte Produkt ein mehrkettiger (z.B. ein heterodimerer) Rezeptor, so kann die erste selektierte Sequenz für eine Polypeptidkette des mehrkettigen Rezeptors kodieren, und die zweite selektierte Sequenz kann für eine zweite Polypeptidkette des Rezeptors kodieren. Ist das mehrkettige Protein ein Immunglobulin, so kann die erste selektierte Sequenz für die schwere Immunglobulinkette (H) kodieren, und die zweite selektierte Sequenz kodiert für die leichte (L-)Kette. In bevorzugten Ausführungsformen ist das aus dem Polynucleotid exprimierte Immunglobulin ein humanisiertes Immunglobulin. Die Erfindung stellt ein Polynucleotid bereit, in dem die selektierten Sequenzen für einen Anti-IgE-Antikörper kodieren. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Anti-IgE der humanisierte E26-Antikörper voller Länge mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 (H-Kette) und Seq.-ID Nr. 2 (L-Kette), die in 13A bzw. 13B gezeigt sind.
Ein Polynucleotid der Erfindung, das in einer eukaryotischen Wirtszelle repliziert, wird ebenfalls bereitgestellt.
Die Erfindung stellt auch Wirtszellen bereit, sowohl Bakterien- als auch eukaryotische Wirtszellen, die die Polynucleotide der Erfindung enthalten. Eine bevorzugte Säugetierzelle ist eine Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelle. Ist das in den Konstrukten vorhandene amplifizierbare selektierbare Gen das DHFR-Gen, so ist die bevorzugte Wirtszelle eine CHO-Zelle mit einem DHFR^–-Phänotyp. Die Erfindung stellt Wirtszellen bereit, die ein erwünschtes Produkt produzieren, das aus der aus Neuronotrophin-3, Desoxyribonuclease, Gefäßendothelwachstumsfaktor, Her2 und Anti-IgE-Antikörper bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines erwünschten Produkts durch Einführen eines Polynucleotids der Erfindung in eine geeignete eukaryotische Zelle, Kultivieren der resultierenden eukaryotischen Zelle unter Bedingungen, um das erwünschte Produkt zu exprimieren, und Gewinnen des erwünschten Produkts. Vorzugsweise wird das erwünschte Produkt aus der Zelle sekretiert, wobei es aus dem Kulturmedium gewonnen werden kann.
Eine Zelle, die ein erwünschtes Produkt exprimiert, kann durch Einführen eines Polynucleotids der Erfindung in eine Population eukaryotischer Zellen und Isolieren der resultierenden Zellen, die das grün fluoreszierende Gen und das amplifizierbare selektierbare Gen exprimieren, gewonnen werden, wobei Expression von diesen Genen ein Hinweis darauf ist, dass die Zelle auch das erwünschte Produkt exprimiert. Zellen, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, können durch Sortieren unter Verwendung des fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) isoliert werden, um hochfluoreszierende Zellen, die vorzugsweise die hellsten 1%–10% der fluoreszierenden Zellen innerhalb der sortierten Population sind, zu sortieren und klonieren.
Die Zellen können wiederholten Sortierdurchgängen unterzogen werden, um die hellsten fluoreszierenden Zellen anzureichern. Die Zellen werden zwischen jedem Sortier- und Klonierungsdurchgang eine bestimmte Zeit lang, vorzugsweise etwa zwei Wochen lang, kultiviert. Vorzugsweise werden die Zellen während dieses Zeitraums in Selektionsmedium kultiviert. Vorzugsweise werden die Zellen während dieser Zeitspanne in Selektionsmedium kultiviert. Vorzugsweise werden die hochfluoreszierenden Zellen in Selektionsmedium kultiviert, das ein geeignetes Amplifikationsmittel enthält, um zumindest das amplifizierbare selektierbare Gen und die selektierte Sequenz zu amplifizieren. Genamplifikation kann durch Aussetzen der Zellen gegenüber ansteigenden Mengen des Amplifikationsmittels in Kultur erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das amplifizierbare selektierbare Gen-DHFR und das Amplifikationsmittel Methotrexat. Nachdem die Zellen Genamplifikation durch Kultivieren in Gegenwart des Amplifikationsmittels unterzogen wurden, werden die Zellen näher analysiert, um Expression des erwünschten Proteins zu bestätigen und die hochproduzierenden Zellen zu identifizieren und isolieren. In einer Ausführungsform wird Expression des erwünschten Proteins durch Analysieren der Zellen auf RNA, die für das erwünschte Produkt kodiert, unter Verwendung des Verfahrens von RT-PCR bestimmt, worin die Menge an spezifischer RNA auf das Produktionsniveau des erwünschten Produkts hinweist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt schematisch 9 Beispiele für Konstruktentwürfe. Gen bezieht sich auf das Gen von Interesse; leer bezeichnet ein Intron ohne ein insertiertes Gen; DHFR-GFP bezieht sich auf das Fusionsgen.
2 zeigt die Translationsprodukte und ihre relativen Mengen, die aus verschiedenen Transkripten resultieren, gespleißt und ungespleißt. Die 2A, 2B und 2C entsprechen den Konfigurationen 1, 3 bzw. 4 in 1. Goi steht für Gen von Interesse; TU, Transkriptionseinheit; T1–4 beziehen sich auf die verschiedenen Transkripte aus der angegebenen Region des Konstrukts.
3 zeigt schematisch Intron- und IRES-Kombinationen in einem Vektor, der eine einzelne Transkriptionseinheit zur Expression des Gens von Interesse aufweist. Für GFP-Selektion kann das GFP-Gen ein im Intron liegendes Gen (transkriptional gebunden) sein, nach der IRES-Sequenz (translational gebunden) liegen oder als ein Fusionsprotein, das an einen selektierbaren Marker gebunden und im Intron oder nach der IRES-Sequenz angeordnet ist, exprimiert werden.
4 zeigt Intron- und IRES-Kombinationen in mehrfachen Transkriptionseinheiten-Konfigurationen zur Expression der beispielhaften E26-Antikörper-Schwer- und -Leichtkette, um den vollständigen E26-Antikörper zu bilden.
5 zeigt ein beispielhaftes, im Intron liegendes DHFR-Intron-Vektorkonstrukt, pSV15.ID.LLn, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
6 zeigt ein Beispiel für den Zwei-Transkriptionseinheiten-Vektor zur Expression von VEGF; siehe 1, Konfiguration 4.
7 zeigt, dass GFP-Protein in Zelllysaten, das durch ELISA gemessen wurde, mit GFP-Fluoreszenz, die mittels FACS gemessen wurde, in 18 GFP-exprimierenden Klonen korrelierte (Korrelationskoeffizient = 0,99, p < 0,0001). Die Fehlerbalken waren Standardabweichungen aus zumindest zwei ELISA-Datenpunkten.
8A zeigt NT3-Produktivität gegenüber GFP-Fluoreszenz in 17 NT3-GFP-produzierenden Klonen (Korrelationskoeffizient = 0,68, p = 0,0018); 8B zeigt relative NT3-RNA- gegenüber NT3-Produktivität (Korrelationskoeffizient = 0,89, p < 0,0001).
9A zeigt DNase-Produktivität gegenüber GFP-Fluoreszenz in 15 DNase-GFP-produzierenden Klonen (Korrelationskoeffizient = 0,52, p < 0,048); die Fehlerbalken waren Standardabweichungen von zumindest 3 ELISA-Datenpunkten. 9B zeigt relative DNase-RNA- gegenüber DNase-Produktivität (Korrelationskoeffizient = 0,90, p < 0,0001). Die Fehlerbalken waren Standardabweichungen von zwei RT-PCR-Messungen.
10 zeigt die Durchflusszytometrieprofile von CHO-Zellen, die VEGF und GFP exprimieren. 10A zeigt das Fluoreszenzprofil von Zellen zwei Wochen nach Transfektion kurz vor dem ersten Sortierdurchgang. Die Fluoreszenzintensität der rechten Peaks beträgt 0,025 mfe. Die Hintergrundfluoreszenz der nicht-transfizierten Zellen betrug 0,0005 mfe. 10B zeigt das Fluoreszenzprofil von Zellen kurz vor dem dritten Sortierdurchgang. Die mittlere Fluoreszenzintensität betrug 1,2 mfe. Diese Zellen wurden durch Sammeln von 35.000 Zellen mit der Fluoreszenz der obersten 2,5% bei der ersten Sortierung und 50.000 Zellen mit der Fluoreszenz der obersten 1,5% bei der zweiten Sortierung erhalten. Die Zellen wurden zwei Wochen lang zwischen den Sortierdurchgängen gezüchtet. Zellen mit der Fluoreszenz der obersten 0,5% wurden mittels FACS kloniert. 10C zeigt das Fluoreszenzprofil des Klons mit der höchsten Fluoreszenz. Die Fluoreszenzintensität betrug 5,0 mfe.
11A zeigt VEGF-Produktivität gegenüber GFP-Fluoreszenz in 48 VEGF-GFP-produzierenden Klonen (Korrelationskoeffizient = 0,70, p < 0,0001). Konzentrationen von VEGF waren der Durchschnitt von zumindest 3 Datenpunkten. Die Fehlerbalken waren Standardabweichungen. 11B zeigt relative VEGF-RNA- gegenüber VEGF-Produktivität (Korrelationskoeffizient = 0,90, p < 0,0001). 11C zeigt relative GFP-RNA- gegenüber GFP-Fluoreszenz (Korrelationskoeffizient = 0,78, p < 0,0001). 11 D zeigt relative VEGF-RNA gegenüber relativer GFP-RNA (Korrelationskoeffizient = 0,71, p < 0,0001). Die Fehlerbalken waren Standardabweichungen von zwei RT-PCR-Messungen. Die Menge von VEGF- oder GFP-RNA wurde bezogen auf die RNA im Klon mit der höchsten Fluoreszenz normalisiert.
12 zeigt einen Vergleich von VEGF-Produktivität unter den 5 besten produzierenden Genen, die entweder durch zufälliges Auswählen und Screenen von VEGF-Klonen (leere Quadrate) oder durch FACS-Sortieren basierend auf GFP-Fluoreszenzintensität und Klonieren von VEGF-GFP-produzierenden Zellen (leere Kreise) gewonnen wurden; und unter den 5 besten Populationen in MTX, die entwe der durch zufälliges Auswählen von VEGF-produzierenden Populationen (3 aus 25 nM, 1 aus 50 nM und 1 aus 100 nM) (volle Quadrate) oder durch Fluoreszenzmikroskopie-Screenen von VEGF-GFP-produzierenden Zellen (2 aus 25 nM und 3 aus 50 nM) (volle Kreise) erhalten wurden.
13 zeigt die Aminosäuresequenzen der schweren Ketten voller Länge (13A, Seq.-ID Nr. 1) und der leichten Ketten voller Länge (13B, Seq.-ID Nr. 2) des Anti-IgE-Antikörpers E26.
14 zeigt E26-Antikörper-Expressionsniveaus aus verschiedenen GFP-Konfigurationen. Die Markierung unter jedem Balken des Diagramms bezeichnet in der Reihenfolge 5' zu 3' den Promotor, der verwendet wurde, um die H-Kette zu transkribieren (SV40 oder MPSV = Myeloproliferativer Sarkomviruspromotor und Enhancer oder VISNA = ein Lentivirus P/E), den selektierbaren Marker im ersten Intron (DHFR, GFP, PD=Puromycin/DHFR-Fusion, DHFR/GFP=Fusion), den Promotor, der verwendet wurde, um die L-Kette zu transkribieren, und den Marker, der im zweiten Intron der zweiten Transkriptionseinheit vorhanden ist. Leer bezieht sich auf ein leeres Intron; IR/GFP bezieht sich auf IRES gefolgt von GFP-Gen mit dem zweiten leeren Intron.
15 zeigt die mittleren GFP-Werte von Zellen, die E26 aus Vektoren mit verschiedenen Konfigurationen von GFP exprimieren.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Erfindung stellt Vektoren bereit, die das amplifizierbare selektierbare Gen, das GFP-Gen und eine Sequenz, die für ein erwünschtes Produkt kodiert, umfassen, worin diese Elemente in einem einzelnen Vektor vorhanden sind und worin zwei oder mehrere dieser Elemente der Transkriptionssteuerung desselben Promotors unterliegen. Expression von GFP zusammen mit einem amplifizierbaren selektierbaren Marker liefert ein effizienteres Verfahren der Selektion und Identifikation von eukaryotischen Zellen, die ein heterologes Gen bei hohen Konzentrationen exprimieren. Der amplifizierbare selektierbare Marker ermöglicht nicht nur Selektion von stabilen transfizierten Säugetierzelllinien, sondern ermöglicht auch Amplifikation des heterologen Gens von Interesse. Wie nachstehend gezeigt erreichten die Vektoren und Verfahren der Erfindung hohe Expression von Proteinen mit variierenden Charakteristika. Diese Proteine umfassen Enzyme, Antikörper, sekretierte Proteine, Zelloberflächenrezeptoren sowie neue Proteine mit bisher unbekannter Funktion, deren offene Leseraster aus Sequenzdatenbanken gebildet oder zusammengefügt wurden. Somit sind die Vektoren der Erfindung im Rahmen von Hochdurchsatz-Screenen auf dem Gebiet der Genomforschung ebenfalls nützlich.
GFP-Fluoreszenz stellt ein nicht-invasives Verfahren für früheres und rascheres Screenen von transfizierten Zellen bereit. Die geringe Größe von GFP ermöglicht das Beibehalten einer kleinen Gesamtgröße der Vektoren, wodurch hohe Transformations- und Transfektionseffizienz erzielt werden kann. Grün fluoreszierendes Protein erfordert keine Substrate, Co-Faktoren oder Enzyme für seine Fluoreszenz, was das Protein darin einzigartig macht, dass es in Echtzeit nachgewiesen werden kann. Die Detektion von intrazellulärem GFP erfordert nur Bestrahlung durch nahes UV- oder Blaulicht. Da GFP keine Färbungsverfahren erfordert, ist es eine bessere Alternative als herkömmliche Enzym- und Antikörper-basierte Verfahren zur Überwachung von Genexpression in einzelnen Zellen. Expression von GFP scheint Zellwachstum oder -funktion nicht zu stören. Die GFP exprimierenden Zellen können mittels fluoreszenzaktiviertem Zellsortieren aussortiert werden. Der FACS kann mehr als 2.000 Zellen/s, zwischen etwa 3.000–10.000 Zellen/s, sortieren, was es ermöglicht, eine große Anzahl an Zellen zu screenen, um hochproduktive Klone zu finden. Er reduziert die Arbeitsmenge erheblich und ermöglicht die Gewinnung hochproduzierender Klone, wenn keine ELISA für das erwünschte Protein verfügbar ist.
Es wird angenommen, dass engere räumliche sowie transkriptionale und translationale Bindung zwischen dem amplifizierbaren selektierbaren Markergen und dem Gen von Interesse die Wahrscheinlichkeit von Co-Amplifikation von beiden Genen unter Selektionsdruck erhöhen würde. Anfänglich jedoch war die Gesamtheit des integrierten Expressionsvektors und der Transkriptionsbindung zwischen dem Produktgen von Interesse und dem amplifizierbaren Gen sowie dem GFP-Reportergen bei Amplifikation nicht vorhersagbar. Es war möglich, dass das Gen von Interesse und/oder das GFP-Gen während der Amplifikation deletiert werden kann, wie davor bereits in Bezug auf das DHFR-Gen berichtet wurde (Kaufman et al., Mol. & Cell. Biol. 12, 1069–1076 (1981); Kaufman & Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601–621 (1982)). Überraschenderweise zeigte, wie in den Beispielen veranschaulicht wird, die Verwendung der Polynucleotide der Erfindung eine gute Korrelation zwischen Expression des erwünschten Proteins (durch RNA und Produkttiter) und GFP-Fluoreszenz, was auf eine gute Co-Expressionseffizienz von zwei verbundenen Transkriptionseinheiten und keinen sichtbaren Verlust dieser Gene während der Amplifikation hinweist.
Die Erfindung zeigte auch, dass Sortieren von Zellen nach dem Kriterium der Intensität von GFP-Fluoreszenz unter Verwendung des FACS die Wahrscheinlichkeit erhöhte, hochproduzierende Klone zu erhalten. Tatsächlich wurden durch FACS-Sortieren höherproduzierende Klone als durch zufälliges manuelles Auswählen von 144 Klonen und Screenen durch ELISA erhalten (siehe 12). FACS-Sortieren würde besonders nützlich sein, um hochproduzierende Klone für Moleküle zu erhalten, die schwierig zu exprimieren sind. Die Versuche hierin zeigen auch, dass Klone, die mittels FACS-Sortieren erhalten werden, mit MTX amplifiziert werden könnten, um höherproduzierende Klone zu erhalten.
Darüber hinaus zeigte die Erfindung, dass die Menge an RNA des erwünschten Proteins sehr gut mit dem Produkttiter korrelierte und dass daher hochproduzierende Klone durch Messen der Menge von RNA des erwünschten Proteins in den hochfluoreszierenden Klonen erhalten werden können. Dies ist zum Screenen auf biologische Aktivitäten sehr nützlich, wenn sekretierte Proteine unbekannter Funktion aus der DNA-Sequenz-Datenbank exprimiert werden.
Definitionen
Ein „Polynucleotid" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine nicht natürlich vorkommende, rekombinant produzierte, polymere Form von Nucleotiden beliebiger Länge, entweder von Ribonucleotiden oder Desoxyribonucleotiden, oder auf Analoga davon. Diese Bezeichnung bezieht sich auf die Primärstruktur des Moleküls und umfasst somit doppel- und einzelsträngige DNA sowie doppel- und einzelsträngige RNA. Sie umfasst auch modifizierte Polynucleotide wie methylierte und/oder verkappte Polynucleotide. Das Polynucleotid kann entweder ein Isolat sein oder in ein anderes Nucleinsäuremolekül, z.B. in einen Expressionsvektor oder das Chromosom einer eukaryotischen Wirtszelle, integriert sein. Polynucleotid umfasst selbstreplizierende Plasmide. Die Bezeichnungen „Konstrukt" und „Vektor" werden hierin mit „Polynucleotid" synonym verwendet. Vektor umfasst Shuttle- und Expressionsvektoren. Typischerweise umfasst das Plasmidkonstrukt auch einen Replikationsursprung (z.B. den CoIE1-Replikationsursprung) und einen selektierbaren Marker (z.B. Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz) zur Replikation bzw. Selektion der Plasmide in Bakterien. Ein Polynucleotid oder Konstrukt umfasst auch einen Expressionsvektor, muss jedoch nicht einer sein. Ein „Expressionsvektor" bezieht sich auf ein Konstrukt, das die erforderlichen Regulationselemente zur Expression von zumindest dem amplifizierbaren selektierbaren Gen, dem GFP-Gen und der selektierten Sequenz in der Wirtszelle enthält.
