DE69920747T2

DE69920747T2 - Methode zur herstellung von rekombinanten zellen

Info

Publication number: DE69920747T2
Application number: DE69920747T
Authority: DE
Inventors: Jorge L. Acevedo; R. Peter RHODE
Original assignee: Sunol Molecular Corp
Current assignee: Sunol Molecular Corp
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2005-10-06
Anticipated expiration: 2019-12-01
Also published as: TWI221483B; US6306605B1; EP1137808B1; CN1328605A; EP1137808A4; CA2353575A1; AU1835600A; DE69920747D1; WO2000032821A1; CN1202261C; ES2230908T3; AU770119B2; JP2002531103A; EP1137808A1; US6156514A; ATE278024T1; DK1137808T3

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zellen, die zumindest eine Aminosäuresequenz exprimieren. Die Erfindung weist eine Reihe von nützlichen Anwendungsmöglichkeiten auf, einschließlich ihrer Verwendung bei der Herstellung von rekombinanten Säugetierzellen, die stabil sind und ein gewünschtes Protein in großen Mengen exprimieren.
2. Hintergrund der Erfindung
Zahlreiche Versuche wurden unternommen, große Mengen einer gewünschten Aminosäuresequenz zu produzieren, indem eine fremde (heterologe) Nucleinsäure in Wirtszellen eingeführt und diese Nucleinsäure dann innerhalb der Zellen exprimiert wurde. Eukaryotische Zellen und insbesondere Säugetierzellen wurden mit unterschiedlichen Ergebnissen eingesetzt. Beispielsweise exprimieren trotz großer Anstrengungen, die Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzellen, welche die Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren, zu verbessern, die meisten Zellen die Nucleinsäure nicht in ausreichendem Ausmaß. Somit besteht auf dem Gebiet der Erfindung Bedarf an Verfahren zur Produktion von rekombinanten Säugetierzellen, welche die eingeführte Nucleinsäure in großen Mengen exprimieren.
Im Allgemeinen wurden zwei Verfahren verwendet, um die Expression von heterologer Nucleinsäure in Säugetierzellen zu erhöhen. Ein Ansatz basiert auf der Amplifikation der Nucleinsäure-Kopienzahl durch Zellselektionsverfahren, wie beispielsweise der Erhöhung der Arzneimittelresistenz. Ein weiterer Ansatz basiert auf der Steigerung der Expression der Nucleinsäure in den Zellen, indem beispielsweise ein oder mehrere vorteilhafte Kontrollelemente dieser Nucleinsäure hinzugefügt werden. Für allgemeine Informationen siehe Kaufman, R.J., und P.A. Sharp, J. Mol. Biol. 159, 601 (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausg. (1989) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York (1989).
Wie berichtet wurde, umfasst die Erhöhung der Arzneimittelresistenz eine Zelltransformation mit zwei Genen, von denen eines für eine Aminosäuresequenz von Interesse kodiert, wie beispielsweise ein heterologes Protein, und das andere für einen selektierbaren Genmarker kodiert, wie beispielsweise Dihydrofolatreductase (DHFR). In Fällen, in denen Der Genmarker DHFR ist, werden transformierte Zellen in Gegenwart des selektionierenden Arzneimittels Methotrexat (MTX) kultiviert. Die normalerweise zytotoxische Wirkung von MTX wird durch die Expression von DHFR im Wesentlichen eliminiert. Transformierte Zellen überleben, weil sie eine ausreichend erhöhte (amplifizierte) DHFR-Kopienzahl aufweisen. Eine Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuresequenz kodiert, wird ebenfalls amplifiziert, wodurch die Expression dieser Sequenz verstärkt wird. Siehe beispielsweise Kaufman, R.J., und P.A. Sharp, s.o.
Die Erhöhung der Arzneimittelresistenz und ähnliche Verfahren erwiesen sich jedoch als nachteilig. Die Produktion der meisten rekombinanten Säugetierzelllinien ist bei Anwendung dieses Verfahrens zeitaufwändig und kann einige Monate in Anspruch nehmen. Außerdem wurde erkannt, dass, wenn die heterologe Nucleinsäure amplifiziert wird, herkömmliche Nucleinsäure-Sequenzierungsverfahren negative Auswirkungen haben können. Weiters kann es ziemlich schwierig sein, eine ausreichend hohe Nucleinsäure-Kopienzahl aufrechtzuerhalten, ohne starken und mitunter langfristigen Selektionsdruck auszuüben. Eine Zellselektionsstrategie, die auf höheren Selektionsdruck abzielt, kann teuer sein und rechtliche Probleme mit sich bringen, wie beispielsweise, wenn ein heterologes Protein für pharmazeutische Zwecke produziert wird.
Darüber hinaus reicht die Erhöhung der Arzneimittelresistenz möglicherweise nicht aus, um die Expression von spezifischen heterologen Nucleinsäuren auf Werte zu erhöhen, die für Anwendungen, wie beispielsweise gewerbliche Zwecke oder Forschungszwecke, ausreichen.
Weitere Probleme der Erhöhung der Arzneimittelresistenz umfassen die genetische Instabilität von klonierten Zelllinien. Diese Probleme sind sehr schwer wiegend. Beispielsweise liefert das Verfahren oft rekombinante Zellen, die sich aus instabilen Genamplifikationsereignissen entwickeln, beispielsweise der Bildung von Double-Minute-Chromosomen. Diese Zellen können gewünschte Eigenschaften verlieren, wenn das Selektionsarzneimittel entfernt wird. Siehe Kaufmann, R.J., et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1750 (1985), und darin angeführten Literaturverweise.
Die optimale Umsetzung der meisten Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz hat außerdem den Einsatz hochspezialisierter Zellen, Vektoren und/oder Zellwachstumsbedingungen erfordert. Die meisten Verfahren verwenden beispielsweise Wirtszellen, die auf eine bestimmte Weise genetische verändert wurden. Solche Zellmutanten sind für manche Anwendungen eventuell nicht geeignet. Als Beispiel für die Schwierigkeiten kann angeführt werden, dass die Erhöhung der Arzneimittelresistenz unter Verwendung von DHFR und MTX in Zellen nicht optimal funktioniert, die ein normales DHFR-Gen aufweisen. Eine Inaktivierung des normalen Gens kann ein langwieriges und aufwändiges Verfahren sein. Siehe beispielsweise Wigler et al., PNAS (USA), 3567 (1980); und Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 (1980).
In Bezug auf die Verwendung von spezifischen Vektoren und Wachstumsbedingungen wurden auch spezifischere Nachteile von DHFR/MTX-Erhöhungsverfahren geoffenbart. Siehe beispielsweise Kaufman und Sharp, s.o.; Schminke, R., Cell 37, 705 (1984). Siehe auch die US-Patente Nr. 5.686.263; 4.956.288 und 5.585.237 und die darin angeführten Literaturverweise.
Es wäre nützlich, Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zellen, die flexibel sind und zur Produktion von genetisch stabilen rekombinanten Zelllinien verwendet werden können, zur Verfügung zu haben. Besonders wünschenswert wären Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien, welche die Verwendung von hochspezialisierten Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen bedeutend verringern oder vermeiden. Weiters wären durch diese Verfahren hergestellte rekombinante Säugetierzelllinien wünschenswert, die eine Aminosäuresequenz von Interesse, wie z.B. ein heterologes Protein, in großer Menge produzieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zellen und insbesondere Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zelllinien, die genetisch stabil sind und zumindest eine gewünschte Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren. In einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zelllinien bereit, die ein heterologes Protein in hohem Ausmaß exprimieren. Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Einführen zumindest eines Vektors, der für die Aminosäuresequenz kodiert, in Wirtszellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Isolierung der rekombinanten Zelllinien, welche die Sequenz in hohem Ausmaß produzieren, förderlich sind. Bevorzugte Verfahren produzieren die Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß und verringern gleichzeitig die Verwendung von hochspezialisierten Wirtszellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen bedeutend. Außerdem werden rekombinante Säugetierzelllinien bereitgestellt, die durch die Verfahren dieser Erfindung hergestellt werden.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien, die genetisch stabil sind und zumindest eine Aminosäuresequenz von Interesse in hohem Ausmaß exprimieren. In einer Ausführungsform wird die Expression der Aminosäuresequenz im Wesentlichen durch die Einführung eines ersten Vektors, der für die Sequenz kodiert, in Wirtszellen erhöht. Der erste Vektor umfasst zumindest eine selektierbare Sequenz, typischerweise eine erste selektierbare Sequenz, die operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist. Darüber hinaus kann der erste Vektor für mehr als eine Kopie der Aminosäuresequenz kodieren. Der erste Vektor kann einmal oder mehrfach in die Wirtszellen eingeführt werden. Die Wirtszellen werden dann unter Bedingungen kultiviert, die der Expression der Aminosäuresequenz förderlich sind, gefolgt von einer Isolierung von rekombinanten Zelllinien (erste stark exprimierende Zellen), welche die Aminosäuresequenz mit einer ersten Expressionsstärke exprimieren.
Weiters umfasst das Verfahren das Einführen eines zweiten für die Aminosäuresequenz kodierenden Vektors, vorzugsweise in die ersten stark exprimierenden Zellen. Der zweite Vektor kann der gleiche sein wie der erste Vektor oder sich von diesem unterschieden und kann, falls erforderlich, für mehr als eine Kopie der Aminosäuresequenz kodieren. Der zweite Vektor wird, je nach Bedarf, einmal oder mehrmals in die ersten stark exprimierenden Zellen eingeführt. Rekombinante Zellen, die den zweiten Vektor umfassen, werden dann unter Bedingungen kultiviert, die der Expression der Aminosäuresequenz förderlich sind. Dann werden Zellen isoliert, welche die Aminosäuresequenz in einem zweiten hohen Ausmaß exprimieren (zweite stark exprimierende Zellen).
Wie erwähnt wurde erkannt, dass Zelllinien, die durch Zellselektionsmodelle hergestellt wurden, und insbesondere Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz nach dem Stand der Technik Nacheile aufweisen. Spezifische Nachteile umfassen die genetische Instabilität und die Notwendigkeit, hochspezialisierte Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen zu verwenden. Die vorliegenden Verfahren vermeiden diese Nachteile im Wesentlichen, indem genetisch stabile Zelllinien bereitgestellt werden, welche die Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß produzieren. Darüber hinaus sind die vorliegenden Verfahren im Allgemeinen flexibler als die Modelle nach dem Stand der Technik und mit verschiedensten Vektoren kompatibel. Nahezu jede transfizierbare Zelle kann in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, einschließlich der meisten primären, sekundären oder kultivierten Säugetierzellen. Geeigneterweise stellen die vorliegenden Verfahren die Züchtung einer spezifischen transfizierbaren Säugetierzelle unter verschiedensten selektiven oder nichtselektiven Wachstumsbedingungen bereit.
Durch die Verfahren der Erfindung hergestellte Zelllinien werden indirekt durch die Selektion zumindest eines durch einen Vektor kodierten Zelloberflächenmarkers selektiert. Die Selektion des Zelloberflächenmarkers gemäß der Erfindung vereinfacht die effiziente Isolierung der Zelllinien, welche die Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren. Wie erwähnt sind die resultierenden Zelllinien genetisch stabil und können unter gleichzeitiger Minimierung oder Umgehung der Verwendung von hochspezialisierten Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen produziert werden.
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung ist das zweite hohe Expressionsausmaß im Wesentlichen zumindest 2- bis 10-mal oder mehr größer als das erste hohe Expressionsausmaß. Verfahren zur Bestimmung der Werte von Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise Proteinen, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen bestimmten Verfahren, wie beispielsweise Antikörperreaktivität.
In einer spezifischeren Ausführungsform umfasst das Verfahren außerdem das Einführen eines dritten Vektors, der für die Aminosäuresequenz kodiert, in die zweiten stark exprimierenden Zellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer dritten Expressionsstärke, die größer ist als die zweite Expressionsstärke, förderlich sind. Zellen, welche die Aminosäuresequenz mit der dritten Expressionsstärke exprimieren, werden dann isoliert, um die Zelllinie (dritte stark exprimierende Zellen) zu isolieren. Der dritte Vektor kodiert vorzugsweise für zumindest eine Aminosäuresequenz von Interesse und kann gleich oder unterschiedlich sein wie der erste oder zweite Vektor (oder beide Vektoren). Der dritte Vektor kann, je nach Bedarf, einmal oder mehrmals in die zweiten stark exprimierenden Zellen eingeführt werden. Die dritten stark exprimierenden Zellen weisen typischerweise im Vergleich zu den ersten oder zweiten stark exprimierenden Zellen erhöhte Expression der Aminosäuresequenz auf.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform umfasst das Verfahren außerdem die Einführung zumindest eines für die Aminosäuresequenz kodierenden Vektors, vorzugsweise eines solcher Vektoren, in die dritten stark exprimierenden Zellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit größerer Stärke als die dritte Expressionsstärke förderlich sind. Weiters umfasst das Verfahren eine zumindest einmalige Wiederholung der Einführungs- und Aussetzungsschritte, um eine Zelllinie zu isolieren, welche die Aminosäuresequenz stärker exprimiert als die dritten stark exprimierenden Zellen. Die Entscheidung, wie oft die Schritte wiederholt werden, wird basierend auf verschiedenen Parametern getroffen, insbesondere jedoch anhand der erforderlichen Expressionsstärke.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der Schritt des Kultivierens der Wirtszellen unter Bedingungen, die der Selektion des ersten Vektors förderlich sind, außerdem das Züchten der Wirtszellen in selektiven Medien. Vorzugsweise umfassen die selektiven Medien zumindest ein Arzneimittel und üblicherweise ein für die erste selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel. Es gilt anzumerken, dass hierin geoffenbarte Vektoren, die eine selektierbare Nucleinsäuresequenz umfassen, z.B. der erste und der vierte Vektor, üblicherweise für eine Aminosäuresequenz kodieren, die selektierbar ist. Veranschaulichende Arzneimittel zur Selektion der Vektoren sind in der nachstehenden Erläuterung und den Beispielen beschrieben.
