-
1. Gebiet
der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Herstellung
von rekombinanten Zellen, die zumindest eine Aminosäuresequenz
exprimieren. Die Erfindung weist eine Reihe von nützlichen
Anwendungsmöglichkeiten
auf, einschließlich
ihrer Verwendung bei der Herstellung von rekombinanten Säugetierzellen,
die stabil sind und ein gewünschtes Protein
in großen
Mengen exprimieren.
-
2. Hintergrund
der Erfindung
-
Zahlreiche
Versuche wurden unternommen, große Mengen einer gewünschten
Aminosäuresequenz
zu produzieren, indem eine fremde (heterologe) Nucleinsäure in Wirtszellen
eingeführt
und diese Nucleinsäure
dann innerhalb der Zellen exprimiert wurde. Eukaryotische Zellen
und insbesondere Säugetierzellen
wurden mit unterschiedlichen Ergebnissen eingesetzt. Beispielsweise
exprimieren trotz großer
Anstrengungen, die Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzellen,
welche die Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren,
zu verbessern, die meisten Zellen die Nucleinsäure nicht in ausreichendem
Ausmaß.
Somit besteht auf dem Gebiet der Erfindung Bedarf an Verfahren zur Produktion
von rekombinanten Säugetierzellen,
welche die eingeführte
Nucleinsäure
in großen
Mengen exprimieren.
-
Im
Allgemeinen wurden zwei Verfahren verwendet, um die Expression von
heterologer Nucleinsäure
in Säugetierzellen
zu erhöhen.
Ein Ansatz basiert auf der Amplifikation der Nucleinsäure-Kopienzahl
durch Zellselektionsverfahren, wie beispielsweise der Erhöhung der
Arzneimittelresistenz. Ein weiterer Ansatz basiert auf der Steigerung
der Expression der Nucleinsäure
in den Zellen, indem beispielsweise ein oder mehrere vorteilhafte
Kontrollelemente dieser Nucleinsäure
hinzugefügt
werden. Für
allgemeine Informationen siehe Kaufman, R.J., und P.A. Sharp, J. Mol.
Biol. 159, 601 (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. Ausg.
(1989) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons,
New York (1989).
-
Wie
berichtet wurde, umfasst die Erhöhung der
Arzneimittelresistenz eine Zelltransformation mit zwei Genen, von
denen eines für
eine Aminosäuresequenz
von Interesse kodiert, wie beispielsweise ein heterologes Protein,
und das andere für
einen selektierbaren Genmarker kodiert, wie beispielsweise Dihydrofolatreductase
(DHFR). In Fällen,
in denen Der Genmarker DHFR ist, werden transformierte Zellen in
Gegenwart des selektionierenden Arzneimittels Methotrexat (MTX)
kultiviert. Die normalerweise zytotoxische Wirkung von MTX wird
durch die Expression von DHFR im Wesentlichen eliminiert. Transformierte Zellen überleben,
weil sie eine ausreichend erhöhte (amplifizierte)
DHFR-Kopienzahl aufweisen. Eine Nucleinsäuresequenz, die für die Aminosäuresequenz
kodiert, wird ebenfalls amplifiziert, wodurch die Expression dieser
Sequenz verstärkt
wird. Siehe beispielsweise Kaufman, R.J., und P.A. Sharp, s.o.
-
Die
Erhöhung
der Arzneimittelresistenz und ähnliche
Verfahren erwiesen sich jedoch als nachteilig. Die Produktion der
meisten rekombinanten Säugetierzelllinien
ist bei Anwendung dieses Verfahrens zeitaufwändig und kann einige Monate
in Anspruch nehmen. Außerdem
wurde erkannt, dass, wenn die heterologe Nucleinsäure amplifiziert
wird, herkömmliche
Nucleinsäure-Sequenzierungsverfahren
negative Auswirkungen haben können.
Weiters kann es ziemlich schwierig sein, eine ausreichend hohe Nucleinsäure-Kopienzahl
aufrechtzuerhalten, ohne starken und mitunter langfristigen Selektionsdruck
auszuüben.
Eine Zellselektionsstrategie, die auf höheren Selektionsdruck abzielt,
kann teuer sein und rechtliche Probleme mit sich bringen, wie beispielsweise, wenn
ein heterologes Protein für
pharmazeutische Zwecke produziert wird.
-
Darüber hinaus
reicht die Erhöhung
der Arzneimittelresistenz möglicherweise
nicht aus, um die Expression von spezifischen heterologen Nucleinsäuren auf
Werte zu erhöhen,
die für
Anwendungen, wie beispielsweise gewerbliche Zwecke oder Forschungszwecke,
ausreichen.
-
Weitere
Probleme der Erhöhung
der Arzneimittelresistenz umfassen die genetische Instabilität von klonierten
Zelllinien. Diese Probleme sind sehr schwer wiegend. Beispielsweise
liefert das Verfahren oft rekombinante Zellen, die sich aus instabilen
Genamplifikationsereignissen entwickeln, beispielsweise der Bildung
von Double-Minute-Chromosomen. Diese
Zellen können
gewünschte
Eigenschaften verlieren, wenn das Selektionsarzneimittel entfernt
wird. Siehe Kaufmann, R.J., et al., Mol. Cell. Biol. 5, 1750 (1985),
und darin angeführten
Literaturverweise.
-
Die
optimale Umsetzung der meisten Verfahren zur Erhöhung der Arzneimittelresistenz
hat außerdem
den Einsatz hochspezialisierter Zellen, Vektoren und/oder Zellwachstumsbedingungen
erfordert. Die meisten Verfahren verwenden beispielsweise Wirtszellen,
die auf eine bestimmte Weise genetische verändert wurden. Solche Zellmutanten
sind für manche
Anwendungen eventuell nicht geeignet. Als Beispiel für die Schwierigkeiten
kann angeführt
werden, dass die Erhöhung
der Arzneimittelresistenz unter Verwendung von DHFR und MTX in Zellen
nicht optimal funktioniert, die ein normales DHFR-Gen aufweisen.
Eine Inaktivierung des normalen Gens kann ein langwieriges und aufwändiges Verfahren
sein. Siehe beispielsweise Wigler et al., PNAS (USA), 3567 (1980);
und Urlaub und Chasin, PNAS (USA) 77, 4216 (1980).
-
In
Bezug auf die Verwendung von spezifischen Vektoren und Wachstumsbedingungen
wurden auch spezifischere Nachteile von DHFR/MTX-Erhöhungsverfahren
geoffenbart. Siehe beispielsweise Kaufman und Sharp, s.o.; Schminke, R.,
Cell 37, 705 (1984). Siehe auch die US-Patente Nr. 5.686.263; 4.956.288
und 5.585.237 und die darin angeführten Literaturverweise.
-
Es
wäre nützlich,
Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Zellen, die flexibel
sind und zur Produktion von genetisch stabilen rekombinanten Zelllinien
verwendet werden können,
zur Verfügung zu
haben. Besonders wünschenswert
wären Verfahren
zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien, welche die
Verwendung von hochspezialisierten Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen
bedeutend verringern oder vermeiden. Weiters wären durch diese Verfahren hergestellte rekombinante
Säugetierzelllinien
wünschenswert,
die eine Aminosäuresequenz
von Interesse, wie z.B. ein heterologes Protein, in großer Menge
produzieren.
-
ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von rekombinanten
Zellen und insbesondere Verfahren zur Herstellung von rekombinanten
Zelllinien, die genetisch stabil sind und zumindest eine gewünschte Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren.
In einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von
rekombinanten Zelllinien bereit, die ein heterologes Protein in
hohem Ausmaß exprimieren.
Die Verfahren umfassen im Allgemeinen das Einführen zumindest eines Vektors, der
für die
Aminosäuresequenz
kodiert, in Wirtszellen und das Aussetzen der Zellen gegenüber Bedingungen,
die der Isolierung der rekombinanten Zelllinien, welche die Sequenz
in hohem Ausmaß produzieren,
förderlich
sind. Bevorzugte Verfahren produzieren die Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß und verringern
gleichzeitig die Verwendung von hochspezialisierten Wirtszellen,
Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen bedeutend. Außerdem werden
rekombinante Säugetierzelllinien
bereitgestellt, die durch die Verfahren dieser Erfindung hergestellt
werden.
-
Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung
von rekombinanten Säugetierzelllinien,
die genetisch stabil sind und zumindest eine Aminosäuresequenz
von Interesse in hohem Ausmaß exprimieren.
In einer Ausführungsform
wird die Expression der Aminosäuresequenz
im Wesentlichen durch die Einführung
eines ersten Vektors, der für
die Sequenz kodiert, in Wirtszellen erhöht. Der erste Vektor umfasst
zumindest eine selektierbare Sequenz, typischerweise eine erste
selektierbare Sequenz, die operabel mit einem für die Aminosäuresequenz
kodierenden Segment verbunden ist. Darüber hinaus kann der erste Vektor
für mehr
als eine Kopie der Aminosäuresequenz
kodieren. Der erste Vektor kann einmal oder mehrfach in die Wirtszellen
eingeführt
werden. Die Wirtszellen werden dann unter Bedingungen kultiviert,
die der Expression der Aminosäuresequenz
förderlich
sind, gefolgt von einer Isolierung von rekombinanten Zelllinien (erste
stark exprimierende Zellen), welche die Aminosäuresequenz mit einer ersten
Expressionsstärke
exprimieren.
-
Weiters
umfasst das Verfahren das Einführen
eines zweiten für
die Aminosäuresequenz
kodierenden Vektors, vorzugsweise in die ersten stark exprimierenden
Zellen. Der zweite Vektor kann der gleiche sein wie der erste Vektor
oder sich von diesem unterschieden und kann, falls erforderlich,
für mehr als
eine Kopie der Aminosäuresequenz
kodieren. Der zweite Vektor wird, je nach Bedarf, einmal oder mehrmals
in die ersten stark exprimierenden Zellen eingeführt. Rekombinante Zellen, die
den zweiten Vektor umfassen, werden dann unter Bedingungen kultiviert,
die der Expression der Aminosäuresequenz
förderlich
sind. Dann werden Zellen isoliert, welche die Aminosäuresequenz
in einem zweiten hohen Ausmaß exprimieren
(zweite stark exprimierende Zellen).
-
Wie
erwähnt
wurde erkannt, dass Zelllinien, die durch Zellselektionsmodelle
hergestellt wurden, und insbesondere Verfahren zur Erhöhung der
Arzneimittelresistenz nach dem Stand der Technik Nacheile aufweisen.
Spezifische Nachteile umfassen die genetische Instabilität und die
Notwendigkeit, hochspezialisierte Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen
zu verwenden. Die vorliegenden Verfahren vermeiden diese Nachteile
im Wesentlichen, indem genetisch stabile Zelllinien bereitgestellt
werden, welche die Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß produzieren.
Darüber
hinaus sind die vorliegenden Verfahren im Allgemeinen flexibler
als die Modelle nach dem Stand der Technik und mit verschiedensten
Vektoren kompatibel. Nahezu jede transfizierbare Zelle kann in den
vorliegenden Verfahren verwendet werden, einschließlich der
meisten primären,
sekundären
oder kultivierten Säugetierzellen.
Geeigneterweise stellen die vorliegenden Verfahren die Züchtung einer
spezifischen transfizierbaren Säugetierzelle
unter verschiedensten selektiven oder nichtselektiven Wachstumsbedingungen
bereit.
-
Durch
die Verfahren der Erfindung hergestellte Zelllinien werden indirekt
durch die Selektion zumindest eines durch einen Vektor kodierten
Zelloberflächenmarkers
selektiert. Die Selektion des Zelloberflächenmarkers gemäß der Erfindung
vereinfacht die effiziente Isolierung der Zelllinien, welche die
Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren.
Wie erwähnt
sind die resultierenden Zelllinien genetisch stabil und können unter
gleichzeitiger Minimierung oder Umgehung der Verwendung von hochspezialisierten
Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen produziert werden.
-
In
einer spezifischen Ausführungsform
der Erfindung ist das zweite hohe Expressionsausmaß im Wesentlichen
zumindest 2- bis 10-mal oder mehr größer als das erste hohe Expressionsausmaß. Verfahren
zur Bestimmung der Werte von Aminosäuresequenzen, wie beispielsweise
Proteinen, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen
bestimmten Verfahren, wie beispielsweise Antikörperreaktivität.
-
In
einer spezifischeren Ausführungsform
umfasst das Verfahren außerdem
das Einführen
eines dritten Vektors, der für
die Aminosäuresequenz
kodiert, in die zweiten stark exprimierenden Zellen und das Aussetzen
der Zellen gegenüber
Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer dritten
Expressionsstärke,
die größer ist
als die zweite Expressionsstärke,
förderlich
sind. Zellen, welche die Aminosäuresequenz
mit der dritten Expressionsstärke
exprimieren, werden dann isoliert, um die Zelllinie (dritte stark
exprimierende Zellen) zu isolieren. Der dritte Vektor kodiert vorzugsweise
für zumindest eine
Aminosäuresequenz
von Interesse und kann gleich oder unterschiedlich sein wie der
erste oder zweite Vektor (oder beide Vektoren). Der dritte Vektor kann,
je nach Bedarf, einmal oder mehrmals in die zweiten stark exprimierenden
Zellen eingeführt
werden. Die dritten stark exprimierenden Zellen weisen typischerweise
im Vergleich zu den ersten oder zweiten stark exprimierenden Zellen
erhöhte
Expression der Aminosäuresequenz
auf.
-
In
einer weiteren spezifischen Ausführungsform
umfasst das Verfahren außerdem
die Einführung
zumindest eines für
die Aminosäuresequenz
kodierenden Vektors, vorzugsweise eines solcher Vektoren, in die
dritten stark exprimierenden Zellen und das Aussetzen der Zellen
gegenüber
Bedingungen, die der Expression der Aminosäuresequenz mit größerer Stärke als
die dritte Expressionsstärke
förderlich
sind. Weiters umfasst das Verfahren eine zumindest einmalige Wiederholung
der Einführungs-
und Aussetzungsschritte, um eine Zelllinie zu isolieren, welche
die Aminosäuresequenz
stärker
exprimiert als die dritten stark exprimierenden Zellen. Die Entscheidung,
wie oft die Schritte wiederholt werden, wird basierend auf verschiedenen
Parametern getroffen, insbesondere jedoch anhand der erforderlichen
Expressionsstärke.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst der Schritt des Kultivierens der Wirtszellen unter Bedingungen,
die der Selektion des ersten Vektors förderlich sind, außerdem das
Züchten
der Wirtszellen in selektiven Medien. Vorzugsweise umfassen die selektiven
Medien zumindest ein Arzneimittel und üblicherweise ein für die erste
selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel. Es gilt anzumerken,
dass hierin geoffenbarte Vektoren, die eine selektierbare Nucleinsäuresequenz
umfassen, z.B. der erste und der vierte Vektor, üblicherweise für eine Aminosäuresequenz
kodieren, die selektierbar ist. Veranschaulichende Arzneimittel
zur Selektion der Vektoren sind in der nachstehenden Erläuterung
und den Beispielen beschrieben.