Wie hierin verwendet bezieht sich ein „fluoreszierendes Protein" auf jedes beliebige Protein, das ausreichende Fluoreszenz emittiert, um Fluoreszenzdetektion des Proteins intrazellulär z.B. durch Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Vorzugsweise können Wirtszellen, die fluoreszierende Proteine exprimieren, unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) nachgewiesen werden. Beispiele für fluoreszierende Proteine umfassen grün, cyan, blau, gelb sowie andere fluoreszierende Proteine aus dem Unterstamm der Coelenterata, den Cnidaria (Nesseltieren). Die für das fluoreszierende Protein kodierenden Sequenzen können natürliche (Wildtyp-)Gene oder Varianten von Genen sein, die synthetisch, z.B. durch gentechnische Veränderung, hergestellt werden. Ein bevorzugtes fluoreszierendes Protein ist grün fluoreszierendes Protein (GFP), vorzugsweise aus Aequorea victoria. In einer Ausführungsform wird die Aequorea-GFP-Mutante S65T (nachstehend beschrieben) verwendet.
Zwei gut charakterisierte GFPs stammen aus der Qualle Aequorea victoria und aus einer Koralle (Renilla reniformis). GFPs aus Aequorea und Renilla transmutieren jeweils blaue Chemolumineszenz aus einem bestimmten primären Photoprotein zu grüner Fluoreszenz. Aequorea-GFP ist ein Protein aus 238 Aminosäureresten. Das Protein wird mit blauem Licht mit einem größeren Absorptionspeak bei 395 nm und einem kleineren Peak bei 475 nm angeregt und emittiert grünes Licht bei 508–509 nm. Das reife gereinigte Protein ist hoch stabil, bleibt bis zu 65°C, pH 11, 1% SDS oder 6 M Guanidinumchlorid fluoreszierend und gegenüber den meisten Proteasen über mehrere Stunden hinweg resistent. Renilla-GFP ist ein noch stabileres Protein als Aequorea-GFP; es zeigt einen einzigen Absorptionspeak bei 498 nm mit einem Emissionspeak bei 509 nm. Ein Bericht zu den Eigenschaften von Aequorea- und Renilla-GFPs ist in Chalfic et al., Science 263, 802–805 (1994), und in Cubitt et al., Trends Biochem. 20, 448–455 (1995), zu finden. GFP kann sowohl in transformierten prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen fluoreszieren.
Die Erfindung umfasst die Verwendung von jeder/m beliebigen Form oder Derivat von GFP, die bzw. das ausreichend Fluoreszenz emittiert, um Fluoreszenzdetektion von intrazellulärem GFP durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines fluoreszenzaktivierten Zellsortierers (FACS) oder durch Fluoreszenzmikroskopie zu ermöglichen. GFP, das im Rahmen der Erfindung verwendbar ist, umfasst Wildtyp-GFP sowie natürlich vorkommende (durch spontane Mutation) oder durch Rekombination gentechnisch veränderte Mutanten und Varianten, trunkierte Versionen und Fragmente, funktionelle Äquivalente, Derivate, Homologe und Fusionen der natürlich vorkommenden oder Wildtyp-Proteine. Zahlreiche Mutationen in und rund um die chromophore Struktur von GFP (rund um die Aminosäuren 64–68) wurden bereits beschrieben. Diese Mutationen resultieren in Modifikationen der Spektraleigenschaften, der Schnelligkeit chromophorer Bildung, des Extinktionskoeffizienten und der physikalischen Eigenschaften des GFP. Diese Formen von GFP können im Vergleich zum Wildtyp-GFP veränderte Anregungs- und Emissionsspektren aufweisen oder können über größere Stabilität verfügen. Die mutierten GFPs können mit erhöhter Intensität oder mit sichtbar anderen Farben als das Wildtyp-Protein fluoreszieren, können z.B. fluoreszierende Proteine mit Blau-, Gelb- oder Rotverschiebung sein, worin die DNA, die diese Gene von den Proteinen enthält, im Handel erhältlich ist (Clontech, Palo Alto, CA; Quantum Biotechnologies, Montreal, Kanada). Mutanten mit gesteigerter Fluoreszenz im Vergleich zum Wildtyp-GFP stellen ein sehr viel empfindlicheres Detektionssystem bereit. Mutanten können im Vergleich zu den 2 Peaks, die für das native Protein charakteristisch sind, einen einzelnen Anregungspeak aufweisen, können gegenüber Lichtbleichung resistent sein oder können raschere Oxidation zu Fluorophor aufweisen. Die Aequorea-GFP-Mutante S65T beispielsweise (Heim et al., Nature 373, 663–664 (1995)), in der Ser65 durch Thr substituiert ist, bietet gegenüber dem Wildtyp-GFP mehrere Vorteile darin, dass die Mutante sechsfach höhere Helligkeit als Wildtyp-GFP, raschere Fluorophorbildung, keine Photoisomerisation und nur sehr langsame Lichtbleichung bereitstellt. Modifikationen von Ser65 zu Thr oder Cys resultieren in GFPs, die bei 509 nm weiter maximal emittieren, jedoch einen einzelnen Anregungspeak aufweisen, der zu 488 nm bzw. 473 nm rotverschoben ist. Dies hat mehrere Vorteile darin, dass die Anregungspeaks besser mit jenen, die bereits mit Fluoreszenzmikroskopen und fluoreszenzaktivierten Zellsortierern (FACS) für FITC verwendet wurden, übereinstimmen. Darüber hinaus erfolgt chromophore Bildung dieser Mutanten rascher, und der Extinktionskoeffizient ist größer als jener des wtGFP (Wildtyp-GFP), was in einem stärkeren Fluoreszenzsignal resultiert (Heim et al. (1995), s.o.). Andere GFP-Mutanten weisen Codons auf, die für Säugetierzellexpression optimiert sind sowie größere Fluoreszenz als das ursprüngliche GFP-Gen aufweisen (siehe Bennet (1998), s.u.; Crameri et al., Nature Biotechnol. 14, 315–319 (1996)).
„Humanisierte" oder andere modifizierte Versionen von GFP, einschließlich Basensubstitution zur Veränderung der Codonpräferenz, die Expression in Säugetierzellen auf hohem Niveau begünstigen, sind zur Verwendung in den Konstrukten der Erfindung geeignet (siehe z.B. Hauswirth et al., US-Patent Nr. 5.874.304; Haas et al., US-Patent Nr. 5.795.737). GFP-Mutanten, die fluoreszieren und durch Bestrahlung mit weißem Licht nachgewiesen werden, werden in der WO 9821355 beschrieben. Wiederum andere mutierte GFPs werden im US-Patent Nr. 5.804.387 (Cormack et al.) und der WO 9742320 (Gaitanaris et al.) beschrieben. GFP wurde funktionell als Fusionsprotein exprimiert (siehe z.B. Marshall et al., Neuron 14, 211–215 (1995); Olson et al., J. Cell. Biol. 130, 639–650 (1995); Bennett et al., Biotechniques 24, 478–482 (1998)). Die in der vorliegenden Erfindung nützlichen GFP-Fusionsproteine umfassen Fusionen mit dem amplifizierbaren selektierbaren Marker, der die kombinierten Eigenschaften von amplifizierbarer Selektion und Fluoreszenz der einzelnen Proteine verleiht. Ein Beispiel für solch ein Fusionsprotein ist ein GFP-DHFR-Fusionsprotein. Daher umfasst „grün fluoreszierendes Proteingen", wie es hierin verwendet wird, Sequenzen, die für jedes beliebige der vorangehenden Polypeptide kodieren.
Ein „selektierbares Markergen" ist ein Gen, das es Zellen ermöglicht, das Gen, für oder gegen das spezifisch selektiert werden soll, in Gegenwart eines entsprechenden Selektionsmittels zu tragen. Beispielsweise kann ein antibiotisches Resistenzgen als ein positives selektierbares Markergen verwendet werden, das ermöglicht, dass auf die Wirtszelle, die mit dem Gen transformiert ist, in Gegenwart des entsprechenden Antibiotikums positiv selektiert wird; eine nicht-transformierte Wirtszelle wäre unter den Selektionskulturbedingungen nicht zu Wachstum oder Überleben in der Lage. Selektierbare Marker können positiv, negativ oder bifunktionell sein. Positive selektierbare Marker ermöglichen Selektion auf Zellen, die den Marker tragen, während negative Selektionsmarker ermöglichen, dass Zellen, die den Marker tragen, selektiv eliminiert werden. Typischerweise verleiht ein selektierbares Markergen Resistenz gegenüber einem Wirkstoff oder kompensiert einen metabolischen oder katabolischen Mangel in der Wirtszelle. Die hierin verwendeten selektierbaren Markergene, einschließlich der amplifizierbaren selektierbaren Gene, umfassen Varianten, Fragmente, funktionelle Äquivalente, Derivate, Homologe und Fusionen des nativen selektierbaren Markergens, solange das kodierte Produkt die selektierbare Eigenschaft beibehält. Nützliche Derivate weisen im Allgemeinen wesentliche Sequenzähnlichkeit (auf der Ebene der Aminosäuren) in Regionen oder Domänen des selektierbaren Markers, die mit der selektierbaren Eigenschaft in Verbindung stehen, auf. Zahlreiche verschiedene Markergene wurden bereits beschrieben, einschließlich bifunktioneller (d.h. positiver/negativer) Marker (siehe z.B. die WO 92/08796, veröffentlicht am 29. Mai 1992, und die WO 94/28143, veröffentlicht am 8. Dezember 1994). Selektierbare Gene, die üblicherweise mit eukaryotischen Zellen verwendet werden, umfassen beispielsweise die Gene für Aminoglykosidphosphotransferase (APH), Hygromycinphosphotransferase (hyg), Dihydrofolatreductase (DHFR), Thymidinkinase (tk), Glutaminsynthetase, Asparaginsynthetase und Gene, die für Resistenz gegen Neomycin (G418), Puromycin, Histidinol D, Bleomycin und Phleomycin kodieren.
Ein „amplifizierbares selektierbares Gen" weist die Eigenschaften eines selektierbaren Markergens wie zuvor definiert auf, kann jedoch darüber hinaus unter geeigneten Bedingungen amplifiziert werden (d.h. zusätzliche Kopien des Gens werden gebildet, die in intrachromosomaler oder extrachromosomaler Form überleben). Das amplifizierbare selektierbare Gen kodiert üblicherweise für ein Enzym, das für Wachstum von eukaryotischen Zellen unter diesen Bedingungen erforderlich ist. Das amplifizierbare selektierbare Gen kann beispielsweise für DHFR (Dihydrofolatreductase) kodieren, wobei das Gen amplifiziert wird, wenn eine damit transfizierte Wirtszelle in Gegenwart des selektiven Mittels Methotrexat (Mtx) gezüchtet wird. Die in Tabelle I unten angegebenen Beispiele für selektierbare Gene sind auch amplifizierbare selektierbare Gene. Ein Beispiel für ein selektierbares Gen, das im Allgemeinen nicht als ein amplifizierbares Gen betrachtet wird, ist das Neomycin-Resistenzgen (Cepko et al., s.o.).
Verweise im Zusammenhang mit der Co-Transfektion eines Gen zusammen mit einem genetischen Marker, der Selektion und darauf folgende Amplifikation ermöglicht, sind z.B. in Kaufman, Genetic Engineering, J. Setlow (Hrsg.), Plenum Press, New York, Bd. 9 (1987); Kaufman & Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601 (1982); Ringold et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 165–175 (1981); Kaufman et al., Mol. Cell Biol. 5, 1750–1759 (1985); Kaetzel & Nilson, J. Biol. Chem. 263, 6244–6251 (1988); Hung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 261–264 (1986); Kaufman et al., EMBO J. 6, 87–93 (1987); Johnston & Kucey, Science 242, 1551–1554 (1988); Urlaub et al., Cell 33, 405–412 (1983), zu finden. Für einen Übersichtsartikel über amplifizierbare selektierbare Gene, die in Tabelle I angeführt sind, siehe Kaufman, Methods in Enzymology 185, 537–566 (1990).
TABELLE I Amplifizierbare selektierbare Gene und ihre Selektionsmittel
Ein bevorzugtes amplifizierbares selektierbares Gen ist das Gen, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert, die für die Biosynthese von Purinen erforderlich ist. Zellen, denen das DHFR-Gen fehlt, wachsen nicht in Medium, dem Purine fehlen. Das DHFR-Gen ist daher als ein dominanter selektierbarer Marker nützlich, um Gene in solchen Zellen zu selektieren und amplifizieren, die in Purin-freiem Medium wachsen. Das in Verbindung mit einem DHFR-Gen verwendete Selektionsmittel ist Methotrexat (Mtx).
Wie hierin verwendet bezieht sich „Selektionsmedium" auf Nährstofflösung, die zum Züchten von eukaryotischen Zellen verwendet wird, die das selektierbare Gen enthalten und exprimieren, und umfasst daher ein „Selektionsmittel". Im Handel erhältliche Medien wie Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ([DMEM], Sigma) sind Beispiele für Nährstofflösungen. Darüber hinaus kann jedes der in Ham & Wallace, Meth. Enz. 58, 44 (1979), Barnes & Sato, Anal. Biochem. 102, 255 (1980); in den US-Patenten Nr. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; oder 4.560.655; der WO 90/03430; WO 87/00195; US-Patent Re. 30.985 oder US-Patent Nr. 5.122.469 beschriebenen Medien als Kulturmedium verwendet werden. Jedes dieser Medien wird nach Bedarf mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie Insulin; Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie HEPES), Nucleosiden (wie Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie Gentamycin^TM-Wirkstoff), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im Mikromolarbereich vorhanden sind) und Glucose oder einer gleichwertigen Energiequelle ergänzt. Das Medium wird häufig mit Serum, z.B. fötalem Kälber- oder Pferdeserum, als eine Quelle für Hormone, Wachstumsfaktoren und andere Elemente ergänzt. Jede andere erforderliche Ergänzung kann bei geeigneten Konzentrationen, die Fachleuten bekannt sind, ebenfalls eingebunden werden.
Die Bezeichnung „Selektionsmittel" bezieht sich auf eine Substanz, die das Wachstum oder Überleben einer Wirtszelle stört, der ein bestimmtes selektierbares Gen fehlt. Beispiele für Selektionsmittel sind oben in Tabelle I angegeben. Das Selektionsmittel umfasst vorzugsweise ein „Amplifikationsmittel", das für die vorliegenden Zwecke als ein Mittel zur Amplifikation von Kopien des amplifizierbaren Gens definiert ist. Das Selektionsmittel kann auch das Amplifikationsmittel sein, sofern das als Basis dienende selektierbare Markergen ein amplifizierbarer selektierbarer Marker ist. Mtx ist beispielsweise ein Selektionsmittel, das für die Amplifikation des DHFR-Gens nützlich ist. Siehe Tabelle I für Beispiele zu Amplifikationsmitteln.
„Selektierte Sequenz" oder „Produktgen" oder „Gen von Interesse" tragen hierin dieselbe Bedeutung und beziehen sich auf eine Polynucleotidsequenz mit beliebiger Länge, die für ein Produkt von Interesse kodiert. Typischerweise weist die selektierte Sequenz eine Länge im Bereich von 1–20 Kilobasen (kb), vorzugsweise von 1–5 kb, auf. Das Gen von Interesse ist ein heterologes Gen in Bezug auf die Wirtszelle. Die selektierte Sequenz kann ein Gen voller Länge oder ein trunkiertes Gen, ein Fusions- oder markiertes Gen sein und kann eine cDNA, eine genomische DNA oder ein DNA-Fragment sein und ist vorzugsweise eine cDNA. Die selektierte Sequenz kann die native Sequenz, d.h. die natürlich vorkommende(n) Form(en), sein oder kann, wie erwünscht, mutiert oder in anderer Weise modifiziert sein. Diese Modifikationen umfassen Humanisierung, Codonersetzung, um Codonverwendung in der selektierten Wirtszelle zu optimieren, oder Markierung. Die selektierte Sequenz kann für ein sekretiertes, zytoplasmatisches, nukleares, membrangebundenes oder Zelloberflächen-Polypeptid kodieren. Expression der selektierten Sequenz sollte für die Wirtszelle nicht schädlich sein oder die Zellfähigkeit beeinträchtigen. Das „erwünschte Produkt" umfasst Proteine, Polypeptide und Fragmente davon, Peptide und Antisense-RNA, die in der Lage sind, in der selektierten eukaryotischen Wirtszelle exprimiert zu werden. Die Proteine können Hormone, Cytokine und Lymphokine, Antikörper, Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle, Enzyme und Fragmente davon sein. Die erwünschten Proteine können als Agonisten oder Antagonisten dienen und/oder therapeutische oder diagnostische Verwendungen aufweisen. Die vorliegenden Polynucleotide sind für die Expression erwünschter Produkte mit Säugetier-Ursprung sehr geeignet, obwohl Mikroben- und Hefeprodukte auch produziert werden können.
Die Bezeichnungen „Polypeptid" und „Protein" werden synonym verwendet, um auf Polymere von Aminosäuren mit beliebiger Länge Bezug zu nehmen. Diese Bezeichnungen umfassen auch Proteine, die posttranslational durch Reaktionen modifiziert werden, die Glykosylierung, Acetylierung und Phosphorylierung umfassen. Die Bezeichnung „Peptid" bezieht sich auf kürzere Abschnitte von Aminosäuren, die im Allgemeinen weniger als etwa 30 Aminosäuren lang sind.
Die Bezeichnung „Antikörper" oder „Immunglobulin" wie hierin verwendet umfasst monoklonale Antikörper, polyklonale Antikörper, multispezifische (z.B. bispezifische Antikörper), einkettige Antikörper einschließlich sFv-Dimere, Antikörperfragmente (z.B. Fab, Fab', F(ab')₂, Fv) und Diabodies, solange sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen. Die Antikörper können aus jeder beliebigen Spezies stammen und umfassen humanisierte Antikörper. „Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z.B. murinen) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Im Großteil der Fälle sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR eines Antikörpers einer nicht-menschlichen Spezies (Donor-Antikörper) wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität oder Funktion ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregionreste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden vollzogen, um Antikörperleistung weiter zu verfeinern und optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, typischerweise zwei, variablen Domäne(n), in der/denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulin-Consensussequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Nähere Details sind in Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992), zu finden.