Häufig wird der zweite oder dritte Vektor (oder beide Vektoren) gemeinsam mit zumindest einem anderen Vektor (hierin manchmal als "vierter" oder "fünfter" Vektor bezeichnet) in Zellen eingeführt, wobei der Vektor für zumindest eine selektierbare Sequenz und insbesondere einen selektierbaren Zelloberflächenmarker, wie beispielsweise ein Zelloberflächenprotein, kodiert. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass es durch die gleichzeitige Einführung des Vektors, der für den selektierbaren Zelloberflächenmarker kodiert, möglich ist, die Produktion von äußerst nützlichen rekombinanten Säugetierzelllinien zu vereinfachen, welche die gewünschte Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren. Beispielsweise zeigte sich, dass es durch die gleichzeitige Einführung des Vektors gemäß der Erfindung möglich ist, Zelllinien herzustellen, während gleichzeitig die Notwendigkeit, hochspezialisierte Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen zu verwenden, verringert oder aufgehoben wird. Außerdem wird durch die Umsetzung der Verfahren die Produktion von genetisch stabilen rekombinanten Zellen gefördert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst der Schritt des Einführens des zweiten Vektors in die ersten stark exprimierenden Zellen außerdem die Einführung eines vierten Vektors in die Zellen. Wie erwähnt kodiert der vierte Vektor für zumindest eine selektierbare Sequenz (hierin im Folgenden als "zweite" selektierbare Sequenz) bezeichnet, vorzugsweise einen selektierbaren Zelloberflächenmarker. Der vierte Vektor kann gleich sein wie ein anderer Vektor des Verfahrens, obwohl sich in den meisten Fällen der vierte Vektor von einem oder allen dieser Vektoren unterscheidet. In einer weiteren Ausführungsform umfasst der vierte Vektor eine zweite selektierbare Sequenz, die operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist. In einer spezifischeren Ausführungsform umfasst das Verfahren außerdem das Züchten der Zellen in selektiven Medien, die zumindest ein für die zweite selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel umfassen.
In Ausführungsformen, in denen der vierte Vektor für den Zelloberflächenmarker kodiert, umfasst das Verfahren vorzugsweise außerdem das Isolieren der den Zelloberflächenmarker exprimierenden Zellen durch zumindest eines von Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung. Üblicherweise wird eines dieser Verfahren eingesetzt, um die den Zelloberflächenmarker exprimierenden Zellen zu isolieren. Durch die Durchführung der Isolierung werden Zelllinien erhalten, welche die durch die Vektoren kodierte Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahren umfasst der Schritt des Einführens des dritten Vektors in die zweiten stark exprimierenden Zellen außerdem die Einführung eines fünften Vektors in die Zellen. In einer spezifischen Ausführungsform ko diert der fünfte Vektor für zumindest eine selektierbare Sequenz (hierin im Folgenden als "dritte" selektierbare Sequenz bezeichnet). Der fünfte Vektor kann gleich oder unterschiedlich sein wie die hierin geoffenbarten Vektoren. In einer spezifischeren Ausführungsform umfasst der fünfte Vektor eine dritte selektierbare Sequenz, die, falls gewünscht, operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden sein kann. Die Zellen werden dann Bedingungen ausgesetzt, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer dritten Expressionsstärke, die größer ist als die zweite Expressionsstärke, förderlich sind. Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem das Züchten der Zellen in selektiven Medien, die zumindest ein Arzneimittel und vorzugsweise ein für die zweite selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel umfassen.
Ein weiterer bevorzugter fünfter Vektor umfasst außerdem eine Sequenz, die für einen selektierbaren Zelloberflächenmarker kodiert, der gleich oder unterschiedlich sein kann wie der durch den vierten Vektor kodierten Zelloberflächenmarker. Falls gewünscht kann der Zelloberflächenmarker operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden sein. Das Verfahren umfasst, falls erforderlich, außerdem vorzugsweise den Schritt des Isolierens der Zellen, die den Zelloberflächenmarker exprimieren, für den der fünfte Vektor kodiert, und die Verwendung zumindest eines von Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung, um Zellen zu isolieren, die den Zelloberflächenmarker exprimieren, der durch den vierten oder fünften Vektor (oder beide Vektoren) exprimiert wird. Durch die Durchführung der Isolierung werden Zelllinien erhalten, welche die durch die Vektoren kodierte Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren.
Genauer gesagt exprimieren zweite stark exprimierende Zellen gemäß vorliegender Erfindung im Vergleich zu ersten stark exprimierenden Zellen zumindest etwa das 2fache der Aminosäuresequenz, wie durch herkömmliche Proteinquantifizierungsverfahren, wie beispielsweise quantitative Gelelektrophorese, Chromatographie und immunologische Verfahren, wie z.B. Western-Immunoblot, ELISA und Antikörperreakti vität, gezeigt wird. Genauer gesagt exprimieren zweite stark exprimierenden Zellen bei Bestimmung durch Antikörperreaktivität im Vergleich zu ersten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache der Aminosäuresequenz.
Dritte stark exprimierende Zellen von besonderen Interesse exprimieren im Allgemeinen etwa 2-mal mehr der Aminosäuresequenz als die zweiten stark exprimierenden Zellen, wie durch die herkömmlichen Proteinsequenz-Quantifizierungsverfahren gezeigt wird. Genauer gesagt exprimieren dritte stark exprimierende Zellen bei Bestimmung mittels Antikörperreaktivität im Vergleich zu zweiten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache der Aminosäuresequenz.
In einer spezifischeren Ausführungsform der Verfahren kodierten der erste, zweite und dritte Vektor unabhängig voneinander für ein erstes Arzneimittelresistenzgen (hierin manchmal als Genmarker bezeichnet), einen selektierbaren Zelloberflächenmarker oder ein zweites Arzneimittelresistenzgen. In dieser Ausführungsform ist jeder der Vektoren operabel mit einem für die Aminosäuresequenz von Interesse kodierenden Segment verbunden. Außerdem können der vierte und fünfte Vektor unabhängig voneinander für ein drittes Arzneimittelresistenzgen und einen weiteren Zelloberflächenmarker kodieren. Das erste, zweite und dritte Arzneimittelresistenzgen und selektierbare Zelloberflächenmarker werden nachstehend näher beschrieben.
Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde eine geeignete Säugetierwirtszelle gewählt, die keine hochspezialisierten Vektoren oder Wachstumsbedingungen erfordert, um ein heterologes Protein optimal zu exprimieren. Bevorzugte Säugetierwirtszellen exprimieren das heterologe Protein in detektierbarem Ausmaß. In manchen Fällen können jedoch geeignete Säugetierwirtszellen das Protein schon als homologes Protein, z.B. in Hintergrundkonzentrationen (Grundniveau), exprimieren. In diesem Fall kann die Erfindung angewandt werden, um die Expression des homologen Proteins auf Werte zu verstärken, die höher sind als die Grundniveaus. Alternativ dazu können die vorliegenden Verfahren verwendet werden, um die Zellexpression ei nes gewünschten heterologen Proteins oder einer gewünschten Polypeptidsequenz zu verstärken. Spezifischere Beispiele für Säugetierwirtszellen sind nachstehend angeführt.
Nach der Einführung des ersten Vektors in die Säugetierwirtszellen werden die ersten stark exprimierenden Zellen in einem Wachstumsmedium isoliert, das im Allgemeinen für den ersten Vektor selektiv ist. Zweite stark exprimierende Zellen werden durch Einführung des zweiten Vektors, der für die Aminosäuresequenz kodiert, in die ersten stark exprimierenden Zellen produziert. In einer Ausführungsform kodieren der erste und zweite Vektor für eine Kopie eines heterologen Proteins und sind im Wesentlichen gleich. Die Einführung des zweiten Vektors wird durch die Einführung eines weiteren ("vierten") Vektors begleitet, der für den selektierbaren Zelloberflächenmarker kodiert. Die Isolierung der zweiten stark exprimierenden Zellen wird unter Bedingungen durchgeführt, die der Selektion des Zelloberflächenmarkers förderlich sind und gegebenenfalls das Züchten in einem selektiven Medium umfassen können. In dieser Ausführungsform wird durch die Selektion des Zelloberflächenmarkers auch eine starke Coexpression der gewünschten Aminosäuresequenz selektiert, für die der erste und zweite Vektor kodieren. Die Verwendung von hochspezialisierten Wirtszellen, Vektoren und Wachstumsmedium zur Selektion der Zellen wird in diesem Beispiel signifikant verringert.
Die vorliegende Erfindung kann angewandt werden, um ein weites Spektrum rekombinanter Zellen und vor allem Säugetierzelllinien herzustellen, die zumindest eine gewünschte Aminosäuresequenz von Interesse oder einen Abschnitt dieser Aminosäuresequenz, wie z.B. ein funktionelles Proteinfragment, stark exprimieren. Verfahren der Erfindung können beispielsweise verwendet werden, um Aminosäuresequenzen von immunologischem Interesse, wie beispielsweise eine Immunglobulinkette (schwer oder leicht) oder funktionelle Fragmente davon, zu exprimieren. Spezifischere Aminosäuresequenzen von Interesse sind nachstehend erläutert.
Die vorliegende Erfindung bringt im Vergleich zu Zellselektionsverfahren nach dem Stand der Technik und insbesondere herkömmlichen Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz bedeutende Vorteile mit sich. Wie erläutert erfordert die Durchführung der meisten Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz im Allgemeinen die Verwendung hochspezialisierter Zelllinien, Vektoren und Wachstumsbedingungen. In den meisten Fällen wurden die Zellen genetisch verändert, um die Resistenz gegenüber einem Arzneimittel zu blockieren, und sie weisen nicht immer gute Wachstumseigenschaften auf. Außerdem sind solche Zellen eventuell schwer herzustellen und/oder zu erhalten, und sie können für viele spezifische Zellselektionsstrategien ungeeignet sein. Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit diesen Mängeln, indem sie Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Zelllinien bereitstellt, welche die Verwendung dieser hochspezialisierten Zelllinien verringern oder vermeiden.
Darüber hinaus maximieren die vorliegenden Verfahren die genetische Stabilität von resultierenden rekombinanten Zelllinien, indem heterologe Nucleinsäuren in das Wirtszellengenom eingeführt werden. Die Bildung von äußerst instabilen Chromosomformationen wird verringert und häufig sogar ganz vermieden.
Diese Erfindung weist noch weitere Vorteile auf. Beispielsweise sind die vorliegenden Verfahren im Wesentlichen viel flexibler als Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien nach dem Stand der Technik und können mit verschiedensten Säugetierexpressionsvektoren verwendet werden. Im Gegensatz dazu sind die meisten Zellselektionsverfahren nach dem Stand der Technik, wie beispielsweise die Erhöhung der Arzneimittelresistenz, auf die Verwendung von hochspezialisierten Vektoren zugeschnitten. Ein anerkannter Aspekt des Problems ist, dass die Vektoren für viele Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz zu groß geworden und schwer zu manipulieren sind. Außerdem sind viele optimale Vektoren zur Verwendung in herkömmlichen Zellselektionsschemen geschützt und stehen nicht immer zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung löst dieses Problem, beispielsweise indem sie für Kompatibilität mit verschiedensten Säugetierexpressionsvektoren sorgt.
Wie erwähnt kann zumindest einer der hierin beschriebenen Vektoren für einen Abschnitt der Aminosäuresequenz von Interesse kodieren. Der erste Vektor (oder einer der Vektoren) kann für das Protein voller Länge kodieren, und zumindest einer der anderen Vektoren, z.B. der zweite, dritte oder vierte Vektor, können für einen spezifischen Abschnitt des Proteins kodieren. Die restlichen Vektoren können verwendet werden, um beispielsweise weitere Abschnitte der Proteinsequenz oder, falls gewünscht, sogar die Proteinsequenz voller Länge einzuführen.
Die Möglichkeit der vorliegenden Verfahren, Abschnitte einer Aminosäuresequenz von Interesse einzuführen, bringt Vorteile mit sich. Beispielsweise können die Verfahren angewandt werden, um eine stark kontrollierte Amplifikation eines oder mehrerer Abschnitte der Aminosäuresequenz durchzuführen. Das heißt, spezifische Abschnitte der Aminosäuresequenz, einschließlich der gesamten Sequenz, können in spezifischen Zellen (z.B. erste oder zweite stark exprimierende Zellen) amplifiziert werden, und zwar vor oder gleichzeitig mit der Amplifizierung einer weiteren Sequenz. Die Erfindung ermöglicht somit die aufeinanderfolgende und abgestimmte Expression einer oder mehrerer Aminosäuresequenzen von Interesse.
Spezifische Verfahren dieser Erfindung bringen weitere Vorteile mit sich. Beispielsweise können die Verfahren zur Herstellung rekombinanter Säugetierzelllinien (manchmal als "hochproduzierende Zelllinien" oder ähnlich bezeichnet) in bedeutend kürzerer Zeit durchgeführt werden als andere Zellselektionsverfahren, einschließlich der meisten Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz nach dem Stand der Technik. Außerdem ergeben die Verfahren hochproduzierende Zelllinien bei Verwendung von weniger Zellpassagen als bei den meisten Verfahren nach dem Stand der Technik, wodurch die Labor- und Medienkosten verringert werden.