-
Häufig wird
der zweite oder dritte Vektor (oder beide Vektoren) gemeinsam mit
zumindest einem anderen Vektor (hierin manchmal als "vierter" oder "fünfter" Vektor bezeichnet) in Zellen eingeführt, wobei
der Vektor für
zumindest eine selektierbare Sequenz und insbesondere einen selektierbaren
Zelloberflächenmarker,
wie beispielsweise ein Zelloberflächenprotein, kodiert. Überraschenderweise
wurde herausgefunden, dass es durch die gleichzeitige Einführung des
Vektors, der für
den selektierbaren Zelloberflächenmarker
kodiert, möglich
ist, die Produktion von äußerst nützlichen
rekombinanten Säugetierzelllinien
zu vereinfachen, welche die gewünschte
Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren. Beispielsweise
zeigte sich, dass es durch die gleichzeitige Einführung des
Vektors gemäß der Erfindung möglich ist,
Zelllinien herzustellen, während
gleichzeitig die Notwendigkeit, hochspezialisierte Zellen, Vektoren
und/oder Wachstumsbedingungen zu verwenden, verringert oder aufgehoben
wird. Außerdem wird
durch die Umsetzung der Verfahren die Produktion von genetisch stabilen
rekombinanten Zellen gefördert.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Schritt des Einführens des zweiten Vektors in
die ersten stark exprimierenden Zellen außerdem die Einführung eines
vierten Vektors in die Zellen. Wie erwähnt kodiert der vierte Vektor
für zumindest
eine selektierbare Sequenz (hierin im Folgenden als "zweite" selektierbare Sequenz)
bezeichnet, vorzugsweise einen selektierbaren Zelloberflächenmarker.
Der vierte Vektor kann gleich sein wie ein anderer Vektor des Verfahrens,
obwohl sich in den meisten Fällen
der vierte Vektor von einem oder allen dieser Vektoren unterscheidet.
In einer weiteren Ausführungsform
umfasst der vierte Vektor eine zweite selektierbare Sequenz, die
operabel mit einem für
die Aminosäuresequenz
kodierenden Segment verbunden ist. In einer spezifischeren Ausführungsform
umfasst das Verfahren außerdem
das Züchten
der Zellen in selektiven Medien, die zumindest ein für die zweite
selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel umfassen.
-
In
Ausführungsformen,
in denen der vierte Vektor für
den Zelloberflächenmarker
kodiert, umfasst das Verfahren vorzugsweise außerdem das Isolieren der den
Zelloberflächenmarker
exprimierenden Zellen durch zumindest eines von Chromatographie, Zell-Panning,
Durchflusszytometrie, Immunfällung oder
Antikörperbindung. Üblicherweise
wird eines dieser Verfahren eingesetzt, um die den Zelloberflächenmarker
exprimierenden Zellen zu isolieren. Durch die Durchführung der
Isolierung werden Zelllinien erhalten, welche die durch die Vektoren
kodierte Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren.
-
In
einer weiteren Ausführungsform
des Verfahren umfasst der Schritt des Einführens des dritten Vektors in
die zweiten stark exprimierenden Zellen außerdem die Einführung eines
fünften
Vektors in die Zellen. In einer spezifischen Ausführungsform
ko diert der fünfte
Vektor für
zumindest eine selektierbare Sequenz (hierin im Folgenden als "dritte" selektierbare Sequenz
bezeichnet). Der fünfte
Vektor kann gleich oder unterschiedlich sein wie die hierin geoffenbarten Vektoren.
In einer spezifischeren Ausführungsform umfasst
der fünfte
Vektor eine dritte selektierbare Sequenz, die, falls gewünscht, operabel
mit einem für die
Aminosäuresequenz
kodierenden Segment verbunden sein kann. Die Zellen werden dann
Bedingungen ausgesetzt, die der Expression der Aminosäuresequenz
mit einer dritten Expressionsstärke, die
größer ist
als die zweite Expressionsstärke,
förderlich
sind. Vorzugsweise umfasst das Verfahren außerdem das Züchten der
Zellen in selektiven Medien, die zumindest ein Arzneimittel und
vorzugsweise ein für
die zweite selektierbare Sequenz selektives Arzneimittel umfassen.
-
Ein
weiterer bevorzugter fünfter
Vektor umfasst außerdem
eine Sequenz, die für
einen selektierbaren Zelloberflächenmarker
kodiert, der gleich oder unterschiedlich sein kann wie der durch
den vierten Vektor kodierten Zelloberflächenmarker. Falls gewünscht kann
der Zelloberflächenmarker
operabel mit einem für
die Aminosäuresequenz
kodierenden Segment verbunden sein. Das Verfahren umfasst, falls
erforderlich, außerdem
vorzugsweise den Schritt des Isolierens der Zellen, die den Zelloberflächenmarker
exprimieren, für
den der fünfte
Vektor kodiert, und die Verwendung zumindest eines von Chromatographie,
Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder Antikörperbindung,
um Zellen zu isolieren, die den Zelloberflächenmarker exprimieren, der durch
den vierten oder fünften
Vektor (oder beide Vektoren) exprimiert wird. Durch die Durchführung der
Isolierung werden Zelllinien erhalten, welche die durch die Vektoren
kodierte Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren.
-
Genauer
gesagt exprimieren zweite stark exprimierende Zellen gemäß vorliegender
Erfindung im Vergleich zu ersten stark exprimierenden Zellen zumindest
etwa das 2fache der Aminosäuresequenz, wie
durch herkömmliche
Proteinquantifizierungsverfahren, wie beispielsweise quantitative
Gelelektrophorese, Chromatographie und immunologische Verfahren,
wie z.B. Western-Immunoblot, ELISA und Antikörperreakti vität, gezeigt
wird. Genauer gesagt exprimieren zweite stark exprimierenden Zellen
bei Bestimmung durch Antikörperreaktivität im Vergleich
zu ersten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache
der Aminosäuresequenz.
-
Dritte
stark exprimierende Zellen von besonderen Interesse exprimieren
im Allgemeinen etwa 2-mal mehr der Aminosäuresequenz als die zweiten stark
exprimierenden Zellen, wie durch die herkömmlichen Proteinsequenz-Quantifizierungsverfahren
gezeigt wird. Genauer gesagt exprimieren dritte stark exprimierende
Zellen bei Bestimmung mittels Antikörperreaktivität im Vergleich
zu zweiten stark exprimierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache
der Aminosäuresequenz.
-
In
einer spezifischeren Ausführungsform
der Verfahren kodierten der erste, zweite und dritte Vektor unabhängig voneinander
für ein
erstes Arzneimittelresistenzgen (hierin manchmal als Genmarker bezeichnet),
einen selektierbaren Zelloberflächenmarker
oder ein zweites Arzneimittelresistenzgen. In dieser Ausführungsform
ist jeder der Vektoren operabel mit einem für die Aminosäuresequenz
von Interesse kodierenden Segment verbunden. Außerdem können der vierte und fünfte Vektor
unabhängig
voneinander für
ein drittes Arzneimittelresistenzgen und einen weiteren Zelloberflächenmarker
kodieren. Das erste, zweite und dritte Arzneimittelresistenzgen
und selektierbare Zelloberflächenmarker
werden nachstehend näher
beschrieben.
-
Zur
Veranschaulichung der Erfindung wurde eine geeignete Säugetierwirtszelle
gewählt,
die keine hochspezialisierten Vektoren oder Wachstumsbedingungen
erfordert, um ein heterologes Protein optimal zu exprimieren. Bevorzugte
Säugetierwirtszellen
exprimieren das heterologe Protein in detektierbarem Ausmaß. In manchen
Fällen
können
jedoch geeignete Säugetierwirtszellen
das Protein schon als homologes Protein, z.B. in Hintergrundkonzentrationen (Grundniveau),
exprimieren. In diesem Fall kann die Erfindung angewandt werden,
um die Expression des homologen Proteins auf Werte zu verstärken, die höher sind
als die Grundniveaus. Alternativ dazu können die vorliegenden Verfahren
verwendet werden, um die Zellexpression ei nes gewünschten
heterologen Proteins oder einer gewünschten Polypeptidsequenz zu
verstärken.
Spezifischere Beispiele für Säugetierwirtszellen
sind nachstehend angeführt.
-
Nach
der Einführung
des ersten Vektors in die Säugetierwirtszellen
werden die ersten stark exprimierenden Zellen in einem Wachstumsmedium isoliert,
das im Allgemeinen für
den ersten Vektor selektiv ist. Zweite stark exprimierende Zellen
werden durch Einführung
des zweiten Vektors, der für
die Aminosäuresequenz
kodiert, in die ersten stark exprimierenden Zellen produziert. In
einer Ausführungsform
kodieren der erste und zweite Vektor für eine Kopie eines heterologen
Proteins und sind im Wesentlichen gleich. Die Einführung des
zweiten Vektors wird durch die Einführung eines weiteren ("vierten") Vektors begleitet,
der für
den selektierbaren Zelloberflächenmarker
kodiert. Die Isolierung der zweiten stark exprimierenden Zellen
wird unter Bedingungen durchgeführt,
die der Selektion des Zelloberflächenmarkers
förderlich
sind und gegebenenfalls das Züchten
in einem selektiven Medium umfassen können. In dieser Ausführungsform
wird durch die Selektion des Zelloberflächenmarkers auch eine starke Coexpression
der gewünschten
Aminosäuresequenz selektiert,
für die
der erste und zweite Vektor kodieren. Die Verwendung von hochspezialisierten
Wirtszellen, Vektoren und Wachstumsmedium zur Selektion der Zellen
wird in diesem Beispiel signifikant verringert.
-
Die
vorliegende Erfindung kann angewandt werden, um ein weites Spektrum
rekombinanter Zellen und vor allem Säugetierzelllinien herzustellen,
die zumindest eine gewünschte
Aminosäuresequenz von
Interesse oder einen Abschnitt dieser Aminosäuresequenz, wie z.B. ein funktionelles
Proteinfragment, stark exprimieren. Verfahren der Erfindung können beispielsweise
verwendet werden, um Aminosäuresequenzen
von immunologischem Interesse, wie beispielsweise eine Immunglobulinkette
(schwer oder leicht) oder funktionelle Fragmente davon, zu exprimieren.
Spezifischere Aminosäuresequenzen von
Interesse sind nachstehend erläutert.
-
Die
vorliegende Erfindung bringt im Vergleich zu Zellselektionsverfahren
nach dem Stand der Technik und insbesondere herkömmlichen Verfahren zur Erhöhung der
Arzneimittelresistenz bedeutende Vorteile mit sich. Wie erläutert erfordert
die Durchführung
der meisten Verfahren zur Erhöhung der
Arzneimittelresistenz im Allgemeinen die Verwendung hochspezialisierter
Zelllinien, Vektoren und Wachstumsbedingungen. In den meisten Fällen wurden
die Zellen genetisch verändert,
um die Resistenz gegenüber
einem Arzneimittel zu blockieren, und sie weisen nicht immer gute
Wachstumseigenschaften auf. Außerdem
sind solche Zellen eventuell schwer herzustellen und/oder zu erhalten,
und sie können
für viele
spezifische Zellselektionsstrategien ungeeignet sein. Die vorliegende
Erfindung beschäftigt
sich mit diesen Mängeln,
indem sie Verfahren zur Erzeugung von rekombinanten Zelllinien bereitstellt,
welche die Verwendung dieser hochspezialisierten Zelllinien verringern
oder vermeiden.
-
Darüber hinaus
maximieren die vorliegenden Verfahren die genetische Stabilität von resultierenden
rekombinanten Zelllinien, indem heterologe Nucleinsäuren in
das Wirtszellengenom eingeführt
werden. Die Bildung von äußerst instabilen
Chromosomformationen wird verringert und häufig sogar ganz vermieden.
-
Diese
Erfindung weist noch weitere Vorteile auf. Beispielsweise sind die
vorliegenden Verfahren im Wesentlichen viel flexibler als Verfahren
zur Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien nach dem
Stand der Technik und können
mit verschiedensten Säugetierexpressionsvektoren
verwendet werden. Im Gegensatz dazu sind die meisten Zellselektionsverfahren
nach dem Stand der Technik, wie beispielsweise die Erhöhung der
Arzneimittelresistenz, auf die Verwendung von hochspezialisierten Vektoren
zugeschnitten. Ein anerkannter Aspekt des Problems ist, dass die
Vektoren für
viele Verfahren zur Erhöhung
der Arzneimittelresistenz zu groß geworden und schwer zu manipulieren
sind. Außerdem sind
viele optimale Vektoren zur Verwendung in herkömmlichen Zellselektionsschemen
geschützt
und stehen nicht immer zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung löst
dieses Problem, beispielsweise indem sie für Kompatibilität mit verschiedensten
Säugetierexpressionsvektoren
sorgt.
-
Wie
erwähnt
kann zumindest einer der hierin beschriebenen Vektoren für einen
Abschnitt der Aminosäuresequenz
von Interesse kodieren. Der erste Vektor (oder einer der Vektoren)
kann für
das Protein voller Länge
kodieren, und zumindest einer der anderen Vektoren, z.B. der zweite,
dritte oder vierte Vektor, können
für einen
spezifischen Abschnitt des Proteins kodieren. Die restlichen Vektoren
können
verwendet werden, um beispielsweise weitere Abschnitte der Proteinsequenz
oder, falls gewünscht,
sogar die Proteinsequenz voller Länge einzuführen.