„Regulationselemente" wie hierin verwendet beziehen sich auf in cis vorhandene Nucleotidsequenzen, die für Transkription und Translation von GFP-Gen, dem ampli fizierbaren selektierbaren Gen und der selektierten Sequenz von Interesse zu Polypeptiden erforderlich sind. Die Transkriptionsregulationselemente umfassen normalerweise einen Promotor 5' von der zu exprimierenden Gensequenz, Transkriptionsinitiations- und -terminationsstellen und Polyadenylierungssignalsequenz. Die Bezeichnung „Transkriptionsinitiationsstelle" bezieht sich auf die Nucleinsäure im Konstrukt, die der ersten Nucleinsäure entspricht, die in das primäre Transkript inkorporiert wird, d.h. auf den mRNA-Vorläufer; die Transkriptionsinitiationsstelle kann mit den Promotorsequenzen überlappen. Die Bezeichnung „Transkriptionsterminationsstelle" bezieht sich auf eine Nucleotidsequenz, die normalerweise am 3'-Ende eines zu transkribierenden Gens von Interesse oder des zu transkribierenden Abschnitts vorhanden ist und die RNA-Polymerase dazu veranlasst, Transkription zu beenden. Die Polyadenylierungssignalsequenz oder das poly-A-Additionssignal sorgt für das Signal für die Spaltung an einer spezifischen Stelle am 3'-Ende von eukaryotischer mRNA und für die posttranslationale Addition im Nucleus von einer Sequenz von etwa 100–200 Adeninnucleotiden (polyA-Schwanz) an das gespaltene 3'-Ende. Die Polyadenylierungssignalsequenz umfasst die Sequenz AATAAA, die etwa 10–30 Nucleotide stromauf von der Spaltungsstelle angeordnet ist, plus eine Stromab-Sequenz.
Der Promotor kann konstitutiv oder induzierbar sein. Ein Enhancer (d.h. ein cis-wirkendes DNA-Element, das auf einen Promotor so wirkt, dass Transkription gesteigert wird) kann erforderlich sein, um in Verbindung mit dem Promotor zu funktionieren, um das mit einem Promotor alleine erhaltene Expressionsniveau zu steigern, und kann als ein Transkriptionsregulationselement eingebunden sein. Häufig umfasst das den Promotor enthaltende Polynucleotidsegment auch die Enhancersequenzen (z.B. CMV IE P/E; SV40 P/E; MPSV P/E). Spleißsignale können, sofern erforderlich, eingebunden werden, um gespleißte Transkripte zu erhalten. Um ein sekretiertes Polypeptid zu produzieren, umfasst die selektierte Sequenz im Allgemeinen eine Signalsequenz, die für ein Leaderpeptid kodiert, das das neu synthetisierte Polypeptid auf und durch die ER-Membran steuert, wo das Polypeptid zur Sekretion geleitet werden kann. Das Leaderpeptid ist häufig, jedoch nicht durchwegs, am Aminoterminus eines sekretierten Proteins vorhanden und wird durch Signalpeptidasen ab gespalten, nachdem das Protein die ER-Membran durchquert hat. Die selektierte Sequenz umfasst im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, ihre eigene Signalsequenz. Fehlt die native Signalsequenz, so kann eine heterologe Signalsequenz an die selektierte Sequenz fusioniert werden. Zahlreiche Signalsequenzen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und aus Sequenzdatenbanken wie GenBank und EMBL erhältlich. Translationsregulationselemente umfassen eine Translationsinitiationsstelle (AUG), ein Stoppcodon und ein poly-A-Signal für jedes einzelne zu exprimierende Polypeptid. In manchen Konstrukten ist eine interne Ribosomeneintrittsstelle (IRES) eingebunden. IRES wird nachstehend definiert.
Eine „Transkriptionseinheit" definiert eine Region innerhalb eines Konstrukts, die ein oder mehrere zu transkribierende Gene enthält, worin die innerhalb dieses Segments enthaltenen Gene operabel aneinander gebunden sind und aus einem einzelnen Promotor transkribiert werden, und infolge dessen sind die verschiedenen Gene zumindest transkriptional verbunden. Mehr als ein Protein oder Produkt kann aus jeder Transkriptionseinheit transkribiert und exprimiert werden. Jede Transkriptionseinheit umfasst die Regulationselemente, die für die Transkription und Translation von jedem beliebigen aus selektierter Sequenz, GFP und amplifizierbaren selektierbaren Markergenen, die innerhalb der Einheit enthalten sind, sowie jeglichen zusätzlichen selektierbaren Markergenen, die operabel an eine dieser drei Komponenten in derselben Transkriptionseinheit gebunden sein können, erforderlich sind. 6 zeigt als eine Veranschaulichung davon ein Konstrukt, das zwei getrennte Transkriptionseinheiten umfasst; DHFR und das erwünschte Protein werden aus der ersten Transkriptionseinheit exprimiert, und GFP wird aus der zweiten Transkriptionseinheit exprimiert. In der ersten Transkriptionseinheit sind DHFR-Gen und die selektierte Sequenz, die für das erwünschte Produkt kodiert, operabel aneinander und an den SV40-Promotor gebunden. Transkription erfolgt durch die DHFR und die selektierte Sequenz zum poly-A-Signal, wodurch ein Primärtranskript voller Länge gebildet wird, das für beide Gene kodiert. Jedes dieser Gene in der Transkriptionseinheit weist sein eigenes Translationsinitiationscodon, ATG, auf. Die zweite Transkriptionseinheit umfasst das GFP-Gen und Regulationselemente, die für GFP-Expression erforderlich sind. Das GFP-Gen wird unabhängig aus einem zweiten SV40-Promotor innerhalb des Konstrukts transkribiert. Jede Transkriptionseinheit enthält ihren eigenen Promotor, wobei jedoch der Typ des Promotors derselbe oder ein unterschiedlicher sein kann. Im in 2 dargestellten Beispiel verwenden die erste und die zweite Transkriptionseinheit denselben Promotortyp, in diesem Fall SV40-Promotor.
Ein „Promotor" bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, die Transkription eines Gens oder einer Sequenz, an die sie operabel gebunden ist, steuert. Ein Promotor umfasst Signale für RNA-Polymerasebindung und Transkriptionsinitiation. Die verwendeten Promotoren sind im Zelltyp der Wirtszelle, in der Expression der selektierten Sequenz erwartet wird, funktionell. Eine große Anzahl an Promotoren, einschließlich konstitutiver; induzierbarer und reprimierbarer Promotoren aus zahlreichen verschiedenen Quellen, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (und in Datenbanken wie GenBank identifiziert) und als oder innerhalb von klonierte(n) Polynucleotide(n) erhältlich (aus z.B. Hinterlegungsorten wie ATCC sowie anderen kommerziellen oder privaten Quellen). Mit induzierbaren Promotoren steigt oder sinkt die Aktivität des Promotors als Reaktion auf ein Signal. Der c-fos-Promotor beispielsweise wird insbesondere bei Bindung von Wachstumshormon an seinen Rezeptor an der Zelloberfläche gebunden. Der Tetracyclin-(tet-)Promotor, der die Tetracyclin-Operatorsequenz (tetO) enthält, kann durch ein Tetracyclin-reguliertes Transaktivatorprotein (tTA) induziert werden. Bindung des tTA an die tetO wird in Gegenwart von tet inhibiert (Mosser et al. (1997), s.o.). Für andere induzierbare Promotoren einschließlich jun, fos und Metallothionein und Hitzeschockpromotoren siehe z.B. Sambrook et al., s.o.; und Gossen et al. Induzierbare Genexpressionssysteme für höhere eukaryotische Zellen sind in Curr. Opi. Biotech. 5, 516–520 (1994), zu finden. Zu den eukaryotischen Promotoren, die als starke Promotoren für Expression auf hohem Niveau identifiziert wurden, zählen früher SV40-Promotor, später Adenovirus-Hauptpromotor, Maus-Metallothionein-1-Promotor, lange terminate Rous-Sarkomvirus-Wiederholung und menschlicher unmittelbarer früher Zytomegalie-Virus-Promotor (CMV).
Ein „Enhancer" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, die Transkription eines Gens oder einer Kodiersequenz, an das bzw. die sie operabel gebunden ist, steigert. Anders als Promotoren sind Enhancer relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig und wurden 5' (Lainins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) oder 3' (Lusky et al., Mol. Cell Bio 3, 1108 (1983)) von der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984)) gefunden. Daher können Enhancer stromauf oder stromab von der Transkriptionsinitiationsstelle oder in erheblichen Distanzen vom Promotor platziert werden, obwohl Enhancer in der Praxis physikalisch und funktionell gesehen mit Promotoren überlappen können. Zahlreiche Enhancer sind aus vielen verschiedenen Quellen auf dem Gebiet der Erfindung bekannt (und in Datenbanken wie GenBank identifiziert) und als oder innerhalb von klonierte(n) Polynucleotidsequenz(en) (aus z.B. Hinterlegungsorten wie der ATCC sowie anderen kommerziellen oder privaten Quellen) erhältlich. Zahlreiche Polynucleotide, die Promotorsequenzen (wie den üblicherweise verwendeten CMV-Promotor) umfassen, umfassen auch Enhancersequenzen. Alle starken Promotoren beispielsweise, die zuvor genannt wurden, enthalten auch starke Enhancer. Bendig, Genetic Engineering 7, 91 (Academic Press, 1988).
Die Bezeichnung „Intron" wie hierin verwendet bezieht sich auf eine nichtkodierende Nucleotidsequenz variierender Länge, die normalerweise innerhalb zahlreicher eukaryotischer Gene vorhanden ist und aus einem neu transkribierten mRNA-Vorläufer durch den Spleißvorgang entfernt wird. Im Allgemeinen erfordert der Spleißvorgang, dass die 5'- und 3'-Enden des Introns korrekt gespalten und die resultierenden Enden der mRNA exakt verbunden werden, sodass eine reife mRNA mit dem passenden Leseraster für Proteinsynthese gebildet wird. Ein in den Konstrukten dieser Erfindung nützliches Intron ist im Allgemeinen ein effizientes Intron, das sich durch eine Spleißeffizienz auszeichnet, die in den meisten abgeleiteten Transkripten zu Expression des erwünschten Produkts führt und gleichzeitig auch ausreichend ungespleißte Transkripte für Expression des selektierbaren Markergens (selektierbaren Markergens, das innerhalb des Introns kloniert und durch die Enden dieses Introns gebunden ist) in ausreichenden Mengen für Selektion bereitstellt. Das effiziente Intron weist vorzugsweise eine Spleißeffizienz von etwa 80 bis 99%, vorzugsweise etwa 90 bis 99%, auf. Intron-Spleißeffizienz kann durch Quantifizieren der gespleißten Transkripte gegenüber den ungespleißten Transkripten voller Länge, die das Intron enthalten, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren, wie beispielsweise quantitativer PCR oder Northern-Blot-Analyse, unter Einsatz von für die Transkripte geeigneten Sonden leicht bestimmt werden. Siehe z.B. Sambrook et al., s.o., und andere allgemeine Klonier-Handbücher. Umkehrtranskriptions-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) kann verwendet werden, um RNA-Proben, die Gemische aus gespleißten und ungespleißten mRNA-Transkripten enthaften, zu analysieren. Fluoreszenzmarkierte Primer, die darauf abzielen, das Intron zu umspannen, werden beispielsweise verwendet, um sowohl gespleißte als auch ungespleißte Targets zu amplifizieren. Die resultierenden Amplifikationsprodukte werden dann durch Gelelektrophorese getrennt und durch Messen der Fluoreszenzemission der geeigneten Bande(n) quantifiziert. Ein Vergleich wird angestellt, um die Menge von gespleißten und ungespleißten Transkripten, die in der RNA-Probe vorhanden sind, zu bestimmen.
Introne weisen hochkonservierte Sequenzen an jedem oder nahe von jedem Ende des Introns auf, die für Spleißen und Intronentfernung erforderlich sind. Wie hierin verwendet bezieht sich „Spleißdonorstelle" oder „SD" oder „5'-Spleißstelle" auf die konservierte Sequenz, die die Exon-Intron-Grenze am 5'-Ende des Introns unmittelbar umgibt, während das Exon die Nucleinsäure 5' zum Intron umfasst. Die Bezeichnung „Spleißakzeptorstelle" oder „SA" oder „3'-Spleißstelle" bezieht sich hierin auf die Sequenz, die die Intron-Exon-Grenze am 3'-Ende des Introns unmittelbar umgibt, während das Exon die Nucleinsäure 3' zum Intron umfasst. Ein „effizientes Intron" umfasst eine Spleißdonorstelle und eine Spleißakzeptorstelle, die zur Spleißung von Messenger-RNA-Vorläufern bei einer Häufigkeit zwischen etwa 80 bis 99%, vorzugsweise 90 bis 95%, noch bevorzugter zumindest 95%, wie durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren wie quantitative PCR bestimmt wird, führen. Zahlreiche Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen wurden bereits charakterisiert, und Ohshima et al., J. Mol. Biol. 195, 247–259 (1987), liefern hierzu einen Überblick. Beispiele für effiziente Spleißdonorsequenzen umfassen die Wildtyp-(WT-)ras-Spleißdonorsequenz und die GAC:GTAAGT-Sequenz. Eine bevorzugte Spleißdonorstelle ist eine „Spleißdonor-Consensussequenz", und eine bevorzugte Spleißak zeptorstelle ist eine „Spleißakzeptor-Consensussequenz"; diese Consensussequenzen sind evolutionär hochkonserviert. Die Consensussequenzen sowohl für Spleißdonor- als auch Spleißakzeptorstellen in den mRNAs höherer Eukaryoten sind in Molecular Biology of the Cell, 3. Auflage, Alberts et al. (Hrsg.), Garland Publishing, Inc., New York, S. 373, 12–53 (1994), gezeigt. Die Consensussequenz für die 5'-Spleißdonorstelle ist C/A (C oder A) AG:GUAAGU (worin der Doppelpunkt die Stelle von Spaltung und Ligation bezeichnet). Die 3'-Spleißakzeptorstelle tritt innerhalb der Consensussequenz (U/C)₁₁NCAG:G auf. Andere effiziente Spleißdonor- und -akzeptorsequenzen können unter Verwendung der Verfahren zur Messung von Spleißeffizienz leicht bestimmt werden.
Eine „interne Ribosomeneintrittsstelle" oder „IRES" beschreibt eine Sequenz, die Translationsinitiation unabhängig vom Gen 5' der IRES funktionell fördert und die Translation von zwei Cistronen (offenen Leserastern) aus einem einzelnen Transkript in einer Säugetierzelle ermöglicht. Die IRES stellt eine unabhängige Ribosomeneintrittsstelle für Translation des offenen Leserasters unmittelbar stromab (stromab wird hierin synonym mit 3' verwendet) davon bereit. Anders als bakterielle mRNA, die polycistronisch sein kann, d.h. für mehrere verschiedene Polypeptide kodiert, die nacheinander aus den mRNAs translatiert werden, sind die meisten mRNAs von Tierzellen monocistronisch und kodieren für die Synthese von nur einem Protein. Mit einem polycistronischen Transkript in einer eukaryotischen Zelle würde Translation an der dem 5'-Ende am nächsten liegenden Translationsinitiationsstelle beginnen, am ersten Stoppcodon enden, und das Transkript würde aus dem Ribosom freigesetzt werden, was zur Translation von nur dem ersten kodierten Polypeptid in der mRNA führt. In einer eukaryotischen Zelle ermöglicht ein polycistronisches Transkript mit einer IRES, die operabel an den zweiten oder darauf folgenden offenen Leseraster im Transkript gebunden ist, die aufeinander folgende Translation von diesem offenen Stromab-Leseraster, um die zwei oder mehreren Polypeptide, für die dasselbe Transkript kodiert, zu bilden. Die Verwendung von IRES-Elementen bei der Vektorkonstruktion wurde bereits früher beschrieben, siehe z.B. Pelletier et al., Nature 334, 320–325 (1988); Jang et al., J. Virol. 63, 1651–1660 (1989); Davies et al., J. Virol. 66, 1924–1932 (1992); Adam et al., J. Virol. 656, 4985–4990 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293–1299 (1992); Sugimoto et al., Biotechnology 12, 694–698 (1994); Ramesh et al., Nucl. Acids Res. 24, 2697–2700 (1996); Mosser et al. (1997), s.o.
„Operabel gebunden" bezieht sich auf eine Aneinanderlagerung von zwei oder mehreren Komponenten, worin die so beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die es ihnen erlauben, in ihrer gewünschten Weise zu funktionieren. Ein Promotor und/oder Enhancer sind beispielsweise operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er in cis wirkt, um die Transkription der gebundenen Sequenz zu steuern oder zu modulieren. Im Allgemeinen, jedoch nicht notwendigerweise, sind die DNA-Sequenzen, die „operabel gebunden" sind, zusammenhängend und, sofern es erforderlich ist, zwei Proteinkodierregionen zu verbinden, oder im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend und in Leseraster. Obwohl jedoch ein operabel gebundener Promotor im Allgemeinen stromauf von der Kodiersequenz angeordnet ist, ist er nicht notwendigerweise mit ihr zusammenhängend. Enhancer müssen nicht zusammenhängend sein. Ein Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn der Enhancer Transkription der Kodiersequenz steigert. Operabel gebundene Enhancer können stromauf, innerhalb oder stromab von Kodiersequenzen und in erheblichen Distanzen vom Promotor angeordnet sein. Eine Polyadenylierungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie am Stromabende der Kodiersequenz angeordnet ist, sodass Transkription durch die Kodiersequenz zur Polyadenylierungssequenz stattfindet. Bindung erfolgt durch rekombinante Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, z.B. unter Verwendung von PCR-Technik, durch Anellieren oder durch Ligation an geeigneten Restriktionsstellen. Sind keine geeigneten Restriktionsstellen vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -Linker gemäß herkömmlicher Praxis verwendet.
Die Bezeichnung „Expression" wie hierin verwendet bezieht sich auf Transkription oder Translation, die innerhalb einer Wirtszelle auftritt. Das Expressionsniveau eines erwünschten Produkts in einer Wirtszelle kann auf Grundlage von entweder der Menge an entsprechender mRNA, die in der Zelle vorhanden ist, oder der Menge des erwünschten Produkts, für das die selektierte Sequenz kodiert, bestimmt werden. mRNA, die beispielsweise aus einer selektierten Sequenz transkribiert wird, kann durch PCR oder durch Northern-Hybridisierung quantifiziert werden (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Protein, für das eine selektierte Sequenz kodiert, kann mittels verschiedener Verfahren, z.B. durch ELSIA, durch Testen auf die biologische Aktivität des Proteins oder unter Einsatz von Tests, die von solcher Aktivität unabhängig sind, wie Western-Blotting oder Radioimmuntest, unter Verwendung von Antikörpern, die bei Umsetzung des Proteins dieses erkennen und binden, quantifiziert werden. Siehe Sambrook et al. (1989), s.o.
Eine „Wirtszelle" bezieht sich auf eine Zelle, in die ein Polynucleotid der Erfindung eingeführt wird. Wirtszelle umfasst sowohl prokaryotische Zellen, die zur Vermehrung des Konstrukts dienen, um Plasmidmaterial zu bilden, als auch eukaryotische Zellen zur Expression der selektierten Sequenz. Typischerweise sind die eukaryotischen Zellen Säugetierzellen.