Die folgenden nicht einschränkenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Die 1A und 1B zeigen veranschaulichende Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. (1A) Der Vektor pJAIgG4TF kodiert für schwere und leichte chimäre Anti-Gewebefaktor- (-TF-) Immunglobulinketten. (1B) Der Vektor pDRHK kodiert für ein einkettiges HLA-DR2/MBP-Molekül, das an eine konstante menschliche Immunglobulin-κ-Domäne fusioniert ist.
2 ist ein Diagramm, das die hohe Produktion eines rekombinanten chimären Anti-TF-Antikörpers in statischen T25-Flaschenkulturen. Rekombinante Zelllinien, die den Anti-TF-Antikörper in hohem Ausmaß produzieren, wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert. Hochproduzierende rekombinanten Zelllinien wurden mit H9G12, 3D2A9 und A11B5 bezeichnet.
3 ist ein Diagramm, das die hohe Produktion eines rekombinanten Anti-TF in einem Bioreaktor zeigt. Rekombinante Zelllinien, die den Anti-TF-Antikörper in hohem Ausmaß produzieren, wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert. Hochproduzierende rekombinanten Zelllinien wurden als Linien, die nach der ersten und dritten Transfektion isoliert wurden, mit H9G12 und A11B5 bezeichnet.
4 ist ein Diagramm, das die hohe Produktion von rekombinanter sc-DR2/MBP-Cκ-Produktion in statischen T25-Flaschenkulturen zeigt. Rekombinante Zelllinien, die das sc-CR2-MBP-Cκ-Fusionsprotein in hohem Ausmaß produzierten, wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert. Hochproduzierende rekombinante Zelllinien wurden mit A5B4, DR2H4 und B9 bezeichnet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie oben zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung eines breiten Spektrums an Zellen und insbesondere rekombinanten Zelllinien bereit. Vor allem werden Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien bereitgestellt, die genetisch stabil sind und ein heterologes oder homologes Protein von Interesse in hohem Ausmaß produzieren. Wie besprochen ist die Erfindung flexibel und kann zur Herstellung äußerst nützlicher Zelllinien eingesetzt werden, die das Protein in hohem Ausmaß produzieren, während die Verwendung hochspezialisierter Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen vermieden wird. Außerdem werden Säugetierzelllinien bereitgestellt, die das Protein in hohem Ausmaß produzieren.
Im Allgemeinen wird die vorliegende Erfindung am besten umgesetzt, indem anerkannte Manipulationen vorgenommen werden. Beispielsweise sind Verfahren zur Isolierung von DNA, Herstellung und Selektion von Vektoren zur Expression der DNA, Reinigung und Analyse von Nucleinsäuren, spezifische Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Vektor-DNA, Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen, Ligation von DNA, Einführung von DNA, einschließlich Vektor-DNA, in Wirtszellen durch stabile oder vorübergehende Mittel, Kultivierung der Wirtszellen in selektiven oder nichtselektiven Medien sowie beispielhafte Wirtszellverfahren zur Selektion und Erhaltung von Zellen, welche die DNA stabil oder vorübergehend exprimieren, auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Siehe im Allgemeinen Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al., s.o.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt neue Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien bereit. Eine rekombinante Säugetierzelllinie wird hierin manchmal als "hochproduzierende" Zelllinie oder ähnliches bezeichnet. Die Ausdrücke "in hohem Ausmaß", "hochproduzierend" oder dergleichen bedeuten, wenn sie in Bezug auf die Menge an Aminosäuresequenz verwendet werden, die durch die Zelllinie produziert wird, dass zumindest durch die Zelllinie im Vergleich zu einer Elternzelle oder Elternzelllinie etwa 2-mal und vorzugsweise etwa 3- bis etwa 40-mal oder mehr (einige heterologe Sequenzen sind in der Elternzelllinie nicht vorhanden) der Aminosäure produziert werden.
Verfahren zur Bestimmung der Menge einer bestimmten Aminosäuresequenz, die durch eine hierin beschriebene rekombinante Zelllinie hergestellt wird, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Chromatographieverfahren, wie beispielsweise Proteingelelektrophorese, und immunologische Verfahren, wie beispielsweise Western-Blotting und ELISA. Genauer gesagt umfassen die Gelelektrophoreseverfahren solche, bei denen eine Protein- oder Peptidsequenz unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder Silberfärbung detektiert und quantifiziert wird. Ein bevorzugtes Proteinquantifizierungsverfahren basiert auf Antikörperreaktivität.
Der Begriff "Antikörperreaktivität" bezeichnet die spezifische Bindung zwischen einem bestimmten Antikörper und der Aminosäuresequenz, die durch die Zelle oder Zelllinie produziert wird. Außerdem bezeichnet der Begriff die Bildung eines spezifischen Bindungspaars zwischen der Aminosäuresequenz (d.h. einem Epitop darauf) und dem Antikörper, der jedoch im Wesentlichen nicht an andere Moleküle bindet, wie beispielsweise durch Western-Blotting, ELISA, RIA, Gel-Retentionsanalyse, Enzymimmuntests, kompetitive Tests, Sättigungstests oder andere geeignete Aminosäuresequenz-Bindungsassays, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt wird. Für eine Offenbarung in Bezug auf diese und andere geeignete Test siehe allgemein Harlow und Lane in "Antibodies: A Laboratory Manual", CSH Publications, N.Y. (1988).
Der Begriff "Eltern-" in Bezug auf eine Wirtszelle oder Zelllinie bezeichnet einen Vorläufer dieser Zelle oder Zelllinie, der zur Herstellung einer nachfolgenden Zelllinie verwendet wurde. Veranschaulichende Elternzellen sind geeignete Wirtszellen, die zur Herstellung der ersten stark exprimierenden Zellen verwendet werden. Die ersten stark exprimierenden Zellen sind wiederum ein Beispiel für eine Elternzelllinie, die zur Herstellung von zweiten stark exprimierenden Zelllinien verwendet wird. Es versteht sich, dass eine Zelllinie, sofern nicht anders angegeben, eine Klonpopulation von Zellen ist, die von einer einzelnen Vorläuferzelle abstammen. Verfahren zur Herstellung von Zelllinien sind auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und um fassen herkömmliche Reihenverdünnungsverfahren. Siehe beispielsweise Ausubel et al., s.o.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Säugetierwirtszellen, die eine erhöhte Expression einer spezifischen Aminosäuresequenz bereitstellen, wie beispielsweise ein heterologes Protein, durch Einführung eines ersten Vektors, der zumindest eine selektierbare Sequenz und vorzugsweise eine selektierbare Sequenz (erste selektierbare Sequenz) umfasst, die operabel mit dem für das Protein kodierenden Segment verbunden ist, in die Zellen erhalten. Nach dem Kultivieren und Isolieren von Zellen, die das Protein mit einer ersten hohen Expressionsstärke exprimieren (erste stark exprimierende Zellen), wird ein zweiter für das Protein kodierender Vektor in die ersten stark exprimierenden Zellen eingeführt. Im Allgemeinen wird die Einführung des zweiten Vektors vorzugsweise von der Einführung eines weiteren Vektors (d.h. vierter Vektor) begleitet, der für zumindest einen und vorzugsweise einen selektierbaren Zelloberflächenmarker kodiert. In anderen Ausführungsformen kodiert der zweite Vektor jedoch sowohl für das Protein als auch zumindest einen Zelloberflächenmarker, vorzugsweise einen solcher Marker. Die Zellen werden Bedingungen ausgesetzt, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer zweiten Expressionsstärke förderlich sind, die größer ist als die erste Expressionsstärke. Bevorzugte Bedingungen selektieren zumindest einen der Zelloberflächenmarker und nutzen keine hochspezialisierten Zellen, Vektoren und Wachstumsbedingungen. Eine Zelllinie, die das Protein mit einer zweiten Expressionsstärke exprimiert, wird dann isoliert, um die zweiten stark exprimierenden Zellen zu produzieren.
Der Begriff "isoliert" in Bezug auf spezifische hierin geoffenbarte Zellen oder Zelllinien betrifft Zellen, die auf zumindest 80 bis 95 Gew.-% Homogenität gereinigt wurden. Gereinigte Zellen mit höherer Reinheit, beispielsweise zumindest etwa 98 bis 99 Gew.-% Homogenität sind für die meisten Anwendungen noch bevorzugter. Sobald sie gereinigt sind, können die Zellen für nachfolgende Manipulationen verwendet werden, wie beispielsweise Zelltransfektionen oder die Etablierung von Zelllinien unter Verwendung von anerkannten Reihenverdünnungsverfahren.
Wie erläutert können der erste und/oder zweite Vektor einmal oder mehr als einmal in die jeweiligen Zellen eingeführt werden, vorzugsweise etwa 2- bis etwa 20-mal, noch bevorzugter etwa 2- bis 5-mal, je nach Bedarf. Die Entscheidung, ob der erste und/oder zweite Vektor ein- oder mehrmals in die jeweiligen Zellen eingeführt werden, hängt von verschiedenen Parametern ab, wie beispielsweise dem gewünschten Ausmaß der erhöhten Expression und der jeweiligen Aminosäuresequenz von Interesse.
In einer spezifischeren Ausführungsform umfassen die Bedingungen zur Auswahl der zweiten stark exprimierenden Zellen die Selektion zumindest eines Zelloberflächenmarkers und vorzugsweise eines Zelloberflächenmarkers, wobei für den Marker einer der Vektoren kodiert, die gleichzeitig in die ersten stark exprimierenden Zellen eingeführt wurden. Wie erwähnt können diese Vektoren der vierte oder fünfte Vektor sein. Dabei ist zu beachten, dass diese Ausführungsform der vorliegenden Verfahren eine bedeutende Verbindung gegenüber Expressionssystemen nach dem Stand der Technik, wie beispielsweise Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz, darstellt. Durch gleichzeitige Einführung der Vektoren in die Zellen kann beispielsweise die Selektion der zweiten stark exprimierenden Zellen durch Selektion des Zelloberflächenmarkers durchgeführt werden, wodurch viele der schon erläuterten Probleme gelöst werden. Auch von Bedeutung ist, dass durch die aufeinander folgende Einführung des ersten und zweiten Vektors gemäß dieser Erfindung Expressionsstärken der Aminosäuresequenz auf über die Summe der Werte der Aminosäuresequenz erhöht werden können.
Eine "Aminosäuresequenz" bezeichnet im Allgemeinen jedes Polymer, das aus im Wesentlichen beliebigen der 20 Aminosäuren besteht, unabhängig von deren Größe. Obwohl der Begriff hierin in Bezug auf Proteine verwendet wird, umfasst er, sofern nicht anders angegeben, auch Polypeptide und Peptide. Die Aminosäuresequenz kann für ein Protein voller Länge (heterolog oder homolog, bezogen auf die exprimierende Zelle) oder einen Abschnitt davon, wie beispielsweise ein funktionelles Fragment, kodieren. Spezifischere Aminosäuresequenzen sind nachstehend beschrie ben. Eine insbesondere bevorzugte Aminosäuresequenz ist eine Immunglobulinschwerkette, eine Immunglobulinleichtkette oder ein funktionelles Fragment davon.
Der Begriff "funktionelles Fragment" in Bezug auf eine Aminosäuresequenz bezeichnet zumindest ein Segment einer Aminosäuresequenz, das zumindest eine der Aktivitäten der Aminosäuresequenz voller Länge aufweist. In Bezug auf Proteinsequenzen umfassen diese Aktivitäten spezifische Bindungsaktivität und enzymatische Aktivität. Bevorzugt funktionelle Fragmente weisen zumindest etwa 70 % und noch bevorzugter von etwa 80 % bis 95 % der Aktivität des Proteins voller Länge auf, wie durch geeignete Mittel bestimmt werden kann.
Der Begriff "operabel gebunden" bezeichnet die Verbindung von Polynucleotidelementen in funktioneller Beziehung. Eine Nucleinsäure ist gemäß dieser Erfindung "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Genauer gesagt können operabel gebundene Sequenzen auf demselben Vektor oder auf verschiedenen Vektoren in derselben Zelle liegen. Beispielsweise ist ein Promotor oder Enhancer operabel mit einer spezifischen kodierenden Sequenz verbunden, wenn er sich auf die Transkription dieser kodierenden Sequenz auswirkt. In diesem Fall bedeutet operabel gebunden, dass die verbundenen DNA-Sequenzen nebeneinander liegen und, wenn dies zur Verbindung zweiter für ein Protein kodierender Regionen erforderlich ist, nebeneinander und im Leserahmen liegen. Operabel gebundene Sequenzen können jedoch in manchen Fällen auf verschiedenen Vektoren liegen. Eine Vektorsequenz, die für eine Untereinheit eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Proteins kodiert, könnte beispielsweise mit einer anderen Vektorsequenz operabel verbunden werden, die für eine andere Untereinheit (Bindepartner) dieses Proteins kodiert.