-
Die
Möglichkeit
der vorliegenden Verfahren, Abschnitte einer Aminosäuresequenz
von Interesse einzuführen,
bringt Vorteile mit sich. Beispielsweise können die Verfahren angewandt
werden, um eine stark kontrollierte Amplifikation eines oder mehrerer Abschnitte
der Aminosäuresequenz
durchzuführen. Das
heißt,
spezifische Abschnitte der Aminosäuresequenz, einschließlich der
gesamten Sequenz, können
in spezifischen Zellen (z.B. erste oder zweite stark exprimierende
Zellen) amplifiziert werden, und zwar vor oder gleichzeitig mit
der Amplifizierung einer weiteren Sequenz. Die Erfindung ermöglicht somit die
aufeinanderfolgende und abgestimmte Expression einer oder mehrerer
Aminosäuresequenzen
von Interesse.
-
Spezifische
Verfahren dieser Erfindung bringen weitere Vorteile mit sich. Beispielsweise
können die
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Säugetierzelllinien (manchmal
als "hochproduzierende
Zelllinien" oder ähnlich bezeichnet)
in bedeutend kürzerer
Zeit durchgeführt
werden als andere Zellselektionsverfahren, einschließlich der
meisten Verfahren zur Erhöhung
der Arzneimittelresistenz nach dem Stand der Technik. Außerdem ergeben
die Verfahren hochproduzierende Zelllinien bei Verwendung von weniger
Zellpassagen als bei den meisten Verfahren nach dem Stand der Technik,
wodurch die Labor- und Medienkosten verringert werden.
-
Die
folgenden nicht einschränkenden
Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
-
KURZBESCHREIBUNG
DER ABBILDUNGEN
-
Die 1A und 1B zeigen
veranschaulichende Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
(1A) Der Vektor pJAIgG4TF kodiert für schwere
und leichte chimäre
Anti-Gewebefaktor- (-TF-) Immunglobulinketten. (1B)
Der Vektor pDRHK kodiert für
ein einkettiges HLA-DR2/MBP-Molekül, das an eine konstante menschliche
Immunglobulin-κ-Domäne fusioniert
ist.
-
2 ist
ein Diagramm, das die hohe Produktion eines rekombinanten chimären Anti-TF-Antikörpers in
statischen T25-Flaschenkulturen. Rekombinante Zelllinien, die den
Anti-TF-Antikörper
in hohem Ausmaß produzieren,
wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert.
Hochproduzierende rekombinanten Zelllinien wurden mit H9G12, 3D2A9
und A11B5 bezeichnet.
-
3 ist
ein Diagramm, das die hohe Produktion eines rekombinanten Anti-TF
in einem Bioreaktor zeigt. Rekombinante Zelllinien, die den Anti-TF-Antikörper in
hohem Ausmaß produzieren,
wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert.
Hochproduzierende rekombinanten Zelllinien wurden als Linien, die
nach der ersten und dritten Transfektion isoliert wurden, mit H9G12
und A11B5 bezeichnet.
-
4 ist
ein Diagramm, das die hohe Produktion von rekombinanter sc-DR2/MBP-Cκ-Produktion in statischen T25-Flaschenkulturen
zeigt. Rekombinante Zelllinien, die das sc-CR2-MBP-Cκ-Fusionsprotein
in hohem Ausmaß produzierten,
wurden nach drei aufeinander folgenden Transfektionen isoliert.
Hochproduzierende rekombinante Zelllinien wurden mit A5B4, DR2H4
und B9 bezeichnet.
-
DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
-
Wie
oben zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Verfahren
zur Herstellung eines breiten Spektrums an Zellen und insbesondere
rekombinanten Zelllinien bereit. Vor allem werden Verfahren zur
Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien
bereitgestellt, die genetisch stabil sind und ein heterologes oder
homologes Protein von Interesse in hohem Ausmaß produzieren. Wie besprochen ist
die Erfindung flexibel und kann zur Herstellung äußerst nützlicher Zelllinien eingesetzt
werden, die das Protein in hohem Ausmaß produzieren, während die Verwendung
hochspezialisierter Zellen, Vektoren und/oder Wachstumsbedingungen
vermieden wird. Außerdem
werden Säugetierzelllinien
bereitgestellt, die das Protein in hohem Ausmaß produzieren.
-
Im
Allgemeinen wird die vorliegende Erfindung am besten umgesetzt,
indem anerkannte Manipulationen vorgenommen werden. Beispielsweise sind
Verfahren zur Isolierung von DNA, Herstellung und Selektion von
Vektoren zur Expression der DNA, Reinigung und Analyse von Nucleinsäuren, spezifische
Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Vektor-DNA, Spaltung
von DNA mit Restriktionsenzymen, Ligation von DNA, Einführung von
DNA, einschließlich
Vektor-DNA, in Wirtszellen durch stabile oder vorübergehende
Mittel, Kultivierung der Wirtszellen in selektiven oder nichtselektiven
Medien sowie beispielhafte Wirtszellverfahren zur Selektion und
Erhaltung von Zellen, welche die DNA stabil oder vorübergehend
exprimieren, auf dem Gebiet der Erfindung allgemein bekannt. Siehe
im Allgemeinen Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al., s.o.
-
Die
vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt neue Verfahren zur
Herstellung von rekombinanten Säugetierzelllinien
bereit. Eine rekombinante Säugetierzelllinie
wird hierin manchmal als "hochproduzierende" Zelllinie oder ähnliches
bezeichnet. Die Ausdrücke "in hohem Ausmaß", "hochproduzierend" oder dergleichen
bedeuten, wenn sie in Bezug auf die Menge an Aminosäuresequenz
verwendet werden, die durch die Zelllinie produziert wird, dass
zumindest durch die Zelllinie im Vergleich zu einer Elternzelle
oder Elternzelllinie etwa 2-mal und vorzugsweise etwa 3- bis etwa
40-mal oder mehr (einige heterologe Sequenzen sind in der Elternzelllinie
nicht vorhanden) der Aminosäure
produziert werden.
-
Verfahren
zur Bestimmung der Menge einer bestimmten Aminosäuresequenz, die durch eine hierin
beschriebene rekombinante Zelllinie hergestellt wird, sind auf dem
Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen Chromatographieverfahren,
wie beispielsweise Proteingelelektrophorese, und immunologische
Verfahren, wie beispielsweise Western-Blotting und ELISA. Genauer
gesagt umfassen die Gelelektrophoreseverfahren solche, bei denen
eine Protein- oder Peptidsequenz unter Verwendung von Coomassie-Blau-
oder Silberfärbung
detektiert und quantifiziert wird. Ein bevorzugtes Proteinquantifizierungsverfahren
basiert auf Antikörperreaktivität.
-
Der
Begriff "Antikörperreaktivität" bezeichnet die spezifische
Bindung zwischen einem bestimmten Antikörper und der Aminosäuresequenz,
die durch die Zelle oder Zelllinie produziert wird. Außerdem bezeichnet
der Begriff die Bildung eines spezifischen Bindungspaars zwischen
der Aminosäuresequenz (d.h.
einem Epitop darauf) und dem Antikörper, der jedoch im Wesentlichen
nicht an andere Moleküle bindet,
wie beispielsweise durch Western-Blotting, ELISA, RIA, Gel-Retentionsanalyse,
Enzymimmuntests, kompetitive Tests, Sättigungstests oder andere geeignete
Aminosäuresequenz-Bindungsassays,
die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, bestimmt wird. Für eine Offenbarung
in Bezug auf diese und andere geeignete Test siehe allgemein Harlow
und Lane in "Antibodies:
A Laboratory Manual",
CSH Publications, N.Y. (1988).
-
Der
Begriff "Eltern-" in Bezug auf eine
Wirtszelle oder Zelllinie bezeichnet einen Vorläufer dieser Zelle oder Zelllinie,
der zur Herstellung einer nachfolgenden Zelllinie verwendet wurde.
Veranschaulichende Elternzellen sind geeignete Wirtszellen, die zur
Herstellung der ersten stark exprimierenden Zellen verwendet werden.
Die ersten stark exprimierenden Zellen sind wiederum ein Beispiel
für eine
Elternzelllinie, die zur Herstellung von zweiten stark exprimierenden
Zelllinien verwendet wird. Es versteht sich, dass eine Zelllinie,
sofern nicht anders angegeben, eine Klonpopulation von Zellen ist,
die von einer einzelnen Vorläuferzelle
abstammen. Verfahren zur Herstellung von Zelllinien sind auf dem
Gebiet der Erfindung allgemein bekannt und um fassen herkömmliche
Reihenverdünnungsverfahren.
Siehe beispielsweise Ausubel et al., s.o.
-
Gemäß einem
Aspekt der Erfindung werden Säugetierwirtszellen,
die eine erhöhte
Expression einer spezifischen Aminosäuresequenz bereitstellen, wie
beispielsweise ein heterologes Protein, durch Einführung eines
ersten Vektors, der zumindest eine selektierbare Sequenz und vorzugsweise
eine selektierbare Sequenz (erste selektierbare Sequenz) umfasst,
die operabel mit dem für
das Protein kodierenden Segment verbunden ist, in die Zellen erhalten. Nach
dem Kultivieren und Isolieren von Zellen, die das Protein mit einer
ersten hohen Expressionsstärke
exprimieren (erste stark exprimierende Zellen), wird ein zweiter
für das
Protein kodierender Vektor in die ersten stark exprimierenden Zellen
eingeführt.
Im Allgemeinen wird die Einführung
des zweiten Vektors vorzugsweise von der Einführung eines weiteren Vektors
(d.h. vierter Vektor) begleitet, der für zumindest einen und vorzugsweise
einen selektierbaren Zelloberflächenmarker
kodiert. In anderen Ausführungsformen
kodiert der zweite Vektor jedoch sowohl für das Protein als auch zumindest
einen Zelloberflächenmarker,
vorzugsweise einen solcher Marker. Die Zellen werden Bedingungen
ausgesetzt, die der Expression der Aminosäuresequenz mit einer zweiten Expressionsstärke förderlich
sind, die größer ist
als die erste Expressionsstärke.
Bevorzugte Bedingungen selektieren zumindest einen der Zelloberflächenmarker
und nutzen keine hochspezialisierten Zellen, Vektoren und Wachstumsbedingungen.
Eine Zelllinie, die das Protein mit einer zweiten Expressionsstärke exprimiert,
wird dann isoliert, um die zweiten stark exprimierenden Zellen zu
produzieren.
-
Der
Begriff "isoliert" in Bezug auf spezifische hierin
geoffenbarte Zellen oder Zelllinien betrifft Zellen, die auf zumindest
80 bis 95 Gew.-% Homogenität gereinigt
wurden. Gereinigte Zellen mit höherer
Reinheit, beispielsweise zumindest etwa 98 bis 99 Gew.-% Homogenität sind für die meisten
Anwendungen noch bevorzugter. Sobald sie gereinigt sind, können die
Zellen für
nachfolgende Manipulationen verwendet werden, wie beispielsweise
Zelltransfektionen oder die Etablierung von Zelllinien unter Verwendung
von anerkannten Reihenverdünnungsverfahren.
-
Wie
erläutert
können
der erste und/oder zweite Vektor einmal oder mehr als einmal in
die jeweiligen Zellen eingeführt
werden, vorzugsweise etwa 2- bis etwa 20-mal, noch bevorzugter etwa
2- bis 5-mal, je nach Bedarf. Die Entscheidung, ob der erste und/oder
zweite Vektor ein- oder mehrmals in die jeweiligen Zellen eingeführt werden,
hängt von verschiedenen
Parametern ab, wie beispielsweise dem gewünschten Ausmaß der erhöhten Expression und
der jeweiligen Aminosäuresequenz
von Interesse.
-
In
einer spezifischeren Ausführungsform
umfassen die Bedingungen zur Auswahl der zweiten stark exprimierenden
Zellen die Selektion zumindest eines Zelloberflächenmarkers und vorzugsweise
eines Zelloberflächenmarkers,
wobei für
den Marker einer der Vektoren kodiert, die gleichzeitig in die ersten
stark exprimierenden Zellen eingeführt wurden. Wie erwähnt können diese
Vektoren der vierte oder fünfte
Vektor sein. Dabei ist zu beachten, dass diese Ausführungsform
der vorliegenden Verfahren eine bedeutende Verbindung gegenüber Expressionssystemen
nach dem Stand der Technik, wie beispielsweise Verfahren zur Erhöhung der
Arzneimittelresistenz, darstellt. Durch gleichzeitige Einführung der Vektoren
in die Zellen kann beispielsweise die Selektion der zweiten stark
exprimierenden Zellen durch Selektion des Zelloberflächenmarkers
durchgeführt werden,
wodurch viele der schon erläuterten
Probleme gelöst
werden. Auch von Bedeutung ist, dass durch die aufeinander folgende
Einführung
des ersten und zweiten Vektors gemäß dieser Erfindung Expressionsstärken der
Aminosäuresequenz
auf über die
Summe der Werte der Aminosäuresequenz
erhöht
werden können.
-
Eine "Aminosäuresequenz" bezeichnet im Allgemeinen
jedes Polymer, das aus im Wesentlichen beliebigen der 20 Aminosäuren besteht,
unabhängig
von deren Größe. Obwohl
der Begriff hierin in Bezug auf Proteine verwendet wird, umfasst
er, sofern nicht anders angegeben, auch Polypeptide und Peptide.
Die Aminosäuresequenz
kann für
ein Protein voller Länge
(heterolog oder homolog, bezogen auf die exprimierende Zelle) oder
einen Abschnitt davon, wie beispielsweise ein funktionelles Fragment,
kodieren. Spezifischere Aminosäuresequenzen
sind nachstehend beschrie ben. Eine insbesondere bevorzugte Aminosäuresequenz
ist eine Immunglobulinschwerkette, eine Immunglobulinleichtkette
oder ein funktionelles Fragment davon.
-
Der
Begriff "funktionelles
Fragment" in Bezug
auf eine Aminosäuresequenz
bezeichnet zumindest ein Segment einer Aminosäuresequenz, das zumindest eine
der Aktivitäten
der Aminosäuresequenz voller
Länge aufweist.
In Bezug auf Proteinsequenzen umfassen diese Aktivitäten spezifische
Bindungsaktivität
und enzymatische Aktivität.
Bevorzugt funktionelle Fragmente weisen zumindest etwa 70 % und
noch bevorzugter von etwa 80 % bis 95 % der Aktivität des Proteins
voller Länge
auf, wie durch geeignete Mittel bestimmt werden kann.
-
Der
Begriff "operabel
gebunden" bezeichnet die
Verbindung von Polynucleotidelementen in funktioneller Beziehung.