Das Verfahren der „Polymerasekettenreaktion" oder „PCR" wie hierin verwendet bezieht sich im Allgemeinen auf ein Verfahren, worin geringe Mengen eines spezifischen Teils einer Nucleinsäure, RNA und/oder DNA amplifiziert werden, wie im US-Patent Nr. 4.683.195, ausgegeben am 28. Juli 1987, beschrieben wird. Im Allgemeinen muss Sequenzinformation von den Enden der Region von Interesse oder darüber hinaus verfügbar sein, sodass Oligonucleotidprimer entworfen werden können; diese Primer weisen eine identische oder ähnliche Sequenz wie die gegenüberliegenden Stränge an der zu amplifizierenden Matrix auf. Im Allgemeinen umfasst das PCR-Verfahren wiederholte Zyklen von Primerextensionssynthese unter Verwendung von zwei DNA-Primern, die in der Lage sind, vorzugsweise an eine Matrixnucleinsäure, die die zu amplifizierende Nucleotidsequenz umfasst, zu hybridisieren. Die 5'-terminalen Nucleotide der zwei Primer können mit den Enden des amplifizierten Materials zusammenfallen. PCR kann verwendet werden, um spezifische RNA-Sequenzen, spezifische DNA-Sequenzen aus genomischer Gesamt-DNA und cDNA, die aus zellulärer Gesamt-RNA transkribiert ist, Bakteriophagen oder Plasmidse quenzen und dergleichen zu amplifizieren. Für allgemeine Informationen siehe Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263 (1987); Erlich et al., PCR Technology, Stockton Press, NY (1989); Wang & Mark, 70–75, und Scharf, 84–98, beides in PCR Protocols, Academic Press (1990). Wie hierin verwendet wird PCR als ein Beispiel, jedoch nicht als das einzige Beispiel, für ein Nucleinsäure-Polymerasereaktionsverfahren zur Amplifikation einer Nucleinsäurentestprobe betrachtet, das eine bekannte Nucleinsäure (DNA oder RNA) als Primer verwendet. Wie hierin verwendet umfassen PCR-Verfahren RT-PCR.
Literaturverweise
Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung werden, außer ausdrücklich anders festgelegt, herkömmliche Verfahren der Molekularbiologie und dergleichen, die im Bereich der Erfindung liegen, zum Einsatz gebracht. Solche Verfahren werden in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z.B. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al. (Hrsg.) (1987), aktualisierte Ausgabe); Essential Molecular Biology (T. Brown (Hrsg.), IRL Press (1991)); Gene Expression Technology (Goeddel (Hrsg.), Academic Press (1991)); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. (Hrsg.), Bartlett Publ. (1990)); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press (1990)); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al. (Hrsg.), Academic Press (1989)); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press bei Oxford University Press (1991)); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait, Hrsg. (1984)); Cell Culture for Biochemists (R. Adams (Hrsg.), Elsevier Science Publishers (1990)); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos (Hrsg.), (1987)); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler, Hrsg. (1991)); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. (Hrsg.), Humana Press (1990)); Culture of Animal Cells, 2. Auflage (R. Freshney et al. (Hrsg.), Alan R. Liss (1987)); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. (Hrsg.), Wiley-Liss (1990)); die Serien Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); und Animal Cell Culture (R. Freshney (Hrsg.), IRL Press (1987); und M. Wirth & H. Hauser, Genetic Engineering of Animal Cells, in: Biotechnology, Bd. 2, A. Puhler (Hrsg.), VCH, Weinheim, 663–744 (1993).
Ausführungsformen der Erfindung
Die Erfindung stellt Konstrukte bereit, die zum Screenen, Selektieren und Isolieren von Zellen, die hohe Konzentrationen eines Gens oder einer Sequenz von Interesse exprimieren, nützlich sind. Zahlreiche Varianten des grundlegenden Konstruktentwurfs sind möglich, und Beispiele hierzu werden nachstehend im Detail gegeben. Fachleute werden erkennen, dass Modifikationen an den vorliegenden Vektoren vollzogen werden können, ohne vom Schutzumfang der Erfindung abzuweichen. Auch wird verstanden werden, dass wünschenswerte Eigenschaften, die Kloniervorgänge erleichtern, in die Gene von Interesse und die Vektoren mittels gentechnischer Veränderung durch Verfahren, die auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik Routine sind, eingeführt werden können.
Amplifizierbare selektierbare Gene zur Verwendung in den Polynucleotiden der Erfindung werden oben im Abschnitt der Definitionen in Form von Beispielen angeführt. Vorzugsweise ist das amplifizierbare selektierbare Gen das Gen, das für DHFR kodiert. Transfektanten, die das DHFR-Gen tragen, können anfänglich für das Kultivieren der Zellen in Kulturmedium, das Mtx enthält, ausgewählt und durch diesen Kultivierungsvorgang identifiziert werden. Die transfizierten Zellen werden gegenüber immer größer werdenden Mengen an Mtx ausgesetzt, um auf Wirtszellen zu selektieren, die Amplifikation erfahren haben, was in Mehrfachkopien des DHFR-Gens und gleichzeitig in Mehrfachkopien des Gens von Interesse und der Sequenzen, die physikalisch mit der DHFR-Sequenz verbunden sind, resultiert (US-Patent Nr. 4.713.339; Axel et al., US-Patent Nr. 4.634.665; Axel et al., US-Patent Nr. 4.399.216; Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989 (1988)). DNA, die für DHFR kodiert, ist erhältlich; ein Maus-DHFR-cDNA-Fragment wurde von Simonsen & Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495–1499 (1983), und im US-Patent Nr. 5.561.053 beschrieben.
Fluoreszierende Proteine und insbesondere grün fluoreszierende Proteine, die in der Erfindung einsetzbar sind, sind oben im Abschnitt „Definitionen" beschrieben. Ein Überblick zu GFP, seine Verwendungen und zu Mikroskopieanordnung und Fluoreszenzfilter zur Detektion von GFP-Fluoreszenz ist in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Beilage 34, Abschnitt 9.7C (1996), zu finden. Ein bevorzugtes fluoreszierendes Protein ist GFP, vorzugsweise aus der Qualle, Aequorea victoria. In einer Ausführungsform wird die Aequorea-GFP-Mutante S65T verwendet. Die Struktur von Aequorea-Wildtyp-GFP und die dafür kodierende cDNA werden in Prasher et al., Gene 111, 229–233 (1992); Chalfie et al., s.o. (1994), beschrieben. (Diese Sequenz weist eine durch PCR geschaffene Änderung auf; Codon 80 wurde von Glu zu Arg (CAG zu CGG) geändert.) Das für GFP kodierende Plasmid pGFP10.1 ist unter der ATCC-Zugriffsnummer 75547 erhältlich (siehe Chalfie, US-Patent Nr. 5.491.084). Eine Beschreibung von Nucleinsäuren, die für mutierte GFPs kodiert, ist z.B. im US-Patent Nr. 5.625.048; US-Patent Nr. 5.777.079; US-Patent Nr. 5.804.387, in den Patentveröffentlichungen WO 9806737, WO 9821355, WO 9742320 und in Chalfie et al., WO 9521191, zu finden. Andere grün fluoreszierende Proteinmutanten mit gesteigerter zellulärer Fluoreszenz im Vergleich zum Wildtyp-Protein werden z.B. in Nataranjan et al., J. Biotechnol. 62, 29–45 (1998); und Crameri et al., Nature Biotechnol. 14, 315–319 (1996), beschrieben. Mutierte GFPs können durch zufällige oder ortsgerichtete Mutagenese der GFP-Gene gebildet werden (ortsgerichtete Mutagenese kann unter Verwendung von z.B. dem In-vitro-Phagemiden-Mutagenese-Set Muta-Gene von Bio-Rad durchgeführt werden). Vektoren, die verschiedene GFP-Genvarianten einschließlich GFP, das an den CMV-Promotor gebunden ist, enthalten, sind im Handel, beispielsweise bei Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA; und Quantum Biotechnologies Inc., Montreal, Kanada, erhältlich. Diese GFP-Geninserts können aus den Vektoren gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeschnitten werden.
Eine Beschreibung der funktionellen Komponenten von Säugetierexpressionsvektoren einschließlich spezifischer Beispiele für Promotoren, Enhancer, Terminations- und Polyadenylierungssignale und Spleißsignale ist in Sambrook et al., s.o. (1989), Kapitel 16: Expression of Cloned Genes in cultured Mammalian Cells, und den darin zitierten Verweisen zu finden.
Jede Transkriptionseinheit enthält einen Promotor, eine Transkriptionsterminationssequenz und eine poly-A-Signalsequenz stromab von den Kodiersequenzen, die in dieser Transkriptionseinheit vorhanden sind. Die Promotorsequenz kann mit der Transkriptionsinitiationsstelle überlappen. Verschiedene poly-A-Stellen sind bekannt, z.B. SV40-, Hepatitis B- oder BGH-(Rinderwachstumshormon-)polyA. Darüber hinaus umfasst jede Kodiersequenz ihre eigene Translationsinitiationsstelle (AUG) und ihr eigenes Stoppcodon. Diese Regulationselemente, sofern sie nicht schon als Teil des Gens von Interesse vorhanden sind, sowie andere wünschenswerte Eigenschaften, die den Kloniervorgang erleichtern, können in das Gen und in die Vektoren mittels gentechnischer Veränderung durch Verfahren, die auf dem Gebiet der DNA-Rekombinationstechnik Routine sind, eingeführt werden.
Das Konstrukt enthält zumindest einen Promotor, um die Transkription der selektierten Sequenz, die für das erwünschte Produkt kodiert, des amplifizierbaren selektierbaren Gens und des grün fluoreszierenden Proteingens zu steuern. Der verwendete Promotor ist einer, der in der Zelle, in der Expression des amplifizierbaren selektierbaren Gens, des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und der selektierten Sequenz erwartet wird, funktionell ist. Ist die Wirtszelle beispielsweise eine Säugetierzelle, so wird der verwendete Promotor ein Promotor, der in Säugetierzellen funktionell ist, vorzugsweise ein Säugetier- oder Viruspromotor sein. Der normalerweise mit dem Gen von Interesse assoziierte Promotor kann verwendet werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellen-Expressionssystemen kompatibel.
Virale Promotoren, die aus den Genomen von Viren gewonnen werden, umfassen Promotoren aus Polyomavirus, Geflügelpockenvirus (UK 2.211.504, veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie Adenovirus 2 oder 5), Herpes-Simplex-Virus (Thymidinkinasepromotor), Rinderpapillomavirus, Vogelsarkomvirus, Zytomegalie-Virus, ein Retrovirus (z.B. MoMLV oder RSV LTR), Hepatitis-B-Virus, Myeloproliferativen Sarkomviruspromotor (MPSV), VISNA und Simianvirus 40 (SV40). Heterologe Säuge tierpromotoren umfassen z.B. den Actin-Promotor, Immunglobulinpromotor, Hitzeschockproteinpromotoren. Die eben erwähnten Promotoren sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden leicht als Restriktionsfragment erhalten, das den SV40-Virus-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan & Berg, Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus (CMV) ist leicht als HindIII-E-Restriktionsfragment zu gewinnen. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein Promotor für eine breite Palette an Wirten, wie der frühe SV40-Promotor oder Rous-Sarkomvirus-LTR, ist zur Verwendung in den vorliegenden Expressionsvektoren geeignet.
Im Allgemeinen wird ein starker Promotor verwendet, um Transkription und Expression des erwünschten Produkts auf hohem Niveau zu erreichen. Zu den eukaryotischen Promotoren, die als starke Promotoren für Expression auf hohem Niveau identifiziert wurden, zählen der frühe SV40-Promotor, der späte Adenovirus-Hauptpromotor, der Maus-Metallothionein-I-Promotor, die lange terminale Rous-Sarkomvirus-Wiederholung und menschlicher unmittelbar früher Zytomegalie-Virus-Promotor (CMV oder CMV IE). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor ein früher SV40- oder ein früher CMV-Promotor.
Die verwendeten Promotoren können konstitutiv oder regulierbar, z.B. induzierbar, sein. Beispiele für induzierbare Promotoren umfassen jun, fos und Metallothionein und Hitzeschockpromotoren. Siehe z.B. Sambrook et al., s.o. Einer oder beide Promotoren der Transkriptionseinheiten können ein induzierbarer Promotor sein. In einer Ausführungsform wird das GFP aus einem konstitutiven Promotor exprimiert, während ein induzierbarer Promotor die Transkription des Gens von Interesse und/oder des amplifizierbaren selektierbaren Markers steuert.
Die Transkriptionsregulationsregion in höheren Eukaryoten kann eine Enhancersequenz umfassen. Zahlreiche Enhancersequenzen aus Säugetiergenen, z.B. aus Globin-, Elastase-, Albumin-, α-Fetoprotein- und Insulingenen, sind bekannt. Ein geeigneter Enhancer ist ein Enhancer aus einem Eukaryotenzellvirus. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), den Enhancer des unmittelbar frühen Zytomegalie-Virus-Promotors (Boshart et al., Cell 41, 521 (1985)), den Polyom-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich Enhancer-Elementen zur Aktivierung eukaryotischer Promotoren. Die Enhancersequenzen können in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zum Gen von Interesse eingeführt werden, sind jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' zum Promotor angeordnet.
Manchmal geht dem Polynucleotid, das für das selektierbare Gen und/oder das Gen von Interesse kodiert, DNA voraus, die für eine Signalsequenz kodiert, die eine spezifische Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids aufweist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente sein, die im Grundexpressionsvektor eingebaut ist, oder sie kann ein Teil des selektierbaren Gens oder des erwünschten Produktgens sein, das in den Expressionsvektor insertiert ist. Wird eine heterologe Signalsequenz verwendet, so ist dies vorzugsweise eine, die durch die Wirtszelle erkannt und verarbeitet (z.B. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird. Für Säugetierzellexpression kann die native Signalsequenz des Proteins von Interesse verwendet werden, wenn das Protein aus einem Säugetier stammt. Alternativ dazu kann die native Signalsequenz durch andere geeignete Säugetier-Signalsequenzen ersetzt werden, wie beispielsweise Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder verwandter Spezies sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes-Simplex-gD-Signal. Die DNA für solch eine Vorläuferregion ist in Leseraster operabel an das selektierbare Gen oder Produktgen gebunden.
Die Säugetier-Expressionsvektoren enthalten typischerweise prokaryotische Sequenzen, die die Vermehrung des Vektors in Bakterien erleichtern. Daher kann der Vektor andere Komponenten wie beispielsweise einen Replikationsursprung (d.h. eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren selektierten Wirtszelle(n) zu replizieren) und antibiotische Resistenzgene zur Selektion in Bakterien aufweisen. Zusätzliche(s) eukaryotische(s) selektierbare(s) Gen(e) kann bzw. können inkorporiert werden. Im Allgemeinen ist in Kloniervektoren der Replikationsursprung einer, der es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind durchwegs bekannt, z.B. der CoIE1-Replikationsursprung in Bakterien. Verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyom, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen ist ein eukaryotisches Replikon für Expression in Säugetierzellen nicht erforderlich, außer es wird extrachromosomale (episomale) Replikation beabsichtigt (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, weil er den frühen Promotor enthält).
Die vorliegenden Konstrukte können zahlreiche verschiedene Nucleotidsequenzinserts aufnehmen. Um Insertion und Expression verschiedener Gene von Interesse aus den Konstrukten und Expressionsvektoren der Erfindung zu erleichtern, sind die Konstrukte mit zumindest einer Klonierstelle zur Insertion jedes beliebigen Gens von Interesse entworfen. Vorzugsweise ist die Klonierstelle eine Mehrfachklonierstelle, d.h. eine, die mehrere Restriktionsstellen enthält. DNA-Kassetten, die Mehrfachklonierstellen aufweisen, können aus im Handel erhältlichen Kloniervektoren isoliert werden.
Jedes Konstrukt oder jeder Expressionsvektor enthält zumindest eine selektierte Sequenz, die für ein Produkt von Interesse kodiert. In einer spezifischen Ausführungsform enthält der Expressionsvektor zwei selektierte Sequenzen in separaten Transkriptionseinheiten, um zwei erwünschte Produkte, z.B. eine schwere und eine leichte Kette eines Immunglobulins, zu exprimieren.
Die „selektierte Sequenz" kodiert für ein erwünschtes Produkt wie ein Protein, Polypeptid, Peptid oder ein Fragment davon oder sogar eine Antisense-RNA. Das Polypeptid kann eine Untereinheit eines mehrkettigen Proteins, z.B. eines Immunglobulins oder eines Rezeptors, sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erwünschte Produkt menschlichen Ursprungs oder humanisiert, wie z.B. humanisierte Antikörper, und Hybrid- oder Fusionsproteine mit menschlichen Teilen. Die Hybrid- und Fusionsproteine umfassen Ig-Fusionsproteine und Proteine, die an eine tag- oder andere Markierung wie z.B. eine Polyhistidin-Markierung oder eine Epitopmarkierung fusioniert sind. Auf dem Gebiet der Erfindung sind verschiedene Markierungen bekannt. In einer Ausführungsform ist das erwünschte Produkt ein therapeutisches Protein oder Peptid. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Protein ein sekretiertes Protein. Sekretierte oder lösliche Formen von normalerweise membrangebundenen Proteinen können aus trunkierten Genen gebildet werden, in denen die für die Transmembrandomäne kodierenden Sequenzen deletiert sind. Das sekretierte Polypeptid kann beispielsweise die extrazelluläre(n) Domäne(n) (ECD) der Gene voller Länge umfassen.
Beispiele für Säugetierpolypeptide oder -proteine umfassen Hormone, Cytokine und Lymphokine, Antikörper, Rezeptoren, Adhäsionsmoleküle und Enzyme. Eine nicht vollständige Liste erwünschter Produkte umfasst z.B. menschliches Wachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Nebenschilddrüsenhormon, thyreotropes Hormon, Follikel-stimulierendes Wachstumshormon, Luteinisierungshormon; Hormonfreisetzungsfaktor; Lipoproteine, α-1-Antitrypsin; Insulin-A-Kette; Insulin-B-Kette; Proinsulin; Calcitonin; Glucagon; Moleküle wie Renin; Gerinnungsfaktoren wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Gewebefaktor und von-Willebrands-Faktor, gerinnungshemmende Faktoren wie Protein C, Atrial natriuretic factor, Lungentensid; einen Plasminogenaktivator, wie Urokinase oder menschlicher Urin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA); Bombesin; Thrombin; hämopoetischen Wachstumsfaktor; Tumornekrosefaktor-α und -β; Enkephalinase; RANTES (regulationsaktiviert, normalerweise T-Zell-exprimiert und -sekretiert); menschliches Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP-1-alpha); ein Serumalbumin wie menschliches Serumalbumin; Müllersche Inhibitionssubstanz; Relaxin-A- oder -B-Kette; Prorelaxin; Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; DNase; Inhibin; Activin; Rezeptoren für Hormone oder Wachstumsfaktoren; Integrin; Protein A oder D; Rheumafaktoren; ein neurotropher Faktor wie aus Knochen gewonnener neurotropher Faktor (BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6), Wachstumsfaktoren einschließlich Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF), Nervenwachstumsfaktor wie NGF-β; aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor (PDGF); Fibroblastenwachstumsfaktor wie aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6; epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); transformierender Wachstumsfaktor (TGF) wie TGF-alpha und TGF-beta, einschließlich TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 oder TGF-β5; insulinähnlicher Wachstumsfaktor-1 und -II (IGF-1 und IGF-11); des(1-3)-IGF-1 (Gehirn-IGF-1), insulinähnliche Wachstumsfaktor-Bindungsproteine; CD-Proteine wie CD-3, CD-4, CD-8 und GD-19; Erythropoietin; osteoinduktive Faktoren; Immunotoxine; ein morphogenetisches Knochenprotein (BMP); ein Interferon wie Interferon-α, -β und -γ; Koloniewachstum stimulierende Faktoren (CSFs), z.B. M-CSF, GM-CSF und G-CSF; Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10; Superoxiddismutase; T-Zell-Rezeptoren, Oberflächenmembranproteine, z.B. HER2, den Zerfall beschleunigender Faktor; virales Antigen wie beispielsweise ein Teil der AIDS-Hülle; Transportproteine, homing-Rezeptoren; Addressine; Regulationsproteine; Antikörper; chimäre Proteine wie Immunoadhäsine und Fragmente von jedem beliebigen der oben aufgelisteten Polypeptide. Beispiele für bakterielle Polypeptide oder Proteine umfassen z.B. alkalische Phosphatse und β-Lactamase.