Verfahren der vorliegenden Erfindung sind mit einem weiten Spektrum an Wirtszellen, vor allem solchen, die gut an eine Gewebekultur angepasst sind, durchführbar und äußerst nützlich. Typischerweise sind die Wirtszellen eukaryotisch, vorzugsweise Säugetierzellen, die in herkömmlichen Medienpräparaten gute Wachstumseigen schaften aufweisen. Im Wesentlichen kann gemäß vorliegender Erfindung nahezu jede beliebige Nicht-Mikrobenzelle eingesetzt werden, die eine gewünschte Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren kann, egal ob sie vorher transformiert wurde oder nicht. Auf dem Gebiet der Erfindung sind verschiedenste solcher Zellen bekannt, wie beispielsweise CHO, CV-1, HeLa und andere Zellen. Sie im Allgemeinen Sambrook et al., s.o., und Ausubel et al., s.o.; und American Tissue Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA.
Wie aus der folgenden Erläuterung und den folgenden Beispielen noch klarer ersichtlich ist, können verschiedenste Vektoren und insbesondere Säugetierexpressionsvektoren gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden. Spezielle Vektoren umfassen im Allgemeinen geeignete Regulationssequenzen zur Selbstreplikation und vorzugsweise die Selektion in einer gewünschten Wirtszelle oder Zelllinie.
Der Begriff "Vektor" ist genauer als beliebige Nucleinsäuresequenz von Interesse definiert, die in eine Wirtszelle inkorporiert werden kann und zur Expression eines Nucleinsäuresequenz von Interesse führt. Diese Nucleinsäuresequenz von Interesse kodiert vorzugsweise für die gesamte oder einen Teil der oben beschriebenen Aminosäuresequenz. Geeignete Vektoren können lineare Nucleinsäuresequenzen, Plasmide, Cosmide, Phagemide, Episome und extrachromosomale DNA umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Außerdem gehören virale DNA und virale RNA dazu. Insbesondere kann der Vektor rekombinante DNA sein. Der Begriff "Expression" oder "Genexpression" bezieht sich hierin auf die Produktion des Proteinprodukts der Nucleinsäuresequenz von Interesse, einschließlich der Transkription der DNA und der Translation des RNA-Transkripts.
Genauer gesagt umfassen Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zumindest eine selektierbare Nucleinsäuresequenz, üblicherweise eine solche Sequenz. Zur Veranschaulichung werden selektierbare Sequenzen manchmal als selektierbarer Genmarker (oder ähnlich) bezeichnet, wenn die Sequenz für eine intra zelluläre Sequenz kodiert; oder als Zelloberflächenmarker (oder ähnlich), wenn die Sequenz für ein Zelloberflächenprotein kodiert.
Offensichtlich sind verschiedenste Vektor-kodierte selektierbare Sequenzen für die Erfindung geeignet. Bevorzugte Vektoren vereinfachen die Selektion von Wirtszellen oder Zelllinien, die den Vektor oder andere Vektoren, die gleichzeitig in die Zelle eingeführt werden, enthalten. Dieses Ziel kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, einschließlich des substanziellen Überlebens der Zellen nach dem Aussetzen gegenüber einem zytotoxischen Arzneimittel. Siehe allgemein Southern, P.J. et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 327 (1982); Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al., s.o.
Veranschaulichende selektierbare Genmarker zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen beispielsweise DHFR, Aminoglykosid-Antibiotikum G418, Hygromycin B (hmb) und Neomycin-Phosphotransferase-II-Gen (neo), Puromycin und das Adenosin-Deaminase-Gen für bestimmte auxotrophe eukaryotische Zellen, z.B. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen). In manchen Fällen scheint die gewünschte Aminosäuresequenz, für die der Vektor kodiert, selbst ein ausreichender selektierbarer Marker zu sein oder die Funktion des selektierbaren Markers positiv zu beeinflussen. In Fällen, in denen die Aminosäuresequenz selbst für die selektierbaren Marker kodiert, muss der Vektor keinen separaten selektierbaren Marker aufweisen. Für weitere Offenbarungen in Bezug auf Genmarker siehe beispielsweise Southern, P.J. et al., J. Mol. Biol. 150, 1 (1981); Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al., s.o., und darin angeführte Literaturverweise.
Wie erläutert kann die selektierbare Nucleinsäuresequenz für einen geeigneten Zelloberflächenmarker und insbesondere ein Zelloberflächenprotein kodieren. Beispiele für Zelloberflächenmarker umfassen Zelloberflächenrezeptoren, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Proteine, Lipoproteine, Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC/HLA), Antikörper, Antigene oder funktionelle Fragmente davon. Genauer gesagt umfassen Zelloberflächenmarker Glykoproteine von immunologischem Interesse, wie beispielsweise CD- (Oberflächenmoleküle humaner Lymphozyten) Glykoproteine, die typi scherweise auf T-Zelloberflächen vorkommen. Ein spezielleres Glykoprotein von Interesse ist das CD4-Molekül und insbesondere ein funktionelles Fragment dieses Moleküls. Siehe auch das CaptureTec^TM-System von InVitrogen.
Wie oben erwähnt können in den nachstehenden Beispielen Zellen, die für einen spezifischen Zelloberflächenmarker kodieren, durch eine oder eine Kombination verschiedener Strategien isoliert werden. In einem Ansatz können die Zellen beispielsweise durch Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung isoliert werden. Ein bevorzugter Ansatz ist Chromatographie, die wie weiter unten erläutert magnetische Selektion umfasst.
Der Begriff "funktionelles Fragment" als Definition für einen selektierbaren Zelloberflächenmarker bezieht sich auf einen Abschnitt dieses Markers, beispielsweise das CD4-Glykoprotein, das zur spezifischen Bindung eines anderen immunologischen Moleküls, wie beispielsweise eines Antikörpers, wie z.B. eines monoklonalen Antikörpers, fähig ist. Der Begriff umfasst auch eine Nucleinsäuresequenz, die für das funktionelle Fragment kodiert.
Im Allgemeinen wird, sobald eine geeignete selektierbare Sequenz gewählt ist, diese operabel mit einer oder mehreren Regulationssequenzen verbunden, sodass die kodierte Aminosäuresequenz im Vektor positioniert ist, beispielsweise neben einem Promotor. Auf diese Weise wird die Expression der gewünschten Aminosäuresequenz vereinfacht. Manche Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise ein heterologes oder homologes Protein, weisen ihre eigenen zell- oder gewebespezifischen Promotor auf. Außerdem sind Regulationssequenzen geeignete Leader- und Polyadenylierungssequenzen.
In spezifischeren Beispielen der vorliegenden Erfindung erfolgt die Expression der Aminosäuresequenz, je nach Bedarf, entweder als Mono- oder Di-Cistron. Die Expression ist beispielsweise monocistronisch, wenn der Promotor operabel mit sowohl der selektierbaren Nucleinsäuresequenz als auch der Aminosäuresequenz von Inter esse verbunden ist, beispielsweise Promotor/kodierte Aminosäuresequenz/selektierbare Nucleinsäuresequenz; Promotor/selektierbare Nucleinsäuresequenz/kodierte Aminosäuresequenz. Alternativ dazu ergibt sich eine dicistronische Expression aus der Expression der Aminosäuresequenz aus separaten Promotoren, beispielsweise Promotor/kodierte Aminosäuresequenz oder selektierbare Nucleinsäuresequenz.
Wie erwähnt sind die vorliegenden Verfahren mit verschiedensten Vektoren durchführbar. Diese Vektoren kodieren typischerweise für die Aminosäuresequenz (oder mehrere solcher Sequenzen), für welche die erhöhte Expression gewünscht ist. Ein bevorzugtes Vektorformat wird manchmal als Expressionskassette bezeichnet. In einer Ausführungsform umfasst die Expressionskassette im Allgemeinen einen Promotor, der in der den Vektor aufweisenden Zelle oder Zelllinie funktionell ist, einen Operator, eine ribosomale Initiationsstelle, die Aminosäuresequenz und einen ausreichenden 3'-Abschnitt, der für die Polyadenylierungssignale kodiert, um das Processing und in manchen Fällen die Sekretion der Aminosäuresequenz aus der Zelle zu vereinfachen. Ein bevorzugtes Beispiel für einen Terminationssequenz ist die Polyadenylierungssequenz von SV40. Falls gewünscht kann die Expressionskassette oder ein anderer geeigneter Abschnitt des Vektors nahe dem 5'-Ende der Aminosäuresequenz eine Signalsequenz aufweisen, um das posttranslationale Processing dieser Sequenz zu vereinfachen. Zumindest ein geeigneter Genmarker oder Zelloberflächenmarker kann, falls erforderlich, im Vektor positioniert sein.
Ein spezifischeres Beispiel für einen geeigneten Vektor, der die Expressionskassette umfasst, ist ein DNA-Vektor, der Folgendes umfasst: (i) einen Replikationsstartpunkt (Ori), der in E. coli funktionell ist; (ii) einen selektierbaren Genmarker (Antibiotikaresistenzgen, z.B. Amp-, Tet-, Neo- oder Kan-Resistenz); (iii) einen starken viralen Promotor, wie z.B. den Zytomegalie-Virus- (CMV-) Promotor und ein optionales CMV-Enhancer-Element; (iv) eine (Ig-C_L)-Immunglobulinleichtketten-Konstantregion-Leadersequenz; (v) die Aminosäuresequenz von Interesse; (vi) ein Ig-C_L-Intron voller Länge, das an ein Ig-C_L-Exon gebunden ist; (vii) eine Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz, z.B. eine Rinderwachstumshormon- (bgh-) Poly-A-Sequenz; und (viii) DNA, die für einen selektierbaren eukaryotischen Marker kodiert, wie z.B. ein starker viraler Promotor (z.B. ein Simian-Virus40- (SV40-) Promotor), der an das Antibiotikaresistenzgen gebunden und an eine virale Polyadenylierungssequenz (z.B. die SV40-Poly-A-Sequenz) fusioniert ist. Alternativ dazu kann der DNA-Vektor alle von (i) – (v) und (vii) – (viii) enthalten, ohne das Ig-C_L-Intron voller Länge, das an das Ig-C_L-Exon von (vi) gebunden ist. Ein Beispiel für eine Ig-C_L-Leader-Sequenz ist der Mäuse-κ-Leader. Ein Beispiel für ein Ig-C_L-Intron voller Länge und ein Exon ist das Cκ-Gen voller Länge.
Die Aminosäuresequenz, für welche eine erhöhte Expression gewünscht ist, kann fast jede Protein- oder Polypeptidsequenz sein, einschließlich heterologer Proteine oder homologer (endogener) Proteine, die von der Wirtszelle natürlich produziert werden. In den meisten Fällen ist die Aminosäuresequenz ein eukaryotisches Protein, wie beispielsweise eine Untereinheit oder ein funktionelles Fragment einer größeren Aminosäuresequenz, wie z.B. eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Proteins, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein. Genauer gesagt umfassen die Aminosäuresequenzen Enzyme, Immunglobuline, Peptidhormone, Vakzine, Rezeptoren, einschließlich T-Zell-Rezeptoren, MHC/HLA-Moleküle (Klasse I und Klasse II) oder Fragmente davon. Weitere spezifische Proteine umfassen Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Zytokine, z.B. Plasminogenaktivatoren, Gewebefaktoren (TF), Insulin, Säugetierwachstumshormone, Erythropoetine, IgE, Urokinasen, Interleukine 1, 2 und 3 oder Fragmente davon. Die Erfindung ist darüber hinaus mit anderen bekannten, teilweise bekannten oder unbekannten Aminosäuresequenzen durchführbar, einschließlich solcher, die für neue Gensequenzen kodieren.
In der Genbank (National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894, USA) ist eine Reihe solcher Aminosäuresequenzen zu finden. Die Genbank steht auch im Internet auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov zur Verfügung.
Die Molekulargewichte von spezifischen hierin erläuterten Vektoren können mithilfe herkömmlicher Verfahren, wie Beispielsweise Agarose-Gelelektrophorese-Größen bestimmung, bestimmt werden und variieren je nach beispielsweise beabsichtigter Verwendung. Die meisten geeigneten Vektoren, und insbesondere ein geeigneter DNA-Vektor, weisen ein Molekulargewicht von zumindest etwa 5 kb und insbesondere von etwa 5 kb bis etwa 35 kb oder mehr auf. Das Molekulargewicht von bestimmten Aminosäuresequenzen kann mithilfe herkömmlicher Proteingrößenbestimmungsverfahren, wie beispielsweise Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bestimmt werden. Alternativ dazu oder zusätzlich kann das Molekulargewicht durch Bestimmung des Molekulargewichts der entsprechenden Nucleinsäuresequenz, gefolgt von einer konzeptionellen Translation dieser Sequenz geschätzt werden. Bei den meisten Anwendungen reicht die Größe der Nucleinsäure, die für die Aminosäuresequenz kodiert, aus, um für ein Protein oder ein Polypeptid mit etwa 500 bis etwa 300.000 Dalton, vorzugsweise etwa 15 bis etwa 200.000 Dalton, zu kodieren.
In den folgenden Beispielen sind spezifischere Vektoren zur Verwendung in der Erfindung erläutert, wie beispielsweise pJAlgG4Tf.A8, pDRHK und pMACS. Siehe auch 1A und 1B. Der pDRHK-Vektor wurde gemäß dem Budapester Vertrag mit der ATCC an der oben angeführten Adresse hinterlegt. Der DNA-Vektor wurde am 17. September 1997 bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Zugriffsnummer 209274. Der pDRHK-Vektor ist ein Säugetierexpressionsvektor, der einen CMV-Promotor, ein IgC-κ-Leader-Peptid, eine Klonierungsregion, ein Mäuse-κ-Intron und eine menschliche κ-Konstantdomänen-Exon-Sequenz umfasst.