Eine Nucleinsäure
ist gemäß dieser
Erfindung "operabel
gebunden", wenn
sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz
gesetzt wird. Genauer gesagt können
operabel gebundene Sequenzen auf demselben Vektor oder auf verschiedenen
Vektoren in derselben Zelle liegen. Beispielsweise ist ein Promotor
oder Enhancer operabel mit einer spezifischen kodierenden Sequenz
verbunden, wenn er sich auf die Transkription dieser kodierenden
Sequenz auswirkt. In diesem Fall bedeutet operabel gebunden, dass
die verbundenen DNA-Sequenzen nebeneinander liegen und, wenn dies
zur Verbindung zweiter für
ein Protein kodierender Regionen erforderlich ist, nebeneinander und
im Leserahmen liegen. Operabel gebundene Sequenzen können jedoch
in manchen Fällen
auf verschiedenen Vektoren liegen. Eine Vektorsequenz, die für eine Untereinheit
eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Proteins kodiert,
könnte
beispielsweise mit einer anderen Vektorsequenz operabel verbunden
werden, die für
eine andere Untereinheit (Bindepartner) dieses Proteins kodiert.
-
Verfahren
der vorliegenden Erfindung sind mit einem weiten Spektrum an Wirtszellen,
vor allem solchen, die gut an eine Gewebekultur angepasst sind,
durchführbar
und äußerst nützlich.
Typischerweise sind die Wirtszellen eukaryotisch, vorzugsweise Säugetierzellen,
die in herkömmlichen
Medienpräparaten
gute Wachstumseigen schaften aufweisen. Im Wesentlichen kann gemäß vorliegender
Erfindung nahezu jede beliebige Nicht-Mikrobenzelle eingesetzt werden,
die eine gewünschte
Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren
kann, egal ob sie vorher transformiert wurde oder nicht. Auf dem Gebiet
der Erfindung sind verschiedenste solcher Zellen bekannt, wie beispielsweise
CHO, CV-1, HeLa und andere Zellen. Sie im Allgemeinen Sambrook et al.,
s.o., und Ausubel et al., s.o.; und American Tissue Type Culture
Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA.
-
Wie
aus der folgenden Erläuterung
und den folgenden Beispielen noch klarer ersichtlich ist, können verschiedenste
Vektoren und insbesondere Säugetierexpressionsvektoren
gemäß vorliegender
Erfindung verwendet werden. Spezielle Vektoren umfassen im Allgemeinen
geeignete Regulationssequenzen zur Selbstreplikation und vorzugsweise
die Selektion in einer gewünschten
Wirtszelle oder Zelllinie.
-
Der
Begriff "Vektor" ist genauer als
beliebige Nucleinsäuresequenz
von Interesse definiert, die in eine Wirtszelle inkorporiert werden
kann und zur Expression eines Nucleinsäuresequenz von Interesse führt. Diese
Nucleinsäuresequenz
von Interesse kodiert vorzugsweise für die gesamte oder einen Teil der
oben beschriebenen Aminosäuresequenz.
Geeignete Vektoren können
lineare Nucleinsäuresequenzen,
Plasmide, Cosmide, Phagemide, Episome und extrachromosomale DNA
umfassen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Außerdem gehören virale DNA und virale RNA
dazu. Insbesondere kann der Vektor rekombinante DNA sein. Der Begriff "Expression" oder "Genexpression" bezieht sich hierin
auf die Produktion des Proteinprodukts der Nucleinsäuresequenz
von Interesse, einschließlich
der Transkription der DNA und der Translation des RNA-Transkripts.
-
Genauer
gesagt umfassen Vektoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung
zumindest eine selektierbare Nucleinsäuresequenz, üblicherweise
eine solche Sequenz. Zur Veranschaulichung werden selektierbare
Sequenzen manchmal als selektierbarer Genmarker (oder ähnlich)
bezeichnet, wenn die Sequenz für
eine intra zelluläre
Sequenz kodiert; oder als Zelloberflächenmarker (oder ähnlich), wenn
die Sequenz für
ein Zelloberflächenprotein
kodiert.
-
Offensichtlich
sind verschiedenste Vektor-kodierte selektierbare Sequenzen für die Erfindung
geeignet. Bevorzugte Vektoren vereinfachen die Selektion von Wirtszellen
oder Zelllinien, die den Vektor oder andere Vektoren, die gleichzeitig
in die Zelle eingeführt
werden, enthalten. Dieses Ziel kann durch verschiedene Verfahren
erreicht werden, einschließlich
des substanziellen Überlebens
der Zellen nach dem Aussetzen gegenüber einem zytotoxischen Arzneimittel.
Siehe allgemein Southern, P.J. et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 327
(1982); Sambrook et al., s.o.; und Ausubel et al., s.o.
-
Veranschaulichende
selektierbare Genmarker zur Verwendung in dieser Erfindung umfassen beispielsweise
DHFR, Aminoglykosid-Antibiotikum G418, Hygromycin B (hmb) und Neomycin-Phosphotransferase-II-Gen
(neo), Puromycin und das Adenosin-Deaminase-Gen für bestimmte
auxotrophe eukaryotische Zellen, z.B. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters
(CHO-Zellen). In manchen Fällen
scheint die gewünschte
Aminosäuresequenz,
für die
der Vektor kodiert, selbst ein ausreichender selektierbarer Marker
zu sein oder die Funktion des selektierbaren Markers positiv zu
beeinflussen. In Fällen,
in denen die Aminosäuresequenz
selbst für
die selektierbaren Marker kodiert, muss der Vektor keinen separaten
selektierbaren Marker aufweisen. Für weitere Offenbarungen in
Bezug auf Genmarker siehe beispielsweise Southern, P.J. et al.,
J. Mol. Biol. 150, 1 (1981); Sambrook et al., s.o.; und Ausubel
et al., s.o., und darin angeführte
Literaturverweise.
-
Wie
erläutert
kann die selektierbare Nucleinsäuresequenz
für einen
geeigneten Zelloberflächenmarker
und insbesondere ein Zelloberflächenprotein kodieren.
Beispiele für
Zelloberflächenmarker
umfassen Zelloberflächenrezeptoren,
Glykoproteine, Kohlenhydrate, Proteine, Lipoproteine, Haupthistokompatibilitätskomplexe
(MHC/HLA), Antikörper,
Antigene oder funktionelle Fragmente davon. Genauer gesagt umfassen
Zelloberflächenmarker
Glykoproteine von immunologischem Interesse, wie beispielsweise
CD- (Oberflächenmoleküle humaner
Lymphozyten) Glykoproteine, die typi scherweise auf T-Zelloberflächen vorkommen.
Ein spezielleres Glykoprotein von Interesse ist das CD4-Molekül und insbesondere
ein funktionelles Fragment dieses Moleküls. Siehe auch das CaptureTecTM-System von InVitrogen.
-
Wie
oben erwähnt
können
in den nachstehenden Beispielen Zellen, die für einen spezifischen Zelloberflächenmarker
kodieren, durch eine oder eine Kombination verschiedener Strategien
isoliert werden. In einem Ansatz können die Zellen beispielsweise
durch Chromatographie, Zell-Panning, Durchflusszytometrie, Immunfällung oder
Antikörperbindung
isoliert werden. Ein bevorzugter Ansatz ist Chromatographie, die
wie weiter unten erläutert
magnetische Selektion umfasst.
-
Der
Begriff "funktionelles
Fragment" als Definition
für einen
selektierbaren Zelloberflächenmarker bezieht
sich auf einen Abschnitt dieses Markers, beispielsweise das CD4-Glykoprotein,
das zur spezifischen Bindung eines anderen immunologischen Moleküls, wie
beispielsweise eines Antikörpers,
wie z.B. eines monoklonalen Antikörpers, fähig ist. Der Begriff umfasst
auch eine Nucleinsäuresequenz,
die für
das funktionelle Fragment kodiert.
-
Im
Allgemeinen wird, sobald eine geeignete selektierbare Sequenz gewählt ist,
diese operabel mit einer oder mehreren Regulationssequenzen verbunden,
sodass die kodierte Aminosäuresequenz
im Vektor positioniert ist, beispielsweise neben einem Promotor.
Auf diese Weise wird die Expression der gewünschten Aminosäuresequenz
vereinfacht. Manche Aminosäuresequenzen,
wie beispielsweise ein heterologes oder homologes Protein, weisen
ihre eigenen zell- oder gewebespezifischen Promotor auf. Außerdem sind
Regulationssequenzen geeignete Leader- und Polyadenylierungssequenzen.
-
In
spezifischeren Beispielen der vorliegenden Erfindung erfolgt die
Expression der Aminosäuresequenz,
je nach Bedarf, entweder als Mono- oder Di-Cistron. Die Expression
ist beispielsweise monocistronisch, wenn der Promotor operabel mit
sowohl der selektierbaren Nucleinsäuresequenz als auch der Aminosäuresequenz
von Inter esse verbunden ist, beispielsweise Promotor/kodierte Aminosäuresequenz/selektierbare
Nucleinsäuresequenz;
Promotor/selektierbare Nucleinsäuresequenz/kodierte
Aminosäuresequenz.
Alternativ dazu ergibt sich eine dicistronische Expression aus der
Expression der Aminosäuresequenz
aus separaten Promotoren, beispielsweise Promotor/kodierte Aminosäuresequenz oder
selektierbare Nucleinsäuresequenz.
-
Wie
erwähnt
sind die vorliegenden Verfahren mit verschiedensten Vektoren durchführbar. Diese Vektoren
kodieren typischerweise für
die Aminosäuresequenz
(oder mehrere solcher Sequenzen), für welche die erhöhte Expression
gewünscht
ist. Ein bevorzugtes Vektorformat wird manchmal als Expressionskassette
bezeichnet. In einer Ausführungsform umfasst
die Expressionskassette im Allgemeinen einen Promotor, der in der
den Vektor aufweisenden Zelle oder Zelllinie funktionell ist, einen
Operator, eine ribosomale Initiationsstelle, die Aminosäuresequenz
und einen ausreichenden 3'-Abschnitt,
der für die
Polyadenylierungssignale kodiert, um das Processing und in manchen
Fällen
die Sekretion der Aminosäuresequenz
aus der Zelle zu vereinfachen. Ein bevorzugtes Beispiel für einen
Terminationssequenz ist die Polyadenylierungssequenz von SV40. Falls
gewünscht
kann die Expressionskassette oder ein anderer geeigneter Abschnitt
des Vektors nahe dem 5'-Ende
der Aminosäuresequenz
eine Signalsequenz aufweisen, um das posttranslationale Processing
dieser Sequenz zu vereinfachen. Zumindest ein geeigneter Genmarker
oder Zelloberflächenmarker kann,
falls erforderlich, im Vektor positioniert sein.
-
Ein
spezifischeres Beispiel für
einen geeigneten Vektor, der die Expressionskassette umfasst, ist
ein DNA-Vektor, der Folgendes umfasst: (i) einen Replikationsstartpunkt
(Ori), der in E. coli funktionell ist; (ii) einen selektierbaren
Genmarker (Antibiotikaresistenzgen, z.B. Amp-, Tet-, Neo- oder Kan-Resistenz);
(iii) einen starken viralen Promotor, wie z.B. den Zytomegalie-Virus-
(CMV-) Promotor und ein optionales CMV-Enhancer-Element; (iv) eine (Ig-CL)-Immunglobulinleichtketten-Konstantregion-Leadersequenz; (v)
die Aminosäuresequenz
von Interesse; (vi) ein Ig-CL-Intron voller
Länge,
das an ein Ig-CL-Exon gebunden ist; (vii)
eine Wachstumshormon-Polyadenylierungssequenz, z.B. eine Rinderwachstumshormon-
(bgh-) Poly-A-Sequenz; und (viii) DNA, die für einen selektierbaren eukaryotischen
Marker kodiert, wie z.B. ein starker viraler Promotor (z.B. ein
Simian-Virus40- (SV40-) Promotor), der an das Antibiotikaresistenzgen
gebunden und an eine virale Polyadenylierungssequenz (z.B. die SV40-Poly-A-Sequenz)
fusioniert ist. Alternativ dazu kann der DNA-Vektor alle von (i) – (v) und
(vii) – (viii) enthalten,
ohne das Ig-CL-Intron voller Länge, das
an das Ig-CL-Exon von (vi) gebunden ist.
Ein Beispiel für eine
Ig-CL-Leader-Sequenz ist der Mäuse-κ-Leader. Ein
Beispiel für
ein Ig-CL-Intron voller Länge und
ein Exon ist das Cκ-Gen
voller Länge.
-
Die
Aminosäuresequenz,
für welche
eine erhöhte
Expression gewünscht
ist, kann fast jede Protein- oder Polypeptidsequenz sein, einschließlich heterologer
Proteine oder homologer (endogener) Proteine, die von der Wirtszelle
natürlich
produziert werden. In den meisten Fällen ist die Aminosäuresequenz
ein eukaryotisches Protein, wie beispielsweise eine Untereinheit
oder ein funktionelles Fragment einer größeren Aminosäuresequenz,
wie z.B. eines aus mehreren Untereinheiten bestehenden Proteins, ohne
jedoch auf diese eingeschränkt
zu sein. Genauer gesagt umfassen die Aminosäuresequenzen Enzyme, Immunglobuline,
Peptidhormone, Vakzine, Rezeptoren, einschließlich T-Zell-Rezeptoren, MHC/HLA-Moleküle (Klasse
I und Klasse II) oder Fragmente davon. Weitere spezifische Proteine
umfassen Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Zytokine, z.B.
Plasminogenaktivatoren, Gewebefaktoren (TF), Insulin, Säugetierwachstumshormone, Erythropoetine,
IgE, Urokinasen, Interleukine 1, 2 und 3 oder Fragmente davon. Die
Erfindung ist darüber
hinaus mit anderen bekannten, teilweise bekannten oder unbekannten
Aminosäuresequenzen
durchführbar,
einschließlich
solcher, die für
neue Gensequenzen kodieren.
-
In
der Genbank (National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville
Pike, Bethesda, MD 20894, USA) ist eine Reihe solcher Aminosäuresequenzen zu
finden. Die Genbank steht auch im Internet auf http://www.ncbi.nlm.nih.gov
zur Verfügung.