Bevorzugte Polypeptide und Proteine hierin sind therapeutische Proteine wie TGF-β, TGF-α, PDGF, EGF, FGF, IGF-1, DNase, Plasminogenaktivatoren wie t-PA, Gerinnungsfaktoren wie Gewebefaktor und Faktor VIII, Hormone wie Relaxin und Insulin, Cytokine wie IFN-γ, chimäre Proteine wie TNF-Rezeptor-IgG-Immunoadhäsin (TNFr-IgG) oder Antikörper wie Anti-IgE. Bevorzugte therapeutische Proteine sind jene menschlichen Ursprungs oder „humanisierte" Proteine wie humanisierte Antikörper. In spezifischen Ausführungsformen kodiert die selektierte Sequenz für ein Protein, das aus der aus Neuronotrophin-3, Desoxyribonuclease, Gefäßendothelwachstumsfaktor, HER2-Rezeptor und Immunglobulin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Erwünschte Produktgene oder -sequenzen können aus Phagendisplay-Bibliotheken, cDNA-Bibliotheken oder genomischen DNA-Bibliotheken gewonnen werden. Das Gen oder die Sequenz von Interesse kann mittels PCR-Verfahren unter Verwendung geeigneter Primer isoliert oder chemisch synthetisiert werden. Bibliotheken werden mit Sonden (wie Antikörpern oder Oligonucleotiden) gescreent, die entworfen sind, um das selektierbare Gen oder das Produktgen (oder das/die Protein(e), für das/die es kodiert) zu identifizieren. Screening der cDNA oder genomischen Bibliothek mit der selektierten Sonde kann unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren, die in den Beispielen 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989), beschrieben werden, durchgeführt werden.
Es gilt zu verstehen, dass die zuvor beschriebenen Elemente in geeignetem Leseraster gebunden sind. Weiters gilt zu verstehen, dass die Vektoren der Erfindung Additionen von Sequenzen und Stellen aufweisen können, die das Konstruieren und Klonieren oder Optimieren von Expression in der selektierten Wirtszelle erleichtern.
Die meisten Expressionsvektoren sind „Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zu Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen in der Lage, können jedoch zur Expression in andere Organismen transfiziert werden. Ein Vektor wird beispielsweise in E. coli kloniert, und anschließend wird derselbe Vektor in Hefe- oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert, obwohl er nicht in der Lage ist, unabhängig von dem Wirtszellenchromosom zu replizieren.
Zur Analyse, um korrekte Sequenzen in den Konstrukten zu bestätigen, werden Plasmide aus den Transformanten hergestellt, durch Restriktion analysiert und/oder mittels auf dem Gebiet der Erfindung bekannter Verfahren sequenziert.
Die 1 bis 6 zeigen schematisch Beispiele für die verschiedenen Konfigurationen der Elemente in Expressionsvektoren, von denen manche Ausführungsformen der Erfindung sind. Die Konfiguration des GFP und des amplifizierbaren selektierbaren Markers (und jedes beliebigen zusätzlichen selektierbaren Markers) sowie die Beschaffenheit der Promotor/Enhancer-Regionen, die für Expression eines bestimmten erwünschten Proteins optimal sind, können von Fachleuten leicht durch Testen verschiedener Konfigurationen und Elemente und Vergleichen der resultierenden Produktivität des erwünschten Proteins bestimmt werden. Aus praktischen Gründen wird in den folgenden Beispielen auf das DHFR-Gen und dessen Genfusionen Bezug genommen, es gilt jedoch zu verstehen, dass jedes beliebige geeignete amplifizierbare selektierbare Gen anstelle von DHFR eingesetzt werden kann. Unabhängig davon, ob das Konstrukt eine oder mehrere Transkriptionseinheiten aufweist, umfasst jede der Transkriptionseinheiten die für die Transkription und Translation der selektierten Sequenz, des GFP und der amplifizierbaren selektierbaren Markergene in den geeigneten Wirtszellen erforderlichen Elemente innerhalb dieser Einheit. Diese Elemente, sofern sie nicht bereits als Teil des Gens vorhanden sind, können mittels gentechnischer Veränderung durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren der DNA-Rekombinationstechnik in die Konstrukte eingeführt werden. Im Allgemeinen werden der Promotor und andere Transkriptions- und Translationsregulationselemente so ausgewählt, dass sie das Expressionsniveau und Sekretionsniveau (sofern relevant) des erwünschten Produkts optimieren. Die Regulationselemente in der zweiten Transkriptionseinheit können dieselben wie jene sein, die in der ersten Transkriptionseinheit verwendet werden, z.B. der SV40-Promotor, und dieselbe poly-A-Signalsequenz-Quelle kann sowohl in die erste als auch die zweite Transkriptionseinheit kloniert werden.
Ein Polynucleotid, das eine einzelne Transkriptionseinheit umfasst, aus der der amplifizierbare selektierbare Marker, das erwünschte Protein und GFP exprimiert werden, wird in 1, Reihe 1 und 2, dargestellt. Im Konstrukt mit der einzelnen Transkriptionseinheit wird der Promotor und gegebenenfalls ein Enhancer stromauf von den Sequenzen, die für ein erwünschtes Protein, einen amplifizierbaren Marker und GFP kodieren, angeordnet. Der Enhancer wird praktischerweise, muss jedoch nicht, zusammenhängend mit dem Promotor platziert, um zur Förderung von Transkription aktiv zu sein. Eine Transkriptionsterminationssequenz und ein polyA-Signal sind stromab von den drei Komponenten (dem amplifizierbaren selektierbaren Marker, der selektierten Sequenz und den GFP-Genen) vorhanden. Die Sequenz, die das polyA-Signal enthält, das in den in den Arbeitsbeispielen unten beschriebenen Konstrukten vorhanden ist, umfasst eine Transkriptionsterminationsstelle.
DHFR, das erwünschte Protein und GFP können aus einem Promotor exprimiert werden, um die Co-Expressionseffizienz zu verbessern. GFP und DHFR können beispielsweise als ein Fusionsprotein exprimiert werden, oder eine IRES kann den Bedarf an einem zweiten Promotor zur Expression von GFP umgehen. In den in 1, Reihe 1 und 2, gezeigten Konstrukten wird das beispielhafte amplifizierbare selektierbare Gen, DHFR, an das GFP-Gen fusioniert, um ein DHFR-GFP-Fusionsgen zu bilden. Jede der Stromauf- und Stromab-Kodiersequenzen (im ersten Beispiel in 1, Reihe 1, ist die Stromauf-Kodiersequenz DHFR-GFP-Fusionsgen; im zweiten Beispiel, gezeigt in Reihe 2, ist die Stromauf-Kodiersequenz die selektierte Sequenz) weist ihr Translationsstoppsignal auf. Translation initiiert wiederum die Stromab-Kodiersequenz. Diese Szenarien ermöglichen Expression von zwei separaten Proteine aus einem einzelnen Promotor. Es gilt zu verstehen, dass die Positionierung des Promotors/Enhancers, des Translationsstoppsignals, der Translationsinitiationsstelle, der Transkriptionsterminationsstelle und des polyA-Signals in Bezug auf die verschiedenen Komponenten in jeder Transkriptionseinheit wie hierin beschrieben für alle nachstehend beschriebenen Konstrukte gilt.
Die Polynucleotide der Erfindung sind vorzugsweise so konfiguriert, dass sie den Großteil des Transkripts auf Expression des erwünschten Produkts lenken, während sie es gleichzeitig, bei einem festgelegten Verhältnis, an Expression des amplifizierbaren selektierbaren Gens binden, um Selektion auf stabile Transfektanten zu ermöglichen. Für Säugetierexpressionsvektoren wird bevorzugt, über ein Intron 5' eines Gens (Gen von Interesse, GFP oder anderes selektierbares Gen) für verbesserte Expression zu verfügen. Intron-modifizierte selektierbare Gene umfassen die Kodiersequenz eines selektierbaren Gens und ein Intron, das die Konzentration an selektierbarem Protein reduziert, das vom selektierbaren Gen produziert wird. (WO 92/17566; Abrams et al., J. Biol. Chem. 264 (24), 14016–14021 (1989)).
Vorzugsweise weist das in den Konstrukten der Erfindung vorhandene Intron effiziente Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen wie zuvor definiert auf, sodass Spleißen des primären Transkripts bei einer Häufigkeit über 90%, vorzugsweise von zumindest 95%, auftritt. Auf diese Weise werden zumindest 95% der Transkripte in das erwünschte Produkt translatiert und 5% oder weniger in den amplifizierbaren selektierbaren Marker, sofern einer im Intron angeordnet ist. In einer Ausführungsform wird ein Intron mit Consensus-Spleißdonor- und -akzeptorstellen verwendet. Die zur Verwendung in den vorliegenden Konstrukten geeigneten Introne weisen im Allgemeinen eine Länge von zumindest 91 Nucleotiden, vorzugsweise von zumindest etwa 150 Nucleotiden, auf, da Introne, die kürzer als die angegebene Nucleotidanzahl sind, zu weniger effizienter Spleißung neigen. Die obere Grenze für die Länge des Introns kann bis zu 30 kb oder mehr reichen. Das hierin verwendete Intron ist jedoch im Allgemeinen weniger als etwa 10 kb lang.
Introne, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, werden auf geeignete Weise durch jedes beliebige von zahlreichen Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt sind, wie Isolierung aus einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure oder de-novo-Synthese, hergestellt. Die in zahlreichen natürlich vorkommenden eukaryotischen Genen vorhandenen Introne wurden bereits identifiziert und charakterisiert. Mount, Nucl. Acids Res. 10, 459 (1982). Künstliche Introne, die funktionelle Spleißstellen umfassen, wurden auch beschrieben. Winey et al., Mol. Cell Biol. 9, 329 (1989); Gatermann et al., Mol. Cell Biol. 9, 1526 (1989). Introne können aus natürlich vorkommenden Nucleinsäuren, beispielsweise durch Verdau einer natürlich vorkommenden Nucleinsäure mit einer geeigneten Restriktionsendonuclease oder durch PCR-Klonierung unter Verwendung von Primern; die zu Sequenzen an den 5'- und 3'-Enden des Introns komplementär sind, gewonnen werden. Alternativ dazu können Introne mit definierter Sequenz und Länge durch In-vitro-Deletionsmutagenese eines bestehenden Introns oder synthetisch unter Verwendung verschiedener Verfahren der organischen Chemie hergestellt werden. Narang et al., Meth. Enzymol. 68, 90 (1979); Caruthers et al., Meth. Enzymol. 154, 287 (1985); Froehler et al., Nucl. Acids Res. 14, 5399 (1986).
In einer Ausführungsformen ist das verwendete Intron das Intron des Vektors pRK, der eine SD, die aus dem unmittelbar frühen CMV-Gen abgeleitet ist, und eine SA-Stelle aus einer variablen Region des IgG-H-Ketten-Gens enthält, wie in Lucas et al., Nucl. Acids Res. 24, 1774–1779 (1996), Suva et al., Science 237, 893–896 (1997), und dem US-Patent Nr. 5.561.053 beschrieben ist. Das selektierbare Gen oder Fusionsgen wird innerhalb des Introns unter Verwendung jedes beliebigen der verschiedenen bekannten Verfahren zur Modifikation einer Nucleinsäure in vitro insertiert. Gene können in das Intron außerhalb der Consensussequenz und ohne Unterbrechen der Sequenzen, die zum Spleißen wichtig sind, insertiert werden. Typischerweise wird ein selektierbares Gen zuerst durch Spalten des Introns mit einer Restriktionsendonuclease und anschließend durch kovalentes Binden der resultierenden Restriktionsfragmente an das selektierbare Gen in der korrekten Ausrichtung für Wirtszellenexpression, beispielsweise durch Ligation mit Ligase, in ein Intron eingeführt. Fehlen geeignete Restriktionsstellen innerhalb des Introns, so können sie unter Verwendung von Linkern und Oligonucleotiden durch PCR, Ligation oder Restriktion und Anellierung eingeführt werden. Ein Beispiel für Intronmodifikation ist in Lucas et al. (1996), s.o., beschrieben.
Die IRES kann variierende Längen aufweisen und aus verschiedenen Quellen, z.B. aus Encephalomyocarditis-Virus-(EMCV-) oder Picornavirus-Genomen, stammen. Verschiedene IRES-Sequenzen und ihre Konstruktion werden z.B. in Pelletier et al., Nature 334, 320–325 (1988); Jang et al., J. Virol. 63, 1651–1660 (1989); Davies et al., J. Virol. 66, 1924–1932 (1992); Adam et al., J. Virol. 65, 4985–4990 (1991); Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293–1299 (1992); Sugimoto et al., Biotechnology 12, 694–698 (1994); Ramesh et al., Nucl. Acids Res. 24, 2697–2700 (1996); und Mosser et al. (1997), s.o., beschrieben. In einer Ausführungsform wird die IRES von ECMV in den Vektoren der Erfindung verwendet. Die Stromab-Kodiersequenz wird operabel an die IRES, beispielsweise bei etwa 8 Basen oder mehr stromab vom 3'-Ende der IRES oder in jeder beliebigen Entfernung, die die Expression des Stromab-Gens nicht negativ beeinflusst, gebunden. Die optimale oder zulässige Entfernung zwischen der IRES und dem Beginn des Stromab-Gens kann durch Variieren der Entfernung und Messen von Expression als eine Funktion der Entfernung leicht bestimmt werden.
Anstatt das amplifizierbare selektierbare Gen mit dem GFP-Gen zu fusionieren, können die zwei Gene getrennt in der einzelnen Transkriptionseinheit vorhanden sein. Somit umfasst ein dritter Konstruktentwurf, der in 1, Reihe 3, abgebildet ist, in der Reihenfolge 5' zu 3' ein Intron, dem eine selektierte Sequenz folgt, und eine IRES. In einer Ausführungsform ist das DHFR-Gen innerhalb des Introns angeordnet, und das GFP-Gen ist stromab von der IRES platziert. In solch einem Konstrukt kodiert das primäre ungespleißte Transkript für alle drei Komponenten, wobei jedoch nur die DHFR- und die GFP-Gene translatiert werden. Die DHFR-Sequenzen werden jedoch aus dem primären Transkript mit großer Häufigkeit gespleißt, und das resultierende gespleißte Transkript wird translatiert, um das erwünschte Produkt und GFP zu bilden. In einer alternativen Ausführungsform wird das GFP-Gen innerhalb des Introns platziert, und das DHFR-Gen liegt stromab von der IRES.
Die Konstrukte können zwei Expressions-/Transkriptionseinheiten umfassen, wie in 1, Reihen 4–9, gezeigt wird. Das in 1, Reihe 4, abgebildete Zwei-Transkriptionseinheiten-Konstrukt umfasst eine selektierte Sequenz. Die Reihen 5–9 zeigen Konstrukte, worin zwei selektierte Sequenzen insertiert werden können, eine pro Transkriptionseinheit. Jede der zwei Transkriptionseinheiten umfasst einen Promotor und gegebenenfalls einen Enhancer, eine Transkriptionsterminationsstelle und eine polyA-Signalsequenz. Die zweite Transkriptionseinheit kann dieselbe oder eine andere Art von Promotor verwenden, als in der ersten Transkriptionseinheit verwendet wird. Beide Transkriptionseinheiten können beispielsweise den SV40-Promotor verwenden. Eine oder beide der Transkriptionseinheiten können ein Intron umfassen.
1, Reihe 4, zeigt ein Konstrukt, worin die erste Transkriptionseinheit DHFR in einem Intron (dem ersten Intron) enthält, gefolgt von der selektierten Sequenz. Die zweite Transkriptionseinheit umfasst das GFP-Gen. Die zweite Transkriptionseinheit umfasst vorzugsweise ein Intron (das als das zweite Intron bezeichnet wird) unmittelbar 5' vom GFP. Die drei Kodiersequenzen sind physikalisch stets in einem Vektor aneinander gebunden, werden jedoch unabhängig voneinander von zwei Promotoren transkribiert. Das aus der ersten Transkriptionseinheit produzierte primäre Transkript kodiert sowohl für DHFR als auch die selektierte Sequenz, wobei jedoch nur das DHFR-Gen zum Produkt translatiert wird. Vorzugsweise weisen zumindest 95% der Transkripte ein ausgespleißtes DHFR-Gen auf und translatieren zum erwünschten Produkt. In der zweiten Transkriptionseinheit produzieren, sofern das GFP stromab eines Introns platziert ist, sowohl gespleißte als auch ungespleißte Transkripte aus dieser Transkriptionseinheit GFP.
Werden die DHFR- und GFP-Gene aus separaten Transkriptionseinheiten exprimiert, so sind ihre Positionen untereinander austauschbar, sodass das DHFR-Gen in die erste Transkriptionseinheit und GFP in die zweite Transkriptionseinheit oder umgekehrt platziert werden kann.
Das vorangehende, die zwei Transkriptionseinheiten, wovon jede ein Intron aufweist, umfassende Konstrukt ist zur Expression von zwei Genen von Interesse wie in 1, Reihe 5, gezeigt nützlich. Die zweite Transkriptionseinheit kann eine zweite selektierte Sequenz und das GFP-Gen im zweiten Intron umfassen, beides Kodiersequenzen, die operabel an denselben Promotor gebunden und aus eben diesem selben Promotor transkribiert werden.
In wiederum einer anderen Ausführungsform des obigen Konstrukts, das zwei Transkriptionseinheiten und zwei Introne umfasst, wird, anstatt das GFP-Gen innerhalb des zweiten Introns in der zweiten Transkriptionseinheit zu platzieren, eine IRES zwischen der zweiten selektierten Sequenz und dem GFP-Gen platziert (1, Reihe 6). Sowohl die zweite selektierte Sequenz als auch das GFP-Gen aus der zweiten Transkriptionseinheit werden aus der dicistronischen Nachricht translatiert.
