DE69532801T2

DE69532801T2 - Rekombinanter Bakulovirus und seine Verwendung zur Herstellung monoklonaler Antikörper

Info

Publication number: DE69532801T2
Application number: DE69532801T
Authority: DE
Inventors: Martine Cerutti; Hassan Chaabihi; Gerard Devauchelle; Laurent Gauthier; Michel Kaczorek; Marie-Paule Lefranc; Marie-Alix Poul
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-31
Publication date: 2005-03-17
Anticipated expiration: 2015-02-01
Also published as: EP0742833B1; FR2715664A1; DE69532801D1; EP0742833A1; JPH09511386A; FR2715664B1; CA2182380A1; AU1582495A; ATE263251T1; WO1995020672A1

Description

Die Erfindung betrifft ein modifiziertes Baculovirus und seine Verwendung zur Herstellung von Immunoglobulinen. Die Antikörper oder Immunoglobuline werden von den B-Lymphozyten produziert. Jeder B-Lymphozyt scheidet einen einzigen Typ von Antikörpern aus. Jedes Immunoglobulinmolekül besteht aus der Assoziierung zweier schwerer Ketten (H) und zweier leichter Ketten (L), die durch Disulfidbrücken verbunden sind. Jede Kette besteht aus einem variablen Teil (VH und VL), der den Ort der Fixierung an das Antigen aufweist, und einem konstanten Teil (CH und CL). Es existieren mehrere Typen von schweren Ketten (γ1, γ2, γ3, γ4, α, ε, μ), welche die verschiedenen Klassen von Immunoglobulinen (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4„ IGA, IgE, IgM ...) definieren, und zwei Typen von leichten Ketten (Kappa-(κ)-Kette und Lambda-(λ)-Kette). Beispielsweise bestehen die Antikörper der Klasse IgG1 aus zwei schweren Ketten vom Typ γ1 und zwei leichten Ketten κ oder λ. Die variablen Teile sind die Träger der Spezifizität des Antikörpers für sein Antigen.
Für jede Kette eines gegebenen Antikörpers besteht die variable Region aus mehreren Domänen, von denen einige mehr oder weniger konserviert werden. Die Umordnung dieser variablen Region ist das Ergebnis einer Rekombination auf dem Niveau der genomischen DNA der B-Lymphozyten.
Die monoklonalen Antikörper werden in klassischer Weise ausgehend von Kulturen von Hybridomlinien erzeugt, wobei jede Linie, die von einem einzigen B-Lymphozyten stammt, einen einzigen Typ von Immunoglobulin sekretiert.
Die monoklonalen Antikörper (MAbs) werden heute häufig für die in vitro-Diagnostik verwendet, und ihre Verwendung in der Therapie und zur in vivo-Diagnostik entwickelt sich vielversprechend. Diese Entwicklung ist jedoch dadurch gebremst, daß die einzigen monoklonalen Antikörper, über die man gegenwärtig relativ leicht und in genügender Menge ausgehend von Hybridomkulturen verfügen kann, monoklonale Antikörper von Nagetieren sind. Die Immunoglobuline von Nagetieren (und allgemein nicht menschliche Immunoglobuline) induzieren aber beim Menschen eine unerwünschte Immunantwort, was ihr therapeutisches Interesse erheblich begrenzt.
Es wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um Immunoglobuline zu erhalten, die diesen Nachteil nicht aufweisen; es wurde besonders vorgeschlagen, auf genetischem Wege rekombinante Antikörper herzustellen, in denen der größtmögliche Teil des Moleküls von einem Gen von menschlichem Ursprung abgeleitet ist.
Die erhaltenen Antikörper, bei denen nur die variablen Domänen von nicht humanem Ursprung sind, werden als chimärische Antikörper bezeichnet. Es existieren auch sogenannte humanisierte Antikörper, deren Sequenzen der variablen Region, die an der Erkennung des Antigens nicht direkt beteiligt sind, durch Sequenzen von humanem Ursprung ersetzt wurden. In den zwei Fällen ist der Hauptteil des Immunoglobulinmoleküls von einem Gen menschlichen Ursprungs abgeleitet.
Die Gewinnung von Antikörpern durch genetische Methoden erfordert jedoch gelegentlich die Wahl eines geeigneten Expressionswirts, welcher die notwendigen Modifikationen nach der Übertragung gewährleistet, um die Eigenschaften des nativen Antikörpers zu reproduzieren. Zu diesem Zweck wurde unter anderem vorgeschlagen, das System Baculovirus/Insektenzellen zu verwenden.
Die Baculoviren werden gegenwärtig als Vektoren zur Expression von heterologen Genen verwendet, die in Zellen von infizierten Insekten unter die Kontrolle von viralen Promotern gebracht sind. Der Promoter des Polyhedrins oder auch der des p10 (Proteine, die in großer Menge während der sehr langsamen Phase des viralen Replikationszyklus erzeugt werden), werden also häufig für diesen Zweck verwendet.
HASEMAN und CAPRA [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3942–3946 (1990)], PUTLITZ et al. [Bio/Technology, 8, 651–654, (1990)], REIS et al. [Bio/Technology, 10, 910-912, (1992)] haben so Baculoviren konstruiert, in denen an ein und demselben Locus zwei Kopien des Polyhedrin-Promoters eingesetzt waren, wobei die eine dieser Kopien die Expression eines für die schwere Kette eines Immunoglobulins der Maus kodierenden Gens kontrolliert und die andere Kette die Expression eines für die leichte Kette des gleichen Immunoglobulins kodierenden Gens kontrolliert. Die mit diesen Baculoviren infizierten Insektenzellen scheiden Immunoglobuline aus, welche im wesentlichen die gleichen Eigenschaften wie die ursprünglichen lymphozytären Antikörper besitzen, die als Modell gedient haben. Jedoch bleibt die Struktur des auf diese Weise modifizierten Baculovirus nicht über einige virale Replikationszyklen hinaus erhalten.
Die Erfindung bezweckt die gleichzeitige Herstellung der schweren Kette (H) und leichten Kette (L) eines gegebenen Antikörpers in einer Insektenzelle unter Verwendung eines Expressionsvektors, der von einem Baculovirus abgeleitet ist, aber nicht die Nachteile von Expressionsvektoren des gleichen Typs aufweist, die im Stand der Technik für die Herstellung von Immunoglobulinen verwendet wurden.
Zu diesem Zweck haben die Erfinder doppelrekombinante Baculoviren konstruiert, in denen die kodierenden Sequenzen der zwei Ketten H und L an verschiedenen Loci des Genoms des Baculovirus liegen und jede unter der Kontrolle eines anderen starken Promoters ist (im Gegensatz zu den Baculoviren des Standes der Technik, wie oben erwähnt, wo die zwei Ketten an ein und dem gleichen Locus des Genoms eines Baculovirus plaziert und unter der Kontrolle von zwei Kopien des gleichen Promoters sind).
Die Erfindung hat zum Gegenstand ein rekombinantes Baculovirus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aufweist:

– eine Expressionskassette mit einer Sequenz, die für mindestens einen Teil einer H-Kette eines Immunoglobulins kodiert, wobei diese Sequenz unter der transkriptionalen Kontrolle eines ersten Baculovirus-Promoters steht, und
– eine Expressionskassette, die eine für mindestens einen Teil einer L-Kette eines Immunoglobulins kodierende Sequenz aufweist, wobei die Sequenz unter der transkriptionalen Kontrolle eines zweiten Baculovirus-Promoters steht, wobei
– der erste und zweite Promoter zwei verschiedene Promoter sind und sich an zwei verschiedenen Loci befinden.

Gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind der erste und der zweite Promoter starke Promoter.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung befindet sich der eine der Promoter an der beim wilden Baculovirus vom Promoter des Polyhedrins besetzten Platz und der andere an dem beim wilden Baculovirus vom Promoter des p10 besetzten Platz.
Unter "Baculovirus-Promoter" wird jeder Promoter verstanden, der in das Genom eines Baculovirus integriert werden und in Insektenzellen funktionieren kann; ein solcher Promoter wird als "stark" bezeichnet, wenn er das Erreichen eines hohen Transkriptionsniveaus eines unter seine Kontrolle gestellten Gens ermöglicht (beispielsweise in der Größenordnung des Niveaus, das mit dem Polyhedrin- oder p10-Promoter erhalten wird.
Diese Definition umfaßt nicht nur die Promoter vom "Wild"-Typ, wie die Polyhedrin- und P10-Promoter der Baculoviren AcMNPV oder S1MNPV, sondern auch die Promoterderivate, die aus mehr oder weniger erheblichen Modifkationen der Sequenz eines "wilden" Baculovirus-Promoters stammen, und besonders die synthetischen oder rekombinanten Promo ter, wie beispielsweise der von WANG et al. [Gene, 100, 131–137, (1991)] beschriebene synthetische Promoter.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform eines erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus ist mindestens einer der benutzten Promoter ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus:

– dem Polyhedrin-Promoter;
– dem p10-Promoter;
– einem neuen synthetischen Promoter, der hiernach Syn-Promoter benannt ist und aus einem doppelsträngigen DNA-Fragment mit der folgenden Sequenz besteht:

Die Sequenz des (+)-Stranges dieses Fragments ist in der beigefügten Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID NO : 1 identifizier.
Die Sequenz des (-)-Stranges dieses Fragments ist in der beigefügten Sequenzliste unter der Nummer SEQ ID NO : 2 identifiziert.
Die Verwendung des Syn-Promoters ermöglicht eine sehr deutliche Erhöhung der Produktion von rekombinanten Antikörpern.
Der Syn-Promoter an sich bildet ebenfalls einen Gegenstand der Erfindung.
Die Promoter p10, Polyhedrin und Syn können in beliebiger Kombination 2 zu 2 assoziiert sein, besonders kann der Syn-Promoter mit dem Polyhedrin-Promoter oder auch vorteilhafterweise mit dem p10-Promoter assoziiert sein.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist jede Expressions-Kassette auf:
(i) einen starken Baculovirus-Promoter, wie oben definiert; (ii) eine für ein Signalpeptid kodierende Sequenz; (iii) eine für eine variable Domäne einer H-Kette oder L-Kette von Immunoglobulin kodierende Sequenz; (iv) eine für mindestens einen Teil einer konstanten Domäne einer H- oder L-Kette von Immunoglobulin kodierende Sequenz.
Ein solches rekombinantes Baculovirus bildet einen Expressionsvektor, der direkt zur Herstellung von Immunoglobulinen in einer Insektenzelle verwendbar ist.
Vorzugsweise sind die unter die Kontrolle des ersten Promoters gestellte für das Peptidsignal kodierende Sequenz und die unter die Kontrolle des zweiten Promoters gestellte für das Signalpeptid kodierende Sequenz zwei verschiedene Sequenzen.
An sich bekannte Sequenzen, die für Signalpeptide kodieren, die in Insektenzellen funktionieren, sind zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendbar. Als nicht begrenzendes Beispiel seien Sequenzen genannt, die für die Signalpeptide von Acetylcholinesterase von Drosophila, dem Schaf-Trophoblastin, dem Rinderlaktotransferrin, H- und L-Ketten von Immunoglobulin usw. kodieren.
Die Erfinder haben jedoch festgestellt, daß es zur Erreichung der besten Abscheidung des Immunoglobulinmoleküls vorzuziehen ist, daß die Sequenz His-Val-Ser unmittelbar vor der von der Signal-Peptidase benutzten Schnittstelle vorhanden ist.
Die Sequenzen, welche für die konstanten und variablen Domänen kodieren, können von gleichem Ursprung oder verschiedenem Ursprung sein. Es kann sich auch um synthetische oder rekombinante Sequenzen handeln. Vorteilhafterweise ist die für die konstante Domäne kodierende Sequenz von menschlichem Ursprung; die für die variable Domäne kodierende Sequenz kann von vollständig humanem Ursprung oder mindestens teilweise nicht humanem Ursprung, beispielsweise von der Maus usw. sein.
Die Erfindung umfaßt die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus infizierten Insektenzellen.
Die Infektion der Zellen durch ein doppelrekombinantes Baculovirus entsprechend der Erfindung führt zur Produktion der H- und L-Ketten. Diese Ketten assoziieren sich, um den gewünschten monoklonalen Antikörper wiederherzustellen, der anschließend in das Kulturmedium abgegeben wird.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Insektenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus infiziert sind, in Kultur bringt und das genannte Immunoglobulin aus dem Kulturmedium extrahiert.
Die Erfindung umfaßt auch die nach dem obigen Verfahren erhältlichen Immunoglobuline.
Die Erfindung hat außerdem zum Gegenstand ein Verfahren der Herstellung eines rekombinanten Baculovirus, das wie folgt gekennzeichnet ist:

– man stellt ein erstes Transfer-Plasmid her, das eine Sequenz aufweist, die für mindestens einen Teil der H-Kette des Immunoglobulins unter der transkriptionalen Kontrolle eines ersten starken Promoters eines Baculovirus kodiert;
– man stellt ein zweites Transfer-Plasmid her, das eine Sequenz aufweist, die für mindestens einen Teil der L-Kette des Immunoglobulins unter der transkriptionalen Kontrolle eines zweiten starken Promoters des Baculovirus kodiert;

Die Konstruktion eines erfindungsgemäßen rekombinanten Baculovirus erfolgt unter Verwendung klassischer Methoden der Klonierung von heterologen Genen bei den Baculoviren.
Schematisch erfolgt die Konstruktion der Transfer-Plasmide, indem man in ein Plasmid, das sich in einem Wirtsbakterium (im allgemeinen E. coli) replizieren kann, die Region des Gens des Baculovirus einsetzt (beispielsweise p10 oder Polyhedrin), an dessen Stelle man die Gene einführen will, welche für die H- oder L-Ketten des Immunoglobulins kodieren. In dieser Region wird die kodierende Sequenz des Gens des Baculovirus (und gegebenenfalls die Promoter-Sequenz des Gens) durch die Sequenz ersetzt, die für die zu exprimierende Immunoglobulin-Kette kodiert (und gegebenenfalls durch die Sequenz des Promoters, unter dessen Kontrolle man diese Immunoglobulin-Kette exprimieren will, wenn es sich beispielsweise um einen "abgeleiteten" Promoter handelt). Das so erhaltene Transfer-Plasmid enthält also einen Insert, der eine heterologe Sequenz aufweist, die von Sequenzen des Baculovirus flankiert ist. Man co-transfiziert anschließend die Insektenzellen mit der DNA des so realisierten Transfervektors und der DNA des Baculovirus, was durch homologe Rekombination zwischen der viralen DNA und den die heterologe Sequenz im Plasmid flankierenden Sequenzen des Baculovirus den Transfer der Fremdfrequenz des Plasmids zum viralen Genom ermöglicht.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens tragen die verwendeten Transfer-Plasmide einen Insert mit einer Expressionskassette, wie oben definiert, und beiderseits dieser Kassette Baculovirussequenzen, die homolog zu denen der Regionen sind, welche den Teil des viralen Genoms flankieren, an dessen Stelle man diese Kassette einfügen will.
Gemäß einer bevorzugten Maßnahme dieser Ausführungsform sind die genannten Sequenzen des Baculovirus homolog zu denjenigen der Regionen, welche das Gen von p10 flankieren, oder homolog zu derjenigen der Regionen, welche das Polyhedringen flankieren.
Nach der Replikation der viralen DNA in den transfizierten Zellen nimmt man die Selektion der rekombinanten Baculoviren vor, welche die heterologen Sequenzen integriert haben.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht die DNA des Baculovirus, mit dem die homologe Rekombination von Transfer-Plasmiden durchgeführt wurde, aus der DNA eines Baculovirus, der zuvor durch Einsatz von zwei Stellen Bsu361 beiderseits der für das p10-Protein kodierenden Sequenz modifiziert wurde (wobei diese zwei Stellen die einzigen für das betreffende Enzym im Genom des modifizierten Baculovirus sind) und durch das Enzym Bsu361 verdaut ist.
Das Baculovirus, in das die Stellen Bsu361 eingesetzt werden, kann ein wildes Baculovirus oder ein bereits modifiziertes Baculovirus sein, beispielsweise das als AcD3 bezeichnete Virus, das durch Entfernung des Gens und des PolyhedrinPromoters modifiziert ist, vorausgesetzt jedoch, daß das Baculovirus die das Polyhedrin und p10 flankierenden Regionen beibehält.
Wenn man DNA-Fragmente, die bei dem Verdau Bsu361 erhalten wurden, mit den zwei Transfervektoren (durch Co-Transfektion) zusammenbringt, Rekonstituieren von diesen DNA-Fragmenten nur diejenigen ein zirkulares virales Genom, welche mit dem Vektor rekombinieren, der die p10 flankierenden Regionen trägt, und ermöglichen die Gewinnung von lebensfähigen Viren.
Von den erhaltenen Viren ermöglichen nur diejenigen, welche auch mit dem Vektor rekombiniert wurden, der die das Polyhedrin flankierenden Regionen trägt, die Expression der zwei Immunoglobulin-Ketten. Sie können daher selektiert werden, indem man das erzeugte Immunoglobulin nachweist (z.B. durch ELISA). Außerdem sind im Fall, wo das Ausgangsvirus das Polyhedringen aufweist, nur die Viren, die mit dem Vektor rekombiniert sind, der die das Polyhedrin flankierenden Regionen trägt, von diesem Gen befreit und können auf der Basis ihres Phänotyps ob- (Abwesenheit von Polyedern) selektiert werden.
Dieses Verfahren ermöglicht also in einem einzigen Schritt, indem man eine dreifache Transfektion vornimmt, die Vektoren zu erhalten, welche die schweren und die leichten Ketten integriert haben.
Die Erfindung wird weiter erläutert durch die folgende Beschreibung, welche sich auf Beispiele der Herstellung von rekombinanten Baculoviren gemäß der Erfindung und ihre Verwendung für die Herstellung von Immunoglobulinen in Insektenzellen bezieht.
Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß diese Beispiele nur zur Erläuterung des Gegenstands der Erfindung dienen und in keiner Weise eine Einschränkung derselben bilden.
Beispiel 1.: Konstruktion einer leichten Kappa-Kette-Kassette (pBC_κ) (Fig. 1):
a- Plasmid pGmAc 116T:
Dieser Transfervektor wird abgeleitet aus dem Plasmid pGmAc115T [ROYER et al., J. Virol., 66, 3230–3235 (1992)], das selbst ein Derivat des Plasmids pAc1 ist [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664–2671 (1993)], welches das Fragment EcoRI-I des Baculovirus der nuklearen Polyhedrose von Autographa californica (AcMNPV), und damit das Polyhedrin-Gen und die dieses Gen flankierenden Sequenzen enthält. Um pGmAc116T zu erhalten, wurde aus dem Plasmid pGmAc115T ein Fragment von 1900 pb entfernt, das von einer Stelle EcoRI, die vor dem Polyhedringen bis zu einer Stelle Xhol geht, die 1900 pb nach dieser Stelle EcoRI liegt. Die Entfernung wurde vorgenommen durch erschöpfenden Schnitt Xhol, gefolgt von einem Teilschnitt durch EcoRI. 5 μg des Plasmids pGm115T wurden während 2 Stunden bei 37°C mit 15 Einheiten des Enzyms Xhol (Boehringer) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl und unter den vom Lieferanten angegebenen Bedingungen digeriert. Das Enzym wurde durch eine Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt und die plasmidische DNA wurde mit Alkohol gefällt. Diese DNA wurde anschließend teilweise durch EcoRI (Boehringer) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl in Gegenwart von 0,5 Enzymeinheiten geschnitten. Die Inkubation wurde bei 37°C während 20 Minuten vorgenommen. Nach einer neuen Extraktion mit Phenol/Chloroform wurden die durch die Schnitte Xhol und EcoRI erzeugten Enden freigelegt durch das Enzym von Klenow (Biolabs) in Gegenwart von 4 dNTPs nach der Vorschrift des Lieferanten. Schließlich wurde die plasmidische DNA mit Alkohol gefällt und mit der Ligase des T4-Phagen (Boehringer) unter den vorgeschriebenen Bedingungen inkubiert. Kompetente Bakterien E. coli wurden durch ein Teil des Gemisches der Ligation transformiert, wobei das Screening der aus dieser Transformation folgenden Kolonien die Selektionierung des Plasmids pGmAc116T ermöglichte.
b – Die Promoter:
Der p10-Promoter oder der Polyhedrin-Promoter des Virus der nuklearen Polyhedrose von Spodoptera littoralis (SIMNPV) werden durch PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, was die Wiederherstellung einer EcoRV-Stelle vor dem Promoter und einer Bg1II-Stelle nach dem Promoter ermöglicht. Das Produkt der Amplifizierung wird durch EcoRV und Bg1II verdaut, und die Fragmente, welche die Promotersequenzen tragen, werden in pGmAc116T eingesetzt, das zuvor durch die gleichen Enzyme verdaut wurde. Der Verdau durch EcoRV und Bg1II ermöglicht die Beseitigung des Polyhedrin-Promoters von AcMNPV und dessen Ersatz durch einen der oben angegebenen zwei Promoter.
Die erhaltenen Plasmide werden hier jeweils als pGmAc 10 (Promoter von p10) oder pGmAc33 (Promoter von Polyhedrin) bezeichnet.
Der synthetische Promoter wurde durch chemische Synthese in Form von zwei komplementären Oligonukleotiden hergestellt: SEQ ID NO : 1 und SEQ ID NO : 2.
Nachdem sie sich einander zugeordnet haben, bilden diese Oligonukleotide eine doppelsträngige DNA, die direkt in einer Ligationsreaktion verwendbar ist.
Das Plasmid pGmAc116T wurde durch EcoRV und BglII verdaut, um den PolyhedrinPromoter von AcMNPV zu beseitigen, und die Sequenz des synthetischen Promoters wurde an dessen Stelle eingesetzt. Das erhaltene Plasmid wird als pGmAcSyn bezeichnet.
c – Signalpeptid:
Es wurde die folgende kodierende Sequenz für das Signalpeptid gewählt:
Diese Sequenz wurde ausgewählt aus von NEUBERGER M. S., EMBO J, vol. 2, Seiten 1373–1378 (1983) publizierten Sequenzen.
Sie ist in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 3 identifiziert.
Diese Sequenz wurde chemisch synthetisiert in Form von zwei komplementären Oligonukleotiden mit Enden, welche den Einsatz des Duplex in eine Stelle BglII ermöglichen. An einem der Enden des Duplex ist eine Sequenz vorhanden, die der des Anfangs des "Framework 1 " der leichten Ketten (mit der Stelle SacI) entspricht, gefolgt von einer Sequenz, die eine Stelle Xhol trägt. Für die Vereinigung werden 15 μg jedes der zwei Oligonukleotide in 50 μl Puffer (Tris 1 mM pH 7,5, EDTA 0,1 mM) während 5 Minuten in einem Wasserbad bei 70°C inkubiert. Man läßt das Bad anschließend bis auf Raumtemperatur (22 bis 25°C) abkühlen. Das Gemisch wird direkt in den Ligationsreaktionen mit den Plasmiden pGmAc10, pGmAc33 oder dem Plasmid pGmAcSyn verwendet, die zuvor durch BglII geschnitten wurden.
Die Ligationsbedingungen sind wie folgt:
1 μg des ausgewählten Plasmids pGmAc, geschnitten durch BglII, 1 μg des doppelsträngigen Oligonukleotids, das die für das Signalpeptid kodierende Sequenz trägt, 2 μl von Puffer Ligase 10X (BOEHRINGER), destilliertes Wasser q.s.p., 19 μl, 1 Einheit (1 μl) Ligase (BOEHRINGER); die Inkubation wurde bei 22°C während 2 Stunden durchgeführt. Das Ligationsprodukt wird verwendet, um die kompetenten Bakterien E. coli zu transformieren.
d – Konstante Region
Die kodierende Sequenz der konstanten Region der humanen leichten κ-Kette wurde durch PCR amplifiziert, indem man als Matrix die DNAc von humanen B-Lymphozyten verwendet. Die humanen Lymphozyten (etwa 5×10⁸) wurden ausgehend von 200 ml Blut präpariert unter Verwendung von HISTOPAQUE^® (SIGMA). Die gesamte RNA dieser Lymphozyten wurde extrahiert unter Verwendung eines Kits PHARMACIA (RNA extraction kit). Der erste Strang der DNAc wurde hergestellt aus der Gesamt RNA mit Hilfe des Kits "First-Strand cDNA synthesis kit" von PHARMACIA.
Es wurden die folgenden Primer zum Amplifizieren der cDNA Cκ verwendet:
HuCκBAC:
(die Stelle Xhol ist unterstrichen).
Dieser Primer entspricht einer Konsensussequenz bei 3' von Sequenzen, welche für die variablen Domänen der humanen leichten Immunoglobulin-Ketten (Jκ) kodieren und eine Schnittstelle durch Xhol enthalten.
Er wird in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 4 identifiziert.
HuCκFOR:
(die Stelle BglII ist unterstrichen).
Dieser Primer ist komplementär zum Ende 3' der humanen Gene Cκ und trägt eine Stelle BglII nach dem Stop-Codon TAG.
Er wird in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 5 identifiziert.