-
Die
Molekulargewichte von spezifischen hierin erläuterten Vektoren können mithilfe
herkömmlicher
Verfahren, wie Beispielsweise Agarose-Gelelektrophorese-Größen bestimmung,
bestimmt werden und variieren je nach beispielsweise beabsichtigter
Verwendung. Die meisten geeigneten Vektoren, und insbesondere ein
geeigneter DNA-Vektor, weisen ein Molekulargewicht von zumindest
etwa 5 kb und insbesondere von etwa 5 kb bis etwa 35 kb oder mehr
auf. Das Molekulargewicht von bestimmten Aminosäuresequenzen kann mithilfe
herkömmlicher Proteingrößenbestimmungsverfahren,
wie beispielsweise Polyacrylamid-Gelelektrophorese, bestimmt werden.
Alternativ dazu oder zusätzlich
kann das Molekulargewicht durch Bestimmung des Molekulargewichts
der entsprechenden Nucleinsäuresequenz, gefolgt
von einer konzeptionellen Translation dieser Sequenz geschätzt werden.
Bei den meisten Anwendungen reicht die Größe der Nucleinsäure, die
für die Aminosäuresequenz
kodiert, aus, um für
ein Protein oder ein Polypeptid mit etwa 500 bis etwa 300.000 Dalton,
vorzugsweise etwa 15 bis etwa 200.000 Dalton, zu kodieren.
-
In
den folgenden Beispielen sind spezifischere Vektoren zur Verwendung
in der Erfindung erläutert,
wie beispielsweise pJAlgG4Tf.A8, pDRHK und pMACS. Siehe auch 1A und 1B.
Der pDRHK-Vektor wurde gemäß dem Budapester
Vertrag mit der ATCC an der oben angeführten Adresse hinterlegt. Der
DNA-Vektor wurde am 17. September 1997 bei der ATCC hinterlegt und
erhielt die Zugriffsnummer 209274. Der pDRHK-Vektor ist ein Säugetierexpressionsvektor,
der einen CMV-Promotor, ein IgC-κ-Leader-Peptid,
eine Klonierungsregion, ein Mäuse-κ-Intron und
eine menschliche κ-Konstantdomänen-Exon-Sequenz
umfasst.
-
Wie
oben erwähnt
beschäftigt
sich die vorliegende Erfindung mit einer Reihe von rekombinanten Manipulationen,
einschließlich
sequenzieller und abgestimmter Vektoreinführung, um rekombinante Säugetierzelllinien
herzustellen, die eine Aminosäuresequenz
in hohem Ausmaß exprimieren.
Die Einführung
der Vektoren kann auf verschiedene Arten durchgeführt werden,
einschließlich
retroviraler Transfer, virale Infektion, Calcium-, Liposom- oder Polybren-vermittelte
Transfektion, biolistischer Transfer oder andere auf dem Gebiet
der Erfindung bekannte Verfahren. Noch bevorzugtere Einführungsverfahren
umfassen solche, die für
eine stabile Transfektion von Säugetierzellen
angepasst werden können,
wie beispielsweise Elektroporation.
-
Bei
manchen Anwendungen sind jedoch vorübergehende Einführungsverfahren
von Nutzen, solange die resultierenden rekombinanten Zelllinien
genetisch stabil sind.
-
Um
die Erfindung besser zu veranschaulichen, wird eine geeignete Wirtszelle,
wie beispielsweise eine CHO, einmal oder zumindest zweimal (mehrfach)
mit geeigneten Vektoren transfiziert, die jeweils zumindest einen
selektierbaren Marker umfassen und für zumindest ein heterologes
Protein von Interesse kodieren. In einer spezifischeren Ausführungsform
werden die Wirtszellen mit einem Vektor transfiziert, der eine erste
selektierbare Sequenz (Genmarker) umfasst, die operabel mit einem
Segment verbunden ist, das wiederum operabel mit dem kodierten Protein
verbunden ist. Verschiedene Transfektionsverfahren können verwendet
werden, um den Vektor in die Wirtszellen einzuführen, wie beispielsweise herkömmliche
Calciumphosphatvermittelte Transfektions- oder Lipofektionsverfahren.
Transfizierte Wirtszellen werden dann selektiven Wachstumsbedingungen
unterzogen, sodass erste stark exprimierende Zellen isoliert werden
können.
Verfahren zur Isolierung von transfizierten Zellen wurden beispielsweise
in Sambrook et al., s.o.; Ausubel et al., s.o.; und Wigler PNAS
(USA) 76, 1376 (1979) beschrieben.
-
Die
ersten stark exprimierenden Zellen werden isoliert und können, falls
gewünscht,
durch ein herkömmliches
Verfahren oder eine Kombination von herkömmlichen Verfahren charakterisiert
werden. In einem Ansatz werden die CHO-Zellen beispielsweise mit
einem Vektor transfiziert, der für
einen Neomycin-Genmarker kodiert (der G418-Resistenz bereitstellt),
der operabel mit einer Proteinsequenz verbunden ist, wie beispielsweise
einer Immunglobulin-kodierenden Sequenz, insbesondere einer für einen Antikörper kodierenden
Sequenz. Transfizierte Wirtszellen, welche die Proteinsequenz exprimieren,
werden dann durch Standardverfahren kloniert (z.B. Grenzverdünnung und
Heranreifen), durchgeführt
in Mikrotiter-Gewebekulturplatten. Nachdem die Zellen einige Tage
bis einige Wochen lang oder länger
inkubiert wurden, treten typischerweise Einzelkolonien auf. Vorzugsweise
werden nur Einzelkolonien für weitere
Manipulationen verwendet. Hochproduzierende Klone werden durch ein
geeignetes Verfahren selektiert, wie beispielsweise durch herkömmliche immuno logische
Verfahren, insbesondere einen ELISA-Assay. Bevorzugt sind ELISA-Assays,
die optimiert wurden, um Antikörperproduktion
zu detektieren und zu quantifizieren. Bevorzugt hochproduzierende
Zellen sind solche, die im ELISA-Assay im Wesentlichen die größte Antikörpermenge
erzeugen. Noch bevorzugter sind erste hochproduzierende Zellen,
die etwa 0,5 bis etwa 20 Mikrogramm Antikörper pro Milliliter Medium
erzeugen. Insbesondere bevorzugt sind hochproduzierende Zellen,
die etwa 1 bis etwa 5 Mikrogramm Antikörper pro Milliliter Medium erzeugen.
-
Die
ersten hochproduzierenden Zellen werden weiter manipuliert, vor
allem um die Zellkopien von Nucleinsäure zu erhöhen, die für die Proteinsequenz kodiert.
Ein spezifisches Ziel in diesem Beispiel ist die Herstellung einer
einen genetisch stabilen Antikörpers
produzierenden Zelllinie. In einer Ausführungsform werden die ersten
hochproduzierenden Zellen weiter mit zwei unterschiedlichen Vektoren
transfiziert, beispielsweise durch Elektroporation: Ein Vektor kodiert
für die
Proteinsequenz und der andere Vektor kodiert für einen geeigneten Zelloberflächenmarker,
wie beispielsweise ein Glykoprotein, insbesondere CD4 oder ein Fragment
davon. Siehe 1A. Ein bevorzugter im Handel
erhältlicher
Vektor, der für
CD4 kodiert, ist pMACS (siehe unten). In diesem Beispiel werden
Transfektanten mit einem spezifischen Antikörper oder einem geeigneten
Antigenbindungsfragment davon behandelt, das zur spezifischen Bindung
des Zelloberflächenproteins
fähig ist.
-
Der
Begriff "genetisch
stabil" in Bezug
auf eine Zelle bedeutet hierin, dass eine Zelle im Wesentlichen
frei von genomischen Umbauten ist, welche die heterologe Nucleinsäure enthalten.
Vor allem werden Umbauten vermieden, die Double-minute-Chromosome
umfassen. Die vorliegenden Verfahren führen vorzugsweise die heterologen
Nucleinsäuren
in das Wirtszellgenom ein, um die genetische Stabilität zu maximieren.
-
Die
spezifische Bindung zwischen Zellen, die das Zelloberflächenprotein
von einem der Vektoren exprimieren, und der Proteinsequenz, für die der
andere Vektor kodiert, kann auf verschiedene Arten detektiert werden,
einschließlich
durch herkömmliche immunologische
Verfahren, wie z.B. Chromatographie und insbesondere Säulenchromatographie
unter Verwendung von Magnetkügelchen.
Bei diesem Ansatz wird der Antikörper,
der gegen das Zelloberflächenprotein
gerichtet ist, kovalent an die Magnetkügelchen gebunden, wodurch alle
Zellen, die das Zelloberflächenprotein
exprimieren, isoliert werden können,
indem ein Magnetfeld an die Zellen und die Magnetkügelchen
angelegt wird. Gebundene Zellen werden dann aus der Säule entnommen
und in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Gegebenenfalls können die
Zellen in einem selektiven Medium, wie beispielsweise einem mit
G418 ergänzten
Medium, gezüchtet
werden.
-
Die
zweiten hochproduzierenden Zellen können durch verschiedene Verfahren
isoliert werden. In einem speziellen Ansatz werden die Zellen beispielsweise
ausreichend lange in den Wells gezüchtet, sodass eine Antikörperproduktion
und -sekretion in das Kulturmedium stattfinden kann. Ein geeigneter
Anti-Idiotyp-Antikörper
gegen einen Fc-Abschnitt wird auf die Mikrotiter-Kulturplattenwells
aufgetragen, und das Zellkulturmedium wird zugesetzt. Das Medium, das
große
Mengen des Antikörper
enthält,
kann durch Standardverfahren detektiert werden, beispielsweise durch
herkömmliche
Sandwich-Tests, wobei ein geeigneter sekundärer Antikörper verwendet wird, der mit
z.B. Meerrettichperoxidase (HFP) markiert ist. Bevorzugte zweite
hochproduzierende Zellen werden durch die Identifikation hoher Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten
in Bezug auf die Zellanzahl in der Platte isoliert. Verfahren zur
Durchführung
dieser Analyse werden weiter unten genauer beschrieben und umfassen
insbesondere eine ELISA-Detektionsformat. Bevorzugt sind zweite
hochproduzierende Zellen, die in einem Zeitraum von 24 Stunden etwa
0,1 bis etwa 10 Mikrogramm Antikörper
oder mehr pro 106 Zellen produzieren. Noch
bevorzugter ist ein Bereich von etwa 1 bis etwa 5 Mikrogramm Antikörper pro
106 Zellen über einen Zeitraum von 24 Stunden.
-
Wie
erwähnt
sind weiters zweite hochproduzierende Zellen bevorzugt, die im Vergleich
zu den ersten hochproduzierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache
oder mehr an Antikörpern
produzieren. Die Antikörperreaktivität ist ein
bevorzugtes Verfahren zur Durchführung
dieser Bestimmung.
-
Zweite
stark exprimierende Zellen werden weiter transfiziert, um Zelllinien
zu isolieren, die mehr des Proteins exprimieren, z.B. die dritten
stark exprimierenden Zellen. Um beispielsweise die Produktion des
Antikörper
in den zweiten stark exprimierenden Zellen zu erhöhen, werden
die beiden Vektoren, die zur Transfektion der ersten stark exprimierenden
Zellen verwendet wurden, wieder und wieder verwendet, um die zweiten
stark exprimierenden Zellen zu cotransfizieren. Ein bevorzugtes
Transfektionsverfahren ist Elektroporation, obwohl, falls gewünscht, auch andere
Transfektionsverfahren angewandt werden können. Hochproduzierende Zellen,
die größere Mengen
des Antikörpers
erzeugen, können
wie oben erläutert
unter Verwendung von magnetischer Säulenchromatographie an CD4
exprimierenden Zellen, gefolgt von der Isolierung von hochproduzierenden Zellen
isoliert werden. Gegebenenfalls können die Zellen in einem nichtselektiven
oder selektiven Medium, wie z.B. einem mit G418 ergänzten Medium,
gezüchtet
werden. Bevorzugte hochproduzierende Zellen erzeugen maximale Mengen
eines Antikörpers, wie
durch die Identifikation von hohen Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten
in Bezug auf die Zellanzahl in den Platten bestimmt werden kann.
-
In
diesem Beispiel werden selektierte Zelllinien vorzugsweise reihenverdünnt und
durch herkömmliche
Verfahren in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Nach etwa einigen Tagen
bis einigen Wochen oder mehr wird die Antikörperproduktion durch ein geeignetes
immunologisches Verfahren, wie z.B. ELISA, getestet. Klone mit hohen
Antikörperproduktionswerten
werden weiter amplifiziert. Bevorzugt sind Klone mit etwa 1 bis
etwa 100 Mikrogramm Antikörper
oder mehr pro 106 Zellen in einem Zeitraum
von 24 Stunden. Noch bevorzugter ist ein Bereich von etwa 15 bis
etwa 50 Mikrogramm Antikörper
pro 106 Zellen über einem Zeitraum von 24 Stunden.
Außerdem
sind Klone bevorzugt, welche die zumindest etwa 2- bis etwa 10fache
Antikörperproduktion
der zweiten hochproduzierenden Zellen aufweisen.
-
Selektierte
Klone, welche die oben genannten Kriterien erfüllen, werden vorzugsweise gemäß herkömmlichen
Verfahren reihenverdünnt.
Nach einigen Tagen bis einigen Wochen oder mehr werden Einzelkolonien
durch ein geeignetes immunologisches Verfahren, wie z.B. ELISA,
auf ihre Antikörperproduktion
getestet. Der höchstproduzierende
Klon (dritte stark exprimierende Zelle) wird zur Herstellung von
statischen Kulturen ausgewählt,
wie weiter unten im Detail beschrieben ist. Bevorzugte dritte stark
exprimierende Zellen produzieren etwa 20 bis etwa 200 Mikrogramm
pro Milliliter einer Kultur. Noch bevorzugtere dritte stark exprimierende
Zellen produzieren etwa 50 bis etwa 150 Mikrogramm pro Milliliter
Kultur, wobei im Allgemeinen etwa 100 Mikrogramm pro Milliliter
Kultur bevorzugt sind.
-
Außerdem sind
dritte hochproduzierende Zellen bevorzugt, die im Vergleich zu den
zweiten hochproduzierenden Zellen das etwa 3- bis etwa 40fache des
Antikörpers
produzieren, wie durch die Antikörperreaktivität bestimmt
wird.
-
Außerdem sind
dritte hochproduzierenden Zellen bevorzugt, die im Vergleich zu
den ersten hochproduzierenden Zellen das etwa 10- bis etwa 200fache
des Antikörpers
produzieren, wie durch die Antikörperreaktivität bestimmt
wird.