In wiederum einer anderen alternativen Konfiguration des obigen Konstrukts, das zwei Transkriptionseinheiten und zwei Introne umfasst, wird ein DHFR-GFP-Fusionsgen innerhalb des ersten Introns platziert (1, Reihe 7). Das zweite Intron kann ohne jegliches Insert bleiben (in den Figuren als leer angegeben), oder ein anderes selektierbares Markergen kann in das Intron insertiert werden.
In wiederum anderen Variationen des Konstrukts, das zwei Transkriptionseinheiten und zwei Introne umfasst, wird das erste Intron in der ersten Transkriptionseinheit leer gelassen, wobei jedoch eine IRES stromab vom ersten Gen von Interesse insertiert wird, was Translation eines Stromab-DHFR-GFP-Fusionsgens ermöglicht. Die zweite Transkriptionseinheit umfasst das zweite Intron, gefolgt von einem zweiten Gen von Interesse (1, Reihe 8). Gegebenenfalls kann ein anderes selektierbares Markergen (ein anderes als das amplifizierbare selektierbare Gen und das GFP-Gen) innerhalb des zweiten Introns platziert werden, oder das Intron kann ohne ein insertiertes Gen bleiben.
Schließlich kann die erste Transkriptionseinheit in der Reihenfolge 5' zu 3' ein erstes Intron, die erste selektierte Sequenz, eine IRES und DHFR umfassen; die zweite Transkriptionseinheit kann ein zweites Intron, eine zweite selektierte Sequenz, eine IRES und das GFP-Gen in dieser Reihenfolge umfassen (1, Reihe 9).
Expressionsvektoren mit zwei oder mehreren Transkriptionseinheiten sind zur Expression von Proteinen nützlich, die heterodimer oder mehrkettig sind. Die erste und die zweite selektierte Sequenz im Vektor können für die zwei Polypeptidketten eines heterodimeren Rezeptors kodieren. Beispielsweise kann die erste selektierte Sequenz in der ersten Transkriptionseinheit für eine schwere (H) Immunglobulinkette kodieren und die zweite selektierte Sequenz in der zweiten Transkriptionseinheit kodiert für die leichte (L) Immunglobulinkette. Zur Expression von Antikörper-H- und -L-Kette ist die bevorzugte Konfiguration die Anordnung des selektierbaren Markers (DHFR oder Puromycin-DHFR-Fusion) im Intron 5' zur H-Kette und des GFP-Gens im Intron 5' der L-Kette.
Transfektion und Wirtszellen
Die Plasmide können in Bakterienwirtszellen vermehrt werden, um DNA-Material für Subklonierungsschritte oder zur Einführung in eukaryotische Wirtszellen herzustellen. Transfektion von eukaryotischen Wirtszellen kann durch jedes beliebige Verfahren, das auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist und z.B. in Sambrook et al., s.o., beschrieben wird, durchgeführt werden. Transfektionsverfahren umfassen Lipofektion, Elektroporation, Calciumphosphat-Co-Fällung, Rubidiumchlorid- oder Polykation(wie DEAE-Dextran-)vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion und Mikroinjektion. Vorzugsweise ist die Transfektion eine stabile Transfektion. Das Transfektionsverfah ren, das optimale Transfektionshäufigkeit und Expression des Konstrukts in der bestimmten Wirtszelllinie und im bestimmten Wirtszelltyp bereitstellt, wird bevorzugt. Geeignete Verfahren können durch Routineverfahren bestimmt werden. Für stabile Transfektanten werden die Konstrukte integriert, sodass sie innerhalb des Wirtschromosoms stabil aufrechterhalten werden.
Wirtszellen, die für Expression der selektierten Sequenz und des amplifizierbaren selektierbaren Markers geeignet sind, umfassen eukaryotische Zellen, vorzugsweise Säugetierzellen. Insekten- und Pflanzenzellen können auch mit geeigneten Promotoren verwendet werden (z.B. Baculoviruspromotor in Sf9-Insektenzellen). Der Zelltyp sollte in der Lage sein, das für das erwünschte Protein kodierende Konstrukt zu exprimieren, das Protein zu verarbeiten und ein sekretiertes Protein zur Zelloberfläche für Sekretion zu transportieren. Verarbeitung umfasst co- und post-translationale Modifikation wie Leaderpeptidspaltung, GPI-Anbindung, Glykosylierung, Ubiquitinierung und Disulfidbindungsbildung. Kulturen von sich unbegrenzt vermehrenden Wirtszellen, die für Transfektion einsetzbar sind, und In-vitro-Zellkultur und dergleichen, die typischerweise zur gentechnischen Veränderung verwendet werden, werden bevorzugt. Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert mit SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Derivate, die an Wachstum in Suspensionskultur angepasst sind; Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); DHFR^–-Chinahamster-Eierstockzellen (ATCC-CRL-9096); dp12.CHO-Zellen, ein Derivat von CNO/DHFR- (EP 307.247, veröffentlicht am 15. März 1989); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen von der Afrikanischen Grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mausbrusttumor (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); PEER menschliche akute lymphoblastische Zelllinie (Ravid et al., Int. J. Cancer 25, 705–710 (1980)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; menschliche Hepatomlinie (Hep G2), menschli che HT1080-Zellen, KB-Zellen, JW-2-Zellen, Detroit-6-Zellen, NIH-3T3-Zellen, Hybridom- und Myelomzellen. Embryonale Zellen, die zur Bildung transgener Tiere verwendet werden, sind ebenfalls geeignet (z.B. Zygoten und embryonale Stammzellen).
Eine geeignete Wirtszelle, wenn ein Wildtyp-DHFR-Gen verwendet wird, ist die Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, ATCC CRL-9096, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub & Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben, sowie Derivate von dieser Zelllinie, einschließlich der dp12-Zelllinie. Um das DHFR-Amplifikationsverfahren auf andere Zelltypen auszuweiten, kann ein mutiertes DHFR-Gen, das für ein Protein mit reduzierter Empfindlichkeit gegenüber Methotrexat kodiert, in Verbindung mit Wirtszellen verwendet werden, die normale Mengen an einem endogenen Wildtyp-DHFR-Gen enthalten (siehe Simonsen & Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2495 (1983); Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567–3570 (1980); Haber & Schimke, Somatic Cell Genetics 8, 499–508 (1982)).
Screening und Selektion
Bakterien, die mit dem GFP-Gen transformiert sind, können unter Verwendung einer Langwellen-UV-Lampe auf Fluoreszenz gescreent werden.
Nach der Transfektion von Säugetierzellen werden die Zellen typischerweise etwa 2 Tage lang in nicht selektivem Medium gezüchtet. Die Zellen werden etwa 18–48 h nach der Transfektion in Selektionsmedium gegeben und etwa 2–4 Wochen in selektiver Kultur gehalten. Ist ein zweites selektierbares Markergen, das nicht das amplifizierbare selektierbare Gen ist, im Expressionsvektor vorhanden, so können die Zellen für Expression der beiden Markergene gleichzeitig durch Zusatz von beiden selektiven Mitteln zum Kulturmedium selektiert werden. Zellen können beispielsweise für DHFR-Expression in Gegenwart von Methotrexat und gleichzeitig für Hygromycinresistenz selektiert werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH und dergleichen sind jene, die davor für die für Expression selektierte Wirtszelle verwendet wur den, und werden durchschnittlichen Fachleuten bekannt sein. Zellen, die Selektion überleben, werden dann z.B. mittels FACS auf Fluoreszenz gescreent.
Die Selektion von rekombinanten Wirtszellen, die höhere Konzentrationen eines erwünschten Proteins exprimieren, ist im Allgemeinen ein Verfahren mit mehreren Schritten. Transfizierte Zellen werden auf Expression des GFP und/oder des amplifizierbaren selektierbaren Markers gescreent, um Zellen zu identifizieren, die den Expressionsvektor inkorporiert haben. Typischerweise werden die transfizierten Wirtszellen Selektion auf Expression des/r selektierbaren Marker(s) durch Kultivieren in Selektionsmedium für etwa 2 Wochen unterzogen. Hiernach werden die überlebenden Zellen zum Screenen und Sortieren durch Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie auf Expression von GFP vereinigt. Die Durchflusszytometer werden im Allgemeinen mit Fluoresceinisothiocyanat-(FITC-)Filter ausgestattet, um Fluoreszenz nachzuweisen. Die Zellen werden typischerweise mehreren Durchgängen, vorzugsweise zumindest zwei Durchgängen, von aufeinander folgenden Sortierungsschritten unterzogen. Die hellsten Zellen aus den frühen FACS-Sortierungsschritten können für darauf folgendes Kultivieren und weiteres Sortieren vereinigt werden; im letzten Sortierungsdurchgang werden dann die einzelnen Klone herausgetrennt. Wiederholtes Sortieren reichert die hohe, stabile Fluoreszenzzellpopulation an. Typischerweise werden Zellen etwa 1–3 Wochen lang gezüchtet, noch typischer 2 Wochen zwischen den Sortierungsdurchgängen, wobei dies von der Vermehrungsgeschwindigkeit der bestimmten Wirtszelle abhängt. Jede beliebige Anzahl oder jeder Prozentsatz von fluoreszierenden Zellen kann sortiert werden. Typischerweise werden die hellsten 1–10% fluoreszierender Zellen (Fluoreszenzintensität wird in mfe-Einheiten gemessen, die durch FACS-Analyse bestimmt werden) in der analysierten Population im ersten und im zweiten Sortierungsdurchgang aussortiert, und einige wenige Zellen werden in den darauf folgenden Sortierungsschritten aussortiert. Im ersten Durchgang beispielsweise werden die hellsten 5% fluoreszierender Zellen sortiert, im zweiten Durchgang werden die hellsten 1% der Zellen gesammelt, und im dritten Durchgang werden die hellsten 0,5% der Zellen isoliert und kloniert. Suspensions- oder anhaftende Zellen werden typischerweise in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) sortiert und in Wachstumsmedium gesammelt. Die sortierten Zellen können mit oder ohne Selektion kultiviert werden. Fluoreszenzsortieren und Selektion/Amplifikation können nacheinander oder gleichzeitig erfolgen.
Fluoreszenzmikroskopie zur Detektion von Fluoreszenz wird auf dem Gebiet der Erfindung gelehrt, siehe z.B. Bennett et al., Biotechniques 24, 4778–482 (1998). Durchflusszytometrieverfahren zur Detektion von fluoreszierenden Zellen und Analyse von GFP können wie in den nachstehenden Beispielen oder in der Literatur beschrieben (siehe z.B. Subramanian & Srienc (1996), s.o., Ropp et al., Cytometry 21, 309–317 (1995); Nataranjan et al., J. Biotechnol. 62, 29–45 (1998); Mosser et al., S. 152 (1997), s.o.) durchgeführt werden. Kurz zusammengefasst werden die transfizierten Zellen bei einer Lichtwellenlänge, die für das besondere mutierte GFP-Protein geeignet ist, unter solchen Bedingungen, dass das GFP sichtbares fluoreszierendes Licht emittiert, beleuchtet. Die Anregungs- und Emissionswellenlänge variiert mit dem bestimmten verwendeten fluoreszierenden Protein und wird im Allgemeinen vom Hersteller/Zulieferer der GFP-Mutante beschrieben werden. Fluoreszenzintensität wird unter Verwendung von z.B. einem FACSCAN- oder FACSCalibur-Durchflusszytometers gemessen.
Nach dem Fluoreszenzsortieren werden einzelne Klone in geeignetem Selektionsmedium kultiviert, um auf Klone zu selektieren, die Amplifikation von zumindest dem amplifizierbaren selektierbaren Gen, und üblicherweise auch von benachbarten, physikalisch damit verbundenen Sequenzen, erfahren hatten. Die Konzentration von Selektionswirkstoff und Zellen, die für die Selektion von „amplifizierten" Zellen geeignet ist, hängt von der Zelllinie ab und kann mittels Routineverfahren bestimmt werden, wie beispielsweise durch Variieren der Wirkstoffkonzentration oder der Anzahl der Zellen, um im Allgemeinen etwa 5% Überleben in einer Kurve zur Wirkstofftötung zu erreichen. Es wird bevorzugt, eine niedrige Wirkstoffkonzentration beizubehalten und eher die Zellanzahl zu variieren.
Das in Verbindung mit einem DHFR-Gen verwendete Selektionsmittel ist Methotrexat (Mtx), und hell fluoreszierende Zellen werden für Amplifikation des DHFR-Gens und des Produktgens durch Aussetzung gegenüber stetig ansteigenden Mengen an Mtx selektiert. Transfizierte Zellen werden in GHT-freiem Medium, das Mtx in einer anfänglichen Konzentration, die typischerweise im Bereich von zwischen etwa 1 nM und 1.000 nM, noch typischer zwischen 50 nM und 500 nM, liegt, enthält, kultiviert. Die Konzentration von Mtx kann schrittweise durch Steigerungen um z.B. 100 nM erhöht werden. Weniger als 100% Überleben oder Konfluenz sollte erhalten werden.
Transfektanten, die die Wirkstoffselektion überleben und vorzugsweise auch intensive Fluoreszenz zeigen, können dann analysiert werden, um Synthese des erwünschten Produkts durch Analysieren der Proteine oder mRNA zu bestätigen.
Analyse der Transfektanten
Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), durch Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer in geeigneter Weise markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Verschiedene Markierungen können verwenden werden, wobei Radioisotope, insbesondere ³²P, am üblichsten sind. Es können jedoch auch andere Verfahren verwendet werden, wie beispielsweise die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als die Stelle für Bindung an Avidin oder Antikörper, die mit zahlreichen verschiedenen Markierungen, wie Radionucliden, Fluoreszenz, Enzymen und dergleichen, markiert werden können. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplexe, einschließlich DNA-Duplexe, RNA-Duplexe und DNA-RNA-Hybridduplexe oder DNA-Protein-Duplexe, erkennen. Die Antikörper wiederum können markiert sein, und der Test kann dort durchgeführt werden, wo der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei der Bildung von Duplex an der Oberfläche die Gegenwart von Antikörper, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
Proteintiter kann mittels verschiedener Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, z.B. durch ELISA unter Verwendung von z.B. einem Antikörper, Liganden, Rezeptor oder jedem beliebigen Bindungspartner des erwünschten Proteins, getestet werden. Gegenwart des erwünschten Produkts kann auch durch einen funktionellen Test getestet werden. Ist das erwünschte Produkt beispielsweise ein sekretiertes Enzym, so würde der funktionelle Test das Testen des Zellüberstandes auf enzymatische Wirkung auf ein Substrat umfassen. Andere immunologische Verfahren wie Immunfällung, Western-Blotting und Sondieren mit Antikörper, immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten und Tests von Zellkultur oder Körperflüssigkeiten können verwendet werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Mit immunhistochemischen Färbungsverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratation und Fixation, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, worin die Markierungen üblicherweise per Sichtprüfung nachweisbar sind, wie z.B. Enzymmarkierungen, Fluoreszenzmarkierungen, Lumineszenzmarkierungen und dergleichen. Ein besonders empfindliches Färbungsverfahren, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird von Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben. Die im Überstand oder im Lysat vorhandenen Proteine können direkt oder indirekt markiert sein. Biosynthetische und andere Verfahren zur Markierung von Proteinen sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt.
Transkriptionsniveaus sind nützliche indirekte Indikatoren für das Niveau der erwünschten Proteinsynthese. RNA kann mittels Routineverfahren wie PCR, RT-PCR oder Northern-Blot-Analyse unter Verwendung geeigneter Primer, Oligonucleotide oder Sonden analysiert werden. In der bevorzugten Ausführungsform wird die mRNA durch quantitative PCR analysiert, die nützlich ist, um die Spleißeffizienz zu bestimmen, und Proteinexpression wird unter Verwendung von ELISA gemessen.
Das Protein von Interesse wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als ein sekretiertes Polypeptid gewonnen, oder es kann aus Wirtszelllysaten gewonnen werden, wenn es ohne ein Sekretionssignal exprimiert wird. Wird das Produktgen in einer rekombinanten Zelle, die nicht menschlichen Ursprungs ist, exprimiert, so ist das Pro dukt von Interesse vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, das Produkt von Interesse von rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die in Bezug auf das Produkt von Interesse im Wesentlichen homogen sind. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder Lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu, entfernen. Das Produkt von Interesse wird hiernach von kontaminierenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, beispielsweise durch Fraktionierung an Immunaffinitäts- oder Ionenaustauschsäulen; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Siliciumdioxid oder einem Kationenaustauschharz wie DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE Ammoniumsulfatfällung; Gelelektrophorese unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75; Chromatographie auf Plasminogensäulen, um das Produkt von Interesse zu binden, und Protein-A-Sepharose-Säulen, um Kontaminanten wie IgG zu entfernen.
Ein Set, das ein oder mehrere Polynucleotide der Erfindung in einem geeigneten Gefäß wie z.B. einer Phiole enthält, kann bereitgestellt werden. Die Expressionsvektoren umfassenden Polynucleotide können zumindest eine Klonierungsstelle zur Insertion einer selektierten Sequenz von Interesse enthalten oder können ein spezifisches Gen von Interesse aufweisen, das bereits im Vektor vorhanden ist. In einer Ausführungsform enthält das Polynucleotid im Set zwei Transkriptionseinheiten, mit dem DHFR-Gen im Intron einer Transkriptionseinheit und dem GFP-Gen stromab des zweiten Introns in einer zweiten Transkriptionseinheit. Das Polynucleotid kann in einer dehydratisierten oder lyophilisierten Form oder in einer wässrigen Lösung bereitgestellt werden. Das Set kann einen Puffer zur Rekonstitution des dehydratisierten Polynucleotids umfassen. Andere Reagenzien können im Set eingebunden sein, z.B. Reaktionspuffer, positive und negative Kontrollvektoren zum Vergleich. Im Allgemeinen umfasst das Set auch Anweisungen zur Verwendung der darin enthaltenen Reagenzien.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verständlich sein, die als Veranschaulichung der Erfindung dienen sollen.
BEISPIELE
Abkürzungen
CHO, Chinahamster-Eierstock; dNTP, Desoxyribonucleosidtriphosphat; DHFR, Dihydrofolatreductase; DNase, Desoxyribonuclease; ELISA, enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung; FACS, fluoreszenzaktivierter Zellsortierer; FAM, 6-Carboxyfluorescein; FBS, fötales Rinderserum; GFP, grün fluoreszierendes Protein; GHT, Glycin, Hypoxanthin und Thymidin; IRES, interne Ribosomeneintrittsstelle; kb, Kilobase; kDa, Kilodalton; mfe, Million Fluorescein-Äquivalenz; MTX, Methotrexat; NT3, Neuronotrophin-3; PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PCR, Polymerasekettenreaktion; TAMRA, 6-Carboxytetramethylrhodamin; VEGF, Gefäßendothelwachstumsfaktor.