Wie oben erwähnt beschäftigt sich die vorliegende Erfindung mit einer Reihe von rekombinanten Manipulationen, einschließlich sequenzieller und abgestimmter Vektoreinführung, um rekombinante Säugetierzelllinien herzustellen, die eine Aminosäuresequenz in hohem Ausmaß exprimieren. Die Einführung der Vektoren kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden, einschließlich retroviraler Transfer, virale Infektion, Calcium-, Liposom- oder Polybren-vermittelte Transfektion, biolistischer Transfer oder andere auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren. Noch bevorzugtere Einführungsverfahren umfassen solche, die für eine stabile Transfektion von Säugetierzellen angepasst werden können, wie beispielsweise Elektroporation.
Bei manchen Anwendungen sind jedoch vorübergehende Einführungsverfahren von Nutzen, solange die resultierenden rekombinanten Zelllinien genetisch stabil sind.
Um die Erfindung besser zu veranschaulichen, wird eine geeignete Wirtszelle, wie beispielsweise eine CHO, einmal oder zumindest zweimal (mehrfach) mit geeigneten Vektoren transfiziert, die jeweils zumindest einen selektierbaren Marker umfassen und für zumindest ein heterologes Protein von Interesse kodieren. In einer spezifischeren Ausführungsform werden die Wirtszellen mit einem Vektor transfiziert, der eine erste selektierbare Sequenz (Genmarker) umfasst, die operabel mit einem Segment verbunden ist, das wiederum operabel mit dem kodierten Protein verbunden ist. Verschiedene Transfektionsverfahren können verwendet werden, um den Vektor in die Wirtszellen einzuführen, wie beispielsweise herkömmliche Calciumphosphatvermittelte Transfektions- oder Lipofektionsverfahren. Transfizierte Wirtszellen werden dann selektiven Wachstumsbedingungen unterzogen, sodass erste stark exprimierende Zellen isoliert werden können. Verfahren zur Isolierung von transfizierten Zellen wurden beispielsweise in Sambrook et al., s.o.; Ausubel et al., s.o.; und Wigler PNAS (USA) 76, 1376 (1979) beschrieben.
Die ersten stark exprimierenden Zellen werden isoliert und können, falls gewünscht, durch ein herkömmliches Verfahren oder eine Kombination von herkömmlichen Verfahren charakterisiert werden. In einem Ansatz werden die CHO-Zellen beispielsweise mit einem Vektor transfiziert, der für einen Neomycin-Genmarker kodiert (der G418-Resistenz bereitstellt), der operabel mit einer Proteinsequenz verbunden ist, wie beispielsweise einer Immunglobulin-kodierenden Sequenz, insbesondere einer für einen Antikörper kodierenden Sequenz. Transfizierte Wirtszellen, welche die Proteinsequenz exprimieren, werden dann durch Standardverfahren kloniert (z.B. Grenzverdünnung und Heranreifen), durchgeführt in Mikrotiter-Gewebekulturplatten. Nachdem die Zellen einige Tage bis einige Wochen lang oder länger inkubiert wurden, treten typischerweise Einzelkolonien auf. Vorzugsweise werden nur Einzelkolonien für weitere Manipulationen verwendet. Hochproduzierende Klone werden durch ein geeignetes Verfahren selektiert, wie beispielsweise durch herkömmliche immuno logische Verfahren, insbesondere einen ELISA-Assay. Bevorzugt sind ELISA-Assays, die optimiert wurden, um Antikörperproduktion zu detektieren und zu quantifizieren. Bevorzugt hochproduzierende Zellen sind solche, die im ELISA-Assay im Wesentlichen die größte Antikörpermenge erzeugen. Noch bevorzugter sind erste hochproduzierende Zellen, die etwa 0,5 bis etwa 20 Mikrogramm Antikörper pro Milliliter Medium erzeugen. Insbesondere bevorzugt sind hochproduzierende Zellen, die etwa 1 bis etwa 5 Mikrogramm Antikörper pro Milliliter Medium erzeugen.
Die ersten hochproduzierenden Zellen werden weiter manipuliert, vor allem um die Zellkopien von Nucleinsäure zu erhöhen, die für die Proteinsequenz kodiert. Ein spezifisches Ziel in diesem Beispiel ist die Herstellung einer einen genetisch stabilen Antikörpers produzierenden Zelllinie. In einer Ausführungsform werden die ersten hochproduzierenden Zellen weiter mit zwei unterschiedlichen Vektoren transfiziert, beispielsweise durch Elektroporation: Ein Vektor kodiert für die Proteinsequenz und der andere Vektor kodiert für einen geeigneten Zelloberflächenmarker, wie beispielsweise ein Glykoprotein, insbesondere CD4 oder ein Fragment davon. Siehe 1A. Ein bevorzugter im Handel erhältlicher Vektor, der für CD4 kodiert, ist pMACS (siehe unten). In diesem Beispiel werden Transfektanten mit einem spezifischen Antikörper oder einem geeigneten Antigenbindungsfragment davon behandelt, das zur spezifischen Bindung des Zelloberflächenproteins fähig ist.
Der Begriff "genetisch stabil" in Bezug auf eine Zelle bedeutet hierin, dass eine Zelle im Wesentlichen frei von genomischen Umbauten ist, welche die heterologe Nucleinsäure enthalten. Vor allem werden Umbauten vermieden, die Double-minute-Chromosome umfassen. Die vorliegenden Verfahren führen vorzugsweise die heterologen Nucleinsäuren in das Wirtszellgenom ein, um die genetische Stabilität zu maximieren.
Die spezifische Bindung zwischen Zellen, die das Zelloberflächenprotein von einem der Vektoren exprimieren, und der Proteinsequenz, für die der andere Vektor kodiert, kann auf verschiedene Arten detektiert werden, einschließlich durch herkömmliche immunologische Verfahren, wie z.B. Chromatographie und insbesondere Säulenchromatographie unter Verwendung von Magnetkügelchen. Bei diesem Ansatz wird der Antikörper, der gegen das Zelloberflächenprotein gerichtet ist, kovalent an die Magnetkügelchen gebunden, wodurch alle Zellen, die das Zelloberflächenprotein exprimieren, isoliert werden können, indem ein Magnetfeld an die Zellen und die Magnetkügelchen angelegt wird. Gebundene Zellen werden dann aus der Säule entnommen und in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Gegebenenfalls können die Zellen in einem selektiven Medium, wie beispielsweise einem mit G418 ergänzten Medium, gezüchtet werden.
Die zweiten hochproduzierenden Zellen können durch verschiedene Verfahren isoliert werden. In einem speziellen Ansatz werden die Zellen beispielsweise ausreichend lange in den Wells gezüchtet, sodass eine Antikörperproduktion und -sekretion in das Kulturmedium stattfinden kann. Ein geeigneter Anti-Idiotyp-Antikörper gegen einen Fc-Abschnitt wird auf die Mikrotiter-Kulturplattenwells aufgetragen, und das Zellkulturmedium wird zugesetzt. Das Medium, das große Mengen des Antikörper enthält, kann durch Standardverfahren detektiert werden, beispielsweise durch herkömmliche Sandwich-Tests, wobei ein geeigneter sekundärer Antikörper verwendet wird, der mit z.B. Meerrettichperoxidase (HFP) markiert ist. Bevorzugte zweite hochproduzierende Zellen werden durch die Identifikation hoher Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten in Bezug auf die Zellanzahl in der Platte isoliert. Verfahren zur Durchführung dieser Analyse werden weiter unten genauer beschrieben und umfassen insbesondere eine ELISA-Detektionsformat. Bevorzugt sind zweite hochproduzierende Zellen, die in einem Zeitraum von 24 Stunden etwa 0,1 bis etwa 10 Mikrogramm Antikörper oder mehr pro 10⁶ Zellen produzieren. Noch bevorzugter ist ein Bereich von etwa 1 bis etwa 5 Mikrogramm Antikörper pro 10⁶ Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden.
Wie erwähnt sind weiters zweite hochproduzierende Zellen bevorzugt, die im Vergleich zu den ersten hochproduzierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache oder mehr an Antikörpern produzieren. Die Antikörperreaktivität ist ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung dieser Bestimmung.
Zweite stark exprimierende Zellen werden weiter transfiziert, um Zelllinien zu isolieren, die mehr des Proteins exprimieren, z.B. die dritten stark exprimierenden Zellen. Um beispielsweise die Produktion des Antikörper in den zweiten stark exprimierenden Zellen zu erhöhen, werden die beiden Vektoren, die zur Transfektion der ersten stark exprimierenden Zellen verwendet wurden, wieder und wieder verwendet, um die zweiten stark exprimierenden Zellen zu cotransfizieren. Ein bevorzugtes Transfektionsverfahren ist Elektroporation, obwohl, falls gewünscht, auch andere Transfektionsverfahren angewandt werden können. Hochproduzierende Zellen, die größere Mengen des Antikörpers erzeugen, können wie oben erläutert unter Verwendung von magnetischer Säulenchromatographie an CD4 exprimierenden Zellen, gefolgt von der Isolierung von hochproduzierenden Zellen isoliert werden. Gegebenenfalls können die Zellen in einem nichtselektiven oder selektiven Medium, wie z.B. einem mit G418 ergänzten Medium, gezüchtet werden. Bevorzugte hochproduzierende Zellen erzeugen maximale Mengen eines Antikörpers, wie durch die Identifikation von hohen Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten in Bezug auf die Zellanzahl in den Platten bestimmt werden kann.
In diesem Beispiel werden selektierte Zelllinien vorzugsweise reihenverdünnt und durch herkömmliche Verfahren in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Nach etwa einigen Tagen bis einigen Wochen oder mehr wird die Antikörperproduktion durch ein geeignetes immunologisches Verfahren, wie z.B. ELISA, getestet. Klone mit hohen Antikörperproduktionswerten werden weiter amplifiziert. Bevorzugt sind Klone mit etwa 1 bis etwa 100 Mikrogramm Antikörper oder mehr pro 10⁶ Zellen in einem Zeitraum von 24 Stunden. Noch bevorzugter ist ein Bereich von etwa 15 bis etwa 50 Mikrogramm Antikörper pro 10⁶ Zellen über einem Zeitraum von 24 Stunden. Außerdem sind Klone bevorzugt, welche die zumindest etwa 2- bis etwa 10fache Antikörperproduktion der zweiten hochproduzierenden Zellen aufweisen.
Selektierte Klone, welche die oben genannten Kriterien erfüllen, werden vorzugsweise gemäß herkömmlichen Verfahren reihenverdünnt. Nach einigen Tagen bis einigen Wochen oder mehr werden Einzelkolonien durch ein geeignetes immunologisches Verfahren, wie z.B. ELISA, auf ihre Antikörperproduktion getestet. Der höchstproduzierende Klon (dritte stark exprimierende Zelle) wird zur Herstellung von statischen Kulturen ausgewählt, wie weiter unten im Detail beschrieben ist. Bevorzugte dritte stark exprimierende Zellen produzieren etwa 20 bis etwa 200 Mikrogramm pro Milliliter einer Kultur. Noch bevorzugtere dritte stark exprimierende Zellen produzieren etwa 50 bis etwa 150 Mikrogramm pro Milliliter Kultur, wobei im Allgemeinen etwa 100 Mikrogramm pro Milliliter Kultur bevorzugt sind.
Außerdem sind dritte hochproduzierende Zellen bevorzugt, die im Vergleich zu den zweiten hochproduzierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache des Antikörpers produzieren, wie durch die Antikörperreaktivität bestimmt wird.
Außerdem sind dritte hochproduzierenden Zellen bevorzugt, die im Vergleich zu den ersten hochproduzierenden Zellen das etwa 10- bis etwa 200fache des Antikörpers produzieren, wie durch die Antikörperreaktivität bestimmt wird.
Ein spezifisches Beispiel für einen geeignete Antikörper ist der Anti-TF-Antikörper, der durch den in 1A dargestellten pJAlgG4TF.A8-Vektor kodiert ist.
Die hochproduzierenden Zelllinien, die durch die hierin beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, sind für eine Reihe äußerst nützlicher Anwendungen geeignet, einschließlich Anwendungen im Handel, in der Forschung und in der Medizin. Beispielsweise wurde herausgefunden, dass die hochproduzierenden Zellen, die durch das Verfahren hergestellt werden, vor allem für eine kommerzielle Produktion der Proteinsequenz geeignet sind. Zur Veranschaulichung wurde in den nachstehenden Beispielen die Verwendung eines Hohlfaserbioreaktors zur Herstellung der Proteinsequenz in großem Maßstab (d.h. Milligrammmengen pro ml) beschrieben.
In einem spezifischen Beispiel der vorliegenden Erfindung können rekombinante Säugetierzelllinien hergestellt werden, die große Mengen an MHC-Komplexen, insbesondere rekombinanten einkettigen und heterodimeren MHC-Komplexen, herstellen. Diese Komplexe wurden in beispielsweise der US 5.869.270 geoffenbart, die am 31. Jänner 1996 eingereicht wurde; sowie in der PCT-Anmeldung WO 96/04314, die am 15. Februar 1996 veröffentlicht wurde. In der US 5.869.270 und in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO 96/04314 sind verschiedene einkettige MHC-Fusionskomplexe beschrieben, die ein kovalent gebundenes präsentierendes Peptid umfassen.