-
Ein
spezifisches Beispiel für
einen geeignete Antikörper
ist der Anti-TF-Antikörper,
der durch den in 1A dargestellten pJAlgG4TF.A8-Vektor
kodiert ist.
-
Die
hochproduzierenden Zelllinien, die durch die hierin beschriebenen
Verfahren hergestellt wurden, sind für eine Reihe äußerst nützlicher
Anwendungen geeignet, einschließlich
Anwendungen im Handel, in der Forschung und in der Medizin. Beispielsweise
wurde herausgefunden, dass die hochproduzierenden Zellen, die durch
das Verfahren hergestellt werden, vor allem für eine kommerzielle Produktion
der Proteinsequenz geeignet sind. Zur Veranschaulichung wurde in
den nachstehenden Beispielen die Verwendung eines Hohlfaserbioreaktors zur
Herstellung der Proteinsequenz in großem Maßstab (d.h. Milligrammmengen
pro ml) beschrieben.
-
In
einem spezifischen Beispiel der vorliegenden Erfindung können rekombinante
Säugetierzelllinien
hergestellt werden, die große
Mengen an MHC-Komplexen, insbesondere rekombinanten einkettigen
und heterodimeren MHC-Komplexen, herstellen. Diese Komplexe wurden
in beispielsweise der
US 5.869.270 geoffenbart,
die am 31. Jänner 1996
eingereicht wurde; sowie in der PCT-Anmeldung WO 96/04314, die am
15. Februar 1996 veröffentlicht
wurde. In der
US 5.869.270 und
in der veröffentlichten
PCT-Anmeldung WO 96/04314 sind verschiedene einkettige MHC-Fusionskomplexe
beschrieben, die ein kovalent gebundenes präsentierendes Peptid umfassen.
-
Um
beispielsweise rekombinante Säugetierzelllinien
herzustellen, die einen gewünschten
einkettigen MHC-Komplex in großen
Mengen exprimieren, wird eine geeignete Säugetierwirtszelle, wie z.B. CHO,
einmal oder zumindest zweimal (mehrfach) mit geeigneten Vektoren
transfiziert. Die Vektoren umfassen jeweils zumindest einen selektierbaren
Marker, wie er oben definiert ist, und zumindest ein Segment, das
für den
Einketten-MHC-Komplex kodiert. In bevorzugten Ausführungsformen
gehört
der einkettige Komplex zur Klasse II, obwohl in manchen Fällen ein
einkettiger Komplex der Klasse I bevorzugt wird. Die Wirtszellen
werden vorzugsweise mit einem geeigneten Vektor transfiziert, der
für den
Einkettenkomplex kodiert, der operabel mit einem selektierbaren
Marker verbunden ist. Eine Reihe von Transfektionsverfahren ist
geeignet, wie z.B. herkömmliche Calciumphosphat-vermittelte
Transfektions oder Lipofektionsverfahren. Transfizierte Wirtszellen
werden dann selektiven Wachstumsbedingungen ausgesetzt, sodass erste
stark exprimierende Zellen isoliert werden können. Verfahren zur Isolierung
von transfizierten Zellen wurden beispielsweise in Sambrook et al.,
s.o.; Ausubel et al., s.o.; und Wigler PNAS (USA) 76, 1376 (1979),
beschrieben.
-
Bei
einem spezifischeren Verfahren umfasst der Vektor einen selektierbaren
Genmarker, wie beispielsweise ein Neomycin-Gen, das operabel mit dem
Einketten-MHC-Komplex
verbunden ist. Wirtszellen werden vorzugsweise durch Elektroporation transfiziert,
und transfizierte Wirtszellen, welche die Fusionsproteinsequenz
ex primieren, werden durch Grenzverdünnungsverfahren kloniert, die
in Mitrotiter-Gewebekulturplatten durchgeführt werden. Nachdem die Zellen
einen Tag bis zu einigen Wochen lang oder länger inkubiert wurden, werden
transfizierte Zellen geerntet und in einem nichtselektiven oder
selektiven Medium, wie beispielsweise einem mit G418 ergänzten Medium,
verdünnt. Überstände werden wie
oben beschrieben getestet und expandiert. Selektierte Klone werden
geerntet und einige Tage bis einige Wochen lang oder länger gezüchtet, um
erste hochproduzierende Zellen zu isolieren. Bevorzugt sind erste
hochproduzierende Zellen, die etwa 1 bis 100 Nanogramm des Fusionsproteins
pro ml Medium produzieren. Noch bevorzugter sind erste hochproduzierende
Zellen, die 10 bis 50 Nanogramm pro Milliliter produzieren.
-
Die
ersten hochproduzierenden Zellen, die das Einketten-MHC-Fusionsprotein
produzieren, werden wie folgt weiter manipuliert. Die ersten hochproduzierenden
Zellen werden weiters mit zwei Vektoren cotransfiziert, beispielsweise
durch Elektroporation: Ein Vektor kodiert für das einkettige Fusionsprotein,
und der andere Vektor kodiert für
ein geeignetes Zelloberflächenprotein,
wie beispielsweise ein Glykoprotein und insbesondere CD4. Ein bevorzugter
Vektor, der für
CD4 kodiert, ist der im Handel erhältliche pMACS-Vektor (siehe
unten). Transfektanten werden dann mit einem spezifischen Antikörper oder
einem geeigneten Antigenbindungsfragment davon behandelt, das zur
spezifischen Bindung des Zelloberflächenproteins fähig ist.
Die spezifische Bindung kann auf verschiedene Arten detektiert werden, wobei
jedoch Säulenchromatographie
unter Verwendung von Magnetkügelchen
bevorzugt ist. Gebundene Zellen werden dann aus der Säule entfernt
und in Mikrotiter-Gewebekulturplatten gezüchtet. Diese zweiten hochproduzierenden
Zellen können
in einem nichtselektiven oder selektiven Medium, wie z.B. in einem
mit G418 ergänzten
Medium, gezüchtet
werden.
-
Falls
gewünscht
können
statische Kulturen der zweiten hochproduzierenden Zellen hergestellt werden.
Bevorzugt sind zweite hochproduzierende Zellen, die etwa 50 bis
500 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren. Noch
bevorzugter sind hochproduzierende Zellen, die etwa 100 bis 200 Nanogramm
des Fusionsproteins pro Milliliter produzieren.
-
Um
die Produktion des Einketten-MHC-Komplexes weiter zu steigern, können außerdem die zweiten
hochproduzierenden Zellen transfiziert werden. In einem Ansatz werden
die zweiten hochproduzierenden Zellen mit einem Gemisch aus dem
Vektor, der für
das einkettige MHC-Fusionsprotein kodiert, und einem weiteren Vektor,
der eine selektierbare Nucleinsäuresequenz
trägt,
die Resistenz gegenüber einem
Arzneimittel wie etwa Puromycin oder einem anderen geeigneten Arzneimittel
verleiht, cotransfiziert. Die Cotransfektion kann durch ein beliebiges geeignetes
Verfahren erfolgen, einschließlich
Elektroporation, falls gewünscht.
Nach Inkubation für
einige Tage bis zu einigen Wochen oder länger werden Zellen geerntet
und in einem Medium resuspendiert, das mit Puromycin ergänzt wurde.
Nachdem resistente Kolonien visualisiert wurden, kann das Kulturmedium
auf die Produktion des Fusionsproteins hin getestet werden, beispielsweise
durch ELISA. Statische Kulturen können aus Klonen hergestellt
werden, die große
Mengen des Proteins produzieren. Bevorzugte dritte hochproduzierende
Zellen produzieren etwa 500 bis etwa 5.000 Nanogramm pro Milliliter
des Fusionsproteins. Noch bevorzugter sind dritte hochproduzierende
Zellen, die etwa 1.000 bis 2.000 Nanogramm pro Milliliter des Proteins
produzieren.
-
Falls
gewünscht
können
geeignete dritte hochproduzierende Zellen weiter subkloniert werden, um
die rekombinante Proteinexpression zu verbessern. Ein bevorzugtes
Verfahren ist Grenzverdünnungsklonierung.
Außerdem
sind Klone der dritten hochproduzierenden Zellen bevorzugt, die
in 24 Stunden etwa 100 bis etwa 1.000 Nanogramm des Fusionsproteins
pro Milliliter produzieren. Insbesondere bevorzugt sind Klone, die
in 24 Stunden etwa 200 bis 500 Nanogramm des Fusionsproteins pro Milliliter
produzieren.
-
Ein
Beispiel für
einen Vektor, der für
einen Einketten-MHC-Komplex kodiert, ist der in 1B dargestellte
pDRHK-Vektor. Dieser Vektor kodiert für einen sc-DR2/MBP-Einketten-MHC-Komplex
der Klasse II.
-
Die
vorliegenden Verfahren können
je nach Anwendung variiert werden. Beispielsweise umfasst die Erfindung
speziell die folgenden Ausführungsformen:
1) Transfektion mit einem Expressionsvektor, der ein Arzneimittelresistenzgen
trägt,
2) Cotransfektion mit einem Expressionsvektor und einem Vektor, der
vorübergehend
einen Zelloberflächenmarker
exprimiert, und 3) Cotransfektion mit einem Expressionsvektor und
einem Vektor, der ein anderes Arzneimittelresistenzgen trägt. Die
hierin erläuterten
Zellselektionsverfahren können
angewandt werden, um diese spezifischen Strategien umzusetzen. Die
Erfindung kann auch verwendet werden, um Zellen mit Expressionsvektoren
zu retransfizieren, die für
spezifischen rekombinante Proteine von Interesse kodieren, wie beispielsweise
wenn ein Expressionsvektor für
zwei Polypeptidsequenzen (Immunglobulin-Schwer- und -Leichtkette)
kodiert. Eine bevorzugte Expression umfasst die abgestimmte Expression von
beiden Polypeptidketten. Diese spezifischen Verfahren und andere
hierin angeführte
Verfahren sind für
verschiedene Anwendungen geeignet, einschließlich der Vereinfachung der
Selektion und des Screenings von Zellen.
-
Die
vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher veranschaulicht.
Diese Beispiele sollen das Verständnis
der Erfindung unterstützen
und dienen nicht als Einschränkung.
-
Beispiel I – Retransfektion
von CHO-Zellen zur Produktion eines rekombinanten Anti-Gewebefaktor- (-TF-)
Antikörpers
in hohem Ausmaß
-
1. Vektorcharakterisierung
-
Ein
Vektor, der als pJAlgG4TF.A8 (1A) bezeichnet
wird, wurde hergestellt, um chimäre
Anti-Gewebefaktor- (-TF-) Antikörperschwer-
und -leichtketten in Säugetierzellen
zu exprimieren. Anfängliche
Versuche zur vorübergehenden
Transfektion wurden durchgeführt,
um die Antikörperexpression
des pJAlgG4TF.A8-Vektors zu tes ten. COS-Zellen wurden unter Verwendung
des Qiagen-Lipofectin-Reagens vorübergehend transfiziert. Kurz
gesagt wurden 2,5 × 105 Zellen/Well in eine Platte mit 6 Wells gesät und 24
Stunden lang bei 37 °C
inkubiert. Zwei Mikrogramm pJAlgG4-TF.A8-DNA wurden mit 100 μl IMDM vermischt.
Um den Lipid-Komplex herzustellen, wurden 10 μl Lipide zur DNA-Lösung zugesetzt. Das
Gemisch wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert.
Während
DNA den Lipid-Komplex bildete, wurden die Zellen mit PBS gewaschen.
Das DNA-Lipid-Gemisch wurde mit 600 μl 10 % SSM [10 % fötales Rinderserum
(FBS), das mit einem CellGro-IMDM-Medium (MediaTech) ergänzt war]
vermischt und zu den gewaschenen Zellen zugesetzt. Die Zellen wurden
3 Stunden lang bei 37 °C und
10 % CO2 mit Lipid-Komplexen inkubiert.
Die transfizierten Zellen wurden mit PBS gewaschen, 2 ml 10 % SSM
wurden zugesetzt und das Ganze wurde 72 Stunden lang bei 37 °C und 10
% CO2 inkubiert. Der Kulturüberstand
wurde auf seine Antikörperproduktion
getestet.
-
2. ELISA zur Überprüfung der
Antikörperproduktion
-
Um
die Gegenwart des menschlichen IgG4-Antikörpers zu detektieren, wurde
ein menschlicher HC/κ-spezifischer
Sandwich-ELISA entwickelt. Kurz gesagt wurden Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC)
mit 100 μl
1 μg/ml
Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Fab) in einem R5-Puffer (10 mM Tris-HCl,
pH 8,5) beschichtet und über
Nacht bei 4 °C inkubiert.
Die Wells wurden dann einmal mit einem R55-Puffer (2 mM Imidazol,
7,5 mM NaCl, 0,02 % Tween-20) gewaschen, mit einer Plastikfolie
bedeckt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Um die Antikörperproduktion
zu testen, wurde das R55 entfernt und 100 μl Transfektantüberstand
wurden zu den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei
37 °C wurden
die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen und 100 μl einer 1:800-Verdünnung (in PBS,
das 10 % FBS enthielt) eines Anti-Human-κ-Ketten-HRP-Antikörpers (Southern
Biotech) wurden zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37 °C inkubiert
und 6-mal mit 400 μl
R55-Puffer gewaschen. Um die Gegenwart des Sondenantikörpers zu detektieren,
wurden 100 μl
1 × ABTS-Substrat
(Kirkegaard & Perry
Labs) für
4 Minuten zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer (Kirgegaard & Perry Labs) zugesetzt.
Das Absorptions vermögen wurde
bei 405 nm bestimmt. Gereinigtes menschliches IgG4-Protein diente
als positive Kontrolle. Die Ergebnisse solch eines Tests zeigten,
dass der Anti-TF-IgG4-Anitkörper durch
eine COS-Zelle produziert wurde, die vorübergehend mit dem pJAlgG4TF.A8-Vektor
transfiziert war.