Beispiel 1
Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion und Expression verschiedener erwünschter Proteine, von grün fluoreszierendem Protein (GFP) und DHFR, aus einem einzelnen Vektor in Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zellen. Die Versuche zeigten, dass hochproduzierende Klone mittels FACS-Sortierung basierend auf GFP-Expression gewonnen werden könnten. Ein Zwei-Promotor-System wurde verwendet, um das erwünschte Protein und GFP zu exprimieren. DHFR und das erwünschte Protein wurden aus einer Transkriptionseinheit exprimiert, und GFP wurde aus einer separaten Transkriptionseinheit exprimiert (1 und 6).
Transfizierte Zellen wurden in Selektionsmedium gezüchtet und auf Fluoreszenz von GFP sortiert und durch FACS kloniert. Die folgenden unterschiedlichen erwünschten Proteine (Enzym und Wachstumsfaktor) wurden aus diesem repräsentativen Expressionsvektor exprimiert: Neuronotrophin-3 (NT3), Desoxyribonuclease (DNase) und Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF). FACS-Sortierung erhöhte die Wahrscheinlichkeit stark, hochproduzierende Klone zu erhalten. Insgesamt wurde eine gute Korrelation zwischen der erwünschten Protein-RNA oder GFP-RNA und zwischen Pro duktivität des erwünschten Proteins und der GFP-Fluoreszenz in den erwünschten, Protein-GFP-produzierenden Klonen beobachtet (siehe die 8A–B, 9A–B und 11A–D), was auf eine gute Co-Expressionseffizienz von zwei gebundenen Transkriptionseinheiten hinweist.
1. Materialien und Verfahren
1.1 Konstruktion von Plasmiden
Wie in Lucas et al., in Nucleic Acid Res. 24, 1774–1779 (1996), beschrieben, wurde ein Vektor, der das DHFR-Gen im Intron enthielt, durch Insertieren der Maus-DHFR-cDNA in das Intron des Expressionsvektors pRK konstruiert (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987)). Expressionsvektor pRK wird durch den unmittelbar frühen CMV-Genpromotor und -enhancer (CMV IE P/E) gesteuert und weist eine Spleißdonorstelle aus dem CMV-IE-Gen und eine Spleißakzeptorstelle aus einem IgG-Schwerketten-Variabelregionen-Gen auf (Eaton et al., Biochem. 25, 8343–8347 (1986)). Eine EcoRV-Stelle wurde in eine BstX1-Stelle, die 36 Basen stromab von der SD des 144-bp-Introns von pRK vorhanden ist, insertiert. Ein stumpfendiges 678–bp-Fragment, das die Maus-DHFR-cDNA enthielt (Simonsen & Levinson (1983), s.o.), wurde in die EcoRV-Stelle insertiert.
5 zeigt einen DHFR-Intronvektor, pSV15.ID.LLn (Lucas et al. (1996), s.o.), der eine Größe von 5141 bp aufweist und eine Klonierlinkerregion (ClaI bis HindIII-Mehrfachklonierstelle) enthält, die durch Fettdruck markiert ist. Der Vektor pSV17.ID.LLn ist mit diesem Vektor bis auf die Ausnahme, dass die Mehrfachklonierstelle umgekehrt ist, sodass die HindIII-Stelle an Position 1289 und ClaI an 1331 liegt, identisch (nicht dargestellt).
Um GFP mit DHFR alleine zu exprimieren, wurde ein EcoRI-HindIII-Fragment aus pCMV.S65T.GFP (Ropp et al., Cytometry 21, 309–317 (1995)), das für GFPS65T kodierende cDNA enthielt, in eine Klonier-Linkerregion des dicistronischen DHFR-Intronvektors, der in Lucas et al. (1996), s.o., beschrieben wird, insertiert.
Um ein erwünschtes Protein (z.B. NT3, DNase oder VEGF) mit GFP zu exprimieren, wurde die AvrII-1900-Stelle stromab von der Klonier-Linkerregion des DHFR-Intronvektors zu einer SpeI-Stelle konvertiert. Dieser modifizierte Vektor wurde mit AvrII an 369 und KpnI an 1550 verdaut, und das 4-kb-KpnI-AvrII-Hauptkettenfragment wurde isoliert. Davor wurde NT3, DNase oder VEGF₁₆₅-cDNA in den DHFR-Intronvektor kloniert. Ein 2-kb-AvrII-KpnI-Fragment, das für DHFR kodierende cDNA und eines von NT3, DNase oder VEGF enthielt, wurde aus diesen Vektoren isoliert und mit dem zuvor erwähnten KpnI-AvrII-Hauptkettenfragment ligiert, um NT3-, DNase- oder VEGF-Expressionsvektoren mit einer einzelnen SpeI-Stelle zu erhalten. Aus einem Vektor, der jenem in pSV15.ID.LLn ähnlich ist, außer dass er das DHFR-Gen nicht enthält, wurde ein AvrII-AvrII-Fragment, das die für GFPS65T kodierende cDNA und die SV40-polyA enthielt, in die SpeI-Stelle kloniert, um eine zweite Transkriptionseinheit zu erhalten, die GFP unter dem zweiten SV40-Promotor, der 5' vom GFP im Vektor vorhanden ist, exprimiert. 6 zeigt ein Beispiel für den Zwei-Transkriptionseinheiten-Vektor zur Expression von VEGF. Sowohl DHFR, das Gen von Interesse, als auch GFP weisen ihre ATG-Initiationsstellen auf.
1.2 Zellkultur und Transfektionen
DP12-Zellen, ein CHO-K1-DUX-B11-(DHFR-)Derivat, wurden in 50:50-F12/DMEM-Medium, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin; 10 μg/ml Glycin, 15 μg/ml Hypoxanthin, 5 μg/ml Thymidin und 5% fötalem Rinderserum (Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD), gezüchtet. CHO-Zellen, die in einer Platte mit 100 mm Durchmesser (bis zu etwa 80–85% Konfluenz) gezüchtet wurden, wurden mit linearisiertem Plasmid (15 μg) transfiziert. Transfektionen für Expression von GFP alleine, NT3 mit GFP (NT3, wie in Rosenthal et al., Neuron 4, 767–773 (1990), beschrieben) oder DNase mit GFP (DNase, wie in Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9188–9192 (1990), beschrieben) wurden mit Lipofectamin (Gibco BRL) durchgeführt, und Transfektionen für Expression von VEGF alleine (Leung et al., Science 246, 1306–1309 (1989)) oder VEGF mit GFP wurden mit SuperFect (Qiagen Inc., Santa Clarita; CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Transfizierte CHO-Zellen wurden in GHT-freiem F12/DMEM-Medium (Medium, dem Glycin, Hypoxanthin und Thymidin fehlt), ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 5% dialysiertem fötalem Rinderserum, gezüchtet.
Um Zellen in Methotrexat (MTX) zu züchten, wurden transfizierte Zellen in Medium gegeben, das 10 nM MTX (Sigma, St. Louis, MO) enthielt, und die MTX-Konzentration wurde schrittweise über einen bestimmten Zeitraum angehoben. Für Korrelationsstudien von GFP-Fluoreszenz und Produktivität des erwünschten Proteins wurden die Zellen zu 1,5 Million Zellen pro 100 mm Platte überimpft und 2 Tage lang für Produktivitätsmessungen kultiviert. Überstände wurden geerntet, und die Menge des produzierten erwünschten Proteins wurde mittels ELISA gemessen. Produktivität (pg/Zelle/Tag) wurde als pg/((Ct-CO)t/In(Ct/C0)) berechnet, worin C0 und Ct für die Anfangs- und Endanzahl der Zellen und t für die Inkubationszeit steht. Für Produktivitätsstudien an Zellen, die in MTX gezüchtet wurden, wurde MTX in das Medium eingebunden.
1.3 FACS
Durchflusszytometrieanalyse und Sortieren wurden wie zuvor beschrieben unter Verwendung eines EPICS-Elite-ESP-Zytometers (Coulter Corp. Hialeach, FL), ausgestattet mit einem Argonionenlaser, durchgeführt (Ropp et al., Cytometry 21, 309–317 (1995)). Die Anregungswellenlänge betrug 488 nm, und die Emissionswellenlänge betrug 525 ± 25 nm. Zellen in 100-mm-Schale wurden trypsiniert und in 2% dia-filtriertem FBS in PBS resuspendiert. Propidiumiodid wurde zugesetzt, und die Zellen wurden bei 1.000–3.000 Zellen/s in phosphatgepufferter Kochsalzlösung sortiert und in Wachstumsmedium gesammelt. Einzelzellklonieren in 96-Well-Platten erfolgte unter Verwendung des Autoclone-Systems, mit dem das Zytometer ausgestattet war. Fluoreszenzintensität von Klonen wurde unter Verwendung entweder von FACScan- oder FACSCalibur-Durchflusszytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) gemessen. Kalibrierpartikel (4700 – 3,3 × 10⁵ Fluoresceinäquivalenz; Spherotech, Inc., Libertyville, IL) wurden verwendet, um eine Standardkurve zu erstellen. Die Fluores ceinäquivafenz der mittleren geometrischen Fluoreszenzintensität von Zellen wurde berechnet und im Rahmen der Datenanalyse verwendet.
1.4 ELISA
Für GFP-ELISA wurden ELISA-Platten mit 2 μg/ml polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen Wildtyp-GFP (Clonetech, Palo Alto, CA) in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden mit 0,5% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur 1 h lang blockiert. Seriell verdünnte Proben und Standards (Wildtyp-GFP) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 0,5% Rinderserumalbumin, 0,05% Polysorbat 20 enthielt, wurden zu den Platten zugesetzt, und die Platten wurden 1 h lang inkubiert. An die Platte gebundenes GFP wurde durch Zusetzen von biotinyliertem polyklonalem Kaninchen-Antikörper zum Wildtyp-GFP, gefolgt von Streptavidinperoxidase (Sigma) und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (Kirkegaard & Perry Laboratories) als Substrat nachgewiesen. Die Platten wurden zwischen den Verfahrensschritten gewaschen. Absorption wurde bei 450 nm an einem Vmax-Plattenleser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) abgelesen. Die Standardkurve wurde unter Verwendung eines Anpassungsprogramms (vier Parameter, nicht lineare Regressionskurve) (entwickelt bei Genentech) angepasst. Datenpunkte, die in den linearen Bereich der Standardkurve fielen, wurden zur Berechnung der GFP-Konzentration in den Proben verwendet. Der Testbereich erstreckte sich von 0,16–10 ng/ml. NT3, DNase oder VEGF in den Überständen wurden auch unter Verwendung einer ELISA vom Sandwich-Typ gemessen. NT3-ELISA verwendete echten polyklonalen Schwein-Antikörper gegen rekombinantes menschliches NT3 (Genentech) zur Beschichtung und biotinylierten echten polyklonalen Schwein-Antikörper zur Detektion. Der Testbereich erstreckte sich von 0,10–6,25 ng/ml. DNase-ELISA verwendete polyklonalen Ziegen-Antikörper gegen rekombinante menschliche DNase (Genentech) zur Beschichtung und biotinylierten polyklonalen Kaninchen-Antikörper zur Detektion. Der Testbereich erstreckte sich von 0,39–25 ng/ml. VEGF-ELISA verwendete einen monoklonalen Antikörper gegen VEGF zur Beschichtung und biotinylierten monoklonalen Antikörper zur Detektion. Der Testbereich erstreckte sich von 0,015–1 ng/ml (Shifren et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 3112–3118 (1996)).
1.5 RNA-Quantifizierung
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Minisets (Qiagen) hergestellt, und die Konzentration wurde mittels Absorption bestimmt. RT-PCR wurde in einem 7700 Sequence Detector (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) unter Verwendung von Reagenzien, die bei PE Applied Biosystems erworben wurden, durchgeführt. Die Sequenzen der 5'- und 3'-Endprimer und Sonde waren GTGGAGAGGGTGAAGGTGATGC (Seq.-ID Nr. 3); CGAAAGGGCAGATTGTGTGGAC (Seq.-ID Nr. 4) bzw. FAM-TAACCGCTACCGGGACAGGAAAATGGT-TAMRA (Seq.-ID Nr. 5) für GFP, AGAGTCACCGAGGGGAGTA (Seq.-ID Nr. 6), CGTAGGTTTGGGATGTTTTG (Seq.-ID Nr. 7) bzw. FAM-ACGGGCAACTCTCCTGTCAAACAAT-TAMRA (Seq.-ID Nr. 8) für NT3, AGCCACTGGGACGGAACA (Seq.-ID Nr. 9), ACCGGGAGAAGAACCTGACA (Seq.-ID Nr. 10) bzw. FAM-CTGACCAGGTGTCTGCGGTGGACAG-TAMRA (Seq.-ID Nr. 11) für DNase und TCGCCTTGCTGCTCTACCTC (Seq.-ID Nr. 12), GGCACACAGGATGGCTTGA (Seq.-ID Nr. 13) bzw. FAM-CCAAGTGGTCCCAGGCTGCACCCAT-TAMRA (Seq.-ID Nr. 14) für VEGF. Das Reaktionsgemisch wies 1 × Puffer A, 4 mM Magnesiumchlorid, eine optimale Konzentration von Primern (20 nM für GFP, 50 nM für NT3 und VEGF, 25 nM für DNase), 100 nM Sonde, 50 ng Gesamt-RNA, 0,3 mM dNTP (oder 0,6 mM dUTP anstelle von 0,3 mM dTTP), RNase-Inhibitor (400 U/ml), MuLV-Umkehrtranskriptase (250 U/ml), TaqGold (25 U/ml) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl auf. Die PCR-Zyklusbedingung lautete 48°C, 30 min; 95°C, 10 min; 40 Zyklen bei 95°C, 30 s, und 60°C, 2 min. Die amplifizierten PCR-Produkte wiesen bei der Analyse auf dem Agarosegel – 1% SeaKem LE, 3% NuSieve 1:3 (FMC BioProducts, Rockland, ME) – das erwartete jeweilige Molekulargewicht auf (536 bp für GFP, 243 bp für NT3, 159 bp für DNase und 202 bp für VEGF).
1.6 Statistische Analyse
Daten aus den Korrelationsstudien wurden unter Verwendung von Korrelationskoeffizient mit p-Wert aus Fishers r-zu-z-Transformation (StatView program, Abacus Concepts, Berkeley, CA) analysiert.
2. Resultate
2.1 Expression von GFP alleine
DHFR^–-CHO-Zellen wurden mit dem GFP-Expressionsvektor transfiziert. Transfizierte Zellen wurden im GHT-freien Medium gezüchtet und mittels FACS zu verschiedenen Fluoreszenzpopulationen sortiert. Um hochfluoreszierende Klone zu erhalten, wurden die hellsten 5% der Zellen sortiert. Es wurden Zellen mit sechsfach höherer Fluoreszenz erhalten. Nach zwei Wochen Vermehrung wurden diese Zellen einem zweiten Sortiervorgang unterzogen, wobei die hellsten 1% der Zellen gesammelt wurden. Nach weiteren zwei Wochen Vermehrung wurden die hellsten 0,4% der Zellen in einer dritten Sortierung kloniert. Achtzehn Klone mit verschiedenen Fluoreszenzintensitäten wurden durch Fluoreszenzmikroskopie selektiert. Die Klone mit der höchsten Fluoreszenz wiesen eine Fluoreszenzintensität von 1,4 mfe auf.
Zur Bestimmung von GFP-Konzentration in diesen Klonen wurden Lysate durch 15-minütige Inkubation der Zellen in einer konfluenten 100-mm-Schale mit 0,35 ml von 150 mM NaCl, 50 mM HEPES, 0,5% Triton X100, das 1 mM AEBSF enthielt, 11 U/ml Aprotinin und 50 mM Leupeptin (ICN Biomedicals, Aurora, OH) auf Eis hergestellt. Die Zellkerne wurden bei 14.000 U/min in der Eppendort-Zentrifuge pelletiert, und die Überstände wurden abgenommen und eingefroren bis zur Durchführung der Tests gelagert. GFP-Konzentration in Zelllysat wurde bezogen auf die Gesamtproteinkonzentration, die unter Verwendung des BCA-Proteintestsets (Pierce, Rockford, IL) gemessen wurde, normalisiert.
Die Analyse dieser Klone zeigte, dass die mittels FACS gemessene GFP-Fluoreszenz sehr gut mit GFP im Zelllysat korrelierte, wie durch ELISA gemessen wurde (Korrelationskoeffizient = 0,99, p < 0,0001; 7). Daher stellte die GFP-Fluoreszenz der Zelle quantitativ die Menge von zellulärem GFP-Protein in diesen Klonen dar. Dies stimmt mit den früheren Berichten überein, die zeigten, dass GFP-Fluoreszenz ein gutes Maß für den Gesamt-GFP-Gehalt in vorübergehend transfizierten CHO-Zellen war (Subramanian et al., J. Biotechnol. 49, 137–151 (1996), und Natarajan et al., J. Biotechnol. 62, 29–45 (1998)). Ähnlich wie in früheren Berichten (Gubin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 347–350 (1997)) wurde keine offensichtliche Wirkung von GFP auf CHO-Zellvermehrung beobachtet. Die FACS-Profile von diesen Klonen blieben während der zwei Untersuchungswochen dieselben und veränderten sich nicht, wenn sie eingefroren und neuerlich kultiviert wurden.
Lysate von manchen selektierten Klonen wurden an einem 16%igen SDS-Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen analysiert (Laemmli et al., Nature 227, 680–685 (1970)). Protein-Blotting und Sondieren mit Antikörper auf Wildtyp-GFP ergaben eine einzelne Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht von 27 kDa (Prasher et al., Gene 111, 229–233 (1992)).
Manche der hochfluoreszierenden Zellen, die aus dem ersten Sortierungsdurchgang erhalten wurden, wurden bei ansteigenden Konzentrationen von MTX im Lauf von zwei Monaten gezüchtet. Die Klone wurden aus Zellen, die in 50 nM (36 Klone) und in 100 nM (14 Klone) MTX gezüchtet wurden, manuell ausgewählt und mittels Fluoreszenzmikroskopie gescreent. Fluoreszenzintensitäten von sechs selektierten 50-nM-Klonen und fünf selektierten 100-nM-Klonen wurden mittels FACS gemessen. Die Klone mit der höchsten Fluoreszenz aus 50 und 100 nM MTX wiesen Fluoreszenzintensitäten von 1,6 bzw. 3,2 Millionen Fluorescein-Äquivalenz (mfe) auf. Im Vergleich dazu wiesen die Klone mit höchster Fluoreszenz, die durch wiederholtes FACS-Sortieren erhalten wurden, eine Fluoreszenzintensität von 1,4 mfe auf (7). FACS-Sortieren selektierte demnach Klone mit Fluoreszenz, die mit jener von Klonen in 50 nM MTX vergleichbar war. Der Klon mit 3,2 mfe Fluoreszenz aus 100 nM MTX wies 2,3fach höhere Fluoreszenz, gemessen mittels FACS, und 2,2-mal mehr zelluläres GFP, gemessen durch ELISA, als der Klon mit 1,4 mfe auf, der durch FACS-Sortieren gewonnen wurde. Dies zeigt, dass die Korrelation zwischen GFP- Fluoreszenz, gemessen durch FACS, und zellulärem Protein, gemessen durch ELISA, die in den durch FACS-Sortieren erhaltenen Klonen beobachtet wurde, auf Klone mit einer Fluoreszenz von bis zu 3,2 mfe ausgeweitet werden könnte. Abgesehen von dem Vorteil, dass FACS-Sortieren weniger arbeitsaufwendig ist, umgeht dieses Verfahren auch die Probleme von Heterogenität und Instabilität, die manchmal mit Klonen auftreten, die in MTX alleine selektiert wurden (Kaufman & Sharp (1982), Schimke (1992), s.o.).