Um beispielsweise rekombinante Säugetierzelllinien herzustellen, die einen gewünschten einkettigen MHC-Komplex in großen Mengen exprimieren, wird eine geeignete Säugetierwirtszelle, wie z.B. CHO, einmal oder zumindest zweimal (mehrfach) mit geeigneten Vektoren transfiziert. Die Vektoren umfassen jeweils zumindest einen selektierbaren Marker, wie er oben definiert ist, und zumindest ein Segment, das für den Einketten-MHC-Komplex kodiert. In bevorzugten Ausführungsformen gehört der einkettige Komplex zur Klasse II, obwohl in manchen Fällen ein einkettiger Komplex der Klasse I bevorzugt wird. Die Wirtszellen werden vorzugsweise mit einem geeigneten Vektor transfiziert, der für den Einkettenkomplex kodiert, der operabel mit einem selektierbaren Marker verbunden ist. Eine Reihe von Transfektionsverfahren ist geeignet, wie z.B. herkömmliche Calciumphosphat-vermittelte Transfektions oder Lipofektionsverfahren. Transfizierte Wirtszellen werden dann selektiven Wachstumsbedingungen ausgesetzt, sodass erste stark exprimierende Zellen isoliert werden können. Verfahren zur Isolierung von transfizierten Zellen wurden beispielsweise in Sambrook et al., s.o.; Ausubel et al., s.o.; und Wigler PNAS (USA) 76, 1376 (1979), beschrieben.
Bei einem spezifischeren Verfahren umfasst der Vektor einen selektierbaren Genmarker, wie beispielsweise ein Neomycin-Gen, das operabel mit dem Einketten-MHC-Komplex verbunden ist. Wirtszellen werden vorzugsweise durch Elektroporation transfiziert, und transfizierte Wirtszellen, welche die Fusionsproteinsequenz ex primieren, werden durch Grenzverdünnungsverfahren kloniert, die in Mitrotiter-Gewebekulturplatten durchgeführt werden. Nachdem die Zellen einen Tag bis zu einigen Wochen lang oder länger inkubiert wurden, werden transfizierte Zellen geerntet und in einem nichtselektiven oder selektiven Medium, wie beispielsweise einem mit G418 ergänzten Medium, verdünnt. Überstände werden wie oben beschrieben getestet und expandiert. Selektierte Klone werden geerntet und einige Tage bis einige Wochen lang oder länger gezüchtet, um erste hochproduzierende Zellen zu isolieren. Bevorzugt sind erste hochproduzierende Zellen, die etwa 1 bis 100 Nanogramm des Fusionsproteins pro ml Medium produzieren. Noch bevorzugter sind erste hochproduzierende Zellen, die 10 bis 50 Nanogramm pro Milliliter produzieren.
Die ersten hochproduzierenden Zellen, die das Einketten-MHC-Fusionsprotein produzieren, werden wie folgt weiter manipuliert. Die ersten hochproduzierenden Zellen werden weiters mit zwei Vektoren cotransfiziert, beispielsweise durch Elektroporation: Ein Vektor kodiert für das einkettige Fusionsprotein, und der andere Vektor kodiert für ein geeignetes Zelloberflächenprotein, wie beispielsweise ein Glykoprotein und insbesondere CD4. Ein bevorzugter Vektor, der für CD4 kodiert, ist der im Handel erhältliche pMACS-Vektor (siehe unten). Transfektanten werden dann mit einem spezifischen Antikörper oder einem geeigneten Antigenbindungsfragment davon behandelt, das zur spezifischen Bindung des Zelloberflächenproteins fähig ist. Die spezifische Bindung kann auf verschiedene Arten detektiert werden, wobei jedoch Säulenchromatographie unter Verwendung von Magnetkügelchen bevorzugt ist. Gebundene Zellen werden dann aus der Säule entfernt und in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Diese zweiten hochproduzierenden Zellen können in einem nichtselektiven oder selektiven Medium, wie z.B. in einem mit G418 ergänzten Medium, gezüchtet werden.
Falls gewünscht können statische Kulturen der zweiten hochproduzierenden Zellen hergestellt werden. Bevorzugt sind zweite hochproduzierende Zellen, die etwa 50 bis 500 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren. Noch bevorzugter sind hochproduzierende Zellen, die etwa 100 bis 200 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren.
Um die Produktion des Einketten-MHC-Komplexes weiter zu steigern, können außerdem die zweiten hochproduzierenden Zellen transfiziert werden. In einem Ansatz werden die zweiten hochproduzierenden Zellen mit einem Gemisch aus dem Vektor, der für das einkettige MHC-Fusionsprotein kodiert, und einem weiteren Vektor, der eine selektierbare Nucleinsäuresequenz trägt, die Resistenz gegenüber einem Arzneimittel wie etwa Puromycin oder einem anderen geeigneten Arzneimittel verleiht, cotransfiziert. Die Cotransfektion kann durch ein beliebiges geeignetes Verfahren erfolgen, einschließlich Elektroporation, falls gewünscht. Nach Inkubation für einige Tage bis zu einigen Wochen oder länger werden Zellen geerntet und in einem Medium resuspendiert, das mit Puromycin ergänzt wurde. Nachdem resistente Kolonien visualisiert wurden, kann das Kulturmedium auf die Produktion des Fusionsproteins hin getestet werden, beispielsweise durch ELISA. Statische Kulturen können aus Klonen hergestellt werden, die große Mengen des Proteins produzieren. Bevorzugte dritte hochproduzierende Zellen produzieren etwa 500 bis etwa 5.000 Nanogramm pro Milliliter des Fusionsproteins. Noch bevorzugter sind dritte hochproduzierende Zellen, die etwa 1.000 bis 2.000 Nanogramm pro Milliliter des Proteins produzieren.
Falls gewünscht können geeignete dritte hochproduzierende Zellen weiter subkloniert werden, um die rekombinante Proteinexpression zu verbessern. Ein bevorzugtes Verfahren ist Grenzverdünnungsklonierung. Außerdem sind Klone der dritten hochproduzierenden Zellen bevorzugt, die in 24 Stunden etwa 100 bis etwa 1.000 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren. Insbesondere bevorzugt sind Klone, die in 24 Stunden etwa 200 bis 500 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren.
Ein Beispiel für einen Vektor, der für einen Einketten-MHC-Komplex kodiert, ist der in 1B dargestellte pDRHK-Vektor. Dieser Vektor kodiert für einen sc-DR2/MBP-Einketten-MHC-Komplex der Klasse II.
Die vorliegenden Verfahren können je nach Anwendung variiert werden. Beispielsweise umfasst die Erfindung speziell die folgenden Ausführungsformen: 1) Transfektion mit einem Expressionsvektor, der ein Arzneimittelresistenzgen trägt, 2) Cotransfektion mit einem Expressionsvektor und einem Vektor, der vorübergehend einen Zelloberflächenmarker exprimiert, und 3) Cotransfektion mit einem Expressionsvektor und einem Vektor, der ein anderes Arzneimittelresistenzgen trägt. Die hierin erläuterten Zellselektionsverfahren können angewandt werden, um diese spezifischen Strategien umzusetzen. Die Erfindung kann auch verwendet werden, um Zellen mit Expressionsvektoren zu retransfizieren, die für spezifischen rekombinante Proteine von Interesse kodieren, wie beispielsweise wenn ein Expressionsvektor für zwei Polypeptidsequenzen (Immunglobulin-Schwer- und -Leichtkette) kodiert. Eine bevorzugte Expression umfasst die abgestimmte Expression von beiden Polypeptidketten. Diese spezifischen Verfahren und andere hierin angeführte Verfahren sind für verschiedene Anwendungen geeignet, einschließlich der Vereinfachung der Selektion und des Screenings von Zellen.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher veranschaulicht. Diese Beispiele sollen das Verständnis der Erfindung unterstützen und dienen nicht als Einschränkung.
Beispiel I – Retransfektion von CHO-Zellen zur Produktion eines rekombinanten Anti-Gewebefaktor- (-TF-) Antikörpers in hohem Ausmaß
1. Vektorcharakterisierung
Ein Vektor, der als pJAlgG4TF.A8 (1A) bezeichnet wird, wurde hergestellt, um chimäre Anti-Gewebefaktor- (-TF-) Antikörperschwer- und -leichtketten in Säugetierzellen zu exprimieren. Anfängliche Versuche zur vorübergehenden Transfektion wurden durchgeführt, um die Antikörperexpression des pJAlgG4TF.A8-Vektors zu tes ten. COS-Zellen wurden unter Verwendung des Qiagen-Lipofectin-Reagens vorübergehend transfiziert. Kurz gesagt wurden 2,5 × 10⁵ Zellen/Well in eine Platte mit 6 Wells gesät und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zwei Mikrogramm pJAlgG4-TF.A8-DNA wurden mit 100 μl IMDM vermischt. Um den Lipid-Komplex herzustellen, wurden 10 μl Lipide zur DNA-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Während DNA den Lipid-Komplex bildete, wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Das DNA-Lipid-Gemisch wurde mit 600 μl 10 % SSM [10 % fötales Rinderserum (FBS), das mit einem CellGro-IMDM-Medium (MediaTech) ergänzt war] vermischt und zu den gewaschenen Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden 3 Stunden lang bei 37 °C und 10 % CO₂ mit Lipid-Komplexen inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, 2 ml 10 % SSM wurden zugesetzt und das Ganze wurde 72 Stunden lang bei 37 °C und 10 % CO₂ inkubiert. Der Kulturüberstand wurde auf seine Antikörperproduktion getestet.
2. ELISA zur Überprüfung der Antikörperproduktion
Um die Gegenwart des menschlichen IgG4-Antikörpers zu detektieren, wurde ein menschlicher HC/κ-spezifischer Sandwich-ELISA entwickelt. Kurz gesagt wurden Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Fab) in einem R5-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Wells wurden dann einmal mit einem R55-Puffer (2 mM Imidazol, 7,5 mM NaCl, 0,02 % Tween-20) gewaschen, mit einer Plastikfolie bedeckt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Um die Antikörperproduktion zu testen, wurde das R55 entfernt und 100 μl Transfektantüberstand wurden zu den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen und 100 μl einer 1:800-Verdünnung (in PBS, das 10 % FBS enthielt) eines Anti-Human-κ-Ketten-HRP-Antikörpers (Southern Biotech) wurden zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37 °C inkubiert und 6-mal mit 400 μl R55-Puffer gewaschen. Um die Gegenwart des Sondenantikörpers zu detektieren, wurden 100 μl 1 × ABTS-Substrat (Kirkegaard & Perry Labs) für 4 Minuten zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer (Kirgegaard & Perry Labs) zugesetzt. Das Absorptions vermögen wurde bei 405 nm bestimmt. Gereinigtes menschliches IgG4-Protein diente als positive Kontrolle. Die Ergebnisse solch eines Tests zeigten, dass der Anti-TF-IgG4-Anitkörper durch eine COS-Zelle produziert wurde, die vorübergehend mit dem pJAlgG4TF.A8-Vektor transfiziert war.
3. ELISA zur Überprüfung der Antikörperspezifität
Ein zweiter Sandwich-ELISA wurde entwickelt, um spezifisch Antikörper zu detektieren, die an einen menschlichen Gewebefaktor binden. Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) wurden über Nacht bei 4 °C mit 100 μl 500 ng/ml rekombinantem menschlichem TF in R65-Puffer (100 mM Natriumbicarbonat, pH 8,2) beschichtet. Am nächsten Tag wurden die Platten mit R55-Puffer gewaschen, abgedeckt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Um die Anti-TF-Antikörperproduktion zu detektieren, wurde der R55 entfernt, und 100 μl Transfektantenüberstand wurden den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und 100 μl einer 1:800-Verdünnung (in PBS, das 10 % FBS enthielt) eines Anti-Human-κ-Ketten-HRP-Antikörpers (Southern Biotech) wurden zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37 °C inkubiert und 6-mal mit 400 μl R55-Puffer gewaschen. Um die Gegenwart des Sondenantikörpers zu detektieren, wurden 100 μl 1 × ABTS-Substrat für 4 Minuten zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer zugesetzt. Das Absorptionsvermögen wurde bei 405 nm bestimmt. Gereinigtes Mäuse-H36.D2-Anti-TF-Protein diente als positive Kontrolle. Die Ergebnisse solch eines Tests zeigten, dass der Anti-TF-IgG4-Anitkörper durch eine COS-Zelle produziert wurde, die vorübergehend mit pJAlgG4TF.A8 transfiziert war.
4. Anfängliche stabile Transfektion von CHO-Zellen
Um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die den rekombinanten Anti-TF-Antikörper exprimiert, wurden CHO.K1-Zellen mit dem pJAlgG4TF.A8-VEktor transfiziert. Kurz gesagt wurden 100 μg pJAlgG4TF.A8-DNA durch 4-stündigen Verdau mit Pvul bei 37 °C linearisiert. CHO.K1-Zellen (ATCC CCL-61) wurden auf eine Konzentration von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Ein Volumen von 800 μl Zellen wurde zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. 25 Mikrogramm pJAlgG4TF.A8-DNA wurden zugesetzt, mit den Zellen vermischt und 10 Minuten lang inkubiert. Dann wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension zu einem T25-Kolben mit 10 ml 10 % SSM zugesetzt und über Nacht bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert. 24 Stunden später wurden die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-PBS geerntet, in PBS resuspendiert und 1:9, 1:27 und 1:81 in einem mit G418 ergänzten Medium verdünnt. 100 μl/Well der transfizierten Zellen wurden in 96-Well-Platten ausplattiert und bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert.