-
3. ELISA zur Überprüfung der
Antikörperspezifität
-
Ein
zweiter Sandwich-ELISA wurde entwickelt, um spezifisch Antikörper zu
detektieren, die an einen menschlichen Gewebefaktor binden. Maxisorp-96-Well-Platten
(NUNC) wurden über
Nacht bei 4 °C
mit 100 μl
500 ng/ml rekombinantem menschlichem TF in R65-Puffer (100 mM Natriumbicarbonat, pH
8,2) beschichtet. Am nächsten
Tag wurden die Platten mit R55-Puffer gewaschen, abgedeckt und bis
zur Verwendung bei 4 °C
gelagert. Um die Anti-TF-Antikörperproduktion
zu detektieren, wurde der R55 entfernt, und 100 μl Transfektantenüberstand wurden
den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei 37 °C wurden
die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und 100 μl einer 1:800-Verdünnung (in
PBS, das 10 % FBS enthielt) eines Anti-Human-κ-Ketten-HRP-Antikörpers (Southern
Biotech) wurden zugesetzt. Die Platten wurden dann bei 37 °C inkubiert
und 6-mal mit 400 μl
R55-Puffer gewaschen. Um die Gegenwart des Sondenantikörpers zu
detektieren, wurden 100 μl
1 × ABTS-Substrat
für 4 Minuten
zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer
zugesetzt. Das Absorptionsvermögen
wurde bei 405 nm bestimmt. Gereinigtes Mäuse-H36.D2-Anti-TF-Protein
diente als positive Kontrolle. Die Ergebnisse solch eines Tests
zeigten, dass der Anti-TF-IgG4-Anitkörper durch eine COS-Zelle produziert
wurde, die vorübergehend
mit pJAlgG4TF.A8 transfiziert war.
-
4. Anfängliche
stabile Transfektion von CHO-Zellen
-
Um
eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die den rekombinanten Anti-TF-Antikörper exprimiert, wurden
CHO.K1-Zellen mit dem pJAlgG4TF.A8-VEktor transfiziert. Kurz gesagt
wurden 100 μg pJAlgG4TF.A8-DNA
durch 4-stündigen
Verdau mit Pvul bei 37 °C
linearisiert. CHO.K1-Zellen (ATCC CCL-61) wurden auf eine Konzentration
von 1,25 × 107 Zellen/ml verdünnt. Ein Volumen von 800 μl Zellen
wurde zu einer 0,4 cm großen
Elektroporationsküvette
zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. 25 Mikrogramm pJAlgG4TF.A8-DNA
wurden zugesetzt, mit den Zellen vermischt und 10 Minuten lang inkubiert.
Dann wurden die Zellen bei 960 μF und
250 V elektroporiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde
die Zellsuspension zu einem T25-Kolben mit 10 ml 10 % SSM zugesetzt
und über Nacht
bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert. 24 Stunden später wurden
die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-PBS geerntet, in PBS resuspendiert
und 1:9, 1:27 und 1:81 in einem mit G418 ergänzten Medium verdünnt. 100 μl/Well der
transfizierten Zellen wurden in 96-Well-Platten ausplattiert und
bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert.
-
Der
Kulturüberstand
der transfizierten Zellen wurde wie oben beschrieben auf seine Antikörperproduktion
getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert. Der Klon
H9 der Reihe H der Säule
9 der 1:27-Verdünnungsplatte
wurde als starker Antikörperproduzent
selektiert.
-
Diese
Zelllinie wurde durch Grenzverdünnung
kloniert. Kurz gesagt wurde der selektierte Klon auf 1.000 Zellen/ml
in PBS verdünnt.
Eine Reihe von 1:10-Verdünnungen
in 10 % SSM wurden durchgeführt,
um 1 Zelle/ml zu erhalten. Von diesen Verdünnungen wurden 100 ul/Well
in 96-Well-Platten mit flachem Boden plattiert. Diese Platten wurden
bei 37 °C in
10 % CO2 inkubiert. Nach dreitägiger Inkubation wurden
100 μl/Well
10 % SSM zu jedem Well zugesetzt. Drei Wochen später traten Einzelkolonien auf. Nur
Einzelkolonien wurden durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion getestet. Klone
mit starker Antikörperproduktion
wurden amplifiziert und selektiert. Der Klon H9g12 wurde als stärkster Produzent
selektiert und auf seine Antikörperproduktion
in einem statischen Medium untersucht.
-
Die
selektierten Klone wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet,
in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Well in 10 ml 10 % SSM-Medium resuspendiert
und in einen T25-Gewebekulturkolben zugesetzt. Die Zellen wurden
bei 37 °C
in 10 % CO2 21 Tage lang, oder bis 80 %
der Zellen abgestorben waren, inkubiert. Die Zellsus pension wurde
zentrifugiert, und der Überstand
wurde durch einen ELISA-Assay auf seine Antikörperproduktion getestet. Die
maximale Antikörperproduktion
des H9g12-Klons betrug
3,5 μg/ml.
-
5. Stabile Retransfektion
der CHO-H9g12-Zelllinie
-
Dieses
Verfahren wurde entwickelt, um mehr Kopien der Gene von Interesse
dem Genom einer stabilen Antikörper
produzierenden Zelllinie hinzuzufügen. Um dieses Verfahren umzusetzen,
wurde der Klon H9g12 mit einem Gemisch aus dem Anti-Human-TF-Megavektor
pJAlgG4TF.A8 und pMACS cotransfiziert. Der pMACS-Vektor ermöglicht eine
vorübergehende
Expression eines membrangebundenen CD4-Proteins. Um die H9g12-Zelllinie
zu cotransfizieren, wurden 800 μl
einer Suspension von 1,25 × 107 Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt
und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von
pJAlgG4TF.A8- und pMACS-DNA (40 μl
1 μg/ml
Pvul-linearisiertes pJAlgG4TF.A8 und 5 μl 1 μg/ml supergeknäueltes pMACS)
wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden
die Zellen bei 960 μF
und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang
bei 37 °C
inkubiert, in einem T25-Kolben auf 10 ml 10 % SSM verdünnt und
72 Stunden lang bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert, um die vorübergehende
Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden
die Zellen mit 5 ml PBE (EDTA in einer PBS-Lösung) bei Raumtemperatur behandelt,
bis sie sich ablösten.
Die Zellen wurden einmal gewaschen, in 380 μl PBE resuspendiert und mit
80 μl eines
Antikörper
markiert, der für das
Zelloberflächen-exprimierte
menschliche CD4-Molekül
spezifisch war. Dieser Antikörper
war kovalent an ein Magnetkügelchen
gebunden. Nach einer 15- bis 20-minütigen Inkubation bei 4 °C wurden
die Antikörper-markierten
Zellen auf eine Magnetsäule
aufgetragen. Transfizierte Zellen, die das CD4 auf ihrer Oberfläche exprimierten,
wurden durch die Säule
mit 1 ml PBE gewaschen. Die gebundenen Zellen wurden dann aus der
Säule eluiert,
indem die Säule
von Magnetfeld entfernt wurde und 1 ml PBE durch die Säule geleitet
wurde. CD4 exprimierende Zellen wurden in 199 ml 10 % SSM verdünnt, das mit G418
(1,5 mg/ml) ergänzt
war, und in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden plattiert. Die
Platten wurden bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert.
-
Um
die Antikörperproduktion
zu bestimmen, wurden Maxisorp-96-Well-Platten (NUNC) wie oben beschrieben
mit 100 μl
1 μg/ml
Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Fab) (Pierce) beschichtet. Das Medium von
retransfizierten Zellen wurde 24 Stunden vor dem Test verändert. Fünf Mikroliter
des Transfektanten-24-Stunden-Überstands
wurden zu 95 μl
10 % FBS-PBS zugesetzt. Der verdünnte Überstand
wurde zu den beschichteten Wells zugesetzt und 60 Minuten lang bei
37 °C inkubiert.
Dann wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und ein Anti-Human-κ-Ketten-Antikörper-HRP (Southern Biotech)
wurde verwendet, um wie oben beschrieben rekombinante Antikörper zu
detektieren, die im Überstand
vorhanden waren. Ein gereinigtes IgG4-Protein (Biodesign) diente als positive
Kontrolle und wurde verwendet, um eine Standardkurve für die Antikörperkonzentration
zu erstellen.
-
Die
Klonselektion wurde durch einen Vergleich der Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten in
Bezug auf die Zellanzahl durchgeführt. Kurz gesagt wurden die
hochproduzierenden Klone mit Trypsin behandelt und gezählt. Unter
Verwendung der berechneten Antikörperproduktionsgeschwindigkeit und
der Anzahl der Zellen wurden Werte für μg Antikörper/106 Zellen/24
Stunden bestimmt. Stärker
produzierende Klone wurden auf 24 Wells/Platte amplifiziert und
expandiert. Der selektierte Klone wurde 3D2 genannt.
-
Zur
Grenzverdünnungsklonierung
wurden die selektierten Klone in 10 % SSM reihenverdünnt, in
96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben
inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf
ihre Antikörperproduktion
getestet. Klone mit hohen Werten für die Antikörperproduktion wurden amplifiziert
und selektiert. Der Klon 3D2A9 wies 2,58 μg Antikörper/106 Zellen/24
Stunden auf und wurde als bester Klon selektiert. Für diesen
Klone wurde eine Analyse der Antikörperproduktion in einer statischen
Kultur initiiert.
-
Statische
Kulturen des 3D2A9-Klons wurden initiiert, indem eine Konzentration
von 2 × 105 Zellen/ml in 10 ml 10 % SSM-Medium in einem
T25-Gewebekulturkolben zugesetzt wurden. Die Kolben wurden bei 37 °C in 10 %
CO2 21 Tage lang. oder bis 80 % der Zellen
abgestorben waren, inkubiert. Dann wurde die Zellsuspension zentrifugiert
und der Überstand
wurde durch ELISA auf seine Antikörperproduktion getestet. Die
maximale Antikörperproduktion des
3D2A9-Klons betrug 21 μg/ml.
Dieser Produktionswert war 7-mal höher als der des ersten transfizierten
Klons.
-
3. Dritte
stabile Transfektion
-
Um
den Antikörperproduktionswert
der transfizierten Zellen weiter zu erhöhen, wurde der Klon 3D2A9 erneut
mit einem Gemisch aus dem Anti-Human-TF-Megavektor pJAlgG4TF.A8
und pMACS cotransfiziert. Um diese Zelllinie zu cotransfizieren,
wurden 800 μl
einer Suspension von 1,25 × 107 Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt
und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von
pJAlgG4TF.A8- und pMACS-DNA (50 μl
1 μg/ml
Pvul-linearisiertes pJAlgG4TF.A8 und 5 μl 1 μg/ml supergeknäueltes pMACS)
wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation auf Eis wurden
die Zellen bei 960 μF
und 250 V elektroporiert. Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang
bei 37 °C
inkubiert, zu 10 ml 10 % SSM in einem T25-Kolben zugesetzt und 48
Stunden lang bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert, um die vorübergehende
Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden
die Zellen mit den Anti-CD4-Magnetkügelchen markiert und wie oben
beschrieben auf einer Magnetsäule
selektiert. CD4 exprimierende Zellen wurden in 200 ml 10 % SSM verdünnt, das
mit G418 (1,5 mg/ml) ergänzt
war. Dann wurde die Zellsuspension in einer 96-Well-Platte mit flachem
Boden ausplattiert. Die Platten wurden etwa drei Wochen lang bei
37 °C in
10 % CO2 inkubiert.
-
Maxisorp-96-Well-Platten
(NUNC) wurden wie oben beschrieben mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc
(Fab) (Pierce) in R5 beschichtet. Um die Antikörperproduktionsgeschwindigkeiten
zu bestimmen, wurde Medium von retransfizierten Zellen 24 Stunden
vor dem Test verändert.
Fünf Mikroliter
des Transfektanten-24-Stunden- Überstands
wurden zu 95 μl
10 % FBS-PBS zugesetzt. Der verdünnte Überstand
wurde den beschichteten Wells zugesetzt und 60 Minuten lang bei
37 °C inkubiert.
Dann wurden die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen, und ein Anti-Human-κ-Ketten-Antikörper-HRP (Southern
Biotech) wurde verwendet, um wie oben beschrieben rekombinante Antikörper zu
detektieren, die im Überstand
vorhanden waren. Ein gereinigter chimärer Anti-TF-Antikörper diente
als positive Kontrolle und wurde verwendet, um eine Standardkurve für die Antikörperkonzentration
zu erstellen. Ergebnisse dieses Tests erlaubten die Selektion von
stark Antikörper
produzierenden Klonen, die dann auf eine 12-Well-Platte amplifiziert
wurden. Diese Klone wurden bis zu 80 % des Wells gezüchtet, und
24-Stunden-Überstände wurden
getestet. Eine 1:100-Verdünnung
der 24-Stunden-Kulturüberstände wurde durch
ELISA getestet.
-
Die
Zellen wurden auch gezählt,
und Antikörperproduktionswerte
von μg/106 Zellen/24 Stunden wurden bestimmt. Die
stärksten
Antikörper
produzierenden Mutterklone A9B11 und A9F12 wurden basierend auf
diesen Werten selektiert.
-
Selektierte
Klone wurden in 10 % SSM reihenverdünnt, in 96-Well-Platten mit
flachem Boden gesät
und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien
durch ELISA auf ihre Antikörperproduktion
getestet. Klone mit einem hohen Antikörperproduktionswert wurden
amplifiziert. Die primären
Klone A9F12C2 und A9AllB5 wiesen die höchsten Werte mit einer Antikörperproduktionsgeschwindigkeit
von 30 bis 40 μg/106 Zellen/24 Stunden auf. Diese Klone wurden
für statische
Kulturen expandiert.
-
Statische
Kulturen des A9F12C2-Klons wurden durch den Zusatz einer Konzentration
von 2 × 105 Zellen/ml in 10 ml 10 % SSM-Medium zu einem T25-Gewebekulturkolben
initiiert. Die Kolben wurden bei 37 °C in 10 % CO2 21
Tage lang oder bis 80 % der Zellen abgestorben waren inkubiert.
Dann wurde die Zellsuspension zentrifugiert und der Überstand
wurde durch ELISA auf seine Antikörperproduktion getestet. Die
maximale Antikörperproduktion
des A9F12C2-Klons betrug 52 μg/ml.
Dieser Produktionswert war 2-mal höher als der des zweiten transfizierten
Klons.
-
Der
selektierte Klon A9F12C12 wurde in 10 % SSM reihenverdünnt, in
96-Well-Platten mit flachem Boden gesät und wie oben beschrieben
inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch ELISA auf
ihre Antikörperproduktion
getestet. Der sekundäre
Klon A9F12C2E7 wies die höchste Antikörperproduktionsgeschwindigkeit
auf und wurde für
statische Kulturen expandiert. Diese statischen Kulturen wurde wie
oben beschrieben hergestellt.