2.2 Expression von NT3 oder DNase mit GFP
CHO-Zellen wurden mit einem DHFR-Intronvektor, der für Neuronotrophin-3 (NT3) (Rosenthal et al., Neuron 4, 767–773 (1990)) oder Desoxyribonuclease (DNase) (Shak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9188–9192 (1990)) kodierende cDNA enthielt, transfiziert, und für GFP, DHFR und NT3 oder DNase kodierende cDNA wurde in einer Transkriptionseinheit exprimiert, und GFP wurde in einer zweiten Transkriptionseinheit exprimiert (1, Reihe 4, und 6). Etwa zwei Wochen nach Selektion, oder wenn ausreichend Zellen für das Sortieren vorhanden waren, wurden transfizierte Zellen sortiert und mittels FACS kloniert. Die Klone mit hoher Fluoreszenz wurden durch Sortieren der hellsten 5% der Zellen im ersten Sortierungsdurchgang, Züchten der Zellen zwei Wochen lang und Klonieren der besten 4% (NT3) oder 2% (DNase) der Zellen im zweiten Sortierungsdurchgang gewonnen. Siebzehn NT3-GFP-Klone und 15 DNase-GFP-Klone mit unterschiedlichen Fluoreszenzintensitäten wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie selektiert.
Eine Korrelation zwischen Produktivität und GFP-Fluoreszenz wurde in 17 NT3-GFP-produzierenden Klonen (Korrelationskoeffizient = 0,68, p = 0,0018; 8A) und in 15 DNase-GFP-produzierenden Klonen (Korrelationskoeffizient = 0,52, p = 0,048; 9A) gezeigt. (Die Produktivität des Klons mit nicht nachweisbarer NT3- oder DNase-Produktion wurde unter Verwendung der jeweiligen ELISA-Testgrenze berechnet.) Demnach steigerte das Sortieren von Zellen gemäß GFP-Fluoreszenz durch FACS die Wahrscheinlichkeit, hochproduzierende Klone zu gewinnen. NT3-GFP-Klone wiesen im Vergleich mit DNase-GFP-Klonen mit ähnlicher GFP-Fluoreszenz eine viel geringere Produktivität auf, sogar wenn das Molekulargewicht von NT3 (15 kD für ein Monomer, Rosenthal et al., Neuron 4, 767–773 (1990)) und DNase (29 kD; Shak et al. (1990)) berücksichtigt wurde. NT3 ist dafür bekannt, als ein Pro-Protein synthetisiert und dann zur reifen Form verarbeitet zu werden, und wurde als schwierig zu exprimieren erkannt. FACS-Sortieren würde besonders nützlich sein, um hochproduzierende Klone für Moleküle zu gewinnen, die schwierig zu exprimieren sind.
NT3- oder DNase-RNA, gemessen durch RT-PCR unter Verwendung von Echtzeit-PCR, korrelierte in den einzelnen Klonen bezüglich der Produktivität sehr gut (Korrelationskoeffizient = 0,91, p < 0,0001 sowohl für NT3 als auch DNase, 8B und 9B). Die Menge von RNA wurde in Bezug auf die Menge von RNA des Klons mit der höchsten Fluoreszenz normalisiert.
2.3 Vergleich der Gewinnung von Klonen, die VEGF stark produzieren, durch FACS-Sortieren gegenüber zufälliges Auswählen von Klonen
Gefäßendothelwachstumsfaktor (VEGF) (Leung et al., 1989) wurde mit GFP exprimiert. Transfizierte Zellen wurden durch FACS sortiert und kloniert. VEGF ist ein potentes Mitogen für Gefäßendothelzellen in vitro und ein angiogener Faktor in vivo. Transfizierte Zellen wurden mittels FACS sortiert und kloniert. Um hochfluoreszierende Klone zu erhalten, wurden die besten 2,5% der Zellen sortiert, und 35.000 Zellen wurden abgenommen. Nach zusätzlichen zwei Wochen der Vermehrung wurden die besten 1,5% der Zellen in einem zweiten Sortierungsdurchgang sortiert, wobei 50.000 Zellen abgenommen wurden. Nach zusätzlichen zwei Wochen der Vermehrung wurden die besten 0,5% der Zellen in einem dritten Sortierungsdurchgang sortiert. Das wiederholte Sortieren reicherte die Population hochfluoreszierender Zellen an.
Die Fluoreszenzintensität betrug 0,025 mfe für die hochfluoreszierende Population der nicht sortierten Zellen (10A), 0,12 mfe für Zellen aus dem ersten Sortierungsdurchgang und 1,2 mfe für Zellen aus dem zweiten Sortierungsdurchgang (10B). Die Fluoreszenz des Klons mit der höchsten Fluoreszenz, der aus dem dritten Sortierungsdurchgang gewonnen wurde, betrug 5,0 mfe (10C). Bei Betrachtung mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte sehr helle Fluoreszenz gesehen werden, die über das gesamte Zytoplasma und den Zellkern verteilt war, was mit früheren Berichten übereinstimmt (Ogawa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11899–11903 (1995); Subramanian et al., J. Biotechnol. 49, 137–151 (1996)). Achtundvierzig Klone mit unterschiedlicher Fluoreszenz, einschließlich 15 hochfluoreszierender Klone, die wie zuvor beschrieben gewonnen wurden, wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie für Korrelationsstudien ausgewählt.
Eine Analyse dieser Klone zeigte, dass hochfluoreszierende Klone große Mengen an VEGF produzierten, und VEGF-Produktivität korrelierte gut mit GFP-Fluoreszenz (Korrelationskoeffizient = 0,70, p < 0,0001; 11A). FACS-Sortierung war demnach zur Gewinnung hochproduzierender Klone sehr nützlich. Darüber hinaus korrelierte VEGF-Produktivität mit VEGF-RNA sehr gut (Korrelationskoeffizient = 0,90, p < 0,0001; 11B), und GFP-Fluoreszenz korrelierte gut mit GFP-RNA (Korrelationskoeffizient = 0,78, p < 0,0001; 11C). Weiters korrelierte VEGF-RNA gut mit GFP-RNA (Korrelationskoeffizient = 0,71, p < 0,0001; 11D).
Zwei Monate waren erforderlich, um Klone mittels FACS zu gewinnen, die VEGF hoch produzierten. Die FACS-Sortierungsschritte könnten durch weniger langes Warten zwischen den Sortierungsdurchgängen verkürzt werden, außer wenn die Zwei-Wochen-Phase zwischen den Durchgängen die Häufigkeit spontan ampfifizierter Klone steigert (Johnson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3711–3715 (1983)).
Vier VEGF-GFP-Klone wurden mit MTX amplifiziert und in 500 nM MTX über einen Zeitraum von zweieinhalb Monaten kloniert. Die Produktivität blieb für die zwei Klone dieselbe und ergab 3,3 pg/Zelle/Tag, was darauf schließen lässt, dass hochproduzierende Klone eine höhere Konzentration von MTX zur Amplifikation benötigen könnten. Die Produktivität sank in manchen Klonen aus dem Klon, der 1,9 pg/Zelle/Tag produzierte, stieg jedoch im Fall des Klons, der 1,3 pg/Zelle/Tag produzierte, auf 4–5 pg/Zelle/Tag an. Demnach könnten Klone, die durch FACS-Sortierung erhalten werden, mit MTX amplifiziert werden, um höher produzierende Klone zu erhalten.
Um höher produzierende Klone auf herkömmliche Weise zu erhalten, wurden CHO-Zellen in 100-mm-Platten mit dem VEGF-Expressionsvektor transfiziert, und die Hälfte der Zellen wurde in sechs 100-mm-Platten in GHT-freiem Medium ausplattiert. Zwei Wochen nach der Transfektion wurden 144 Klone (24 Klone aus jeder Platte) per Zufallssystem manuell ausgewählt und auf 96-Well-Platten transferiert und auf VEGF-Produktion mittels ELISA gescreent. Vierundzwanzig VEGF-Klone wurden auf 12-Well-Platten zur weiteren Bewertung transferiert. Neun Klone wurden selektiert, und ihre Produktivitäten wurden gemessen. Der Klon mit der höchsten Produktion, der durch zufälliges Auswählen von Klonen erhalten wurden, produzierte 0,71 pg/Zelle/Tag. Dahingegen produzierte der Klon mit der höchsten Produktion, der mittels FACS erhalten wurde, 4,4 pg/Zelle/Tag. Demnach selektierte das FACS-Sortierungsverfahren hochproduzierende Klone in effizienter Weise, und höher produzierende Klone wurden demnach mittels FACS-Sortierung erhalten.
Um zu bewerten, ob GFP-Fluoreszenz zum Selektieren hochproduzierender Klone in MTX nützlich sei, wurden VEGF- und VEGF-GFP-produzierende Zellen bei steigenden Konzentrationen von MTX im Zeitraum von eineinhalb Monaten gezüchtet. Zellen wurden aus sieben VEGF-GFP-Klonen (4 aus 25 nM und 3 aus 50 nM MTX) genommen, die durch Fluoreszenzmikroskopie ausgewählt worden waren. Alle sieben produzierten eine gute Menge an VEGF (0,6–3,2 pg/Zelle/Tag). Im Vergleich dazu produzierten Zellen, die aus 45 zufällig ausgewählten VEGF-Klonen in MTX (10 aus 25 nM und 15 aus 50 nM und 20 aus 100 nM) herausgenommen wurden, nicht mehr als 2,4 pg/Zelle/Tag. Fluoreszenzmikroskopie selektierte demnach gut produzierende Zellen in MTX, was darauf hinweist, dass FACS für das weitere Screenen von in MTX ausgewählten Zellen nützlich wäre. Produktivität der besten fünf produzierenden Klone, die entweder durch zufällige Auswahl der Klone oder durch FACS-Sortieren gewonnen wurden, und der fünf am besten produzierenden Populationen in MTX, die entweder durch zufällige Auswahl von Populationen oder durch Fluoreszenzmikroskopie gewonnen wurden, sind in 12 gezeigt.
Beispiel 2
Beispiel 2 beschreibt die Expression eines humanisierten Anti-IgE-Antikörpers (E26) aus einem Vektor, in dem das Antikörper-Schwerketten-(H-)Gen in eine Transkriptionseinheit kloniert wird und das Leichtketten-(L-)Gen aus einer zweiten Transkriptionseinheit transkribiert wird. Eine Beschreibung des E26-Antikörpers ist in der WO 99/01556, veröffentlicht am 14. Jänner 1999, zu finden. 4 zeigt die verschiedenen Konfigurationen der Vektoren, die zur Expression von E26-Antikörper in DHFR^–-DP12-CHO-Zellen verwendet werden. Keine Translationseinheit bedeutet, dass kein Gen-Insert in das Intron kloniert wurde (leeres Intron). Wie aus der Fig. klar hervorgeht, sind die H-Kette und die L-Kette des Antikörpers in ihrer Position in den zwei Transkriptionseinheiten untereinander austauschbar. In ähnlicher Weise sind die Positionen des GFP und des amplifizierbaren selektierbaren Markers in dem ersten oder zweiten Intron ebenfalls untereinander austauschbar. In einem Konstrukt wurde der selektierbare Marker, Puromycin, innerhalb des ersten Introns kloniert, dem zweiten Intron wurde kein Gen-Insert eingeführt, und das DHFR-GFP-Fusionsgen wurde 3' von der IRES insertiert (4, mittlere Reihe).
15 zeigt die Resultate einer GFP-FACS-Analyse von E26-Antikörper-exprimierenden Zellpools. Die mittleren GFP-Werte (log-GFP) wurden über 100 der kontrollierten Zellen bestimmt. Antikörperexpressionsniveaus wurden auch unter identischen Bedingungen für jeden Pool nach 48 h getestet (14) und in Hinsicht auf Korrelation mit der GFP-Expression verglichen. Pools, die in 10 nM Mtx (10 nM) für höhere Stringenz selektiert wurden, zeigten im Vergleich zu jenen, die in GHT-Minus-Medium, einem minimalen Strigenzstandard für die DHFR-Arbeitsvorschrift (D), selektiert wurden, Steigerungen sowohl bezüglich der Produktivität als auch bezüglich der mittleren GFP-Fluoreszenz. Zwei der GHT-Minus-selektierten Pools wurden ebenfalls sortiert, und Zellen mit den besten 5% Fluoreszenzwerten wurden vermehrt und neuerlich auf Antikörperexpression und GFP-Fluoreszenz bewertet. In jedem Fall verbesserte sich Antikörperexpression mit Fluoreszenz (Sortierung). In allen Fällen zeigte die Platzierung des selektierbaren Markers (DHFR oder Puromycin- DHFR-Fusion) im Intron 5' zur H-Kette und des GFP-Gens im Intron 5' zur L-Kette konsequent korrelative Beziehungen bei Expression und GFP-Bestimmung.
Sequenzprotokoll

Claims

Polynucleotid, umfassend: a) ein amplifizierbares selektierbares Gen; b) ein grün fluoreszierendes Protein-(GFP)Gen; und c) eine selektierte Sequenz, die für ein erwünschtes Produkt kodiert, wobei die selektierte Sequenz operabel entweder an das amplifizierbare selektierbare Gen oder das GFP-Gen und an einen Promotor gebunden ist, worin das Polynucleotid eine erste Transkriptionseinheit, die einen ersten Promotor gefolgt von einem Intron und der selektierten Sequenz umfasst; und eine zweite Transkriptionseinheit, die einen zweiten Promotor und ein Intron 3' des zweiten Promotors umfasst; umfasst, worin das Intron in der ersten Transkriptionseinheit das erste Intron ist und das Intron in der zweiten Transkriptionseinheit das zweite Intron ist und worin beide von erstem und zweitem Intron durch eine 5'-Spleißdonorstelle und eine 3'-Spleißakzeptorstelle definiert sind, wodurch eine Spleißwirksamkeit von zumindest 95%, bestimmt durch quantitative PCR, bereitgestellt wird; und worin entweder (i) das amplifizierbare selektierbare Gen im ersten Intron angeordnet und an den ersten Promotor operabel gebunden ist und das GFP-Gen im oder 3' vom zweiten Intron angeordnet und an den zweiten Promotor operabel gebunden ist; oder (ii) das GFP-Gen im ersten Intron angeordnet und an den ersten Promotor operabel gebunden ist und das amplifizierbare selektierbare Gen in der zweiten Transkriptionseinheit angeordnet und an den zweiten Promotor operabel gebunden ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1, worin das amplifizierbare selektierbare Gen aus der aus den für Dihydrofolatreductase (DHFR) und Glutaminsynthetase kodierenden Genen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Polynucleotid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das GFP-Gen für ein mutiertes GFP kodiert, das eine höhere Fluoreszenzintensität als das Wildtyp-GFP aufweist.
Polynucleotid nach Anspruch 3, worin das mutierte GFP GFP-S65T mit einer Serin-zu-Threonin-Substitution in Aminosäure 65 des Wildtyp-GFP von Aequorea victoria ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das amplifizierbare selektierbare Gen im Intron der ersten Transkriptionseinheit angeordnet ist, worin das amplifizierbare selektierbare Gen und die selektierte Sequenz beide operabel an den ersten Promotor gebunden sind; und das GFP-Gen 3' vom zweiten Intron angeordnet und operabel an den zweiten Promotor in der zweiten Transkriptionseinheit gebunden ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das amplifizierbare selektierbare Gen im ersten Intron angeordnet und operabel an den ersten Promotor gebunden ist und das GFP-Gen im zweiten Intron angeordnet und operabel an den zweiten Promotor gebunden ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das GFP-Gen im ersten Intron angeordnet und operabel an den ersten Promotor gebunden ist und das amplifizierbare selektierbare Gen im zweiten Intron angeordnet und operabel an den zweiten Promotor gebunden ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die zweite Transkriptionseinheit weiters eine selektierte Sequenz 3' vom zweiten Intron umfasst, worin die selektierte Sequenz in der ersten Transkriptionseinheit die erste selektierte Sequenz ist und die selektierte Sequenz in der zweiten Transkriptionseinheit die zweite selektierte Sequenz ist, worin die zweite selektierte Sequenz operabel an den zweiten Promotor gebunden ist und für ein zweites erwünschtes Produkt kodiert.
Polynucleotid nach Anspruch 8, weiters umfassend eine IRES 3' von der zweiten selektierten Sequenz.
Polynucleotid nach Anspruch 9, worin das amplifizierbare selektierbare Gen im ersten Intron angeordnet und operabel an den ersten Promotor gebunden ist und das GFP-Gen 3' von der IRES angeordnet und operabel an den zweiten Promotor gebunden ist.
Polynucleotid nach Anspruch 8, worin die erste Transkriptionseinheit weiters eine IRES 3' von der ersten selektierten Sequenz umfasst.
Polynucleotid nach Anspruch 11, worin die zweite Transkriptionseinheit weiters eine IRES 3' von der zweiten selektierten Sequenz umfasst, worin die IRES in der ersten Transkriptionseinheit die erste IRES und die IRES in der zweiten Transkriptionseinheit die zweite IRES ist.
Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin der erste Promotor und der zweite Promotor der CMV- oder der SV40-Promotor sind.
Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin zumindest einer der Promotoren induzierbar ist.
Polynucleotid nach Anspruch 13, worin der CMV-Promotor der menschliche, unmittelbar frühe Zytomegalievirus-(CMV-)Promotor ist.
Wirtszelle, umfassend das Polynucleotid nach einem der vorangehenden Ansprüche.
Wirtszelle nach Anspruch 16, worin die Zelle eine Säugetierzelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 17, worin die Säugetierzelle eine Chinahamster-Eierstock-(CHO-)Zelle ist.
Wirtszelle nach Anspruch 18, worin das amplifizierbare selektierbare Gen das DHFR-Gen ist und die CHO-Zelle einen DHFR^–-Phänotyp aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines erwünschten Proteins, umfassend das Einführen des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 15 in eine geeignete eukaryotische Wirtszelle, das Kultivieren der eukaryotischen Wirtszelle unter Bedingungen, um das erwünschte Protein zu exprimieren, und das Gewinnen des erwünschten Proteins.