Der Kulturüberstand der transfizierten Zellen wurde wie oben beschrieben auf seine Antikörperproduktion getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert. Der Klon H9 der Reihe H der Säule 9 der 1:27-Verdünnungsplatte wurde als starker Antikörperproduzent selektiert.
Diese Zelllinie wurde durch Grenzverdünnung kloniert. Kurz gesagt wurde der selektierte Klon auf 1.000 Zellen/ml in PBS verdünnt. Eine Reihe von 1:10-Verdünnungen in 10 % SSM wurden durchgeführt, um 1 Zelle/ml zu erhalten. Von diesen Verdünnungen wurden 100 ul/Well in 96-Well-Platten mit flachem Boden plattiert. Diese Platten wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert. Nach dreitägiger Inkubation wurden 100 μl/Well 10 % SSM zu jedem Well zugesetzt. Drei Wochen später traten Einzelkolonien auf. Nur Einzelkolonien wurden durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Klone mit starker Antikörperproduktion wurden amplifiziert und selektiert. Der Klon H9g12 wurde als stärkster Produzent selektiert und auf seine Antikörperproduktion in einem statischen Medium untersucht.
Die selektierten Klone wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet, in einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/Well in 10 ml 10 % SSM-Medium resuspendiert und in einen T25-Gewebekulturkolben zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ 21 Tage lang, oder bis 80 % der Zellen abgestorben waren, inkubiert. Die Zellsus pension wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen ELISA-Assay auf seine Antikörperproduktion getestet. Die maximale Antikörperproduktion des H9g12-Klons betrug 3,5 μg/ml.
5. Stabile Retransfektion der CHO-H9g12-Zelllinie
Dieses Verfahren wurde entwickelt, um mehr Kopien der Gene von Interesse dem Genom einer stabilen Antikörper produzierenden Zelllinie hinzuzufügen. Um dieses Verfahren umzusetzen, wurde der Klon H9g12 mit einem Gemisch aus dem Anti-Human-TF-Megavektor pJAlgG4TF.A8 und pMACS cotransfiziert. Der pMACS-Vektor ermöglicht eine vorübergehende Expression eines membrangebundenen CD4-Proteins. Um die H9g12-Zelllinie zu cotransfizieren, wurden 800 μl einer Suspension von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von pJAlgG4TF.A8- und pMACS-DNA (40 μl 1 μg/ml Pvul-linearisiertes pJAlgG4TF.A8 und 5 μl 1 μg/ml supergeknäueltes pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, in einem T25-Kolben auf 10 ml 10 % SSM verdünnt und 72 Stunden lang bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert, um die vorübergehende Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden die Zellen mit 5 ml PBE (EDTA in einer PBS-Lösung) bei Raumtemperatur behandelt, bis sie sich ablösten. Die Zellen wurden einmal gewaschen, in 380 μl PBE resuspendiert und mit 80 μl eines Antikörper markiert, der für das Zelloberflächen-exprimierte menschliche CD4-Molekül spezifisch war. Dieser Antikörper war kovalent an ein Magnetkügelchen gebunden. Nach einer 15- bis 20-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Antikörper-markierten Zellen auf eine Magnetsäule aufgetragen. Transfizierte Zellen, die das CD4 auf ihrer Oberfläche exprimierten, wurden durch die Säule mit 1 ml PBE gewaschen. Die gebundenen Zellen wurden dann aus der Säule eluiert, indem die Säule von Magnetfeld entfernt wurde und 1 ml PBE durch die Säule geleitet wurde. CD4 exprimierende Zellen wurden in 199 ml 10 % SSM verdünnt, das mit G418 (1,5 mg/ml) ergänzt war, und in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden plattiert. Die Platten wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert.
Um die Antikörperproduktion zu bestimmen, wurden Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) wie oben beschrieben mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Fab) (Pierce) beschichtet. Das Medium von retransfizierten Zellen wurde 24 Stunden vor dem Test verändert. Fünf Mikroliter des Transfektanten-24-Stunden-Überstands wurden zu 95 μl 10 % FBS-PBS zugesetzt. Der verdünnte Überstand wurde zu den beschichteten Wells zugesetzt und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und ein Anti-Human-κ-Ketten-Antikörper-HRP (Southern Biotech) wurde verwendet, um wie oben beschrieben rekombinante Antikörper zu detektieren, die im Überstand vorhanden waren. Ein gereinigtes IgG4-Protein (Biodesign) diente als positive Kontrolle und wurde verwendet, um eine Standardkurve für die Antikörperkonzentration zu erstellen.
Die Klonselektion wurde durch einen Vergleich der Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten in Bezug auf die Zellanzahl durchgeführt. Kurz gesagt wurden die hochproduzierenden Klone mit Trypsin behandelt und gezählt. Unter Verwendung der berechneten Antikörperproduktionsgeschwindigkeit und der Anzahl der Zellen wurden Werte für μg Antikörper/10⁶ Zellen/24 Stunden bestimmt. Stärker produzierende Klone wurden auf 24 Wells/Platte amplifiziert und expandiert. Der selektierte Klone wurde 3D2 genannt.
Zur Grenzverdünnungsklonierung wurden die selektierten Klone in 10 % SSM reihenverdünnt, in 96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Klone mit hohen Werten für die Antikörperproduktion wurden amplifiziert und selektiert. Der Klon 3D2A9 wies 2,58 μg Antikörper/10⁶ Zellen/24 Stunden auf und wurde als bester Klon selektiert. Für diesen Klone wurde eine Analyse der Antikörperproduktion in einer statischen Kultur initiiert.
Statische Kulturen des 3D2A9-Klons wurden initiiert, indem eine Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml in 10 ml 10 % SSM-Medium in einem T25-Gewebekulturkolben zugesetzt wurden. Die Kolben wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ 21 Tage lang. oder bis 80 % der Zellen abgestorben waren, inkubiert. Dann wurde die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand wurde durch ELISA auf seine Antikörperproduktion getestet. Die maximale Antikörperproduktion des 3D2A9-Klons betrug 21 μg/ml. Dieser Produktionswert war 7-mal höher als der des ersten transfizierten Klons.
3. Dritte stabile Transfektion
Um den Antikörperproduktionswert der transfizierten Zellen weiter zu erhöhen, wurde der Klon 3D2A9 erneut mit einem Gemisch aus dem Anti-Human-TF-Megavektor pJAlgG4TF.A8 und pMACS cotransfiziert. Um diese Zelllinie zu cotransfizieren, wurden 800 μl einer Suspension von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von pJAlgG4TF.A8- und pMACS-DNA (50 μl 1 μg/ml Pvul-linearisiertes pJAlgG4TF.A8 und 5 μl 1 μg/ml supergeknäueltes pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, zu 10 ml 10 % SSM in einem T25-Kolben zugesetzt und 48 Stunden lang bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert, um die vorübergehende Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden die Zellen mit den Anti-CD4-Magnetkügelchen markiert und wie oben beschrieben auf einer Magnetsäule selektiert. CD4 exprimierende Zellen wurden in 200 ml 10 % SSM verdünnt, das mit G418 (1,5 mg/ml) ergänzt war. Dann wurde die Zellsuspension in einer 96-Well-Platte mit flachem Boden ausplattiert. Die Platten wurden etwa drei Wochen lang bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert.
Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) wurden wie oben beschrieben mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Fab) (Pierce) in R5 beschichtet. Um die Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten zu bestimmen, wurde Medium von retransfizierten Zellen 24 Stunden vor dem Test verändert. Fünf Mikroliter des Transfektanten-24-Stunden- Überstands wurden zu 95 μl 10 % FBS-PBS zugesetzt. Der verdünnte Überstand wurde den beschichteten Wells zugesetzt und 60 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Dann wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und ein Anti-Human-κ-Ketten-Antikörper-HRP (Southern Biotech) wurde verwendet, um wie oben beschrieben rekombinante Antikörper zu detektieren, die im Überstand vorhanden waren. Ein gereinigter chimärer Anti-TF-Antikörper diente als positive Kontrolle und wurde verwendet, um eine Standardkurve für die Antikörperkonzentration zu erstellen. Ergebnisse dieses Tests erlaubten die Selektion von stark Antikörper produzierenden Klonen, die dann auf eine 12-Well-Platte amplifiziert wurden. Diese Klone wurden bis zu 80 % des Wells gezüchtet, und 24-Stunden-Überstände wurden getestet. Eine 1:100-Verdünnung der 24-Stunden-Kulturüberstände wurde durch ELISA getestet.
Die Zellen wurden auch gezählt, und Antikörperproduktionswerte von μg/10⁶ Zellen/24 Stunden wurden bestimmt. Die stärksten Antikörper produzierenden Mutterklone A9B11 und A9F12 wurden basierend auf diesen Werten selektiert.
Selektierte Klone wurden in 10 % SSM reihenverdünnt, in 96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Klone mit einem hohen Antikörperproduktionswert wurden amplifiziert. Die primären Klone A9F12C2 und A9AllB5 wiesen die höchsten Werte mit einer Antikörperproduktionsgeschwindigkeit von 30 bis 40 μg/10⁶ Zellen/24 Stunden auf. Diese Klone wurden für statische Kulturen expandiert.
Statische Kulturen des A9F12C2-Klons wurden durch den Zusatz einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml in 10 ml 10 % SSM-Medium zu einem T25-Gewebekulturkolben initiiert. Die Kolben wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ 21 Tage lang oder bis 80 % der Zellen abgestorben waren inkubiert. Dann wurde die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand wurde durch ELISA auf seine Antikörperproduktion getestet. Die maximale Antikörperproduktion des A9F12C2-Klons betrug 52 μg/ml. Dieser Produktionswert war 2-mal höher als der des zweiten transfizierten Klons.
Der selektierte Klon A9F12C12 wurde in 10 % SSM reihenverdünnt, in 96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Der sekundäre Klon A9F12C2E7 wies die höchste Antikörperproduktionsgeschwindigkeit auf und wurde für statische Kulturen expandiert. Diese statischen Kulturen wurde wie oben beschrieben hergestellt.
Um die Antikörperkonzentration in den statischen Kulturüberständen zu bestimmen, wurden 5 μl A9F12C2E7-Zellüberstand zu 4,995 μl 10 % PBS zugesetzt. Dieser verdünnte Überstand wurde durch den oben beschriebenen Antikörper-ELISA auf den chimären Antikörper untersucht. Als positive Kontrolle wurde der gereinigte chimäre Anti-TF-Antikörper verwendet. Die Ergebnisse dieses Tests zeigten, dass der sekundäre Klon A9F12C2E7 in einer statischen Kultur einen maximalen Antikörperproduktionswert von 52,6 μg/ml aufwies.
Der selektierte Klon A9F12C2E7 wurde in 10 % SSM reihenverdünnt, in 96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Der tertiäre Klon A9F12C2E7B4 wurde als stärkster Produzent selektiert und wurde für eine statische Kultur expandiert. Diese Kulturen wurden wie oben beschrieben initiiert.
Um die Antikörperkonzentration in den statischen Kulturüberständen zu bestimmen, wurden 5 μl A0F12C2E7-Zellüberstand zu 4,995 μl 10 % PBS zugesetzt. Dieser verdünnte Überstand wurde durch den oben beschriebenen Antikörper-ELISA auf den chimären Antikörper untersucht. Als positive Kontrolle wurde der intern gereinigte chimäre Anti-TF-Antikörper verwendet. Die maximale Antikörperproduktion des Klons A9F12C2E7B4 betrug 102,3 μg/ml (2). Die Zelllinie wurde amplifiziert und eingefroren. Fünfzig Phiolen mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml wurden als anfängliche Impfzellbank hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Die Bezeichnung der Zelllinie ist cH36 (chimäres H36).
4. Bioreaktorinjektion
Ein Hohlfaserbioreaktor wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgebaut. Der selektierte Klon wurde bei 1 × 10⁸ Zellen/ml im korrekten Volumen von 30 % SSM resuspendiert und in den Bioreaktor injiziert. Dann wurde der Bioreaktor gemäß den Anweisungen des Herstellers betrieben. Die maximale Produktion wurde wie oben beschrieben durch ELISA bestimmt. Der erste primäre Transfektionsklon H0g12 erzeugte maximal 70 μg Antikörper/ml, während der dritte primäre Transfektionsklon A11B5 1.100 μg Antikörper/ml erzeugte (3).
Beispiel 2 – Herstellung von Zelllinien zur Produktion eines rekombinanten HLA-DR2-MHC-Moleküls der Klasse II
1. Vektorcharakterisierung
Ein Vektor, der als pDRHK (1B) bezeichnet wird, wurde zur Säugetierexpression eines löslichen einkettigen HLA-DR2/MBP-Moleküls, das an die menschliche konstante Immunglobulin-κ-Domäne fusioniert ist, hergestellt. Anfängliche Versuche zur vorübergehenden Transfektion wurden durchgeführt, um die Proteinexpression des pDRHK-Vektors zu testen. COS-Zellen wurden unter Verwendung des Qiagen-Lipofectin-Reagens vorübergehend transfiziert. Kurz gesagt wurden 2,5 × 10⁵ Zellen/Well in eine Platte mit 6 Wells gesät und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Zwei Mikrogramm pDRHK-DNA wurden mit 100 μl IMDM vermischt. Um den Lipid-Komplex herzustellen, wurden 10 μl Lipide zur DNA-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Während DNA den Lipid-Komplex bildete, wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Das DNA-Lipld-Gemisch wurde mit 600 μl 10 % SSM vermischt und zu den gewaschenen Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden 3 Stunden lang bei 37 °C und 10 % CO₂ mit Lipid-Komplexen inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, 2 ml 10 % SSM wur den zugesetzt und das Ganze wurde 72 Stunden lang bei 37 °C und 10 % CO₂ inkubiert. Der Kulturüberstand wurde auf seine Antikörperproduktion getestet.