Die Amplifikation mit den Primern HuCκBAC und HuCκFOR ermöglichte ein Fragment von etwa 340 pb zu erhalten, das die Gesamtheit der gerahmten Region Cκ der Stellen Xhol und BglII enthält.
Das Amplifikationsprodukt wurde durch BglII und Xhol verdaut, bevor es in die Stellen Xhol-BglII der Plasmide pGmAc kloniert wurde, welche die für das Signalpeptid kodierende Sequenz tragen, um die pBCκ Plasmide zu liefern.
Die Zusammensetzung der Ligationsmischung ist wie folgt:
1 μg des durch Xhol und BglII geschnittenen Plasmids pGmAc, 200 ng des amplifizierten und durch BglII und Xhol verdauten Fragments Ck, 2 μl Puffer Ligase 10X (BOEHRINGER), destilliertes Wasser q.s.p. 19 μl, 1 Einheit (1 μl) Ligase (BOEHRINGER).
Die Inkubation wurde bei 22°C während 2 Stunden durchgeführt. Das Ligationsprodukt wurde zum Transformieren der kompetenten E. coli Bakterien verwendet.
Beispiel 2 – Leichte λ-Ketten-Kassette (pBCλ) (Fig. 2):
a. Konstante Region Cλ:
Wie für die kodierende Sequenz der konstanten Region Ck wurde die kodierende Sequenz Cλ durch Amplifizierung der DNA durch PCR erhalten, welche komplementär zu den Boten RNAs von Human-B-Lymphozyten ist.
Die Amplifizierung der Cλ-Region durch PCR wurde in Gegenwart des Primers OPP-HuCλ3' realisiert, der komplementär zum Ende 3' der Cλ-Regionen ist und die Restriktions stelle BglII beibringt, und des Primers OPP-HuCλ5', der komplementär zum Ende 5' der Cλ-Region ist und die Restriktionsstelle Xhol beibringt.
Die Sequenzen der zwei Primer sind wie folgt:
OPP-HuCλ3':
(Stelle BglII unterstrichen) in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 6 identifiziert.
OPP-HuCλ5':
(Stelle Xhol unterstrichen) in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 7 identifiziert.
Nach Schnitt durch die Enzyme BglII und Xhol wird die amplifizierte Sequenz Cλ zwischen die Stellen Xhol und BglII des Plasmids pBCκ eingesetzt, aus dem zuvor das Gen Cκ durch Behandlung mit den Enzymen BglII und Xhol und Reinigung des Plasmidfragments von 7,8 kb erhalten wurde.
Das erhaltene Plasmid wird als pBCλ bezeichnet.
Das Einsetzen der konstanten λ-Region wurde verifiziert durch Sequenzierung des pBCλ Plasmids in Gegenwart der zwei Primer OPP-HuCλ3' und OPP-HuCλ5'.
Die Lambda-Ketten-Kassette (Cλ) dient zum Klonieren von variablen Teilen leichter Ketten vom Typ Lambda.
Diese variablen Teile werden durch PCR amplifiziert unter Verwendung einerseits eines Primers (OPP-HuVλ5'), der auf der Höhe des Framework 1 der leichten Ketten hybridisiert und die Wiederherstellung einer Stelle SacI ermöglicht, und andererseits eines Primers (OPP-HuVλ3'), der quasi komplementär zum Primer OPP-HuCλ5' ist und die Wiederherstellung einer Stelle Xhol ermöglicht.
Die Sequenz dieser Primer sind wie folgt:
OPP-HuVλ5':
(Stelle SacI unterstrichen) die in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 8 identifiziert ist.
OPP-HuCλ3':
(Stelle Xhol unterstrichen) die in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID NO : 9 identifiziert ist.
Beispiel 3 – Kassette der schweren Kette γ1 (pBCγ1) (Fig. 3):
a. Transferplasmid:
Das Plasmid pGm16 [BLANC et al., Virology, 192, 651–654, (1993)], das abgeleitet ist von einem Plasmid, in dem das Fragment EcoRI-P des Baculovirus AcMNPV, das das Gen p10 enthält, kloniert wurde. Es wurde fast die Gesamtheit der kodierenden Sequenz entfernt und ersetzt durch eine Stelle BglII, welche das Einsetzen von zu exprimierenden Sequenzen unter der Kontrolle des Promoters p10 ermöglicht.
b. Das Signalpeptid:
Die kodierende Sequenz des Signalpeptids für die Sekretion der schweren Kette ist eine künstliche Sequenz, die für ein Peptid kodiert, das zwei die Sekretion begünstigende Eigenschaften hat: globale Hydrophobizität (diese Eigenschaft haben alle Signalpeptide) und Anwesenheit der Sequenz Val-His-Ser vor der Stelle des Schnitts durch die „Signalpeptidase".
Die kodierende Sequenz dieses Signalpeptids ist die folgende:
Sie ist in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID Nr.: 10 identifiziert.
Sie wurde chemisch synthetisiert in Form von komplementären Strängen, so daß sie in eine Stelle BglII (3) eingesetzt werden kann. Die Bedingungen der Anlagerung und der Ligation sind identisch mit denen, die für die Klonierung der kodierenden Sequenz des für die leichte Kette verwendeten Signalpeptids verwendet wurden.
c. Konstante humane Regionen:
– IgG1 (Cγ1)
Die cDNA der kodierenden Sequenz der humanen Region Cγ1 wurde mittels PCR amplifiziert unter Verwendung der folgenden Primer:
– HuCγ1BAC:
(0rt Kpnl unterstrichen).
Dieser Primer entspricht einer Konsensussequenz der humanen JH-Regionen (Enden 3' der variablen Regionen der humanen schweren Ketten) und weist eine Stelle Kpnl auf.
Er wird in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID Nr.: 11 identifiziert.
– HuCγ1FOR:
(Stelle BglII unterstrichen) ist in der beigefügten Liste von Sequenzen unter der Nummer SEQ ID Nr.: 12 identifiziert.
Die Sequenz wurde ausgehend von humanen Cγ1-Sequenzen bestimmt. Der Primer ist komplementär zum Ende 3' der humanen Cγ1 und ermöglicht es, nach der Amplifizierung eine Stelle BglII vor dem Stop-Codon zu rekonstituieren.
Die zum Amplifizieren der humanen Region Cγ1 verwendete Matrix ist die gleiche Mischung von DNAc, wie die zur Amplifizierung der kodierenden Sequenzen Cκ und C_λ verwendete.
Das Amplifizierungsprodukt wurde sequenziert und kloniert im Transfervektor pGm16, der die für das Signalpeptid kodierende Sequenz trägt. Die erhaltene Konstruktion wurde pBCγ1 genannt (3).
Zur Amplifizierung der konstanten Regionen der Immunoglobuline IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM und IgA verwendet man als 5'-Primer den obigen Primer HuCγ1BAC, der jeweils mit den folgenden 3'-Primern assoziiert ist:

- IgG2: HuCγ1FOR,
– IgG3: HuCγ1FOR,
– IgG4: HuCγ1FOR,
– IgE:
in der beigefügten Liste von Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 13
– IgM:
in der beigefügten Liste von Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 14
- IgA:
in der beigefügten Liste von Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 15

Für die konstanten Regionen der IgG1, 2, 3 und 4 wird der gleiche Primer bei 3' verwendet wegen der starken Konservierung von Sequenzen zwischen den verschiedenen Unterklassen dieses Abschnitts. Für die Primer, die für die Produkte IgE, die IgM und IgA verwendet wurden, sind die eingeführten BglII-Schnittstellen unterstrichen.
Beispiel 4 – Expression eines chimerischen Antikörpers (Maus-Mensch) in Insektenzellen, die durch einen erfindungsgemäßen Vektor infiziert wurden:
Das MAb K20 ist ein Maus-Antikörper, der von einem Hybridom produziert wird. Er ist gegen die β-Untereinheit der CD29-Rezeptoren der Lymphozyten gerichtet [BOUMSELL et al., J. Exp. Med. 152, S. 229 (1980)]. Ein erfindungsgemäßes rekombinantes Baculovirus wurde verwendet, um einen chimerischen Antikörper K20 zu exprimieren, der die variablen Regionen des ursprünglichen K20 und die konstanten humanen Regionen aufweist, die von den Kassetten pBCκ und pBCγ1 stammen.
1. Klonierung der variablen Region der leichten κ-Ketten von K20:
Die Gesamt-RNA des Hybridoms wurde mit Hilfe des Kits „RNA extraction Kit" von PHARMACIA extrahiert und eine inverse Transkription wurde unter Verwendung des Primers VKFOR durchgeführt (First-Strand cDNA Synthesis kit; PHARMACIA):
– VKFOR:
(Stelle XhoI unterstrichen).
in der beigefügten Liste von Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 16.
Dieser Primer ist komplementär zur Konsensussequenz am 3'-Ende der variablen Region Vκ der Mäusegene. Er soll die Vκ amplifizieren, die mit den Verbindungen Jκ1 oder Jκ2 (welche die am meisten verbreiteten sind) jedoch auch die mit den Verbindungen Jκ4 oder Jκ5 rearrangiert sind.
Die cDNA wurde mittels PCR amplifiziert, indem man einerseits den Primer VκFOR und andererseits den Starter Vκ2BAC verwendete:
– Vκ2BAC:
(Stelle SacI unterstrichen) in der beigefügten Liste von Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 17.
Die Sequenz dieses Primers ist identisch mit einer bereits publizierten Sequenz [WINTER et CLACKSON, Nature, 352, S. 624, (1991)]. Vκ2BAC ist in der Lage, variable Maus-Regionen Vκ3, Vκ4 und Vκ6 zu amplifizieren.
Nach der Amplifikation der Region VκK20 wurde ein Verdau SacI-XhoI des Amplifikationsprodukts durchgeführt und das erhaltene Fragment wurde zwischen die Stellen SacI und XhoI des leichten Kettenplasmids pBCκ kloniert, um das Plasmid pBVκK20HuCκ zu liefern (4A).
2. Klonierung der variablen Regionen der schweren Kette γ1 von K20:
Die inverse Transkription an der Gesamt-RNA, die aus dem K20 liefernden Hybridom extrahiert war, wurde realisiert unter Verwendung des Primers VHFOR. Dieser gleiche Primer und der Primer VH1BAC haben anschließend dazu gedient, die Region VH ausgehend von der DNAc zu amplifizieren:
– VHFOR:
(Stelle KpnI unterstrichen) in der beigefügten Liste der Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 18.
– VH1BAC:
(Stelle PstI unterstrichen) in der beigefügten Liste der Sequenzen identifiziert unter der Nummer SEQ ID Nr.: 19.
VHFOR ist identisch mit einem Primer, der beschrieben wurde von ORLANDI et al. (1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 3833–3837), wobei der einzige Unterschied auf dem Niveau des „a" liegt, welches ein „C" ersetzt (vgl. oben die unterstrichene Stelle KpnI).
Nach der Amplifizierung und dem Verdau durch PstI und KpnI wird die Region VH von K20 in das schwere Kettenplasmid auf der Höhe der Stellen PstI-KpnI eingesetzt. Das beladene Plasmid wird als pBVHK20HUCγ1 bezeichnet (4B).
3. Konstruktion eines rekombinanten Virus, das das chimere K20 produziert (Fig. 5):
a. Einsetzen der schweren Kette:
Das beladene Plasmid pBVHK20HUCγ1 wurde verwendet zur Cotransfektion mit der DNA eines modifizierten Baculovirus genannt AcSLp10 [CHAABIHI et al., J. Virol., 67, 2664–2671 (1993)], dem das Polyhedringen (Promoter + kodierende Sequenz) fehlt, der jedoch die kodierende Sequenz des Polyhedrins unter der Kontrolle des Promoters P10 am natürlichen Ort P10 trägt. Dieses Virus erzeugt in den infizierten Zellen Polyeder, wobei die Rekombination auf der Höhe des Locus P10 so leicht aufgefunden werden kann. Die Bedingungen der Cotransfektion sind wie folgt: 500 ng virale DNA werden mit 5 μg plasmidischer DNA und 40 μl DOTAP-Lösung (BOEHRINGER) in 3 ml Kulturmedium ohne Serum für Insektenzellen gemischt. Diese Mischung wird verwendet, um 4 × 10⁶ Zellen Sf9 (ATCC35CRL 1711) zu überdecken; nach 4 Stunden Kontakt wird die Cotransfektionsmischung durch 4 ml von komplettem Medium ersetzt und die Inkubation wird 5 Tage bei 27° C durchgeführt.
Auf die Cotransfektion folgend wurde das Virus, das unter der Kontrolle des Promoters P10 die schwere Kette des chimerischen Antikörpers K20 produziert, durch die Methode von Lyse-Plaques gereinigt. Dieses Virus wurde als AcSLp10-K20H bezeichnet.
b. Einsetzen der leichten Kette:
Das beladene Plasmid pBVκK20HUCκ wurde in Cotransfektion mit der DNA des modifizierten Baculovirus AcSLp10-K20H verwendet.
Die Doppelrekombinanten wurden nach der Methode der begrenzten Verdünnung zusammen mit ELISA und/oder molekularer Hybridisierung selektiert.
Nach der Cotransfektion führte man eine Verdünnungsreihe des infektiösen Überstands auf, und jede Verdünnung wurde zur Infektion von Insektenzellen verwendet. Drei Tage nach der Infektion wurden die Überstände an ELISA getestet, um das Vorhandensein von korrekt zusammengesetzten Antikörpern vom Humantyp zu untersuchen. Die Überstände der am stärksten positiven Löcher für die stärksten Verdünnungen werden ihrerseits verdünnt und zum Infizieren anderer Kulturen verwendet; nach einigen Zyklen Verdünnung/Infektion werden die an Baculovirus angereicherten den ganzen Antikörper liefernden Überstände auf einem Zellrasen ausgebreitet und nach der Methode von Lyseplaques kloniert.