-
Um
die Antikörperkonzentration
in den statischen Kulturüberständen zu
bestimmen, wurden 5 μl A9F12C2E7-Zellüberstand
zu 4,995 μl
10 % PBS zugesetzt. Dieser verdünnte Überstand
wurde durch den oben beschriebenen Antikörper-ELISA auf den chimären Antikörper untersucht.
Als positive Kontrolle wurde der gereinigte chimäre Anti-TF-Antikörper verwendet.
Die Ergebnisse dieses Tests zeigten, dass der sekundäre Klon
A9F12C2E7 in einer statischen Kultur einen maximalen Antikörperproduktionswert
von 52,6 μg/ml
aufwies.
-
Der
selektierte Klon A9F12C2E7 wurde in 10 % SSM reihenverdünnt, in
96-Well-Platten
mit flachem Boden gesät
und wie oben beschrieben inkubiert. Nach drei Wochen wurden Einzelkolonien durch
ELISA auf ihre Antikörperproduktion
getestet. Der tertiäre
Klon A9F12C2E7B4 wurde als stärkster Produzent
selektiert und wurde für
eine statische Kultur expandiert. Diese Kulturen wurden wie oben
beschrieben initiiert.
-
Um
die Antikörperkonzentration
in den statischen Kulturüberständen zu
bestimmen, wurden 5 μl A0F12C2E7-Zellüberstand
zu 4,995 μl
10 % PBS zugesetzt. Dieser verdünnte Überstand
wurde durch den oben beschriebenen Antikörper-ELISA auf den chimären Antikörper untersucht.
Als positive Kontrolle wurde der intern gereinigte chimäre Anti-TF-Antikörper verwendet.
Die maximale Antikörperproduktion
des Klons A9F12C2E7B4 betrug 102,3 μg/ml (2). Die
Zelllinie wurde amplifiziert und eingefroren. Fünfzig Phiolen mit einer Konzentration
von 1 × 106 Zellen/ml wurden als anfängliche
Impfzellbank hergestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert.
Die Bezeichnung der Zelllinie ist cH36 (chimäres H36).
-
4. Bioreaktorinjektion
-
Ein
Hohlfaserbioreaktor wurde gemäß den Anweisungen
des Herstellers aufgebaut. Der selektierte Klon wurde bei 1 × 108 Zellen/ml im korrekten Volumen von 30 %
SSM resuspendiert und in den Bioreaktor injiziert. Dann wurde der
Bioreaktor gemäß den Anweisungen
des Herstellers betrieben. Die maximale Produktion wurde wie oben
beschrieben durch ELISA bestimmt. Der erste primäre Transfektionsklon H0g12
erzeugte maximal 70 μg
Antikörper/ml,
während
der dritte primäre
Transfektionsklon A11B5 1.100 μg
Antikörper/ml
erzeugte (3).
-
Beispiel 2 – Herstellung
von Zelllinien zur Produktion eines rekombinanten HLA-DR2-MHC-Moleküls der Klasse
II
-
1. Vektorcharakterisierung
-
Ein
Vektor, der als pDRHK (1B) bezeichnet wird, wurde zur
Säugetierexpression
eines löslichen
einkettigen HLA-DR2/MBP-Moleküls,
das an die menschliche konstante Immunglobulin-κ-Domäne fusioniert ist, hergestellt.
Anfängliche
Versuche zur vorübergehenden
Transfektion wurden durchgeführt,
um die Proteinexpression des pDRHK-Vektors zu testen. COS-Zellen
wurden unter Verwendung des Qiagen-Lipofectin-Reagens vorübergehend transfiziert.
Kurz gesagt wurden 2,5 × 105 Zellen/Well in eine Platte mit 6 Wells
gesät und
24 Stunden lang bei 37 °C
inkubiert. Zwei Mikrogramm pDRHK-DNA wurden mit 100 μl IMDM vermischt.
Um den Lipid-Komplex herzustellen, wurden 10 μl Lipide zur DNA-Lösung zugesetzt.
Das Gemisch wurde verwirbelt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang
inkubiert. Während
DNA den Lipid-Komplex
bildete, wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Das DNA-Lipld-Gemisch
wurde mit 600 μl
10 % SSM vermischt und zu den gewaschenen Zellen zugesetzt. Die
Zellen wurden 3 Stunden lang bei 37 °C und 10 % CO2 mit
Lipid-Komplexen inkubiert. Die transfizierten Zellen wurden mit
PBS gewaschen, 2 ml 10 % SSM wur den zugesetzt und das Ganze wurde
72 Stunden lang bei 37 °C
und 10 % CO2 inkubiert. Der Kulturüberstand wurde auf seine Antikörperproduktion getestet.
-
2. ELISA zur Detektion
von sc-DR2/MBP-Cκ-Produktion
-
Um
die Gegenwart von sc-DRZ/MBP-C6 zu detektieren, wurde ein menschlicher
6/HLA-DR-spezifischer Sandwich-ELISA entwickelt. Kurz gesagt wurden
Maxisorp-96-Well-Platten
(NUNC) mit 100 μl 1 μg/ml Ziegen-Anti-Human-IgG-κ in PBS beschichtet
und über
Nacht bei 4 °C
inkubiert. Die Wells wurden dann einmal mit R55-Puffer gewaschen, mit einer Plastikfolie
bedeckt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Um die rekombinante
Proteinproduktion zu testen, wurde der R55 entfernt, und 100 μl Transfektantenüberstand
wurden zu den beschichteten Wells zugesetzt. Nach 30 Minuten bei
37 °C wurden
die Wells 6-mal mit R55-Puffer gewaschen und 100 μl einer 1:1.000-Verdünnung (in
PBS, das 10 % FBS enthielt) eines Anti-HLA-DR-Antikörpers L243, das an HRP konjugiert
war (Anergen, ATCC HB-55), wurden zugesetzt. Die Platten wurden
dann bei 37 °C inkubiert
und 6-mal mit 400 μl
R55-Puffer gewaschen.
Um die Gegenwart des Sondenantikörpers
zu detektieren, wurden 100 μl
1 × ABTS-Substrat
für 5 Minuten
zugesetzt, und dann wurden 100 μl ABTS-Quenchpuffer
zugesetzt. Das Absorptionsvermögen
wurde bei 405 nm bestimmt. Die Ergebnisse solch eines Tests zeigten,
dass das scDR2/MBP-Cκ-Fusionsprotein
durch eine COS-Zelle produziert wurde, die vorübergehend mit dem pDRHK-Vektor
transfiziert war.
-
3. Anfängliche
stabile Transfektion
-
Um
eine stabile Zelllinie zu erzeugen, die das scDR2/MBP-Cκ-Fusionsprotein
exprimiert, wurden CHO.K1-Zellen mit dem pDRHK-Vektor transfiziert. Kurz
gesagt wurden 100 μg
pDRHK-DNA durch 4-stündigen
Verdau mit Pvul bei 37 °C
linearisiert. CHO.K1-Zellen (ATCC CCL-61) wurden auf eine Konzentration
von 1,25 × 107 Zellen/ml verdünnt. Ein Volumen von 800 μl Zellen
wurde zu einer 0,4 cm großen
Elektroporationsküvette
zugesetzt und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. 20 Mikrogramm pDRHK-DNA
wurden zugesetzt, mit den Zellen vermischt und 10 Minuten lang inkubiert.
Dann wurden die Zellen bei 960 μF
und 250 V elektroporiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation auf Eis wurde
die Zellsuspension zu einem T25-Kolben mit 10 ml 10 % SSM zugesetzt
und über
Nacht bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert. 24 Stunden später wurden
die Zellen durch Inkubation mit Trypsin-PBS geerntet, in PBS resuspendiert
und 1:9, 1:27 und 1:81 in einem mit G418 ergänzten Medium verdünnt. 100 μl/Well der
transfizierten Zellen wurden in 96-Weil-Patten plattiert und bei
37 °C in
10 % CO2 inkubiert.
-
Der
Kulturüberstand
von Zellen von verschiedenen 96-Well-Platten wurde wie oben beschrieben
auf seine Antikörperproduktion
getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert. Der Klon
A5 der Reihe A der Säule
5 der 1:27-Platte wurde als starker Produzent selektiert. Diese
Zelllinie wurde durch Grenzverdünnung,
wie sie oben beschrieben wurde, subkloniert. Nach dem Screenen wurde
der Klon A5B4 als stärkste
Produktionszelllinie selektiert, und eine statische Kultur wurde
initiiert.
-
Die
selektierten Klone wurden durch Behandlung mit Trypsin geerntet,
in einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/Well in 10 ml 10 % SSM-Medium resuspendiert
und zu einem T25-Gewebekulturkolben zugesetzt. Die Zellen wurden
bei 37 °C
in 10 % CO2 21 Tage lang, oder bis 80 %
der Zellen abgestorben waren, inkubiert. Die Zellsuspension wurde
zentrifugiert, und der Überstand
wurde durch einen ELISA-Assay auf seine rekombinante DR2-Produktion getestet.
Die rekombinante sc-DR2/MBP-C6-Fusionsproteinproduktion
des A5B4-Klons war 20 ng/ml.
-
4. Stabile
Retransfektion
-
Um
dieses Verfahren fortzusetzen, wurde der Klon A5B4 mit einem Gemisch
aus pDRHK und pMACS cotransfiziert. Ein Volumen von 800 μl einer Suspension
von 1,25 × 107 Zellen/ml wurde zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt und
10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von
pDRHK- und pMACS-DNA (30 μl
1 μg/ml Pvul-linearisiertes
pDRHK und 5 μl
1 μg/ml
superge knäueltes
pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation
auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert.
Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, in einem T25-Kolben
auf 10 ml 10 % SSM verdünnt
und 72 Stunden lang bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert, um die vorübergehende
Expression des CD4-Proteins zu ermöglichen. An diesem Punkt wurden
die Zellen mit 5 ml PBE bei Raumtemperatur behandelt, bis sie sich
ablösten.
Die Zellen wurden einmal gewaschen, in 380 μl PBE resuspendiert und mit
80 μl eines
Antikörper
markiert, der für
das Zelloberflächen-exprimierte
menschliche CD4-Molekül
spezifisch war. Dieser Antikörper
war kovalent an ein Magnetkügelchen gebunden.
Nach einer 15- bis 20-minütigen
Inkubation bei 4 °C
wurden die Antikörper-markierten
Zellen auf eine Magnetsäule
aufgetragen. Von transfizierten Zellen, die das CD4 auf ihrer Oberfläche exprimierten,
wird erwartet, dass sie die Magnetsäule binden. Die untransfizierten
Zellen wurden durch die Säule mit
1 ml PBE gewaschen. Die gebundenen Zellen wurden dann aus der Säule eluiert,
indem die Säule von
Magnetfeld entfernt wurde und 1 ml PBE durch die Säule geleitet
wurde. CD4 exprimierende Zellen wurden in 199 ml 10 % SSM verdünnt, das
mit G418 (1,5 mg/ml) ergänzt
war, und in eine 96-Well-Platte mit flachem Boden plattiert. Die
Platten wurden bei 37 °C
in 10 % CO2 inkubiert.
-
Nach
3 Wochen wurde der Überstand
von verschiedenen 96-Well-Platen wie oben beschrieben auf rekombinantes
Protein getestet. Positive Klone wurden selektiert und expandiert.
Der Klon DR22 wurde als stärkster Produzent
selektiert. Diese Zelllinie wurde eingefroren.
-
Eine
Phiole des DR22-Klons wurde rasch in einem
Wasserbad mit 37 °C
aufgetaut und auf 95 % Lebensfähigkeit
gezüchtet.
Die Zellen wurden wie oben beschrieben zur Grenzverdünnungsklonierung reihenverdünnt. Nach
drei Wochen Wachstum wurden Einzelkolonien durch ELISA auf ihre sc-DR2-Cκ-Produktion
getestet. Die Klone mit den höchsten
Produktionswerten wurden amplifiziert und selektiert. Der Klon DR22-H4 wurde als bester Produzent identifiziert.
Statische Kulturen wurden wie oben beschrieben hergestellt, und
die rekombinante Proteinproduktion des DR22-H4-Klons
betrug 100 ng/ml.
-
4. Dritte
stabile Transfektion
-
Um
die rekombinante Proteinproduktion weiter zu erhöhen, wurde der Klon DR22-H4 erneut mit einem Gemisch aus pDRHK und
pPUR (Clonetech), einem Vektor, der ein Gen trägt, das Resistenz gegenüber Puromycin
verleiht, cotransfiziert. Kurz gesagt wurden 800 μl einer Suspension
von 1,25 × 107 Zellen/ml zu einer 0,4 cm großen Elektroporationsküvette zugesetzt
und 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Ein 3:1-Molverhältnis von
pDRHK- und pMACS-DNA (25 μl
1 μg/ml
Pvul-linearisiertes pDRHK und 5 μl
1 μg/ml
supergeknäueltes
pMACS) wurde zu den Zellen zugesetzt. Nach 10-minütiger Inkubation
auf Eis wurden die Zellen bei 960 μF und 250 V elektroporiert.
Dann wurden die Zellen 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, zu 10 ml 10 % SSM
in einem T25-Kolben zugesetzt und 48 Stunden lang bei 37 °C in 10 % CO2 inkubiert. Dann wurden die Zellen durch
Trypsinbehandlung geerntet, zentrifugiert und in 10 % SSM resuspendiert,
das G418 (1,5 mg/ml) und Pyromycin (20 μg/ml) enthielt. Die Zellen wurden
in 96-Well-Platten mit flachem Boden plattiert und bei 37 °C in 10 % CO2 inkubiert. Nachdem Kolonien aufgetreten
waren, wurde das Kulturmedium auf rekombinante Proteine getestet.
Die Klone A9 und B9 erwiesen sich als stärkste Produzenten und wurden
wie oben beschriebenen in statischen Kulturen getestet. Die rekombinante
Proteinproduktion in einer statischen Kultur betrug 1.800 ng/ml
für A9
und 2.108 für
B9 (4).
-
Diese
Zelllinien wurden durch Grenzverdünnung subkloniert und auf ihre
rekombinante Proteinproduktion getestet. Die primären Klone
A9D5, A9G4, A9C7, B9H3, B9G4 und B9H5 wiesen scDR2/MBP-Cκ-Produktionsgeschwindigkeit
von 200 bis 300 ng/ml in 24 Stunden auf. Die rekombinante Proteinproduktion
dieser Klone in statischen Kulturen wurde wie oben beschrieben bestimmt.