2. ELISA zur Detektion von sc-DR2/MBP-Cκ-Produktion
Um die Gegenwart von sc-DRZ/MBP-C6 zu detektieren, wurde ein menschlicher 6/HLA-DR-spezifischer Sandwich-ELISA entwickelt. Kurz gesagt wurden Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-κ in PBS beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Wells wurden dann einmal mit R55-Puffer gewaschen, mit einer Plastikfolie bedeckt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Um die rekombinante Proteinproduktion zu testen, wurde der R55 entfernt, und 100 μl Transfektantenüberstand wurden zu den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen und 100 μl einer 1:1.000-Verdünnung (in PBS, das 10 % FBS enthielt) eines Anti-HLA-DR-Antikörpers L243, das an HRP konjugiert war (Anergen, ATCC HB-55), wurden zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37 °C inkubiert und 6-mal mit 400 μl R55-Puffer gewaschen. Um die Gegenwart des Sondenantikörpers zu detektieren, wurden 100 μl 1 × ABTS-Substrat für 5 Minuten zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer zugesetzt. Das Absorptionsvermögen wurde bei 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse solch eines Tests zeigten, dass das scDR2/MBP-Cκ-Fusionsprotein durch eine COS-Zelle produziert wurde, die vorübergehend mit dem pDRHK-Vektor transfiziert war.
3. Anfängliche stabile Transfektion
Um eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die das scDR2/MBP-Cκ-Fusionsprotein exprimiert, wurden CHO.K1-Zellen mit dem pDRHK-Vektor transfiziert. Kurz gesagt wurden 100 μg pDRHK-DNA durch 4-stündigen Verdau mit Pvul bei 37 °C linearisiert. CHO.K1-Zellen (ATCC CCL-61) wurden auf eine Konzentration von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml verdünnt. Ein Volumen von 800 μl Zellen wurde zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. 20 Mikrogramm pDRHK-DNA wurden zugesetzt, mit den Zellen vermischt und 10 Minuten lang inkubiert. Dann wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde die Zellsuspension zu einem T25-Kolben mit 10 ml 10 % SSM zugesetzt und über Nacht bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert. 24 Stunden später wurden die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-PBS geerntet, in PBS resuspendiert und 1:9, 1:27 und 1:81 in einem mit G418 ergänzten Medium verdünnt. 100 μl/Well der transfizierten Zellen wurden in 96-Weil-Patten plattiert und bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert.
Der Kulturüberstand von Zellen von verschiedenen 96-Well-Platten wurde wie oben beschrieben auf seine Antikörperproduktion getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert. Der Klon A5 der Reihe A der Säule 5 der 1:27-Platte wurde als starker Produzent selektiert. Diese Zelllinie wurde durch Grenzverdünnung, wie sie oben beschrieben wurde, subkloniert. Nach dem Screenen wurde der Klon A5B4 als stärkste Produktionszelllinie selektiert, und eine statische Kultur wurde initiiert.
Die selektierten Klone wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet, in einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/Well in 10 ml 10 % SSM-Medium resuspendiert und zu einem T25-Gewebekulturkolben zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ 21 Tage lang, oder bis 80 % der Zellen abgestorben waren, inkubiert. Die Zellsuspension wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde durch einen ELISA-Assay auf seine rekombinante DR2-Produktion getestet. Die rekombinante sc-DR2/MBP-C6-Fusionsproteinproduktion des A5B4-Klons war 20 ng/ml.
4. Stabile Retransfektion
Um dieses Verfahren fortzusetzen, wurde der Klon A5B4 mit einem Gemisch aus pDRHK und pMACS cotransfiziert. Ein Volumen von 800 μl einer Suspension von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml wurde zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von pDRHK- und pMACS-DNA (30 μl 1 μg/ml Pvul-linearisiertes pDRHK und 5 μl 1 μg/ml superge knäueltes pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, in einem T25-Kolben auf 10 ml 10 % SSM verdünnt und 72 Stunden lang bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert, um die vorübergehende Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden die Zellen mit 5 ml PBE bei Raumtemperatur behandelt, bis sie sich ablösten. Die Zellen wurden einmal gewaschen, in 380 μl PBE resuspendiert und mit 80 μl eines Antikörper markiert, der für das Zelloberflächen-exprimierte menschliche CD4-Molekül spezifisch war. Dieser Antikörper war kovalent an ein Magnetkügelchen gebunden. Nach einer 15- bis 20-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden die Antikörper-markierten Zellen auf eine Magnetsäule aufgetragen. Von transfizierten Zellen, die das CD4 auf ihrer Oberfläche exprimierten, wird erwartet, dass sie die Magnetsäule binden. Die untransfizierten Zellen wurden durch die Säule mit 1 ml PBE gewaschen. Die gebundenen Zellen wurden dann aus der Säule eluiert, indem die Säule von Magnetfeld entfernt wurde und 1 ml PBE durch die Säule geleitet wurde. CD4 exprimierende Zellen wurden in 199 ml 10 % SSM verdünnt, das mit G418 (1,5 mg/ml) ergänzt war, und in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden plattiert. Die Platten wurden bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert.
Nach 3 Wochen wurde der Überstand von verschiedenen 96-Well-Platen wie oben beschrieben auf rekombinantes Protein getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert. Der Klon DR2² wurde als stärkster Produzent selektiert. Diese Zelllinie wurde eingefroren.
Eine Phiole des DR2²-Klons wurde rasch in einem Wasserbad mit 37 °C aufgetaut und auf 95 % Lebensfähigkeit gezüchtet. Die Zellen wurden wie oben beschrieben zur Grenzverdünnungsklonierung reihenverdünnt. Nach drei Wochen Wachstum wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre sc-DR2-Cκ-Produktion getestet. Die Klone mit den höchsten Produktionswerten wurden amplifiziert und selektiert. Der Klon DR2²-H4 wurde als bester Produzent identifiziert. Statische Kulturen wurden wie oben beschrieben hergestellt, und die rekombinante Proteinproduktion des DR2²-H4-Klons betrug 100 ng/ml.
4. Dritte stabile Transfektion
Um die rekombinante Proteinproduktion weiter zu erhöhen, wurde der Klon DR2²-H4 erneut mit einem Gemisch aus pDRHK und pPUR (Clonetech), einem Vektor, der ein Gen trägt, das Resistenz gegenüber Puromycin verleiht, cotransfiziert. Kurz gesagt wurden 800 μl einer Suspension von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von pDRHK- und pMACS-DNA (25 μl 1 μg/ml Pvul-linearisiertes pDRHK und 5 μl 1 μg/ml supergeknäueltes pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, zu 10 ml 10 % SSM in einem T25-Kolben zugesetzt und 48 Stunden lang bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert. Dann wurden die Zellen durch Trypsinbehandlung geerntet, zentrifugiert und in 10 % SSM resuspendiert, das G418 (1,5 mg/ml) und Pyromycin (20 μg/ml) enthielt. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit flachem Boden plattiert und bei 37 °C in 10 % CO₂ inkubiert. Nachdem Kolonien aufgetreten waren, wurde das Kulturmedium auf rekombinante Proteine getestet. Die Klone A9 und B9 erwiesen sich als stärkste Produzenten und wurden wie oben beschriebenen in statischen Kulturen getestet. Die rekombinante Proteinproduktion in einer statischen Kultur betrug 1.800 ng/ml für A9 und 2.108 für B9 (4).
Diese Zelllinien wurden durch Grenzverdünnung subkloniert und auf ihre rekombinante Proteinproduktion getestet. Die primären Klone A9D5, A9G4, A9C7, B9H3, B9G4 und B9H5 wiesen scDR2/MBP-Cκ-Produktionsgeschwindigkeit von 200 bis 300 ng/ml in 24 Stunden auf. Die rekombinante Proteinproduktion dieser Klone in statischen Kulturen wurde wie oben beschrieben bestimmt.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zelllinie mit der Besonderheit einer erhöhten Expression einer Aminosäuresequenz, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Einführen von Wirtszellen in einen ersten Vektor, der eine erste selektierbare Sequenz umfasst, die operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist, b) Kultivierung der Wirtszellen unter Bedingungen, die der Selektion des ersten Vektors förderlich sind, c) Isolation von Zellen, welche die Aminosäuresequenz mit einer ersten Expressionsstärke exprimieren (erste stark exprimierende Zellen), d) Einführen eines zweiten für die Aminosäuresequenz kodierenden Vektors in die mit der ersten Expressionsstärke exprimierenden Zellen, e) Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer zweiten Expressionsstärke, die größer ist als die erste Expressionsstärke, förderlich sind; und f) Isolation der Zellen, welche die Aminosäuresequenz mit der zweiten Expressionsstärke exprimieren, um die Zelllinie herzustellen (zweite stark exprimierende Zellen), worin das Verfahren weiters die Auswahl zumindest eines vektorkodierten Zelloberflächenmarkers umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren außerdem Folgendes umfasst: g) Einführen eines dritten für die Aminosäuresequenz kodierenden Vektors in die Zellen, die mit der zweiten Expressionsstärke exprimieren, und Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer dritten Expressionsstärke, die größer ist als die zweite Expressionsstärke, förderlich sind; und h) Isolation der Zellen, welche die Aminosäuresequenz mit der dritten Expressionsstärke exprimieren, um die Zelllinie herzustellen (dritte stark exprimierende Zellen).
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Verfahren außerdem die Einführung eines für die Aminosäuresequenz kodierenden Vektors in die dritten stark exprimierenden Zellen, das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit größerer Stärke als die dritte Expressionsstärke förderlich sind, und die zumindest einmalige Wiederholung der Einführungs- und Aussetzungsschritte umfasst, um eine Zelllinie zu isolieren, welche die Aminosäuresequenz stärker exprimiert als die dritten stark exprimierenden Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt b) des Verfahrens außerdem das Züchten der Zellen in selektiven Medien umfasst, die zumindest ein für die erste selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel enthalten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt d) des Verfahrens außerdem die Einführung eines vierten Vektors in die Zellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen umfasst, die der Expression der Aminosäuresequenz mit der zweiten Expressionsstärke förderlich sind.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der vierte Vektor außerdem eine zweite selektierbare Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, worin der vierte Vektor außerdem eine zweite selektierbare Sequenz umfasst, die operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 6, worin das Verfahren außerdem das Züchten der Zellen in selektiven Medien umfasst, die zumindest ein für die zweite selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel umfassen.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der vierte Vektor außerdem eine für einen selektierbaren Zelloberflächenmarker kodierende Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der selektierbare Zelloberflächenmarker operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin das Verfahren außerdem das Isolieren der den Zelloberflächenmarker exprimierenden Zellen durch zumindest eines von Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, worin Schritt g) des Verfahrens außerdem die Einführung eines fünften Vektors in die Zellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen umfasst, die der Expression der Aminosäuresequenz mit der dritten Expressionsstärke förderlich sind.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der fünfte Vektor außerdem eine dritte selektierbare Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die dritte selektierbare Sequenz operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das Verfahren außerdem das Züchten der Zellen in selektiven Medien umfasst, die zumindest ein für eine dritte selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel enthaften.
Verfahren nach Anspruch 12, worin der fünfte Vektor außerdem eine für einen selektierbaren Zelloberflächenmarker kodierende Sequenz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der selektierbare Zelloberflächenmarker operabel mit einem für die Aminosäuresequenz kodierenden Segment verbunden ist.
Verfahren nach Anspruch 16, worin das Verfahren außerdem das Isolieren der den Zelloberflächenmarker exprimierenden Zellen durch zumindest eines von Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die zweiten stark exprimierenden Zellen bei Bestimmung durch Antikörperreaktivität im Vergleich zu den ersten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache der Aminosäuresequenz exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die dritten stark exprimierenden Zellen bei Bestimmung durch Antikörperreaktivität im Vergleich zu den zweiten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache der Aminosäuresequenz exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz für eine schwere bis leichte Immunglobulinkette oder ein funktionelles Fragment davon kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die einzelnen Vektoren unabhängig voneinander für ein erstes Arzneimittelresistenzgen, einen Zelloberflächenmarker oder ein zweites Arzneimittelresistenzgen kodieren und die einzelnen Vektoren operabel mit der Aminosäuresequenz verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der selektierbare Zelloberflächenmarker ein Zelloberflächenrezeptor, Glykoprotein, Kohlenhydrat, Protein, Lipoprotein, Haupthistokompatibilitäts- (MHC/HLA) Komplex, Antikörper, Antigen oder funktionelles Fragment davon ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin der selektierbare Zelloberflächenmarker ein CD- („cluster of differentiation" – Oberflächenmoleküle humaner Lymphozyten) Glykoprotein ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das Arzneimittel ein Aminoglykosidantibiotikum (G418), Hygromycin B(hmb), Puromycin oder Neomycin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest einer der ersten und zweiten Vektoren etwa 2- bis etwa 20-mal in die Zellen eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der dritte Vektor 2- bis 10-mal in die Zellen eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Zelloberflächenmarker zumindest durch einen der ersten und zweiten Vektoren kodiert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der dritte Vektor außerdem eine Sequenz umfasst, die für den selektierbaren Zelloberflächenmarker kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz für eine Immunglobulinschwerkette, eine Immunglobulinleichtkette oder ein funktionelles Fragment davon kodiert.