Beispiel 5 – Herstellung und Reinigung des Antikörpers K20:
Das doppelrekombinate Virus wurde durch eine Reihe von Passagen auf Insektenzellen in Kultur amplifiziert. Der virale Vorrat wurde anschließend verwendet, um eine gerührte Kultur zu infizieren (500 ml Kultur mit 10⁶ Zellen pro ml).
Nach 72 Stunden der Infektion wurde die Kultur gesammelt und bei 1000 g zentrifugiert, um den Überstand zu klären. Letzterer wurde bis auf 1/3 seines Anfangsvolumens durch Zentrifugieren durch eine Membran mit nur einer Schnittschwelle von 30 kDa konzentriert (CENTRIPEP 30, Amicon) (erste Zentrifugierung: 1000 g, 20° C, 30 Minuten; Beseitigung des Filtrats; zweites Zentrifugieren: 1000 g, 20° C, 20 Minuten).
Die Lösung wurde in einem Puffer zur Fixierung an Protein A ins Gleichgewicht gesetzt durch Verdünnung in diesem Puffer gefolgt von einer neuen Konzentration durch Zentrifugieren (Verdünnungspuffer: Glycin 1,5 M, NaCl 3 M; pH 8,9). Die ins Gleichgewicht gesetzte Lösung wurde anschließend in eine Säule von Protein A gegeben, die selbst im gleichen Puffer wie die Lösung von K20 ins Gleichgewicht gesetzt war. Nach Spülen der Säule wurde der Antikörper mit einem Elutionspuffer (Acetat 0,1 M, NaCl 0,5 M; pH 3) eluiert. Auf die Elution folgt eine Messung von DO bei 280 nm. Die den Antikörper enthaltenden Fraktionen wurden gemischt und durch Zentrifugieren durch eine Membran konzentriert, die eine Schnittschwelle von 10 kDa hatte (CENTRIPEP 10, AMICON). Die konzentrierte Lösung wird mit PBS verdünnt, dann in der gleichen Weise rekonzentriert. Die erhaltene Lösung von Antikörper wird bei +4° C in PBS konserviert (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na₂HPO₄-7H₂O; 1,4 mM KH₂PO₄).
Die Qualität des Antikörpers wurde kontrolliert durch Elektrophorese an Polyacrylamid-SDS-Gel unter Verwendung eines Human-IgG1 aus dem Handel (SIGMA) als Vergleich. Diese Untersuchung zeigte, daß der nicht-reduzierte chimerische Antikörper (intakte Disulfidbrücken) auf dem gleichen Niveau wie der humane Vergleichsantikörper wandert.
Nach Behandlung mit Dithiotreitol (DTT) beobachtet man das Auftreten von zwei Banden, die den schweren und leichten Ketten entsprechen und auf dem gleichen Niveau wie die Ketten des ebenfalls mit DTT reduzierten menschlichen Vergleichsantikörpers wandern.
Um die vorangehenden Ergebnisse zu bestätigen, wurden die Proteine der den Antikörper enthaltenden Fraktionen auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und die H- und L-Ketten wurden durch die für die humanen Cγ- und Cκ-Regionen spezifischen Antikörper nachgewiesen.
Diese Untersuchung zeigt, daß der von den Insektenzellen produzierte Antikörper tatsächlich aus H- und L-Ketten besteht und daß die konstanten Teile dieser Ketten von den spezifischen Antikörpern erkannt werden.
Beispiel 6 – Test der Aktivität und der Spezifizität des von den Insektenzellen produzierten K20:
Der monoklonale Antikörper K20 ist gerichtet gegen die β1-Untereinheit der Humanintegrine (Rezeptor CD29), die an der Oberfläche der Lymphozyten lokalisiert ist. Die Fixierung von K20 am CD29-Molekül inhibiert die Proliferation von aktiven humanen T4-Lymphozyten [GROUX et al., Nature, 339, 152–154, (1989)]. Der Suppressoreffekt von K20 auf die T-Zellenproliferation ermöglicht es, die Verwendung dieses Antikörpers bei der Verhinderung des Abstoßens von Transplantaten in Betracht zu ziehen. Um die Aktivität des erfindungsgemäß produzierten chimerischen Antikörpers K20 zu testen, wurden zwei Arten von Untersuchungen durchgeführt: die Immunofluoreszenz und die Inhibierung der T-lymphozytären Proliferation. Die befolgten Untersuchungsprotokolle wurden im wesentlichen bereits beschrieben [GROUX et al, Nature, 339, 152–154, (1989); TICCHIONI et al., Journal of Immunology 151, 119–127, (1993)].
1. Untersuchungen der Immunofluoreszenz:
Humane Lymphozyten, welche den Rezeptor CD29 trugen, wurden auf einer Glasscheibe fixiert und dann in Gegenwart des erfindungsgemäßen produzierten chimerischen R20, von K20 der Maus oder nur Puffer inkubiert.
Nach einer Reihe von Spülungen fügte man entweder einen sekundären Antikörper mit spezifischer Fluoreszenz des erfindungsgemäß produzierten chimerischen K20 oder auch einen spezifisch fluoreszierenden sekundären Antikörper des K20 der Maus zu.
Nach erneutem Spülen wurden die Präparate unter dem Mikroskop beobachtet, um die Fluoreszenz zu erkennen. Das zeigte, daß das erfindungsgemäß produzierte chimerische K20 sich spezifisch an den das CD29 tragenden Lymphozyten fixiert, ebenso wie der positive Vergleich K20 der Maus, während keinerlei Fluoreszenz in Abwesenheit der K20-Antikörper beobachtet wurde.
2. Inhibierung der Proliferation von CD4⁺-Lymphozyten durch K20:
Humane CD4+-Lymphozyten wurden aktiviert durch einen Anti-CD3-Antikörper in Gegenwart von Interleukin-2. Der erfindungsgemäße chimerische Antikörper K20 oder K20 der Maus wurden zugesetzt (20 μg/ml), um ihre Wirkung auf die lymphozytäre Proliferation zu verifizieren. Eine Untersuchung mit einem nicht-inhibierenden Antikörper [GROUX et al., Nature, 339, S. 152, (1989)] wurde durchgeführt, um als negativer Vergleich zu dienen.
Die Proliferation wird gemessen, indem man die Menge von ³H-Thymidin zählt, die nach 4 Tagen Kultur eingebaut ist, die auf Behandlung durch die Antikörper folgen. Man beobachtet 50 bis 70 % Inhibierung der Proliferation, wenn die Zellen mit dem erfindungsgemäß produzierten K20-Antikörper inkubiert wurden.
Der K20-Antikörper der Maus inhibiert die Proliferation aktivierte Lymphozyten ebenfalls in den gleichen Verhältnissen: 50 bis 70 %.
Beispiel 7 – Vergleich der Wirksamkeit des Syn-Promoters und des Polyhedrin-Promoters:
Zwei doppelrekombinante Viren wurden nach dem in den obigen Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Protokoll konstruiert:

– in dem einen von ihnen (Virus 1) ist die schwere Kette unter der Kontrolle des Promoters P 10 und die leichte Kette unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promoters;
– im anderen (Virus 2) ist die schwere Kette unter der Kontrolle des Promoters P10 und die leichte Kette unter der Kontrolle des Syn-Promoters.

Die Menge Antikörper, die von den durch das eine oder andere dieser Viren infizierten Zellen sekretiert werden, wird wie im Beispiel 5 beschrieben bestimmt.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I angegeben, welche die Menge sekretierter Antikörper (in μg/ml) zu verschiedenen Zeiten nach der Infektion (p.i.) angibt:
Tabelle I
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Sekretion von Antikörpern früher und stärker einsetzt, wenn der Syn-Promoter verwendet wird.
LISTE DER SEQUENZEN

Claims

Rekombinantes Baculovirus, einen Expressionsvektor ausbildend, der für die Produktion von Immunoglobulinen in einer Insektenzelle nutzbar ist, und dadurch gekennzeichnet, dass er aufweist: – eine Expressionskassette, aufweisend eine für mindestens einen konstanten oder variablen Teil einer H-Kette eines Immunoglobulins kodierende Sequenz, die unter der transkriptionalen Kontrolle eines ersten Baculovirus-Promoters steht, – eine Expressionskassette, aufweisend eine für mindestens einen konstanten oder variablen Teil einer L-Kette eines Immunoglobulins kodierenden Sequenz, die unter der transkriptionalen Kontrolle eines zweiten Baculovirus-Promoters steht; wobei der erste und der zweite Promoter zwei verschiedene Promoter sind und sich an zwei verschiedenen Loci befinden.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich einer der Promoter an der beim wilden Baculovirus vom Polyhedrin-Promoter belegten und der andere an der beim wilden Baculovirus vom P10-Promoter belegten Stelle befindet.
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Promoter starke Promoter sind.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Promoter aus der Gruppe ausgewählt wird, die gebildet wird von: – dem Promoter P10, – dem Polyhedrin-Promoter, – einem synthetischen Promoter, Promoter Syn genannt, der von einem doppelstrangigen DNA-Fragment gebildet wird, dessen Sequenz, die in der anliegen den Sequenzliste unter den Nummern SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, folgende ist:
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass jede Expressionskassette umfasst: (i) einen starken Baculovirus-Promoter, und unter Kontrolle des besagten Promoters (ii): eine kodierende Sequenz für ein Signalpeptid; (iii) eine kodierende Sequenz für eine variable Immunoglobulindomäne; (iv) eine kodierende Sequenz für eine konstante Domäne einer H- oder L-Immunoglobulinkette.
Rekombinantes Baculovirus nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sich die für ein Signalpeptid kodierende Sequenz unter Kontrolle des ersten Promoters von der für ein Signalpeptid kodierenden Sequenz unter Kontrolle des zweiten Promoters unterscheidet.
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine der für ein Signalpeptid kodierenden Sequenzen für ein Peptid kodiert, das eine His-Val-Ser-Sequenz unmittelbar vor der von der Signalpeptidase genutzten Spaltstelle aufweist.
Rekombinantes Baculovirus nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die für die konstante Immunoglobulindomäne kodierende Sequenz eine Sequenz menschlichen Ursprungs ist.
Von einem rekombinanten Baculovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8 infizierte Insektenzelle.
Verfahren zur Herstellung eines Immunoglobulins, dadurch gekennzeichnet, dass man Insektenzellen nach Anspruch 9 kultiviert, und dadurch, dass man das besagte Immunoglobulin aus dem Kulturmilieu extrahiert.
Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Baculovirus nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass: – man ein erstes Transferplasmid herstellt, das eine für mindestens einen konstanten oder variablen Teil der H-Immunoglobulinkette kodierende Sequenz aufweist, unter transkriptionaler Kontrolle eines ersten starken Baculovirus-Promoters; – man ein zweites Transferplasmid herstellt, das die für mindestens einen konstanten oder variablen Teil der L-Immunoglobulinkette kodierende Sequenz aufweist, unter transkriptionaler Kontrolle eines zweiten starken Promoters des besagten Baculovirus; wobei der erste und der zweite Promoter zwei verschiedene Promoteren sind, – man die homologe Rekombination des einen und des anderen der besagten Plasmide mit der DNA eines Baculovirus durchführt; – man nach Replikation der viralen DNA in den transfizierten Zellen rekombinante Baculoviren selektiert, die an verschiedenen Loci die für mindestens einen Teil der H-Kette kodierende Sequenz und die für mindestens einen Teil der L-Immunoglobulinkette kodierende Sequenz integriert haben.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass jedes verwendete Transferplasmid ein Insert trägt, aufweisend: – eine Expressionskassette, so wie in Anspruch 5 definiert, und auf beiden Seiten dieser Kassette Baculovirussequenzen, die denen der Regionen entsprechen, die den Abschnitt des viralen Genoms flankieren als dessen Ersatz man die besagte Kassette einfügen möchte.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die besagten Baculovirussequenzen denen der Regionen entsprechen, die das Gen der p10 flankieren, oder denen der Regionen entsprechen, die das Polyhedrin-Gen flankieren.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA des Baculovirus, mit dem die homologe Rekombination der Transferplasmide durchgeführt wird, aus der DNA eines Baculovirus besteht, der zuvor durch Insertion von zwei Bsu36I-Stellen beiderseits der für das Protein P10 kodierenden Sequenz (wobei dieses zwei Stellen die einzigen für das betreffende Enzym im Genom des besagten modifizierten Baculovirus sind) modifiziert und vom Enzym Bsu36I verdaut wurde.